WO2017207628A1 - Anticorps pour le traitement de cancers - Google Patents

Anticorps pour le traitement de cancers Download PDF

Info

Publication number
WO2017207628A1
WO2017207628A1 PCT/EP2017/063158 EP2017063158W WO2017207628A1 WO 2017207628 A1 WO2017207628 A1 WO 2017207628A1 EP 2017063158 W EP2017063158 W EP 2017063158W WO 2017207628 A1 WO2017207628 A1 WO 2017207628A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
region
mutation
particular embodiment
parent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2017/063158
Other languages
English (en)
Inventor
Céline MONNET
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LFB SA
Original Assignee
LFB SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LFB SA filed Critical LFB SA
Priority to CA3026145A priority Critical patent/CA3026145A1/fr
Priority to US16/305,832 priority patent/US20190218292A1/en
Priority to EP17728131.8A priority patent/EP3464359A1/fr
Publication of WO2017207628A1 publication Critical patent/WO2017207628A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to the immunotherapy of cancers. BACKGROUND OF THE INVENTION
  • Immunotherapy by administering exogenous antibodies to patients is nowadays widely used for the treatment of various pathologies, in particular cancers.
  • CTL4 Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Antigen 4 (CTLA4) (e.g., Ipilimumab -
  • Ipilimumab blocks the escape route of cancer cells by suppressing their T-cell blocking action via their CTLA4 receptor
  • PD1 the Programmed Death Cell 1
  • Nivolumab e.g., Nivolumab - Opdivo® Bristol Myers Squibb and Pembrolizumab - Keytruda® Merck.
  • This monoclonal antibody causes blocking of the PD1 receptor, an inhibitory immune control point present on T lymphocytes, and thus results in the activation of the immune response of said T lymphocyte.
  • Nivolumab blocks the pathway of immune escape of cancer cells by suppressing their T cell inhibition action via their stimulation of the PD-1 receptor.
  • Nivolumab appears to have anti-tumor activity in patients with metastatic renal cell carcinoma (Motzer et al., American Society of Clinical Oncology 33 (13): 1430-1437 (2014)); or
  • LAG3 lymphocyte Activation Gene 3 (e.g., BMS-986016).
  • LAG3 is an inhibitory immune control point present on T lymphocytes. It is today the target of development of inhibitors, in particular of monoclonal antibodies. In a manner similar to CTLA4 and PD1, the blocking of this receptor would thus make it possible to block its inhibitory effect on the response of the effector cells, and thus activate the immune response.
  • the present invention thus relates to an antibody, in particular an inhibitor, targeted against at least one immune control point, having a modified Fc region relative to that of a parent antibody.
  • an antibody is suitable for use in the treatment of cancer.
  • the antibody according to the invention has a modified affinity for at least one of the Fc receptors (FcR) relative to the parent Fc region.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one antibody according to the invention.
  • Said composition may be suitable for use in the treatment of cancers.
  • the antibody according to the invention has a prolonged half-life and / or a modified functional activity, in particular decreased.
  • FIG. 1 shows alignments of native human IgG1 sequences referring to positions 216 to 447 (according to the index UE) with the corresponding sequences of human IgG2 (SEQ ID NO: 7), human IgG3 (SEQ ID NO: 8) and human IgG4 (SEQ ID NO: 9).
  • the IgG1 sequences refer to the Glml allotype, 17 (SEQ ID NO: 6) and the Glm3 allotype (SEQ ID NO: 10).
  • the "lower hinge CH2-CH3" domain of IgG1 begins with cysteine 226 (see arrow). The CH2 domain is highlighted in gray and the CH3 domain is italicized.
  • Figure 2 shows the human FcRn binding (hFcRn) results on cells by various nivolumab mutants
  • Figure 3 shows the human CD16aV binding (hCD16aV) results on cells by various nivolumab mutants.
  • the present invention relates to an antibody raised against an immune control point, having a modified Fc region relative to that of a parent antibody.
  • the present invention relates to an antibody inhibitor of at least one immune control point, having a modified Fc region relative to that of a parent antibody.
  • antibody is meant a tetramer made of two heavy chains of 50-70 kDa each (called H chains for Heavy) and two light chains of about 25 kDa each (called chains L for Light) linked by bridges. intra and interchain disulfides and identical to each other.
  • This tetramer comprises at least two variable regions at the N-terminal end of each chain (called VL for the light chains and VH for the heavy chains) and a constant region at the C-terminal end, consisting of a single domain called CL. for the light chain and three or four domains for the heavy chain called CH1, CH2, CH3 and possibly CH4.
  • Each domain comprises about 110 amino acids and is structurally comparable.
  • the 2 heavy chains are linked by disulfide bridges at CH2 and each heavy chain is linked to a light chain by a disulphide bridge between CH1 and CL.
  • the region that determines the specificity of the antibody for the antigen is carried by the variable parts, it is these parts that are responsible for the recognition of the antigen.
  • three loops are pooled to form an antigen binding site. Each of the loops is called a Region Determining Complementarity (or CDR).
  • CDR Region Determining Complementarity
  • the constant parts of the heavy chains that form the Fc region they can bind to the Fc (FcR) receptors of effector cells or molecules such as complement proteins to induce different functional properties.
  • the assembly of chains compound an antibody allows to define a characteristic three-dimensional structure in Y, where
  • the base of Y corresponds to the constant region Fc, or Fc fragment: it is recognized by complement proteins and Fc receptors in order to mediate the effector functions of the antibody, and
  • the ends of the Y arms correspond to the respective assembly of the variable region of a light chain and the variable region of a heavy chain, said ends constituting the Fab region and determining the specificity of the antibody for the antigen .
  • the light chain group includes two subtypes, lambda and kappa.
  • the kappa and lambda light chains are shared by all classes and subclasses. In humans, the proportion of kappa and lambda produced is in a ratio of 2 to 1.
  • IgG is the most abundant immunoglobulin circulating antibody in serum (75-80%). They are present as monomers and have a half-life of 21 days (higher than other immunoglobulins).
  • IgG1 for gamma
  • IgG2 for gamma2
  • IgG3 for gamma3
  • IgG4 for gamma4
  • the four subclasses of human IgG are also distinguished in their biological activity, despite very homologous structures (more than 95% of sequence homology for Fc regions).
  • Antibodies include, but are not limited to, full-length immunoglobulins, monoclonal antibodies, multi-specific antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and fully human antibodies.
  • Fc or "Fc region” or “Fc fragment” refers to the constant region of the heavy chain of an antibody excluding the first immunoglobulin constant region (CH1) domain.
  • Fc refers to the last two domains (CH2 and CH3) of IgG constant region, and to the flexible N-terminal hinge of these domains.
  • the Fc region comprises the CH2 and CH3 domains as well as the lower hinge region between CH1 and CH2.
  • the Fc region corresponds to the residue C226 to its carboxy terminal end, ie the residues of position 226 to 447, where the numbering is according to the EU index or equivalent in Kabat.
  • Analogous domains for other IgG subclasses can be determined from the alignment of the heavy chain or heavy chain amino acid sequences of the IgG subclasses with it of an IgG1 human (see Figure 1).
  • the Fc region used may further comprise a portion of the upper hinge region located between positions 216-226 according to the EU index or equivalent in Kabat; in this case, the Fc region used corresponds to the residues of heading 216 to 447, 217 to 447, 218 to 447, 219 to 447, 220 to 447, 221 to 447, 222 to 447, 223 to 447, 224 to 447 or 225 to 447, where the numbering is according to the EU index or equivalent in Kabat.
  • the Fc region used corresponds to the residues of position 216 to 447, where the numbering is according to the EU index or equivalent in Kabat.
  • the Fc region used is chosen from the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 and 5.
  • the Fc region of the parent antibody is an IgG1.
  • the Fc region of the parent antibody has the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the sequences represented in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 and 5 are free of an N-terminal hinge region.
  • sequences represented in SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 and 10 respectively correspond to the sequences represented in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 and 5 with their N-terminal hinge regions.
  • the Fc region of the parent antibody is selected from SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 and 10.
  • the Fc region of the parent antibody has a sequence corresponding to positions 1-232, 2-232, 3-232, 4-232, 5-232, 6-232, 7-232, 8-232, 9 -232, 10-232 or 11-232 of the sequence SEQ ID NO: 6.
  • the Fc region of the parent antibody is IgG4.
  • the Fc region of the parent antibody has the sequence SEQ ID NO: 4 or 9.
  • the Fc region of the parent antibody is a mutated IgG4 at position 228, preferably comprising the S228P mutation.
  • the Fc region of the parent antibody has the sequence SEQ ID NO: 4 or 9, more preferably comprising the S228P mutation.
  • position is meant a position in the amino acid sequence. For the Fc region, the positions are numbered according to the EU index or equivalent in Kabat.
  • amino acid or “residue” is meant one of the 20 naturally occurring amino acids or natural analogues.
  • amino acid or “residue” is meant one of the 20 naturally occurring amino acids or natural analogues.
  • activating receptor is meant, in the present invention, a surface receptor which, after interaction with its ligand, causes the triggering of a signaling pathway leading to the activation of the immune response.
  • the activator immune control point is preferably selected from GITR and OX40.
  • the target immune control point of the antibodies according to the invention is an inhibitory receptor for immune effector cells.
  • inhibitory receptor is meant, in the present invention, a surface receptor which, after interaction with its ligand, causes the triggering of a signaling pathway leading to the inactivation of the immune response.
  • the inhibitory immune control point is selected from PD1, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 and a2AR.
  • PD1, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 and a2AR are receptor inhibitors of immune effector cells.
  • the inhibitory immune control point is PD1.
  • the antibody according to the invention is an anti-PD1 comprising, as VH and VL, the sequences SEQ ID NO: 11 and 12 respectively, or else 13 and 14 respectively.
  • PDl Programmed Cell Death Factor 1
  • PD1 is an inhibitory receptor of the CD28 family expressed on the surface of activated T and B lymphocytes and Natural Killers. Its role is to limit the activity of effector cells in secondary lymphoid tissues or tumors, thus conferring on it a mechanism of important tumor resistance.
  • PD1 inhibits lymphocyte function when engaged with one of its ligands (PDL1 (or B7-H1 or CD274) and PDL2).
  • PDL1 is a molecule expressed on the surface of tumor cells and myeloid cells. In case of chronic exposure to the PDL1 ligand (for example in the case of cancers), the PD1-bearing lymphocytes at their surface are inhibited in their function, which then causes an anergy phenomenon.
  • Anti-PD1 antibodies are used in the treatment of cancers such as lung cancer, non-small cell lung cancer (NSCLC), mesothelioma, bladder cancer, colorectal cancer, metastatic colorectal cancer , bladder cancers, breast cancers, head and neck cancers, testicular cancers, endometrial cancers, esophageal cancers, thymus cancers, hematological cancers, cancers of the advanced hematologic cancers such as non-Hodgkin lymphoma, Hodgkin lymphoma, chronic lymphoid leukemia, multiple melanomas, acute myeloid leukemias, brain tumors, glioblastomas, solid tumors, gastric adenocarcinomas, germ cell tumors , hepatocellular carcinoma, melanoma, metastatic melanoma, lymphoma, diffuse large B cell lymphoma (LDGCB), follicular lymphoma ularia, unresectable or metastatic melan
  • CTLA4 Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4
  • CTLA4 is an inhibitory receptor expressed only on the surface of T lymphocytes. Its role is to regulate the first stages of activation of T lymphocytes. Indeed, 48 hours after activation of T lymphocytes by via their receptor (TCR or T Cell Receptor), CTLA4 engages with its ligands (CD80 or CD86) which are expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs) at the level of the lymph nodes and sometimes tumors . This results in a signaling cascade leading to the inhibition of T lymphocytes.
  • the anti-CTLA4 antibodies are used in the treatment of cancers such as lung cancer, "non-small cell” lung cancers (NSCLC), carcinomas small cell lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, gastric cancer, kidney cancer, neck and head cancer, liver cancer, metastatic and non-metastatic melanoma resectable, cutaneous melanoma with lymph node involvement, renal carcinoma, myeloma, lymphoma, hepatocellular carcinoma, brain metastasis, solid tumors, mesothelioma, lymphoma or melanoma.
  • NSCLC non-small cell lung cancers
  • TIM3 T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3 is a surface-expressed receptor of ⁇ -IFN secretory T cells.
  • galectin-9 is a protein overexpressed in tumor cells.
  • the engagement of TIM3 with galectin-9 leads to an inhibition of the immune response.
  • LAG3 lymphocyte activation gene 3
  • CD223 is a molecule expressed on the surface of T lymphocytes. Its only known ligand is the Major Histocompatibility Complex type II (MHC II), which can be expressed by certain cancer cells but also by antigen presenting cells (APCs) (macrophages and dendritic cells) infiltrated at the level of tumors.
  • MHC II Major Histocompatibility Complex type II
  • APCs antigen presenting cells
  • KIR Killer-cell immunoglobulin-like receptor
  • BTLA1 B and T lymphocyte attenuator
  • CD272 T lymphocyte attenuator
  • HVEM herpesvirus entry mediator
  • A2AR are expressed in different types of effector cells of immunity, especially in T cells, as well as in endothelial cells.
  • a2AR binds to its ligand, adenosine (which accumulates in tumors), CD4 + cells express FOXP3 and thus differentiate into regulatory T cells, which has the effect of inhibiting the immune response.
  • inhibitory antibody is meant an antibody capable of binding to its target immune control point inhibitor to prevent binding to its endogenous ligand.
  • an inhibitory antibody of at least one inhibitory immune control point is capable of binding to said control point to neutralize it, and thus prevent its binding with its ligand and thereby block the inhibitory signaling pathways of the immune response resulting from this interaction.
  • activator antibody is meant an antibody capable of binding to its target immune control point activator and thus stimulate the signaling pathways activating the immune response resulting from this interaction.
  • activator antibody is also meant an antibody capable of binding to its target which is an endogenous inhibitory ligand of an activating immune control point expressed on the surface of the cancer cells.
  • parent antibody is used to define the reference antibody that may be of natural or synthetic origin.
  • the parent antibody comprises a Fc region called "parent Fc region”.
  • Said parent Fc region is selected from the group of wild-type Fc regions and their fragments.
  • wild type or WT is meant here an amino acid sequence or a nucleotide sequence found in nature, ie which is of natural origin, including allelic variations, and which is not It has not been intentionally modified by molecular biology techniques such as by mutagenesis.
  • wild-type Fc regions refer in particular to the Fc region of IgG1 having the sequence SEQ ID NO: 1 (Glml allotype, 17), the Fc region of IgG2 having the sequence SEQ ID NO: 2, the Fc region of IgG3 having the sequence SEQ ID NO: 3, the Fc region of IgG4 having the sequence SEQ ID NO: 4, and the Fc region of IgG1 having the sequence SEQ ID NO: 5 (Glm3 allotype ).
  • Wild type Fc regions also refer to the Fc regions corresponding to the sequences SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 10.
  • the parent antibody comprises a human Fc region, preferably a Fc region of a Human IgG1 or human IgG4.
  • the parent antibody may comprise pre-existing amino acid changes in the Fc region (e.g., a Fc mutant) relative to wild-type Fc regions.
  • immune effector cells is meant the subpopulation of effector cells that exert their functions by the Fc receptor (FcR) they express. Lymphocytes, monocytes, neutrophils, natural killer (NK) cells, eosinophils, basophils, mast cells, dendritic cells, Langerhans cells and platelets are considered to be effector cells.
  • FcR Fc receptor
  • the antibody according to the invention has a modified Fc region giving it a higher affinity for the FcRn receptor.
  • the FcRn receptor corresponding to the "neonatal Fc receptor” is a protein composed of a heavy chain encoded by the FcRn gene (called FCGRT in humans) and a light chain, the p2-microglobulin molecule. It can bind the Fc region of IgG and has for characteristic of increasing the half-life of the IgG that bind to it.
  • FcRn can be found in various organisms including, but not limited to, humans, mice, rats, rabbits and monkeys.
  • affinity is meant the fixing capacity between a ligand and its receptor.
  • the Fc regions used according to the invention have a modified affinity, advantageously increased, to the FcRn receptor. This increase in FcRn binding results in an improvement in serum retention in vivo and, therefore, an increase in half-life.
  • the antibodies according to the invention may be used alone or in combination, for example, several antibodies having different Fc regions may be administered in combination or co-administered.
  • the modified Fc region of the antibody according to the invention comprises at least one mutation with respect to the Fc region of a parent antibody.
  • the mutations concerned are not the natural variations that define the isotype of the immunoglobulin, but artificial mutations, the production process generating the Fc region carrying the desired mutation (s).
  • the invention relates to a composition comprising a single type of antibody comprising a mutated Fc region.
  • the composition then comprises antibody molecules of identical sequence.
  • mutation is meant a change of at least one amino acid of the sequence of a polypeptide, including a change of at least one amino acid in the Fc region of the parent antibody.
  • the antibody obtained then comprises a mutated Fc region relative to that of the parent antibody.
  • the mutation is a substitution, an insertion or a deletion of at least one amino acid at a particular position.
  • the mutated Fc regions may have several mutations, affecting several amino acids, preferably from two to ten.
  • substitution is meant the replacement of an amino acid by another amino acid at a particular position in a sequence of the parent antibody.
  • the 434S substitution refers to a variant (or mutant) antibody, in this case a variant for which an amino acid at position 434 is replaced by serine.
  • the following mutation label is used: "434S” or "N434S”, and means that the parent antibody comprises asparagine at position 434, which is replaced by serine in the variant.
  • the preferred format is "2591 / 315D / 434Y” or "V259I / N315D / N434Y".
  • deletion of amino acids or “deletion” is meant the deletion of an amino acid at a particular position in a sequence of the parent antibody.
  • E294del or 294del refers to the removal of glutamic acid at position 294.
  • amino acid insertion or “insertion” is meant the addition of an amino acid at a particular position in a sequence of the parent antibody.
  • insertion G> 235-236 designates a glycine insertion between positions 235 and 236.
  • EU index or equivalent in Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 1991.
  • EU index or equivalent in Kabat refers to the US numbering of residues of the human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 antibody. This is illustrated on the IMGT website (http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu IGHGnber.html).
  • the present invention relates to an antibody for which the modified Fc region has a higher affinity for the FcRn receptor relative to the Fc region of a parent antibody and comprises at least two mutations, said mutations being chosen from:
  • the present invention relates to an antibody whose Fc region comprises at least one combination of mutations selected from 226G / 315D / 434Y, 230S / 315D / 434Y, 230T / 315D / 434Y, 230T / 264E / 434S, 230T / 389T / 434S, 241L / 264E / 378V, 241L / 264E / 434S, 250A / 389K / 434Y, 2591 / 315D / 434Y, 284E / 378T / 396L, 264E / 378V / 434Y, 345D / 330V / 434Y, 315D / 382V / 434Y and 378V / 383N / 434Y with respect to the Fc region of said parent antibody, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat.
  • the present invention relates to an antibody whose Fc region comprises at least one mutation chosen from 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 2591, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 3081, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S and 439R relative to the Fc region
  • the present invention relates to an antibody whose Fc region comprises a combination of mutations selected from 307A / 315D / 330V / 382V / 389T / 434Y, 256N / 378V / 383N / 434Y, 315D / 330V / 361D / 378V / 434Y, 345D / 330V / 361D / 378V / 434Y, 2591 / 315D / 434Y, 230S / 315D / 428L / 434Y, 241L / 264E / 307P / 378V / 433R, 250A / 389K / 434Y, 305A / 315D / 330V / 395A / 343Y, 264E / 386R / 396L / 434S / 439R, 315D / 330V / 362R / 434Y,
  • the Fc regions carry a mutation selected from the group consisting of a mutation at amino acid 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400,
  • mutated Fc which have a high binding affinity for FcRn may comprise at least one amino acid change at one of said amino acid positions.
  • positions 230, 264, 307, 315, 330, 378 and 434 are preferred, more preferably positions 264, 315, 378 and 434.
  • At least two, even three, four, or five amino acid mutations can substantially enhance the binding affinity for FcRn compared to the parent Fc.
  • the mutations are:
  • At least one of positions 378 and 434 is mutated; and optionally at least one other selected from the group consisting of 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421 and 434.
  • the mutations are 226G, 226Y, 227S, 227L, 228R, 228L, 230S, 230T, 230L, 230A, 230Q, 231T, 231V, 233D, 234R, 239A, 241L, 241Y, 241R, 243L, 246R, 250A.
  • the Fc regions comprise at least one mutation selected from the group consisting of 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 2591, 264E, 265G, 267R, 290E.
  • the Fc regions carry a combination of mutations selected from 315D / 330V / 361D / 378V / 434Y, 230S / 315D / 428L / 434Y, 307A / 315D / 330V / 382V / 389T / 434Y, 2591 / 315D / 434Y and 256N / 378V / 383N / 434Y.
  • the Fc regions carry at least one mutation chosen from:
  • the mutants used are chosen from N315D / A330V / N361D / A378V / N434Y, P230S / N315D / M428L / N434Y, E294del / T307P / N434Y, T307A / N315D / A330V / E382V / N389T / N434Y, V259I / N315D / N434Y and
  • the mutants according to the invention are produced by a production method generating the Fc region carrying the desired mutation (s).
  • the inhibitory antibody of at least one immune control point according to the invention is obtained by a process comprising at least one step of mutagenesis of the Fc region of the parent antibody.
  • This mutagenesis can be random, as explained in paragraph 1 of Example 1.
  • Mutagenesis may also be site-directed mutagenesis.
  • the site-directed mutagenesis can be carried out according to the following protocol:
  • Each mutation of interest in the Fc fragment is inserted independently into an expression vector containing the anti-immune control point heavy chain (containing the variable portion of the anti-immune control point antibody, and the region constant portion Fc wild-type) by overlap PCR using two sets of primers adapted to integrate the targeted mutation (s) with the codon (s) encoding the desired amino acid.
  • the mutations to be inserted are close to the Fc sequence, they are added via the same oligonucleotide.
  • the fragments obtained by PCR are associated and the resulting fragment is amplified by PCR using standard protocols.
  • the PCR product containing the entire anti-immune control point heavy chain mutated on the Fc fragment, can be purified on 1% (w / v) agarose gel, digested with the appropriate restriction enzymes and cloned into the eukaryotic expression vector (such as the bicistronic HK-Gen EFSS vector) which also contains the unmodified light chain of the anti-immune control point antibody under consideration.
  • the eukaryotic expression vector such as the bicistronic HK-Gen EFSS vector
  • the mutations carried by the Fc region of the antibody according to the invention give it an increased half-life, and allow an improved efficiency of the blocking of the immune control points.
  • the present invention relates to an antibody having functional activity mediated by the modified Fc region, particularly decreased, relative to that of the parent antibody.
  • Functional activity mediated by the Fc region means the effector functions mediated by the Fc region. Included in said functional activities mediated by the Fc region are antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC), complement dependent cytotoxicity (CDC), antibody dependent cellular phagocytosis. (ADCP), endocytosis activity, secretion of cytokines or a combination of at least two of these activities.
  • ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • ADCP antibody dependent cellular phagocytosis.
  • endocytosis activity secretion of cytokines or a combination of at least two of these activities.
  • the functional activity mediated by the Fc region considered in the invention is selected from ADCC, CDC, ADCP and combinations of at least two of these activities. This functional activity can be evaluated by methods well known in the art.
  • the functional activity mediated by the Fc region is modified, in particular decreased relative to that of the parent antibody, by a ratio at least equal to 2, preferably greater than 5, preferably greater than 10, preferably greater than at 15, preferably greater than 20, preferably greater than 25, preferably greater than 30.
  • the antibody according to the invention which comprises a modified Fc region, is such that a mutation selected from 294Del, 293Del and 293del / 294del is introduced into the Fc region of the parent antibody, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat.
  • This deletion may be the only mutation of the Fc region, or be accompanied by other mutations, in particular among those listed in the present application.
  • the antibody according to the invention comprises an Fc region comprising a single mutation chosen from the deletion of the amino acid at position 294 (294Del), the deletion of the amino acid at position 293 (293Del), the double deletion of amino acids 293 and 294.
  • This single mutation leads to a particular glycosylation of the Fc region, namely a hypersialylation, particularly advantageous vis-à-vis the half-life of glycoproteins and inflammatory processes without altering FcRn binding and / or protein half-life.
  • the mutated Fc regions used in the invention carry the deletion of the amino acid at position 293 or 294, and also carry one or more mutations at positions selected from the following list: 226, 230, 241, 256, 259, 264, 307, 315, 330, 342, 361, 362, 378, 382, 383, 389, 396, 397, 421, 428 and / or 434.
  • a preferred gate region Fc the combination of mutations 307P, 434Y, in association with Del294 deletion.
  • the present invention relates to an antibody comprising a mutated Fc region having a functional activity mediated by the modified Fc region relative to that of a parent antibody, characterized in that said Fc region comprises at least one combination of 2 mutations, said combination being selected from: (i) a mutation selected from 307N, 326E, 326T, 334N, 334R, 352L, 378V, 378T, 394P, 396L, 397M and 421T; and
  • the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat and with the proviso that the mutation (i) does not take place on the same amino acid as the mutation (ii).
  • the mutated Fc regions comprise at least one combination of 3 mutations, said combination comprising:
  • the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat and with the proviso that the mutation (i) does not take place on the same amino acid as the mutation (ii).
  • the mutations carried by the Fc region of the modified antibody modulate its functional activity, thus making it possible to improve the effectiveness of the antibody described in the present invention.
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention has a modified affinity for at least one of the Fc region receptors (FcR) selected from the complement Clq and the receptors FcgRIIIa (CD16a), FcgRIIa (CD32a), and FcgRIIb ( CD32b).
  • the affinity of the mutated Fc region for the Clq complement, for the FcgRIIIa (CD16a) and FcgRIIa (CD32a) receptors is decreased, and the affinity of the mutated Fc region for FcgRIIb (CD32b) is increased.
  • modified affinity for at least one of the Fc region receptors (FcR) is meant the increase or decrease in the binding affinity, in vivo or in vitro, of the mutated Fc region of the invention for at least one of Clq, FcgRIIIa (CD16a), FcgRIIa (CD32a) and FcgRIIb (CD32b).
  • the Fc region receptors involved in the present invention are human receptors:
  • the FcgRIIIa receptor (CD 16a) which is involved in the ADCC and has a V / F polymorphism at position 158,
  • the FcgRIIa receptor (CD32a), which is involved in platelet activation and phagocytosis, has an H / R polymorphism at position 131, and
  • the affinity of an antibody for a FcR can be evaluated by methods well known in the art. For example, one skilled in the art can determine affinity (Kd) using surface plasmon resonance (SPR). Alternatively, one skilled in the art can perform an appropriate ELISA test. An appropriate ELISA assay compares the binding forces of the parent Fc and the mutated Fc. The detected signals specific for the mutated Fc and the parent Fc are compared.
  • the mutated Fc region of the antibody according to the invention has an increased affinity for the FcgRIIb receptor (CD32b), and comprises at least one combination of 2 mutations, said combination comprising: i) a mutation selected from 326E, 326T, 378V, 397M, 352L, 394P, 396L and 421T; and
  • the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat and with the proviso that the mutation (i) does not take place on the same amino acid as the mutation (ii).
  • said mutated Fc region comprises at least one combination of 3 mutations, said combination comprising:
  • said mutated Fc region comprises a combination of 4 mutations, said combination comprising at least one mutation (i), and at least 3 mutations (ii), and preferably a combination of 5 mutations, said combination comprising at least one mutation (i), and at least 4 mutations (ii).
  • the mutations carried by the Fc region of the modified antibody increase its affinity for the FcgRIIb inhibitory receptor (CD32b) and reduce its affinity for the Clq, FcgRIIIa (CD16a) and FcgRIIa (CD32a) receptors, thus making it possible to reduce its activity. functional.
  • This thus makes it possible to improve its efficiency with respect to the immune control points and to reduce a possible toxic effect of lysis of the effector cells of the immune system recognized by the antibodies of the invention.
  • the present invention relates preferentially to an antibody for which the parent antibody comprises a parent Fc region which is a human Fc region, preferably an Fc region of a human IgG1 or a human IgG2 or a human IgG4.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising (i) at least one antibody, and (ii) at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • composition a composition having curative or preventive properties with regard to human or animal diseases.
  • the pharmaceutical composition comprises a single antibody.
  • a single antibody is meant the presence of a set of antibodies all directed against the same target and having exactly the same structure at the Fc region.
  • the pharmaceutical composition comprises two combined antibodies directed against different receptors.
  • an antibody directed against CTLA4 is combined with an antibody directed against PD1.
  • an antibody directed against CTLA4 is combined with an antibody against TIM3.
  • an anti-CTLA4 antibody is combined with an antibody against LAG3.
  • an antibody directed against CTLA4 is combined with an antibody directed against KIR.
  • an antibody directed against CTLA4 is combined with an antibody directed against BTLA1.
  • an antibody directed against CTLA4 is combined with an antibody directed against a2AR.
  • an antibody against PD1 is combined with an antibody against TIM3.
  • an antibody against PD1 is combined with an antibody against LAG3.
  • an antibody against PD1 is combined with an antibody against KIR.
  • an antibody against PD1 is combined with an antibody against BTLA1.
  • an antibody against PD1 is combined with a antibody directed against a2AR.
  • an antibody against TIM3 is combined with an antibody against LAG3.
  • an antibody against TIM3 is combined with an antibody against KIR.
  • an antibody against TEVI3 is combined with an antibody against BTLA1.
  • an antibody against TIM3 is combined with an antibody directed against a2AR.
  • an antibody against LAG3 is combined with an antibody against KIR.
  • an antibody against LAG3 is combined with an antibody against BTLA1. In another particular embodiment, an antibody against LAG3 is combined with an antibody directed against a2AR. In another particular embodiment, an antibody to KIR is combined with an antibody against BTLA1. In another particular embodiment, an antibody directed against KIR is combined with an antibody directed against a2AR. In another particular embodiment, an antibody directed against a2AR is combined with an antibody directed against BTLA1.
  • any route of administration is contemplated, including parenteral routes, such as the intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, topical, or mucosal route, for example by inhalation. Enteral (oral, rectal) and intrathecal routes are also possible. Preferably, the intravenous route is used.
  • the antibodies according to the invention are generally formulated in pharmaceutical compositions comprising pharmaceutically acceptable excipients.
  • compositions may be in any suitable dosage form depending on the chosen route of administration.
  • compositions useful according to the invention advantageously comprise one or more excipients or vehicles, which are pharmaceutically acceptable.
  • excipients or vehicles for example, saline, physiological, isotonic, buffered, etc., solutions compatible with a pharmaceutical use and known to those skilled in the art may be mentioned.
  • the compositions may contain one or more agents or vehicles selected from dispersants, solubilizers, stabilizers, preservatives, etc.
  • Agents or vehicles that can be used in formulations include methylcellulose, hydroxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, polysorbate 80, mannitol, gelatin, lactose, vegetable oils, and the like. acacia, etc.
  • the compositions can be possibly formulated with dosage forms or devices providing sustained and / or delayed release. For this type of formulation, an agent such as cellulose, carbonates or starches is advantageously used. indications
  • the immune system normally recognizes tumor cells as foreign elements, which results in an anti-tumor immune response.
  • cancer cells put in place escape strategies to the immune system; they are no longer recognized or eliminated by the immune system.
  • the immune control points expressed on the surface of the effector cells of immunity constitute an important route of tumor escape. Indeed, these molecules when they are inhibitory (which is the case for PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, KIR, BTLA1 and a2AR), have the function of attenuating the immune response when they are engaged with their ligands which are often expressed by tumor cells.
  • the present invention relates more particularly to a pharmaceutical composition for its use in the treatment of cancers. More particularly, the targeted cancers use the tumor escape mechanism described above.
  • cancer any physiological condition characterized by abnormal cell proliferation.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is thus used to treat different types of cancer.
  • cancers include non-small cell lung cancer (NSCLC), unresectable or metastatic melanoma, advanced renal cell carcinoma, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, cancer lung cancer, lymphoma, mesothelioma, colorectal cancer, metastatic colorectal cancer, breast cancer, gastric cancer, head and neck cancer, brain tumors, glioblastoma, solid tumors, cancer endometrial cancer, esophageal cancer, gastric adenocarcinoma, germ cell tumors, testicular cancer, hepatocellular carcinoma, thymus cancer, diffuse large B-cell lymphoma (LDGCB), hematologic malignancies advanced hematologic malignancies (such as non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin lymphoma, chronic lymphocytic leukemias, multiple melanomas, acute myeloid leukemias), a
  • the optimized anti-PD1 antibody of the invention is used in the treatment of cancers.
  • a tumor antigen has already been presented to a lymphocyte via an antigen presenting agent (APC)
  • APC antigen presenting agent
  • said lymphocyte acquires the memory of the antigen.
  • the memory lymphocyte subsequently encounters the tumor antigen in a lymph node metastasis, its activation is inhibited by the commitment of PD1 (expressed on the surface of the lymphocytes) with PDL1 (expressed on the surface of the tumor cells).
  • PDL1 antigen presenting agent
  • the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of lung cancers.
  • the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC).
  • the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of unresectable or metastatic melanomas.
  • the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of advanced renal cell carcinomas.
  • the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of bladder cancers.
  • the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of lymphomas.
  • the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of mesotheliomas.
  • the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of colorectal cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of cancers metastatic colorectal. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of breast cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of gastric cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of cancers of the head and neck. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of brain tumors. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of glioblastomas.
  • the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of solid tumors. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of endometrial cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of cancers of the esophagus. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of germ cell tumors. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of testicular cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of hepatocellular carcinomas. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of melanomas.
  • the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of thymic cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of diffuse large B-cell lymphoma (LDGCB). In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of hematological cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of advanced hematologic cancers such as non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin lymphoma, chronic lymphoid leukemia, multiple melanoma, acute myeloid leukemia. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of follicular lymphomas.
  • LGCB diffuse large B-cell lymphoma
  • the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of astrocytomas. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of uveal melanomas. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of solid sarcomas. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of cancers of the ovarian epithelium. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of primary peritoneal cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of cancers of the fallopian tubes.
  • the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of cancers of the cervix. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of cancers of the anus. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of ovarian cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of urogenital cancer. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of urothelial cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of genitourinary cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of urogenital neoplasms.
  • the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of thoracic tumors. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of adrenocortical carcinoma. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of biliary cancer. In a particular embodiment, the optimized anti-PD1 antibody is used in the treatment of fibrosarcomas.
  • the optimized anti-CTLA4 antibody of the invention is used in the treatment of cancers.
  • the function of the CTLA4 receptor is to inactivate lymphocytes after presentation of their antigen by Antigen Presenting Cells (APCs) to modulate the immune response.
  • APCs Antigen Presenting Cells
  • cancer cell antigens are delivered by APCs into the lymph node and presented to circulating naive lymphocytes.
  • the naive lymphocyte encounters the antigen in the T-dependent ganglion zone, it is activated and then secretes cytokines while acquiring antigen memory.
  • CTLA4 appears on the surface of the lymphocyte 24 to 48 hours after the encounter with the tumor antigen.
  • the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of metastatic or unresectable melanomas. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of melanomas. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of renal cell carcinoma. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of non-small cell lung carcinomas. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of lung cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of myelomas. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of lymphomas.
  • the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of hepatocellular carcinomas. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of breast cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of pancreatic cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of prostate cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of brain metastases. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of solid tumors. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of gastric cancers.
  • the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of kidney cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of cancers of the neck and head. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of liver cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of brain cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of acute myeloid leukemias. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of chronic lymphoid leukemias. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of cervical adenocarcinoma.
  • the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of Hodgkin lymphoma. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of non-Hodgkin's lymphoma. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of gastrointestinal stromal tumors. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of metastatic brain cancers. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of ovarian cancer. In a particular embodiment, the anti-CTLA4 antibody Optimized is used in the treatment of follicular lymphomas.
  • the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of carcinomas of Merkel cells. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of uveal melanomas. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of synovial sarcoma. In a particular embodiment, the optimized anti-CTLA4 antibody is used in the treatment of fibrosarcomas.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a combination of two antibodies.
  • the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of lung cancers.
  • the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of non-small cell lung cancers (NSCLC).
  • the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of renal carcinomas.
  • the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of melanomas.
  • the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of glioblastomas.
  • the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of gliosarcomas. In another particular embodiment, the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of uveal melanoma. In another particular embodiment, the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of ovarian carcinomas. In another particular embodiment, the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of cancers of the fallopian tubes.
  • the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of primary peritoneal carcinoma. In another particular embodiment, the composition comprising the antibody optimized anti-CTLA4 and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of solid tumors. In another particular embodiment, the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of breast cancer. In another particular embodiment, the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of non-Hodgkin's lymphomas. In another particular embodiment, the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of Hodgkin's lymphomas.
  • the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in multiple myeloma treatment.
  • the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of kidney cancers.
  • the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of hepatocellular carcinoma.
  • the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of metastatic or unresectable melanoma.
  • the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of sarcomas.
  • composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of prostate cancers. In another particular embodiment, the composition comprising the optimized anti-CTLA4 antibody and the combined anti-PD1 antibody is used in the treatment of bladder cancers.
  • an IgG4 isotype antibody of anti-PD1 specificity was produced with a non-mutated sequence of IgG4 Fc, such as the sequence SEQ ID NO: 9, to serve as a reference.
  • the human Fc gene coding for residues 226 to 447 (according to the EU index of Kabat and represented in FIG. 1) derived from the heavy chain of a human IgG1 is cloned in a suitable vector, such as the phagemid vector pMG58 according to standard protocols well known to those skilled in the art.
  • the Fc libraries are expressed using the Phage-display technique according to standard protocols, for use in the selection of Fc fragments.
  • the selection can be done according to the protocol detailed in the patent application WO 2010/106180, in particular by selection on FcRn in solid or liquid phase, and then the determination of the binding characteristics of the FcRn fragments can be carried out by ELISA.
  • Fc variants were prepared in an integer IgG1 format in the CHO cell line with anti-PD1 specificity.
  • the cell culture production and antibody purification steps were carried out according to standard techniques of the art, with a view to their characterization.
  • Table 1 IgG1 anti-PD1 mutants selected according to the method described in the application
  • the C6A66 mutant (E294del / T307P / N434Y) was produced as whole IgG1 in YB2 / 0 (ATCC, CRL-1662) with anti-PD1 specificity.
  • the cell culture production and antibody purification steps were carried out according to standard techniques of the art, with a view to their characterization.
  • the FcRn binding assays were performed according to the methods described in the application WO 2010/106180. Briefly, the pH6 binding of IgG1 or IgG4 to FcRn and PD1 ligand were measured by standard ELISA. For this Maxisorp immunoplates were coated with FcRn or PD1 antigens.
  • Human T cells are purified from PBMC using a CD4 + T cell enrichment column (such as that developed by R & D Systems). Each cell culture well contains 10 * 5 purified T cells and 10 * 4 allogeneic dendritic cells for a total volume of 200 ⁇ L ⁇ .
  • Anti-PD1 antibodies (C6A_78, T5A_74, C6A_66, parent IgG1, IgG4, as a reference) are added at different concentrations. Some wells are incubated with anti-CD3 antibodies (positive control) or with irrelevant antibodies (negative control). The cells are cultured for 5 days at 37 ° C. The 5 th day, medium ⁇ are taken from each well for measuring the amount of secreted cytokines.
  • IFN-gamma, TNF-alpha, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 and IL-12 cytokine levels are quantified by flow cytometry of Pearl Array (CBA) (BD Biosciences). The results indicate that treatments with anti-PD1 variants result in greater stimulation of cytokine secretion by cells compared to treatment with reference anti-PD1 IgG4, regardless of the cell production system used. 4) Anti-tumoral effect of anti-PD1 IgG1 on in vivo models
  • PD1 knock-in mice (such as those proposed by Isi Innovation), males and females aged 7 to 10 weeks divided into 6 groups, undergo subcutaneous injections of SA1 / N fibrosarcoma cells at a rate of 2 * 10 6. cells dissolved in 200 ⁇ L ⁇ of DMEM at day 0.
  • mice are treated with PBS (vehicle) or with 10 mg / kg of an irrelevant antibody (negative control), IgG4 anti-PD1 (reference) and with the different variants of anti-PDl IgG1 (C6A_78, T5A_74, C6A_66) at 200 ⁇ L ⁇ injection. These injections are performed intraperitoneally on days 1, 4, 8 and 11.
  • Each group contains 10 animals and the groups consist of: (i) a carrier group, (ii) an irrelevant antibody negative control, (iii) an anti-PD1 IgG4 reference group, (iv) a C6A_78 anti-PDl IgG1 group (v) a T5A_74 anti-PD1 IgG1 group, and (vi) a C6A_66 anti-PD1 IgG1 group.
  • the mice are observed twice a week to evaluate tumor growth for about 6 weeks.
  • the results indicate that, advantageously, the mutated anti-PD1 according to the invention lead to a tumor growth inhibition effect that persists longer than the parent anti-PD1s, but also that the reference anti-PD1 IgG4s. This effect can be observed with the mutated anti-PD1 IgG1 according to the invention produced in YB2 / 0 and with the mutated anti-PD1 IgG1 according to the invention produced in CHO.
  • the anti-CTLA4 IgG1 variants were obtained according to the method described in the application WO 2010/106180 which uses the MUTAGEN TM random mutagenesis method (WO 02/038756). Typically, this method includes the following steps:
  • the human Fc gene coding for residues 226 to 447 (according to the EU index of Kabat and represented in FIG. 1) derived from the heavy chain of a human IgG1 is cloned in a suitable vector, such as the phagemid vector pMG58 according to standard protocols well known to those skilled in the art.
  • a suitable vector such as the phagemid vector pMG58 according to standard protocols well known to those skilled in the art.
  • the Fc libraries are expressed using the Phage-display technique according to standard protocols, for use in the selection of Fc fragments.
  • the selection can be done according to the protocol detailed in the patent application WO 2010/106180, in particular by selection on FcRn in solid or liquid phase, and then the determination of the binding characteristics of the FcRn fragments can be carried out by ELISA.
  • the Fc variants were prepared in a full IgG1 format in the YB2 / 0 cell line (ATCC, CRL-1662) on the one hand, and in CHO on the other hand, with anti-CTLA4 specificity.
  • the cell culture production and antibody purification steps were carried out according to standard techniques of the art, with a view to their characterization.
  • the FcRn binding assays were performed according to the methods described in the application WO 2010/106180. Briefly, IgG1 binding to FcRn at pH 6 and CTLA4 ligand were measured by standard ELISA. For this Maxisorp immunoplates were coated with FcRn or CTLA4 antigens. Then, the anti-CTLA4, Del294 and C6_A66 anti-CTLA4 IgG1 solutions produced in CHO or YB2 / 0 were added to each well with a final concentration of 0 ⁇ g of IgG / ml and was contacted with anti-human goat IgG HRP F (ab ') 2 at the same concentration for 2 hours at room temperature.
  • the F (ab ') 2 aggregated IgG were then incubated with gentle shaking for 1 hour at 30 ° C on the ELISA plates saturated for FcRn and CTLA4. The plates are then revealed with TMB (Pierce) and the absorbances are read at 450 nm. The final results indicate that the FcRn binding of the Del294 mutant is not impaired and that of the C6A_66 mutant is increased, regardless of the cell production system used. The CTLA4 antigen binding of the two mutants was not impaired relative to a reference parental anti-CTLA4 IgG1 (Table 4).
  • Table 4 Results of characterization of FcRn and CTLA4 antigen binding of selected anti-CTLA4 IgG1 variants (++: increased FcRn binding compared to the parent anti-CTLA4 IgG1; CTLA4 antigen binding compared to the parent anti-CTLA4 IgG1)
  • NK cells are incubated with target eukaryotic cells expressing CTLA4, in the presence of different concentrations (0.005 to 5000 ng / ml) of anti-CTLA4-related IgG1 and anti-CTLA4 294del and C6A-66 IgG1 variants produced in YB2 / 0 or CHO.
  • the level of intracellular lactate dehydrogenase (LDH) released by the lysed target cells is measured.
  • Human NK cells were purified from peripheral blood of healthy volunteer donors by the negative depletion technique developed by Miltenyi.
  • the ADCC test involves the incubation of NK cells with target eukaryotic cells expressing the CTLA4 antigen, in the presence of different concentrations of anti-CTLA4 antibodies.
  • the cytotoxicity induced by the anti-CTLA4 antibodies was measured by quantifying in cell supernatants the intracellular LDH released by the lysed target cells. The results indicate that anti-CTLA4 IgG1 variants show decreased ADCC activity relative to the parental anti-CTLA4 IgG1 regardless of the cell production system used.
  • Cytokine IFN-gamma, TNF-alpha, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 and IL-12 levels were quantified by flow cytometry of Pearl Array (CBA) (BD Biosciences). The results indicate that treatments with anti-CTLA4 variants result in greater stimulation of cytokine secretion by cells compared to treatment with parent anti-CTLA4 IgG1, regardless of the cell production system used.
  • CTLA4 knock-in mice (such as those proposed by Oncolmmune, Inc.), male and female aged 7 to 10 weeks divided into 5 groups, undergo subcutaneous injections of SA1 / N fibrosarcoma cells at a rate of 2 * 10. 6 cells dissolved in 200 ⁇ L ⁇ of DMEM at day 0.
  • mice are treated with PBS (vehicle) or with 10 mg / kg of an irrelevant antibody (negative control), Anti-CTLA4 IgG1 parent (reference) and with the different IgG1 variants (294del, C6A_66) produced in CHO or YB2 / 0 at a rate of 200 ⁇ per injection. These injections are performed intraperitoneally on days 1, 4, 8 and 11.
  • Each group contains 10 animals and the groups consist of: (i) a vehicle group, (ii) an irrelevant negative control, (iii) a reference anti-CTLA4 IgG1 reference group; (iv) an anti-CTLA4 294del IgG1 group; and (v) an anti-CTLA4 C6A_66 IgG1 group.
  • the mice are observed twice a week to evaluate tumor growth for about 6 weeks. The results indicate that, advantageously, the anti-CTLA4 mutated according to the invention lead to an inhibition of tumor growth that persists longer than the anti-CTLA4 parents.
  • an IgG4 isotype antibody of anti-PD1 specificity was produced with a non-mutated sequence according to the invention of IgG4 Fc, such as the sequence SEQ ID NO: 9, to serve as a reference (IgG4_S228P). .
  • Fc variants were prepared in an integer IgG1 format in the CHO-S cell line with anti-PD1 specificity.
  • VH and VL sequences of nivolumab (SEQ ID NO: 11 and 12 respectively), or the VH and VL sequences of pembrolizumab (SEQ ID NO: 13 and 14 respectively) were used as variable portions.
  • Each mutation of interest in the Fc fragment was inserted independently into an expression vector containing the anti-PD1 heavy chain (containing the variable portion of the anti-PD1 antibody nivolumab and pembrolizumab, and the wild-type Fc region constant part).
  • -type by overlap PCR using two sets of primers adapted to integrate the targeted mutation (s) with the codon (s) encoding the desired amino acid.
  • the fragments thus obtained by PCR were combined and the resulting fragment was amplified by PCR using standard protocols.
  • the PCR product, containing the entire anti-PD1 heavy chain mutated on the Fc fragment was purified on 1% (w / v) agarose gel, digested with the appropriate restriction enzymes, and cloned into a vector.
  • eukaryotic expression which also contains the unmodified light chain of the anti-PD1 antibody under consideration.
  • the cell culture production and antibody purification steps were carried out according to standard techniques of the art, with a view to their characterization.
  • the anti-PD1 IgG4 variants were obtained by site-directed mutagenesis in the same manner as described above.
  • Human PD1 receptor binding (recombinant protein such as R & D System PD1-Fc ref 1086-PD) and human CD64 receptor (hCD64) (hFcyRI):
  • Maxisorp immunoplates are coated with the PD1 antigen (human, cynomolgus or murine monkey) in PBS (10ng, 10ng, 20ng per well respectively) or the human CD64 receptor (100ng / well) overnight at 4 ° C ( ⁇ / well).
  • the parent anti-PD1 IgG1 or IgG4 solutions or each variant are added to each well at increasing concentrations (from 0.00625 to 0 ⁇ g / ml).
  • F (ab ') 2 of human goat anti-human CK IgG HRP for 1h at 37 ° C. The bound IgGs are detected after revelation at TMB by measuring the absorbance at 450 nm.
  • the results show that all nivolumab variants tested (IgG1_C6A_74Del294 nivolumab, IgG1_C6A_74 nivolumab and IgG4_S228P / C6A_74 nivolumab) and references (IgG1_WT and IgG4_S228P) recognize the PD1 human antigen and the PD1 cynomolgus monkey antigen, and do not recognize murine PD1 antigen.
  • pembrolizumab variants The results appear in tables 7a and 7b
  • Table 7a Binding of the different nivolumab mutants to human, murine or cynomolgus PD1 antigen
  • Table 7b Binding of the different pembrolizumab mutants to the human, murine or cynomolgus PD1 antigen
  • the IgG4 nivolumab (IgG4_S228P / C6A_74 nivolumab but also IgG1_C6A-74Del294 nivolumab) variants have a weak binding, whereas the latter is strong with IgG1_WT and IgG1_C6A_74 nivolumab.
  • Table 8a Binding of the different nivolumab mutants to hCD64
  • FcRn receptor binding (recombinant human FcRna protein and ⁇ 2-microglobulin):
  • Maxisorp immunoplates are coated with FcRn in pH6 phosphate buffer (250ng per well) overnight at 4 ° C ( ⁇ / well). After saturation of the plates for 2 hours in pH6 phosphate buffer and 5% skimmed milk, the solutions of parent anti-PD1 IgG1 or IgG4 or each variant are added to each well at increasing concentrations (from 0.00488 to 10 ⁇ g / ml). for 1h at 37 ° C and then contacted with F (ab ') 2 IgG HRP goat anti-human CK for 1h at 37 ° C. The bound IgGs are detected after revelation at TMB by measuring the absorbance at 450 nm.
  • IgG variants were tested for binding to several human Fc? Rs by ELISA.
  • Maxisorp immunoplates were coated with 50ng hCD32aH / well or 75ng hCD16aV / well in PBS.
  • Immobilizing nickel chelating plates (Hisgrab Pierce) were coated with 50ng hCD32aR / well or 100ng hCD32b / well in PBS. After coating overnight at 4 ° C, the plates were washed twice with PBS / 0.05 Tween-20 and saturated with PBS / 4 BSA for 2 hours at 37 ° C.
  • the supernatants were diluted in PBS to a final concentration of 1 ⁇ g IgG / ml and mixed with F (ab ') 2 IgG HRP goat anti-CK at the same concentration for 2 hours at ambient temperature.
  • the F (ab ') 2 aggregated IgGs are then incubated with gentle shaking for 1 hour at 30 ° C. on the saturated ELISA plates at different dilutions in PBS. Plates are then revealed with TMB (Pierce) and absorbance read at 450 nm.
  • Table 10a Binding of different nivolumab mutants to different human FcyRs
  • each animal received a single intravenous injection of 5 mg / kg IgG at the retro-orbital sinus, in a protocol similar to that previously described (Petkova SB, et al., Enhanced half-life of genetically engineered human IgGl antibodies in a humanized FcRn mouse model: potential application in humorally mediated autoimmune disease (Int Immunol 2006).
  • the half-life is calculated from the plasma concentrations measured during the elimination phase.
  • the half-life time can thus be obtained:
  • the MRT or the average residence time can be estimated. It reflects the duration of presence of the Fc polypeptide in the body.
  • the MRT can be obtained as follows:
  • AUC time 0 of the plasma concentration versus time curve
  • AUMC first order moment of the plasma concentration versus time curve.
  • Blood samples were taken from the retro-orbital sinus at multiple time points and IgGs titrated by ELISA.
  • results show, in each case, an increased half-life of the mutants IgG1_C64_74Del294 nivolumab and IgG4_S228P / C6A_74 nivolumab, relative to the respective references IgG1_WT and IgG4_S228P.
  • AUC area under the curve extrapolated to infinity
  • Vd volume of distribution
  • MRTinf mean residence time when the concentration profile is extrapolated to infinity 5) Characterization of cellular links to the human FcRn receptor, human CD64
  • hFcRn Human FcRn receptor binding
  • Roscan® Alexa R48 Roscan® Alexa R48
  • Jurkat-hFcRn Jurkat cells expressing the hFcRn receptor on their surface
  • Jurkat-hFcRn cells were incubated for 20 minutes at 4 ° C. with variable concentrations (500, 250, 125, 62, 31, 15, 8, 4, 2 and 0 ⁇ g / ml) of the antibodies of Tables 5 and 6.
  • variable concentrations 500, 250, 125, 62, 31, 15, 8, 4, 2 and 0 ⁇ g / ml
  • Human CD64 receptor binding was assessed on cells by a competition test using Rituxan labeled with Alexa 488 fluorochrome and Jurkat cells expressing the CD64 receptor on their surface (Jurkat-CD64).
  • Jurkat-CD64 cells were incubated for 20 minutes at 4 ° C. with varying concentrations (500, 250, 125, 62, 31, 15, 8, 4, 2 and 0 ⁇ g / ml) of the antibodies of Tables 5 and 6. diluted in PBS pH 7.4, simultaneously with Rituxan-A488 used at a fixed concentration.
  • Human hCD16aV receptor binding was assayed on cells by a competition test using Rituxan labeled with Alexa 488 fluorochrome and Jurkat cells expressing the hCD 16aV receptor on their surface (Jurkat-hCD 16aV).
  • Jurkat-hCD 16aV cells were incubated for 20 minutes at 4 ° C. with varying concentrations (500, 250, 125, 62, 31, 15, 8, 4, 2 and 0 ⁇ g / ml) of Tables 5 and 6 diluted in PBS pH 7.4, simultaneously with Rituxan-A488 used at a fixed concentration.
  • Figure 3 shows the binding results of the different nivolumab mutants to the hCDl ⁇ aV receptor.
  • Jurkat target cells expressing human PD1 on their surface were incubated with increasing concentrations of anti-PD1 antibodies (0 to 500 ng / ml) in the presence of Jurkat cells expressing the human CD16 receptor and acetate and phorbol myristate (PMA).
  • PMA phorbol myristate
  • the amount of IL-2 released by Jurkat CD16 cells was measured by colorimetry (R & D Systems DuoSet Kit IL-2).
  • the tests described make it possible to confirm the functional properties of the various IgG1 and IgG4 variants described in the context of the present application.
  • the described results confirm the advantageous properties of IgG mutants and IgG4 nivolumab and pembrolizumab having improved half-life in the body compared to the reference Ig, allowing an antitumor prolonged effect, and possessing Human Fcgamma receptor binding properties are advantageous for improved effector properties.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

La présente invention se rapporte à un anticorps inhibiteur d'au moins un point de contrôle immunitaire possédant une région Fc modifiée par rapport à celle de l'anticorps parent.

Description

Anticorps pour le traitement de cancers
La présente invention concerne l'immunothérapie de cancers. Arrière-plan technologique de l'invention :
L'immunothérapie par administration à des patients d'anticorps exogènes, est aujourd'hui largement utilisée pour le traitement de diverses pathologies, notamment des cancers.
Au cours des dernières années, les connaissances concernant la biologie et l'immunologie des cancers n'ont cessé d'évoluer. Il est désormais reconnu que le système immunitaire est impliqué dans les réponses anti-tumorales notamment par reconnaissance des cellules cancéreuses par les cellules immunitaires. Cette reconnaissance peut avoir pour conséquence un contrôle, voire une élimination tumorale. Cependant, les cellules effectrices de l'immunité possèdent à leur surface des récepteurs appelés points de contrôle immunitaires. Ces récepteurs ont pour rôle de moduler (inhiber ou activer) la réponse immunitaire notamment, pour maintenir la tolérance du soi. Il est à présent connu que les cellules cancéreuses empruntent ce mécanisme d'échappement pour résister au système immunitaire, notamment en exprimant à leur surface des ligands desdits récepteurs points de contrôle immunitaires qui entraîneront une inhibition de la réponse de la cellule effectrice immunitaire lors de leur reconnaissance par celle-ci (Pardoll et al., Nat. Rev. Cancer. 12 :252-264 (2012)). Une nouvelle approche de l'immunothérapie contre les cancers est alors née pour contre-attaquer ce phénomène d'échappement immunitaire en rétablissant la réponse immunitaire et donc le rejet tumoral. Ainsi, depuis quelques années, des anticorps dirigés contre ces points de contrôle immunitaires sont développés. Les principaux anticorps commercialisés ou en développement visent :
- le Cytotoxic T-Lymphocyte Associated antigen 4 (CTLA4) (e.g., Ipilimumab -
Yervoy® Bristol Myers Squibb). Cet anticorps monoclonal entraine le blocage du récepteur CTLA4, point de contrôle immunitaire inhibiteur présent sur les lymphocytes T, et a ainsi pour conséquence l'activation de la réponse immunitaire dudit lymphocyte T. En d'autres termes, Ipilimumab bloque la voie d'échappement immunitaire des cellules cancéreuses en supprimant leur action d'inhibition des lymphocytes T via leur stimulation du récepteur CTLA4. Une étude clinique a permis de mettre en évidence pour la première fois que des patients atteints de mélanomes métastatiques traités avec un anticorps anti-CTLA4 (Ipilimumab), voient leur durée de vie augmentée (Hodi et al., N Engl. J. Med., 363 :711-723 (2010) et 363 : 1290 (2010) (eratum) ; Robert et al., N Engl. J. Med.,364 :2517-2526 (2011)) ;
le Programmed Death Cell 1 (PD1) (e.g., Nivolumab - Opdivo® Bristol Myers Squibb et Pembrolizumab - Keytruda® Merck). Cet anticorps monoclonal entraine le blocage du récepteur PD1, point de contrôle immunitaire inhibiteur présent sur les lymphocytes T, et a ainsi pour conséquence l'activation de la réponse immunitaire dudit lymphocyte T. En d'autres termes, le Nivolumab bloque la voie d'échappement immunitaire des cellules cancéreuses en supprimant leur action d'inhibition des lymphocytes T via leur stimulation du récepteur PD-1. Le Nivolumab semble notamment présenter une activité anti-tumorale chez des patients dans le cas de carcinomes à cellules rénales métastatiques (Motzer et al., American Society of Clinical Oncology 33 (13) : 1430-1437 (2014)) ; ou
- le lymphocyte Activation Gene 3 (LAG3) (e.g., BMS-986016). LAG3 est un point de contrôle immunitaire inhibiteur présent sur les lymphocytes T. C'est aujourd'hui la cible de développement d'inhibiteurs, notamment d'anticorps monoclonaux. De façon similaire à CTLA4 et PD1, le blocage de ce récepteur permettrait ainsi de bloquer son effet inhibiteur de la réponse des cellules effectrices, et ainsi activer la réponse immunitaire.
Il existe aujourd'hui un besoin d'optimiser ces anticorps dirigés contre un point de contrôle immunitaire, ceci notamment pour obtenir un effet clinique plus efficace ou moins toxique. En particulier, il existe un besoin d'obtenir des anticorps présentant une demi- vie améliorée dans l'organisme permettant un effet prolongé anti-tumoral, en étant bien tolérés par l'organisme, et/ou possédant avantageusement des propriétés effectrices améliorées.
Résumé de l'invention :
La présente invention se rapporte ainsi à un anticorps, en particulier inhibiteur, ciblé contre au moins un point de contrôle immunitaire, possédant une région Fc modifiée par rapport à celle d'un anticorps parent. Un tel anticorps est adapté pour une utilisation dans le traitement d'un cancer. De préférence, l'anticorps selon l'invention a une affinité modifiée pour au moins un des récepteurs Fc (FcR) par rapport à la région Fc parente.
L'invention se rapporte également à une composition pharmaceutique comprenant au moins un anticorps selon l'invention. Ladite composition peut convenir pour une utilisation dans le traitement de cancers. De préférence, l'anticorps selon l'invention a une demi-vie prolongée et/ou une activité fonctionnelle modifiée, notamment diminuée.
Légende de la figure :
La figure 1 montre des alignements de séquences d'IgGl humaine natif se référant aux positions 216 à 447 (selon l'indice UE) avec les séquences correspondantes d'IgG2 humaine (SEQ ID NO: 7), IgG3 humaine (SEQ ID NO: 8) et IgG4 humaine (SEQ ID NO: 9). Les séquences d'IgGl se réfèrent à l'allotype Glml,17 (SEQ ID NO: 6) et à l'allotype Glm3 (SEQ ID NO: 10). Le domaine "charnière inférieure CH2-CH3" de IgGl commence à la cystéine 226 (voir flèche). Le domaine CH2 est surligné en gris et le domaine CH3 est en italique.
La figure 2 montre les résultats de liaison au FcRn humain (hFcRn) sur cellules par divers mutants nivolumab, et la figure 3 montre les résultats de liaison au CD16aV humain (hCD16aV) sur cellules par divers mutants nivolumab.
Les séquences sont les suivantes :
SEQ ID NO : Séquences
1 Fc d'IgGl G 1ml, 17 humain (résidus 226- 447 selon l'indice UE)
2 Fc d'IgG2 humain (résidus 226-447 selon l'index EU)
3 Fc d'IgG3 humain (résidus 226-447 selon l'index EU)
4 Fc d'IgG4 humain (résidus 226-447 selon l'index EU)
5 Fc d'IgGl Glm3 humain (résidus 226-447 selon l'index EU)
6 Fc d'IgGl G 1ml, 17 humain (résidus 216- 447 selon l'indice UE)
7 Fc d'IgG2 humain
8 Fc d'IgG3 humain
9 Fc d'IgG4 humain 10 Fc d'IgGl Glm3 humain
11 VH de nivolumab
12 VL de nivolumab
13 VH de pembrolizumab
14 VL de pembrolizumab
Description détaillée
Caractéristique des anticorps
La présente invention se rapporte à un anticorps dirigé contre un point de contrôle immunitaire, possédant une région Fc modifiée par rapport à celle d'un anticorps parent.
Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à un anticorps inhibiteur d'au moins un point de contrôle immunitaire, possédant une région Fc modifiée par rapport à celle d'un anticorps parent.
Par « anticorps » on entend un tétramère fait de deux chaînes lourdes de 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light) liées par des ponts disulfures intra et intercaténaires et identiques entre elles. Ce tétramère comprend au moins deux régions variables à l'extrémité N-terminale de chaque chaîne (dites VL pour les chaînes légères et VH pour les chaînes lourdes) et une région constante en extrémité C-terminale, constituée d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines pour la chaîne lourde appelés CH1, CH2, CH3 et éventuellement CH4.
Chaque domaine comprend environ 110 acides aminés et est structuré de manière comparable. Les 2 chaînes lourdes sont liées par des ponts disulfures au niveau des CH2 et chaque chaîne lourde est liée à une chaîne légère par un pont disulfure entre le CH1 et le CL. La région qui détermine la spécificité de l'anticorps pour l'antigène est portée par les parties variables, ce sont ces parties qui sont responsables de la reconnaissance de l'antigène. Dans chaque région variable, trois boucles sont rassemblées pour former un site de liaison à l'antigène. Chacune des boucles est appelée une Région Déterminant la Complémentarité (ou CDR). Quant aux parties constantes des chaînes lourdes qui forment la région Fc, elles peuvent se lier aux récepteurs Fc (FcR) des cellules effectrices ou des molécules comme les protéines du complément pour induire différentes propriétés fonctionnelles. L'assemblage des chaînes qui composent un anticorps permet de définir une structure tridimensionnelle caractéristique en Y, où
la base du Y correspond à la région constante Fc, ou fragment Fc : elle est reconnue par des protéines du complément et les récepteurs Fc afin de médier les fonctions effectrices de l'anticorps, et
les extrémités des bras du Y correspondent à l'assemblage respectif de la région variable d'une chaîne légère et de la région variable d'une chaîne lourde, lesdites extrémités constituant la région Fab et déterminant la spécificité de l'anticorps pour l'antigène.
Il existe cinq types de chaînes lourdes (alpha, gamma, delta, epsilon, mu), qui déterminent les classes d'immunoglobulines (IgA, IgG, IgD, IgE, IgM). Le groupe de la chaîne légère comprend deux sous-types, lambda et kappa. Les chaînes légères kappa et lambda sont partagées par toutes les classes et sous-classes. Chez l'homme, la proportion de kappa et lambda produite se situe dans un rapport de 2 pour 1.
Les IgG sont les immunoglobulines les plus abondantes des anticorps circulants dans le sérum (75-80%). Elles sont présentes sous forme de monomères et présentent une demi-vie de 21 jours (supérieure aux autres immunoglobulines).
Il existe quatre types de chaînes lourdes gamma, ce qui détermine quatre sous-classes d'IgG (IgGl pour gammal, IgG2 pour gamma2, IgG3 pour gamma3 et IgG4 pour gamma4). Ces quatre sous-classes diffèrent par des nombres et des positions variables des ponts disulfures
(Basic and Clinical Immunology, 8ème édition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G.
Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 et Chapitre 6).
Les quatre sous-classes des IgG humaines se distinguent également au niveau de leur activité biologique, malgré des structures très homologues (plus de 95% d' homologie de séquence pour les régions Fc).
Les anticorps comprennent notamment les immunoglobulines pleine longueur, les anticorps monoclonaux, les anticorps multi-spécifiques, les anticorps chimériques, les anticorps humanisés et les anticorps entièrement humains.
Le terme "Fc" ou "région Fc" ou "fragment Fc" désigne la région constante de la chaîne lourde d'un anticorps à l'exclusion du premier domaine de région constante d'immunoglobuline (CH1). Ainsi Fc fait référence aux deux derniers domaines (CH2 et CH3) de région constante d'IgG, et à la charnière flexible N-terminale de ces domaines. Pour une IgGl humaine, la région Fc comprend les domaines CH2 et CH3 ainsi que la région charnière inférieure entre CHl et CH2. Ainsi, la région Fc correspond au résidu C226 jusqu'à son extrémité carboxy-terminale, soit les résidus de la position 226 à 447, où la numérotation est selon l'index EU ou équivalent dans Kabat. Les domaines analogues pour d'autres sous- classes d'IgG peuvent être déterminés à partir de l'alignement des séquences d'acides aminés des chaînes lourdes ou des fragments de chaînes lourdes des sous-classes d'IgG avec elle d'une IgGl humaine (Cf. figure 1). La région Fc utilisée peut comprendre en outre une partie de la région charnière supérieure, située entre les positions 216 à 226 selon l'index EU ou équivalent dans Kabat ; dans ce cas, la région Fc utilisée correspond aux résidus de la position 216 à 447, 217 à 447, 218 à 447, 219 à 447, 220 à 447, 221 à 447, 222 à 447, 223 à 447, 224 à 447 ou 225 à 447, où la numérotation est selon l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence dans ce cas, la région Fc utilisée correspond aux résidus de la position 216 à 447, où la numérotation est selon l'index EU ou équivalent dans Kabat.
De préférence, la région Fc utilisée est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5. De préférence, la région Fc de l'anticorps parent est une IgGl. De préférence, la région Fc de l'anticorps parent a pour séquence SEQ ID NO : 1. Les séquences représentées en SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5 sont exemptes de région charnière en N-terminal.
Les séquences représentées en SEQ ID NO : 6, 7, 8, 9 et 10 correspondent respectivement aux séquences représentées en SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4 et 5 avec leurs régions charnières en N- terminal. Aussi, dans un mode de réalisation particulier, la région Fc de l'anticorps parent est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 6, 7, 8, 9 et 10.
De préférence, la région Fc de l'anticorps parent a une séquence correspondant aux positions 1-232, 2-232, 3-232, 4-232, 5-232, 6-232, 7-232, 8-232, 9-232, 10-232 ou 11-232 de la séquence SEQ ID NO : 6.
De préférence, alternativement, la région Fc de l'anticorps parent est une IgG4. De préférence, la région Fc de l'anticorps parent a pour séquence SEQ ID NO : 4 ou 9. Encore plus préférentiellement, la région Fc de l'anticorps parent est une IgG4 mutée en position 228, de préférence comprenant la mutation S228P. De préférence, la région Fc de l'anticorps parent a pour séquence SEQ ID NO : 4 ou 9, plus préférentiellement comprenant la mutation S228P.
Par « position » on entend une position dans la séquence d'acides aminés. Pour la région Fc, les positions sont numérotées selon l'indice de l'UE ou équivalent dans Kabat. Par « acide aminé » ou « résidu » on entend l'un des 20 acides aminés naturels ou des analogues naturels. Les termes « points de contrôle immunitaires » se réfèrent à des récepteurs situés en surface des cellules effectrices de l'immunité capables d'inhiber (points de contrôle immunitaires inhibiteurs) ou de stimuler la réponse immunitaire (points de contrôle immunitaires activateurs) après engagement avec leurs ligands. Par « récepteur activateur » on entend, dans la présente invention, un récepteur de surface qui, après interaction avec son ligand, entraîne le déclenchement d'une voie de signalisation conduisant à l'activation de la réponse immunitaire. Le point de contrôle immunitaire activateur est choisi de préférence parmi GITR et OX40. De préférence, le point de contrôle immunitaire cible des anticorps selon l'invention est un récepteur inhibiteur des cellules effectrices immunitaires.
Par « récepteur inhibiteur » on entend, dans la présente invention, un récepteur de surface qui, après interaction avec son ligand, entraîne le déclenchement d'une voie de signalisation conduisant à l'inactivation de la réponse immunitaire.
De préférence, le point de contrôle immunitaire inhibiteur est choisi parmi PDl, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLAl et a2AR. PDl, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLAl et a2AR sont des récepteurs inhibiteurs des cellules effectrices immunitaires. De préférence, le point de contrôle immunitaire inhibiteur est PDl. De préférence, l'anticorps selon l'invention est un anti-PDl comprenant comme VH et VL les séquences SEQ ID NO : 11 et 12 respectivement, ou bien 13 et 14 respectivement.
PDl (Programmed cell Death factor 1) est un récepteur inhibiteur de la famille CD28 exprimé à la surface des lymphocytes T et B activés et des Natural Killer. Son rôle est de limiter l'activité des cellules effectrices dans les tissus lymphoïdes secondaires ou les tumeurs, lui conférant ainsi un mécanisme de résistance tumorale important. PDl inhibe les fonctions lymphocytaires lorsqu'il est engagé avec un de ses ligands (PDLl (ou B7-H1 ou CD274) et PDL2). PDLl est une molécule exprimée à la surface des cellules tumorales et des cellules myéloïdes. En cas d'exposition chronique au ligand PDLl (par exemple dans le cas de cancers), les lymphocytes portant PD1 à leur surface sont inhibés dans leur fonction, ce qui entraîne alors un phénomène d'anergie. Les anticorps anti-PDl sont utilisés dans le traitement de cancers tels que les cancers du poumon, les cancers du poumon « non à petites cellules » (NSCLC), les mésothéliomes, les cancers de la vessie, les cancers colorectaux, les cancers colorectaux métastatiques, les cancers de la vessie, les cancers du sein, les cancers de la tête et du cou, les cancers des testicules, les cancers de l'endomètre, les cancers de l'œsophage, les cancers du thymus, les cancers hématologiques, les cancers hématologiques avancés tels que les lymphomes non-hodgkiniens, les lymphomes hodgkiniens, les leucémies lymphoïdes chroniques, les mélanomes multiples, les leucémies myéloïdes aiguës, les tumeurs du cerveau, les glioblastomes, les tumeurs solides, les adénocarcinomes gastriques, les tumeurs des cellules germinales, les carcinomes hépatocellulaires, les mélanomes, les mélanomes métastatiques, les lymphomes, les lymphomes diffus à grandes cellules B (LDGCB), les lymphomes folliculaires, les mélanomes non résécables ou métastatiques ou encore les carcinomes de cellules rénales avancés.
CTLA4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4) est un récepteur inhibiteur exprimé uniquement à la surface des lymphocytes T. Son rôle est de réguler les premières étapes d' activation des lymphocytes T. En effet, 48 heures après activation des lymphocytes T par l'intermédiaire de leur récepteur (TCR ou T Cell Receptor), CTLA4 s'engage avec ses ligands (CD80 ou CD86) qui sont exprimés à la surface des cellules présentatrices d'antigène (CPA) au niveau des ganglions lymphatiques et parfois des tumeurs. Ceci entraîne une cascade de signalisation conduisant à l'inhibition des lymphocytes T. Les anticorps anti-CTLA4 sont utilisés dans le traitement de cancers tels que le cancer du poumon, les cancers du poumon « à non petites cellules » (NSCLC), les carcinomes du poumon à petites cellules, les cancers du sein, les cancers du pancréas, les cancers de la prostate, les cancers gastriques, les cancers du rein, les cancers du cou et de la tête, les cancers du foie, les mélanomes métastatiques ou non résécables, les mélanomes cutanés avec atteinte des ganglions lymphatiques, les carcinomes rénaux, les myélomes, les lymphomes, les carcinomes hépatocellulaires, les métastases cérébrales, les tumeurs solides, mésothéliomes, les lymphomes ou encore les mélanomes.
TIM3 (T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3) est un récepteur exprimé en surface des lymphocytes T sécréteurs d'IFN γ. Un de ses ligands est la galectine-9, qui est une protéine surexprimée dans les cellules tumorales. L'engagement de TIM3 avec la galectine-9 conduit à une inhibition de la réponse immunitaire. LAG3 (lymphocyte activation gene 3) aussi nommée CD223 est une molécule exprimée en surface des lymphocytes T. Son seul ligand connu est le Complexe Majeur d'Histocompatibilité de type II (CMH II) qui peut être exprimé par certaines cellules cancéreuses mais aussi par les cellules présentatrices d'antigène (CPA) (macrophages et cellules dendritiques) infiltrées au niveau des tumeurs. L'engagement de LAG3 avec son récepteur entraîne un phénomène d'anergie.
KIR (Killer-cell immunoglobulin-like receptor) est une molécule exprimée en surface des Natural Killers, des lymphocytes T et des CPA. Lorsque KIR se lie à son ligand, le CMH de type I (CMH I), la réponse effectrice des Natural Killers est atténuée au niveau des tumeurs.
BTLA1 (B and T lymphocyte attenuator), aussi appelé CD272, est une molécule exprimée en surface des lymphocytes. Son ligand, la molécule HVEM (herpesvirus entry mediator), est exprimé dans certains types de tumeurs (notamment dans le cas des mélanomes).
Les a2AR sont exprimés dans différents types de cellules effectrices de l'immunité, notamment dans les lymphocytes T, ainsi que dans les cellules endothéliales. Lorsque l'a2AR se lie à son ligand, l'adénosine (qui s'accumule dans les tumeurs), les cellules CD4+ expriment FOXP3 et se différentient ainsi en cellules T régulatrices, ce qui a pour conséquence d'inhiber la réponse immunitaire.
Par « anticorps inhibiteur » on entend un anticorps capable de se lier à sa cible point de contrôle immunitaire inhibiteur pour empêcher sa liaison à son ligand endogène. Dans le contexte de la présente invention, un anticorps inhibiteur d'au moins un point de contrôle immunitaire inhibiteur est capable de se lier audit point de contrôle pour le neutraliser, et donc empêcher sa liaison avec son ligand et bloquer ainsi les voies de signalisation inhibitrices de la réponse immunitaire découlant de cette interaction. Par « anticorps activateur » on entend un anticorps capable de se lier à sa cible point de contrôle immunitaire activateur et donc stimuler ainsi les voies de signalisation activatrices de la réponse immunitaire découlant de cette interaction. Par « anticorps activateur » on entend également un anticorps capable de se lier à sa cible qui est un ligand inhibiteur endogène d'un point de contrôle immunitaire activateur exprimé en surface des cellules cancéreuses. En se liant à l'inhibiteur endogène d'un point de contrôle immunitaire activateur exprimé en surface des cellules cancéreuses, ledit anticorps empêche sa liaison avec son récepteur et bloque ainsi l'inhibition de la réponse immunitaire découlant de cette interaction. Le terme « anticorps parent » est utilisé pour définir l'anticorps de référence qui peut être d'origine naturelle ou synthétique. Dans le contexte de la présente invention, l'anticorps parent comprend une région Fc dite « région Fc parente ». Ladite région Fc parente est choisie parmi le groupe de régions Fc de type sauvage et leurs fragments. Par "type sauvage ou WT", on entend ici une séquence d'acides aminés ou une séquence nucléotidique que l'on trouve dans la nature c'est à dire qui est d'origine naturelle, y compris des variations alléliques, et qui n'a pas été intentionnellement modifiée par des techniques de biologie moléculaire telles que par mutagenèse. Par exemple, les régions Fc de « type sauvage » se réfèrent notamment à la région Fc de l'IgGl ayant la séquence SEQ ID NO :1 (allotype Glml,17), la région Fc d'IgG2 ayant la séquence SEQ ID NO : 2, la région Fc d' IgG3 ayant la séquence SEQ ID NO : 3, la région Fc d' IgG4 ayant la séquence SEQ ID NO : 4, et la région Fc d' IgGl ayant la séquence SEQ ID NO :5 (allotype Glm3). Les régions Fc de « type sauvage » se réfèrent également aux régions Fc correspondant aux séquences SEQ ID NO : 6 à SEQ ID NO : 10. De préférence, l'anticorps parent comprend une région Fc humaine, de préférence une région Fc d'une IgGl humaine ou d'une IgG4 humaine. L'anticorps parent peut comprendre des modifications d'acides aminés préexistantes dans la région Fc (par exemple un mutant Fc) par rapport à des régions Fc de type sauvage.
Par « cellules effectrices immunitaires », on entend la sous-population de cellules effectrices qui exercent leurs fonctions par engagement des récepteurs Fc (FcR) qu'elles expriment. Sont considérées comme cellules effectrices les lymphocytes, les monocytes, les neutrophiles, les cellules Natural Killer (NK), les éosinophiles, les basophiles, les mastocytes, les cellules dendritiques, les cellules de Langerhans et les plaquettes.
De préférence, l'anticorps selon l'invention présente une région Fc modifiée lui conférant une affinité supérieure pour le récepteur FcRn.
Le récepteur FcRn correspondant au « neonatal Fc receptor » est une protéine composée d'une chaîne lourde codée par le gène FcRn (appelé FCGRT chez l'Homme) et d'une chaîne légère, la molécule de p2-microglobuline. Il peut lier la région Fc des IgG et a pour caractéristique d'augmenter la demi-vie des IgG qui s'y fixent. Le FcRn peut être retrouvé chez différents organismes y compris, sans s'y limiter, les humains, les souris, les rats, les lapins et les singes. Par « affinité » on entend la capacité de fixation entre un ligand et son récepteur.
Par « affinité supérieure au FcRn » on entend l'augmentation de l'affinité de liaison, in vivo ou in vitro, de la région Fc mutée de l'invention pour le FcRn, par rapport à celle de l'anticorps parent. La capacité de la région Fc mutée de l'invention à se lier à un récepteur FcRn peut être évaluée in vitro par un test ELISA, comme décrit par exemple dans la demande de brevet WO2010/106180. Selon un mode de réalisation particulier, les régions Fc utilisées selon l'invention présentent une affinité modifiée, avantageusement augmentée, au récepteur FcRn. Cette augmentation de la liaison au FcRn se traduit par une amélioration de la rétention de sérum in vivo et, par conséquent, une augmentation de la demi- vie.
Les anticorps selon l'invention peuvent être utilisés seuls ou en combinaison, par exemple plusieurs anticorps présentant des régions Fc différentes peuvent être administrés en combinaison ou co-administrés.
Selon un aspect de l'invention, la région Fc modifiée de l'anticorps selon l'invention comprend au moins une mutation par rapport à la région Fc d'un anticorps parent. Les mutations concernées ne sont pas les variations naturelles qui définissent l'isotype de l'immunoglobuline, mais des mutations artificielles, le procédé de production générant la région Fc portant la ou les mutations désirées.
De manière préférentielle, l'invention se rapporte à une composition comprenant un seul type d'anticorps comprenant une région Fc mutée. En d'autres termes, la composition comprend alors des molécules d'anticorps de séquence identique.
Par « mutation » on entend un changement d'au moins un acide aminé de la séquence d'un polypeptide, notamment un changement d'au moins un acide aminé dans la région Fc de l'anticorps parent. L'anticorps obtenu comprend alors une région Fc mutée par rapport à celle de l'anticorps parent. De préférence, la mutation est une substitution, une insertion ou une délétion d'au moins un acide aminé à une position particulière. Les régions Fc mutées peuvent présenter plusieurs mutations, touchant plusieurs acides aminés, de préférence de deux à dix. Par «substitution», on entend le remplacement d'un acide aminé par un autre acide aminé à une position particulière dans une séquence de l'anticorps parent. Par exemple, la substitution 434S se réfère à un anticorps variant (ou mutant), en l'occurrence un variant pour lequel un acide aminé à la position 434 est remplacé par la sérine. De préférence, le libellé suivant de mutation est utilisé: « 434S » ou « N434S », et signifie que l'anticorps parent comprend l'asparagine en position 434, qui est remplacé par la sérine dans le variant. Dans le cas d'une combinaison de substitutions, le format préféré est le suivant: « 2591/315D/434Y » ou « V259I/N315D/N434Y ». Cela signifie qu'il existe trois substitutions dans le variant, en positions 259, 315 et 434, et que l'acide aminé en position 259 de l'anticorps parent, à savoir la valine, est remplacé par l'isoleucine, que l'acide aminé en position 315 de l'anticorps parent, soit l'asparagine, est remplacé par l'acide aspartique et que l'acide aminé en position 434 de l'anticorps parent, soit l'asparagine, est remplacé par la tyrosine.
Par « délétion d'acides aminés» ou «délétion», on entend la suppression d'un acide aminé à une position particulière dans une séquence de l'anticorps parent. Par exemple, E294del ou 294del désigne la suppression de l'acide glutamique en position 294.
Par « insertion d'acide aminé » ou « insertion », on entend l'addition d'un acide aminé à une position particulière dans une séquence de l'anticorps parent. Par exemple, l'insertion G>235- 236 désigne une insertion de glycine entre les positions 235 et 236. Tout au long de la présente demande, la numérotation des résidus dans la région Fc est celle de la chaîne lourde d'immunoglobuline selon l'index EU ou équivalent dans Kabat et al. (Séquences of Proteins of Immunological Interest, 5e éd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, dans le Maryland, 1991). L'expression «index EU ou équivalent dans Kabat» fait référence à la numérotation EU des résidus de l'anticorps humain IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Cela est illustré sur le site IMGT (http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu IGHGnber.html).
De préférence, la présente invention porte sur un anticorps pour lequel la région Fc modifiée a une affinité supérieure pour le récepteur FcRn par rapport à la région Fc d'un anticorps parent et comprend au moins deux mutations, lesdites mutations étant choisies parmi:
(i) une modification choisie parmi 378V, 378T, 434Y et 434S et
(ii) au moins une modification choisie parmi 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y et 434S, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii). De préférence, la présente invention se rapporte à un anticorps dont la région Fc comprend au moins une combinaison de mutations choisies parmi 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241L/264E/378V, 241L/264E/434S, 250A/389K/434Y, 2591/315D/434Y, 284E/378T/396L, 264E/378V/434Y, 345D/330V/434Y, 315D/382V/434Y et 378V/383N/434Y par rapport à la région Fc dudit anticorps parent, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
De préférence, la présente invention se rapporte à un anticorps dont la région Fc comprend au moins une mutation choisie parmi 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 2591, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 3081, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S et 439R par rapport à la région Fc dudit anticorps parent, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence, la présente invention se rapporte à un anticorps dont la région Fc comprend une combinaison de mutations choisies parmi 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 315D/330V/361D/378V/434Y, 345D/330V/361D/378V/434Y, 2591/315D/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 241L/264E/307P/378V/433R, 250A/389K/434Y, 305A/315D/330V/395A/343Y, 264E/386R/396L/434S/439R, 315D/330V/362R/434Y, 294del/307P/434Y, 305A/315D/330V/389K/434Y, 315D/327V/330V/397M/434Y, 230T/241L/264E/265G/378V/421T, 264E/396L/415N/434S, 227L/264E/378V/434S, 264E/378T/396L, 230T/315D/362R/426T/434Y, 226G/315D/330V/434Y,
230L/241L/243L/264E/307P/378V, 250A/315D/325S/330V/434Y,
290E/315D/342R/382V/434Y, 241L/315D/330V/392R/434Y, 241L/264E/307P/378W/434S, 230T/264E/403T/434S, 264E/378V/416K, 230T/315D/362E/434Y, 226G/315D/434Y, 226G/315D/362R/434Y, 226G/264E/347R/370R/378V/434S, 3081/315D/330V/382V/434Y, 230T/264E/378V/434S, 231T/241L/264E/378T/397M/434S, 230L/264E/378W/434S, 230T/315D/330V/386K/434Y, 226G/315D/330V/389T/434Y, 267R/307P/378V/421T/434Y, 230S/315D/387T/434Y, 230S/264E/352S/378V/434S et 230T/303A/322R/389T/404L/434S par rapport audit anticorps parent, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
Dans un mode de réalisation préféré, les régions Fc portent une mutation sélectionnée dans le groupe consistant en une mutation à l'acide aminé 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 ou 447, la numérotation des acides aminés de la région Fc se référant à celle de l'indice EU, ou l'équivalent dans Kabat.
Certaines positions d'acides aminés de la liste ci-dessus - à savoir 226, 230, 241, 256, 259, 264, 307, 315, 330, 342, 361, 362, 378, 382, 383, 389, 396, 397, 421, 428 et 434 - sont préférées. Notamment, les Fc mutés qui présentent une grande affinité de liaison pour le FcRn sont susceptibles de comprendre au moins une modification d'acide aminé au niveau de l'une desdites positions d'acides aminés. Parmi celles-ci, les positions 230, 264, 307, 315, 330, 378 et 434 sont préférées, de préférence encore les positions 264, 315, 378 et 434.
Dans un mode de réalisation particulier, au moins deux, voire trois, quatre, ou cinq mutations d'acides aminés peuvent améliorer sensiblement l'affinité de liaison pour le FcRn en comparaison avec le Fc parent.
Dans un mode de réalisation particulier, les mutations sont :
(i) une ou deux mutations choisies dans le groupe constitué des positions 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421, et 434 ; de préférence 230, 264, 307, 315, 330, 378 et 434, de préférence encore 264, 315, 378 et 434 ; et
(ii) au moins une autre, différente, parmi les positions 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292,293, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 et 447, de préférence 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421 et 434. Dans un mode de réalisation préféré, au moins une des positions 378 et 434 est mutée; et éventuellement encore au moins une autre sélectionnée dans le groupe constitué de 226, 230, 241, 264, 307, 315, 330, 342, 362, 378, 382, 389, 396, 397, 421 et 434.
De préférence, les mutations sont 226G, 226Y, 227S, 227L, 228R, 228L, 230S, 230T, 230L, 230A, 230Q , 231T, 231V, 233D, 234R, 239A, 241L, 241 Y, 241R, 243L, 246R, 250A, 252L, 256N, 2591, 264A, 264E, 264M, 265G, 265N, 267N, 267R, 269D, 269G, 270N, 270E, 276S, 284L, 285Y, 288R, 2891, 290R, 290E, 291S, 291Q 292W, 293del, 294del, 297D, 298G, 298N, 299M, 299A, 299K, 301C, 302A, 303A, 3031, 305A, 307P, 307A, 307N, 3081, 309P, 311R, 315D, 317R, 320T, 320E, 322R, 325S , 327V, 327T, 330V, 330T, 332V, 334E, 334R, 335A, 338R, 340E, 342R, 342E, 342K, 343S, 345Q, 345G, 347R, 350A, 352S, 354P, 355Q, 355G, 356N, 359A, 360N, 360R, 361D, 361S, 362R, 362E, 369A, 370R, 371D, 375A, 375G, 378V, 378T, 378S, 380Q, 382V, 382G, 383R, 383N, 3841, 384T, 385R, 386R, 386K, 387S, 387T, 389T, 389K, 389R, 390S, 392E, 392R, 393N, 394A, 395A, 395S, 396S, 396L, 397A, 397M, 398P, 399N, 400P, 401A, 401G, 403T, 404L, 408T, 411A, 412A, 414R, 415D, 415N, 416K, 416G, 418R, 418K, 418E, 419H, 420R, 421T, 421S, 421D, 422A, 424L, 426T, 428L, 433R, 433P, 434Y, 434S, 434H, 438R, 439R, 440R, 440N, 443R, 444F, 444P, 445S, 446A, 447Net 447E, et sont décrites également dans la demande de brevet WO2010/106180.
Dans un autre mode de réalisation, les régions Fc comprennent au moins une mutation choisie dans le groupe constitué de 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 2591, 264E, 265G, 267R, 290E, 293del, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 3081, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S et 439R, de préférence 226G, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 342R, 362R, 362E, 378V, 378T, 382V, 389T, 389K, 396L, 397M, 421T, 434Y et 434S.
Des exemples de combinaisons de mutations particulières sont présentés ci-après :
226G/330V, 230L/264E, 230L/378V, 230S/315D, 230S/434Y, 230T/378V, 241L/434S, 250A/434Y, 264E/378T, 305A/315D, 305A/330V, 305A/434Y, 307P/434Y, 315D/389T, 330V/382V, 330V/389T, 378V/421T, 389K/434Y, 389T/434Y, 396L/434S, 230T/264E, 230T/315D, 230T/434S, 230T/434Y, 241L/307P, 264E/307P, 264E/396L, 315D/362R, 315D/382V, 362R/434Y, 378V/434Y, 382V/434Y, 226G/315D, 226G/434Y, 241L/378V, 307P/378V, 241L/264E, 378V/434S, 264E/378V, 264E/434S, 315D/330V, 330V/434Y et 315D / 434Y; ou encore 226G/315D/330V, 226G/315D/434Y, 226G/330V/434Y, 230L/264E/378V, 230T/264E/378V, 230T/264E/434S, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/389T/434S, 241L/264E/434S, 241L/264E/378V, 241L/264E/307P, 241L/307P/378V, 250A/389K/434Y, 256N/378V/434Y, 2591/315D/434Y, 264E/378T/396L, 264E/378V/416K, 294del/307P/434Y, 264E/307P/378V, 264E/396L/434S, 264E/378V/434S, 305A/315D/330V, 305A/315D/434Y, 305A/330V/434Y, 307P/378V/434Y, 315D/330V/382V, 315D/330V/389T, 315D/378V/434Y, 315D/389T/434Y, 315D/362R/434Y, 315D/382V/434Y, 315D/330V/434Y, 330V/382V/434Y, 330V/389T/434Y et 378V/383N/434Y.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, les régions Fc portent une combinaison de mutations choisie parmi 315D/330V/361D/378V/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 2591/315D/434Y et 256N/378V/383N/434Y.
Dans un autre mode de réalisation, les régions Fc portent au moins une mutation choisie parmi :
G316D, K326E, N315D, N361H, P396L, T350A, V284L, V323I, P352S, A378V, Y436H, V266M, N421T, G385R, K326T, H435R, K447N, N434K, K334N, V397M, E283G, A378T, F423L, A431V, F423S, N325S, P343S, K290E, S375R, F405V, K322E, K340E, N389S, F243I, T307P, N389T, S442F, K248E, Y349H, N286I, T359A, S383R, K334R, T394P, V259A, T393A, P352L, Q418P, V302A, L398P, F423P, S442P, V363I, S383N, S254F, K320E, G402D, I253F, V284A, A431T, N315H, Y319H, C226Y, F405L, T393I, N434S, R255W, A287T, N286Y, A231V, K274R, V308G, K414R, M428T, E345G, F243L, P247T, Q362R, S440N, Y278H, D312G, V262A, V305A, K246R, V308I, E380G, N276S, K439Q, S267G, F423Y, A231T, K320R, L410R, K320M, V412M, T307N, T366A, P230S, Y349S, A339T, K246E, K274E, A231P, I336T, S298N, L234P, S267N, V263A, E333G, V308A, K439R, K392R, S440G, V397I, I336V, Y373D, K288E, L309P, P227S, V379A, K288R, K320T, V282A, I377T, N421S et C261R,
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence, les mutants utilisés sont choisis parmi N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y, P230S/N315D/M428L/N434Y, E294del/T307P/N434Y, T307A/N315D/A330V/E382V/N389T/N434Y, V259I/N315D/N434Y et
T256N/A378V/S383N/N434Y. De préférence, les mutants selon l'invention sont produits par un procédé de production générant la région Fc portant la ou les mutations désirées. Ainsi, préférentiellement, l'anticorps inhibiteur d'au moins un point de contrôle immunitaire selon l'invention est obtenu par un procédé comprenant au moins une étape de mutagénèse de la région Fc de l'anticorps parent.
Cette mutagénèse peut être aléatoire, comme explicité au paragraphe 1 de l'exemple 1.
La mutagénèse peut également être une mutagénèse dirigée. De préférence, la mutagénèse dirigée peut être réalisée selon le protocole suivant :
Chaque mutation d'intérêt dans le fragment Fc est insérée indépendamment dans un vecteur d'expression contenant la chaîne lourde anti-point de contrôle immunitaire (contenant la partie variable de l'anticorps anti-point de contrôle immunitaire, et la partie constante de région Fc wild-type) par PCR de chevauchement en utilisant deux ensembles d'amorces adaptées pour intégrer la ou les mutation(s) ciblées avec le(s) codon(s) codant l'acide aminé souhaité. Avantageusement, quand les mutations à insérer sont proches sur la séquence du Fc, elles sont ajoutées via un même oligonucléotide. Les fragments obtenus par PCR sont associés et le fragment résultant est amplifié par PCR en utilisant des protocoles standards. Le produit de PCR, contenant la chaîne lourde entière de anti-point de contrôle immunitaire muté sur le fragment Fc, peut être purifié sur gel d'agarose 1% (w/v), digéré avec les enzymes de restriction adéquates et cloné dans le vecteur d'expression eucaryote (tel que le vecteur bicistronique HK-Gen EFSS) qui contient également la chaîne légère non modifiée de l'anticorps anti-point de contrôle immunitaire considéré.
Avantageusement, les mutations portées par la région Fc de l'anticorps selon l'invention lui confèrent une demi-vie augmentée, et permettent une efficacité améliorée du blocage des points de contrôle immunitaires.
De préférence, la présente invention se rapporte à un anticorps présentant une activité fonctionnelle médiée par la région Fc modifiée, en particulier diminuée, par rapport à celle de l'anticorps parent.
Par « activité fonctionnelle médiée par la région Fc » on entend les fonctions effectrices médiées par la région Fc. Sont comprises dans lesdites activités fonctionnelles médiées par la région Fc la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), la cytotoxicité dépendante du complément (CDC), la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP), l'activité d'endocytose, la sécrétion de cytokines ou une combinaison d'au moins deux de ces activités. De préférence, l'activité fonctionnelle médiée par la région Fc considérée dans l'invention est choisie parmi l'ADCC, la CDC, l'ADCP et les combinaisons d'au moins deux de ces activités. Cette activité fonctionnelle peut être évaluée par des procédés bien connus de l'art antérieur.
L'activité fonctionnelle médiée par la région Fc est modifiée, en particulier diminuée par rapport à celle de l'anticorps parent, d'un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30.
De préférence, l'anticorps selon l'invention, qui comprend une région Fc modifiée, est tel qu'une mutation choisie parmi 294Del, 293Del et 293del/294del est introduite dans la région Fc de l'anticorps parent, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. Cette délétion peut être l'unique mutation de la région Fc, ou s'accompagner d'autres mutations, en particulier parmi celles listées dans la présente demande. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, l'anticorps selon l'invention comprend une région Fc comprenant une unique mutation choisie parmi la délétion de l'acide aminé en position 294 (294Del), la délétion de l'acide aminé en position 293 (293Del), la double délétion des acides aminés 293 et 294.Cette seule mutation conduit à une glycosylation particulière de la région Fc, à savoir une hypersialylation, particulièrement avantageuse vis-à-vis de la demi-vie des glycoprotéines et des processus inflammatoires, sans altérer la liaison au FcRn et/ou la demi-vie protéique.
Selon un autre mode de réalisation particulier, les régions Fc mutées utilisées dans l'invention portent la délétion de l'acide aminé en position 293 ou 294, et portent en outre une ou plusieurs mutations à des positions sélectionnées dans la liste ci-après : 226, 230, 241, 256, 259, 264, 307, 315, 330, 342, 361, 362, 378, 382,383, 389, 396, 397, 421, 428 et/ou 434. Par exemple, une région Fc préférée porte la combinaison des mutations 307P, 434Y, en association avec la délétion Del294.
De préférence, la présente invention se rapporte à un anticorps comprenant une région Fc mutée et présentant une activité fonctionnelle médiée par la région Fc modifiée par rapport à celle d'un anticorps parent, caractérisé en ce que ladite région Fc comprend au moins une combinaison de 2 mutations, ladite combinaison étant choisie parmi : (i) une mutation choisie parmi 307N, 326E, 326T, 334N, 334R, 352L, 378V, 378T, 394P, 396L, 397M et 421T ; et
(ii) au moins une mutation choisie parmi 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 2431, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261R, 262A, 263 A, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 2861, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 3081, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 3231, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 3631, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 3931, 394P, 396L, 3971, 397M, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 421S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P et 447N,
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).
De préférence, les régions Fc mutées comprennent au moins une combinaison de 3 mutations, ladite combinaison comprenant :
(i) une mutation choisie parmi 326E, 326T, 352L, 378V, 378T, 396L, 397M, 421T, 334N, 334R, 307N et 394P ; et
(ii) au moins 2 mutations choisies parmi 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 2431, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261R, 262A, 263 A, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 2861, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 3081, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 3231, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 3631, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 3931, 394P, 396L, 3971, 397M, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 421S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P et 447N,
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).
Avantageusement, les mutations portées par la région Fc de l'anticorps modifié modulent son activité fonctionnelle, permettant ainsi d'améliorer l'efficacité de l'anticorps décrit dans la présente invention. La région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention a une affinité modifiée pour au moins un des récepteurs de la région Fc (FcR) choisi parmi le complément Clq et les récepteurs FcgRIIIa (CD16a), FcgRIIa (CD32a), et FcgRIIb (CD32b).
De préférence l'affinité de la région Fc mutée pour le complément Clq, pour les récepteurs FcgRIIIa (CD 16a) et FcgRIIa (CD32a) est diminuée, et l'affinité de la région Fc mutée pour FcgRIIb (CD32b) est augmentée. Par « affinité modifiée pour au moins un des récepteurs de la région Fc (FcR) », on entend l'augmentation ou la diminution de l'affinité de liaison, in vivo ou in vitro, de la région Fc mutée de l'invention pour au moins l'une des molécules Clq, FcgRIIIa (CD16a), FcgRIIa (CD32a) et FcgRIIb (CD32b). Les récepteurs de la région Fc impliqués dans la présente invention sont les récepteurs humains :
- Clq qui est impliqué dans l'activité CDC,
- le récepteur FcgRIIIa (CD 16a) qui est lui impliqué dans l'ADCC et présente un polymorphisme V/F en position 158,
- le récepteur FcgRIIa (CD32a) qui est quant à lui impliqué dans l'activation plaquettaire et la phagocytose, il présente un polymorphisme H/R en position 131, et
- le récepteur FcgRIIb (CD32b) qui est impliqué dans l'inhibition de l'activité cellulaire.
L'affinité d'un anticorps pour un FcR peut être évaluée par des procédés bien connus de l'art antérieur. Par exemple, l'homme de l'art peut déterminer l'affinité (Kd) en utilisant la résonance plasmonique de surface (SPR). Alternativement, l'homme de l'art peut effectuer un test ELISA approprié. Un dosage ELISA approprié permet de comparer les forces de liaison du Fc parent et du Fc muté. Les signaux détectés spécifiques du Fc muté et du Fc parent sont comparés.
De préférence, la région Fc mutée de l'anticorps selon l'invention présente une affinité augmentée pour le récepteur FcgRIIb (CD32b), et comprend au moins une combinaison de 2 mutations, ladite combinaison comprenant : i) une mutation choisie parmi 326E, 326T, 378V, 397M, 352L, 394P, 396L et 421T ; et
ii) au moins une mutation choisie parmi 316D, 334R, 248E, 334N, 418P, 231V, 320E, 402D, 359A, 383R, 421T et 361H,
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).
Plus préférentiellement, ladite région Fc mutée comprend au moins une combinaison de 3 mutations, ladite combinaison comprenant :
(i) une mutation choisie parmi 326E, 326T, 352L, 378V, 378T, 396L, 397M, 421T, 334N, 334R, 307N et 394P ; et
(ii) au moins 2 mutations choisies parmi 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 2431, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261R, 262A, 263 A, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 2861, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 3081, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 3231, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 3631, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 3931, 394P, 396L, 3971, 397M, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 421S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P, et 447N, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).
De préférence, ladite région Fc mutée comprend une combinaison de 4 mutations, ladite combinaison comprenant au moins une mutation (i), et au moins 3 mutations (ii), et de préférence une combinaison de 5 mutations, ladite combinaison comprenant au moins une mutation (i), et au moins 4 mutations (ii).
Avantageusement, les mutations portées par la région Fc de l'anticorps modifié augmentent son affinité pour le récepteur inhibiteur FcgRIIb (CD32b) et diminuent son affinité pour les récepteurs Clq, FcgRIIIa (CD16a) et FcgRIIa (CD32a), permettant ainsi de diminuer son activité fonctionnelle. Cela permet ainsi d'améliorer son efficacité vis-à-vis des points de contrôle immunitaires et de diminuer un éventuel effet toxique de lyse des cellules effectrices du système immunitaire reconnues par les anticorps de l'invention. La présente invention se rapporte préférentiellement à un anticorps pour lequel l'anticorps parent comprend une région Fc parente qui est une région Fc humaine, de préférence une région Fc d'une IgGl humaine ou d'une IgG2 humaine ou d'une IgG4 humaine.
L'invention se rapporte à une composition pharmaceutique comprenant (i) au moins un anticorps, et (ii) au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Par « composition pharmaceutique », on entend une composition possédant des propriétés curatives ou préventives à l'égard des maladies humaines ou animales.
Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend un unique anticorps. Par « comprend un unique anticorps », on entend la présence d'un ensemble d'anticorps tous dirigés contre la même cible et possédant exactement la même structure au niveau de la région Fc.
Dans un autre mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend deux anticorps combinés dirigés contre des récepteurs différents.
Par « comprend deux anticorps », on entend la présence d'anticorps dirigés contre deux cibles différentes et avec des structures de leur région Fc pouvant être différentes selon la cible de l'anticorps. Dans un mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre CTLA4 est combiné à un anticorps dirigé contre PDl. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre CTLA4 est combiné à un anticorps dirigé contre TIM3. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps anti-CTLA4 est combiné à un anticorps dirigé contre LAG3. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre CTLA4 est combiné à un anticorps dirigé contre KIR. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre CTLA4 est combiné à un anticorps dirigé contre BTLA1. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre CTLA4 est combiné avec un anticorps dirigé contre a2AR. Dans un autre mode de réalisation, un anticorps dirigé contre PDl est combiné avec un anticorps dirigé contre TIM3. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre PDl est combiné avec un anticorps dirigé contre LAG3. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre PDl est combiné avec un anticorps dirigé contre KIR. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre PDl est combiné avec un anticorps dirigé contre BTLA1. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre PDl est combiné avec un anticorps dirigé contre a2AR. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre TIM3 est combiné avec un anticorps dirigé contre LAG3. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre TIM3 est combiné avec un anticorps dirigé contre KIR. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre TEVI3 est combiné avec un anticorps dirigé contre BTLA1. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre TIM3 est combiné avec un anticorps dirigé contre a2AR. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre LAG3 est combiné avec un anticorps dirigé contre KIR. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre LAG3 est combiné avec un anticorps dirigé contre BTLA1. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre LAG3 est combiné avec un anticorps dirigé contre a2AR. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre KIR est combiné avec un anticorps dirigé contre BTLA1. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre KIR est combiné avec un anticorps dirigé contre a2AR. Dans un autre mode de réalisation particulier, un anticorps dirigé contre a2AR est combiné avec un anticorps dirigé contre BTLA1.
Toute voie d'administration est envisagée, notamment des voies parentérales, telles que la voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intradermique, topique, ou par voie mucosale, par exemple par inhalation. Les voies entérales (orale, rectale) et intrathécale sont également possibles. De préférence, la voie intraveineuse est utilisée.
Les anticorps selon l'invention sont généralement formulés au sein de compositions pharmaceutiques comprenant des excipients pharmaceutiquement acceptables.
Les compositions pharmaceutiques peuvent se présenter sous toute forme galénique adaptée en fonction de la voie d'administration choisie.
Les compositions pharmaceutiques utiles selon l'invention comprennent avantageusement un ou plusieurs excipients ou véhicules, acceptables sur le plan pharmaceutique. On peut citer par exemple des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations (liquides et/ou injectables et/ou solides) sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales, l'acacia, etc. Les compositions peuvent être formulées éventuellement au moyen de formes galéniques ou de dispositifs assurant une libération prolongée et/ou retardée. Pour ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel que la cellulose, des carbonates ou des amidons. Indications
Le système immunitaire reconnaît normalement les cellules tumorales comme des éléments étrangers, ce qui a pour conséquence d'entraîner une réponse immunitaire anti-tumorale. Cependant, il arrive que les cellules cancéreuses mettent en place des stratégies d'échappement au système immunitaire ; elles ne sont alors plus reconnues ou éliminées par le système immunitaire. Les points de contrôle immunitaires exprimés en surface des cellules effectrices de l'immunité constituent une voie importante de l'échappement tumoral. En effet, ces molécules lorsqu'elles sont inhibitrices (ce qui est le cas pour PD1, CTLA4, LAG3, TIM3, KIR, BTLA1 et a2AR), ont pour fonction d'atténuer la réponse immunitaire lorsqu'elles sont engagées avec leur ligands qui sont souvent exprimés par les cellules tumorales.
La présente invention se rapporte plus particulièrement à une composition pharmaceutique pour son utilisation dans le traitement de cancers. Plus particulièrement, les cancers visés utilisent le mécanisme d'échappement tumoral décrit ci-avant.
Par « cancer » on entend toute condition physiologique caractérisée par une prolifération cellulaire anormale.
La composition pharmaceutique selon l'invention est ainsi utilisée pour traiter différents types de cancers. Des exemples de cancers incluent notamment des cancers du poumon « non à petites cellules » (NSCLC), des mélanomes non résécables ou métastatiques, des carcinomes des cellules rénales avancés, des cancers de la vessie, les cancers du rein, des mélanomes, des cancers du poumon, des lymphomes, des mésothéliomes, des cancers colorectaux, les cancers colorectaux métastatiques, des cancers du sein, des cancers gastriques, des cancer de la tête et du cou, des tumeurs du cerveau, des glioblastomes, des tumeurs solides, des cancers de l'endomètre, des cancers de l'œsophage, des adénocarcinomes gastriques, des tumeurs des cellules germinales, des cancers des testicules, des carcinomes hépatocellulaires, des cancers du thymus, des lymphomes diffus à grande cellules B (LDGCB), des cancers hématologiques, des cancers hématologiques avancés (tels que les lymphomes non hodgkiniens, les lymphomes hodgkiniens, les leucémies lymphoïdes chroniques, les mélanomes multiples, les leucémies myéloïdes aiguës), les astrocytomes, les mélanomes de l'uvée, les sarcomes solides, les cancers de l'épithélium ovarien, les cancers péritonéaux primaires, les cancers des trompes de Fallope, des cancers du col de l'utérus, des cancers de l'anus, des cancers ovariens, des cancers urogénitaux, des cancers urothéliaux, des cancers génito-urinaires, des néoplasmes urogénitaux, des tumeurs thoraciques, des carcinomes adrénocorticaux, des cancers biliaires, des lymphomes folliculaires, des cancers du pancréas, des cancers de la prostate, des métastases cérébrales, des cancers du foie, des adénocarcinomes cervical, des tumeurs stromales gastro-intestinales, des cancers du cerveau métastatiques, des carcinomes des cellules de Merkel, le sarcome synovial, cette liste n'étant pas exhaustive.
Dans un mode de réalisation, l'anticorps anti-PDl optimisé de l'invention est utilisé dans le traitement de cancers. Lorsqu'un antigène tumoral a déjà été présenté à un lymphocyte par l'intermédiaire d'une Celle Présentatrice d'Antigène (CPA), ledit lymphocyte acquiert la mémoire de l'antigène. Lorsque le lymphocyte mémoire rencontre ultérieurement l'antigène tumoral dans une métastase ganglionnaire, son activation est inhibée par l'engagement de PD1 (exprimé en surface des lymphocytes) avec PDL1 (exprimé en surface des cellules tumorales). Ainsi, les cellules cancéreuses sont capables d'échapper à la réponse immunitaire. Le blocage de PD1 par un anticorps anti-PDl conduit à une ré-activation des lymphocytes présents dans les zones tumorales.
Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers du poumon. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti- PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers du poumon « non à petites cellules » (NSCLC). Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de mélanomes non résécables ou métastatiques. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de carcinomes des cellules rénales avancés. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers de la vessie. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de lymphomes. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de mésothéliomes. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti- PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers colorectaux. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers colorectaux métastatiques. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers du sein. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers gastriques. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers de la tête et du cou. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de tumeurs du cerveau. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de glioblastomes. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de tumeurs solides. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers de l'endomètre. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers de l'œsophage. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de tumeurs des cellules germinales. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers des testicules. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de carcinomes hépatocellulaires. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de mélanomes. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers du thymus. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de lymphomes diffus à grande cellules B (LDGCB). Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers hématologiques. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers hématologiques avancés tels que les lymphomes non hodgikinien, les lymphomes hodgkiniens, les leucémies lymphoïdes chroniques, les mélanomes multiples, les leucémies myéloïdes aiguës. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de lymphomes folliculaires. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement d'astrocytomes. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti- PDl optimisé est utilisé dans le traitement de mélanomes de l'uvée. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de sarcomes solides. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers de l'épithélium ovarien. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers péritonéaux primaires. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers des trompes de Fallope. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers du col de l'utérus. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers de l'anus. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers des ovaires. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancer urogénital. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers urothélial. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancers génito-urinaire. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de néoplasmes urogénitaux. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de tumeurs thoraciques. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de carcinome adrénocortical. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de cancer biliaire. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-PDl optimisé est utilisé dans le traitement de fibrosarcomes.
Dans un autre mode de réalisation, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé de l'invention est utilisé dans le traitement de cancers. Le récepteur CTLA4 a pour fonction d' inactiver les lymphocytes après présentation de leur antigène par des Cellules Présentatrices d'Antigène (CPA) pour moduler la réponse immunitaire. Ainsi, les antigènes des cellules cancéreuses sont apportés par les CPA dans le ganglion lymphatique et présentés aux lymphocytes naïfs circulant. Quand le lymphocyte naïf rencontre l'antigène dans la zone T-dépendante du ganglion, il est activé et sécrète alors des cytokines tout en acquérant une mémoire de l'antigène. CTLA4 apparaît à la surface du lymphocyte 24 à 48 heures après la rencontre avec l'antigène tumoral. En se fixant à B7-1 et B7-2 (molécules exprimées sur la CPA), il induit une inactivation lymphocytaire. Ainsi, les cellules cancéreuses sont capables d'échapper à la réponse immunitaire Le blocage de CTLA4 par un anticorps anti-CTLA4 conduit à une activation non spécifique du système immunitaire en freinant l'inhibition physiologique.
Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement des mélanomes métastatiques ou non résécables. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement des mélanomes. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement des carcinomes rénaux. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti- CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement des carcinomes du poumon « non à petites cellules ». Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement de cancers du poumon. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement de myélomes. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement de lymphomes. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement des carcinomes hépatocellulaires. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement des cancers du sein. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement des cancers du pancréas. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement des cancers de la prostate. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement des métastases cérébrales. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement des tumeurs solides. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement des cancers gastriques. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement des cancers du rein. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement des cancers du cou et de la tête. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement des cancers du foie. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement des cancers du cerveau. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti- CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement de leucémies myéloïde aiguës. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement de leucémies lymphoïdes chroniques. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti- CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement d'adénocarcinome cervical. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement de lymphome de Hodgkin. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement de lymphome non-Hodgkinien. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement de tumeurs stromales gastro intestinales. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti- CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement de cancers du cerveau métastatique. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement du cancer des ovaires. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement de lymphomes folliculaires. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement de carcinomes des cellules de Merkel. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti- CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement de mélanomes de l'uvée. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement de sarcome synovial. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CTLA4 optimisé est utilisé dans le traitement de fibrosarcomes.
La composition pharmaceutique de la présente invention peut comprendre une combinaison de deux anticorps.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti-PDl combinés est utilisée dans le traitement de cancers du poumon. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti-PDl combinés est utilisée dans le traitement de cancers du poumon « non à petites cellules » (NSCLC). Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti- PDl combinés est utilisée dans le traitement de carcinomes rénaux. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti-PDl combinés est utilisée dans le traitement de mélanomes. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti-PDl combinés est utilisée dans le traitement de glioblastomes. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti-PDl combinés est utilisée dans le traitement de gliosarcomes. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti- CTLA4 optimisé et l'anticorps anti-PDl combinés est utilisée dans le traitement de mélanome de l'uvée. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti-PDl combinés est utilisée dans le traitement de carcinomes des ovaires. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti-PDl combinés est utilisée dans le traitement de cancers des trompes de Fallope. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti-PDl combinés est utilisée dans le traitement de carcinome péritonéal primaire. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti-PDl combinés est utilisée dans le traitement de tumeurs solides. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti-PDl combinés est utilisée dans le traitement de cancer du sein. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti-PDl combinés est utilisée dans le traitement de lymphomes non-Hodgkiniens. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti- PDl combinés est utilisée dans le traitement de lymphomes Hodgkiniens. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti-PDl combinés est utilisée dans le traitement myélomes multiples. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti-PDl combinés est utilisée dans le traitement de cancers du rein. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti- CTLA4 optimisé et l'anticorps anti-PDl combinés est utilisée dans le traitement de carcinome hépatocellulaire. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti-PDl combinés est utilisée dans le traitement de mélanome métastatique ou non résécable. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti- PDl combinés est utilisée dans le traitement de sarcomes. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti- PDl combinés est utilisée dans le traitement de cancers de la prostate. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprenant l'anticorps anti-CTLA4 optimisé et l'anticorps anti-PDl combinés est utilisée dans le traitement de cancers de la vessie.
Exemple 1 : Effets des variants d'IgGl optimisés anti-PDl sur le système immunitaire et la croissance tumorale
Dans cet exemple, un anticorps d' isotype IgG4 de spécificité anti-PDl été produit avec une séquence non mutée de Fc d'IgG4, telle que la séquence SEQ ID NO :9, pour servir de référence.
1) Obtention des anticorps Les variants d'IgGl anti-PDl ont été obtenus selon la méthode décrite dans la demande WO 2010/106180 qui utilise le procédé de mutagenèse aléatoire MUTAGEN™ (WO 02/038756). Typiquement, cette méthode comprend les étapes suivantes : A/ Construction d'une banque de Fc
Le gène humain Fc codant pour les résidus 226 à 447 (selon l'index EU de Kabat et représenté en figure 1) dérivé de la chaîne lourde d'une IgGl humaine est cloné dans un vecteur approprié, tel que le vecteur phagemide pMG58 selon les protocoles standards bien connus de l'homme du métier.
B/ Mutagenèse
Plusieurs banques sont ensuite générées, suivant la procédure décrite dans WO 02/038756, qui utilise des ADN polymérases humaines de faible fidélité dans le but d'introduire des mutations aléatoires de façon homogène sur la séquence cible entière. Plus précisément, trois mutases distinctes (pol β, η et l) ont été utilisées dans des conditions différentes pour créer des profils de mutations complémentaires.
Cl Expression des banques de Fc par Phage-display et sélection des variants présentant une liaison améliorée au récepteur néonatal FcRn
Les banques de Fc sont exprimées en utilisant la technique du Phage-display selon des protocoles standards, pour servir à la sélection des fragments Fc. La sélection peut se faire conformément au protocole détaillé dans la demande brevet WO 2010/106180, notamment par sélection sur FcRn en phase solide ou liquide, puis la détermination des caractéristiques de liaisons des fragments au FcRn peut être réalisée par ELISA.
D/ Production des variants sous forme d'IgGl entière dans CHO et évaluation de leurs propriétés
Les variants Fc ont été préparés dans un format IgGl entière dans la lignée cellulaire CHO avec la spécificité anti-PDl. Les étapes de production par culture cellulaire et de purification des anticorps ont été réalisées selon des techniques courantes de l'art, en vue de leur caractérisation.
Plusieurs combinaisons de mutations ont été sélectionnées. Les combinaisons suivantes ont été sélectionnées : Variant Mutations
C6A_78 T256N/A378V/S383N/N434Y
T5A_74 N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y
C6A_66 E294del/T307P/N434Y
Table 1 : Mutants d'IgGl anti-PDl sélectionnés selon la méthode décrite dans la demande
WO2010/106180
E/ Production des variants sous forme d'IgGl entière dans YB2/0 et évaluation de leurs propriétés
Par ailleurs, le mutant C6A_66 (E294del/T307P/N434Y) a été produit sous forme d'IgGl entière dans YB2/0 (ATCC, CRL-1662) avec la spécificité anti-PDl. Les étapes de production par culture cellulaire et de purification des anticorps ont été réalisées selon des techniques courantes de l'art, en vue de leur caractérisation.
2) Caractérisation de la liaison au FcRn et de la liaison antigénique:
Les tests de liaison au FcRn ont été réalisés selon les méthodes décrites dans la demande WO 2010/106180. Brièvement, la liaison à pH6 des IgGl ou IgG4 au FcRn et au ligand PD1 ont été mesurées par un test ELISA classique. Pour cela des immunoplaques Maxisorp ont été revêtues avec des FcRn ou des antigènes PD1. Ensuite, les solutions d'IgG4 anti-PDl de référence, d'IgGl anti-PDl parent, d'IgGl C6A_78, T5A_74 et C6A_66 produits dans CHO d'une part, et les solutions d'IgG4 anti-PDl de référence, d'IgGl anti-PDl parent, et d'IgGl C6A_66 produits dans YB2/0 d'autre part, ont été ajoutées dans chaque puits avec une concentration finale de 0^g d'IgG/mL et ont été mis en contact avec des F(ab')2 d'IgG HRP de chèvre anti-humaine à la même concentration pendant 2 heures à température ambiante. Les IgG agrégées aux F(ab')2 ont ensuite été incubées sous agitation douce pendant 1 heure à 30°C sur les plaques ELISA saturées pour FcRn et PD1. Les plaques ont ensuite été révélées avec TMB (Pierce) et les absorbances ont été lues à 450 nm. Les résultats finaux indiquent que la liaison au FcRn de l'ensemble de ces mutants est améliorée et que la liaison à l'antigène PD1 n'est pas altérée par rapport à un IgGl anti-PDl parent (Table 2A) ou à un IgG4 anti-PDl de référence (Table 2B), indépendamment du système cellulaire de production.
Variant Mutations Liaison FcRn Liaison au
PD1
C6A_78 T256N/A378V/S383N/N434Y ++ = T5A_74 N315D/A330V/N361D/A378V/N434Y ++ =
C6A_66 E294del/T307P/N434Y ++ =
Table 2A : Résultats de la caractérisation de la liaison au FcRn et à l'antigène PD1 des variants d'IgGl anti-PDl sélectionnés produits dans CHO ou YB2/0 (++ : augmentation de la liaison au FcRn comparé à l'IgGl anti-PDl parent ; = : même affinité de liaison à l'antigène PD1 comparé à l'IgGl anti-PDl parent)
Figure imgf000034_0001
Table 2B : Résultats de la caractérisation de la liaison au FcRn et à l'antigène PD1 des variants d'IgGl anti-PDl sélectionnés produits dans CHO ou YB2/0 (++ : augmentation de la liaison au FcRn comparé à l'IgG4 anti-PDl de référence; = : même affinité de liaison à l'antigène PD1 comparé à l'IgG4 anti-PDl de référence)
3) Effet des anticorps IgGl anti-PDl sélectionnés sur la libération de cytokines
Les lymphocytes T humains sont purifiés à partir de PBMC en utilisant une colonne d'enrichissement à lymphocytes T CD4+ (telle que celle développée par R&D Systems). Chaque puits de culture cellulaire contient 10*5 cellules T purifiées et 10*4 cellules dendritiques allogéniques pour un volume total de 200μL·. Les anticorps anti-PDl (C6A_78, T5A_74, C6A_66, IgGl parent, IgG4, comme référence) sont ajoutés à différentes concentrations. Certains puits sont incubés avec des anticorps anti-CD3 (contrôle positif) ou avec des anticorps irrelevants (contrôle négatif). Les cellules sont mises en culture pendant 5 jours à 37°C. Au 5eme jour, ΙΟΟμί de milieu sont prélevés dans chacun des puits pour mesurer la quantité de cytokines sécrétées. Les taux de cytokines IFN-gamma, TNF-alpha, IL-2, IL-4, IL-6, IL- 10 et IL- 12 sont quantifiés par cytométrie en flux de perle Array (CBA) (BD Biosciences). Les résultats indiquent que les traitements avec les variants anti-PDl entraînent une stimulation plus forte de la sécrétion de cytokines par les cellules par rapport au traitement avec l'IgG4 anti-PDl de référence, quel que soit le système de production cellulaire utilisé. 4) Effet anti-tumoral des IgGl anti-PDl sur les modèles in vivo
Un modèle de tumeur in vivo est utilisé pour analyser l'effet des variants d'anticorps anti-PDl sur la croissance tumorale. Les souris knock-in PD1 (telles que celles proposées par Isi Innovation), mâles et femelles âgées de 7 à 10 semaines réparties en 6 groupes, subissent des injections sous-cutanées de cellules de fibrosarcomes SA1/N à raison de 2*106 cellules dissoutes dans 200μL· de DMEM au jour 0. Pour étudier l'activité anti-tumorale des anticorps, les souris sont traitées avec du PBS (véhicule) ou avec 10mg/kg d'un anticorps irrelevant (contrôle négatif), d'IgG4 anti-PDl (référence) et avec les différents variants d'IgGl anti-PDl (C6A_78, T5A_74, C6A_66) à raison de 200μL· par injection. Ces injections sont réalisées de manière intra-péritonéale aux jours 1, 4, 8 et 11. Chacun des groupes contient 10 animaux et les groupes consistent en : (i) un groupe véhicule, (ii) un contrôle négatif anticorps irrelevant, (iii) un groupe de référence IgG4 anti-PDl, (iv) un groupe IgGl anti-PDl C6A_78 (v) un groupe IgGl anti-PDl T5A_74, (vi) un groupe IgGl anti-PDl C6A_66. Les souris sont observées deux fois par semaine pour évaluer la croissance tumorale pendant environ 6 semaines. Les résultats indiquent que, avantageusement, les anti-PDl mutés selon l'invention conduisent à un effet d'inhibition de la croissance tumorale qui perdure plus longtemps que les anti-PDl parents, mais aussi que les IgG4 anti-PDl de référence. Cet effet peut être observé avec les IgGl anti-PDl mutés selon l'invention produits dans YB2/0 et avec les IgGl anti-PDl mutés selon l'invention produits dans CHO.
Exemple 2 : Effets des variants d'IgGl optimisés anti-CTLA4 sur le système immunitaire et la croissance tumorale
1) Obtention des anticorps
Les variants d'IgGl anti-CTLA4 ont été obtenus selon la méthode décrite dans la demande WO 2010/106180 qui utilise le procédé de mutagenèse aléatoire MUTAGEN™ (WO 02/038756). Typiquement, cette méthode comprend les étapes suivantes :
A/ Construction d'une banque de Fc
Le gène humain Fc codant pour les résidus 226 à 447 (selon l'index EU de Kabat et représenté en figure 1) dérivé de la chaîne lourde d'une IgGl humaine est cloné dans un vecteur approprié, tel que le vecteur phagemide pMG58 selon les protocoles standards bien connus de l'homme du métier. B/ Mutagenèse
Plusieurs banques sont ensuite générées, suivant la procédure décrite dans WO 02/038756, qui utilise des ADN polymérases humaines de faible fidélité dans le but d'introduire des mutations aléatoires de façon homogène sur la séquence cible entière. Plus précisément, trois mutases distinctes (pol β, η et l) ont été utilisées dans des conditions différentes pour créer des profils de mutations complémentaires.
Cl Expression des banques de Fc par Phage-display et sélection des variants présentant une liaison améliorée au récepteur néonatal FcRn
Les banques de Fc sont exprimées en utilisant la technique du Phage-display selon des protocoles standards, pour servir à la sélection des fragments Fc. La sélection peut se faire conformément au protocole détaillé dans la demande brevet WO 2010/106180, notamment par sélection sur FcRn en phase solide ou liquide, puis la détermination des caractéristiques de liaisons des fragments au FcRn peut être réalisée par ELISA.
D/ Production des variants sous forme d'Ig entière et évaluation de leurs propriétés
Les variants Fc ont été préparés dans un format IgGl entière dans la lignée cellulaire YB2/0 (ATCC, CRL-1662) d'une part, et dans CHO d'autre part, avec la spécificité anti-CTLA4. Les étapes de production par culture cellulaire et de purification des anticorps ont été réalisées selon des techniques courantes de l'art, en vue de leur caractérisation.
Plusieurs combinaisons de mutations ont été sélectionnées. Les combinaisons suivantes ont été sélectionnées :
Figure imgf000036_0001
Table 3 : Mutants d'IgGl anti-CTLA4 sélectionnés selon la méthode décrite dans la demande
WO2010/106180
2) Caractérisation de la liaison au FcRn et de la liaison antigénique:
Les tests de liaison au FcRn ont été réalisés selon les méthodes décrites dans la demande WO 2010/106180. Brièvement, la liaison des IgGl au FcRn à pH 6 et au ligand CTLA4 ont été mesurées par un test ELISA classique. Pour cela des immunoplaques Maxisorp ont été revêtues avec des FcRn ou des antigènes CTLA4. Ensuite, les solutions d'IgGl anti- CTLA4 parent, Del294 et C6_A66 produits en CHO ou YB2/0 ont été ajoutés dans chaque puits avec une concentration finale de O^g d'IgG/mL et ont été mis en contact avec des F(ab')2 d'IgG HRP de chèvre anti-humaine à la même concentration pendant 2 heures à température ambiante. Les IgG agrégées aux F(ab')2 ont ensuite été incubées sous agitation douce pendant 1 heure à 30°C sur les plaques ELISA saturées pour FcRn et CTLA4. Les plaques sont ensuite révélées avec TMB (Pierce) et les absorbances sont lues à 450 nm. Les résultats finaux indiquent que la liaison au FcRn du mutant Del294 n'est pas altérée et que celle du mutant C6A_66 est augmentée, quel que soit le système de production cellulaire utilisé. La liaison à l'antigène CTLA4 des deux mutants n'est pas altérée par rapport à un IgGl anti-CTLA4 parent de référence (Table 4).
Figure imgf000037_0001
Table 4 : Résultats de la caractérisation de la liaison au FcRn et à l'antigène CTLA4 des IgGl anti-CTLA4 variants sélectionnés (++ : augmentation de la liaison au FcRn comparé à l'IgGl anti-CTLA4 parent ; = : même affinité de liaison à l'antigène CTLA4 comparé à l'IgGl anti- CTLA4 parent)
3) Tests de l'activité ADCC des mutants anti-CTLA4
Des cellules NK sont incubées avec des cellules eucaryotes cibles exprimant CTLA4, en présence de différentes concentrations (0.005 à 5000 ng/ml) d'IgGl anti-CTLA4 parent et de variants IgGl anti-CTLA4 294del et C6A_66 produits en YB2/0 ou en CHO. Le niveau de lactate déshydrogénase (LDH) intracellulaire libéré par les cellules cibles lysées est mesuré. Des cellules NK humaines ont été purifiées à partir de sang périphérique de donneurs volontaires sains par la technique de déplétion négative développée par Miltenyi. Le test ADCC comprend l'incubation de cellules NK avec des cellules eucaryotes cibles exprimant l'antigène CTLA4, en présence de différentes concentrations d'anticorps anti-CTLA4. Après 16 heures d'incubation, la cytotoxicité induite par les anticorps anti-CTLA4 a été mesurée en quantifiant dans les surnageants cellulaires la LDH intracellulaire libérée par les cellules cibles lysées. Les résultats indiquent que les variants d'IgGl anti-CTLA4 présentent une activité ADCC diminuée par rapport à l'IgGl anti-CTLA4 parent quel que soit le système de production cellulaire utilisé.
4) Effet des anticorps anti-CTLA4 sélectionnés sur la libération de cytokines Les lymphocytes T humains sont purifiés à partir de PBMC en utilisant une colonne d'enrichissement à lymphocytes T CD4+ (telle que celle développée par R&D Systems). Chaque puits de culture cellulaire contient 10*5 cellules T purifiées et 10*4 cellules dendritiques allogéniques pour un volume total de 200μL·. Les anticorps anti-CTLA4 (Del294, C6A_66, IgGl parent, comme référence) sont ajoutés à différentes concentrations. Certains puits sont incubés avec des anticorps anti-CD3 (contrôle positif) ou avec des anticorps irrelevants (contrôle négatif). Les cellules sont mises en culture pendant 5 jours à 37°C. Au 5eme jour, ΙΟΟμί de milieu sont prélevés dans chacun des puits pour mesurer la quantité de cytokines sécrétées. Les taux de cytokines IFN-gamma, TNF- alpha, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 et IL-12 ont été quantifiés par cytométrie en flux de perle Array (CBA) (BD Biosciences). Les résultats indiquent que les traitements avec les variants anti-CTLA4 entraînent une stimulation plus forte de la sécrétion de cytokines par les cellules par rapport au traitement avec l'IgGl anti-CTLA4 parent, quel que soit le système de production cellulaire utilisé.
5) Effet anti-tumoral des IgGl anti-CTLA4 sur les modèles in vivo
Un modèle de tumeur in vivo est utilisé pour analyser l'effet des variants d'anticorps anti- CTLA4 sur la croissance tumorale. Les souris knock-in CTLA4 (telles que celles proposées par Oncolmmune, Inc), mâles et femelles âgées de 7 à 10 semaines réparties en 5 groupes, subissent des injections sous-cutanées de cellules de fibrosarcomes SA1/N à raison de 2*106 cellules dissoutes dans 200μL· de DMEM au jour 0. Pour étudier l'activité anti-tumorale des anticorps, les souris sont traitées avec du PBS (véhicule) ou avec 10mg/kg d'un anticorps irrelevant (contrôle négatif), d'IgGl anti-CTLA4 parent (référence) et avec les différents variants IgGl (294del, C6A_66) produits dans CHO ou YB2/0 à raison de 200μί par injection. Ces injections sont réalisées de manière intra-péritonéale aux jours 1, 4, 8 et 11. Chacun des groupes contient 10 animaux et les groupes consistent en : (i) un groupe véhicule, (ii) un contrôle négatif irrelevant, (iii) un groupe de référence IgGl anti-CTLA4 parent, (iv) un groupe IgGl anti-CTLA4 294del et (v) un groupe IgGl anti-CTLA4 C6A_66. Les souris sont observées deux fois par semaine pour évaluer la croissance tumorale pendant environ 6 semaines. Les résultats indiquent que, avantageusement, les anti-CTLA4 mutés selon l'invention conduisent à un effet d'inhibition de la croissance tumorale qui perdure plus longtemps que les anti-CTLA4 parents. Cet effet peut être observé avec les anti-CTLA4 mutés selon l'invention produits dans YB2/0 et avec les anti-CTLA4 mutés selon l'invention produits dans CHO. Exemple 3 : Préparation et propriétés des variants d'IgGl et d'IgG4 optimisés anti-PDl
Dans cet exemple, un anticorps d' isotype IgG4 de spécificité anti-PDl a été produit avec une séquence non mutée selon l'invention de Fc d'IgG4, telle que la séquence SEQ ID NO :9, pour servir de référence (IgG4_S228P).
1) Obtention des anticorps variants d'IgGl sous forme d'IgGl entière dans CHO-S
Les variants Fc ont été préparés dans un format IgGl entière dans la lignée cellulaire CHO-S avec la spécificité anti-PDl.
Pour cela, les séquences VH et VL du nivolumab (SEQ ID NO : 11 et 12 respectivement), ou bien les séquences VH et VL du pembrolizumab (SEQ ID NO : 13 et 14 respectivement) ont été utilisées comme parties variables.
Chaque mutation d'intérêt dans le fragment Fc a été insérée indépendamment dans un vecteur d'expression contenant la chaîne lourde anti-PDl (contenant la partie variable de l'anticorps anti-PDl nivolumab et pembrolizumab, et la partie constante de région Fc wild-type) par PCR de chevauchement en utilisant deux ensembles d'amorces adaptées pour intégrer la ou les mutation(s) ciblées avec le(s) codon(s) codant l'acide aminé souhaité. Les fragments ainsi obtenus par PCR ont été associés et le fragment résultant a été amplifié par PCR en utilisant des protocoles standards. Le produit de PCR, contenant la chaîne lourde entière de anti-PDl muté sur le fragment Fc, a été purifié sur gel d'agarose 1% (w/v), digéré avec les enzymes de restriction adéquates et cloné dans un vecteur d'expression eucaryote qui contient également la chaîne légère non modifiée de l'anticorps anti-PDl considéré.
Les étapes de production par culture cellulaire et de purification des anticorps ont été réalisées selon des techniques courantes de l'art, en vue de leur caractérisation.
Les combinaisons de mutations sélectionnées sont les suivantes:
Variant Mutations
IgGl_C6A_74 V259I/N315D/N434Y
nivolumab
IgGl_C6A_74Del294 V259I/Del294/N315D/N434Y
nivolumab
IgGl_C6A_74 V259I/N315D/N434Y
pembrolizumab
IgGl_C6A_74Del294 V259I/Del294/N315D/N434Y pembrolizumab
Table 5 : Mutants d'IgGl anti-PDl produits dans le cadre de l'invention
2) Obtention des anticorps variants d'IgG4
Les variants d'IgG4 anti-PDl ont été obtenus par mutagenèse dirigée de la même manière que décrit ci- avant.
Les combinaisons de mutations sélectionnées sont les suivantes:
Figure imgf000040_0001
Table 6 : Mutants d'IgG4 anti-PDl produits dans le cadre de l'invention
3) Caractérisation des liaisons au FcRn et au récepteur CD64 humain (FcyRI), et de la liaison antigénique:
3.1. Liaison au récepteur PD1 humain (protéine recombinante telle que R&D System PD1- Fc réf 1086-PD) et au récepteur CD64 humain (hCD64) (hFcyRI):
Des immunoplaques Maxisorp sont revêtues avec l'antigène PD1 (humain, singe cynomolgus ou murin) en PBS (lOng, lOng, 20ng par puits respectivement) ou le récepteur humain CD64 (lOOng/puits) pendant une nuit à 4°C (ΙΟΟμΙ/puits). Après saturation des plaques pendant 2 heures en tampon PBS et BSA 4%, les solutions d'IgGl ou IgG4 anti-PDl parent ou de chaque variant sont ajoutées dans chaque puits à des concentrations croissantes (de 0,00625 à 0^g/ml pour PD1 et de 0,03125 à ^g/ml pour hCD64) pendant lh à 37°C puis sont mises en contact avec des F(ab')2 d'IgG HRP de chèvre anti-CK humaine pendant lh à 37°C. Les IgG liées sont détectées après révélation au TMB par mesure de l'absorbance à 450 nm.
Concernant la liaison antigénique, les résultats montrent que tous les variants nivolumab testés (IgGl_C6A_74Del294 nivolumab, IgGl_C6A_74 nivolumab et IgG4_S228P/C6A_74 nivolumab) et les références (IgGl_WT et IgG4_S228P) reconnaissent l'antigène humain PD1 et l'antigène PD1 de singe cynomolgus, et ne reconnaissent pas l'antigène PD1 murin. Les mêmes résultats peuvent être observés avec les variants pembrolizumab Les résultats figurent en tables 7a et 7b
Figure imgf000041_0002
Table 7a : Liaison des différents mutants de nivolumab à l'antigène PDl humain, murin ou de cynomolgus
Figure imgf000041_0003
Table 7b : Liaison des différents mutants de pembrolizumab à l'antigène PDl humain, murin ou de cynomolgus
Concernant la liaison à hCD64, les variants IgG4 nivolumab (IgG4_S228P/C6A_74 nivolumab mais aussi IgGl_C6A-74Del294 nivolumab) présentent une faible liaison, alors que cette dernière est forte avec IgGl_WT et IgGl_C6A_74 nivolumab.
Les résultats figurent en tables 8a et 8b :
Figure imgf000041_0004
Table 8a : Liaison des différents mutants de nivolumab à hCD64
Figure imgf000041_0001
Table 8b : Liaison des différents mutants de pembrolizumab à hCD64
3.2. Liaison au récepteur FcRn (protéine recombinante FcRna humaine et β2- microglobuline) :
Des immunoplaques Maxisorp sont revêtues avec le FcRn en tampon phosphate à pH6 (250ng par puits) pendant une nuit à 4°C (ΙΟΟμΙ/puits). Après saturation des plaques pendant 2 heures en tampon phosphate pH6 et lait écrémé 5%, les solutions d'IgGl ou IgG4 anti-PDl parent ou de chaque variant sont ajoutées dans chaque puits à des concentrations croissantes (de 0,00488 à 10μg/ml) pendant lh à 37°C puis sont mises en contact avec des F(ab')2 d'IgG HRP de chèvre anti-CK humaine pendant lh à 37°C. Les IgG liées sont détectées après révélation au TMB par mesure de l'absorbance à 450 nm.
Les résultats montrent que les variants nivolumab testés (IgGl_C6A_74Del294 nivolumab et IgG4_S228P/C6A_74 nivolumab mais aussi IgGl_C6A_74 nivolumab) présentent une forte liaison au FcRn. Les mêmes observations sont faites avec les variants pembrolizumab.
Les résultats figurent en tables 9a et 9b :
Figure imgf000042_0001
Figure imgf000042_0002
Table 9b : Liaison des différents mutants de pembrolizumab au FcRn
3.3. Les variants d'IgG ont été testés pour leur liaison à plusieurs FcyRs humains par ELISA. Des immunoplaques Maxisorp ont été revêtues avec 50ng hCD32aH/puits ou 75ng hCD16aV/puits dans du PBS. Des plaques chélatantes au nickel immobilisantes (Hisgrab Pierce) ont été revêtues avec 50ng hCD32aR/puits ou lOOng hCD32b/puits dans du PBS. Après le revêtement pendant une nuit à 4°C, les plaques ont été lavées deux fois avec du PBS/0,05 Tween-20 et saturées avec du PBS/4 de BSA pendant 2 heures à 37°C. En parallèle, les surnageants ont été dilués dans du PBS à une concentration finale de 1 μg d'IgG/ml et mélangés avec des F(ab')2 d'IgG HRP de chèvre anti-CK à la même concentration pendant 2 heures à température ambiante. Les IgG agrégées aux F(ab')2 sont ensuite incubées sous agitation douce pendant 1 heure à 30°C sur les plaques ELISA saturées à différentes dilutions en PBS. Les plaques sont ensuite révélées avec TMB (Pierce) et l'absorbance lues à 450 nm.
Les résultats montrent à chaque fois une forte liaison pour IgGl_WT nivolumab et IgGl_C6A_74 nivolumab, et une faible liaison pour les autres variants.
Les résultats figurent en tables 10a et 10b :
Figure imgf000043_0001
Table 10a : Liaison des différents mutants de nivolumab à différents FcyRs humains
Figure imgf000043_0002
Table 10b : Liaison des différents mutants de pembrolizumab à différents 'cyRs humains
4) Etude pharmacocinétique des différents variants selon l'invention: Des expériences de pharmacocinétique ont été effectuées chez les souris exprimant h FcRn qui sont homozygotes KO pour un allèle du FcRn miirin et hétérozygote pour un transgène de FcRn humain ( mFcRn ' hFcRnTg).
Pour ces études pharmacocinétiques, chaque animal a reçu une seule injection intraveineuse d'IgG à 5 m g/k au niveau du sinus rétro-orbital, dans un protocole similaire à celui décrit précédemment (Petkova SB, et al. Enhanced half-life of genetically engineered human IgGl antibodies in a humanized FcRn mouse model: potential application in humorally mediated autoimmune disease. Int Immunol 2006).
Généralement la demi-vie est calculée à partir des concentrations plasmatiques mesurées durant la phase d'élimination.
Le temps de demi- vie peut être ainsi obtenu :
- par résolution d'équation:
Tl/2 = (Ln2 x Vd) / CL, avec
Vd = volume de distribution = Dose / concentration plasmatique initiale
CL = Clairance = Dose / AUC (aire sous la courbe) - par analyse graphique en déterminant sur l'axe des ordonnées (concentration en μg/ml) l'intervalle de temps écoulé entre la concentration Cl et la concentration C2. Il est impératif de tracer cette courbe en échelle semi-logarithmique afin de s'assurer de l'alignement des points expérimentaux dans cette dernière phase dite d'élimination. La durée d'exploration de cette pente doit être suffisamment longue pour permettre une estimation précise de la demi- vie.
Une fois la pente de la phase d'élimination mesurée (ke ou constante d'élimination), la demi- vie peut être calculée comme suit :
Tl/2 = Ln2 / ke = 0.693 / ke Par ailleurs, le MRT ou le temps moyen de résidence peut être estimé. Il traduit la durée de présence du polypeptide Fc dans l'organisme.
Le MRT peut être obtenu comme suit :
MRT = AUC / AUMC, avec
AUC = moment d'ordre 0 de la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps AUMC = moment d'ordre 1 de la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps.
Des échantillons de sang ont été prélevés à partir du sinus rétro-orbital à de multiples points de temps et les IgGs titrées par ELISA.
Les résultats montrent à chaque fois une demi-vie augmentée des mutants IgGl_C64_74Del294 nivolumab et IgG4_S228P/C6A_74 nivolumab, par rapport aux références respectives IgGl_WT et IgG4_S228P.
Les résultats sont donnés en table 11 :
Figure imgf000045_0001
Table 11 : Résultats pharmacocinétiques des différents mutants de nivolumab
Tl/2 = demi-vie
Cmax = concentration maximale observée
AUC = aire sous la courbe extrapolée jusqu 'à l 'infini
Vd = volume de distribution
CL = clairance
MRTinf = temps moyen de résidence lorsque le profil de concentration est extrapolé à l'infini 5) Caractérisation des liaisons cellulaires au récepteur humain FcRn, à CD64 humain
(FcyRI), au récepteur humain CD16aV et test d'activation de cellules Jurkat exprimant PD1 :
5.1. Test de liaison cellulaire au récepteur humain FcRn
La liaison au récepteur humain FcRn (hFcRn) a été évaluée sur cellules par un test de compétition utilisant Rituxan marqué par le fluorochrome Alexa 488 (Rituxan A488) et des cellules Jurkat exprimant le récepteur hFcRn à leur surface (Jurkat-hFcRn). Les cellules Jurkat-hFcRn ont été incubées pendant 20 minutes à 4°C avec des concentrations variables (500; 250; 125; 62; 31; 15; 8; 4; 2 et 0 μg/ml) des anticorps des tables 5 et 6 dilués en PBS pH6, simultanément avec Rituxan- A488 utilisé à une concentration fixe. Après lavage, la fixation de Rituxan- A488 au hFcRn exprimé par les cellules Jurkat-hFcRn a été évaluée par cytométrie en flux. Les valeurs de fluorescence moyenne (MFI) observée ont été exprimées en pourcentage, 100% était la valeur obtenue avec Rituxan-A488 seul et 0% la valeur en l'absence de Rituxan-A488. La figure 2 montre que les mutants de nivolumab selon l'invention lient le récepteur hFcRn exprimé à la surface des cellules avec une forte affinité.
5.2. Test de liaison cellulaire au récepteur humain CD64
La liaison au récepteur humain CD64 a été évaluée sur cellules par un test de compétition utilisant Rituxan marqué par le fluorochrome Alexa 488 et des cellules Jurkat exprimant le récepteur CD64 à leur surface (Jurkat-CD64).
Les cellules Jurkat-CD64 ont été incubées pendant 20 minutes à 4°C avec des concentrations variables (500; 250; 125; 62; 31; 15; 8; 4; 2 et 0 μg/ml) des anticorps des tables 5 et 6 dilués en PBS pH7,4, simultanément avec Rituxan-A488 utilisé à une concentration fixe.
Après lavage, la fixation de Rituxan- A488 au CD64 exprimé par les cellules Jurkat-CD64 a été évaluée par cytométrie en flux. Les valeurs de fluorescence moyenne (MFI) observée ont été exprimées en pourcentage, 100% était la valeur obtenue avec Rituxan-A488 seul et 0% la valeur en l'absence de Rituxan-A488.
5.3. Test de liaison cellulaire au récepteur humain hCD16aV
La liaison au récepteur humain hCD16aV a été évaluée sur cellules par un test de compétition utilisant Rituxan marqué par le fluorochrome Alexa 488 et des cellules Jurkat exprimant le récepteur hCD 16aV à leur surface (Jurkat-hCD 16aV) .
Les cellules Jurkat-hCD 16aV ont été incubées pendant 20 minutes à 4°C avec des concentrations variables (500; 250; 125; 62; 31; 15; 8; 4; 2 et 0 μg/ml) des anticorps des tables 5 et 6 dilués en PBS pH7,4, simultanément avec Rituxan-A488 utilisé à une concentration fixe.
Après lavage, la fixation de Rituxan-A488 au hCDlôaV exprimé par les cellules Jurkat- hCDlôaV a été évaluée par cytométrie en flux. Les valeurs de fluorescence moyenne (MFI) observée ont été exprimées en pourcentage, 100% était la valeur obtenue avec Rituxan-A488 seul et 0% la valeur en l'absence de Rituxan-A488.
La figure 3 montre les résultats de liaison des différents mutants de nivolumab au récepteur hCDlôaV.
5.4. Test d'activation de cellules Jurkat-PDl par l'étude du relargage d'IL-2
Les cellules cibles Jurkat exprimant le PD1 humain à leur surface (Jurkat-PDl) ont été incubées avec des concentrations croissantes des anticorps anti-PDl (0 à 500 ng/ml) en présence de cellules Jurkat exprimant le récepteur CD 16 humain et d'acétate et myristate de phorbol (PMA).
Après 16 heures d'incubation à 37 °C, la quantité d'IL-2 relarguée par les cellules Jurkat CD 16 a été mesurée par colorimétrie (R&D Systems DuoSet Kit IL-2).
Ce test permet de vérifier in vitro l'absence de fonction effectrice des anticorps produits selon l'invention.
Conclusion
Les tests décrits permettent de confirmer les propriétés fonctionnelles des différents variants d'IgGl et IgG4 décrits dans le cadre de la présente demande. En particulier, les résultats décrits permettent de confirmer les propriétés avantageuses des mutants IgGl et IgG4 de Nivolumab et Pembrolizumab, présentant une demi-vie améliorée dans l'organisme par rapport aux Ig de référence, permettant un effet prolongé anti-tumoral, et possédant des propriétés de liaison aux récepteurs Fcgamma humains avantageux pour des propriétés effectrices améliorées.

Claims

Revendications
Anticorps inhibiteur d'au moins un point de contrôle immunitaire, possédant une région Fc modifiée par rapport à celle d'un anticorps parent et comprend au moins deux mutations, lesdites mutations étant choisies parmi:
(i) une mutation choisie parmi 378V, 378T, 434Y et 434S et
(ii) au moins une mutation choisie parmi 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 378V, 378T, 389T, 389K, 434Y et 434S,
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).
Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce que le point de contrôle immunitaire est un récepteur inhibiteur des cellules effectrices immunitaires.
Anticorps selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le point de contrôle immunitaire est choisi parmi PD1, CTLA4, TIM3, LAG3, KIR, BTLA1 et a2AR.
Anticorps selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la région Fc comprend au moins une combinaison de mutations choisies parmi 226G/315D/434Y, 230S/315D/434Y, 230T/315D/434Y, 230T/264E/434S, 230T/389T/434S, 241L/264E/378V, 241L/264E/434S, 250A/389K/434Y, 2591/315D/434Y, 284E/378T/396L, 264E/378V/434Y, 345D/330V/434Y, 315D/382V/434Y et 378V/383N/434Y par rapport à la région Fc dudit anticorps parent, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
Anticorps selon la revendication 4, caractérisé en ce que la région Fc comprend en outre au moins une mutation choisie parmi 226G, 227L, 230S, 230T, 230L, 231T, 241L, 243L, 250A, 256N, 2591, 264E, 265G, 267R, 290E, 294del, 303A, 305A, 307P, 307A, 3081, 315D, 322R, 325S, 327V, 330V, 342R, 347R, 352S, 361D, 362R, 362E, 370R, 378V, 378T, 382V, 383N, 386R, 386K, 387T, 389T, 389K, 392R, 395A, 396L, 397M, 403T, 404L, 415N, 416K, 421T, 426T, 428L, 433R, 434Y, 434S et 439R par rapport à la région Fc dudit anticorps parent, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la région Fc comprend une combinaison de mutations choisies parmi 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 256N/378V/383N/434Y, 315D/330V/361D/378V/434Y, 345D/330V/361D/378V/434Y, 2591/315D/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 241L/264E/307P/378V/433R, 250A/389K/434Y,
305A/315D/330V/395A/343Y, 264E/386R/396L/434S/439R, 315D/330V/362R/434Y, 294del/307P/434Y, 305 A/315D/330V/389K/434Y, 315D/327V/330V/397M/434Y, 230T/241L/264E/265G/378V/421T, 264E/396L/415N/434S, 227L/264E/378V/434S, 264E/378T/396L, 230T/315D/362R/426T/434Y, 226G/315D/330V/434Y,
230L/241L/243L/264E/307P/378V, 250A/315D/325S/330V/434Y,
290E/315D/342R/382V/434Y, 241L/315D/330V/392R/434Y,
241L/264E/307P/378W/434S, 230T/264E/403T/434S, 264E/378V/416K,
230T/315D/362E/434Y, 226G/315D/434Y, 226G/315D/362R/434Y,
226G/264E/347R/370R/378V/434S, 3081/315D/330V/382V/434Y,
230T/264E/378V/434S, 231T/241L/264E/378T/397M/434S, 230L/264E/378W/434S, 230T/315D/330V/386K/434Y, 226G/315D/330V/389T/434Y, 267R/307P/378V/421T/434Y, 230S/315D/387T/434Y, 230S/264E/352S/378V/434S et 230T/303A/322R/389T/404L/434S par rapport à la région Fc dudit anticorps parent, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
Anticorps selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la région Fc comprend une combinaison de mutations choisie parmi 315D/330V/361D/378V/434Y, 230S/315D/428L/434Y, 307A/315D/330V/382V/389T/434Y, 2591/315D/434Y et 256N/378V/383N/434Y.
Anticorps selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il présente une activité fonctionnelle médiée par la région Fc modifiée, en particulier diminuée, par rapport à celle de l'anticorps parent.
Anticorps selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il présente une activité fonctionnelle médiée par la région Fc modifiée, en particulier diminuée par rapport à celle de l'anticorps parent, d'un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30.
10. Anticorps selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que ladite activité fonctionnelle médiée par la région Fc est choisie parmi la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), la cytotoxicité dépendante du complément (CDC), la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP), et une combinaison d'au moins deux de ces activités.
11. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'une mutation choisie parmi 294Del, 293Del et 293del/294del est introduite dans la région Fc de l'anticorps parent, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
12. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 10, présentant une activité fonctionnelle médiée par la région Fc modifiée par rapport à celle d'un anticorps parent, caractérisé en ce que ladite région Fc comprend au moins une combinaison de 2 mutations, ladite combinaison étant choisie parmi :
(i) une mutation choisie parmi 307N, 326E, 326T, 334N, 334R, 352L, 378V, 378T, 394P, 396L, 397M et 421T ; et
(ii) au moins une mutation choisie parmi 226Y, 227S, 230S, 231V, 234P, 2431, 243L, 246R, 246E, 247T, 248E, 253F, 254F, 255W, 259A, 261R, 262A, 263A, 266M, 267N, 267G, 274E, 274R, 276S, 278H, 282A, 283G, 284L, 2861, 286Y, 287T, 288E, 288R, 290E, 298N, 302A, 305A, 307P, 308A, 3081, 308G, 309P, 312G, 315D, 316D, 319H, 320T, 320R, 320M, 322E, 3231, 325S, 333G, 334N, 334R, 336T, 339T, 340E, 343S, 345G, 349S, 349H, 350A 352S, 359A, 361H, 362R, 3631, 366A, 373D, 375R, 377T, 378V, 378T, 379A, 380G, 383R, 385R, 389S, 389T, 392R, 393A, 3931, 394P, 396L, 3971, 397M, 398P, 405V, 405L, 410R, 412M, 414R, 421T, 421S, 423L, 423Y, 423S, 423P, 428T, 431V, 431T, 434K, 434S, 435R, 436H, 439R, 440G, 440N, 442F, 442P et 447N, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).
13. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ladite région Fc modifiée a une affinité modifiée pour au moins un des récepteurs de la région Fc (FcR) choisi parmi le complément Clq et les récepteurs FcgRIIIa (CD16a), FcgRIIa (CD32a), et FcgRIIb (CD32b).
14. Anticorps selon la revendication 13, caractérisé en ce que ladite région Fc modifiée a une affinité augmentée pour le récepteur FcgRIIb (CD32b), et comprend au moins une combinaison de 2 mutations, ladite combinaison comprenant :
i) une mutation choisie parmi 326E, 326T, 378V, 397M, 352L, 394P, 396L et 421T ; et
ii) au moins une mutation choisie parmi 316D, 334R, 248E, 334N, 418P, 231V, 320E, 402D, 359A, 383R, 421T et 361H,
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat et avec la condition que la mutation (i) n'a pas lieu sur le même acide aminé que la mutation (ii).
15. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que l'anticorps parent comprend une région Fc parente qui est une région Fc humaine, de préférence une région
Fc d'une IgGl humaine ou d'une IgG2 humaine ou d'une IgG4 humaine.
16. Anticorps selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'anticorps parent comprend une région Fc parente qui est une région Fc d'une IgG4 humaine mutée en position 228, de préférence comprenant la mutation S228P, de préférence de séquence SEQ ID NO : 4 ou 9 et comprenant la mutation S228P.
17. Composition pharmaceutique comprenant (i) au moins un anticorps selon l'une des revendications 1 à 16, et (ii) au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
18. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 16 ou composition pharmaceutique selon la revendication 17, pour son utilisation dans le traitement de cancers.
PCT/EP2017/063158 2016-05-31 2017-05-31 Anticorps pour le traitement de cancers Ceased WO2017207628A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA3026145A CA3026145A1 (fr) 2016-05-31 2017-05-31 Anticorps pour le traitement de cancers
US16/305,832 US20190218292A1 (en) 2016-05-31 2017-05-31 Antibody for cancer treatment
EP17728131.8A EP3464359A1 (fr) 2016-05-31 2017-05-31 Anticorps pour le traitement de cancers

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1654891 2016-05-31
FR1654891A FR3051794A1 (fr) 2016-05-31 2016-05-31 Anticorps pour le traitement de cancers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017207628A1 true WO2017207628A1 (fr) 2017-12-07

Family

ID=56943665

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2017/063158 Ceased WO2017207628A1 (fr) 2016-05-31 2017-05-31 Anticorps pour le traitement de cancers

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20190218292A1 (fr)
EP (1) EP3464359A1 (fr)
CA (1) CA3026145A1 (fr)
FR (1) FR3051794A1 (fr)
WO (1) WO2017207628A1 (fr)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019115773A1 (fr) * 2017-12-15 2019-06-20 Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Variants avec fragment fc ayant une affinité augmentée pour fcrn et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment fc
US10513558B2 (en) 2015-07-13 2019-12-24 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-PD1 antibodies, activatable anti-PD1 antibodies, and methods of use thereof
US10844119B2 (en) 2016-10-11 2020-11-24 Agenus Inc. Anti-LAG-3 antibodies and methods of use thereof
EP3997126A4 (fr) * 2019-07-09 2024-01-24 Zydus Lifesciences Limited Anticorps dirigés contre le récepteur de mort programmée humaine pd-1
RU2820162C2 (ru) * 2017-12-15 2024-05-30 Ксл Инновейшн Пти Лтд Варианты с fc-фрагментом, обладающие повышенной аффинностью к fcrn и повышенной аффинностью по меньшей мере к одному рецептору fc-фрагмента

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN119255817A (zh) * 2022-03-28 2025-01-03 齐鲁制药有限公司 包含抗ctla4和抗pd1的混合抗体的药物组合物及其治疗用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010106180A2 (fr) * 2009-03-20 2010-09-23 Lfb Biotechnologies Variants fc optimisés
WO2014089113A1 (fr) * 2012-12-03 2014-06-12 Bristol-Myers Squibb Company Amélioration de l'activité anticancéreuse de protéines de fusion de fc immuno-modulatrices

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010106180A2 (fr) * 2009-03-20 2010-09-23 Lfb Biotechnologies Variants fc optimisés
WO2014089113A1 (fr) * 2012-12-03 2014-06-12 Bristol-Myers Squibb Company Amélioration de l'activité anticancéreuse de protéines de fusion de fc immuno-modulatrices

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAHAN RONY ET AL: "Fc[gamma]Rs Modulate the Anti-tumor Activity of Antibodies Targeting the PD-1/PD-L1 Axis.", CANCER CELL 14 SEP 2015, vol. 28, no. 3, 14 September 2015 (2015-09-14), pages 285 - 295, XP002766294, ISSN: 1878-3686 *
LI XIAODONG ET AL: "Emerging immune checkpoints for cancer therapy.", ACTA ONCOLOGICA (STOCKHOLM, SWEDEN) NOV 2015, vol. 54, no. 10, November 2015 (2015-11-01), pages 1706 - 1713, XP002766293, ISSN: 1651-226X *
SCAPIN GIOVANNA ET AL: "Structure of full-length human anti-PD1 therapeutic IgG4 antibody pembrolizumab.", NATURE STRUCTURAL & MOLECULAR BIOLOGY DEC 2015, vol. 22, no. 12, December 2015 (2015-12-01), pages 953 - 958, XP002766296, ISSN: 1545-9985 *
YANG XIAOYU ET AL: "Comprehensive Analysis of the Therapeutic IgG4 Antibody Pembrolizumab: Hinge Modification Blocks Half Molecule Exchange In Vitro and In Vivo.", JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES DEC 2015, vol. 104, no. 12, December 2015 (2015-12-01), pages 4002 - 4014, XP009192999, ISSN: 1520-6017 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10513558B2 (en) 2015-07-13 2019-12-24 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-PD1 antibodies, activatable anti-PD1 antibodies, and methods of use thereof
US10882908B2 (en) 2016-10-11 2021-01-05 Agenus Inc. Anti-LAG-3 antibodies and methods of use thereof
US12187795B2 (en) 2016-10-11 2025-01-07 Agenus Inc. Anti-LAG-3 antibodies and methods of use thereof
US11993651B2 (en) 2016-10-11 2024-05-28 Agenus Inc. Anti-lag-3 antibodies and methods of use thereof
US10844119B2 (en) 2016-10-11 2020-11-24 Agenus Inc. Anti-LAG-3 antibodies and methods of use thereof
AU2018382593B2 (en) * 2017-12-15 2025-09-18 Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Variants with Fc fragment having an increased affinity for FcRn and an increased affinity for at least one receptor of the Fc fragment
JP2021508444A (ja) * 2017-12-15 2021-03-11 ラボラトワール フランセ デュ フラクシオヌマン エ デ ビオテクノロジＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｆｒａｎｃａｉｓ Ｄｕ Ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ Ｅｔ Ｄｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＦｃＲｎに対する増大した親和性および少なくとも１つのＦｃフラグメント受容体に対する増大した親和性を有するＦｃフラグメントを伴う変異体
JP2023134604A (ja) * 2017-12-15 2023-09-27 ラボラトワール フランセ デュ フラクシオヌマン エ デ ビオテクノロジ ＦｃＲｎに対する増大した親和性および少なくとも１つのＦｃフラグメント受容体に対する増大した親和性を有するＦｃフラグメントを伴う変異体
CN111601821A (zh) * 2017-12-15 2020-08-28 法国血液分割暨生化制品实验室 具有对FcRn的亲和力提高以及对至少一个Fc片段受体的亲和力提高的Fc片段的变体
RU2820162C2 (ru) * 2017-12-15 2024-05-30 Ксл Инновейшн Пти Лтд Варианты с fc-фрагментом, обладающие повышенной аффинностью к fcrn и повышенной аффинностью по меньшей мере к одному рецептору fc-фрагмента
FR3075200A1 (fr) * 2017-12-15 2019-06-21 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Variants avec fragment fc ayant une affinite augmentee pour fcrn et une affinite augmentee pour au moins un recepteur du fragment fc
WO2019115773A1 (fr) * 2017-12-15 2019-06-20 Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Variants avec fragment fc ayant une affinité augmentée pour fcrn et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment fc
KR102932628B1 (ko) * 2017-12-15 2026-02-27 라보라토이레 프란카이즈 듀 프락티온네먼트 에트 데스 바이오테크놀로지스 FcRn에 대한 증가된 친화성 및 적어도 하나의 Fc 단편 수용체에 대한 증가된 친화성을 가진 Fc 단편을 가진 변이체
JP7897688B2 (ja) 2017-12-15 2026-07-30 ラボラトワール フランセ デュ フラクシオヌマン エ デ ビオテクノロジ ＦｃＲｎに対する増大した親和性および少なくとも１つのＦｃフラグメント受容体に対する増大した親和性を有するＦｃフラグメントを伴う変異体
EP3997126A4 (fr) * 2019-07-09 2024-01-24 Zydus Lifesciences Limited Anticorps dirigés contre le récepteur de mort programmée humaine pd-1
US12516121B2 (en) 2019-07-09 2026-01-06 Zydus Lifesciences Limited Antibodies to human programmed death receptor PD-1

Also Published As

Publication number Publication date
US20190218292A1 (en) 2019-07-18
EP3464359A1 (fr) 2019-04-10
FR3051794A1 (fr) 2017-12-01
CA3026145A1 (fr) 2017-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114007699B (zh) 拮抗剂抗cd7抗体
EP3378487B1 (fr) Polythérapie utilisant une molécule de liaison à l'antigène à rôle de redirection des cellules t, ciblant des cellules immunosupressives
CA2590303C (fr) Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoietiques lymphoides de type b
EP3319989B1 (fr) Utilisation de fragments fc modifies en immunotherapie
EP3464359A1 (fr) Anticorps pour le traitement de cancers
EP2931749B1 (fr) Utilisation d'anticorps monoclonaux pour le traitement de l'inflammation et d'infections bacteriennes
EP3277723A1 (fr) Lignee cellulaire surexprimant l'antigene cd303 humain
CN114585416B (zh) 用于调节免疫应答和治疗疾病的btla结合（cd272）抗体
HUE029946T2 (en) Anti-CD4 antibody
HUE029465T2 (en) Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US20240327544A1 (en) Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in combination therapy for cancer
TW202144423A (zh) 抗ｏｘ４０抗體及其用途
EP3481865B1 (fr) Mutants fc à activité fonctionnelle ameliorée
WO2022239820A1 (fr) Anticorps agoniste anti-pd-1 humain pour le traitement ou la prévention de maladies inflammatoires, et composition pharmaceutique le contenant
EP3601342A1 (fr) Anticorps dirigés contre un ligand d'un point de contrôle immunitaire avec fragment fc ayant une affinité améliorée pour cd16a
JP2024536383A (ja) 併用におけるｐｄ－ｌ１およびｃｄ１３７に対する多重特異性結合剤
EP3390452B1 (fr) Nouvelle utilisation d'un anticorps dirige contre la proteine membranaire cd303
WO2018109209A1 (fr) Combinaison d'anticorps anti-cd303 et anti-amhrii
CN117957253A (zh) 癌症的组合治疗中针对cd40和cd137的多特异性结合剂
CN121620391A (zh) 用于治疗癌症的针对pd-l1和cd137的多特异性结合剂
CN118339183A (zh) 组合中针对pd-l1和cd137的多特异性结合剂
TW202602940A (zh) 激動性抗ｉｌ－２ｒｂｇ重鏈抗體
HK40110611A (en) Multispecific binding agents against cd40 and cd137 in combination therapy for cancer
Monteiro et al. Fc récepteur et polynucléaire neutrophile

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17728131

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3026145

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017728131

Country of ref document: EP

Effective date: 20190102