WO2018088813A2 - Nkx3.2 단편 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

Nkx3.2 단편 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the C-terminal expansion domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, starting from the amino acid at position 16 of SEQ ID NO: 41, and from 1 to 15 amino acids in sequence from the C-terminus to the N-terminal direction are deleted. Can be.
  • the present invention provides a host cell comprising the expression vector.
  • the Nkx3.2 fragment of the present invention has a level of NF- ⁇ B activation similar to that of full-length Nkx3.2 and is resistant to proteolytic degradation by Siah1.
  • the Nkx3.2 fragment showed at least 10-fold improvement in the treatment of degenerative arthritis compared to Nkx3.2 in an animal model based in vivo efficacy evaluation. Therefore, the Nkx3.2 fragment can be usefully used for preventing or treating arthritis.
  • the present invention provides a polypeptide represented by the following formula (I):
  • the C-terminal extension domain refers to a polypeptide having an amino acid sequence of Nos. 310 to 333 of the full-length Nkx3.2 protein as a domain bound to the C-terminus of the core domain described above.
  • the C-terminal extension domain may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the C-terminal extension domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, or 1, 2, 3, 4 from the C-terminal to the N-terminal direction starting from the amino acid at position 16 of the polypeptide Dog, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, or fifteen amino acid residues may be deleted.
  • the expression vector may be a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector or a viral vector.
  • the expression vector may be prepared by a person skilled in the art so that the polynucleotide according to the present invention can be expressed and secreted.
  • the core domain is a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
  • the N-terminal extension domain refers to a polypeptide having an amino acid sequence of Nos. 112 to 165 of the full-length Nkx3.2 protein as a domain bound to the N-terminus of the core domain described above.
  • the N-terminal extension domain may have an amino acid sequence of SEQ ID 35.
  • the C-terminal expansion domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, or 13, 14, 15 from the C-terminal to the N-terminal direction starting from the amino acid at position 24 of the polypeptide Dog, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 or 23 amino acid residues may be deleted.
  • the N-terminal expansion domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, or 1, 2, 3, 4 from the N-terminal to the C-terminal direction starting from the amino acid at position 1 of the polypeptide Dogs, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen, sixteen, seventeen, eighteen, nineteen, twenty, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40 or 41 amino acid residues may be deleted.
  • the polypeptide represented by the formula (I) or (II) is a fragment of the Nkx3.2 protein and does not exist in vivo. However, the polypeptide has the same activity as the full-length Nkx3.2 protein, but is not easily degraded in vivo, and thus may be present in the body for a long time as compared to the full-length Nkx3.2 protein, thereby exhibiting better activity.
  • the polynucleotide may comprise encoding a fragment having an amino acid residue deleted in the N-terminal extension domain and the C-terminal extension domain as described above.
  • the polynucleotide may include one substituted with another base sequence expressing the polypeptide of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 5.
  • the host cell is a cell transformed with the expression vector containing the polynucleotide according to the present invention, may be a prokaryote or eukaryotic cell. Specifically, it may be a mammalian cell. The transformation can be carried out by methods known in the art. Meanwhile, one example of the prokaryotic cell may be E. coli , and one example of the eukaryotic cell may be yeast.
  • the mammalian cells may be NS / 0 myeloma cells (NS / 0 myeloma cells), 293 cells, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), HeLa cells, CapT cells (human amniotic fluid-derived cells) or COS cells.
  • the dosage of the polypeptide included in the pharmaceutical composition according to the present invention may be 0.0001 to 100 mg / kg.
  • the administration may be administered once a day, may be divided into several times.
  • the N-terminal extension domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, starting from the amino acid at position 1 of SEQ ID NO: 35 and from 1 to 53 amino acids in succession from the N-terminus to the C-terminal direction Can be;
  • the C-terminal extension domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, or 1, 2, 3, 4 from the C-terminal to the N-terminal direction starting from the amino acid at position 24 of the polypeptide Dogs, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen, sixteen, seventeen, eighteen, nineteen, twenty, 21, 22 or 23 amino acid residues may be deleted.
  • the N-terminal extension domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, starting from the amino acid at position 1 of SEQ ID NO: 39 and from 1 to 41 amino acids in succession from the N-terminus to the C-terminal direction.
  • the C-terminal expansion domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, starting from the amino acid at position 16 of SEQ ID NO: 41, and from 1 to 15 amino acids in sequence from the C-terminus to the N-terminal direction are deleted. Can be.
  • the N-terminal expansion domain is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, or 1, 2, 3, 4 from the N-terminal to the C-terminal direction starting from the amino acid at position 1 of the polypeptide Dogs, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen, sixteen, seventeen, eighteen, nineteen, twenty, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40 or 41 amino acid residues may be deleted.
  • the C-terminal extension domain refers to a polypeptide having an amino acid sequence of Nos. 318 to 333 of the full-length Nkx3.2 protein as a domain bound to the C-terminus of the core domain described above.
  • the C-terminal extension domain may have an amino acid sequence of SEQ ID 41.
  • the C-terminal extension domain may be one in which 13 or 15 amino acid residues are deleted from the C-terminal to the N-terminal direction starting from the amino acid at position 16 of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41. .
  • polynucleotides encode the aforementioned core domain, N-terminal extension domain, and C-terminal extension domain, each of which may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 38, SEQ ID NO: 36 or 40, and SEQ ID NO: 6 or 42 have.
  • the polynucleotide may comprise encoding a fragment having an amino acid residue deleted in the N-terminal extension domain and the C-terminal extension domain as described above.
  • the polynucleotide may include one substituted with another base sequence expressing the polypeptide of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 5.
  • polynucleotide may comprise encoding a fragment having an amino acid residue deleted in the N-terminal extension domain and the C-terminal extension domain as described above.
  • the polynucleotide may include one substituted with another base sequence expressing the polypeptide of SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 or SEQ ID NO: 41.
  • AAV viruses can be prepared by co-transforming a plasmid comprising the gene sequence of interest with two AAV terminal repeats located next to it and an expression plasmid comprising a wild type AAV coding sequence without terminal repeats.
  • the present invention provides Nkx3 having increased stability in vivo, comprising the step of deleting any one selected from the group consisting of an N-terminal site, a C-terminal site, and a combination thereof of a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. Provided are methods for making 2 fragments.
  • Deletion of the C-terminal region, starting with the amino acid at position 333 of SEQ ID NO: 7 may be one to 23 amino acids consecutively deleted from the C-terminal to the N-terminal direction.
  • the deletion of the C-terminal part is 13, 15, 17, 19, 21 starting from the amino acid at position 333 of SEQ ID NO: 7 from the C-terminal to the N-terminal direction.
  • 23 amino acid residues may be deleted.
  • Siah1 (SEQ ID NO: 29; GenBank Accession No. AAH35562.1) was amplified by PCR under the same conditions and methods as in Example 1, and the amplified PCR product was cleaved using EcoRI and NcoI. It was digested with the same restriction enzyme and the EcoRI and ClaI of the pCS 3HA expression vector (Addgene plasmid # 17095 pCS2P +) containing a label repeated three times in the amino acid sequence of human influenza hemagglutinin (HA) (SEQ ID NO: 33; YPYDVPDYA). 3 HA epitope tag was inserted between the sites), and an expression vector expressing Siah1 was prepared.
  • HA human influenza hemagglutinin
  • I ⁇ B ⁇ (SEQ ID NO: 31; GenBank Accession No. CAB65556) was amplified by PCR under the same conditions and methods as in Example 1.
  • the amplified PCR product was cleaved using EcoRI and XbaI.
  • a 6 Myc epitope tag was inserted between the EcoRI and ClaI site of the pCS 6Myc expression vector (Addgene plasmid # 17095 pCS2P +) containing a 6-repeat label of Myc amino acid sequence (SEQ ID NO: 34: EQKLISEEDL) digested with the same restriction enzyme.
  • Expression vector expressing I ⁇ B ⁇ was prepared.
  • the control group was a group of animals in which the knee incision and the endothelial were cut and sutured through mock surgery.
  • empty vector AAV was injected into the knee joint cavity, and after 4 weeks of breeding, the progression of degenerative arthritis was analyzed through histopathology.

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Abstract

본 발명은 관절염의 병리조직 환경 하에서 안정성이 향상된 Nkx3.2의 단편 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 Nkx3.2 단편은 전장의 Nkx3.2와 유사한 수준의 NF-κB 활성화 기능을 가지며, Siah1에 의한 단백질 분해에 저항성을 가진다. 또한, 상기 Nkx3.2 단편은 동물모델 기반 in vivo 효능 평가에서 Nkx3.2에 비해 최소 10배 이상 향상된 퇴행성 관절염 치료효과를 나타내었다. 따라서, 상기 Nkx3.2 단편은 관절염 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

NKX3.2 단편 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물
본 발명은 관절염의 병리조직 환경 하에서 안정성이 향상된 Nkx3.2 단편 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
발생율이 가장 높은 관절염 중 하나인 퇴행성 관절염은, 퇴행성 변화로 관절을 보호하는 연골조직이 손상되거나, 관절을 이루는 뼈와 인대 등이 손상되어 염증과 통증이 생기는 질환이다. 기존의 퇴행성 관절염의 치료는 주로 염증 제어를 통해 이루어져 왔으나, 이는 근본적인 치료 기술이 될 수 없음이 입증되고 있다.
따라서, 퇴행성 관절염의 근본적인 치료를 위해서는 연골세포의 생성, 분화, 사멸 및 석회화 등의 과정을 조절하는 표적을 확보하고, 상기 표적을 제어하는 기술의 개발이 요구되고 있다.
한편, 퇴행성 관절염에 의한 연골조직의 소실이 과발현된 Nkx3.2(NK3 homeobox 2)에 의해 억제됨으로써, 상기 단백질이 퇴행성 관절염의 치료에 사용될 수 있음이 확인된 바 있다. 이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1150900호는 Nkx3.2 단백질을 이용한 관절염 치료용 조성물, 관절염 진단 키트 또는 관절염 치료제의 스크리닝 방법을 개시하고 있다.
또한, 연골세포 비대화/석회화 과정에서 활성화되는 인디안 헤지호그 신호전달로 인해 Nkx3.2 단백질 분해가 촉진되고, 이러한 현상이 단백질 분해 효소 Siah1에 의해 매개됨이 보고된 바 있다. 이와 더불어, 연골세포 석회화를 동반하는 퇴행성 관절염의 발병과 함께 인디안 헤지호그(Indian Hedgehog, Ihh) 신호전달이 증가하며, 이를 제어함으로써 동물모델에서의 퇴행성 관절염 진행이 억제될 수 있음이 알려져 있다.
본 발명자들은 Nkx3.2를 기반으로 하는 퇴행성 관절염 치료에 있어, 퇴행성 관절염의 병리 환경 하에서 효과적으로 작용할 수 있는 Nkx3.2 변이체를 개발하기 위해 연구한 결과, Siah1에 의해 유도되는 단백질 분해에 저항성을 가지는 Nkx3.2 단편들을 제조하였다. 또한, 상기 Nkx3.2 단편들이 전장의 Nkx3.2와 유사한 수준의 NF-κB 활성화를 유도할 수 있음을 확인하였다. 나아가, 상기 Nkx3.2 단편들이 전장의 Nkx3.2에 비해 현저히 향상된 퇴행성 관절염 치료효능을 보임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 식 (I)로 표시되는 폴리펩타이드를 제공한다:
N-말단 확장 도메인-코어 도메인-C-말단 확장 도메인 (I)
상기 식 (I)에서,
코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;
N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 35의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 53개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며;
C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 식 (II)로 표시되는 폴리펩타이드를 제공한다:
N-말단 확장 도메인-코어 도메인-C-말단 확장 도메인 (II)
상기 식 (II)에서,
코어 도메인은 서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;
N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 39의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 41개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며;
C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 41의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 15개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 Nkx3.2 단편은 전장의 Nkx3.2와 유사한 수준의 NF-κB 활성화 기능을 가지며, Siah1에 의한 단백질 분해에 저항성을 가진다. 또한, 상기 Nkx3.2 단편은 동물모델 기반 in vivo 효능 평가에서 Nkx3.2에 비해 최소 10배 이상 향상된 퇴행성 관절염 치료효과를 나타내었다. 따라서, 상기 Nkx3.2 단편은 관절염 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 Nkx3.2 단편들의 Siah1에 의한 단백질 분해 저항성을 확인한 도면이다.
도 2는 Nkx3.2 단편과 IκBα의 결합 유무를 확인한 도면이다.
도 3은 Nkx3.2 단편이 IκBα의 분해를 유도하는지 확인한 도면이다.
도 4는 Nkx3.2 단편이 NF-κB의 전사기능을 활성화 시키는지 확인한 그래프이다.
도 5는 Nkx3.2에 의해 유도되는 NF-κB 활성화 과정의 분자적 기전을 보여주는 모식도이다.
도 6은 Nkx3.2 단편의 치료효과를 검증하기 위한 퇴행성 관절염 유발 동물모델을 이용한 동물실험 과정을 도식화한 도면이다.
도 7은 Nkx3.2 또는 Nkx3.2 단편의 환부 내 발현에 의한 퇴행성 관절염 치료 효능을 조직병리학적으로 확인한 사진이다.
도 8은 조직학적인 분석을 통해 얻어진 모든 데이터를 정량적으로 평가하여 퇴행성 관절염 중증도를 최소 0점에서 최대 5점으로 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 식 (I)로 표시되는 폴리펩타이드를 제공한다:
N-말단 확장 도메인-코어 도메인-C-말단 확장 도메인 (I)
상기 식 (I)에서,
코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;
N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 35의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 53개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며;
C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.
상기 코어 도메인은 전장의 Nkx3.2 단백질의 166번부터 309번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 전장의 Nkx3.2 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 N-말단 확장 도메인은 상술한 코어 도메인의 N-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 112번부터 165번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개 또는 53개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 11개, 18개, 38개, 41개, 44개, 47개, 50개 또는 53개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 C-말단 확장 도메인은 상술한 코어 도메인의 C-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 310번부터 333번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개, 15개, 17개, 19개, 21개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 아미노산 잔기의 결실은, N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인 중 어느 하나 또는 양쪽 도메인 전부에서 발생할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 13, 14, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 제공한다. 상기 단편은 서열번호 13의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 53개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 또한, 상기 단편은 서열번호 13의 333번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 13의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 13의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 11개, 18개, 38개, 41개, 44개, 47개, 50개 또는 53개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 또한, 서열번호 13의 333번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개, 15개, 17개, 19개, 21개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 식 (II)로 표시되는 폴리펩타이드를 제공한다:
N-말단 확장 도메인-코어 도메인-C-말단 확장 도메인 (II)
상기 식 (II)에서,
코어 도메인은 서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;
N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 39의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 41개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며;
C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 41의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 15개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.
상기 코어 도메인은 전장의 Nkx3.2 단백질의 154번부터 317번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 전장의 Nkx3.2 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 코어 도메인은 서열번호 37의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 N-말단 확장 도메인은 상술한 코어 도메인의 N-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 112번부터 153번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개 또는 41개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 11개, 18개, 38개 또는 41개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 C-말단 확장 도메인은 상술한 코어 도메인의 C-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 318번부터 333번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
구체적으로, C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개 또는 15개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 3개, 6개, 9개, 13개 또는 15개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 화학식 (I) 또는 (II)로 표시되는 폴리펩타이드는 Nkx3.2 단백질의 단편으로서, 생체 내에서는 존재하지 않는다. 그러나, 상기 폴리펩타이드는 전장의 Nkx3.2 단백질과 동일한 활성을 가지면서도, 생체 내에서 쉽게 분해되지 않아 전장의 Nkx3.2 단백질에 비해 체내에서 오랫동안 존재함으로써, 더 우수한 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 (I) 또는 (II)로 표시되는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 상기 코어 도메인, N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인을 코딩하는 것으로서, 각각은 서열번호 2 또는 38, 서열번호 36 또는 40 및 서열번호 6 또는 42의 염기서열을 가질 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 상술한 바와 같은 N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인에서 아미노산 잔기가 결실된 단편을 코딩하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1, 서열번호 35 또는 서열번호 5의 폴리펩타이드를 발현시키는 다른 염기서열로 치환된 것을 포함할 수 있다.
또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상술한 바와 같은 N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인에서 아미노산 잔기가 결실된 단편을 코딩하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 37, 서열번호 39 또는 서열번호 41의 폴리펩타이드를 발현시키는 다른 염기서열로 치환된 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드(cosmid) 벡터, 박테리오파지 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 발현벡터는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드가 발현 및 분비될 수 있도록 통상의 기술자에 의해 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
상기 숙주세포는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드가 포함된 발현벡터가 형질전환된 세포로서, 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 구체적으로, 포유동물세포일 수 있다. 상기 형질전환은 통상의 기술분야에 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 한편, 상기 원핵세포의 일 예는 E. coli일 수 있으며, 진핵세포의 일 예는 효모(Yeast)일 수 있다. 또한, 상기 포유동물세포는 NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cell), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CapT 세포(인간 양수 유래 세포) 또는 COS 세포일 수 있다.
본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다.
상기 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 백시니아 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 바이러스는 아데노-부속 바이러스(AAV)일 수 있다. 상기 아데노 부속 바이러스는 특정 혈청형 (serotype)에 한정되지 않으며, 바람직하게는 AAV1 내지 AAV9 중 어느 하나일 수 있다.
상기 아데노-부속 바이러스(AAV)는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941호 및 제 4,797,368호에 상세하게 개시되어 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미를 동시 형질전환시켜 제조될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 본 발명자들은 Nkx3.2의 단편을 제작하여, 상기 단편이 Siah1에 의해 분해되지 않으면서도(도 1) IκBα와의 결합을 통해 IκBα의 분해를 유도하고(도 2 및 3), NF-κB에 의한 전사 활성화를 유도함을 확인하였다(도 4). 또한, Nkx3.2의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 아데노 부속 바이러스를 퇴행성 관절염 유발 마우스에 관절강 투여하여 손상된 연골조직이 회복되는 것을 확인하였다(도 7 및 8). 따라서, 본 발명의 Nkx3.2의 단편은 관절염의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 Nkx3.2 단편을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 Nkx3.2 단편은 하기 식 (I)로 표시되는 폴리펩타이드일 수 있다:
N-말단 확장 도메인-코어 도메인-C-말단 확장 도메인 (I)
상기 식 (I)에서,
코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;
N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 35의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 53개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며;
C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.
상기 코어 도메인은 전장의 Nkx3.2 단백질의 166번부터 309번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 전장의 Nkx3.2 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 N-말단 확장 도메인은 상술한 코어 도메인의 N-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 112번부터 165번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개 또는 53개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 11개, 18개, 38개, 41개, 44개, 47개, 50개 또는 53개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 C-말단 확장 도메인은 상술한 코어 도메인의 C-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 310번부터 333번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개, 15개, 17개, 19개, 21개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 아미노산 잔기의 결실은, N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인 중 어느 하나 또는 양쪽 도메인 전부에서 발생할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 13, 14, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 제공한다. 상기 단편은 서열번호 13의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 53개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 또한, 상기 단편은 서열번호 13의 333번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 13의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 13의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 11개, 18개, 38개, 41개, 44개, 47개, 50개 또는 53개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 또한, 서열번호 13의 333번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개, 15개, 17개, 19개, 21개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
또한, 상기 Nkx3.2 단편은 하기 식 (II)로 표시되는 폴리펩타이드일 수 있다:
N-말단 확장 도메인-코어 도메인-C-말단 확장 도메인 (II)
상기 식 (II)에서,
코어 도메인은 서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;
N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 39의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 41개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며;
C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 41의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 15개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.
상기 코어 도메인은 전장의 Nkx3.2 단백질의 154번부터 317번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 전장의 Nkx3.2 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 코어 도메인은 서열번호 37의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 N-말단 확장 도메인은 상술한 코어 도메인의 N-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 112번부터 153번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개 또는 41개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 11개, 18개, 38개 또는 41개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 C-말단 확장 도메인은 상술한 코어 도메인의 C-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 318번부터 333번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
구체적으로, C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개 또는 15개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 3개, 6개, 9개, 13개 또는 15개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 화학식 (I) 또는 (II)로 표시되는 폴리펩타이드는 Nkx3.2 단백질의 단편으로서, 생체 내에서는 존재하지 않는다. 그러나, 상기 폴리펩타이드는 전장의 Nkx3.2 단백질과 동일한 활성을 가지면서도, 생체 내에서 쉽게 분해되지 않아 전장의 Nkx3.2 단백질에 비해 체내에서 오랫동안 존재함으로써, 더 우수한 활성을 나타낼 수 있다.
상기 Nkx3.2 단편은 (I) 또는 (II)로 표시되는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터로 형질전환시킨 숙주세포를 통해 수득할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 상술한 코어 도메인, N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인을 코딩하는 것으로서, 각각은 서열번호 2 또는 38, 서열번호 36 또는 40 및 서열번호 6 또는 42의 염기서열을 가질 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 상술한 바와 같은 N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인에서 아미노산 잔기가 결실된 단편을 코딩하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1, 서열번호 35 또는 서열번호 5의 폴리펩타이드를 발현시키는 다른 염기서열로 치환된 것을 포함할 수 있다.
또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상술한 바와 같은 N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인에서 아미노산 잔기가 결실된 단편을 코딩하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 37, 서열번호 39 또는 서열번호 41의 폴리펩타이드를 발현시키는 다른 염기서열로 치환된 것을 포함할 수 있다.
상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드(cosmid) 벡터, 박테리오파지 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 발현벡터는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드가 발현 및 분비될 수 있도록 통상의 기술자에 의해 제작될 수 있다.
상기 숙주세포는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드가 포함된 발현벡터가 형질전환된 세포로서, 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 구체적으로, 포유동물세포일 수 있다. 상기 형질전환은 통상의 기술분야에 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 한편, 상기 원핵세포의 일 예는 E. coli일 수 있으며, 진핵세포의 일 예는 효모(Yeast)일 수 있다. 또한, 상기 포유동물세포는 NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cell), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CapT 세포(인간 양수 유래 세포) 또는 COS 세포일 수 있다.
상기 관절염은 골 관절염, 류마티스 관절염, 퇴행성 관절염, 통풍 관절염, 소아 관절염, 노인성 관절염, 반응성 관절염 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 0.1 내지 99 중량%, 1 내지 90 중량%, 10 내지 80 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다.
상기 Nkx 3.2 단편을 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 약학 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시에 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 폴리펩타이드의 투여량은 0.0001 내지 100 ㎎/㎏일 수 있다. 이때, 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명은 상기 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 Nkx3.2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 재조합 바이러스에 적재되는 폴리뉴클레오타이드는 하기 식 (I)로 표시되는 폴리펩타이드를 코딩하는 것일 수 있다:
N-말단 확장 도메인-코어 도메인-C-말단 확장 도메인 (I)
상기 식 (I)에서,
코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;
N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 35의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 53개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며;
C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.
상기 코어 도메인은 전장의 Nkx3.2 단백질의 166번부터 309번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 전장의 Nkx3.2 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 N-말단 확장 도메인은 상술한 코어 도메인의 N-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 112번부터 165번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개 또는 53개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 11개, 18개, 38개, 41개, 44개, 47개, 50개 또는 53개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 C-말단 확장 도메인은 상술한 코어 도메인의 C-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 310번부터 333번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개, 15개, 17개, 19개, 21개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 아미노산 잔기의 결실은, N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인 중 어느 하나 또는 양쪽 도메인 전부에서 발생할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 13, 14, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, 상기 재조합 바이러스에 적재되는 폴리뉴클레오타이드는 하기 식 (II)로 표시되는 폴리펩타이드를 코딩하는 것일 수 있다:
N-말단 확장 도메인-코어 도메인-C-말단 확장 도메인 (II)
상기 식 (II)에서,
코어 도메인은 서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;
N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 39의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 41개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며;
C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 41의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 15개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.
상기 코어 도메인은 전장의 Nkx3.2 단백질의 154번부터 317번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 전장의 Nkx3.2 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 코어 도메인은 서열번호 37의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 N-말단 확장 도메인은 상술한 코어 도메인의 N-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 112번부터 153번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개 또는 41개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 11개, 18개, 38개 또는 41개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 C-말단 확장 도메인은 상술한 코어 도메인의 C-말단에 결합되는 도메인으로서, 전장의 Nkx3.2 단백질의 318번부터 333번까지의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 15번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
구체적으로, C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개 또는 15개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드거나, 상기 폴리펩타이드의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 3개, 6개, 9개, 13개 또는 15개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 화학식 (I) 또는 (II)로 표시되는 폴리펩타이드는 Nkx3.2 단백질의 단편으로서, 생체 내에서는 존재하지 않는다. 그러나, 상기 폴리펩타이드는 전장의 Nkx3.2 단백질과 동일한 활성을 가지면서도, 생체 내에서 쉽게 분해되지 않아 전장의 Nkx3.2 단백질에 비해 체내에서 오랫동안 존재함으로써, 더 우수한 활성을 나타낼 수 있다.
상기 Nkx3.2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스는 (I) 또는 (II)로 표시되는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 벡터로 형질감염시킨 숙주세포를 통해 수득할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 상술한 코어 도메인, N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인을 코딩하는 것으로서, 각각은 서열번호 2 또는 38, 서열번호 36 또는 40 및 서열번호 6 또는 42의 염기서열을 가질 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 상술한 바와 같은 N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인에서 아미노산 잔기가 결실된 단편을 코딩하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1, 서열번호 35 또는 서열번호 5의 폴리펩타이드를 발현시키는 다른 염기서열로 치환된 것을 포함할 수 있다.
또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상술한 바와 같은 N-말단 확장 도메인 및 C-말단 확장 도메인에서 아미노산 잔기가 결실된 단편을 코딩하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 37, 서열번호 39 또는 서열번호 41의 폴리펩타이드를 발현시키는 다른 염기서열로 치환된 것을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 13, 14, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있다.
상기 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 백시니아 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 바이러스는 아데노-부속 바이러스(AAV)일 수 있다. 상기 아데노 부속 바이러스는 특정 혈청형 (serotype)에 한정되지 않으며, 바람직하게는 AAV1 내지 AAV9 중 어느 하나일 수 있다.
상기 아데노-부속 바이러스(AAV)는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941호 및 제 4,797,368호에 상세하게 개시되어 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미를 동시 형질전환시켜 제조될 수 있다.
상기 관절염은 골 관절염, 류마티스 관절염, 퇴행성 관절염, 통풍 관절염, 소아 관절염, 노인성 관절염, 반응성 관절염 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다.
상기 Nkx3.2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 약학 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시에 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 재조합 바이러스의 성인 기준 1일 1.0x105 내지 1.0x1015 바이러스 유전체(viral genome)의 양으로 투여할 수 있다. 구체적으로, 본 발며의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준 1일 1.0x105 내지 1.0x1015, 1.0x107 내지 1.0x1013, 1.0x108 내지 1.0x1012 또는 1.0x109 내지 1.0x1010의 양으로 투여할 수 있다.
본 발명은 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 상기 Nkx 3.2 단편 또는 Nkx3.2 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다. 구체적으로 상기 약학 조성물은 관절강 내 투여할 수 있다.
상기 약학 조성물은 관절강 내 투여할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 "관절강"이란, 관절에서 뼈와 뼈의 틈새로서, 관절포에 의하여 싸여있는 내강을 의미한다. 관절강 내에 투여하는 방법은 다양하다. 예를 들면, 환자가 천장을 쳐다보는 자세로 누운 상태에서 한쪽 무릎을 90도로 굽히도록 하고 관절강 내에 주삿바늘을 찌르는 방법이 있다. 상기 자세에서 안쪽과 바깥쪽의 관절 경계선을 비교적 쉽게 손으로 구분할 수 있다. 안쪽과 바깥쪽, 양쪽 모두에 주사할 수 있으나, 주로 안쪽 방향으로 주사한다. 또한, 무릎을 편 상태에서 주사하는 방법도 있다. 상기 두 자세 모두 예정된 주사 위치에 정확하게 주삿바늘을 꽂았다면, 별다른 저항감 없이 주사액을 주입할 수 있다. 그러나, 주사기를 누를 때 약물이 잘 들어가지 않고 저항감이 느껴지거나 환자가 심한 통증을 호소한다면 바늘의 위치를 조정해야 한다.
본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 N-말단 부위, C-말단 부위 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 부위를 결실시키는 단계를 포함하는, 체내 안정성이 증가된 Nkx3.2 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 N-말단 부위의 결실은, 서열번호 7의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 165개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 결실은 서열번호 7의 112번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 53개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 N-말단 부위의 결실은 서열번호 7의 112번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 11개, 18개, 38개, 41개, 44개, 47개, 50개 또는 53개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 C-말단 부위의 결실은, 서열번호 7의 333번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 C-말단 부위의 결실은 서열번호 7의 333번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개, 15개, 17개, 19개, 21개 또는 23개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 아미노산 잔기의 결실은 N-말단 부위 및 C-말단 부위 중 어느 하나 또는 양쪽에서 발생할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 Nkx3.2 단편은 서열번호 13, 14, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 아미노산 잔기의 결실은 통상의 기술자에 의해 적절한 방법으로 수행될 수 있다. 상기 방법으로 제조된, 체내 안정성이 증가된 Nkx3.2 단편은 생체 내에서 Siah1에 의해 쉽게 분해되지 않아 천연형의 Nkx3.2 단백질에 비해 체내에서 오랫동안 존재할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. Nkx3.2의 단편을 발현하는 벡터의 제작
Siah1에 의한 단백질 분해에 저항성을 가지는 변이체를 확보하기 위하여 다음과 같은 방법으로 Nkx3.2의 단편을 발현하는 벡터를 제작하였다.
구체적으로, 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 가지는 Nkx3.2 유전자를 주형으로 Lamp Pfu DNA 중합효소(Cat.# LP116-250, BioFACT, 한국)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물을 제한효소인 EcoRI(Cat.# FD0274, ThermoFisher, 미국)과 XhoI(Cat.# FD0694, ThermoFisher, 미국) 또는 XbaI(Cat.# FD0684, ThermoFisher, 미국)으로 절단하고, T4 리가아제(Cat.# EL0011, ThermoFisher, 미국)를 사용하여 pCS 발현벡터(Addgene Cat # 17095)에 각각 삽입하였다.
그 결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 20종의 Nkx3.2의 단편을 발현하는 발현벡터를 제작하였다.
명칭 특징 서열번호
Nkx3.2(1-333) 전장의 Nkx3.2 서열번호 7
Nkx3.2(1-320) 1 내지 320번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 9
Nkx3.2(1-307) 1 내지 307번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 10
Nkx3.2(42-333) 42 내지 333번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 11
Nkx3.2(99-333) 99 내지 333번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 12
Nkx3.2(112-333) 112 내지 333번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 13
Nkx3.2(123-333) 123 내지 333번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 14
Nkx3.2(99-330) 99 내지 330번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 15
Nkx3.2(99-327) 99 내지 327번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 16
Nkx3.2(99-320) 99 내지 320번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 17
Nkx3.2(105-327) 105 내지 327번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 18
Nkx3.2(110-324) 110 내지 324번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 19
Nkx3.2(112-320) 112 내지 320번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 20
Nkx3.2(123-320) 123 내지 320번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 21
Nkx3.2(130-320) 130 내지 320번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 22
Nkx3.2(150-320) 150 내지 320번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 23
Nkx3.2(153-318) 153 내지 318번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 24
Nkx3.2(156-316) 156 내지 316번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 25
Nkx3.2(159-314) 159 내지 314번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 26
Nkx3.2(162-312) 162 내지 312번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 27
Nkx3.2(165-310) 165 내지 310번째 아미노산을 포함하는 Nkx3.2 단편 서열번호 28
실시예 2. Siah1에 의한 단백질 분해에 저항성을 가지는 Nkx3.2 단편 선별
실시예 1.에서 제작된 Nkx3.2 단편을 발현하는 발현벡터를 이용하여, Siah1에 의해 분해되지 않는 Nkx3.2의 단편을 다음과 같은 방법으로 선별하였다.
먼저, Siah1(서열번호 29; GenBank Accession No. AAH35562.1)을 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 통해 증폭시키고, 증폭된 PCR 산물을 EcoRI 및 NcoI을 사용하여 절단하였다. 이를 동일한 제한효소로 절단된, 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA)의 아미노산 서열(서열번호 33; YPYDVPDYA)이 3번 반복된 표지를 포함하는 pCS 3HA 발현벡터(Addgene plasmid #17095 pCS2P+의 EcoRI과 ClaI site 사이에 3 HA epitope tag을 삽입한 형태의 벡터)에 삽입하여, Siah1을 발현하는 발현벡터를 제작하였다.
한편, 293T 신장세포주(Cat.# CRL-3216, ATCC, 미국)는 10%(v/v) 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 상기 준비된 세포를 60x15 ㎜ 세포 배양 플레이트에 세포수가 5x105개가 되도록 분주하고, Nkx3.2를 발현하는 발현벡터 2 ㎍, 및 Nkx3.2 단편을 발현하는 발현벡터들을 4 ㎍씩 사용하여, 이들 각각을 2 ㎍의 Siah1를 발현하는 발현벡터와 함께 일시적 형질전환(transient transfection)시켰다. 형질전환은 VivaMagic(Cat.# VM001, 비바젠, 한국)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.
형질전환된 세포들로부터 전체 단백질을 분리하고, 이를 Bio-Rad Laboratories protein kit(Cat.# 500-0116, Bio-Rad, 미국)를 이용하여 정량한 뒤, Nkx3.2, Siah1 및 β-actin 각각에 대한 웨스턴 블롯팅을 통상적인 방법으로 수행하였다. 이때, 항-Nkx3.2 항체(Cat.# Ab83288, Abcam, 영국)는 1:1000, 항-HA 항체(Cat.# 11583816001, Roche, 스위스)는 1:5000, 항-Myc 항체(Cat.# 11667149001, Roche, 스위스)는 1:5000 및 항-β-actin 항체(Cat.# LF-PA0207, AbFrontier, 한국)는 1:5,000으로 3%(v/v)의 소혈청알부민(BSA)을 포함하는 TBST 완충액에 희석하여 사용하였다. 그 결과, 웨스턴 블롯팅 밴드를 촬영한 사진을 도 1에 나타내었고, 이를 하기 표 2에 정리하였다.
명칭 서열번호 Siah1에 의한 분해 여부
Nkx3.2(1-333) 서열번호 7 +++ ○
Nkx3.2(1-320) 서열번호 9 + X
Nkx3.2(1-307) 서열번호 10 - X
Nkx3.2(42-333) 서열번호 11 +++ ○
Nkx3.2(99-333) 서열번호 12 ++ X
Nkx3.2(112-333) 서열번호 13 ++ X
Nkx3.2(123-333) 서열번호 14 - X
Nkx3.2(99-330) 서열번호 15 +++ ○
Nkx3.2(99-327) 서열번호 16 +++ ○
Nkx3.2(99-320) 서열번호 17 + X
Nkx3.2(105-327) 서열번호 18 ++ ○
Nkx3.2(110-324) 서열번호 19 +++ ○
Nkx3.2(112-320) 서열번호 20 - X
Nkx3.2(123-320) 서열번호 21 - X
Nkx3.2(130-320) 서열번호 22 - X
Nkx3.2(150-320) 서열번호 23 - X
Nkx3.2(153-318) 서열번호 24 - X
Nkx3.2(156-316) 서열번호 25 ++ X
Nkx3.2(159-314) 서열번호 26 ++ X
Nkx3.2(162-312) 서열번호 27 ++ X
Nkx3.2(165-310) 서열번호 28 ++ X
도 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, Siah1에 의한 Nkx3.2 단백질의 분해 현상이 전장의 Nkx3.2(1-333)와는 달리, Nkx3.2(1-320), Nkx3.2(1-307), Nkx3.2(123-333), Nkx3.2(99-320), Nkx3.2(112-320), Nkx3.2(123-320), Nkx3.2(130-320), Nkx3.2(150-320) 및 Nkx3.2(153-318) 단편들에서는 일어나지 않았다.
실시예 3. Nkx3.2 단편과 IκBα의 결합 유무 확인
Nkx3.2는 IκBα와의 결합을 통해 NF-κB의 활성화를 유도한다. 따라서, Nkx3.2(112-320), Nkx3.2(123-320), Nkx3.2(130-320), Nkx3.2(150-320) 및 Nkx3.2(153-318) 단편들이 IκBα와의 결합 유무를 면역침강법을 이용하여 확인하였다.
먼저, IκBα(서열번호 31; GenBank Accession No. CAB65556)를 실시예 1.과 동일한 조건 및 방법으로 PCR을 통해 증폭시키고, 증폭된 PCR 산물을 EcoRI 및 XbaI을 사용하여 절단하였다. 이를 동일한 제한효소로 절단된, Myc 아미노산 서열(서열번호 34: EQKLISEEDL)이 6번 반복된 표지를 포함하는 pCS 6Myc 발현벡터(Addgene plasmid #17095 pCS2P+의 EcoRI과 ClaI site 사이에 6 Myc epitope tag을 삽입한 형태의 벡터)에 삽입하여 IκBα를 발현하는 발현벡터를 제작하였다.
그 후, 실시예 1.에서 제조된 Nkx3.2(1-333)과 상기 단편들을 각각 발현하는 발현벡터들을 8 ㎍씩 사용하여, 이들 각각을 동량의 IκBα를 발현하는 발현벡터와 함께 실시예 2.와 동일한 조건 및 방법으로 293T 신장 세포주에 형질전환하였다. 이때, Nkx3.2 단백질에 의해 IκBα 단백질이 분해되는 것을 억제하기 위해 프로테오좀 분해 억제제인 MG132(Cat.# 474790, Merck Millipore, 독일) 20 μM의 농도로 첨가하였다. 6시간 후, 세포로부터 전체 단백질을 분리하고, IκBα에 표지된 Myc을 인식하는 항-Myc 항체를 이용하여 통상적인 방법으로 면역침강을 수행한 뒤, 상기 기재된 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅한 결과 사진을 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, Nkx3.2(112-320), Nkx3.2(123-320), Nkx3.2(130-320), Nkx3.2(150-320) 및 Nkx3.2(153-318) 단편들에서 전장의 Nkx3.2(1-333)와 유사하게 밴드가 형성되었다. 따라서, 상기 Nkx3.2 단편들이 NF-κB의 활성화를 위해 필수적으로 요구되는 IκBα와의 결합체 형성 기능을 보유하고 있음을 확인하였다.
실시예 4. Nkx3.2 단편에 의한 IκBα단백질 분해 여부 확인
Nkx3.2는 IκBα와의 결합을 통해 IκBα의 유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해를 촉진시킨다. 이에, Nkx3.2(112-320), Nkx3.2(123-320), Nkx3.2(130-320), Nkx3.2(150-320) 및 Nkx3.2(153-318) 단편들이 이와 같은 활성을 유지하는지 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
한편, ATDC5 연골 세포주(Cat.# RCB0565, Riken, 일본)는 10%(v/v) 우태아혈청이 포함된 DMEM/F12(Dulbecco's modified Eagle's medium: Nutrient Mixture F-12) 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 상기 준비된 세포를 90x20 ㎜ 세포 배양 플레이트에 세포수가 5x105개가 되도록 분주하고, 여기에 Nkx3.2(1-333)를 발현하는 발현벡터 4 ㎍, 및 Nkx3.2 단편을 발현하는 발현벡터들을 8 ㎍씩 사용하여, 이들 각각을 1 ㎍의 IκBα를 발현하는 발현벡터와 함께 일시적 형질전환을 수행하였다. 형질전환은 VivaMagic(Cat.# VM001, 비바젠, 한국)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.
이후의 과정은 실시예 2.와 동일한 조건 및 방법으로 웨스턴 블롯팅을 수행하였으며, 그 결과를 확인한 사진을 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, Nkx3.2(112-320), Nkx3.2(123-320), Nkx3.2(130-320), Nkx3.2(150-320) 및 Nkx3.2(153-318) 단편들에서 전장의 Nkx3.2(1-333)와 유사한 강도의 밴드가 형성되었다. 이로부터, 상기 Nkx3.2 단편들이 전장의 Nkx3.2와 동일한 수준으로 IκBα의 단백질 분해를 유도할 수 있음을 검증하였다.
실시예 5. Nkx3.2 단편에 의한 NF-κB 전사기능 활성화 여부 확인
Nkx3.2는 NF-κB의 활성화를 유도함으로써, 연골세포의 세포사멸을 억제한다. 따라서, Nkx3.2 단편에 의한 NF-κB의 활성화를 측정하기 위하여, NF-κB에 특이적인 DNA 결합 사이트(서열번호 35: GGGAATTTCC)가 4번 반복된 폴리뉴클레오티드 서열을 MluI 및 XhoI을 이용하여 pGL3-Basic 벡터(Cat.# E1751, Promega, 미국)에 삽입하여 4x-κB-Luc 발현벡터를 제작하였다. 또한, 상기 발현벡터를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 Nkx3.2에 의한 NF-κB의 전사기능 활성화를 확인하였다.
먼저, 전장의 Nkx3.2(1-333) 및 Nkx3.2 단편을 발현하는 발현벡터 200 ng, 4x-κB-Luc 발현벡터 100 ng, pRL-TK 발현벡터 (Cat.# E2241, Promega, 미국) 20 ng을 각각 사용하여 293T 신장 세포주로 일시적 형질전환시켰다.
형질전환은 VivaMagic을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 24시간 후, Dual-Luciferase Reporter Assay System (Cat.# E1910, Promega, 미국)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 루시퍼라제 어세이를 수행하였다.
구체적으로, 형질전환된 293T 신장 세포주의 배양액을 제거하고, 1xPBS로 세척하였다. 여기에 150 ㎕의 1x Passive Lysis Buffer(PLB)를 첨가하여 15분 동안 상온에서 세포를 용해시키고, 10 ㎕의 세포 용해물에 50 ㎕의 LAR II를 첨가하여 반응시킨 뒤, 파이어플라이 루시퍼라제(FireFly luciferase) 활성을 측정하였다. 여기에 50 ㎕의 Stop&Glo를 첨가하여 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase) 활성을 측정하였다. 실험 결과는 각각의 샘플에 대한 레닐라 루시퍼라제 활성을 파이어플라이 루시퍼라제 활성으로 정규화시키고(normalized), 이에 대한 백분율의 평균을 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 음성 대조군으로서 pCS2 벡터만을 형질전환한 세포에서의 루시퍼라제 활성을 1로 하였을 때, 전장의 Nkx3.2(1-333)뿐만 아니라, Nkx3.2(112-320), Nkx3.2(123-320), Nkx3.2(130-320), Nkx3.2(150-320) 및 Nkx3.2(153-318) 단편들에서 모두 유의하게 증가된 루시퍼라제 활성을 나타내었다. 따라서, 상기 Nkx3.2 단편들이 전장의 Nkx3.2와 유사한 수준의 NF-κB 전사기능 활성화 기능을 보유하고 있음을 확인하였다.
실시예 6. Nkx3.2 단편의 향상된 퇴행성 관절염 치료 효능 확인
상기의 in vitro 실험들을 통해 전장의 Nkx3.2에 비하여 Nkx3.2 단편들이 나타내는 기능적 우수성을 확인할 수 있었다. 이에, Nkx3.2 단편에 대한 in vivo 측면에서의 향상된 기능을 검증하기 위하여 Nkx3.2 단편(123-320)과 전장의 Nkx3.2(1-333)의 퇴행성 관절염 치료 효능을 비교 분석하였다. 이를 위해 DMM(Destabilization of Medial Meniscus)이라 명명되는 외과적 시술을 통해 퇴행성 관절염을 유도하는 마우스 모델을 선택하였다. 해당 실험과정을 도 6에 도식화하였다.
구체적으로, 무릎조직 내 내측반월상연골 인대를 절단하여, 내측반월상연골의 구조적인 불안정화를 유도하고 이를 통해 대퇴골연골과 경골연골이 서로 마주 부딪히게 하여 연골손상을 유도함으로써 퇴행성 관절염을 유도하였다. 대조군(Control)은 모의수술을 통하여 무릎 외피와 내피를 절개하였다가 봉합한 동물군을 사용하였다. 퇴행성 관절염을 유도한 동물군과 모의수술 대조군을 8주간 사육하고, 이 시점에서 Nkx3.2 단편(123-320) 또는 전장의 Nkx3.2(1-333)를 발현하는 AAV(Adeno-Associated Virus) 또는 공벡터 AAV를 해당 무릎 관절강에 주사하여, 4 주간 사육한 뒤 퇴행성 관절염의 진행 정도를 조직 병리 분석을 통해 분석하였다.
조직병리학적 분석은 양이온 화합물로써 연골의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfateproteoglycan)이 띄는 음이온기에 효과적으로 부착되어 붉은색의 색깔을 띄는 염색 시료인 Safranin-O 염색 방법을 채택하였다. 붉은색으로 진하게 염색된 부위는 건강성이 유지된 연골 조직으로 평가되며, 반대로 Safranin-O 염색이 약하거나 없으며 조직이 손상된 부분은 퇴행성 관절염 병증이 진행된 병변으로 해석된다.
도 7에 나타난 바와 같이, 공벡터 AAV가 관절강으로 주사된 대조군의 경우, 투여된 바이러스 입자의 양에 상관없이 매우 심한 연골 손상 및 퇴행 현상이 관찰되었다.
전장의 Nkx3.2(1-333)를 발현하는 AAV가 관절강으로 주사된 비교군의 경우, 1x1010 AAV 투여군에서만 유의한 퇴행성 관절염 치료 효능이 관찰되었다.
반면, Nkx3.2 단편(123-320)을 발현하는 AAV가 관절강으로 주사된 실험군의 경우, 가장 낮은 용량인 1.25x109 AAV 투여군에서부터 월등한 퇴행성 관절염 치료효과를 나타내었다. 즉, Nkx3.2 단편(123-320) 단편의 경우, 퇴행성 관절염 치료 효능이 전장의 Nkx3.2(1-333) 대비 최소 10배 이상 향상되었음을 확인할 수 있었다.
상기 조직병리학적 분석을 통해 얻어진 모든 데이터를 정량적으로 평가하고, 그 결과를 그래프화하여 도 8에 나타내었다. 각 실험군 별로 분석된 동물의 수는 3마리이며, 퇴행성 관절염 중증도를 최소 0점에서 최대 5점으로 평가하여 막대 그래프를 작성하였다. 평균의 표준오차(mean with SEM)가 오차막대로 표기되었으며, 바이러스 입자의 투여 용량 A, B, C, D는 각각 1.25x109, 2.5x109, 5x109, 1x1010 순서로 증가 되었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 공벡터 AAV가 관절강으로 주사된 대조군의 경우, 투여된 바이러스 입자의 양에 상관없이 4.5 내지 5점의 높은 점수가 평가되었다. 또한, 전장의 Nkx3.2(1-333)을 발현하는 AAV가 관절강으로 주사된 비교군의 경우, 1x1010 AAV 투여군에서만 1.5점의 낮은 점수가 평가되었다. 반면, Nkx3.2 단편(123-320)의 을 발현하는 AAV가 관절강으로 주사된 실험군의 경우, 가장 낮은 용량인 1.25x109 AAV 투여군에서부터 1점 이하의 매우 낮은 점수가 평가되었다. 즉, Nkx3.2 단편(123-320) 단편이 전장의 Nkx3.2(1-333)보다 퇴행성 관절염 치료 효능이 우수하다는 것을 확인하였다.

Claims (37)

  1. 하기 식 (I)로 표시되는 폴리펩타이드:
    N-말단 확장 도메인-코어 도메인-C-말단 확장 도메인 (I)
    상기 식 (I)에서,
    코어 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;
    N-말단 확장 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 35의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 53개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며;
    C-말단 확장 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 23개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 35의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 11개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 35의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 18개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 35의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 38개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 35의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 41개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 35의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 44개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 35의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 47개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 35의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 50개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 35의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 53개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 15개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 17개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 19개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 21개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  15. 제 1항에 있어서,
    상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 5의 24번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 23개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  16. 제 1항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 서열번호 13, 14, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
  17. 하기 식 (II)로 표시되는 폴리펩타이드:
    N-말단 확장 도메인-코어 도메인-C-말단 확장 도메인 (II)
    상기 식 (II)에서,
    코어 도메인은 서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;
    N-말단 확장 도메인은 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 39의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 41개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며;
    C-말단 확장 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 41의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 15개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 39의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 11개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  19. 제 17항에 있어서,
    상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 39의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 18개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  20. 제 17항에 있어서,
    상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 39의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 38개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  21. 제 17항에 있어서,
    상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 39의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 41개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  22. 제 17항에 있어서,
    상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 41의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 3개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  23. 제 17항에 있어서,
    상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 41의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 6개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  24. 제 17항에 있어서,
    상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 41의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 9개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  25. 제 17항에 있어서,
    상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 41의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 13개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  26. 제 17항에 있어서,
    상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 41의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 15개의 아미노산이 연속적으로 결실된, 폴리펩타이드.
  27. 제1항 또는 제17항의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  28. 제27항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터.
  29. 제28항의 발현벡터를 포함하는 숙주세포.
  30. 제1항 또는 제17항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 관절염이 골 관절염, 류마티스 관절염, 퇴행성 관절염, 통풍 관절염, 소아 관절염, 반응성 관절염 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  32. 제27항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스.
  33. 제 32항에 있어서,
    상기 바이러스가 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 백시니아 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 것인, 재조합 바이러스.
  34. 제32항의 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 관절염이 골 관절염, 류마티스 관절염, 퇴행성 관절염, 통풍 관절염, 소아 관절염, 반응성 관절염 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  36. 제30항 또는 제34항의 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 관절염의 예방 또는 치료방법.
  37. 제 36항에 있어서,
    상기 투여는 관절강 투여를 하는 것인, 관절염의 예방 또는 치료방법.
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