WO2018004253A2 - 표적 단백질 검출을 위한 압타머-면역세포 바이오프로브 - Google Patents

표적 단백질 검출을 위한 압타머-면역세포 바이오프로브 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an aptamer-immune cell bioprobe that specifically binds to a target protein, and more specifically to an in vitro target protein in real time, wherein the aptamer that targets the protein is prepared by binding to living immune cells. It relates to a bioprobe capable of detecting.
  • Aptamers are single-stranded DNA, RNA, polypeptides or modified nucleic acids that have stable tertiary structure and are characterized by high affinity and specificity for binding to target molecules. Is similar or larger, but more stable in the external environment, ie heat, pH, pressure, and the like.
  • the properties of aptamers attached to specific domains of target proteins and molecules are utilized in microarray-based biosensing by the introduction of fluorescence or markers.
  • Detection of the target protein through a probe has been used in many ways, but most of the existing detection has a molecular level detection method.
  • Methods of detecting target proteins or cells on an array using antibodies or fluorescent particles have already been widely used.
  • these methods are in vitro detection methods, and the detection is performed on a sample discharged in vitro, thereby responding to changes in the microenvironment in which the cells belong. It's hard to do and it's a lot of constraint. Therefore, the inventors propose a protein detection bioprobe that can detect specific proteins using living immune cells and at the same time maintain the intact function of immune cells.
  • a bioprobe combining aptamer specifically binding to C-reactive protein (CRP) and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is provided.
  • CRP C-reactive protein
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • CRP C-reactive protein
  • PBMCs Peripheral blood monocytes
  • lymphocytes are involved in intercellular immune responses in the blood and exhibit homing mechanisms in the inflammatory response.
  • aptamers into these immune cells allows us to image the homing mechanism of peripheral blood monocytes and their role in the body.
  • an aptamer that specifically binds to a target protein and a bioprobe for detecting a target protein including immune cells linked through the aptamer and a linker, the inherent function is alive. It is possible to detect in vitro proteins in real time through the aptamers associated with maintaining immune cells.
  • One aspect of the present invention provides an aptamer specifically binding to a target protein, and a bioprobe for detecting a target protein including immune cells connected through the aptamer and a linker.
  • the aptamer may have 15 to 250, preferably 40 to 150, more preferably 70 to 72 nucleotides.
  • the aptamer may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the immune cells are composed of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), T cells, B cells, neutrophils, basophil, eosinophil and monocytes. It can be selected from the group.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the immune cells may be isolated from the blood of a sample patient.
  • the linker may be selected from the group consisting of sulfo-NHS-biotin, EDC / NHS-biotin, amine-PEG2-biotin, sulfo-NHS-LC-biotin and Avidin. have.
  • the protein is C-reactive protein (C-reactive protein, CRP), Vascular endothelial growth factor (VGF), integrin (integrin), BNP2, TGF- ⁇ and CK- It may be selected from the group consisting of BM.
  • One aspect of the present invention provides a diagnostic reagent for protein detection comprising the target protein detection bioprobe.
  • the aptamer-immune cell bioprobe according to the present invention is a living cell sensor, which enables monitoring in real time by detecting the presence and concentration of a target protein directly in the body. At the same time as this detection, it can also function as an immune mediated cell.
  • bioprobe of the present invention can be used directly in screening drugs, determining drug effects, and the like.
  • Figure 1 shows the detection of CRP through the aptamer-immune cell bioprobe (Apt-PBMC bioprobe) of the present invention and mobile phase observation schematic diagram.
  • Figure 2 shows fluorescence images of the stages of formation of Apt-PBMC bioprobe: Bright field images (a and A), nuclear staining images of Apt-PBMC bioprobe with DAPI (b and B), streptavidin Confirmation of binding between cells and linker using / PE (c and C), fluorescence images (d and D) of aptamer with 5-FAM attached, and merged images (e and E).
  • Figure 3 shows the image of the Apt-PBMC bioprobe detected CRP at each concentration, it was confirmed that the intensity of fluorescence increases with the concentration: bright field image from above, nuclear staining of Apt-PBMC bioprobe using DAPI Images, fluorescence images using anti-hCRP antibodies, and merged images.
  • Figure 4 shows the results of the TNF- ⁇ secretion confirming test results of Apt-PBMC bioprobe (A), the survival rate test results (B) of the Apt-PBMC bioprobe and PBMC, and the Apt-PBMC bioprobe according to the CRP concentration
  • the detection graph C is shown.
  • Figure 5 shows the results of the mobile phase experiment according to the CRP concentration gradient of the Apt-PBMC bioprobe.
  • One aspect of the present invention provides an aptamer specifically binding to a target protein, and a bioprobe for detecting a target protein including an immune cell linked through the aptamer and a linker.
  • aptamer is a single-stranded DNA, RNA, polypeptide or modified nucleic acid having high specificity and affinity for a particular protein or other substance.
  • aptamers specific to a specific protein are already known, and suitable aptamers or novel synthetic aptamers specific to the target protein and the like can be selected and used according to the target protein for detection of the bioprobe of the present invention. As a replacement it can serve as various sensors.
  • the aptamer may be one having 15 to 250, preferably 40 to 150, more preferably 70 to 72 nucleotides. It is preferable that the concentration of nucleotides is 50pM, and if the concentration is less than 50pM, a problem of reduced detectability may occur.
  • the aptamer may be preferably a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • Aptamers are used in the form of binding to inorganic or organic particles, specifically vitamins, proteins, polypeptides, and the like, which bind to the linker used in the bioprobe.
  • the linker connected to the aptamer is streptavidin
  • the aptamer is prepared in the form of biotin attached to the 5 'end connected to the streptavidin and bound to the linker.
  • the term “immune cell” does not attach, grow, or differentiate without stimulation, and moves along the bloodstream, where specific target proteins, such as proteins or target tissues, exist, such as inflammation or tissue necrosis. It is desirable to be able to reach the site and capture the protein or the like which is the target substance directly.
  • the immune cells are selected from the group consisting of peripheral blood monocytes (PBMC), T-cells exposed to antigens, B-cells, neutrophils, basophils, eosinophils and monocytes. It may be, but is not limited thereto.
  • PBMC peripheral blood monocytes
  • T-cells exposed to antigens PBMC
  • B-cells neutrophils
  • basophils basophils
  • eosinophils neutrophils
  • monocytes neutrophils
  • monocytes neutrophils
  • basophils basophils
  • eosinophils eosinophils
  • monocytes mesenchymal stem cells
  • the immune cells may be isolated from blood of a patient who is a sample.
  • the blood collection method uses a conventionally known method. As a blood collection method, it is preferable to obtain immune cells by collecting peripheral blood of a patient, which is a specimen in a diseased or healthy state, from the vein of the arm, but any material containing immune cells can be used. Heparin or citric acid can be added to the collected peripheral blood to prevent coagulation.
  • the immune cells and aptamers may be included in a ratio of 8 ⁇ 10 6 / mL: 50pM to 1 ⁇ 10 7 / mL: 50pM. If the immune cells are less than 1x10 5 / mL or the aptamer is more than 100pM, problems of cell loss and cytotoxicity may occur.
  • the target protein may move to a large number of places after being administered into the blood and directly detect the protein, and at the same time, perform immune mediated activity.
  • linker refers to a medium for binding aptamers and immune cells. One end of the linker is aptamer, the other end is covalently bonded to immune cells, hydrogen bonds, etc. It combines to connect the two materials.
  • the linker may be used one or two or more substances, selected from the group consisting of sulfo-NHS-biotin, streptavidin, EDC / NHS-biotin, amine-PEG2-biotin, sulfo-NHS-LC-biotin and avidin It may be, but is not limited thereto.
  • the linker sulfo-NHS-biotin utilizes the mutual binding force of biotin-streptabitin to maintain a low cytotoxic environment and stably connect the aptamer and PBMC. .
  • protein or "target protein” is a protein present in the blood of a sample, the presence or concentration of which changes according to the disease or health condition of the sample, and the detection of the protein as a disease or health Means a substance that can confirm the state.
  • the protein or target protein may be included in the protein or target protein of the present invention as long as the aptamer specific for the protein is known or a novel aptamer specific for the protein can be synthesized or found, C-reactive protein, vascular epidermis Growth factor, integrin, BNP2, TGF- ⁇ and CK-BM can be selected from the group consisting of, but not limited to.
  • TNF- ⁇ is a cytokine involved in the inflammatory response, secreted from macrophage or T cells to regulate the secretion of IL-1 and IL-6, or through apoptosis. Means a substance that modulates cell mediated immune responses.
  • the bioprobe of the present invention enables direct detection of target substances in vivo, but may be indirectly affected by immune responses and antibodies, and thus may be restricted. However, in vitro, in particular, it can be utilized for observation in experiments in which live cells or various molecules are mounted on microfluidic or 3D cell cultures.
  • the term "diagnostic reagent” refers to a reagent that makes it possible to confirm the presence and concentration of a target protein in vitro and outside the body through a fluorescence image, wherein the diagnostic reagent is a preparation of a pharmaceutically acceptable carrier, excipient and / or diluent. But will be further sterilized and have a suitable wall.
  • the diagnostic reagent When used in the body, the diagnostic reagent is administered parenterally, and the parenteral administration is by an injection method. Dosage ranges depending on the weight, age, sex, time of administration, administration method and purpose of diagnosis.
  • the diagnostic reagent can also be used in vitro. Assays for detection of target proteins, kits that facilitate this, are available, but are not limited to these.
  • the aptamer used in the Example was a total of 72mer single-stranded DNA (see SEQ ID NO: 1), was used by Bioneer (Korea) custom made, and the biotin attached to the 5 'end of the sequence, the aptamer is a cell, In particular, a 5-FAM fluorescent marker was introduced at the 3 'end to confirm that the introduction site of the sulfo-NHS-biotin linker and the streptavidin were sequentially attached to:
  • the medium was used after filtering RPMI 1640 with 10% fetal bovine serum (FBS) added with 1% penicillin / streptomycin with a pore 0.2 ⁇ m syringe filter.
  • FBS fetal bovine serum
  • PBMC pore 0.2 ⁇ m syringe filter
  • the pellet phosphate buffer solution (DPBS (-)) washed with, by counting the cell viability of PBMC 1x10 7 gae survival rate of 90% or more cells Secured.
  • the washed PBMC was centrifuged once more, and then 400 ⁇ l of 1 mM sulfo-NHS-biotin was added to the pellet, mixed, and reacted at room temperature for 30 minutes, thereby inducing covalent bonding with the amine group of the surface protein of PBMC.
  • the total reaction time was within 30 minutes.
  • the reacted cells were washed with serum-free RPMI 1640 and centrifuged (x200 g, 7 minutes) to remove supernatant, and washed twice with 400 ⁇ l of DPBS.
  • Serum-free RPMI 1640 protected cells and provided environmental conditions in the introduction of linkers into PBMCs.
  • PBS (Ca 2 + and Mg 2 + containing) then a solution of the number of biotin attached to the 5 'end aptamer (SEQ ID NO: 1.1) with 100pM sterilized in a volume ratio of 1: 10, by heating at 95 °C for 5 minutes DNA
  • DAPI was introduced and stained with PBMC to identify the nucleus, and thus, the process of Apt-PBMC bioprobe formation through streptavidin and aptamer binding to the cytoplasm was identified.
  • CRP was prepared by concentration and reacted, and then imaged using an anti-CRP antibody labeled with a fluorescent marker.
  • Cells were divided into 4 ⁇ 10 5 cells / ml into tubes, and CRP was added to each tube to be 0, 0.01, 0.1, 1, 2.5, 5, 10 and 30 ⁇ g / ml, and then reacted at room temperature for 1 hour. After centrifugation (x200g, 7 minutes), washed twice to collect the cell pellet. The labeled anti-CRP antibody was added to be diluted 1: 200 and reacted at room temperature for 1 hour, followed by washing with DPBS (-) using a centrifuge.
  • the lowest detection limit (LOD) was 0.05 ⁇ g / ml, which showed a sensitivity similar to 0.04 mg / ml of high-sensitivity CRP (hs-CRP), thus confirming its potential as a highly sensitive cell sensor based on living cells.
  • Cell fixation was performed to sequentially dehydrate and fix ethanol to 50%, 70% and 100%, respectively, of the Apt-PBMC bioprobe pellets captured with CRP. Completely fixed cells were air dried and washed twice with PBST (-, 0.05% Tween-20).
  • DAPI working solution (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) was added to perform nuclear staining for 5 minutes. It was then washed twice with PBST (-) and completely dried. 20 ⁇ l of fluorescence mounting medium (Dako) was added, covered with coverslip, sealed (manicured), and then stored at 4 ° C.
  • PBMC and Apt-PBMC were dispensed into 1.5 wells of 5x / well in 24 wells, and then a stimulant lipopolysaccharide ( lipopolysaccharide (LPS) was added to 0.2 ⁇ g / ml.
  • lipopolysaccharide (LPS) lipopolysaccharide (LPS) was added to 0.2 ⁇ g / ml.
  • TNF- ⁇ secretion was quantified by enzymatic immunoassay (ELISA) to stimulate T cells in PBMC for a total of 24 hours of culture (human TNF- ⁇ ELISA kit, R & D system).
  • ELISA enzymatic immunoassay
  • Apt-PBMC bioprobe showed a TNF- ⁇ secretion of 90% or less compared to the control, confirming that it serves as a living cell sensor or cell mediator.
  • Cell viability was determined using a Trypan Blue assay. Apt-PBMC was prepared, the thawed PBMCs were incubated for 16 hours, stabilized, and then incubated for 3 days under the same conditions (5% CO 2, 37 ° C.). Cells were centrifuged and washed every 12 hours, 0.4% trypan blue solution was added, and cell viability was observed using a cell counter.
  • the concentration of sulfo-NHS-biotin or streptavidin used in the present invention confirms that there is little interference with ligands and receptors on the cell surface.
  • viability as a living cell sensor has been confirmed by the small change in cell viability and image production using a fluorescence detector, but may affect the characteristics of the immune cells PBMC.
  • Reduction of TNF- ⁇ in any sense proves that cells are affected by added molecules, but confirms that they are not limited in their functional performance as immune cells, and cell viability is most important in cell sensors. It becomes a condition.
  • Apt-PBMC bioprobe did not have a significant difference compared to the control until 36 hours, after which it was confirmed that the survival rate decreases little by little. However, even after 3 days, the survival rate was observed to be 65% or more, confirming that the linker and other molecules did not significantly affect the cell survival rate. This suggests that live cell sensors using PBMC may be used in vivo.
  • Apt-PBMC bioprobe is not only an immune cell but also a cell sensor equipped with a homing molecule.
  • a CRP standard solution was added separately to 0, 4 and 4 ⁇ g / ml on epoxy glass made with a 3 mm wide channel using a sine pen to make a hydrophobic barrier and reacted at 4 ° C. After blocking for 1 hour at 37 ° C. with 2% BSA, washing was performed twice with PBST. 20 ⁇ l (1 ⁇ 10 7 pcs / ml) of Apt-PBMC stained with DAPI was placed on the channel, reacted for 2 hours, and washed with PBS and water to confirm a pattern (mobile phase) attached to the surface CRP of Apt-PBMC.
  • Apt-magnetic beads bioprobes were prepared by replacing the cells with iron oxide beads.
  • EDC / NHS carboxyl group attached iron oxide beads
  • Iron oxide particles replacing the cells were used in its mechanism of action, confirming that the carboxyl groups on the iron oxide beads surface were reacted with the amine groups of the biotinylated anti-CRP antibody by EDS / NHS to bind the two substances.

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Abstract

본 발명은 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머(aptamer), 및 상기 압타머와 링커(linker)를 통하여 연결된 면역세포를 포함하는 표적 단백질 검출용 바이오프로브(bioprobe)에 관한 것으로서, 단백질을 표적화하는 압타머가 살아있는 면역세포와 결합되어 제조된 실시간으로 체내외 단백질을 검출할 수 있는 바이오프로브를 제공한다. 또한, 상기 바이오프로브를 포함하는 단백질 검출용 진단 시약을 제공한다.

Description

표적 단백질 검출을 위한 압타머-면역세포 바이오프로브
본 발명은 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머(aptamer)-면역세포 바이오프로브에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 단백질을 표적화하는 압타머가 살아있는 면역세포와 결합되어 제조된, 실시간으로 체내외 표적 단백질을 검출할 수 있는 바이오프로브에 관한 것이다.
압타머란 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 갖는 단일가닥(single strand) DNA, RNA, 폴리펩타이드 또는 변형핵산을 이르는 것으로, 항체에 비하여 결합력은 비슷하거나 큰 반면, 외부 환경, 즉, 열, pH, 압력 등에 보다 안정적이다. 목적 단백질 및 분자의 특이 도메인에 붙는 압타머의 성질은 형광이나 마커의 도입으로 마이크로어레이(microarray)를 기반으로 하는 바이오센싱에 활용된다.
탐지자(probe)를 통한 목적 단백질의 검출은 여러 방면으로 사용되어 왔으나, 기존 대부분의 검출은 분자 수준의 검출법을 지니고 있다. 항체 또는 형광 입자들을 이용하여 어레이 상에서 표적 단백질이나 세포를 검출하는 방법은 이미 널리 사용되고 있으나, 이러한 방법들은 체외 검출법으로, 체외로 배출된 시료에서 검출이 수행되므로 세포가 속해있는 미세환경의 변화에 대응하기 어렵고 제약이 많이 따르고 있다. 이에 발명자들은 살아있는 면역세포를 이용하여 특정 단백질을 탐지할 수 있는 동시에, 면역세포 본연의 기능을 그대로 유지하고 있는 단백질 검출용 바이오프로브를 제안한다. 그 대표적인 예로서, C 반응성 단백(C-reactive protein, CRP)에 특이적으로 결합하는 압타머와 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 결합시킨 바이오프로브를 제공한다.
C 반응성 단백(CRP)은 5개의 원형 서브 구조가 집합하여 이루어진 단백질이다. 혈청 내에 존재하고 간에서 생성되며, 감염이나 염증성 반응에서 혈액 내 증가를 관찰할 수 있고, 특히, 심혈관 질환(cardiovascular disease, CVD)에서 급격히 증가하는 것으로 알려져 있다.
말초혈액단핵구(PBMC)는 부유 세포로서 자극이 없이는 분화하지 않고 독립적이며 선·후천적 면역 반응에 있어 중요한 역할을 담당하고 있다. 특히, 림프구는 혈액 내에서 세포간 면역 반응에 관여하며, 염증성 반응에서 귀환(homing) 메커니즘을 보인다. 이러한 면역 세포에 압타머의 도입은 말초혈액단핵구의 호밍 메커니즘 및 체내에서의 역할을 이미지로 확인할 수 있도록 해준다.
표적 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머(aptamer), 및 상기 압타머와 링커(linker)를 통하여 연결된 면역세포를 포함하는 표적 단백질 검출용 바이오프로브(bioprobe)를 제공함으로써, 살아있어 본연의 기능을 유지하고 있는 면역세포와 결합된 압타머를 통하여 실시간으로 체내외 단백질을 검출을 가능케 한다.
본 발명의 일 양상은 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머, 및 상기 압타머와 링커를 통하여 연결된 면역세포를 포함하는 표적 단백질 검출용 바이오프로브를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 압타머는 15 내지 250개, 바람직하게는 40 내지 150개, 보다 바람직하게는 70 내지 72개의 뉴클레오타이드를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 압타머는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 면역세포는 말초혈액단핵구(PBMC), T 세포, B 세포, 호중성구(neutrophil), 호염기구(basophil), 호산구(eosinophil) 및 단핵구(monocyte)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 면역세포는 검체인 환자의 혈액으로부터 분리되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 링커는 설포-NHS-바이오틴, EDC/NHS-바이오틴, 아민-PEG2-바이오틴, 설포-NHS-LC-바이오틴 및 아비딘(Avidin)으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단백질은 C 반응성 단백(C-reactive protein, CRP), 혈관표피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 인테그린(integrin), BNP2, TGF-β 및 CK-BM으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 양상은 상기 표적 단백질 검출용 바이오프로브를 포함하는 단백질 검출용 진단 시약을 제공한다.
본 발명에 따른 압타머-면역세포 바이오프로브는 살아있는 세포 센서로서, 체내에서 직접 표적 단백질의 존부 및 농도를 검출하여 실시간으로 모니터링을 가능하게 한다. 이러한 검출과 동시에, 면역 매개 세포로서의 기능 또한 발휘할 수 있다.
또한, 본 발명의 바이오프로브는 약물의 스크리닝, 약물의 효과 판정 등에서도 직접적으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 압타머-면역세포 바이오프로브(Apt-PBMC 바이오프로브)를 통한 CRP의 검출과 그 이동상 관찰 모식도를 나타낸다.
도 2는 Apt-PBMC 바이오프로브의 형성 단계별 형광이미지를 나타낸다: 명시야(Bright Field) 이미지(a 및 A), DAPI를 이용한 Apt-PBMC 바이오프로브의 핵 염색 이미지(b 및 B), 스트렙타비딘/PE를 이용한 세포와 링커 사이의 결합 확인 이미지(c 및 C), 5-FAM이 부착된 압타머의 형광 이미지(d 및 D), 및 병합(merge) 이미지(e 및 E).
도 3은 각 농도에서 CRP를 탐지한 Apt-PBMC 바이오프로브의 이미지를 나타내며, 농도에 따라 형광의 세기가 증가하는 것을 확인하였다: 위에서부터 명시야 이미지, DAPI를 이용한 Apt-PBMC 바이오프로브의 핵 염색 이미지, 항-hCRP 항체를 이용한 형광 이미지, 및 병합 이미지.
도 4는 Apt-PBMC 바이오프로브의 TNF-α 분비 확인 실험 결과(A), Apt-PBMC 바이오프로브와 PBMC의 시간에 따른 생존율 확인 시험 결과(B), 및 CRP 농도에 따른 Apt-PBMC 바이오프로브의 검출 그래프(C)를 나타낸다.
도 5는 Apt-PBMC 바이오프로브의 CRP 농도 구배에 따른 이동상 실험 결과를 나타낸다.
본 발명의 일 양상은 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머(aptamer), 및 상기 압타머와 링커(linker)를 통하여 연결된 면역세포를 포함하는 표적 단백질 검출용 바이오프로브를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "압타머"는 특정 단백질 등 물질에 대하여 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA，RNA，폴리펩타이드 또는 변형핵산이다. 이미 특정 단백질에 특이적인 다양한 압타머가 공지되어 있으며，본 발명의 바이오프로브의 검출 목적인 표적 단백질에 따라 그 표적 단백질 등에 특이적인 알맞은 공지된 압타머 또는 신규의 합성 압타머를 선택하여 사용할 수 있으며, 이의 교체로서 다양한 센서로서의 역할을 수행할 수 있다. 상기 압타머는 15 개 내지 250개, 바람직하게는 40 내지 150개, 보다 바람직하게는 70 내지 72개의 뉴클레오타이드를 갖는 것일 수 있다. 뉴클레오타이드의 농도는 50pM인 것이 바람직하며, 50pM 미만인 경우에는 검출능력 감소의 문제가 발생할 수 있다. 상기 압타머는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 압타머는 당해 바이오프로브에 사용되는 링커에 상호결합하는 무기 또는 유기입자, 구체적으로는 비타민, 단백질, 폴리펩타이드 등에 결합된 형태로 사용된다. 예를 들어, 압타머에 연결되는 링커가 스트렙타비딘인 경우, 압타머는 상기 스트렙타비딘과 연결되는 5' 말단에 바이오틴이 부착된 형태로 제조되어 링커에 결합된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역세포(immune cell)"는 자극 없이는 부착되지 않고 자라거나 분화하지 않으며, 혈류를 따라 이동함으로써 표적 물질인 단백질 등이 존재하는 특정 부위, 예를 들어 염증부위나 조직괴사부위에 도달하여 표적 물질인 단백질 등을 직접 포획할 수 있는 것이 바람직하다. 상기 면역세포는 말초혈액단핵구(PBMC), 항원에 노출된 T-세포, B-세포, 호중성구(neutrophil), 호염기구(basophil), 호산구(eosinophil) 및 단핵구(monocyte)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역세포는 혈액 등 액체 중에서 우수한 이동성 및 특정 물질로의 귀환(homing) 작용을 나타내는 것을 특징으로 하며, 상기 면역세포를 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)로 대체하는 것도 가능하다.
상기 면역세포는 검체인 환자의 혈액으로부터 분리되는 것일 수 있다. 상기 혈액의 채혈방법은 종래의 공지된 방법을 사용한다. 채혈방법으로서는 질환 또는 건강한 상태 때의 검체인 환자의 말초혈액을 팔의 정맥에서 채혈을 하여　면역세포를 얻는 것이 바람직하나, 면역세포를 함유하는 것이라면 어느 것도 재료로 사용할 수 있다. 채혈한 말초혈액에는 응고가 일어나지 않도록 헤파린 또는 구연산을 첨가할 수 있다.
상기 면역세포와 압타머는 8x106/mL:50pM 내지 1x107/mL:50pM의 비율로 포함될 수 있다. 면역세포가 1x105/mL 미만 또는 압타머가 100pM 초과인 경우 세포소실, 세포독성의 문제가 발생할 수 있다.
본 발명의 바이오프로브의 면역세포는 살아있는 상태를 유지하면서 센서로 작용하므로, 혈중에 투여된 후 표적 단백질이 많은 곳으로 이동하여 직접 단백질을 검출하는 한편, 동시에 면역 매개 활동을 수행할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "링커(linker)"는 압타머와 면역세포를 결합시키기 위한 매개체로, 링커의 한 쪽 끝은 압타머와, 다른 한 쪽 끝은 면역세포와 공유결합, 수소결합 등에 의하여 결합을 이루어 두 물질을 연결한다. 상기 링커는 1 또는 2종 이상의 물질이 사용될 수 있으며, 설포-NHS-바이오틴, 스트렙타비딘, EDC/NHS-바이오틴, 아민-PEG2-바이오틴, 설포-NHS-LC-바이오틴 및 아비딘으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, Apt-PBMC 바이오프로브를 제조하는 경우, 링커인 설포-NHS-바이오틴은 바이오틴-스트렙타비틴의 상호 결합력을 이용하여 세포 독성이 적은 환경을 유지하며 안정적으로 압타머와 PBMC를 연결한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질" 또는 ＂표적 단백질＂은 검체의 혈중에 존재하는 단백질로서 검체의 질병 또는 건강 상태의 변화에 따라 존부 또는 농도가 변화하며，그 단백질의 검출로서 검체의 질병 또는 건강 상태를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 상기 단백질 또는 표적 단백질은 당해 단백질에 특이적인 압타머가 공지되어 있거나 당해 단백질에 특이적인 신규한 압타머를 합성 또는 발견할 수 있다면 본 발명의 단백질 또는 표적 단백질에 포함될 수 있으며，C 반응성 단백, 혈관표피성장인자, 인테그린, BNP2, TGF-β 및 CK-BM으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용되는 용어 "TNF-α"는 염증성 반응에 관여하는 사이토카인으로서, 마크로파지(macrophage) 또는 T 세포로부터 분비되어 IL-1 및 IL-6의 분비를 조절하거나 아포토시스(apoptosis) 등을 통하여 세포 매개 면역반응을 조절하는 물질을 의미한다.
본 발명의 바이오프로브는 생체 내에서 표적 물질들을 직접 검출 가능하도록 하지만, 면역 반응과 항체 등의 간접 영향을 받을 수 있어 제약이 존재할 수 있다. 그러나, 생체 외에서는 특히 미세유체 또는 3D 세포 배양 상에 살아 있는 세포나 여러 분자들을 탑재한 실험에서의 관찰에의 활용이 가능하다.
본 명세서 사용되는 용어 "진단 시약"은 형광이미지를 통하여 체내외에서 표적 단백질의 유무 및 농도를 확인하는 것을 가능하도록 하는 시약을 의미하며, 진단 시약은 제약상 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제의 제제를 포함할 것이나, 추가로 멸균될 것이고 적합한 장성을 가진다.
상기 진단 시약은 체내에서 사용되는 경우 비경구로 투여되며, 비경구 투여는 혈관주사 주입방식에 의한다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 투여시간, 투여방법 및 진단목적에 따라 그 범위가 다양하다.
상기 진단 시약은 체외에서 사용되는 것도 가능하다. 표적 단백질의 검출을 위한 어세이, 이를 용이하게 하는 키트 형태로 사용가능하며, 이에 한정되지 않는다.
이하 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 실시예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 입자가 부착된 압타머의 제조
실시예에서 사용된 압타머는 총 72mer의 단일가닥 DNA(서열번호 1 참조)로서, Bioneer사(한국)에서 주문제작하여 사용하였으며, 상기 서열의 5' 말단에 바이오틴을 붙인 것과, 본 압타머가 세포, 특히 설포-NHS-바이오틴 링커의 도입 부위와 스트렙타비딘이 순차적으로 붙은 부위에 결합 되는지 확인하기 위하여 3'말단에 5-FAM 형광 표지자를 도입한 것을 준비하였다:
(서열 1.1) 5'-바이오틴-GGCAGGAAGACAAACACACAAGCGGGTGGGTGTGTACTATTGCA GTATCTATTCTGTGGTCTGTGGTGCTGT-3'; 및
(서열 1.2) 5'-바이오틴-GGCAGGAAGACAAACACACAAGCGGGTGGGTGTGTACTATTGCA GTATCTATTCTGTGGTCTGTGGTGCTGT-FAM-3'.
실시예 2. 압타머 -면역세포 바이오프로브의 제조
2.1. 면역세포의 준비
배지는 1% 페니실린/스트렙토마이신 첨가 10% 소태아혈청(FBS)을 첨가한 RPMI 1640을 공경 0.2㎛ 주사기 필터(syringe filter)로 여과한 후 사용하였다. 세포(PBMC)는 해동시킨 후 5% CO2, 37℃에서 16시간 동안 배양하여 컨디션을 회복시킨 후 사용하였다.
2.2. 면역세포에 설포 - NHS - 바이오틴의 도입
먼저, 16시간 동안 배양된 PBMC를 원심분리(x200g, 7분)하고, 펠렛을 인산완충용액(DPBS(-))으로 세척한 후, PBMC의 세포생존율을 계수하여 1x107개 90% 이상의 세포 생존율을 확보하였다. 세척한 PBMC를 한 번 더 원심분리한 후, 그 펠렛에 1mM 설포-NHS-바이오틴 400㎕를 첨가하고 혼합시켜 실온에서 30분 동안 반응시킴으로써, PBMC의 표면 단밸질의 아민 그룹과의 공유결합을 유도하였으며, 칼슘 이온 등과 같은 잠재적 물질에 의한 세포 독성을 최소화하기 위하여 총 반응시간은 30분 이내로 하였다. 반응시킨 세포를 무혈청 RPMI 1640으로 세척 및 원심분리(x200g, 7분)하여 상청액을 제거하고, DPBS 400㎕를 첨가하여 2회 세척하였다. 무혈청 RPMI 1640은 PBMC에의 링커 도입에 있어 세포를 보호하게 해주며 환경적 조건을 제공하였다.
본 단계가 잘 이루어졌는지 확인하기 위하여, 1/200로 희석된 스트렙타비딘 피코에리트린(Phycoerythrin, PE) 5㎕/튜브를 첨가하여 세포를 형광염색하여 관찰하였으며, 관찰 결과 피코에리트린에 의하여 세포벽이 적색으로 염색된 것을 확인하였다.
2.3. 압타머의 도입
상기 세포 펠렛에 50㎍/㎖ 스트렙타비딘 400㎕를 첨가한 후, 실온에서 15분 동안 반응시키고 원심분리하여 무혈청 RPMI 1640으로 2회 세척하였다.
PBS(Ca2 + 및 Mg2 + 포함) 중의 5'말단에 바이오틴이 부착된 압타머(서열 1.1) 100pM와 멸균수를 1:10의 부피비로 혼합한 후, 95℃에서 5분 동안 열처리하여 DNA를 CRP와 결합할 수 있는 초기 조건, 즉 단일가닥으로 분리하고, 4℃에서 10분 동안 급속냉각시켜 그 상태를 유지하였다. 스트렙타비딘-PBMC 바이오프로브가 형성되었는지 여부는 형광염색으로 확인하였다.
상기 세포 펠렛에 바이오틴이 부착된 압타머 10㎕ 및 무혈청 배지 RPMI 1640 390㎖를 첨가하여 실온에서 15분 동안 반응시킨 후, 원심분리하여 상청액을 제거하고 세척하였다. 바이오틴이 부착된 압타머가 세포에 확실히 부착되는지 확인하기 위하여, 같은 방법으로 3'말단에 5-FAM(5-Carboxyfluorescein)이 붙어있는 단일가닥 DNA(서열1.2)를 이용하여 형광이미지를 확인하였다. 형광이미지를 분석한 결과, 바이오틴화 DNA(압타머)는 스트렙타비딘과 마찬가지로 PBMC 표면에 결합되는 것을 확인하였다. 또한, 단계별 에탄올로 세포고정 후 DAPI를 도입하여 PBMC를 염색하여 핵을 확인함으로써, 스트렙타비딘과 압타머가 세포질에 결합됨을 통하여 Apt-PBMC 바이오프로브가 형성되는 과정을 파악 할 수 있었다.
실험예 1. 압타머 -면역세포 바이오프로브의 형광이미지화
이렇게 조합된 Apt-PBMC 바이오프로브의 CRP 포획능을 확인하기 위하여, CRP를 농도별로 준비하여 반응시킨 후 형광 표지자로 라벨링된 항-CRP 항체를 이용하여 이미지화하였다.
세포를 각각 4x105개/㎖씩 튜브에 나누어 담고, CRP를 각 튜브에 0, 0.01, 0.1, 1, 2.5, 5, 10 및 30㎍/㎖이 되도록 첨가한 후 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이후 원심분리(x200g, 7분)한 후, 2회 세척하여 세포 펠렛을 수거하였다. 여기에 라벨링된 항-CRP 항체를 1:200으로 희석되도록 첨가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 원심분리기를 이용하여 DPBS(-)로 세척하였다.
CRP가 첨가되지 않은 대조군에서는 노이즈 상태의 형광세기가 관찰되었고, CRP의 농도가 진할수록 이미지 상에서 적색 형광의 세기 값은 증가하는 것을 관찰하였다.
10mM CaCl2를 첨가하여 CRP와 반응시킨 후, 잔존하는 칼슘 이온과 BSA, 안정제 등을 여과하여 순수 CRP/Ca2 +를 표준 시료로 이용하였다. Apt-PBMC 바이오프로브에 의해 포획된 CRP/Ca2 +에 동량의 항-CRP 항체를 이용하여 포획을 확인한 결과, 칼슘 이온이 부재하는 것보다 10배 이상의 형광 세기를 확인하였다. CRP 농도에 따른 형광세기 값의 변화는 하기 표로 나타내었으며, image J 소프트웨어를 통하여 15개 이상의 세포의 형광세기 값을 각각 평균으로 나타내었다. 최저 검출한계치(LOD)는 0.05㎍/㎖로 high-sensitivity CRP(hs-CRP)의 0.04㎎/㎖와 비슷한 감도를 나타내므로, 생세포를 기반으로한 고감도 세포 센서로서의 가능성을 확인하였다.
실험예 2. 압타머 -면역세포 바이오프로브의 핵 염색 및 세포 고정
세포고정은 CRP를 포획한 Apt-PBMC 바이오프로브 펠렛에 에탄올을 각각 50%, 70% 및 100%가 되도록 첨가하여 순차적으로 탈수 및 고정되도록 수행하였다. 완전히 고정된 세포를 공기로 건조시킨 후, PBST(-, 0.05% Tween-20)로 2회 세척하였다.
여기에, DAPI 작동 용액(working solution)(4',6-다이아미디노-2-페닐인돌) 1㎖를 첨가하여 5분 동안 핵 염색을 실시하였다. 이후 이를 PBST(-)로 2회 세척한 후 완전히 건조시켰다. 형광 마운팅 배지(fluorescence mounting medium, Dako사) 20㎕를 첨가하고 커버슬립(coverslip)으로 덮어 봉입(매니큐어 처리)한 후 4℃에서 보관하였다.
실험예 3. TNF -α의 정량화
Apt-PBMC가 검출 중에 살아있는 상태를 유지하며 세포 매개 면역반응 조절 세포로서의 기능을 수행함을 확인하기 위하여, PBMC 및 Apt-PBMC를 1.5x105개/웰로 24웰에 분주한 후, 자극제인 리포다당류(lipopolysaccharide, LPS) 0.2㎍/㎖가 되도록 첨가하였다. 총 24시간의 배양 기간 동안 PBMC 내 T 세포를 자극시켜 TNF-α의 분비량을 효소 면역 측정법(ELISA)를 이용하여 TNF-α를 정량화하였다(인간 TNF-α ELISA 키트, R&D 시스템). LPS에 의하여 자극된 PBMC에 비하여, Apt-PBMC 바이오프로브는 대조군 대비 90% 이하의 TNF-α 분비량을 나타내어, 생세포 센서 또는 세포 매개체로서의 역할을 수행하는 것을 확인하였다.
실험예 4. 세포 생존율의 판별
트립판 블루 분석방법(Trypan Blue assay)을 이용하여 세포 생존율을 판별하였다. Apt-PBMC를 제조하고, 해동시킨 PBMC를 16시간 동안 배양하여 안정화시킨 후, 같은 조건(5% CO2, 37℃) 하에서 3일 동안 배양하였다. 12시간마다 세포를 원심분리 및 세척하고, 0.4% 트립판 블루 용액을 첨가한 후, 세포 계수기를 이용하여 세포 생존율을 관찰하였다.
본 발명에서 사용한 설포-NHS-바이오틴 또는 스트렙타비딘의 농도는 세포 표면의 리간드 및 리셉터들에 방해가 적음을 단적으로 확인시켜주고 있다. 이러한 생세포 센서로서의 가능성은 세포생존율의 적은 변화와 형광탐지자를 이용한 이미지 제작 등에 의하여 확인되었으나, 면역세포인 PBMC의 특성에 영향을 미칠 수 있다. TNF-α의 감소는 어떤 의미에서든 첨가된 분자에 의해 세포가 영향을 받고 있음을 증명하기도 하지만, 면역세포로서의 기능적 수행에 있어 제약을 많이 받지 않는 것을 확인시켜주고, 세포 센서에서 세포 생존율은 가장 중요한 조건이 된다. 따라서, Apt-PBMC 바이오프로브를 제조한 후 대조군 PBMC와의 세포 생존율을 72시간 동안 비교하였는데, Apt-PBMC 바이오프로브는 36시간까지 대조군 대비 큰 차이가 없었으며, 이후 조금씩 생존율이 감소하는 것을 확인하였다. 그러나, 3일 이후에도 생존율이 65%이상으로 관찰되어 링커 및 다른 분자들이 세포의 생존율에 크게 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 이는 PBMC를 이용한 생세포 센서가 생체 내외로 사용될 가능성이 있음을 시사하였다.
또한, 트립판 블루 염색법에 의해 염색되지 않은 세포는 트립판 블루를 배출 하는 것으로 이해되며, 세포막 능동수송과 세포 소기관에 첨가된 분자들이 침투하거나 영향을 최소한으로 미치는 것으로도 이해할 수 있었다.
실험예 5. 압타머 -면역세포 바이오프로브의 이동상 확인
DPBS에 용해시킨 CRP(pH 8.0, 0.2% BSA 함유) 용액 50㎕에 염화칼슘(CaCl2)을 10mM가 되도록 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 잔류하는 칼슘 이온을 원심분리(14000rpm, 5분)하여 초미세여과(ultrafiltration)하여 제거하였다(CRP 표준용액).
Apt-PBMC 바이오프로브는 면역세포로서의 역할뿐만 아니라 호밍 분자(homing molecule)을 탑재한 세포 센서로서의 역할과 이동이 가능하다. 이것을 증명하기 위하여, 사인펜으로 폭 3mm의 채널을 만들어 소수성 장벽을 만든 에폭시 글래스(epoxy glass) 위에 CRP 표준 용액을 각각 0, 4 및 4㎍/㎖이 되도록 분리하여 첨가하고 4℃에서 반응시켰다. 2% BSA를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹한 후, PBST로 2회 세척하였다. DAPI 로 염색된 Apt-PBMC 20㎕(1x107개/㎖)를 채널 위에 올리고, 2시간 동안 반응시킨 후, PBS 및 물로 세척하여 Apt-PBMC의 표면 CRP에 부착되는 패턴(이동상)을 확인하였다.
관찰 결과, CRP의 농도가 높은 영역에서 보다 많은 세포(~2x106개/슬라이드)가 관찰되었으며, 나머지 두 영역에서는 각각 ~1.6x105개/슬라이드, ~6x104/슬라이드로 관찰되어 Apt-PBMC 바이오프로브가 CRP의 농도에 의존적으로 이동한다는 것을 확인하였다.
비교예 1. Apt-자성 비드 바이오프로브의 제조
압타머의 존재여부 및 전체 가설의 증명을 위하여, 세포를 산화철 비드로 대체로 하여 Apt-자성 비드(Magnetic bead) 바이오프로브를 제조하였다.
CRP의 농도를 각각 8.4, 16.8 및 25.2ng/㎖로 하여 스트렙타비딘 PE에 의한 형광세기 값(λex/λem = 500/580nm)을 측정하였다. 또한, 카르복시기가 부착된 산화철 비드(M270)를 기반으로 EDC/NHS를 도입하여 바이오틴이 부착된 항-CRP 항체를 결합시킨 후, Apt-자성 비드 바이오프로브를 만들어 직접적인 PBMC를 이용하는 생 세포센서로서의 성능을 평가하였다.
세포를 대체한 산화철 입자가 그 작용 메커니즘에 사용되어, EDS/NHS에 의하여 산화철 비드 표면에 있는 카르복시기를 바이오틴화된 항-CRP 항체의 아민기와 반응하게 하여 두 물질을 결합시킴을 확인하였다.
항체를 산화철 비드에 결합시킨 후, 각각 8.4, 16.8 및 25.2ng/㎖의 CRP 용액을 도입하여, 압타머가 올바르게 작동하는지 여부를 판별하였다. PE가 부착된 스트렙타비딘을 첨가하여 이미지를 확인하였고, 이를 통하여 CRP 농도가 증가함에 따라 PE에 의한 형광세기 값이 증가함을 관찰하였다(p값 < 0.0001). 압타머가 존재하지 않는 대조군에서도 형광세기 값이 관찰되었는데, 이는 산화철/CRP의 바이오틴 부분에 스트렙타비딘 PE가 부착되어 발생한 것으로 판단되었다.
비드에 의한 CRP 검출이기 때문에, 이 방법을 먼저 실험하여 항체의 성능을 검증하였다. CRP 농도에 따라 형광세기 값이 스트렙타비딘 PE에 의하여 증가하는 것을 확인하였고, 대조군에서는 큰 폭의 형광세기 값의 감소를 확인 하였다. 이런 결과들로 인하여, 각각의 생체 분자(biomolecule)의 도입 및 링커의 도입이 가능함을 확인하였고, 또한 CRP 농도에 따른 형광세기 변화도 함께 확인함으로써 세포 센서로서의 기능을 수행할 수 있음을 확인하였다. 또한, 산화철 비드를 코어로 하는 압타머 산화철 비드는 체외에서 탐지자로 이용될 수 있음도 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

  1. 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머(aptamer), 및 상기 압타머와 링커(linker)를 통하여 연결되는 면역세포를 포함하는 표적 단백질 검출용 바이오프로브(bioprobe).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 압타머는 15 내지 250개의 뉴클레오타이드를 갖는 것인 표적 단백질 검출용 바이오프로브.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 압타머는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것인 표적 단백질 검출용 바이오프로브.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포는 말초혈액단핵구(PBMC), B-세포, T-세포, 호중성구(neutrophil), 호염기구(basophil), 호산구(eosinophil) 및 단핵구(monocyte)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 표적 단백질 검출용 바이오프로브.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포는 검체인 환자의 혈액으로부터 분리되는 것인 표적 단백질 검출용 바이오프로브.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 링커는 설포-NHS-바이오틴, EDC/NHS-바이오틴, 아민-PEG2-바이오틴, 설포-NHS-LC-바이오틴 및 아비딘(Avidin)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 표적 단백질 검출용 바이오프로브.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단백질은 C 반응성 단백(C-reactive protein, CRP), 혈관표피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 인테그린(integrin), BNP2, TGF-β 및 CK-BM으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 표적 단백질 검출용 바이오프로브.
  8. 제1항 내지 제7항에 따른 표적 단백질 검출용 바이오프로브를 포함하는 표적 단백질 검출용 진단 시약.
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