WO2017167914A1 - Procédé d'extraction de glycolipides et glycolipides obtenus - Google Patents

Procédé d'extraction de glycolipides et glycolipides obtenus Download PDF

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WO2017167914A1
WO2017167914A1 PCT/EP2017/057601 EP2017057601W WO2017167914A1 WO 2017167914 A1 WO2017167914 A1 WO 2017167914A1 EP 2017057601 W EP2017057601 W EP 2017057601W WO 2017167914 A1 WO2017167914 A1 WO 2017167914A1
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WO
WIPO (PCT)
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glycolipids
phase
water
apolar
polar
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Ceased
Application number
PCT/EP2017/057601
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English (en)
Inventor
Clément CELLIER
Jean-Baptiste DELAFOSSE
Romain KOENIG
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oleon NV
Original Assignee
Oleon NV
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Filing date
Publication date
Application filed by Oleon NV filed Critical Oleon NV
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Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D11/00—Solvent extraction
    • B01D11/04—Solvent extraction of solutions which are liquid
    • B01D11/0426—Counter-current multistage extraction towers in a vertical or sloping position
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS OR COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings or cooking oils
    • A23D9/007—Other edible oils or fats, e.g. shortenings or cooking oils characterised by ingredients other than fatty acid triglycerides
    • A23D9/013—Other fatty acid esters, e.g. phosphatides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B11/00—Recovery or refining of other fatty substances, e.g. lanolin or waxes

Definitions

  • the present invention relates to a new process for the purification of glycolipids by liquid / liquid extraction in which the first liquid phase, called polar, is a solution consisting mainly of an alcohol and water in which the raw material has been previously dissolved, and the second liquid phase, called apolar phase, consists mainly of an organic solvent of low dielectric constant, for example an alkane.
  • the invention also relates to a mixture of glycolipids obtained by this process.
  • Biotensioactives formed from simple raw materials such as vegetable oils or sugars offer similar or better performance than fossil surfactants, while having a lower environmental impact and toxicity, and better biodegradability. It is therefore quite natural for the actors of the field to present for several years new results on the synthesis of these biotensioactives by fermentation or enzymatic way, and on the characterization of their performances in the purified state, whether for applications in cosmetic, agriculture, environment, or pharmaceutical.
  • the purification of the glycolipids is of a high technical complexity, because of the presence of other lipids to be separated, such as fatty acids, triglycerides, esters of fatty acids, with a slight difference between the physico-chemical properties of the lipid impurities and glycolipids.
  • This complexity is even greater than the process of synthesis of the crude raw material rich in glycolipids is the result of a process of enzymatic transformation or fermentation, which causes the formation of many co-products, especially color responsible. , and requires the presence of salts, various nutrients, and biomass.
  • the techniques available for the fractionation of lipids include evaporation and in particular evaporation in a very large vacuum, such as short-path distillation, membrane processes such as nanofiltration, crystallization or precipitation, techniques based on chromatography. and liquid-liquid extraction.
  • the exploitation of the liquid-liquid extraction is complicated by the surfactant properties of the glycolipids, and by the hydrophobicity of the molecule. Under these conditions a simple mixture of water and organic solvent can not be used, because it would lead to no visible splitting between the different lipid classes, or even depending on the quantities involved could lead to the formation of two emulsified liquid phases difficult to separate. It is therefore necessary to define two liquid phase compositions that are not miscible and are easily separable despite the presence of a large amount of biotensioactives, to ensure a selective separation between the lipids and ensure the absence of stable emulsion.
  • EP 1 813 664 EP describes the preparation of an oil enriched in glycosphingolipids or US 201 1/019073 for extracting lipids from a mass of microalgae without damaging them. These processes are complex, with steps of heating the raw material.
  • the products obtained are complex oils enriched in glycolipids, but do not make it possible to obtain purified glycolipids, essentially glycolipids (at least 90%) and triglycerides and fatty acids in very small proportions (less than 1% and less than 5%). % respectively).
  • the application WO 2004/020647 describes a process for the preparation of mannosylerythritol lipids (MELs) in which the isolation of the product from the biomass is by simple dissolution in ethanol from the solid fractions previously obtained by heating to more than 100 ° C and liquids likely to contain the MELs, then evaporation of ethanol, that is to say without special purification to remove residual hydrophobic impurities such as triglycerides or fatty acids.
  • MELs mannosylerythritol lipids
  • the application JP 2007-252280 describes a method of isolating MELs in the form of solid beads from the fermentation must and a high content of fatty acids in the recovered product.
  • a process for extracting glycolipids from a vegetable oil is described in application EP 1 027 413.
  • the polar lipid content in the extract obtained does not exceed 50%, of which less than 80% of glycolipids .
  • the techniques for fractionating glycolipids by extraction with carbon dioxide under supercritical conditions are described in application EP 1 222 009.
  • the method comprises a number of steps that are too important for the industrial purification of purified biosurfactants, and the extracted phase. is very dilute, less than 1% solutes, despite an extremely high operating pressure of 250 bar.
  • the present invention relates to a novel process for the purification of glycolipids by liquid / liquid extraction from a raw material comprising the glycolipids to be purified and hydrophobic impurities such as triglycerides and fatty acids or fatty acid derivatives, characterized in that it includes the successive stages of i. dissolving the raw material in a polar phase comprising at least one C2-C3 alcohol and water to dissolve the glycolipids and the hydrophobic impurities, then
  • the weight ratio alcohol / water in the polar phase ranging from 2/1 to 5/1.
  • the method according to the invention is particularly suitable for the purification of mannosylerythritol lipids (MELs) as glycolipids, in particular obtained by fermentation, more particularly obtained by fermentation of vegetable oils, for example peanut oil, coconut oil, coconut oil. rapeseed, olive oil, palm oil, soybean oil or sunflower oil.
  • MELs mannosylerythritol lipids
  • the invention also relates to a mixture of glycolipids obtained by this process, in particular whose characteristics are the following, the contents being expressed in mass and out of water:
  • the present invention relates to a novel method for purifying glycolipids by liquid / liquid extraction from a raw material comprising the glycolipids to be purified and hydrophobic impurities such as triglycerides and fatty acids, characterized in that it comprises the successive steps of
  • Step i) of dissolution makes it possible to eliminate at this stage the residual solids such as traces of cellular or protein residues.
  • the C2-C3 alcohol is chosen from ethanol, isopropanol and mixtures thereof in all proportions, advantageously ethanol being predominant in the ethanol / isopropanol mixture, more preferably an ethanol / isopropanol mixture comprising more 70% ethanol, advantageously more than 80% ethanol, preferably more than 90% ethanol.
  • the C2-C3 alcohol is pure ethanol.
  • the polar phase is thus defined as the solution constituted at least by the C2-C3 alcohol mixture and water, as well as the glycolipids and the impurities it contains following the dissolution of the raw material.
  • apolar organic solvent or apolar extraction solvent
  • organic solvent of low dielectric constant the term includes for example hydrocarbons but excludes water and alcohols C2-C3.
  • the apolar phase is thus defined as the solution constituted mainly by the apolar organic solvent, as well as by the impurities extracted during the contacting of the apolar phase with the polar phase.
  • the content of impurities in the polar phase decreases during contacting.
  • the process according to the invention is particularly suitable for a raw material rich in glycolipids whose glycolipid content represents at least 25% of the dry matter, advantageously at least 35% of the dry matter, generally from 20 to 60% or more 60% according to the dry matter.
  • the insoluble content in the polar solvent is lower than the glycolipid content, advantageously less than 20% of the dry matter, preferably less than 15% of the dry matter.
  • These raw materials generally comprise, in addition to the glycolipids to be purified, hydrophobic impurities such as triglycerides and fatty acids, which can represent up to 75% of the dry matter.
  • the weight ratio alcohol / water in the polar phase ranges from 2/1 to 5/1, preferably from 2.5 / 1 to 4/1, advantageously from 2.5 to 3.5.
  • Those skilled in the art will be able to determine the water content in the polar phase used in step i. to allow both a good dissolution of the glycolipids, then to promote a good transfer of hydrophobic impurities in the apolar phase. It will take into account in particular the possible presence of water in the raw material.
  • Step i. dissolution of glycolipids also causes the dissolution of hydrophobic impurities such as triglycerides and fatty acids (so-called free fatty acids). Dissolution methods are well known to those skilled in the art.
  • the dissolution can be carried out continuously or discontinuously, by adding the mixture of alcohol and water to the raw material to dissolve, or vice versa.
  • Mixing of the streams will be implemented for example in a stirred tank equipped with stirring means ensuring an axial or radial flow, but preferably axial or even more preferably a mixed flow through the use of suitable mobiles, for example blades inclined at 45 °, or by the use of two superimposed mobiles, one axial and the other radial.
  • the stirring time must be sufficient to obtain a liquid phase of homogeneous appearance, staging of the stirring in two successive tanks can also be considered to ensure homogeneity and have a buffer capacity.
  • the raw material to be dissolved is fed into the mixture of alcohol and water with stirring.
  • the raw material is present in a form equivalent to a solid, for example a viscous or gelled paste, it will be fed in the form of particles, the average size of which will be reduced by one of the methods known by the art. skilled in the art, such as extrusion or pumping through a reduced-size pipe.
  • the process for synthesizing the raw material rich in glycolipids is conducted in such a way that the raw material rich in glycolipids is fluid or even comparable to a liquid.
  • the dissolution of the raw material in the dilution solvent is carried out continuously using a continuous mixing technology in pipe, for example the technology marketed by SULZER CHEMTECH under the name SMI.
  • the raw material rich in glycolipids and lipids is diluted in the mixture of alcohol and water rather than in the apolar organic solvent before the liquid-liquid extraction step, which limits the exposure to the apolar organic solvent and the risks of rejection of this solvent.
  • the amount of mixture of alcohol and added water does not exceed five times the amount of raw material to be treated, and preferably does not exceed twice the amount of raw material to be treated.
  • the mixture of alcohol and water contains up to a few percent of apolar organic solvent, if it is previously saturated. This is particularly the case when it is recycled and has already been used for the extraction stage.
  • the polar phase consisting of the raw material diluted in the mixture of alcohol and water can be treated by centrifugation, filtration, flocculation, coagulation or adsorption, or any combination of these techniques, to remove traces of residual biomass from the process of synthesis of the raw material, as well as if necessary any residual protein disorder in the solution.
  • An advantageous mode of implementation The invention consists in treating a raw material that is free of biomass and proteins by means of a suitable harvesting method at the end of the synthesis.
  • the apolar organic solvent is advantageously chosen from alkanes on the one hand, or hydrocarbons of plant origin such as terpenes on the other hand.
  • the alkanes the apolar organic solvent is advantageously chosen from cyclohexane, n-heptane, butane or pentane under pressure, in the liquid state.
  • the hydrocarbons of plant origin the apolar organic solvent may be chosen from terpenes, such as the isomers of limonene, pinene, or any natural mixture consisting mainly of these species.
  • An advantageous embodiment of the invention also consists in using the product of the hydrogenation of these terpenes, for example para-menthane rich fractions obtained by hydrogenation of limonene-rich fractions, as an apolar extraction solvent.
  • the apolar organic solvent, the alcohol and a portion of the water used in the context of the invention are recycled and reused for the most part for the fractionation of the following batch of raw material, said fractionation being preferably made of continuous way.
  • the consumption of solvent and alcohol on the process is limited, so that the total amount of solvent and alcohol consumed is at least less than the mass of purified glycolipids, preferably less than one tenth of the mass of glycolipids purified.
  • the polar phase comprising the glycolipids is brought into contact with the apolar extraction solvent under conditions such that the transfer of the hydrophobic impurities from the polar phase to the apolar phase is facilitated (step ii.).
  • Those skilled in the art are well acquainted with the different methods of contacting immiscible liquid phases for the industrial implementation of liquid / liquid separation methods. These methods can be performed discontinuously (or "batch") or continuously.
  • the conditions necessary for effective transfer from one phase to another include in particular an intimate mixing of the phases so that the contact area between the two liquids is increased.
  • This intimate mixing of the phases can be carried out by mechanical stirring, in particular in a stirred tank or column, for example, or by counter-current circulation in a column packed with perforated trays, or various loose packing elements, for example Raschig, Pall or Nutter rings, or Berl or Intalox saddles, or structured packing elements consisting of an assembly of plates corrugated to the dimensions of the column.
  • These elements will for example consist of plastic or metal, the choice of material to be governed by the nature of the continuous phase in the column.
  • the choice of the so-called continuous phase is carried out by means of preliminary agitation tests on polar and apolar phase samples.
  • the continuous phase is chosen so that the speed of Decantation and formation of a clear interface is minimized after stopping agitation.
  • RETreybal Liquid Extraction", Second Edition, Editions Mc-Graw Hill
  • RHPerry LARobbins and RWCusack (Chapter 15 of the Perry's Chemical Engineering Handbook, Eighth Edition, also edited by Me Graw Hill).
  • the operating conditions are also chosen such that the volume or flow rate of apolar extraction solvent required to achieve glycolipid purity greater than 95% is minimized. That is, the equipment or separation method used ensures, or simulates in the case of a batch process in a stirred tank for example, a countercurrent flow of the two liquid phases.
  • the extract constituted by the apolar phase at the column outlet was in contact with the polar phase with little depletion so that the content of impurities in the extract is maximized.
  • the raffinate constituted by the polar phase at the column outlet was in contact with the apolar phase with little impurity enrichment, so that the quality of the raffinate is maximized.
  • the effectiveness of a countercurrent flow in a liquid-liquid extraction device is dependent on the technology used, the operating conditions such as flow rate or stirring intensity, and physicochemical properties. phases such as interfacial tension and viscosity.
  • the efficiency of a given equipment under given conditions is currently characterized by the concept of theoretical stages of separation, measurable by dedicated tests performed on a ternary system whose phase balance is known. In the context of the invention described here the number of theoretical stages of separation to be implemented is chosen between 2 and 15, preferably between 5 and 10.
  • the advantage of a device against the current with high efficiency is double because it decreases the flow of extraction solvent required to achieve a given purity, but also increases the glycolipid yield because the glycolipid content in the recovered apolar phase little depends on the efficiency implemented.
  • apolar phase is in contact in the column with a polar phase whose glycolipid concentration is relatively constant.
  • the weight ratio of apolar organic solvent is from 0.2 to 3 times the weight of the polar phase to be treated, preferably from 0.5 to 1 time.
  • a glycolipid purity in the polar phase excluding alcohol, apolar solvent and water, greater than 95%, and this with a yield greater than 90%, that is to say that less than 10% of the glycolipids are extracted with the impurities.
  • This optimal mixing level results in the definition of the operating conditions, for example stirring speed in the case of agitated technologies, frequency or pulsation intensity on the feed rate in the case of pulsed columns, or speeds of passage of fluids in the case of fixed technologies, the objective being that the dispersed phase undergo balanced actions of division and coalescence.
  • These two actions can be either successive in the basic case of a discontinuous process in a stirred tank, where the phase of physical separation of the phases by decantation succeeds the transfer phase with stirring.
  • These two actions may be simultaneous but spatially separated in a column with perforated trays for example or in a column agitated to a lesser extent, or they may be completely simultaneous for example in a packed column.
  • a final example for the implementation of a liquid-liquid extraction is the use of centrifugal technologies such as those marketed by the companies ALFA-LAVAL, ROUSSELET-ROBATEL or B & P PROCESS EQUIPMENTS.
  • the steps ii. and iii. contacting and then separation of the apolar and polar phases are carried out simultaneously, together, on a countercurrent extraction device with continuous circulation of the two liquid streams, in particular on a counter-agitated extraction column. current, or on a centrifugal extractor.
  • washing section of the apolar phase output by counter-extraction glycolipids it contains, a mixture of alcohol C2-C3 and water.
  • a washing section can be implemented according to the same general principles of liquid-liquid extraction described above, and advantageously are implemented in the same equipment as the main step of extraction of hydrophobic impurities.
  • two feeds of solutions rich in alcohol and water are considered, one at the top of the column consists exclusively of alcohol and water, and the other at an intermediate point of the column is the main feed consisting of glycolipids and impurities dissolved in a mixture of alcohol and water.
  • step i) dissolution and ii) contact with the apolar phase is without heating, at room temperature between 15 and 30 ° C, preferably 25 ° C.
  • the implementation of the method according to the invention therefore does not require heating or cooling for steps i) and ii) which is a significant economic advantage.
  • most of the lipids and hydrophobic byproducts of the fermentation are extracted during this step, they are therefore not exposed to the risks of thermal degradation which are conventional for fatty acids in particular, and which may lead to the formation of products, especially responsible for color or smell.
  • Industrial facilities are also generally in industrial buildings themselves temperate, protected from cold weather. In case of great heat wave, the high temperatures that can be observed do not have a substantial impact on the result obtained.
  • the apolar phase collected after step iii. is then advantageously concentrated especially by evaporation or distillation, or by membrane processes such as nanofiltration and particularly nanofiltration with a membrane whose material is resistant to the solvents used.
  • a concentration step aims to obtain firstly a residue concentrated in hydrophobic impurities that can be removed from the process, and secondly a regenerated and freed from impurities non-polar organic solvent, which can be recycled.
  • this concentration is carried out by evaporation at a pressure greater than atmospheric pressure to facilitate the condensation of solvent vapors, or at a pressure below atmospheric pressure to ensure that any possible solvent leakage is channeled to the process, while limiting the risk of thermal degradation of the products that constitute the residue after evaporation.
  • the recovery of the apolar solvent by evaporation is carried out under reduced pressure.
  • the pressure is preferably chosen between 900 and 50 mbar absolute, and preferably between 500 and 200 mbar absolute.
  • the recovery yield of the apolar organic solvent is greater than 95%, and even more advantageously the residual content of apolar organic solvent in the residue is less than 5000 ppm. It is possible that two liquid phases are obtained by the condensation of the vapors generated. In this case, the two phases are separated, for example by decantation, and only the phase richest in apolar organic solvent is recycled as extraction solvent.
  • the least rich phase of apolar solvent is rich in alcohol and water, and is recycled as an additive for the dilution of the raw material.
  • all or part of the recycled stream may also be treated by an additional purification step, for example distillation or membrane filtration such as nanofiltration and particularly nanofiltration with a membrane whose material is resistant to the solvents used, or even a fraction of the flow can be purged, to eliminate any trace contaminant likely to accumulate from the process.
  • the chosen solution can be applied continuously or periodically, whatever it may be.
  • the polar phase collected after step iii. may optionally be treated by additional purification steps prior to step iv. isolation of glycolipids from the polar phase.
  • the polar phase may be subjected to an adsorption step on adsorbents such as polymer resins, grafted or not, activated carbons, silica gels, zeolites, or bleaching earths such as bentonites, or membrane filtration such as nanofiltration and particularly nanofiltration with a membrane whose material is resistant to the solvents used.
  • adsorbents such as polymer resins, grafted or not, activated carbons, silica gels, zeolites, or bleaching earths such as bentonites, or membrane filtration such as nanofiltration and particularly nanofiltration with a membrane whose material is resistant to the solvents used.
  • membrane filtration such as nanofiltration and particularly nanofiltration with a membrane whose material is resistant to the solvents used.
  • any additional purification contemplated at this stage does not significantly affect the glycolipid mass content with respect to other lipid-type organic impurities. It affects only less than 1000 ppm impurities and is only intended to improve the characteristics such as color, odor, or salt content, of the finished product.
  • Such an adsorption step may be carried out continuously on a filter consisting of a fixed bed of adsorbent particles, or discontinuously in a first step of mixing the polar phase with the adsorbent, and then a second separation step. purified polar phase and solid adsorbent.
  • the polar phase collected after step iii. is passed on a fixed bed of adsorbent polymer resin or activated carbon.
  • Step iv. It consists in isolating the glycolipids from the polar phase, which means that alcohol and water, which mainly constitute the polar phase, are recovered.
  • polar phase means that alcohol and water, which mainly constitute the polar phase
  • Those skilled in the art are familiar with industrial methods for isolating glycolipids from the polar phase, in particular evaporation or distillation, or membrane processes such as nanofiltration and particularly nanofiltration with a membrane whose material is resistant to the solvents used.
  • the glycolipids are isolated from the polar phase by distillation of the alcohol, any traces of apolar organic solvent, and a fraction of the water, and then by evaporation of the residual water.
  • the evaporation or the distillation are preferably carried out at a reduced pressure in order to prevent degradation of the glycolipids and the formation of secondary products which are particularly responsible for color.
  • the evaporation or the distillation is carried out at a pressure of between 900 and 50 mbar absolute, preferably at a pressure of between 500 and 100 mbar absolute.
  • the evaporation or the distillation is carried out at a temperature of between 40 and 200 ° C., preferably at a temperature of between 50 and 120 ° C.
  • the distillation consists of supplying the polar phase, the glycolipids of which must be isolated on a column packed with loose or structured packing elements identical to those described for the liquid-liquid extraction step, said column being equipped with an evaporator at its foot and a condenser at its head, and the feeding being carried out homogeneously on the section.
  • the column and in particular the lower section can also be equipped with trays equipped with bells, perforations or movable or fixed valves.
  • the lower section is equipped with trays whose design minimizes the risk of foaming, for example the technologies marketed by the companies Koch-Glitsch or UOP, under the names ULTRA-TRAY or MD, respectively.
  • step iv. for the isolation of glycolipids from the polar phase is carried out in two stages, the first step consisting of removing the alcohol and the possible traces of apolar organic solvent by distillation and then the optional second step of removing the residual water by decantation. or evaporation.
  • the first step consisting of removing the alcohol and the possible traces of apolar organic solvent by distillation and then the optional second step of removing the residual water by decantation. or evaporation.
  • an alcohol-rich distillate is obtained and is recycled for the dilution of the raw material rich in glycolipids and impurities, with a view to its purification by liquid-liquid extraction under the conditions described in FIG. 'invention.
  • all or part of the recycled stream may also be treated by an additional purification step, for example distillation or membrane filtration, or even a fraction of the stream may be purged, to eliminate from the process any contaminant in the trace state likely to 'accumulate.
  • the chosen solution can be applied continuously or periodically, whatever it may be.
  • the possible evaporation of the residual water to obtain the dehydrated glycolipids is carried out in the same ranges of pressure and temperature as the distillation. However, it is advantageously carried out on an evaporation technology which minimizes the residence time of the product, for example on a falling-film or thin-film evaporator. Even more advantageously, the evaporation of the residual water is carried out on a technology resistant to the presence of foam, and which tolerates products whose viscosity is high.
  • the term "high viscosity” refers here to a range of viscosity which can reach from 10 to 1,000 Pa.s or more up to 5,000 Pa.s under working conditions, in particular temperature and shear rate.
  • Such evaporation technologies indicated for the dehydration of glycolipids are thin film or scraped film evaporators, or technologies such as the technology marketed by APV under the name PARAVAP.
  • the final dehydration step is carried out on a thin-film evaporator.
  • the water recovered by condensation of the vapors can be recycled to the process if necessary, advantageously replacing an external water consumption, or purged as an aqueous effluent.
  • Glycolipid isolation may also include a settling step depending on the content of water, alcohol and glycolipids.
  • a glycolipid-poor aqueous phase can be formed under precise conditions of alcohol, water and glycolipid content.
  • the aqueous phase poor in glycolipids is preferably separated by a technique such as decantation, hydrocyclone or centrifugation, and purged. If necessary, an additional amount of water may be added at any time in the glycolipid isolation sequence, but before this settling step preferably and at the latest during this step. Thus, the amount of aqueous phase that is poor in glycolipids to be removed is increased, but this effluent can eliminate traces of hydrophilic contaminants such as salts.
  • glycolipids that can be extracted by the process according to the invention are products of natural origin, generally fermentation products of vegetable oils or obtained by enzymatic conversion of vegetable oils. Mention may in particular be made of rhamnolipids, sophorolipids, cellobiolipids, trehalose lipids, and mannosylerythritol lipids.
  • the raw material is a fermentation product of vegetable oils, for example peanut oil, coconut oil, rapeseed oil, olive oil, palm oil, soybean oil or sunflower oil.
  • vegetable oils for example peanut oil, coconut oil, rapeseed oil, olive oil, palm oil, soybean oil or sunflower oil.
  • MELs mannosylerythritol lipids
  • glycolipids glycolipids.
  • MELs are well known to those skilled in the art, and include several molecules identified in particular as MEL-A, MEL-B and MEL-C, according to their degree of acetylation.
  • Kitamoto et al. (1990) who produce MELs from soybean oil as the main substrate one can cite Accorsini et al. (2012) who produce Mels by fermentation of soybean oil and glycerol as main substrates, mention may be made of Kitamoto et al. (2001) that produce MELs from alkanes as main substrates.
  • Kitamoto et al. (2001) that produce MELs from alkanes as main substrates We can also mention the patent application WO 2014/185805 which describes the production of MELs from a lignocellulosic biomass.
  • the discontinuous processes used by the previous authors consist in mixing all or almost all the elements of the fermentation medium in the reactor and in fermenting these elements with the microorganism inoculated.
  • the semi-continuous or batch fed processes consist in the addition during the fermentation of some of the elements of the fermentation medium.
  • the fermentation method used, the carbon sources used, the fermentation conditions used, the strain of the microorganism used is of little importance.
  • the strain used may be the strain Pseudozyma aphidis DSMZ 70725, a strain of Pseudozyma aphidis species, Pseudozyma antartica, Pseudozyma tsukubaiensis, a strain of the genus Pseudozyma or any other strain capable of producing MELs.
  • the fermentation medium for producing the surfactants may be a fermentation medium whose composition has been adjusted to produce the MELs. This medium will contain one or more nitrogen sources including organic sources such as yeast extract and mineral sources such as nitrate salts, ammonium salts, urea.
  • the medium will contain carbon sources such as fats and oils such as peanut oil, coconut oil, rapeseed oil, olive oil, palm oil, soybean oil or sunflower oil, from other sources other insoluble carbon such as paraffin or alkanes, soluble carbon sources such as glucose, fructose, glycerol, or any combination of these carbon sources.
  • carbon sources such as fats and oils such as peanut oil, coconut oil, rapeseed oil, olive oil, palm oil, soybean oil or sunflower oil, from other sources other insoluble carbon such as paraffin or alkanes, soluble carbon sources such as glucose, fructose, glycerol, or any combination of these carbon sources.
  • the medium also contains sources of vitamins and minerals.
  • the pH and the temperature can be adjusted by those skilled in the art so as to promote the production of MELs.
  • agitation and aeration can be adjusted by those skilled in the art to promote the production of MELs.
  • the fermentation mode may be a batch or fed batch process, or even a continuous process.
  • the phase rich in glycolipids can be isolated by any solid / liquid separation process, such as sieving or filtration, or by any liquid / liquid separation process, such as decantation or centrifugation, depending on the physical state of the MEL-rich phase.
  • the physical state of the MEL-rich phase depends in particular on the weight ratio between MELs and impurities such as fatty acids, but also other operating conditions such as temperature and pH, according to what is described in the literature, in particular by Rau. et al. (2005a) or in the application JP 2007-252280
  • the MEL-rich phase thus isolated is the raw material that can be treated by the process according to the invention.
  • glycolipids isolated by the process according to the invention advantageously have the following characteristics, the contents being expressed in mass and out of water:
  • glycolipids At least 90%, preferably at least 95% of glycolipids
  • glycolipids are MELs.
  • the relative proportion of MELs (A, B or C) will depend in particular on the fermentation method, the starting substrate and the strain employed.
  • the above composition may comprise essentially Mel-A or Mel-B or Mel-C as glycolipids.
  • the above composition comprises a content of MELs of 50% to 60% of MEL-A, 10% to 40% of MEL-B and 5% to 35% of MEL-C. , the percentage being expressed in relation to the total MELs in the composition.
  • the invention also relates to a mixture of glycolipids, in particular MELs, obtainable by the process according to the invention, characterized in that it has the composition as specified above.
  • FIG. 1 represents the schematic diagram of the liquid-liquid extraction step, in the most common case where the apolar organic solvent has a density lower than that of the polar phase.
  • the stream (1) represents the raw material rich in glycolipids and impurities, dissolved and diluted in the C2-C3 alcohol mixture and water, and constitutes the polar phase fed.
  • the flow (1) is thus fed to a liquid-liquid extraction column (2) which ensures a countercurrent flow of the two liquid phases, and a separation of the two phases after transfer of the solutes, the indicated pattern not prejudging the type of contactor used and phase separation mode as has been described in the detailed description of the invention.
  • the second liquid feed (3) consists of the apolar organic solvent.
  • the flow rate of the recycled stream (4) is much greater than the flow rate required for the makeup flow (5).
  • the apolar organic solvent has a density lower than that of the polar phase, it goes up in the column (2) by gravity, against the current of the polar phase, heavier.
  • the raffinate phase (6) constitutes the polar phase purified because depleted in hydrophobic impurities, it is recovered at the bottom of the column (2) after a settling time sufficient to prevent any entrainment of apolar extraction solvent (3).
  • the extracted phase (7) consists of the apolar extraction solvent saturated with alcohol and water due to contact with the polar phase, and enriched by the extracted solutes.
  • the extracted solutes are very predominantly hydrophobic impurities, and in a minor way glycolipids.
  • the extracted phase (7) is fed on an evaporator (8), which generates vapors rich in apolar organic solvent (9) which are recovered in a liquid state after condensation and cooling on the condenser (10).
  • the condensed vapors (4) then constitute the flow recycling in apolar solvent.
  • the unvaporated fraction (1 1) of the extracted phase (7) constitutes the residue of the operation, is rich in hydrophobic impurities and is removed from the process.
  • the recovery yield of the apolar organic solvent from the stream (7) to the stream (4) is greater than 95%.
  • FIG. 2 represents an improved version of the liquid-liquid extraction step, where a step of washing the extracted phase with a mixture of C2-C3 alcohol and water is implemented to maximize the rate of glycolipids recovery.
  • This figure 2 is also made for the most common case where the apolar organic solvent has a density lower than that of the polar phase.
  • the description and references given for FIG. 1 remain valid for this FIG. 2, but the liquid-liquid extraction column (2) is also fed in the case of FIG. 2 by an additional flow of C2 alcohol mixture. -C3 and water (12) at the top of the column.
  • the global polar feed is thus constituted on the one hand by the flow (1) which represents the raw material rich in glycolipids and impurities, dissolved and diluted in a mixture of C2-C3 alcohol and water, and by the flow (12) which consists of a C2-C3 alcohol mixture and water without glycolipids or impurities.
  • the main impurity extraction step is carried out on the lower section (13) analogously to the general case described in FIG. 1, but a second separation step is carried out on the upper section (14) which consists in washing the apolar phase before recovery at the top of the column.
  • the glycolipids possibly present in the ascending apolar phase at the main feed (1) are again extracted in the polar washing phase (12), which ensures a minimum content of glycolipids in the extract (7) which is recovered at the top of column (2).
  • the polar washing phase from (12) and the main polar diet (1) spontaneously mix at the main feed (1), and a single raffinate phase (6) is recovered at the bottom of the column (2). .
  • FIG. 3 represents the general principle of implementation of the invention.
  • the raw material (1) rich in glycolipids and impurities is dissolved in step i. by mixing with a mixture of C2-C3 alcohol and water (2).
  • the solution obtained is then optionally but not necessarily clarified during a step A, before being brought into contact with the apolar extraction solvent (3) during step ii.
  • the two liquid phases, one polar and the other nonpolar, are separated in step iii.
  • the recovered apolar phase (4) is then optionally concentrated during a step B, to obtain a regenerated extraction solvent that can be recycled to (3).
  • the residue (5) is waste for the process, where the impurities with a reduced glycolipid content are removed.
  • the purified polar phase (6) recovered at the end of step iii.
  • step C purified glycolipids (7) are then isolated from the polar phase purified in step iv., after which the alcohol and a part of the water (8) which can be recycled in (2) are also recovered. ), and possibly excess water (9) which can be purged.
  • Figure 8 shows the preferred embodiment of step iv. isolating the glycolipids from the polar phase, that is to say the succession of a distillation step of the alcohol and any traces of apolar organic solvent, elimination after decantation of the phase of excess water, and evaporation of residual water.
  • FIG. 4 represents an exemplary method implemented for step iv. isolation of glycolipids.
  • the purified polar phase (1) is fed on a distillation column (2), optionally with a makeup quantity of pure water (3). Energy is supplied to the process at the level of the reboiler (4) and solvent-rich vapors are recovered at the top of the column and condensed on the condenser (5).
  • the distillate obtained is distributed between a reflux (6) to the column, and a collection (7) of a C2-C3 alcohol mixture and purified water that can be recycled for step i. of the process.
  • the liquid residue (8) is collected at the reboiler (4), and optionally cooled and decanted on the equipment (9).
  • Any excess water (10) is separated, and is either recycled to the feed (1) or purged from the process to result in the aqueous effluent (1 1).
  • the glycolipid-rich phase (12) is then fed to an evaporator (13).
  • the vapors (14) consist essentially of water but still contain traces of alcohol. They are condensed on (15) to produce a distillate (16), which is either recycled to the column (2) or purged to yield a second aqueous effluent (17).
  • FIG. 5A shows the HPLC chromatogram obtained during the analysis of the raw material rich in glycolipids and impurities, used as starting material for the invention.
  • the abscissa represents the elution time in minutes.
  • the ordinate is masked and indicated in arbitrary units specific to the analysis apparatus used, the quantifications are carried out with the aid of an external calibration. Peaks are identified by the acronyms TAG, FFA, Ul, and MELs which refer to triglycerides (Triacyl Glycerides), fatty acids (Free Fatty Acids), other unidentified impurities, and glycolipids (Mannosyl Erythritol Lipids, respectively). as part of this example).
  • the total glycolipid content quantified from this chromatogram is 43% by weight.
  • the glycolipid purity with respect to the total lipids is 65% by mass, not counting the unidentified impurities.
  • FIG. 5B shows the HPLC chromatogram obtained during the analysis of a sample of purified glycolipids according to the invention.
  • the analysis conditions as well as the display references are strictly identical to those of FIG. 5A.
  • e the raw material rich in glycolipids and impurities, used as starting material for the invention. Peaks are identified by the acronyms TAG, FFA, Ul, and MELs that return triglycerides (Tri Acyl Glycerides), fatty acids (Free Fatty Acids), other unidentified impurities, and glycolipids (Mannosyl Erythritol Lipids, respectively, in this example).
  • the total glycolipid content quantified from this chromatogram is 96.5% by weight.
  • the purity of glycolipids with respect to the total lipids is also 96.5% by mass, the main quantifiable residual impurity being the fatty acids.
  • Figure 6 shows the selectivity of the liquid-liquid extraction, defined as the ratio of the fatty acid partition coefficient (FFA - Free Fatty Acids) by the glycolipid partition coefficient (MEL - Mannosyl Erythritol Lipids in the context of this example), as a function of the weight ratio ethanol / water in the polar phase as constituted before the extraction step.
  • the partition coefficient K of a species is itself defined by the ratio of the concentration of the species in the apolar phase (extract) by the concentration of the species in the polar phase (raffinate) at equilibrium. The values of these partition coefficients are taken at equilibrium between the two phases, and the tests carried out to obtain them are described in Examples 2 and 6.
  • the strain Pseudozyma aphidis DSM 70725 is stored on a PDA (Potatoe Dextrose Agar) agar medium. It was transferred to oese in a preculture medium and sterilely cultured for 2 days at 30 ° C and 200 rpm in a 1/5-filled Erlenmeyer flask. This first propagation step was then transferred sterilely in a second propagation step with a transfer rate of 10% vol / vol. This second propagation step was then transferred to a third propagation step with a transfer rate of 10% vol / vol.
  • the composition of the preculture medium is given in the following table:
  • the whole is dissolved in distilled water and is sterilized at 121 ° C for 20 minutes.
  • the volume of the liquid medium is limited to 1/5 of the total volume of the vial for optimal oxygenation.
  • the propagation culture was incubated for 2 days at 30 ° C and 200 rpm. It was then transferred to a total instrumented fermenter 7L equipped with temperature, pH, pO 2 and foam probes previously calibrated according to the usual rules for those skilled in the art.
  • composition of the fermentation medium is given in the following table:
  • Canola oil 8% The ingredients of the medium were dissolved in deionized water and the medium was sterilized in the fermenter at 121 ° C for 30-40 minutes. The volume of prepared medium was 4.32L. The transfer volume of the propagation medium was 10% vol / vol. The fermentation was controlled at 37 ° C, the pO 2 was controlled to be greater than 0 by stirring and aeration.
  • the organic phase containing the soybean oil, the fatty acids derived from the hydrolysis of the triglycerides of the oil and the MELs were separated from the aqueous phase. This separation was carried out by discontinuous centrifugation and the organic phase was recovered for separation of MELs and other compounds.
  • gel beads containing the soybean oil, the fatty acids resulting from the hydrolysis of the triglycerides of the soybean oil and the MELs were separated from the aqueous phase by solid / liquid separation on a sieve. 200 ⁇ .
  • MEL-enriched raw materials can be obtained in a similar way by fermenting other vegetable oils, such as peanut, coconut, rapeseed, olive, palm or sunflower oils or blends of oil and other carbon substrates such as glucose or glycerol.
  • vegetable oils such as peanut, coconut, rapeseed, olive, palm or sunflower oils or blends of oil and other carbon substrates such as glucose or glycerol.
  • a crude product rich in MELs was produced under conditions similar to those described in Example 1.
  • the composition of the crude product as measured by HPLC was 43 w% MELs (including 22.7 w% MEL). -A, 5.1 w% MEL-B, 15.2 w% MEL-C), 35 w% water and the balance consisting of hydrophobic impurities, mostly fatty acids.
  • This crude product is diluted in a solution of water and ethanol in the proportions described in the table below.
  • the resulting solution is filtered on WHATMAN TM GF / F filter paper (0.7 ⁇ ) to remove traces of solids such as residual biomass and haze proteins. It is then brought into contact with cyclohexane in the proportions described in the table below.
  • the cell containing the two liquid phases is stirred for 8 hours with the aid of a magnetic bar to ensure a sufficient contact time for the phases and the attainment of equilibrium solute concentrations in each of the two phases. phases.
  • the cell is also double-wrapped and thermostated at 25 ° C to ensure a constant and controlled temperature over the entire duration of the test. After stopping the stirring, a rest period of 5 hours is applied to ensure perfect separation of the liquid phases by decantation.
  • Each of the two phases is then removed and analyzed by HPLC, for the quantification of the mass contents of MEL A and impurities.
  • MEL A Only MEL A are quantified because it is the form with the highest degree of acylation among the MEL forms, so the most likely to be extracted in the apolar phase among the forms A, B and C.
  • the results presented in the table below clearly indicate a partition coefficient, that is to say a ratio of apolar phase concentration by polar phase concentration, significantly higher for fatty acids than for MELs.
  • triglyceride levels are not indicated because the residual triglyceride contents in the polar phase were systematically below the limit required for reliable quantification, and in particular not detected for tests 5 and 6, which means that the triglyceride content was less than about 100 ppm for these tests.
  • Example 2 The liquid-liquid extraction tests described in Example 2 were reproduced strictly identically for Tests 1, 2 and 3, in particular as regards the temperature control at 25 ° C., the only difference being that the apolar solvent used was Dipentene 38, a mixture of terpenes marketed by the company DRT, in place of cyclohexane. Dipentene 38 contains in particular 40% of dipentene, a racemic mixture of the isomers of limonene and l-limonene, 20% of alpha-terpinene, 10% of gamma-terpinene, and 20% of terpinolene. The conditions of the tests are described in the table below.
  • a crude product rich in MELs was produced under conditions similar to those described in Example 1.
  • the composition of the crude product as measured by HPLC was 39.3 w% MELs, and 21.5 w% impurities like lipids, fatty acids or triglycerides (Figure 5A).
  • the water content is of the order of 35% by weight.
  • This crude product has the appearance of a viscous paste, and is diluted with a mixture of 85% ethanol and 15% water, initially with a ratio of 0.5 mass of alcohol mixture and alcohol. water per mass of starting material. The ratio ethanol / water is close to 1 in the liquid solution obtained at the end of this first dilution.
  • the solution is centrifuged at 4000 G for 30 min on a ROTINA 380R centrifuge.
  • the supernatant liquid is recovered by overflow and filtered on WHATMAN TM GF / F filter paper (0.7 ⁇ ) to eliminate the cloudiness.
  • a second dilution with the same mixture of 85% ethanol and 15% water is then carried out, with a ratio of 2.35 mixtures of alcohol mixture and water per mass of clarified solution. At the end of this second dilution the mass ratio ethanol / water in the liquid solution is 3.6.
  • the second solution obtained is used as a polar feed for the continuous liquid-liquid extraction step to follow.
  • the feed rates of each phase are set at 4.5 kg / h for the polar phase and 2.6 kg / h for the apolar extraction solvent, so that the mass ratio of the two flow rates is 0.58.
  • the temperature is regulated at 25 ° C over the entire height of the column through a double jacket with water circulation.
  • the stirring speed is set at 100 rpm, and after a settling time of one hour the flow rates and compositions of the output streams are measured.
  • the operating point obtained is described by the following table. This operating point is still maintained for more than two hours stably, and was interrupted only because of exhaustion of the products to be fed.
  • the mass balance closure is close to 100% for MELs and for triglycerides and fatty esters. A significant difference of 15% is noted for fatty acids, but remains within the cumulative uncertainty of analyzes and flow measurements.
  • the recovery yield of the MELs in the raffinate phase is greater than 95%.
  • a mass of 1,066 grams of purified polar phase is concentrated by evaporation on a rotary evaporator, reference R-200 sold by the company Buchi, at a pressure of 250 mbar and at a heating temperature of 75 ° C., until by a factor of 5. At this point 213 grams of demineralized water are added and evaporation is resumed.
  • the pressure went down to 1 mbar at the end of the operation, with a maximum heating temperature of 90 ° C, to limit the time of the operation performed in batch.
  • a mass of 89 grams of residue is obtained.
  • the residue is highly viscous, orange and limpid. It contains a total concentration of MELs of 95.6 w%.
  • the residual contents of fatty acids and of triglycerides or fatty esters are quantified at 3.35 w% and 0.35 w% respectively (FIG. 5B).
  • the total water content is measured by Karl-Fischer analysis at 2 w%, while the residual contents of alcohol and apolar solvent are confirmed at less than 1000 ppm ethanol and less than 1 ppm cyclohexane by GC-MS analysis.
  • This example describes an advantageous way of implementing the invention, also including a decolorization step on activated carbon.
  • a total mass of 7.57 kg of the purified polar phase produced under the conditions of Example 4 is passed over a column 25 mm in internal diameter and 25 cm high, filled with activated carbon supplied by CECA CARBON under reference ECA 14 076.
  • Several tests are carried out with superficial velocities of between 1 and 4 m / h for the liquid phase.
  • the total mass of activated carbon used is 123 grams.
  • the liquid recovered after passage over carbon is then fractionated by discontinuous distillation at 250 mbar on a distillation column of 25 mm internal diameter, filled to a height of 1 m by Pro-Pak TM bulk metal lining.
  • a mass of 1.25 kg of solution is treated at each operation fed continuously during the test to keep a constant colum of about 300 to 400 g in the boiler, and 250 g of demineralized water are added at the end of the test until elimination of alcohol at the top of the column.
  • the residue of the distillation is cooled and decanted, a mass of 445 grams of excess water is separated.
  • the MEL content in this excess water is less than 1%.
  • a mass of 1.07 kg of lower phase rich in MEL and water is concentrated on a rotary evaporator under the same conditions as described in Example 4.
  • a mass of 393 grams of residue is obtained.
  • the residue is highly viscous, yellow to orange-yellow in color and limpid. It contains a total concentration of MELs measured at 100.8 w%.
  • Example 4 The conditions of Example 4 were reproduced identically until the liquid-liquid extraction step, which had the effect of producing a polar solution rich in glycolipids and lipids, in which the mass ratio ethanol / water was 3.6.
  • a second operating point was made by adjusting the feed rates of each phase to 4.1 kg / h for the polar phase and 2.8 kg / h for cyclohexane, so that the mass ratio of the two flow rates is 0.68.
  • the temperature is regulated at 25 ° C over the entire height of the column through a double jacket with water circulation.
  • the stirring speed is set at 100 rpm, and after a settling time of one hour the flow rates and compositions of the output streams are measured.
  • the operating point obtained is described by the following table
  • the mass balance loop is close to 100% for MELs. Deviations of 5 and 10% are noted for fatty acids and for triglycerides or fatty esters respectively, but remain within the cumulative uncertainty margin of analyzes and flow measurements.
  • the recovery yield of the MELs in the purified polar phase remains greater than 95%, although slightly degraded compared with the results of Example 4.
  • the purity of the MELs, on the other hand, in the purified polar phase is increased since the glycolipids represent 97.5% of the total quantified lipids. Increase the flow of Extraction solvent on a given equipment therefore makes it possible to increase the level of purity achieved, with an acceptable decrease in yield under the conditions described.
  • Example 7 Effect of an insufficient water content in the polar phase
  • Example 2 The liquid-liquid extraction tests described in Example 2 were reproduced strictly identically for the tests 10, 11 and 12, especially as regards the temperature control at 25 ° C., the only difference being that the raw material tested came from a production lot whose composition was significantly different from Example 2: in fact the composition of the crude product was 35.24 w% MELs (including 21.62 w% MEL-A). 3.96 w% MEL-B, 10.12 w% MEL-C), 35.5 w% FFA, and 18.9 w% water. The mass ratios for the different dilutions have been modified and are described in the table below.

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Abstract

La présente invention concerne un nouveau procédé de purification de glycolipides par extraction liquide/liquide dans lequel la première phase liquide, dite polaire, est une solution constituée principalement d'un alcool et d'eau dans lequel la matière première a été préalablement dissoute, et la seconde phase liquide, dite apolaire, est un solvant organique de faible constante diélectrique, par exemple un alcane. L'invention concerne également un mélange de glycolipides obtenus par ce procédé.

Description

PROCÉDÉ D'EXTRACTION DE GLYCOLIPIDES ET GLYCOLIPIDES OBTENUS
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un nouveau procédé de purification de glycolipides par extraction liquide/liquide dans lequel la première phase liquide, dite polaire, est une solution constituée principalement d'un alcool et d'eau dans lequel la matière première a été préalablement dissoute, et la seconde phase liquide, dite apolaire, est constituée principalement d'un solvant organique de faible constante diélectrique, par exemple un alcane. L'invention concerne également un mélange de glycolipides obtenus par ce procédé.
ETAT DE LA TECHNIQUE
L'essor des biotechnologies blanches présente de nombreuses opportunités pour le développement d'une nouvelle chimie et de nouvelles applications basées sur la transformation de matières premières renouvelables. Les biotensioactifs formés à partir de matières premières simples telles qu'huiles végétales ou sucres offrent des performances similaires voire supérieures à celles des tensio-actifs d'origine fossile, tout en présentant un impact environnemental et une toxicité plus faibles, et une meilleure biodégradabilité. C'est donc tout naturellement que les acteurs du domaine présentent depuis plusieurs années de nouveaux résultats sur la synthèse de ces biotensioactifs par voie fermentaire ou enzymatique, et sur la caractérisation de leurs performances à l'état purifié, que ce soit pour des applications en cosmétique, agriculture, environnement, ou pharmaceutiques.
Entre ces deux aspects relatifs à la synthèse d'une part et à l'application d'autre part, la purification des biotensioactifs est un maillon indispensable mais paradoxalement négligé à date. Les travaux connus rappelés ci-après ne font état d'aucun procédé de purification applicable à une échelle industrielle, qui offre à la fois un rendement et une qualité élevés, qui soit associé à des solvants dont les contraintes d'utilisation sont acceptables par les réglementations sanitaires et environnementales, et qui soit basé sur l'utilisation de technologies de séparation capacitives et robustes. Cela est pourtant le résultat indispensable pour permettre le développement économique de ces biotensioactifs.
La purification des glycolipides est d'une complexité technique élevée, du fait de la présence d'autres lipides à séparer, tels que acides gras, triglycérides, esters d'acides gras, avec une faible différence entre les propriétés physico-chimiques des impuretés lipidiques et des glycolipides. Cette complexité est d'autant plus grande que le procédé de synthèse de la matière première brute riche en glycolipides est le résultat d'un procédé de transformation enzymatique ou de fermentation, ce qui occasionne la formation de nombreux co-produits, notamment responsables de couleur, et nécessite la présence de sels, de divers nutriments, et de biomasse. Les techniques disponibles pour le fractionnement des lipides comptent notamment l'évaporation et en particulier l'évaporation sous très grand vide, comme la distillation court trajet, les procédés membranaires tels que la nanofiltration, la cristallisation ou la précipitation, les techniques basées sur la chromatographie et l'extraction liquide- liquide. L'exploitation de l'extraction liquide-liquide est compliquée par les propriétés tensio- actives des glycolipides, et par le caractère hydrophobe de la molécule. Dans ces conditions un simple mélange d'eau et de solvant organique ne peut pas être utilisé, car il ne mènerait à aucun fractionnement visible entre les différentes classes de lipides, voire en fonction des quantités impliquées pourrait aboutir à la formation de deux phases liquides émulsionnées difficilement séparables. Il est donc nécessaire de définir deux compositions de phases liquides qui ne soient pas miscibles et soient facilement séparables malgré la présence d'une quantité importante de biotensioactifs, pour assurer une séparation sélective entre les lipides et garantir l'absence d'émulsion stable.
L'extraction de lipides à partir de biomasse complexe avec un alcool est connu de l'état de la technique. Par exemple, EP 1 813 664 EP décrit la préparation d'une huile enrichie en glycosphingolipides ou de US 201 1/019073 pour extraire les lipides d'une masse de microalgues sans les détériorer. Ces procédés sont complexes, avec des étapes de chauffage de la matière première. Les produits obtenus sont des huiles complexes enrichies en glycolipides, mais ne permettent pas d'obtenir des glycolipides purifiés, essentiellement des glycolipides (au moins 90%) et des triglycérides et acides gras en très faibles proportions (moins de 1 % et moins de 5% respectivement).
L'extraction des lipides grâce à l'utilisation de deux solvants organiques non miscibles est décrite à l'échelle du laboratoire notamment pour la caractérisation d'échantillons de tissus ou produits naturels, notamment la méthode dite de Folch (Folch J. et al., A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues). Mais la complexité du procédé qui comporte de nombreuses étapes d'extraction et la nature et les quantités de solvants employés (plus de 20 fois la masse de lipides à extraire) ne permet pas d'envisager une exploitation industrielle.
L'extraction de lipides polaires par séparation liquide/liquide avec un mélange éthanol/eau (ratio massique éthanol/eau supérieur à 6) et de l'éther de pétrole est également connue (Galanos D.S. et al. Isolation of polar lipids from triglycéride mixtures). Toutefois, ce procédé décrit à l'échelle du laboratoire ne permet pas une purification des lipides polaires acceptable pour une exploitation industrielle, avec une pureté de 50 à 75 % environ (Hartman L., Comparison of two methods for the séparation of polar from nonpolar lipids).
Plus spécifiquement pour la purification des glycolipides, l'extraction liquide-liquide a été décrite dans la plupart des cas avec un solvant de polarité intermédiaire, tel l'acétate d'éthyle ou le Methyl-ter-Butyl Ether (MTBE), pour extraire les glycolipides du moût de fermentation. Des exemples sont donnés par U. Rau et al. (« Downstream processing of Mannosylerythritol lipids produced by Pseudozyma aphidis »), Smyth T.J.P. et al. (« Isolation and Analysis of Low Molecular Weight Microbial Glycolipids), et Hubert J. et al. (« New perspectives for microbial glycolipid fractionation and purification processes »). Ces procédés de laboratoire restent complexes, nécessitant de nombreuses étapes, avec notamment l'élimination nécessaire du solvant d'extraction avant de pouvoir procéder à la purification, voire l'emploi de technologies trop complexes pour un procédé industriel, comme la chromatographie de partage centrifuge (Hubert J. et al.). En outre, les rendements obtenus sont très faibles, limité à 8% pour Rau & al. (2005a), ce qui exclut toute extrapolation à échelle industrielle.
La demande WO 2004/020647 décrit un procédé de préparation de mannosylérythritol lipides (MELs) dans lequel l'isolation du produit à partir de la biomasse se fait par simple dissolution dans l'éthanol à partir des fractions solides préalablement obtenues par chauffage à plus de 100°C et liquides susceptibles de contenir les MELs, puis évaporation de l'éthanol, c'est à dire sans purification particulière pour éliminer des impuretés hydrophobes résiduelles comme les triglycérides ou les acides gras. De même, la demande JP 2007-252280 décrit un procédé d'isolation de MELs sous formes de billes solides à partir du moût de fermentation et une teneur en acides gras élevée dans le produit récupéré. Un procédé d'extraction de glycolipides à partir d'une huile végétale est décrit dans la demande EP 1 027 413. Là aussi, la teneur en lipides polaires dans l'extrait obtenu ne dépasse pas 50%, dont moins de 80% de glycolipides. Enfin les techniques de fractionnement de glycolipides par extraction au dioxyde de carbone dans des conditions supercritiques sont décrites dans la demande EP 1 222 009. La méthode comprend toutefois un nombre d'étapes trop important pour la purification industrielle de biosurfactants purifiés, et la phase extraite est très diluée, à moins de 1 % de solutés, malgré une pression opératoire extrêmement élevée de 250 bar.
Il existe un besoin de pouvoir disposer d'un procédé robuste et efficace pour l'obtention de glycolipides de haute pureté, susceptible d'être exploité industriellement.
EXPOSE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un nouveau procédé de purification de glycolipides par extraction liquide/liquide à partir d'une matière première comprenant les glycolipides à purifier et des impuretés hydrophobes de type triglycérides et acides gras ou dérivés d'acides gras, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives de i. dissoudre la matière première dans une phase polaire comprenant au moins un alcool en C2-C3 et de l'eau pour dissoudre les glycolipides et les impuretés hydrophobes, puis
ii. mise en contact de la phase polaire avec une phase apolaire comprenant un solvant organique apolaire non miscible à la phase polaire pour permettre le transfert des impuretés hydrophobes dans la phase apolaire, puis
iii. séparation des phases polaires et apolaires et récupération de la phase polaire purifiée, puis
iv. isolation des glycolipides de la phase polaire purifiée,
le rapport pondéral alcool/eau dans la phase polaire allant de 2/1 à 5/1 .
La méthode selon l'invention est particulièrement appropriée pour la purification de mannosylerythritol lipides (MELs) comme glycolipides, en particulier obtenus par fermentation, plus particulièrement obtenus par fermentation d'huiles végétales, par exemple huile d'arachide, huile de coco, huile de colza, huile d'olive, huile de palme, huile de soja ou huile de tournesol.
L'invention concerne également un mélange de glycolipides obtenus par ce procédé, en particulier dont les caractéristiques sont les suivantes, les teneurs étant exprimées en masse et hors eau :
au moins 90 %, de préférence au moins 95% de glycolipides
- moins de 1 %, de préférence moins de 0.2%, de triglycérides
moins de 5%, de préférence moins de 3%, d'acides gras libres
moins de 1000 ppm, de préférence moins de 100 ppm d'alcool en C2-C3 moins de 50 ppm, de préférence moins de 1 ppm, de solvant organique apolaire. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un nouveau procédé de purification de glycolipides par extraction liquide/liquide à partir d'une matière première comprenant les glycolipides à purifier et des impuretés hydrophobes de type triglycérides et acides gras caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives de
i. dissoudre la matière première dans une phase polaire comprenant au moins un alcool en C2-C3 et de l'eau pour dissoudre les glycolipides et des impuretés hydrophobes, puis
ii. mise en contact de la phase polaire avec une phase apolaire comprenant un solvant organique apolaire non miscible à la phase polaire pour permettre le transfert des impuretés hydrophobes dans la phase apolaire, puis
iii. séparation des phases polaires et apolaires et récupération de la phase polaire purifiée, puis iv. isolation des glycolipides de la phase polaire purifiée.
L'étape i) de dissolution permet d'éliminer à ce stade les solides résiduels tels que des traces de résidus cellulaires ou protéiques.
De manière préférentielle, l'alcool en C2-C3 est choisi parmi l'éthanol, l'isopropanol et leurs mélanges en toutes proportions, avantageusement l'éthanol étant majoritaire dans le mélange éthanol/isopropanol, plus préférentiellement un mélange éthanol/isopropanol comprenant plus de 70% d'éthanol, avantageusement plus de 80 % d'éthanol, préférentiellement plus de 90 % d'éthanol. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'alcool en C2-C3 est de l'éthanol pur.
Sauf indication contraire, les pourcentages sont exprimés en poids.
La phase polaire est donc définie comme la solution constituée au moins par le mélange d'alcool en C2-C3 et d'eau, ainsi que les glycolipides et les impuretés qu'elle contient suite à la dissolution de la matière première.
Le solvant organique apolaire, ou encore solvant d'extraction apolaire, est défini comme un solvant organique de faible constante diélectrique, le terme inclut par exemple les hydrocarbures mais exclut l'eau et les alcools en C2-C3.
La phase apolaire est donc définie comme la solution constituée principalement par le solvant organique apolaire, ainsi que par les impuretés extraites lors de la mise en contact de la phase apolaire avec la phase polaire. Ainsi la teneur en impuretés dans la phase polaire diminue lors de la mise en contact.
Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour une matière première riche en glycolipides dont la teneur en glycolipides représente au moins 25% de la matière sèche, avantageusement au moins 35 % de la matière sèche, généralement de 20 à 60 %, voire plus 60% selon la matière sèche.
De manière avantageuse, la teneur en insolubles dans le solvant polaire est inférieure à la teneur en glycolipides, avantageusement inférieure à 20 % de la matière sèche, préférentiellement inférieure à 15% de la matière sèche
Ces matières premières comprennent généralement, outre les glycolipides à purifier, des impuretés hydrophobes telles que des triglycérides et acides gras, qui peuvent représenter jusqu'à 75% de la matière sèche.
Le rapport pondéral alcool/eau dans la phase polaire va de 2/1 à 5/1 , de préférence de 2,5/1 à 4/1 , avantageusement de 2,5 à 3,5. L'homme du métier saura déterminer la teneur en eau dans la phase polaire employée dans l'étape i. pour permettre à la fois une bonne dissolution des glycolipides, puis pour favoriser un bon transfert des impuretés hydrophobes dans la phase apolaire. Il tiendra compte notamment de la présence éventuelle d'eau dans la matière première. L'étape i. de dissolution des glycolipides entraine également la dissolution d'impuretés hydrophobes comme les triglycérides et les acides gras (dits acides gras libres). Les méthodes de dissolution sont bien connues de l'homme du métier. La dissolution peut être réalisée de façon continue ou de façon discontinue, par ajout du mélange d'alcool et d'eau à la matière première à dissoudre, ou inversement. Le mélange des flux sera mis en œuvre par exemple dans une cuve agitée équipée de mobiles d'agitation assurant un écoulement axial ou radial, mais de préférence axial ou encore plus préférentiellement un écoulement mixte grâce à l'utilisation de mobiles adaptés, par exemple pales inclinées à 45°, ou par l'utilisation de deux mobiles superposés, l'un axial et l'autre radial. La durée sous agitation doit être suffisante pour obtenir en sortie une phase liquide d'apparence homogène, un étagement de l'agitation dans deux cuves successives peut également être considéré pour assurer l'homogénéité et disposer d'une capacité tampon. De façon avantageuse, la matière première à dissoudre est alimentée dans le mélange d'alcool et d'eau sous agitation. De façon encore plus avantageuse si la matière première est présente sous une forme équivalente à un solide, par exemple une pâte visqueuse ou gélifiée, elle sera alimentée sous la forme de particules dont la taille moyenne sera réduite par l'une des méthodes connues par l'homme du métier, telle qu'extrusion ou pompage à travers une conduite de dimension réduite. De préférence, le procédé de synthèse de la matière première riche en glycolipides est conduit de telle manière que la matière première riche en glycolipides soit fluide, voire assimilable à un liquide. De façon encore plus avantageuse, la dissolution de la matière première dans le solvant de dilution est réalisée de façon continue grâce à une technologie de mélange continu en conduite, par exemple la technologie commercialisée par la société SULZER CHEMTECH sous le nom SMI.
La matière première riche en glycolipides et en lipides est diluée dans le mélange d'alcool et d'eau plutôt que dans le solvant organique apolaire avant l'étape d'extraction liquide-liquide, ce qui limite l'exposition au solvant organique apolaire et les risques de rejets de ce solvant. De manière avantageuse, la quantité de mélange d'alcool et d'eau ajouté ne dépasse pas cinq fois la quantité de matière première à traiter, et de préférence ne dépasse pas deux fois la quantité de matière première à traiter. Eventuellement le mélange d'alcool et d'eau contient jusqu'à quelques pourcents de solvant organique apolaire, s'il en est préalablement saturé. C'est notamment le cas lorsqu'il est recyclé et a déjà été utilisé pour l'étape d'extraction. Si nécessaire la phase polaire constituée par la matière première diluée dans le mélange d'alcool et d'eau peut être traitée par centrifugation, filtration, floculation, coagulation ou adsorption, ou toute combinaison de ces techniques, pour éliminer les traces de biomasse résiduelle issue du procédé de synthèse de la matière première, ainsi que si nécessaire tout trouble protéique résiduel dans la solution. Un mode avantageux de mise en œuvre de l'invention consiste à traiter une matière première exempte de biomasse et de protéines grâce à un mode de récolte adapté en fin de synthèse.
Le solvant organique apolaire est avantageusement choisi parmi les alcanes d'une part, ou les hydrocarbures d'origine végétale tels que les terpènes d'autre part. Parmi les alcanes, le solvant organique apolaire est avantageusement choisi parmi le cyclohexane, le n-heptane, le butane ou le pentane sous pression, à l'état liquide. Parmi les hydrocarbures d'origine végétale, le solvant organique apolaire peut être choisi parmi les terpènes, tels que les isomères du limonène, du pinène, ou tout mélange naturel constitué majoritairement par ces espèces. Un mode avantageux de mise en œuvre de l'invention consiste également à utiliser le produit de l'hydrogénation de ces terpènes, par exemple les fractions riches en para-menthane obtenu par hydrogénation de fractions riches en limonène, comme solvant d'extraction apolaire. Le solvant organique apolaire, l'alcool et une partie de l'eau utilisés dans le cadre de l'invention sont recyclés et réutilisés pour leur majeure partie pour le fractionnement de la charge suivante de matière première, le dit fractionnement étant de préférence réalisé de façon continue. Ainsi la consommation de solvant et d'alcool sur le procédé est limitée, de sorte que la quantité totale de solvant et d'alcool consommée soit au moins inférieure à la masse de glycolipides purifiée, de préférence inférieure à un dixième de la masse de glycolipides purifiée.
La phase polaire comprenant les glycolipides est mise en contact avec le solvant d'extraction apolaire, dans des conditions telles que le transfert des impuretés hydrophobes de la phase polaire vers la phase apolaire soit facilité (étape ii.). L'homme du métier connaît bien les différentes méthodes de mise en contact de phases liquides non miscibles pour la mise en œuvre industrielle de méthodes de séparation liquide/liquide. Ces méthodes peuvent être réalisées de manière discontinue (ou « batch ») ou encore de manière continue.
Les conditions nécessaires à un transfert efficace d'une phase à l'autre incluent en particulier un mélange intime des phases, pour que la surface de contact entre les deux liquides soit augmentée. Ce mélange intime des phases peut être assuré par agitation mécanique notamment, dans une cuve ou une colonne agitée par exemple, ou par circulation à contre-courant dans une colonne garnie de plateaux perforés, ou de divers éléments de garnissage en vrac, par exemple des anneaux de Raschig, de Pall ou de Nutter, ou des selles de Berl, ou Intalox, ou par des éléments de garnissage structuré constitué d'un assemblage de plaques corruguées aux dimensions de la colonne. Ces éléments seront par exemple constitués de plastique ou de métal, le choix du matériau devant être gouverné par la nature de la phase continue dans la colonne. Le choix de la phase dite continue est effectué grâce à des tests préalables d'agitation sur des échantillons de phase polaire et apolaire. La phase continue est choisie de telle sorte que la vitesse de décantation et de formation d'une interface claire soit minimisée après arrêt de l'agitation. Un descriptif détaillé de ces technologies et de leurs principes de fonctionnement sont décrits par les ouvrages de référence pour l'homme du métier, par exemple par R.E.Treybal (« Liquid Extraction », Seconde édition, Editions Mc-Graw Hill) ou encore par R.H.Perry, L.A.Robbins and R.W.Cusack (Chapitre 15 du Perry's Chemical Engineering Handbook, Huitième édition, également aux Editions Me Graw Hill).
Les conditions de mise en œuvre sont également choisies telles que le volume ou le débit de solvant d'extraction apolaire requis pour atteindre une pureté en glycolipides supérieure à 95% soit minimisé. C'est-à-dire que l'équipement ou la méthode de séparation mis en œuvre assure, ou simule dans le cas d'un procédé discontinu dans une cuve agitée par exemple, un écoulement à contre-courant des deux phases liquides. Dans cette configuration, l'extrait constitué par la phase apolaire en sortie de colonne était en contact avec la phase polaire peu appauvrie de sorte que la teneur en impuretés dans l'extrait est maximisée. Réciproquement, le raffinât constitué par la phase polaire en sortie de colonne était en contact avec la phase apolaire peu enrichie en impuretés, de sorte que la qualité du raffinât est maximisée. L'efficacité d'un écoulement à contre-courant dans un dispositif d'extraction liquide-liquide est dépendant de la technologie mise en œuvre, des conditions opératoires telles que vitesse d'écoulement ou intensité d'agitation, et des propriétés physico-chimiques des phases telles que tension interfaciale et viscosité. L'efficacité d'un équipement donné dans des conditions données est couramment caractérisée par la notion d'étages théoriques de séparation, mesurable par des essais dédiés réalisés sur un système ternaire dont l'équilibre de phases est connu. Dans le cadre de l'invention décrite ici le nombre d'étages théoriques de séparation à mettre en œuvre est choisi entre 2 et 15, de préférence entre 5 et 10. L'intérêt d'un dispositif à contre-courant avec une efficacité élevée est double puisqu'il diminue le débit de solvant d'extraction requis pour atteindre une pureté donnée, mais aussi de fait augmente le rendement en glycolipides car la teneur en glycolipides dans la phase apolaire récupérée dépend elle peu de l'efficacité mise en œuvre. En effet la phase apolaire est en contact dans la colonne avec une phase polaire dont la concentration en glycolipides est relativement constante. Le ratio massique de solvant organique apolaire est de 0.2 à 3 fois la masse de phase polaire à traiter, de préférence de 0.5 à 1 fois. Dans les conditions décrites ci-dessus il est possible d'atteindre une pureté en glycolipides dans la phase polaire, hors alcool, solvant apolaire et eau, supérieure à 95%, et ce avec un rendement supérieur à 90%, c'est-à-dire que moins de 10% des glycolipides sont extraits avec les impuretés. Ces performances sont suffisamment élevées pour considérer une extrapolation d'un procédé de production de glycolipides par voie fermentaire vers une maille de production industrielle. Parallèlement au mélange intime des phases nécessaire au transfert, il est également nécessaire d'autoriser une coalescence des gouttelettes de phase dispersée, de sorte que celle-ci reste séparée de la phase continue par décantation et que l'opération soit stable, sans engorgement de l'équipement d'extraction par sortie d'une phase avec l'autre. Ce point est essentiel pour assurer un procédé robuste et capacitif. Il s'agit donc de définir le niveau de mélange maximal qui peut être atteint avant que les avantages, à savoir un transfert rapide des solutés d'une phase à l'autre, deviennent inférieurs aux inconvénients, à savoir une diminution du débit maximal qui peut être traité dans un équipement de taille donnée avant engorgement avec sortie d'une phase dans l'autre. Ce niveau de mélange optimal se traduit par la définition des conditions opératoires, par exemple vitesse d'agitation dans le cas des technologies agitées, fréquence ou intensité de pulsation sur le débit d'alimentation dans le cas des colonnes puisées, ou vitesses de passage des fluides dans le cas des technologies fixes, l'objectif étant que la phase dispersée subisse des actions équilibrées de division et coalescence. Ces deux actions peuvent être soit successives dans le cas basique d'un procédé discontinu dans une cuve agitée, où la phase de séparation physique des phases par décantation succède à la phase de transfert sous agitation. Ces deux actions peuvent être simultanées mais séparées dans l'espace dans une colonne à plateaux perforés par exemple ou dans une colonne agitée dans une moindre mesure, ou alors elles peuvent être totalement simultanées par exemple dans une colonne à garnissage. Un dernier exemple pour la mise en œuvre d'une extraction liquide-liquide est l'utilisation de technologies centrifuges telles que celles commercialisées par les sociétés ALFA-LAVAL, ROUSSELET-ROBATEL ou B&P PROCESS EQUIPMENTS.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les étapes ii. et iii. de mise en contact puis de séparation des phases apolaire et polaire sont réalisées de façon simultanée, conjointement, sur un dispositif d'extraction à contre-courant avec circulation continue des deux flux liquides , en particulier sur une colonne d'extraction agitée à contre- courant, ou sur un extracteur centrifuge.
À noter qu'il est possible de considérer l'ajout d'une section de lavage de la phase apolaire en sortie par contre-extraction des glycolipides qu'elle contient, par un mélange d'alcool en C2-C3 et d'eau. Ainsi il est possible de maximiser à la fois le niveau de pureté atteint dans la phase polaire, et le taux de récupération des glycolipides dans cette même phase. Une telle section de lavage peut être mise en œuvre suivant les mêmes principes généraux de l'extraction liquide-liquide décrits précédemment, et de façon avantageuse sont mis en œuvre dans le même équipement que l'étape principale d'extraction des impuretés hydrophobes. Dans ce cas deux alimentations de solutions riches en alcool et en eau sont considérées, l'une en tête de colonne est constituée exclusivement d'alcool et d'eau, et l'autre en un point intermédiaire de la colonne est l'alimentation principale, constituée des glycolipides et des impuretés dissoutes dans un mélange d'alcool et d'eau.
De manière avantageuse, la mise en œuvre de l'étape i) de dissolution et ii) de mise en contact avec la phase apolaire se fait sans chauffage, à température ambiante comprise entre 15 et 30 °C, avantageusement 25 °C. La mise en œuvre du procédé selon l'invention ne nécessite donc pas de chauffage ou de refroidissement pour les étapes i) et ii) ce qui constitue un avantage économique important. Egalement, la plupart des lipides et sous- produits hydrophobes de la fermentation sont extraits lors de cette étape, ils ne sont donc pas exposés aux risques de dégradation thermique qui sont classiques pour les acides gras notamment, et qui peuvent entraîner la formation de sous-produits, notamment responsables de couleur ou d'odeur. Les installations industrielles sont d'ailleurs généralement dans des bâtiments industriels eux même tempérés, à l'abri des grands froids. En cas de grande canicule, les températures élevées susceptibles d'être observées n'ont pas d'impact substantiel sur le résultat obtenu.
La phase apolaire collectée après l'étape iii. est ensuite avantageusement concentrée notamment par évaporation ou distillation, ou encore par des procédés membranaires tels que nanofiltration et particulièrement nanofiltration avec une membrane dont le matériau résiste aux solvants utilisés. Une telle étape de concentration vise à obtenir d'une part un résidu concentré en impuretés hydrophobes qui peut être éliminé du procédé, et d'autre part un solvant organique apolaire régénéré et débarrassé des impuretés, qui peut être recyclé. De manière avantageuse cette concentration est réalisée par évaporation sous une pression supérieure à la pression atmosphérique pour faciliter la condensation des vapeurs de solvant, ou sous une pression inférieure à la pression atmosphérique pour assurer de canaliser toute fuite éventuelle de solvant sur le procédé, tout en limitant le risque de dégradation thermique des produits qui constituent le résidu après évaporation. De préférence, la récupération du solvant apolaire par évaporation est réalisée sous pression réduite. La pression est choisie de préférence entre 900 et 50 mbar absolus, et de préférence entre 500 et 200 mbar absolus. De façon avantageuse, le rendement de récupération du solvant organique apolaire est supérieur à 95%, et de façon encore plus avantageuse la teneur résiduelle en solvant organique apolaire dans le résidu est inférieure à 5 000 ppm. Il est possible que deux phases liquides soient obtenues par la condensation des vapeurs générées. Dans ce cas, les deux phases sont séparées, par exemple par décantation, et seule la phase la plus riche en solvant organique apolaire est recyclée en tant que solvant d'extraction. La phase la moins riche en solvant apolaire est riche en alcool et en eau, et est recyclée en tant qu'appoint pour la dilution de la matière première. Si nécessaire tout ou partie du flux recyclé peut également être traité par une étape supplémentaire de purification, par exemple distillation ou filtration membranaire telle que nanofiltration et particulièrement nanofiltration avec une membrane dont le matériau résiste aux solvants utilisés, voire une fraction du flux peut être purgée, pour éliminer du procédé tout contaminant à l'état de trace susceptible de s'accumuler. La solution retenue pouvant être appliquée de façon continue ou périodique, quelle qu'elle soit.
La phase polaire collectée après l'étape iii. peut éventuellement être traitée par des étapes supplémentaires de purification avant l'étape iv. d'isolation des glycolipides de la phase polaire. Par exemple, la phase polaire peut être soumise à une étape d'adsorption sur des adsorbants tels que résines polymères, greffées ou non, charbons actifs, gels de silice, zéolites, ou terres décolorantes telles que bentonites, ou encore filtration membranaire telle que nanofiltration et particulièrement nanofiltration avec une membrane dont le matériau résiste aux solvants utilisés. L'objectif de cette étape facultative est d'éliminer sélectivement une impureté non extraite par le solvant apolaire ou encore présente à l'état de trace. Toute purification supplémentaire envisagée à ce stade n'influe pas de façon significative sur la teneur massique en glycolipides vis-à-vis des autres impuretés organiques de type lipides. Elle n'impacte que des teneurs inférieures à 1000 ppm en impuretés et ne vise qu'à améliorer les caractéristiques telles que couleur, odeur, ou teneurs en sels, du produit fini. Une telle étape d'adsorption peut être réalisée en continu sur un filtre constitué d'un lit fixe de particules d'adsorbants, ou en discontinu suivant une première étape de mélange de la phase polaire avec l'adsorbant, puis une seconde étape de séparation de la phase polaire purifiée et de l'adsorbant solide. De manière avantageuse, la phase polaire collectée après l'étape iii. est passée sur un lit fixe de résine polymère adsorbante ou de charbon actif.
L'étape iv. consiste à isoler les glycolipides de la phase polaire, ce qui signifie que l'alcool et l'eau qui constituent majoritairement la phase polaire sont récupérés. L'homme du métier connaît les méthodes industrielles permettant d'isoler les glycolipides de la phase polaire, notamment évaporation ou distillation, ou encore des procédés membranaires tels que nanofiltration et particulièrement nanofiltration avec une membrane dont le matériau résiste aux solvants utilisés. De manière avantageuse, les glycolipides sont isolés de la phase polaire par distillation de l'alcool, des traces éventuelles de solvant organique apolaire, et d'une fraction de l'eau, puis par évaporation de l'eau résiduelle.
L'évaporation ou la distillation sont réalisées de préférence à une pression réduite pour éviter la dégradation des glycolipides et la formation de produits secondaires notamment responsables de couleur. De manière avantageuse l'évaporation ou la distillation est réalisée à une pression comprise entre 900 et 50 mbar absolus, de préférence à une pression comprise entre 500 et 100 mbar absolus. De même l'évaporation ou la distillation est réalisée à une température comprise entre 40 et 200°C, de préférence à une température comprise entre 50 et 120°C. La distillation consiste à alimenter la phase polaire dont les glycolipides doivent être isolés sur une colonne garnie d'éléments de garnissage vrac ou structuré identiques à ceux qui ont été décrits pour l'étape d'extraction liquide-liquide, ladite colonne étant équipée d'un évaporateur à son pied et d'un condenseur à sa tête, et l'alimentation étant réalisée de façon homogène sur la section. La colonne et notamment la section basse peut également être équipée de plateaux équipés de cloches, de perforations ou de clapets mobiles ou fixes. De manière avantageuse la section basse est équipée de plateaux dont la conception minimise les risques de moussage, par exemple les technologies commercialisées par les sociétés KOCH-GLITSCH ou UOP, sous les noms ULTRA-TRAY ou MD, respectivement. Le taux de reflux en tête de colonne est réglé pour atteindre une composition cible dans le distillât, et notamment sur le ratio entre eau et alcools. De manière avantageuse, l'étape iv. d'isolation des glycolipides de la phase polaire est réalisée en deux étapes, la première étape consistant à éliminer l'alcool et les traces éventuelles de solvant organique apolaire par distillation puis la seconde étape, facultative, consistant à éliminer l'eau résiduelle par décantation ou évaporation. À l'issue de la première étape de distillation un distillât riche en alcool est obtenu et est recyclé pour la dilution de la matière première riche en glycolipides et en impuretés, en vue de sa purification par extraction liquide-liquide dans les conditions décrites dans l'invention. Si nécessaire tout ou partie du flux recyclé peut également être traité par une étape supplémentaire de purification, par exemple distillation ou filtration membranaire, voire une fraction du flux peut être purgée, pour éliminer du procédé tout contaminant à l'état de trace susceptible de s'accumuler. La solution retenue pouvant être appliquée de façon continue ou périodique, quelle qu'elle soit.
L'évaporation éventuelle de l'eau résiduelle pour obtenir les glycolipides déshydratés est réalisée dans les mêmes gammes de pression et de température que la distillation. Elle est cependant réalisée avantageusement sur une technologie d'évaporation qui minimise le temps de séjour du produit, par exemple sur un évaporateur à film tombant ou à couche mince. De façon encore plus avantageuse, l'évaporation de l'eau résiduelle est réalisée sur une technologie résistante à la présence de mousse, et qui tolère les produits dont la viscosité est élevée. Le terme de viscosité élevée désigne ici une gamme de viscosité qui peut atteindre de 10 à 1 000 Pa.s, ou plus, jusqu'à 5 000 Pa.s, dans les conditions de travail notamment température et taux de cisaillement. De telles technologies d'évaporation indiquées pour la déshydratation des glycolipides sont les évaporateurs à couche mince ou à film raclé, ou les technologies telles que la technologie commercialisée par APV sous le nom PARAVAP. De manière avantageuse, l'étape finale de déshydratation est réalisée sur un évaporateur à couche mince. L'eau récupérée par condensation des vapeurs peut être recyclée sur le procédé si besoin, en remplaçant avantageusement une consommation d'eau extérieure, ou purgée en tant qu'effluent aqueux. L'étape iv. d'isolation des glycolipides peut également inclure une étape de décantation en fonction de la teneur en eau, en alcool et en glycolipides. Une phase aqueuse pauvre en glycolipides peut être formée sous des conditions précises de teneur en alcool, en eau et en glycolipides. Dans ce scénario, la phase aqueuse pauvre en glycolipides est préférentiellement séparée par une technique telle que décantation, hydrocyclone ou centrifugation, et purgée. Si nécessaire, une quantité supplémentaire d'eau peut être ajoutée à tout moment de la séquence d'isolation des glycolipides, mais avant cette étape de décantation de préférence et au plus tard pendant cette étape. Ainsi la quantité de phase aqueuse pauvre en glycolipides à éliminer est augmentée, mais cet effluent peut éliminer des traces de contaminants hydrophiles tels que des sels.
Les glycolipides susceptibles d'être extraits par le procédé selon l'invention sont des produits d'origine naturelle, généralement des produits de fermentation d'huiles végétales ou obtenus par conversion enzymatique d'huiles végétales. On citera en particulier les rhamnolipides, les sophorolipides, les cellobiolipides, les tréhalose lipides, et les mannosylerythritol lipides.
De manière avantageuse, la matière première est un produit de fermentation d'huiles végétales, par exemple huile d'arachide, huile de coco, huile de colza, huile d'olive, huile de palme, huile de soja ou huile de tournesol.
La méthode selon l'invention est particulièrement appropriée pour la purification de mannosylerythritol lipides (MELs) comme glycolipides. Les MELs sont bien connus de l'homme du métier, et comprennent plusieurs molécules identifiées notamment comme MEL-A, MEL-B et MEL-C, suivant leur degré d'acétylation.
La préparation de MELs par fermentation est bien connue de l'homme du métier, en particulier les procédés fermentaires discontinus et les procédés fermentaires semi continus. On peut citer Kitamoto et al. (1990) qui produisent des MELs à partir d'huile de soja comme substrat principal, on peut citer Accorsini et al. (2012) qui produisent des Mels par fermentation d'huile de soja et de glycérol comme substrats principaux, on peut citer Kitamoto et al. (2001 ) qui produisent des MELs à partir d'alcanes comme substrats principaux. On peut encore citer la demande de brevet WO 2014/185805 qui décrit la production de MELs à partir d'une biomasse lignocellulosique. Les procédés discontinus, utilisés par les auteurs précédents, consistent à mélanger la totalité ou la quasi-totalité des éléments du milieu de fermentation dans le réacteur et à fermenter ces éléments avec le microorganisme inoculé.
Les procédés semi continus ou discontinus alimentés consistent en l'ajout au cours de la fermentation de certains des éléments du milieu de fermentation. On peut citer le travail de Rau et al. (2005b) qui réalisent des apports d'huile de soja, de glucose et de nutriments au cours de la production des MELs. Dans la présente invention, le mode de fermentation utilisé, les sources de carbone utilisées, les conditions de fermentation utilisées, la souche du microorganisme utilisé importent peu. Par exemple, la souche utilisée peut être la souche Pseudozyma aphidis DSMZ 70725, une souche des espèces Pseudozyma aphidis, Pseudozyma antartica, Pseudozyma tsukubaiensis, une souche du genre Pseudozyma ou tout autre souche apte à produire des MELs. De même, le milieu de fermentation pour produire les surfactants peut être un milieu de fermentation dont la composition aura été ajustée pour produire les MELs. Ce milieu contiendra une ou plusieurs sources d'azote dont des sources organiques telles que l'extrait de levure et des sources minérales telles que des sels de nitrate, des sels d'ammonium, de l'urée. Le milieu contiendra des sources de carbone telles que des graisses et des huiles telles que huile d'arachide, huile de coco, huile de colza, huile d'olive, huile de palme, huile de soja ou huile de tournesol, d'autres sources de carbone insolubles autres tel que la paraffine ou les alcanes, des sources de carbone solubles tels que le glucose, le fructose, le glycérol, ou toute combinaison de ces sources de carbone. Le milieu contient également des sources de vitamines et minéraux.
De même le pH et la température peuvent être ajustés par l'homme du métier de façon à favoriser la production des MELs. De même, l'agitation et l'aération peuvent être ajustés par l'homme du métier de façon à favoriser la production des MELs. De même, le mode de fermentation peut être un procédé discontinu ou discontinu alimenté, voire un procédé continu.
En fin de fermentation, la phase riche en glycolipides, tels que les rhamnolipides, les sophorolipides, les tréhaloses lipides ou les MELs, en particulier les MELs peut être isolée par tout procédé de séparation solide/liquide, tel que tamisage ou filtration, ou par tout procédé de séparation liquide/liquide, tel que décantation ou centrifugation, selon l'état physique de la phase riche en MELs. L'état physique de la phase riche en MELs dépend notamment du ratio pondéral entre MELs et impuretés telles que les acides gras, mais également d'autres conditions opératoires telles que température et pH, conformément à ce qui est décrit dans la littérature notamment par Rau et al. (2005a) ou dans la demande JP 2007-252280 La phase riche en MELs ainsi isolée constitue la matière première qui peut être traité par le procédé selon l'invention.
Les glycolipides isolés par le procédé selon l'invention ont de manière avantageuse les caractéristiques suivantes, les teneurs étant exprimées en masse et hors eau :
- au moins 90 %, de préférence au moins 95% de glycolipides
- moins de 1 %, de préférence moins de 0.2%, de triglycérides
- moins de 5%, de préférence moins de 3%, d'acides gras libres
- moins de 1000 ppm, de préférence moins de 100 ppm d'alcool en C2-C3
- moins de 50 ppm, de préférence moins de 1 ppm, de solvant organique apolaire. En particulier, les glycolipides sont des MELs. La proportion relative en MELs (A, B ou C) dépendra en particulier de la méthode de fermentation, du substrat de départ et de la souche employée. Ainsi, la composition ci-dessus peut comprendre essentiellement du Mel- A ou du Mel-B ou du Mel-C comme glycolipides. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention la composition ci-dessus comprend une teneur en MELs de 50% à 60 % de MEL- A, 10% à 40 % de MEL-B et 5% à 35% de MEL-C, le pourcentage étant exprimé par rapport au total des MELs dans la composition.
L'invention concerne également un mélange de glycolipides, en particulier de MELs, susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'il a la composition telle que précisée précédemment.
DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 représente le schéma de principe de l'étape d'extraction liquide-liquide, dans le cas le plus courant où le solvant organique apolaire a une densité inférieure à celle de la phase polaire. Le flux (1 ) représente la matière première riche en glycolipides et en impuretés, dissoute et diluée dans le mélange d'alcool en C2-C3 et d'eau, et constitue la phase polaire alimentée. Le flux (1 ) est ainsi alimenté sur une colonne d'extraction liquide- liquide (2) qui assure un écoulement à contre-courant des deux phases liquides, et une séparation des deux phases après transfert des solutés, le schéma indiqué ne préjugeant pas du type de contacteur utilisé ni du mode de séparation des phases ainsi que cela a été décrit dans la description détaillée de l'invention. La seconde alimentation liquide (3) est constituée par le solvant organique apolaire. Plus précisément elle est constituée par le mélange du solvant organique apolaire recyclé (4) et d'un appoint en solvant organique apolaire pur (5). De façon avantageuse, le débit du flux recyclé (4) est très supérieur au débit requis pour le flux d'appoint (5). Dans le cas le plus courant où le solvant organique apolaire a une densité inférieure à celle de la phase polaire, il remonte dans la colonne (2) par gravité, à contre-courant de la phase polaire, plus lourde. La phase raffinât (6) constitue la phase polaire purifiée car appauvrie en impuretés hydrophobes, elle est récupérée en pied de la colonne (2) après un temps de décantation suffisant pour prévenir tout entraînement de solvant d'extraction apolaire (3). La phase extrait (7) est constituée par le solvant d'extraction apolaire saturé en alcool et en eau du fait du contact avec la phase polaire, et enrichi par les solutés extraits. De façon avantageuse dans les conditions de l'invention, les solutés extraits sont très majoritairement des impuretés hydrophobes, et de façon minoritaire des glycolipides. Dans l'une des configurations de l'invention, la phase extrait (7) est alimentée sur un évaporateur (8), qui génère des vapeurs riches en solvant organique apolaire (9) qui sont récupérées dans un état liquide après condensation et refroidissement sur le condenseur (10). Les vapeurs condensées (4) constituent alors le flux de recyclage en solvant apolaire. La fraction non évaporée (1 1 ) de la phase extrait (7) constitue le résidu de l'opération, il est riche en impuretés hydrophobes et est éliminé du procédé. De façon avantageuse, le rendement de récupération du solvant organique apolaire du flux (7) vers le flux (4) est supérieur à 95%.
La figure 2 représente une version améliorée de l'étape d'extraction liquide-liquide, où une étape de lavage de la phase extrait par un mélange d'alcool en C2-C3 et d'eau est mise en œuvre pour maximiser le taux de récupération des glycolipides. Cette figure 2 est également réalisée pour le cas le plus courant où le solvant organique apolaire a une densité inférieure à celle de la phase polaire. Le descriptif et les références données pour la figure 1 restent valables pour cette figure 2, mais la colonne d'extraction liquide-liquide (2) est également alimentée dans le cas de la figure 2 par un flux supplémentaire de mélange d'alcool en C2-C3 et d'eau (12) en tête de colonne. L'alimentation polaire globale est donc constituée d'une part par le flux (1 ) qui représente la matière première riche en glycolipides et en impuretés, dissoute et diluée dans un mélange d'alcool en C2-C3 et d'eau, et par le flux (12) qui est constitué d'un mélange d'alcool en C2-C3 et d'eau sans glycolipides ni impuretés. Ainsi la principale étape d'extraction des impuretés est réalisée sur la section basse (13) de façon analogue au cas général décrit par la figure 1 , mais une seconde étape de séparation est réalisée sur la section haute (14) qui consiste à laver la phase apolaire avant sa récupération en tête de colonne. Sur cette section haute (14) les glycolipides éventuellement présents dans la phase apolaire ascendante au niveau de l'alimentation principale (1 ) sont à nouveau extraits dans la phase polaire de lavage (12), ce qui assure une teneur minimale en glycolipides dans l'extrait (7) qui est récupéré en tête de colonne (2). Dans cette configuration optimisée il est possible d'atteindre un rendement et une qualité supérieurs à 98%. La phase polaire de lavage issue de (12) et l'alimentation polaire principale (1 ) se mélangent spontanément au niveau de l'alimentation principale (1 ), et une phase raffinât unique (6) est récupérée en pied de colonne (2).
La figure 3 représente le principe général de mise en œuvre de l'invention. La matière première (1 ) riche en glycolipides et en impuretés est dissoute lors de l'étape i. par mélange avec un mélange d'alcool en C2-C3 et d'eau (2). La solution obtenue est alors éventuellement mais non obligatoirement clarifiée lors d'une étape A, avant d'être mise en contact avec le solvant d'extraction apolaire (3) lors de l'étape ii. Les deux phases liquides, l'une polaire et l'autre apolaire, sont séparées lors de l'étape iii. La phase apolaire récupérée (4) est alors éventuellement concentrée lors d'une étape B, pour obtenir un solvant d'extraction régénéré qui peut être recyclé en (3). Le résidu (5) constitue un déchet pour le procédé, où sont éliminées les impuretés avec une teneur réduite en glycolipides. La phase polaire purifiée (6) récupérée à l'issue de l'étape iii. est alors éventuellement traitée par des étapes complémentaires mais non obligatoires de purification, lors d'une étape C. Les glycolipides purifiés (7) sont alors isolés de la phase polaire purifiée lors de l'étape iv., à l'issue de laquelle sont également récupérés l'alcool et une partie de l'eau (8) qui peuvent être recyclés en (2), et éventuellement de l'eau excédentaire (9) qui peut être purgée. La figure 8 représente le mode de mise en œuvre privilégié de l'étape iv. d'isolation des glycolipides à partir de la phase polaire, c'est-à-dire la succession d'une étape de distillation de l'alcool et des traces éventuelles de solvant organique apolaire, d'élimination après décantation de la phase d'eau excédentaire, et d'évaporation de l'eau résiduelle.
La figure 4 représente un exemple de procédé mis en œuvre pour l'étape iv. d'isolation des glycolipides. La phase polaire purifiée (1 ) est alimentée sur une colonne de distillation (2), éventuellement avec une quantité d'appoint d'eau pure (3). De l'énergie est apportée au procédé au niveau du rebouilleur (4) et des vapeurs riches en solvant sont récupérées en tête de colonne et condensées sur le condenseur (5). Le distillât obtenu est réparti entre un reflux (6) vers la colonne, et une collecte (7) d'un mélange d'alcool en C2- C3 et d'eau purifié qui peut être recyclé pour l'étape i. du procédé. Le résidu liquide (8) est collecté au niveau du rebouilleur (4), et éventuellement refroidi et décanté sur l'équipement (9). L'eau excédentaire éventuelle (10) est séparée, et est soit recyclée vers l'alimentation (1 ) soit purgée du procédé pour aboutir à l'effluent aqueux (1 1 ). La phase riche en glycolipides (12) est alors alimentée sur un évaporateur (13). Les vapeurs (14) sont essentiellement constituées d'eau mais contiennent encore des traces d'alcool. Elles sont condensées sur (15) pour produire un distillât (16), qui est soit recyclé sur la colonne (2) soit purgé pour aboutir à un second effluent aqueux (17).
La figure 5A présente le chromatogramme HPLC obtenu lors de l'analyse de la matière première riche en glycolipides et en impuretés, utilisée comme produit de départ pour l'invention. L'abscisse représente le temps d'élution en minutes. L'ordonnée est masquée et indiquée en unités arbitraires spécifiques à l'appareil d'analyse utilisé, les quantifications sont réalisées avec l'aide d'un étalonnage externe. Les pics sont identifiés par les acronymes TAG, FFA, Ul, et MELs qui renvoient respectivement aux triglycérides (Tri Acyl Glycerides), aux acides gras (Free Fatty Acids), à d'autres impuretés non identifiées, et aux glycolipides (Mannosyl Erythritol Lipids dans le cadre de cet exemple). La teneur totale en glycolipides quantifiée à partir de ce chromatogramme est 43 % en masse. La pureté en glycolipides par rapport aux lipides totaux est de 65% en masse, sans compter les impuretés non identifiées.
La figure 5B présente le chromatogramme HPLC obtenu lors de l'analyse d'un échantillon de glycolipides purifiés selon l'invention. Les conditions d'analyse ainsi que les références d'affichage sont rigoureusement identiques à celles de la figure 5A. e la matière première riche en glycolipides et en impuretés, utilisée comme produit de départ pour l'invention. Les pics sont identifiés par les acronymes TAG, FFA, Ul, et MELs qui renvoient respectivement aux triglycérides (Tri Acyl Glycerides), aux acides gras (Free Fatty Acids), à d'autres impuretés non identifiées, et aux glycolipides (Mannosyl Erythritol Lipids dans le cadre de cet exemple). La teneur totale en glycolipides quantifiée à partir de ce chromatogramme est 96.5 % en masse. La pureté en glycolipides par rapport aux lipides totaux est également de 96.5% en masse, la principale impureté résiduelle quantifiable étant les acides gras.
La figure 6 présente la sélectivité de l'extraction liquide-liquide, définie comme étant le rapport du coefficient de partage des acides gras (FFA - Free Fatty Acids) par le coefficient de partage des glycolipides (MEL - Mannosyl Erythritol Lipids dans le cadre de cet exemple), en fonction du rapport pondéral éthanol/eau dans la phase polaire telle que constituée avant l'étape d'extraction. Le coefficient de partage K d'une espèce est lui-même défini par le rapport de la concentration de l'espèce dans la phase apolaire (extrait) par la concentration de l'espèce dans la phase polaire (raffinât) à l'équilibre. Les valeurs de ces coefficients de partage sont prises à l'équilibre entre les deux phases, et les essais réalisés pour les obtenir sont décrits dans les exemples 2 et 6. La figure 6 illustre bien d'une part que la sélectivité pour les impuretés (FFA) vis-à-vis des glycolipides (MEL) est nettement supérieure à 1 dans l'ensemble des conditions testées, ce qui démontre l'effet purifiant de l'extraction sur la phase polaire, et d'autre part que la sélectivité est très nettement supérieure dans les conditions proposées dans l'invention concernant le rapport pondéral alcool/eau. En effet les valeurs minimales, où l'extraction des impuretés est tout de même sept fois plus efficace que l'extraction des glycolipides, sont obtenues lorsque le rapport est soit de 2, soit de 4. Lorsque le rapport est de 3 environ, les sélectivités obtenues dépassent 20 et atteignent parfois 100.
EXEMPLES
Exemple 1 - Production de MELs par fermentation
La souche Pseudozyma aphidis DSM 70725 est conservée sur un milieu gélosé PDA (Potatoe Dextrose Agar). Elle a été transférée à l'oese dans un milieu de préculture et cultivée stérilement pendant 2 jours à 30°C et 200 rpm dans une fiole d'erlenmeyer remplie au 1 /5. Cette première étape de propagation a ensuite été transférée stérilement dans une seconde étape de propagation avec un taux de transfert de 10% vol/vol. Cette seconde étape de propagation a été ensuite transférée dans une troisième étape de propagation avec un taux de transfert de 10% vol/vol. La composition du milieu de préculture est donnée dans le tableau suivant :
Figure imgf000020_0001
Le tout est dissout dans de l'eau distillée et est stérilisé à 121 °C pendant 20 minutes. Le volume du milieu liquide est limité à 1/5 du volume total de la fiole pour une oxygénation optimale. La culture de propagation a été incubée pendant 2 jours à 30 °C et 200 rpm. Elle a ensuite été transférée dans un fermenteur instrumenté de 7L total équipé de sondes température, pH, p02 et mousse préalablement calibrées selon les règles habituelles pour l'homme du métier.
La composition du milieu de fermentation est donnée dans le tableau suivant :
Produit Concentration en g/L
NH4N03 2
KH2P04 0,2
MgS04 x 7H20 0,2
Extrait de levure 1
Concentration
Produit
en % volume/volume
Huile de colza 8% Les ingrédients du milieu ont été dissouts dans de l'eau désionisée et le milieu a été stérilisé dans le fermenteur à 121 °C pendant 30-40 minutes. Le volume de milieu préparé a été de 4.32L. Le volume de transfert du milieu de propagation a été de 10% vol/vol. La fermentation a été régulée à 37°C, la p02 a été régulée de façon à être supérieure à 0 par l'agitation et l'aération.
Au cours de la fermentation, la phase organique contenant l'huile de soja, les acides gras issus de l'hydrolyse des triglycérides de l'huile et les MELs ont été séparés de la phase aqueuse. Cette séparation a été réalisée par centrifugation discontinue et la phase organique a été récupérée pour séparation des MELs et des autres composés.
En fin de fermentation, des billes de gel contenant l'huile de soja, les acides gras issus de l'hydrolyse des triglycérides de l'huile de soja et les MELs ont été séparés de la phase aqueuse par séparation solide/liquide sur un tamis de 200 μηι.
Des matières premières enrichies en MELs peuvent être obtenues de manière similaire par la fermentation d'autres huiles végétales, comme les huiles d'arachide, de coco, de colza, d'olive, de palme ou de tournesol ou des mélanges d'huile et d'autres substrats carbonés tels que du glucose ou du glycérol.
Exemple 2 - Extraction sélective de lipides neutres avec le cyclohexane
Un produit brut riche en MELs (matière première) a été produit dans des conditions similaires à celles décrites dans l'exemple 1. La composition du produit brut telle que mesurée par HPLC était de 43 w% en MELs (dont 22.7 w% de MEL-A, 5.1 w% de MEL-B, 15.2 w% de MEL-C), 35 w% en eau et le complément constitué d'impuretés hydrophobes, acides gras pour la majeure partie. Ce produit brut est dilué dans une solution d'eau et d'éthanol dans les proportions décrites dans le tableau ci-dessous. La solution obtenue est filtrée sur papier filtre WHATMAN™ GF/F (0.7 μηη) pour éliminer les traces de solides tels que biomasse résiduelle et protéines responsable de trouble. Elle est ensuite mise en contact avec du cyclohexane dans les proportions décrites dans le tableau ci-dessous.
Soit ratio Ratio massique
Teneur en eau
Ratio massique massique entre
Essai dans le mélange
(éthanol+eau) éthanol/eau dans cyclohexane et
N° d'éthanol et d'eau
/produit brut la phase polaire phase polaire ajouté
(chargée) (chargés)
1 10% 2,0 3,27 1 ,0
2 10% 1 ,0 2,00 1 ,0 3 25% 2,0 1 ,76 1 ,0
4 18% 2,0 2,31 3,0
5 18% 4,0 3,07 4,5
6 18% 8,0 3,66 4,5
Pour chaque essai, la cellule contenant les deux phases liquides est agitée pendant 8 heures à l'aide d'un barreau aimanté pour assurer un temps de contact suffisant pour les phases et l'atteinte des concentrations en solutés à l'équilibre dans chacune des phases. La cellule est également double-enveloppée et thermostatée à 25°C pour assurer une température constante et maîtrisée sur toute la durée de l'essai. Après arrêt de l'agitation, un temps de repos de 5 heures est appliqué pour assurer une séparation parfaite des phases liquides par décantation. Chacune des deux phases est alors prélevée et analysée par HPLC, pour la quantification des teneurs massiques en MEL A et en impuretés. Seuls les MEL A sont quantifiés car il s'agit de la forme avec le degré d'acylation le plus élevé parmi les formes de MELs, donc la plus susceptible d'être extraite dans la phase apolaire parmi les formes A, B et C. Les résultats présentés dans le tableau ci-dessous indiquent clairement un coefficient de partage, c'est-à-dire un ratio de la concentration en phase apolaire par la concentration en phase polaire, nettement supérieur pour les acides gras que pour les MELs. Surtout, les teneurs en triglycérides ne sont pas indiquées car les teneurs résiduelles en triglycérides dans la phase polaire étaient systématiquement sous la limite requise pour une quantification fiable, et notamment non détectés pour les essais 5 et 6 ce qui signifie que la teneur en triglycérides était inférieure à 100 ppm environ pour ces essais.
Composition phase Composition phase
Coefficients de partage
Essai polaire apolaire
N° MEL A, Acides MEL A, Acides Acides
MEL A
w% gras, w% w% gras, w% gras
1 6,28% 1 ,60% 0,73% 3,25% 0,12 2,03
2 8,17% 1 ,56% 2,88% 3,76% 0,35 2,41
3 5,32% 0,61 % 1 ,78% 3,04% 0,33 4,98
4 7,04% 0,55% 0,15% 1 ,21 % 0,02 2,20
5 4,01 % 0,14% < 0.15% 0,52% 0,04 3,71
6 2,15% 0,05% < 0.15% 0,15% 0,07 3,00 Exemple 3 - Extraction sélective de lipides neutres avec les terpènes
Les essais d'extraction liquide-liquide décrits dans l'exemple 2 ont été reproduits strictement à l'identique pour les essais 1 , 2 et 3, notamment en ce qui concerne la régulation de la température à 25°C, la seule différence étant que le solvant apolaire utilisé a été du Dipentene 38, mélange de terpènes commercialisé par la société D.R.T., à la place du cyclohexane. Le Dipentene 38 contient notamment 40% de dipentène, mélange racémique des isomères d-limonène et l-limonène, 20% de alpha-terpinène, 10% de gamma-terpinène, et 20% de terpinolène. Les conditions des essais sont décrites dans le tableau ci-dessous.
Figure imgf000023_0001
Les résultats présentés dans le tableau ci-dessous confirment que des performances similaires au cyclohexane sont obtenues avec le mélange de terpènes. Le coefficient de partage des MELs est très nettement en faveur de la phase polaire, tandis que le coefficient de partage des acides gras est très nettement en faveur de la phase apolaire.
Figure imgf000023_0002
Exemple 4 - Purification de MELs par extraction liquide-liquide continue - 1
Un produit brut riche en MELs a été produit dans des conditions similaires à celles décrites dans l'exemple 1 . La composition du produit brut telle que mesurée par HPLC était de 39.3 w% en MELs, et de 21 .5 w% en impuretés de type lipides, acides gras ou triglycérides (figure 5A). La teneur en eau est de l'ordre de 35% en masse. Ce produit brut a l'apparence d'une pâte visqueuse, et est dilué par un mélange constitué de 85% d'éthanol et 15% d'eau, dans un premier temps avec un ratio de 0.5 masse de mélange d'alcool et d'eau par masse de produit de départ. Le ratio ethanol/eau est proche de 1 dans la solution liquide obtenue à l'issue de cette première dilution. La solution est centrifugée à 4000 G pendant 30 min sur une centrifugeuse ROTINA 380R. Le liquide surnageant est récupéré par surverse et filtré sur papier filtre WHATMAN™ GF/F (0.7 μηη) pour éliminer le trouble. Une seconde dilution par le même mélange à 85% d'éthanol et 15% d'eau est alors réalisée, avec un ratio de 2.35 masses de mélange d'alcool et d'eau par masse de solution clarifiée. À l'issue de cette seconde dilution le ratio massique éthanol/eau dans la solution liquide est donc de 3.6. La seconde solution obtenue est utilisée comme alimentation polaire pour l'étape d'extraction liquide-liquide continue à suivre. Une colonne d'extraction mécaniquement agitée, de technologie KUHNI commercialisée par la société SULZER, de diamètre interne 32 mm et de hauteur agitée 900 mm, est alimentée d'une part en tant que phase lourde la phase polaire décrite précédemment, et d'autre part en tant que solvant d'extraction apolaire par du cyclohexane pur à 99.9%. Les débits d'alimentation de chaque phase sont réglés à 4.5 kg/h pour la phase polaire et à 2.6 kg/h pour le solvant d'extraction apolaire, de sorte que le ratio massique des deux débits soit de 0.58. La température est régulée à 25°C sur toute la hauteur de la colonne grâce à une double-enveloppe avec circulation d'eau. La vitesse d'agitation est réglée à 100 tours par minute, et après une durée de stabilisation d'une heure les débits et compositions des flux de sortie sont mesurés. Le point de fonctionnement obtenu est décrit par le tableau suivant. Ce point de fonctionnement est encore maintenu pendant plus de deux heures de façon stable, et n'a été interrompu que pour cause d'épuisement des produits à alimenter.
Figure imgf000024_0001
Le bouclage du bilan massique est proche de 100% pour les MELs et pour les triglycérides et esters gras. Un écart de 15% non négligeable est relevé pour les acides gras, mais reste dans la marge d'incertitude cumulée des analyses et des mesures de débits. Le rendement de récupération des MELs dans la phase raffinât est supérieur à 95%. Une masse de 1 066 grammes de phase polaire purifiée est concentrée par évaporation sur un évaporateur rotatif, référence R-200 commercialisé par la société Buchi, à une pression de 250 mbar et à une température de chauffe de 75°C, jusqu'à obtenir une concentration par un facteur 5. À ce stade 213 grammes d'eau déminéralisée sont ajoutés et l'évaporation est reprise. La pression est descendue jusqu'à 1 mbar en fin d'opération, avec une température de chauffage maximale de 90°C, pour limiter le temps de l'opération réalisée en batch. Une masse de 89 grammes de résidu est obtenue. Le résidu est fortement visqueux, de couleur orange et limpide. Il contient une concentration totale en MELs de 95.6 w%. Les teneurs résiduelles en acides gras et en triglycérides ou esters gras sont quantifiées à 3.35 w% et à 0.35 w% respectivement (figure 5B). La teneur totale en eau est mesurée par analyse Karl-Fischer à 2 w%, tandis que les teneurs résiduelles en alcool et en solvant apolaire sont confirmées à moins de 1000 ppm en éthanol et moins de 1 ppm en cyclohexane par analyse GC-MS.
Exemple 5 - Purification de MELs par extraction liquide-liquide et adsorption
Cet exemple décrit une façon avantageuse de mettre en œuvre l'invention, en incluant également une étape de décoloration sur charbon actif. Une masse totale de 7.57 kg de la phase polaire purifiée produite dans les conditions de l'exemple 4, sont passés sur une colonne de 25 mm de diamètre intérieur, et 25 cm de haut, garnie de charbon actif fourni par la société CECA CARBON sous la référence ECA 14 076. Plusieurs essais sont réalisés avec des vitesses superficielles comprises entre 1 et 4 m/h pour la phase liquide. La masse totale de charbon actif utilisée est de 123 grammes. Le liquide récupéré après passage sur charbon est ensuite fractionné par distillation discontinue à 250 mbar sur une colonne de distillation de 25 mm de diamètre intérieure, garnie sur une hauteur de 1 m par du garnissage métallique vrac Pro-Pak™. Une masse de 1.25 kg de solution est traitée à chaque opération alimentée en continu pendant l'essai pour garder un colume constant d'environ 300 à 400 g dans le bouilleur, et 250 g d'eau déminéralisée sont ajoutés en fin d'essai jusqu'à élimination des de l'alcool en tête de colonne. Le résidu de la distillation est refroidi et décanté, une masse de 445 grammes d'eau excédentaire est séparée. La teneur en MEL dans cette eau excédentaire est inférieure à 1 %. Une masse de 1.07 kg de phase inférieure riche en MEL et en eau est concentrée sur évaporateur rotatif dans les mêmes conditions que décrites dans l'exemple 4. Une masse de 393 grammes de résidu est obtenue. Le résidu est fortement visqueux, de couleur jaune à jaune orangé et limpide. Il contient une concentration totale en MELs mesurée à 100.8 w%. Mais compte tenu de l'incertitude analytique ce résultat peut être normalisé avec les teneurs résiduelles en acides gras et en triglycérides ou esters gras qui sont quantifiées à 3.35 w% et à 0.35 w% respectivement, pour aboutir à une pureté relative en glycolipides par rapport aux lipides totaux de 96.5%, identique à l'échantillon obtenu en fin d'exemple 4. La teneur totale en eau est mesurée par analyse Karl-Fischer à 0.14 w%, tandis que les analyses des teneurs résiduelles en alcool et en solvant par GC-MS donnent un résultat comparable pour l'éthanol et proche de 0.1 ppm pour le cyclohexane.
Exemple 6 - Purification de MELs par extraction liquide-liquide continue - 2
Les conditions de l'exemple 4 ont été reproduites à l'identique jusqu'à l'étape d'extraction liquide-liquide, ce qui avait eu pour effet de produire une solution polaire riche en glycolipides et en lipides, dans laquelle le ratio massique éthanol/eau était de 3.6. Un second point de fonctionnement a été réalisé en ajustant les débits d'alimentation de chaque phase à 4.1 kg/h pour la phase polaire et à 2.8 kg/h pour le cyclohexane, de sorte que le ratio massique des deux débits soit de 0.68. La température est régulée à 25°C sur toute la hauteur de la colonne grâce à une double-enveloppe avec circulation d'eau. La vitesse d'agitation est réglée à 100 tours par minute, et après une durée de stabilisation d'une heure les débits et compositions des flux de sortie sont mesurés. Le point de fonctionnement obtenu est décrit par le tableau suivant
Figure imgf000026_0001
Le bouclage du bilan massique est proche de 100% pour les MELs. Des écarts de 5 et 10% sont relevés pour les acides gras et pour les triglycérides ou esters gras respectivement, mais restent dans la marge d'incertitude cumulée des analyses et des mesures de débits. Le rendement de récupération des MELs dans la phase polaire purifiée reste supérieur à 95% quoique légèrement dégradé par rapport aux résultats de l'exemple 4. La pureté des MELs en revanche dans la phase polaire purifiée est augmentée puisque les glycolipides représentent 97.5% du total des lipides quantifiés. Augmenter le débit de solvant d'extraction sur un équipement donné permet donc d'augmenter le niveau de pureté atteint, avec une diminution acceptable du rendement dans les conditions décrites.
Exemple 7 - Effet d'une teneur insuffisante en eau dans la phase polaire
Les essais d'extraction liquide-liquide décrits dans l'exemple 2 ont été reproduits strictement à l'identique pour les essais 10, 1 1 et 12, notamment en ce qui concerne la régulation de la température à 25°C, la seule différence étant que la matière première testée provenait d'un lot de production dont la composition était significativement différente de l'exemple 2 : en effet la composition du produit brut était de 35.24 w% en MELs (dont 21 .62 w% de MEL-A, 3.96 w% de MEL-B, 10.12 w% de MEL-C), 35.5 w% de FFA, et 18.9 w% d'eau. Les ratios massiques pour les différentes dilutions ont été modifiés et sont décrits dans le tableau ci-dessous.
Figure imgf000027_0001
Les résultats présentés dans le tableau ci-dessous confirment que des sélectivités très importantes, supérieures à 30 dans les deux cas comme indiqué par le Figure 6, sont obtenues lorsque le ratio massique ethanol/eau est proche de 3, malgré les variations de qualité de matière première et de ratios de dilutions. Cependant cette sélectivité tend à diminuer pour l'essai n°1 1 où le ratio massique éthanol/eau est de 4. Dans ce cas l'extraction des acides gras reste performante car la concentration dans la phase apolaire est deux fois plus élevée que dans la phase polaire, mais la sélectivité diminue du fait d'une extraction plus importante des glycolipides. La sélectivité pour ce point reste satisfaisante car elle est de 7, mais elle montre qu'une augmentation excessive de la teneur en eau a pour effet de diminuer la sélectivité de l'extraction.
Essai Composition phase Composition phase
Coefficients de partage
N° polaire apolaire Acides Acides Acides
MELs, w% MELs, w% MEL
gras, w% gras, w% gras0 3,50% 0,41 % 0,13% 1 ,16% 0,04 2,831 4,68% 3,01 % 1 ,61 % 7,00% 0,34 2,332 5,93% 0,74% 0,59% 2,83% 0,10 3,82
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- EP 1 027 413
- EP 1 222 009
- EP 1 813 664
- US 201 1/019207

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé de purification de glycolipides par extraction liquide/liquide à partir d'une matière première comprenant les glycolipides à purifier et des impuretés hydrophobes caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives de
1. dissoudre la matière première dans une phase polaire comprenant au moins un alcool en C2-C3 et de l'eau pour dissoudre les glycolipides, puis
ii. mise en contact de la phase polaire avec une phase apolaire comprenant un solvant organique apolaire non miscible à la phase polaire pour permettre le transfert des impuretés hydrophobes dans la phase apolaire, puis
iii. séparation des phases polaires et apolaires et récupération de la phase polaire purifiée, puis
iv. isolation des glycolipides de la phase polaire purifiée
caractérisé en ce que le rapport pondéral alcool/eau dans la phase polaire va de 2/1 à 5/1.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'alcool en C2-C3 est choisi parmi l'éthanol, l'isopropanol et leurs mélanges en toutes proportions.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le rapport pondéral phase polaire/matière première dans l'étape i. de dissolution est inférieur ou égale à 5.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le solvant organique de la phase apolaire est choisi parmi le cyclohexane, l'heptane, le butane ou le pentane à l'état liquide ou un hydrocarbure insaturé d'origine végétale tel que les terpènes, limonène, ou pinène, ou leurs dérivés hydrogénés, tel que le paramenthane.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape ii. de mise en contact des phases apolaire et polaire et l'étape iii. de séparation de ces phases sont réalisées conjointement sur un dispositif d'extraction à contre-courant avec circulation continue des deux flux liquides.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la phase polaire obtenue à l'étape iii. est soumise à une étape de décoloration, par exemple adsorption sur charbon actif, avant d'isoler les glycolipides.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'étape iv d'isolation des glycolipides est réalisée par distillation ou évaporation de l'alcool, des traces éventuelles de solvant organique apolaire et de l'eau.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'étape iv d'isolation des glycolipides est réalisée par distillation de l'alcool, des traces éventuelles de solvant organique apolaire et d'une fraction de l'eau, puis évaporation de l'eau résiduelle.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'une quantité supplémentaire d'eau est ajoutée à la phase polaire purifiée après extraction pour faciliter l'isolation des glycolipides, l'éventuel excédent d'eau étant éliminé par décantation avant évaporation.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les glycolipides sont des MELs.
1 1 . Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la matière première est un produit de fermentation d'huile végétale.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 1 1 , caractérisé en ce que les glycolipides isolés ont les caractéristiques suivantes, les teneurs étant exprimées en masse et hors eau :
au moins 90% de glycolipides
moins de 1 %, de préférence moins de 0.2%, de triglycérides
moins de 5%, de préférence moins de 3%, d'acides gras libres
moins de 1000 ppm, de préférence moins de 100 ppm, d'alcools en C2-C3, moins de 50 ppm, de préférence moins de 1 ppm, de solvant apolaire.
13. Mélange de glycolipides susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 1 1 , caractérisé en ce qu'il a la composition suivante les teneurs étant exprimées en masse et hors eau :
au moins 90% de glycolipides
moins de 1 %, de préférence moins de 0.2%, de triglycérides
moins de 5%, de préférence moins de 3%, d'acides gras libres
moins de 1000 ppm, de préférence moins de 100 ppm d'alcool en C2-C3 moins de 50 ppm, de préférence moins de 1 ppm, de solvant organique apolaire.
14. Mélange selon la revendication 13, caractérisé en ce que les glycolipides sont des mannosylerythritol lipides (MELs) comprenant un mélange de MEL-A, MEL-B et MEL-C.
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