WO2017135631A1 - 세포의 동결보존용 배지 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a cryopreservation medium composition having excellent cell recovery rate, cell viability and cell activity after thawing, and a pharmaceutical composition comprising the medium composition and therapeutic cells.
  • cryopreservation is mainly used as a preservation method that can maintain the characteristics of the cell line for a long time.
  • Cryopreservation can overcome the difficulties of cell culture and maintenance, and can prevent contamination from bacteria or mycoplasma. In addition, it is possible to prevent the transformation of the cell line, as well as to ensure the reproducibility of the experiment and production.
  • a method of protecting cell membranes by adding 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) to a cell culture medium containing serum, and slowly cooling and preserving in liquid nitrogen at -196 ° C is used.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the trace components in the serum have an effect on the growth of the cells, but not only difficult to analyze these components, there is a problem that the components may vary depending on the production time or location.
  • the present inventors have completed the present invention by establishing a cryopreservation medium composition that can be cryopreserved animal cells for a long time, and does not include serum and can be usefully used as a cell therapeutic composition.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition comprising the cryopreservation medium composition.
  • composition of the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer or infectious diseases containing the composition of the present invention and immune cells as an active ingredient.
  • composition of the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative diseases and immune-related diseases containing the composition of the present invention and stem cells as an active ingredient.
  • the composition can be administered directly to the subject after thawing the cryopreserved therapeutic cells without additional procedures such as washing, separation and the like. Therefore, the composition can be used as an excellent cell cryopreservation medium composition or therapeutic composition.
  • Figures 1a to 1d shows the recovery rate (Fig. 1a and 1c) and viability (Fig. 1b) after thawing frozen NK cells with the cryopreservation medium composition of the cells prepared in one embodiment of the present invention and incubated with IL-2 And FIG. 1D).
  • Figures 2a to 2d is a cryopreservation medium composition of the cells prepared in one embodiment of the present invention immediately after thawing the cytotoxicity to K562 cells of NK cells (Fig. 2a and 2b) and after thawing IL-2 It shows the value measured after incubation with (FIGS. 2C and 2D).
  • Figure 3a and Figure 3b shows the number of cells (FIG. 3a) and viability (FIG. 3a) measured after culturing for 3 days after thawing HuT78 cells frozen in the cryopreservation medium composition of the cells prepared in one embodiment of the present invention ).
  • FIG. 4A and 4B show the number of cells (FIG. 4A) and viability (FIG. 4B) measured after culturing for 3 days after thawing K562 cells frozen with the cell cryopreservation medium composition prepared in one embodiment of the present invention.
  • FIG. Indicates.
  • the present invention relates to 15 to 55 v / v% albumin, 20 to 30 v / v% dextran, 2 to 8 v / v% dimethylsulfoxide and 15 to 55% v / v%
  • a cryopreservation medium composition of cells comprising a cell culture medium.
  • cryopreservation refers to keeping cells stable over long periods of time through freezing.
  • Cells are usually mutated at about one in ten thousand in culture.
  • cell passage may change into a cell group different from the original cell group, and in some cases, specific functions possessed by the cell may be lost. It may also be infected with mycoplasma or the like during subculture. Due to this problem, the cells are cryopreserved to freeze and preserve the cells before they are lost, and to be taken out and used when needed.
  • Cryopreservation of cells is performed by treating cryoprotectants to cells to be frozen, and the compositions of the present invention comprise albumin, dextran, dimethylsulfoxide and cell culture medium to prevent cell damage by cryoprotectants.
  • the cryopreservation of cells safety and stability were improved.
  • freeze inhibitor is a substance used to store cells in cryogenic conditions of -80 ° C to -200 ° C.
  • the material can minimize the damage of the cells due to the formation of ice crystals and imbalance of ions and osmotic pressure inevitably accompanying the freezing and thawing process.
  • albumin refers to the whole or part of human albumin that is biologically active or human albumin.
  • the albumin may be used as an animal-free alternative that is equivalent to or better than serum in cryopreservation and is added to the cryopreservation composition to stabilize cells.
  • the albumin has an Accession Number of ANC98520.1 in GenBank of the US National Institutes of Health, and an amino acid sequence which shows 70% or more, specifically 80% or more, more specifically 95% or more, 98% or more similarities with the protein. It can include both.
  • the amino acid sequence having the same or equivalent biological activity as the albumin it may also include protein variants having an amino acid sequence of which some sequences are deleted, modified, substituted or added.
  • the content of albumin included in the composition of the present invention may be 15 to 55 v / v%, specifically 18 to 40 v / v%, more specifically 20 to 35 v / v% based on the volume of the total composition.
  • the content of albumin may be 20 v / v%, 35 v / v% or 50 v / v% with respect to the total composition.
  • the v / v% means the volume percentage of each component to the volume of the total composition.
  • the term "dextran” refers to a polysaccharide that is a polymer of D-glucose.
  • the dextran may be classified as Dextran 1, Dextran 40, Dextran 70, etc. according to the weight average molecular weight.
  • the dextran may be dextran 40.
  • the amount of dextran included in the composition of the present invention may be 20 to 30 v / v%, specifically 23 to 27 v / v%, based on the total volume of the composition. According to one embodiment of the invention, the content of dextran may be 25 v / v% with respect to the total composition.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the content of dimethyl sulfoxide included in the composition of the present invention may be 2 to 8 v / v%, specifically 4 to 6 v / v%, based on the total volume of the composition. According to an embodiment of the present invention, the content of dimethyl sulfoxide may be 5 v / v% with respect to the total composition.
  • cell culture medium is a mixture for growth and proliferation of cells in vitro , including elements essential for the growth and proliferation of cells, such as sugars, amino acids, various nutrients, minerals, and the like. Means. Cell culture media can be optimized for specific cell cultures, such as basal culture media formulated to support cell growth, cell culture production media formulated to promote protein production from cells, and high concentrations of nutrients. There is a concentrated medium.
  • Components which may be included in the cell culture medium include glycerin, L-alanine, L-arginine hydrochloride, L-cysteine hydrochloride-monohydrate, L-glutamine, L-histidine hydrochloride-monohydrate, L-lysine hydrochloride, L-methionine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-valine, L-asparagine-monohydrate, L-aspartic acid, L-cystine 2HCl, L-glutamic acid, L-isoleucine, L-leucine, L -Phenylalanine, L-tryptophan, L-tyrosine disodium salt dihydrate, i-inositol, thiamine hydrochloride, niacinamide, pyridoxine hydrochloride, biotin, D-pantothenate calcium, folic acid, riboflavin, vitamin B12, sodium chlor
  • the cell culture medium according to the present invention may be prepared artificially or used commercially.
  • Examples of commercially available cell culture media include Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), Basic Medium Eagle (BME), RPMI1640, F-10, F-12, and ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal). Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), cellgro SCGM, X-VIVO, AIM-V, and others.
  • the content of the culture medium may be 15 to 55 v / v%, specifically 30 to 52 v / v%, relative to the volume of the total composition. According to one embodiment of the present invention, the content of the culture medium may be 20 v / v%, 35 v / v% or 50 v / v% with respect to 100 v / v% of the total composition.
  • the cells that can be preserved with the cryopreservation composition of the present invention may be animal cells, but any cell that can be stably cryopreserved by the composition of the present invention may be used.
  • the cells may be cells derived from humans, monkeys, pigs, horses, cattle, sheep, dogs, cats, mice, rabbits, and the like, and specifically, immune cells, tumor cells, cord blood cells, stem cells derived from the animals. , Epithelial cells, primary cells, and the like.
  • cryopreservation composition of the present invention may further comprise a buffer, tonicity agent or apoptosis inhibitor.
  • the buffer may be any one selected from the group consisting of citrate, phosphate, succinate, tartrate, fumarate, gluconate, oxalate, lactate, acetate, histidine and tris.
  • the tonicity agent is from the group consisting of sodium chloride, potassium chloride, boric acid, sodium borate, mannitol, glycerin, propylene glycol, polyethylene, glycol, maltose, sucrose, erythritol, arabitol, xylitol, sorbitol trihalose and glucose It may be any one selected.
  • the apoptosis inhibitor may be any one selected from the group consisting of ROCK (Rho-associated kinase) inhibitor, catalase, and zVAD-fmk.
  • the present invention provides a cell cryopreservation method comprising the step of freezing the cells to which the cryopreservation composition according to the present invention is added.
  • the freezing of cells to which the cryopreservative composition of the present invention is added may be performed through a conventional method, and examples thereof include vitrification freezing and slow freezing.
  • Vitrification freezing is a method of freezing the cells by controlling the temperature at a constant rate per minute using equipment such as controlled rate freezing (CRF). When the temperature reaches -80 ° C, the frozen cells are stored in a nitrogen tank.
  • slow freezing is a vial containing a cryopreservation composition containing the cells in a freezing container box containing isopropyl alcohol, the temperature is constantly dropped for 12 to 24 hours in a cryogenic freezer below -70 °C How to freeze. The frozen cells are then stored in a liquid nitrogen tank.
  • the cell cryopreservation method may be vitrification freezing.
  • the vitrification freezing is performed using CRF, 1) cooling the cells at room temperature to 4 ° C; 2) cooling to ⁇ 8 ° C., ⁇ 1 ° C. per minute; 3) cooling to -65 ° C, -25 ° C per minute; 4) heating to ⁇ 14 ° C., 15 ° C. per minute; 5) cooling to -45 ° C, -1 ° C per minute; And 6) cooling to ⁇ 90 ° C. at ⁇ 10 ° C. per minute.
  • the cell cryopreservation method may be performed by including a proper concentration of cells in a vial.
  • the concentration of the cells may be 1x10 4 to 1x10 8 cells / ml, specifically 1x10 5 to 1x10 7 cells / ml, but is not limited thereto.
  • the concentration may vary depending on the type of cells.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or infectious disease containing the composition of the present invention and immune cells as an active ingredient.
  • the composition is the same as the cryopreservation medium composition of the cells described above.
  • the cell culture medium which may be included when used as a pharmaceutical composition is preferably a medium containing no toxic substances such as serum, phenol red or ⁇ -mercaptoethanol. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention is not human toxic, and can be directly administered to a subject after thawing.
  • the term "immune cell” is a cell involved in the immune response of the human body includes natural killer cells, T cells, B cells, dendritic cells and the like. Specifically, the immune cells may be natural killer cells.
  • the cancer may be bladder cancer, breast cancer, stomach cancer, lung cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, cervical cancer, central nerve cancer, glioblastoma, liver cancer, skin cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, esophageal cancer, kidney cancer, lung cancer, epithelial cancer, blood cancer, Prostate cancer, soft tissue sarcoma, multiple sclerosis, and the like.
  • infectious disease refers to a pathological condition caused by infection of a virus or pathogen, and includes all diseases that can be transmitted or infected through respiratory, blood, skin contact, and the like.
  • infectious diseases include, but are not limited to, hepatitis B and C, human papilloma virus (HPV) infection, cytomegalovirus infection, viral respiratory disease, influenza, and the like. .
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative diseases containing the composition of the present invention and stem cells as an active ingredient.
  • the composition is the same as the cryopreservation medium composition of the cells described above.
  • the cell culture medium which may be included when used as a pharmaceutical composition is preferably a medium containing no toxic substances such as serum, phenol red or ⁇ -mercaptoethanol. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention is not human toxic, and can be directly administered to a subject after thawing.
  • stem cell refers to a cell having pluripotency capable of differentiating into various cells.
  • the stem cells may include human embryonic stem cells, bone marrow stem cells, mesenchymal stem cells, human neural stem cells, oral mucosa cells and the like.
  • the stem cells may be mesenchymal stem cells.
  • degenerative disease refers to a pathological condition in which the tissue loses its original function due to irreversible quantitative loss of the tissue.
  • the degenerative diseases include, but are not limited to, neurological diseases of the brain, ischemic diseases, skin damage, bone diseases, degenerative arthritis, and the like.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of immune diseases containing the composition of the present invention and stem cells as an active ingredient.
  • immune disease refers to any pathological condition in which tissue is damaged due to an excessive or undesired immune response. Accordingly, the term “immune disease” has the same meaning as “hyperimmune disease” and “composition for the prevention or treatment of immune disease” has the same meaning as “immune inhibitor”.
  • Such immune diseases include, but are not limited to, graft-versus-host disease, graft rejection, chronic inflammatory disease, inflammatory pain, neuropathic pain, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and autoimmune disease. .
  • autoimmune disease refers to a pathological condition caused by immune cells attacking themselves without distinguishing themselves from foreign substances.
  • the autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosis, Hashimoto's thyroiditis, Grave's disease, multiple sclerosis, and scleroderma.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive in addition to the active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may be formulated in a unit dosage form suitable for administration in the body of a patient according to conventional methods in the pharmaceutical art.
  • Formulations suitable for this purpose include solutions or suspensions for injection as parenteral preparations, or ointments as preparations for topical administration.
  • diluents or excipients such as fillers, weights, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants and the like commonly used may be used together.
  • the dosage of the composition may be about 1 ⁇ g to 50 mg per kg of body weight based on the total composition, and the dosage of therapeutic cells such as immune cells and stem cells is 1 day, 1 to 10 days per adult. 8 , 10 to 10 5 , 10 2 to 10 3 can be.
  • the administration may be administered once to several times a day. However, the dosage and frequency of administration may be determined in consideration of factors such as the extent of the disease, the route of administration as well as the weight, age and sex of the patient.
  • cryopreservation media composition 5 ml of DMSO, 25 ml of dextran 40, 50 ml of albumin and 20 ml of RPMI1640 as cell culture medium were mixed (Example 1).
  • dimethyl sulfoxide DMSO, BIONICHE PHARMA, USA
  • Dextran 40 Korea Pharmaceutical Industry, Korea
  • Albuminju Green Cross, Korea
  • RPMI1640 Gibco, USA
  • cryopreservation medium composition As a comparative example to the above example, 5 ml of DMSO and 95 ml of albumin was mixed to prepare a cryopreservation medium composition (Comparative Example 1). Comparative Examples 2 to 6 in the same manner as described above also in the content as shown in Table 1 dimethyl sulfoxide (DMSO, BIONICHE PHARMA, USA), dextran 40 (Korea Pharmaceutical Industry, Korea), albuminju (Green Cross, Korea ) Or cryopreservation media composition comprising RPMI1640 (Gibco, USA).
  • Example 1 Example 2 Example 3 Comparative Example 1 Comparative Example 2 Comparative Example 3 Comparative Example 4 Comparative Example 5 Comparative Example 6 DMSO (v / v%) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Dextran 40 (v / v%) 25 25 25 - 25 25 25 25 25 25 25 Albumin Agriculture (v / v%) 50 35 20 95 70 10 5 One 0 RPMI1640 (v / v%) 20 35 50 - - 60 65 69 70
  • cryopreservation medium composition After freezing NK cells with the cryopreservation medium composition prepared in Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 6, thawing them, the cryopreservation medium composition was evaluated.
  • monocytes were isolated from human peripheral blood (Seoul National University Hospital, Korea). In the isolated monocytes, CD3-positive cells were removed using CliniMACS system and used as seed cells. On the other hand, monocytes gamma-irradiated at 2,000 cGy were used as supporting cells for NK cell culture. Seed and feeder cells were 0.5 ⁇ 10 6 cells / in CellGro® SCGM medium (CellGenix, Germany) containing 500 IU / ml IL-2, anti-CD3 antibody 10 ⁇ g / ml OKT3 and 1 v / v% plasma. Cultures were maintained at a concentration of ml to 1 ⁇ 10 6 cells / ml. The culture was carried out for 14 to 21 days at 37 °C, 5% CO 2 conditions.
  • the cultured NK cells were collected and centrifuged for 10 minutes at 4 ° C and 1,500 rpm. The pellet was washed with RPMI1640 medium and the number of cells was counted. After dispensing into a 15 ml tube to 1x10 8 cells, it was centrifuged under the same conditions as above to obtain pellets. The obtained pellets were frozen with the cryopreservation compositions prepared in Examples 1-3 and Comparative Examples 1-6.
  • the frozen cells were stored in a vapor LN2 tank for a period of time to perform cell freezing. Frozen cells were taken out and thawed rapidly in a 37 ° C. constant temperature bath. Cells were suspended by adding RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum, corresponding to 10 times the cell volume, and centrifuged at 4 ° C. and 1,200 rpm for 10 minutes to obtain cells.
  • CRF controlled rate freezing
  • the obtained cells were resuspended in RPMI1640 medium containing 500 IU / ml IL-2 and 10% fetal bovine serum to a concentration of 2 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • Ten milliliters of the resuspended cells were dispensed into T75 flasks, and on the third day of culture, an equal amount of medium was added and cultured for 7 days.
  • the viable cell number and viability of the cultured NK cells were measured according to the manufacturer's manual using an ADAM cell counter Accustain kit (DigitalBio).
  • the cells cultured in Experimental Example 1.2 were counted and diluted with PBS to a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • the diluted cells were dispensed into two wells of rounded 96 well plates, each 14 ⁇ l.
  • 14 ⁇ l of a T solution capable of measuring the total cell number was added, mixed with the diluted cells, and 14 ⁇ l of which was placed in a T panel of the counter chip.
  • 14 ⁇ l of an N solution capable of measuring the number of dead cells was added to another well, mixed with the diluted cells, and 14 ⁇ l of the N solution was added to the N panel of the counter chip.
  • the chip was inserted into an ADAM counter and the number of viable cells was measured and the results are shown in FIGS. 1A-1D.
  • FIGS. 1A and 1C show the number of viable cells after incubation with IL-2 after thawing based on the number of cells in the vial upon freezing. It is shown in Tables 3 and 4 below.
  • the survival rate expressed as a percentage of the viable cells based on the total cell number, shown in Table 5 and Table 6 below.
  • tumor cells were treated by treating NK cells to confirm tumor cell killing ability.
  • the activity of NK cells obtained immediately after thawing in Experimental Example 1.1 and NK cells obtained after culturing in Experimental Example 1.2 were evaluated, respectively.
  • tumor cells K562 cells (ATCC, USA) were cultured in 37%, 5% CO 2 conditions in RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum. The cultured cells were collected by trypsin treatment and then suspended in the culture medium to a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / ml. 1 mM calcein AM (Life Technologies, USA) was added to a final concentration of 30 ⁇ . The cells were incubated at 37 ° C., 5% CO 2 conditions for 1 hour to label tumor cells with fluorescence.
  • the labeled tumor cells were washed with 10 ml of culture medium, resuspended to a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml, and 100 ⁇ l were dispensed into rounded 96 well plates.
  • the cells obtained immediately after thawing and after culturing in Experimental Example 1.1 and Experimental Example 1.2 were used for NK cells (effector cells, E) and K562 cells (target cells, T).
  • the ratios were mixed so that 10: 1, 3: 1, 1: 1 and 0.3: 1 were added, and 100 ⁇ l was added thereto.
  • spontaneous release added the same amount of media to tumor cells, and maximum release added the same amount of 2% Triton X-100 to tumor cells.
  • the cytotoxicity to tumors was cytotoxic compared to the Examples when the albumin content was 10% or less or 70% or more. Found to be low.
  • freezing activated immune cells decreases cell activity and decreases the function of immune cells.
  • thawed cells maintain different activities depending on the composition of the freezing medium.
  • Example 3 it was confirmed that the highest NK cell activity when thawed after freezing.
  • cryopreservation medium composition prepared in Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 6 can also be used for freezing tumor cells.
  • HuT78 human T lymphoma cells HuT78 (ATCC, USA) and human leukemia cells K562 (ATCC, USA) were 37 ° C. and 5% CO 2 in RPMI1640 medium containing 10% fetal calf serum or 20% fetal calf serum, respectively. Cultured under conditions. After the cultured cells were recovered and suspended in each culture medium, HuT78 cells were frozen in a vial at a concentration of 1 ⁇ 10 7 cells / ml and K562 cells at a concentration of 4 ⁇ 10 6 cells / ml. Cell freezing was performed as described in Experimental Example 1.1 above. The frozen cells were resuspended in each culture medium and aliquoted to a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / ml and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 4 days.
  • the cultured cells were measured by the same method as Experimental Example 1.3 and the number of cells survived and the survival rate. Viable cell numbers and viability for HuT78 cells are shown in FIGS. 3A and 3B and the same results for K562 cells are shown in FIGS. 4A and 4B.
  • the tumor cells, HuT78 and K562 cells were similar in the cryopreservation medium composition of Examples 1 to 3 and the cryopreservation medium composition of Comparative Example 2 were similar in viable cell number and viability. appear.
  • the cryopreservation medium composition of Comparative Example 1 showed a significantly lower viable cell number and survival rate.

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Abstract

본 발명은 해동 이후의 세포 회수율, 세포 생존율 및 세포 활성이 우수한 세포의 동결보존용 배지 조성물, 및 상기 배지 조성물과 치료용 세포를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 배지 조성물은 세척, 분리 등과 같은 추가적인 절차 없이 동결보존된 치료용 세포를 개체에 바로 투여할 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 우수한 세포 동결보존용 배지 조성물 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있다.

Description

세포의 동결보존용 배지 조성물 및 이의 용도
본 발명은 해동 이후의 세포 회수율, 세포 생존율 및 세포 활성이 우수한 세포의 동결보존용 배지 조성물, 및 상기 배지 조성물과 치료용 세포를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
동물세포를 배양하는 방법의 발전과 더불어, 이는 단백질 의약품의 생산을 포함하는 다양한 분야의 생물학적 연구에 널리 적용되고 있다. 동물세포를 이용하여 단백질 의약품을 생산할 때, 장기간 동안 세포주의 특성을 유지할 수 있는 보존방법으로 동결보존(cryopreservation)이 주로 사용되고 있다.
동결보존을 통해 세포 배양 및 유지의 어려움을 극복할 수 있고, 세균이나 마이코플라즈마(mycoplasma) 등으로부터의 오염을 방지할 수 있다. 또한, 세포주의 형질전환을 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 실험 및 생산의 재현성을 확보할 수 있다.
일반적으로, 동결보존 과정에서 동물세포는 세포손상을 입게 되는데, 세포가 낮은 온도에 노출되면서 세포 내의 기관과 세포 기능에 장애가 발생하게 된다. 따라서, 동결보존 후에 세포의 동일성을 확보하기 위해서는 세포에 따른 특성과 생존율을 유지할 수 있는 동결보존 방법의 개발과 검증이 실시되어야 한다.
동물세포를 동결보존하는 일반적인 방법으로는 혈청이 포함된 세포 배양용 배지에 10% 다이메틸설폭사이드(DMSO)를 첨가하여 세포막을 보호하고, 서서히 냉각하여 -196℃ 액체질소에서 보존하는 방법이 사용된다. 그러나, 상기와 같은 방법은 혈청이 갖는 문제점으로 인해 단백질 생산 등의 공정에서 사용 빈도가 감소하고 있다. 또한, 혈청 내 미량 성분들은 세포의 성장에 영향을 미치고 있으나, 이들 성분의 분석이 어려울 뿐만 아니라, 생산 시기나 장소에 따라 그 성분이 달라질 수 있는 문제가 있다.
또한, 혈청은 대부분 동물 유래이고, 사람으로부터 유래되었다고 하더라도 바이러스 등에 의한 감염에 노출되어 있다. 따라서, 이를 포함하는 조성물을 세포 치료제와 같이 직접적인 치료 약물로 사용하는 데에는 안전성의 문제가 있다.
이에, 본 발명자들은 동물세포를 장기간 동결보존할 수 있고, 혈청을 포함하지 않아 세포치료제의 조성으로 유용하게 사용할 수 있는 동결보존용 배지 조성물을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 세포의 동결보존용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 동결보존용 배지 조성물을 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 총 조성물에 대하여, 15 내지 55 v/v%의 알부민, 20 내지 30 v/v%의 덱스트란, 2 내지 8 v/v%의 다이메틸설폭사이드 및 15 내지 55% v/v%의 세포 배양 배지를 포함하는 세포 동결보존용 배지 조성물을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 조성물 및 면역세포를 유효성분으로 함유하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 조성물 및 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 질환 및 면역관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 세포 동결보존용 배지 조성물 내에서 세포를 동결시키면, 세포 해동하였을 때 해동된 세포의 생존율이 높을 뿐만 아니라 세포의 활성도 유지된다. 또한, 상기 조성물은 세척, 분리 등과 같은 추가적인 절차 없이 동결보존된 치료용 세포를 해동 후에 개체에 바로 투여할 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 우수한 세포 동결보존용 배지 조성물 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있다.
도 1a 내지 도 1d는 본 발명의 일 실시예에서 제조한 세포의 동결보존용 배지 조성물로 동결한 NK 세포를 해동하고 IL-2로 배양한 후 회수율(도 1a 및 도 1c) 및 생존율(도 1b 및 도 1d)을 나타낸다.
도 2a 내지 도 2d는 본 발명의 일 실시예에서 제조한 세포의 동결보존용 배지 조성물로 동결한 NK 세포의 K562 세포에 대한 세포 독성을 해동 직후(도 2a 및 도 2b) 및 해동 후 IL-2로 배양한 후(도 2c 및 도 2d)에 측정한 값을 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 일 실시예에서 제조한 세포의 동결보존용 배지 조성물로 동결한 HuT78 세포를 해동 후 3일 동안 배양한 뒤에 측정한 세포의 수(도 3a) 및 생존율(도 3b)을 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명의 일 실시예에서 제조한 세포 동결보존용 배지 조성물로 동결한 K562 세포를 해동 후 3일 동안 배양한 뒤에 측정한 세포의 수(도 4a) 및 생존율(도 4b)을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 총 조성물에 대하여, 15 내지 55 v/v%의 알부민, 20 내지 30 v/v%의 덱스트란, 2 내지 8 v/v%의 다이메틸설폭사이드 및 15 내지 55% v/v%의 세포 배양 배지를 포함하는 세포의 동결보존용 배지 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "동결보존(cryopreservation)"은 동결을 통해 장기간에 걸쳐 세포를 안정하게 유지시키는 것을 의미한다. 세포는 일반적으로 배양과정에서 일만 개 중에 한 개 정도의 비율로 돌연변이가 일어난다. 또한, 장기간에 걸쳐 세포의 계대를 계속하면, 본래의 세포집단과는 다른 세포집단으로 변할 수 있고, 심하게는 세포가 가진 특정 기능이 소실되는 경우도 있다. 또한, 계대배양 중 마이코플라스마 등에 감염될 수도 있다. 이러한 문제점으로 인하여 세포의 고유한 특성이 소실되기 전에 세포를 동결시키고 이를 보존하며 필요 시에 꺼내어 사용할 수 있도록 세포의 동결 보존을 수행한다.
세포의 동결보존은 동결시키고자 하는 세포에 동결억제제를 처리함으로써 수행되며, 본 발명의 조성물은 동결억제제에 의한 세포 손상을 막기 위하여, 알부민, 덱스트란, 다이메틸설폭사이드 및 세포 배양 배지를 포함하여, 세포의 동결보존에 있어 안전성 및 안정성을 향상시켰다.
이에 사용된 용어 "동결억제제"는 세포를 -80℃ 내지 -200℃의 초저온 상태에서 보관할 때 사용되는 물질이다. 특히, 상기 물질은 동결과 해동과정에서 필연적으로 동반되는 얼음 결정의 형성과 이온 및 삼투압의 불균형에 따른 세포의 손상을 최소화할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "알부민(albumin)"은 인간 알부민의 전체 또는 생물학적 활성이 있는 인간 알부민의 일부분을 의미한다. 상기 알부민은 동결보존에 있어 혈청과 동등하거나 더 우수한 무동물성(animal-free) 대체제로서 사용될 수 있으며, 동결보존용 조성물에 첨가되어 세포를 안정화시키는 역할을 한다.
상기 알부민은 미국 국립 보건원의 GenBank에서 Accession Number가 ANC98520.1일 수 있고, 상기 단백질과 70% 이상, 구체적으로 80% 이상, 더욱 구체적으로 95% 이상, 가장 구체적으로 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열을 모두 포함할 수 있다. 또한, 상기 알부민과 동일하거나 이에 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 알부민의 함량은 총 조성물의 부피에 대해 15 내지 55 v/v%, 구체적으로 18 내지 40 v/v%, 보다 구체적으로는 20 내지 35 v/v%일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 알부민의 함량은 총 조성물에 대해 20 v/v%, 35 v/v% 또는 50 v/v%일 수 있다. 이때, 상기 v/v%는 총 조성물의 부피에 대한 각 성분의 부피 백분율을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "덱스트란(dextran)"은 D-글루코스의 중합체인 다당류를 의미한다. 상기 덱스트란은 중량 평균 분자량에 따라 덱스트란 1, 덱스트란 40, 덱스트란 70 등과 같이 분류할 수 있다. 일 실시예로 상기 덱스트란은 덱스트란 40일 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 덱스트란의 함량은 총 조성물의 부피에 대해 20 내지 30 v/v%, 구체적으로 23 내지 27 v/v%일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 덱스트란의 함량은 총 조성물에 대해 25 v/v%일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)"는 세포막 투과성 동결보존제로 사용되며, 세포막을 투과하여 세포 내 수분을 치환하고 냉동시 얼음 결정이 형성되는 것을 억제한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 다이메틸설폭사이드의 함량은 총 조성물의 부피에 대해 2 내지 8 v/v%, 구체적으로 4 내지 6 v/v%일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 다이메틸설폭사이드의 함량은 총 조성물에 대해 5 v/v%일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "세포 배양 배지"는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 무기질 등과 같이 세포의 성장 및 증식에 필수적인 요소를 포함하는, 시험관 내(in vitro)에서 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다. 세포 배양 배지는 특정 세포 배양을 위해 최적화될 수 있으며, 그 예로는 세포 성장의 지지를 위해 조제된 기본 배양 배지, 세포로부터 단백질 생산을 촉진하도록 조제된 세포 배양 생산 배지, 영양소들을 고농도로 농축시켜 만든 농축 배지가 있다.
상기 세포 배양 배지에 포함될 수 있는 성분은 글리세린, L-알라닌, L-아르기닌 하이드로클로라이드, L-시스테인 하이드로클로라이드-모노하이드레이트, L-글루타민, L-히스티딘 하이드로클로라이드-모노하이드레이트, L-리신 하이드로클로라이드, L-메티오닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-발린, L-아스파라긴-모노하이드레이트, L-아스파르트산, L-시스틴 2HCl, L-글루탐산, L-이소류신, L-류신, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-티로신 디소듐염 디하이드레이트, i-이노시톨, 티아민 하이드로클로라이드, 나이아신아미드, 피리독신 하이드로클로라이드, 바이오틴, D-판토텐산칼슘, 엽산, 리보플라빈, 비타민 B12, 염화나트륨(NaCl), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 염화칼륨(KCl), 염화칼슘(CaCl2), 인산수소나트륨 모노하이드레이트(NaH2PO4-H2O), 황산동 펜타하이드레이트(CuSO4-5H2O), 황산제이철 헵타하이드레이트(FeSO4-7H2O), 염화마그네슘(무수), 황산마그네슘(MgSO4), 인산수소이나트륨(Na2HPO4), 황산아연 헵타하이드레이트(ZnSO4-7H2O), D-글루코즈(덱스트로즈), 소듐 피루베이트, 히포크산틴 Na, 리놀렌산, 리포산, 푸트레신 2HCl 및 티미딘으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 세포 배양 배지는 인위적으로 제조하여 사용하거나, 상업적으로 시판되는 것을 사용할 수 있다. 상업적으로 시판되고 있는 세포 배양 배지의 예는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), cellgro SCGM, X-VIVO, AIM-V 등이 있다.
상기 배양 배지의 함량은 총 조성물의 부피에 대해 15 내지 55 v/v%, 구체적으로 30 내지 52 v/v%일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 배양 배지의 함량은 총 조성물 100 v/v%에 대하여 20 v/v%, 35 v/v% 또는 50 v/v%일 수 있다.
본 발명의 동결보존용 조성물로 보존할 수 있는 세포는 동물세포일 수 있으나, 본 발명의 조성물에 의하여 안정적으로 동결보존될 수 있는 세포라면 모두 사용가능하다. 상기 세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등으로부터 유래한 세포일 수 있고, 구체적으로는 상기 동물로부터 유래한 면역세포, 종양세포, 제대혈 세포, 줄기세포, 상피세포, 1차 배양세포(primary cell) 등일 수 있다.
또한, 본 발명의 동결보존용 조성물은 완충제, 등장화제 또는 세포사멸 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 완충제는 시트레이트, 포스페이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트, 히스티딘 및 트리스로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 한편, 상기 등장화제는 염화나트륨, 염화칼륨, 붕산, 붕산나트륨, 만니톨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌, 글리콜, 말토스, 자당, 에리쓰리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 트리할로즈 및 포도당으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 상기 세포사멸 억제제는 ROCK(Rho-associated kinase) 억제제, 카탈라아제(catalase) 및 zVAD-fmk로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 동결보존용 조성물을 첨가한 세포를 동결시키는 단계를 포함하는 세포 동결보존 방법을 제공한다.
본 발명의 동결보존용 조성물을 첨가한 세포의 동결은 통상적인 방법을 통하여 수행될 수 있으며, 그 예로는 유리화 동결, 완만 동결 등이 있다. 유리화 동결은 CRF(controlled rate freezing)와 같은 장비를 이용하여 1분당 일정한 속도로 온도를 조절하여 세포를 동결시키는 방법으로, -80℃에 도달하면 동결된 세포를 질소 탱크에 보관한다. 한편, 완만 동결은 세포가 포함된 동결보존용 조성물이 담긴 바이알을 이소프로필 알코올이 담긴 냉동용 컨테이너 박스에 넣고, -70℃ 이하의 초저온 냉동고에서 12시간 내지 24시간 동안 온도를 일정하게 떨어뜨려 세포를 동결시키는 방법이다. 이후, 동결된 세포는 액체 질소 탱크에 보관한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 세포 동결보존 방법은 유리화 동결일 수 있다. 상기 유리화 동결은 CRF를 사용하여, 1) 상온의 세포를 4℃로 냉각하는 단계; 2) 분당 -1℃ 씩, -8℃로 냉각하는 단계; 3) 분당 -25℃ 씩, -65℃로 냉각하는 단계; 4) 분당 15℃ 씩, -14℃로 승온하는 단계; 5) 분당 -1℃ 씩, -45℃로 냉각하는 단계; 및 6) 분당 -10℃ 씩, -90℃로 냉각하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 세포 동결보존 방법은 적정 농도의 세포를 바이알에 포함하여 수행할 수 있다. 상기 세포의 농도는 바이알 당 1x104 내지 1x108 cell/㎖, 구체적으로 1x105 내지 1x107 cell/㎖일 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 상기 농도는 세포의 종류에 따라 달라질 수 있다.
본 발명은 본 발명의 조성물 및 면역세포를 유효성분으로 함유하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 상기 서술된 세포의 동결보존용 배지 조성물과 동일하다. 다만, 약학 조성물로 사용되는 경우에 포함될 수 있는 세포 배양 배지는 혈청, 페놀레드 또는 β-머캅토에탄올과 같이 독성물질이 포함되지 않은 배지인 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 인체 독성이 없어, 해동 후 개체에 직접 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "면역세포"는 인체의 면역반응에 관여하는 세포로 자연살해세포, T 세포, B 세포, 수지상세포 등이 있다. 구체적으로, 상기 면역세포는 자연살해세포일 수 있다.
상기 암은 방광암, 유방암, 위암, 폐암, 난소암, 갑상선암, 자궁경부암, 중추신경암, 교아종, 간암, 피부암, 췌장암, 위암, 대장암, 직장암, 식도암, 신장암, 폐암, 상피암, 혈액암, 전립선암, 연조직육종, 다발성 경화증 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "감염성 질환"은 바이러스 또는 병원균의 감염을 원인으로 하는 병적상태를 의미하고, 이는 호흡기, 혈액, 피부접촉 등을 통해 전염 또는 감염될 수 있는 질환을 모두 포함한다. 상기 감염성 질환의 예는 B형 및 C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus, HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환, 인플루엔자 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물 및 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 상기 서술된 세포의 동결보존용 배지 조성물과 동일하다. 다만, 약학 조성물로 사용되는 경우에 포함될 수 있는 세포 배양 배지는 혈청, 페놀레드 또는 β-머캅토에탄올과 같이 독성물질이 포함되지 않은 배지인 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 인체 독성이 없어, 해동 후 개체에 직접 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "줄기세포(stem cell)"는 다양한 세포로 분화가 가능한 전분화능을 갖는 세포를 의미한다. 상기 줄기세포는 인간배아줄기세포, 골수줄기세포, 중간엽줄기세포, 인간신경줄기세포, 경구막점막세포 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "퇴행성 질환"은 조직의 비가역적인 양적 소실로 인하여 해당 조직이 원래의 기능을 상실하는 병적 상태를 의미한다. 상기 퇴행성 질환은 뇌신경질환, 허혈성 질환, 피부손상, 골질환, 퇴행성 관절염 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물 및 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "면역질환"은 과도하거나(excessive), 원치않는(undesired) 면역반응을 원인으로 조직이 손상되는 모든 병적 상태를 의미한다. 따라서, 상기 용어 "면역질환"은 "면역과다 질환"과 동일한 의미를 가지며, "면역질환의 예방 또는 치료용 조성물"은 "면역 억제제"와 동일한 의미를 가진다.
상기 면역질환은 이식편대 숙주질환, 이식편 거부반응, 만성 염증성 질환, 염증성 통증, 신경병성 통증, 만성 폐색성 호흡기 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) 및 자가면역 질환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어 "자가면역질환"은 면역 세포가 자신과 외부물질을 구별하지 못하고 자신을 공격하여 발생하는 병적 상태를 의미한다. 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 전신성홍반성낭창(systemic lupus erythematosis), 하시모토씨 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 그레브스 병(Grave's disease), 다발성경화증(multiple sclerosis), 경피증(Scleroderma), 중증근무력증(myasthenia gravis), 제1형 당뇨(type I diabetes), 알레르기성 뇌척수염(allergic encephalomyelitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 백반증(vitilligo), 베제트병(Becet's disease), 크론병(Crohn's disease), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 혈소판 감소성 자반증(thrombocytopenic purpura), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune anemia), 부신백질이영양증(adrenoleukodystrophy, ALD) 및 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus, SLE)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 약학 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 국소 투여용 제제로서 연고제 등이 있다. 본 발명의 조성물을 제형화할 때, 일반적으로 사용되는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 함께 사용할 수 있다.
상기 조성물의 1회 투여량은 전체 조성물 기준으로 체중 1 ㎏ 당 약 1 ㎍ 내지 50 ㎎일 수 있고, 면역세포 및 줄기세포 등의 치료용 세포의 투여량은 성인을 기준으로 1일, 1 내지 108, 10 내지 105, 102 내지 103개일 수 있다. 상기 투여는 1일 1회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 상기 투여량 및 투여 횟수는 질병의 정도, 투여 경로뿐만 아니라 환자의 체중, 연령 및 성별 등과 같은 인자를 고려하여 결정할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예, 비교예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 비교예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 내지 3. 동결보존용 배지 조성물의 제조
동결보존용 배지 조성물을 제조하기 위해, 5 ㎖의 DMSO, 25 ㎖의 덱스트란 40, 50 ㎖의 알부민주 및 세포배양배지로서 20 ㎖의 RPMI1640을 혼합하였다(실시예 1). 상기와 같은 방법으로 실시예 2 및 3 또한 하기 표 1에 기재된 바와 같은 함량으로 다이메틸설폭사이드(DMSO, BIONICHE PHARMA, 미국), 덱스트란 40(대한약품공업, 한국), 알부민주(녹십자, 한국) 및 RPMI1640(Gibco, 미국)을 포함하는 동결보존용 배지 조성물을 제조하였다.
비교예 1 내지 6. 동결보존용 배지 조성물의 제조
상기 실시예에 대한 비교예로서, 5 ㎖의 DMSO 및 95 ㎖의 알부민주를 혼합하여 동결보존용 배지 조성물을 제조하였다(비교예 1). 상기와 같은 방법으로 비교예 2 내지 6 또한 하기 표 1에 기재된 바와 같은 함량으로 다이메틸설폭사이드(DMSO, BIONICHE PHARMA, 미국), 덱스트란 40(대한약품공업, 한국), 알부민주(녹십자, 한국) 또는 RPMI1640(Gibco, 미국)을 포함하는 동결보존용 배지 조성물을 제조하였다.
실시예 1 실시예 2 실시예 3 비교예 1 비교예 2 비교예 3 비교예 4 비교예 5 비교예 6
DMSO(v/v%) 5 5 5 5 5 5 5 5 5
덱스트란 40(v/v%) 25 25 25 - 25 25 25 25 25
알부민주(v/v%) 50 35 20 95 70 10 5 1 0
RPMI1640(v/v%) 20 35 50 - - 60 65 69 70
실험예 1. 동결 및 해동 후, NK 세포 평가
1.1. NK 세포의 동결 및 해동
상기 실시예 1 내지 3, 비교예 1 내지 6에서 제조된 동결보존용 배지 조성물로 NK 세포를 동결한 뒤, 이를 해동하여, 상기 동결보존용 배지 조성물을 평가하였다.
먼저, 인간의 말초혈액(서울대학교병원, 한국)에서 단핵구를 분리하였다. 분리된 단핵구에서 CliniMACS 시스템을 이용하여 CD3 양성인 세포를 제거하고, 이를 시드(seed) 세포로써 사용하였다. 한편, 2,000 cGy로 감마선 조사한 단핵구는 NK 세포 배양을 위한 지지세포로써 사용하였다. 시드세포 및 지지세포를 500 IU/㎖의 IL-2, 항 CD3 항체인 10 ㎍/㎖의 OKT3 및 1 v/v% 혈장을 포함하는 CellGro® SCGM 배지(CellGenix, 독일)에서 0.5x106 cell/㎖ 내지 1x106 cell/㎖의 농도를 유지하며 배양하였다. 배양은 37℃, 5% CO2 조건으로 14 내지 21일간 하였다.
상기 배양된 NK 세포를 모아 4℃, 1,500 rpm의 조건으로 10분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 RPMI1640 배지로 세척하고, 세포의 수를 계수하였다. 1x108개의 세포가 되도록 15 ㎖ 튜브에 분주한 뒤, 이를 상기와 동일한 조건으로 원심분리하여 펠렛을 수득하였다. 수득된 펠렛을 실시예 1 내지 3, 비교예 1 내지 6에서 제조된 동결보존용 조성물로 동결하였다.
세포를 하기 표 2에 기재된 조건으로 CRF(controlled rate freezing) 후, 동결된 세포를 베이퍼 LN2 탱크(vapor LN2 tank)에서 일정기간 동안 보관하여 세포 동결을 수행하였다. 동결된 세포를 꺼내어 37℃ 항온 수조에서 빠르게 해동하였다. 여기에 세포 부피의 10배에 해당하는, 10% 우태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지를 첨가하여 세포를 현탁하고, 이를 4℃, 1,200 rpm의 조건으로 10분간 원심분리하여 세포를 수득하였다.
0 단계 End Temp. +4℃
1 단계 End Temp. -8℃; Slope -1℃/분
2 단계 End Temp. -65℃; Slope -25℃/분
3 단계 End Temp. -14℃; Slope +15℃/분
4 단계 End Temp. -45℃; Slope -1℃/분
5 단계 End Temp. -90℃; Slope -10.00℃/분
1.2. NK 세포의 배양
상기 수득한 세포를 500 IU/㎖의 IL-2 및 10% 우태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지에 2x106 cell/㎖의 농도가 되도록 재현탁하였다. 재현탁된 세포 10 ㎖을 T75 플라스크에 분주하고, 배양 3일째에 동량의 배지를 추가하여 7일간 배양하였다.
1.3. 생존 세포 수 및 생존율 확인
상기 배양한 NK 세포의 생존 세포 수 및 생존율은 ADAM cell counter Accustain kit(DigitalBio)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하여 측정하였다.
먼저, 상기 실험예 1.2에서 배양한 세포를 계수하여 1x106 cell/㎖의 농도가 되도록 PBS로 희석하였다. 희석된 세포를 14 ㎕씩 바닥이 둥근 96 웰 플레이트의 2개의 웰에 각각 분주하였다. 상기 2개의 웰 중 하나에는 총 세포 수를 측정할 수 있는 T 용액(solution) 14 ㎕를 첨가하여 희석된 세포와 섞어준 뒤, 이중 14 ㎕를 취하여 계수기 칩(chip)의 T 패널에 넣었다. 한편, 죽은 세포 수를 측정할 수 있는 N 용액을 다른 하나의 웰에 14 ㎕ 첨가하여 희석된 세포와 섞어준 뒤, 이중 14 ㎕를 취하여 계수기 칩의 N 패널에 넣어주었다. 상기 칩을 ADAM 계수기에 삽입하고 생존 세포 수를 측정하여 그 결과를 도 1a 내지 도 1d에 나타내었다.
도 1a 및 도 1c에서 동결한 세포의 해동 후 IL-2로 배양한 후 회수율은, 동결 시 바이알(vial) 내의 세포 수를 기준으로 해동 후 IL-2로 배양한 후 생존 세포 수를 백분율로 나타내었고, 이를 하기 표 3 및 표 4에 나타내었다.
평균 표준편차
비교예1 36 2
비교예2 60 5.8
실시예1 72 18.1
실시예2 82 6.2
실시예3 85 27.6
　 평균 표준편차
실시예 3 78.5 13.6
비교예 3 67.6 23.1
비교예 4 58.9 2.4
비교예 5 57.8 20.8
비교예 6 45.0 6.5
한편, 도 1b 및 도 1d에서 동결한 세포의 해동 후 IL-2로 배양한 후 생존율은, 총 세포 수를 기준으로 생존 세포 수를 백분율로 나타내었고, 이를 하기 표 5 및 표 6에 나타내었다.
평균 표준편차
비교예1 42 23
비교예2 67 13
실시예1 76 6
실시예2 80 11
실시예3 79 7
　 평균 표준편차
실시예 3 72 6
비교예 3 68 15
비교예 4 66 11
비교예 5 66 9
비교예 6 65 11
도 1a 내지 도 1d 및 상기 표 3 내지 표 6에 나타난 바와 같이, 배양 7일 후 실시예 1 내지 3의 동결보존용 배지 조성물을 사용하였을 때 세포의 회수율 및 생존율이 70% 이상으로 높게 나타났다. 반면, DMSO와 알부민주를 포함(비교예 1), DMSO, 덱스트란 40과 알부민주를 포함(비교예 2), DMSO, 덱스트란 40, 15 v/v% 미만의 알부민주와 RPMI1640을 포함하는(비교예 3 내지 6) 동결보존용 배지 조성물은 낮은 세포 회수율 및 생존율을 보였다.
1.4. NK 세포 활성 평가
실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 6의 동결배지에서 동결하고 해동한 NK 세포의 세포 활성을 확인하기 위하여, 종양 세포에 NK 세포를 처리하여 종양 세포 살상능을 확인하였다. 이때, 실험예 1.1에서 해동 직후 수득한 NK 세포와 실험예 1.2에서 배양 후 수득한 NK 세포의 활성을 각각 평가하였다.
먼저, 종양 세포인 K562 세포(ATCC, 미국)는 10% 소태아 혈청이 포함된 RPMI1640 배지에서 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 상기 배양한 세포를 트립신 처리하여 회수한 뒤, 1x106 cell/㎖의 농도가 되도록 상기 배양 배지로 현탁하였다. 여기에 1 mM calcein AM(Life Technologies, 미국)을 최종 농도가 30 μM이 되도록 첨가하였다. 상기 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양하여 종양 세포를 형광으로 표지하였다.
표지된 종양 세포를 10 ㎖의 배양 배지로 세척한 뒤, 1x105 cell/㎖의 농도가 되도록 재현탁하여 바닥이 둥근 96 웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주하였다. 여기에 상기 실험예 1.1 및 실험예 1.2에서 해동 직후 및 배양 후 수득한 세포를, NK 세포[이펙터 세포(effector cell, E)] 및 K562 세포[표적 세포(target cell, T)]에 대한 수의 비율이 10:1, 3:1, 1:1 및 0.3:1이 되도록 혼합하여, 이를 100 ㎕씩 첨가하였다. 이때, 자발적인 방출(spontaneous release)은 종양 세포에 동량의 배지를, 최대 방출(maximun release)은 종양 세포에 동량의 2% 트리톤X-100을 첨가하였다.
이를 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시킨 뒤, 4℃에서 2,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 100 ㎕의 상층액을 검은 웰 플레이트로 옮겨 385 ㎚/450 ㎚의 조건에서 형광측정기로 형광을 측정하였다. 얻어진 형광 측정값을 이용하여 하기 수학식 1로 NK 세포에 의한 종양 세포의 용해율(%)을 계산하여, 도 2a 내지 도 2d에 나타내었고, 이를 하기 표 7 내지 표 10에 나타내었다. 표 7에서 자연살해세포 공여자 n은 6이고, 표 8에서 자연살해세포 공여자 n은 3이다.
Figure PCTKR2017000859-appb-M000001
해동 직후 비교예1 비교예2 실시예1 실시예2 실시예3
E10 44 60 59 65 76
E3 22 32 32 42 52
E1 8 13 12 17 24
E0.3 2 4 9 7 8
해동 직후 실시예 3 비교예 3 비교예 4 비교예 5 비교예 6
E30 90 84 82 77 66
E10 65 53 50 47 37
E3 33 24 21 21 16
E1 13 10 7 9 6
E0.3 5 5 2 3 4
배양 후 비교예1 비교예2 실시예1 실시예2 실시예3
E10 84 87 86 86 88
E3 68 82 77 76 77
E1 45 61 52 46 45
E0.3 17 28 21 19 18
배양 후 실시예 3 비교예 3 비교예 4 비교예 5 비교예 6
E30 84 81 84 82 80
E10 83 82 82 77 73
E3 76 71 67 65 56
E1 50 41 35 34 29
E0.3 22 14 13 14 10
도 2a 및 도 2b와 상기 표 7 및 표 8에 나타난 바와 같이, 동결된 세포를 해동한 직후, 종양에 대한 세포독성은 알부민 함량이 10% 이하이거나 70% 이상일 경우 실시예와 비교해서 세포독성이 낮은 것으로 나타났다. 일반적으로 활성화된 면역세포를 동결하면 세포의 활성이 감소되어 면역세포의 기능이 감소되는 것으로 알려져 있지만 동결배지 조성에 따라 해동된 세포의 활성이 다르게 유지됨을 확인할 수 있었다. 특히, 실시예 3의 경우 동결 후 해동했을 때 가장 높은 NK 세포 활성을 유지함을 확인할 수 있었다.
반면, 동결된 세포를 일정 기간 동안 배양한 뒤, 종양 세포에 대한 세포독성을 확인한 결과는, 도 2c 및 도 2d와 상기 표 9 및 표 10에 나타난 바와 같이, 모든 실시예 및 비교예에서 유사한 것으로 나타났다. 이는 세포를 배양하는 과정에서 배지에 첨가된 IL-2에 의해 감소된 NK 세포의 활성이 회복되었기 때문인 것으로 판단된다.
실험예 2. 해동 후, 종양 세포 평가
상기 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 6에서 제조한 동결보존용 배지 조성물이 종양 세포의 동결에도 사용할 수 있는지 여부를 확인하였다.
먼저, 인간 T 림프종 세포인 HuT78(ATCC, 미국) 및 인간 백혈병 세포인 K562(ATCC, 미국)는 각각 10% 우태아 혈청 또는 20% 우태아 혈청이 포함된 RPMI1640 배지로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 상기 배양한 세포를 회수하여 각각의 배양 배지로 현탁한 후, HuT78 세포는 1x107 cell/㎖의 농도로, K562 세포는 4x106 cell/㎖의 농도로 바이알에 넣어 동결하였다. 세포 동결은 상기 실험예 1.1에 서술된 바와 동일하게 수행하였다. 상기 동결한 세포는 각각의 배양 배지로 재현탁하여 1x106 cell/㎖의 농도가 되도록 분주하여 4일간 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
상기 배양한 세포는 상기 실험예 1.3과 동일한 방법으로 생존한 세포 수 및 생존율을 측정하였다. HuT78 세포에 대한 생존 세포 수 및 생존율은 도 3a 및 도 3b에, K562 세포에 대한 동일한 결과는 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.
그 결과, 도 3a 내지 도 4b에 나타난 바와 같이 종양 세포인 HuT78 및 K562 세포는 실시예 1 내지 3의 동결보존용 배지 조성물과 비교예 2의 동결보존용 배지 조성물에서 생존 세포 수 및 생존율이 유사한 것으로 나타났다. 반면, 비교예 1의 동결보존용 배지 조성물은 현저히 낮은 생존 세포 수 및 생존율을 나타내었다.

Claims (16)

  1. 총 조성물의 부피에 대하여, 15 내지 55 v/v%의 알부민, 20 내지 30 v/v%의 덱스트란, 2 내지 8 v/v%의 다이메틸설폭사이드 및 15 내지 55 v/v%의 세포 배양 배지를 포함하는 세포 동결보존용 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 알부민이 18 내지 40 v/v%로 포함되는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 덱스트란이 23 내지 27 v/v%로 포함되는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 다이메틸설폭사이드가 4 내지 6 v/v%로 포함되는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 30 내지 52 v/v%로 포함되는 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포가 동물세포인, 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 동물세포가 면역세포인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 면역세포가 자연살해세포인, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 세포와 함께 대상체에 직접 투여되는 것인, 조성물.
  10. 제1항의 조성물을 첨가한 세포를 동결시키는 단계를 포함하는, 세포 동결보존 방법.
  11. 제1항의 조성물 및 면역세포를 유효성분으로 함유하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 면역세포가 자연살해세포인, 약학 조성물.
  13. 제1항의 조성물 및 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 줄기세포가 중간엽줄기세포인, 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 퇴행성 질환이 뇌신경질환, 허혈성 질환, 피부손상, 골질환 및 퇴행성 관절염으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 조성물.
  16. 제1항의 조성물 및 중간엽줄기세포를 유효성분으로 함유하는 이식편대 숙주질환, 이식편 거부반응, 자가면역질환, 만성 염증성 질환, 염증성 통증, 신경병성 통증 및 만성 폐색성 호흡기 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)으로 구성된 군으로부터 선택되는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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