WO2017174100A1 - Parallelisierung des sted-mikroskopieverfahrens - Google Patents

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WO2017174100A1 PCT/EP2016/000581 EP2016000581W WO2017174100A1 WO 2017174100 A1 WO2017174100 A1 WO 2017174100A1 EP 2016000581 W EP2016000581 W EP 2016000581W WO 2017174100 A1 WO2017174100 A1 WO 2017174100A1
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diffractive optical
optical element
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excitation
regions
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Karl-Heinz Brenner
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Universitaet Heidelberg
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/58—Optics for apodization or superresolution; Optical synthetic aperture systems

Definitions

  • the present invention relates to a STED microscope and a ST E D method.
  • STED Microscopic stimulated emission and depletion
  • the object is illuminated not only with the focused excitation beam, but simultaneously with a second beam, the "switch-off beam", with an annular or donut-shaped light distribution
  • the excitation beam and the switch-off beam overlap so that the maximum intensity of the excitation beam in the center of the turn-off beam (ie, where the turn-off beam is dark) .
  • This causes the fluorescence molecules in the outer area of the excitation focus to be "switched off” in a targeted manner.
  • the fluorescence molecules in the central area remain unaffected. Details of the STED method are described in detail in the literature and are assumed to be known.
  • a first aspect of the invention relates to a STED microscope with diffractive elements.
  • the microscope comprises a light source or lighting device that is designed to generate an excitation beam and a switch-off beam.
  • the wavelength of the excitation beam may be suitably selected to excite the fluorescent dyes in the sample to be examined.
  • the wavelength of the turn-off beam (STED beam) can be suitably selected to achieve a stimulation of stimulated emission by deactivating or switching off excited fluorescent dyes.
  • the light source may e.g. pulsed or cw lasers, and possibly other optical components, such as beam splitters, collimators, lenses, etc.
  • an array of focused light spots or illumination spots is generated by means of the first diffractive optical element.
  • an array for example a one-dimensional or two-dimensional array, of annular or donut-shaped illumination spots (switch-off regions or depletion regions) is formed. Areas) for STED microscopy.
  • the centers of the point-shaped excitation regions preferably coincide with the centers of the annular or donut-shaped switch-off regions.
  • the first and / or the second diffractive optical element may be transmissive elements. This allows a particularly compact construction of the STED microscope.
  • the individual excitation regions are generated by the respective sub-elements of the first and second diffractive optical elements.
  • Each diffractive sub-element has a pattern which is designed to generate the corresponding point or donut-shaped intensity distribution in the respective excitation or switch-off region by means of diffraction.
  • the pattern can be generated, for example, by lithography or other suitable methods.
  • the STED microscope can comprise a detection unit for detecting the fluorescence emitted by a sample to be examined.
  • the detection unit may comprise a two-dimensional detector, e.g. a CCD camera.
  • An advantage of the proposed STED microscope is the "parallelization" of the STED method, as the object is simultaneously illuminated by multiple excitation and turn-off beams, creating multiple excitation and turn-off areas, in conventional STED methods based on a serial scan of the object , the illumination time (dwell time) per point is very short.
  • a much longer residence time eg, about 10,000 times
  • irradiation with significantly more light eg 10,000 times
  • the working distance (i.e., the focal length fo) of the STED microscope may be greater than that of conventional STED microscopes.
  • the working distance is equal to or greater than 1000 pm.
  • Another advantage is that by means of diffractive optical elements a Dahlfallt of Intensity curves can be generated, the individual parameters of the intensity distribution (such as ring radius and ring width) can be set independently. As a result, the STED microscope can be better and more flexibly adapted to the respective measurement situation.
  • r 0 ⁇ (x, y) a vector describing the displacement with respect to the origin of the excitation area (excitation focus) or the donut-shaped disabling area in the x-y plane, where the x-y is the plane perpendicular to the direction of light propagation z; J 0 is a Bessel function of zeroth order;
  • R 0 is the ring radius of the generated donut-shaped switch-off region.
  • the amplitude and the phase of the sub-elements of the first and second diffractive optical elements can each be obtained by means of Fourier transformation of the formula (2) or of the formula (3).
  • the Fourier transform of formula (2) or formula (3) thus provides an "ideal" diffractive sub-element for the first and second diffractive optical elements, respectively continuous phase up.
  • the complex amplitude of a binarized phase element can thus be described by the formula (4):
  • the diffractive optical elements or sub-elements defined by the formulas (2) and (3) are particularly suitable for producing optimal punctiform or donut-shaped light distributions.
  • a diffractive optical element or sub-element defined by formula (2) has a much sharper focus (in both the x and y directions) than a comparable refractive optical element (eg, a microlens made of glass or plastic). This allows a higher precision and a better resolution of the scan.
  • Each donut-shaped region (switch-off region) produced by means of a diffractive optical element according to the formula (3) has a ring width and a ring radius which are predetermined by the periodically arranged sub-elements of the first diffractive optical element ,
  • a particular advantage of the proposed diffractive optical element is that the ring radius can be chosen almost arbitrarily and independently of the ring width.
  • a step height of ⁇ is possible, so that the ring radius can not be selected or varied.
  • by modifying the Bessel function it is possible to set the intensity curve quantitatively and flexibly, which is not possible with a conventional spiral phase plate.
  • the array of sub-elements of the first diffractive optical element and / or the second diffractive optical element may have a period of less than 100 pm, for example a period between 10 and 100 pm.
  • the periods in two orthogonal directions e.g., in the x and y directions
  • the periods of the arrays of the first and second diffractive optical elements are the same.
  • the diffractive optical elements can be produced by lithography, in particular electron beam lithography.
  • the first and / or the second diffractive optical element may each comprise a glass plate, wherein at least one of the surfaces of the glass plate has elevations and / or depressions which form the diffractive patterns of the sub-elements.
  • An advantage of lithographic processes is the high accuracy with which the diffractive patterns can be generated.
  • the glass plate may e.g. be coated with a photoresist, which is exposed based on the produced or predetermined diffractive sub-elements or diffractive structures. Subsequently, the photoresist is developed so that, depending on the photoresist used, the exposed or unexposed areas of the photoresist dissolve.
  • One advantage of electronically controllable light modulators is that the generated excitation and / or switch-off regions can be changed quickly and flexibly and without the use of additional mechanical and / or optical parts and adapted to the respective measurement situation. Due to the production-related minimum size of the modulator pixels, a reduction optics can be used.
  • the STED microscope may further comprise: a first imaging system for imaging the array of excitation regions generated by the first diffractive optical element onto a sample to be examined; and a second imaging system for imaging the array of switch-off regions generated by the second diffractive optical element onto the sample to be examined.
  • the first and second imaging systems may include at least one lens. It is possible that the two imaging systems have common components (e.g., a common lens).
  • the first and second imaging systems may include other components, such as e.g. Beam splitters, spectral and / or spatial filters, aperture, etc., include. Preferably, all lenses are optimized for infinity rendering.
  • An exemplary illumination device comprises a first imaging system having a first objective, a second imaging system having a second objective and a third objective which is a component of both the first and the second imaging system.
  • the excitation beam and the switch-off beam can be superimposed and fed to the third objective.
  • the at least one beam splitter is non-polarizing and has a split ratio of 50:50.
  • the first and second diffractive optical elements and the objectives can be arranged and designed in such a way that a point in the object plane of the first imaging system is converted by the first objective into a (perfect) plane wave.
  • the third lens converts this plane wave back into a diffraction-limited point.
  • the combination of the first and the third lens thus causes an optical image.
  • the combination of the second and the third lens causes an optical image.
  • the first diffractive optical element thus generates an array of foci (excitation foci or excitation foci) in the object plane of the first imaging system, so that a corresponding image is formed on the sample.
  • the second diffractive optical element generates an array of donut-shaped off-switch areas in the object plane of the second imaging system. The image is also formed on the sample and is superimposed there with the array of foci or Foki (excitation focus or Excitation foci).
  • the first and / or second imaging system is / are adjusted such that the array of excitation regions substantially overlaps the array of switch-off regions on the sample, in particular such that each excitation region is overlapped with an associated switch-off region.
  • the alignment of the excitation regions and the donut-shaped switch-off regions with respect to each other can be achieved e.g. by moving the first and / or the second diffractive optical element. This can e.g. by a mechanical arrangement (e.g., including an actuator) or by a piezoelectric actuator.
  • the STED microscope may accordingly comprise adjusting means which are designed to displace the first and / or the second diffractive optical element in at least one direction in a plane which is perpendicular to the light propagation direction.
  • the adjusting means may further be designed to also displace the first and / or the second diffractive optical element along the light propagation direction. Due to the lower weight of diffractive optical elements, the realization of a mechanical translation or displacement with high accuracy is comparatively simple. If electronically controllable spatial light modulators are used, the alignment can be done electronically, e.g. by shifting the diffraction pattern generated by the light modulator.
  • the STED microscope may include a scanner adapted to move the arrays of excitation and turn-off regions to scan the sample with the arrays of excitation and turn-off regions.
  • the scan may be mechanical (eg, by mechanical movement of the first and second optical elements), by additional optical elements, or electronically. It is also possible to move the sample.
  • the STED microscope may further comprise a variable wheel, which comprises a plurality of different diffractive optical elements, and which makes it possible to replace the second diffractive optical element with another diffractive optical element. By replacing the second diffractive optical element can eg Ausschalte Symposium Edition with different ring widths and / or radii are generated. It is also possible to realize different depletion intensities.
  • a method for STED microscopy comprises the steps:
  • the method may further comprise aligning the first and second diffractive optical elements to achieve an overlap of the array of excitation regions and the array of switch-off regions.
  • the alignment or the adjustment takes place in such a way that each excitation area is overlapped or superposed with an associated switch-off area and that the maximum intensity of the respective excitation area substantially coincides with the center of the respective switch-off area.
  • the alignment of the first and second optical elements may be mechanical or electronic.
  • FIG. 2A is the amplitude and Fig. 2B is the phase of an exemplary "ideal" diffractive optical sub-element designed to produce a point-shaped light distribution;
  • FIG. 2C is the phase of an exemplary binary diffractive optical sub-element designed to produce a point-shaped light distribution;
  • 3A is a gray value representation of the phase of an exemplary diffractive optical subelement designed to generate a point-shaped light distribution
  • FIG. 3B illustrates the phase of an exemplary binary diffractive optical sub-element designed to produce a point-shaped light distribution
  • FIG. 3C shows the intensity of the diffraction pattern of an exemplary diffractive optical subelement designed to produce a donut-shaped light distribution
  • FIG. 3D shows the intensity of the diffraction pattern of an exemplary binary diffractive optical sub-element designed to produce a donut-shaped light distribution
  • FIG. 3C shows the intensity of the diffraction pattern of an exemplary diffractive optical subelement designed to produce a donut-shaped light distribution
  • FIG. 3D shows the intensity of the diffraction pattern of an exemplary binary diffractive optical sub-element designed to produce a donut-shaped light distribution
  • FIG. 4A illustrates the phase of an exemplary binary diffractive optical element configured to generate a periodic array of donut-shaped light spots
  • FIG. Fig. 4B shows an array of donut-shaped light spots (excitation regions) generated by the diffractive optical element shown in Fig. 4A.
  • Fig. 1 shows the basic structure of a STED microscope.
  • the STED microscope comprises a light source or illumination device (not shown) which generates an excitation beam and which generates a turn-off beam (depletion beam).
  • the light source or lighting device may e.g. include two pulsed or cw lasers.
  • the excitation beam is diffracted by the first diffractive optical element DOE1, so that a plurality of excitation beams is generated.
  • Each of the generated Ausschaltestrahlen is imaged by means of a first imaging system in a point-shaped spot (excitation area or excitation focus) for the STED microscopy.
  • the turn-off beam is diffracted by the second diffractive optical element DOE2, so that a plurality of turn-off beams are generated.
  • Each of the generated Ausschaltestrahlen is imaged by means of a second imaging system in an annular or donut-shaped Ausschplungs Symposium (depletion region) for the STED microscopy.
  • the first imaging system comprises a first objective M01 and a third objective M03
  • the second imaging system comprises a second objective M02 and the third objective M03.
  • the combination of the first objective M01 and the third objective M03 causes an optical imaging.
  • the first diffractive optical element DOE1 generates an array of foci (focus of focus or excitation focus) in the object plane of the first imaging system M01-M03, the image of this array being formed on the examined object 0.
  • the second diffractive optical element generates an array of donut-shaped spots (donut rings) in the object plane of the second imaging system M02-M03, the image of this array likewise being formed on the object and superimposed thereon with the array of foci ,
  • Alignment between focus and donut may be accomplished by translating DOE1 and DOE2 laterally relative to each other.
  • the lateral displacement can be realized in mechanical form (eg by an actuator) or in piezoelectric form.
  • the object is thus illuminated by an array 20 of punctiform light spots or excitation foci (excitation regions) and an array 30 of donut-shaped light spots (switch-off regions).
  • the beam splitter BS1 guides the signals generated by the diffraction at the first diffractive optical element DOE1 Excitation beams propagated by the first objective M01 and the excitation beams generated by the diffraction at the second diffractive optical element and propagated through the second objective M02.
  • the dichroic beam splitter BS2 separates the fluorescent light emitted by the object O from the excitation light.
  • the fluorescent light is registered by a camera 10, such as a CCD camera.
  • the objectives M01 to M03 are preferably optimized for imaging to infinity (or "infinity corrected").
  • the first diffractive optical element and the second diffractive optical element each comprise an array of diffractive optical sub-elements.
  • the arrays can be one-dimensional or two-dimensional arrays.
  • the individual sub-elements can be obtained as follows:
  • the formula (5) is exact in the case of a periodic pattern or a periodic wave field in the context of scalar optics (without vector character).
  • a diffractive sub-element obtained by a Fourier transform of the object spectrum according to formula (6) has an amplitude and a phase in continuous form and is capable of producing a point-shaped light distribution in the focus space or a focus. This point-shaped light distribution can be imaged by means of a suitable imaging system on the object to be examined.
  • Fig. 2A shows the amplitude and Fig. 2B the phase of such an exemplary "ideal" diffractive optical sub-element, which is obtained by means of a Fourier transform of formula (6) and is designed to generate a point-shaped light distribution.
  • a binary diffractive optical element Since the production of a diffractive element with continuous amplitude and / or phase is difficult, a binary diffractive optical element is proposed.
  • the amplitude of the Fourier transform can be normalized (e.g., set to 1).
  • the phase of the Fourier transform can be binarized.
  • Fig. 2C shows the phase of an exemplary binary diffractive optical element.
  • FIGS. 3A-3D illustrate the influence of the normalization and binarization operations on the focus or on the light distribution in the focal plane.
  • Fig. 3A shows the phase of an exemplary "ideal" diffractive optical element (ie without binarization) and
  • Fig. 3B the phase (+ ⁇ / 2, - ⁇ / 2) of a binary diffractive optical element
  • Fig. 3C shows the intensity of the diffraction image
  • Fig. 3D shows the same for the binarized diffractive optical element shown in Fig. 3 B.
  • the diffractive optical element or subelement (binary or continuous) obtained by means of a Fourier transformation of the formula (6) has a substantially sharper focus with the same parameters (diameter and focal length) (in both the x and y directions ) as a refractive optical element (eg, a microlens made of glass or plastic). This allows higher precision and better resolution of the scan.
  • the individual sub-elements of the second diffractive optical element can be obtained similarly to the sub-elements of the first diffractive optical element, using not the constant 1 (as in the first diffractive optical element) but the Fourier transform of the desired distribution as the pupil function. For an annular or donut-shaped distribution, this is the Bessel distribution Jo. The condition for a donut-shaped spot is thus:
  • Formula (8) gives the optimal object or element spectrum ü opt of a donut-shaped spot or a donut-shaped light distribution at ox .
  • the Fourier transform of the object spectrum given by formula (8) provides the single diffractive sub-element of the second diffractive optical element.
  • Such an "ideal" diffractive sub-element has an amplitude and a phase in continuous form and is suitable for generating a donut-shaped light distribution in the focus space
  • the periodic arrangement of several subelements forms the second diffractive optical element
  • Figure 4A shows the phase of an exemplary binary diffractive optical element designed to be a periodic array
  • the diffractive pattern of each subelement was obtained after binarizing the Fourier transform of formula (8).
  • FIG. 4B shows the generated array of donut-shaped light spots (excitation regions). Both the ring radius Ro and the ring position correspond to the design specification.
  • the xy distribution shown in Fig. 4B corresponds to the donut-shaped distribution produced with a spiral phase plate, with the difference that both the ring radius and the ring width are adjustable are. Other courses of depletion intensity could be selected as needed, which is not possible with a spiral phase plate.
  • detection unit e.g., CCD camera

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein STED-Mikroskop und ein STED Mikroskopieverfahren. Das STED Mikroskop umfasst: eine Lichtquelle zum Erzeugen eines Anregungsstrahls und eines Ausschaltestrahls; ein erstes diffraktives optisches Element (DOE1) und ein zweites diffraktives optisches Element (DOE2) mit jeweils einer periodischen Anordnung von diffraktiven Sub-Elementen, wobei das erste diffraktive optische Element (DOE1) ausgelegt ist, einen Anregungsstrahl derart zu beugen, dass ein Array von punktförmigen Anregungsbereichen (20) erzeugt wird; und das zweite diffraktive optische Element (DOE2) ausgelegt ist, einen Ausschaltestrahl derart zu beugen, dass ein Array von Donut-förmigen Ausschaltebereichen (30) erzeugt wird.

Description

"Parallelisierung des STED-Mikroskopieverfahrens"
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein STED-Mikroskop und ein ST E D-Verfahren.
Mikroskopische Stimulated Emission & Depletion (STED) Verfahren ermöglichen es, die klassischen Grenzen der optischen Auflösung zu überwinden und haben in der Mikroskopie einen Durchbruch bewirkt. Bei dem STED Verfahren werden Fluoreszenzmoleküle durch Licht bestimmter Wellenlängen in einen angeregten Zustand überführt, aus dem die Moleküle spontan mittels Fluoreszenz wieder in den Grundzustand zurückkehren. Durch Depletion mittels stimulierter Emission wird der Bereich, aus dem Fluoreszenz emittiert wird, wesentlich kleiner gemacht als der vom Anregungslicht beleuchtete beugungsbegrenzte Bereich. Dazu wird das Objekt nicht nur mit dem fokussierten Anregungsstrahl beleuchtet, sondern gleichzeitig mit einem zweiten Strahl, dem„Ausschaltestrahl", mit einer ringförmigen bzw. Donut-förmigen Lichtverteilung. Der Anregungsstrahl und der Ausschaltestrahl überlappen so, dass sich die maximale Intensität des Anregungsstrahls in der Mitte des Ausschaltestrahls (d.h. da wo der Ausschaltestrahl dunkel ist) befindet. Dadurch werden die Fluoreszenzmoleküle im Außenbereich des Anregungsfokus gezielt „ausgeschaltet". Die Fluoreszenzmoleküle im zentralen Bereich bleiben hingegen unbeeinflusst. Details des STED Verfahrens sind in der Literatur ausführlich beschrieben und werden als bekannt vorausgesetzt. Konventionelle STED Verfahren verwenden ein Mikroskopobjektiv und eine scannende (d.h. serielle oder Punkt-für-Punkt) Abtastung des Objekts, um ein vollständiges Bild zu erhalten. Für große Bildfelder entstehen hierdurch lange Scanzeiten, welche diverse Probleme mit sich bringen, wie z.B. Zeitaufwand, Veränderung der Probe, etc. Des Weiteren wird zum Erzeugen des Donut-förmigen Depletion-Bereichs bzw. Ausschaltebereichs üblicherweise eine Phasenplatte mit einer Spiralphase verwendet. Die Spiralphasenplatte bewirkt, dass in einer Zwischenebene eine ringförmige bzw. Donut-Verteilung entsteht, welche auf das zu untersuchende Objekt mittels geeigneter Abbildungssysteme abgebildet wird. Mit einer Spiralphasenplatte kann jedoch die Topologie des erzeugten ringförmigen bzw. Donut-förmigen Bereichs nicht flexibel gewählt werden.
Vor diesem Hintergrund ist es eine technische Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine schnellere, robustere und flexiblere STED-Mikroskopie zu ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch ein STED-Mikroskop und ein entsprechendes Verfahren für die STED- Mikroskopie mit den Merkmalen der jeweiligen unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche. Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft ein STED-Mikroskop mit diffraktiven Elementen. Das Mikroskop umfasst eine Lichtquelle bzw. Beleuchtungsvorrichtung, die ausgelegt ist, einen Anregungsstrahl und einen Ausschaltestrahl zu erzeugen. Die Wellenlänge des Anregungsstrahls kann geeignet gewählt werden, um die Fluoreszenzfarbstoffe in der zu untersuchenden Probe anzuregen. Die Wellenlänge des Ausschaltestrahls (STED-Strahl) kann geeignet gewählt werden, um ein Abregen bzw. Ausschalten von angeregten Fluoreszenzfarbstoffen mittels stimulierter Emission zu erzielen. Die Lichtquelle kann z.B. gepulste oder cw-Laser, sowie gegebenenfalls weitere optische Komponente, wie Strahlteiler, Kollimatoren, Linsen, etc., umfassen. Ferner umfasst das Mikroskop zwei diffraktive optische Elemente, die jeweils ein Array bzw. eine periodische Anordnung von diffraktiven Sub-Elementen aufweisen. Das erste diffraktive optische Element ist ausgelegt, den Anregungsstrahl derart zu beugen, dass ein Array bzw. eine periodische Anordnung von punktförmigen Anregungsbereichen erzeugt wird. Das zweite diffraktive optische Element ist ausgelegt, den Ausschaltestrahl (STED-Strahl oder Depletion- Strahl) derart zu beugen, dass ein Array bzw. eine periodische Anordnung von ringförmigen bzw. Donut-förmigen Ausschaltebereichen (Depletion-Bereichen) erzeugt wird. Das Array kann z.B. ein eindimensionales oder zwei-dimensionales Array sein.
Anders ausgedrückt wird mittels des ersten diffraktiven optischen Elements ein Array von fokussierten Lichtpunkten bzw. Beleuchtungsspots (Anregungsbereichen bzw. Anregungsfokussen oder Anregungsfoki) erzeugt. Mittels des zweiten diffraktiven optischen Elements wird ein Array, z.B. ein eindimensionales oder zwei-dimensionales Array, von ringförmigen bzw. Donut-förmigen Beleuchtungsspots (Ausschaltebereichen bzw. Depletion- Bereichen) für die STED Mikroskopie erzeugt. Vorzugsweise fallen die Zentren der punktförmigen Anregungsbereiche zusammen mit den Zentren der ringförmigen bzw. Donut- förmigen Ausschaltebereiche. Das erste und/oder das zweite diffraktive optische Element können transmissive Elemente sein. Dies ermöglicht einen besonders kompakten Bau des STED Mikroskops. Die einzelnen Anregungsbereiche (Anregungsfokusse bzw. Anregungsfoki) bzw. Ausschaltebereiche (Depletion-Bereiche) werden von den jeweiligen Sub-Elementen des ersten bzw. des zweiten diffraktiven optischen Elements erzeugt. Jedes diffraktive Sub-Element weist ein Muster auf, welches ausgelegt ist, die entsprechende punkt- oder Donut-förmige Intensitätsverteilung im jeweiligen Anregungs- oder Ausschaltebereich mittels Diffraktion zu erzeugen. Das Muster kann z.B. durch Lithographie oder andere geeignete Methoden erzeugt werden.
Ferner kann das STED-Mikroskop eine Detektionseinheit zum Detektieren des von einer zu untersuchenden Probe ausgesandten Fluoreszenzlichts umfassen. Die Detektionseinheit kann einen zwei-dimensionalen Detektor umfassen, z.B. eine CCD Kamera.
Ein Vorteil des vorgeschlagenen STED-Mikroskops ist die „Parallelisierung" des STED Verfahrens, da das Objekt gleichzeitig von mehreren Anregungs- und Ausschaltestrahlen beleuchtet wird, wodurch mehrere Anregungs- und Ausschaltebereiche entstehen. Bei herkömmlichen STED Verfahren, die auf eine serielle Abtastung des Objekts basieren, ist die Beleuchtungszeit (Verweilzeit) pro Punkt sehr kurz. Mit dem vorgeschlagenen STED Mikroskop ist eine wesentlich höhere Verweilzeit (z.B. um etwa 10000 Mal) und damit auch eine Bestrahlung mit wesentlich mehr Licht (z.B. 10000 Mal) möglich.
Zudem kann der Arbeitsabstand (d.h. die Brennweite fo) des STED Mikroskops größer als der von herkömmlichen STED-Mikroskopen sein. Der Arbeitsabstand kann z.B. bei einer numerischen Apertur NA =0,75 in Luft oder NA = 1,14 mit Immersion (Brechungsindex n = 1,33) bis zu 2000 pm betragen, im Vergleich zu einem Arbeitsabstand von 130 pm bei einem herkömmlichen STED-Objektiv. Vorzugsweise ist der Arbeitsabstand gleich oder größer als 1000 pm.
Ein weiterer Vorteil ist es, dass mittels diffraktiver optischer Elemente eine Vielfallt von Intensitätsverläufe erzeugt werden können, wobei die einzelnen Parameter der Intensitätsverteilung (wie z.B. Ringradius und Ringbreite) unabhängig voneinander eingestellt werden können. Dadurch kann das STED-Mikroskop besser und flexibler an die jeweilige Messsituation angepasst werden.
Die komplexe Amplitude eines diffraktiven optischen Sub-Elements kann mit der Formel (1) beschrieben werden: u (r ) = A (F)exp (/^ (r ))
( 1)
Die Fourier-Transformation der komplexen Amplitude im k-Raum liefert das Spektrum des diffraktiven optischen Sub-Elements.
Das Spektrum im k-Raum üopt(kj_, 0) eines optimalen ersten diffraktiven optischen SubElements, das ausgelegt ist, eine punktförmige Lichtverteilung zu erzeugen, ist vorzugsweise durch die Formel (2) gegeben:
Figure imgf000005_0001
Das Spektrum üopt(k , 0) eines optimalen zweiten diffraktiven optischen Elements, das ausgelegt ist, eine ringförmige bzw. Donut-förmige Lichtverteilung zu erzeugen, ist vorzugsweise durch die Formel (3) gegeben:
Figure imgf000005_0002
In den Formeln (2) und 3) bezeichnen:
Figure imgf000005_0003
kx = (kx, ky) bzw. einen Wellenvektor im k-Raum, welcher die Komponenten kx und ky des Wellenvektors zusammenfassend beschreibt;
z eine Ausbreitungsdistanz der Welle bzw. des Lichtstrahls (in die Lichtausbreitungsrichtung); ω = 2n/f, wobei /die Lichtfrequenz ist;
c die Lichtgeschwindigkeit;
r0 ± = (x, y) einen Vektor, welcher die Verschiebung bezüglich des Ursprungs des Anregungsbereichs (Anregungsfokus) oder des Donut-förmigen Ausschaltebereichs in der x— y Ebene beschreibt, wobei die x— y die Ebene senkrecht zur Lichtausbreitungsrichtung z ist; J0 eine Besselfunktion nullter Ordnung;
R0 den Ringradius des erzeugten Donut-förmigen Ausschaltebereichs.
Die Amplitude und die Phase der Sub-Elemente des ersten und des zweiten diffraktiven optischen Elements können jeweils mittels Fourier-Transformation der Formel (2) bzw. der Formel (3) erhalten werden. Die Fourier-Transformation der Formel (2) bzw. Formel (3) liefert folglich ein„ideales" diffraktives Sub-Element für das erste bzw. zweite diffraktive optische Element. Ein solches„ideales" diffraktives Sub-Element weist eine kontinuierliche Amplitude und eine kontinuierliche Phase auf.
Um die Herstellbarkeit zu vereinfachen werden binäre bzw. binarisierte diffraktive SubElemente vorgeschlagen, bei denen die Amplitude normalisiert (z.B. Amplitude = 1) und die Phase binarisiert wird. Die komplexe Amplitude eines binarisierten Phasenelements kann somit durch die Formel (4) beschrieben werden:
«iÄ (r ) = l - exp (i^ (r )) f Wobei (4) φΒ (7) ζ {0, π}
Es hat sich herausgestellt, dass die durch die Formel (2) und (3) definierten diffraktiven optischen Elemente bzw. Sub-Elemente besonders geeignet sind, optimale punktförmige bzw. Donut-förmige Lichtverteilungen zu erzeugen. So weist ein durch Formel (2) definiertes diffraktives optisches Element bzw. Sub-Element einen wesentlich schärferen Fokus auf (sowohl in x- als auch in y-Richtung) als ein vergleichbares refraktives optisches Element (z.B. eine Mikrolinse aus Glas oder Kunststoff). Dies ermöglicht eine höhere Präzision und eine bessere Auflösung des Scanvorgangs.
Jeder ringförmige bzw. Donut-förmige Bereich (Ausschaltebereich), der mittels eines diffraktiven optischen Elements nach der Formel (3) erzeugt wird, weist eine Ringbreite und einen Ringradius auf, welche durch die periodisch angeordneten Sub-Elemente des ersten diffraktiven optischen Elements vorgegeben sind. Ein besonderer Vorteil des vorgeschlagenen diffraktiven optischen Elements ist, dass der Ringradius nahezu beliebig und unabhängig von der Ringbreite gewählt werden kann. Bei einer herkömmlichen Spiralphasenplatte dagegen ist lediglich eine Stufenhöhe von π möglich, so dass der Ringradius nicht gewählt bzw. variiert werden kann. Des Weiteren ist es durch Modifikation der Besselfunktion möglich, den Intensitätsverlauf quantitativ und flexibel einzustellen, was mit einer herkömmlichen Spiralphasenplatte nicht möglich ist.
Die Anzahl der Sub-Elemente des ersten und/oder des zweiten diffraktiven optischen Elements kann variieren und kann z.B. bis zu mehrere Tausend oder Zehntausend betragen. Vorzugsweise ist die Anzahl der Sub-Elemente größer als der durch die numerische Apertur festgelegte Überlapp. Bei einer Periode von 25 pm und einem Elementendurchmesser von 1 cm kann die Anzahl der Sub-Elemente beispielsweise 400 x 400 = 160 000 sein. Das Array von Sub-Elemente des ersten diffraktiven optischen Elements und/oder des zweiten diffraktiven optischen Elements kann eine Periode kleiner als 100 pm aufweisen, beispielsweise eine Periode zwischen 10 und 100 pm. Bei einer zwei-dimensionalen Anordnung können die Perioden in zwei orthogonalen Richtungen (z.B. in x- und y-Richtung) gleich oder unterschiedlich sein. Vorzugsweise sind die Perioden der Arrays des ersten und des zweiten diffraktiven optischen Elements gleich.
Aufgrund der relativ kleinen Periode (z.B. von 1 μητι bis 100 pm) ist ein schnelleres Scannen bei einer vorgegebenen Auflösung möglich. Bei einer herkömmlichen Spiralphasenplatte müsste die Periode viel größer (z.B. ca. 5 mm) sein, um ähnlich gute Ergebnisse bzw. eine ähnlich gute Qualität der Donut-förmigen Ausschaltbereiche zu erzielen. Eine Periode, welche kleiner als 100 pm ist, würde somit bei herkömmlichen Phasenplatten wegen beugungsbedingter Strukturverbreiterung nicht funktionieren. Somit ist es möglich, die Baugröße des STED- Mikroskops zu verringern.
Die diffraktiven optischen Elemente können durch Lithographie, insbesondere Elektronenstrahllithographie hergestellt werden. Das erste und/oder das zweite diffraktive optische Element kann/können jeweils eine Glasplatte aufweisen, wobei zumindest eine der Oberflächen der Glasplatte Erhöhungen und/oder Vertiefungen aufweist, die die diffraktiven Muster der Sub-Elemente bilden. Ein Vorteil der lithographischen Verfahren ist die hohe Genauigkeit mit der die diffraktiven Muster erzeugt werden können. Die Glasplatte kann z.B. mit einem Photolack beschichtet werden, welcher auf Basis der herzustellenden bzw. vorgegebenen diffraktiven Sub-Elemente oder diffraktiven Strukturen belichtet wird. Anschließend wird der Photolack entwickelt, so dass sich abhängig vom verwendeten Photolack die belichteten oder die nicht belichteten Stellen des Photolacks lösen. Prinzipiell können die im Photolack vorhandenen Strukturen bereits verwendet werden. Vorzugsweise werden jedoch die Strukturen in die Glasplatte geätzt und anschließend der Photolack entfernt. Die Herstellung kann durch Replikationstechnik erfolgen, bei der durch ein Abformen eines Masters Kopien hergestellt werden können. Andere Methoden zur Herstellung von diffraktiven optischen Elementen sind ebenfalls möglich. Es ist ferner möglich, räumliche Lichtmodulatoren (wie z.B. LCD Modulatoren) als diffraktive optische Elemente einzusetzen. Die räumlichen Lichtmodulatoren können elektronisch steuerbar sein. Insbesondere können die diffraktiven Muster der einzelnen diffraktiven SubElemente dynamisch veränderbar sein, um z.B. den Radius der Anregungsbereiche und/oder den Ringradius und/oder die Ringbreite der Ausschaltebereiche zu verändern. Ebenfalls ist es möglich, die Anordnung der Anregungs- und Ausschaltebereiche (z.B. die Periode der beiden Arrays) und/oder deren Position der dynamisch zu verändern. Ein Vorteil von elektronisch steuerbaren Lichtmodulatoren ist, dass die erzeugten Anregungs- und/oder Ausschaltebereiche schnell und flexibel und ohne die Verwendung zusätzlicher mechanischer und/oder optischer Teile geändert und an die jeweilige Messsituation angepasst werden können. Wegen der herstellungsbedingten Mindestgröße der Modulatorpixel kann eine Verkleinerungsoptik eingesetzt werden.
Das STED-Mikroskop kann ferner umfassen: ein erstes Abbildungssystem zum Abbilden des mittels des ersten diffraktiven optischen Elements erzeugten Arrays von Anregungsbereichen auf eine zu untersuchende Probe; und ein zweites Abbildungssystem zum Abbilden des mittels des zweiten diffraktiven optischen Elements erzeugten Arrays von Ausschaltebereichen auf die zu untersuchende Probe.
Das erste und das zweite Abbildungssystem können zumindest eine Linse bzw. ein Objektiv umfassen. Es ist möglich, dass die beiden Abbildungssysteme gemeinsame Komponente (z.B. ein gemeinsames Objektiv) aufweisen. Das erste und das zweite Abbildungssystem können weitere Komponenten, wie z.B. Strahlteiler, spektrale und/oder räumliche Filter, Blenden, etc., umfassen. Vorzugsweise sind alle Objektive für eine Abbildung ins Unendliche optimiert ("infinity corrected").
Eine beispielhafte Beleuchtungsvorrichtung umfasst ein erstes Abbildungssystem mit einem ersten Objektiv, ein zweites Abbildungssystem mit einem zweiten Objektiv und ein drittes Objektiv, welches Bestandteil sowohl des ersten als auch des zweiten Abbildungssystems ist. Durch zumindest einen Strahlteiler können der Anregungsstrahl und der Ausschaltestrahl (Depletion-Strahl) überlagert und dem dritten Objektiv zugeführt werden. Vorzugsweise ist der zumindest eine Strahlteiler nicht-polarisierend und weist ein Teilungsverhältnis von 50:50 auf.
Das erste und das zweite diffraktive optische Element und die Objektive können derart angeordnet und ausgelegt werden, dass ein Punkt in der Objektebene des ersten Abbildungssystem vom ersten Objektiv in eine (perfekte) Planwelle gewandelt wird. Das dritte Objektiv wandelt diese Planwelle wieder in einen beugungsbegrenzten Punkt. Die Kombination des ersten und des dritten Objektiv bewirkt somit eine optische Abbildung. Ebenso bewirkt die Kombination des zweiten und des dritten Objektivs eine optische Abbildung.
Das erste diffraktive optische Element erzeugt somit ein Array von Fokussen (Anregungsfokussen bzw. Anregungsfoki) in der Objektebene des ersten Abbildungssystems, so dass ein entsprechendes Bild auf der Probe entsteht. Das zweite diffraktive optische Element erzeugt ein Array von Donut-Ringen bzw. Donut-förmigen Ausschaltebereichen in der Objektebene des zweiten Abbildungssystems. Das Bild entsteht ebenfalls auf der Probe und überlagert sich dort mit dem Array von Fokussen bzw. Foki (Anregungsfokussen bzw. Anregungsfoki).
Vorzugsweise ist/sind das erste und/oder zweite Abbildungssystem derart justierbar bzw. justiert, dass das Array von Anregungsbereichen mit dem Array von Ausschaltebereichen auf der Probe im Wesentlichen überlappt, insbesondere so, dass jeder Anregungsbereich mit einem zugehörigen Ausschaltebereich überlappt bzw. überlagert ist. Die Ausrichtung bzw. das Justieren der Anregungsbereiche und der Donut-förmigen Ausschaltebereiche zueinander kann z.B. durch Verschieben des ersten und/oder des zweiten diffraktiven optischen Elements erfolgen. Dies kann z.B. durch eine mechanische Anordnung (umfassend z.B. ein Stellelement) oder durch einen piezoelektrischen Aktuator realisiert werden. Das STED-Mikroskop kann dementsprechend Justiermittel umfassen, die ausgelegt sind, das erste und/oder das zweite diffraktive optische Element in zumindest eine Richtung in einer Ebene, die senkrecht zur Lichtausbreitungsrichtung ist, zu verschieben. Die Justiermittel können ferner ausgelegt sein, das erste und/oder das zweite diffraktive optische Element ebenfalls entlang der Lichtausbreitungsrichtung zu verschieben. Aufgrund des geringeren Gewichts von diffraktiven optischen Elementen ist die Realisierung einer mechanischen Translation bzw. Verschiebung mit hoher Genauigkeit vergleichsweise einfach. Werden elektronisch steuerbare räumliche Lichtmodulatoren verwendet, kann die Ausrichtung bzw. das Justieren elektronisch erfolgen, z.B. durch ein Verschieben des durch den Lichtmodulator erzeugten Diffraktionsmusters.
Ferner kann das STED Mikroskop einen Scanner bzw. Scanmittel umfassen, der bzw. das ausgelegt ist, die Arrays von Anregungs- und Ausschaltebereichen zu bewegen, um die Probe mit den Arrays von Anregungs- und Ausschaltebereichen abzutasten. Somit können auch größere Objekte mikroskopisch untersucht werden, wobei bei jedem Schritt die Probe parallel von mehreren Anregungs- und Ausschaltebereiche beleuchtet wird. Der Scan kann mechanisch (z.B. durch eine mechanische Bewegung des ersten und des zweiten optischen Elements), durch zusätzliche optische Elemente oder elektronisch erfolgen. Es ist ebenfalls möglich, die Probe zu verschieben. Das STED-Mikroskop kann ferner ein Wechselrad umfassen, welches eine Mehrzahl von unterschiedlichen diffraktiven optischen Elementen umfasst, und welches es ermöglicht, das zweite diffraktive optische Element durch ein anderes diffraktives optisches Element zu ersetzen. Durch Austausch des zweiten diffraktiven optischen Elements können z.B. Ausschaltebereiche mit unterschiedlichen Ringbreiten und/oder Radien erzeugt werden. Ebenfalls ist es möglich, unterschiedliche Depletion-Intensitäten zu realisieren.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren für die STED Mikroskopie bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte:
Bereitstellen eines STED Mikroskops nach einem der oben beschriebenen Aspekte; Beleuchten des ersten diffraktiven optischen Elements mit einem Anregungsstrahl und Erzeugen eines Arrays von punktförmigen Anregungsbereichen auf einer zu untersuchenden Probe bzw. auf einem zu untersuchenden Objekt;
Beleuchten des zweiten diffraktiven optischen Elements mit einem Ausschaltestrahl und
Erzeugen eines Arrays von Donut-förmigen Ausschaltebereichen auf der zu untersuchenden Probe bzw. auf dem zu untersuchenden Objekt, wobei das Array von Anregungsbereichen und das Array von Ausschaltebereichen im Wesentlichen überlappen;
Detektieren zumindest eines Teils des Fluoreszenzlichts, das von der zu untersuchenden Probe bzw. dem zu untersuchenden Objekt ausgesendet wird.
Das Verfahren kann ferner eine Ausrichtung bzw. ein Justieren des ersten und zweiten diffraktiven optischen Elements umfassen, um eine Überlappung des Arrays von Anregungsbereichen und des Arrays von Ausschaltebereichen zu erzielen. Insbesondere erfolgt die Ausrichtung bzw. das Justieren so, dass jeder Anregungsbereich mit einem zugehörigen Ausschaltebereich überlappt bzw. überlagert ist und dass die maximale Intensität des jeweiligen Anregungsbereichs im Wesentlichen mit dem Zentrum des jeweiligen Ausschaltebereichs zusammenfällt. Wie oben beschrieben kann die Ausrichtung bzw. das Justieren des ersten und des zweiten optischen Elements mechanisch oder elektronisch erfolgen.
Die Erfindung wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert und beschrieben. Es zeigen: Fig. 1 den prinzipiellen Aufbau eines STED-Mikroskops;
Fig. 2A die Amplitude und Fig. 2B die Phase eines beispielhaften„idealen" diffraktiven optischen Sub-Elements, das ausgelegt ist, eine punktförmige Lichtverteilung zu erzeugen; Fig. 2C die Phase eines beispielhaften binären diffraktiven optischen Sub-Elements, das ausgelegt ist, eine punktförmige Lichtverteilung zu erzeugen;
Fig. 3A eine Grauwertdarstellung der Phase eines beispielhaften diffraktiven optischen SubElements, das ausgelegt ist, eine punktförmige Lichtverteilung zu erzeugen;
Fig. 3B die Phase eines beispielhaften binären diffraktiven optischen Sub-Elements, das ausgelegt ist, eine punktförmige Lichtverteilung zu erzeugen;
Fig. 3C die Intensität des Beugungsbilds eines beispielhaften diffraktiven optischen SubElements, das ausgelegt ist, eine ringförmige bzw. Donut-förmige Lichtverteilung zu erzeugen; Fig. 3D die Intensität des Beugungsbilds eines beispielhaften binären diffraktiven optischen Sub-Elements, das ausgelegt ist, eine ringförmige bzw. Donut-förmige Lichtverteilung zu erzeugen;
Fig. 4A die Phase eines beispielhaften binären diffraktiven optischen Elements, das ausgelegt ist, eine periodische Anordnung bzw. ein Array von Donut-förmigen Lichtspots zu erzeugen; Fig. 4B ein Array von Donut-förmigen Lichtspots (Anregungsbereichen), das durch das in Fig. 4A gezeigte diffraktive optische Element erzeugt wird.
Fig. 1 zeigt den prinzipiellen Aufbau eines STED-Mikroskops. Das STED Mikroskop umfasst eine Lichtquelle bzw. Beleuchtungsvorrichtung (nicht gezeigt), die einen Anregungsstrahl und die einen Ausschaltestrahl (Depletion-Strahl) erzeugt. Die Lichtquelle bzw. die Beleuchtungsvorrichtung kann z.B. zwei gepulste oder cw-Laser umfassen.
Der Anregungsstrahl wird durch das erste diffraktive optische Element DOE1 gebeugt, so dass eine Mehrzahl von Anregungsstrahlen erzeugt wird. Jeder der erzeugten Ausschaltestrahlen wird mittels eines ersten Abbildungssystems in einem punktförmigen Spot (Anregungsbereich bzw. Anregungsfokus) für die STED-Mikroskopie abgebildet. Der Ausschaltestrahl wird durch das zweite diffraktive optische Element DOE2 gebeugt, so dass eine Mehrzahl von Ausschaltestrahlen erzeugt wird. Jeder der erzeugten Ausschaltestrahlen wird mittels eines zweiten Abbildungssystems in einem ringförmigen bzw. Donut-förmigen Ausschaltebereich (Depletion-Bereich) für die STED-Mikroskopie abgebildet.
Das erste Abbildungssystem umfasst ein erstes Objektiv M01 und ein drittes Objektiv M03, das zweite Abbildungssystem umfasst ein zweites Objektiv M02 und das dritte Objektiv M03. Die Kombination aus dem ersten Objektiv M01 und dem dritten Objektiv M03 bewirkt eine optische Abbildung. Das erste diffraktive optische Element DOE1 erzeugt ein Array von Fokussen bzw. Foki (Abbildungsfokussen bzw. Anregungsfoki) in der Objektebene des ersten Abbildungssystems M01-M03, wobei das Bild dieses Arrays auf dem untersuchten Objekt 0 entsteht. Das zweite diffraktive optische Element erzeugt ein Array von Donut-förmigen Spots (Donut-Ringen) in der Objektebene des zweiten Abbildungssystems M02-M03, wobei das Bild dieses Arrays ebenfalls auf dem Objekt entsteht und sich dort mit dem Array von Fokussen bzw. Foki überlagert. Das Alignment bzw. die Ausrichtung zwischen Fokus und Donut kann durch laterales Verschieben von DOE1 und DOE2 relativ zu einander erfolgen. Die laterale Verschiebung kann in mechanischer Form (z.B. durch ein Stellelement) oder in piezoelektrischer Form realisiert werden. Das Objekt wird somit durch ein Array 20 von punktförmigen Lichtflecken bzw. Anregungsfokussen (Anregungsbereichen) und ein Array 30 von ringförmigen bzw. Donut-förmige Lichtflecken (Ausschaltebereichen) beleuchtet Der Strahlteiler BS1 führt die durch die Beugung an dem ersten diffraktiven optischen Element DOE1 erzeugten und durch das erste Objektiv M01 propagierten Anregungsstrahlen sowie die durch die Beugung an dem zweiten diffraktiven optischen Element erzeugten und durch das zweite Objektiv M02 propagierten Anregungsstrahlen. Der dichroische Strahlteiler BS2 trennt das vom Objekt O emittierte Fluoreszenzlicht vom Anregungslicht zusammen. Das Fluoreszenzlicht wird von einer Kamera 10, wie z.B. einer CCD-Kamera registriert. Die Objektive M01 bis M03 sind vorzugsweise für eine Abbildung ins Unendliche optimiert (bzw. "infinity corrected").
Das erste diffraktive optische Element und das zweite diffraktive optische Element umfassen jeweils ein Array von diffraktiven optischen Sub-Elementen. Die Arrays können eindimensionale oder zweidimensionale Arrays sein. Die einzelnen Sub-Elemente können wie folgt erhalten werden:
Die Lichtausbreitung einer Lichtverteilung von z = 0 in Richtung z > 0 kann durch die Formel (5) beschreiben werden: u( L,z
Figure imgf000014_0001
wobei:
ü[kL,Q^ : die Lichtverteilung (Winkelspektrum) bei z = 0 (d.h. in der Pupille) beschreibt.
Die Formel (5) ist bei einem periodischen Muster bzw. einem periodischen Wellenfeld im Rahmen der skalaren Optik (ohne Vektorcharakter) exakt.
Die Bedingung für einen Fokus ist, dass die Lichtamplitude in einem Punkt (x,y) maximal ist, d.h. u(fQ ,z) muss maximimiert werden. Dies wird erreicht, wenn alle Beiträge unter dem Integral positiv sind. Folglich ist das optimale Objekt- bzw. Elementspektrum üopt bei r0 ± das komplex konjugierte der Terme im Integral:
Figure imgf000014_0002
Eine Fourier-Transformation des durch Formel (6) gegebenen Objekt- bzw. Elementenspektrums liefert das einzelne diffraktive Sub-Element des ersten diffraktiven optischen Elements bzw. dessen Amplitude und Phase. Dabei gilt für die Koordinaten im
Pupillenraum ( * und im Frequenzraum ( ):
Figure imgf000014_0003
wobei λ die Lichtwellenlänge ist. Ein diffraktives Sub-Element, das durch eine Fourier-Transformation des Objektspektrums nach Formel (6) erhalten wird, weist eine Amplitude und eine Phase in kontinuierlicher Form auf und ist geeignet, eine punktförmige Lichtverteilung im Fokusraum bzw. ein Fokuss zu erzeugen. Diese punktförmige Lichtverteilung kann mittels eines geeigneten Abbildungssystems auf dem zu untersuchenden Objekt abgebildet werden. Fig. 2A zeigt die Amplitude und Fig. 2B die Phase eines solchen beispielhaften„idealen" diffraktiven optischen Sub-Elements, das mittels einer Fourier-Transformation der Formel (6) erhalten wird und ausgelegt ist, eine punktförmige Lichtverteilung zu erzeugen.
Da die Herstellung eines diffraktiven Elements mit kontinuierlicher Amplitude und/oder Phase schwierig ist, wird ein binäres diffraktives optisches Element vorgeschlagen. Um ein binäres diffraktives optisches Element zu erhalten, kann die Amplitude des Fourier-Transformierten normiert werden (z.B. auf 1 gesetzt werden). Ferner kann die Phase des Fourier- Transformierten binarisiert werden. Fig. 2C zeigt die Phase eines beispielhaften binären diffraktiven optischen Elements.
Fig. 3A-3D illustrieren den Einfluss der Normierungs- und Binarisierungsoperationen auf den Fokus bzw. auf die Lichtverteilung in der Fokusebene. Fig. 3A zeigt die Phase eines beispielhaften„idealen" diffraktiven optischen Elements (d.h. ohne Binarisierung) und Fig. 3B die Phase (+π/2, - ττ/2) eines binären diffraktiven optischen Elements. Fig. 3C zeigt die Intensität des Beugungsbilds des in Fig. 3A gezeigten diffraktiven optischen Elements. Fig. 3D zeigt dasselbe für das in Fig. 3B gezeigte binarisierte diffraktive opitsche Element. Wie aus dem Vergleich von Fig. 3C und 3D ersichtlich ist, beeinträchtigt die Binarisierung die Form des Fokus nicht wesentlich, sondern nur die Peakamplitude und den Hintergrund. Das in Fig. 3A-3D gezeigte Beispiel wurde speziell so gewählt, dass der Unterschied zwischen einem „idealen" und einem binarisierten diffraktiven optischen Element deutlich wird. In einer praktischen Situation ist dieser Unterschied so klein, dass er nicht oder nur kaum wahrnehmbar ist.
Das mittels einer Fourier-Transformation der Formel (6) erhaltene diffraktive optische Element bzw. Sub-Element (binär oder kontinuierlich) weist bei gleichen Parametern (Durchmesser und Brennweite) einen wesentlich schärferen Fokus auf (sowohl in x- als auch in y-Richtung) als ein refraktives optisches Element (z.B. eine Mikrolinse aus Glas oder Kunststoff). Dies ermöglicht eine höhere Präzision und eine bessere Auflösung des Scanvorgangs. Die einzelnen Sub-Elemente des zweiten diffraktiven optischen Elements können ähnlich zu den Sub-Elementen des ersten diffraktiven optischen Elements erhalten werden, wobei als Pupillenfunktion nicht die Konstante 1 ( wie beim ersten diffraktiven optischen Element), sondern das Fouriertransformierte der gewünschten Verteilung verwendet wird. Für eine ringförmige bzw. Donut-förmige Verteilung ist dies die Besselverteilung Jo. Die Bedingung für einen Donut-förmigen Spot ist somit:
Figure imgf000016_0001
Formel (8) ergibt das optimale Objekt- bzw. Elementspektrum üopt eines Donut-förmigen Spots bzw. einer Donut-förmigen Lichtverteilung bei o x. Die Fourier-Transformation des durch Formel (8) gegebenen Objektspektrums liefert das einzelne diffraktive Sub-Element des zweiten diffraktiven optischen Elements. Ein solches„ideales" diffraktives Sub-Element weist eine Amplitude und eine Phase in kontinuierlicher Form auf und ist geeignet, eine Donut- förmige Lichtverteilung im Fokusraum zu erzeugen. Durch eine Binarisierung (umfassend eine Normalisierung der Amplitude und Binarisierung der Phase) kann ein entsprechendes binäres diffraktives optisches Sub-Element erhalten werden. Die periodische Anordnung mehrerer SubElemente (ideal oder binär) bildet das zweite diffraktive optische Element. Fig. 4A zeigt die Phase eines beispielhaften binären diffraktiven optischen Elements, das ausgelegt ist, eine periodische Anordnung bzw. ein Array von Donut-förmigen Lichtspots zu erzeugen. Das gezeigte diffraktive optische Element umfasst ein Array von 3 x 3 binären diffraktiven Sub-Elementen (Phasenelementen) mit den folgenden Parametern: Periode P= 64 μητι, Ringradius Ro = 2 μητι und fo = 5 mm, wobei fo die nötige Ausbreitungsdistanz für die Entstehung des Fokus bzw. der Donut-Verteilung ist. Das diffraktive Muster eines jeden SubElements wurde nach einer Binarisierung der Fouriertransformierten der Formel (8) erhalten. Fig. 4B zeigt das erzeugte Array von Donut-förmigen Lichtspots (Anregungsbereichen). Sowohl der Ringradius Ro als auch die Ringposition entspricht der Designvorgabe. Die in Fig. 4B gezeigte x-y Verteilung entspricht der mit einer Spiralphasenplatte erzeugten Donut-förmigen Verteilung, mit dem Unterschied, dass sowohl der Ringradius als auch die Ringbreite einstellbar sind. Es könnten nach Bedarf auch andere Verläufe der Depletion-Intensitat gewählt werden, was mit einer Spiralphasenplatte nicht möglich ist.
Weitere Kombinationen von Merkmalen und/oder andere Geometrien und/oder Anordnungen des STED-Mikroskops sind selbstverständlich auch möglich. Ferner sind die in der Beschreibung genannten Vorteile von Merkmalen oder Kombinationen von Merkmalen beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen.
Bezugszeichenliste
M01-M03 Objektive
DOE1, DOE2 diffaktive optische Elemente;
BS 1, BS2 Strahlteiler;
0 Objekt bzw. Probe
10 Detektionseinheit (z.B. CCD Kamera)
20 Array von punktförmigen Anregungsbereichen (Anregungsfokussen bzw.
Anregungsfoki);
30 Array von ringförmigen bzw. Donut-förmigen Ausschaltebereichen

Claims

Ansprüche
1. STED-Mikroskop umfassend
eine Lichtquelle, die ausgelegt ist, einen Anregungsstrahl und einen Ausschaltestrahl zu erzeugen;
ein erstes diffraktives optisches Element (DOE1) und ein zweites diffraktives optisches Element (DOE2) mit jeweils einer periodischen Anordnung von diffraktiven Sub-Elementen, wobei
das erste diffraktive optische Element (DOE1) ausgelegt ist, einen Anregungsstrahl derart zu beugen, dass ein Array von punktförmigen Anregungsbereichen (20) erzeugt wird; und
das zweite diffraktive optische Element (DOE2) ausgelegt ist, einen Ausschaltestrahl derart zu beugen, dass ein Array von Donut-förmigen Ausschaltebereichen (30) erzeugt wird.
2. STED-Mikroskop nach Anspruch 1,
wobei die diffraktiven Sub-Elemente des ersten diffraktiven optischen Elements (DOE1) jeweils auf einer, vorzugsweise binarisierten und/oder normalisierten, Fourier-Transformation der Funktion üop k , 0) basieren, wobei
Figure imgf000019_0001
wobei die diffraktiven Sub-Elemente des zweiten diffraktiven optischen Elements (DOE2) jeweils auf einer, vorzugsweise binarisierten und/oder normalisierten, Fourier-Transformation der Funktion üovt(k , 0) basieren, wobei
Figure imgf000019_0002
und wobei:
k± = (kx, ky) einen Wellenvektor im k-Raum mit den Komponenten kx und ky bezeichnet; z die Ausbreitungsrichtung der Welle bzw. des Lichtstrahls bezeichnet;
ω = 2π//, wobei /die Lichtfrequenz ist;
c die Lichtgeschwindigkeit ist;
r± 0 = (x, y) einen Vektor, welcher den Ort des Anregungsbereichs oder des Ausschaltebereichs in der x— y Ebene beschreibt, bezeichnet;
J0 eine Besselfunktion nullter Ordnung ist;
R0 den Ringradius des erzeugten Donut-förmigen Ausschaltebereichs bezeichnet.
3. STED-Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2,
wobei die periodische Anordnung der Sub-Elemente des ersten diffraktiven optischen Elements (DOE1) eine Periode, die kleiner als 100 μηι ist, aufweist, und/oder
wobei die periodische Anordnung der Sub-Elemente des zweiten diffraktiven optischen Elements (DOE2) eine Periode, die kleiner als 100 μηη ist, aufweist.
4. STED-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, ferner umfassend
ein erstes Abbildungssystem (M01 , M03) zum Abbilden des mittels des ersten diffraktiven optischen Elements erzeugten Arrays (20) von Anregungsbereichen auf eine zu untersuchende Probe (O); und
ein zweites Abbildungssystem (M01 , M03) zum Abbilden des mittels des zweiten diffraktiven optischen Elements (DOE2) erzeugten Arrays (30) von Ausschaltebereichen auf die zu untersuchende Probe (O).
5. STED-Mikroskop nach Anspruch 4, wobei das erste Abbildungssystem (M01 , M03) und/oder zweite Abbildungssystem (M02, M03) derart justierbar ist/sind, dass das Array von Anregungsbereichen (20) mit dem Array von Ausschaltebereichen (30) im Wesentlichen überlappt.
6. STED-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, femer umfassend ein Wechselrad mit einer Mehrzahl von diffraktiven optischen Elementen, welches ausgelegt ist, das zweite diffraktive optische Element (DOE2) durch ein anderes diffraktives optisches Element zu ersetzen.
7. Verfahren für die STED-Mikroskopie, umfassend die Schritte:
Bereitstellen eines STED Mikroskops nach einem der vorangegangenen Ansprüche;
Beleuchten des ersten diffraktiven optischen Elements (DOE1) mit einem Anregungsstrahl und Erzeugen eines Arrays von punktförmigen Anregungsbereichen auf einer zu untersuchenden Probe (0);
Beleuchten des zweiten diffraktiven optischen Elements (DOE2) mit einem Ausschaltestrahl und Erzeugen eines Arrays von Donut-förmigen Ausschaltebereichen auf der zu untersuchenden Probe (0), welches im Wesentlichen mit dem Array von Anregungsbereichen überlappt;
Detektieren zumindest eines Teils des Fluoreszenzlichts, das von der zu untersuchenden probe (0) ausgesendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, ferner umfassend den Schritt:
Ausrichtung des ersten diffraktiven optischen Elements (DOE1) und zweiten diffraktiven optischen Elements (DOE2), um eine Überlappung des Arrays von Anregungsbereichen und des Arrays von Ausschaltebereichen zu erzielen, wobei die Ausrichtung ein laterales Verschieben des ersten und/oder des zweiten diffraktiven optischen Elements umfasst.
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