WO2017178662A1 - Procédé de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales et appareil associé - Google Patents

Procédé de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales et appareil associé Download PDF

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cells
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Catherine Michèle Marilou ALIX - PANABIERES
Andrew David Griffiths
Raphaël Clément Li-Ming DOINEAU
Clément NIZAK
Philippe Chi-Thanh NGHE
Jean-Marie Pierre BAUDRY
Elodie Michèle Christine BRIENT-LITZLER
Klaus EYER
Jérôme Bibette
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier
Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville de Paris ESPCI
Universite de Montpellier
AxLR SATT du Languedoc Roussillon SAS
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Universite de Montpellier
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    • G01N33/57595—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving intracellular compounds
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Definitions

  • the present invention is in the field of biological diagnosis in oncology. It relates to a method and apparatus for detecting and / or characterizing tumor cells by detecting one or more elements of the tumor cell secretome, in particular one or more peptides or proteins, and in particular one or more tumor markers.
  • the invention also relates to detection and / or characterization drops of tumor cells and their method of preparation.
  • EPISPOT epidermal Immunospot
  • Epithelial Immunospot A method for detecting circulating tumor cells commonly designated by the acronym EPISPOT, for the English term “Epithelial Immunospot”, is known from the prior art, in particular EP 1 506 407.
  • This technique allows the detection of circulating tumor cells. in a biological sample of a patient with solid cancer, by detecting tumor markers released by these cells. It implements the deposition of cells on a solid culture surface, more particularly 96-well plates, at a rate of 2.10 5 cells per well, an antibody specific for a tumor marker of interest being fixed on this culture surface. solid, followed by the culture of these cells, then the washing out of the cells and the detection of the tumor marker of interest by a labeled specific antibody.
  • the resolution obtained by such a method is limited. Indeed, in the same well, the detected proteins come from different cells. It is difficult to know which cell secreted what. The signal does not provide information on cell heterogeneity. In addition, it is difficult to recover cells to analyze their genotype.
  • the present invention aims to provide a more accurate and reliable detection method.
  • WO 2009/01 1808 A1 describes a method for determining an activity for fixing a protein within a droplet.
  • the presence of a single ball of significant size per drop is not favorable to the resolution of the method. Indeed, the secondary antibodies are distributed over the entire surface of the ball. The dynamic range of the process is therefore limited by the external surface available per ball.
  • An object of the invention is to provide a more reliable and more sensitive method of analysis than existing methods allowing the analysis of the secretome of living cells, either singly or in the form of an aggregate, for detecting and / or characterizing cells.
  • tumor cells and in particular single tumor cells or aggregates of tumor cells.
  • the subject of the invention is a method for detecting and / or characterizing tumor cells, comprising:
  • a plurality of drops contained in a carrier fluid at least one of the drops comprising at least one particle aggregate defining an elongate object along a main axis, at least some drops containing a cell capable of producing at least one element target of the secretome of a tumor cell adapted to attach to the aggregate;
  • the method for detecting and / or characterizing tumor cells comprises:
  • the drops comprising a plurality of particles capable of forming an aggregate of particles defining an elongate object along a main axis, at least some drops containing a cell;
  • the cell incubating the plurality of drops under conditions and for a time sufficient so that, in the drops containing a cell, the cell is capable of producing at least one target element of the secretome of a tumor cell, capable of being fixed on the aggregate;
  • each physical parameter being characteristic of the fixation of a distinct target element of the secretome of a tumor cell on the aggregate
  • the detection and / or characterization of tumor cells from the measurement of said at least one physical parameter.
  • Said cell is a single cell or an aggregate of cells, in particular an aggregate suspected to be an aggregate of tumor cells.
  • the aggregates of tumor cells are of oligoclonal origin and result from the adhesion, or grouping, of several primary tumor cells.
  • Aggregates of tumor cells can typically contain 2 to 15 tumor cells. They consist essentially of tumor cells, but may also contain other types of cells, such as leukocytes, platelets, in limited numbers.
  • the method according to the invention therefore relates in particular to a method for detecting and / or characterizing single tumor cells comprising:
  • a carrier fluid comprising at least one of the drops comprising at least one particle aggregate defining an elongated object along a main axis, at least some drops containing a single cell;
  • single-cell-containing drop is meant that the drop comprises a single cell.
  • single tumor cell-containing drop is meant that the drop comprises a single cell which is a tumor cell.
  • a tumor cell is not a cell created by artificial fusion of a tumor cell with another cell, such as a hybridoma.
  • the method is intended to determine the presence of drops, or even to select drops, comprising a single cell whose secretome comprises a particular target element, this target element being a molecule of the secretome of a tumor cell, and in particular a tumor marker.
  • the secretome of a cell is the set of elements (organic or inorganic molecules, such as proteins, peptides, carbohydrates, lipids, or nucleic acids, or vesicles) present in the conditioned medium of a cell in culture.
  • elements organic or inorganic molecules, such as proteins, peptides, carbohydrates, lipids, or nucleic acids, or vesicles
  • secretome refers in a particular sense to the portion of the proteome (i.e., all the proteins and peptides expressed by the cell) that is present in the conditioned medium of a cell in culture.
  • CA15-3 CA15
  • CA 125 CA 125
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • cathepsin D alphafoetoprotein
  • S100 protein FGF-2 or EGF
  • EGF EGF
  • the HER2, EGFR (Epithelial Growth Factor Receptor) or MUC 1 markers are cleaved proteins; or - released by the cell.
  • the released molecules are, for example, non-membrane proteins secreted by the cell by different routes from the secretory pathways, for example by budding, such as the protein CK 19 (Cytokeratin 19).
  • Exosomes are also part of the secretome of tumor cells. These are vesicles consisting of a lipid bilayer membrane surrounding a small cytosol.
  • the cytosol of the exosomes may comprise proteins, double-stranded DNA, but also RNA (in particular mRNA, miRNA). Exosomes would allow tumor cells to transfer oncogenic proteins and / or nucleic acids to modulate the activity of recipient cells, thereby playing a role in tumorigenicity, tumor growth, metastatic processes and drug resistance.
  • the method according to the invention may comprise one or more of the following characteristics, taken separately or in any technically possible combination:
  • the particles are magnetic particles, advantageously paramagnetic, preferably superparamagnetic;
  • the step of providing the drops comprises:
  • the target element is an element of the secretome of a tumor cell
  • the target element is a peptide or protein of the secretome of a tumor cell
  • the target element is a nucleic acid (DNA or RNA), in particular a miRNA of a tumor cell;
  • the target element is an exosome of a tumor cell
  • the drops comprise a producing entity capable of producing the target element, the producing entity being a single tumor cell or an aggregate of tumor cells, and in particular a single circulating tumor cell (CTC), a disseminated tumor cell; (DTC), or an aggregate of CTCs or DTCs;
  • the method comprises, before the measuring step, a step of orienting the main axis of the aggregate along a detection axis; ix) the method comprises multiple measurement steps, with a step of orienting the main axis of the aggregate according to a different detection axis for each of the measurements;
  • the method comprises:
  • the method comprises:
  • a device comprising a set of circulation of the drop and a plurality of filing zones, and a means of directing the drop or part of the drop selectively towards a filing zone
  • the decision to classify the drop or part of the drop the decision of selectively selecting a classification zone from the plurality of classification zones
  • At least one drop comprises at least one target element, at least one capture element capable of capturing the target element and at least one signaling entity capable of forming a complex with the target element, possibly captured by the element capture method, the method comprising measuring a signal indicating relocation or concentration of said at least one signaling entity on the aggregate;
  • At least one drop comprises at least one target element, at least one first signaling entity capable of forming a complex with the target element and at least one second distinct signaling entity capable of forming a complex with the target element, the method comprising measuring a signal indicating the concentration of each of the relocated signaling entities on the aggregate;
  • At least one drop comprises at least one target element, at least one signaling entity capable of forming a complex with the target element and at least one quantization entity capable of forming a complex with the target element, the method comprising :
  • At least one drop comprises at least two distinct signaling entities, each of the two signaling entities being able to form a complex with a distinct target element on the aggregate, the method comprising measuring a signal indicating the concentration of each of the relocated signaling entities;
  • the drops comprise a producing entity, the producing entity being a cell capable of producing an element of the secretome of a tumor cell, each member of the secretome of a tumor cell being a separate target element, the measurement of the signal indicating the concentration of each of the relocated signaling entities allowing quantification of the secretome element (s);
  • the measurement of a physical parameter is a measure of radioactivity, colorimetry or fluorescence
  • At least one of the drops comprises a cell capable of secreting the target element and the method comprises an incubation step during which the target element is secreted into the drop by the cell;
  • the method comprises a step of measuring a physical parameter, locally at a first point located away from the aggregate in at least one of the drops and the same physical parameter, locally at a second point in the vicinity of the aggregate in the same drop;
  • the maximum particle size is less than 50% of the drop diameter
  • the drop contains at least one signaling entity, and the measurement of the physical parameter depends on the position of the signaling entity within the drop or with respect to the aggregate;
  • the producer entity produces a plurality of target elements selected from the group consisting of the elements, and in particular the proteins and peptides, of the secretome of a tumor cell;
  • the method includes a step of determining at least one characteristic of the producing entity
  • the classification decision step takes place after the measurement step
  • the drop contains superparamagnetic particles, the drop or part of the drop is directed towards the grading zone by a selected means of direction from a magnetic field, an electric field, a dielectrophoresis, an electrocoalescence or a surface acoustic wave;
  • a part of the drop is extracted by means of the magnetic force, the extracted part forming an auxiliary drop and containing the aggregate;
  • the particles are functionalized with a capture element adapted to fix the target element and each drop comprises a signaling entity adapted to fix the target element;
  • the signaling entity is fluorescent, radioactive or colored
  • the measurement of a physical parameter is a measurement of chromometry, fluorescence or radioactivity
  • the measurement of the physical parameter includes the location of a fluorescence, chromometric or radioactivity signal within the drop;
  • the measurement of the physical parameter comprises the location of a fluorescence signal of chromometry or of radioactivity with respect to the aggregate, within the drop;
  • the measurement of the physical parameter includes measuring the intensity of a fluorescence, chromometric or radioactivity signal within the drop, preferably at the level of the aggregate;
  • the measurement of the physical parameter comprises the variation over time of the location and / or intensity of a fluorescence, chromometric or radioactivity signal within the drop, preferably at the level of the aggregate ;
  • each drop comprises at least two distinct signaling entities, each of the two signaling entities being able to form a complex with a distinct target element on the aggregate, each signaling entity being fluorescent in a separate fluorescence channel;
  • the cell is a tumor cell, in particular a single tumor cell or an aggregate of tumor cells;
  • the cell in particular the single cell or the cell aggregate, is derived from a biological fluid and is selected from the group consisting of a circulating tumor cell and a disseminated tumor cell;
  • the measuring step comprises the measurement of said at least one physical parameter locally at a plurality of points situated in the drop, the measuring step preferably comprising the determination of the integral of the measured values within the drop;
  • the measuring step is carried out in a microfluidic chamber without circulation of the drops; xxxix) the method comprises:
  • a device comprising a set of circulation of the drop and a plurality of filing zones, and a means of directing the drop or part of the drop selectively towards a filing zone
  • the decision to classify the drop or part of the drop the decision of selectively selecting a classification zone from the plurality of classification zones
  • At least one drop comprises at least two distinct signaling entities, each of the two signaling entities being capable of forming a complex with a distinct target element on the aggregate, the method comprising measuring a signal indicating the concentration of each of the relocated signaling entities;
  • the drops comprise a single or aggregate cell capable of secreting, cleaving or releasing one or more elements of the tumor cell secretome, each element of the tumor cell secretome being a separate target element, the measuring the signal indicating the concentration of each of the relocated signaling entities allowing quantification of the elements or elements of the tumor cell secretome.
  • the invention also relates to an apparatus for detecting and / or characterizing tumor cells, either singly or in the form of an aggregate of tumor cells, comprising:
  • a set of supplying a plurality of drops contained in a carrier fluid at least one of the drops comprising at least one aggregate of particles defining an elongate object along a main axis, at least some drops containing a single tumor cell or under a single form of an aggregate of cells, capable of producing a target element adapted to be fixed on the aggregate,
  • the apparatus comprises a set of measurement of a physical parameter characteristic of setting a target element on the aggregate
  • the apparatus optionally further comprising:
  • the subject of the invention is also a drop of detection and / or characterization of tumor cells, either single or in the form of an aggregate of tumor cells, comprising a plurality of particles capable of forming an aggregate of particles defining an elongated object according to a main axis, and a tumor cell, unique or in the form of an aggregate of tumor cells, and optionally at least one target element of the tumor cell secretome, which is unique in the form of an aggregate of tumor cells, capable of being fixed on the aggregate.
  • the subject of the invention is also a process for the preparation of detection drops and / or characterization of tumor cells, unique or in the form of an aggregate of tumor cells, comprising:
  • dispersing in a mass of fluid intended to form drops, particles suitable for forming an aggregate defining an object elongated along a main axis, and a plurality of cells, at least some cells being tumor cells capable of producing a target element of the secretome of a tumor cell and then
  • each drop comprises a plurality of particles and at least some of the drops comprise, in addition, a single cell or in the form of an aggregate, and
  • each drop of at least one particle aggregate defining an elongate object along a major axis optionally forming in each drop of at least one particle aggregate defining an elongate object along a major axis, the particle aggregate being formed in each drop after the dispersion.
  • FIG. 1 is a schematic representation of the main elements of a first analysis apparatus according to the invention
  • FIG. 2 and FIG. 3 are diagrammatic representations of a process step with the first apparatus
  • FIGS. 4 to 7 are photographs of part of a second apparatus according to the invention during different process steps according to the invention.
  • FIG. 8 is a schematic representation of a third apparatus according to the invention, Figures 9 and 10 show sets of spacing drops and reading,
  • FIGS. 11 and 12 represent devices for generating drops
  • FIG. 13 is a schematic representation of a droplet during a step of implementing a method
  • FIGS 14 to 26 illustrate examples of application of the method.
  • a first apparatus 1 for analyzing the droplet content and for detecting and / or characterizing tumor cells, which are unique or in the form of an aggregate of tumor cells, according to the invention is represented in FIG.
  • the apparatus 1 comprises a supply assembly 4 of a plurality of drops 6 contained in a carrier fluid 8, at least a portion of the drops 6 comprising at least one aggregate 10 of particles 12 defining an elongate object along a main axis X.
  • An elongated object is an object having an elongated shape.
  • An elongated shape has, along the main axis, a length greater than its length in a direction perpendicular to the main axis.
  • a sphere is not elongated.
  • an oblong object, a cone, a rod or a non-spherical ovoid have elongated shapes.
  • the apparatus 1 further comprises a measuring assembly 14 of a physical parameter in the drop.
  • the measurement unit 14 is, for example, able to measure a physical parameter, locally at a first point 16 located away from the aggregate 10 in at least one of the drops and the same physical parameter locally. in a second point 18 in the vicinity of the aggregate 10 in the same drop.
  • the apparatus 1 also comprises a device 20 comprising a circulation assembly 22, a circulation conduit 24 and a detection zone 26.
  • the circulating assembly 22 is able to circulate each drop 6 in the carrier fluid 8 in the conduit 24 in the form of a train of successive drops.
  • the supply assembly 4 comprises a loading assembly 28 and an aggregation assembly 30.
  • the supply assembly 4 further comprises a spacer assembly 31.
  • the loading assembly 28 is able to provide a plurality of initial drops 32 comprising a dispersion of particles 12, at least one of the initial drops 32 further comprising at least one target element 37 of the secretome of a tumor cell 90.
  • the spacing assembly 31 is able to space two successive drops 6 of the drop train, that is to say to increase the distance between two successive drops.
  • the spacer assembly 31 has a carrier fluid inlet 8. Examples of the set of spacings are shown in FIGS. 9 and 10.
  • the carrier fluid 8 is able to separate two successive drops 6 of the drop train to prevent their contact.
  • the separation of drops 6 is performed by a mechanical device.
  • the fluid forming the internal phase of the drops 6 and the carrier fluid 8 are substantially immiscible.
  • the drops 6 comprise an aqueous internal phase and the carrier fluid 8 is an organic or oily phase.
  • the carrier fluid 8 is advantageously a fluorinated oil.
  • the carrier fluid 8 or the fluid forming the internal phase of the drops advantageously comprises a surfactant capable of preventing the fusion of two drops 6 in contact, for example as described in US Patent 2010/01051 12 or surfactant EA from RainDance Technologies.
  • substantially immiscible is generally meant that the solubility of the fluid forming the drops in the carrier fluid 8, measured at 25 ° C and at ambient pressure, is less than 1%.
  • the size of the drops 6 is, for example, between 1 ⁇ and 1000 ⁇ .
  • the volume of the drops 6 is advantageously between 0.1 picolitre and 1 microliter.
  • the drops 6 provided are substantially monodisperse. This means that the polydispersity of the drops 6 is less than 5%.
  • the drops 6 are spherical. In a variant, the drops
  • the drops 6 are of elongated shape along the Y circulation axis of the conduit 24.
  • the drops 6 are of flattened puck shape along an axis perpendicular to the Y circulation axis. Composition of the drops
  • Each initial drop 32 comprises a base fluid, a dispersion of solid particles 12 in the base fluid and a plurality of signaling entities 34.
  • at least one initial drop 32 comprises a cell 90, preferably a single tumor cell. or an aggregate of tumor cells, and optionally at least one target element 37 of the tumor cell secretome.
  • the volume of a drop 6 is advantageously between 0.1 picolitre and 1 microliter.
  • the volume of a cell is about 1 picoliter.
  • a drop volume of between 20 and 150 picoliters for example 20 to 50 picoliters, or 30 to 40 picoliters, for single cells, or even 30 to 40 picoliters, will be advantageously chosen. from 60 to 150 picoliters, or from 80 to 120 picoliters, in particular for cell aggregates.
  • the analysis of single cells and aggregates can be done simultaneously or sequentially.
  • droplet volumes adapted to be able to encapsulate the cell aggregates (for example from 60 to 150 picoliters, typically about 100 ⁇ l).
  • an integrated separation system (with techniques as described in Sajeesh and Sen, Microfluidics and Nanofluidics 2014, 17, 1-52) can be used to separate single cells and cell aggregates, followed by encapsulation separate single cells on the one hand, and cell aggregates on the other.
  • the single cells and cell aggregates are encapsulated in drops of small volumes (e.g., 20 to 50 picoliters), and the cell aggregates are sorted, and volume is added to the drops containing the cell aggregates in a second time.
  • small volumes e.g. 20 to 50 picoliters
  • the separation of the single cells and cell aggregates can also be done prior to the implementation of the invention, and the single cells and cell aggregates are then analyzed sequentially and separately.
  • the drop initially comprises the cell in the base fluid, typically a medium adapted to the culture of mammalian cells (and in particular of human cells) such as DMEM or RPMI, the base fluid then being devoid of elements of the secretome of the cell.
  • the secretome elements accumulate over time, in the base fluid, by secretion, cleavage or release from the single cell.
  • the base fluid is adapted so that a single cell or aggregate of cells in the droplet is capable of producing at least one target element of the secretome of a tumor cell, capable of binding to the aggregate, particularly when the single cell is a tumor cell or when the cell aggregate contains or consists of tumor cells.
  • each tumor cell 90 unique or in the form of a cluster of cells, encapsulated in a droplet is capable of producing a target element 37.
  • the tumor cells 90 secrete, cleave or release secretome elements such as proteins or peptides, in particular proteins or peptides that mark the tumor.
  • Tumor cells unique or in the form of a aggregates of cells, including circulating tumor cells or disseminated tumor cells.
  • the particles 12 are intended to form the elongated aggregate 10.
  • the particles 12 are superparamagnetic particles that acquire a magnetic moment at the application of a magnetic field.
  • Superparamagnetism is a behavior of ferromagnetic or ferrimagnetic materials that occurs when they are in the form of small grains or nanoparticles. In grains of sufficiently small size, the magnetization can be reversed spontaneously under the influence of temperature.
  • the term "magnetic particles" in the text refers to superparamagnetic particles.
  • the magnetic particles 12 are, for example, chosen from particles provided by the company Dynal (Life Technologies) or Ademtech or Miltenyi.
  • the particles 12 are for example nanometric. Thus, their maximum dimension is less than 1 ⁇ and is for example between 50 nm and 1000 nm.
  • the particles 12 are advantageously substantially monodisperse. For example, the variation between the maximum dimensions of the particles 12 is strictly less than 10%.
  • the size and number of particles 12 per drop 6 are chosen to form the desired number of aggregates.
  • the maximum particle size 12 is less than 50% of the diameter of the drop 6.
  • the concentration of particles 12 allows a colloidal stability.
  • the concentration of particles 12 by drops 6 is such that the particles 12 occupy between 0.1% and 5% of the volume of the drop 6, for example 1.7%.
  • each drop of 33 picoliters contains on average 500 particles 12 of 300 nm in diameter.
  • the particles 12 initially form a homogeneous dispersion in the initial drops 32. They are distributed substantially uniformly in the volume of the initial drop 32. Thus, the concentration of particles 12 is homogeneous over the entire initial drop 32.
  • the particles 12 advantageously have a surface for coupling biological molecules, consisting of a surface material.
  • the particles 12 are covered with a polymer having COOH or NH 2 functions.
  • this surface material also makes it possible to limit the spontaneous aggregation of the particles 12 in the drop.
  • the particles 12 are advantageously functionalized. This means in particular that the surface material of the particles 12 comprises functional elements.
  • the functional elements comprise a capture element 36.
  • the capture element 36 is, for example, able to capture the target element 37.
  • the capture element 36 is able to bind indirectly to the target element 37. signaling entity 34 via the target element 37.
  • the target element 37 secreted or released by the tumor cell, alone or in the form of an aggregate, or cleaved from the tumor cell, alone or in the form of an aggregate, is recognized by both the capture elements 36 particles 12 and signaling entities 34.
  • the capture elements 36 are advantageously constituted by a polyclonal antibody or a monoclonal antibody (in multiple copies) directed against, or specific of the target element 37.
  • the capture elements 36 are advantageously constituted by a nucleic acid (in multiple copies) hybridizing to the target nucleic acid, preferably a nucleic acid comprising or consisting of a sequence complementary to the sequence of the target nucleic acid.
  • the capture nucleic acid is typically a DNA sequence, consisting for example of 10 to 200, 10 to 100, 10 to 50, or 10 to 30 nucleotides.
  • the capture elements 36 are advantageously constituted by antibodies directed against a protein present in the membrane, or by lipids or sterols immobilized on a solid surface, for example particles, as described in FIG. Kuhn et al. (Integr Biol, 2012, 4, 1550-1555).
  • the label may typically be a radioelement, a chromophore compound, a fluorophore, or an enzyme coupled directly or indirectly to the antibody or nucleic acid.
  • the presence of these target elements 37 in the drop 6 allows the relocation of the signaling entities 34 to the aggregate 10, as will be described later.
  • the single cell is not a tumor cell
  • the cell aggregate does not contain a tumor cell, or when the single cell or cell aggregate does not produce, or not in sufficient quantity, the target element 37 of the tumor cell secretome, the signaling entities 34 do not relocate on the aggregate 10.
  • the relocation of the signaling entities 34 to the aggregate thus makes it possible to detect that the cell, alone or in the form of an aggregate, secretes, cleaves or relaxes the target element 37 and therefore:
  • the cell characterize that the cell is a tumor cell if the target element is a specific marker of the tumor cells or of a tumor cell type, and / or
  • the target element 37 is part of the secretome of the cell.
  • different signal entities and different different catch elements are associated. Their relocation is detected independently by different signaling entities and different capture elements, for example on different fluorescence channels.
  • Each relocation of a distinct signaling entity 34 associated with a distinct target element makes it possible to detect that the cell secretes, cleaves or relays the associated target element 37.
  • the aggregate assembly 30 is capable of generating an aggregation of the particles 12 along a main axis X.
  • the aggregation assembly 30 comprises, for example, two magnets 38 located on either side of the duct 24.
  • the magnetic field is non-parallel to the circulation axis Y and advantageously perpendicular to the circulation axis Y.
  • the aggregate assembly 30 allows the formation of an elongated aggregate in each drop 6.
  • the magnets 38 are permanent.
  • the aggregation assembly 30 comprises a non-permanent magnet.
  • the aggregation set 30 is able to switch from an active mode to an inactive mode to generate elongated aggregates in only some drops.
  • Each aggregate 10 of particles 12 comprises for example a column oriented along a main axis X.
  • the height of the column is advantageously between 50% and 100% of the diameter of the drop 6. Its width is, for example, less than 60% of its height.
  • the aggregate assembly 30 is, for example, able to orient the aggregate along a preferred axis.
  • the axis X of the aggregate 12 is perpendicular to the circulation axis Y of the drops 6 in the circulation duct 24.
  • the measuring assembly 14 comprises for example a laser line capable of optically measuring the intensity of the fluorescence along a line extending along an axis X 'perpendicular or inclined with respect to the axis of circulation Y.
  • the measuring assembly 14 is able to perform the measurement within the drop in the detection zone 26.
  • the axis X 'of the laser line is advantageously parallel to the axis of the aggregate X in the detection zone 26.
  • the measurement as a function of time of the signal obtained by the laser line corresponds to a spatial scan of the drop 6 passing in front of the laser line. This makes it possible to successively take several measurement points and in particular at least a first measurement point 16 located away from the aggregate 10 and a second measurement point 18 located closer to the aggregate 10, in the vicinity of the aggregate 10.
  • the signaling entity 34 is fluorescent.
  • the circulation duct 24 is intended to allow the circulation of the drops 6, 32 along the circulation axis Y in a direction of flow going from the supply assembly 4 to the measuring assembly 14.
  • the circulation duct 24 advantageously has an internal diameter less than or equal to 1 mm.
  • the circulation duct 24 is elongated along the circulation axis Y.
  • the circulation duct 24 has an inner cross section of rounded contour such as circular or elliptical, or of polygonal contour such as rectangular.
  • the circulation duct 24 is for example defined in a translucent material allowing measurement of optical parameters by the measuring assembly 14.
  • the circulation duct 24 defines at least one transparent measurement window in the detection zone 26.
  • the walls of the circulation duct 24 are sealed to the carrier fluid 8.
  • the circulation duct 24 is defined in a capillary tube of internal dimension advantageously less than 1 mm.
  • the circulation duct 24 is defined in a microfluidic chip.
  • the set of circulation drops 22 is intended to move one by one the drops 6, 32 in the conduit 24 in the direction of circulation.
  • the circulation assembly 22 comprises, for example, a syringe driver making it possible to apply controlled flow rates to the carrier fluid 8.
  • the circulation assembly 22 comprises a pressure controller. Analysis method with the first device
  • the particles 12 are homogeneously dispersed in each initial drop 32.
  • each initial drop 32 contains a high number of individual particles 12, for example greater than 10. The probability of obtaining an initial drop 32 devoid of particles 12 is very low, or even zero.
  • Some drops 6 comprise a single tumor cell 90 secreting, releasing or cleaving the target element 37.
  • the signaling entities 34 are dispersed homogeneously in each initial drop 32.
  • bonds are formed between the elements having particular affinities.
  • each target element 37 binds to a signaling entity 34 and a capture element 36.
  • the signaling entity 34 is thus relocated to a particle 12.
  • located entities are understood to mean the entities linked to the aggregate 10.
  • the initial drops 32 are circulated together with the carrier fluid 8 in the conduit 24 by the circulation assembly 22.
  • At least one initial drop 32 is conducted to the aggregation assembly 30.
  • An aggregate 10 of particles 12 defining an elongate object along a major axis X is formed by the aggregation assembly 30 in the initial drop 32.
  • the particles 12 are magnetic particles, they align along the main axis X during their passage opposite each magnet 38 of the aggregation assembly 30.
  • the drop 6 comprising the elongate object is led to the detection zone 26.
  • a physical parameter is measured locally by the measuring assembly 14 in at least a first point 16 in at least one of the drops 6.
  • a physical parameter is measured locally by the measuring assembly 14 in at least one first point 16 in at least one of the drops 6 and the same physical parameter is measured locally in at least one second point 18 at the neighborhood of the aggregate 10 in the same drop 6 by the measuring assembly 14.
  • FIG. 2 represents by way of illustration different measurements obtained for different drops 6.
  • the graph represents the fluorescence intensity measured by the laser line as a function of time.
  • the fluorescence intensity is measured in a wavelength range characteristic of the signaling entity 34.
  • the fluorescence intensity is furthermore measured in a wavelength range characteristic of the particles 12, the particles 12 being fluorescent.
  • the aggregate 10 is thus more easily identifiable.
  • the fluorescence intensity 40 corresponding to the fluorescence of the signaling entity 34 measured on the laser line is shown in dashed lines in FIG. 2 for different drops 6.
  • the fluorescence intensity 41 corresponding to the fluorescence of the particles 12 is presented in full lines in FIG. 2 for different drops 6.
  • the measuring step includes determining the physical parameter locally at a plurality of points in the drop. It also advantageously comprises an accumulation of the measured values in a plurality of points, for example the determination of the integral of the measured values within the drop 6.
  • the first drop 42 shown is a drop 6 in which the different signaling entities 34 have not been relocated to the particles 12.
  • the distribution of the signaling entities 34 is homogeneous within the drop 6.
  • a signal intensity of fluorescence in the form of a plate 44 is measured.
  • the second drop 48 shown is a drop 6 in which part of the signaling entities 34 has been relocated to the particles 12.
  • signaling 34 are linked to a target element 37 captured by the capture element 36.
  • the fluorescence intensity in the vicinity of the aggregate 10 is therefore greater than in the rest of the drop 6.
  • a fluorescence intensity signal having a peak 50 in addition to a plateau 52 is measured.
  • the height of the plate 52 of the second drop 48 is smaller than the height of the plate 44 of the first drop 42 because fewer sign entities 34 are free from the aggregate 10.
  • the third drop 56 shown is a drop 6 in which a larger proportion of the signaling entities 34 has been relocated to the aggregate.
  • a fluorescence intensity signal having a peak 58 and a plateau 59.
  • the height of the peak 58 measured is greater than the height of the peak 50 measured in the second drop 48 because more signaling entities 34 are captured by the particles. 12 and are therefore located in the vicinity of the aggregate 10.
  • FIG. 3 illustrates the choice of parameters that are useful for estimating the concentration of relocated signaling entities 34.
  • Figure 3 which represents the signal S in the course of time t, we see three drops containing a (left and right) or two aggregates (in the center) which have a higher signal peak.
  • the useful parameter may be the maximum of the signal (indicated Max) or the integral of the signal with respect to a given threshold (Int).
  • a first method consists in estimating this concentration by the maximum value of the signal (Max) in each drop 6, that is to say the height of the signal peaks relocated on the aggregate.
  • a second, more precise method consists in calculating the integral of the signals (Int) for each drop 6 beyond a threshold set by the user, as represented for example in FIG. more interesting to limit the dispersion of the signal.
  • Both of these signal processing methods can be performed in real time. Other methods, for example combining these approaches, could be applied, for example to measure both the relocated and non-relocated signaling entity 34.
  • the invention also makes it possible to measure the concentration of the target element 37 in the drop 6.
  • the capture element 36 is in sufficient quantity and of sufficient affinity for the target element 37 to capture at least more than 90% of the target element on the aggregate, advantageously all of it;
  • the concentration of the signaling entity 34 is greater than that of the target element 37 and the dissociation constant Kd between the signaling entity 34 and the target element 37 is lower than the concentration of the target element 37 advantageously by a factor greater than 10. This is typically the case when using optimized assay reagents such as subnanomolar Kd monoclonal antibodies, and it is desired to detect target element concentrations 37 greater than nanomolar.
  • “Nanomolar” is understood to mean 1 nanomole / L.
  • each target element 37 gives rise to the formation of a capture element complex 36 - target element 37 - signaling entity 34.
  • the concentration of the target element 37 is therefore proportional to the signal of the target element 37.
  • the signaling entity 34 relocated on the aggregate 10.
  • Other conditions make it possible to perform this quantification and will be obvious to those skilled in the art by modifying the concentrations and affinities of the capture elements 36, or signaling entities 34 for the target element 37.
  • the target element is a specific marker of the secretome of a tumor cell, its detection may be sufficient to detect encapsulated single or aggregated tumor cells.
  • the target element is a characteristic marker of the secretome of a tumor cell, but not specific to the tumor cells, its detection in combination with one or more other target elements constituting characteristic markers of the secretome of a tumor cell can make it possible to detect that the single encapsulated cell is a tumor cell.
  • This information makes it possible to know which drops must be retrieved downstream for other measurements or uses.
  • the method thus makes it possible to detect isolated tumor cells from a biological sample comprising heterogeneous cells.
  • Non-tumor cells or tumor cells that do not produce the target element are identified because their drop does not contain the target element and the signaling entities have not been relocated.
  • This method thus makes it possible to detect or even count tumor cells in a population of cells from a biological sample.
  • the measurement of the target element can make it possible to obtain information relating to the production of the target element by the single tumor cell, for example at its concentration.
  • the aggregate of encapsulated cells contains one or more tumor cells
  • measurement of the target element can make it possible to obtain information relating to the production of the target element by the aggregate of cells, for example at its concentration.
  • information is obtained on one or more characteristics of each tumor cell encapsulated in the drop, or of each aggregate containing one or more tumor cells encapsulated in the drop.
  • This information makes it possible to obtain information on the heterogeneity or the properties of the tumor cells.
  • information can be obtained both on the tumor nature of the cell and on characteristics of the tumor cell, for example by detecting the target element and measuring its concentration.
  • target elements are tumor markers and other elements of the secretome, such as proteins or peptides, which are not specifically tumor markers.
  • This information makes it possible to obtain information on the heterogeneity of the tumor cells and various mechanisms.
  • FIGS 4 to 7 illustrate a portion of a second apparatus 60 according to the invention.
  • This second apparatus 60 differs from the first apparatus 1 in that the device 20 comprises a chamber 62.
  • the chamber 62 comprises a plurality of circulation passages 64 and a plurality of separation pads 66. Other rooms are possible.
  • chambers do not comprise separation pads as described in document PCT / FR2009 / 051396.
  • the chamber 62 is intended to store a plurality of drops 6 in a carrier fluid 8 during an aggregation step or an orientation step and during the measurement step.
  • the measuring assembly of the second apparatus 60 differs from the measuring assembly 14 of the first apparatus 1 in that it is able to measure the physical parameter simultaneously on several drops 6 present in the chamber 62.
  • FIG. 4 shows the chamber 62 containing initial drops 32 in a carrier fluid 8. The dispersion of the magnetic particles 12 is visible.
  • Figure 5 shows the same chamber 62 after the formation of the aggregates 10 in the drops. A plurality of elongated aggregates is formed in each drop 6.
  • Figure 6 shows in the same device 60 a plurality of drops 6 having elongated aggregates. The nature and amount of drops 6 have been adjusted so that only one elongate aggregate is present per drop. The presence of a single aggregate 10 per drop 6 facilitates the measurement.
  • FIG. 7 shows the same chamber 62 after a step of orienting the aggregates along the same detection axis D. Analysis method with the second apparatus
  • the analysis method according to the invention from this second apparatus 60 differs from the method previously described in that the measurement is performed on the plurality of drops 6 simultaneously, for example by measuring throughout the chamber 62 at the same time, and not by circulation of the drops 6 in front of a detector.
  • An advantage of this method is that it is possible to repeat the measurement of the physical parameter on the same droplet over time, since the drops are stationary, and thus be able to determine the kinetics of secretion of an element of the secretome.
  • the method also differs in that it comprises, before the measuring step, a step of orienting the main axis X of the aggregate 10 along a detection axis D.
  • the detection axes it will be possible to multiply the detection axes, by applying magnetic fields of variable orientation.
  • This approach has the advantage of making it possible to discriminate the aggregate 10 from other non-magnetic droplet objects, or to reduce parasitic signals.
  • the background fluorescence can be reduced.
  • the detection according to different axes makes it possible to distinguish a relocation of the signaling entity 34 on an aggregate 10 of a relocation of the signaling entity 34 to another object of the drop 6, for example on a cell.
  • An implementation of this idea consists in applying a magnetic field B1 to align the main axis X of the aggregate 10 in a first orientation D1, then to apply a magnetic field B2 perpendicular to B1 to align the main axis X of the aggregate 10 according to a second orientation D2 perpendicular to D1.
  • a third apparatus 70 according to the invention is shown in FIG. 8.
  • This third apparatus 70 differs from the first apparatus 1 in that it further comprises a classification unit 72.
  • the third apparatus 70 differs from the first apparatus 1 in that the loading assembly 28 includes an inlet zone 74 of the inner phase and an inlet region of the carrier fluid 76 and a junction zone 78. loading assembly 28 further comprises an incubation zone 79.
  • the input zone of the internal phase 74 comprises a first input duct 80, a second input duct 82 and a co-flow duct 84.
  • the first inlet duct 80 is intended for introducing the first mass of fluid 86 intended to form part of the internal phase of the drops.
  • the first internal fluid mass comprises the particles 12 and a plurality of signaling entities 34.
  • the second inlet duct 82 is intended for the entry of the second fluid mass 88 intended to form part of the internal phase of the drops.
  • the second internal fluid mass comprises a suspension of cells capable of containing producing tumor cells 90 of the target element 37.
  • the concentration of the cells 90 in the second mass of fluid is advantageously such that a large proportion of drops contain only one cell 90, for example more than 10% of the drops contains a cell 90.
  • the co-flow duct 84 allows a distribution of the two fluid masses 86, 88 intended to form the internal phase.
  • the inlet zone of the carrier fluid 76 is intended for the inlet of the carrier fluid 8.
  • the carrier fluid 8 enters through two inlet conduits 92.
  • the junction zone 78 joins the inlet zone of the carrier fluid 76 and the inlet zone of the internal phase 74. In particular, the junction zone joins the co-flow conduit 84 to the inlet conduits 92 of the fluid carrier.
  • the junction zone 78 is capable of forming the initial drops 32.
  • the junction zone 78 shown here is a hydrodynamic focusing junction. Examples of hydrodynamic focusing junctions are illustrated in FIGS. 11 and 12. As a variant, the initial drops 32 are formed in a T junction.
  • the initial drops 32 comprising a mixture of the two fluid masses 86
  • the initial drops 32 comprise a dispersion of particles 12 and signaling entities 34.
  • At least some initial drops 32 further comprise a single cell 90 or in the form of an aggregate of cells.
  • the incubation zone 79 is situated downstream of the junction zone 78.
  • the incubation zone is intended to allow the secretion of the target element 37 by the single cells 90 or in the form of cell aggregates.
  • the chip comprises means for supplying or exchanging oxygen in the incubation zone 79.
  • the incubation is performed outside the device 20.
  • the third apparatus 70 also differs in that the device 20 further comprises a plurality of grading zones 94, 96 and a direction means 98 of the drop or part of the drop selectively to a grading zone 94, 96.
  • the classification zones 94, 96 are situated downstream of the detection zone 26.
  • the conduit 24 comprises a bifurcation 100 in two output conduits 102, 104.
  • the first classification zone 94 comprises the first output conduit 102 intended to receive a first group of drops 106.
  • the second classification zone 96 comprises the second outlet duct 104 intended to receive a second group of drops 108.
  • the device 20 comprises a larger number of classification zones 94, 96 depending on the number of sorting criteria.
  • the direction means 98 selectively drops is for example able to direct a drop 6 to a classification area 94, 96 by means of a magnetic force.
  • the drops 6 are directed by means of electrodes.
  • the drops are directed to a grading zone, by dielectrophoresis, by electrocoalescence with a current or by surface acoustic waves (SAW).
  • SAW surface acoustic waves
  • a suspension of magnetic particles 12 and signaling entities 34 is prepared and injected into the first inlet conduit 80.
  • a suspension of cells 90 capable of containing tumor cells is prepared and injected into the second inlet duct 82.
  • a carrier fluid 8 is supplied and injected into the carrier fluid inlet conduits 92.
  • the fluids 86, 88 are set in motion by means of the circulation sets 22.
  • the initial drops 32 are formed in the junction zone 78.
  • the method further comprises an incubation step in which the cell 90, singly or in the form of a clustered cell cluster, is capable of secreting, cleaving or releasing the target element 37 of the cell secretome.
  • tumor to be analyzed for example the protein or peptide of the tumor cell secretome.
  • the incubation is thus performed under conditions and for a time sufficient for the cell 90, in particular when it is in the form of a single cell, to be capable of producing at least one target element 37 of the secretome of a tumor cell.
  • the incubation step lasts 5 minutes to 32 hours, for example about 1 to 24 hours, or 2 to 9 hours, in particular for the analysis of freshly recovered cells from a biological fluid of a patient.
  • the incubation step lasts 32 to 72 hours, for example about 32 to 48 hours, for example about 36 hours, especially for the analysis of thawed cells.
  • Incubation is generally carried out at 37 ⁇ 1 ° C, with 5% C0 2 . Incubation is typically performed in the presence of a buffer or appropriate medium.
  • An advantage of the process according to the invention is that, compared to the EPISPOT analysis method as described in the patent application EP 1 506 407, the duration of the incubation step can be shortened because of the sensitivity of the process according to the invention. Due to the accumulation of the secretome elements in the restricted volume of the drop, with equivalent incubation time, the concentration of the secretome elements to be detected will be higher in the process according to the invention compared to the EPISPOT process. The implementation of the method according to the invention is therefore faster and more sensitive.
  • the drops 6 advantageously comprise a culture medium for keeping the cells 90 alive in the drop for three days or more. It is typically a culture medium for mammalian cells, especially human cells, with or without serum.
  • the incubation step is carried out in the incubation zone 79 of the device 20. In a variant, this step is performed outside the device 20.
  • the steps of forming the aggregate and measuring are the same as for the analysis method with the first apparatus 1.
  • the method differs in that the measurement step is followed by an analysis step.
  • the analysis step makes it possible to determine which group 106, 108 belongs to a drop 6 according to predetermined criteria and to generate a drop classification decision 6 after the measuring step.
  • the drop 6 is directed towards one of the classification zones 94, 96 by the direction means 98.
  • the drops 106 in which the signal of high fluorescence intensity is located mainly in the vicinity of the aggregate 10 are directed into the first classification zone 94.
  • the drops of the first group 106 correspond by example to the third drops 56 of Figure 2.
  • These drops 106 contain, for example, the tumor cells 90, which are unique or in the form of aggregates of tumor cells, the secretome of which comprises the target element 37.
  • the drops 106 are optionally recovered so that their contents, and in particular the tumor cell or cells, contained, or analyzed by other techniques, or for tumor cells 90, unique or in the form of aggregates of tumor cells, to be put back in culture.
  • the drops 108 in which a different signal, in particular a substantially homogeneous signal on the drop 108, has been measured are directed to another classification zone 96.
  • the second group of drops 108 comprises, for example, drops that do not comprise a cell 90 and drops containing a single cell 90 not producing the target element 37 of the tumor cell secretome in sufficient quantity or quality.
  • RNA transcriptome
  • messengers for gene expression, and microRNAs genome, epigenome, or proteome
  • Transcriptome analysis particularly the analysis of mRNAs, tumor cells (especially CTCs) can reveal very important information on the drug sensitivity and resistance.
  • CTCs tumor cells
  • the expression of ARV7 mRNA, a truncated form of the androgen receptor that has no binding domain to its ligand but persists CTCs could predict the failure of anti-androgen therapies (including therapies using Enzalutamide and / or abiraterone).
  • Patients whose CTCs express this ARV7 mRNA may, however, remain taxane-sensitive and the detection of this ARV7 splice variant in CTCs may become a marker of selection for appropriate treatment in these patients.
  • MicroRNAs are key regulators of gene expression and have become potential diagnostic markers and targets for anti-cancer therapies. Thanks to an in situ hybridization technique, it is possible to analyze large miRNAs (eg miR-10b) at the single cell scale.
  • mutations within genes encode therapeutic targets or signaling proteins downstream of targets that affect the efficacy of targeted therapies.
  • EGFR mutations affect anti-EGFR therapies in lung cancer
  • CTCs bearing the mutated KRAS genes will escape anti-EGFR therapy and their early detection may be important in guiding patient choice of treatment.
  • the cells analyzed in the drops can be decapsulated from the emulsion.
  • a suitable method for decapsulating the emulsion comprises adding 5% v / v 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoro-1-octanol (Sigma-Aldrich), followed by incubation for one hour. The phases are separated by centrifugation (for example 300 g, for 5 min), and the cells are collected at the interface of the two phases, aqueous and fluorinated.
  • the method may comprise the introduction of a third layer, of a density between that of the aqueous phase and the fluorinated phase (for example 1.10 g / ml), before centrifugation. between the two phases.
  • the third layer is generally an aqueous osmolarity solution adapted for contact with the cells.
  • a suitable solution is for example prepared, for example, by dissolving 27.6 g of Nycodenz (Progen) in 100 ml of a solution consisting of 5 mM TrisHCI, 3 mM KCL, 0.3 mM CaNa 2 EDTA, pH 7.5.
  • the cells are then harvested in said third layer, positioned at the interface of the aqueous phase and the fluorinated phase, thus avoiding taking the fluorinated phase with the cells.
  • this method makes it possible to assay / quantify an element of the tumor cell secretome, such as a protein or peptide of the tumor cell secretome in the drop containing the single cell or the aggregate of cells.
  • an elongated aggregate 10 provides a better signal-to-noise ratio and a larger dynamic range compared to the test described in Mazutis et al. (Nat prot 2013) where a single ball is encapsulated. Indeed the signal generated by the signaling entity 34 will be focused on a width smaller than that of a sphere of equal area. The height of the peak as shown in FIG. 2 will therefore be higher than in the case of a single ball for the same number of relocated signaling entities 34.
  • This method can be used in many biological analysis methods.
  • the method according to the invention can be applied to many types of secretome elements, in particular proteins or peptides of the secretome.
  • This invention makes it possible to analyze in a very complete manner the liquid biopsy of the cancer in real time by phenotyping, a secretome analysis and molecular analysis of tumor cells, single or in the form of aggregates of tumor cells.
  • the apparatus according to the invention can be integrated as a technological brick in more complex devices, in particular in a high throughput screening device, in a lab on a chip, in a "point of care” device in laboratory instruments. , robots, or others.
  • the method according to the invention can be integrated into complex protocols for diagnosis, drug discovery, target discovery, drug evaluation.
  • microfluidic systems according to the invention and the methods according to the invention can be combined or included in other types of microfluidic components or for other microfluidic functions known in the state of the art.
  • the invention may further be particularly useful in combination with various optical methods, including optical detection methods.
  • the method is applicable, for example, to determine the presence of a target element 37 in the secretome, the concentration of a secreted, salted or cleaved target element 37, thereby establishing characteristics of the tumor cell producing the element. target 37 in the drop 6.
  • the method also makes it possible to sort, capture and extract drops having interesting characteristics, and in particular containing a single tumor cell or an aggregate of tumor cells.
  • the method comprises the formation of a sandwich, the target element 37 being on the one hand linked to the capture element 36 of the particle 12 and on the other hand to the signaling entity 34, signaling entity 34 being fluorescent.
  • the capture element 36 is an antibody, polyclonal or monoclonal.
  • the signaling entity 34 is an antibody, polyclonal or monoclonal.
  • the target element 37 is a peptide or protein of the secretome.
  • capture element 36 is a nucleic acid, such as a DNA probe or an aptamer.
  • the signaling entity 34 is a nucleic acid, in particular a DNA probe.
  • the target element 37 is a nucleic acid of the secretome, in particular double-stranded DNA, mRNA or miRNA.
  • the capture element 36 is a polyclonal or monoclonal antibody or nanobody, or an aptamer directed against a protein present in the membrane or attached to the membrane, or against lipids or sterols.
  • the signaling entity 34 is an antibody, polyclonal or monoclonal.
  • the target element 37 is an exosome.
  • several pairs of capture element 36 - target element 37 or capture element triplets 36 - target element 37 - signaling entity 34 can be analyzed simultaneously, to detect the presence of several target elements 37 of different nature.
  • a droplet comprises several target elements 37a, 37b of different nature and several signaling entities 34a, 34b each being able to form a complex with one of the target elements 37a, 37b.
  • Some particles 12 of the aggregate 10 comprise a capture element 36a adapted to capture a first target element 37a, other particles comprise another capture element 36b adapted to capture a second target element 37b.
  • the aggregation of particles 12 is reversible.
  • the presence of the target element 37 makes the aggregation non-reversible and consolidates the aggregate 10 during its formation in the aggregation set 30.
  • the aggregate 10 therefore stably exists only in the drops 6 containing the target element 37.
  • the reversibility of the aggregation of the particles 12 dissolved the aggregate 10 it does not enter the reading zone 26.
  • the aggregate 10 can be formed and orientated only in the presence of this pre-aggregation, which limits the peak acquisition according to FIG. 2 to the drops containing the target element 37 by another method than via the signaling entity 34.
  • the present invention finds particular application for the detection and / or characterization of tumor cells isolated from biological fluids.
  • Each cell can release, secrete, or cleave in vitro a number of elements of the tumor cell secretome, including a certain number of proteins or peptides, including one or more tumor markers for identifying a tumor cell.
  • the present invention also makes it possible to study or characterize the secretome of cells, either single cells or in the form of an aggregate of cells, which will, prior to or simultaneously with their characterization, have been identified as tumor cells, in particular by the method of detecting tumor cells according to the invention.
  • the tumor cells are, for example, living circulating tumor cells, hereinafter designated by the acronym 'CTCs', isolated from the blood, or living disseminated tumor cells, hereinafter designated by the symbol' DTC, isolated from bone marrow, or live tumor cells from any other biological fluid, for example urine or cerebrospinal fluid (CSF).
  • 'CTCs' living circulating tumor cells
  • DTC living disseminated tumor cells
  • Aggressive metastatic tumor cells which are capable of giving distant metastases, are among the cells to which the present invention applies.
  • aggregated CTCs in the bloodstream could have a much higher metastatic potential than isolated CTCs.
  • the present invention has the advantage of allowing an analysis of living CTCs, and thus of studying the functionality of these cells, whereas the techniques of the prior art involve the isolation and the fixing of the CTCs, before analysis.
  • the tumor cells may be cancer cells of solid cancer or of liquid cancer (leukemia, lymphoma).
  • tumor cells are isolated from biological fluids of patients with solid cancer, for example breast, prostate, colon, rectum, thyroid, skin, liver, testis cancer. , ovary, etc.
  • the tumor cells are in particular human or animal cells, such as rodent (for example rat or mouse), primate (for example monkey), canine (for example dog) or feline (for example cat).
  • the cells will have been labeled prior to their encapsulation.
  • the cells can in fact be pre-labeled, for example with one or more labeled antibodies (for example with a fluorochrome) directed against one or more membrane tumor markers, in order to identify the tumor nature of the encapsulated cell, or of the aggregate of encapsulated cells, by detecting the signal emitted by the labeled antibody (s) at the level of the cell or of the cell aggregate. This detection can be performed on the circulating drops as in static mode.
  • labeled antibodies for example with a fluorochrome
  • the target element (s) are cytokeratins such as CK19.
  • the target element (s) are tissue markers such as mammaglobin (for the breast), prostate-specific antigen (PSA) or human kallikrein 3 (hK3) (for the prostate).
  • the target element (s) are mesenchymal markers such as "human glandular kallikrein” (hK2), Her2-neu, thyroglobulin, CA19-9, CA15-3 ACE (angiotensin converting enzyme), CA. 125, Cathepsin D, alphafoetoprotein, S100 protein, fibroblast growth factor-2 (FGF-2), epithelial growth factor (EGF), etc.
  • mesenchymal markers such as "human glandular kallikrein” (hK2), Her2-neu, thyroglobulin, CA19-9, CA15-3 ACE (angiotensin converting enzyme), CA. 125, Cathepsin D, alphafoetoprotein, S100 protein, fibroblast growth factor-2 (FGF-2), epithelial growth factor (EGF), etc.
  • the single tumor cell 90 is a prostate tumor cell
  • at least one target element 37 is PSA (prostate-specific antigen).
  • PSA prostate-specific antigen
  • the capture element 36 grafted onto the particles 10 is a first anti-PSA antibody.
  • the signaling element 34 is a second anti-PSA antibody which is labeled, in particular with a fluorochrome such as Alexa 555. This marker is very specific for prostate cancers, its presence alone makes it possible to characterize the cells as cells. tumors from prostate cancer.
  • markers are detected in combination to characterize the tumor cells.
  • some markers are not specific to one type of cancer, but the combined presence of two different markers makes it possible to identify the type of cancer.
  • the choice of marker combinations suitable for identifying a type of cancer is within the abilities of those skilled in the art.
  • the VEGF marker exists in the secretome of many tumor cells. However, its presence with other markers makes it possible to characterize a Cancer. Likewise, the presence of the marker FGF2 alone is not sufficient in itself to characterize a cancer.
  • Each sandwich immunoassay detects a distinct target element 37a, 37b secreted by the single tumor cell 90.
  • the signaling entities 36 comprise fluorochromes.
  • a different fluorochrome is preferably associated with each specific binding partner of a different target element, and in particular with a different tumor marker.
  • the method according to the invention makes it possible to detect CTCs or DTCs by means of a method of the multiparametric fluorescent EPISPOT type, which uses different pairs of antibodies and different fluorochromes.
  • fluorochromes include Alexa488, for green, Alexa555 for red, Alexa350 for blue, etc.
  • the number of target elements 37 that can be analyzed for a single tumor cell is chosen upstream of the experiment, by choosing the pairs of particles functionalized with capture elements and signaling entities. For example, it is possible to perform measurements on more than nine different fluorescence channels. This allows, for example to make more than nine simultaneous measurements of secretome elements of a single tumor cell.
  • the detection method comprises a preliminary stage of enrichment of the CTCs or DTCs present in the biological sample.
  • the enrichment of the cells of the biological sample can be based on the expression of markers expressed on the surface of the cells, the size, the density or the electrical charges of the cells.
  • CTCs can be isolated from blood by leukocyte depletion or by filtration.
  • the enrichment of the cells of the biological sample can for example consist of either a positive sorting of the cells, based on the expression of membrane-specific proteins of the epithelial cells, for example, Epithelial Cell Adhesion Molecule or EpCAM, or on a sorting negative cells based on the expression of specific markers on the surface of unwanted hematopoietic cells, such as for example CD45, CD4, CD8, CD19, CD56.
  • the cells can be sorted according to their size thanks to the use of a filter membrane which will retain the large cells and let the hematopoietic cells of smaller size pass.
  • the cells can be sorted according to their density, by centrifugations on specific gradients.
  • the cells can be sorted according to their electrical charge by dielectrophoresis because the CTCs / DTCs, have a charge different from those of hematopoietic cells, by the use of dielectrophoresis.
  • the cells obtained after the enrichment step can also be identified as being tumorous in the drops.
  • the enriched cells are labeled with a labeled antibody (in particular by fluorescence) directed against one or more tumor cell surface markers.
  • the tumor cells then become labeled, in particular by fluorescence, with their membrane.
  • the cells may be labeled with (1) an anti-EpCAM fluorescent antibody and / or an anti-E-cadherin fluorescent antibody to detect the expression of EpCAM and / or E-Cadherin on the cell surface to identify any epithelial cell, and / or (2) a fluorescent anti-PSMA antibody (Prostate specifies antigen membrane) to identify tumor cells of the prostate, and / or (3) an anti-fluorescent antibody -N-Cadherin to identify mesenchymal cells that have undergone an epithelial-mesenchymal transition (EMT), and / or (4) an anti-plastin 3 antibody that targets a new marker, plastin 3, which is not under-expressed during ⁇ and which allows the detection of epithelial and mesenchymal tumor cells, This step which precedes the encapsulation of the cells of the sample and makes it possible to determine the phenotype of the CTCs or DTCs.
  • the present invention is particularly advantageous because the number of drops is in theory not limited and can reach in practice, for example, up to 100,000 and even up to 1,000,000 drops. It is thus possible to have drops that do not comprise cells or non-enriched cells. If the encapsulated cell is not tumor, the signal will be different and the drop will be discarded. The system allows to refine purification. It is therefore suitable for working with biological samples that are not rich in CTCs.
  • the protocol of the following examples includes:
  • Drops production is performed after mixing a reagent solution and an on-chip sample solution.
  • the reagent solution is aspirated into a reservoir connected to a 1 mL Hamilton syringe filled with mineral oil (Sigma Aldrich, # 330760) just prior to start of compartmentalization.
  • the samples to be screened are mixed with the working solution just before compartmentalization and then transferred to a glass vial previously filled with fluorinated oil (3M, NOVEC HFE-7500) and the vial is kept at 4 ° C on ice.
  • fluorinated oil 3M, NOVEC HFE-7500
  • Capillaries advantageously made of PTFE of 0.3 mm internal diameter (sold by Fisher, 1919445) make it possible to connect the vial and the reservoir of the reagent solution to the device for forming drops. These two solutions are injected on a drop forming chip which makes it possible to generate drops comprising an equal volume of each of the two solutions.
  • the volume of the drops is chosen by the user from the flow rate of the fluorinated oil.
  • the volume of the drops is 33 picoliters.
  • the fluorinated oil is the carrier fluid 8. It constitutes the continuous phase of the emulsion comprising the drops.
  • Solutions of test reagents and samples to be screened are injected into the chip at the same flow rate, advantageously at 200 microliters / hour for each solution.
  • the flow rate is imposed by a standard syringe pump system, for example a Cetoni neMESYS pump or by a pump controlling the pressure, for example the system marketed by Fluigent.
  • the drops are generated at a hydrodynamic focusing junction as illustrated in FIGS. 11 and 12.
  • the external phase is here a fluorinated oil (3M, NOVEC HFE-7500) to which two% w / v surfactants have been added.
  • PFPE perfluoropolyether tails
  • PEG head -600 gmol
  • Fig. 11 and Fig. 12 show flow-focusing devices for mixing a flow containing the magnetic beads mixed with the other reagents and a flow containing the samples before the formation of drops at the hydrodynamic focusing junction located on the right.
  • the magnetic particles measure 500 nm in diameter and in FIG. 12 the magnetic particles measure 200 nm in diameter.
  • a second step is the collection stage.
  • a short capillary makes it possible to connect the flask to the chip.
  • the outlet capillary measures less than 20 cm, preferably 10 cm.
  • the drops are advantageously incubated at 37 ° C. for 20 to 90 minutes and under magnetic fields, the incubation time and temperature depending on the analysis carried out and on the type of production entity 90 and target element 37 studied. .
  • the vial containing the emulsion is transferred to 4 ° C., which is still kept in a magnetic field.
  • the first type of device is a device according to the invention as described in FIG.
  • the vial containing the drops is connected to a chip for reinjection, the vial is on the one hand connected to the chip and on the other hand to a pressure system, a pressure pump or syringe and its pump, constituting the circulation assembly 22.
  • the spacing assembly 31 comprises two oil inlets connected to the chip. These entries are intended to inject oil advantageously fluorinated oil for spacing the drops of the emulsion as shown in Figure 9.
  • the flow rates of the spacer oil are advantageously each fixed at 300 microliters / hour and the flow rate of the circulating assembly is advantageously set at 50 microliters / hour and make it possible to adjust the flow rate and the reinjection frequency. drops so as to obtain a frequency of between 250 and 1000 Hz.
  • a pair of permanent magnets 38 advantageously provided by K & J Magnetics, # BC 14-N52, is placed on either side of the chip around the main channel 24. These magnets 38 are intended to generate and orient the bead aggregates. during the reinjection of the drops.
  • Equipment control software for example lasers or photomultipliers, is created to analyze and sort the drops.
  • the sorting system requires an FPGA card to perform a real-time analysis of the signal.
  • the measurement is made in the drops one by one after their passage through the spacer assembly and these drops can be sorted to a desired output after the reading zone illustrated in FIG.
  • Example 2 Device for Measuring Type 2 Drops (Second Device 60)
  • the second type of measuring device is a drop storage chamber produced in a 2-dimensional plane. This example presents two possible alternatives for making such rooms.
  • the first is a chamber manufactured by conventional PDMS microfabrication, advantageously comprising pillars positioned in a regular manner to prevent the collapse of the chamber as illustrated in Figures 4 to 7.
  • the second is a glass chamber according to the invention PCT / FR2009 / 051396.
  • this approach makes it possible to incubate the drops for long periods (> 1 H) without moving the drops.
  • the drops can therefore be collected directly in such a chamber after their formation.
  • the measuring device is a two-dimensional reading device, for example in a glass chamber.
  • the magnetic field is generated by a pair of permanent magnets 38 advantageously provided by K & J Magnetics, # BY042, placed on either side of the storage chamber. These magnets 38 are intended to generate and orient the aggregates of beads in drops stored in the chamber.
  • Example 3 Quantification of a Tumor Marker in a Type 1 Measuring Device
  • the purpose of this example is to demonstrate the quantification of a tumor marker.
  • the target element 37 is a tumor marker and more particularly an angiogenesis marker (VEGF [vascular epithelial growth factor]) which is already contained in the solution to be screened, this example not implementing cells. .
  • VEGF vascular epithelial growth factor
  • the drops measure 33 picoliters.
  • the preparation of the drops includes:
  • the Reagent Solution contains:
  • particles 12 which are here colloidal magnetic particles, such as particles conjugated with steptavidin (for example Ademtech streptavidin plus particles), which are functionalized with a capture element 36, for example a VEGF specific antibody conjugated to biotin (for example the antibody Ref 500-P10GBt, Peprotech).
  • steptavidin for example Ademtech streptavidin plus particles
  • biotin for example the antibody Ref 500-P10GBt, Peprotech
  • EDC carboxyl and 1-ethyl-3- [3- (dimethylamino) propyl] carbodiimide (EDC) particles, for example, a signaling entity 34 which is here an antibody against VEGF functionalized with a fluorescent molecule, such as bevacizumab (supplied by adjoin University Hospital) which is functionalized with an N-Hydroxysuccinimide (NHS ester) of Alexa Fluor 647 or the like .
  • a signaling entity 34 which is here an antibody against VEGF functionalized with a fluorescent molecule, such as bevacizumab (supplied by adjoin University Hospital) which is functionalized with an N-Hydroxysuccinimide (NHS ester) of Alexa Fluor 647 or the like .
  • NHS ester N-Hydroxysuccinimide
  • working solution includes:
  • Insulin-Transferin-Selenium (ITS) 100X (GIBCO, Ref 51300-044): 1% final,
  • bFGF Basic Fibroblast Growth Factor
  • Miltneyi (Ref 130097750): 10 ng / mL final
  • the magnetic colloidal particles 12 are treated before use.
  • the particles 12 are particles provided by Chemicell (ScreenMAG) or Ademtech (Bio Adembeads) in a storage solution.
  • streptavidin or the like is already immobilized on the particles by the suppliers (such as Ademtech streptavidin plus beads). They are retained on a magnetic medium in order to remove the storage solution and then they are suspended in an excess of pluronic F-127 at 10% w / w (ThermoFisher), advantageously 10x the initial volume of particles, and incubated for fifteen minutes. minutes in an ultrasonic bath at 4 ° C.
  • the magnetic colloidal particles are washed twice in PBS and suspended in the working solution.
  • the biotinylated version of the capture molecule is added in excess for 1 hour (room temperature).
  • the particles 12 are washed twice and suspended in the working solution.
  • Fluorescent reagents are centrifuged for five minutes at at least 12,000 g and at 4 ° C before use to remove traces of reagent aggregates.
  • the sample solution to be screened comprises:
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the sample solution to be screened contains different concentrations of the target element 37 (VEGF) (provided for example by Genscript) diluted in the working solution (cf above).
  • VEGF target element 37
  • the concentrations of target element 37 (VEGF) in the sample solution to be screened are 0 nM, 5 nM, 20 nM or 50 nM.
  • the reagent solution contains the following reagents:
  • a capture element 36 here a VEGF-specific antibody described above
  • the appropriate signaling entity 34 here another specific VEGF antibody conjugated with a fluorescent molecule
  • the purpose of this example is to demonstrate the quantification of two signaling entities (two tumor markers) simultaneously.
  • This example is similar in every respect to Example 3 with the difference that two distinct target elements 37 are measured simultaneously.
  • the two target entities are the tumor markers VEGF and CK19 [Cytokeratin 19].
  • the Reagent Solution contains:
  • particles 12 which are here colloidal magnetic particles, functionalized with two capture elements 36, here antibodies specific for VEGF (Ref 500-P10GBt, Peprotech) and antibodies specific for CK19 (KS19.2 from Progen) which are immobilized on the particles by an appropriate method, such as by the biotin-streptavidin pair,
  • a first signaling entity 34 which is here a VEGF specific antibody fluorescently labeled with a suitable fluorophore, such as a conjugation of bevacizumab with AlexaFluor647,
  • a second signaling entity 34 which is here an antibody specific for CK19, such as (Progen KS19.1), fluorescently labeled by the fluorophore Alexa Fluor 488,
  • the sample solution to be screened comprises:
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • a second target element 37 here CK19, adapted to be captured by the second capture element 36
  • the sample solution to be screened contains different concentrations of the first target element 37 (VEGF), for example provided by Genscript, and the second target element 37 (CK19), for example provided by MyBioSource) diluted the solution of the work (see below). above).
  • VEGF first target element 37
  • CK19 second target element 37
  • MyBioSource MyBioSource
  • the concentrations of the first target element 37 (VEGF) in the sample solution to be screened are 0 nM, 2.5 nM, 10 nM or 25 nM.
  • the concentrations of the second target element 37 (CK19) in the sample solution to be screened are 0 nM, 2.5 nM, 10 nM or 25 nM.
  • a total of 16 concentration combinations of the two target elements are prepared.
  • the drops are analyzed by means of a type 1 device simultaneously measuring the fluorescence of the fluorophores, such as AlexaFluor488 and 647, on the two signaling entities 34.
  • Example 5 Quantification of a secreted tumor marker at the single cell scale in a type 1 measuring device.
  • the purpose of this example is to demonstrate the possibility of detecting and quantifying a tumor marker secreted at the single cell level.
  • This example is similar in all respects to Example 3 except that the target element 37 (VEGF) is secreted by a producing entity 90 (a cell) in the drop during an incubation phase.
  • the cells are either a colon cancer CTC line (CTC-MCC-41 .4 obtained in the LCCRH laboratory), or a cell population of CTC-enriched colon cancer patients.
  • CTCs are enriched with the RosetteSep protocol (StemCell Technology procedure) via leukocyte depletion.
  • the cell pellet obtained contains the circulating tumor cells and is ready to be used for the single-cell EPISPOT according to the invention.
  • the sample solution to be screened contains cells suspended in the working solution described in Example 3.
  • the concentration of cells per drop is 0.3 cells per drop.
  • An emulsion with drops of 33 picoliters, as here, contains more than 30.10 6 drops per millitre.
  • To have 0.3 cells per drop it takes about 18.10 6 cells per milliliter in the sample solution to be screened (which is concentrated twice with respect to the drops).
  • the cell concentration in the sample solution to be screened is twice as large as the final concentration since the two aqueous solutions will be mixed in a drop with a 50/50 ratio.
  • Example 6 Quantification of two tumor markers simultaneously secreted at the single cell scale in a type 1 measuring device.
  • the purpose of this example is to demonstrate the possibility of simultaneously detecting and quantifying two tumor markers secreted at the single cell level.
  • This example is similar in every way to Example 5 except that two target elements 37 separate, are measured simultaneously.
  • the two target elements are the tumor markers VEGF and CK19, which are measured as in Example 4.
  • Example 7 Sorting of cells according to a secreted tumor marker.
  • the purpose of this experiment is to demonstrate the screening of cells according to a secreted tumor marker.
  • This example is similar in every respect to Example 5 except that the droplets with a large fluorescence signal corresponding to the fluorescence of the fluorophore on the signaling entity 34 are sorted by "fluorescence activated dielectrophoresis" (FADS) as described in Baret et al. (Lab Chip 2009, 9, 1850-1858). The sorted and collected drops are broken and the cells are recovered as described in Mazutis et al. (Prot Nat 2013, 8, 870-891).
  • FADS fluorescence activated dielectrophoresis
  • Example 8 Sorting of cells according to two secreted tumor markers.
  • the purpose of this experiment is to demonstrate the screening of cells according to two secreted tumor markers.
  • This example is similar in every respect to Example 7 except that two distinct target elements 37 are measured simultaneously.
  • the two target elements 37 are the tumor markers VEGF and CK19, which are measured as in Example 4.
  • the droplets with a large fluorescence signal corresponding to the fluorescence of the fluorophore such as Alexafluor488 on the first signaling entity 34, and Alexafluor647on the second signaling entity 34 is sorted by "fluorescence activated dielectrophoresis" (FADS) as described in Baret et al. (Lab Chip 2009, 9, 1850-1858).
  • the sorted and collected drops are broken and the cells are recovered as described in Mazutis et al. (Nat Prot 2013).
  • the purpose of this example is to demonstrate the quantitation of a tumor marker in a type 2 device, i.e. a chamber in which the drops are distributed in two dimensions in a single layer.
  • a type 2 device i.e. a chamber in which the drops are distributed in two dimensions in a single layer.
  • This example is similar in every respect to Example 3 with the difference that the drops measure 40 picoliters and are analyzed in a measuring device type 2.
  • a 38 ⁇ high chamber is created between two glass slides.
  • An inlet and an outlet are made in the upper glass slide and each provided with a standard connector for connecting the connection capillaries.
  • Example 9 The purpose of this example is to demonstrate the quantification of two signaling entities (two tumor markers) simultaneously in a type 2 device.
  • This example is similar in every respect to Example 4 except that the drops measure 40 picoliters and are analyzed in a type 2 measuring device, as in Example 9.
  • Example 11 Kinetic and Quantitative Measurement of a Secreted Tumor Marker at the Single Cell Scale in a Type 2 Meter (Second Unit 60)
  • the purpose of this example is to demonstrate the kinetic and quantitative measurement of a tumor marker secreted at the single cell scale in a type 2 device.
  • This example is similar in every respect to Example 5 except that the drops measure 40 picoliters and are analyzed in a type 2 measuring device, as in Example 9.
  • the secretion rate of the target element 37 (tumor marker VEGF) is determined.
  • Example 12 Kinetic and Quantitative Measurement of Two Tumor Markers Simultaneously Secreted at the Single Cell Scale in a Type 2 Measuring Device (Second Apparatus 60)
  • the purpose of this example is to demonstrate the simultaneous kinetic and quantitative measurement of two tumor markers secreted at the single cell scale in a type 2 device.
  • This example is similar in every respect to Example 6 except that the drops measure 40 picoliters and are analyzed in a type 2 measuring device, as in Example 9 except that two distinct target elements 37 are measured simultaneously.
  • the two target entities are the tumor markers VEGF and CK19, which are detected as in Example 10.
  • the fluorescent signals of the two signaling entities 34 relocated on the magnetic bead line the secretion rate of the two target elements 37 (the VEGF and CK19 tumor markers) are determined.
  • Figure 14 illustrates quantitation of a tumor marker in a type 1 device.
  • the graph shows the peak intensity value obtained for the channel measuring the green fluorescence.
  • the error bar shows the standard deviation.
  • LnCAPs are cells derived from an epithelial cell line derived from human prostate carcinoma.
  • Figure 15 illustrates a sorting of drops in a type 1 device.
  • This graph shows the possibility of measuring PSA secreting cells in a type 1 device.
  • Three different droplet populations can be distinguished because of their different droplet codes (shown along the x-axis, corresponding to the fluorescence of the Sulforhodamine B marker). From left to right, we observe the emulsion of cells to be sorted, the positive control and the negative control. In the fluorescence channel shown in ordinate, the relocation of the anti-PSA on the column of beads is illustrated.
  • the drops included in the black rectangle are positive drops for the secretion of PSA and containing a cell.
  • Figure 16 illustrates a sort of drops in a type 1 device.
  • This graph shows a selection window for EpCAM-positive drop sorting from a drop emulsion containing cells.
  • the loading is about 5%. This shows a good correlation between the EpCAM positivity in the selection window and the cell loading.
  • the ordinate axis represents the maximum value measured within the droplet (that is, the peak corresponding to the cell).
  • the x-axis represents the integral of the signal under the peak.
  • FIG. 17 represents a selection window "gate 5" for sorting EpCAM-positive cells.
  • Figure 18 shows a selection window "treats 6" for PSA secreting cells. To be selected, the two criteria must be satisfied, the selected drops correspond to the drops whose measures in the windows "spoils 5" and "spoils 6".
  • FIGS. 19 and 20 represent drops successfully sorted according to two criteria: the secretion of PSA (FIG. 19), and the expression of EpCAM. (Figure 20). of the Empty drops (negative control) were also sorted to facilitate the transfer of drops of interest into the viewing chamber. Starting from an emulsion with 0.2% of drops of interest, a 20% enrichment of drops of interest is obtained. By counting the negative control drops preserved for the transfer of the drops, an effective droplet transfer is obtained at approximately 99%.
  • Figures 21 to 23 illustrate quantitation of a tumor marker in a type 2 device.
  • Figures 21 (in the bright field) and 22 (in a fluorescence channel) show the secretion of PSA by LNCAP cells. These cells are incubated for one hour in the drops and the secretion of PSA results in the relocation of the fluorescence on the columnar particle aggregate.
  • Figure 23 illustrates a calibration curve for the quantification of PSA obtained from the drop table.
  • the curve has a shape generally observed for non-washing immunoassay experiments. After an abrupt increase phase (up to 60nM) in which the protein binds to the beads, there is a decrease in the fluorescence relocation due to saturation on the beads and an increase in the concentration of free PSA. The data are presented on average and error -type of the average (SEM).
  • the calibration curve shows a signal increase at higher concentrations.
  • the signal can be significantly distinguished from the background noise. This is advantageous for experience developments because even cells with very high secretion levels can be detected.
  • Figures 24 and 25 illustrate quantification of a tumor marker in a type 2 device.
  • Figures 24 (in bright field) and 25 (in a fluorescence channel) represent the secretion of protein CK19 by a SK-BR cell.
  • SK-BR3 is a cell line derived from a tumor of human breast cancer.
  • CK19 is usually a protein integrated into the cell membrane. However, it can be detached and relocate on the elongated aggregate.
  • An epithelial cell line derived from human prostate carcinoma (LnCAP) is used for experiments to observe cell secretion of PSA.
  • the following table shows the conditions and results of the PSA secretion experiment using LnCAP cells as a template.
  • Figure 26 illustrates the measurement of the kinetics of a secreted marker in a Type 2 device.
  • Figure 26 shows a PSA secretion pattern for individual LnCAP cells encapsulated in drops for one hour and then measured at 10 minute intervals.
  • Jurkat cells come from an immortalized line of human Lymphocite T. Both cell lines were cultured in RPMI medium with 10% FBS and encapsulated in drops. These experiments show that it is indeed capable of detecting small amounts of cells.

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Abstract

La présente invention s'inscrit dans le domaine du diagnostic biologique en cancérologie. Elle a pour objet un procédé et un appareil de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales par détection d'un ou plusieurs éléments du sécrétome de cellule tumorale, en particulier un ou plusieurs peptides ou protéines, et notamment un ou plusieurs marqueurs tumoraux. L'invention concerne également, des gouttes de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales et leur procédé de préparation.

Description

Procédé de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales et appareil associé
La présente invention s'inscrit dans le domaine du diagnostic biologique en cancérologie. Elle a pour objet un procédé et un appareil de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales par détection d'un ou plusieurs éléments du sécrétome de cellule tumorale, en particulier un ou plusieurs peptides ou protéines, et notamment un ou plusieurs marqueurs tumoraux. L'invention concerne également des gouttes de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales et leur procédé de préparation.
L'article « Challenges in circulating tumour cell research » de la revue Nature Reviews Cancer publié en septembre 2014, volume 14, p 623 à 6131 , décrit différentes technologies pour détecter des cellules tumorales circulantes.
Un procédé de détection de cellules tumorales circulantes communément désigné par l'acronyme EPISPOT, pour l'anglais « Epithélial Immunospot », est connu de l'art antérieur, notamment du document EP 1 506 407. Cette technique permet la détection de cellules tumorales circulantes dans un échantillon biologique d'un patient atteint de cancer solide, par détection de marqueurs tumoraux libérés par ces cellules. Elle met en œuvre le dépôt de cellules sur une surface de culture solide, plus particulièrement des plaques de 96 puits, à raison de 2.105 cellules par puits, un anticorps spécifique d'un marqueur tumoral d'intérêt étant fixé sur cette surface de culture solide, suivi de la culture de ces cellules, puis de l'élimination des cellules par lavage et de la détection du marqueur tumoral d'intérêt par un anticorps spécifique marqué.
Cependant, la résolution obtenue par un tel procédé est limitée. En effet, dans un même puits, les protéines détectées proviennent de différentes cellules. Il est difficile de savoir quelle cellule a sécrété quoi. Le signal ne permet pas d'obtenir d'information sur l'hétérogénéité cellulaire. En outre, il est difficile de récupérer les cellules pour analyser leur génotype.
La présente invention vise à obtenir un procédé de détection plus précis et plus fiable.
Le document WO 2009/01 1808 A1 décrit un procédé de détermination d'une activité de fixation d'une protéine au sein d'une goutte.
La publication « Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics », de Mazutis et al. publiée en ligne, le 4 avril 2013 dans la revue Nature Protocols illustre ce principe. Un hybridome de souris est encapsulé dans une goutte avec une bille recouverte d'anticorps anti-souris. L'hybridome sécrète des anticorps. Un anticorps secondaire couplé à un fluorophore permet de révéler la présence de l'anticorps sécrété. La distribution de l'anticorps secondaire est, en l'absence d'anticorps sécrété, homogène dans la goutte, mais elle se relocalise sur la bille en présence d'anticorps. Ce procédé est donc très sélectif pour déterminer l'activité d'une cellule particulière.
Par contre, un tel procédé présente divers inconvénients. Le procédé de compartimentation des cellules et des billes est aléatoire. Le nombre de billes dans les gouttes peut être estimé par une loi de distribution de Poisson. De même, le nombre de cellules au sein des gouttes peut être estimé par une loi de distribution de Poisson indépendante. Les concentrations initiales en billes et en gouttes sont ajustées pour avoir en moyenne une cellule et une bille par goutte. Seule une partie des gouttes présente donc un intérêt pour l'analyse réalisée.
Par ailleurs, la présence d'une bille unique de taille significative par goutte n'est pas favorable à la résolution de la méthode. En effet, les anticorps secondaires se répartissent sur toute la surface de la bille. La gamme dynamique du procédé est donc limitée par la surface externe disponible par bille.
Un but de l'invention est de fournir un procédé d'analyse plus fiable et plus sensible que les procédés existants permettant l'analyse du sécrétome de cellules vivantes, uniques ou sous forme d'un agrégat, pour détecter et/ou caractériser des cellules tumorales, et notamment les cellules tumorales uniques ou les agrégats de cellules tumorales.
A cet effet, l'invention a pour objet un procédé de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales comprenant:
- la fourniture d'une pluralité de gouttes contenues dans un fluide porteur, au moins une des gouttes comprenant au moins un agrégat de particules définissant un objet allongé selon un axe principal, au moins certaines gouttes contenant une cellule susceptible de produire au moins un élément cible du sécrétome d'une cellule tumorale propre à se fixer sur l'agrégat ;
- la mesure d'au moins un paramètre physique caractéristique de la fixation d'un élément cible du sécrétome d'une cellule tumorale sur l'agrégat ; et
- la détection et/ou la caractérisation de cellules tumorales à partir de la mesure dudit au moins un paramètre physique. Plus spécifiquement, le procédé de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales selon l'invention comprend :
- la fourniture d'une pluralité de gouttes contenues dans un fluide porteur, les gouttes comprenant une pluralité de particules propre à former un agrégat de particules définissant un objet allongé selon un axe principal, au moins certaines gouttes contenant une cellule ;
- l'incubation de la pluralité de gouttes dans des conditions et pendant une durée suffisante pour que, dans les gouttes contenant une cellule, la cellule soit susceptible de produire au moins un élément cible du sécrétome d'une cellule tumorale, propre à se fixer sur l'agrégat ;
- la formation dans chaque goutte d'au moins un agrégat de particules définissant un objet allongé selon un axe principal ;
- la mesure d'au moins un paramètre physique, chaque paramètre physique étant caractéristique de la fixation d'un élément cible distinct du sécrétome d'une cellule tumorale sur l'agrégat ; et
- la détection et/ou la caractérisation de cellules tumorales à partir de la mesure dudit au moins un paramètre physique.
Ladite cellule est une cellule unique ou un agrégat de cellules, notamment un agrégat soupçonné d'être un agrégat de cellules tumorales.
Les agrégats de cellules tumorales sont d'origine oligoclonale et résultent de l'adhésion, ou du regroupement, de plusieurs cellules tumorales primaires. Les agrégats de cellules tumorales peuvent contenir typiquement 2 à 15 cellules tumorales. Ils sont essentiellement constitués de cellules tumorales, mais peuvent aussi contenir d'autres types de cellules, telles que des leucocytes, des plaquettes, en nombre limité.
Le procédé selon l'invention concerne donc en particulier un procédé de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales uniques comprenant :
- la fourniture d'une pluralité de gouttes contenues dans un fluide porteur, au moins une des gouttes comprenant au moins un agrégat de particules définissant un objet allongé selon un axe principal, au moins certaines gouttes contenant une cellule unique ;
- l'incubation des gouttes contenant une cellule unique dans des conditions et pendant une durée suffisante pour que la cellule unique soit susceptible de produire au moins un élément cible du sécrétome d'une cellule tumorale, propre à se fixer sur l'agrégat; - la mesure d'au moins un paramètre physique, chaque paramètre physique étant caractéristique de la fixation d'un élément cible distinct du sécrétome d'une cellule tumorale sur l'agrégat ; et
- la détection et/ou la caractérisation de cellules tumorales uniques à partir de la mesure dudit au moins un paramètre physique.
Par « goutte contenant une cellule unique » on entend que la goutte comprend une seule cellule.
Par « goutte contenant une cellule tumorale unique » on entend que la goutte comprend une seule cellule qui est une cellule tumorale.
Au sens de l'invention, une cellule tumorale n'est pas une cellule créée par fusion artificielle d'une cellule tumorale avec une autre cellule, telle qu'un hybridome.
En particulier, le procédé est destiné à déterminer la présence de gouttes, voire à sélectionner des gouttes, comprenant une cellule unique dont le sécrétome comprend un élément cible particulier, cet élément cible étant une molécule du sécrétome d'une cellule tumorale, et en particulier un marqueur tumoral.
Le sécrétome d'une cellule est l'ensemble des éléments (molécules organiques ou inorganiques, telles que les protéines, peptides, glucides, lipides, ou acides nucléiques, ou encore vésicules) présents dans le milieu conditionné d'une cellule en culture. Le terme 'sécrétome' désigne dans un sens particulier la partie du protéome (c'est-à-dire l'ensemble des protéines et peptides exprimés par la cellule) qui est présente dans le milieu conditionné d'une cellule en culture.
Ces molécules, et en particulier protéines ou peptides sont :
- sécrétées (par la voie dite 'classique' impliquant le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi, ou par des voies dites 'non classiques' telles que le transport actif à travers une protéine membranaire transporteur, ou la sécrétion via des endosomes de recyclage ou des vacuoles d'exocytose). C'est le cas par exemple de la protéine PSA (Prostate Spécifie Antigen), de la mammaglobine, de la kallikréine 3 humaine (hK3), de l'« human glandular kallikrein » (hK2), de la la thyroglobuline, des protéines CA19-9, CA15-3, CA 125 (« CA » étant l'abréviation de « cancer antigen »), de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE), de la Cathepsine D, de l'alphafoetoprotéine, de la protéine S100, du FGF-2 ou de l'EGF ;
- clivées dans leur domaine extracellulaire, lorsqu'il s'agit de protéines membranaires dont le domaine extracellulaire est clivé enzymatiquement et relâché dans le milieu extracellulaire (« shed protein » en anglais). Par exemple, les marqueurs HER2, EGFR (Epithelial Growth Factor Receptor) ou MUC 1 sont des protéines clivées ; ou - relargués par la cellule. Les molécules relarguées sont par exemple des protéines non membranaires sécrétées par la cellule par des voies différentes des voies de sécrétion, par exemple par bourgeonnement, comme la protéine CK 19 (Cytokeratin 19).
Les exosomes font aussi partie du sécrétome des cellules tumorales. Il s'agit de vésicules constituées d'une membrane de bicouche lipidique entourant un petit cytosol. Le cytosol des exosomes peut comprendre des protéines, de l'ADN double brin, mais aussi de l'ARN (en particulier ARNm, miRNA). Les exosomes permettraient aux cellules tumorales de transférer des protéines et/ou des acides nucléiques oncogéniques pour moduler l'activité de cellules receveuses, jouant ainsi un rôle dans la tumorigénicité, la croissance tumorale, les processus métastatiques et la résistance aux médicaments.
Le procédé selon l'invention peut comprendre l'une ou plusieurs des caractéristiques suivantes, prises isolément ou suivant toutes combinaisons techniquement possibles :
i) les particules sont des particules magnétiques, avantageusement paramagnétiques, de préférence superparamagnétiques ;
ii) l'étape de fourniture des gouttes comprend :
- la dispersion des particules dans une masse de fluide destinée à former les gouttes, puis
- la dispersion de la masse de fluide sous forme de gouttes,
- la formation dans chaque goutte d'au moins un agrégat de particules définissant un objet allongé selon un axe principal, l'agrégat de particules étant formé dans chaque goutte après la dispersion ;
iii) l'élément cible est un élément du sécrétome d'une cellule tumorale,
iv) l'élément cible est un peptide ou une protéine du sécrétome d'une cellule tumorale;
v) l'élément cible est un acide nucléique (ADN ou ARN), en particulier un miRNA d'une cellule tumorale;
vi) l'élément cible est un exosome d'une cellule tumorale;
vii) au moins certains gouttes comprennent une entité productrice susceptible de produire l'élément cible, l'entité productrice étant une cellule tumorale unique ou un agrégat de cellules tumorales, et en particulier une cellule tumorale circulante (CTC) unique, une cellule tumorale disséminée (DTC) unique, ou un agrégat de CTCs ou DTCs; viii) le procédé comprend avant l'étape de mesure, une étape d'orientation de l'axe principal de l'agrégat selon un axe de détection ; ix) le procédé comprend de multiples étapes de mesure, avec une étape d'orientation de l'axe principal de l'agrégat selon un axe de détection différent pour chacune des mesures ;
x) le procédé comprend :
- la fourniture d'un dispositif comprenant un ensemble de mise en circulation de la goutte et une zone de détection ;
- le transport de la goutte vers la zone de détection, la mesure au sein de la goutte étant effectuée dans la zone de détection ;
xi) le procédé comprend :
- la fourniture d'un dispositif comprenant un ensemble de mise en circulation de la goutte et une pluralité de zones de classement, et un moyen de direction de la goutte ou d'une partie de la goutte sélectivement vers une zone de classement,
- la décision de classement de la goutte ou d'une partie de la goutte, la décision consistant à choisir sélectivement une zone de classement parmi la pluralité des zones de classement,
- le transport de la goutte, respectivement d'une partie de la goutte, vers la zone de classement de la goutte choisie lors de l'étape de décision ;
xii) au moins une goutte comprend au moins un élément cible, au moins un élément de capture apte à capturer l'élément cible et au moins une entité de signalisation apte à former un complexe avec l'élément cible, éventuellement capturé par l'élément de capture, le procédé comprenant la mesure d'un signal indiquant la relocalisation ou la concentration de ladite au moins une entité de signalisation sur l'agrégat ;
xiii) au moins une goutte comprend au moins un élément cible, au moins une première entité de signalisation apte à former un complexe avec l'élément cible et au moins une seconde entité de signalisation distincte apte à former un complexe avec l'élément cible, le procédé comprenant la mesure d'un signal indiquant la concentration de chacune des entités de signalisation relocalisées sur l'agrégat ;
xiv) au moins une goutte comprend au moins un élément cible, au moins une entité de signalisation apte à former un complexe avec l'élément cible et au moins une entité de quantification apte à former un complexe avec l'élément cible, le procédé comprenant :
- la mesure d'un signal représentatif de la concentration de l'entité de signalisation relocalisée sur l'agrégat,
- la mesure d'un signal représentatif de la concentration de l'entité de quantification relocalisée sur l'agrégat, - la détermination de la constante de dissociation de l'élément cible avec l'entité de signalisation à partir du rapport du signal de l'entité de signalisation relocalisée sur le signal de l'entité de quantification relocalisée ;
xv) au moins une goutte comprend au moins deux entités de signalisation distinctes, chacune des deux entités de signalisation étant apte à former un complexe avec un élément cible distinct sur l'agrégat, le procédé comprenant la mesure d'un signal indiquant la concentration de chacune des entités de signalisation relocalisée ;
xvi) au moins certaines gouttes comprennent une entité productrice, l'entité productrice étant une cellule susceptible de produire un élément du sécrétome d'une cellule tumorale, chaque élément du sécrétome d'une cellule tumorale étant un élément cible distinct, la mesure du signal indiquant la concentration de chacune des entités de signalisation relocalisée permettant une quantification du ou des élément(s) du sécrétome ;
xvii) la mesure d'un paramètre physique est une mesure de radioactivité, de colorimétrie ou de fluorescence ;
xviii) au moins une des gouttes comprend une cellule apte à sécréter l'élément cible et le procédé comprend une étape d'incubation au cours de laquelle l'élément cible est sécrété dans la goutte par la cellule ;
xix) le procédé comprend une étape de mesure d'un paramètre physique, localement en un premier point situé à l'écart de l'agrégat dans au moins une des gouttes et du même paramètre physique, localement en un deuxième point au voisinage de l'agrégat dans la même goutte ;
xx) la dimension maximale des particules est inférieure à 50 % du diamètre de la goutte ;
xxi) la goutte contient au moins une entité de signalisation, et la mesure du paramètre physique dépend de la position de l'entité de signalisation au sein de la goutte ou par rapport à l'agrégat ;
xxii) l'entité productrice produit plusieurs éléments cibles choisis dans le groupe constitué par les éléments, et en particulier les protéines et peptides, du sécrétome d'une cellule tumorale;
xxiii) le procédé comporte une étape de détermination d'au moins une caractéristique de l'entité productrice ;
xxiv) l'étape de décision de classement a lieu après l'étape de mesure ;
xxv) la goutte contient des particules superparamagnétiques, la goutte ou la partie de la goutte est dirigée vers la zone de classement par un moyen de direction choisi parmi un champ magnétique, un champ électrique, une diélectrophorèse, une électrocoalescence ou une onde acoustique de surface ;
xxvi) une partie de la goutte est extraite au moyen de la force magnétique, la partie extraite formant une goutte auxiliaire et contenant l'agrégat ;
xxvii) les particules sont fonctionnalisées avec un élément de capture propre à fixer l'élément cible et chaque goutte comprend une entité de signalisation propre à fixer l'élément cible ;
xxviii) l'entité de signalisation est fluorescente, radioactive ou colorée ;
xxix) la mesure d'un paramètre physique est une mesure de chromométrie, de fluorescence ou de radioactivité ;
xxx) la mesure du paramètre physique comprend la localisation d'un signal de fluorescence, de chromométrie ou de radioactivité au sein de la goutte ;
xxxi) la mesure du paramètre physique comprend la localisation d'un signal de fluorescence de chromométrie ou de radioactivité par rapport à l'agrégat, au sein de la goutte ;
xxxii) la mesure du paramètre physique comprend la mesure de l'intensité d'un signal de fluorescence, de chromométrie ou de radioactivité au sein de la goutte, de préférence au niveau de l'agrégat ;
xxxiii) la mesure du paramètre physique comprend la variation au cours du temps de la localisation et/ou de l'intensité d'un signal de fluorescence, de chromométrie ou de radioactivité au sein de la goutte, de préférence au niveau de l'agrégat ;
xxxiv) chaque goutte comprend au moins deux entités de signalisation distinctes, chacune des deux entités de signalisation étant apte à former un complexe avec un élément cible distinct sur l'agrégat, chaque entité de signalisation étant fluorescente dans un canal de fluorescence distinct ;
xxxv) la cellule est une cellule tumorale, en particulier une cellule tumorale unique ou un agrégat de cellules tumorales ;
xxxvi) la cellule, en particulier la cellule unique ou l'agrégat de cellules, est issue d'un fluide biologique et est choisie dans le groupe constitué par une cellule tumorale circulante et une cellule tumorale disséminée ;
xxxvii) l'étape de mesure comporte la mesure dudit au moins un paramètre physique localement en une pluralité de points situés dans la goutte, l'étape de mesure comportant de préférence la détermination de l'intégrale des valeurs mesurées au sein de la goutte ;
xxxviii) l'étape de mesure est effectuée dans une chambre microfluidique sans circulation des gouttes; xxxix) le procédé comprend :
- la fourniture d'un dispositif comprenant un ensemble de mise en circulation de la goutte et une pluralité de zones de classement, et un moyen de direction de la goutte ou d'une partie de la goutte sélectivement vers une zone de classement,
- la décision de classement de la goutte ou d'une partie de la goutte, la décision consistant à choisir sélectivement une zone de classement parmi la pluralité des zones de classement,
- le transport de la goutte, respectivement d'une partie de la goutte, vers la zone de classement de la goutte choisie lors de l'étape de décision,
et éventuellement en outre la récolte de la goutte triée par transport vers la zone de classement, la lyse de la goutte triée et récoltée, puis la lyse de la goutte et la récolte de la cellule tumorale vivante contenue dans la goutte triée et lysée. xl) au moins une goutte comprend au moins deux entités de signalisation distinctes, chacune des deux entités de signalisation étant apte à former un complexe avec un élément cible distinct sur l'agrégat, le procédé comprenant la mesure d'un signal indiquant la concentration de chacune des entités de signalisation relocalisées ;
xli) au moins certaines gouttes comprennent une cellule, unique ou sous forme d'un agrégat, susceptible de sécréter, cliver ou relarguer un ou plusieurs éléments du sécrétome de cellule tumorale, chaque élément du sécrétome de cellule tumorale étant un élément cible distinct, la mesure du signal indiquant la concentration de chacune des entités de signalisation relocalisées permettant une quantification du ou des éléments du sécrétome de cellule tumorale. L'invention a également pour objet un appareil de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales, uniques ou sous forme d'un agrégat de cellules tumorales, comprenant :
- un ensemble de fourniture d'une pluralité de gouttes contenues dans un fluide porteur, au moins une des gouttes comprenant au moins un agrégat de particules définissant un objet allongé selon un axe principal, au moins certaines gouttes contenant une cellule tumorale, unique ou sous forme d'un agrégat de cellules, susceptible de produire un élément cible propre à se fixer sur l'agrégat,
caractérisé en ce que l'appareil comprend un ensemble de mesure d'un paramètre physique caractéristique de la fixation d'un élément cible sur l'agrégat,
l'appareil comprenant éventuellement en outre:
- un ensemble de mise en circulation de la goutte, - un ensemble de décision de classement de la goutte,
- un ensemble de tri de la goutte selon la décision de classement.
L'invention a également pour objet une goutte de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales, uniques ou sous forme d'un agrégat de cellules tumorales, comprenant une pluralité de particules propre à former un agrégat de particules définissant un objet allongé selon un axe principal, et une cellule tumorale, unique ou sous forme d'un agrégat de cellules tumorales, et éventuellement au moins un élément cible du sécrétome de la cellule tumorale, unique sous forme d'un agrégat de cellules tumorales, propre à se fixer sur l'agrégat.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation de gouttes de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales, uniques ou sous forme d'un agrégat de cellules tumorales, comprenant :
- la dispersion, dans une masse de fluide destinée à former des gouttes, de particules propres à former un agrégat définissant un objet allongé selon un axe principal, et d'une pluralité de cellules, au moins certaines cellules étant des cellules tumorales susceptibles de produire un élément cible du sécrétome d'une cellule tumorale, puis
- la dispersion de la masse de fluide sous forme de gouttes, de sorte que chaque goutte comprenne une pluralité de particules et qu'au moins certaines gouttes comprennent, en outre, une cellule, unique ou sous forme d'un agrégat, et
- éventuellement la formation dans chaque goutte d'au moins un agrégat de particules définissant un objet allongé selon un axe principal, l'agrégat de particules étant formé dans chaque goutte après la dispersion.
L'invention, en particulier selon le mode 'cellule unique', sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, donnée uniquement à titre d'exemple, et faite en se référant aux dessins annexés, sur lesquels :
la figure 1 est une représentation schématique des éléments principaux d'un premier appareil d'analyse selon l'invention,
la figure 2 et la figure 3 sont des représentations schématiques d'une étape de procédé avec le premier appareil,
les figures 4 à 7 sont des photographies d'une partie d'un deuxième appareil suivant l'invention lors de différentes étapes de procédé suivant l'invention,
- la figure 8 est une représentation schématique d'un troisième appareil selon l'invention, les figures 9 et 10 représentent des ensembles d'espacement de gouttes et de lecture,
les figures 1 1 et 12 représentent des dispositifs de générations de gouttes, la figure 13 est une représentation schématique d'une goutte lors d'une étape de mise en œuvre d'un procédé,
les figures 14 à 26 illustrent des exemples d'application du procédé.
Premier appareil
Un premier appareil d'analyse 1 du contenu de gouttes et de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales, uniques ou sous forme d'un agrégat de cellules tumorales, suivant l'invention est représenté sur la figure 1 .
L'appareil 1 comprend un ensemble de fourniture 4 d'une pluralité de gouttes 6 contenues dans un fluide porteur 8, au moins une partie des gouttes 6 comprenant au moins un agrégat 10 de particules 12 définissant un objet allongé selon un axe principal X.
Un objet allongé est un objet présentant une forme allongée. Une forme allongée présente selon l'axe principal, une longueur supérieure à sa longueur suivant une direction perpendiculaire à l'axe principale. Ainsi, une sphère n'est pas allongée. Par exemple, un objet oblong, un cône, une tige ou un ovoïde non sphérique présentent des formes allongées.
L'appareil 1 comprend, en outre, un ensemble de mesure 14 d'un paramètre physique dans la goutte.
L'ensemble de mesure 14 est, par exemple, propre à effectuer la mesure d'un paramètre physique, localement en un premier point 16 situé à l'écart de l'agrégat 10 dans au moins une des gouttes et du même paramètre physique localement en un deuxième point 18 au voisinage de l'agrégat 10 dans la même goutte.
L'appareil 1 comporte également un dispositif 20 comprenant un ensemble de mise en circulation 22, un conduit de circulation 24 et une zone de détection 26.
L'ensemble de mise en circulation 22 est apte à faire circuler chaque goutte 6 dans le fluide porteur 8 dans le conduit 24 sous forme d'un train de gouttes successives.
L'ensemble de fourniture 4 comprend un ensemble de chargement 28 et un ensemble d'agrégation 30. L'ensemble de fourniture 4 comprend en outre un ensemble d'espacement 31 .
L'ensemble de chargement 28 est apte à fournir une pluralité de gouttes initiales 32 comprenant une dispersion de particules 12, au moins une des gouttes initiales 32 comprenant en outre au moins un élément cible 37 du sécrétome d'une cellule tumorale 90.
L'ensemble d'espacement 31 est apte à espacer deux gouttes successives 6 du train de goutte, c'est-à-dire à augmenter la distance entre deux gouttes successives. Par exemple, l'ensemble d'espacement 31 comporte une entrée de fluide porteur 8. Des exemples d'ensemble d'espacements sont représentés sur les figures 9 et 10.
Le fluide porteur 8 est apte à séparer deux gouttes successives 6 du train de gouttes pour empêcher leur contact. En variante, la séparation des gouttes 6 est effectuée par un dispositif mécanique.
Le fluide formant la phase interne des gouttes 6 et le fluide porteur 8 sont sensiblement immiscibles. Par exemple, les gouttes 6 comprennent une phase interne aqueuse et le fluide porteur 8 est une phase organique ou huileuse.
Le fluide porteur 8 est avantageusement une huile fluorée.
Le fluide porteur 8 ou le fluide formant la phase interne des gouttes comprend avantageusement un tensio-actif apte à empêcher la fusion de deux gouttes 6 en contact, comme par exemple tel que décrit dans le brevet US 2010/01051 12 ou encore le surfactant EA de la société RainDance Technologies.
Par « sensiblement immiscibles », on entend généralement que la solubilité du fluide formant les gouttes dans le fluide porteur 8, mesurée à 25°C et à pression ambiante, est inférieure à 1 %.
La taille des gouttes 6 est, par exemple, comprise entre 1 μηι et 1000 μηι. Le volume des gouttes 6 est compris avantageusement entre 0.1 picolitre et 1 microlitre.
Les gouttes 6 fournies sont sensiblement monodisperses. Ceci signifie que la polydispersité des gouttes 6 est inférieure à 5 %.
Dans l'exemple représenté, les gouttes 6 sont sphériques. En variante, les gouttes
6 sont de forme allongée selon l'axe de circulation Y du conduit 24. En variante, les gouttes 6 sont de forme de palet aplati selon un axe perpendiculaire à l'axe de circulation Y. Composition des gouttes
Chaque goutte initiale 32 comprend un fluide de base, une dispersion de particules 12 solides dans le fluide de base et une pluralité d'entités de signalisation 34. En outre au moins une goutte initiale 32 comprend une cellule 90, de préférence une cellule tumorale unique ou un agrégat de cellules tumorales, et éventuellement au moins un élément cible 37 du sécrétome de cellule tumorale. Comme indiqué ci-dessus, le volume d'une goutte 6 est compris avantageusement entre 0.1 picolitre et 1 microlitre. Le volume d'une cellule est d'environ 1 picolitre. Pour encapsuler une cellule unique ou un agrégat de cellule tumorale, on choisira avantageusement un volume de goutte compris entre 20 et 150 picolitres, par exemple de 20 à 50 picolitres, ou encore de 30 à 40 picolitres, notamment pour les cellules uniques, ou encore de 60 à 150 picolitres, ou encore de 80 à 120 picolitres, notamment pour les agrégats de cellules.
L'analyse des cellules uniques et des agrégats peut être fait simultanément ou séquentiellement. Pour l'analyse simultanée, on utilise avantageusement des volumes de gouttes adaptés pour pouvoir encapsuler les agrégats de cellules (par exemple de 60 à 150 picolitres, typiquement environ 100 pl). Pour l'analyse séquentielle, un système de séparation intégré (avec des techniques telles que décrites dans Sajeesh and Sen, Microfluidics and Nanofluidics 2014, 17, 1 -52) peut être utilisé pour séparer cellules uniques et agrégats de cellules, suivi par une encapsulation séparée des cellules uniques d'une part, et des agrégats de cellules d'autre part. Alternativement, les cellules uniques et les agrégats de cellules sont encapsulés dans des gouttes de petit volumes (par exemple de 20 à 50 picolitres), et les agrégats de cellules sont triés, et du volume est ajouté aux gouttes contenant les agrégats de cellules dans un deuxième temps. La séparation des cellules uniques et agrégats de cellules peut aussi être faite préalablement à la mise en œuvre de l'invention, et les cellules uniques et agrégats de cellules sont alors analysés séquentiellement et séparément.
La goutte comprend initialement la cellule dans le fluide de base, typiquement un milieu adapté à la culture de cellules de mammifère (et en particulier de cellules humaines) tel que le DMEM ou RPMI, le fluide de base étant alors dépourvu d'éléments du sécrétome de la cellule. Les éléments du sécrétome s'accumulent au cours du temps, dans le fluide de base, par sécrétion, clivage ou relargage à partir de la cellule unique.
Le fluide de base est adapté pour qu'une cellule unique ou un agrégat de cellules dans la goutte soit susceptible de produire au moins un élément cible du sécrétome d'une cellule tumorale, propre à se fixer sur l'agrégat, en particulier lorsque la cellule unique est une cellule tumorale ou lorsque l'agrégat de cellules contient ou consiste en des cellules tumorales.
Par exemple, chaque cellule tumorale 90, unique ou sous forme d'un agrégat de cellules, encapsulée dans une goutte est apte à produire un élément cible 37. En particulier, les cellules tumorales 90 sécrètent, clivent ou relarguent des éléments du sécrétome tels que des protéines ou des peptides, en particulier des protéines ou des peptides marqueurs de la tumeur. Les cellules tumorales, uniques ou sous forme d'un agrégat de cellules, sont notamment des cellules tumorales circulantes ou des cellules tumorales disséminées.
Les particules 12 sont destinées à former l'agrégat 10 de forme allongée. Par exemple, les particules 12 sont des particules superparamagnétiques qui acquièrent un moment magnétique à l'application d'un champ magnétique. Le superparamagnétisme est un comportement des matériaux ferromagnétiques ou ferrimagnétiques qui apparaît lorsqu'ils sont sous la forme de petits grains ou nanoparticules. Dans des grains de taille suffisamment petite, l'aimantation peut se renverser spontanément sous l'influence de la température. Le terme « particules magnétiques » dans le texte désigne des particules superparamagnétiques.
Les particules magnétiques 12 sont, par exemple, choisies parmi les particules fournies par la société Dynal (Life Technologies) ou Ademtech ou Miltenyi.
Les particules 12 sont par exemple nanométriques. Ainsi, leur dimension maximale est inférieure à 1 μηι et est par exemple comprise entre 50 nm et 1000 nm. Les particules 12 sont avantageusement sensiblement monodisperses. Par exemple, la variation entre les dimensions maximales des particules 12 est strictement inférieure à 10 %. La taille et le nombre de particules 12 par gouttes 6 sont choisies pour former le nombre désiré d'agrégats. La dimension maximale des particules 12 est inférieure à 50 % du diamètre de la goutte 6.
La concentration de particules 12 permet une stabilité colloïdale.
La concentration de particules 12 par gouttes 6 est telle que les particules 12 occupent entre 0,1 % et 5 % du volume de la goutte 6, par exemple 1 ,7 %.
Dans un exemple, chaque goutte 6 de 33 picolitres contient en moyenne 500 particules 12 de 300 nm de diamètre.
Les particules 12 forment initialement une dispersion homogène dans les gouttes initiales 32. Elles sont réparties sensiblement uniformément dans le volume de la goutte initiale 32. Ainsi, la concentration en particules 12 est homogène sur l'ensemble de la goutte initiale 32.
Les particules 12 possèdent avantageusement une surface permettant le couplage de molécules biologiques, constituée d'un matériau de surface. Par exemple les particules 12 sont couvertes d'un polymère présentant des fonctions COOH ou NH2.
Avantageusement, ce matériau de surface permet également de limiter l'agrégation spontanée des particules 12 dans la goutte.
De manière additionnelle, il peut avantageusement favoriser la stabilité de l'agrégat 10, par exemple, via des liaisons non spécifiques entre le matériau d'une bille et de sa voisine dans l'agrégat. Les particules 12 sont avantageusement fonctionnalisées. Ceci signifie notamment que le matériau de surface des particules 12 comporte des éléments fonctionnels.
Dans l'exemple représenté, les éléments fonctionnels comportent un élément de capture 36. L'élément de capture 36 est, par exemple, apte à capturer l'élément cible 37. L'élément de capture 36 est apte à se lier indirectement à l'entité de signalisation 34 par l'intermédiaire de l'élément cible 37.
L'élément cible 37 sécrété ou relargué par la cellule tumorale, unique ou sous forme d'un agrégat, ou bien clivé de la cellule tumorale, unique ou sous forme d'un agrégat, est reconnu à la fois par les éléments de capture 36 des particules 12 et par les entités de signalisation 34.
Lorsque l'élément cible 37 est une protéine, un peptide, un lipide, un glucide ou un exosome du sécrétome, les éléments de capture 36 sont avantageusement constitués par un anticorps polyclonal ou un anticorps monoclonal (en multiples copies) dirigés contre, ou spécifiques de l'élément cible 37.
Lorsque l'élément cible 37 est un acide nucléique cible, tel qu'un miRNA, du sécrétome, les éléments de capture 36 sont avantageusement constitués par un acide nucléique (en multiples copies) s'hybridant à l'acide nucléique cible, de préférence un acide nucléique comprenant ou constitué d'une séquence complémentaire à la séquence de l'acide nucléique cible. L'acide nucléique de capture est typiquement une séquence d'ADN, constituée par exemple de 10 à 200, 10 à 100, 10 à 50, ou 10 à 30 nucléotides.
Lorsque l'élément cible 37 est un exosome, les éléments de capture 36 sont avantageusement constitués par des anticorps dirigés contre une protéine présente dans la membrane, ou par des lipides ou stérols immobilisés sur une surface solide, par exemple des particules, comme décrit dans Kuhn et al. (Integr. Biol, 2012, 4, 1550-1555).
De la même manière, selon la nature de l'élément cible, les entités de signalisation
34 sont avantageusement constituées par (i) un anticorps polyclonal ou un anticorps monoclonal (en multiples copies) dirigés contre, ou spécifiques de l'élément cible 37, l'anticorps monoclonal ou polyclonal étant marqué de manière détectable, ou (ii) un acide nucléique de signalisation (en multiples copies) s'hybridant à l'acide nucléique cible, de préférence un acide nucléique comprenant ou constitué d'une séquence complémentaire à la séquence de l'acide nucléique cible, l'acide nucléique de signalisation étant marqué de manière détectable.
Le marqueur peut être typiquement un radioélément, un composé chromophore, un fluorophore, ou une enzyme couplée de manière directe ou indirecte à l'anticorps ou à l'acide nucléique. La présence de ces éléments cibles 37 dans la goutte 6 permet la relocalisation des entités de signalisation 34 sur l'agrégat 10, comme cela sera décrit par la suite.
En revanche, lorsque la cellule unique n'est pas une cellule tumorale, lorsque l'agrégat de cellules ne contient pas de cellule tumorale, ou lorsque la cellule unique ou l'agrégat de cellules ne produit pas, ou pas en quantité suffisante, l'élément cible 37 du sécrétome de cellule tumorale, les entités de signalisation 34 ne se relocalisent pas sur l'agrégat 10.
La relocalisation des entités de signalisation 34 sur l'agrégat permet ainsi de détecter que la cellule, unique ou sous forme d'un agrégat, sécrète, clive ou relargue l'élément cible 37 et donc:
- de caractériser que la cellule est une cellule tumorale si l'élément cible est un marqueur spécifique des cellules tumorales ou d'un type de cellule tumorale, et/ou
- de caractériser que l'élément cible 37 fait partie du sécrétome de la cellule. Lorsque plusieurs éléments cibles 37 distincts sont recherchés, des entités de signalisations différentes et des éléments de captures différents distincts sont associés. Leur relocalisation est détectée indépendamment par des entités de signalisations différentes et des éléments de captures différents, par exemple sur des canaux de fluorescence différents.
Chaque relocalisation d'une entité de signalisation 34 distinctes associées à un élément cible distinct permet de détecter que la cellule sécrète, clive ou relargue l'élément cible 37 associé.
L'ensemble d'agrégation 30 est apte à engendrer une agrégation des particules 12 selon un axe principal X.
L'ensemble d'agrégation 30 comporte, par exemple, deux aimants 38 situés de part et d'autre du conduit 24. Le champ magnétique est non parallèle à l'axe de circulation Y et avantageusement perpendiculaire à l'axe de circulation Y. L'ensemble d'agrégation 30 permet la formation d'un agrégat allongé dans chaque goutte 6.
Dans un mode de réalisation les aimants 38 sont permanents.
En variante, l'ensemble d'agrégation 30 comporte un aimant non-permanent.
En variante, l'ensemble d'agrégation 30 est apte à basculer d'un mode actif à un mode inactif afin de générer des agrégats 10 allongés dans certaines gouttes seulement.
Chaque agrégat 10 de particules 12 comporte par exemple une colonne orientée suivant un axe principal X. La hauteur de la colonne est avantageusement comprise entre 50 % et 100 % du diamètre de la goutte 6. Sa largeur est, par exemple, inférieure à 60 % de sa hauteur. De plus, l'ensemble d'agrégation 30 est, par exemple, apte à orienter l'agrégat suivant un axe préférentiel. Dans l'exemple représenté, l'axe X de l'agrégat 12 est perpendiculaire à l'axe de circulation Y des gouttes 6 dans le conduit de circulation 24.
L'ensemble de mesure 14 comprend par exemple une ligne laser apte à mesurer de manière optique l'intensité de la fluorescence selon une ligne s'étendant selon un axe X' perpendiculaire ou incliné par rapport à l'axe de circulation Y.
L'ensemble de mesure 14 est apte à effectuer la mesure au sein de la goutte dans la zone de détection 26.
L'axe X' de la ligne laser est avantageusement parallèle à l'axe de l'agrégat X dans la zone de détection 26.
Lorsque le débit du fluide porteur 8 est constant, la mesure en fonction du temps du signal obtenu par la ligne laser correspond à un balayage spatial de la goutte 6 passant devant la ligne laser. Ceci permet de prendre successivement plusieurs points de mesure et en particulier au moins un premier point 16 de mesure situé à l'écart de l'agrégat 10 et un deuxième point 18 de mesure situé plus proche de l'agrégat 10, au voisinage de l'agrégat 10.
En pratique, une pluralité de points de mesure successifs sont pris sur toute la dimension longitudinale de la goûte 6 lors de son passage progressif en regard de l'ensemble de mesure 14.
Dans l'exemple représenté sur les figures 1 à 3, l'entité de signalisation 34 est fluorescente.
Le conduit de circulation 24 est destiné à permettre la circulation des gouttes 6, 32 suivant l'axe de circulation Y dans un sens de circulation allant de l'ensemble de fourniture 4 vers l'ensemble de mesure 14.
Le conduit de circulation 24 présente avantageusement un diamètre intérieur inférieur ou égal à 1 mm.
Le conduit de circulation 24 est allongé selon l'axe de circulation Y. Le conduit de circulation 24 présente une section transversale intérieure de contour arrondi tel que circulaire ou elliptique, ou de contour polygonal tel que rectangulaire.
Le conduit de circulation 24 est par exemple défini dans un matériau translucide permettant la mesure de paramètres optiques par l'ensemble de mesure 14. En variante, le conduit de circulation 24 définit au moins une fenêtre de mesure transparente dans la zone de détection 26.
Les parois du conduit de circulation 24 sont étanches au fluide porteur 8. Par exemple, le conduit de circulation 24 est défini dans un tube capillaire de dimension interne avantageusement inférieure à 1 mm. En variante, le conduit de circulation 24 est défini dans une puce microfluidique.
L'ensemble de mise en circulation des gouttes 22 est destiné à déplacer une à une les gouttes 6, 32 dans le conduit 24 dans le sens de circulation.
L'ensemble de mise en circulation 22 comprend par exemple un pousse-seringue permettant d'appliquer des débits contrôlés au fluide porteur 8. En variante l'ensemble de mise en circulation 22 comprend un contrôleur de pression. Procédé d'analyse avec le premier appareil
Un premier procédé d'analyse suivant l'invention mis en œuvre dans le premier appareil 1 va maintenant être décrit.
Un appareil 1 tel que précédemment décrit est fourni. Des gouttes initiales 32 telles que décrites plus haut sont préparées dans un fluide porteur 8.
De préférence, les particules 12 sont dispersées de manière homogène dans chaque goutte initiale 32. Compte tenu de la faible taille des particules 12 individuelles par rapport aux gouttes initiales 32, chaque goutte initiale 32 contient un nombre élevé de particules individuelles 12 par exemple supérieur à 10. La probabilité d'obtenir une goutte initiale 32 dépourvue de particules 12 est très faible, voire nulle.
Certaines gouttes 6 comprennent une cellule tumorale unique 90 sécrétant, relargant ou clivant l'élément cible 37.
De préférence, les entités de signalisation 34 sont dispersées de manière homogène dans chaque goutte initiale 32.
Au sein de la goutte initiale 32, des liaisons se forment entre les éléments ayant des affinités particulières.
Dans un exemple, chaque élément cible 37 se lie à une entité de signalisation 34 et à un élément de capture 36. L'entité de signalisation 34 est ainsi relocalisée sur une particule 12.
Dans la suite, on entend par entités « relocalisées», les entités liées à l'agrégat 10. Les gouttes initiales 32 sont mises en circulation conjointement avec le fluide porteur 8 dans le conduit 24 par l'ensemble de mise en circulation 22.
Au moins une goutte initiale 32 est conduite vers l'ensemble d'agrégation 30. Un agrégat 10 de particules 12 définissant un objet allongé selon un axe principal X est formé par l'ensemble d'agrégation 30 dans la goutte initiale 32. De préférence, lorsque les particules 12 sont des particules magnétiques, elles s'alignent le long de l'axe principal X lors de leur passage en regard de chaque aimant 38 de l'ensemble d'agrégation 30.
La goutte 6 comprenant l'objet allongé est conduite vers la zone de détection 26. Un paramètre physique est mesuré localement par l'ensemble de mesure 14 en au moins un premier point 16 dans au moins une des gouttes 6.
Dans une mise en œuvre particulière, un paramètre physique est mesuré localement par l'ensemble de mesure 14 en au moins un premier point 16 dans au moins une des gouttes 6 et le même paramètre physique est mesuré localement en au moins un deuxième point 18 au voisinage de l'agrégat 10 dans la même goutte 6 par l'ensemble de mesure 14.
Mesure
La figure 2 représente à titre illustratif différentes mesures obtenues pour différentes gouttes 6. Le graphique représente l'intensité de fluorescence mesurée par la ligne laser en fonction du temps.
L'intensité de fluorescence est mesurée dans une gamme de longueur d'onde caractéristique de l'entité de signalisation 34. Dans l'exemple, l'intensité de fluorescence est, en outre, mesurée dans une gamme de longueur d'onde caractéristique des particules 12, les particules 12 étant fluorescentes. L'agrégat 10 est ainsi plus facilement repérable.
L'intensité de fluorescence 40 correspondant à la fluorescence de l'entité de signalisation 34 mesurée sur la ligne laser est présentée en pointillés sur la figure 2 pour différentes gouttes 6.
L'intensité de fluorescence 41 correspondant à la fluorescence des particules 12 est présentée en traits pleins sur la figure 2 pour différentes gouttes 6.
L'étape de mesure comporte la détermination du paramètre physique localement en une pluralité de points situés dans la goutte. Elle comprend en outre avantageusement un cumul des valeurs mesurées en une pluralité de points, par exemple la détermination de l'intégrale des valeurs mesurées au sein de la goutte 6.
La première goutte 42 représentée est une goutte 6 dans laquelle les différentes entités de signalisation 34 n'ont pas été relocalisées sur les particules 12. La répartition des entités de signalisation 34 est homogène au sein de la goutte 6. Un signal d'intensité de fluorescence sous forme d'un plateau 44 est mesuré.
La deuxième goutte 48 représentée est une goutte 6 dans laquelle une partie des entités de signalisation 34 a été relocalisé sur les particules 12. En effet, ces entités de signalisation 34 sont liées à un élément cible 37 capturé par l'élément de capture 36. L'intensité de fluorescence au voisinage de l'agrégat 10 est donc plus importante que dans le reste de la goutte 6. Un signal d'intensité de fluorescence présentant un pic 50 en plus d'un plateau 52 est mesuré.
La hauteur du plateau 52 de la deuxième goutte 48 est plus faible que la hauteur du plateau 44 de la première goutte 42 car moins d'entités de signalisations 34 sont libres à l'écart de l'agrégat 10.
La troisième goutte 56 représentée est une goutte 6 dans laquelle une proportion plus importante des entités de signalisation 34 a été relocalisée sur l'agrégat. Un signal d'intensité de fluorescence présentant un pic 58 et un plateau 59. La hauteur du pic 58 mesurée est plus importante que la hauteur du pic 50 mesurée dans la deuxième goutte 48 car plus d'entités de signalisation 34 sont capturées par les particules 12 et sont donc situées au voisinage de l'agrégat 10. La figure 3 illustre le choix des paramètres utiles pour estimer la concentration d'entités de signalisation 34 relocalisées.
Sur la figure 3 qui représente le signal S au cours du temps t, on voit trois gouttes contenant un (à gauche et à droite) ou deux agrégats (au centre) qui présentent un pic plus élevé de signal. Le paramètre utile peut-être le maximum du signal (indiqué Max) ou l'intégrale du signal par rapport à un seuil donné (Int).
Une première méthode consiste à estimer cette concentration par la valeur maximale du signal (Max) dans chaque goutte 6, c'est-à-dire la hauteur des pics de signal relocalisés sur l'agrégat.
Une seconde méthode, plus précise, consiste à calculer l'intégrale des signaux (Int) pour chaque goutte 6 au-delà d'un seuil fixé par l'utilisateur, comme représenté par exemple sur la figure 3. Cette méthode peut s'avérer plus intéressante pour limiter la dispersion du signal.
Ces deux méthodes de traitement du signal peuvent être effectuées en temps réel. D'autres méthodes, par exemple combinant ces approches, pourraient être appliquées, par exemple pour mesurer à la fois l'entité de signalisation 34 relocalisée et non relocalisée.
L'invention permet, en outre, de mesurer la concentration de l'élément cible 37 dans la goutte 6.
Un cas simple pour ce faire est de se placer dans le cas où : - l'élément de capture 36 est en quantité suffisante et d'affinité suffisante pour l'élément cible 37 pour capturer au moins plus de 90 % de l'élément cible sur l'agrégat, avantageusement la totalité ;
- la concentration de l'entité de signalisation 34 est supérieure à celle de l'élément cible 37 et la constante de dissociation Kd entre l'entité de signalisation 34 et l'élément cible 37 est inférieure à la concentration de l'élément cible 37, avantageusement d'un facteur supérieur à 10. Ceci est typiquement le cas quand on utilise des réactifs de dosage optimisés comme des anticorps monoclonaux de Kd subnanomolaires, et qu'on veut détecter des concentrations d'élément cible 37 supérieures au nanomolaire.
On entend par « nanomolaire » égal à 1 nanomole/L.
Dans ces conditions particulière, la présence de chaque élément cible 37 donne lieu à la formation d'un complexe élément de capture 36 - élément cible 37 - entité de signalisation 34. La concentration de l'élément cible 37 est donc proportionnelle au signal de l'entité de signalisation 34 relocalisé sur l'agrégat 10. D'autres conditions permettent de réaliser cette quantification et seront évidentes à l'homme de l'art en modifiant les concentrations et les affinités des éléments de capture 36, ou des entités de signalisation 34 pour l'élément cible 37.
Application : détection de cellule tumorale
Si l'élément cible est un marqueur spécifique du sécrétome d'une cellule tumorale, sa détection peut suffire à détecter les cellules tumorales, uniques ou sous forme d'un agrégat, encapsulées.
Si l'élément cible est un marqueur caractéristique du sécrétome d'une cellule tumorale, mais non spécifique des cellules tumorales, sa détection en combinaison avec un ou plusieurs autres éléments cibles constituant des marqueurs caractéristiques du sécrétome d'une cellule tumorale peut permettre de détecter que la cellule unique encapsulée est une cellule tumorale.
A la suite de l'étape de mesure, une information sur la nature tumorale de la cellule encapsulée dans la goutte, sous forme de cellule unique ou dans un agrégat de cellules, est obtenue.
Cette information permet de savoir quelles gouttes doivent être récupérées en aval pour d'autres mesures ou utilisations.
Le procédé permet ainsi de détecter des cellules tumorales isolées à partir d'un échantillon biologique comprenant des cellules hétérogènes. Les cellules non tumorales ou les cellules tumorales ne produisant pas l'élément cible sont repérées car leur goutte ne contient pas l'élément cible et les entités de signalisation n'auront pas été relocalisées. Ce procédé permet ainsi d'effectuer une détection voire un comptage de cellules tumorales dans une population de cellules provenant d'un échantillon biologique.
Application : caractérisation de cellule tumorale
Si les cellules uniques encapsulées sont uniquement des cellules tumorales, la mesure de l'élément cible peut permettre d'obtenir des informations relatives à la production de l'élément cible par la cellule tumorale unique, par exemple à sa concentration.
Si l'agrégat de cellules encapsulées contient une ou des cellules tumorales, la mesure de l'élément cible peut permettre d'obtenir des informations relatives à la production de l'élément cible par l'agrégat de cellules, par exemple à sa concentration.
A la suite de l'étape de mesure, une information est obtenue sur une ou des caractéristiques de chaque cellule tumorale encapsulée dans la goutte, ou de chaque agrégat contenant une ou des cellules tumorales encapsulé(es) dans la goutte.
Cette information permet d'obtenir des informations sur l'hétérogénéité ou les propriétés des cellules tumorales.
Application : détection et caractérisation de cellule tumorale
Au cours de la mesure, on peut obtenir à la fois des informations sur la nature tumorale de la cellule et sur des caractéristiques de la cellule tumorale, par exemple en détectant l'élément cible et en mesurant sa concentration.
En outre, en détectant plusieurs éléments cibles, on peut obtenir un grand nombre d'informations simultanément. Par exemple certains éléments cibles sont des marqueurs tumoraux et d'autres éléments du sécrétome, tels que des protéines ou peptides, qui ne sont pas spécifiquement des marqueurs tumoraux.
A la suite de l'étape de mesure, une information sur des caractéristiques de chaque cellule tumorale encapsulée dans la goutte est obtenue.
Cette information permet d'obtenir des informations sur l'hétérogénéité des cellules tumorales et différents mécanismes.
Deuxième appareil
Les figures 4 à 7 illustrent une partie d'un deuxième appareil 60 suivant l'invention. Ce deuxième appareil 60 diffère du premier appareil 1 en ce que le dispositif 20 comporte une chambre 62. La chambre 62 comporte une pluralité de passages de circulation 64 et une pluralité de plots de séparation 66. D'autres chambres sont possibles. Dans une variante, des chambres ne comprennent pas de plots de séparation tels que décrits dans le document PCT/FR2009/051396.
La chambre 62 est destinée à stocker une pluralité de gouttes 6 dans un fluide porteur 8 pendant une étape d'agrégation ou une étape d'orientation et pendant l'étape de mesure.
L'ensemble de mesure du deuxième appareil 60 diffère de l'ensemble de mesure 14 du premier appareil 1 en ce qu'il est apte à mesurer le paramètre physique simultanément sur plusieurs gouttes 6 présentes dans la chambre 62.
La figure 4 présente la chambre 62 contenant des gouttes initiales 32 dans un fluide porteur 8. La dispersion des particules 12 magnétique est visible. La figure 5 présente la même chambre 62 après la formation des agrégats 10 dans les gouttes. Une pluralité d'agrégats allongés est formée dans chaque goutte 6. La figure 6 présente dans un même dispositif 60 une pluralité de gouttes 6 présentant des agrégats 10 allongés. La nature et la quantité de gouttes 6 ont été ajustées pour qu'un seul agrégat 10 allongé soit présent par goutte. La présence d'un unique agrégat 10 par goutte 6 facilite la mesure. La figure 7 présente la même chambre 62 après une étape d'orientation des agrégats selon un même axe de détection D. Procédé d'analyse avec le deuxième appareil
Le procédé d'analyse suivant l'invention à partir de ce deuxième appareil 60 diffère du procédé précédemment décrit en ce que la mesure est effectuée sur la pluralité de gouttes 6 simultanément, par exemple par mesure dans toute la chambre 62 en même temps, et non par circulation des gouttes 6 devant un détecteur.
Un avantage de ce procédé est qu'il est possible de répéter la mesure du paramètre physique sur une même gouttelette au cours du temps, puisque les gouttes sont stationnaires, et de pouvoir ainsi déterminer la cinétique de sécrétion d'un élément du sécrétome.
Le procédé diffère également en ce qu'il comprend avant l'étape de mesure, une étape d'orientation de l'axe principal X de l'agrégat 10 selon un axe de détection D.
Avantageusement, on pourra multiplier les axes de détection, en appliquant des champs magnétiques d'orientation variable. Cette approche à l'avantage de permettre de discriminer l'agrégat 10 d'autres objets de la goutte non magnétiques, ou réduire les signaux parasites. Par exemple, le bruit de fond en fluorescence peut être réduit. Par exemple, la détection selon différents axes permet de distinguer une relocalisation de l'entité de signalisation 34 sur un agrégat 10 d'une relocalisation de l'entité de signalisation 34 sur un autre objet de la goutte 6, par exemple sur une cellule.
Une implémentation de cette idée consiste à appliquer un champ magnétique B1 pour aligner l'axe principal X de l'agrégat 10 selon une première orientation D1 , puis à appliquer un champ magnétique B2 perpendiculaire à B1 pour aligner l'axe principal X de l'agrégat 10 selon une deuxième orientation D2 perpendiculaire à D1 .
Troisième appareil
Un troisième appareil 70 suivant l'invention est représenté sur la figure 8. Ce troisième appareil 70 diffère du premier appareil 1 en ce qu'il comporte en outre un ensemble de classement 72.
De plus, le troisième appareil 70 diffère du premier appareil 1 en ce que l'ensemble de chargement 28 comprend une zone d'entrée 74 de la phase interne et une zone d'entrée du fluide porteur 76 et une zone de jonction 78. L'ensemble de chargement 28 comprend en outre une zone d'incubation 79.
La zone d'entrée de la phase interne 74 comporte un premier conduit d'entrée 80, un deuxième conduit d'entrée 82 et un conduit de co-écoulement 84.
Le premier conduit d'entrée 80 est destiné à l'introduction de la première masse de fluide 86 destinée à former une partie de la phase interne des gouttes. Dans l'exemple, la première masse de fluide interne comporte les particules 12 et une pluralité d'entités de signalisation 34.
Le deuxième conduit d'entrée 82 est destiné à l'entrée de la deuxième masse de fluide 88 destinée à former une partie de la phase interne des gouttes. Dans l'exemple, la deuxième masse de fluide interne comporte une suspension de cellules susceptible de contenir des cellules tumorales productrices 90 de l'élément cible 37.
La concentration des cellules 90 dans la deuxième masse de fluide est avantageusement telle qu'une proportion importante de gouttes contiennent une cellule 90 seulement, par exemple plus de 10 % des gouttes contient une cellule 90.
Le conduit de co-écoulement 84 permet une répartition des deux masses de fluide 86, 88 destinée à former la phase interne.
La zone d'entrée du fluide porteur 76 est destinée à l'entrée du fluide porteur 8. Dans l'exemple représenté, le fluide porteur 8 entre par deux conduits d'entrées 92.
La zone de jonction 78 joint la zone d'entrée du fluide porteur 76 et la zone d'entrée de la phase interne 74. En particulier, la zone de jonction joint le conduit de co- écoulement 84 aux conduits d'entrées 92 du fluide porteur. La zone de jonction 78 est apte à former les gouttes initiales 32. La zone de jonction 78 représentée ici est une jonction de focalisation hydrodynamique. Des exemples de jonctions de focalisation hydrodynamique sont illustrés sur les figures 1 1 et 12. En variante les gouttes initiales 32 sont formées dans une jonction T.
Les gouttes initiales 32 comprenant un mélange des deux masses de fluides 86,
88 sont formées. Les gouttes initiales 32 comprennent une dispersion de particules 12 et des entités de signalisation 34.
Au moins certaines gouttes initiales 32 comprennent en outre une cellule 90, unique ou sous forme d'un agrégat de cellules.
La zone d'incubation 79 est située en aval de la zone de jonction 78. La zone d'incubation est destinée à permettre la sécrétion de l'élément cible 37 par les cellules 90, uniques ou sous forme d'agrégats de cellules.
Avantageusement, la puce comprend un moyen d'apport ou d'échange d'oxygène dans la zone d'incubation 79.
En variante, l'incubation est effectuée hors du dispositif 20.
Le troisième appareil 70 diffère également en ce que le dispositif 20 comprend en outre une pluralité de zones de classement 94, 96 et un moyen de direction 98 de la goutte ou une partie de la goutte sélectivement vers une zone de classement 94, 96.
Les zones de classement 94, 96 sont situées en aval de la zone de détection 26. Le conduit 24 comporte une bifurcation 100 en deux conduits de sorties 102, 104. La première zone de classement 94 comporte le premier conduit de sortie 102 destiné à recevoir un premier groupe de gouttes 106. La deuxième zone de classement 96 comporte le deuxième conduit de sortie 104 destiné à recevoir un deuxième groupe de gouttes 108. En variante, le dispositif 20 comporte un nombre plus important de zones de classement 94, 96 suivant le nombre de critères de tri.
Le moyen de direction 98 des gouttes sélectivement est par exemple apte à diriger une goutte 6 vers une zone de classement 94, 96 au moyen d'une force magnétique.
En variante les gouttes 6 sont dirigées au moyen d'électrodes.
Par exemple, les gouttes sont dirigées vers une zone de classement, par diélectrophorèse, par électrocoalescence avec un courant ou par des ondes acoustiques de surface (SAW).
Procédé d'analyse avec le troisième appareil
Le procédé d'analyse avec le troisième appareil 70 suivant l'invention va maintenant être décrit. Un appareil 70 tel que précédemment décrit est fourni. Une suspension de particules 12 magnétiques et d'entités de signalisation 34 est préparée et injectée dans le premier conduit d'entrée 80.
Une suspension de cellules 90 susceptible de contenir des cellules tumorales est préparée et injectée dans le deuxième conduit d'entrée 82.
Un fluide porteur 8 est fourni et injecté dans les conduits d'entrées de fluide porteur 92.
Les fluides 86, 88 sont mis en mouvement au moyen des ensembles de mise en circulation 22. Les gouttes initiales 32 sont formées dans la zone de jonction 78.
Le procédé comporte, en outre, une étape d'incubation au cours de laquelle la cellule 90, unique ou sous forme d'un agrégat de cellules, compartimentée est susceptible de sécréter, cliver ou relarguer, l'élément cible 37 du sécrétome de cellule tumorale à analyser, par exemple la protéine ou peptide du sécrétome de cellule tumorale. L'incubation est ainsi réalisée dans des conditions et pendant une durée suffisante pour que la cellule 90, en particulier lorsqu'elle est sous forme de cellule unique, soit susceptible de produire au moins un élément cible 37 du sécrétome d'une cellule tumorale.
Typiquement, l'étape d'incubation dure 5 minutes à 32 heures, par exemple environ 1 à 24 heures, ou encore 2 à 9 heures, notamment pour l'analyse de cellules fraîchement récupérées d'un fluide biologique d'un patient. En variante, l'étape d'incubation dure 32 à 72 heures, par exemple environ 32 à 48 heures, par exemple environ 36 heures, notamment pour l'analyse de cellules décongelées.
L'incubation est en général réalisée à 37 ± 1 °C, avec 5% de C02. L'incubation est typiquement réalisée en présence d'un tampon ou milieu approprié.
Un avantage du procédé selon l'invention est que, par rapport au procédé d'analyse EPISPOT tel que décrit dans la demande de brevet EP 1 506 407, la durée de l'étape d'incubation peut être raccourcie du fait de la sensibilité du procédé selon l'invention. Du fait de l'accumulation des éléments du sécrétome dans le volume restreint de la goutte, à durée d'incubation équivalente, la concentration des éléments du sécrétome à détecter sera plus élevée dans le procédé selon l'invention comparativement au procédé EPISPOT. La mise en œuvre du procédé selon l'invention est donc plus rapide et plus sensible.
Les gouttes 6 comprennent avantageusement un milieu de culture permettant le maintien en vie des cellules 90 dans la goutte pendant trois jours ou plus. Il s'agit typiquement d'un milieu de culture de cellules mammifères, notamment de cellules humaines, avec ou sans sérum. L'étape d'incubation est réalisée dans la zone d'incubation 79 du dispositif 20. En variante, cette étape est réalisée hors du dispositif 20.
Les étapes de formation de l'agrégat 10 et de mesure sont les mêmes que pour le procédé d'analyse avec le premier appareil 1 .
Le procédé diffère en ce que l'étape de mesure est suivie d'une étape d'analyse.
L'étape d'analyse permet de déterminer à quel groupe 106, 108 appartient une goutte 6 suivant des critères prédéterminée et de générer une décision de classement par goutte 6 après l'étape de mesure.
Suivant la décision de classement, la goutte 6 est dirigée vers l'une des zones de classement 94, 96 par le moyen de direction 98.
Dans l'exemple représenté sur la figure 8, les gouttes 106 dans lequel le signal de forte intensité de fluorescence est localisé majoritairement au voisinage de l'agrégat 10 sont dirigées dans la première zone de classement 94. Les gouttes du premier groupe 106 correspondent par exemple aux troisièmes gouttes 56 de la figure 2.
Ces gouttes 106 contiennent par exemple les cellules tumorales 90, uniques ou sous formes d'agrégats de cellules tumorales, dont le sécrétome comprend l'élément cible 37. Les gouttes 106 sont éventuellement récupérées pour que leur contenu, et notamment la ou les cellules tumorales contenues, soit analysé par d'autres techniques, ou pour que les cellules tumorales 90, uniques ou sous formes d'agrégats de cellules tumorales, soient remises en culture.
Les gouttes 108 dans lequel un signal différent, notamment un signal sensiblement homogène sur la goutte 108, a été mesuré sont dirigées vers une autre zone de classement 96. Le deuxième groupe de gouttes 108 comporte par exemple des gouttes ne comprenant pas de cellule 90 et des gouttes contenant une cellule unique 90 ne produisant pas l'élément cible 37 du sécrétome de cellule tumorale en quantité ou en qualité suffisante.
Une fois les cellules tumorales 90 vivantes identifiées par leur sécrétome et triées, de nombreuses analyses ultérieures peuvent être réalisées, éventuellement après lyse des gouttes et ré-encapsulation des cellules tumorales 90 vivantes dans des gouttes, comme par exemple l'analyse du transcriptome (ARN messagers pour l'expression des gènes, et microARNs), du génome, de l'épigénome, ou du protéome (Alix-Panabières C, Pantel K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discov. 2016).
L'analyse du transcriptome, en particulier l'analyse des ARNm, des cellules tumorales (notamment des CTCs) peut révéler des informations très importantes sur la sensibilité à un médicament et sa résistance. Par exemple, dans le cancer de la prostate métastatique et résistant à la castration, l'expression de l'ARNm ARV7, une forme tronquée du récepteur aux androgènes qui n'a plus de domaine de liaison à son ligand mais qui persiste actif, dans les CTCs pourrait prédire l'échec des thérapies anti- androgène (notamment des thérapies utilisant Enzalutamide et/ou abiraterone). Des patients dont les CTCs expriment cet ARNm ARV7 peuvent cependant rester sensibles aux taxanes et la détection de ce variant d'épissage ARV7 dans les CTCs pourrait devenir un marqueur de sélection d'un traitement approprié chez ces patients.
Les microARNs (miARNs) sont des régulateurs clés de l'expression des gènes et sont devenus de potentiels marqueurs diagnostiques et des cibles importantes pour les thérapies anti-cancéreuses. Grâce à une technique d'hybridation in situ, il est possible d'analyser d'importants miRNAs (par exemple miR-10b) à l'échelle de la cellule unique.
En ce qui concerne l'analyse du génome, des mutations au sein même de gènes codent pour des cibles thérapeutiques ou des protéines de signalisation en aval de cibles qui affectent l'efficacité de thérapies ciblées. A titre d'exemple, les mutations d'EGFR affectent les thérapies anti-EGFR dans le cancer du poumon, et les mutations KRAS - une protéine en aval d'EGFR - bloquent l'efficacité des thérapies anti-EGFR dans le cancer du colon. Récemment, l'analyse de centaines de CTCs obtenues à partir de patients avec un cancer colorectal a montré une forte hétérogénéité intra- et inter-patients pour la mutation KRAS. Les CTCs portant les gènes KRAS mutés échapperont à la thérapie anti-EGFR et leur détection précoce peut être importante pour guider le choix du traitement patient par patient.
Les cellules analysées dans les gouttes peuvent être décapsulées de l'émulsion. Une méthode appropriée pour décapsuler l'émulsion comprend l'ajout de 5 % v/v 1 H,1 H,2H,2H-Perfluoro-1 -octanol (Sigma-AIdrich), suivi par une incubation d'une heure. Les phases sont séparées par centrifugation (par exemple 300 g, pendant 5 min), et les cellules sont collectées à l'interface des deux phases, aqueuse et fluorée.
Pour faciliter la collecte des cellules, la méthode peut comprendre l'introduction d'une troisième couche, d'une densité comprise entre celle de la phase aqueuse et de la phase fluorée (par exemple 1 ,10 g/ml), avant la centrifugation entre les deux phases. La troisième couche est généralement une solution aqueuse d'osmolarité adaptée pour le contact avec les cellules. Une solution adaptée est par exemple préparée par exemple dissolution de 27,6 g de Nycodenz (Progen) dans 100 ml d'une solution consistant en TrisHCI 5 mM, KCL 3 mM, CaNa2EDTA 0.3 mM, pH 7.5. Les cellules sont alors récoltées dans ladite troisième couche, positionnée à l'interface de la phase aqueuse et de la phase fluorée, évitant ainsi de prélever de la phase fluorée avec les cellules. Avantages de l'invention
L'utilisation d'une dispersion de particules 12 de faibles tailles par rapport à la taille des gouttes assure une distribution homogène des particules 12 dans les gouttes 6, et donc la formation quasi certaine d'un agrégat 10 de taille significative dans chaque goutte 6.
Globalement, ce procédé permet de doser/quantifier un élément du sécrétome de cellule tumorale, tel qu'une protéine ou peptide du sécrétome de cellule tumorale dans la goutte contenant la cellule unique ou l'agrégat de cellules.
La formation d'un agrégat allongé 10 permet d'obtenir un meilleur rapport signal sur bruit et un intervalle dynamique plus important par rapport à l'essai décrit dans Mazutis et al. (Nat prot 2013) où une seule bille est encapsulée. En effet le signal généré par l'entité de signalisation 34 sera concentré sur une largeur plus petite que celle d'une sphère de surface égale. La hauteur du pic ainsi que présenté sur la Figure 2 sera donc plus élevée que dans le cas d'une seule bille pour un même nombre d'entité de signalisation 34 relocalisées.
Ce procédé est utilisable dans de nombreux procédés d'analyse biologique. Le procédé selon l'invention peut s'appliquer à de nombreux types d'éléments du sécrétome, notamment de protéines ou peptides du sécrétome.
Cette invention permet notamment d'analyser de manière très complète la biopsie liquide du cancer en temps réel par un phénotypage, une analyse du sécrétome et analyse moléculaire de cellules tumorales, uniques ou sous formes d'agrégats de cellules tumorales.
L'appareil selon l'invention peut être intégré comme une brique technologique dans des dispositifs plus complexes en particulier dans un dispositif de criblage à haut débit, dans un laboratoire sur puce, dans un dispositif de « point of care » dans des instruments de laboratoires, des robots, ou autres.
En outre, le procédé selon l'invention peut être intégré dans des protocoles complexes permettant le diagnostic, la découverte de médicaments, la découverte de cibles, l'évaluation d'un médicament.
De plus les systèmes microfluidiques selon l'invention et les procédés selon l'invention peuvent être combinés ou inclus dans d'autres types de composants micro fluidiques ou pour d'autres fonctions micro fluidiques connues dans l'état de l'art.
L'invention peut, en outre, être particulièrement utile en combinaison avec des méthodes optiques diverses, notamment des méthodes de détection optique. Le procédé est applicable par exemple pour déterminer la présence d'un élément cible 37 dans le sécrétome, la concentration d'un élément cible 37 sécrété, relargué ou clivé, ce qui permet d'établir des caractéristiques de la cellule tumorale produisant l'élément cible 37 dans la goutte 6.
Le procédé permet de plus le tri, la capture et l'extraction des gouttes présentant des caractéristiques intéressantes, et notamment contenant une cellule tumorale unique ou un agrégat de cellules tumorales.
Dans un exemple, le procédé comprend la formation d'un sandwich, l'élément cible 37 étant d'une part lié à l'élément de capture 36 de la particule 12 et d'autre part à l'entité de signalisation 34, l'entité de signalisation 34 étant fluorescente.
Dans un exemple, l'élément de capture 36 est un anticorps, polyclonal ou monoclonal. Dans un exemple, l'entité de signalisation 34 est un anticorps, polyclonal ou monoclonal. Dans un exemple, l'élément cible 37 est un peptide ou une protéine du sécrétome.
Dans un exemple, l'élément de capture 36 est un acide nucléique, notamment une sonde d'ADN ou un aptamère. Dans un exemple, l'entité de signalisation 34 est un acide nucléique, notamment une sonde d'ADN. Dans un exemple, l'élément cible 37 est un acide nucléique du sécrétome, notamment un ADN double brin, ARNm ou miRNA.
Dans un exemple, l'élément de capture 36 est un anticorps polyclonal ou monoclonal ou nanocorps, ou un aptamère dirigé contre une protéine présente dans la membrane ou accrochée à la membrane, ou contre des lipides ou stérols. Dans un exemple, l'entité de signalisation 34 est un anticorps, polyclonal ou monoclonal. Dans un exemple, l'élément cible 37 est un exosome. Dans un autre exemple, plusieurs paires élément de capture 36 - élément cible 37 ou triplets élément de capture 36 - élément cible 37 -entité de signalisation 34 peuvent être analysé simultanément, pour détecter la présence de plusieurs éléments cibles 37 de nature différente.
Par exemple, tel que représentée dans la goutte sur la figure 13, une goutte comprend plusieurs éléments cibles 37a, 37b de nature différente et plusieurs entités de signalisations 34a, 34b chacune étant apte à former un complexe avec un des éléments cibles 37a, 37b. Certaines particules 12 de l'agrégat 10 comprennent un élément de capture 36a adapté à la capture d'un premier élément cible 37a, d'autres particules comprennent un autre élément de capture 36b adapté à la capture d'un deuxième élément cible 37b.
Dans certaines applications, l'agrégation des particules 12 est réversible.
Dans certains cas, la présence de l'élément cible 37 rend l'agrégation non réversible et consolide l'agrégat 10 lors de sa formation dans l'ensemble d'agrégation 30. L'agrégat 10 pré-existe donc de manière stable uniquement dans les gouttes 6 contenant l'élément cible 37. Dans les gouttes ne contenant pas l'élément cible 37, la réversibilité de l'agrégation des particules 12 dissous l'agrégat 10 tant qu'il ne rentre pas dans la zone de lecture 26. Dans un régime choisi d'aimantation et de fluidique, l'agrégat 10 ne peut se former et s'orienter qu'en présence de cette pré-agrégation, ce qui limite l'acquisition de pic selon la figure 2 aux gouttes contenant l'élément cible 37 par une autre méthode que via l'entité de signalisation 34.
La présente invention trouve en particulier application pour la détection et/ou la caractérisation de cellules tumorales isolées à partir de fluides biologiques. Chaque cellule peut relarguer, sécréter, ou cliver in vitro un certains nombres d'éléments du sécrétome de cellule tumorale, notamment un certains nombres de protéines ou peptides, dont un ou plusieurs marqueurs tumoraux permettant d'identifier une cellule tumorale. La présente invention permet également d'étudier ou caractériser le sécrétome de cellules, uniques ou sous forme d'un agrégat de cellules, qui auront, préalablement ou simultanément à leur caractérisation, été identifiées comme étant des cellules tumorales, en particulier par le procédé de détection de cellules tumorales selon l'invention.
Les cellules tumorales sont, par exemple, des cellules tumorales circulantes vivantes, ci-après désignées par le sigle 'CTCs', isolées du sang, ou des cellules tumorales disséminées vivantes, ci-après désignées par le sigle 'DTC, isolées à partir de la moelle osseuse, ou encore de cellules tumorales vivantes issues de n'importe quel autre liquide biologique, par exemple l'urine ou le liquide céphalo rachidien (LCR).
Les cellules tumorales métastatiques agressives, qui sont capables de donner des métastases à distance, font notamment partie des cellules auxquelles s'applique la présente invention. En particulier, les CTCs regroupées en agrégat dans la circulation sanguine pourraient avoir un potentiel métastatique beaucoup plus élevé que les CTCs isolées.
La présente invention a l'avantage de permettre une analyse de CTCs vivantes, et donc d'étudier la fonctionnalité de ces cellules, alors que les techniques de l'art antérieur impliquent l'isolation et la fixation des CTCs, avant analyse.
Les cellules tumorales peuvent être des cellules tumorales de cancer solide ou de cancer liquide (leucémie, lymphome).
Par exemple, les cellules tumorales sont isolées à partir de fluides biologiques de patients ayant un cancer solide, par exemple un cancer du sein, de la prostate, du colon, du rectum, de la thyroïde, de la peau, du foie, du testicule, de l'ovaire, etc. Les cellules tumorales sont en particulier des cellules humaines ou animales, telles que des cellules de rongeur (par exemple de rat ou souris), de primate (par exemple de singe), de canin (par exemple de chien) ou félin (par exemple de chat).
Avantageusement les cellules auront été marquées préalablement à leur encapsulation. Les cellules peuvent en effet être pré-marquées, par exemple avec un ou des anticorps marqués (par exemple avec un fluorochrome) dirigés contre un ou des marqueurs tumoraux membranaires, pour identifier la nature tumorale de la cellule encapsulée, ou de l'agrégat de cellules encapsulé, par détection du signal émis par le ou les anticorps marqués au niveau de la cellule ou de l'agrégat de cellules. Cette détection peut être réalisée sur les gouttes en circulation comme en mode statique.
A titre d'exemples, le ou les éléments cibles sont des cytokératines comme CK19. En variante, le ou les éléments cibles sont des marqueurs de tissu comme la mammaglobine (pour le sein), le 'prostate-specific antigen' (PSA) ou la kallikréine 3 humaine (hK3) (pour la prostate).
En variante, le ou les éléments cibles sont des marqueurs mésenchymateux comme l'« human glandular kallikrein » (hK2), Her2-neu, la thyroglobuline, CA19-9, CA15- 3 ACE (enzyme de conversion de l'angiotensine), CA-125, la Cathepsine D, l'alphafoetoprotéine, la protéine S100, le « fibroblast growth factor-2 » (FGF-2), Γ « epithelial growth factor (EGF) », etc.
Dans un exemple, la cellule tumorale unique 90 est une cellule de tumeur de la prostate, et au moins un élément cible 37 est le PSA (prostate-specific antigen). Ce marqueur est spécifique du cancer de la prostate. L'élément de capture 36 greffé sur les particules 10 est un premier anticorps anti-PSA. L'élément de signalisation 34 est un second anticorps anti-PSA qui est marqué, notamment par un fluorochrome tel que Alexa 555. Ce marqueur est très spécifique des cancers de la prostate, sa présence permet à elle seule de caractériser les cellules comme des cellules tumorales provenant d'un cancer de la prostate.
Dans un autre exemple, plusieurs marqueurs sont détectés en combinaison pour caractériser les cellules tumorales. Par exemple, certains marqueurs ne sont pas spécifiques à un type de cancer mais la présence combinée de deux marqueurs différents permet d'identifier le type de cancer. Le choix de combinaisons de marqueurs appropriées pour identifier un type de cancer est à la portée de l'homme du métier.
Ainsi, le marqueur VEGF existe dans le sécrétome de nombreuses cellules tumorales. Cependant, sa présence avec d'autres marqueurs permet de caractériser un cancer. De même, la présence du marqueur FGF2 seul ne suffit pas à elle seule à caractériser un cancer.
Dans l'exemple illustré sur la figure 13, il est ainsi possible d'analyser la présence de plusieurs types d'éléments cibles sécrétés. Chaque immunoessai de type sandwich détecte un élément cible distinct 37a, 37b sécrété par la cellule tumorale unique 90.
La mesure de chaque signal de fluorescence permet donc d'avoir une information sur la nature ou le phénotype de la cellule. De préférence, les entités de signalisation 36 comprennent des fluorochromes. Un fluorochrome différent est de préférence associé à chaque partenaire de liaison spécifique d'un élément cible différent, et notamment d'un marqueur tumoral différent.
Ainsi, dans ses modes de réalisation particulièrement avantageux, le procédé selon l'invention permet la détection des CTCs ou DTCs grâce à un procédé de type EPISPOT fluorescent multiparamétrique, qui utilise différents couples d'anticorps et différents fluorochromes. A titre d'exemple de fluorochromes, on peut citer Alexa488, pour le vert, Alexa555 pour le rouge, Alexa350 pour le bleu, etc.
Le nombre d'éléments cibles 37 pouvant être analysés pour une cellule tumorale unique est choisi en amont de l'expérience, en choisissant les couples de particules fonctionnalisés avec des éléments de capture et d'entités de signalisation. Il est par exemple possible d'effectuer des mesures sur plus de neufs canaux de fluorescence différents. Ceci permet, par exemple de faire plus de neuf mesures simultanées d'éléments du sécrétome d'une cellule tumorale unique.
Obtention des cellules tumorales
Selon des caractéristiques avantageuses de l'invention, le procédé de détection comprend une étape préliminaire d'enrichissement des CTCs ou DTCs présentes dans l'échantillon biologique.
L'enrichissement des cellules de l'échantillon biologique peut être basé sur l'expression de marqueurs exprimés à la surface des cellules, la taille, la densité ou les charges électriques des cellules. Par exemple, les CTCs peuvent être isolées à partir du sang par déplétion des leucocytes ou par filtration.
L'enrichissement des cellules de l'échantillon biologique peut par exemple consister soit en un tri positif des cellules, basé sur l'expression de protéines spécifiques membranaires des cellules épithéliales, comme par exemple, Epithelial Cell Adhésion Molécule ou EpCAM, soit sur un tri négatif des cellules basé sur l'expression de marqueurs spécifiques sur la surface des cellules hématopoïétiques non voulues, comme à titre d'exemple CD45, CD4, CD8, CD19, CD56. Les cellules peuvent être triées selon leur taille grâce à l'utilisation d'une membrane-filtre qui retiendra les cellules de grosse taille et laissera passer les cellules hématopoïétiques de taille inférieure. Les cellules peuvent être triées selon leur densité, par des centrifugations sur des gradients spécifiques.
Les cellules peuvent être triées selon leur charge électrique par diélectrophorèse car les CTCs/DTCs, présentent une charge différente de celles des cellules hématopoïétiques, par l'utilisation de la diélectrophorèse.
Toute autre méthode d'enrichissement permettant d'obtenir des cellules viables connue de l'homme du métier convient aux fins de l'invention. Il s'agira donc de méthode ne mettant pas en œuvre de fixation ou de perméabilisation des CTCs/DTCs afin de conserver leur fonctionnalité (Alix-Panabières et Pantel, Expert Rev Mol Diagn. 2015;15(1 1 ):141 1 -7).
Les cellules obtenues après l'étape d'enrichissement peuvent être également identifiées comme étant tumorales dans les gouttes. Selon un mode de réalisation, les cellules enrichies sont marquées avec un anticorps marqué (notamment par fluorescence) dirigé contre un ou des marqueurs de surface de cellule tumorale. Les cellules tumorales deviennent alors marquées, notamment par fluorescence, à leur membrane. A titre d'exemple, les cellules peuvent être marquées avec (1 ) un anticorps fluorescent anti- EpCAM et/ou un anticorps fluorescent anti-E-Cadhérine pour détecter l'expression d'EpCAM et/ou d'E-Cadhérine à la surface des cellules afin d'identifier toute cellule épithéliale, et/ou (2) un anticorps fluorescent anti-PSMA (Prostate spécifie membrane antigen) afin d'identifier des cellules tumorales de la prostate, et/ou (3) un anticorps fluorescent anti-N-Cadhérine afin d'identifier des cellules mésenchymateuses qui auraient subi une transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT), et/ou (4) un anticorps anti- plastine 3 qui cible un nouveau marqueur, la plastine 3, qui n'est pas sous-exprimé lors de ΙΈΜΤ et qui permet la détection des cellules tumorales épithéliales et mésenchymales, Cette étape qui précède l'encapsulation des cellules de l'échantillon et permet de déterminer le phénotype des CTCs ou DTCs.
La présente invention est particulièrement avantageuse car le nombre de gouttes n'est en théorie pas limité et peut atteindre en pratique, par exemple, jusqu'à 100 000 et même jusqu'à 1 000 000 gouttes. Il est ainsi possible d'avoir des gouttes ne comprenant pas de cellules ou des cellules non enrichies. Si la cellule encapsulée n'est pas tumorale, le signal sera différent et la goutte pourra être écartée. Le système permet ainsi d'affiner la purification. Il est donc adapté pour travailler à partir d'échantillons biologiques peu enrichis en CTCs.
Ceci est particulièrement avantageux pour détecter des cellules tumorales rares dans le sang, telles que les CTCs.
Exemples :
Des exemples de mise en œuvre du procédé vont maintenant être décrits.
Le protocole des exemples suivants comprend :
la préparation de plusieurs solutions aqueuses, contenant les particules 12, l'entité de signalisation 34 et l'élément cible ou une cellule susceptible de le sécréter, le relarguer ou le cliver dans la goutte,
- l'injection des solutions aqueuses en entrée d'une puce de génération de gouttes,
la génération de gouttes comprenant tous les réactifs de l'essai - l'incubation de la solution contenant les gouttes,
l'injection des gouttes dans un appareil selon l'invention (les exemples 1 et 2 correspondent respectivement au premier appareil 1 ou au deuxième appareil 60),
la mesure des résultats de l'essai
éventuellement un tri des gouttes en fonction de la mesure.
Exemple 1 : dispositif de génération de gouttes et de mesure des gouttes de type 1
La production des gouttes, autrement appelée compartimentation est réalisée après avoir mélangé une solution de réactifs et une solution d'échantillon sur puce.
Les solutions sont gardées sur la glace jusqu'à la compartimentation afin d'éviter toute dégradation des réactifs et échantillons.
La solution de réactifs est aspirée dans un réservoir connecté à une seringue Hamilton d'1 mL remplie d'huile minérale (Sigma Aldrich, #330760) juste avant le démarrage de la compartimentation.
Les échantillons à cribler sont mélangés à la solution de travail juste avant la compartimentation puis transférés dans une fiole en verre préalablement remplis d'huile fluorée (3M, NOVEC HFE-7500) et la fiole est maintenue à 4°C sur glace.
Des capillaires, avantageusement en PTFE de diamètre interne 0.3mm (vendu par Fischer, #1 1919445) permettent de relier la fiole et le réservoir de la solution de réactifs au dispositif de formation de gouttes. Ces deux solutions sont injectées sur une puce de formation de gouttes qui permet de générer des gouttes comprenant un volume égal de chacune des deux solutions.
Le volume des gouttes est choisi par l'utilisateur à partir du débit de l'huile fluorée. Avantageusement le volume des gouttes est de 33 picolitres. L'huile fluorée est le fluide porteur 8. Elle constitue la phase continue de l'émulsion comprenant les gouttes.
Les solutions de réactifs d'essais et d'échantillons à cribler sont injectées dans la puce au même débit, avantageusement à 200 microlitres/heure pour chaque solution. Le débit est imposé par un système standard de pompe de seringue par exemple une pompe neMESYS de Cetoni ou par une pompe contrôlant la pression par exemple le système commercialisé par Fluigent.
Les gouttes sont générées à une jonction de focalisation hydrodynamique telle qu'illustrée sur les figures 1 1 et 12. La phase externe est ici une huile fluorée (3M, NOVEC HFE-7500) à laquelle a été ajouté deux % poids/volume de tensioactifs (par exemple un copolymère tribloc comprenant deux queues perfluoropolyether (PFPE) (de poids moléculaire environ -6,000 g/mol) et une tête PEG (-600 gmol).
La figure 1 1 et la figure 12 représentent des dispositifs de flow-focusing permettant de mélanger un flux contenant les billes magnétiques mélangées aux autres réactifs et un flux contenant les échantillons avant la formation de gouttes au niveau de la jonction de focalisation hydrodynamique située à droite. Sur la figure 1 1 , les particules magnétiques mesurent 500 nm de diamètre et sur la figure 12 les particules magnétiques mesurent 200 nm de diamètre.
Une deuxième étape est l'étape de collection. Une fiole maintenue à 4° sous le champ magnétique, avantageusement généré par un aimant en anneau (Amazing magnet H250H-DM), permet la collection des gouttes. Un capillaire court permet de connecter la fiole à la puce. Dans l'idéal, le capillaire de sortie mesure moins de 20 cm, avantageusement 10 cm.
Les gouttes sont mises à incuber avantageusement à 37°C pendant 20 à 90 minutes et sous champs magnétique, le temps et la température d'incubation dépendant de l'analyse effectuée et du type d'entité productrice 90 et d'élément cible 37 étudiés.
A la suite de l'incubation, la fiole contenant l'émulsion est transférée à 4°C toujours maintenue sous champ magnétique.
Le premier type de dispositif est un dispositif suivant l'invention tel que décrit sur la Figure 1 .
La fiole contenant les gouttes est connectée à une puce pour une réinjection, la fiole est d'une part connectée à la puce et d'autre part à un système de pression, une pompe de pression ou une seringue et sa pompe, constituant l'ensemble de mise en circulation 22.
L'ensemble d'espacement 31 comprend deux entrées d'huiles connectées à la puce. Ces entrées sont destinées à injecter de l'huile avantageusement de l'huile fluorée permettant d'espacer les gouttes de l'émulsion telle qu'illustrée sur la figure 9.
Les débits de l'huile d'espacement sont avantageusement fixés chacun à 300 microlitres/heure ainsi que le débit de l'ensemble de mise en circulation est avantageusement fixé à 50 microlitres/heure et permettent d'ajuster le débit et la fréquence de réinjection de gouttes de façon à obtenir une fréquence comprise entre 250 et 1000 Hz.
Une paire d'aimants permanents 38 avantageusement fournie par K&J Magnetics, # BC 14-N52, est placée de part et d'autre de la puce autour du canal principal 24. Ces aimants 38 sont destinés à générer et à orienter les agrégats de billes pendant la réinjection des gouttes.
Un logiciel de contrôle de l'équipement, par exemple des lasers ou des photomultiplicateurs, est créé pour analyser et trier les gouttes. Le système de tri nécessite une carte FPGA pour réaliser une analyse en temps réel du signal.
La mesure est effectuée dans les gouttes une à une après leur passage dans l'ensemble d'espacement et ces gouttes peuvent être triées vers une sortie désirée après la zone de lecture illustrée sur la figure 10.
Lorsqu'un tri et une récupération sont désirés, les gouttes triées et les émulsions non triées sont recueillies sur glace et le contenu des gouttes est récupéré à partir de protocoles standards. Exemple 2 : dispositif de mesure de gouttes de type 2 (deuxième appareil 60)
Le deuxième type de dispositif de mesure est une chambre de stockage des gouttes produite dans un plan à 2 dimensions. Cet exemple présente deux alternatives possibles pour réaliser de telles chambres.
La première est une chambre fabriquée par microfabrication classique en PDMS, comprenant avantageusement des piliers positionnés de manière régulière pour éviter l'effondrement de la chambre telle qu'illustrée sur les figures 4 à 7.
La seconde est une chambre en verre selon l'invention PCT/FR2009/051396. Avantageusement, cette approche permet de réaliser une incubation des gouttes sur de longues durées (>1 H) sans déplacement des gouttes. Les gouttes peuvent donc être collectées directement dans une telle chambre après leur formation. Dans un exemple, le dispositif de mesure est un dispositif de lecture à deux dimensions , par exemple dans une chambre en verre. Le champ magnétique est généré par une paire d'aimants permanents 38 avantageusement fournie par K&J Magnetics, # BY042 , placée de part et d'autre de la chambre de stockage. Ces aimants 38 sont destinés à générer et à orienter les agrégats de billes dans des gouttes stockées dans la chambre.
Le signal fluorescent de l'entité de signalisation 34 relocalisé sur la ligne de billes magnétiques est mesuré par microscopie en épifluorescence. Exemple 3 : Quantification d'un marqueur tumoral dans un dispositif de mesure de type 1
Le but de cet exemple est de démontrer la quantification d'un marqueur tumoral.
Dans cet exemple, l'élément cible 37 est un marqueur tumoral et plus particulièrement un marqueur d'angiogénèse (le VEGF [vascular epithelial growth factor]) qui est déjà contenu dans la solution à cribler, cet exemple ne mettant pas en œuvre des cellules.
Dans cet exemple les gouttes mesurent 33 picolitres.
La préparation des gouttes comprend :
- la préparation de deux solutions aqueuses, appelées « solution de réactifs » contenant les particules 12, l'entité de signalisation 34 et « solution d'échantillon à cribler » contenant l'élément cible dans les exemples ci- dessous,
- l'injection des deux solutions aqueuses en entrée de la puce de génération de gouttes,
- la génération de gouttes comprenant un volume égale de chacune des deux solutions,
- la mesure des gouttes dans un dispositif de type 1 .
La Solution de réactifs contient :
- des particules 12 qui sont ici des particules magnétiques colloïdales, comme des particules conjuguées avec la steptavidine (par exemple des particules Ademtech streptavidin plus), qui sont fonctionnalisées avec un élément de capture 36, par exemple un anticorps spécifique du VEGF conjugé à la biotine (par exemple l'anticorps Ref 500- P10GBt, Peprotech). D'autres méthodes d'immobilisation sont possibles et sont connues de l'homme du métier, comme l'utilisation de particules carboxyle et 1 -éthyl-3-[3- (diméthylamino)propyl]carbodiimide (EDC), par exemple, - une entité de signalisation 34 qui est ici un anticorps contre VEGF fonctionnalisé avec une molécule fluorescente, comme le bevacizumab (fourni par le CHU de Montpellier) qui est fonctionnalisé avec un N-Hydroxysuccinimide (NHS ester) de l'Alexa Fluor 647 ou similaire. D'autres combinaisons de fluorophores ou méthodes de fonctionnalisation sont possibles ; et
- un colorant permettant la détection des gouttes 6, par exemple la sulforhodamine
B.
Ces réactifs sont dilués dans une solution appelée « solution de travail ». La solution de travail comprend :
- RPMI 1640 (Eurobio, Ref CM1 RPM00-01 ),
- L-Glutamine 200mM/100X (Eurobio, Ref CSTGLU00): 1 % final,
- Insulin-Transferin-Selenium (ITS) 100X (GIBCO, Ref 51300-044): 1 % final,
- Sérum de veau foetal décomplémenté 10% (Eurobio, Ref CVFSVF00-01 ),
- EGF Human (Epidermal Growth Factor) - Miltenyi (Ref 130093564): 20 ng/mL final,
- bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor) - Miltneyi (Ref 130097750): 10 ng/mL final,
- Antibiotiques (Pénicilline G à 10 000 UI/500 mL + Gentamicine à 1 mg/500 mL),
- 25 mM de tampon HEPES à ph 7,4,
0,1 % v/v Pluronic F-68 fourni par Life Technologies.
Les particules 12 colloïdales magnétiques sont traitées avant usage. Les particules 12 sont des particules fournies par Chemicell (ScreenMAG) ou Ademtech (Bio Adembeads) dans une solution de stockage. Avantageusement, la streptavidine (ou similaire) est déjà immobilisée sur les particules par les fournisseurs (comme les billes streptavidine plus de Ademtech). Elles sont retenues sur un support magnétique afin de supprimer la solution de stockage puis elles sont mises en suspension dans un excès de pluronic F- 127 à 10% poids/poids (ThermoFisher), avantageusement 10x le volume initiale de particules, et incubées pendant quinze minutes dans un bain d'ultra-son à 4°C.
Après ce traitement, les particules 12 colloïdales magnétiques sont lavées deux fois dans du PBS et mises en suspension dans la solution de travail. Dans cette solution, la version biotinylée de la molécule de capture est ajoutée en excès pour 1 heure (température ambiante).
Avantageusement, les particules 12 sont lavées deux fois et mises en suspension dans la solution de travail. Les réactifs fluorescents sont centrifugés pendant cinq minutes à au moins 12 000 g et à 4°C avant usage, afin de supprimer les traces d'agrégats de réactifs.
La solution d'échantillon à cribler comprend :
- un élément cible 37, ici VEGF, propre à être capturé par l'élément de capture 36 ; et
- la solution de travail.
La solution d'échantillon à cribler contient différentes concentrations de l'élément cible 37 (VEGF) (fournis par exemple par Genscript) dilués dans la solution du travail (cf ci-dessus).
Les concentrations de l'élément cible 37 (VEGF) dans la solution d'échantillon à cribler sont les suivantes : 0 nM, 5 nM, 20 nM ou 50 nM.
La solution de réactifs contient les réactifs suivants :
- 0.16 % p/v de particules magnétiques fonctionnalisées avec un élément de capture 36, ici un anticorps spécifique à VEGF décris ci-dessus,
- 50 n M de Γ entité de signalisation 34 appropriée, ici un autre anticorps spécifique à VEGF conjugué avec une molécule fluorescente,
- 1 μΜ de sulforhodamine B (pour le marquage des gouttes).
Cette solution est complétée de la solution du travail (cf ci-dessus).
Cela permet d'obtenir quatre émulsions différentes avec, respectivement 0 nM, 2,5 nM, 10 nM ou 25 nM d'élément cible 37 (VEGF).
Les gouttes sont ensuite analysées au moyen d'un dispositif de type 1 mesurant la fluorescence du fluorophore de l'entité de signalisation 34, comme le Alexafluor488 ou 647. Exemple 4 : Quantification de deux marqueurs tumoraux simultanément dans un dispositif de mesure de type 1
Le but de cet exemple est de démontrer la quantification de deux entités de signalisation (deux marqueurs tumoraux) simultanément. Cet exemple est similaire en tout point à l'exemple 3 à la différence que deux éléments cibles 37 distincts sont mesurés simultanément. Les deux entités cibles sont les marqueurs tumoraux VEGF et CK19 [Cytokératine 19].
La Solution de réactifs contient :
- des particules 12 qui sont ici des particules magnétiques colloïdales, fonctionnalisées avec deux éléments de capture 36, ici des anticorps spécifiques de VEGF (Ref 500-P10GBt, Peprotech) et des anticorps spécifiques de CK19 (KS19.2 de Progen) qui sont immobilisés sur les particules par une méthode appropriée, comme par le couple biotine-streptavidine,
- une première entité de signalisation 34 qui est ici un anticorps spécifique du VEGF marqué en fluorescence par un fluorophore approprié, comme une conjugaison de bevacizumab avec AlexaFluor647,
- une deuxième entité de signalisation 34 qui est ici un anticorps spécifique de CK19, comme le (KS19.1 de Progen), marqué en fluorescence par le fluorophore Alexa Fluor 488,
- un colorant permettant la détection des gouttes 6, tel que la sulforhodamine B, Ces réactifs sont dilués dans une solution appelée solution de travail identique à celle utilisée dans l'exemple 2.
La solution d'échantillon à cribler comprend :
- un premier élément cible 37, ici VEGF, propre à être capturé par le premier l'élément de capture 36,
- un deuxième élément cible 37, ici CK19, propre à être capturé par le deuxième élément de capture 36,
- la solution de travail.
La solution d'échantillon à cribler contient différentes concentrations du premier élément cible 37 (VEGF), par exemple fournis par Genscript, et du deuxième élément cible 37 (CK19), par exemple fournis par MyBioSource) dilués la solution du travail (cf ci- dessus).
Les concentrations du premier élément cible 37 (VEGF) dans la solution d'échantillon à cribler sont les suivantes : 0 nM, 2,5 nM, 10 nM ou 25 nM. Les concentrations du deuxième élément cible 37 (CK19) dans la solution d'échantillon à cribler sont les suivantes : 0 nM, 2,5 nM, 10 nM ou 25 nM. Au total 16 combinaisons de concentrations des deux éléments cibles sont préparées.
Les gouttes sont analysées au moyen d'un dispositif de type 1 mesurant simultanément la fluorescence des fluorophores, comme l'AlexaFluor488 et 647, sur les deux entités de signalisation 34.
Exemple 5 : Quantification d'un marqueur tumoral sécrété à l'échelle de la cellule unique dans un dispositif de mesure de type 1.
Le but de cet exemple est de démontrer la possibilité de détecter et quantifier un marqueur tumoral sécrété à l'échelle de la cellule unique. Cet exemple est similaire en tout point à l'exemple 3 à la différence que l'élément cible 37 (VEGF) est sécrété par une entité productrice 90 (une cellule) dans la goutte pendant une phase d'incubation. Les cellules sont soit une lignée CTC de cancer du colon (CTC-MCC-41 .4 obtenue au sein du laboratoire LCCRH), soit une population de cellules de patients atteints de cancer du colon enrichie en CTCs. Dans le deuxième cas, les CTCs sont enrichis avec le protocole des RosetteSep (procédure StemCell Technology) via une déplétion des leucocytes.
Le protocole d'enrichissement des CTCs par la technique des RosetteSep est la suivante :
- Transférer le sang (15 ml_) du tube EDTA dans un falcon 50 de ml_ ;
- Ajouter 20 μΙ de Rosette StemCell (Human circulating Epithelial Tumor Cell Enrichment - Ref 15167) par ml_ de sang total ;
- Mélanger et mettre à tourner lentement sur le MACS mix au minimum 20mn ;
- Dans un falcon, déposer le volume adéquat de Ficoll (Milieu de séparation des lymphocytes) en fonction du volume de sang selon les recommandations du fournisseur ;
- Diluer le sang au ½ avec du PBS 1 x/2%SVF ;
- Déposer la solution [sang+rosettes+PBS] délicatement à la surface du Ficoll et centrifuger 20 min à 1200g sans frein.
- Récupérer toute la partie supérieure du Ficoll avec l'anneau cellulaire (où se trouvent les cellules tumorales circulantes) ;
- Laver 2X avec du PBS/SVF 2% qsp 50ml.
Le culot cellulaire obtenu contient les cellules tumorales circulantes et est prêt à être utilisé pour l'EPISPOT à cellule unique selon l'invention.
La solution d'échantillon à cribler contient des cellules mises en suspension dans la solution de travail décrite dans l'exemple 3. Avantageusement, la concentration de cellules par goutte est de 0,3 cellule par goutte. Une émulsion avec des gouttes de 33 picolitres, comme ici, contient, plus de 30.106 gouttes par millitres. Pour avoir 0,3 cellule par goutte, il faut environ 18.106 cellules par millilitre dans la solution d'échantillon à cribler (qui est concentrée deux fois par rapport aux gouttes). Il convient de noter que la concentration en cellules dans la solution d'échantillon à cribler est deux fois plus importante que la concentration finale puisque les deux solutions aqueuses seront mixées dans une goutte avec un ratio 50/50.
Exemple 6: Quantification de deux marqueurs tumoraux simultanément sécrété à l'échelle de la cellule unique dans un dispositif de mesure de type 1.
Le but de cet exemple est de démontrer la possibilité de détecter et quantifier simultanément deux marqueurs tumoraux sécrétés à l'échelle de la cellule unique. Cet exemple est similaire en tout point à l'exemple 5 à la différence que deux éléments cibles 37 distincts, sont mesurés simultanément. Les deux éléments cibles sont les marqueurs tumoraux VEGF et CK19, qui sont mesurés comme dans l'exemple 4.
Exemple 7 : Tri de cellules en fonction d'un marqueur tumoral sécrété. Le but de cette expérience est de démontrer le criblage de cellules en fonction d'un marqueur tumoral sécrété. Cet exemple est similaire en tout point à l'exemple 5 à la différence que les gouttelettes avec un signal de fluorescence important correspondant à la fluorescence du fluorophore sur l'entité de signalisation 34 sont triées par « fluorescence activated dielectrophoresis » (FADS) tel que décrit dans Baret et al. (Lab Chip 2009, 9, 1850-1858). Les gouttes triées et recueillies sont brisées et les cellules sont récupérées tel que décrit dans Mazutis et al. (Nat. Prot. 2013, 8, 870-891 ).
Exemple 8 : Tri de cellules en fonction de deux marqueurs tumoraux sécrétés.
Le but de cette expérience est de démontrer le criblage de cellules en fonction de deux marqueurs tumoraux sécrétés. Cet exemple est similaire en tout point à l'exemple 7 à la différence que deux éléments cibles 37 distincts, sont mesurés simultanément. Les deux éléments cibles 37 sont les marqueurs tumoraux VEGF et CK19, qui sont mesurés comme dans l'exemple 4. Les gouttelettes avec un signal de fluorescence important correspondant à la fluorescence du fluorophore comme le Alexafluor488 sur la première entité de signalisation 34, et Alexafluor647sur la deuxième entité de signalisation 34 sont triées par « fluorescence activated dielectrophoresis » (FADS) tel que décrit dans Baret et al. (Lab Chip 2009 , 9, 1850-1858). Les gouttes triées et recueillies sont brisées et les cellules sont récupérées tel que décrit dans Mazutis et al. (Nat Prot 2013).
Exemple 9 : Quantification d'un marqueur tumoral dans un dispositif de mesure de type 2 (deuxième appareil 60)
Le but de cet exemple est de démontrer la quantification d'un marqueur tumoral dans un dispositif de type 2, c'est-à-dire une chambre dans laquelle les gouttes sont réparties en deux dimensions dans une couche unique. Cet exemple est similaire en tout point à l'exemple 3 à la différence que les gouttes mesurent 40 picolitres et sont analysées dans un dispositif de mesure de type 2. Une chambre de 38 μηι de hauteur est créée entre deux lames de verre. Une entrée et une sortie sont réalisées dans la lame de verre supérieur et munis chacun de connecteur standard pour y connecter les capillaires dé connexion. Exemple 10 : Quantification de deux marqueurs tumoraux simultanément dans un dispositif de mesure de type 2 (deuxième appareil 60)
Le but de cet exemple est de démontrer la quantification de deux entités de signalisation (deux marqueurs tumoraux) simultanément dans un dispositif de type 2, Cet exemple est similaire en tout point à l'exemple 4 à la différence que les gouttes mesurent 40 picolitres et sont analysées dans un dispositif de mesure de type 2, comme dans l'exemple 9.
Exemple 11 : Mesure cinétique et quantitative d'un marqueur tumoral sécrété à l'échelle de la cellule unique dans un dispositif de mesure de type 2 (deuxième appareil 60).
Le but de cet exemple est de démontrer la mesure cinétique et quantitative d'un marqueur tumoral sécrété à l'échelle de la cellule unique dans un dispositif de type 2. Cet exemple est similaire en tout point à l'exemple 5 à la différence que les gouttes mesurent 40 picolitres et sont analysées dans un dispositif de mesure de type 2, comme dans l'exemple 9. En mesurant l'évolution, à l'échelle de la cellule unique, du signal fluorescent de l'entité de signalisation 34 relocalisé sur la ligne de billes magnétiques le taux de sécrétion de l'élément cible 37 (le marqueur tumoral VEGF) est déterminé. Exemple 12 : Mesure cinétique et quantitative de deux marqueurs tumoraux simultanément sécrétés à l'échelle de la cellule unique dans un dispositif de mesure de type 2 (deuxième appareil 60).
Le but de cet exemple est de démontrer la mesure cinétique et quantitative simultanément de deux marqueurs tumoraux sécrétés à l'échelle de la cellule unique dans un dispositif de type 2, Cet exemple est similaire en tout point à l'exemple 6 à la différence que les gouttes mesurent 40 picolitres et sont analysées dans un dispositif de mesure de type 2, comme dans l'exemple 9 à la différence que deux éléments cibles 37 distincts, sont mesurés simultanément. Les deux entités cibles sont les marqueurs tumoraux VEGF et CK19, qui sont détectés comme dans l'exemple 10.
En mesurant l'évolution, à l'échelle de la cellule unique, les signaux fluorescents des deux entités de signalisation 34 relocalisés sur la ligne de billes magnétiques le taux de sécrétion des deux éléments cibles 37 (les marqueurs tumoraux VEGF et CK19) sont déterminés. Exemples de mise en œuvre
La figure 14 illustre la quantification d'un marqueur tumoral dans un dispositif de type 1 . Le graphique montre la valeur du pic d'intensité maximale obtenue pour le canal mesurant la fluorescence verte. Les gouttes comprennent des billes recouvertes avec un anticorps anti-PSA biotinylé. Les billes sont alignées pour former une colonne. Avec 25 nM de PSA, la fluorescence de l'anticorps secondaire anti-PSA est relocalisée sur la colonne de billes magnétiques, ce qui augmente la valeur du pic d'intensité (n=200,000). La barre d'erreurs montre la déviation standard. On effectue la même mesure pour des gouttes contenant des cellules LnCAP ayant été incubées pendant 1 heure à 37 °C dans les gouttes. Les LnCAP sont des cellules issues d'une lignée cellulaire épithéliale dérivée à partir d'un carcinome de prostate humaine.
La figure 15 illustre un tri de gouttes dans un dispositif de type 1 . Ce graphique montre la possibilité de mesurer les cellules sécrétant la PSA dans un dispositif de type 1 . Trois différentes populations de gouttes peuvent être distinguées en raison de leurs codes de gouttes différents (représenté selon l'axe des abscisses, correspondant à la fluorescence du marqueur Sulforhodamine B). De gauche à droite, on observe l'émulsion de cellules à trier, le contrôle positif et le contrôle négatif. Dans le canal de fluorescence représenté en ordonné, la relocalisation de l'anti-PSA sur la colonne de billes est illustrée. Les gouttes comprises dans le rectangle noir sont des gouttes positives pour la sécrétion de PSA et contenant une cellule.
La figure 16 illustre un tri de gouttes dans un dispositif de type 1 . Ce graphique montre une fenêtre de sélection pour le tri de gouttes positive à l'EpCAM à partir d'une émulsion de gouttes contenant des cellules. Le chargement est d'environ 5%. Ceci montre une bonne corrélation entre la positivité EpCAM dans la fenêtre de sélection et le chargement en cellules. L'axe des ordonnées représente la valeur maximale mesurée au sein de la goutte (c'est-à-dire le pic correspondant à la cellule). L'axe des abscisses représente l'intégrale du signal sous le pic.
Les figures 17 à 20 illustrent un tri sur la base de deux critères dans un dispositif de type 1 . La figure 17 représente une fenêtre de sélection « gâte 5 »pour le tri des cellules positives à l'EpCAM. La figure 18 représente une fenêtre de sélection « gâte 6 » pour des cellules sécrétant PSA. Pour être sélectionnés, les deux critères doivent être sastisfaits, les gouttes sélectionnées correspondent aux gouttes dont les mesures dont dans les fenêtres « gâte 5 » et « gâte 6 ».
Les images des figures 19 et 20 représentent des gouttes triées avec succès selon deux critères : la sécrétion de PSA (figure 19), et l'expression d'EpCAM. (figure 20). Des gouttes vides (contrôle négatif) ont également été triées pour faciliter le transfert des gouttes d'intérêts dans la chambre de visualisation. En partant d'une émulsion avec 0,2% de gouttes d'intérêt, il est obtenu un enrichissement à 20% de gouttes d'intérêt. En comptant les gouttes contrôle négatif conservées pour le transfert des gouttes on obtient un transfert des gouttes efficace à environ 99%.
Les figure 21 à 23 illustrent une quantification d'un marqueur tumoral dans un dispositif de type 2. Les figures 21 (en champ clair) et 22 (dans un canal de fluorescence) montrent la sécrétion de PSA par des cellules LNCAP. Ces cellules sont incubées pendant une heure dans les gouttes et la sécrétion de PSA aboutit à la relocalisation de la fluorescence sur l'agrégat de particules en colonne.
La figure 23 illustre une courbe de calibration pour la quantification du PSA obtenue à partir du tableau de gouttes. La courbe présente une forme généralement observée pour les expériences d'immunoessais sans lavage. Après une phase d'augmentation brusque (jusqu' à 60nM) dans laquelle la protéine se lie aux billes, on observe une diminution de la relocalisation de fluorescence due à la saturation sur les billes et une augmentation de la concentration de PSA libre. Les données sont présentées en moyenne et erreur -type de la moyenne (SEM).
Nous avons réalisé cette courbe de calibration à partir de la forme soluble de la protéine de PSA, à différente concentration avec deux anticorps respectifs. Les concentrations des réactifs, billes et agents de détection sont ajustées pour que la capacité de PSA soit à environ 70nM. Le système est très sensible aux concentrations les plus faibles en dessous de 70nM. Nous avons déterminé que la limite de blanc (correspondant au plus fort signal attendue dans une goutte vide) est de 1 ,047. Il faut comparer cette valeur à la valeur moyenne de 1 ,031 obtenue pour une concentration de OnM. La limite de détection, c'est-à-dire la plus petite quantité distinguable du bruit de fond, est de 2,5 nM PSA, correspondant à seulement 60000 molécules. En incubant des cellules pendant une heure, on peut détecter toutes les cellules qui sécrètent plus de 16 molécules par secondes. En prolongeant le temps d'incubation à 2 heures, on peut diminuer cette limite aux cellules sécrétant 8 molécules par secondes, etc. Les taux de sécrétions rapportés dans la littérature pour d'autres molécules peuvent varier entre 10 et 10000 molécules par secondes selon le type cellulaire et la fraction sécrétée. Ceci montre que l'ordre de grandeur obtenu est satisfaisant.
En outre, la courbe de calibration montre une augmentation de signal à des concentrations plus élevées. Par exemple à environ 500nM de PSA le signal peut être significativement distingué du bruit de fond. Ceci est avantageux pour des développements d'expérience car même les cellules avec de très haut taux de sécrétion peuvent être détectées.
Les figure 24 et 25 illustrent une quantification d'un marqueur tumoral dans un dispositif de type 2. Les figures 24 (en champ clair) et 25 (dans un canal de fluorescence) représente la sécrétion de la protéine CK19 par une cellule SK-BR-3. SK-BR3 est une lignée cellulaire provenant d'une tumeur d'un cancer du sein humain.
CK19 est habituellement une protéine intégrée dans la membrane cellulaire. Cependant, elle peut être détachée et se relocaliser sur l'agrégat allongé.
Une lignée cellulaire épithéliale dérivée à partir d'un carcinome de prostate humaine (LnCAP) est utilisée pour les expériences afin d'observer la sécrétion cellulaire de PSA.
Nous avons trouvé que la température est un facteur important puisque la sécrétion de protéine a seulement pu être observée autour des températures physiologiques et pas à des températures inférieure telle que 25°C. Aux températures inférieures, les signaux relocalisés sur les cellules et non sur les particules, montrant que la PSA était liée à la membrane ou qu'un phénomène similaire avait lieu.
Nous avons en outre utilisé la cellule de la lignée LnCAP pour déterminer le pourcentage de sécrétion de PSA de ces cellules. En considérant la littérature et des expériences précédentes, nous savons que toutes les cellules ne vont pas produire en permanence de la PSA. L'idée de cette expérience est de prélever le pourcentage de cellules qui sécrètent de la PSA au sein de la population de LnCAP. Cette expérience est effectuée à 37°C et les signaux de sécrétions sont mesurés à 0, 30 et 60 minutes.
Le tableau suivant représente les conditions et résultats de l'expérience sur la sécrétion de PSA en utilisant des cellules LnCAP comme modèle.
Temps d'incubation à 37°C (min) 0 30 60
Nombre de gouttes 5860 6352 5745
Nombre de cellules 53 57 52
Relocalisation de fluorescence sur l'agrégat 0 16 27 allongé
Relocalisation de fluorescence sur les 19 1 1 6
cellules
Pas de relocalisation trouvée 34 30 19
% de cellules sécrétant le marqueur 0 27.9 52.25
% d'anticorps relocalisé sur les cellules 36 19.2 1 1 .6 A 0 minute, aucune relocalisation de fluorescence n'est trouvée au niveau de l'agrégat allongé. Cependant, nous avons remarqué que l'agent de détection était relocalisé sur la membrane de certaines cellules. Ce phénomène est sans doute lié aux conditions de culture et à une centrifugation à température ambiante. Nous avons fait le même constat pour les mesures à 30 minutes ou 60 minutes mais le nombre de cellules avec l'agent de détection relocalisé sur la membrane a diminué régulièrement tandis que le pourcentage de cellules sécrétant le marqueur augmente.
Ensuite, nous pouvons analyser le profil de sécrétion des cellules LnCAP encapsulée individuellement.
La figure 26 illustre la mesure de la cinétique d'un marqueur sécrété dans un dispositif de type 2 La figure 26 représente un profil de sécrétion de PSA pour des cellules LnCAP individuelles encapsulées dans des gouttes pendant une heure puis mesurées par intervalles de dix minutes.
Ici, nous montrons que le taux de sécrétion des cellules individuelles est varié, même si des distributions similaires ont été trouvées pour d'autres lignées cellulaires. Nous montrons également que la sécrétion suit plutôt une cinétique brusque qu'une libération régulière.
On observe que quelques cellules sécrètent plus de 800 molécules de PSA tandis que la majorité des cellules sécrète très peu de molécules de PSA (environs 10 molécules par cellules) ou aucune (ces cellules n'ont pas été représentées.
Pour simuler les détections de cellules tumorales circulantes (CTCs) dans le sang, nous avons mélangé des cellules LnCAP avec des cellules Jurkat. Les cellules Jurkat proviennent d'une lignée immortalisée de Lymphocite T humain. Les deux lignées cellulaires ont été mises en culture dans un milieu RPMI avec 10% de FBS et encapsulée dans des gouttes. Ces expériences montrent qu'on est en effet capable de détécter de faibles quantités de cellules. Nous avons réalisé l'expérience pour différentes concentrations de LnCAP dans les cellules Jurkat. Pour la détection, nous avons utilisé la taille de la cellule avec un marqueur de fluorescence.
Le tableau suivant présente dans les résultats de l'expérience.
Taux de Testé Nombre de Nombre de Nombre total de Dilution de (correspondants LnCAP LNCAP cellules
LnCAP dans les au taux de attendues trouvées
Jurkat dilution trouvé)
0.0001 0.0001 3 4 30284
0.001 0.001 31 32 31612
0.001 0.0004 8 4 8184 0.001 0.001 2 2 1701
0.01 0.0093 45 42 4498
0.1 0.07 198 138 1975
L'étude préliminaire montre que le minimum de détection de LnCAP peut être de
0.0001 .
Nous avons construit cette expérience pour détecter la PSA dans les gouttes et montrer que les cellules LnCAP sécrètent le PSA à un taux détectable. Les expériences montrent la sensibilité de détection dans des cellules mélangées artificiellement avec d'autres cellules.

Claims

REVENDICATIONS
1 .- Procédé de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales (90), comprenant:
- la fourniture d'une pluralité de gouttes (6) contenues dans un fluide porteur (8), au moins une des gouttes (6) comprenant au moins un agrégat (10) de particules (12) définissant un objet allongé selon un axe principal (X), au moins certaines gouttes (6) contenant une cellule (90) susceptible de produire au moins un élément cible du sécrétome d'une cellule tumorale propre à se fixer sur l'agrégat ;
- la mesure d'au moins un paramètre physique caractéristique de la fixation d'un élément cible (37) du sécrétome d'une cellule tumorale sur l'agrégat (10) ; et
- la détection et/ou la caractérisation de cellules tumorales (90) à partir de la mesure dudit au moins un paramètre physique.
2.- Procédé selon la revendication 1 , ledit procédé étant un procédé de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales uniques comprenant :
- la fourniture d'une pluralité de gouttes (6) contenues dans un fluide porteur (8), au moins une des gouttes (6) comprenant au moins un agrégat (10) de particules (12) définissant un objet allongé selon un axe principal (X), au moins certaines gouttes (6) contenant une cellule unique (90) ;
- l'incubation des gouttes (6) contenant une cellule unique (90) dans des conditions et pendant une durée suffisante pour que la cellule unique (90) soit susceptible de produire au moins un élément cible (37) du sécrétome d'une cellule tumorale, propre à se fixer sur l'agrégat (10) ;
- la mesure d'au moins un paramètre physique, chaque paramètre physique étant caractéristique de la fixation d'un élément cible (37) distinct du sécrétome d'une cellule tumorale sur l'agrégat (10) ; et
- la détection et/ou la caractérisation de cellules tumorales uniques (90) à partir de la mesure dudit au moins un paramètre physique.
3. - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la cellule (90) est issue d'un fluide biologique et est choisie dans le groupe constitué par une cellule tumorale circulante (CTC) et une cellule tumorale disséminée (DTC).
4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape de mesure comporte la mesure dudit au moins un paramètre physique localement en une pluralité de points situés dans la goutte (6), l'étape de mesure comportant de préférence la détermination de l'intégrale des valeurs mesurées au sein de la goutte (6).
5. - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape de mesure est effectuée dans une chambre microfluidique sans circulation des gouttes.
6. - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant :
- la fourniture d'un dispositif comprenant un ensemble de mise en circulation (22) de la goutte et une pluralité de zones de classement (94, 96), et un moyen de direction
(98) de la goutte ou d'une partie de la goutte sélectivement vers une zone de classement (94, 96),
- la décision de classement de la goutte (6) ou d'une partie de la goutte, la décision consistant à choisir sélectivement une zone de classement parmi la pluralité des zones de classement (94, 96),
- le transport de la goutte (6), respectivement d'une partie de la goutte, vers la zone de classement de la goutte (6) choisie lors de l'étape de décision.
7. - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel au moins une goutte comprend au moins deux entités de signalisation (34) distinctes, chacune des deux entités de signalisation (34) étant apte à former un complexe avec un élément cible distinct (37) sur l'agrégat (10), le procédé comprenant la mesure d'un signal indiquant la concentration de chacune des entités de signalisation (34) relocalisée.
8.- Procédé selon la revendication 7, dans lequel au moins certaines gouttes (6) comprennent une cellule tumorale susceptible de sécréter, cliver ou relarguer un ou plusieurs éléments du sécrétome de cellule tumorale, chaque éléments du sécrétome de cellule tumorale étant un élément cible distinct (37), la mesure du signal indiquant la concentration de chacune des entités de signalisation (34) relocalisées permettant une quantification du ou des éléments du sécrétome de cellule tumorale.
9.- Appareil de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales (90) comprenant :
- un ensemble de fourniture d'une pluralité de gouttes (6) contenues dans un fluide porteur (8), au moins une des gouttes (6) comprenant au moins un agrégat (10) de particules (12) définissant un objet allongé selon un axe principal (X), au moins certaines gouttes (6) contenant une cellule (90) tumorale susceptible de produire un élément cible (37) propre à se fixer sur l'agrégat (10),
caractérisé en ce que l'appareil comprend un ensemble de mesure d'un paramètre physique caractéristique de la fixation d'un élément cible (37) sur l'agrégat (10),
l'appareil comprenant éventuellement, en outre:
- un ensemble mise en circulation de la goutte (22),
- un ensemble de décision de classement de la goutte,
- un ensemble de tri de la goutte selon la décision de classement.
10.- Goutte de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales (90), comprenant une pluralité de particules propre à former un agrégat (10) de particules (12) définissant un objet allongé selon un axe principal (X), et une cellule tumorale (90) et éventuellement au moins un élément cible (37) du sécrétome de la cellule tumorale (90) propre à se fixer sur l'agrégat (10).
1 1 .- Procédé de préparation de gouttes (6) de détection et/ou de caractérisation de cellules tumorales comprenant :
- la dispersion, dans une masse de fluide (86) destinée à former des gouttes (6), de particules (12) propres à former un agrégat (10) définissant un objet allongé selon un axe principal (X), et d'une pluralité de cellules (90), au moins certaines cellules (90) étant des cellules tumorales susceptibles de produire un élément cible (37) du sécrétome d'une cellule tumorale, puis
- la dispersion de la masse de fluide (86) sous forme de gouttes (32), de sorte que chaque goutte comprenne une pluralité de particules (12) et qu'au moins certaines gouttes (6) comprennent, en outre, une cellule (90), et
- éventuellement la formation dans chaque goutte (6) d'au moins un agrégat (10) de particules (12) définissant un objet allongé selon un axe principal (X), l'agrégat (10) de particules (12) étant formé dans chaque goutte (6) après la dispersion.
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