WO2017123021A1 - 페록시다신을 포함하는 무혈청 배지 첨가제 조성물 및 이의 이용 - Google Patents

페록시다신을 포함하는 무혈청 배지 첨가제 조성물 및 이의 이용 Download PDF

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조영애
김현경
이승우
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • Serum-free medium additive composition comprising peroxidacin and use thereof
  • the present invention relates to a medium additive composition for serum-free culture of cells, including peroxidasin, and a serum-free culture method of cells using the same.
  • Stem cells are those that can differentiate into pluripotency that can differentiate into cells derived from endoderm, mesoderm and ectoderm of an animal, or cells closely related to tissue or function. Refers to a cell having a multipotency. Stem cells include embryonic stem cells, adult stem cells,
  • Induced pluripotent stem cells induced Pluripotent Stem cell
  • Stem cells have been widely applied in clinical practice.
  • human mesenchymal stem cells which are a type of adult stem cells, are used in cancerization or ethical problems that are generally a problem in embryonic stem cells. It is used as a cell therapy for regeneration of damaged tissues in the cardiovascular system, nervous system, musculoskeletal system, etc. through in vitro culture, or for the purpose of reducing allogeneic immune reaction or facilitating hematopoietic cell transplantation.
  • stem cells obtained from tissues are very small, for various clinical purposes of stem cells, it is necessary to grow the stem cells stably enough in vitro and proliferate.
  • glycoproteins lose their functional activity when produced from prokaryotic cells, and thus are mainly animal cells (eg, CHO cells, BHK). Cells, NS0 cells, etc.), using complex eukaryotic cells. Therefore, a technique for culturing cells stably in vitro is essential for mass culturing of animal cells for producing a biopharmaceutical such as a recombinant protein or a gene therapeutic.
  • a culture medium containing non-human animal-derived serum such as fetal bovine serum
  • Serum is a nutrient for promoting cell growth or proliferation, or hormones. It is added to the medium as a source of biologically active substance.
  • expensive serum increases the price of the medium, and the complex components make it difficult to purify the recombinant protein, and there is a fear that there are differences in the components of the production process, which may result in different results for each experiment.
  • animal serum has a relatively high risk of being infected with various pathogens such as microorganisms, viruses, or prions, and may cause inadequate immune response, indicating a problem of stability.
  • stem cells obtained from the human body are cultured in a test tube, and then put back into the patient. Since the culture process must be secured to the human body, a serum substitute that can replace animal serum To dig it would be very meaningful commercially
  • Drosophila peroxidas is composed of 1512 amino acid residues and is known to form a trimer.
  • the human peroxidas molecule consists of 1479 amino acids, leucine-rich repeats (LRR), and immunoglobulin C2 (IgC2). It is known to include an ECM motif and peroxidase domain, including the -type domain and von Willebrand factor type C (vWC).
  • the present invention provides the use of peroxidasin as a medium additive capable of promoting the proliferation and survival of cells while replacing animal serum.
  • a media additive composition for serum-free culture of cells including peroxidasin, is provided.
  • a medium for serum-free culture of cells comprising the medium additive composition.
  • a method of serum-free culture of cells comprising culturing the cells in the medium.
  • the present invention As one aspect for achieving the above object, the present invention
  • It relates to a medium additive composition for serum-free culture of cells, including peroxidasin (peroxidasin).
  • the present invention relates to a medium for serum-free culture of cells, comprising the medium additive composition.
  • the invention relates to a method of serum-free culture of cells, comprising culturing the cells in the medium.
  • Serum-free culture herein means cell culture in cell culture medium that contains no or substantially no serum from human or non-human animals.
  • substantially free of animal-derived serum means that the animal-derived serum is included at a lower level than the amount of the medium used in the conventionally used medium, or at an additional amount that does not substantially affect the proliferation or survival of cells. For example, it may mean that the animal-derived serum in the medium is 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2% or less, 1% or less, 0.5% or less, or 0.1% or less.
  • basal medium for serum-free culture there is no particular limitation on the basal medium for serum-free culture herein, and for example, basal culture medium of animal cells, which is well known in the art, can be used.
  • basal culture medium of animal cells, which is well known in the art, can be used.
  • Such basal medium may
  • human peroxidasin can be used. Sequence information of peroxidasin can be found through known databases. For example, the nucleotide sequence of the human peroxidasin gene can be found in Genbank Accession No. NM_012293.1, and the amino acid sequence of the protein can be found in Genbank Accession No. NP_036425.1.
  • Peroxidasin protein is included in the scope of the present invention even if some sequences are altered so long as it maintains an activity that promotes the proliferation or survival of cells in serum-free culture.
  • sequence variants may include substitutions, deletions, additions and / or insertions of amino acids as compared to a reference protein that has not been altered in sequence and exhibits similar or equivalent biological activity to that unmodified reference protein such as a wild type protein. It includes.
  • sequence homology is intended to indicate a degree of similarity with a wild type or a reference amino acid sequence or base sequence, and at least 60% of the amino acid sequence of a wild type peroxidasin protein, 65 Contain at least%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% of the same amino acid residues and exhibit biologically equivalent activity with the wild-type protein If included, it may be included in the scope of the present invention.
  • Such protein moieties may comprise the same active site as the protein of interest. This homology comparison can be performed by using a comparison program that is easy to see with the naked eye.
  • Sequence alignment methods for comparison may use methods known in the art and include, for example, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA and TFASTA.
  • Amino acid substitutions are known in the art. For example, commonly occurring substitutions are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thr / Phe , Ala / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly may be substituted, but is not limited thereto.
  • peroxidasin proteins are phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation within the range that does not alter the activity of the molecule as a whole. And so on
  • protein variants with increased structural stability or increased protein activity against heat, ⁇ , etc. of proteins due to mutations or modifications on amino acid sequences may also be included in the scope of the present invention.
  • Peroxidase in the present invention can be obtained by various methods. For example, it can be obtained by extraction and purification in nature by methods well known in the art. Alternatively, it can be obtained as a synthetic protein synthesized chemically or recombinant protein using gene recombination technology. When prepared by chemical synthesis, it can be obtained using a polypeptide synthesis method well known in the art. When using a recombinant technique, a nucleic acid encoding a peroxidasin protein is inserted into an appropriate expression vector, the vector is transformed into a host cell, the host cell is cultured so that the target protein is expressed, and then the peroxidasin protein from the host cell. It can be obtained by recovering the.
  • Proteins are expressed in selected host cells and then subjected to conventional biochemical separation techniques, such as treatment with protein precipitants (salting), centrifugation, sonication, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography for isolation and purification. (Gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like can be used. In general, these can be used in combination to separate proteins of high purity.
  • the peroxidasin nucleic acid molecule can be used as isolating or preparing, or commercially available using standard molecular biology techniques, such as chemical synthesis or recombinant methods.
  • the medium additive composition or the medium composition of the present invention is a recombinant vector containing peroxidas, a cell into which the vector is introduced, a culture of the cell, or purified
  • the recombinant vector may be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that function in the selected expression host.
  • the recombinant vector is a genetic construct comprising essential regulatory elements operably linked to express a gene insert in a cell of an individual, and can use standard recombinant DNA techniques to produce such gene constructs.
  • the type of recombinant vector is not particularly limited as long as it expresses a gene of interest in various host cells such as prokaryotic cells and eukaryotic cells and produces a protein of interest, but has a promoter with strong activity and strong expression ability. Vectors that can produce large quantities of foreign protein in a state-like form are preferred.
  • the recombinant vector preferably contains at least a promoter, an initiation codon, a gene encoding a protein of interest, a termination codon and a terminator.
  • the DNA encoding the signal peptide, an enhancer sequence, a non-translated region, a selectable marker region, or a replicable unit at the 5 'and 3' ends of the gene of interest may be appropriately included.
  • a conventional method known in the art may be used, and for example, calcium phosphate method or calcium chloride / rubidium chloride method, electroporation, electroinjection, heat Laminar method, chemical treatment methods such as PEG, g en eg un , retroviral infection, microinjection, DEAE-dextran, cationic liposome Etc. may be used, but is not limited thereto.
  • prokaryotic cells or eukaryotic cells may be used, and cells having high DNA introduction efficiency and high expression efficiency of introduced DNA may be used.
  • Cells expressing peroxidasin can be cultured by appropriately adjusting conditions such as temperature, pH of the medium, and incubation time so as to be suitable for growth of cells and mass production of peroxidasin protein. In one embodiment, in cell culture
  • IPTG isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside
  • IPTG isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside
  • the expressed peroxidasin can be isolated and purified after cell disruption by conventional biochemical separation techniques as described above.
  • the media additive composition or the media composition of the present application may include a culture of cells into which a recombinant vector containing peroxidas is introduced.
  • the culture may be a culture comprising the cell itself into which the peroxidasin has been introduced, or the cell may be a conditioned medium comprising the peroxidas removed and secreted by the cells.
  • the growth factor may further include growth factors.
  • the growth factor fibroblast growth factor (FGF), for example, basic fibroblast growth factor (bFGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), epithelium Growth factor (EGF), connective tissue growth factor (CTGF), insulin-like growth factor (IGF), transforming growth factor (TGF), Nerve growth factor (NGF), hepatocyte growth factor (HGF), platelet-derived growth factor (PDGF), bone-derived growth factor (BDF), Stem cell factor, leukemia inhibitory factor (LIF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), and glia-derived neurotrophic factor (GDNF) , Activin A (A ctinvin A), Noggin, bone mwphogenetic protein 2 (BMP2), bone morphogenetic protein 4 (BMP4), angiopoietin-l, SHH (sonic hedgehog), Wnt, FLT-3 (FMS-related tyrosine kinase 3 ligand),
  • Animal cells may be exemplified, but are not limited thereto.
  • Embryonic stem cells Embryonic stem cells, adult stem cells, and induced pluripotent stem cdl (iPS).
  • Adult stem cells refer to undifferentiated stem cells found throughout the adult even after embryonic development. These adult stem cells have a site-specific differentiation ability to differentiate themselves according to the characteristics of the surrounding tissues.
  • Adult stem cells may be derived from various adult cells such as bone marrow, blood, brain, skin, fat, skeletal muscle, umbilical cord, umbilical cord blood and the like.
  • mesenchymal stem cells skeletal muscle stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, hepatic stem cells, adipose derived stem cells ( adipose-derived stem cell, fat Derived progenitor cells (adipose-derived progenitor cells), vascular endothelial progenitor cells (vascular endothelial progenitor cells) and the like, but are not limited thereto.
  • Induced pluripotent stem cells express four kinds of genes that cause reverse differentiation into somatic cells such as skin cells of adults without pluripotency.
  • stem cells having the same pluripotency as embryonic stem cells can be made. These are called induced pluripotent stem cells or dedifferentiated stem cells. Induced pluripotent stem cells can replace cells damaged by diseases such as Parkinson's disease or type 1 diabetes. Stem cell therapy using induced pluripotent stem cells, somatic cells obtained from patients, induced pluripotent stem cells are made and differentiated in vitro to study the progress of various diseases, and used in disease models and cell-based research in drug development.
  • Progenitor cells are cells before they have the shape and function of a specific cell, and can be differentiated into cells of a specific cell lineage or formed into a specific type of tissue, and have self-renewal but extremely limited differentiation capacity. It means a cell having. Endoderm progenitor cells, mesoderm progenitor cells, and ectoderm progenitor cells are all included here.
  • Animal cells are functional and structural basic units derived from animals including humans, and may be included in the scope of the present invention as long as they are cells derived from animals including humans. Accordingly, the animal cells of the present invention include, but are not limited to, epithelial cells, endothelial cells, muscle cells, germ cells, skin cells (eg, fibroblasts, keratinocytes), immune cells, cancer cells and the like.
  • the animal cells of the present invention include, but are not limited to, epithelial cells, endothelial cells, muscle cells, germ cells, skin cells (eg, fibroblasts, keratinocytes), immune cells, cancer cells and the like.
  • Chinese hamster ovary (CHO) cells, mouse myeloma (NS0) cells are functional and structural basic units derived from animals including humans, and may be included in the scope of the present invention as long as they are cells derived from animals including humans. Accordingly, the animal cells of the present invention include, but are not limited to, epithelial cells, end
  • Primary cell refers to a cell cultured directly in a culture dish by removing an organ or tissue of an individual during cell culture. In general, most of the cells are attached to the culture plate and grow. These cells continue to grow and grow into a monolayer on the bottom of the culture plate, and these cells stop proliferating when there is no place for attachment. This primary cell growth is called primary culture.
  • primary culture When culturing primary cells, basic Since culturing using a culture medium does not achieve the desired level of cell growth, primary cell growth cultures are mainly used. Currently, commercial cell growth cultures are dependent on imports, which is more than 10 times the cost of basic cultures. As a result, there have been many limitations such as the lack of smooth research and experimentation. Therefore, serum-free culture using the medium additive composition of the present application and a medium containing the same, primary cells can be cultured in a cheaper and more efficient manner than conventional serum.
  • the culturing method contemplated for culturing various cells as such may follow well-known culturing methods for culturing each cell. ⁇ Effects of the Invention ⁇
  • the present invention provides a medium additive capable of culturing and propagating cells in a serum-free culture system, wherein the serum-free culture of cells using the same is a worldwide shortage of animal serum and serum collection from bovine fetus.
  • Cells free from ethical issues and can be configured to have a clearly defined cell culture environment so that cell activity is constantly regulated, unlike serum, which is unclear in components, and safer by inherently blocking contamination of animal substances Can be provided.
  • FIG. 1 shows the structure of a plasmid (pCMV-SC-CF-H-WT-PXDN) for producing recombinant human PXDN.
  • FIG. 2A shows the structure of wild-type human PXDN (WT), PXDN variant ( ⁇ ) lacking the N-terminal ECM motif, and PXDN variant ( ⁇ ) lacking a peroxidase domain.
  • Figure 2b is a process for establishing a cell line stably expressing the cells incorporating the wild-type PXDN and deletion variants thereof, adding the cell culture (CM) to PXDN deficient cells, and measuring the extent of cell proliferation.
  • 2C shows the results of measuring peroxidase activity.
  • 3A shows the procedure for purifying recombinant PXDN from cell cultures of cell lines expressing wild-type human PXDN (HEK293-H-WT-PXDN).
  • 3B shows the results of SDS-PAGE analysis on the cell culture (CM), the results of SDS-PAGE analysis on the purified PXDN protein and P-60 protein from the cell culture, and the purified PXDN. The result of dot blot analysis after PXDN antibody treatment to protein and p_60 protein is shown.
  • 3c shows the result of SDS-PAGE analysis on the purified PXDN protein under non-reducing conditions and reducing conditions.
  • 3D shows purified PXDN protein and P-60 protein.
  • Figure 4a shows the result of measuring the degree of cell proliferation when treated with recombinant PXDN (rPXDN) protein and bFGF to PXDN deficient cells.
  • Figure 4b shows the results of measuring the cell survival when treated with recombinant PXDN (rPXDN) protein without adding bFGF to PXDN deficient cells.
  • 5a shows PXDN or Collagen IV targeting HUVEC cells.
  • FIG. 5b and 5c show the immunofluorescence results for after treatment with siRNA or control a control siRNA targeting the PXDN or Collagen IV in HUVEC cells, PXDN, Col IV, FN, or LAM of cells (Scale bar : 20 ⁇ ).
  • FIG. 5D shows Western blot results of detecting monomers and dimers of the collgen lV NCl domain after each siRNA treatment, and Western blot results of detecting ERK1 / 2 and FAK phosphorylation when stimulated with growth factors after each siRNA treatment.
  • FIG. 5E shows immunofluorescence staining after treatment of siPXDN to HUVEC cells, bFGF only or bFGF and rPXDN (Scale bar: FIG. 6A shows treatment of bFGF, purified rPXDN or P-60 protein to HUVEC cells.
  • FIG. 6b shows treatment of bFGF on HUVEC, HMVEC, BM-MSC and T98G cells or treatment of rPXDN or P-60 protein with bFGF.
  • Figure 6c shows the results of measurement of cell proliferation when the treatment of rPXDN or P-60 protein without growth factor in HUVEC cells
  • Figure 6d shows the results of cell survival with bFGF
  • Fig. 6E shows the cell proliferation when the concentration of rPXDN or P-60 protein was treated, and the growth of cells when rPXDN or P-60 protein was treated with various growth factors (VEGF or EGF) in HUVEC cells.
  • VEGF or EGF various growth factors
  • Figure 7a is an exemplary PXDN observed that the expression in cord blood mononuclear cell-derived iPS cells, the Figure 7b rPXDN (100 nM) to feeder free culture medium of iPS cells Representative cell photographs taken at the time of addition and incubation and the results of measuring the degree of cell proliferation are shown graphically (right).
  • HMVECs Human umbilical vein endothelial cells
  • BM-MSCs bone marrow-derived mesenchymal stem / stromal cells
  • Human umbilical vein endothelial cells were cultured in M199 medium with 20% serum (Gibco), 30 g / ml Endothelial cell growth supplements (BD Biosciences), 90 jig / ml heparin and 1% antibiotic. Human microvascular endothelial cells
  • EGM2 endothelial growth medium 2
  • -MV medium Longer growth medium 2
  • Bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured by adding 20% serum and 1% antibiotics to DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) medium (Invitrogen). Other cells were cultured with 10% serum and 1% antibiotic in DMEM medium.
  • Humanized PXDN cDNA purchased from Open Biosystems (Cat No BC 140295) was amplified by PCR using a PCR primer set (forward: GCCGCCATGGCCAAGCGCT (SEQ ID NO: 1), reverse: GGAGGGCTTTTCCTCCGCC (SEQ ID NO: 2)) and Mammalian Expression Vector Recombinant plasmid (pCMV-SC-CF-H-WT-), which is inserted into the cloning site of the pCMV-SC-CF vector (Stratagene), expresses human type PXDN. PXDN) was produced.
  • a PCR primer set forward: GCCGCCATGGCCAAGCGCT (SEQ ID NO: 1), reverse: GGAGGGCTTTTCCTCCGCC (SEQ ID NO: 2)
  • pCMV-SC-CF-H-WT- Mammalian Expression Vector Recombinant plasmid
  • Deletion-mutants are restricted to Bgl II and Sal I (201-2086 bp corresponding to N-terminal ECM motifs, ⁇ ) or Sal I and BspE I (2086 to 3317 bp corresponding to peroxidase domain, ⁇ ) restriction enzymes.
  • the plasmid (pCMV-SC-CF-H-WT-PXDN) was digested and prepared by filling the sticky ends with Klenow enzyme (Takara) and self-ligation. The inserted DNA sequence was confirmed by sequencing.
  • Example 3 Expression and Purification of Recombinant Humanized PXDN Protein
  • Recombinant plasmids expressing human type PXDN (pCMV-SC-CF-H-WT-PXDN) or recombinant plasmids expressing defective variant PXDNol were transfected into HEK293 cells, respectively, and treated with G418 (Sigma) 800 g / ml for 2 weeks. By selection, HEK293 cells expressing PXDN were obtained. The cells were cultured confluent at 80-90%, incubated for 24 hours in serum-free DMEM medium, the supernatant was collected, and centrifuged at 3,000 rpm to recover the conditioned medium (CM).
  • CM conditioned medium
  • the recovered CM was thickened using a filter (Amicon, Millipore) with a cutoff of 3 kDa, and then diluted with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) and concentrated again.
  • the concentrated protein solution was loaded on a Q exchange spin column (Thermo Scientific), washed with 20 mM potassium phosphate buffer containing 25 mM NaCl, and the protein bound to the column was loaded with 20 mM potassium phosphate buffer containing lM NaCl. Elution.
  • TMB 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzicline
  • siRNAs targeting PXDN or Collagen IV and control siRNAs as controls were purchased from ST pharm (Seoul, Korea). siRNA sequences are as follows: PXDN knockdown; forward, GCAUCAAUGCUGGCAUCUUTT (SEQ ID NO: 3), reverse,
  • CUCGCCGGACACGCUGAACTT SEQ ID NO: 8
  • Cells were plated at 30 cells / mm2, incubated for 24 hours, and 50 nM of siRNA was transfected using lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). After 4 hours, the cells were washed with PBS and cultured in fresh culture medium for 48 hours.
  • Example 6 Cell Proliferation Test
  • each cell was treated with recombinant protein and 10 ng / ml of bFGF, EGF or VEGF in serum-free medium and incubated for 48 hours.
  • Immunofluorescence staining In the experimental group treated with recombinant PXDN to naive cells not treated with siRNA, each cell was treated with recombinant protein and 10 ng / ml of bFGF, EGF or VEGF in serum-free medium and incubated for 48 hours.
  • the sulfilimine crosslinking level in the NCI domain of Collagen IV was investigated according to the method of a previously reported paper (Lazar, Peterfi et al. 2015). Endothelial cells cultured for 72 hours after transfection of each siRNA were washed with 300 mM HEPES buffer (pH 7.4). Scratch cells by adding hypotonic lysis buffer (10 mM CaC12, 50 mM Hepes, pH7.4) with 0.1 mM benzamidine hydrochloride (Sigma), 1 mM PMSF (Gibco), and 1 mM N-ethylmaleimide (Sigma). Recovered.
  • Lysis buffer [50 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM Na3V04, 50 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mM PMSF , 1 g / ml pepstatin, and protein inhibitor mix (Roche)] were added to lyse the cells, followed by centrifugation at 14,000 rpm for 30 minutes to obtain supernatant. After the 8% SDS-PAGE was performed on a portion of the supernatant, Isolate proteins onto nitrocellulose membrane
  • CMC-7 Induced pluripotent stem cells (iPS) cells (CMC-7) derived from cord blood mononuclear cells were distributed by Professor Ji Ji-hyun of Garlic University (Stem Cells Int. 2016; 2016: 1329459). CMC-7 cells were seeded on plates coated with vitronectin (0.5 ug / ml, Gibco) and incubated in TeSR-E8 (Stemcell) medium. The culture was changed by replacing the medium once every 24 hours.
  • iPS Induced pluripotent stem cells
  • TeSR-E8 medium 50 ul of 0.5 ug / ml vitronectin was added to a 96 well plate and coated at 4 ° C.
  • Cultured CMC-7 iPS cells were treated with 0.05% trypsin-EDTA, then 5 ml of TeSR-E8 medium was added and centrifuged (1300 rpm, 5 min). After removing the supernatant, the cells were suspended in TeSR-E8 medium to which 10 uM ROCK inhibitor (Y27632, Sigma) was added, and the cells were seeded in 1500 well plates coated with vitronectin and incubated for 24 hours. Thereafter, 100 nM rPXDN-added TeSR-E8 medium was added and incubated for 120 hours.
  • Plasmid (pCMV-SC-CF-H-WT-PXDN) was transfected into HEK293 cells to obtain a stable cell line expressing recombinant human PXDN (rPXDN), which was named HEK293-H-WT-PXDN.
  • rPXDN recombinant human PXDN
  • PXDN-expressing plasmids lacking N-terminal ECM motifs ( ⁇ ) or peroxidase domain ( ⁇ ) were prepared and transfected to HEK293 cells to secure stable cell lines. These cell lines were respectively identified as ⁇ 293- ⁇ - ⁇ - It was named ⁇ ⁇ and HEK293-H-AP-PXDN (FIG. 2A).
  • the cell lines were cultured in serum free medium (EBM) to recover the supernatant
  • CM conditioned medium
  • PXDN deficient cells caused by PXDN siRNA knockdown and cultured for 48 hours with the addition of 10ng / ml bFGF to observe cell proliferation (FIG. 2B).
  • HEK293 -H-WT-PXDN CM expressing full-length PXDN was treated with PXDN deficient cells, it was observed that cell proliferation of these cells was fully recovered, but HEK293-H-AN-PXDN or HEK293-H- AP-PXDN CM does not restore cell proliferation at all like CM derived from cells into which empty vectors have been introduced.
  • FIG. 5A The Fibrillar network assembly of Col IV was significantly reduced in PXDN-deficient cells, and the ratio of NCI dimers formed by crosslinking by sulfilimine bonds in Col IV was also reduced (FIGS. 5B to 5D).
  • PXDN knockdown significantly reduced the fibrillar network assembly of fibronectin (FN) and decreased the assembly of laminin (LAM) to some extent.
  • rPXDN a protein purified from CM, did not promote cell growth.
  • rPXDN can be used as an adjuvant to promote growth and survival in defined culture medium for stem cells, progenitor cells or various cell cultures.

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Abstract

본 발명은 페록시다신(peroxidasin)을 포함하는, 세포의 무혈청 배양을 위한 배지 첨가제 조성물 및 이를 이용한 세포의 무혈청 배양 방법에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
페록시다신을 포함하는 무혈청 배지 첨가제 조성물 및 이의 이용
【기술분야】
본 발명은 페록시다신 (peroxidasin)을 포함하는, 세포의 무혈청 배양을 위한 배지 첨가제 조성물 및 이를 이용한 세포의 무혈청 배양 방법에 관한 것이다. 【배경기술】
줄기세포 (stem cell)란 동물의 내배엽 (endoderm), 중배엽 (mesoderm) 및 외배엽 (ectoderm) 유래의 세포로 분화할 수 있는 전분화능 (pluripotency), 또는 조직 또는 기능에 있어 밀접하게 관련된 세포로 분화할 수 있는 다분화능 (multipotency)을 가지는 세포를 말한다. 줄기세포에는 배아줄기세포, 성체줄기세포 및
유도만능줄기세포 (induced Pluripotent Stem cell) 등이 이에 포함된다.
줄기세포는 임상에 다양하게 적용되고 있는데, 예를 들어, 성체줄기세포의 일종인 중간엽줄기세포 (human mesenchymal stem cell)는 배아줄기세포에서 일반적으로 문제가 되는 암 (cancer)화나 윤리적인 문제에서 자유로워, 체외 배양을 통하여 심혈관계, 신경계, 근-골격계 등에서 손상조직의 재생을 위한 세포치료제로 사용되거나, 동종면역반웅을 감소 또는 조혈세포이식을 용이하게 하기 위한 목적으로 사용되고 있다.
그러나 조직으로부터 수득되는 줄기세포의 수는 매우 적기 때문에, 줄기세포의 다양한 임상 웅용을 위하여는， 줄기세포를 체외에서 안정적으로 충분히 배양하여 증식시킬 필요가 있다.
또한, 의약용으로 사용되는 호르몬, 효소， 사이토카인 또는 치료 항체 등은 대부분 재조합 당단백질로서, 이러한 당단백질은 원핵세포로부터 생산할 경우 그 기능적 활성을 상실하기 때문에 주로 동물세포 (예, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포 등)와 같은 복잡한 진핵세포를 이용하여 생산된다. 따라서， 세포를 체외에서 안정적으로 배양하는 기술은, 재조합 단백질이나 유전자 치료제 등의 생물의약품을 생산하기 위한 동물세포의 대량 배양에도 필수적으로 요구된다.
종래 줄기세포나 동물세포를 체외에서 배양하는 경우, 우태아 혈청 (fatal bovine serum)과 같은 비인간 동물 -유래 혈청을 포함하는 배양 배지를 사용해 왔다. 혈청은 세포 성장 또는 증식을 촉진하기 위한 영양원, 또는 호르몬 등과 같은 생물학적 활성 물질의 공급원으로서 배지에 첨가된다. 그러나 고가의 혈청은 배지 가격을 상승시키고, 그 복잡한 성분으로 인해 재조합 단백질의 정제를 어렵게 할 뿐 아니라, 생산되는 과정마다 성분 차이가 있어서 실험을 할 때마다 다른 결과를 초래할 우려가 있다. 또한, 동물 혈청은 미생물, 바이러스 또는 프리온과 같은 각종 병원체에 감염될 위험성이 상대적으로 높고, 부적절한 면역 반웅을 야기시킬 수 있어 안정성에 대한 문제가 지적되고 있다.
이에, 비인간 동물 -유래 혈청을 사용하지 않고 세포를 배양하기 위한 기술이 개발되어 왔다. 그 예로, 자가 이식 치료를 위한 세포 배양의 경우, 동일 환자로부터 수득된 자가 인간 혈청을 사용함으로써 세포의 오염을 피할 수 있으나, 혈청을 생산하기 위하여 많은 양의 혈액이 요구되는 문제가 있다. 또한， 혈청이 포함되지 않은 무혈청 배양 배지 또는 혈청 성분을 적게 포함하고 있는 저혈청 배양 배지가 개발되었으나, 이러한 배지는 특정세포만 잘 자라게 하고， 혈청 대신 사용하는 단백질성 세포 성장인자가 너무 고가이며, 혈청을 포함한 배지에서보다 세포의 성장 및 산물 생산이 안정적이지 못한 문제가 있다.
또한， 줄기세포를 세포치료제로 이용하는 경우 인체에서 얻어진 줄기세포를 시험관에서 배양한 후 다시 환자에게 투입하게 되는데, 이러한 배양 과정은 인체에 대한 안정성이 담보되어야 하므로， 동물성 혈청을 대체할 수 있는 혈청 대체제를 발굴하는 것은 상업적으로 매우 의미가 있다고 할 것이다
한편, 페톡시다신 (peroxidasin) 은 초파리에서 처음 발견되었으며, 초파리의 hemocyte에서 matrix 형성 및 consolidation에 중요한 역할을 할 것으로 제시한 바 있다 (Nelson, Fessler et al. 1994). 초파리의 페록시다신은 1512 아미노산 잔기로 이루어져 있으며 트라이머 (trimer)의 구조를 이루는 것으로 알려져 있으며， 인간 페록시다신 분자는 1479 개의 아미노산으로 이루어져 있고 leucine-rich repeats (LRR), immunoglobulin C2 (IgC2)-type domain 및 von Willebrand factor type C (vWC)를 포함하는 ECM motif 및 peroxidase domain을 포함하는 것으로 알려져 있다.
그러나, 무혈청 배지에서 페록시다신이 세포 증식과 생존을 촉진하는 기능에 대해서는 알려진 바 없다.
【발명의 상세한
:【기술적 과제】 본 발명은 동물 혈청을 대체하면서도 세포의 증식과 생존을 촉진할 수 있는 배지 첨가제로서의 페록시다신의 용도를 제공한다.
일예로, 페록시다신 (peroxidasin)을 포함하는, 세포의 무혈청 배양을 위한 배지 첨가제 조성물이 제공된다.
다른 예로, 상기 배지 첨가제 조성물을 포함하는, 세포의 무혈청 배양용 배지가 제공된다.
다른 예로, 상기 배지 내에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포의 무혈청 배양 방법이 제공된다. 【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은
페록시다신 (peroxidasin)을 포함하는, 세포의 무혈청 배양올 위한 배지 첨가제 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서， 본 발명은 상기 배지 첨가제 조성물을 포함하는， 세포의 무혈청 배양용 배지에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 배지 내에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포의 무혈청 배양 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본원에서 무혈청 배양이란, 인간 또는 비인간 동물로부터 유래된 혈청을 전혀 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 세포 배양 배지에서의 세포 배양을 의미한다. 여기에서， 동물 유래 혈청을 실질적으로 포함하지 않는다는 것은, 동물 유래 혈청을 통상적으로 사용되는 배지 내 첨가량보다 낮은 수준으로 포함하거나， 실질적으로 세포의 증식 또는 생존에 영향을 미치지 않는 첨가량으로 포함하는 것을 의미할 수 있다ᅳ 예를 들어, 배지 내 동물 유래 혈청을 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1 % 이하, 0.5% 이하 또는 0.1% 이하로 포함하는 것을 의미할 수 있다.
본원에서 무혈청 배양을 위한 기본 배지에는 특별한 제한이 없으며, 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 동물 세포의 기본 배양 배지를 사용할 수 있다. 일 구체예로, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지 , MEM(Minimal Essential Medium) 배지 , IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지 , alpha- minimum essential medium (a-MEM), Ml 99 (Medium 199), RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지 , BME(Basal Medium Eagle) 배지 , GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium) 배지, EGM2(endothelial growth medium 2)-MV 배지, Ham's F- 12 배지, Ham's F- 10 배지, El 99 배지, MCDB 배지, Leibovitz L-15 배지, 또는 Williams Medium E 를 예시할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 기본 배지는 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 페톡시다신은, 무혈청 배양에서 세포의 증식 또는 생존올 촉진하는 활성을 가지는 한, 어떠한 생물에서 유래한 것이라도사용 가능하나, 바람직하게는 인간 페록시다신을 사용할 수 있다. 페록시다신의 서열 정보는 공지된 데이터베이스를 통하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 인간 페록시다신 유전자의 염기 서열은 Genbank등록번호 NM_012293.1에서 확인할 수 있고， 그 단백질의 아미노산 서열은 Genbank등록번호 NP_036425.1에서 확인할 수 있다.
페록시다신 단백질은, 무혈청 배양에서 세포의 증식 또는 생존을 촉진하는 활성을 유지하는 한, 일부 서열이 변경되어도 본 발명의 범주에 포함된다. 이러한 서열 변이체는, 서열이 변경되지 않은 기준 단백질과 비교하여 아미노산의 치환, 결실, 부가 및 /또는 삽입을 포함할 수 있으며, 그 변형되지 않은 기준 단백질, 예컨대 야생형 단백질과 유사한 또는 동등한 생물학적 활성을 나타내는 것을 포함한다. 이와 관련하여, 용어 "서열 상동성 "이란 야생형 (wild type) 또는 기준이 되는 아미노산 서열 또는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 야생형의 페록시다신 단백질의 아미노산서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 잔기를 포함하면서 야생형의 단백질과 생물학적으로 균등한 활성을 보유한다면 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 이러한 단백질 상동물은 목적 단백질과 동일한 활성 부위를 포함할 수 있다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율 (%)로 계산할 수 있으며， 상동성 (%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며， 예를 들어, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA를 포함한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 치환은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 통상적으로 일어나는 치환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 치환을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
경우에 따라서， 페록시다신 단백질은 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 범위 내에서 인산화 (phosphorylation), 황화 (sulfation), 아크릴화 (acrylation), 당화 (glycosylation), 메틸화 (methylation), 파네실화 (farnesylation) 등으로
수식 (modification) 될 수도 있다. 또한, 아미노산 서열 상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열 , ρΗ 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질 변이체도 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
본 발명에서 페록시다신은 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 예를 들면, 당 분야에 널리 공지된 방법으로 천연에서 추출 및 정제하여 얻을 수 있다. 또는, 화학적으로 합성된 합성 단백질 또는 유전자 재조합 기술을 이용한 재조합 단백질로 수득할 수 있다. 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당 분야에 널리 공지된 폴리펩티드 합성법을 이용하여 얻을 수 있다. 유전자 재조합 기술올 이용할 경우, 페록시다신 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 백터에 삽입하고, 백터를 숙주세포로 형질전환하여 목적 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 페록시다신 단백질을 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후， 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리 (염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피 (겔여과), 흡착크로마토그래피， 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용할 수 있다. 상기 페록시다신 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나， 시판되는 것을 사용할 수 있다.
본원의 배지 첨가제 조성물 또는 배지 조성물은, 페록시다신을 포함하는 재조합 백터, 상기 백터가 도입된 세포, 상기 세포의 배양물, 또는 정제된
페록시다신을 포함할 수 있다.
재조합 백터는 숙주세포에 도입된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결될 수 있다. 상기 재조합꿱터는 개체의 세포 내에서 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물로서, 이러한 유전자 작제물올 제조하기 위해 표준 재조합 DNA 기술을 이용할 수 있다. 재조합 백터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포 등의 각종 숙주세포에서 목적하는 유전자를 발현하고, 목적하는 단백질을 생산하는 기능을 하면 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 백터가 바람직하다. 재조합 백터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자, 종결코돈 및 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩타이드를 코드하는 DNA, 인핸서 서열, 목적하는 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 비해독영역, 선별 마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다.
재조합 백터를 세포에 도입하는 방법은 당업계에 알려진 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있으며， 예컨대 인산칼슘법 또는 염화캄슘 /염화루비듐법， 일렉트로포레이션법 (electroporation), 전기주입법 (electroinjection), 열층격법, PEG 등의 화학적 처리 방법, 유전자총 (gene gun), 레트로바이러스 감염 (retroviral infection), 미세주입법 (microinjection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀법 (cationic liposome) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
재조합 백터가 도입되며 페록시다신을 발현하는 세포로는, 원핵 세포 또는 진핵 세포를 사용할 수 있으며， DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 세포가사용될 수 있다. 페록시다신을 발현하는 세포는, 세포의 생육과 페록시다신 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도， 배지의 pH 및 배양 시간 등의 조건들을 적절하게 조절하여 배양할 수 있다. 일 구체예로， 세포 배양시
발현유도인자로 IPTG(isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside)를 사용하여 페록시다신 단백질 발현을 유도할 수 있고 유도시간은 단백질의 양이 최대화될 수 있도록 조절할 수 있다. 발현된 페록시다신은 세포 파쇄 후， 상술한 바와 같은 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리 및 정제 가능하다.
또한， 본원의 배지 첨가제 조성물 또는 배지 조성물은， 페록시다신을 포함하는 재조합 백터가 도입된 세포의 배양물을 포함할 수 있는데, 상기 배양물은 페록시다신이 도입된 세포 자체를 포함하는 배양물이거나， 또는 세포는 제거되고 세포에 의해 분비된 페록시다신을 포함하는 조건화된 배양물 (conditioned medium)일 수 있다.
본원의 배지 첨가제 조성물 또는 배지 조성물은, 페록시다신과 함께
성장인자를 더욱 포함할 수 있다. 상기 성장인자는, 섬유아세포 성장인자 (fibroblast growth factor, FGF), 예를 들어, 염기성 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF), 혈관내피세포 성장인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF), 상피성장인자 (epidermal growth factor, EGF), 결합조직성장인자 (connective tissue growth factor, CTGF), 인술린유사 성장인자 (insulin-like growth factor, IGF), 형질전환 성장 인자 (transforming growth factor, TGF), 신경 성장인자 (nerve growth factor, NGF), 간세포 성장인자 (hepatocyte growth factor, HGF), 혈소판유래 성장인자 (platelet-derived growth factor, PDGF), 뼈유래 성장인자 (bone-derived growth factor, BDF), 즐기세포 인자 (stem cell factor), 백혈병 억제 인자 (Leukemia inhibitory factor, LIF), 뇌유래 신경성장 인자 (Brain-derived neurotrophic factor, BDNF), 교질세포 유래 신경성장 인자 (Glial- derived neurotrophic factor, GDNF), 액티빈 A (Actinvin A), 노긴 (Noggin), 골형태형성 단백질 2(bone mwphogenetic protein 2, BMP2), 골형태형성단백질 4(bone morphogenetic protein 4, BMP4), 엔지오포이에틴 l(Angiopoietin-l), SHH (sonic hedgehog), Wnt, FLT- 3(FMS-related tyrosine kinase 3 ligand) 및 콜로니 자극 인자 (colony stimulation factor, CSF)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 배지에 배양 가능한 세포로는, 줄기세포, 전구세포 또는
동물세포를 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즐기세포는
배아줄기세포, 성체줄기세포 및 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cdl, iPS)를 포함한다.
성체줄기세포는 배아 발달 단계 이후에도 성체 전반에서 발견되는 미분화된 줄기세포를 의미한다. 이러한 성체줄기세포는 주변조직의 특성에 세포 자신을 맞추어 분화하는 조직특이적 분화능력 (site-specific differentiation)을 가지고 있다.
성체줄기세포는, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방, 골격근, 탯줄, 제대혈 등의 다양한 성체 세포로부터 유래할 수 있다. 구체예로， 중간엽 줄기 세포， 골격근 줄기 세포 (skeletal muscle stem cell), 조혈줄기세포 (hematopoietic stem cell), 신경줄기세포 (neural stem cell), 간 줄기세포 (hepatic stem cell), 지방 유래 줄기 세포 (adipose-derived stem cell), 지방 유래 전구 세포 (adipose-derived progenitor cell), 혈관 내피 전구 세포 (vascular endothelial progenitor cell) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
유도만능줄기세포는 다능성이 없는 성인의 피부세포와 같은 체세포에 역분화를 일으키는 4가지 특정 유전자를 도입한 후 발현시키거나 역분화를
일으키는 4가지 유전자가 도입된 세포에서 만들어진 역분화 유도 단백질을
추출하여 이를 다시 체세포에 주입함으로써 배아 줄기세포와 같은 다능성을 갖는 줄기세포를 만들 수 있는데 이를 유도 다능성 줄기세포 또는 역분화 줄기세포라고 한다. 유도만능줄기세포는 파킨슨병이나 제 1형 당뇨병과 같은 질병으로 인해 손상된 세포들을 대체할 수 있다. 유도만능줄기세포를 이용한 줄기세포치료, 환자들에게서 체세포를 얻어 유도만능줄기세포를 만들어서 생체외에서 분화시킴으로써 여러 가지 질병의 경과를 연구하여 질병 모델, 신약 개발에서의 세포 기반 연구 등에 이용된다. 전구세포는 특정 세포의 형태 및 기능을 갖추기 전 단계의 세포이며， 특정 세포 계통의 세포로 분화되거나 특정 유형의 조직으로 형성될 수 있는 세포로서, 자가재생산능 (self-renewal)은 가지나 극히 제한된 분화능을 갖는 세포를 의미한다. 내배엽 전구세포, 중배엽 전구세포, 및 외배엽 전구세포가모두 이에 포함된다.
동물세포는 인간을 포함한 동물로부터 기원한 기능적 및 구조적 기본 단위이며， 인간을 포함한 동물로부터 기원한 세포이면 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 따라서 본 발명의 동물세포는 이로 제한되는 것은 아니나, 상피세포， 내피세포, 근육세포, 생식세포, 피부 세포 (예로, 섬유아세포, 각질세포), 면역세포， 암세포 등을 포함한다. 구체예로, CHO(Chinese hamster ovary) 세포, NS0(mouse myeloma) 세포,
BHK(baby hamster kidney) 세포, Sp2/0(mouse myeloma) 세포, 인간 망막세포 (human retinal cell), HUVEC 세포, HMVEC 세포, COS-l 세포， COS-7 세포, HeLa세포， HepG-2 세포， HL-60 세포， IM-9 세포， Jurkat 세포, MCF-7 세포 또는 T98G 세포 둥을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 배지에 배양 가능한 세포는， 일차 세포를 포함한다. 일차세포는 세포 배양 시 개체의 기관이나 조직을 떼어내어 배양접시에 바로 배양한 세포를 말한다. 일반적으로 대부분의 세포는 배양접시에 부착하여 성장하게 되는데， 이들 세포는 계속 성장하여 배양접시 바닥에 단층 (monolayer)으로 자라게 되고 이들 세포는 더 이상 부착할 곳이 없는 상태가 되면 증식을 멈추게 되는데, 이렇게 일차세포를 키우는 것을 일차배양이라고 한다. 일차세포를 배양할 경우， 기본 배양액을 이용하여 배양하면 원하는 정도의 세포성장 효과를 얻을 수 없기 때문에 일차세포 성장 배양액을 주로 이용하고 있는데, 현재 상용하는 알차세포 성장 배양액은 수입에 의존하고 있어 기본 배양액의 10배가 넘는 비용부담이 크기 때문에 연구와 실험이 원활하게 진행되지 않는 등 많은 제한이 있어 왔다. 따라서, 본원의 배지 첨가제 조성물 및 이를 포함하는 배지를 이용한 무혈청 배양으로, 기존 혈청보다 저렴하고 효율적인 방법으로 일차 세포를 배양할 수 있다.
이와 같이 다양한 세포들을 배양하기 위해 고려되는 배양 방법은 각 세포를 배양하기 위해 잘 알려진 배양 방법을 따를 수 있다. 【발명의 효과】
본 발명은 무혈청 조건의 배양 시스템에서 세포를 배양 및 증식시킬 수 있는 배지 첨가제를 제공하며, 이를 이용한 세포의 무혈청 배양은 동물성 혈청의 전세계적인 공급 부족 및 우태아 (bovine fetus)로부터의 혈청 수집에 따른 윤리적 문제로부터 자유롭고, 성분이 명확하지 않은 혈청과 달리 세포 활성이 일정하게 조절되도록 명확하게 정의된 (defined) 세포 배양 환경을 구성할 수 있고, 동물성 물질의 오염을 원천적으로 차단함으로써 보다 안전한 세포를 제공할수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 재조합 인간 PXDN를 제조하기 위한 플라스미드 (pCMV-SC-CF-H- WT-PXDN)의 구조를 나타낸다.
도 2a는 야생형의 인간 PXDN (WT), N-말단의 ECM모티프가 결실된 PXDN 변이체 (ΔΝ), 및 페록시다아제 (peroxidase) 도메인이 결실된 PXDN 변이체 (ΔΡ)의 구조를 나타낸다. 도 2b는 상기 야생형 PXDN 및 이의 결실 변이체를 도입한 세포를 안정적으로 발현하는 세포주를 확립하고 그 세포 배양물 (CM)을 PXDN 결핍 세포에 첨가한 후, 세포 증식 정도를 측정하는 과정과 그 결과를 나타내고, 도 2c는 페록시다아제 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3a는 야생형의 인간 PXDN를 발현하는 세포주 (HEK293-H-WT-PXDN)의 세포 배양물로부터 재조합 PXDN 을 정제하는 과정을 나타낸다. 도 3b는 상기 세포 배양물 (CM)에 대한 SDS-PAGE 분석 결과, 상기 세포 배양물로부터 정제된 PXDN 단백질과 P-60 단백질에 대한 SDS-PAGE 분석 결과, 그리고 상기 정제된 PXDN 단백질과 p_60 단백질에 PXDN 항체를 처리한 후의 dot blot 분석 결과를 나타낸다. 도 3c는 정제된 PXDN 단백질에 대하여 비환원 조건 및 환원 조건에서 SDS-PAGE 로 분석한 결과를 나타낸다. 도 3d는 정제된 PXDN 단백질과 P-60 단백질의
퍼옥시다제 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4a는 PXDN 결핍 세포에 재조합 PXDN(rPXDN) 단백질 및 bFGF 를 처리하였을 때 세포 증식 정도를 측정한 결과를 나타낸다. 도 4b 는 PXDN 결핍 세포에 bFGF 를 첨가하지 않고 재조합 PXDN(rPXDN) 단백질을 처리하였을 때 세포 생존 정도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 5a는 HUVEC 세포에 PXDN또는 Collagen IV를 표적으로 하는
siR A(siPXDN, siCol IV) 또는 대조군인 control siRNA(siCTL)를 처리한 다음， bFGF 만 처리하거나 bFGF 및 재조합 PXDN(rPXDN)을 처리하는 과정을 도식화한 그림이다.' 도 5b와 5c는 HUVEC 세포에 PXDN또는 Collagen IV를 표적으로 하는 siRNA또는 대조군인 control siRNA를 처리한후， 세포의 PXDN, Col IV, FN, 또는 LAM에 대한 면역형광염색 결과를 나타낸다 (Scale bar: 20 μιη). 또한, 도 5d는 각 siRNA 처리 후 collgen lV NCl domain의 monomer와 dimer를 검출한 웨스턴 블랏 결과와, 각 siRNA 처리 후 성장 인자로 자극한 경우 ERK1/2 및 FAK 인산화 정도를 검출한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. 도 5e 는 HUVEC 세포에 siPXDN 을 처리하고， bFGF 만 처리하거나 bFGF 및 rPXDN을 처리한 후의 면역형광염색 결과를 나타낸다 (Scale bar: 도 6a는 HUVEC 세포에 bFGF, 정제된 rPXDN 또는 P-60 단백질을 처리한 경우 p-ERKl/2 및 ERK1/2 수준을 측정한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. 도 6b 는 HUVEC, HMVEC, BM-MSC 및 T98G 세포에 bFGF 를 처리하거나 bFGF와 함께 rPXDN 또는 P-60 단백질을 처리한 경우 세포 증식 정도를 측정한 결과를 나타낸다. 도 6c 는 HUVEC 세포에 성장인자 없이 rPXDN또는 P-60 단백질을 처리한 경우 세포 생존 정도를 측정한 결과를 나타낸다. 도 6d 는 HUVEC 세포에 bFGF와 함께 rPXDN 또는 P-60 단백질을 농도별로 처리한 경우 세포 증식 정도를 측정한 결과를 나타낸다. 도 6e는 HUVEC 세포에 다양한 성장 인자 (VEGF 또는 EGF)와 함께 rPXDN 또는 P-60 단백질을 처리한 경우 세포 증식 정도를 측정한 결과를 나타낸다. 도 7a은 cord blood mononuclear cell 유래 iPS 세포에서도 PXDN이 발현되는 것을 관찰한 것이고, 도 7b는 iPS 세포의 feeder free 배양 배지에 rPXDN (100 nM)을 첨가하여 배양하였을 때 촬영한 대표적 세포 사진 (왼쪽)과 세포 증식 정도를 측정한 결과를 그래프로 (오른쪽) 나타낸다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 실시예 1. 세포 배양과 시약
인간 제대정맥 내피세포 (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)는 기존 논문 (Jaffe, Nachman et al. 1973)의 방법에 따라 신생아의 탯줄 조직을 사용하여 분리 하였다. 신생아의 탯줄 조직은 The Catholic University of Korea, College of Medicine (approval No. CUMC09U157)의 Institutional Review Board 승인과 절차를 통해 수집되었다. 인간 미세혈관 내피세포 (human microvascular endothelial cells, HMVECs)와 골수유래 중간엽 줄기세포 (bone marrow-derived mesenchymal stem/stromal cells, BM- MSCs)는 Lonza로부터 구입하여 사용하였다. T98G과 HEK293 세포는 ATCC로부터 구입하였다. 인간 제대정맥 내피세포는 M199 배지에 20 % 혈청 (Gibco), 30 g/ml 내피세포 성장인자 (Endothelial cell growth supplements; BD Biosciences), 90 jig/ml 해파린과 1% 항생제를 첨가하여 배양하였다. 인간 미세혈관 내피세포는
EGM2(endothelial growth medium 2)-MV 배지 (Lonza)에서 배양하였다. 골수유래 중간엽 줄기세포는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지 (Invitrogen)에 20% 혈청과 1% 항생제를 첨가하여 배양하였다. 그 외 다른 세포는 DMEM 배지에 10% 혈청과 1% 항생제를 첨가하여 배양하였다. 실시예 2. 재조합 인간형 PXDN과 결손 변이형 (deletion-mutant) PXDN 발현 플라스미드 백터 제작
Open Biosystems (Cat No BC 140295)으로부터 구입한 인간형 PXDN cDNA를 PCR프라이머 세트 (forward: GCCGCCATGGCCAAGCGCT (서열번호 1), reverse: GGAGGGCTTTTCCTCCGCC (서열번호 2))를 이용하여 PCR을 실시하여 증폭하였고, Mammalian Expression Vector인 pCMV-SC-CF vector (Stratagene)의 클로닝 사이트에 삽입하여, 인간형 PXDN을 발현하는 재조합 플라스미드 (pCMV-SC-CF-H-WT- PXDN)를 제작하였다. Deletion-mutant의 경우는 Bgl II와 Sal I (N-terminal ECM motifs에 해당하는 201 - 2086 bp 제거, ΔΝ) 또는 Sal I과 BspE I (peroxidase domain에 해당하는 2086 - 3317 bp 제거 , ΔΡ) 제한 효소로 플라스미드 (pCMV-SC-CF-H-WT-PXDN)를 절단한 푸, Klenow enzyme (Takara)으로 sticky ends를 채우고 self-ligation 시켜 제작하였다. 삽입된 DNA 염기서열은 sequencing에 의해 확인하였다. 실시예 3. 재조합 인간형 PXDN 단백질의 발현 및 정제
인간형 PXDN 를.발현하는 재조합 플라스미드 (pCMV-SC-CF-H-WT-PXDN) 또는 결손 변이형 PXDN올 발현하는 재조합 플라스미드를 각각 HEK293 세포에 transfection하여 G418 (Sigma) 800 g/ml을 2 주간 처리하여 selection함으로서 PXDN을 발현하는 HEK293 세포를 확보하였다. 이 세포를 80 ~90 %로 confluent 하게 배양하고 무혈청 DMEM 배지에서 24 시간을 더 배양하여 상층액을 취하고 3,000 rpm에서 원심분리하여 conditioned medium (CM)을 회수 하였다. 회수된 CM을 cutoff가 3 kDa 인 filter (Amicon, Millipore)를 사용하여 농죽시킨 후, 20 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0)로 희석하고 다시 농축시키는 작업을 반복하였다. 농축된 단백질 용액을 Q exchange spin column (Thermo Scientific)에 loading 하였고， 25 mM NaCl이 첨가된 20 mM potassium phosphate buffer로 washing한후, column에 결합된 단백질은 l M NaCl이 첨가된 20 mM potassium phosphate buffer를 이용하여 elution하였다. 회수된 단백질 용액의 염의 농도를 조절한 후, Sephacryl S-300 (GE Healthcare)이 충전된 column에 loading하고, 150 mM NaCl이 첨가된 potassium phosphate buffer (pH 7.2 7.5)로 elution 시켜 단백질 크기 별로 분획하였다. Pooling한 용액을 Centricon (cutoff: 100 kDa, Millipore)을 사용하여 농축한 후, endotoxin을 Triton X-1 14로 추출하여 제거하고 SM-2 bead를 처리하여 잔여 Triton X-1 14를 제거하였다 (Aida and Pabst 1990). 정제된 재조합 단백질을 SDS-PAGE와 Coomassie Blue 염색을 통해 확인하였다. 실시예 4. Peroxiase 활성 검사
150 의 CM또는 재조합 PXDN 단백질 용액을 96 well 플레이트에 첨가하고, 50 μL 3,3',5,5'-Tetramethylbenzicline (TMB) substrate solution (Sigma)을
처리하였다. 30 분간 반웅을 시킨 후, ELISA reader (Molecular Devices)를 이용하여 650 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실시예 5. RNA interference and cell transfection
PXDN 또는 Collagen IV를 표적으로 하는 siRNA와 대조군인 control siRNA를 ST pharm사 (Seoul, Korea)로부터 구입하였다. siRNA서열은 다음과 같다: PXDN knockdown; forward, GCAUCAAUGCUGGCAUCUUTT (서열번호 3), reverse,
AAGAUGCCAGCAUUGAUGCTT (서열번호 4), for Col IV knockdown; forward,
CCUCAUCUGUGAUAUAGACGGAUAUTT (서열번호 5), reverse,
AUAUCCGUCUAUAUCACAGAUGAGGTT (서열번호 6), for siCTL; forward;
GUUCAGCGUGUCCGGCGAGTT (서열번호 7), reverse,
CUCGCCGGACACGCUGAACTT (서열번호 8). 세포를 30 cells/mm2 로 plating 하여 24 시간 동안 배양한 후 50 nM의 siRNA를 lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) 를 이용하여 transfection시켰다 . 4 시간 후에 세포를 PBS로 세척한 후 fresh한 배양 배지에서 48 시간 동안 배양하였다. 실시예 6. 세포 증식 검사
세포를 96 well 플레이트에서 24 시간 동안 배양하였다. 적절한 fresh media로 교체 한후 48 시간 동안 배양 하였다 . 20 L MTS reagent(Promega)를 첨가 하여 4 시간 동안 반웅시킨 후, ELISA reader (Molecular Devices)로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 증식 수준을 조사하였다. Complementation assay를 위해， siRNA를 transfection하고 48시간 배양하여 PXDN이 결핍되게 된 내피세포에 재조합 PXDN을 농도 별로 처리 하거나 CM을 처리 하고, 10 ng/ml bFGF 첨가또는 비첨가 조건에서 48 시간 동안 배양 하였다 . siRNA를 처리하지 않은 naive한 세포에 재조합 PXDN을 처리한 실험군에서는 무혈청 배지 조건에서 각각의 세포에 재조합 단백질과 10 ng/ml의 bFGF, EGF 또는 VEGF를 처리하고 48 시간 동안 배양하였다ᅳ 실시예 7. 면역형광염색
세포를 PBS로 세척하고, 100% 메탄올로 5 분간 고정하고, 0.1% Triton X-100올 3 분간 처리하였다. 비특이적 단백질 결합을 차단시키기 위해 5% BSA를 1 시간 동안 처리하였다. 일차 항체를 가해 반웅시키고, PBS로 3회 세척한후 Alexa 488(Invitrogen) 이나 Cy 3(Millipore)가 결합된 이차 항체를 이용하여 2 시간 동안 반응 시켰다. 일차 항체 희석 배율은 다음과 같다: PXDN (1 :500), fibronectin (FN; clone IST-4, 1 : 100, Sigma), Col IV (clone CIV 22, 1 :100， DAKO) 와 laminin (LAM; 1:100, Abeam). 음성 대조군으로 일차 항체 대신 완층용액올 사용 하였다. 슬라이드에 l g/ml DAPI(Sigma)를 가해 핵올 염색하였다. 이미지는 confocal microscope (Zeiss LSM 510 Meta with LSM image examiner software) 를 이용하여 확보하였다. Complementation assay를 위해, siRNA를 transfection하고 48시간 배양시켜 PXDN이 결핍되게 된 내피세포에 재조합 PXDN를 처리하고 10 ng/ml bFGF를 가해 48 시간 동안 배양한 후: 세포를 고정시키고 면역형광 염색을 실시하였다. NIH Image J 프로그램을 이용하여 형광 image를 분석하였다. 실시예 8. NCI sulfilimine crosslink검출
Collagen IV의 NCI domain 내의 sulfilimine crosslinking 수준을 기존에 보고된 논문의 방법에 따라 조사하였다 (Lazar, Peterfi et al. 2015). 각 siRNA를 transfection한 후 72시간 동안 배양시킨 내피세포를 300 mM HEPES buffer(pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 mM benzamidine hydrochloride (Sigma), 1 mM PMSF (Gibco), 1 mM N-ethylmaleimide (Sigma)가 첨가된 hypotonic lysis buffer (10 mM CaC12, 50 mM Hepes, pH7.4)를 가해 세포를 긁어내고 celUysate를 회수하였다. Cell lysate에 0.5 mg/ml collagenase (Gibco)를 가해 37 °C에서 24 시간 동안 반웅시킨 후 western blot을 실시하였다. 일차 항체인 Col IV 2 (Chondrex Inc) 와 horseradish peroxidase (HRP)가 conjugation된 이차 항체를
이용하여 collagen IV NCI domain의 monomer와 dimer를 검출하였다. 실시예 9. Western blot
Lysis buffer [50 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM Na3V04, 50 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mM PMSF, 1 g/ml pepstatin, and protein inhibitor mix (Roche)]를 가해 세포를 용해시킨 후 14,000 rpm 에서 30 분간 원심분리하여 상층액올 확보하였고, 상층액의 일부에 대해 8% SDS-PAGE를 실시한 후, 분리된 단백질들을 nitrocellulose membrane에
transfer하였다. 비특이적 단백질 결합을 차단하기 위해 5 % skim milk 용액으로 1 시간 처리하였고, 일차 항체와 HRP가 conjugation된 이차 항체를 차례대로 반웅시킨 후, ECL kit (Amersham)을 사용하여 면역반웅 단백질 밴드를 검출하였다. 일차 항체로 PXDN, Flag-tag (Abeam), p-actin(Sigma), p-ERKl/2 (Cell Signaling), ERKl/2 (Cell Signaling): p-FAK (R&D Systems) 와 FAK (Millipore)을 사용하였다. 실시예 10. 유도만능줄기세포의 세포증식 검사
10-1 : iPS 세포 배양
Cord blood mononuclear cell에서 유래한 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPS) 세포 (CMC-7)는 가를릭대학교 주지현 교수팀으로부터 분양받았다 (Stem Cells Int. 2016;2016: 1329459). Vitronectin (0.5 ug/ml, Gibco)으로 coating 된 plate에 CMC- 7 세포를 seeding 하여 TeSR-E8 (Stemcell) 배지에서 배양하였다. 24 시간 마다 1 회씩 배지를 교체하여 배양하였다.
10-2: iPS 세포 증식 검사
96 well 플레이트에 0.5 ug/ml의 vitronectin 50 ul를 넣고 4°C에서 coating하였다. 배양된 CMC-7 iPS 세포에 0.05% trypsin-EDTA을 처리한 후 TeSR-E8 배지 5 ml을 가하고 원심분리하였다 (1300 rpm, 5 min). 상층액을 제거한 후 10 uM ROCK inhibitor (Y27632, Sigma)가 첨가된 TeSR-E8 배지에 세포를 현탁시킨 후 세포를 1500 개씩 vitronectin이 coating된 96 well 플레이트에 seeding하여 24 시간 동안 배양 하였다. 그 후, 100 nM rPXDN이첨가된 TeSR-E8 배지를 가하여 120 시간 동안 배양 하였다. 매 24 시간 마다 rPXDN이 첨가된 배지로 교체하여 배양하였다. 그 후, 20 μΐ MTS reagent (Promega)를 첨가 하여 3 시간 동안 반웅시킨 후, ELISA reader (Molecular Devices)로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 증식 수준을 대조군과 비교하여 조사하였다. 실시예 11. 통계분석
데이타는 대표적 실험의 mean ± SEM으로 표시하였다. GraphPad Prism 5
(GraphPad Software) 프로그램에서 one-way ANOVA를 이용하여 비교 분석하였으며 , 사후 검정은 Tukey test로 분석하였다. * p<0.05, ** p<().01, *** ρθ.001.
«실험 결과 >>
1. PXDN 발현 세포주 확립 및 CM의 활성 조사: 결손 변이형과 비교 분석 인간 PXDN cDNA (aa 1-1479)를 mammalian expression plasmid vector (pCMV-SC- CF) 의 cytomegalovirus promoter와 Flag-tag사이에 삽입하여 PXDN서열이 삽입된 재조합 플라스미드 (pCMV-SC-CF-H-WT-PXDN; 도 1)를 제작하였다. PXDN이 다른 peroxidase들과 다르게 immunoglobulin C2 (IgC2)-type domain, leucine-rich repeats (LRR), 그리고 von Willebrand factor type C (vWC)를 포함하는 ECM motif들을 지닌다. 따라서， PXDN이 세포 밖으로 분비되어 CM성분으로 세포 외에서 작용하는지, 그리고 ECM motif와 peroxidase domain이 PXDN 기능에 필수적인지 조사하였다. 재조합
플라스미드 (pCMV-SC-CF-H-WT-PXDN)를 HEK293 세포에 transfection시켜서 재조합 human PXDN (rPXDN)을 발현하는 stable cell line을 확보하였고, 이 세포주를 HEK293- H-WT-PXDN으로 명명하였다. 또한， N-terminal ECM motifs (ΔΝ) 또는 peroxidase domain (ΔΡ)이 결핍된 PXDN 발현 플라스미드를 제작하여 이들에 대해서도 HEK293 세포에 transfection시켜 stable cell line을 확보 하였고, 이 세포주를 각각 ΗΕΚ293-Η-ΔΝ-ΡΧί Ν 및 HEK293-H-AP-PXDN으로 명명하였다 (도 2a).
이 세포주들을 무혈청 배지 (EBM)에서 배양하여 상층액을 회수하여
conditioned medium (CM)을 확보한 후, PXDN siRNA knockdown에 의해 초래된 PXDN 결핍 세포에 가하고 10ng/ml bFGF를 첨가하여 48시간 동안 배양하여 세포 증식을 관찰하였다 (도 2b). Full-length PXDN을 발현하는 HEK293 -H-WT-PXDN CM을 PXDN 결핍 세포에 처리하였을 때， 이들 세포의 세포 증식이 층분히 회복되는 것이 관찰되었지만 , HEK293-H-AN-PXDN 혹은 HEK293-H-AP-PXDN CM에서는 empty vector가 도입된 세포에서 유래된 CM과 같이 세포 증식을 전혀 회복시키지
못하였다 (도 2b).
또한, HEK293-H-AP-PXDN CM과 empty vector CM에서는 peroxidase 활성이 관찰되지 않았고 , HEK293-H-AN-PXDN과 HEK293 -H-WT-PXDN CM에서는 peroxidase 활성이 유사한 수준으로 나타나는 것이 확인되었다 (도 2c). 이러한 결과는 PXDN의 기능에 ECM motif와 peroxidase domain이 모두 필요하며, PXDN 발현 세포주의 CM이 세포 증식 촉진에 활용될 수 있음을 제시한다.
2. rPXDN 단백질 정제
HEK293-H-WT-PXDN 세포주를 배양하여 CM을 확보한 후, 실험 방법에서 설명하였듯이 CM으로부터 음이온교환수지 Q-spin column chromatography와 Sephacryl S-300 size exclusion chromatography를 실시하여 rPXDN 단백질을 정제하였다 (도 3a). 최종적으로 시료 내의 endotoxin을 Triton X-114로 추출하여 제거하고, SM-2 bead을 통하여 잔여 Triton X-114를 제거 하였다. CM과 정제된 단백질을 환원 조건에서 6% SDS-PAGE 분석을 실시하였올 때 정제된 rPXDN 단백질의 크기는 약 170 kDa 이었다 (도 3b). CM 내에 많은 양 존재 하지만 아직 정체가 불분명한 단백질 P-60 (약 60 kDa)도 대조군 단백질로 확보하였다.
PXDN 항체로 dot blot analysis를 실시하여 P-60는 반웅하지 않고, rPXDN만 반응함을 확인하였다. 비환원 조건에서 SDS-PAGE 분석하였을 때 rPXDN의 크기가 대략 500 kDa 정도로 나타나므로, rPXDN이 CM에서 trimer 형태로 존재하는 것으로 추정되었다 (도 3c). 실시된 모든 실험에 사용된 rPXDN의 농도는 monomer 기준으로 산정하였다. 정제된 rPXDN의 peroxidase 활성을 TMB oxidation 방법으로 계측하였을 때, 정제된 rPXDN 농도에 따라 의존적으로 peroxidase 활성이 증가되었다 (도 3d). 따라서, 정제된 rPXDN이 trimer를 형성하고 peroxidase 활성을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다.
3. PXDN-결핍된 내피세포에서 rPXDN에 의한 세포 성장과 생존 회복 세포 외에서 가한 재조합 PXDN 단백질이 PXDN knockdown된 세포의 기능을 보충할 수 있는 지 조사하기 위하여, siRNA knockdown에 의해 형성된 PXDN 결핍 세포에 정제된 rPXDN을 가하여 48시간 동안 배양하였다 (도 4a). rPXDN을 처리하지 않았을 때, PXDN siRNA를 처리하여 초래된 PXDN 결핍 세포의 증식이 대조군 siRNA을 처리한 세포에 비해 확연하게 감소되는 것을 관찰하였다 (도 4a). 반면에, PXDN 결핍 세포에 rPXDN을 처리 하였을 경우, 이들 세포 성장이 rPXDN의 농도에 따라 의존적으로 회복되는 것을 관찰하였다. 이러한 결과는 PXDN이 세포 밖에서 기능하는 것을 뒷받침한다. 뿐만 아니라, PXDN 결핍 세포에 bFGF와 같은 성장인자를 첨가하지 않고 rPXDN만 처리하였을 때, PXDN 결핍세포의 세포 사멸이 rPXDN의 농도에 따라 의존적으로 억제되는 것을 관찰하였다 (도 4b). 이러한 결과들은 정제된 rPXDN이 PXDN 결핍세포의 증식과 생존을 충분히 보상할 수 있음을 제안한다. 4. rPXDN에 의한 PXDN 결핍세포의 Col IV， FN, LAM의 assembly를 통한 fibrillary network 형성의 회복
PXDN이 세포의 pericellular ECM에서 fibrillar network 형성을 위한 assembly에 필요한지 조사 하였다 (도 5a). 우선 PXDN이 결핍된 세포에서 Col IV의 fibrillar network assembly가 현저히 감소되는 것이 관찰되었고, Col IV 내에서 sulfilimine bond에 의해 crosslink되어 형성된 NCI dimer의 비율도 감소되는 것이 관찰되었다 (도 5b 내지 도 5d). 또한 PXDN knockdown은 fibronectin (FN)의 fibrillar network assembly도 현저히 감소시켰고， laminin (LAM)의 assembly도 어느 정도 감소시키는 것이
관찰되었다. Col IV-결핍된 세포에서도 PXDN이 결핍된 세포에서와 유사하게 FN과 LAM의 fibrillar network assembly가 억제되는 것이 관찰되었다. 또한 PXDN의 결핍은 bFGF나 VEGF 유도에 의한 FAK와 ERK1/2의 인산화를 감소시키는 것으로
나타났는데， 이는 아마도 ECM assembly의 손상으로 인한 것으로 추정된다. 또한, 재조합 PXDN이 PXDN 결핍 세포에서 나타나는 ECM assembly 감소를 회복시킬 수 있는지를 조사 하였다. 도 5e에 나타낸 바와 같이 rPXDN은 PXDN이 결핍된 세포에서 나타나는 부실한 Col IV, FN, LAM의 fibrillar network assembly를 회복시킬 수 있었다. 이들 결과는 rPXDN이 세포의 ECM assembly또는 deposit에 작용하여 세포 기능에 필요한 ECM 매개 신호 전달이 잘 될 수 있도록 작용할 수 있음을 제안한다.
5. 무혈청 배지에서 직접적인 ERK1/2 활성화 없이 rPXDN에 의한 세포 증식 촉진
정제된 rPXDN이 무혈청 배지에서 세포의 증식을 촉진하는지 여부를 naive cell을 사용하여 조사하였다. 도 6a와 6b에서 보는 것처럼, 제대정맥 내피세포에 정제된 rPXDN (lOO nM)을 처리하였을 때 내피세포에서 직접적으로 ERK1/2을 activation시키지 않았지만, bFGF 존재 하에 내피세포의 증식을 촉진시키는 것을 관찰하였다. 다른 일차배양 세포들 (HMVECs, BM-MSC)과 상업적으로 확보 가능한 암세포주 (뇌종양 세포주 T98G) 또한 정제된 rPXDN 첨가에 따라 세포 증식이 촉¾되었다. 반면, CM으로부터 정제된 단백질인 P-60의 경우에는 세포의 성장을 촉진시키지 못하였다.
다음으로， 성장인자가 없는 조건에서 rPXDN을 여러 농도로 가해 48시간 배양하여 HUVEC 세포의 생존 및 성장에 미치는 영향을 조사하였을 때, rPXDN이 첨가됨에 따라 농도 의존적으로 세포 생존올 증가시킴을 확인하였다 (도 6c). bFGF 성장인자 첨가 조건에서 rPXDN올 가하여 48 시간 배양하였을 때에는 농도 의존적으로 HUVEC 세포의 증식을 촉진시킴올 확인하였다 (도 6d).
이러한 세포 증식 촉진효과가 bFGF에 특이적인지 아니면 성장인자 종류와 상관없이 나타나는 것인지 조사하기 위해, VEGF 또는 EGF를 가한 조건에서 rPXDN을 가해 HUVEC을 배양하였을 때， P60 단백질은 세포 증식 촉진 효과를 나타내지 않았지만 rPXDN은 현저한 세포 증식 촉진 효과가 있음을 확인할 수 있었다 (도 6e). 따라서, 이러한 결과들은 rPXDN이 줄기세포, 전구 세포 또는 각종 세포 배양올 위한 defined culture medium 에서 성장 및 생존을 촉진시킬 수 있는 보조제로 사용될 수 있음을 나타낸다.
6. Feeder free 배지에서 rPXDN에 의한 iPS 세포 증식 촉진
Cord blood mononuclear cell에서 유래한 iPS 세포가 PXDN을 발현하는 지 조사하기 위해 Western blot을 실시하였을 때, HUVEC 세포와 같이 iPS 세포인 CMC- 7 세포도 PXDN을 발현하는 것을 확인할 수 있었다 (도 7a). 정제된 rPXDN이 무혈청 배지에서 iPS 세포의 증식을 촉진하는지 여부를 조사하였다. 도 7b에서 보는 것처럼， 정제된 rPXDN이 첨가됨에 따라 세포 증식이 촉진되는 것이 관찰되었다. 따라서, 이러한 결과는 rPXDN이 iPS 세포의 feeder free cell culture에 사용될 수 있음을 제안한다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 11
페록시다신 (peroxidasin)을 포함하는, 세포의 무혈청 배양을 위한 배지 첨가제 조성물.
【청구항 2】
거 1 1항에 있어서, 상기 조성물은 페록시다신을 포함하는 재조합 백터, 상기 재조합 백터가 도입된 세포, 상기 세포의 배양물, 또는 정제된 페록시다신을 포함하는 것인 조성물.
【청구항 3]
저 U항에 있어서， 성장인자를 더욱 포함하는 조성물.
【청구항 4]
제 3항에 있어서, 상기 성장인자는 섬유아세포 성장인자 (fibroblast growth factor, FGF), 혈관내피세포 성장인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF), 상피성장인자 (epidermal growth factor, EGF), 결합조직성장인자 (connective tissue growth factor, CTGF), 인술린유사 성장인자 (insulin-like growth factor, IGF), 형질전환 성장 인자 (transforming growth factor, TGF), 신경 성장인자 (nerve growth factor, NGF), 간세포 성장인자
(hepatocyte growth factor, HGF), 혈소판유래 성장인자 (platelet-derived growth factor, PDGF), 뻐유래 성장인자 (bone-derived growth factor, BDF), 줄기세포 인자 (stem cell factor, 백혈병 억제 인자 (Leukemia inhibitory factor, LIF), 뇌유래 신경성장 인자 (Brain-derived neurotrophic factor, BDNF), 교질세포 유래 신경성장 인자 (Glial-derived neurotrophic factor, GDNF), 액티빈 A (Actinvin A), 노긴 (Noggin), 골형태형성 단백질 2(bone morphogenetic protein 2, BMP2), 골형태형성단백질 4(bone morphogenetic protein 4, BMP4): 엔지오포이에틴 l(Angiopoietin-l), SHH (sonic hedgehog), Wnt, FLT-3(FMS-related tyrosine kinase 3 ligand) 및 콜로니 자극 인자 (colony stimulation factor, CSF)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 조성물. '
【청구항 5】
제 3항에 있어서, 상기 성장인자는 염기성 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF)인 조성물.
【청구항 6】
제 1항에 있어서, 상기 세포는 즐기세포， 전구세포 또는 동물세포인, 조성물.
【청구항 7】
제 1항에 있어서, 상기 세포는 일차 세포인, 조성물.
【청구항 8]
제 6항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포 및 유도만능줄기세포인, 조성물.
【청구항 9】
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 배지 첨가제 조성물을 포함하는, 세포의 무혈청 배양용 배지.
【청구항 10】
제 9항의 배지 내에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포의 무혈청 배양 방법.
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