WO2017209587A1 - Procédé d'extraction et de purification de collagène marin natif à partir des écailles de sardine sardina pilchardus - Google Patents

Procédé d'extraction et de purification de collagène marin natif à partir des écailles de sardine sardina pilchardus Download PDF

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acid
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extraction
fish
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PCT/MA2017/000013
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Inventor
Mariem KHAROUBI
Fatima BELLALI
Zakaria TENZALI
Radi YOUSSEF
Jamal CHAIRA
Alhayane HASSAN
Said HANOUN
Abdellah AKESBI
Issam LAAZUIOUZ
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Association Pole De Competitivite Pou La Peche Et L'industrie De Transformation Des Produits de la Mer
Institut National De Recherche Halieutique
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Institut National De Recherche Halieutique
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]

Definitions

  • the field of the invention is marine biotechnology, particularly the technical field of collagen extraction for the industrial production of marine collagen type I for application in the food industry, cosmetfood and possibly medical application.
  • Collagen is a fibrous extracellular protein that is widely distributed in animals and secreted primarily by connective tissue cells such as skin and bones.
  • Collagen is a biopolymer widely used in the design of biomaterials to replace or treat damaged tissue (Wallace, 2003). This native undenatured collagen can thus be used by the cosmetic, pharmaceutical and medical industries due to its many other characteristics. In particular, four of these properties are particularly involved in biomaterials: high mechanical resistance, haemostatic power, low antigenicity and effects on cell differentiation (Fujioka et al, 1998).
  • CN102839207 discloses a process for preparing collagen peptides from fish scales, characterized by the following main steps:
  • step 1 The recovery of fish scales and their immersion in hydrochloric acid to eliminate calcium; washing them for neutralization, drying and grinding; Addition of demineralized, dried and milled fish scales obtained in step 1 to an enzyme reactor with water and a mixed protease mixture to extract the collagen peptide. After the extraction is performed, deactivation of the enzyme and centrifugation are carried out to obtain an enzymolysis solution, wherein the mixed protease is a mixture of neutral protease, papain and flavourzyme;
  • the enzymatically produced fish scale collagen peptide using neutral protease, papain and flavourzyme involves a single step, so that not only the enzymatic hydrolysis time (9 hours) is reduced, but the extraction rate of the collagen peptide is also improved (72.72%).
  • the method solves the particular problem of the bitter taste taste of the collagen peptide encountered in other techniques.
  • CN102586373 discloses a method of extracting collagen of high quality at low temperature.
  • the method comprises the following steps:
  • the method described is safe, practical and environmentally friendly.
  • the activity of the collagen peptide is maintained at a maximum extent.
  • the patent CNl 02633877 treats a process for the industrial preparation of a collagen powder from fish skins and from fish scales, characterized by a low temperature extraction, four times.
  • the method not only is the toxicity caused by the residual solvent removed, but the fish oil can also be obtained. Thanks to the macroporous resin, not only the color and smell of fish are completely removed, but the natural pigment can also be obtained.
  • the method has the beneficial effects that l) the collagen is white and odorless 2) the yield is considerable 3) the natural pigment is non-toxic, brightly colored and stable 4) the fish oil is edible.
  • Collagen powder is a medicinal and biochemical material.
  • the invention CN10 23 21 719 relates the collagen production preparation technology particularly the collagen production preparation technology by enzymatic hydrolysis of fish scales, belonging to the technical field of collagen extraction.
  • the present technology goes through the following steps of 1) washing. 2) Alkaline treatment 4) Decalcification 5) Cooking 6) Cooling 7) Preliminary enzymatic hydrolysis 8) Secondary enzymatic hydrolysis 9) Yeast fermentation of collagen solution of fish scales 10) Activated carbon adsorption reaction 1 1) Filtration 12) Concentration 13) Sterilization 13) Atomization.
  • the method provided by the invention in addition to the effect of obtaining high molecular weight and low molecular weight collagen peptides from fish scales, provides the effects of the removal of pigments that affect the skin. appearance of the collagen product and reduced ⁇ collagen fish odor, which improves the value of the finished product of marine collagen.
  • Acid extraction of marine collagen requires preliminary treatments to remove mineral impurities and impurities in the form of non-collagenic proteins. These deproteinization and demineralization treatments consume considerable quantities of chemicals (bases and acids) and are of long duration. Deproteinization with sodium hydroxide can last up to 24 hours with concentrations between 0.3 M and 2.5 M in a ratio between 1: 10 and 1: 30. As for the demineralization, its duration can go up to 48 h. Similarly, the acid-soluble extraction requires a significant investment in time which is close to 48 hours and in extractor acid quantity, which inevitably has repercussions on the industrial profitability of the entire process.
  • the present invention relates to a method in which the preliminary deproteinization and demineralization treatments and the acid-soluble extraction are optimized by the surface response method in such a way as to minimize the quantity of inputs, the duration of the process while at the same time achieving maximum performance of demineralization, deproteinization, recovery of native collagen with a high degree of purity.
  • the invention relates to an acid process for the preparation of good quality native marine collagen type I, from sardine scales, characterized in that it comprises the steps of washing with water of the scales, of alkaline treatment, of acid treatment, cold extraction at acid pH, ultracentrifugation, precipitation and dialysis ( Figure 1).
  • the raw material consists of fresh or thawed scales, obtained in large quantities, during fishing and during the industrial processing of sardines.
  • the fresh or frozen flakes are sufficiently washed with running water 3 times to remove undesirable compounds, such as, for example, blood, fats, flaps of flesh and algae.
  • the scales are then dried in a cold electric dryer.
  • the scales After washing and drying, the scales are immersed, with stirring, in a cold alkaline bath of sodium hydroxide in order to remove non-collagenic proteins and obtain a collagen with a high degree of purity.
  • the alkaline bath is followed by washing with water to remove excess sodium hydroxide and filtration to recover the deproteinized residues.
  • Two acids can be used for demineralization, either diaminotetracarboxylic acid EDTA or mineral acid: hydrochloric acid.
  • the demineralization was carried out at a concentration of 0.1M HCl for 18h.
  • the invention makes it possible to solve the technical problems of the length of the acid and alkaline treatment previously stated with only 4H and a ratio of 1: 8 for the alkaline treatment and a decrease of 24H to 18H for the acid treatment.
  • Deproteinized, demineralized and neutralized scales are solubilized in a cold acid bath with stirring.
  • the acid-soluble extraction was carried out at a concentration of 0.5 M acetic acid for only 30 h.
  • the invention makes it possible to circumvent the technical problem of the acid extraction time which is lowered from 48 hours to 30 hours with only 0.5 M acetic acid.
  • the collagen solution thus obtained is then centrifuged at 20,000 g at 4 ° C. for 1 hour in order to remove the undissolved large aggregates.
  • the recovered supernatant is precipitated selectively with a neutral salt.
  • This salt is preferably sodium chloride
  • the precipitated collagen is then recovered as pellets by centrifugation at 20,000 g for 1 hour at 4 ° C. These pellets are solubilized in acetic acid.
  • Dialysis was performed using a dialysis bag with a breakpoint of 14 KDA.
  • the collagen thus purified is a heterodimer which consists of two alpha chains and one beta chain (Fig.2).
  • the denaturation start temperature of the purified collagen from the scales is 27.5 ° C.
  • the denaturation temperature of the acid-soluble collagens of mammals is of the order of 38 ° C. whereas the collagen denaturation start temperature from the scales in accordance with the invention is close to 27.5 ° C. This lower temperature is an advantageous characteristic of the collagen of the invention.
  • the collagen solutions are transparent to a collagen concentration of between 4 mg / ml and 5.23 mg / ml of acetic acid.
  • the extraction yield obtained by this method is 26.7%.
  • Figure 1 depicts the acidic method of preparing marine collagen from sardine scales which comprises: Washing, alkaline treatment, acid treatment, cold extraction at acidic pH, ultracentrifugation, collagen precipitation , resuspension of collagen and dialysis.
  • Fig. 1 Acidic process for preparing native marine collagen from sardine scales
  • Figure 2 depicts the electrophoretic molecular identification of purified collagen. Compared with a molecular marker (left), purified collagen is a hetérodimére that consists of:
  • the deproteinized residues are then demineralized in a solution of 400 ml 0.1M HCl for 18 h at 4 ° C.
  • the scales are then completely solubilized in 400 ml of 0.5M ml acetic acid with stirring for 30 h at 4 ° C.
  • the collagen solution is then centrifuged at 20,000 g at 4 ° C. for 1 hour. The supernatant is recovered, the pellet is resolubilized in 320 ml of acetic acid (0.5M).
  • the collagen obtained is recovered in the form of pellets by centrifugation at 20,000 g for 1 hour at 4 ° C. These pellets are resolubilized in 3 ml of 0.5M acetic acid.
  • the collagen solution is dialyzed against acetic acid at 0.5 M for 24h and against distilled water (24h) (It takes about 10 volumes of the solution of distilled or acetic water for a volume of collagen dialysis).

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'extraction acide à faible température et de purification de collagène marin natif type I soluble à partir des écailles de sardine (sardina pilchardus) fraîches ou congelées, caractérisée en ce qu'il comprend par les étapes de1) lavage à l'eau des écailles, 2) séchage des écailles 3) traitement alcalin pour éliminer les protéines non collagénique, 4) traitement acide pour éliminer les minéraux, 5)extraction à froid à pH acide pour solubiliser les fibrilles de collagène natif, 6)ultracentrifugation pour éliminer les gros agrégats, 7) précipitation du collagène par adjonction d'un sel neutre 8) remise en suspension du collagène précipité et 9) dialyse au moyen d'un sac de dialyse. Ce procédé permet dans un délai raisonnable de produire un collagène avec une pureté maximale en supprimant la quasi -totalité des impuretés non collagénique et des minéraux, en solubilisant la totalité du collagène et en limitant sa dénaturation. En plus de l'obtention de collagène marin natif type I avec un rendement considérable, ce procédé optimisé par la méthode de réponse de surface RSM permet de réduire la durée du traitement alcalin et acide, de diminuer considérablement la durée de l'extraction acide. Il permet également d'amoindrir la quantité de réactifs utilisés en l'occurrence, la soude, l'acide déminéralisateur et l'acide extracteur. Le procédé résout le problème particulier de la gestion des produits chimiques, de manière plus durable et plus économique. Le collagène natif de haute qualité ainsi obtenu est propice à des applications en alimentaire, en cosmetfood et en biomédical.

Description

Domaine
Le domaine de l'invention est la biotechnologie marine plus particulièrement le domaine technique de l'extraction du collagène pour la production industrielle du collagène marin type I à des fins d'application en agro- alimentaire, en cosmetfood et éventuellement en application médicale.
DESCRPTION DETAILLEE
Contexte
[0001]
Le collagène est une protéine extracellulaire fibreuse très largement répandue chez les animaux et sécrétée principalement par les cellules des tissus conjonctifs, comme la peau et les os.
[0002]
La prépondérance des résidus prolines et hydroxyproline confère à la triple hélice du collagène une rigidité caractéristique. Les groupements hydroxyles des résidus d'hydroxyproline participent à la formation de très nombreuses liaisons hydrogènes qui permettent de stabiliser l'ensemble de la structure (Kielty et Grant, 2002).
[0003]
Le collagène est un biopolymère largement utilisé dans la conception de biomatériaux visant à remplacer ou à traiter les tissus endommagés (Wallace, 2003). Ce collagène natif non dénaturé peut être ainsi utilisé par les industries cosmétique, pharmaceutique et médicale en raison de ses nombreuses autres caractéristiques. Notamment, quatre de ces propriétés sont particulièrement mises à contribution dans les biomatériaux: une forte résistance mécanique, un pouvoir hémostatique, une faible antigénicité et des effets sur la différenciation cellulaire (Fujioka et al, 1998).
[0004]
Actuellement, l'origine industrielle du collagène est bovine, porcine ou aviaire. Les origines porcines et bovines sont en tête de la production de collagène.
[0005]
En ce qui concerne cette production, elle se heurte à des restrictions religieuses dans certains pays musulmans ou juifs et à des restrictions sanitaires notamment celle relative à la crise de l'Encéphalopathie spongioforme et à celle de la grippe aviaire.
[0006]
La recherche d'autres ressources alternatives pour la production du collagène est donc particulièrement importante.
[0007]
Les écailles et les arrêtes du poisson renferment également du collagène qui s'apparente à celui des mammifères. [0008]
Au Maroc, ces écailles ne sont pas actuellement valorisées et sont considérées comme des déchets.
[0008]
Au Maroc, les entreprises en amont notamment les industries de pêche et les industries transformatrices de la sardine génèrent des tonnages considérables d'écaillés que l'on peut envisager de transformer en collagène marin.
Etat de la technique antérieure
Le brevet CN102839207 décrit un procédé de préparation de peptides de collagène à partir des écailles de poisson, caractérisé par les étapes principales suivantes :
- La récupération des écailles de poisson et leur immersion dans l'acide chlor hydrique pour éliminer le calcium; leur lavage pour neutraliser, leur séchage et leur broyage; L'ajout des écailles de poisson déminéralisées, séchées et broyées obtenus dans l'étape 1 dans un réacteur enzymatique avec de l'eau et un mélange de protéase mixte pour extraire le peptide de collagène. Après que l'extraction soit effectuée, la désactivation de l'enzyme et la centrifugation sont mises en œuvre pour obtenir une solution d'enzymolyse, dans laquelle la protéase mixte est un mélange de protéase neutre, de papaïne et de flavourzyme ;
La réalisation de la concentration en film de la solution d'hydrolysat obtenu par l'étape 2, la congélation et le séchage de la solution concentrée pour obtenir la poudre de peptide de collagène.
Selon cette invention, le peptide de collagène des écailles de poisson obtenu par méthode enzymatique en utilisant la protéase neutre, la papaïne et le flavourzyme fait intervenir une seule étape, de telle sorte que non seulement le temps d'hydrolyse enzymatique (9 heures ) est réduit, mais le taux d'extraction du peptide de collagène est également améliorée(72,72%). Par ailleurs, le procédé résout le problème particulier de la saveur du goût amer du peptide de collagène rencontré dans les autres techniques.
Le brevet CN102586373 divulgue un procédé d'extraction de collagène de haute qualité à basse température.
Le procédé comprend les étapes suivantes:
Récupération des écailles de poisson ou des peaux de poisson ;
Traitement par hydrolyse enzymatique à une température de 6 0 C;
Filtration de l'hydrolysat enzymatique pour obtenir une solution de collagène
- Séchage de la solution de collagène pour obtenir une poudre de collagène.
Selon l'invention, le procédé décrit est sûr, pratique et respectueux de l'environnement. En plus, en raison de l'adoption de l'extraction à basse température, l'activité du peptide de collagène est conservée à une étendue maximale. Le brevet CNl 02633877 traite un procédé de préparation industrielle d'une poudre de collagène à partir des peaux de poisson et à partir des écailles de poissons, caractérisé par une extraction à basse température, à quatre reprises.
Le procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à:
- la dilution de l'acide et de la base et le déshuilage à basse température,
- l'extraction à basse température, à quatre reprises,
- la désodorisation par du charbon actif et par de la porcelaine,
- la séparation par centrifugation papillon des particules solides, de l' l'huile et de l'eau,
L'adsorption par résine macroporeuse de telle sorte que les métaux lourds sont éliminés, le liquide de collagène est obtenu et le pigment est élué.
- La concentration par ultrafiltration
- Le séchage par pulvérisation, de sorte que le collagène et deux pigments peuvent être obtenus;
La réalisation d'une extraction supercritique au dioxyde de carbone, de sorte que l'huile de poisson comestible peut être obtenu.
Selon le procédé, non seulement la toxicité provoquée par le solvant résiduel est éliminée, mais l'huile de poisson peut également être obtenu. Grâce à la résine macroporeuse, non seulement la couleur et l'odeur de poisson sont complètement enlevées, mai le pigment naturel peut également être obtenu. La méthode présente les effets bénéfiques que l)le collagène est blanc et sans odeur 2) le rendement est considérable 3) le pigment naturel est non-toxique, de couleur vive et stable 4) l'huile de poisson es comestible.
Les quatre produits ainsi obtenus peuvent être utilisés pour des produits de soins et de santé, des aliments et des additifs alimentaires. La poudre de collagène est un matériau médicinal et biochimique.
L'invention CN10 23 21 719 relate la technologie de préparation de production de collagène particulièrement la technologie de préparation de production de collagène par hydrolyse enzymatique des écailles de poisson, appartenant au domaine technique de l'extraction de collagène. La présente technologie passe par les étapes suivantes de 1) lavage. 2) Traitement alcalin 4) Décalcification 5) Cuisson 6) Refroidissement 7) Hydrolyse enzymatique préliminaire 8) Hydrolyse enzymatique secondaire 9) Fermentation par levure de la solution du collagène des écailles de poisson 10) Réaction d'adsorption par le charbon actif 1 1) Filtration 12) Concentration 13) Stérilisation 13) Atomisation .
La méthode fournie par l'invention, en plus de l'effet de l'obtention de peptides de collagène à forte concentration et à faible poids moléculaire à partir des écailles de poisson, elle apporte les effets de l'élimination des pigments qui affectent l'apparence du produit de collagène et réduit Γ odeur de poisson de collagène, ce qui améliore la valeur du produit fini du collagène marin. Description détaillée de Pinvention
Four résoudre le problème
Les extractions acides de collagène marin nécessitent des traitements préliminaires pour éliminer les impuretés minérales et les impuretés sous forme de protéines non collagénique. Ces traitements de déprotéinisation et de déminéralisation consomment des quantités considérables de produits chimiques (bases et acides) et sont de longue durée. La déprotéinisation avec l'hydroxyde de sodium peut durer jusqu'à 24 heures avec des concentrations comprises entre 0,3 M et 2, 5 M selon un ratio compris entre 1 : 10 et 1 : 30. Quant à la déminéralisation, sa durée peut aller jusqu'à 48 h. Similairement, l'extraction acido-soluble nécessite un investissement important en temps qui avoisinent les 48 heures et en quantité d'acide extracteur, ce qui se répercute inéluctablement sur la rentabilité industrielle de tout le procédé.
La présente invention concerne un procédé dont lequel les traitements préliminaires de déprotéinisation et de déminéralisation et l'extraction acido-soluble sont optimisés par la méthode de réponse de surface de telle manière à minimiser la quantité des intrants, la durée du process tout en réussissant des performances maximales de déminéralisation, de déprotéinisation, de récupération de collagène natif avec un haut degré de pureté.
Les moyens de résolution du problème
L'invention concerne un procédé acide de préparation de collagène marin natif type I, de bonne qualité, à partir des écailles de sardine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de lavage à l'eau des écailles, de traitement alcalin, de traitement acide, d'extraction à froid à pH acide , d'ultracentrifugation, de précipitation et de dialyse (figure 1).
La matière première est constituée des écailles fraîches ou décongelées, obtenues en grande quantité, lors de la pêche et lors la transformation industrielle de la sardine.
Dans le procédé de l'invention, les écailles fraîches ou congelées sont lavées suffisamment à l'eau courante 3 fois pour éliminer les composés indésirables, tels que par exemple le sang, les graisses, les lambeaux de chair et les algues.
Les écailles sont ensuite séchées dans séchoir électrique à froid.
Après lavage et séchage, les écailles sont immergées, sous agitation, dans un bain alcalin froid de soude afin d'éliminer les protéines non collagénique et obtenir un collagène avec un haut degré de pureté.
Le bain alcalin est suivi d'un lavage à l'eau pour éliminer l'excès de soude et d'une filtration pour récupérer les résidus déprotéinisés.
Nous avons montré par la méthode de réponse de surface RSM qu'une combinaison judicieuse des paramètres réactionnels tels que la concentration de la soude, le ratio soude écaille et la durée de la déprotéinisation permettaient l'élimination des protéines non collagénique avec un rendement satisfaisant sans altérer l'intégrité du collagène. Les trois facteurs étudiés pour la déprotéinisation sont donc la concentration de NaOH, le temps de traitement et le ratio NaOH /écailles. La teneur en protéines totales et en hydroxyproline en solution ont été analysées respectivement en vue de déterminer la quantité des protéines non collagénique solubilisés et les pertes de collagène durant la déprotéinisation et la déminéralisation.
De ce fait, et selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, nous utiliserons la soude à raison de 0,1M de NaOH avec un ratio uniquement de 1:8 pendant seulement 4h. Après cette déprotéinisation, les écailles sont immergées dans un bain acide froid sous agitation.
D'une manière avantageuse, et comparés aux travaux décrits dans la littérature, nous avons trouvé par la méthode de réponse de surface RSM qu'une combinaison judicieuse des paramètres réactionnels tels que la nature de l'acide, la concentration de l'acide et la durée de la déminéralisation permettaient d'extraire le maximum de minéraux avec un rendement satisfaisant supérieur à 99% en seulement 18 h sans altérer l'intégrité du collagène.
Deux acides peuvent être utilisés pour la déminéralisation, soit l'acide diaminotétracarboxylique l'EDTA ou l'acide minéral : l'acide chlorhydrique.
D'une manière avantageuse, la déminéralisation a été effectuée à une concentration de 0,1M H CL pendant 18h.
D'une manière profitable, la déminéralisation a été effectuée à une concentration de
0, 3 M EDTA pendant 18h.
On comprend ainsi que l'invention permet de résoudre les problèmes techniques de la longueur du traitement acide et alcalin énoncés précédemment avec seulement 4H et un ratio de 1 :8 pour le traitement alcalin et une diminution de 24 H à 18H pour le traitement acide.
Les écailles ainsi déprotéinisées et déminéralisées sont ensuite lavées à l'eau jusqu' à neutralisation.
Les écailles déprotéinisés, déminéralisées et neutralisées sont solubilisées dans un bain acide froid sous agitation.
D'une manière avantageuse, l'extraction acidosoluble a été effectuée à une concentration de 0,5 M d'acide acétique pendant seulement 30 H.
On comprend ainsi que l'invention permet de contourner le problème techniques de la durée d'extraction acide qui se voit baisser de 48 H à 30H avec seulement 0,5 M d'acide acétique.
La solution de collagène ainsi obtenue est ensuite centrifugée à froid à 20 000g à 4°C pendant 1 heure dans le but d'éliminer les gros agrégats non dissous.
Le surnageant récupéré est précipité sélectivement par un sel neutre. De préférence ce sel est le chlorure de sodium
Après 12 h d'agitation à 4°C, un précipité de collagène se forme.
Le collagène précipité est ensuite récupéré sous forme de culots par centrifugation à 20 000g pendant 1 heure à 4°C. Ces culots sont solubilisés dans l'acide acétique.
On procédera ensuite à deux dialyses successives effectuées contre de l'acide acétique d'une part et contre l'eau distillée d'autre part. La dialyse a été réalisée grâce à un sac de dialyse dont le seuil de rupture est de 14 KDA.
Le collagène ainsi purifié est un hétérodimère qui se compose de deux chaînes alpha et une chaîne Béta (Fig.2).
La température de début de dénaturation du collagène purifié à partir des écailles est de 27,5°C. La température de dénaturation des collagènes acido-solubles de mammifères est de l'ordre de 38 ° C tandis que la température de début de dénaturation du collagène à partir des écailles conforme à l'invention est voisine de 27,5 °C. Cette température plus basse constitue une caractéristique avantageuse du collagène de l'invention.
Les solutions de collagène sont transparentes à une concentration en collagène comprise entre 4 mg/ml et 5,23 mg/ml d'acide acétique.
Le rendement d'extraction obtenu par ce procédé est de 26,7%.
Brèves description de figures
La figure 1 décrit le procédé acide de préparation de collagène marin à partir des écailles de sardines en qui comprend : Le lavage, le traitement alcalin, le traitement acide, l'extraction à froid à pH acide, l'ultracentrifugation, la précipitation du collagène, la remise en suspension du collagène et la dialyse.
Figure imgf000009_0001
fig. 1. Procédé acide de préparation de collagène marin natif à partir des écailles de sardine
La figure 2 décrit l'identification moléculaire par électrophorèse du collagène purifié. Comparé avec un marquer moléculaire (à gauche), le collagène purifié est un hetérodimére qui se compose de :
Deux chaînes alpha dont le poids moléculaire est situé entre Π 6 et 97 KDa
Une chaîne Béta d'un poids moléculaire approximatif de 200 KDa
Figure imgf000010_0001
figure 2. Electrophorèse SDS-PAGE en conditions dénaturantes Exemple
L'invention est illustrée de manière non limitative par l'exemple ci-dessous :
Exemple
40 g des écailles de sardine congelées sont mises à décongeler en chambre froide (4°C). Après, on procède à une déprotéinisation par 360 mL de NaOH (0,1M) sous agitation pendant 4H à 4°C. Les écailles déproteinisées ont été filtrées et lavées 3 fois avec 360 ml chaque fois
- Les résidus déproteinisés sont ensuite déminéralisés dans une solution 400 ml HCL 0.1M pendant 18 h à 4°C.
- Les écailles sont ensuite totalement solubilisés dans 400 ml de l'acide acétique ml 0.5M sous agitation pendant 30 h à 4°C .
- La solution de collagène est centrifugée par la suite à 20 000g à 4°C pendant 1 heure. On récupère le surnagent, le culot est resolubilisé dans 320ml d'acide acétique (0,5M).
- Cette opération d'extraction est réalisée deux fois. Le deux surnageant sont réunis et le collagène qu'ils renferment est précipité par addition de 60g de chlorure de sodium (concentration 0,7 M final ).
Le collagène obtenu est récupéré sous forme de culots par centrifugation à 20 000g pendant 1 heure à 4°C. Ces culots sont resolubilisés dans 3 ml d'acide acétique à 0.5M. La solution de collagène est dialysée contre de l'acide acétique à 0,5 M pendant 24h et contre l'eau distillée (24h) (Il faut environ 10 volumes de la solution de l'eau distillé ou a acétique pour un volume de collagène dialysé).
- Le rendement calculé selon la formule suivante ci-dessous est de 26,7%
Rendement^ masse du collagène purifié / masse initiale des écailles x 100
10. 6 g 26, 7%
40 g X 100

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation de collagène à partir des écailles de sardine fraîches ou décongelées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de lavage à l'eau des écailles, de traitement alcalin, de traitement acide d'extraction acide à froid, ultracentrifugation, précipitation et dialyse
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le lavage à l'eau est un lavage à l'eau courante 3 fois.
3. Procédé selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les écailles de sardine sont utilisées séchées.
4. Procédé selon les revendications 1, 2 et 3 caractérisés en ce que les écailles séchées sont déprotéinsées par la soude à raison de 0,1 M de NaOH, ratio 1 : 8 pendant 4h.
5. Procédé selon les revendication 1, 2, 3 et 4 , caractérisé en ce que les écailles déprotéinsées sont déminéralisées par un acide diaminotétracarboxylique ou un acide minéral.
6. Procédé selon la revendication 5 , caractérisé en ce que l'acide déminéralisateur est choisi parmi les acides minéraux comme étant l'acide chlorhydrique.
7. Procédé selon la revendication 5 , caractérisé en ce que l'acide déminéralisateur est choisi parmi les acides diaminotétracarboxylique comme étant l'EDTA.
8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le acide chlorhydrique est utilisé de préférence à une concentration de 0,1M pendant 18 h.
9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'EDTA est utilisé de préférence à une concentration de 0,3 M pendant 18 h.
10. Procédé selon la revendication 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 et 9 caractérisé en ce qu'on procédé à un lavage des écailles déprotéinsées et déminéralisées à l'eau jusqu'à neutralisation
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que l'extraction acido-soluble du collagène est effectuée par un acide organique.
12. Procédé selon la revendication 1 1 caractérisé en ce que l'extraction est effectuée à froid, de préférence à une concentration de 0,5 M d'acide acétique pendant 30H 4°C.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend en outre par une étape de précipitation saline avec le chlorure de sodium, après 12 h d'agitation à 4°C.
14. Procédé selon les revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la solution de collagène précipité est ensuite récupérée sous forme de culots par centrifugation.
15. Procédé selon la revendication 14 selon laquelle la centrifugation est effectuée à 20 000g pendant 1 heure à 4°C.
16. Procédé selon la revendication 1 àl5 selon lesquelles les culots récupérés sont resolubilisés dans l'acide acétique.
17. Procédé selon la revendication 1 àl6 selon lesquelles on procédera ensuite à deux dialyses successives effectuées contre de l'acide acétique d'une part et contre l'eau distillée d'autre part avec un sac de dialyse dont le seuil de rupture est 14 KDA.
18. Procédé selon la revendication 1 àl 7 selon lesquelles le collagène purifié est un hetérodimére qui se compose de deux chaînes alpha et une chaîne Béta.
19. Procédé selon la revendication 1 àl8 selon lesquelles le collagène purifié a une température de dénaturation de 27,5°C.
20. Procédé selon la revendication 1 àl9 que le rendement en collagène natif est de 26,7%.
21. Procédé selon la revendication 1 à 20 que les solutions de collagène sont transparentes à une concentration en collagène comprise entre 4 mg/ml et 5,23 mg/ml d'acide acétique.
22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, caractérisé en ce que les écailles proviennent de poissons marins ou d'eau douce.
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 22 caractérisé en ce que le dit poisson est la sardine marocaine sardina pilchardus.
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