WO2018012702A1 - Pcl 패치 조직재생 지지체 및 그 제조방법 - Google Patents

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정종훈
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장경제
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    • D10B—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBLASSES OF SECTION D, RELATING TO TEXTILES
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Definitions

  • the present invention relates to a PCL patch tissue regeneration support and a method of manufacturing the same, and more particularly, to a polycaprolactone (PCL) patch tissue regeneration support and a method for producing the growth factor release.
  • PCL polycaprolactone
  • Chronic otitis media (chronic eardrum perforation) is a persistent disease of the eardrum, one of the most common causes of hearing damage in the field of otorhinolaryngology, but most therapeutic methods still rely on surgical methods (tympanic regeneration).
  • Eardrum perforation can be divided into acute and chronic. Acute eardrum perforation is highly likely to regenerate naturally if the size of the perforation is not large.However, chronic eardrum perforation (chronic otitis media) over 3 months does not heal most naturally. Older age can lead to complications such as irritation, hearing loss, facial paralysis, or brain abscess.
  • tympanic regeneration For the treatment of chronic otitis media, the surgical method called tympanic regeneration is generally used, which is expensive, requires more than one hour of operation time and requires complicated anesthesia, requires hospitalization, and recurrence rate. There are many problems, such as more than 10%.
  • Electrospinning is one of the easiest ways to produce nanofibers, which is a method that can produce nanofibers that are uniform and continuous and can exhibit various properties depending on the composition ratio.
  • the part of obtaining the nanofibers spun by the electrospinning method is called a collector, it is possible to adjust the characteristics of the nanofibers obtained according to the shape of the collector.
  • the characteristics of the cells were also controlled in the nanostructure obtained through electrospinning.
  • An object of the present invention is to provide a PCL patch tissue regeneration support and a method of manufacturing the same, which can be used as a non-surgical treatment for chronic eardrum perforation, which is simple, efficient and has low recurrence rate.
  • the present invention comprises the steps of preparing a solution by adding polycaprolactone (PCL) and acid to the organic solvent and stirring; Adding a growth factor to the solution and stirring to prepare an electrospinning solution; And connecting the prepared electrospinning solution to a syringe pump and operating the electrospinning apparatus to collect nanofibers arranged in a spindle shape in the collector.
  • PCL polycaprolactone
  • the present invention comprises the steps of preparing a polycaprolactone-polyethylene glycol copolymer solution by adding polycaprolactone (PCL) and polyethylene glycol (PEG) and acid to the organic solvent and stirring; Adding a growth factor to the solution and stirring to prepare an electrospinning solution; And connecting the prepared electrospinning solution to a pump and then operating an electrospinning apparatus to collect nanofibers arranged in a spindle shape in the collector.
  • PCL polycaprolactone
  • PEG polyethylene glycol
  • the present invention also provides a PCL patch tissue regeneration support, which comprises polycaprolactone as fusiform nano-fibers.
  • the present invention also provides a PCL and PEG patch tissue regeneration support comprising fusiform nanofibers, comprising polycaprolactone and polyethylene glycol.
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of chronic tympanosclerosis, comprising the PCL patch tissue regeneration support.
  • the present invention also provides a composition for the prevention or treatment of chronic tympanosclerosis, comprising PCL and PEG patch tissue regeneration support.
  • PCL patch tissue regeneration support according to the present invention can be usefully used for the treatment of chronic eardrum perforation, especially in the treatment-dependent therapy for the treatment of chronic eardrum perforation can exhibit a high eardrum recovery rate.
  • PCL patch tissue regeneration support can be applied to the regeneration and treatment of other damaged tissues, it is possible to develop and apply a variety of tissue regeneration support by simulating the tissue structure of other parts of the human body.
  • FIG. 1 is a bottom plate design (a) of the collector, a cylindrical collector disposed on the collector bottom plate (b), the design of a metal column pointed to one end to be attached to the collector bottom plate (c), and modeling by combining all the components
  • Figure 2 shows the electrospinning collector (d) for producing a spindle pattern patch showing one aspect
  • Figure 2 shows an electron microscope image of the electrospun fusiform PCL patch, a photograph of a fusiform PCL patch at 200 magnification (a), a photograph of a magnification of the fusiform PCL patch 3000 times (b), a fusiform PCL patch (C) a photograph taken at a magnification of 300,000 times, and a photograph taken at 300,000 times to measure the thickness of the nanofiber strand (d);
  • Figure 3 shows an electron microscope image of the electrospun fusiform PCL and PEG patch, a photograph of the fusiform PCL and PEG patch at 200 magnification (a), the photograph of the magnification of the PCL and PEG patch at 3000 times magnification (b ), A picture (c) of the spindle-type PCL and PEG patches magnified by 300,000 times, and a picture (d) of the nanofiber strands measured by analyzing the images taken at 300,000 times;
  • Figure 4 shows the morphology of TM cells in EGF loaded PCL patch support
  • 5A and 5B show the results of cell proliferation test of tympanic stem cells (TM cell) in a spindle-type PCL patch prepared by electrospinning, and results of the growth of tympanic stem cells in a PCL patch carrying PCL and IGFBP2; Figure showing the results of proliferation of tympanic stem cells in PCL patch carrying PCL and EGF;
  • Figure 6 shows the results of cell proliferation test of the tympanic stem cells (TM cell) in the spindle PCL and PEG patches prepared using electrospinning, the tympanum on the patch prepared according to Example 4 and Comparative Examples 5-7 Figure showing the stem cell proliferation results;
  • Figure 7 shows the patch application test results in a chronic eardrum perforated animal model, the tympanic photo (a to e) of the test group treated by applying the spindle PCL patch, the table below shows the control and EGF-R (EGF is A table showing the treatment rates of the included random) PCL patch, EGF-N (spindle type with EGF) PCL patch; And
  • Figure 8 shows the patch application test results in the animal model of chronic perforation perforation, tympanic photograph (a to e) of the test group treated by applying the spindle PCL patch, the table below shows the control and EGF-R (EGF is It is a table showing the treatment rate of the included random) PCL patch, EGF-N (spindle pattern with EGF) PCL patch.
  • EGF-R EGF is It is a table showing the treatment rate of the included random) PCL patch
  • EGF-N spindle pattern with EGF
  • the inventors of the present invention have found that the characteristics of the cells can be controlled even in the nanostructure by adjusting the properties of the nanofibers obtained according to the shape of the collector by using the electrospinning method, in particular the growth factor and spindle type supported by the PCL patch.
  • the present invention was completed by finding out that the PCL patch scaffold arranged in the present invention is effective in treating chronic eardrum.
  • the present invention comprises the steps of preparing a solution by adding polycaprolactone (PCL) and acid to the organic solvent and stirring; Adding a growth factor to the solution and stirring to prepare an electrospinning solution; And connecting the prepared electrospinning solution to a syringe pump in a collector-shaped cylindrical shape accommodating a needle therein, and then operating the electrospinning apparatus to collect nanofibers arranged in a spindle shape in the collector.
  • PCL polycaprolactone
  • the polycaprolactone is a polyester-based biodegradable polymer polymerized from caprolactone (CL).
  • CL caprolactone
  • PCL Polycaprolactone
  • the preparing of the solution may include adding polycaprolactone and an acid to an organic solvent and then stirring the solution at 200 to 500 rpm for 24 to 48 hours, but is not limited thereto.
  • the concentration of polycaprolactone in the organic solvent may be 70 to 90 mg / ml, but is not limited thereto.
  • the organic solvent is trifluoroethanol (2,2,2-trifluoroethanol), chloroform, chloroform, dichloromethane, tetrahydrofuran, tetrahydrofuran, dimethylformamide, and dimethylsulfoxide. It may be any one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the acid may be any one selected from the group consisting of acetic acid, formic acid, propionic acid, and lactic acid, but is not limited thereto.
  • the growth factor may be any one selected from the group consisting of epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • IGFBP insulin-like growth factor binding protein
  • the epidermal growth factor serves to promote the synthesis of DNA, RNA, protein, hyaluronic acid and fibronectin.
  • the EGF is found in the early stages of the repair of the tympanic perforation, and the growth factor in which the EGF is combined with heparin may play an important role in the healing of the tympanic perforation.
  • the fibroblast growth factor can help the migration of fibroblasts, proliferate and repair the cells.
  • the insulin-like growth factor binding protein may prevent cell death and promote growth or promote differentiation depending on the intracellular matrix.
  • Preparing the electrospinning solution may be to add a growth factor of 0.16 to 16 ⁇ g / ml in the solution, but is not limited thereto.
  • the preparing of the electrospinning solution may include adding a growth factor to the solution and then stirring the solution for 20 to 30 minutes at 0 to 10 ° C., but is not limited thereto.
  • the step of collecting the nanofibers may be to connect the prepared electrospinning solution to the syringe pump and then discharge the electrospinning device at a rate of 0.2 to 3.0 ⁇ l / hr, but is not limited thereto.
  • the nanofibers may have an average thickness of 200 to 800 nm, but is not limited thereto.
  • the collector may be of a cylindrical shape accommodating the needle therein, but is not limited thereto.
  • the collector serves to collect charged nanofibers, and is composed of a copper pipe having excellent conductivity and a sharp metallic needle at the center thereof.
  • the present invention comprises the steps of preparing a polycaprolactone-polyethylene glycol copolymer solution by adding polycaprolactone (PCL) and polyethylene glycol (PEG) and acid to the organic solvent and stirring; Adding a growth factor to the solution and stirring to prepare an electrospinning solution; And connecting the prepared electrospinning solution to a pump and then operating an electrospinning apparatus to collect nanofibers arranged in a spindle shape in the collector.
  • PCL polycaprolactone
  • PEG polyethylene glycol
  • the preparing of the solution may include adding polycaprolactone, polyethylene glycol, and acid to an organic solvent, and then stirring the solution at 200 to 500 rpm for 24 to 48 hours, but is not limited thereto.
  • the concentration of polycaprolactone in the organic solvent may be 100 to 160 mg / ml, but is not limited thereto.
  • the concentration of polyethylene glycol in the organic solvent may be 40 to 100 mg / ml, but is not limited thereto.
  • the organic solvent may be trifluoroethanol (2,2,2-trifluoroethanol), chloroform, chloroform, dichloromethane, tetrahydrofuran, tetrahydrofuran, dimethylformamide, and dimethylsulfoxide. It may be any one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the acid may be any one selected from the group consisting of acetic acid, formic acid, propionic acid, and lactic acid, but is not limited thereto.
  • the growth factor may be any one selected from the group consisting of epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • IGFBP insulin-like growth factor binding protein
  • the preparing of the electrospinning solution may add a growth factor of 0.16 to 16 ⁇ g / ml to the solution, but is not limited thereto.
  • the preparing of the electrospinning solution may include adding a growth factor to the solution and then stirring the solution for 20 to 30 minutes at 0 to 10 ° C., but is not limited thereto.
  • the step of collecting the nanofibers may be to run the electrospinning device by connecting the prepared electrospinning solution to the pump to release at a rate of 0.2 ⁇ 3.0 ⁇ l / hr, but is not limited thereto.
  • the nanofibers may have an average thickness of 200 to 800 nm, but is not limited thereto.
  • the collector may be of a cylindrical shape accommodating the needle therein, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a PCL patch tissue regeneration support, which comprises polycaprolactone as fusiform nano-fibers.
  • the PCL patch tissue regeneration support may further include a growth factor, but is not limited thereto.
  • the PCL patch tissue regeneration support may include polycaprolactone and growth factors in a weight ratio of 10 4 to 10 6 : 1, but is not limited thereto.
  • the growth factor may be any one selected from the group consisting of epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • IGFBP insulin-like growth factor binding protein
  • the nanofibers may have an average thickness of 200 to 800 nm, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a PCL and PEG patch tissue regeneration support comprising fusiform nanofibers, comprising polycaprolactone and polyethylene glycol.
  • the PCL and PEG patch tissue regeneration support may further include a growth factor, but is not limited thereto.
  • the PCL and PEG patch tissue regeneration support may include polycaprolactone and growth factors in a weight ratio of (7 ⁇ 10 4 to 7 ⁇ 10 6 ): 1, but is not limited thereto.
  • the PCL and PEG patch tissue regeneration support may include polyethylene glycol and growth factors in a weight ratio of (3 ⁇ 10 4 to 3 ⁇ 10 6 ): 1, but are not limited thereto.
  • the PCL and PEG patch tissue regeneration support may include polycaprolactone and polyethylene glycol in a weight ratio of (2 to 4): 1, but is not limited thereto.
  • the growth factor may be any one selected from the group consisting of epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • IGFBP insulin-like growth factor binding protein
  • the nanofibers may have an average thickness of 200 to 800 nm, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of chronic tympanosclerosis, comprising the PCL patch tissue regeneration support.
  • the present invention also provides a composition for the prevention or treatment of chronic tympanosclerosis, comprising PCL and PEG patch tissue regeneration support.
  • the composition may be a pharmaceutical composition or a dietary supplement, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition can be used in the form of powder, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and the solid preparations may include at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose ( sucrose, lactose, gelatin and the like can be mixed and prepared.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. .
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the amount of the compound which is an active ingredient of the pharmaceutical composition may vary depending on the age, sex, weight, and disease of the patient, but is preferably 0.001 to 100 mg / kg, preferably 0.01 to 10 mg / kg once or several times daily. can do.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, and the like. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.
  • the pharmaceutical composition may be administered to mammals such as mice, mice, livestock, humans, and the like by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrabronchial inhalation, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • the dietary supplement may be provided in the form of powder, granules, tablets, capsules, syrups or beverages, the dietary supplement is used with other foods or food additives in addition to the compound according to the present invention as an active ingredient, and It can be suitably used according to the phosphorus method.
  • the mixed amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use thereof, for example, prophylactic, health or therapeutic treatment.
  • the effective dose of the compound contained in the health functional food may be used in accordance with the effective dose of the pharmaceutical composition, but may be less than the above range in the case of long-term intake for health and hygiene purposes or health control purposes However, since the active ingredient has no problem in terms of safety, it is evident that it can be used in an amount above the above range.
  • dietary supplements for example, meat, sausages, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, drinks, tea , A drink, an alcoholic beverage, and a vitamin complex.
  • the distance between the needle end of the 22 gage and the collector was fixed at 10 cm, and a voltage generator generated 18 kV.
  • TFE trifluoroethanol
  • PCL polycaprolactone
  • acetic acid 40 ⁇ l of acetic acid
  • the prepared electrospinning solution was placed in a syringe and spun at a rate of 0.6 ⁇ l / hr by connecting a syringe pump.
  • PCL patch tissue regeneration support arranged in spindle form was prepared by adjusting and operating the electrospinning apparatus.
  • PCL patch tissue regeneration support prepared according to Example 1 below was named 'EGF-A'.
  • PCL patch tissue regeneration support was prepared in the same manner as in Example 1 except that 1.6 ⁇ g of IGFBP was added instead of EGF.
  • PCL patch tissue regeneration support prepared according to Example 2 below was named 'IGFBP-A'.
  • PCL patch tissue regenerating scaffolds were prepared under the same conditions as in Example 1 except that 1.6 ⁇ g and 1.6 ⁇ g of EGF and IGFBP were added, respectively.
  • PCL patch tissue regeneration support prepared according to Example 3 below was named 'EGF / IGFB-A'.
  • the distance between the needle end of the 22 gage and the collector was fixed at 10 cm, and a voltage generator generated 18 kV.
  • PCL polycaprolactone
  • PEG polyethylene glycol
  • TFE trifluoroethanol
  • the prepared electrospinning solution was placed in a syringe and spun at a rate of 0.6 ⁇ l / hr by connecting a syringe pump.
  • a collector consisting of a highly conductive copper pipe and a sharp metallic needle at the end thereof was used to collect in the form of a fusiform pattern patch, and conditions were generated to generate an electric field of 1.6 kV / cm.
  • PCL and PEG patch tissue regeneration scaffolds arranged in spindle form were prepared by adjusting and operating the electrospinning apparatus.
  • PCL and PEG patch tissue regeneration support prepared according to Example 4 below was named 'PCL / PEG / EGF-A'.
  • Example 2 The same conditions as in Example 1 were used except that a growth factor was used, but the collector was generally used for electrospinning without adding EGF, which was named as 'PCL-R'.
  • Example 2 Except for using a collector generally used for electrospinning was the same conditions as in Example 2, hereinafter referred to as 'IGFBP-R'.
  • Example 4 The same conditions as in Example 4 were used except that the growth factor was used without the addition of EGF, which was generally used for electrospinning, and was named ⁇ PCL / PEG-R ''.
  • SEM Scanning electron microscopy
  • each nanofiber strand did not exceed 300 nm.
  • 3 (a) to 3 (d) show scanning electron microscope images of spindle PCL and PEG patches obtained from a cylindrical collector accommodating saliva therein.
  • Figure 3 (b) and Figure 3 (c) is an image obtained by randomly expanding a specific portion of the sample, it can be seen that most of the nanofiber strands extend in a straight line.
  • each nanofiber strand did not exceed 300 nm.
  • Rat fibroblast passage 2 (provided by Ajou University Otolaryngology, hereinafter referred to as "TM cell") was used for in vitro testing. After thawing the frozen TM cells were cultured in a medium prepared by mixing DMEM low glucose, 10% FBS (Fatal Bovine Serum), 1% penicillin in 37 °C, 5% CO 2 incubator for 7 to 10 hours. After confirming that the culture density of the TM cells became confluent, they were separated from the culture plate using trypsin EDTA.
  • the experimental group was prepared by the fusiform patch (EGF-A) containing the EGF prepared by Example 1, the nanopattern patch (PCL-R) by spinning the PCL prepared by Comparative Example 1 in a nonwoven fabric, Comparative Example 2
  • In vitro testing was performed using the prepared spindle-shaped nanopattern patches (PCL-A), and the random patches containing EGF prepared by Comparative Example 3 (EGF-R).
  • the four kinds of patches were prepared in a circular well having a diameter of 6 mm in a 96 well plate and fixed to each plate.
  • Each 96 well plates were then seeded with 1 ⁇ 10 3 TM cells per well.
  • the activity of the cells was measured by the WST assay at 1, 3 and 5 day intervals.
  • the experiment of the same process as described above was repeated by including the IGFBP prepared in Example 2 in the patch.
  • Random means a patch radiated in a random shape
  • Aligned means a patch made to be arranged in fusiform
  • w / o EGF means that EGF is not contained
  • w EGF is EGF is It means that it contains.
  • 5a and 5b shows the results of confirming the proliferation of the cells by culturing the tympanic stem cells on a patch for 5 days to measure the activity of the cells, including EGF and IGFBP prepared according to Examples 1 and 2
  • EGF and IGFBP prepared according to Examples 1 and 2 A similar test result was observed in the PCL patch, and both tests did not show a significant difference on the 1st and 3rd days, and both experiments showed a clear difference only on the 5th day. That is, it was observed that cell proliferation was most active on spindle-type PCL patches including EGF and IGFBP prepared according to Examples 1 and 2.
  • Rat fibroblast passage 2 (provided by Ajou University Otolaryngology, hereinafter referred to as "TM cell") was used for in vitro testing. After thawing the frozen TM cells were cultured in a medium prepared by mixing DMEM low glucose, 10% FBS (Fatal Bovine Serum), 1% penicillin in 37 °C, 5% CO 2 incubator for 7 to 10 hours. After confirming that the culture density of the TM cells became confluent, they were separated from the culture plate using trypsin EDTA.
  • the experimental group was a PCL and PEG fusiform nanopattern patch containing EGF (Example 4, PCL / PEG / EGF-A), a nanopatch spinning the PCL and PEG containing EGF in the form of a nonwoven fabric (Comparative Example 5, PCL / PEG / EGF-R), nanopatches that emit PCL and PEG that do not contain EGF (Comparative Example 6, PCL / PEG-R), and PCL and PEG fusiform nanopattern patches that do not contain EGF (comparison) Example 7, PCL / PEG-A), performed in vitro.
  • the four kinds of patches were prepared in a circular well having a diameter of 6 mm in a 96 well plate and fixed to each plate. Thereafter, 1 ⁇ 10 3 TM cells per well were dispensed into 96 well plates.
  • the activity of the cells was measured by the WST assay at intervals of 1 day, 3 days, and 7 days.
  • FIG. 6 is a view showing the results of confirming the proliferation of cells by culturing the eardrum stem cells on the patch for 1 day, 3 days, 7 days to measure the activity of the cells.
  • the chronic eardrum perforation model used the Choung's COM mode1 1 method (Choi SJ, et al. TERM 2011) to make perforation lasting more than 8 weeks in Sprague-Dawley rats.
  • the experimental group was conjugated with a random patch and fusiform patch including EGF and IGFBP-2, and the control group did not receive any treatment.
  • the size of the perforation of the tympanic membrane was measured weekly by displaying the relative ratio (%) of the perforation size to the pars tensa in the state in which the eardrum was photographed using an endoscope. Eight weeks after patch conjugation, the healing rate of the eardrum was compared.
  • Figure 7 shows the results of applying the PCL patch in the chronic eardrum perforated animal model, each orange round circular photo is a tympanic photo of each animal model, dark colored circular tympanic perforation visible in the lower left of each eardrum Indicates.
  • Figure 7 (a) is the result that the perforation is not maintained because the recovery is not made
  • Figure 7 (b) to Figure 7 (e) is a recovery can be seen that most of the perforation disappeared.
  • Figure 8 shows the results of applying the PCL patch carrying IGFBP in a chronic eardrum perforated animal model, 21.4% (2/14) of the eardrum in the control group that did not receive any treatment (see Figure 8 (a)) could be observed.
  • the experimental group applying the IGFBP random patch prepared by Comparative Example 4 showed a tympanic recovery rate of 32.4% (5/18), and the experimental group applying the IGFBP fusiform patch prepared by Example 2 was 35.0% (7/20). It was observed that the eardrum recovered. Through this, it was confirmed that the growth factors (EGF and IGFBP) carrying the PCL patch and the spindle pattern structure of the patch support were effective in treating chronic eardrum.
  • the growth factors (EGF and IGFBP) carrying the PCL patch and the spindle pattern structure of the patch support were effective in treating chronic eardrum.

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Abstract

본 발명은 PCL 패치 조직재생 지지체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유기용매에 폴리카프로락톤(PCL)과 산을 첨가한 후 교반하여 용액을 준비하는 단계; 상기 용액에 성장인자를 첨가한 후 교반하여 전기방사 용액을 준비하는 단계; 및 상기 준비된 전기방사 용액을 시린지 펌프에 연결한 후 전기방사 장치를 가동하여 컬렉터에 방추형으로 배열된 나노섬유를 포집하는 단계를 포함하는, PCL 패치 조직재생 지지체의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 PCL 패치 조직재생 지지체는 급성 및 만성고막 천공의 치료에 유용하게 이용될 수 있으며, 특히 만성고막 천공 치료를 위해 수술에 의존하는 치료법에서 수술의 비중을 줄이고 높은 고막 회복율을 나타낼 수 있다. 또한 PCL 및 패치 조직재생 지지체는 손상된 다른 조직의 재생 및 치료에 응용할 수 있으며, 인체의 다른 부위의 조직구조를 모사하여 다양한 조직재생 지지체의 개발 및 응용이 가능하다.

Description

PCL 패치 조직재생 지지체 및 그 제조방법
본 발명은 PCL 패치 조직재생 지지체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 성장인자 방출형의 폴리카프로락톤(Polycaprolaclone; 이하 'PCL') 패치 조직재생 지지체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
만성중이염(만성고막천공)은 고막천공이 지속되는 질환으로 이비인후과 영역에서 가장 흔한 청력손상의 원인 중 하나이지만 아직까지도 대부분의 치료적 방법을 수술적 방법(고막재생술)에 의존하고 있다.
고막천공은 크게 급성과 만성으로 나눌 수 있는데, 급성 고막천공은 천공의 크기가 크지 않을 경우 자연적으로 재생될 가능성이 높으나, 3개월 이상 되는 만성고막천공(만성중이염)은 대부분 자연적으로 치유되지 않으며, 오래되는 경우 이루, 화농, 청력소실, 안면신경마비, 또는 뇌 농양 등의 합병증을 유발할 수 있다.
이러한 만성중이염의 치료를 위해서는 일반적으로 고막재생술 이라는 수술적 방법을 사용하게 되는데, 비용이 많이 들고, 1시간 이상의 수술시간과 마취가 요하는 등의 복잡한 술식을 요하며, 입원이 필요하고, 재발율이 10% 이상에 달하는 등의 많은 문제점을 가지고 있다.
통계청 발표에 의하면 2009년부터 2013년까지 중이염에 의한 환자 수는 평균 170만명 정도이며, 진료비 또한 약 1700억원 규모로 형성되어 있음이 조사되었다.
이러한 수술적 방법의 문제점을 극복하고자 많은 방법이 연구되어오고 있는데, 그 중 가장 고전적인 방법이 paper patch technique이다. 즉, 천공부위에 종이 패치를 잘라 붙이는 것으로 고막천공 변연의 세포가 종이패치를 지지대로 삼아 자랄 수 있게 하는 역할을 해주는 치료법이다. 일반적으로 작은 천공 크기의 급성고막천공에 효과가 있으나 만성고막천공에는 전혀 효과가 없는 것으로 알려져 있다. 즉, 비생체적합성 물질로 인하여 염증을 유발하고 성공률이 10%에 미치지 못하는 것으로 알려졌다.
이러한 paper patch technique 외에 만성고막 천공 치료를 위하여 패치형태의 스캐폴드를 적용하는 연구중, 성장인자를 포함하는 키토산 패치를 제작한 뒤, 이를 만성 동물모델에 적용하여 치료효과를 확인하는 시도가 보고되었다. 키토산 패치에 성장인자를 담지시켜 서방성을 가지도록 하였고, 이를 통해 만성고막천공 동물모델에서 높은 치유율을 보이는 것이 확인되었다. 상기 키토산 패치에 담지시킨 상피성장인자(epidermal growth factor; 이하 'EGF')등은 줄기세포의 증식에 영향을 주는 요소로 알려져 있으며, 이를 담지한 패치는 고막천공의 변연에 남아있는 줄기세포를 자극하여 만성고막천공 치료에 영향을 주는 것으로 보고되어 있다. 다만, 상기 키토산 패치는 미 식약청 FDA로부터 승인받지 못하여 임상에 쉽게 적용하기 위한 다양한 시도들이 이루어지지 않은 문제점이 있다.
인체의 모든 세포는 세포외기질(extracellular matrix; 이하 'ECM')이 제공하는 다양한 환경 속에 있으며, 세포외 기질은 각각의 특정적인 나노 구조를 갖는 것으로 보고되고 있다. 최근 보고된 연구에 따르면 인 비트로(in vitro) 실험에서 세포가 부착하여 자라는 기질의 표면 나노구조에 의해서 세포의 모양, 이동성 뿐만 아니라 기능까지 조절 될 수 있음이 확인되었다. 따라서, 고막조직의 경우에도 적절한 나노환경을 제공할 경우, 고막줄기세포가 나노구조의 모양이나 배치에 반응하여 그 모양이나 이동성, 그리고 기능까지 변화할 수 있음을 시사하고 있다.
나노섬유를 가장 쉽게 제조할 수 있는 방법으로 전기방사법이 있으며, 이는 균일하고 연속적이며, 조성비에 따라 다양한 특성을 발휘할 수 있는 나노섬유를 제조할 수 있는 방법이다. 이 때, 전기방사법에서 방사된 나노섬유를 획득하는 부분을 컬렉터라고 부르며, 컬렉터의 형태에 따라 수득하는 나노섬유의 특성을 조절 할 수 있다. 국내외의 활발한 연구를 통해 전기방사를 통해 얻어진 나노구조에서도 세포의 특성이 조절됨을 발견 하였다.
다만, 약물전달체 및 다양한 의료용 분야 연구에 사용될 수 있는 생분해성과 생체적합성이 우수한 고분자를 전기방사법을 통해 방추형의 조직재생 지지체를 제조하는 방법에 대해서는 전무한 상황이다.
본 발명의 목적은 간편하고 효율적이며 재발율이 적은 만성고막 천공의 비수술적 치료방법으로 사용될 수 있는 PCL 패치 조직재생 지지체 및 그 제조방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유기용매에 폴리카프로락톤(PCL)과 산을 첨가한 후 교반하여 용액을 준비하는 단계; 상기 용액에 성장인자를 첨가한 후 교반하여 전기방사 용액을 준비하는 단계; 및 상기 준비된 전기방사 용액을 시린지 펌프에 연결한 후 전기방사 장치를 가동하여 컬렉터에 방추형으로 배열된 나노섬유를 포집하는 단계를 포함하는, PCL 패치 조직재생 지지체의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 유기용매에 폴리카프로락톤(PCL) 및 폴리에틸렌글라이콜(PEG)과 산을 첨가한 후 교반하여 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글라이콜 공중합체 용액을 준비하는 단계; 상기 용액에 성장인자를 첨가한 후 교반하여 전기방사 용액을 준비하는 단계; 및 상기 준비된 전기방사 용액을 펌프에 연결한 후 전기방사 장치를 가동하여 컬렉터에 방추형으로 배열된 나노섬유를 포집하는 단계;를 포함하는, PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 방추형으로 배열된 나노섬유로서, 폴리카프로락톤을 포함하는, PCL 패치 조직재생 지지체를 제공한다.
또한 본 발명은 방추형으로 배열된 나노섬유로서, 폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글라이콜을 포함하는, PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 PCL 패치 조직재생 지지체를 포함하는, 만성고막 천공의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체를 포함하는, 만성고막 천공의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 PCL 패치 조직재생 지지체는 만성고막 천공의 치료에 유용하게 이용될 수 있으며, 특히 만성고막 천공 치료를 위해 수술에 의존하는 치료법에서 수술의 비중을 줄이고 높은 고막 회복율을 나타낼 수 있다. 또한 PCL 패치 조직재생 지지체는 손상된 다른 조직의 재생 및 치료에 응용할 수 있으며, 인체의 다른 부위의 조직구조를 모사하여 다양한 조직재생 지지체의 개발 및 응용이 가능하다.
도 1은 컬렉터의 하판 설계도(a), 컬렉터 하판에 원기둥형 컬렉터를 배치한 도면(b), 컬렉터 하판에 부착시킬 한쪽 끝이 뾰족한 금속 기둥의 디자인(c), 및 모든 구성요소를 결합하여 모델링한 모습을 나타낸 방추형 패턴 패치 제작을 위한 전기방사용 컬렉터(d)를 나타낸 도면;
도 2는 전기방사된 방추형 PCL 패치의 전자현미경 이미지를 나타낸 것으로서, 방추형 PCL 패치를 200 배율로 촬영한 사진(a), 방추형 PCL 패치를 3000배로 확대하여 촬영한 사진(b), 방추형 PCL 패치를 300,000배로 확대하여 촬영한 사진(c), 및 300,000배로 촬영한 사진을 이미지 분석하여 나노섬유 가닥의 두께를 측정한 사진(d)으로 나타낸 도면;
도 3은 전기방사된 방추형 PCL 및 PEG 패치의 전자현미경 이미지를 나타낸 것으로서, 방추형 PCL 및 PEG 패치를 200 배율로 촬영한 사진(a), 방추형 PCL 및 PEG 패치를 3000배로 확대하여 촬영한 사진(b), 방추형 PCL 및 PEG 패치를 300,000배로 확대하여 촬영한 사진(c), 및 300,000배로 촬영한 사진을 이미지 분석하여 나노섬유 가닥의 두께를 측정한 사진(d)으로 나타낸 도면;
도 4는 EGF가 담지된 PCL 패치 지지체에서의 TM 세포의 형태를 관찰한 도면;
도 5a 및 도 5b는 전기방사를 이용하여 제조된 방추형 PCL 패치에서의 고막줄기세포(TM cell)의 세포증식시험결과를 나타낸 것으로서, PCL과 IGFBP2를 담지한 PCL 패치에서의 고막줄기세포 증식결과 및 PCL과 EGF를 담지한 PCL 패치에서의 고막줄기세포 증식결과를 나타낸 도면;
도 6은 전기방사를 이용하여 제조된 방추형 PCL 및 PEG 패치에서의 고막줄기세포(TM cell)의 세포증식시험결과를 나타낸 것으로서, 실시예 4와 비교예 5 내지 7에 따라 제조된 패치 상에서의 고막줄기세포 증식결과를 나타낸 도면;
도 7은 만성고막천공 동물모델에서의 패치 적용 시험 결과를 나타낸 것으로서, 방추형 PCL 패치를 적용시켜 치료된 시험군의 고막 사진(a 내지 e)이며, 아래의 표는 대조군과 EGF-R(EGF가 포함된 랜덤형) PCL 패치, EGF-N(EGF가 포함된 방추형) PCL 패치의 치료율을 표로 나타낸 도면; 및
도 8은 만성고막천공 동물모델에서의 패치 적용 시험 결과를 나타낸 것으로서, 방추형 PCL 패치를 적용시켜 치료된 시험군의 고막 사진(a 내지 e)이며, 아래의 표는 대조군과 EGF-R(EGF가 포함된 랜덤형) PCL 패치, EGF-N(EGF가 포함된 방추형 패턴) PCL 패치의 치료율을 표로 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자들은 전기방사법을 이용하여 컬렉터의 형태에 따라 수득하는 나노섬유의 특성을 조절함으로써 나노구조에서도 세포의 특성이 조절될 수 있음을 발견하였고, 특히 PCL 패치가 담지하고 있는 성장인자와 방추형으로 배열된 PCL 패치 지지체가 만성 고막 치료에 효과가 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 유기용매에 폴리카프로락톤(PCL)과 산을 첨가한 후 교반하여 용액을 준비하는 단계; 상기 용액에 성장인자를 첨가한 후 교반하여 전기방사 용액을 준비하는 단계; 및 상기 준비된 전기방사 용액을 시린지 펌프에상기 컬렉터는 침을 내부에 수용하는 원통형태로 연결한 후 전기방사 장치를 가동하여 컬렉터에 방추형으로 배열된 나노섬유를 포집하는 단계를 포함하는, PCL 패치 조직재생 지지체의 제조방법을 제공한다.
상기 폴리카프로락톤은 카프로락톤(CL)으로부터 중합되는 폴리에스터 계열의 생분해성 고분자이다. 폴리카프로락톤(PCL)은 생분해성과 생체적합성이 우수한 고분자로 알려져 있으며, 이 때문에 약물 전달체 및 다양한 의료용 분야 연구에 사용될 수 있다.
상기 용액을 준비하는 단계는 유기용매에 폴리카프로락톤과 산을 첨가한 후 24 내지 48시간 동안 200 내지 500 rpm 속도로 교반하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유기용매 내 폴리카프로락톤의 농도는 70 내지 90 ㎎/㎖일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유기용매는 트리플루오로에탄올(2,2,2-trifluoroethanol), 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide), 및 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 산은 아세트산, 포름산, 프로피온산, 및 젖산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 성장인자는 상피 성장인자(EGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 인슐린양 성장인자 결합단백질(IGFBP), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 상피 성장인자(EGF)는 DNA, RNA, 단백질, 히알루론산과 피브로넥틴의 합성을 촉진시키는 역할을 한다. 상기 EGF는 고막천공이 치유되는 초기에 많이 발견되며 상기 EGF가 헤파린과 결합된 성장인자는 고막천공의 치유에 중요한 역할을 수행할 수 있다.
상기 섬유아세포 성장인자(FGF)는 섬유아세포의 이동을 돕고 세포를 증식시키며 회복시킬 수 있다.
상기 인슐린양 성장인자 결합단백질(IGFBP)은 세포 사멸을 방지하고 세포 내 기질에 따라 성장을 촉진시키거나 분화를 촉진시킬 수 있다.
상기 전기방사 용액을 준비하는 단계는 용액에 성장인자를 0.16 내지 16 ㎍/㎖로 첨가하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 전기방사 용액을 준비하는 단계는 상기 용액에 성장인자를 첨가한 후 0 내지 10℃에서 20 내지 30분 동안 교반하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 나노섬유를 포집하는 단계는 준비된 전기방사 용액을 시린지 펌프에 연결한 후 0.2 ~ 3.0 ㎕/hr의 속도로 방출하여 전기방사 장치를 가동하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 나노섬유는 평균두께가 200 내지 800 nm일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 컬렉터는 침을 내부에 수용하는 원통형태로 이루어진 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
도 1을 참조하면, 상기 컬렉터는 대전된 나노섬유를 포집하는 역할을 수행하며, 전도성이 우수한 구리 파이프와 그 가운데 끝이 날카로운 금속성 바늘로 구성되어 있다.
또한 본 발명은 유기용매에 폴리카프로락톤(PCL) 및 폴리에틸렌글라이콜(PEG)과 산을 첨가한 후 교반하여 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글라이콜 공중합체 용액을 준비하는 단계; 상기 용액에 성장인자를 첨가한 후 교반하여 전기방사 용액을 준비하는 단계; 및 상기 준비된 전기방사 용액을 펌프에 연결한 후 전기방사 장치를 가동하여 컬렉터에 방추형으로 배열된 나노섬유를 포집하는 단계;를 포함하는, PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체의 제조방법을 제공한다.
상기 용액을 준비하는 단계는 유기용매에 폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글라이콜과 산을 첨가한 후 24 내지 48시간 동안 200 내지 500 rpm 속도로 교반하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유기용매 내 폴리카프로락톤의 농도는 100 내지 160 ㎎/㎖일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유기용매 내 폴리에틸렌글라이콜의 농도는 40 내지 100 ㎎/㎖일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유기용매는 트리플루오로에탄올(2,2,2-trifluoroethanol), 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide), 및 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 산은 아세트산, 포름산, 프로피온산, 및 젖산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 성장인자는 상피 성장인자(EGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 인슐린양 성장인자 결합단백질(IGFBP), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 전기방사 용액을 준비하는 단계는 용액에 성장인자를 0.16 내지 16 ㎍/㎖로 첨가할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 전기방사 용액을 준비하는 단계는 상기 용액에 성장인자를 첨가한 후 0 내지 10℃에서 20 내지 30분 동안 교반하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 나노섬유를 포집하는 단계는 준비된 전기방사 용액을 펌프에 연결한 후 0.2 ~ 3.0 ㎕/hr의 속도로 방출하여 전기방사 장치를 가동하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 나노섬유는 평균두께가 200 내지 800 nm일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 컬렉터는 침을 내부에 수용하는 원통형태로 이루어진 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 방추형으로 배열된 나노섬유로서, 폴리카프로락톤을 포함하는, PCL 패치 조직재생 지지체를 제공한다.
상기 PCL 패치 조직재생 지지체는 성장인자를 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 PCL 패치 조직재생 지지체는 폴리카프로락톤 및 성장인자를 104 내지 106 : 1의 중량비로 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 성장인자는 상피 성장인자(EGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 인슐린양 성장인자 결합단백질(IGFBP), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 나노섬유는 평균두께가 200 내지 800 nm일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 방추형으로 배열된 나노섬유로서, 폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글라이콜을 포함하는, PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체를 제공한다.
상기 PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체는 성장인자를 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체는 폴리카프로락톤 및 성장인자를 (7×104 ~ 7×106) : 1의 중량비로 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체는 폴리에틸렌글라이콜 및 성장인자를 (3×104 ~ 3×106) : 1의 중량비로 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체는 폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글라이콜을 (2 ~ 4) : 1의 중량비로 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 성장인자는 상피 성장인자(EGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 인슐린양 성장인자 결합단백질(IGFBP), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 나노섬유는 평균두께가 200 내지 800 nm일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 상기 PCL 패치 조직재생 지지체를 포함하는, 만성고막 천공의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체를 포함하는, 만성고막 천공의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학 조성물 또는 건강기능식품일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.
또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학조성물의 유효성분인 화합물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중, 질환에 따라 달라질 수 있으나, 0.001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　
상기 약학 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품은 유효성분인 본 발명에 따른 화합물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
22 gage의 니들 말단과 컬렉터 사이의 거리는 10 cm로 고정하였고, 전압발생장치로 18 ㎸의 전압을 발생시켰다.
트리플루오로에탄올(TFE) 2 ㎖에 160 ㎎의 폴리카프로락톤(PCL)과 아세트산(Acetic acid) 40 ㎕를 첨가한 용액을 제조하였다. 이후 PCL이 TFE에 완전히 용해 될 수 있도록 24 내지 48시간 동안 300 rpm의 속도로 교반시켜 용액을 준비하였다.
PCL이 완전히 용해되었음을 확인한 뒤 1.6 ㎍의 EGF를 용액에 첨가하였다. 이후, EGF가 PCL과 잘 혼합될 수 있도록 4℃에서 20분 동안 교반시켜 전기방사 용액을 준비하였다.
상기 준비된 전기방사 용액을 시린지에 넣고 시린지 펌프를 연결하여 0.6 ㎕/hr의 속도로 방사하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이 방추형 패턴 패치의 형태로 포집이 가능하도록, 전도성이 좋은 구리 파이프와 그 가운데 끝이 날카로운 금속성 바늘로 구성되어있는 컬렉터를 이용하였고, 1.6 ㎸/㎝의 전기장이 생성되도록 조건을 조절하여 전기방사 장치를 작동시킴으로써 방추형으로 배열된 PCL 패치 조직재생 지지체를 제조하였다. 이하 실시예 1에 따라 제조된 PCL 패치 조직재생 지지체를'EGF-A'로 명명하였다.
<실시예 2>
EGF 대신에 IGFBP을 1.6 ㎍ 첨가한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 조건으로 방추형으로 배열된 PCL 패치 조직재생 지지체를 제조하였다. 이하 실시예 2에 따라 제조된 PCL 패치 조직재생 지지체를'IGFBP-A'로 명명하였다.
<실시예 3>
EGF와 IGFBP을 각각 1.6 ㎍ 및 1.6 ㎍ 첨가한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 조건으로 방추형으로 배열된 PCL 패치 조직재생 지지체를 제조하였다. 이하 실시예 3에 따라 제조된 PCL 패치 조직재생 지지체를 'EGF/IGFBP-A'로 명명하였다.
<실시예 4>
22 gage의 니들 말단과 컬렉터 사이의 거리는 10 cm로 고정하였고, 전압발생장치로 18 ㎸의 전압을 발생시켰다.
트리플루오로에탄올(TFE) 2 ㎖에 280 ㎎의 폴리카프로락톤(PCL, MW: 80,000 , Sigma Aldrich), 및 120 ㎎의 폴리에틸렌글라이콜(PEG, MW: 3,350, Sigma Aldrich) 과 아세트산(Acetic acid, Sigma Aldrich) 40 ㎕를 첨가한 용액을 제조하였다. 이후 PCL과 PEG가 TFE에 완전히 용해될 수 있도록 24 내지 48시간 동안 300 rpm의 속도로 교반시켜 용액을 준비하였다.
PCL과 PEG가 완전히 용해되었음을 확인한 뒤 4 ㎍의 EGF를 용액에 첨가하였다. 이후, EGF가 PCL 및 PEG와 잘 혼합될 수 있도록 4℃에서 20분 동안 교반시켜 전기방사 용액을 준비하였다.
상기 준비된 전기방사 용액을 시린지에 넣고 시린지 펌프를 연결하여 0.6 ㎕/hr의 속도로 방사하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이 방추형 패턴 패치의 형태로 포집이 가능하도록, 전도성이 좋은 구리 파이프와 그 가운데 끝이 날카로운 금속성 바늘로 구성되어있는 컬렉터를 이용하였고, 1.6 ㎸/㎝의 전기장이 생성되도록 조건을 조절하여 전기방사 장치를 작동시킴으로써 방추형으로 배열된 PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체를 제조하였다. 이하 실시예 4에 따라 제조된 PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체를'PCL/PEG/EGF-A'로 명명하였다.
<비교예 1>
성장인자인 EGF를 첨가하지 않고 전기방사 시 일반적으로 사용되는 컬렉터를 이용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 조건이었으며, 이하 'PCL-R'로 명명하였다.
<비교예 2>
성장인자인 EGF를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 조건이었으며, 이하 'PCL-A'로 명명하였다.
<비교예 3>
전기방사 시 일반적으로 사용되는 컬렉터를 이용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 조건이었으며, 이하 'EGF-R'로 명명하였다.
<비교예 4>
전기방사 시 일반적으로 사용되는 컬렉터를 이용한 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 조건이었으며, 이하 'IGFBP-R'로 명명하였다.
<비교예 5>
전기방사 시 일반적으로 사용되는 컬렉터를 이용한 것을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일한 조건이었으며, 이하 'PCL/PEG/EGF-R'로 명명하였다.
<비교예 6>
성장인자인 EGF를 첨가하지 않고 전기방사 시 일반적으로 사용되는 컬렉터를 이용한 것을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일한 조건이었으며, 이하 'PCL/PEG-R'로 명명하였다.
<비교예 7>
성장인자인 EGF를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일한 조건이었으며, 이하 'PCL/PEG-A'로 명명하였다.
<실험예 1> 고막재생용 방추형 PCL 패치 지지체의 형태학적 분석
방사 조건을 달리하여 제조된 고막재생용 방추형 PCL 패치 지지체의 표면 특성을 분석하기 위하여 주사전자현미경(SUPRA, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 주사전자현미경 분석(scanning electron microscopy; 이하 'SEM')을 수행하였다.
도 2(a) 내지 도 2(d)는 침을 내부에 수용하는 원통형 컬렉터에서 얻어진 방추형 PCL 패치의 주사전자현미경 이미지를 나타낸 것이다. 도 2(a)를 참조하면, 200 배율로 촬영한 사진을 통해 각각의 나노섬유 가닥이 정중앙을 향하고 있는 모습을 확인할 수 있었다.
도 2(b) 및 도 2(c)는 시료의 특정 부분을 무작위로 확대하여 얻었다. 대부분의 나노섬유 가닥이 직선으로 뻗어 있음을 확인할 수 있었다.
도 2(d)를 참조하면, 각각의 나노섬유 가닥의 두께는 300 nm를 넘지 않는 결과를 나타내었다.
<실험예 2> 고막재생용 방추형 PCL 및 PEG 패치 지지체의 형태학적 분석
방사 조건을 달리하여 제조된 고막재생용 방추형 PCL 및 PEG 패치 지지체의 표면 특성을 분석하기 위하여 주사전자현미경(SUPRA, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 주사전자현미경 분석(scanning electron microscopy; 이하 'SEM')을 수행하였다.
또한, 도 3(a) 내지 도 3(d)는 침을 내부에 수용하는 원통형 컬렉터에서 얻어진 방추형 PCL 및 PEG 패치의 주사전자현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 3(a)를 참조하면, 200 배율로 촬영한 사진을 통해 각각의 나노섬유 가닥이 정중앙을 향하고 있는 모습을 확인할 수 있었다.
또한, 도 3(b) 및 도 3(c)는 시료의 특정 부분을 무작위로 확대하여 얻은 이미지로서, 대부분의 나노섬유 가닥이 직선으로 뻗어 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 도 3(d)를 참조하면, 각각의 나노섬유 가닥의 두께는 300 nm를 넘지 않는 결과를 나타내었다.
<실험예 3> PCL 나노패턴패치의 In Vitro 검사
인 비트로 검사를 위해 쥐 고막에서 채취한 쥐 섬유아세포 및 줄기세포 계대2(rat fibroblast passage 2; 아주대 이비인후학과 제공, 이하 "TM 세포")를 사용하였다. 냉동되어 있던 TM 세포를 해동한 뒤 DMEM low glucose, 10% FBS(Fatal Bovine Serum), 1% 페니실린을 혼합하여 만든 배지에 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 7 ~ 10시간 동안 배양하였다. TM 세포의 배양밀도가 컨플루언트(confluent)해진 것을 확인한 뒤 트립신 EDTA를 이용해 배양 플레이트에서 분리하였다.
이때 실험군은 실시예 1에 의해 제조된 EGF가 포함된 방추형패치(EGF-A), 비교예 1에 의해 제조된 PCL을 부직포모양으로 방사한 나노패턴패치(PCL-R), 비교예 2에 의해 제조된 방추형으로 배열된 나노패턴패치(PCL-A), 및 비교예 3에 의해 제조된 EGF가 포함된 랜덤패치(EGF-R)로 하여 인 비트로 검사를 수행하였다.
이후 96웰 플레이트에 상기 네 종류의 패치를 6 mm의 지름을 갖는 원형으로 제조하여 각각의 플레이트에 고정시켰다. 이후 96 웰 플레이트에 웰당 1 × 103개의 TM 세포를 각각 시딩하였다.
이후 1일, 3일, 5일 간격으로 WST 시험법으로 세포의 활성을 측정하였다. 또한 실시예 2에 의해 제조된 IGFBP를 패치에 포함시켜서 상기한 것과 같은 과정의 실험을 반복하였다.
실시예 1에 따른 EGF가 포한된 패치에 대하여 TM 세포의 부착 모양을 형광현미경을 통해 분석하였다. 이는 EGF가 포함된 나노섬유가 EGF 모양에 어떠한 역할을 부여하는지 조사함과 동시에, 나노패턴 패치에서 패턴의 영향을 예측하기 위해 실시하였다.
도 4를 참조하면, Random은 랜덤모양으로 방사된 패치를 뜻하며, Aligned는 방추형으로 배열되게 제작된 패치를 의미하고, w/o EGF는 EGF가 함유되지 않았음을 의미하며, w EGF는 EGF가 함유되었음을 의미한다.
도 4를 참조하면, EGF를 함유하고 있는 패치에서 TM 세포의 형태가 길쭉하게 늘어지는 현상을 관찰할 수 있었다. 또한 방추형 패턴이 세포를 중심(Centroid)방향으로 배열되게 하는 것을 확인할 수 있었고, 이러한 현상은 EGF가 함유되어 세포의 형태가 길쭉한 실험군에서 더 뚜렷하게 관찰되었다.
도 5a 및 도 5b는 고막 줄기세포를 5일간 패치위에서 배양하여 세포의 활성도를 측정하는 방식으로 세포의 증식을 확인한 결과를 나타낸 것으로서, 실시예 1 및 실시예 2에 따라 제조된 EGF와 IGFBP를 포함하는 PCL 패치에서 유사한 실험결과를 관찰할 수 있었으며, 두 시험 모두 1일, 및 3일에서는 두드러진 차이를 나타내지 않음을 확인 할 수 있었고, 양쪽 실험 모두 5일차가 되어서야 뚜렷한 차이를 나타내었다. 즉, 실시예 1 및 실시예 2에 따라 제조된 EGF 및 IGFBP를 포함하는 방추형 PCL 패치위에서의 세포 증식이 가장 활발해 짐을 관찰하였다.
<실험예 4> PCL 및 PEG 나노패턴패치의 In Vitro 검사
인 비트로 검사를 위해 쥐 고막에서 채취한 줄기세포 계대2(rat fibroblast passage 2; 아주대 이비인후학과 제공, 이하 "TM 세포")를 사용하였다. 냉동되어 있던 TM 세포를 해동한 뒤 DMEM low glucose, 10% FBS(Fatal Bovine Serum), 1% 페니실린을 혼합하여 만든 배지에 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 7 ~ 10시간 동안 배양하였다. TM 세포의 배양밀도가 컨플루언트(confluent)해진 것을 확인한 뒤 트립신 EDTA를 이용해 배양 플레이트에서 분리하였다.
이때 실험군은 EGF가 포함된 PCL 및 PEG 방추형 나노패턴패치(실시예 4, PCL/PEG/EGF-A), EGF가 포함된 PCL 및 PEG를 부직포 모양으로 방사한 나노패치(비교예 5, PCL/PEG/EGF-R), EGF가 포함되지 않은 PCL 및 PEG를 부직포 모양으로 방사한 나노패치(비교예 6, PCL/PEG-R), 및 EGF가 포함되지 않은 PCL 및 PEG 방추형 나노패턴패치(비교예 7, PCL/PEG-A)로 하여 인 비트로 검사를 수행하였다.
이후 96웰 플레이트에 상기 네 종류의 패치를 6 mm의 지름을 갖는 원형으로 제조하여 각각의 플레이트에 고정시켰다. 이후 96 웰 플레이트에 웰당 1 × 103개의 TM 세포를 각각 분주하였다.
이후 1일, 3일, 7일 간격으로 WST 시험법으로 세포의 활성을 측정하였다.
도 6은 고막 줄기세포를 1일, 3일, 7일 동안 패치 상에서 배양하여 세포의 활성도를 측정하는 방식으로 세포의 증식을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도면을 참조하면, 실시예 4 및 비교예 5에 따라 제조된 EGF를 포함하는 PCL 및 PEG 패치와 비교예 6 및 비교예 7에 따라 제조된 EGF를 포함하지 않은 PCL 및 PEG 패치에서, 1일, 3일, 7일에서 EGF를 포함하는 패치 상에서 세포 부착 및 증식이 빠른 점을 관찰하였다.
그러나, 실시예 4와 비교예 5에 따라 제조된 EGF를 포함하는 PCL 및 PEG 패치를 비교하면, 비교예 5에 따라 제조된 패치에서 세포의 부착이 뛰어나는 경향이나, 7일차에서의 세포 증식은 실시예 4에 따라 제조된 EGF를 포함하는 PCL 및 PEG패치에서 더 우수한 경향을 보인 점을 고려하였을 때, 실시예 4에 따라 제조된 EGF를 포함하는 PCL 및 PEG 나노패턴패치 상에서 세포 증식이 빠른 점을 관찰하였다.
<실험예 5> PCL 패치 지지체를 만성 고막동물모델에 적용
만성고막천공 모델은 Choung's COM mode1 1 방법(Choi SJ, et al. TERM 2011)을 이용하여 Sprague-Dawley 쥐에서 8 주 이상 천공이 지속되는 고막을 만들었다. 실험군은 EGF 및 IGFBP-2를 포함하는 랜덤패치와 방추형패치를 접합시키고 대조군은 어떠한 처치도 시행하지 않았다. 고막천공의 크기는 내시경을 이용하여 사진을 촬영한 상태에서 고막은 긴장부(pars tensa)에 대한 천공 크기의 상대적 비율(%)로 표시하여 매주 크기의 변화를 측정하였다. 패치 접합 이후 8주간 관찰하여 고막의 치유율을 비교하였다.
이 후 8주간 패치에 의한 치료효과를 관찰한다. 관찰 도중에 패치가 떨어지면 새롭게 패치를 붙여주며 관리 하였고, 마지막 8주차에 패치를 제거하여 천공부위를 관찰하였다.
도 7은 만성고막 천공 동물모델에서의 PCL 패치 적용 결과를 나타낸 것으로서, 각각의 주황빛을 띄는 원형의 사진이 동물모델 각각의 고막 사진이며, 각각의 고막의 좌측하단에 보이는 어두운 색을 띄는 원이고막 천공을 나타낸다.
도 7(a)는 회복이 이루어지지 않아 천공이 계속 유지 되되는 결과이며, 도 7(b) 내지 도 7(e)는 회복이 이루어져 천공이 대부분 사라진 모습을 볼 수 있다.
아무 처리도 하지 않은 대조군에서는(도 7(a) 참조), 21.4%(2/14)의 고막이 회복되는 것을 관찰 할 수 있었다. 비교예 3에 의해 제조된 EGF 랜덤PCL 패치를 적용한 실험군은 32.4%(12/37)의 고막 회복률을 보였으며, 실시예 1에 의해 제조된 EGF방추형 PCL 패치를 적용한 실험군은 48.4%(16/33)의 고막 회복률을 보이는 것으로 관찰되었다.
도 8은 만성고막 천공 동물모델에서의 IGFBP를 담지한 PCL 패치 적용 결과를 나타낸 것으로서, 아무 처리도 하지 않은 대조군에서는(도 8(a) 참조), 21.4%(2/14)의 고막이 회복되는 것을 관찰 할 수 있었다. 비교예 4에 의해 제조된 IGFBP 랜덤패치를 적용한 실험군은 32.4%(5/18)의 고막 회복률을 보였으며, 실시예 2에 의해 제조된 IGFBP 방추형패치를 적용한 실험군은 35.0%(7/20)의 고막 회복률을 보이는 것으로 관찰되었다. 이를 통해 PCL 패치가 담지하고 있는 성장인자(EGF 및 IGFBP)와, 패치 지지체의 방추형 패턴 구조가 만성 고막 치료에 효과가 있음을 확인하였다.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims (27)

  1. 유기용매에 폴리카프로락톤(PCL)과 산을 첨가한 후 교반하여 용액을 준비하는 단계;
    상기 용액에 성장인자를 첨가한 후 교반하여 전기방사 용액을 준비하는 단계; 및
    상기 준비된 전기방사 용액을 시린지 펌프에 연결한 후 전기방사 장치를 가동하여 컬렉터에 방추형으로 배열된 나노섬유를 포집하는 단계를 포함하는, PCL 패치 조직재생 지지체의 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 용액을 준비하는 단계는,
    유기용매에 폴리카프로락톤과 산을 첨가한 후 24 내지 48시간 동안 200 내지 500 rpm 속도로 교반하는 것을 특징으로 하는, PCL 패치 조직재생 지지체의 제조방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 유기용매 내 폴리카프로락톤의 농도는,
    70 내지 90 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는, PCL 패치 조직재생 지지체의 제조방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 유기용매는,
    트리플루오로에탄올(2,2,2-trifluoroethanol), 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide), 및 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, PCL 패치 조직재생 지지체의 제조방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 산은,
    아세트산, 포름산, 프로피온산, 및 젖산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, PCL 패치 조직재생 지지체의 제조방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 성장인자는,
    상피 성장인자(EGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 인슐린양 성장인자 결합단백질(IGFBP), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, PCL 패치 조직재생 지지체의 제조방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 전기방사 용액을 준비하는 단계는,
    용액에 성장인자를 0.16 내지 16 ㎍/㎖로 첨가하는 것을 특징으로 하는, PCL 패치 조직재생 지지체의 제조방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 전기방사 용액을 준비하는 단계는,
    상기 용액에 성장인자를 첨가한 후 0 내지 10℃에서 20 내지 30분 동안 교반하는 것을 특징으로 하는, PCL 패치 조직재생 지지체의 제조방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 나노섬유를 포집하는 단계는,
    준비된 전기방사 용액을 시린지 펌프에 연결한 후 0.2 ~ 3.0 ㎕/hr의 속도로 방출하여 전기방사 장치를 가동하는 것을 특징으로 하는, PCL 패치 조직재생 지지체의 제조방법.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 나노섬유는,
    평균두께가 200 내지 800 nm인 것을 특징으로 하는, PCL 패치 조직재생 지지체의 제조방법.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 컬렉터는,
    침을 내부에 수용하는 원통형태로 이루어진 것을 특징으로 하는, PCL 패치 조직재생 지지체의 제조방법.
  12. 유기용매에 폴리카프로락톤(PCL) 및 폴리에틸렌글라이콜(PEG)과 산을 첨가한 후 교반하여 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글라이콜 공중합체 용액을 준비하는 단계;
    상기 용액에 성장인자를 첨가한 후 교반하여 전기방사 용액을 준비하는 단계; 및
    상기 준비된 전기방사 용액을 펌프에 연결한 후 전기방사 장치를 가동하여 컬렉터에 방추형으로 배열된 나노섬유를 포집하는 단계;
    를 포함하는, PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체의 제조방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 용액을 준비하는 단계는,
    유기용매에 폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글라이콜과 산을 첨가한 후 24 내지 48시간 동안 200 내지 500 rpm 속도로 교반하는 것을 특징으로 하는, PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체의 제조방법.
  14. 청구항 12에 있어서,
    상기 유기용매 내 폴리카프로락톤의 농도는,
    100 내지 160 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는, PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체의 제조방법.
  15. 청구항 12에 있어서,
    상기 유기용매 내 폴리에틸렌글라이콜의 농도는,
    40 내지 100 ㎎/㎖ 인 것을 특징으로 하는, PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체의 제조방법.
  16. 방추형으로 배열된 나노섬유로서, 폴리카프로락톤을 포함하는, PCL 패치 조직재생 지지체.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 PCL 패치 조직재생 지지체는,
    성장인자를 더 포함하는, PCL 패치 조직재생 지지체.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 PCL 패치 조직재생 지지체는,
    폴리카프로락톤 및 성장인자를 104 내지 106 : 1의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는, PCL 패치 조직재생 지지체.
  19. 청구항 17에 있어서,
    상기 성장인자는,
    상피 성장인자(EGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 인슐린양 성장인자 결합단백질(IGFBP), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, PCL 패치 조직재생 지지체.
  20. 청구항 16에 있어서,
    상기 나노섬유는,
    평균두께가 200 내지 800 nm인 것을 특징으로 하는, PCL 패치 조직재생 지지체.
  21. 방추형으로 배열된 나노섬유로서, 폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글라이콜을 포함하는, PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체는,
    성장인자를 더 포함하는, PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체.
  23. 청구항 22에 있어서,
    상기 PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체는,
    폴리카프로락톤 및 성장인자를 (7×104 ~ 7×106) : 1의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는, PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체.
  24. 청구항 22에 있어서,
    상기 PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체는,
    폴리에틸렌글라이콜 및 성장인자를 (3×104 ~ 3×106) : 1의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는, PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체.
  25. 청구항 22에 있어서,
    상기 PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체는,
    폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글라이콜을 (2 ~ 4) : 1의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는, PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체.
  26. 청구항 16 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 따른 PCL 패치 조직재생 지지체를 포함하는, 만성고막 천공의 예방 또는 치료용 조성물.
  27. 청구항 21 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 따른 PCL 및 PEG 패치 조직재생 지지체를 포함하는, 만성고막 천공의 예방 또는 치료용 조성물.
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