JPS6252620B2

JPS6252620B2 -

Info

Publication number: JPS6252620B2
Application number: JP55040154A
Authority: JP
Inventors: Setsutaka Kanejima; Tsutae Akao; Tadaaki Furuta
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1980-03-31
Filing date: 1980-03-31
Publication date: 1987-11-06
Also published as: JPS56152740A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、白血球浮遊液から顆粒球、単球を粘
着し、リンパ球を分離する分離材に関するもの
で、さらに詳しくは、酸性官能基を含有する合成
樹脂性ゲル型粒状疎水性固体物質であつて、酸性
官能基濃度が湿体１ml容積当たり1.2ｍ当量（ミ
リ化学当量）以上で、かつ湿体の粒径が30μ以上
350μ以下よりなる分離材に関するものである。従来、白血球浮遊液から顆粒球、単球を除去し
てリンパ球を分離する方法としては、両細胞間の
密度、大きさ、形態の違い、顆粒球、単球の貧食
能、粘着能の性状を利用する方法、およびこれら
を組合せて分離する方法が知られている。一方、最近の細胞性免疫学の目ざましい発展に
伴ない、リンパ球を、その亜分画であるＴ細胞
（胸腺由来リンパ球）やＢ細胞（骨髄由来リンパ
球）の比率にできるだけ影響を与えることなく、
しかも定量的に、すなわち高収率で高純度に、さ
らにリンパ球機能を損なうことなく白血球浮遊液
から分離することの必要性がますます増大してき
ている。しかしながら、従来の分離方法では、リンパ球
群と顆粒球、単球群との間で重なる分画があるた
めに定量性に乏しく、また細胞障害を起こすこと
が多い。例えば、最も一般的に使われているソデ
イウムメトリゾエイトフイコールを使つての比重
遠心法によつてリンパ球を分離する方法にして
も、顆粒球は除去できても、リンパ球と同じ単核
細胞である単球は混入してくる。また癌患者白血
球を使つた場合には、顆粒球も密度が変わり混入
してくることが多い。これらの混入してくる単
球、顆粒球を除去するために、ダイアイオンエナ
カルボニル粒子やラテツクス粒子を貧食させて除
去する方法を組合せることも行なわれているが、
リンパ球への細胞障害が避けられず、またリンパ
球の亜分画であるＢ細胞の一部を失なうことが多
い。また繊維に対する粘着性の違いを利用して分
離する方法は、繊維間隔、繊維充填密度によつて
性能が大きく左右され、安定した性能が得にくい
ばかりでなく、多くの場合、純度の高いリンパ球
を得ようとすれば、粘着性のある一部のＢ細胞、
さらには一部のＴ細胞亜分画が失なわれがちであ
る。また一定の粒径を持つた多糖類、例えばアガ
ロースゲルやデキストランゲルに対する粘着性の
違いを利用して分離する方法は、ゲルが強度、
熱、化学的安定性に欠け、また微生物繁殖が起こ
りやすく、分離性能の維持が困難であり、さらに
ゲル自体一部のＢ細胞を粘着する傾向にある。以上記したことから明らかなように、白血球浮
遊液を検体に使つて、リンパ球を簡便な操作によ
り、純度も回収率も高く、しかも、細胞障害を与
えることなく分離することが、細胞性免疫学を中
心とする医学、生物学の分野で広く期待されてい
るにもかゝわらず、その達成がなされていない現
状である。本発明者らは、白血球浮遊液を用いて、リンパ
球を細胞膜および細胞機能を損なうことなく、純
度も回収率も高く簡便に分離することを目的にし
て、選択特異的な細胞分離材について鋭意研究を
重ねた結果、酸性官能基濃度が湿体１ml容積当た
り1.2ｍ当量以上で、かつ湿体の粒径が30μ以上
350μ以下である酸性官能基を含有する合成樹脂
製ゲル型粒状疎水性固体物質と白血球浮遊液と
を、蛋白含有液中で接触させることにより、該物
質（以下、本発明の分離材と略す）がリンパ球を
吸着しないことを見い出し、本発明を完成するに
至つた。すなわち、本発明の分離材と白血球浮遊液とを
蛋白含有液中で接触させることにより、細胞膜の
陰性荷電がリンパ球の方が顆粒球、単球よりも大
きいこと、および細胞の粘着性が顆粒球、単球の
方がリンパ球よりも強いことの相加効果が充分に
発揮できるため、本発明の分離材にリンパ球が粘
着せずに、顆粒球、単球のみが粘着することにな
り、分離可能となる。したがつて、液の出入口と１つ以上のフイルタ
ーを有するカラムを作製し、１ｇ／dl以上の蛋白
を含む液に浸漬した本発明の分離材を充填し、血
液または血液から分離した白血球を１ｇ／dl以上
の蛋白を含む液に浮遊させた液を前記カラムに注
入し、洗浄液により洗い出す操作を行なえば、選
択的にリンパ球だけが浮遊した液を得ることがで
きる。本発明において、酸性官能基を含有する粒状疎
水性固体物質とは、粒状の疎水性固体物質に酸性
官能基、すなわち強酸性官能基または弱酸性官能
基が存在しているものとして定義できる。強酸性
官能基とは、例えば、スルホン基であり、弱酸性
官能基とは、例えば、カルボキシル基、ホスホン
基、フエノール基などである。具体的には、上記各酸性官能基を直接結合した
スチレンとジビニルベンゼンの共重合体、例とし
ては、スチレンに４〜12％のジビニルベンゼンを
加え、その混合物に重合の触媒として少量の過酸
化ベンゾイルと水を加え、ベントナイトやアルギ
ン酸などの懸濁剤を加えて懸濁重合を行ない、作
成した重合体を濃硫酸またはクロルスルホン酸で
処理して得られたものなどである。また、フエノ
ールスルホン酸とホルムアルデヒドとフエノール
との縮合体、ビニルスルホン酸の重合体、アクリ
ル酸重合体、メタクリル酸重合体、イタコン酸重
合体、マレイン酸重合体、フマル酸重合体、ブタ
ジエン−１−カルボン酸重合体、イミノジ酢酸型
スチレン重合体、１・３・５−レゾルシン酸とホ
ルムアルデヒドとの縮合体、ジアリルホスホン酸
重合体、フエノールとホルムアルデヒドとの縮合
体などがある。本発明における酸性官能基の濃度としては、湿
体１ml容積当たり1.2ｍ当量以上であることが性
能を発揮するのに適しており、1.2ｍ当量未満の
場合は、分離材へのリンパ球吸着率が増加する傾
向にある。酸性官能基の濃度の上限は特に制限は
ないが、過大の酸性官能基濃度を有するものは、
強度劣化をきたし用いられない。酸性官能基はＨ
型（例えば−SO₃H）あるいは塩形〔例えば−
SO₃Na、−SO₃K、（−SO₃）₂Ca、（−SO₃）₂Mgな
ど〕いずれでも使用できるが、塩形の方が浮遊液
のPH調整が容易であるために使用上好ましい。本発明における粒径としては、実際に使用する
湿潤状態で、すなわち湿体で、350μ以下、極め
て望ましくは200μ以下であることが性能を発揮
するのに適しており、350μよりも大きい場合
は、分離材への顆粒球、単球の吸着率が減少する
傾向にある。湿体粒径としては、正規分布をなし
ているとみなせる粒度分布において、分離材の90
％以上のものを含む有効径として30μ以上350μ
以下の粒径範囲、望ましくは70μ以上200μ以下
の粒径範囲にあるものが使用でき、有効径がこの
範囲にあるものを適当に混ぜ合わせて使用しても
よい。本発明に用いるリンパ球を分離するための分離
器の１例を図面により説明すると、細胞浮遊液お
よび洗浄液を注入する入口１と、細胞浮遊液およ
び洗浄液を流出させる出口２とを持つたカラム３
に、出口の所に分離材が流出しない程度の孔径を
持つたフイルター４を取り付け、カラム３内に前
記した分離材５が充填されている。分離器を用いて、白血球からリンパ球を分離す
るには、血液または血液から遠心法、比重遠心法
などの方法により分離した白血球を蛋白含有液に
浮遊させた液を、あらかじめ蛋白含有液で洗浄し
た分離器に注入し、浮遊液が本発明の分離材に浸
透し終つた時点で、洗浄液を流して未吸収着細胞
を洗い出すことにより行なう。以上の方法により
洗い出した洗浄液中には、リンパ球が含まれるこ
とになる。本発明の分離材と白血球とを接触させる際に使
用する蛋白含有液としては、１ｇ／dl以上の蛋白
を含む液、望ましくは自己血清または動物血清、
例えば牛胎児血清や子牛血清を30％以上含む培養
液または緩衝液、さらに望ましくは100％血清が
用いられる。１ｇ／dl未満の蛋白を含む液を用い
た場合、例えば血清10％を含む緩衝液を用いた場
合は、分離材へのリンパ球吸着率が増加する傾向
にある。また分離材を、１ｇ／dl以上の蛋白を含
む液であらかじめコーテイング処理を行なつてお
けば、分離操作の際、あらかじめ分離器を蛋白含
有液で洗浄する必要がなく、分離操作が簡単にな
り便利である。分離操作の際の温度は、細胞障害を与えない温
度であればいずれでもよいが、室温（18〜25℃）
から体温（37℃近辺）ぐらいの温度が好ましい。このようにして得られたリンパ球について、幼
若化能、抗体産生調節作用、細胞障害能、抗体産
生能などの免疫学的機能検査を行なつた結果、分
離器に注入する前のリンパ球の機能と変わらない
程度に機能を保持していた。さらに、リンパ球を溶出させた後、分離器に１
ｇ／dl以上の分離に際して用いたと同様の蛋白を
含む液を加えながら、おだやかに分離材を撹拌す
ることにより、一たん吸着した白血球を溶離さ
せ、回収することができる。このようにして得ら
れた白血球は、バイアビリテイーにすぐれ、免疫
学的機能検査においても機能の低下は特に認めら
れないものである。以上、酸性官能基を含有する粒状疎水性固体物
質であつて、酸性官能基濃度が湿体１ml容積当た
り1.2ｍ当量以上で、かつ湿体の粒径が30μ以上
350μ以下であることを特徴とする、白血球浮遊
液から顆粒球、単球を吸着し、リンパ球を分離す
る分離材、および該分離材と白血球浮遊液とを１
ｇ／dl以上の蛋白を含む液中で接触させることに
より白血球浮遊液からリンパ球を分離する本発明
は、従来のリンパ球分離用試料およびそれらの方
法と比べて、下記の効果がある。 (1) 白血球からリンパ球を分離するまでの操作が
簡単で、しかも一段階で済む。すなわち、白血
球浮遊液を本発明の分離材を充填した容器に注
入し、洗浄液を流すだけの操作で済む。 (2) 分離する際に、白血球の酵素処理や薬剤処理
などをする必要がなく、また分離後も元のリン
パ球性状と異なることもないので、リンパ球の
機能変化、低下が起こらない。したがつて、リ
ンパ球についての免疫学的機能検査にも使え
る。 (3) 分離器の作製が従来のリンパ球分離用試料お
よび分離機器の作製に比べて容易で、しかも安
価である。 (4) 分離材は高分子合成物質であるので、一定の
活性を持つ分離材の作製および活性の維持が容
易にでき、しかも滅菌操作が簡単にできる。さ
らに物理的、化学的、生物的安定性にすぐれ、
経時的劣化もない。次に実施例によつて本発明をさらに詳細に説明
する。実施例１分離器の作製；ゲル型粒状スルホン化ポリスチレ
ン−ジビニルベンゼン樹脂のNaイオン型（酸
性官能基濃度；湿体１ml容積当たり1.5ｍ当
量、湿体の粒径；有効径100〜350μ）２mlを燐
酸緩衝液に充分に浸し、洗浄後、この樹脂を、
底面に50μｍメツシユのナイロンネツトのフイ
ルターを引いた液入口と出口とを持つた内径10
mmのアクリル製プラスチツクのカラム（図面参
照）に、気泡が入らないように注意しながら充
填することにより作製した。分離操作；ヘパリン加ヒト末梢血からソデイウム
メトリゾエイト−フイコール混液（ｄ＝
1.077、20℃）を使つて、比重遠心法により分
離し、燐酸緩衝液で洗浄した白血球分画を２×
10⁶／mlの濃度に、100％牛胎児血清（蛋白含有
量4.5ｇ／dl）に浮遊させた液0.5mlを、前もつ
て100％牛胎児血清４mlで洗浄した分離器の入
口より静かに流し込み、浮遊液が充分に分離材
に浸透し終つた時点で、たゞちに洗浄液として
牛胎児血清４mlをカラム入口から流し込み、自
然落下の流速で、分離材に吸着していない細胞
を洗い出して回収した。分析結果；全細胞回収率は、自動血球計数器また
は血球計算盤を使つての顕微鏡観察により求め
た。また検体および回収液中のリンパ球は、亜
分画であるＴ細胞をノイラミニダーゼ処理羊赤
血球とのロゼツト反応により、Ｂ細胞を表面免
疫グロブリンに対する螢光抗体法により分析
し、Ｔ細胞とＢ細胞との和によつて算出した。
一方、検体および回収液中の顆粒球、単球群
は、ペルオキシダーゼ染色法により分析した。
さらに全細胞回収率と検体および回収液中の各
組成割合とを使つて、各組成の回収率を算出し
た。結果は、Ｔ細胞、Ｂ細胞についてのデータ
も含めて表１に示す。実施例２〜５実施例１と同様な方法により、ゲル型粒状スル
ホン化ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂の
Naイオン型（酸性官能基濃度；湿体１ml容積当
たり2.0ｍ当量、湿体の粒径；有効径70〜300μ）
−実施例２−、ゲル型粒状メタクリル酸−ジビニ
ルベンゼン樹脂のNaイオン型（酸性官能基濃
度；湿体１ml容積当たり2.5ｍ当量、湿体の粒
径；有効径100〜350μ）−実施例３−、ゲル型粒
状アクリル酸−ジビニルベンゼン樹脂のNaイオ
ン型（酸性官能基濃度；湿体１ml容積当たり3.5
ｍ当量、湿体の粒径；有効径70〜350μ）−実施例
４−、ゲル型粒状カルボキシル化ポリスチレン−
ジビニルベンゼン樹脂のNaイオン型（酸性官能
基濃度；湿体１ml容積当たり4.1ｍ当量、湿体の
粒径；有効径70〜350μ）−実施例５−をそれぞれ
分離材に用いて実験した結果を表１にまとめて示
す。

【表】比較例１、２実施例２と同じ濃度および組成の白血球浮遊液
を使つて、ゲル型粒状スルホン化ポリスチレン−
ジビニルベンゼン樹脂のNaイオン型（酸性官能
基濃度；湿体１ml容積当たり1.0ｍ当量、湿体の
粒径；有効径70〜350μ）−比較例１−、ゲル型粒
状スルホン化ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹
脂のNaイオン型（酸性官能基濃度；湿体１ml容
積当たり2.0ｍ当量、湿体の粒径；有効径380〜
550μ）−比較例２−をそれぞれ分離材に用いて、
実施例１と同様の分離操作を実施した。分析結果
は表２にまとめて表す。比較例３培地を100％牛胎児血清の代わりに10％牛胎児
血清−燐酸緩衝液（蛋白含有量0.44ｇ／dl）を用
いた以外は、実施例２と同じ濃度および組成の白
血球浮遊液を使つて、実施例１と同様の方法によ
り実施した。分析結果は表２に示す。

【表】実施例６ゲル型粒状スルホン化ポリスチレン−ジビニル
ベンゼン樹脂のNaイオン型（酸性官能基濃度；
湿体１ml容積当たり1.8ｍ当量、湿体の粒径；有
効径70〜200μ）を分離材として使用し、ヘパリ
ン加ヒト末梢血から遠心法によりバツフイーコー
トを分離し、燐酸緩衝液で充分に洗浄した白血球
分画を１×10⁷／mlの濃度に100％牛胎児血清に浮
遊させた液、0.5mlを検体液として使用し、実施
例１と同様の方法により実施した。分析の結果、検体液中の組成割合は、リンパ球
＝38.5％（Ｔ＝35.2％、Ｂ＝3.3％）、顆粒・単球
＝61.3％であつたのに対して、回収液中の組成割
合は、リンパ球＝79.1％（Ｔ＝72.4％、Ｂ＝6.7
％）、顆粒・単球＝19.1％であり、回収率は、全
細胞＝45.5％、リンパ球＝93.5％（Ｔ＝93.6％、
Ｂ＝92.4％）、顆粒・単球＝14.2％であつた。実施例７実施例６と同じ分離材を使用して、白血球を
7.86×10⁶／mlの濃度で含むヘパリン加ヒト末梢
血0.5mlをそのまま検体液として使つて、実施例
１と同様の方法により実施した。分析の結果、検体液中の組成割合は、リンパ球
＝37.1％（Ｔ＝27.5％、Ｂ＝9.6％）、顆粒・単球
＝62.0％であつたのに対して、回収液中の組成割
合は、リンパ球＝85.2％（Ｔ＝64.8％、Ｂ＝20.4
％）、顆粒・単球＝12.6％であり、回収率は、全
細胞＝36.3％、リンパ球＝83.4％（Ｔ＝85.5％、
Ｂ＝77.1％）、顆粒・単球＝7.4％であつた。な
お、回収液中には、血球として赤血球、血小板も
含まれているため、これらを除去したい場合は、
さらに溶血操作や遠心操作が必要である。実施例８実施例１と同様にして分離器を作成し、同様の
分離操作にて、吸着していない細胞を洗い出した
後、10％牛胎児血清含有リン酸緩衝液８mlをカラ
ム入口から流し込み、自然落下の流速で流下させ
ながら、パスツールピペツトにてピペツテイング
を行なうことにより、おだやかに分離材をかきま
ぜ、分離した白血球を溶出させる。得られた白血球は、実施例１と同様にして分析
した結果、組成割合はＴリンパ球23.6％、Ｂリン
パ球10.7％、顆粒、単球64.3％であつた。

【図面の簡単な説明】

図面は分離器の１例を示す断面図である。１……液の入口、２……液の出口、３……カラ
ム、４……フイルター、５……分離材。

Claims

【特許請求の範囲】

１酸性官能基を含有する合成樹脂製ゲル型粒状
疎水性固体物質であつて、酸性官能基濃度が湿体
１ml容積当たり1.2ｍ当量以上であつて、かつ湿
体の粒径が30μ以上350μ以下であることを特徴
とする、白血球浮遊液から顆粒球、単球を粘着
し、リンパ球を分離する分離材。