WO2018088878A2 - 탄산탈수소 효소에 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

탄산탈수소 효소에 결합하는 항체 및 이의 용도 Download PDF

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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/988—Lyases (4.), e.g. aldolases, heparinase, enolases, fumarase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention is an antibody that recognizes and binds a carbonic anhydrous dehydrogenase.
  • Carbonic anhydrase is an enzyme belonging to the family of enzymes that participate in the maintenance of pH homeostasis in vivo by * reversing the reversible hydration of carbonic acid to hydrogen carbonate and floton. Because most carbonic anhydrases contain zinc ions in their active sites. These are classified with metal enzymes.
  • CA carbonate dehydrogenase
  • CA-II, CA-IX and CA-XII are tumor-associated and they are potential histological and prognostic biomarkers for various tumors [Nordfors et al. (2010), BMC cancer; 10: 148].
  • CA-II is the most widely expressed. It is a member of the ⁇ -CA gene family and is substantially present in human tissues and organs.
  • the transmembrane enzyme, CA-IX has been recognized as a tumor-associated antigen expressed in many types of human cancer tumors and normal gastrointestinal tissues.
  • CA-IX is cell adhesion, differentiation. The enzyme is functionally involved in proliferation and carcinogenesis Activity is comparable to CA-I I.
  • CA-XI I Another transmembrane CA isozyme, CA-XI I, was first discovered in normal kidney tissue and renal cell carcinoma. According to a new study, CA-XI I has several other tumors [Ulmasov, B., (2000). i cat ion and kinet ic analys is of recombinant CA XI I, a membrane carboni c anhydrase overexpressed in certain cancers. Proc Nat 1 Acad Sci USA 97, 14212-1421, but also in some normal organs, such as colon and uterus. The high expression of CA— II, CA-IX and CA-XI I in tumors, especially under hypoxic conditions, suggests that their enzymes may be functionally involved in the infiltration process promoted by acidification of the extracellular space. It is.
  • One embodiment of the present invention relates to antibodies that bind to carbonic anhydrous dehydrogenase and antigen-binding fragments thereof.
  • nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment. It relates to a vector and a host cell comprising the nucleic acid molecule.
  • Antibodies, nucleic acid molecules, vectors, and / vi are related to methods of detecting or diagnosing carbon dioxide dehydrogenase-related vaginal whites, including host cells, or diagnostic kits.
  • One embodiment of the present invention relates to a composition or use for the prophylaxis, treatment, or alleviation of diseases related to carbonic anhydrase, including the antibody, nucleic acid molecule, vector, and / or host cell.
  • One embodiment of the invention comprising administering a composition comprising the antibody, nucleic acid molecules, vector, and / or host cells to a subject having a carbonic anhydrase related disease.
  • a composition comprising the antibody, nucleic acid molecules, vector, and / or host cells.
  • Prevention of Carbonate Dehydrogenase Related Diseases To a method of treatment or alleviation.
  • the antibody nucleic acid molecule, vector. And / or reduce the size of tumors or tumor degeneration of solid or solid cancer cells, including host cells.
  • the present invention provides an antibody that recognizes and binds a carbonic anhydrous dehydrogenase, a nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment, a vector and host cell comprising the nucleic acid molecule, and a CA-XI I positive solid cancer of the antibody or antigen-binding fragment thereof. For alleviation, prophylaxis, treatment or diagnostic use.
  • the antibody according to the present invention is an antibody that specifically recognizes and binds a carbonic anhydrous dehydrogenase.
  • the antibody of the present invention binds to CA—XI I, and specifically, the antigen-determining site to which the antibody binds is a non-catalyzed region of CA-XI I located at the N-terminus. )to be.
  • the CA-XI I is preferably a human-derived enzyme. Specifically, the amino acid sequence of human-derived CA-XI I is shown in SEQ ID NO: 5.
  • catalyst domain is a well-known term in the art and, moreover, in the region of CA-XI I where a catalyst from carbonic acid to bicarbonate and poloton occurs in balance with the present invention. It is about.
  • non-catalytic domain refers to a region other than the catalytic domain which is a region where the catalyst from carbonic acid to dicarbonate and floron occurs.
  • the noncatalytic domain is an N-terminal non-catalytic domain, preferably the non-catalytic site is N-terminals 1 to 93 in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of human-derived CA-XI I isotype I It may mean a peptide consisting of amino acid or a fragment thereof.
  • the site of the antigen to which the antibody according to the present invention binds may be the non-catalytic site or fragment thereof, that is, from the N-terminal 1 to the amino acid sequence of human-derived CA—XI I isotype I (SEQ ID NO: 5). Teptide or fragment thereof consisting of amino acid 93.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 may be a peptide or a fragment thereof consisting of amino acids 25 to 93, or 25 to 57 of the N-terminal.
  • the site of the antigen to which the antibody according to the invention binds or The epitope comprises 7 to 93 amino acids in length, 7 to 69 amino acids in length, comprising 7 amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 14 amino acids to 33 amino acids long, 14 amino acids to 93 amino acids long, 14 amino acids to 69 amino acids long, 14 amino acids to 33 amino acids long, 19 amino acids to 93 amino acids long, 19 amino acids to 69 amino acids Or peptides having an amino acid length of 19 amino acids to 33 amino acids in length.
  • the site of the antigen to which the antibody binds or the epitope of the antibody is epitope.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 it may be a peptide having essentially the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having a length of 7 to 93 amino acids or 7 to 69 amino acids in length.
  • a peptide having essentially the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and having a length of consecutive 14 yamino acids to 93 amino acids or 14 to 69 amino acids in length more preferably Is a peptide having a length of 7 to 14 contiguous amino acids consisting essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in SEQ ID NO: 2, most preferably consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 It may be a peptide.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 which is the amino acid sequence of human-derived CA-XI I
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 includes amino acids 32 to 38
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 includes amino acids 25 to 38 do.
  • the site of the antigen to which the antibody binds or the epitope of the antibody essentially includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and is 14 to 93 amino acids in length or It may be a peptide having a length of 14 amino acids to 69 amino acids, preferably in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • It may be a peptide having a length of 14 to 19 amino acids consecutively including amino acid sequence, most preferably a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 which is the amino acid sequence of human-derived CA-XI I
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 includes amino acids 39 to 52
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 includes amino acids 39 to 57 do.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 which is the amino acid sequence of human-derived CA—XI I, which is an antigen
  • amino acid sequence of the antigenic region at SEQ ID NOs: 1 to 4 are summarized in Table 1 below.
  • Antibody-specific antibody of the present invention is an antibody derivatizing key specific antibody, and the site-specific antibody of the present invention is a bicarbonate deactivation enzyme Humanized antibodies.
  • the non-catalytic site of carbonic anhydrogenase is a peptide or fragment thereof consisting of amino acids 1-93 of the N-terminus in amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of human-derived CA-XI I isotype I, 25-93 Peptides consisting of amino acids, or peptides consisting of amino acids 25-57 or fragments of these peptides.
  • the peptide may bind to a peptide fragment comprising essentially the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the antibody binds to a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an example of the antibody is CDR1 to the heavy chain variable region of the antibody produced by accession number KCLRF—BP—00280 hybridoma cells It may include CDR3 and CDR1 to CDR3 of the light chain variable region.
  • the hybridoma cell line to the Korea Cell Line Research Foundation, Cancer Research Institute, Seoul National University, located at 28, Yeongun-dong, Jongno-gu, Seoul, Korea. It was deposited on the 14th and received accession number KCLRF-BP-00280 dated 20 February 2012.
  • the antibody produced by Accession No. KCLRF-BP-00280 hybridoma was named 27B6.
  • an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • an antibody according to the present invention is SEQ ID NO: 6 to One or more amino acid sequences selected from the group consisting of a CDR of the V H region comprising an amino acid sequence and a CDR of the V L region comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 9 to 11, preferably, V H region SEQ ID NO: 6 (CDR1), SEQ ID NO: 7CCDR2) and SEQ ID NO: 8 (CDR3) and / or amino acid sequence determining the CDR of the V L region SEQ ID NO: 9 (CDR1), SEQ ID NO: 10 CDR2) and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 KCDR3).
  • the antibody according to the invention may also comprise a V H region comprising the amino acid of SEQ ID NO: 12 and a V L region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:
  • the antibody is a peptide consisting of amino acids 1 to 93 of the N-terminal in the amino acid sequence of the human-derived CA-XI I isotype I (SEQ ID NO: 5), or SEQ ID NO: 3 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, Preferably, it can bind to a peptide fragment comprising essentially the amino acid sequence of SEQ ID NO:
  • one example of the antibody as an antibody binding to a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 heavy chain of the antibody produced by Accession No. KCLRF ⁇ BP-00279 hybridoma cells.
  • CDR1 ' endoscopic CDR 3 of the variable region and CDR1 to CDR3 of the light chain variable region may be included.
  • the hybridoma cell line to the Korea Cell Line Research Foundation, Cancer Research Institute, Seoul, Korea, located at 28, Yeongun-dong, Jongno-gu, Seolle-si, Korea. It was deposited on the 14th and was given accession number KCLRF-BP—00279 dated 20 February 2012.
  • the antibody produced by the hybridoma having accession number KCLRF—BP—00279 is named 4B4, and includes a heavy chain variable region including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 and a light chain variable region including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21. It is an antibody.
  • an antibody according to the present invention may be an antibody comprising at least one CDR selected from the group consisting of a CDR comprising an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 14 to 16 and a CDR comprising an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 17 to 19,
  • the amino acid sequence for determining the CDR of the V H region is SEQ ID NO: 14 (CDR1), SEQ ID NO: 15 CDR2) and SEQ ID NO: 16 CDR3).
  • SEQ ID NO: 17 (CDR1), SEQ ID NO: 18 (CDR2) and SEQ ID NO: 19 (CDR3) which are amino acid sequences that determine the CDR of the V L region.
  • the antibody according to the present invention may include a V H region comprising an amino acid of SEQ ID NO: 20 and a V L region comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.
  • CDR sequences and variable region sequences according to one embodiment of the mouse antibody or chimeric antibody are summarized in the table below.
  • an antibody that binds to an antigenic determining site comprising SEQ ID NO: 1 and an antibody that binds to an antigenic determining site including SEQ ID NO: 3 can bind together to one antigen.
  • the two antibodies can be used to perform sandwich ELSIA analysis on CA-XI I antigen, and the like.
  • the antibody binds to the epitope including SEQ ID NO: 1 in a sandwich ELISA assay, for example, 27B6 antibody. It is more preferable to use as a CAPTURE antibody, an antibody which binds to the antigenic determination site including SEQ ID NO: 3, for example 4B4 antibody as a DETECTOR antibody.
  • Humanized antibodies that bind to the CA-XI I antigen are light and heavy chain variable of mouse monoclonal antibody 4B4 (Accession No. KCLRF-BP— 00279) that specifically binds to CA-XI I.
  • DNP004 humanized antibodies that bind to the CA-XI I antigen
  • one example may include a CDR of a V H region including amino acid sequences of SEQ ID NOs: 14, 15, and 28, and a CDR of 1 ⁇ 4, region including amino acid sequences of SEQ ID NOs: 29, 30, and 31. It may be an antibody comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of.
  • CDRl of the V L region of the antibody is represented by the general formula of SEQ ID NO: 29.
  • Specific examples may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 or 33
  • CDR2 of the V L region is represented by the general formula of SEQ ID NO: 30
  • specific example includes an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 33 to 42 can do.
  • CDR sequences and variable region sequences according to one embodiment of the humanized antibody are summarized in the table below.
  • SEQ ID NOs: 32 to 42 in Table 3 below In the sequence. The parts shown in bold represent the modified amino acid sequence.
  • the antibody may be an antibody including one or more framework sequences selected from the group consisting of amino acid sequences of heavy chain variable region frameworks 1 to 4 and light chain variable region frameworks 1 to 4.
  • the amino acid sequences of the frameworks 1 to 4 of the heavy chain variable region may comprise SEQ ID NOs: 43 to 46, respectively, and the amino acid sequences of the frameworks 1 to 4 of the light chain variable region are SEQ ID NOs: 47, 48, 51, and 52, respectively . It may include.
  • Framework 2 of the light chain variable region is represented by the general formula of SEQ ID NO: 48.
  • One specific example may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49 or 50.
  • the humanized antibody (DNP004) according to the present invention may include a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 53 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 54 to 63 have.
  • Humanized antibody (DNP004) according to the present invention was selected from the candidate group having a higher antigen binding capacity than the chimeric 4B4 antibody as shown in Figure 31 (Example 16), which shows a higher cell binding capacity in various cell lines (Example 18) shows that humanized antibody (DNP004) is superior to chimeric 4B4 antibody, with a significant reduction in the immunogenic potential inherent in mouse or chimeric antibodies.
  • tumor degeneration includes inducing or facilitating a decrease in tumor size and / or inhibition, interruption or reduction of growth of tumor cells.
  • Tumor size reduction is, for example, based on 100% prior to treatment of a composition comprising an antibody or fragment thereof, the tumor size obtained when the composition comprising the antibody or fragment thereof is administered. And less than 97%, less than 95%, less than 90%, less than 85%, less than 80%, less than 75%, and the like.
  • Antibodies according to the present invention have antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADC, Ant i body-dependent ee l 1 -meta ated cytotoxi ci ty) and complement system dependent (CDC, omp 1 ement -dependent cytotoxi ci ty).
  • ADC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • CDC complement system dependent
  • the antibody according to the present invention may be a part or all of the FUCOSE which is a sugar residue bound to the antibody. Fucose-removing antibody according to the present invention.
  • the clef ucose-type antibody was more effective against tumor than fucose-type antibody (see Fig. 14.17).
  • the antibody or antigen-binding fragment may be isolated (not present in vivo) or non-naturally occuring in vivo, and may be produced synthetically or genetically, for example. have. The above method can be easily carried out by a known technique.
  • the present invention also provides a substance for recognizing a CA-XI I epitope.
  • the substance may be selected from the group consisting of antibodies, antibody fragments, ligands, and the like, the antibody may be a monoclonal or polyclonal antibody, preferably from humans and animals. It may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, for example a monoclonal antibody.
  • Monoclonal antibodies can be prepared according to methods well known in the art. For example, it may be prepared using phage di spl ay technique.
  • Antibodies according to the invention include such mouse antibodies, chimeric antibodies.
  • the term / "comp 1 ement ar i ty determining region” refers to the amino acid sequence of the hypervar i able region of the light chain and light chain of immunoglobulin. it means.
  • the heavy and light chains may each comprise three CDRs (CDRHl, CDRH2, CDRH3 and CDRLl, CDRL2, CDRL3).
  • the CDRs can provide key contact residues for the antibody to bind antigen or epitope.
  • the term “specifically bind” or “specifically recognized” is the same as that commonly known to those skilled in the art, antigens and antibodies specifically interact with the immunological response It means.
  • binding fragment is a fragment thereof that refers to the entire structure of an immunoglobulin and refers to a portion of a polypeptide comprising a moiety to which an antigen can bind. ScFv, (scFv) 2. scFv -Fc, Fab.Fab 'or F (ab') 2, but is not limited thereto.
  • the anti-CA—XII antibody may be a monoclonal antibody.
  • Monoclonal antibodies can be prepared according to methods well known in the art. For example, it can be prepared using phage clisplay technique.
  • anti-CA-XII antibodies can be prepared as monoclonal antibodies derived from mice by conventional methods.
  • individual monoclonal antibodies can be screened based on their ability to bind to CA-XII using a typical EL ISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) format. Assays can be assayed for inhibitory activity through functional assays such as competitive ELISMCompetitive ELISAs or assays such as cell-based assays for assaying molecular interactions on conjugates.
  • the respective affinity (Kcl values) for CA— ⁇ is then assayed for selected monoclonal antibody members based on strong inhibitory activity.
  • the final selected antibodies can be prepared and used as humanized antibodies, as well as human immunoglobulin-antibodied antibodies, the remainder of which provides the antigen binding site.
  • Methods of making humanized antibodies are well known in the art (Almagr J. C. and Fransson, J., “Humanizat ion of ant i bodies,” Frontiers in Bioscience, 13 (2008), 1619-1633).
  • hybridomas that produce the anti-CA—XII antibodies.
  • the hybridoma is deposited as KCLRF— BP-00279 or I (aRF-BP-00280 may be one.
  • Another example provides an anti-CA-XII antibody or antigen-binding fragment thereof produced by the hybridoma.
  • CDR-H1. CDR-H2, CDR-H3, or a combination thereof of the anti-CA-XII antibody produced by the hybridoma
  • the light chain complementarity determining region CDR-Ll, CDR- L2, CDR-L3, or a combination thereof
  • the complementarity determining region may be determined by any conventional method, for example, IMGT definition (ht tp: // www. Imgt. Org / IMGT_vquest / share / text es /) or Cabat definition (http: // www.bioinf.org.uk/abs/), but is not limited thereto.
  • CA-XII antibodies or antibody fragments may bind with a variety of labeling agents, toxic substances or antitumor agents.
  • the antibodies of the invention by methods known in the art to one of ordinary skill in the art that it may be coupled to the pyojigi, toxin, or anti-tumor agents: clear. This combination is. After expression of the sieve or antigen. It is also possible to carry out chemically at the attachment site, or the binding product may be manipulated into the antibody or antigen of the present invention at the DNA level. Next, in the appropriate host system described below in the present specification, DNA is expressed and the expressed protein is recovered and regenerated as necessary. The linkage may be accomplished through a linker known in the art.
  • linkers which release toxins or anti-tumor agents under acidic or reducing conditions or upon exposure to certain proteases.
  • the label In certain embodiments, it is desirable to bind toxins, or anti-tumor agents, by spacer arms of various lengths and to reduce potential steric hindrance.
  • the labeling group may be selected from the group consisting of radioisotopes, haptens, fluorescent materials, chromogens and dyeing materials. Can be labeled, specifically, flags (FLAG), GFP, YFP, RFP, dTomato, cherry, Cy3. Cy5, Cy5.5, Cy7, DNP, AMCA. Biotin, Digoxigenin, Tamra. It is selected from Texas Red, Rhodamine, Arexa fluors, FITC, and TRITC.
  • the black marker may be a radioisotope such as 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, lllln, 1251, or 1311.
  • a new example of a suitable marker is an enzyme group (eg Western horseradish peroxy).
  • Azeotropin wasabi galactosidase, luciferase, alkaline phosphatase), chemiluminescent group, biotinyl group, or a second reporter, which is a predetermined polypeptide epitope
  • the toxic substance relates to any compound that is toxic to cells or organisms.
  • toxins are for example radioisotopes.
  • Small molecules, peptides, or proteins may be used.
  • Antibody black or antibody fragments can be combined with toxic substances to form a fusion protein.
  • Toxin proteins include lysine, saporin, gelonin, mororclin and diphtheria toxin . Or pseudomonas toxin.
  • Radioisotopes include, but are not limited to, 1311, 188Rh and 9OT.
  • anti-tumor agent specifies a drug capable of either stopping or delaying abnormal proliferation of tissue.
  • antitumor agents are particularly useful when treating cancer.
  • Antitumor agents are angiogenesis inhibitors, DNA inserters or DNA crosslinkers, DNA synthesis inhibitors, DNA-RNA transcription control factors, enzyme inhibitor gene control factors. Smile tube inhibitors, or other anti-tumor can best.
  • the present invention relates to a nucleic acid molecule encoding an antibody according to the present invention.
  • the nucleic acid molecule of the present invention which encodes the antibody of the present invention, is for example DNA.
  • a chimeric nucleic acid molecule produced by recombinant technology alone or in combination with any one of DNA or RNA produced by cDNA, RA or synthesis, or a nucleic acid molecule thereof may be used.
  • genomic DNA corresponding to fragments and derivatives thereof.
  • Amino acids of antibodies The nucleotide sequence may contain a single or a plurality of nucleotide substitutions, deletions or additions necessary to include nucleic acids encoding these sequences in which one amino acid is substituted in the sequence.
  • the nucleic acid molecule is a cDNA molecule.
  • One embodiment of the invention also relates to a vector comprising a nucleic acid molecule in an expressible form.
  • the vector of the present invention is, for example, a phage vector.
  • a plasmid vector, a viral vector or a retrovirus vector may also be used.
  • Retrovirus vectors may be replicable or may be replication deficient. In the latter case, virus propagation generally occurs in the complementing host / eel Is.
  • nucleic acid molecules cited above can be inserted into the vector to cause translational fusions called other polynucleotides.
  • a vector will have at least one replicator . It may contain ores and inheritance systems for cloning or expression, one or more markers for host selection, such as antibiotic resistance and one or more expression cassettes.
  • Suitable origins of replication include, for example, origins of replication of Col El, SV40 virus and M13.
  • Nucleic acid molecules detailed herein are introduced directly into the host.
  • Blacks can be designed for introduction via liposomes, phage vectors or viral vectors (eg adenovirus vectors, retrovirus vectors).
  • Baclovirus systems, or systems based on vaccinia virus or Semiki Forest virus, can also be used as eukaryotic expression systems for the nucleic acid molecules of the present invention. '
  • Another embodiment of the invention relates to a non-human host comprising a vector of the invention.
  • the host may be prokaryotic or eukaryotic.
  • the polynucleotide or vector of the present invention present in the host cell may be bound within the genome of the host cell, or may be maintained outside the chromosome.
  • the present invention can also be used to produce the antibodies of the present invention. It also relates to a transgenic non-human animal comprising one or more nucleic acid molecules of the invention. Produce antibodies in the tissues of goats, cattle, horses, butts, rats, mice, rabbits, hamsters or other mammals, or body fluids such as milk, blood or urine. It is also possible to recover from these.
  • the present invention also provides a method for producing a substance that selectively recognizes a CA-XII epitope and a producer for producing an antibody.
  • Antibodies or antibody fragments against the CA-XII epitope may comprise a portion of a CA-XII protein comprising a CA-XII protein, a CA-XII epitope, a CA-XII epitope, or a CA-XII epitope.
  • Cells expressing the site can be prepared by a conventional method using the antigen.
  • the method for producing CA-XII antibody comprises (a) a portion of CA-XII protein including an antigen-determining site of CA-XII protein, an antigen-determining site of CA-XII, and a CA—XII.
  • Isolation and purification of monoclonal antibodies can be carried out using affinity chromatography, such as ion exchange chromatography (DEAE or .DE52), anti-immunoglobulin column or protein A column, in culture supernatant or ascites.
  • affinity chromatography such as ion exchange chromatography (DEAE or .DE52), anti-immunoglobulin column or protein A column, in culture supernatant or ascites.
  • the epitope to which the antibody according to the present invention binds exhibits solid cancer specific expression. Therefore, CA-XII antibody can not only be useful for the detection of tumor cells, but also include toxic substances to specifically cytotoxicity only tumor cells.
  • Another example provides the use as a marker for the detection of solid cancer at the antigenic determinant site located in the non-catalytic region of CA-XII, specifically CA-XII. It provides a composition for detecting cancer stem cells of solid cancer comprising a substance interacting with the antigenic determination site.
  • the interacting material is CA-XII, specifically CA- Any substance capable of interacting with an antigenic determinant site located in the non-catalytic region of XI I, such as a chemical molecular molecule, an antibody, an antigen binding fragment of an antibody. It may be at least one selected from the group consisting of aptamers and the like.
  • the invention in another embodiment, relates to a diagnostic composition
  • a diagnostic composition comprising an antibody of the invention, a nucleic acid molecule of the invention, a vector of the invention or a host of the invention.
  • a composition is intended to define a composition comprising at least one antibody, nucleic acid molecule, vector and / or host of the invention.
  • the diagnostic composition of the present invention is the detection of undesirable or overexpression of CA, in particular CA—XI I, in a variety of cells, tissues or other suitable samples, the method comprising contacting a sample with an antibody of the invention and CA. It is particularly useful for detection, including detecting the presence of CA-XI I. Therefore, the diagnostic composition of the present invention may be used to assess the onset or disease state defined below.
  • malignant cells such as cancer cells expressing CA, particularly C / V-XI I, may be targeted with the antibody, antibody fragment or derivative of the present invention.
  • the cells bound by the antibodies of the present invention are therefore attacked by immune system functions such as the complement system or by cell mediated cytotoxicity, thus reducing the number of cells exhibiting undesired or missing expression of CA, in particular CA— ⁇ . Or are these cells eradicated.
  • the antibody, antibody fragment or derivative of the present invention is bound to a labeling group.
  • Such antibodies are particularly suitable for diagnostic applications.
  • the diagnostic composition of the present invention can be administered as the sole active agent. Or in combination with other agents.
  • Tumor cell test method is to (a) react the CA-XI I antibody to a sample containing tumor cells, and (b) determine a sample that shows a positive response to the antibody as a tumor.
  • the sample may be, but is not limited to, lymph, bone marrow, blood or blood cells.
  • the tumor cells are preferably breast cancer. Lung cancer, colon cancer, gastric cancer, prostate cancer, or liver cancer cells.
  • the CA-XI I antibody When examining tumor cells using the CA-XI I antibody, the CA-XI I antibody may be labeled with a substance capable of confirming antigen-antibody reactivity.
  • the materials that can be used include radioisotopes, fluorescent materials, luminescent materials, chromogens, or other dyeing materials.
  • CA-XI I antibody of the present invention may be provided as a diagnostic kit for diagnosing solid cancer.
  • the diagnostic kit may include, in addition to the CA-XI I antibody, antigen-antibody reaction detection means.
  • the detection means may be flow cytometry, immunohistochemical staining, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA), fluorescence immunoassay (Florescence immunoassay: FIA) and luminescence immunoassay (LIA) may be a conventional material for carrying out the method selected from the group consisting of. .
  • the marker means H Khorse radish peroxi dase (Enzyme)
  • the fluorescent material is FITC (Fluoresceinthi ocarbamyl ethylenedi amine)
  • the luminescent material is luminol, isoluminol and lucigenin (l ucigenin). This.
  • the radioisotope is 1251. 3H, 14C, and 1311, although not limited thereto.
  • the labeling means labeling by means of the enzyme substrate, fluorescence. 'Can be identified using tools for measuring luminescence or radiation.
  • the CA XI I antibodies can be prepared as ELISA kits or strip kits.
  • 27B6 and 4B4 antibody according to a specific embodiment of the present invention is not overlapping the antigen binding site, it is possible to bind together to one antigen. Therefore, sandwich ELSIA analysis of CA—XI I antigen and the like can be performed using the two antibodies, and in particular, it is more preferable to use 27B6 antibody as CAPTURE antibody and 4B4 antibody as DETECTOR antibody in sandwich ELISA analysis. .
  • the invention is an antibody of the invention.
  • a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid molecule of the invention, a vector of the invention or a host of the invention.
  • the antibody of the invention, the nucleic acid molecule of the invention, the vector of the invention or the host of the invention is for use in treating or inhibiting solid cancer.
  • Nucleic Acid Molecules of the Invention, Vectors or Bones of the Invention A method for treating or inhibiting solid cancer by administering an effective amount of a host of the invention to a subject in need thereof.
  • solid cancer is to define an abnormal mass of tissue that normally does not contain cysts or liquid regions.
  • Solid cancer includes both benign (not cancer) or malignant (often referred to in the art as cancer).
  • solid cancers to which the antibody according to the present invention is applicable include sarcomas, gliomas, cancer tumors, mesothelioma, lymphomas, kidney tumors, lung tumors, breast tumors, cervical tumors, ovarian tumors, colon rectal tumors, hepatic tumors, prostate tumors, Pancreatic tumors and head cervical tumors, preferably breast cancer.
  • the breast cancer preferably also includes triple negative breast cancers (TNBC), wherein the triple negative breast cancers include three types including HER2, estrogen receptor (ER), and 3 ⁇ 4 progesterone receptor (PR).
  • TNBC triple negative breast cancers
  • ER estrogen receptor
  • PR progesterone receptor
  • the lung cancer may be small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma of the lung.
  • the therapeutic effect is not only the growth inhibition (quantitative reduction), apoptos is effect, but also migration (migrat i on), invas ion of cancer cells (especially cancer stem cells) or cancer tissues including the same ), And metastasis is inhibited, thereby inhibiting the exacerbation of cancer.
  • subject or “patient” means a patient in need of alleviation, prevention and / or treatment of solid cancer, and may be any mammal, such as primates such as humans and monkeys, rodents such as mice and rats. And may be a patient having solid cancer, having symptoms of solid cancer, or at risk of developing solid cancer.
  • a therapeutic agent containing a CA-XI I antibody as an active ingredient is administered orally or parenterally, preferably parenterally, to a subject having tumor cells, that is, a human or an animal.
  • the therapeutic agent may include a pharmacologically acceptable excipient, the dosage of which is preferably adjusted according to the condition of the patient, for example
  • the formulation of the therapeutic agent may be, but is not limited to, a liquid, powder, emulsion, suspension or injection.
  • the onset is due to antibodies to the CA-XI I epitope, antibody fragments (F (ab ') 2,
  • Fab and Fv, etc. Fab and Fv, etc.
  • a ligand-conjugated group to provide a method for treating acute leukemia, chronic leukemia and lymphocytic lymphoma with blast crisis.
  • the antibody or antibody fragment is preferably selected from the group consisting of monoclonal or polyclonal antibodies, preferably from humans and animals.
  • the CA—XI I antibody or antibody fragment may further include the above-mentioned toxin.
  • Toxins can be fused, conjugated, bound, or linked to an antibody, which can be implemented by known techniques.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as the sole active agent or in combination with other agents, preferably in combination with those known to be suitable for the treatment of the disease in question.
  • other anticancer drugs such as chemotherapy. Excluding radiation therapy, cell therapy ⁇ Can be performed in parallel.
  • Various solid cancer therapeutic anticancer agents used in the chemotherapy or cell therapy may use known anticancer agents.
  • CA- ⁇ ⁇ Another example is CA- ⁇ ⁇ .
  • solid cancer therapeutic agent candidate by selecting the candidate compound that binds to the "key step, and the antigen-determining regions in contact with the candidate compound to an antigen determination site epitope portion positioned in the non-catalytic region of the CA-XI I It provides a screening method of a solid cancer therapeutic agent or inhibitor, comprising the step of. In another example. It provides a pharmaceutical composition for the treatment of solid cancer comprising the solid cancer screened as an active ingredient screened as described above.
  • the candidate compound may be artificially synthesized or naturally produced in various compounds, polypeptides, oligopeptides, peptide constructs or protein constructs (eg, antibodies, antigen-binding fragments of antibodies, peptibodies, nanobodies, etc.), It may be at least one selected from the group consisting of polynucleotides, oligonucleotides, antisense -RNA, short hairpin RNA (shRNA), small interference RNA (siRNA), aptamers, natural extracts.
  • polypeptides oligopeptides, peptide constructs or protein constructs
  • protein constructs eg, antibodies, antigen-binding fragments of antibodies, peptibodies, nanobodies, etc.
  • It may be at least one selected from the group consisting of polynucleotides, oligonucleotides, antisense -RNA, short hairpin RNA (shRNA), small interference RNA (siRNA), aptamers, natural extract
  • the binding of the candidate compound and the epitope may be performed by confirming the formation of the complex of the candidate compound and the epitope, which may be performed through various methods known in the art. For example, it can be measured by conventional enzymatic reaction, fluorescence, luminescence and / or radiation detection, and specifically, immunochromatography (Ichen unochromatography), immunohistochemical staining (Immunohistocheniistry), enzyme-linked immunosorbent assay (enzyme linked) immunosorbent assay: ELISA), radioimmunoassay i.e.
  • Radioimmunoassay RIA
  • enzyme immunoassays enzyme immunoassays
  • fluorescence immunoassay Floresence immunoassay: FIA
  • luminescent immunoassay luminescence ⁇ immunoassay: LiA
  • Western Blossom Ting It may be measured by a method selected from the group consisting of Western blotting, and the like, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to an antibody that recognizes and binds a carbonic anhydrous dehydrogenase, a nucleic acid molecule encoding the antibody: or antigen-binding fragment, a vector and host cell comprising the nucleic acid molecule, and a carbonic anhydrous dehydrogenase of the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • a disease for example solid cancer alleviation, prevention, treatment or diagnostic use.
  • FIG. 1 shows a semi-ungular test in peripheral blood of solid cancer specific mouse monoclonal antibody 27B6 according to Example 1.
  • Figure 2 shows a check is also 'antigen specificity and affinity of 27B6 chimeric antibodies results according to the second embodiment.
  • Figure 3 shows the antigen halftone screening process of mouse monoclonal antibody 4B4 according to Example 3.
  • Figure 4 shows the results confirming the antigen specificity and affinity of the 4B4 chimeric antibody according to Example 4.
  • Figures 5a, 5b and 5c shows the results of confirming the expression of the carboni c anhydrase 12 antigen of the 4B4 chimeric antibody in various breast cancer cells according to Example 6.
  • FIG. 6 is a result obtained by electrophoresis of a sample obtained by separating and purifying each antigen from pulmonary adenocarcinoma A549 cell line lysate using a column prepared with 27B6 chimeric antibody and 4B4 chimeric antibody according to Example 6.
  • FIG. 6 is a result obtained by electrophoresis of a sample obtained by separating and purifying each antigen from pulmonary adenocarcinoma A549 cell line lysate using a column prepared with 27B6 chimeric antibody and 4B4 chimeric antibody according to Example 6.
  • Figure 11 shows the results of confirming the antibody-dependent cytotoxic effect of the 27B6 chimeric antibody according to Example 9-1.
  • FIG. 13 shows antibody dependent cytotoxicity test of defucosylated 27B6 chimeric antibody in various solid cancer cell lines according to Example 10-1.
  • Figure 14 shows antibody dependent cytotoxicity test of Defucosyl ated 27B6, 4B4 chimeric antibody using Luc i ferase assay in breast cancer cell line according to Example 1.
  • FIG. 15 shows the results of confirming the expression level of CA XI I antigen and binding of 27B6 and 4B4 chimeric antibodies in trinegative breast cancer cell line according to Example 11.
  • FIG. 17 shows the results of the effectiveness of the 4B4 antibody against triple negative breast cancer according to Example 11.
  • FIG. 20 shows the results of the combination effect of the 27B6 antibody and the radiation treatment according to Example 13.
  • FIG. 21 shows test results of ELISA testing the binding capacity (af f ini ty) of CA-XI I of selected clones (phage di splayed scFv) according to Example 14.
  • FIG. FIG. 22 shows the sequence of the light chain variable region (VL) and CDR1 and CDR2 of 10 clones selected according to Example 14 (clone numbers # 1. 2. 8. 11, 15, 19, 22, 25, 26 and 30) Represents an array of.
  • Figure 25 shows binding confirmation of CA-XI I positive triple negative breast cancer cell line MDAMB-231 of humanized antibody DNP004 according to Example 15.
  • FIG. 26 is a photograph showing the results of physical property analysis using SDS-PAGE of an antibody candidate group according to Example 16.
  • FIG. 27 shows evaluation of the avidity of antibody candidate groups with CA XI I positive cell lines according to Example 16.
  • Figure 30 shows the results confirming the antibody-dependent cytotoxic effect of DNP004 humanized antibody in breast cancer cell line according to Example 18.
  • Figure 31 shows the results of confirming the antibody-dependent cytotoxic effect of the DNP004 humanized antibody in lung cancer cell line in accordance with Example 18.
  • Figure 32 shows the results of confirming the antibody-dependent cytotoxic effect of the DNP004 humanized antibody in liver cancer cell line in accordance with Example 18.
  • Figure 33 shows the results of confirming the antibody-dependent cytotoxic effect of the DNP004 humanized antibody in gastric cancer cell line according to Example 18.
  • FIG. 36 shows the results of confirming the anti-tumor effect of the DNP004 humanized antibody in the kidney cancer cell line mouse animal model according to Example 19.
  • FIG. 36 shows the results of confirming the anti-tumor effect of the DNP004 humanized antibody in the kidney cancer cell line mouse animal model according to Example 19.
  • the antibody was expressed in breast cancer, colorectal cancer, and prostate cancer as well as lung cancer, and was named as solid antibody specific antibodies 27B6 and 4B4.
  • solid cancer cell specific antibodies In order to prepare solid cancer cell specific antibodies, solid cancer cells were directly immunized to mice, and monoclonal antibodies against them were established by cell fusion method. Then, antigens that bind to solid cancer cell specific monoclonal antibodies were analyzed and identified.
  • lung adenocarcinoma cell line A549 (ATCC CCL-185) per 6-week-old Bal b / c female cut mouse was injected into mouse peritoneal cavity (IP; intraper i toneal cavi ty) by the number of lxlO 7 . Serum was isolated by injecting three times at three-week intervals and taking a blood sample from the vein.
  • A549 cell line As a result of confirming the titer of A549 cells by flow cytometry, it was confirmed that the sera immunized with A549 cells showed high positive for A549 cell line (not shown). Specifically, three days before cell fusion, 50 ug ant i-CA-XI I agoni st niAb was added to increase the immune response and A549 (ATCC CCL-185) was injected with the number of lxlO 7 antibodies to the A549 surface antigen. Induced to be amplified.
  • the myeloma cells and splenocytes were mixed at a ratio of 1: 5 and the supernatant was removed after centrifugation.
  • 1 ml of 50% PEGCpolyethylene glycol) 1500 preheated to 37 ° C. was slowly added over 1 minute. It was allowed to stand for about 1 minute and then diluted gradually by adding RPMI medium slowly. After centrifugation, RPMI containing ⁇ (20% FBS.hypoxant hi ne-am i nop er i n-1 hym idi ne) ° ⁇ was suspended and dispensed into 150-well wells in 96-well plates 37 ° C 5% were cultured in a C0 2 incubator.
  • the hybridoma cell line producing the 27B6 antibody was deposited with the Korean Cell Line Research Foundation, Cancer Research Institute, Seoul National University, addressed to 28, Yeongun-dong, Jongno-gu, Seoul, Korea, and received the accession number KCLRF—BP-00280. .
  • isotypi.ng uses rabbi t ant i -murine isotype specific antiseradgGl, IgG2a, IgG2b, igG3, IgM, IgA, Kappa, Lamda) and secondary antibody uses per oxidaseoxid label ' ed goat ant i -mouse IgG. Color reaction was induced using ortho-phenylenediamine (OPD) and hydrogen peroxide substrate, and the absorbance of 450 ⁇ was measured to confirm the value.
  • OPD ortho-phenylenediamine
  • the 27B6 monoclonal antibody was identified by the mouse IgGl / kappa light chain (result not shown).
  • the antibody cloning procedure is shown in FIG. Specifically, 27B6 antibody gene was cloned using Mouse Ig-Primer Set (Mi llipore, Cat. #: 69831). Perform PCR using Mouse Ig-Primer Set from RNA isolated from 27B6 hybridoma, insert it into pGeni-T vector (Pr omega, Cat. #: A3600), and check sequencing DNA sequence. Mouse antibody genes were identified through the IMGT site (www. Imgt.org).
  • the repetition variable region and light chain variable region sequences of the 27B6 Ab gene CDR sequence are shown in SEQ ID NOs: 12 and 13, and CDR1 to CDR of the heavy chain variable region.
  • CDR3 is shown in SEQ ID NOs: 6 to 8, respectively, and CDR1 to CDR3 of the light chain variable region are shown in SEQ ID NOs: 9 to 11, respectively (see Table 2 above).
  • HuIgFc DNA was transformed into CH0 cell-derived DHFR DG44 cell line, followed by selective culture exaggeration in selection medium to develop a stable cell iine expressing 27B6 recombinant antibody.
  • Detailed experimental method is as follows. First, inoculate lx 10 6 cells / ml in a 6-well plate 3 hours before transforming the DG44 cell line (Invitrogen, Cat No.
  • the selection process gradually increased the concentration of MTX and G418, but the selection period for each concentration was fixed at 3 weeks.
  • the screening process was completed with the adaptation process in Power CH0 medium containing 1000NM MTX and 400ug / ml G418, and the limiting dilution was established to establish the final cell line after the selection process. ) To obtain a single colony (single colony).
  • 27B6 pairing 3 ⁇ 4 was developed.
  • sandwich ELISA was implemented using chimeric 27B6 and mouse serum.
  • Human lung adenocarcinoma cell line A549 lxlO 7 cells were immunized in the abdominal cavity of 6-week old female mice at 3 week intervals and serum was taken in the same manner as described in Example ⁇ 1-2>.
  • chimeric 27B6 purified antibody was added to a microplate at a concentration of 100 ng / mL and coated at 37 ° C. for 1 hour.
  • a blocking buffer (sigma) was added at 200ul / well on a 27B6 coated microplate and blocked at 37 ° C for 1 hour.
  • A549 cells were prepared with lxlO 7 cells / ml concentration lysate using 1% NP40 lysis buffer. Prepared A549 lysate with 50LiL / well M roplate was added and reacted for 1 hour at 37 ° C. and washed three times with PBS.
  • the lung cancer cell line A549 positive and normal lung cell line are identical to the lung cancer cell line A549 positive and normal lung cell line
  • FIG. 3 shows antigenic halftone screening of 4B4 antibodies.
  • the hybridoma cell line producing the 4B4 antibody is deposited with the 14.02.2012 dated at Seoul National University, Korea Institute of Cancer Cell Line Research Foundation based in the Republic of Korea Jongno address 28 Yeongeon grant date 20/02/2012 accession number KCLRF-BP-00279 received.
  • 3-3 4B4 antibody analysis
  • the CDR amino acid sequence of the antibody was analyzed in substantially the same manner as in ⁇ Example 1-5>.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region sequences of the 4B4 antibody obtained in Example 3-2 were shown in SEQ ID NOs: 20 and 21, and CDR1 to CDR3 of the repeat variable region were shown in SEQ ID NOs: 14 to 16, respectively.
  • CDR1 to CDR3 of the light chain variable region are shown in SEQ ID NOs: 17 to 19, respectively (see Table 2 above).
  • a chimeric antibody was prepared in which the remaining portions except for the variable region were replaced with Fc of human IgGl, followed by antigen specificity. And affinity similar to the original mouse derived 4B4 antibody.
  • 4B4 chimeric antibody was prepared in the same manner as in ⁇ Example 2>. As a result, the antigen specificity and affinity of the developed 4B4 chimeric antibody were confirmed by flow cytometry. It was confirmed to be similar to the 4B4 antibody (FIG. 5). 5 shows antigen specificity and affinity of AB4 chimeric antibodies.
  • cancer cell lines were obtained through KCLB Korean Cell Line Bank) and SNlKSeoul National University), and L ⁇ 132, SW-900, DU145, LNCap, MCF— 7, Huh7, and Hs-578T were 10% heat inactivated fetal bovine serumCFBS; Dubco's MEM (GIBC0, invitrogen) medium with GIBCO invitrogen) was added to A549, NCI—H460. NCI-H417. DLD-1, HCT116, HT-29, SW-480, SW-620, LS174T, P03. SNU1. SNU638. SNU719.
  • MDA-MB453 was incubated using a RPMI 1640 (GIBCO, invitrogen) medium supplemented with 10% heat inactivated FBS at 37 ° C. using a 5% C0 2. incubator.
  • BT-20 contains Eagle's MEM (GIBC0, invitrogen) medium with 10% heat inactivated fetal bovine servine (FBS; GIBCO, invitrogen); KATO III contains 20% heat inactivated fetal bovine serurn ( 37 ° F using IMDM (GIBCO, invitrogen) medium supplemented with FBS; GIBCO, invitrogen) and ' Leibovitz's L-15 Medium with 10% heat inactivated fetal bovine serum (FBS; GIBCO, invitrogen) added to SW480, MDA-MB468 5% C0 at C 2 . Incubated with the incubator in the state ⁇
  • Table 5 shows the expression patterns for carbonic anhydrase 12 antigen in various solid cancer cell lines. Percent of positive cells of the 27B6 and 4B4 monoclonal antibodies in the test subject 5000 sepojeung in Table 16 were analyzed by FACS analysis, eu is the number of positive cells of 10% mimin ", is the number of positive cells, 1 ⁇ '30% range, ++ Is in the range of 30-70% positive cells. +++ indicates 70-100% of the positive cells, negative numbers of positive cells less than 10% indicated by-, and all of the above cells are determined to be positive.
  • the 27B6 and 4B4 monoclonal antibodies of the present invention show a difference in binding degree in various types of lung adenocarcinoma, colon cancer, gastric cancer, liver cancer and breast cancer cell lines, but positive response It confirmed that it represents. Whereas peripheral blood-derived lymphocytes and monocytes. The granulocytes all had negative reactions. This indicates that the 27B6 and 4B4 antibodies of the present invention can be used as therapeutic agents for solid cancers expressing CA XII antigens.
  • 27B6 and 4B4 have both positive reactions not only in ER.PR but also in HER2-positive breast cancer cells. Therefore, triple negative breast In addition to cancer, it can be used as a treatment for various types of breast cancer. Therefore, flow cytometry confirmed the binding of 27B6 and 4B4 monoclonal antibodies in three different phenotype breast cancer cell lines.
  • MCF-7 cells (breast cancer cell line, ER positive cell line) were treated with Dubco's MEKGIBCO, invitrogen medium supplemented with 10% heat inactivated fetal bovine serum (FBS; GIBCO. Invitrogen), MDA-MB23K malignant breast cancer cell line), SK- BR-3 cells (human breast cancer cell line that overexpresses the Her2 (Neu / ErbB-2) gene ⁇ product) from 10% to 5% at 37 ° C using the heat inactivated FBS are added RPMI 1640 (GIBCO, invitrogen) medium C0 2 . The culture was carried out using a state incubator.
  • FBS heat inactivated fetal bovine serum
  • SK- BR-3 cells human breast cancer cell line that overexpresses the Her2 (Neu / ErbB-2) gene ⁇ product
  • 27B6 and 4B4 antibodies according to the present invention because both ER, PR as well as HER2-positive breast cancer cells show positive response. As well as triple negative breast cancer It can also be used as a treatment for cancer.
  • Immunohistochemical staining of the 27B6 and 4B4 monoclonal antibodies of the present invention on the prepared cryosection tissues was as follows. ⁇ Thymus and tonsil cryosection tissues stored at ⁇ 20 ° C. were dried at room temperature for 30 to 60 minutes, and then in lx PBS. Soak for 60 minutes. Then 3% hydrogen peroxide intrinsic in the (3 ⁇ 40 2) banung for 10 minutes at room temperature peroxidase dajje running water after inhibiting the activity of the (per ox i sase) can Serra chlorine phase covering the tissue with a serum containing the derived immunoglobulin After reacting for 30 minutes at, nonspecific staining with mouse antibody was removed.
  • the primary antibody (27B6.4.4B4) was reacted for 60 minutes in the silver.
  • the concentration of antibody used is 10 ug / ml each.
  • HRP-conjugated goat ant i -mouse antibody (Dako, Denmark) was added and reacted at room temperature for 30 minutes, followed by washing with three times of lx PBST (0.05% Tween2C, lx PBS) for 5 minutes.
  • Amino Di aminobenz kline (DAB) was developed, washed with running water for 5 minutes, counterstained with hematoxyl in and washed with running water for 7 minutes. After staining, the slides were dehydrated and sealed, and the staining results were analyzed under a microscope.
  • the antigens recognized by the 27B6 and 4B4 monoclonal antibodies of the present invention were not distributed in normal thymus and tonsil tissues, and in particular, were not expressed in normal mature, immature T and B cells. .
  • the 27B6 antibody was weakly stained in the basal layer of the amygdala, but this may be a result of nonspecific binding.
  • Two antibody solutions were prepared by dialysis of 5 nig of purified 4B4 and 27B6 monoclonal antibodies in binding buffer (0.2 M sodium bicarbonate, 0.5 M sodium chloride, pH8.3).
  • NHS-Act ivated sepharose 4 Fast Flow resin (GE Healthcare) Pack 2 nils in a 5 nil column, wash with 20 ml of ImM HCl, and then re-bind with 20 ml of sodium bicarbonate, 0.5 M sodium chloride, pH8.3.
  • the prepared column out-let was blocked, and the prepared two antibody solutions were placed in each column, and the column in-let was blocked to react at room temperature for 4 hours.
  • washing buffer (20 niM Sodium acetate, 0.5M Sodium chloride, pH5.4) was poured to wash the column, and To remove the remaining reaction, 50 ml of blocking buffer (0.1M ethanol amine, 0.5M sodium chloride, pH8.3) was passed. The prepared two columns were kept in storage until use after 20 nil of preservation buffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.02% sodium azide, pH8.0) was poured.
  • elution buffer 0.3 M Glycine, 0.1 M sucrose, 0,1 3 Mannitol, 1.0 M urea, 0.5% Tween-80, and 20 nil of pH 3.0 solution were used. Second washing solution was used as a mixture of the elution buffer at 25% ratio in the wash buffer. Eluated solution obtained during antigen separation 20m: ' 5 ml of TCA was added to i ' and stored for 30 minutes. The precipitate was then obtained by centrifugation and further washed twice with aceron. The final precipitate was suspended in IX SDS—PAGE Sample buffer and subjected to electrophoresis and corgi staining. As described above, the antigens finally separated and purified by the columns prepared with the 4B4 and 27B6 antibodies are shown in FIG. 6. In FIG. 6. A column prepared with 4B4 and 27B6 monoclonal antibodies was used for electrophoresis.
  • Antigen isolated and purified by resin prepared by combining 4B4 and 27B6 monoclonal antibodies were identified as shown in FIG. About 58 kDa major protein bands, indicated by arrows, were identified to Seo-Ru Institute of Medicine. Sympathy is In-Gel Peptides were prepared by digestion and analyzed by LC-MS / MS. The results obtained were processed by PLGS (Waters) and MASCOT (Matrix Science). The series of analysis methods is as follows.
  • Gel protein was dehydrated with 10OT ACN (Acetonitrile) and completely dried using Speedvac. In the dried state, trypsin was added and digested for 15 minutes. Samples were extracted with 60% ACN, 0.1% TFA and concentrated to Speeclvac. Samples were dissolved in 20ul of 5% CAN, 0.2% TFA (Trifluoracetic acid) solution and analyzed by LOMS / MS.
  • 27B6 10 Act in gamma 41580 5.33 Among the analyzed results, it was confirmed that Carbonic anhydrase 12 was commonly identified in antigens purified by 4B4 and 27B6 monoclonal antibodies as expected and is known as a protein present on the cell surface. Because other proteins are proteins inside the cell, they cannot be antigens of 4B4 and 27B6 monoclonal antibodies, and are considered to be impurities included in incomplete 5J purification.
  • Peptide sequence isolated from 27B6 was QFLLTNNGHSVK (SEQ ID NO . 22).
  • 4 kinds of WTYFGPDGENSWSK (SEQ ID NO. 23), GQEAFVPGFNIEELLPER (SEQ ID NO: 24) and YKGQEAFVPGFNIEELLPER (SEQ ID NO: 25), and peptide sequences isolated at 4B4 were QFLLTNNGHSVK (SEQ ID NO: 22), EMINNFR (SEQ ID NO: 26), GVIYKPAT Number 27).
  • Dual QFLLTNNGHSVK sequences were analyzed in common in 4B4 and 27B6.
  • Figure 8 shows the peptide sequence of the amino acid sequence of Carbonic ahydrase " 12 precursor isoform 1 and analyzed in bold.
  • Figure 8 is a list of proteins identified by LC-MS / MS analysis of the purified purified antigen. According to Example 6, the protein sequence of the carbonic anhydrase 12 isoform 1 was analyzed based on the antigen peptide fragment detected by LC-MS / MS, indicating that the antigen recognized by the 27B6 and 4B4 antibodies was Carbonic anhydrase 12 isoforml.
  • Figure 7 shows the results of the ELISA assay that the antigen for the 4B4 and 27B6 monoclonal antibodies are Carbonic anhydrase 12.
  • 4B4 and 27B6 monoclonal antigen assay (western blotting)
  • Sandwich ELISA was performed as follows to compensate for this. Put 100ng per well of chimeric 4B4 or chimeric 27B6 monoclonal antibody per well on a Maxisrop ELISA plate, and react for 1 hour at 37 ° C to coat the antibody. 200 ul of lx blocking solution (sigma) per well Put and block reaction at 37 ° C for one hour. The recombinant protein Carbonic anhydrase 12 was diluted twice from 100 ng / nil in each well and reacted at 37 ° C.
  • Table 10 shows 27B6 and 4B4 monoclonal antibodies as Capture / Detector antibodies.
  • Table 10 shows 27B6 and 4B4 monoclonal antibodies as Capture / Detector antibodies.
  • both 27B6 and 4B3 ⁇ 4 monoclonal antibodies were simultaneously recognized by Carbonic anhydrase 12.
  • the pSec-Tag-CA XII full-hFc recombinant gene was used to generate a CA-XII mutant recombinant gene using restriction enzymes BamHI and Hindlll.
  • the entire nucleotide sequence of the CA-XII antigen and a hFc-coupled gene were inserted into pSec-Tag to prepare a CA-XII full-expressing hFc fusion protein.
  • deletion mutant_hFc was prepared from N-terminal to amino acid No. 300. It was.
  • PSec-Tag vector was inserted and transformed by inserting into CH0 cells using ViaFect (Promega). More specifically, the plated the day before each gene and V i aFect com i ex to a new medium. Sprinkled on the ground CH0 cells and incubated for 48 hours. Two days after the transfection, the culture supernatant was harvested to obtain human Fc (hF: c) l ; Expression was detected using a sandwich to be detected.
  • the antigen-binding site of the 27B6 antibody identified by the cleavage method in the above experimental result is APVNGSKWTYFGPD of SEQ ID NO: 2 (consisting of amino acids 25 to 38 of SEQ ID NO: 5), the three-dimensional crystal structure of CA XII
  • the preferred antigen-binding site which was reconfirmed on the basis of this, is the WTYFGPD of SEQ ID NO: 1 consisting of 7 amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (composed of amino acids 32 to 38 of SEQ ID NO).
  • the antigen-binding site of the 4 ⁇ 4 antibody confirmed by the cleavage method in the experimental result is SEQ ID NO.
  • GENSWSKKYPSCGGLLQSP of 4 (consists of amino acids 39 to 57 of SEQ ID NO: 5), and the preferred antigen-binding site ' : is again identified based on the three-dimensional crystal structure of CA XII. Consisting of GENSWSKKYPSCGG of SEQ ID NO: 3 (consisting of amino acids 39 to 52 of SEQ ID NO: 5).
  • A549 cells, a lung adenocarcinoma cell line, are dispensed in 96-well plates at 5 ⁇ 10 3 cel ls / well and incubated for 20-24 hours in a 37 ° C0 2 incubator. After removing the culture medium of each well, 10% human serum was mixed with RPMI medium containing fetal bovine serum to a final concentration of lOug / nil, and then mixed with lOOul of each well. Busy.
  • chimeric 27B6 and chimeric 4B4 monoclonal antibodies obtained in Examples 2 and 4 of the present invention showed complement-dependent cytotoxicity.
  • 8-2 CDC effect in triple negative breast cancer
  • Example 8-1> The treatment effect was evaluated in substantially the same manner as in ⁇ Example 8-1>, but instead of the A549 cell line as a target cell, a triple negative f ' cancer cell line MDAMB-231 was measured to measure absorbance at OD450nm.
  • Table 11 shows the results confirming that 4B4 chimeric antibody shows complement dependent cytotoxicity in triple negative breast cancer according to Example 8.
  • effector cells effector cell
  • Ficoll ficoll
  • PBMC Per ipher a ⁇ Blood Mononuclear Cell
  • HT29 colon cancer
  • A549 pulmonary adenocarcinoma
  • target cells as various solid cancer cell lines.
  • NCI-H460 pulmonary adenocarcinoma
  • MCF7 breast cancer
  • ⁇ ⁇ g / niL, 0.1 ⁇ g / mL, 1 3g / mL were prepared by Dodo Tok 3 ⁇ 4, which were dispensed by lOOul to the plate from which the culture medium was removed, and then reacted for 30 minutes in a 37 ° C incubator. to put such that each of 5 X 10 5 (50-fold of the target cells) per well and incubated, standing for 24 hours 37 ° C C0 2 in Kyubey Ata. As a positive control, lysis buffer was added and incubated at 37 ° C for 24 hours.
  • Effector cells were prepared in the same manner as in method 9-1 and subjected to antibody dependent cytotoxicity test. : 27B6 antibody.
  • the anti-triglyceride cancer cell lines MDAMB—231, MDAMB-468, MDAMB-453, and BT-20 cell lines which have not been developed for the present treatment, exhibit high antibody-dependent cytotoxic activity (FIG. 12). 12 shows the results of confirming the antibody-dependent cytotoxic effect of the triple negative breast cancer cell line of 27B6 antibody.
  • breast cancer cell lines MDAMB231 and SK-BR3, were plated at 1.25xl0 4 cel ls / wel 1 on 96well plates and incubated in 37 ° C C0 2 incubator for 20-24 hours.
  • RPMI containing 4% of low IgG FBS is added to the wells on which cells are plated.
  • 27B6. Dilute the 4B4 antibody to 3-fold at up to 10 ug / ml to prepare a diluted antibody sample using RPMI containing 4% low IgG FBS up to about 1.2 ng / ml. Each prepared antibody sample was added 25 ul to the well, and then the lid of the piate was closed and maintained in a clean bench.
  • ADCC reporter eel 1 (ADCC Reporter Bioassay, Pr omega) was harvested and suspended in RPMI containing 4% of low IgG FBS to 3xl0 6 cel ls / ml. After adding 25 ul of ADCC reporter and cell suspension to each well, incubate in 3? T CO 2 incubator for 24 hours. Before removing the plate, melt it in a pre-frozen luc if erase substrate * bath. After removing the plate and standing at room temperature for 15 minutes, 75ul of luc if erase substrate was added to each well, and then reacted for 30 minutes in the dark room. The luminescence was measured by using ieter on lumin. Defucosylated 27B6 using the Luc if erase assay. The antibody dependent cytotoxicity test result of 4B4 chimeric antibody is shown in FIG.
  • MDA—MB-231 and MDA—MB-453 cell lines which are triple negative breast cancer cell lines.
  • MDA-MB-231 and MDA-MB-453 cells were prepared with 1.5 X 10 8 (in RPMI: Matrigel mixture), and then inoculated subcutaneously into the right flank of the mouse and the control group. Randomized to test group.
  • FIG. 15 further shows cell surface binding of chimeric 27B6 of Example 2 and chimeric 4B4 antibodies of Example 4 to MDA-MB231 cells used in animal experiments
  • FIG. 16 shows results of animal experiments using the same.
  • Antibody administration inhibits the growth of cancer produced by the MDA-MB231 cell line and results in a decrease in size.
  • test substance was 27B6 fucose chimeric antibody, 27B6 defucose chimeric antibody, 4B4 fucose chimeric antibody 4B4 defucose chimeric antibody, 12 mg / kg per mouse was intraperitoneally administered 3 days after breast cancer cells were inoculated. ⁇ The frequency of administration of test substance shall be administered twice a week for 3 weeks and before tumor size twice a week.
  • the efficacy of Ant i-CA XI I ant ibodies against breast cancer is calculated by the following equation (a X b) / 2, where a is a short diameter and b is a long diameter.
  • the measurement results are shown in FIG. 18, and there was no promotion or inhibition of cell activity by antibody administration, and no inhibition of CA XII enzyme and no effect on tumor cell growth. Therefore, the antibody according to the present invention showed antitumor activity by ADCC, CDC through the immune system.
  • Example 13 Evaluation of Treatment Effect According to Antibody and Radiotherapy Combination It was confirmed whether the anticancer effect was increased when the antibody and the radiation therapy were treated together according to the present invention.
  • the cell killing effect of the A549 cancer cell line was measured by MTT assay.
  • the combined effect of radiation therapy As shown in FIG. 20, compared to the isotype control antibody and the radiation combination treatment as the antibody alone treatment or the negative control for the antibody, the results of killing the cancer cells at a high rate when the 27B6 and the radiation treatment were combined treatment were confirmed.
  • 4B4 chimeric antibody of the full IgG form obtained in Example 4 was converted to the scFv form for antibody screening by Ph.
  • the scFv was produced by combining the VL and VH sequence and the length of the linker was created, a number of constructs 1 igat to the phagemid vector.
  • the ligated plasmid vector was selected as the VH-long 1 inker -VL form of DNP004 scFv with the highest binding ability by using CA XII and antigen binding.
  • Bio-panning of CA XII was performed on the 11 sub libraries. After primary screening, 552 clones with high signal were selected in the VL region, and 78 clones with higher signal than mother clone were screened through secondary screening. After checking the nucleotide sequence, a total of 32 clones with different nucleotide sequences were selected.
  • the 32 selected clones were reconfirmed by the ELISA method for CA XII, and 10 clones with 1.5 times more than the 4B4 chimeric antibody with ELISA signal (clone ID 1.2, 4, 5, 8). , 15, 24. 25, 26, 28) were selected, and sequencing of these CDRs confirmed that there was a mutation in the LCDR1 and LCDR 2 portions (FIG. 22).
  • CHO cells were seeded in 96-well plates and transfected with miniprepped DNA of humanized clones.
  • Detailed experimental method is as follows.
  • Binding of humanized clones to antigen CA—XI I was tested in parallel using the protocol and antigen provided by HT Labs. Activity (affinity) was calculated for each clone and positive control (chimeric clone) on the same plate 4B4).
  • the antigen binding capacity of 10 variants (clone ID 1, 2, 4, 5, 8, 15, 24, 25, 26, 28) was not significantly higher than that of mother clone (4B4 chimeric).
  • the expected affinity of the mother clone appears to be about KD 10 10 M level, which is considerably high, even though the antigen binding capacity of the 10 candidate antibodies does not fall short of the mother clone. .
  • DNP004 humanized antibody gene is a humanized antibody using a light and heavy chain variable region gene of mouse monoclonal antibody 4B4 (Hybridoma Accession No .: KCLR.F-BP-00279) that specifically binds to CA-XII.
  • KCLR.F-BP-00279 mouse monoclonal antibody 4B4
  • 10 types of random mut at ion sub libraries or position specific mutation sub libraries were prepared for all or part of the variable region.
  • a total of 552 clones and individual clones were screened using the phage display method, and 78 clones showing higher signal than these clones were selected. As a result of sequencing, a total of 32 different clones were selected. As a result of re-confirming the binding capacity of 32 kinds of CA ⁇ , 10 clones with 1.5 times or more ELISA signal compared to mother clone were identified, and mostly mutations were found in LCDR1 and 2 parts. Therefore, 10 species were selected by judging the LCDR1 and 2 regions as hot-spots, and additionally, 4 species (11, 22, 19, and 30) having mutations in the LCDR2 region were selected for full IgGl conversion. The final 10 species were selected by ELISA after expression / purification of 10 species except for clone ID 4, 5, 24, 28 due to low expression.
  • antibody candidates of humanized antibody # 8 most similar to mouse monoclonal antibody 4B4 were selected.
  • Each candidate antibody identified the humanized antibody gene through sequencing, and the heavy and light chain variable regions of the analyzed DNP004 antibody.
  • the sequence is as follows (Table 13, Table 14).
  • the CDRs of the chain variable region may be the same or different, but the CDR sequences of the light chain variable region may be different.
  • the amino acids shown in bold in SEQ ID NO: 15 16. 28. 32 to 42 represent modified.
  • heavy chain expression plasmids and light chain expression plasmids were prepared, respectively.
  • the heavy chain expression plasmid was used as a pcDNA3.4 (Invitrogen) vector, and the light chain expression plasmid was used as a pOptiVEC (Invitrogen) vector.
  • variable region coding cDNA and the constant region coding cDNA of each antibody were synthesized (Bioneer).
  • the heavy and light chain expression genes thus synthesized were cut with the detailed enzymes Xho I and Sal I, and then the ligation gene fragments were ligation into the pcDNA3.4 vector and the light chain gene fragments into the pOpt i Vec vector, respectively.
  • PcDNA.3.4-4B4 heavy chain expression plasmid and P 0ptiVEC-4B4 light chain expression fulamid were cut with the detailed enzymes Xho I and Sal I, and then the ligation gene fragments were ligation into the pcDNA3.4 vector and the light chain gene fragments into the pOpt i Vec vector, respectively.
  • Each . 300niL of each culture was injected into protein A (GE Helthcare, Cat. No. 11-0034-93) and purified using an elution buffer (20 rnM citric buffer pH3.0).
  • the obtained antibody was dialyzed with phosphate buffered saline and quantified before and after dialysis to confirm the loss.
  • the expression level is 1.0 ⁇ showed a very large chaeo to 10.0 ug / niL range 25, and confirmed the high expression rate in the "# 26 mutant (Table 16).
  • FIG. 26 is a photograph showing the results of physical property analysis using SDS-PAGE of an antibody candidate group.
  • variant 15 was unclear in light chain staining, but in seven other variants, no abnormality was observed (FIG. 26). :
  • Each antibody was diluted with phosphate buffered saline, prepared at 1.0 ing / mL, and injected into 20 uL of TSKgel G3000SWXL (TOSOH) equilibrated with an equilibration buffer (0.1M sodium phosphate, 0.1M sodium chloride pH7.0).
  • the eluted protein was detected at a wavelength of 280 nni while the equilibration buffer was stirred for 40 minutes at a flow rate of 0.5 niL / min.
  • the detected peaks were integrated by automatic integration to calculate the area for each peak, and the area ratio of the main peak was described as a percentage.
  • Antibody variant ' Protein thermal shift dye at 0.44 ug and bufferdnvitrogen, Cat. No .: 4462263) was added according to the manufacturer's manual to prepare 20 uL of the mixture and injected into Real time PCR equipped with Protein Thermal Shift TM Software vl.O. Fluorescence values emitted by the binding between the protein thermal shift dye and the antibody were detected while continuously increasing the temperature from 25 ° C. to 95 ° C. at 0.05 ° C./sec. VA (trade name) after completion of the test
  • Variant No. 8 showed the highest main peak ratio at 62 ° C, and was determined to be the most robust variant as the Tm analysis value (Table 18).
  • MDAMB231 breast cancer cell line expressing CA XII antigen 10% heat inactivated Incubated in RPMI 1640 (GIBC0, invitrogen) with FBS, desorbed with Trypsine-EDTA (Invitrogen), washed with phosphate buffered saline and centrifuged. 10 6 cells / tube were dispensed.
  • Humanized antibody variants were added to each tube at a concentration of 1.0 ug / mL and reacted for 30 minutes in the intestine. After phosphate buffered saline was added and washed by centrifugation, FITC-labeled secondary antibody Goat ant i-Mouse IgG (H + U—FITC (Dinoni was added and refrigerated for 20 minutes in refrigeration). The cells were suspended in phosphate buffered saline with 1% formaldehyde and fluorescence was analyzed by flow cytometry (Stratedigiii, SlOOOEXi). Mean Fluorescence of 4B4 chimeric antibody bound to MDAMB231 cell line.
  • the binding force of the variants based on Intensity (MFI) is shown as a percentage in FIG. 28. All variants showed more than 90% relative ' binding force, and variants 8, 11, 15, and 26 showed 99% relative binding, showing little difference from chimeric antibodies (FIG. 27).
  • HT-29, LS174T, PC-3, SNU638, SNU719, MKN45, NCI-N87, SK-BR3, MDA-MB231, MDA—MB453 were prepared using RPMI 1640 (GIBCO, invitrogen) medium with 10% heat inactivated FBS. Incubated at 37 ° C. using a 5% C02 incubator. Hep3B.l-7 and PLC / PRF / 5 also contained Eagle's MEM (GIBC0, invitrogen) medium supplemented with 10% heat inactivated fetal bovine serum (FBS; GIBCO. Invitrogen), and KAT0 ⁇ was 20% heat inactivated fetal bovine serum. (FBS; GIBCO, 'mvi trogen ) 7 f the addition IMDIvKGIBCO, invitrogen) with the medium was added medium 5% C02 at 37 ° C. The culture was carried out using a state incubator.
  • RPMI 1640 GIBCO, invitrogen
  • the human cancer cell antibody (DNP004) of the present invention was added to the cultured cancer cell line, and then washed with PBS after reaction for 3 minutes at 4t for 30 minutes, followed by FiTC-conjugated goa !: anti-Huma IG (DiNona Inc, Korea). Incubate at 4 ° C for 15 minutes. Again washed with PBS and analyzed by FACSca liber (Bee ton Dickinson, USA) and the results are described below (Table 19). Table 19 below shows the expression patterns for carbonic anhydrase 12 antigen in various solid cancer cell lines.
  • Table 19 shows the expression patterns for carbonic anhydrase 12 antigen in various solid cancer cell lines.
  • the percentage of DNP004 positive cells was analyzed by FACS analysis. Of the 5000 cells, the percentage of DNP004 antibody-binding cells was calculated as%,-less than 10% positive cells, and + 10 positive cells. ⁇ 30% range. ++ ranges from 30% to 70% of positive cells, and +++ specifies 70% of
  • Granulocyte As described in Table 19, even if the cells of the same origin, because the Tissue source is different when constructing the cell line, the degree of positive reaction may vary depending on the cell type, but the humanized antibody DNP004 of the present invention has various types of lung Cancer, colon cancer, stomach cancer. Hepatic and breast cancer cell lines showed a difference in the degree of binding, but showed positive reactions, and prostate cancer showed negative reactions. On the other hand, peripheral blood-derived lymphocytes, monocytes, and granulocytes showed negative responses. These results indicate that the humanized antibody DNP004 of the present invention can be used as a therapeutic agent for sympathetic solid cancers.
  • DNP004 antibody shows positive reaction not only in ER and PR but also in breast cancer cell which is HER2 positive. Thus, as well as triple negative breast cancer. It can also be used to treat various types of breast cancer. Flow cytometry was used to determine whether DNP004 humanized antibodies bind to three different phenotype breast cancer cell lines. We compared chimeric 4B4 with the degree of binding.
  • MDAMB '231 and MDAMB453, MCF-7 and S-BR-3 cell lines were cultured in the same manner as in ⁇ Example 5-2>.
  • the culture of a humanized antibody DNP004 put on each cancer cell and then washed with PBS at 4 ° C 30 bungan banung, FITC-conjugated goat ant i- Human IgG 15 bungan incubated at 4 ° C into a (DiNona Inc, Korea) It was. After washing with PBS again, it was analyzed by FACS caliber (Bee ton Dickinson. USA) and the results are shown in FIGS. 28 and 29.
  • DNP004 humanized antibody according to the present invention can be used as a therapeutic agent in various types of breast cancer as well as triple negative breast cancer since it shows both positive reactions not only in ER and PR but also in HER2: positive breast cancer cells. '
  • MKN-45 was plated at 1.25 x 10 4 eel ls / well in 96- ⁇ vell piate and incubated for 20-24 hours in a 37 ° C C0 2 incubator.
  • Example 15 DNP004 humanized antibody was diluted 3-fold at up to 10 ug / ml down to about 1.2 ng / ml Prepare diluted antibody samples using RPMI containing 4% low IgG FBS. Each prepared antibody sample was added to the wells according to the concentrations, and the plate was capped and kept in a clean bench.
  • ADCC reporter eel 1 ADCC Reporter Bi 5 oassay, Pr omega
  • 25 ul of ADCC reporter cell suspension was added to each well, followed by incubation for 24 hours in a 37 ° C CO 2 incubator.
  • FIG. 30 humanized DNP004.
  • Antibody-dependent cytotoxic effect of the antibody in breast cancer cell line Figure 31 shows the antibody-dependent cytotoxic effect of the lung cancer cell line A549 of DNP004 humanized hingche
  • Figure 32 shows the liver cancer cell lines Huh7 and HEP3B of the DNP004 humanized antibody
  • Figure 33 shows the results of confirming the antibody-dependent cytotoxic effect in the gastric cancer cell lines KAT0 ⁇ II, SNU719, MKN-45 of the DNP004 humanized antibody.
  • the DNP004 humanized antibody according to the present invention has demonstrated that there is an apoptosis mechanism due to antibody dependent cytotoxic effect in various types of solid cancer cells expressing DNP004 antigen (CA XII, Carbonic anhydrase XII).
  • mice were randomly divided into a control group (5) and a treatment group (5), and 10 mg / kg of DNP004 humanized antibody was added to the treatment group.
  • the tumor was measured twice a week at intervals of 3-4 days during the experiment, the tumor growth curve was from the start of the antibody administration to the end of the experiment, the average value of the results are shown in Figure 34a. Therefore, the humanized antibody administration group showed the result that most tumor growth is suppressed (FIG. 34).
  • mice were administered to each group of the antibody-administered group (group) administered at a concentration of 4 as 32 mg / kg.
  • the antibody administration group of 16 mg / kg dose partial tumor inhibition showing the effect did not show tumor inhibiting effect as a whole in a dose and proportion, tumor sexual characteristics eu of the complete response is completely inhibited (compl ete remi ss i on) state The result is that the higher the dose over / antibody lucifer. There was a tendency to increase (FIG. 35, Table 20).
  • the mouse animal model was established and anti-tumor effect was confirmed using 786-0 cells, a renal cell cancer cell line expressing the target antigen (CA-XII) of humanized antibody (DNP004) (FIG. 36). .
  • nude mice were injected subcutaneously with a 786-0 cell line with a 1.5 ⁇ 10 7 cell number.
  • tumors' formed were been made very late, unlike the case of the above breast cancer cell line, the tumor formed was identified after about 70 days.
  • the amount of 32 mg / kg of the DNP004 humanized antibody was administered intravenously by mouse twist.
  • the tumors were measured twice a week at intervals of 3-4 days during the experiment, and the tumor growth curve was measured from the start of the antibody administration to the end of the experiment. Tumor growth curves are shown in FIG. 36. Therefore, the anticancer effect of DNP004 humanized antibody was confirmed not only in breast cancer but also in kidney cancer.

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Abstract

본 발명은 탄산탈수소화 효소를 인식하고 결합하는 항체, 상기 항체 또는 항원결합단편을 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 백터 및 숙주세포 및 상기 항체 또는 이의 항원결합단편의 고형암 경감, 예방, 치료 또는 진단 용도에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
탄산탈수소 효소에 결합하는 항체 및 이의 용도 【기술분야】
본 발명은 탄산탈수소 효소를 인식하고 결합하는 항체. 상기 항체 또는 항원결합단편을 코딩하는 핵산분자， 상기 핵산분자를 포함하는 백터 및 숙주세포 및 상기 항체 또는 항원결합단편의 탄산탈수소 효소 관련 질병， 예를 들면 고형암 경감, 예방. 치료 또는 진단 용도에 관한 것이다.
【배경기술】
탄산탈수소 효소 (Carbonic anhydrase, CA)는 탄산수소염 및 플로톤으로의 탄산의 가역적 수화를 *매하여， 이와 같이 생체 내의 pH 항상성의 유지에 관여하는 효소 패밀리에 속하는 효소이다. 대부분의 탄산탈수소 효소는 활성 부위에 아연 이온을 함유하기 때문에. 이들은 금속 효소와 분류된다.
탄산탈스소 효소의 패밀리는 ¾ 개의 그룹으로 구분되며. 적어도 5의 특이한 CA서브 패밀리가 있다 ( α , β , γ , δ . ε ). α— 탄산탈수소효소 (CA)는 포유동물에 있어서 볼 수 있다. α-CA효소는 4개의 넓은 소그룹， 즉 세포질 기질 CA(CA-I, CA-II, CA-III, CA-VI I 및 CA-ΧΙΠ), 미토콘드리아 CA(CA-VA 및 CA-VB) , 분비 CA( CA-VI) 및 막 결합형 CA CA-IV. CA-IX. CA-XII, CA-XIV 및 CA— XV)로 분류된다.
CA-II,' CA-IX 및 CA-XII는 종양과 관련되어 있어 이들은 다양한 종양에 대한 잠재적인 조직학적이고 예후적인 바이오마커이다 [Nordfors et al. (2010), BMC cancer； 10： 148] . CA-II는 가장 광범위하게 발현되어 있는. α-CA유전자 패밀리의 멤버이며 인간 조직 및 장기에서도 실질적으로 존재한다. 막관통 효소인 CA-IX는 여러 종류의 사람 암종양 및 정상 위장 조직에 있어서 발현하는 종양 관련 항원으로 인지되었다. CA-IX는 세포 접착， 분화. 증식 및 발암 프로세스에 기능적으로 관련되어 있어 그 효소 활성은 CA-I I에 필적한다. 다른 막관통 CA 아이소자임인 CA-XI I는 정상 신장 조직 및 신장 세포 암종양에 있어서 최초로 발견되었다. 새로운 연구에 의해 CA-XI I는 기타 몇 개의 종양 [Ulmasov , B .， (2000) . i cat ion and kinet i c analys i s of recombinant CA XI I， a membrane carboni c anhydrase overexpressed in certain cancers . Proc Nat 1 Acad Sc i USA 97， 14212-1421기에 있어서 그러나 결장 및 자궁 등의 몇 개의 정상 장기에 있어서도 발현하고 있는 것이 나타났다. 특히 저산소 조건 하에서 종양에서는 CA— I I , CA-IX 및 CA-XI I가 고발현하고 있는 것에서 이들의 효소가 세포 외 공간의 산성화에 의해 촉진되는 침윤 프로세스에 기능적으로 관여할 가능성이 있는 것이 또한 시사되어 있다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 일예는 탄산탈수소 효소에 결합하는 항체 및 이의 항원결합단편에 관한 것이다.
본 발명의 일예는， 상기 항체 또는 항원결합단편을 코딩하는 핵산분자. 상기 핵산분자를 포함하는 백터 및 숙주세포에 관한 것이다.
본 발명의 일예ᅵ ， 상기. 항체, 핵산분자， 백터， 및 /ΪΕ는 숙주세포를 포함하는 탄산탈수소 효소 관련 질흰의 탐지 또는 진단 방법， 또는 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명의 일예는, 상기 항체， 핵산분자， 백터, 및 /또는 숙주세포를 포함하는 탄산탈수소 효소 관련 질환의 예방, 치료， 또는 경감용 조성물 또는 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일예는, 상기 항체, 핵산분자, 백터， 및 /또는 숙주세포를 포함하는 조성물을 탄산탈수소 효소 관련 질환을 갖는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는. 탄산탈수소 효소 관련 질환의 예방. 치료， 또는 경감방법에 관한 것이다.
본 발명의 일예는. 상기 항체, 핵산분자， 백터. 및 /또는 숙주세포를 포함하는 고형암 또는 고형암 세포의 크기를 감소시키거나 종양 퇴화를 유도 또는 촉진용 조성물, 또는 방법에 관한 것이다.
【기술적 해결방법】
본 발명은 탄산탈수소 효소를 인식하고 결합하는 항체, 상기 항체 또는 항원결합단편을 코딩하는 핵산분자， 상기 핵산분자를 포함하는 백터 및 숙주세포 및 상기 항체 또는 이의 항원결합단편의 CA-XI I 양성인 고형암의 경감， 예방, 치료 또는 진단 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항체는 탄산탈수소 효소를 특이적으로 인식하고 결합하는 항체이다. 구체적으로， 본 발명의 항체는 CA— XI I에 결합하며, 구체적으로는 항체가 결합하는 부위인 항원 결정부위는 N—말단에 위치하는 CA-XI I의 비촉매적 부위 (non-catalyt ic region)이다. 상기 CA-XI I는 사람 유래 효소인 것이 바람직하다. 구체적으로, 사람 유래 CA-XI I의 아미노산 서열을 서열번호 5에 나타낸다.
본 발명에 의한 "촉매 도메인 "이란 용어는 당해 기술 분야에 있어서 주지의 용어이며 한층 더 또한 본 발명과의 균형에서는 탄산에서 중탄산염 및 폴로톤으로의 촉매가 발생하는 · , CA-XI I의 영역에 관한 것이다. 이에 본 발명에 따른 "비촉매적 도메인''이리ᅳ 함은 상기 탄산에서 증탄산염 및 플로론으로의 촉매가 발생하는 영역인 촉매 도메인 이외의 영역을 말한다. 본 명세서에서, 상기 CA-XI I의 비촉매적 도메인은 N-말단의 비촉매적 도메인이며， 바람직하게는 상기 비촉매적 부위는 사람 유래 CA-XI I 이소타입 I의 아미노산 서열 (서열번호 5)에서 N-말단의 1번 내지 93번 아미노산으로 구성된 펩타이드 또는 이의 단편을 의미할 수 있다.
본 발명에 따른 항체가 결합하는 항원의 부위는 상기 비촉매적 부위 또는 이의 단편일 수 있으며, 즉 사람 유래 CA— XI I 이소타입 I의 아미노산 서열 (서열번호 5)에서 N-말단의 1번 내지 93번 아미노산으로 구성된 텝타이드 또는 이의 단편 . 서열번호 5의 아미노산 서열 중에서 N-말단의 25번 내지 93번， 또는 25번 내지 57번 아미노산으로 구성된 펩타이드 또는 이의 단편일 수 있다.
구체적인 예로서， 본 발명에 따른 항체가 결합하는 항원의 부위 또는 항원결정부위 (epi tope)는 서열번호 1， 서열번호 2， 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 연속적인 7개 아미노산 내지 93개 아미노산 길이， 7개 아미노산 내지 69개 아미노산 길이， 7개 아미노산 내지 33개 아미노산 길이， 14개 아미노산 내지 93개 아미노산 길이, 14개 아미노산 내지 69개 아미노산 길이， 14개 아미노산 내지 33개 아미노산 길이, 19개 아미노산 내지 93개 아미노산 길이, 19개 아미노산 내지 69개 아미노산 길이， 또는 19개 아미노산 내지 33개 아미노산 길이를 갖는 펩타이드일 수 있다.
더욱 구체적으로ᅳ 상기 항체가 결합하는 항원의 부위 또는 항체의 항원결정부위 (epi tope)는. 서열번호 5의 아미노산 서열 중에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하며 연속하는 7개 아미노산 내지 93개 아미노산의 길이 또는 7개 아미노산 내지 69개 아미노산 길이를 갖는 펩타이드일 수 있으며 . 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열 증에서 서열번호 2의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하며 연속하는 14개 야미노산 내지 93개 아미노산의 길이 또는 14개 아미노산 내지 69개 아미노산 길이를 갖는 펩타이드, 더욱 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열중에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 연속하는 7개 내지 14개 아미노산의 길이를ᅵ 갖는 펩타이드， 가장 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
사람 유래 CA-XI I의 아미노산 서열인 서열번호 5의 아미노산 서열 중에서, 서열번호 1의 아미노산 서열은 32번 내지 38번 아미노산을 포함하며， 서열번호 2의 아미노산 서열은 25번 내지 38번 아미노산을 포함한다.
또는. 상기 항체가 결합하는 항원의 부위 또는 항체의 항원결정부위 (epi tope)는， 서열번호 5의 아미노산 서열 중에서 서열번호 3의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하며 연속하는 14개 아미노산 내지 93개 아미노산의 길이 또는 14개 아미노산 내지 69개 아미노산 길이를 갖는 펩타이드일 수 있으며， 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열 중에서 서열번호 4의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하며 연속하는 19개 아미노산 내지 93개 아미노산의 길이 또는 19개 아미노산 내지 69개 아미노산 길이를 갖는 펩타이드, 더욱 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열 중에서 서열번호 3의 아미노산 서열올 필수적으로 포함하는 연속하는 14개 내지 19개 아미노산의 길이를 갖는 펩타이드， 가장 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
사람 유래 CA-XI I의 아미노산 서열인 서열번호 5의 아미노산 서열 중에서， 서열번호 3의 아미노산 서열은 39번 내지 52번 아미노산을 포함하며， 서열번호 4의 아미노산 서열은 39번 내지 57번 아미노산을 포함한다.
본 발명에서 항원인 사람 유래 CA— XI I의 아미노산 서열인 서열번호 5의 아미노산 서열과， 서열번호 1 내지 4의 항원결정부위 아미노산 서열을 하기 표 1에 정리한다 .
[표 1]
-1 아미노산 서열 서열 번호
¾ΓΤίί Λόᅳ Γᅳ i WTYFGPD 1
Humani zed 27B6
항원결정부위 APVNGSKWTYFGPD 2 Humani zed 27B6
항원결정부위 GENSWSKKYPSCGG 3 Humani zed 4B4
항원결정부위 GENSWSK YPSCGGLLQSP 4 Humani zed 4B4
사람 유래 CA XI I의 MPRRSLHAAAVLLLV I LKEQPSSPAPVNGSKWTYFGPDGENSWSK 5 아미노산 서열 KYPSCGGLLQSP I DLHSD I LQYDASLTPLEFQGYNLSANKQFLLT
NNGHSVKLNLPSDMH I QGLQSRYSATQLHLHWGNPNDPHGSEHTV SGQHFAAELH I VHYNSDLYPDASTASNKSEGLAVLAVL I EMGSFN PSYDK I FSHLQHVKYKGQEAFVPGFN I EELLPERTAEYYRYRGSL
TTPPCNPTVLWTVFRNPVQ I SQEQLLALETALYCTHMDDPSPREM I NNFRQVQKFDERLVYTSFSQVQVCTAAGLSLG 1 1 LSLALAG I LG I C I VVVVS I WLFRRKS I KKGDNKGV I YKPATKMETEAHA 본 발명에 따른 항체는 탄산탈수소화 효소의 비촉매적 부위를 특이적으로 인식하고 결합하는 항체로 마우스 항체， 키메릭 항체 또는 인간화 항체를 포함한다. 탄산탈수소화 효소의 비촉매적 부위는 사람 유래 CA-XI I 이소타입 I의 아미노산 서열 (서열번호 5)에서 N-말단의 1번 내지 93번 아미노산으로 구성된 펩타이드 또는 이의 단편， 25번 내지 93번 아미노산으로 구성된 펩타이드， 또는 25번 내지 57번 아미노산으로 구성된 펩타이드 또는 이들 펩타이드의 단편일 수 있다.
상기 항체의 일예는. 사람 유래 CA-XI I 이소타입 I의 아미노산 서열 (서열번호 5)에서 N-말단의 1번 내지 93번 아미노산으로 구성된 펩타이드. , 또는 서열번호 5의 아미노산 서열 중에서 서열번호 1 . 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 펩타이드 단편에 결합할 수 있다.
본 발명의 일예에서 , 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 결합하는 항체로서， 상기 항체의 일예는 수탁번호 KCLRF— BP— 00280 하이브리도마 세포에 의해서 생산된 항체의 중쇄 가변부위의 CDR1 내지 CDR 3과 경쇄 가변부위의 CDR1 내지 CDR3을 포함할 수 있다. 상기 하이브리도마 세포주는 대한민국 서울시 종로구 연건동 28에 주소를 둔 서울대학교 암연구소 한국세포주연구재단에 2012.02. 14일자로 기탁하여 2012.02.20일자 수탁번호 KCLRF-BP-00280을 부여받았다. 상기 수탁번호 KCLRF-BP-00280 하이브리도마가 생산하는 항체를 27B6으로 명명하며. 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 항체의 일예는 서열번호 6 내지 8의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역의 CDR 및 서열번호 9 내지 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL영역의 CDR 로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있 며， 바람직하게는 VH 영역의 CDR를 결정하는 아미노산 서열로서 서열번호 6(CDR1) , 서열번호 7CCDR2) 및 서열번호 8(CDR3) 및 /또는 VL 영역의 CDR를 결정하는 아미노산 서열인 서열번호 9(CDR1) , 서열번호 10 CDR2) 및 서열번호 1KCDR3)의 아미노산 서열을 포함한다ᅳ 또한， 본 발명에 따른 항체는 서열번호 12의 아미노산을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함할 수 있다.
상기 항체의 일예는， 사람 유래 CA-XI I 이소타입 I의 아미노산 서열 (서열번호 5)에서 N-말단의 1번 내지 93번 아미노산으로 구성된 펩타이드, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열 중에서 서열번호 3， 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 펩타이드 단편에 결합할 수 있다ᅳ
본 발명의 일예에서， 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 결합하는 항체로서 상기 항체의 일예는 수탁번호 KCLRFᅳ BP- 00279 하어브리도마 세포에 의해서 생산된 항체의 중쇄. 가변부위의 CDR1 ' 내시 CDR 3과 경쇄 가변부위의 CDR1 내지 CDR3을 포함할 수 있다. 상기 하이브리도마 세포주는 대한민국 서을시 종로구 연건동 28에 주소를 둔 서을대학교 암연구소 한국세포주연구재단에 2012.02. 14일자로 기탁하여 2012.02.20일자 수탁번호 KCLRF-BP— 00279을 부여받았다. 상기 수탁번호 KCLRF— BP— 00279를 갖는 하이브리도마가 생산하는 항체를 4B4으로 명명하며， 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체이다.
구체적으로. 본 발명에 따른 항체의 일예는 서열번호 14 내지 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 및 서열번호 17 내지 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 CDR을 포함하는 항체일 수 있으며， 바람직하게는 VH 영역의 CDR를 결정하는 아미노산 서열로서 서열번호 14(CDR1) , 서열번호 15 CDR2 ) 및 서열번호 16 CDR3) 및 /또는 VL 영역의 CDR를 결정하는 아미노산 서열인 서열번호 17(CDR1 ) , 서열번호 18(CDR2) 및 서열번호 19( CDR3)의 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 20의 아미노산을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함할 수 있다. 상기 마우스 항체 또는 키메릭 항체의 일예에 따른 CDR 서열과 가변영역 서열을 하기 표에 정리한다.
【표 2】
Figure imgf000010_0001
4B4 ν,, DIVMTQMPS VPVTPGESVS ISCRSSKSLL HSNGNTYLYW FLQRPGQSPQ 21
LLIYRMSNLA SGVPDRFSGS GSGTAFTLRI SRVEAEDVGV YYCMQHLEYP
FTFGSGTKLE I 본 발명의 구체적 일예에 따라 서열번호 1을 포함하는 항원결정부위에 결합하는 항체와， 서열번호 3을 포함하는 항원결정부위에 결합하는 항체는 하나의 항원에 함께 결합 가능하다. 따라서 , 상기 두 가지 항체를 사용하여 CA-XI I 항원에 대한 샌드위치 ELSIA 분석 등을 수행할 수 있으며， 특히 샌드위치 ELISA 분석에서 서열번호 1을 포함하는 항원결정부위에 결합하는 항체， 예를 들면 27B6 항체를 CAPTURE 항체로， 서열번호 3을 포함하는 항원결정부위에 결합하는 항체, 예를 들면 4B4 항체를 DETECTOR 항체로 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따라 CA-XI I 항원에 결합하는 인간화 항체 (이하， DNP004라 함)는 CA-XI I에 특이적으로 결합하는 마우스 단클론 항체 4B4(수탁번호 KCLRF-BP— 00279〉의 경쇄 및 중쇄 가변영역 유전자를 주형으로 제작한 항체로서， 일예는 서열번호 14， 15 및 28의 아미노산 서열올 포함하는 VH 영역의 CDR 및 서열번호 29 , 30 및 31의 아미노산 서열을 포함하는 ¼,영역의 CDR 로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 .서열을 포함하는 항체일 수 있다.
서열번호 29 : ASSXiVTY (X1=P or S)
서열번호 30 : X2TSX3LX4X5 (X2=A , G or R ; X3=S , R , H , Q , D , E , M ; X4=A . V， I or M ; X5=P or S)
상기 항체의 VL영역의 CDRl은 서열번호 29의 일반식으로 표현되며 . 구체적인일예는 서열번호 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함할 수 있고， VL영역의 CDR2는 서열번호 30의 일반식으로 표현되며， 구체적인 일예는 서열번호 33 내지 42로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 인간화 항체 (DNP004)의 일예에 따른 CDR 서열과 가변영역 서열을 하기 표에 정리한다. 하기 표 3의 서열번호 32번 내지 42번 서열에서. 진하게 표시한 부분은 변형된 아미노산 서열을 나타낸다.
【표 3】
Figure imgf000012_0001
본 발명에 따른 인간화 항체 (DNP004)의 알예가 포함하는 프레임 워크 서열을 하기 표 4에 정리하며. 상기 항체는 중쇄 가변영역 프레임워크 1 내지 4 및 경쇄 가변영역 프레임워크 1 내지 4의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 프레임워크서열을 포함하는 항체일 수 있다. 중쇄 가변영역의 프레임 워크 1 내지 4의 아미노산 서열은 각각 서열번호 43 내지 46을 포함할 수 있으며, 경쇄 가변영역의 프레임워크 1 내지 4의 아미노산 서열은 각각 서열번호 47， 48 , 51 및 52를 .포함할 수 있다. 상기 경쇄 가변영역의 프레임워크 2는 서열번호 48의 일반식으로 표현되며, 구체적인 일예는 서열번호 49 또는 50의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
서열번호 48 : MHWYX6QKPGKAPX7PWIY (X6= Q or H ; H7=R or )
상기 인간화 항체 (DNP004)의 일예에 따른 프레임워크 서열을 하기 표에 정리한다.
【표 4】
Figure imgf000013_0001
일 예로서， 본 발명에 따른 인간화 항체 (DNP004)는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역과， 서열번호 54 내지 63으로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 인간화 항체 (DNP004)는 도 31에 나타낸 바와 같이 키메릭 4B4 항체보다 항원 결합력이 높은 항체를 후보군중에서 선정하였으며 (실시예 16)， 이는 다양한 세포주에서도 보다 높은 세포 결합력을 나타내어 (실시예 18)， 마우스 또는 키메릭 항체에 내재된 면역원성 가능성을 상당히 감소시킴과 함께， 인간화 항체 (DNP004)가 키메릭 4B4 항체보다 우월함을 나타낸다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편은, 종양 퇴화 ( tumor regress ion) 활성 및 _종양 세포주에 대해 직접적인 억제 효과를 갖는 갖는다. 본 명세서에서 종양의 퇴화는 종양 크기의 감소 및 /또는 종양 세포의 성장 저해， 중단 또는 감소 등을 유도 또는 촉진하는 것을 포함한다. 종양의 크기 감소는 예를 들면， 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 처리하기 전을 100%를 기준으로， 상기 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 투여한 경우에 얻어진 종양의 크기가 97%이하， 95%이하ᅳ 90%이하， 85%이하， 80%이하， 75% 이하의 크기를 갖는 경우 등을 들 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 항체-의존성 세포매개성 세포독성 ( ADCC， Ant i body-dependent ee l 1 -medi ated cytotoxi c i ty)과 보체계 의존 (CDC , omp 1 ement -dependent cytotoxi c i ty)을 가진다.
본 발명에 따른 항체는 항체에 결합된 당잔기인 FUCOSE를 일부 또는 전부 제거한 것일 수 있다. 본 발명에 따른 푸코오스 제거 항체도.
고형암에 대한 성징- 억제 및 종양 뢰화 활성을 유지한다. 일예에서
27B6항체와 4B4항체 모두 clef ucose형태의 항체가 fucose형태의 항체에 비해 종양에 대한 효능이 우수하다 (도 14. 17참조) . 본 발명에 따른. 항체 또는 항원 결합 단편은 생체에서 분리된 (생체에 존재하지 않는) 것 또는 비자연적으로 생산 (non-natural ly occurr ing)된 ¾일 수 있으며, 예컨대ᅳ 합성적 또는 유전공학기술로 생산된 것일 수 있다. 상기한 방법은 공지의 기술로 용이하게 실시할 수 있다.
또한 본 발명은 CA-XI I 항원결정부위를 인지하는 물질을 제공한다. 이 물질은 항체， 항체 절편， 리간드 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며， 항체는 단클른 또는 다클론 항체일 수 있으며， 바람직하기로는 사람과 동물에서 기원한 것이다. 다클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있으며， 예컨대， 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage di spl ay 기법을 이용해서 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 상기 마우스 항체, 키메릭 항체를 포함한다.
용어 / "CDR(comp 1 ement ar i ty determining region) "은 면역글로불린의 증쇄 및 경쇄의 고가변 영역 (hypervar i able region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다 (CDRHl, CDRH2, CDRH3 및 CDRLl, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편， 본 명세서에 있어서， 용어， "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식 "은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서， 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다 .
용어, "항원. 결합 단편' '은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분올 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어， scFv, (scFv)2. scFv-Fc , Fab. Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나， 이에 한정되지 않는다.
상기 항 CA— XII 항체는 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대， phage clisplay 기법을 이용해서 제조될 수 있디ᅳ. 또는, 항 CA-XII 항체는 이용해서 통상의 방법에 의하여 마우스 유래의 단클론 항체로 제조될 수 있다. 한편， 전형적인 EL ISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 포맷을 이용하여 CA-XII와의 결합능에 기초하여 개별 단클론 항체들을 스크리닝할 수 있디 . 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적 ELISMCompetitive ELISA)와 같은 기능상 분석 또는 세포 -기반 분석 (cell— based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론항체 멤버들에 대해 CA— ΧΠ에 대한 각각의 친화도 (Kcl values)를 검정한다. 최종 선택된 항체들은 항원결합부를 제의한 나머지 부분이 인간의 면역글로블린 항체화된 항체뿐만 아니라， 인간화 항체로서 제조하여 사용할 수 있다. 인간화 항체의 제조방법은 당 업계에 잘 알려져 있다 (Almagr으 J. C. and Fransson, J., "Humanizat ion of ant i bodies , " Frontiers in Bioscience, 13(2008)， 1619-1633).
다른 예는 상기 항 CA— XII 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다. 구체예에 있어서， 상기 하이브리도마는 기탁번호 KCLRF— BP-00279 또는 I(aRF-BP-00280인 것일 수 있다.
다른 예는 상기 하이브리도마가 생산하는 항 CA-XII 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다.
다른 예는 상기 하이브리도마가 생산하는 항 CA-XII 항체의 중쇄 상보성결정부위 (CDR-H1. CDR-H2, CDR-H3, 또는 이들의 조합)， 경쇄 상보성결정부위 (CDR-Ll, CDR-L2, CDR-L3, 또는 이들의 조합), 또는 이들의 조합; 또는 상기 하이브리도마가 생산하는 항 CA-XII 항체의 중쇄 가변영역， 경쇄 가변영역， 또는 이들의 조합을 포함하는 항 CA-XII 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다. 이 때， 상기 상보성결정부위는 통상적인 모든 방법에 의하여 결정될 수 있으며, 예컨대， IMGT definition (ht tp： // www . imgt . org/ IMGT_vquest / share/ text es/ ) 또는 Cabat definition (http: //www. bioinf .org.uk/abs/)에 의하여 결정될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
CA-XII 항체 또는 항체 절편은 다양한 표지기 (labeling agent), 독성 물질 또는 항종양제와 결합할 수 있다. 당해 기술 분야에 있어서 주지 방법에 의해 본 발명의 항체는 상기 표지기， 독소, 또는 항종양제와 결합될 수 있는 것은 당업자에게: 분명하다. 이러한 결합은 . 체 또는 항원의 발현 후. 부착부위에 화학적으로 수행하는 것도 가능하고， 혹은 DNA 레벨로 본 발명의 항체 또는 항원 내에 결합 산물을 조작해 넣어도 괜찮다. 이어서 본 명세서에 있어서 이하로 기재하는 적절한 숙주계에 있어서 DNA를 발현시키고 그리고 발현시킨 단백질을 회수해， 필요에 따라 재생시킨다. 결합은 당해 기술 수준에 있어서 알려진 링커를 통해 달성해도 괜찮다. 특히 이 기술과 함께 산성 조건 혹은 환원 조건 하에서 또는 특정 프로테아제에 대한 노출시에 독소 또는 항종양제를 방출하는， 다양한 링커를 이용할 수 있다. 특정 양태에 있어서는 표지기. 독소, 또는 항종양 약제를 다양한 길이의 스페이서 암에 의해 결합시키고 잠재적인 입체 장애를 감소시키는 것이 바람직한 경우도 있다.
상기 표지기로서는 방사선동위원소， 합텐， 형광 물질, 크로모젠 (chromogen) 및 염색 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 물질들로 표지될 수 있으며， 구체적으로， 플래그 (FLAG), GFP, YFP, RFP, d토마토 (dTomato), 체리 (cherry), Cy3. Cy5, Cy5.5, Cy7, DNP, AMCA. 비오틴, 디곡시게닌, 탐라 (Tamra). 텍사스 레드, 로다민, 아레크사 플로우 (Alexa fluors), FITC, TRITC에서 선택된다. 흑은 표지기는 예를 들면 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, lllln, 1251， 또는 1311 등의 방사성 동위체 있어도 괜찮다ᅳ 적절한 표지기의 새로운 예는 효소기 (예를 들면 서양 호스래디시 페록시다아제， 서양 와사비 갈락토시다제， 루시페라제， 알칼리포스파타아제), 화학 발광기， 비오티닐기， 또는 제 2의 리포터에 의해 인식된다， 미리 결정된 폴리펩타이드 에피토프이다
상기 독성 물질로서는 세포 또는 생물에 대해서 독성을 가지는 임의의 화합물에 관한다. 따라서， 독소는 예를 들면 방사선동위원소. 소분자， 펩타이드, 또는 단백질이라도 좋다. 항체 흑은 항체 절편은 독성 물질들과 결합되어 융합단백 (fusion protein)을 형성할 수 있다. 독소 단백질로는 리신 (ricin), 사포린 (sapor in)， 젤로닌 (gelonin)， 모로딘 (moniorclin)， 디프테리아독소? 또는 녹농균독소 (pseudomonas toxin)일 수 있으며. 방사선동위원소로는 1311, 188Rh와 9OT가 있으나, 이에 한정돠는 것은 아니다.
상기 "항종양제" 용어는 본 발명에 의하면 조직의 이상 증식을 정지시키거나 또는 지연시키는지 어느 하나가 가능한 약제를 특정한다. 따라서， 항종양제는 특히 암을 치료할 때 유용하다. 항종양제는 혈관 신생 저해제, DNA 삽입제 혹은 DNA 가교제， DNA 합성 저해제， DNA-RNA 전사 제어인자， 효소 저해제 유전자 제어인자. 미소관 저해제, 또는 기타 항종양제일 수'있다.
본 발명은 본 발명에 의한 항체를 코드하는 핵산 분자에 관한다. 본 발명의 항체를 코드하는, 본 발명의 핵산 분자는 예를 들면 DNA. cDNA, R A 또는 합성에 의해 산생되는 DNA 혹은 RNA, 혹은 이들의 핵산 분자의 어느 하나를 단독으로 또는 조합해 포함한 재조합 기술에 의해 산생되는 키메라 핵산 분자라도 좋다ᅳ 핵산 분자는 또한 유전자 전체 혹은 그 상당 부분, 또는 그 단편 및 유도체에 대응하는 게놈 DNA라도 좋다. 항체의 아미노산 서열중에서 하나의 아미노산이 치환되어 있는 이들 서열을 코드하는 핵산을 포함하는데 필요한 단일 또는 복수의 뉴클레오타이드 치환， 결실 또는 부가를 뉴클레오타이드 서열이 함유해도 무방하다. 본 발명의 특히 바람직한 실시 형태에 있어서는 핵산 분자는 cDNA 분자이다.
본 발명의 일실시 형태는 또한 핵산 분자가 발현 가능한 형태로 포함한 백터에도 관한다. 본 발명의 백터는 예를 들면 파지 백터. 플라스미드 백터, 바이러스 백터 또는 레트로바이러스 백터라도 좋다. 레트로바이러스 백터는 복제 가능해도 괜찮고 혹은 복제 결손이라도 좋다. 후자의 경우， 바이러스 증식은 일반적으로 보완 숙주 /세포 (complementing host /eel Is)에서 발생한다.
상기에 인용하는 핵산 분자를 다른 폴리뉴클레오타이드라는 번역 융합이 발생하도록， 백터 내에 삽입할 수 있다. 일반적으로 백터는 1 이상의 복제 기.점 (ori) 및 클로닝 또는 발현에 관한 유전계 (inheritance systems for cloning or expression) , 숙주의 선택을 위한 1 이상의 마커， 예를 들면 항생 물질 내성 및 1 이상의 발현 카세트를 함유할 수 있다. 적절한 복제 기점 (ori)에는 예를 들면 Col El, SV40 바이러스 및 M13의 복제 기점이 포함된다.
본 명세서에 있어서 상술하는 핵산 분자는 숙주로의 직접 도입. 흑은 리포좀， 파지 백터 또는 바이러스 벡터 (예를 들면 아데노바이러스 백터 , 레트로바이러스 백터)를 통한 도입을 위해서 설계될 수 있다. 또한 바클로바이러스 시스템, 또는 백시니어 바이러스 혹은 셈리키 포레스트 바이러스에 기초한 시스템을 본 발명의 핵산 분자를 위한 진핵생물 발현 시스템으로 이용할 수 있다. '
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 백터를 포함한 비인간 숙주에 관한다. 상기 숙주는 원핵세포 또는 진핵세포라도 좋다. 숙주 세포 중에 존재하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 백터는 숙주 세포의 게놈 내에 결합되고 있어도 괜찮고 혹은 염색체 외로 유지되어 있어도 어느 것이라도 좋다ᅳ
본 발명은 또한 본 발명의 항체를 생산하는데 이용될 수 있는， 본 발명의 1 이상의 핵산 분자를 포함한 유전자이식 비인간 동물에도 관한다. 염소， 소， 말, 부타, 래트， 마우스, 토끼， 햄스터 또는 기타 포유동물의 조직, 또는 우유， 혈액 혹은 소변 등의 체액에 있어서 항체를 생산해. 이들에서 회수하는 것도 가능하다.
또한， 본 발명은 CA-XII 항원결정부위를 선택적으로 인지하는 물질을 생산하는 방법과ᅳ 항체를 생산하는 생산주를 제공한다. CA— XII의 항원결정부위에 대한 항체 또는 항체 절편은 CA-XII 단백질， CA-XII의 항원결정부위， CA-XII의 항원결정부위를 포함하는 CA-XII 단백질 일부， 또는 CA-XII의 항원결정부위를 발현하는 세포를 항원으로 이용하여 통상의 방법으로 제조가능 하다. 일례로, CA-XII 항체 제조방법은， (a) CA-XII 단백질， CA-XII의 항원결정부위, CA— XII의 항원결정부위를 포함하는 CA-XII 단백질 일부. 또는 CA-XII의 항원결정부위를 발현하는 '세포를 동물에 주입하여 면역화 시키는 단계, (b) CA— XII에 특이적인 항체를 생산하는 비장세포를 수득하는 단계 및 (c) 상기 비장세포를 골수종세포와 융합 시켜， CA— XII에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 선별하는 단계를 포함하는 CA-XII 항체를 생산하는 생산주 제조방법으로 통하여 실시가능 하다. 상기 생산주는 생체외 (in vitro)에서 배양하거나, 생체내 주입하여 항체를 분리할 수 있다. 일례로. 마우스의 복강내에 삽입하고 복수로부터 분리， 정제한다. 단클론 항체의 분리 및 정제는 배양 상층액 또는 복수를 이온교환 크로마토그래피 (DEAE 또는 . DE52 등)， 항 면역글로불린 칼럼 또는 프로테인 A 컬럼 등의 친화성 크로마토그래피를 이용하여 실시할 수가 있다. 본 발명에 따른 항체가 결합하는 항원결정부위는 고형암 특이적인 발현을 나타낸다'. 따라서ᅳ CA-XII 항체는 종양세포의 검출에 유용하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라 독성물질을 포함시켜 종양세포만 특이적으로 세포살상 (cytotoxicity) 시킬 수 있다.
다른 예는 CA-XII, 구체적으로 CA-XII의 비촉매적 영역에 위치하는 항원결정부위의 고형암의 검출을 위한 마커로서의 용도를 제공한다. 항원결정부위와 상호작용하는 물질을 포함하는 고형암의 암줄기세포 검출용 조성물을 제공한다. 상기 상호작용하는 물질은 CA-XII, 구체적으로 CA- XI I의 비촉매적 영역쎄 위치하는 항원결정부위와 상호작용 가능한 모든 물질, 예컨대， 화학물질 (smal l molecular chemi cal ) , 항체， 항체의 항원결합단편. 앱타머 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서 본 발명은 본 발명의 항체, 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 백터 또는 본 발명의 숙주를 포함한 진단 조성물에 관한다. 본 명세서에 있어서 이용되는 조성물이라 함은 본 발명의 적어도 하나의 항체， 핵산 분자， 백터 및 /또는 숙주를 포함한 조성물을 정의하는 것이다. 본 발명 진단 조성물은 다양한 세포， 조직 또는 다른 적절한 시료에 있어서의, CA , 특히 CA— XI I의 바람직하지 않은 발현 또는 과잉 발현의 검출로서， 시료를 본 발명의 항체와 접촉시키는 것 및 시료에 있어서 CA. 특히 CA-XI I의 존재를 검출하는 것을 포함한 검출에 유용하다. 따라서， 본 발명 진단 조성물을 이하로 정의히-는 발병 또는 질환상태를 평자하기 위해 이용해도 괜찮다. 특히 CA, 특히 C/V-XI I를 발현하는, 암 세포 등의 악성 세포를 본 발명의 항체， 항체 단편 또는 유도체로 타겟팅해도 괜찮다. 본 발명의 항체가 결합한 세포는 그러므로 보체계 등의 면역계 기능에 의해 또는 세포 매개성 세포 독성에 의해 공격되고 따라서， CA, 특히 CA— ΧΠ의 바람직하지 않은 발현 또는^라잉 발현을 나타내는 세포의 수가 감소하거니 또는 이러한 세포가 근절된디' .
본 발명의 일 양태에 있어서는 본 발명의 항체， 항체 단편 또는 유도체를 표지기에 결합시킨다. 이러한 항체는 진단 애플리케이션에 특히 적합하다.
본 발명 진단 조성물은 단독 활성 약제로서 투여 할 수 있고. 또는 다른 약제와 조합하여 투여될 수 있다.
종양세포 검사방법은 (a) CA-XI I 항체를 종양세포를 포함하는 시료에 반웅시키고, (b) 상기 항체에 대하여 양성반응을 나타내는 시료를 종양으로 판단하는 것이다. 상기 시료는 림프액, 골수, 혈액 또는 혈구일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 종양세포는 바람직하기로는 유방암. 폐암, 대장암, 위암, 전립선암， 또는 간암 세포일 수 있다.
상기 CA-XI I 항체를 이용하여 종양세포를 검사하는 경우， 상기 CA- XI I 항체는 항원 -항체 반응성을 확인할 수 있는 물질로 표지된 것일 수 있다. 사용가능한 상기 물질로는 방사성동위원소, 형광물질, 발광물질, 크로모젠 (chromogen) , 또는 기타 염색 물질 등이 있다.
또한 본 발명의 CA-XI I 항체는 고형암을 진단하기 위한 진단키트로 제공될 수 있다.
상기 진단키트는 CA-XI I 항체 이외에, 항원-항체반웅 검출수단을 포함할 수 있다. 상기 검출수단은 유세포측정， 면역조직화학염색， 효소결합 면역톱착 분석 (enzyme l inked immunosorbent assay: ELISA) , 방사선 면역측정법 (radi oimmunoassay : RIA)， 효소 면역분석 (enzyme immunoassay : EIA) , 형광면역분석 (Florescence immunoassay: FIA) 및 발광면역분석 ( luminescence immunoassay: LIA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 실시하기 위한 통상의 물질 일 수 있다. . 즉, 표지수단으로는 효소의 경우 H Khorse radi sh peroxi dase)가 있으며， 형광물질로는 FITC (Fluoresceinthi ocarbamyl ethylenedi amine)가， 발광물질로는 루미놀 ( luminol ) , 이소루미놀 및 루시게닌 ( l ucigenin)이. 방사선 동위원소로는 1251 . 3H , 14C 및 1311가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 표지수단에: 의한 표지여부는 효소의 기질이나, 형광. '발광 또는 방사선을 측정하기 위한 도구를 이용하여 확인 가능하다. 일예로 CA XI I 항체는 ELISA 키트 또는 스트립 키트로 제조될 수 있다.
본 발명의 구체적 일예에 따른 27B6와 4B4항체는 항원결합부위가 중첩되어 있지 아니하여, 하나의 항원에 함께 결합 가능하다. 따라서, 상기 두 가지 항체를 사용하여 CA— XI I 항원에 대한 샌드위치 ELSIA 분석 등을 수행할 수 있으며， 특히 샌드위치 ELISA 분석에서 27B6 항체를 CAPTURE 항체로, 4B4 항체를 DETECTOR 항체로 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
일 실시예에서 본 발명은 본 발명의 항체. 본 발명의 핵산 분자， 본 발명의 백터 또는 본 발명의 숙주를 포함한 의약 조성물에 관한다. 본 발명의 일실시 형태에 의하면 본 발명의 항체, 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 백터 또는 본 발명의 숙주는 고형암을 치료 또는 저해하는데 이용하기 위한 것이다. 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 백터 또는 본 발명의 숙주의 유효량을 투여의 필요가 있는 대상으로 투여함으로써 고형암을 치료 또는 저해하기 위한 방법이다.
본 발명에 의한 "고형암" 용어는 낭포 또는 액체 영역을 통상은 함유하지 않는 조직의 비정상인 덩어리를 정의하는 것이다. 고형암은 양성 (암이 아니다) 또는 악성 (자주 당해 기술 분야에 있어서 암이라고 칭해진다)를 모두 포함한다. 본 발명에 따른 항체를 적용 가능한 고형암의 예는 육종， 신경교종, 암종양， 중피종， 임파종, 신장 종양, 폐종양， 유방 종양， 자궁 경부 종양, 난소 종양, 결장 직장 종양， 간장 종양, 전립선 종양， 췌장 종양 및 머리 경부 종양에서 선택되며, 바람직하게는 유방암. 폐암, 대장암， 위암, 전립선암， 또는 간암이다. 상기 유방암은 바람직하게는 삼중음성 유방암 (Tr iple— negat ive breast cancers (TNBC) )도 포함하며, 상기 삼중음성 유방암은 HER2 , estrogen receptor (ER) , ;¾ progesterone receptor (PR)을 포함하는 3가지 유방암 진단 마커에 의해서도 모두 음성으로 검출되는 유방암으로서 검출이 매우 어려운 문제점이 있다. 상기 폐암은 소.세포폐암, 비소세포폐암， 폐의 선암， 폐의 편평상피암일 수 있다.
■ 상기 고형암의: 치료 효과는 암세포 (특히, 암줄기세포) 또는 이를 포함하는 암조직의 성장 억제 (양적 감소)， 사¾ (apoptos i s) 효과뿐 아니라， 이동 (migrat i on)， 침습 ( invas ion) , 전이 (metastas i s) 등을 억제하여 이로 인한 암의 악화를 억제하는 효과를 포함한다.
본 명세서에서， "대상" 또는 "환자"는 고형암의 경감, 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 환자를 의미하는 것으로, 모든 포유류, 예컨대 인간, 원숭이 등의 영장류， 마우스， 래트 등의 설치류일 수 있고, 고형암을 앓고 있거나 고형암의 증상을 갖거나， 고형암 발병의 위험이 있는 환자일 수 있다.
본 발명에 따른 항체 혹은 항체 절편의 투여는 허용된 모든 약물 투여방법에 의해 시행될 수 있다. 구체적으로 예를 들면, CA-XI I 항체를 유효성분으로 포함하는 치료제를 종양세포를 갖는 대상， 즉 인간 또는 동물에 경구 또는 비경구, 바람직하기로는 비경구로 투여하는 것이다. 상기 치료제는 약리학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있으며, 이의 투여량은 환자의 상태에 따라 적절히 조절하는 것이 바람직하나， 일예로
1일 3 mg 내지 6 , 000 mg 일 수 있다. 치료제의 제형은 액제， 산제, 유제, 현탁제 또는 주사제일 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발병은 CA-XI I 항원결정부위에 대한 항체, 항체 절편 (F(ab ' )2 ,
Fab 및 Fv 등)， 및 리간드 이뤄진 군에서 선택된 항체를 이용하여 급성 백혈병， 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종을 치료하는 방법을 제공한다.
항체 혹은 항체 절편은 바람직하기는 단클론 또는 다클론 항체로 이루어진 군에서 선택되며， 바람직하기로는 사람과 동물에서 기원한 것이다. 상기 CA— XI I 항체 또는 항체 절편은 상기에서 언급한 독소물질이 더욱 포함된 것일 수 있다. 독소물질은 항체에 융합, 접합， 결합， 또는 링크될 수 있으며， 이는 공지의 기술로 실시가능 하다.
본 발명의 의약 조성물은 단독 활성 약제로서 투여해도 괜찮고 또는 기타 약제와 조합하고， 바람직하게는 당해 기술 분야쎄 있어서 문제의 질환의 치료에 적합한 것이 알려지는 것과 조합해 투여해도 괜찮다. 또한, 본 발명의 항체를 투여하는 방법은， 다른 항암차료, 예를 들면 화학적 요법 . 방사선 요법, 세포치료제외■ 병행하여 수행할 수 있디 · . 상기 화학적 요법 또는 세포 치료제에 사용되는 다양한 고형암 치료 항암제는 알려진 항암제를 사용할 수 있다.
다른 예는 CA-ΧΙ Γ . 구체적으로 CA-XI I의 비촉매적 영역에 위치하는 항원결정부위 항원결정부위에 후보 화합물을 접촉시 '키는 단계, 및 상기 항원결정부위에 결합하는 후보 화합물을 선택하여 고형암 치료제 후보물질로 결정하는 단계를 포함하는， 고형암 치료제 또는 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다. 다른 예에서. 상기와 같이 스크리닝된 고형암 치료제를 유효성분으로 포함하는 고형암의 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 후보 화합물은 인공적으로 합성되거나 천연의 각종 화합물, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드， 펩타이드 구조체 또는 단백질 구조체 (예컨대 , 항체 , 항체의 항원 결합 단편， 펩티바디， 나노바디， 등) , 폴리뉴클레오타이드， 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 -RNA, shRNA( short hairpin RNA), siRNA( small interference RNA), 압타머， 천연물 추출물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 후보 화합물과 항원결정부위의 결합은 후보 화합물과 항원결정부위의 복합체 형성을 확인함으로써 수행될 수 있으며, 이는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예컨대 통상적인 효소 반응， 형광, 발광 및 /또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며， 구체적으로， 면역크로마토그래피 (I隱 unochromatography), 면역조직화학염색 (Immunohistocheniistry), 효소결합 면역흡착 분석 (enzyme linked immunosorbent assay: ELISA) , 방사선 면역즉정법 (radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석 (enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석 (Floresence immunoassay: FIA) , 발광면역분석 (luminescence■ immunoassay: LiA) , 웨스턴블라팅 (Western blotting) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
·
【발명의 효과】
. 본 발명은 탄산탈수소 효소를 인식하고 결합하는 항체, 상기 항체 ： 또는 항원결합단편을 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 백터 및 숙주세포 및 상기 항체 또는 이의 항원결합단편의 탄산탈수소화 효소 관련 질병, 예를 들면 고형암 경감, 예방， 치료 또는 진단 용도에 관한 것이다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 실시예 1에 따라 고형암 특이적인 마우스 단클론 항체 27B6의 말초혈액에서의 반웅도 검사를 나타낸다.
도 2는 실시예 2에 따라 27B6 키메릭 항체의 항원 특이성 및 친화도' 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 실시예 3에 따른 마우스 단클론 항체 4B4의 항원 반웅도 스크리닝 과정을 나타낸다. 도 4는 실시예 4에 따라 4B4 키메릭 항체의 항원 특이성 및 친화도 확인한 결과를 나타낸다.
도 5a， 5b 및 5c는 실시예 6에 따라 다양한 유방암 세포에서 4B4 키메릭 항체의 Carboni c anhydrase 12 항원에 대한 발현 양상을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 실시예 6에 따라 27B6 키메릭 항체 및 4B4 키메릭 항체로 제작한 칼럼으로 폐선암 A549 세포주 용해물에서 각각의 항원을 분리정제 하여 얻은 시료를 전기영동으로 확인한 결과이다.
도. 7은 실시예 6에 따라 마우스 단클론 항체 4B4 및 마우스 단클론 항체 27B6에 대한 항원이 Carboni c anhydrase 12라는 것을 ELISA assay로 검증한 결과이다.
도 8은 실시예 76 따라 미.우스 단클론 항체 4B4 및 마우스 단클론 항체 27B6에 대한 항원이 Carboni c anhydrase 12라는 것을 Western blot t ing assay로 검증한 결과이디 ·
도 9는 실시예 7에 따라 마우스 단클론 항체 27B6 및 마우스 단클론 항체
4B4의 에피토프 맵핑을 보여주는 실험 및 결과이다, - ' 도 10은 실시예 8에 따라 27B6 키메릭 항체가 보체 의존성 세포독성을 나타
냄을 확인할 수 있었다.
도 11은 실시예 9ᅳ1에 따라 27B6 키메릭 항체의 항체 의존성 세포독성 효과를 확인한 결과이다.
도 12는 실시예 9-2에 따라 27B6 키메릭 항체의 삼중음성유방암 세포주에서의 항체 의존성 세포독성 효과를 확인한 결과이다.
도 13은 실시예 10-1에 따라 다양한 고형암 세포주에서 defucosylated 27B6 키메릭 항체의 항체 의존성 세포독성 검사를 나타낸다. 도 14은 실시예 1으 2에 따라 유방암 세포주에서 Luc i ferase assay를 이용한 Defucosyl ated 27B6 , 4B4 키메릭 항체의 항체 의존성 세포독성 검사를 나타낸다. 도 15는 실시예 11에 따라 삼증음성유방암 세포주에서 CA XI I항원의 발현 정도와 27B6 , 4B4 키메릭 항체의 결합여부를 확인한 결과이다.
도 16은 삼중음성유방암 동물모델에서 27B6 키메릭 항체 및 4B4 키메릭항체가 종양의 성장을 억제하고 있음을 나타낸 결과이다.
도 17 실시예 11에 따라 삼중음성 유방암에 대한 4B4 항체의 유효성 결과를 나타낸다.
도 18 및 도 19는 실시예 12에 따라 4B4 항체 단독의 직접적인 결합은 암세포 성장에 영향을 주지 않음을 나타낸 결과이다.
도 20은 실시예 13에 따라 27B6 항체와 방사선 치료의 병용효과를 나타낸 결과이다.
도 21은 실시예 14에 따라 선택된 클론 (phage di splayed scFv)의 CA- XI I에 대한 결합력 (af f ini ty )을 ELISA로 테스트한 시험 결과를 나타낸다. 도 22은 실시예 14에 따리- 선택된 10개 클론 (클론 번호 #1. 2. 8. 11 , 15, 19， 22 , 25 , 26 및 30)의 경쇄 가변영역 (VL)의 서열과 CDR1 및 CDR2의 배열을 나타낸다..
도 23. 및 도 24는 실시예 14에 따라 선택된 10개 클론 (클론 번호 #1. . 2； 8 , 11， 15， 19 , 22 , 25.26 및 30)의 전장 IgG의 친화도 시험결과를 니타내는 그래프이다.
도 25은 실시예 15에 따른 인간화 항체 DNP004의 CA— XI I 양성 삼중음성유방암 세포주 MDAMB-231에서의 결합 확인을 나타내는 것이다.
도 26는 실시예 16에 따라 항체 후보군의 SDS-PAGE를 이용한 물성 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 27은 실시예 16에 따라 항체 후보군의 CA XI I 양성 세포주와의 결합력 평가를 나타낸다.
도 28 및 도 29는 실시예 17에 따라 다양한 유방암 세포에서 DNP004 인간화 항체의 carbonic anhydrase 12항원에 대한 결합 양상 확인한 결과이다. ᅳ
도 30은 실시예 18에 따라 DNP004 인간화 항체의 유방암 세포주에서의 항체 의존성 세포독성 효과를 확인한 결과를 나타낸다. 도 31는 실시예 18에 따라 DNP004 인간화 항체의 폐암 세포주에서의 항체 의존성 세포독성 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 32는 실시예 18에 따라 DNP004 인간화 항체의 간암 세포주에서의 항체 의존성 세포독성 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 33는 실시예 18에 따라 DNP004 인간화 항체의 위암 세포주에서의 항체 의존성 세포독성 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 34 내지 35는 실시예 19에 따라 DNP004인간화 항체의 삼중음성 유방암 마우스 모델에서의 항 종양 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 36는 실시예 19에 따라 DNP004인간화 항체의 신장암 세포주 마우스 동물모델에서의 항 종양 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
하기 예시적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나， 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
<실시예 1>항 CA-XII 단클론 항체 (27B6)의 제조
CA-XI I에 특어적인 새로운 항체를 개발하기 위해.다음과 같은 실험을 수행하였으며. 개발， 항체는 폐선암뿐만 아니라 유방암과 대장암 및 전립선암에서도 일부 발현하며 고형암 특이적 항체로 27B6와 4B4로 명명하기로 하였다.
1-1： 27B6 단클론 항체 제작을 위한 타겟 부위 설계
고형암 세포 특이적인 항체를 제작하기 위해， 고형암 세포를 직접 마우스에 면역하고 , 이에 대한 단클론 항체를 세포 융합 방법으로 확립하였다ᅳ 그런 후， 고형암 세포 특이적인 단클론 항체와 결합하는 항원을 분석하여 동정하였다.
1-2： 마우스 면역화 " 고형암에서 발현되는 특이적인 항원에 대한 단클론 항체를 개발하기 위해, 폐선암 세포주인 A549를 면역화한 후 유세포 측정기를 이용한 하이브리도마 선별 과정을 통해, A549세포에 양성반웅을 나타내면서 정상 폐 세포주인 L132에 음성반웅을 나타내는 항체 클론을 골라 선별하였다. 단클론 항체에 대한 양성 세포의 퍼센트는 실험대상 5000개 세포 중에서 DNP004항체와 결합하는 세포의 수를 %로 계산하여， - (음성)는 양성 세포수가 10% 미만， +은 양성 세포수가 10~30%범위, ++은 양성 세포수가 30~70%범위이고, +++은 양성 세포수가 70~10 로 지정하였다.
고형암 특이적 단클론 항체를 개발하기 위하여 6 주령의 Bal b/c 암 컷 마우스 한 마리당 폐선암 세포주인 A549(ATCC CCL-185)를 lxlO7의 수만큼 마우스 복강 ( IP ; intraper i toneal cavi ty)으로 3주간의 간격으로 세 번 주입하고 정맥에서 혈액 검체를 취하여 혈청을 분리하였다. 상기 분리된 혈청에 A549 세포에 희석한 혈청을 넣고 4°C에서 30분간 반웅시킨 후 PBS 3ml을 넣고 1500rpm에서 3분긴 · 원심분리하여 결합하지 않은 항체를 수세하고 결합된 항체를 확인하기 위해 이차항체인 goat ant i -Mouse Ig- FT XXDinona)을 200배 희석하여 넣은 후 4°C에서 15분간 반응 시킨 후 PBS 3ml로 위와 동일한 방법으로 수세한 후 유세포 분석기로 측정하여 A549세포주에 대한' 역가를 확인하였다. A549 세포에 대한' 역가를 유세포분석기로 확인한 결과 A549 세포를 면역화한 혈청에서 A549세포주에 대한 양성이 높게 나타난 것을 확인하였다 (결과 미기재) . 구체적으로 세포 융합을 실시하기 3일 전 50 ug ant i-CA-XI I agoni st niAb를 넣어 면역반응을 증가시키고 A549(ATCC CCL-185)를 lxlO7의 수만큼 주입하여 A549 표면 항원에 대한 항체가 증폭되도록 유도하였다.
1-3： 하이브리도마 세포 제조
상기와 같이 면역화된 마우스의 비장을 절제하여 단일 세포 부유액을 수득하고 RPMI (GIBCO)으로 2회 정도 세척한 후, 0.4% trypan b lue(s igma)를 l : l(v/v)으로 섞은 후 현미경으로 염색되지 않은 세포를 측정하는 트립판 블루 ( tryphan bl ue) 염색법으로 세포수를 계수하였다. 세포융합 partner 세포로는 X63 nioue mye loma 세포주 (ATCC CRL-1580)를 사용하였으며 상기 비장세포와 동일하게 세척 후 세포수를 계수하였다.
상기 골수 (myeloma) 세포와 비장세포는 1 : 5의 비율로 흔합하고 원심분리 후 상등액을 제거하였다. 미리 37°C로 예열된 50% PEGCpolyethylene glycol ) 1500 1ml을 1분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 약 1분 정도 정체시켰다가 RPMI 배지를 서서히 추가하여 단계적으로 희석하였다. 이를 원심 분리한 후 ΐχΗΑΤ이 포함된 RPMI (20%FBS . hypoxant h i ne-am i nop t er i n- 1 hym i d i ne ) °\} 부유시키고， 96-웰 플레이트에 150ul /웰로 분주한 후 37°C 5% C02 배양기에서 배양하였다. 상기 융합 후 일정기간 HAT feeding을 진행하고， 군락을 '형성한 웰이 관찰되면 HT 배지를 150ul첨가하여 37°C 5% C02 배양기에서 48시간 배양 후 3칼라 형광염색을 실행하고 유세포 측정기로 분석하였다. 각기 다른 파장의 염색약으로 염색한 폐선암 세포주인 A549 세포와 정상 폐세포주인 L132는 각 각 형광 염색약으로 염색 후 1 : 1로 섞어 준비한 후 준비된 세포에 하이브리도 배양 상층액을 lOOul씩 넣고 ' 4 '에서 30분간 반응시킨 후 PBS 3ml을 넣고 1500rpm에서 3분간 원심분 ¾하여 결합하지 않은 항체를 수세하고 결합된 항체를 확인하기 위해 이차항체인 goat ant i -Mouse Ig-APC (Dinona)을 )f)배 희석하여 넣은 후 4T:에서 15분간 반웅시킨 후 PBS 3ml로 위 ί 동일한 방법으로 수세한 후 유세포 분석기로 측정하였다.
말초 혈액에 대한 결합 정도를 확인하기 위해 PBMC( per ipheral blood mononuc lear ce l l s , 적십자혈액원)에 하이브리도마 상층액을 lOOul 넣고 4°C에서 30분간 반응 시킨 후 PBS 3ιιι 1을 넣고 1500rpm에서 3분간 원심분리 하여 결합하지 않은 항체를 washing하고 결합된 항체를 확인하기 위해 이차항체인 goat ant i -Mouse Ig-FITC (Dinona)을 200배 희석하여 넣은 후 4°C에서 15분간 반웅 시킨 후 PBS 3nil로 위와 동일한 방법으로 washing한 후 유세포 분석기로 측정하였고 그 결과를 기재하였다 (도 1) . 도 1은 훼선암 특이적인 27B6 단클론 항체의 말초혈액에서의 반웅도 검사 결과를 나타낸다.
상기 방법에서 폐암 세포주인 A549에 양성이면서 정상 폐세포주인 L132와 말초혈액의 과립구 (granu locytes)와 림프구 ( lymphocytes) 및 단핵세포 (monocytes)에 모두 음성인 단클론 항체 (이하 27B6로 명명함)를 선별하고， 최종적으로 제한 희석 (limiting dilution)을 통해 단일 콜로니의 27B6 하이브리도마 세포를 확보하였다ᅳ
상기 27B6 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주는 대한민국 서울시 종로구 연건동 28에 주소를 둔 서울대학교 암연구소 한국세포주연구재단에 2012.02.14일자로 기탁하여 2012.02.20일자 수탁번호 KCLRF— BP-00280을 부여받았다.
1-4： 27B6 단클론 항체의 아이소타입 (isotype) 결정
<실시예 1— 3>에서 제조된 27B6 단클론 항체의 아이소타입을 결정하기 위해 mouse immunoglobulin isotyping EL ISA kit (BD Biosciences, USA)로 분석하였다 . 구체적으로 isotypi.ng은 rabbi t ant i -murine isotype specific antiseradgGl, IgG2a, IgG2b, igG3, IgM, IgA, Kappa, Lamda)를 이용하고 secondary antibody는 per oxidaseᅳ label'ed goat ant i -mouse IgG를 사용하였다, 발색 반웅은 ortho-phenylenediamine(OPD)와 hydrogen peroxide substrate를 이용해 유도하였으며 450皿의 흡광도를 측정하여 값을 확인하였다. ᅵ
상기 실험결과, 27B6 단클론 항체는 mouse IgGl /kappa light chain으로 확인되었다 (결과 미기재).
1-5： 27B6 항체 CDR 서열
항체 클로닝 과정은 도 1에 나타냈다. 구체적으로 , 27B6항체 유전자는 Mouse Ig-Primer Set (Mi llipore, Cat. #： 69831)을 이용하여 클로닝하였다. 27B6 하이브리도마로부터 분리한 RNA로부터 Mouse Ig-Primer Set을 이용하여 PCR을 수행하고ᅳ 이를 pGeni-T 백터 (Pr omega, Cat. #： A3600)에 삽입한 후， 시퀀싱을 통해 DNA 염기서열을 확인하였으며, IMGT site (www. imgt.org)를 통해 마우스 항체 유전자를 확인하였다.
27B6 Ab gene CDR sequence의 증쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 서열을 SEQ ID NO: 12 및 13에 나타냈으며， 중쇄 가변영역의 CDR1 내지 CDR3는 각각 서열번호 6 내지 8에 나타냈으며 , 경쇄 가변영역의 CDR1 내지 CDR3는 각각 서열번호 9 내지 11에 나타냈다 (상기 표 2 참조).
<실시예 2> 27B6 chimeric antibody제조
생쥐 기원의 단클론 항체를 치료 목적으로 인체에 투여할 경우 인체의 면역체계는 종 (Species)이 다르기 때문에 이 단클론 항체를 외래 항원으로 인지하여 인간 항 -생쥐 항체 (human ant i -mouse antibody; HAM A) 반응을 일으키게 되어 혈액 내의 생쥐 항체를 빠르게 제거하고 또한 생쥐 항체의 Fc 부분이 인체 내에서 효과적인 생물학적 기능을 수행하지 못하는 등 치료효과가 급감하게 되며. 동시에 심한 알레르기 반응 및 신장 기능 저하 등 부작용이 수반되게 된다. 따라서. 인체 투여 시 27B6항체의 면역원성을 줄이기 위해서 가변영역 (variable region)을 제외한 나머지 부분을 인간의 IgGl의 Fc로 대체한ᅵ 키메릭 항체를 제작한 후 항원 특이성 및 친화도가 본래의 마우스 유래 27B6 항체와 유사함을 확인하였다.
키메릭 항체를 개발하기 위해 상기 기술한 방법으로 제조된 27B6-
HuIgFc DNA를 CH0세포 유래의 DHFR DG44 세포주에 형질전환 후 선택 배지에서 선택 배양 과장을 거쳐 27B6재조합 항체를 발현하는 인정화 세포주 (stable cell iine)을 개발하였다. 자세한 실험방법은 아래와 같다. 먼저 DG44 세포주 (Invitrogen, Cat No. A1100001)를 형질전환하기 3시간 전에 6ᅳ웰 플레이트에 lx 106 cells/ml농도로 접종하고， GIBC0 (상표명) CD DG44 mediumdnvitrogen, USA) 1ml를 넣어 37°C , 5% C02 조건에서 3시간 동안 배양 후 상기 에서 제조된 27B6-HuIgFc DNA를 Effectene transfection reagent 키트 (QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 준비된 DG 44세포에 형질전환하였다.
상기 형질전환한 지 3일 후， 상층액을 취하여 A549 세포에 넣고
4°C에서 30분간 반응시킨 후 PBS 3ml을 넣고 1500rpni에서 3분간 원심분리하여 결합하지 않은 항체를 수세하고 결합된 항체를 확인하기 위해 이차항체인 goat ant i -Human Ig-FITC(Dinona)을 150배 희석하여 넣은 후 4°C에서 15분간 반웅시킨 후 PBS 3ml로 위와 동일한 방법으로 수세한 후 유세포 분석기로 측정하여 A549세포주에 대한 역가를 확인하였다. 이후 안정적인 세포주를 만들기 위해 30nM MTX( Sigma, USA)과 200ug/ml의 G418(Invitrogen. USA)을 첨가한 PowerCHO LONZA . Switzerland) 배지로 교체 후 클론 선택과정을 시작하였다. MTX와 G418이 포함된 배지에서의 선택과정은 MTX와 G418 첨가 농도를 점진적으로 높이되, 각 농도별 선택과정 기간은 3주로 고정하였다. 최종적으로 선택과정을 마친 세포주는 1000NM MTX와 400ug/ml G418 이 첨가된 Power CH0배지에서 적응과정을 마친 상태로 선별과정을 마무리하였으며, 선별과정 진행 후 최종적인 세포주를 확립하기 위해 제한 희석 (limiting dilution)을 실시하여 단일 콜로니 (single colony)를 확보하였다.
상기 기술한 방법대로 개발한 27B6 키메릭 항체의 항원 특이성 및 친화도를 유세포 측정기를 이용해 확인한 결과 항원 특이성 및 친화도가 본래의 마우스 유래 27B6 항체와 유사함을 확인하였다 (도 2). 도 2는 27B6 키메릭 항체의 항원 특이성 및 친화도 확인한 결과를 나타낸다.
<실시예 3>항 CA-XII 단클론 항체 (4B4)의 제조
3-1： 27B6 페어 항체 개발
동일항원에 결합하지만 다른 에회토프를 인지하는 항체를 추가적으로 확보하기 위하여 27B6 페어링 ¾체를 개발하였다. 우선적으로 27B6 페어링 항체 개발 가능성을 평가하기 위하여， 키메릭 27B6와 마우스 혈청을 사용하여 샌드위치 ELISA를 구현하였다.
상기 실시예 <1-2>에 기술된 방법과 동일하게 인간 폐선암 세포주 A549 lxlO7 세포를 6주령 암컷 마우스 복강에 3주 간격으로 면역하고 혈청의 취하였다.
구체적으로， 키메릭 27B6 정제항체를 100 ng/mL 농도로 microplate에 넣고 37 °C에서 1시간 동안 코팅하였다. 27B6가 코팅된 microplate에 blocking buffer(sigma)을 200ul/well로 넣고 37°C에서 1시간 동안 차단하였다. A549 세포를 1% NP40 lysis buffer를 사용하여 lxlO7 cells/ml 농도 lysate를 준비하였다. 준비된 A549 lysate를 50LiL/well로 m roplate에 넣고 37°C 온도에서 1시간 반웅한 뒤 PBS로 3회 수세하였다. A549 면역으로 확보한 마우스 혈청 1000배 희석액 100 uL/well을 microplate에 넣고 37°C에서 1시간 반응한 뒤 PBS로 3회 수세하였다. 마지막으로 이차 항체 goat ant i -mouse I gG-HRP( Jackson) 2000 희석액을 100 uL/well로 넣고 37 °C에서 30분 반응한 뒤 PBS로 3회 수세하였다. TMB (3.3' ,5,5'-tetraniethylbenzidine)을 50 uL/well로 넣은 뒤 상온에서 10분간 반응하여 발색을 유도하고 2N H2S04 (Sigma)을 동량 넣어 발색반응을 종료하였다. 이후 450 nm 파장에서 흡광값을 측정하였다.
예상한 바와 같이. 27B6와 마우스 혈청으로 구현한 샌드위치 앨리자 (sandwich ELISA)에서 양성반웅을 확인할 수 있었다.
3-2： 단클론 항체의 제조
상기와 같이 면역화된 마우스의 비장을 절제하여 하이브리도마를 생산하는 방법은 <실시예 1ᅳ 3>에 기재한 방법과 동일하게 진행하였다.
상기 방법에서 폐암 세포주인 A549에 양성이면서 정상 폐세포주인
L132와 말초혈액의 과립구 (granulocytes)와 림프구 ( lymphocytes) 및 단핵세포 (monocyte)에 모두 음성인 단클론 항체 27B6와 페어되는 단 론 항체 (이하 4B4로 명명함)를 선별하 3， 최종적으로 제한 희석 Guniting dilution)을 통해 단일 콜로니의 4B4하이브리도마 세포를 확보하였다 (도 3). 도 3는 4B4항체의 항원 반웅도 스크리닝을 나타낸다. 상기 4B4항체를 생산하는 하이브리도마 세포주는 대한민국 서울시 종로구 연건동 28에 주소를 둔 서울대학교 '암연구소 한국세포주연구재단에 2012.02.14일자로 기탁하여 2012.02.20일자 수탁번호 KCLRF-BP-00279을 부여받았다. 3-3： 4B4 항체 분석
상기 <실시예 1-5〉와 실질적으로 동일한 방법으로 항체의 CDR 아미노산 서열을 분석하였다. 상기 <실시예 3— 2>에서 얻어진 4B4 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 서열을 SEQ ID NO: 20 및 21에 나타냈으며, 증쇄 가변영역의 CDR1 내지 CDR3는 각각 서열번호 14 내지 16에 나타냈으며 , 경쇄 가변영역의 CDR1 내지 CDR3는 각각 서열번호 17 내지 19에 나타냈다 (상기 표 2 참조).
<실시예 4> 4B4키메릭 항체 제조
상기 <실시예 2〉에서 기술한 바와 같이 인체 투여 시 4B4항체의 면역원성을 줄이기 위해서 가변영역 (variable region)을 제외한 나머지 부분을 인간의 IgGl의 Fc로 대체한 키메릭 항체를 제작한 후 항원 특이성 및 친화도가 본래의 마우스 유래 4B4 항체와 유사함을 확인하였다.
4B4 키메릭 항체 제조 방법은 <실시예 2>와 동일한 방법으로 수행하였으며, 그 결과 개발한 4B4 키메릭 항체의 항원 특이성 및 친화도를 유세포 측정기를 이용해 확인한 결과 항원 특이성 및 친화도가 본래의 마우스 유래 4B4 항체와 유사함을 확인하였다 (도 5). 도 5는 AB4 키메릭 항체의 항원 특이성 및 친화도를 나타낸다. <실시예 5>다양한세포주에서 항체 발현 분석
5-1： 다양한 세포주에서 항체 발현
KCLB(Korean Cei I Line Bank)와 S lKSeoul National University)를 통해 확보한 다양한 암 세포주에서의 실시예 2 및 실시예 4에서 긱ᅳ각 얻은 키메릭 27B6항체와 키메릭 4B4항체의 결합 여부를 유세포 분석기 (flow cytometry)로 확인하였다.
구체적으로 암세포주는 KCLB Korean Cell Line Bank)와 SNlKSeoul National University)를 통해 얻었으며 Lᅳ 132, SW-900, DU145, LNCap, MCF— 7, Huh7, Hs-578T 는 10% heat inactivated fetal bovine serumCFBS; GIBCO invitrogen)가 첨가된 Dubco's MEM(GIBC0, invitrogen) 배지를 A549, NCI— H460. NCI-H417. DLD-1 ,HCT116， HT-29, SW-480, SW-620, LS174T, P03. SNU1. SNU638. SNU719. MKNl , MKN28, MKN45, MKN74, NCI-N87, SK- BR3 .MDA-MB231. MDA-MB453은 10% heat inactivated FBS이 첨가된 RPMI 1640 (GIBCO, invitrogen) 배지를 이용해 37°C에서 5% C02. 상태의 배양기를 이용해 배양하였다. 또한 Cahi-3, Hep3B, SK-HEP— 1， C3A, Hep G2, PLC/PRF/5, BT-20은 10% heat inactivated fetal bovine ser闘 (FBS; GIBCO, invitrogen)가 첨가된 Eagle's MEM(GIBC0, invitrogen) 배지를， KATO III는 20% heat inactivated fetal bovine ser urn (FBS; GIBCO, invitrogen)가 첨가된 IMDM(GIBCO, invitrogen) 배지를， SW480, MDA-MB468은 10% heat inactivated fetal bovine serum(FBS; GIBCO, invitrogen)가 첨가된' Leibovitz's L-15 Medium 이용해 37°C에서 5% C02. 상태의 배양기를 이용해 배양하였다ᅳ
상기 배양된 암세포주에 본 발명의 27B6, 4B4 단클론 항체를 각각 넣어 4°C에서 30분간 반응시킨 후 PBS로 수세하고, FITC-conjugated goat ant i -mouse Ig G(DiNona Inc, Korea)를 넣어 4°C에서 15분간 배양하였다. 다시 PBS로 수세한 후 FACSca liber (Bee ton Dickinson, USA)로 분석하여 그 결과를 아래에 기재하였다. (표 5) 다양한 고형암 세포주에서의 27B6 및 4B4항체의 반웅을 확인하였디
하기 표 5는 다양한 고형암 세포주에서 carbonic anhydrase 12항원에 대한 발현 양상을 나타낸다,. 표 16에서 실험대상 5000개 세포증에서 27B6 및 4B4 단클론 항체에 대한 양성 세포의 퍼센트는 FACS분석법으로 분석하였으며， ᅳ는 양성 세포수가 10% 미민 '， 은 양성 세포수가 ' 1Ο'30%범위， ++은 양성 세포수가 30~70%범위이고. +++은 양성 세포수가 70-100%을 나타내며, -로 표시된 10%미만인 양성세포수를 음성으로 보며， 그 이상의 세포는 모두 양성으로 판단한다.
【표 5]
Figure imgf000035_0001
MKN 45 + +++
Huh-7 - ++
Liver Hep3B - +
PLC/PRF/5 +++ +++
MCF-7 + +
SK-BR3 +++ +++
Breast MDAMB231 +++ . +++
MDAMB453 +++ ++
BT20 + ᅳ
Lymphocyte - -
PBMC Monocyte - -
Granulocyte -
Cell binding profiling of 4B4 chimeric antibody performed by flow cytometry.
- ： less than 10% of positive cei is
+ ： 10-30%
++ ： 30-70%
+++ ： more than 70% 상기 표 5에 기재한 바와 같이， 본 발명의 27B6및 4B4 단클론 항체는 다양한 종류의 폐선암， 대장암， 위암， 간암 및 유방암 세포주에서 결합정도의 차이는 보이지만 양성반웅을 나타내는 것을 확인하였다. 반면 말초혈액유래 림프구와 단핵구. 과립구에는 모두 음성인 반웅을 확인하였다. 이는 본 발명의 27B6 및 4B4 항체가 CA XII항원을 발현하는 고형암에 대한 치료제로서 사용할 수 있음을 나타낸 것이다.
5-2： 다양한 유형의 유방암세포에서 발현양상
27B6와 4B4는 ER.PR뿐만 아니라 HER2 양성 유방암 세포에서도 모두 양성 반웅을 보임. 따라서， 삼중 음성 유방암 (Triple negative breast cancer)뿐만 아니라 다양한 유형의 유방암에서도 치료제로 쓰일 수 있다. 따라서， 세 가지 서로 다른 표현형의 유방암 세포주에서의 27B6와 4B4단클론 항체의 결합 여부를 유세포 분석기 (flow cytometry)로 확인하였다.
MCF-7 세포 (유방암 세포주， ER positive cell line)는 10% heat inactivated fetal bovine serum(FBS; GIBCO. invitrogen)가 첨가된 Dubco's MEKGIBCO, invitrogen) 배지를， MDA-MB23K악성 유방암 유래 세포주)， SK-BR-3 세포 (human breast cancer cell line that overexpresses the Her2 (Neu/ErbB-2) gene■ product )는 10% heat inactivated FBS이 첨가된 RPMI 1640 (GIBCO, invitrogen) 배지를 이용해 37°C에서 5% C02. 상태의 배양기를 이용해 배양하였다.
상기 배양된 유방암 세포주에 본 발명의 27B6, 4B4 단클론 항체 fl 각각 넣어 41：에서 30분진ᅳ 반웅시킨 후 PBS로 수세하고, FTTC-conjugated goat ant i -mouse Ig G(DiNona Inc, Korea)를 넣어 4°C에서 15분간 배양하였다. 다시 PBS로 수세한 후 FACScaliber(Becton Dickinson, USA)로 분석하여 그 결과를 표 6에 기재하였다.
【표 6]
Figure imgf000037_0001
따라서， 본 발명에 따른 27B6와 4B4항체는 ER,PR뿐만 아니라 HER2 양성 유방암 세포에서도 모두양성 반웅을 보이므로. 삼중음성 유방암 (Triple negative breast cancer)뿐만 아니라 다양한 유형의 방암에서도 치료제로 쓰일 수 있다.
5-3： IHC ( ImmunoHi stoChemi stry)
인체의 정상조직에서 27B6와 4B4 단클론 항체의 결합 항원의 분포는 면역조직화학염색 ( I隱 unohi stochenii stry , IHC)법으로 확인하였다. 인체의 정상 흉선과 편도조직은 충북대학교 병원에서 얻었으며, 충북대학교 병원 병리과에서 동결절편을 제작했다.
상기 제작된 동결절편 조직에 본 발명의 27B6 , 4B4 단클론 항체의 면역조직화학염색은 다음과 같다ᅳ -20°C이하에서 보관된 흉선과 편도 동결절편 조직을 상온에서 30 - 60분간 말리고 lx PBS에 60분간 담궈 두었다. 이어서 3% 과산화수소 (¾02)에 상온에서 10분간 반웅하여 내재성 퍼옥시다쩨 (per oxi sase)의 활성을 억제한 뒤 흐르는 물에 수세하 염소유래 면역글로블린이 포함된 혈청으로 조직을 덮어 상은에서 30분간 반응시켜 마우스 항체에 의한 비특이 염색을 제거하였다. 다음으로 1차 항체 (27B6. 4B4)를 상은에서 60분간 반웅시켰다. 사용된 항체의 농도는 각각 10ug/ml이다 - . 이어서 5분간 3회 lx PBS로 수세한 뒤 HRP- conj ugated goat ant i -mouse 항체 (Dako , Denmark)를 넣어 상온에서 30분간 반웅 후 5분간 3회 lx PBST (0.05% Tween2C , lx PBS )로 수세하였다ᅳ Di aminobenz kline(DAB)으로 발색하였고， 흐르는 물에 5분간 수세한 뒤 Hematoxyl in으로 대조염색을 하고 흐르는 물에 7분간 수세하였다. 염색을 마친 슬라이드는 탈수와 봉입을 한 뒤 염색 결과는 현미경으로 분석하였고, 아래에 기재하였다.
【표 7]
Figure imgf000038_0001
Geminal center - -
Basal layer Basal layer
+ 상기 표 7에 기재한 바와 같이, 본 발명의 27B6 및 4B4 단클론 항체가 인지하는 항원은 정상 흉선과 편도 조직에는 분포하지 않았고， 특히 정상 성숙， 미성숙 T세포와 B 세포에서 발현되지 않는 것을 확인하였다. 27B6 항체의 경우 편도의 basal layer에 약하게 염색되었으나 이는 비특이 결합의 결과로 파악된다.
<실시예 6>단클론항체에 대한항원분석
6-1： 4B4 및 27B6 단클론 항원의 분리 정제
4B4 및 27B6 단클론 항체 개발에 사용된 폐선암 A549 세포주를 1x10s 배양하여 lysis buffer(l% Nonidet P-40;NP-40 in 50mM Tris-HCl, pH 7 A, 50mM EDTA. and ImM pheny 1 -met hy 1 -su 1 f ony 1 - f 1 uor i de； PMSF ) 50 ml로 현탁한 후, 상온에서 15분간 용해시킨 다음 원심 분리를 통해 세포 잔존물을 제거.하고 상층액을 모아 용해물을 준비하였다. 준버된 용해물은 4B4 및 27B6 항체가 인지하는 항원 분리 재료로 사용되었다.
정제된 4B4 및 27B6 단클론 항체 5 nig을 결합 버퍼 (0.2 M sodium bicarbonate, 0.5M sodium chloride, pH8.3)에 투석하여 2종의 항체 용액을 제조하였다. NHS-Act ivated sepharose 4 Fast Flow resin (GE Healthcare) 2 nil을 5 nil column에 패킹하고 ImM HCl 20 ml을 홀려 세척한 뒤 다시 결합 버퍼 (20mM sodium bicarbonate, 0.5M sodium chloride, pH8.3) 20 ml로 수세하여 상기에서 준비된 항체가 잘 결합하도록 컬럼 (cohuiin)을 준비하였다. 준비된 컬럼 출구 (column out—let)를 막고 준비된 2종의 항체 용액을 각각의 컬럼 (column)에 넣은 뒤 컬럼 입구 (column in-let)를 막아 상온에서 4시간 동안 반응 하였다. Resin과 반응하여 결합하지 않은 여분의 항체를 제거하기 위하여 수세 버퍼 (20niM Sodium acetate, 0.5M Sodium chloride, pH5.4) 20 ml을 홀려 주어 컬럼 (column)을 세척하고, Resin에 잔존하는 반웅기를 제거하기 위해 blocking buffer (0.1M ethanol amine, 0.5M sodium chloride, pH8.3) 50 ml을 홀려 주었다. 준비된 2종의 컬럼 (column)은 보전 버퍼 (20 mM Tris-HCl , 150 mM NaCl， 0.02 % sodium azide, pH8.0)을 20 nil 홀려 준 뒤 사용 전까지 넁장 보관 하였다.
준비된 . colu隱은 FPLC (Acta FPLC)에 연결하여 Resin에 결합된 항체가 항원을 인지하여 항원을 분리 할 수 있도록 준비하였다. 폐선암 A549 세포주 용해물은 FPLC에 연결된 컬럼에 주입 ( loading)되었으며 4B4 및 27B6 단클론 항체가 인지하는 항원의 원료로 사용되었다. 항원분리는 방법은 평형 (equilibrium), 원료 주입 (sample loading) , 세척 (washing) , 2차 세척 (second washing), 용출 (e hit ion)의 4단계로 이루어 졌다. 평형 및 세척 버퍼는 0.5% Tween-80, 20 mM Sodium phosphate, 150 mM sodium chloride pH 7.4이며, 평형에는 10 ml, 세척에는 20 ml이 각각 사용되었다 . 용출 버퍼 (elution buffer)는 0.3 M Glycine, 0.1 M sucrose, 0,1 ¾ Mannitol, 1.0 M urea, 0.5% Tween-80, pH3.0 용액 20nil이 사용되었다. 2차 세척 용액 (second washing)은 용출 버퍼를 세척 버퍼에 25% 비율로 흔합한 흔합액을 사용하였다. 항원 분리 과정에서 얻어진 용출액 (eluated solution) 20m:'i에 TCA 5ml을 첨가하여 ' 30 분간 넁장보관 하: Π. 이후 원심분리하여 침전물은 얻고 아세론으로 2회 추가 세척하였다. 최종 얻어진 침전물은 IX SDS— PAGE Sample buffer에 현탁하여 전기영동을 수행하고 코마지 염색을 실시하였다. 상기 기술한 바와 같이 4B4 및 27B6 항체로 각각 제작한 컬럼으로 최종 분리 정제된 항원은 도 6과 같다. 도 6에서. 4B4 및 27B6 단클론 항체로 제작한 칼럼으로 폐선암 A549 세포주 용해물에서 각각의 항원을 분리정제 하여 얻은 시료를 전기영동으로 확인한 결과이다.
6-2： 4B4 및 27B6 단클론 항원 동정
4B4 및 27B6 단클론 항체를 결합시켜 제작한 resin으로 분리 정제된 항원은 도 7과 같이 확인되었다. 화살표로 표시된 약 58 kDa 주요 단백질 밴드 2종은 서을의약연구소에 동정 의뢰되었다. 동정은 In-Gel digest ion으로 펩타이드를 준비하고， LC-MS/MS로 분석하여 얻어진 결과를 PLGS (Waters)와 MASCOT (Matrix Science)로 프로세싱하여 완료되었다. 일련의 분석방법은 다음과 같다.
Gel 상태의 단백질은 10OT ACN (Acetonitri le)으로 탈수하고Speedvac을 이용하여 완전히 건조 되었다. 건조된 상태에서 트립신 (trypsin)을 첨가하여 15분간 digestion 하였다. 시료는 60% ACN, 0.1% TFA로 추출하여 Speeclvac으로 농축하였다. 시료를 5% CAN, 0.2% TFA (Trifluoracetic acid) 용액 20ul에 녹여 LOMS/MS로 분석하였다. LC (;01讓11는 nanoACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 ym, 300 A, 2.1隱 x 150隱 I.D.)가 사용되었으며, 이동상 버퍼 A (0.1% TFA in 100% DW)를 이동상 버퍼 B(0.1% TFA in 100% ACN)로 점진적 교체 방법 (gradient elution)을 사용해 펩타이드를 분리하였다, MS 검출기는 ESI positive, Surver sacn mode를 사용하였다. 이후 얻어진 결과는 PLGS 및 MASCOT로 프로세싱하였다 . 상기와 같은 일련의 분석으로 하기 표 과 같이 최종 동정 결과를 획득하여 하기 표 8에 나타냈다。
【표 8]
Figure imgf000041_0001
27B6 Synaptic vesicle membrane protein
6 42122 5.88
VAT-1 homo log
27B6 7 Protein disulfide isomer ase 57146 5.98
27B6 8 Serum albumin 68647 5.68
27B6 9 Tryps i n 24393 6.91
27B6 10 Act in gamma 41580 5.33 분석된 결과 중 Carbonic anhydrase 12는 기대한 바와 같이 4B4 및 27B6 단클론 항체로 정제한 항원에서 공통적으로 동정되었으며 세포 표면에 존재하는 단백질로 알려져 있음을 확인하였다. 기타 다른 단백질들은 세포 내부에 존재하는 단백질이기 때문에 4B4와 27B6 단클론 항체의 항원이 될 수 없으며， 불완전한 분 5J 정제 과정에서 포함된 불순물로 파악된다.
27B6에서 분리돤 펩타이드 서열은 QFLLTNNGHSVK (서열번호 . 22). WTYFGPDGENSWSK (서열번호. 23), GQEAFVPGFNIEELLPER (서열번호 24) 및 YKGQEAFVPGFNIEELLPER (서열번호 25)의 4 종 이고, 4B4에서 분리된 펩타이드 서열은 QFLLTNNGHSVK (서열번호 22)， EMINNFR (서열번호 26), GVIYKPATK (서열번호 27)의 3종이다. 이중 QFLLTNNGHSVK 서열은 4B4 및 27B6에서 공통적으로 분석되었다. 도 8은 Carbonic ahydrase" 12 precursor isoform 1 아미노산 서열이며 굵은 글씨로 분석된 펩타이드 서열을 표시하였다. 도 8은 분리정제된 항원을 LC-MS/MS로 분석하여 동정된 단백질 목록이다. 표 9는 실시예 6에 따라 Carbonic anhydrase 12 isoform 1의 단백질 서열에 LC-MS/MS로 검출된 항원 펩타이드 단편을 토대로 분석한 결과 27B6 및 4B4항체가 인지하는 항원이 Carbonic anhydrase 12 isoforml 임을 표시한 것이다.
【표 9】 CA12 MPRRSLHAAAVlLl LKEQPSSWVNGSKMiBSPPM isoform 1 WSK YPSCGGLLQSPIDLHSDILOYDASIJPuiQG^LS^ Q
FLUNNGHSVKLNLPSDMHIQGLQS YS^QLHLHWGNPND
PHGSEHTVSGQHF ELHIVHYNSDLYPDASTASNKS^^^
AVUEMGSFNPSYDKIFSHLQHV YICGQI Vre ffiiLlMR
TAEYY YRGSLTTPPCN PTVLWTVF NP^ISQEQLLALEmilC
THMDDPSPREMINNFRQVQKFDE LVYTSFSQVQVCTAAGLS
LGnLSLALAGiLGlQVVWS LFRRKSI GDNKGViYICPOTKM
ETEAHA
4B4 인지항원 QFLUNNGHSV EMINNFR
펩타이드 단편 GVIYKPATK
QFLUNNGHSVK FGPDGENSWS
27B6 인지항원 YKGQEAFVPGFNIEELLPER
펩타이드 단편 GQEAFVPGFNIEELLPER
6-3： 4B4 및 27B6 단클론 항원 검정 (ELISA)
LC-MS/MS에서 얻어진 항원 동정 결과를 검정하기 위하여 재조합 단백질 Carbonic, anhydrase 12 (R&D systems)에 대한 4B4 ；및 27B6 단클론 항체의 반응성을 ELISA 및 Western blotting assay로 확인하였다.
Maxisrop ELISA plate에 well당 재조합 단백질 CA XII을 lOOng 넣어 37°C에서 한 시간 반웅시켜 항원을 코팅한 뒤， lx blocking 용액 (signia)을 well 당 200ul 넣고 37°C에서 한 시간 반응시켜 블로킹하였다. 상기 준비된 플레이트에 4B4, 27B6, 항 CA XII 단클론 항체 (R&D Systems) 및 PBS lOOul을 넣은 후 37°C에서 한 시간 반응시키고 PBS로 수세하여 결합하지 않는 항체는 제거하였다. 이후 Goat ant i -Mouse IgG_HRP( Jackson)을 희석하여 넣어주고 30 분간 반웅시킨 후 PBS로 수세한 뒤 TMB 용액을 well 당 50ul씩 넣어 10분간 반웅시킨 후 황산 50ul를 넣어 반웅을 중지시키고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 재조합 단백질 Carbonic anhydrase 12에 대하여 27B6 단클론 항체의 반응성은 다소 낮으나 4B4, 27B6, anti-CA XII 단클론 항체 (R&D systems) 모두 도 7과 같이 반응성을 나타내었다.
도 7은 4B4 및 27B6 단클론 항체에 대한 항원이 Carbonic anhydrase 12라는 것을 ELISA assay로 검증한 결과이다. 6-4： 4B4 및 27B6 단클론 항원 검정 (western blotting)
상기 실험에서 4B4 및 27B6 단클론 항체가 Carbonic anhydrase 12을 항원으로 인지한다는 것을 보여 주었으나， western blott ing으로 한번 더 검정하였다. 재조합 단백질 Carbonic anhydrase 12을 3분간 끓인 후 8% separating sodium dodecyl su 1 f at e-po 1 yacry 1 am i de gel어 1 loading하여 전기 영동을 실시하였다. 이를 니트로셀를로오스 막에 electrophoretic transfer시킨 후 5% skim mi lk(sigma) 용액으로 블로킹하고 각각 4B4, 27B6, 항 -CA XII 단클론 항체 (R&D Systems)를 결합시킨 후 (27B6: 1.2 lane, 4B4: 3,4 lane, 항— CA XII 단클론 항체: 5,6 lane), 세척 버퍼 (0.1% tweeiv20 in PBS)로 세 번 세척 '한 -T- per ox i dase-con j ugat ed goat ant i -mouse IgG (Sigma, Saint Louis, USA)을 결합시켰다. 상기 니트로셀를로오스 막을 세척 버퍼로 서 j. '척한 후 enhanced chemi luminescence detectio system (ECL, Amer sham, Sweden)로 밴드를 확인하여 그 결과 ¾ 도.8 에!ᅳ기재하였다. 도 8은 4B4 및 27B6 단클론 항체에 대한 항원이 Carbonic anhydrase 12라는 것을 Western blotting assay로 검증한 결과이다. 4B4, 27B6, Anti-CA XII 단클론 항체 (R&D Systems) 모두 40 kDa에 달하는 재조합 CA XII를 대한 반웅성을 나타내었다.
6-5： 4B4 및 27B6 단클론 항원 검정 (Sandwich EL ISA)
상기 E ISA와 WB에서 4B4 및 27B6 단클론 항체가 Carbonic anhydrase 12을 항원으로 인지한다는 것올 증명하였으나, 상대적으로 27B6 단클론 항체는 상대적으로 반웅성이 낮다. 이를 보완하기 위하여 Sandwich ELISA를 아래와 같이 수행하였다. Maxisrop ELISA plate에 well당 chimeric 4B4 또는 chimeric 27B6 단클론 항체를 well 당 100ng 넣어 37°C에서 한 시간 반웅시켜 항체를 코팅한 뒤. lx blocking 용액 (sigma)을 well 당 200ul 넣고 37°C에서 한 시간 반웅시켜 블로킹하였다. 재조합 단백질 Carbonic anhydrase 12을 100 ng/nil에서부터 2배씩 희석하여 각각의 well에 넣어 주고 37°C에서 한 시간 반응시킨 뒤 PBS로 수세하여 결합하지 않는 항원을 제거하였다. 이후 chimeric 27B6가 코팅된 well에는 4B4 단클론 항체를, Chimeric 4B4가 코팅된 well에는 27B6 단클론 항체를 well 당 100 ng을 넣고 37°C에서 한 시간 반응시킨 뒤 PBS로 수세하여 결합하지 않는 항체를 제거하였다. 이후 Goat ant i -Mouse IgG—HRP( Jackson)을 희석하여 넣어주고 30 분 반웅시킨 후 PBS로 수세한 뒤 TMB 용액을 well 당 50ul씩 넣어 10분간 반응시킨 후 황산 50ul를 넣어 반웅을 중지시키고 450ηηι에서 흡광도를 측정하였다. 코팅 항체 (Capture antibody)로 Chimeric 27B6를 사용하고 검출 항체 (Detector antibody)로 4B4를 사용하였을 때 재조합 단백질 Carbonic anhydrase 12에 대한 높은 반응성이 표 10와 갈이 확인되었다. 따라서, 4B4 및 27B6 단클론 항체 모두 Carbonic anhydrase 12을 항원으로 인지함을 증명하였다.
하기 표 10는 27B6 및 4B4 단클론 항체를 Capture/Detector 항체로. 조합하여 Sandwich EL ISA assay로 구현하고, Carbonic anhydrase 12를 27B6와 4B¾ 단클론 항체가 동시에 인지하고 있음을 검증한ᅳ결과이다,
[표 10】
Figure imgf000045_0001
<실시예 7> E itope mapping
에피토프 (epitope)을 검증하기 위하여 도 13에 기재한 바와 같이 하기 실시에서 결정된 에피토프 부위를 포함하거나 포함하지 않는 재조합 항원을 제작하여 실시예 1 및 3에서 각각 얻은 마우스 27B6 단클론항체 및 4B4 단클론 항체에 대한 면역반웅을 실시하였다.
7-1: CA XII mutant 재조합 유전자 제조 및 발현
pSec-Tag-CA XII full-hFc 재조합 유전자를 이용하여 제한효소 BamHI과 Hindlll를 이용해 CA-XII mutant 재조합 유전자를 만들었다. CA- XII 항원의 전체 염기서열과 hFc가 결합된 유전자를 pSec-Tag에 삽입함으로써 CA-XII 전체 발현 hFc 융합 단백질을 제조하였으며， 도 13과 같이， N 말단부터 아미노산 300번까지의 deletion mutant_hFc를 제조하였다. 상기 CA XII fu!l-hFc 및 5종의 deletion mutant -hFc. 가 삽입된 pSec-Tag 벡터를 ViaFect(Promega사)을 이용하여 CH0 세포에 삽입함으로써 형질전환하였다. 보다 구체적으로 상기 각 유전자 및 V i aFect com i ex올 하루 전날 플레이팅하여 새로운 배지로. 갈아준 CH0 세포에 뿌리고 48시간 동안 배양하였다. 상기 형질감염한지 이틀 후 배양 상등액을 수확하여 human Fc(hF:c)l; 검출하는 sandwich 를 이용해 발현여부 ·» -학인하였다.
7-2： 단클론 항체의 에피토프 (epitope) 검증
본 발명의 단클론 항체의 CA-XII에 대한 에피토프를 검증하기 위해, ant i -human Ig 항체 (Jackson Laboratory사)를 well당 50ng 넣어 37°C에서 한 시간 반웅시켜 capture 항체로서 코팅하고， lxblocking 용액 (sigma)을 웰당 200ul 넣고 37°C에서 한 시간 반응시켜 블로킹하였다. 상기 준비된 플레이트에 제조된 CA XII full-hFc 및 5 종의 deletion mutant -hFc 의 배양 상충액을 웰당 lOOul씩 넣은 후 37°C에서 한 시간 반응시키고 PBS로 수세하여 결합하지 않는 항체는 제거하였다. 이에 ant i -mouse Ig, Fc specific-HRP( Jackson Laboratory사)을 희석하여 넣어주고 30분 간 반응시킨 후 PBS로 수세한 뒤 TMB 용액을 웰당 50ul씩 넣어 10분간 반응시킨 후 황산 50ul를 넣어 반응을 중지시키고 450ηπι에서 흡광도를 측정하였다ᅳ 상기 배양 상층액에 CA XII mutant-hFc 단백질이 존재함을 확인하기 위해， 대조군으로 anti-human Ig 항체를 이용하여 Capture & detect Sandwich ELISA를 수행하고 상기 실험 결과를 도 9에 기재하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이， CA-XII의 N-말단에서부터 25번 아미노산에서 57번 아미노산으로 이루어진 단편으로서 non-catalytic domain으로 확인되었다. 따라서, CA-XII의 catalytic domain에는 결합하지 않으며 이에 CA-XII 효소활성을 저해하지 않는 것으로 보인다.
■ 구체적으로， 상기 실험결과에서 절단방법으로 확인한 27B6 항체의 항원결합부위는 서열번호 2의 APVNGSKWTYFGPD (서열번호 5의 25번째 아미노산 내지 38번 아미노산으로 구성됨)이며, CA XII의 3차원적 결정 구조에 근거하여 다시 확인한 바람직한 항원결합부위는 서열번호 2의 아미노산 서열 중예서 7개 아미노산으로 구성된 서열번호 1의 WTYFGPD이다 (서열번호 ΰ의 32번째 아미노산 내지 38번 아미노산으로 구성됨). 또한 상기 실험결과에서 절단방법으로 확인한 4Β4 항체의 항원결합부위는 서열번호. 4의 GENSWSKKYPSCGGLLQSP (서열번호 5의 39번째 아미노산 내지 57번 아미노산으로 구성됨)이며, CA XII의 3차원적 결정 구조에 근거하여 다시 확인한 바람직한 항원결합부위 '：는 서열번호 4의 아미노산 서열 중에서 14개 아미노산으로 구성된 서열번호 3의 GENSWSKKYPSCGG어다 (서열번호 5의 39번째 아미노산 내지 52번 아미노산으로 구성됨).
<실시예 8>고형암에서의 키메릭 항체의 치료효과 (CDC)
8-1:폐선암 세포주에서 CDC효과
폐선암 세포주인 Α549 cell을 96웰 (well) 플레이트에 에 5X103cel ls/well로 분주한 후 37 °C C02 incubator에서 20-24시간 배양한다. 각 웰 (well)의 배양 배지를 제거한 후 우태혈청이 포함되지 않은 RPMI 배지에 정쎄한 키메릭 27B6 항체를 최종 농도 lOug/nil이 되도록 10%의 human serum을 섞어 혼합액을 만든 뒤 각 well에 lOOul씩 분주하였다.
키메릭 4B4 항체도 동일한 방법을 사용하였다. 37 °C C02 i ncubator에서 3hr 배양 후 Ez-CyTox agent (DOGEN , KOREA)를 웰 (we l l ) 당 lOul씩 첨가하였다. 37 °C C02 incubator에서 3hr 30분 배양 후 플레이트 리더기 (p l ate reader )를 이용하여 0D 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타냈으며, 도 10는 27B6항체의 보체 의존성 세포독성 효과를 나타내는 도면이다.
도 10에서 나타낸 바와 같이， 본 발명의 실시예 2 및 4에서 각각 얻은 키메릭 27B6 및 키메릭 4B4 단클론 항체가 보체 의존성 세포독성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 8-2： 삼중음성유방암에서 CDC효과
상기 <실시예 8-1>과 실질적으로 동일한 방법으로 치료효과를 평가하나， 다만 표작세포로 A549세포주 대신에 삼중음성 f「방암 세포주 MDAMB-231를 수행하여 OD450nm에서 흡광도를 측정하여 하기 표 11에 나타냈다ᅳ 표 11은 실시예 8에 따라 4B4 키메릭 항체가 삼중음성유방암에서 보체 의존성 세포독성을 나타냄을 확인한 결과이다ᅳ
【표 11】
Figure imgf000048_0001
상기 표 11에 나타낸 바와 같이. 본 발명의 27B6 단클론항체가 폐선암에서 보체 의존성 세포 독성 작용을 나타냄을 확인할 수 있었다. <실시예 9>고형암에서의 키메릭 항체의 치료효과 (ADCC)
9-1： 항체의존성 세포독성 검사 (ADCC- LDH assay)
' 효과기 세포 (effector cell)'준비를 위해서, 사람의 혈액을 채취하여 피콜 (ficoll)용액을 첨가 한 후 (혈액: ficoll =1:2) 2000rpm에 20분간 원심분리해서 PBMC ( Per ipher a Γ Blood Mononuclear Cell)를 얻었다. 얻은 PBMC를 5% FBS 첨가 RPMI 배지에서 37°C로 보관하였다. 항체 의존성 세포독성 검사는 LDH assay 방법과 Luc if erase assay 방법을 이용하여 실험하였다.
표적세포로 다양한 고형암 세포주로서 HT29(대장암)， A549(폐선암). NCI-H460(폐선암)， MCF7(유방암) 세포를 1 x 104cel ls/wel 1로 96웰 플레이트에 준비한 후 37°C C02 incubator에서 18-20시간 배양한다. 각 웰 (well)의 배양액을 모두 제거한 후 5% 우태혈청이 포함된 배양배지에 키메릭 27B6항체를. ϋ μ g/niL， 0.1 μ g/mL , 1 3g/mL이 되도톡 ¾가하여 준비하고， 이를 배양액을 제거한 플레이트에 lOOul씩 분주한 후 37 °C 인큐베이터에서 30분간 반웅시켰다ᅵ 이후 준비된 효과기 세포를 각 well당 5 X 105(표적세포의 50배)가 되도록 넣어주고 24 시간 37°C C02 인큐베아타에 '서 배양하였다. 양성대조군으로는 용해 버퍼 (lysis buffer)를 넣고 37°C에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양한 후에 2500rpm에서 5분간 원심분리해서 상충액만 수똑한 후 표적세포로부터 용해되어 나온 LDH( lactate dehydrogenase)를 측정해서 세포 용해 정도를 계산하였다 (Promega assay kit). 그 결과 도 11에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 27B6 단클론 항체가 다양한 고형암에서 항체 의존성 세포독성 작용을 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 11). 도 11는 27B6항체의 항체 의존성 세포독성 효과 확인한 결과이다.
9-2： 삼중 음성 유방암에서 항체의존성 세포독성 검사 (ADCC-LDH assay)
효과기 세포는 상기 9-1의 방법과 동일한 방법으로 준비하고 항체 의존성 세포독성 검사를 수행하였다. : 27B6 항체는. 유방암의 분류 중 현재 치료제가 개발되 -지 않은 삼중음성유방암 세포주인 MDAMB— 231, MDAMB-468, MDAMB-453, BT-20 세포주에서 높은 항체 의존성 세포독성 작용을 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 12). 도 12은 27B6 항체의 삼중음성유방암 세포주에서의 항체 의존성 세포독성 효과 확인한 결과이다.
<실시예 10> 고형암에서의 defucosylat i on 키메릭 항체의 치료효과 (ADCC)
10-1： defucosylated Chimeric 27B6항체의 ADCC 효능확인 (Colon, lung, breast cancer)
항체 단백질의 defucosylat ion을 유도하기 위해 . 실시예 2에 따른 27B6와 실시예 4에 따른 4B4 키메릭 항체 세포주의 배양시 defucosylat ion을. 유'도하는 약물인 kifunensine을 lOOng/ml로 양액에 첨가하여 배양한 후 정제하여 defucosylation되지 않은 항체와의 ADCC 효과를 비교하였다, Colon, lung, breast 암에서. kifunensine 처리 ADCC 강화 chimeric 27B6항체의 ADCC 효능확인하였다.
그： ·.결과 ,ᅳᅳ도 13에서 보는 바와 ¾이 kiftmenSme을 처리하여 defucosylat ion을 유도한 항체 * 다양한 고형암 세포주에 처리했을 때 항체 의존성 세포독성이 증가하는 것을 확인할 수 있있다. 도 13은 Defucosylated 27B6 키메릭 항체의 항체 의존성 세포독성 검사결과이다.
10-2： defucosylated Chimeric 27B6항체의 ADCC 효능확인— 삼중음성 유방암
Luciferase ADCC assay 방법을 이용하여 삼중음성 :유방암 세포주인 MDAMB231과 HER2수용체 양성인 유방암 세포주 SK-BR3의 항체 의존성 세포독성효과를 살펴 보았을 때 역시 kifunensine을 처리하여 defucosylat ion을 유도한 항체를 처리했을 때 kifunensine을 처리하지 않은 항체보다 항체 의존성 세포독성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 14). 도 14은 Luciferase assay를 이용한 Defucosylated 27B6, 4B4 키메릭 항체의 항체 의존성 세포독성 검사를 나타낸다.
구체적으로， 표적세포로 유방암 세포주인 MDAMB231과 SK—BR3를 96well plate에 1.25xl04cel ls/wel 1로 plating 후 37 °C C02 incubator에서 20— 24시간 배양한다. 각 웰 (well)의 배양액을 제거한 후 low IgG FBS 4%가 포함되어 있는 RPMI를 세포가 플레이팅되어 있는 well에 25ul씩 첨가한다. 27B6. 4B4 항체를 최대 10ug/ml에서 3-fold로 희석하여 최저 약 1.2ng/ml까지 low IgG FBS 4%가 포함되어 있는 RPMI를 사용하여 희석한 항체시료를 준비한다. 준비된 각각의 항체시료를 해당 well에 25 ul씩 첨가한 후 pi ate의 뚜¾을 닫고 클린 벤치안에서 유지시켰다. 배양하고 있던 ADCC reporter eel 1 (ADCC Reporter Bioassay, Pr omega) 을 harvest 한 후 low IgG FBS 4%가 포함되어 있는 RPMI로 3xl06cel ls/ml이 되게 현탁 한다. 각 well에 ADCC reporter, cell 현탁액을 25 ul씩 첨가한 후 3?t C02 incubator에서 24시긴' 배양한다. 플레이트를 꺼내기 전 미리 얼려져 있는 luc if erase substrate* 중탕기에 녹여 준비해둔다. 플레이트를 꺼내 실온에서 15분 방치 후 luc if erase substrate를 각 well당 75ul씩 첨가한 후 암실에서 30분간 반웅시킨 후 lumin에 ieter를 이용하여 발광도를 측정하였다 ·, . 상기 Luc if erase assay를 이용한 Defucosylated 27B6. 4B4 키메릭 항체의 항체 의존성 세포독성 검사 결과를 도 14에 나타냈다.
도 14에서 보는 바와 같이， kifunensine을 처리하여 (lefucosylation을 유도한 키메릭 27B6 또는 4B4항체를 MDAMB231, SK-BR-3 각각에 처리했을 때 항체 의존성 세포독성이 증가하는 것을 확인하였다.
<실시예 11>마우스 실험모델에서의 27B6, 4B4항체의 치료효과
11-1： 세포주 확립
사람의 유방암 동물 모델은 삼중음성 유방암 (triple negative breast cancer) 세포주인 MDA—MB-231과 MDA—MB-453 세포주로 확립하였다. 먼저， MDA-MB-231과 MDA-MB-453 세포를 1.5 X 108 (in RPMI ： Matrigel mixture )으로 준비한 뒤 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하고 대조군. 시험군으로 무작위 배정한다. 도 15는 동물실험에 사용한 MDA-MB231 세포에 대한 실시예 2의 키메혀 27B6 , 실시예 4의 키메릭 4B4 항체의 세포 표면 결합올 추가 확인한 것이며, 도 16은 이를 이용한 동물실험에 대한 결과로서， 항체 투여에 의해 MDA-MB231 세포주에 의해 생성된 암의 성장이 저해되며 크기가 감소되는 결과이다.
시험물질은 27B6 fucose 키메릭항체, 27B6 defucose 키메릭항체, 4B4 fucose 키메릭 항체 4B4 defucose 키메릭 항체이며， 유방암 세포를 접종하고 3일 뒤부터 마우스 한 마리 당 12mg/kg의 용량을 복강 내로 투여하였다ᅳ 시험물질의 투여횟수는 주 2회 투여로 3주간 투여하고 종양 크기 주 2회 치료제 투여 전에 측정한다. Ant i-CA XI I ant ibodies의 유방암에 대한 유효성은 다음 식 ( a X b)/2 , ( a는 짧은직경， b는 긴직경)으로 계산하여: 부피로 환산된 결과로 비교한다. 실시예 20— 1,의 부피 계산식과 동일하다
[수학식]
부피 계산식 (부피 =( a X b)/2ᅳ a는 짧은직경, b는 긴직경)
11—2 : 삼중음성 유방암에 대한 항 CA-XI I ant ibodies의 유효성 평가 삼중음성 유방암 특어 발현되는 CA XI I 에피토프를 표적으로 삼증음성 유방암에 대한 키메릭 4B4 항체의 유효성을 평가하였다 (도 17) .
4B4를 투여한 유방암의 부피가 억제되는 것을 확인 했고， fucose 항체보다 defucose항체가 성장 억제 효능이 우수했다. 4B4 fucose 항체의 유방암의 성장. 억제 효능은 MDA-MB-231과 MDA-MB-453 두 종양에서 확인되었고， 특히, MDA-MB-453 모델의 경우 .21일째부터 종양이 더 이상 자라지 않는 완전관해 상태를 보였다 (도 17) . 도 17은 삼중음성 유방암에 대한 4B4 항체의 유효성 결과이다.
<실시예 12>항체 투여에 의한 세포 생존에의 영향 확인
실시예 4의 키메릭 4B4 항체를 이용하여 세포 생존에 미치는 영향을 확인하였다. 항원 CA XI I 양성 암세포에 항체 투여 시， 세포 성징- 및 생존에 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 96 웰 flat bottom plate에 cell을 3xl04cel ls/well로 전날 분주하였다 (10%RPMI) . 24hr 후 RPMI제거하고 항체를 포함한 부피가 lOOul 되도록 새로운 5% RPMI를 분주하였다. 24시간 후 CytoTox 96(상표명) Non-Radioact ive Cytotoxicity Assay kit (Pr omega, Cat G1780)를 well 당 50ul씩 분주하고 30분 동안 RT에서 반웅한 후 spectrophotometer로 세포의 활성도 측정하였다. MDA-MB231 세포에 항체 투여 후， 24시간 경과 뒤 세포 활성도를 측정하였다. '
상기 측정결과를 도 18에 나타냈으며, 항체 투여에 의한 세포 활성도의 촉진 또는 저해 현상은 나타나지 않았으며 , CA XII 효소 저해 없으며 종양세포의 성장에 무영향임을 나타낸다. 따라서， 본 발명에 따른 항체는 면역 시스템으로 통한 ADCC, CDC로 항종양 활성을 나타냈다.
A549 에 항체 투여 후， 24시간， 48시간. 72시간 경과 뒤 세포 활성도를 측정하였음ᅵ. 항체를 투여하지 않은 경우에 비교하여 세포 활성도의 변화를 크게 나타나지 않았다. 도 19 및 도 20는 4B4 항체 단독의 직접적인 결합은 암세포 성장에 영향을 주지 않음을 나타낸 결과이다.
항 CA-XII 항체로서 키메릭 4B4항체 자체의 세포 결합만으로는 세포 성장에 영향을 끼치지 않았다. 이와 같은 이유는 키메릭 4B4 항체의 경우. CA-XII 항 의 N-말단 비 효소 부위 (N-terminal non-enzymat i c region)에 결합하기 때문에， CA-XII 효소 활성에는 영향을 미치지 않기 때문으로 보인다.
<실시예 13>항체 및 Radiotherapy병용에 따른 치료 효과 평가 본 발명에 따른 항체와 방사선 요법을 함께 처리할 경우 항암 효과가 증대되는 지 확인하였다.
구체적으로， 본 발명에 따른 실시예 2의 키메릭 27B6 항체와 함께. 각각 cisplatin 5ug/ml 처리. 2 Gy 방사선 조사. 또는 4 Gy 방사선 조사를 수행한 후에， A549 세포에서의 CA XII 발현 정도의 변화를 유세포 분석기로 확인하였다. 그 결과 cisplatin 처리 및 방사선 조사 후 CA XII 항원의 세포 표면 발현이 증가되는 것으로 확인되었으며， 방사선 4 Gy 조사 시 가장 높은 발현 양상을 보였다. 이는 방사선 조사와 본 발명에 따른 CA XII 항체의 병용투여로 암세포 성장 억제에 영향을 미칠 수 있다는 가능성을 제기한다 (도 20의 상단 그래프).
이에. 병용 처리에 대한 암세포 사멸효과를 검증하기 위해， 도 20 아래 그래프와 같이, 27B6 항체와 방사선 조사를 병용 처리 한 후， A549 암세포주의 세포 사멸효과를 MTT assay로 측정하였다 도 20의 아래 그래프는 27B6 항체와 방사선 치료의 병용효과를 나타낸 결과이다. 도 20에 나타낸 바와 같이 , 항체 단독 처리 또는 항체에 대한 음성 대조군으로서 isotype control 항체와 방사선 조사 병용 처리와 비교하여， 27B6와 방사선 조사 병용 처리 시， 높은 비율로 암세포를 사멸시키는 결과를 확인하였다.
<실시예 14>항-CA-XII 키메릭 항체의 인간화
14-1： 인간화 가변 도메인의 구축 (DNP004 scFv form 선랙)
<실시예 4>에서 얻은 full IgG형태의 4B4 키메릭 항체를 주형으로 디에이치랩 소유 Phage dis lay 기술로 antibody screening을 위하^ scFv형태로 전환하였다. 이를 위해 키메릭 4B4항체의 variable region을 E.cc)I.i coclon으로 바꾸고 VL과 VH를 PCR로 연결하여 scFv gene을 제작하였다 VL과 VH의 순서 및 linker의 길이를 조합하여 여러 가지 constructs를 ' 제작한 푸 phagemid vector에 1 igat 하였다 . ligat ion한 plasmid vector는 항원인 CA XII와 결합력 분석을 통해 결합력이 가장 높은 DNP004 scFv의 VH-long 1 inker -VL 형태를 선택하여 mutagenesis template로 사용하였다.
14-2:서브 라이브러리 제작 및 스크리닝
디에치랩사의 노하우를 통하여 variable region 전체 또는 부분에 대해 random mutation sub library 또는 position specific mutation sub- library를 총 11종 제작하였다.. 제작된 Sub-library종류는 다음과 같다:
(DRandom mutation sub-library: VL 1종, VH 1종, VH&VL 2종
(2)Posi t ion specific mutation subᅳ library: LCDR 3종, HCDR 3종， VH&VL 1종
상기 제작한 11종의 서브 라이브러리를 대상으로 CA XII에 대한 bio- panning을 수행하였다. 1차 스크라닝을 통해 VL부분에 signal이 높은 clone 552개를 선정한 후, 2차 스크리닝을 통해 mother clone의 signal보다 높은 clone78개를 선별하였다. 이 후 염기서열을 확인하여 염기서열이 서로 다른 총 32개 clone을 선별하였다.
선정된 32개 clone들을 ELISA방법으로 CA XII에 대한 결합력을 재확인하여， ELISA signal이 mother clone인 4B4 키메릭 항체와 대비하여 1.5배 이상인 clone들 10종 (clone ID 1. 2, 4, 5, 8， 15, 24. 25， 26, 28)을 선정하였고， 이들의 CDR의 서열 분석 결과 LCDR1 및 LCDR 2 부분에 변이가 이 있음을 확인하였다 (도 22).
그런 후에, LCDR1 및 IXDR2 부분을 hot-spot으로 판단하여 상기 10종 (clone ID:1,. 2, 4, 5, 8， 15, 24, 25， 26. 28), 그리고 추가적으로 LCDR2부분에 변이外있는 4종 (clone ID: 11， 22， 19, 30)을 선별하여 full IgG 전환 IXK sun'P Curtis, Chimeric ant i body with human const nt regions , and mouse variable regions directed against carcinoma- associated antigen 17--1A. Proc Nat 1 Acad Sci - tj S A. 1987 Jan;84(l):214-8]을 하였디 (도 21 및 도 22). 하지만 fuil IgG로 전환한 클론들 ί4종 중 Low expression등의 이유로 clone ID: 4, ΰ, 24, 및 28욘 향후 물질 테스트 실험에서 제외하였다. 상기 10종의 선택된 클론의 변이 부위를 하기 표 12에 정리한다.
【표 12】
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000056_0001
14-3： 인간화 라이브러리의 형질감염 및 IgG의 배양 및 측정
CHO 세포를 96웰 플레이트에 접종하고， 인간화 클론들의 미니프랩한 DNA로 형질 감염시켰다. 자세한 실험방법은 아래와 같다.
먼저 CH0 세포주를 형질전환하기 12시간 전에 6-웰 플레이트에 lxl05cel l s/ml 농도로 접종하고 5%우태혈청이 포함된 DMEM 3ml를 넣어 37 °C 5% C02 조건에서 12시간 동안 배양 후 상기에서 제조된. 10종의 Ful l IgG DNA를 ViaFect: reagent 키트 (Promega, USA)를 이용하여 준비된 CHO세포에 형질전환하였다ᅳ . 세포 배양물 상층액을 형질감염 48시간 후 수집하고， 각 인간화 클론 및 대조군의 IgG 항체의 반웅성을 ELISA로 확인하였다.
Maxi srop ELISA pl ate에 wel l당 재조합 단백질 CA XI I을 lOOng 넣어 37°C에세한 시간 반웅시켜 항원을 코팅한 뒤 , lx blocking 용액 (sigma)을 we l l 당 200 ,1 넣고 37°C에ᅳ서 한 시간 반웅시켜 블로 ¾하였다. 상기 준비 ¾ 플레이트에 4B4 , 27B6. 항 CA XI I 단클론 항체 (R&D Systems) 및 PBS lOOul을 넣은 후 37°C에서 한 시간 반옹시키고 PBS로 수세하여 결합하지 않는 항체는 제거하였다ᅳ 이후 Goat ant i -Human IgG—HRP( Jackson)을 희석하여 넣어주고 30 분간 반응시킨 후 PBS로 수세한 뒤 TMB 용액을 wel l 당 50ul씩 넣어 10분간 반웅시킨 후 황산 50ul를 넣어 반응을 중지시키고 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
14-4： ELISA 를 이용한 인간화 항체 후보군 항원 친화력 테스트
항원 CA— XI I에 인간화 클론의 결합을 디에이치랩에서 제공된 프로토콜 및 항원을 이용하여 평행 시험하였다. 활성 (친화력)을 각 클론에 대해 계산하고， 동일한 플레이트 상에서 양성 대조군 (키메라 클론 4B4)의 활성과 비교하였다. 10종의 variants(clone ID 1， 2, 4, 5, 8， 15, 24, 25， 26， 28)의 항원 결합력은 mother clone(4B4 키메릭) 에 비해 크게 높지 않은 것으로 확인되었으나， ELISA상으로 예상되는 mother clone의 affinity는 약 KD 1010 M 수준으로 보이며 이는 상당히 높은 수준으로， 10종의 후보항체의 항원 결합력이 mother clone에 미치지 않더라도 그 결합력이 낮은 것은 아니라고 판단된다 (도 23 및 도 24).
<실시예 15> 인간화 항체 CDR서열 / 항체 sequence
15-1:항 -DNP004 인간화 항체 유전자 서열 선정
DNP004 인간화 항체 유전자는 CA-XII에 특이적으로 결합하는 마우스 단클론 항체 4B4 (하이브리도마 기탁번호: KCLR.F-BP-00279)의 경쇄 및 중쇄 가변영역 유전자를 주형으로 인간화 항체 제작을 진행하되 앞서 디에치랩사의 In silico노하우를 통하여 variable region 전체 또는 부분에 대해 random mut at ion sub library 또는 position specific mutation sub library를 총 10종을 제작하였다.
이렇게 제작된 library를 이용하여 phage display 방법으로 총 552개와 개별적인 clone들을 scireening하여 이들 증 mother clone보다 높은 signal을 보인 clone 78개를 선별하였다. 염기서열 확인 결과 총 32개의 서로 다른 clone을 선별하였다. 32종의 CA ΧΠ에 대한 결합력을 재확인한 결과 ELISA signal이 mother clone 대비 1.5 배 이상인 clone들 10종이 확인되었고 주로 LCDR1, 2 부분에 mutation이 있음이 확인되었다. 따라서, LCDR1, 2 부분을 hot-spot으로 판단하여 10종을 선별하고， 추가적으로 LCDR2부분에 mutation이 있는 4종 (11, 22, 19, 30)을 선별하여 full IgGl 전환을 하였다. 이렇게 준비된 full IgG 14종 중 Low expression등의 이유로 clone ID 4， 5, 24, 28을 제외한 10종을 발현 /정제 후 ELISA를 진행하여 최종 10 종을 선별하였다.
최종적으로는 마우스 단클론 항체 4B4와 가장 유사한 인간화 항체 #8번의 항체 후보를 선정하였다. 각 후보항체들은 시뭔싱을 통해 인간화 항체 유전자를 확인하였으며, 분석된 DNP004항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열은 다음과 같다 (표 13，표 14) . 하기 표 13에 나타낸 바와 같이， 증쇄 가변영역의 CDR은 동일하거나 일부가 다르지만， 경쇄 가변영역의 CDR 서열은 상이할 수 있다. 하기 서열번호 15 16. 28. 32 내지 42에서 진하게 표시한 아미노산은 변형된 것을 나타낸다.
【표 13】
Figure imgf000058_0001
【표 14】
Figure imgf000058_0002
Figure imgf000059_0001
Figure imgf000059_0003
Figure imgf000059_0002
15-2： 인간화 항체 제조
상기 제작된 항- CA XII 인간화 항체 DNP004의 아미노산 서열을 기초로, 인간화 항체를 제작하였다.
항- CA-XII 인간화 항체의 발현을 위하여， 중쇄 발현용 플라스미드와 경쇄 발현용 플라스미드를 각각 제작하였다. 중쇄 발현용 플라스미드는 pcDNA3.4 (Invitrogen 사) 백터를 사용하였고, 경쇄 발현용 플라스미드는 pOptiVEC (Invitrogen사) 백터를 사용하였다.
추가적인 아미노산 삽입 없이 항체 각각의 가변영역 코딩 cDNA와 불변영역 코딩 cDNA를 연속적인 아미노산 서열로서 발현되도록 하기 위하여， 상기 클로닝한 가변영역의 코딩 염기서열과 알려진 human IgGl 불변영역 (증쇄) 및 kappa 불변영역 (경쇄) 코딩 염기서열을 연결한 유전자 조각 각각을 합성 (Bioneer 사)하였다. 이와 같이 합성한 중쇄 및 경쇄 발현 유전자는 세한 효소 Xho I 과 Sal I으로 자른 후， 증쇄 유전자 조각은 pcDNA3.4 백터에, 경쇄 유전자 조각은 pOpt i Vec 백터에 각각 ligation 하여 완전한 항체 발현용 플라스미드를 제작하였다 (pcDNA.3.4- 4B4중쇄 발현 플라스미드 및 P0ptiVEC-4B4경쇄 발현 풀라스미드).
： 상기 제작된 pcDNA3.4—4 증쇄 발현 플라스미드와 pOpt i VEC-4B4 경쇄 발현 플라스미드를 (Ή0세포 유래인 DG44세포 (Invitrogen)에 transfection시켜 형질전환 과정을 수행하였다.
우선 transfection 3일전에 부유상태의 DG44 세포를 5 ES가 포함된
MEMa 배지에 적웅시킴으로서 부착상태 세포로 변환시켜 형질전환 효율을 높일 수 있게 적응시켰다. 형질전환은 ViaFect transfection regent (Pr omega, Cat.#: E4981)를 사용하여 6well plate에서 수행하였다. 형질전환 하루 전날 IX 105cel ls/well의 농도로 계대 배양하여 부착상태로 적응된 DG44세포를 준비하였고， 형질전환에 사용된 DNA의 양은 pOptiVEC- 4B4 경쇄 발현 플라스미드와 pcDNA3.4-4B4 중쇄 발현 플라스미드 각각 3ug, lug 씩 3: 1 비율의 조합으로 사용하였다. 형질전환은 48시간동안 수행하였다. 형질전환된 세포군을 분석하기 위하여 유세포분석기 (flow cytometer) 을 이용하였다. 도 25은 인간화 항체 DNP004의 CA— XII 양성 삼중음성유방암 세포주 MDAMB-231에서의 결합 확인을 나타내는 것이다.
<실시예 16>항체 후보군 물성 평가
인간화 항체 변이체의 발현 및 물리적 특성을 비교 평가하기 위하여
SDS—PAGE 분석， Size exclusion chromatography, Melting temperature, ANS 반응성 등을 비교 평가하였다. '
16-1： 항체 후보군- 발현량 분석
발현양 및 Protein A 정제에 의한 침전 발생 여부를 확인하가 위하여
8종 변이체 제조합 백터를 HEK293F에 도입하여 일시적 형질전환을 유도하였다.
각.각의 배양액 300niL을 protein A(GE Helthcare, Cat . No.11-0034- 93 )에 주입하고 용출버퍼 (20 rnM citric buffer pH3.0)을 사용하여 정제 하였다. 획득한 항체를 인산염 완충식염수로 투석하고 투석 전.후 정량음 실시하여 손실 여부를 확인하였다. 발현량은 1.0 ~ 10.0 ug/niL 범위로 매우 많은 차어를 나타내었으며 25, '26번 변이체에서 높은 발현율을 확인할 수 있었다 (표 16).
【표 16】
Figure imgf000061_0001
인간화 항체 변이체 #30 1.5 [5.0 ug/mL] 1.5
16-2： 항체 후보군에 대한 SDS-PAGE 분석
인간화 항체 변이체들의 중쇄 /경쇄 결합 완정성, 중쇄 및 경쇄의 단일성등을 평가하기 위하여 SDS-PAGE 분석을 실시하였다.
바환원 분석 조건에서는 항체 5 ug을 환원 분석에서는 항체 10 ug을 2X Lae隱 li sample buf fer(Bioread, Cat. No.： 161-0737)에 혼합 한 뒤 100° C에서 5분간 끓여 주고 ini-PROTEAN TGX gel (Bio-Rad, Cat. No.： 456- 1083)에 시료를 load하였다. 150V에서 1시간 동안 전기영동을 실시하고 SimplyBlue Safestain( Invi trogen, Cat. No.： LC6060)으로 2시간 동안 염색하고 증류수로 탈염하였다 인간화 항체 변이체 8종 중에서 클론 #15번 변이체의 경우 경쇄 염색이 불분명하였으나 이외의 변이체 7종에서는 이상 없음을 확인하 ¾다 (도 26).
도 26는 항체 후보군의 SDS-PAGE를 이용한 물성 분석한 결과를 보여주는 사진이다. 인간화 항체 변이체 8종 중에서 15번 변이체의 경우 경쇄 염색이 불분명하였으나 이외의 변이체 7종에서는 이상 없음을 확인하였다 (도 26). :
16-3： 항체 후보군에 대한 SE-HPLC 분석 .
순도 평가를 위하여 Size exc 1 us i on-chromatogr aphy 분석을 실시하였다.
각각의 항체를 인산염완충식염수로 희석하여 1.0 ing/mL로 준비하고 평형버퍼 (0.1M sodium phosphate, 0.1M sodium chloride pH7.0)로 평형화한 TSKgel G3000SWXL(TOSOH)에 20 uL 주입하였다. 0.5 niL/min 유속으로 평형버퍼를 40분 동안 홀러주면서 용출되는 단백질을 280 nni 파장으로 검출하였다. 검출된 피크를 자동적분으로 적분하여 각각의 피크에 대한 면적을 계산하였고, 주피크의 면적비를 백분율로 기술하였다.
대부분의 변이체들의 주피크 면적비는 95% 이상의 순도를 나타내었으나 변이체 #11, 26번의 경우 94.3%, 94.1% 순도로 상대적으로 다소 낮게 평가 되었다 (표 17).
【표 17】
Figure imgf000063_0001
16-4： 항체 후보군- Melting temperature (Tm) 분석
견고성 (robustness) 비교 평가를 위하여 인간화 항체 변이체들의
Melting temperature를 측정하였다.
항체 변이체 ' 0.44 ug에 Protein thermal shift dye와 bufferdnvitrogen, Cat. No.： 4462263)을 제조사 매뉴얼에 따라 첨가하여 흔합액 20uL을 제조하여 Protein Thermal Shift™ Software vl.O이 탑재된 Real time PCR에 주입하였다. 0.05 °C/sec 속도로 25° C부터 95 °C까지 연속적으로 온도를 증가시키면서 Protein thermal shift dye와 항체간의 결합에 의하여 방출되는 형광값을 검출하였다. 시험완료 후 V A (상표명)
7 Software로 Boltzmann fitting을 구현하고 각각의 항체에 대한 melting temperature(Tni)를 계산하였다. 8번 변이체의 경우 Tin 71.41 °C 가장 견고한 항체로 평가되었다. Tm과 순도간의 상관관계를 확인하기 위하여 각각의 변이체를 62 °C 고은조건에서 3시간 방치한 뒤 Size exclusion chromatography 분석을 실시하고 주피크의 면적비를 계산하였다.
변이체 8번의 경우 62°C 고은조건에서 가장 많은 주피크 비율을 나타내었으며， Tm 분석 값과 동일하게 가장 견고한 변이체로 측정되었다 (표 18).
【표 18】·
Figure imgf000064_0001
16- 5： CA XII 양성세포주 결합력 평가
CA XII 항원을 발현하는 MDAMB231 유방암 세포주 10% heat inactivated: FBS가 첨가된 RPMI 1640(GIBC0, invitrogen)에서 배양한 뒤 Trypsine-EDTA(Invitrogen)으로 탈착 한 뒤 인산염완충식염수 넣고 원심분리하여 세척하고 2 X 106 cells/tube로 분주하였다.
인간화 항체 변이체를 1.0 ug/mL 농도가 되도톡 각각의 tube에 넣어 주고 넁장에서 30분 반웅하였다. 인산염완충식염수를ᅵ 넣고 원심분리하여 세척하고 FITC 표지 2차 항체 Goat ant i -Mouse IgG(H+U— FITC (다이노니 넣어 냉장에서 20분 반웅하였다. 인산염완충식염수로 한 번 더 원심분리하여 세척하고 1% formaldehyde가 첨가된 인산염 완충식염수로 세포를 부유하여 유세포분석기 (Stratedigiii, SlOOOEXi)로 형광을 분석하였다ᅳ MDAMB231 세포주에 결합하는 4B4 키메릭 항체의 Mean Fluorescence
Intensity(MFI)을 기준으로 변이체들의 결합력을 백분율로 도 28과 같이 나타내었다. 모든 변이체 모두 90% 이상의 상대적 '결합력을 보였으며， 변이체 8, 11, 15 및 26번은 99%의 상대적 결합력을 나타내어 키메릭 항체와 거의 차이가 없었다 (도 27).
<실시예 17>다양한세포주에서 인간화항체 발현 분석
17- 1:다양한 세포주에서 항체 발현 CLB( Korean Cell Line Bank)와 SNU( Seoul National University)를 통해 확보한 다양한 암 세포주에서의 인간화 항체 (DNP004) 항체의 결합 여부를 유세포 분석기 (flow cytometry)로 확인하였다. 구체적으로 암세포주는 KCLB Korean Cell Line Bank)와 SNl Seoul National University)를. 통해 얻었으며 LNCap, MCF—7, Huh7, Hs-578T 는 10% heat inactivated fetal bovine serum(FBS; GIBCO, invi trogen)가점가된 Dubco's MEM(GIBC0, invitrogen) 배지를 A549, NCI-H460, DLD-1, HT-29, LS174T, PC-3, SNU638, SNU719, MKN45, NCI-N87, SK-BR3, MDA-MB231, MDA—MB453은 10% heat inactivated FBS이 첨가된 RPMI 1640 (GIBCO, invitrogen) 배지를 이용해 37°C에서 5%C02상태의 배양기를 이용해 배양하였다. 또한 Hep3B.l-7, PLC/PRF/5은 10% heat inactivated fetal bovine serum(FBS; GIBCO. invitrogen)가 첨가된 Eagle's MEM(GIBC0, invitrogen) 배지를， KAT0 ΠΙ는 20% heat inactivated fetal bovine serum(FBS; GIBCO, ' mvi trogen) 7f 첨가된 IMDIvKGIBCO, invitrogen) 배지가 첨가된 Medium 이용해 37°C에서 5% C02. 상태의 배양기를 이용해 배양하였다.
상기 배양된 암세포주에 본 발명의 인간회ᅳ 항체 (DNP004)를 각각 넣어 4t에서 30분간 반웅시 ¾ 후 PBS로 수세하고, FiTC-conjugated goa!: anti-Huma I G (DiNona Inc, Korea)를 넣어 4°C에서 15분간 배양하 ¾다. 다시 PBS로 수세한 후 FACSca liber (Bee ton Dickinson, USA)로 분석하여 그 결과를 아래에 기재하였다 (표 19). 하기 표 19는 다양한 고형암 세포주에서 carbonic anhydrase 12항원에 대한 발현 양상을 나타낸다. 표 19에서 DNP004양성 세포의 퍼센트는 FACS분석법으로 분석하였으며， 실험대상 5000개 세포 중에서 DNP004항체와 결합하는 세포의 수를 %로 계산하여， -는 양성 세포수가 10% 미만, +은 양성 세포수가 10~30%범위. ++은 양성 세포수가 30~70%범위이고, +++은 양성 세포수가 70 100%로 지정하였다
【표 19]
Figure imgf000065_0001
Co 1 on DLD-1 - +
HT-29 + +++
LS174T +++ +++
Gastr ic SNU 638 - +
SNU719 ++ ++
KATO III - +++
M N 45 +++ +++
Liver Huh一 7 ++ +++
Hep3B.l-7 + +
PLC/PRF/5 . +++ +++
Prostate LNCap + ᅳ
Kidney 786-0 +++ +++
Breast MCF-7 + ++
S -BR3 +++ ++
MDAMB231 +++ +·!- +
DAMB453 ++ +++
Hs-578T - ++
PBMC Lymphocyte - ― .
Monocyte -
Granulocyte 상기 표 19에 기재한 바와 같이， 같은 origin의 세포라도 세포주 구축시 Tissue 소스가 다르기 때문에 세포 종류에 따라 양성반응의 정도는 차이가 날 수 이 있으나, 본 발명의 인간화 항체 DNP004는 다양한 종류의 폐선암, 대장암， 위암. 간암 및 유방암 세포주에서 결합정도의 차이는 보이지만 양성반응을 나타내었으며, 전립선 암에서는 음성반웅을 나타냄을 확인하였다ᅳ 반면 말초혈액유래 림프구와 단핵구， 과립구에는 모두 음성인 반응을 보이는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 인간화 항체 DNP004가 양성반응을 나타내는 고형암을 적웅증으로 하는 치료제로서 사용할 수 있음을 나타낸 것이다.
17-2： 다양한 유형의 유방암세포에서 발현양상 DNP004항체는 ER,PR뿐만 아니라 HER2 positive인 Breast cancer cell에서도 모두 양성 반웅을 보인다. 따라서, 삼중음성 유방암 (Triple negative breast cancer) 뿐만 아니라. 다양한 유형의 유방암 치료제로도 쓰일 수 있다. 세가지 서로 다른 표현형의 유방암 세포주에서의 DNP004 인간화 항체의 결합 여부를 유세포 분석기 (flow cytometry)로 확인하고. chimeric 4B4와 결합정도의 차이를 비교하였다.
구체적으로, MDAMBᅳ 231 및 MDAMB453, MCF-7 , S -BR-3 세포주는 상기 <실시예 5-2>와 동일한 방법으로 배양하였다. 상기 배양된 암세포주에 DNP004 인간화 항체를 각각 넣어 4°C에서 30분간 반웅시킨 후 PBS로 수세하고， FITC-conjugated goat ant i- Human IgG(DiNona Inc , Korea)를 넣어 4°C에서 15분간 배양하였다. 다시 PBS로 수세한 후 FACS caliber (Bee ton Dickinson. USA)로 분석하여 그 결과를 도 28 및 도 29에 기재하였다.
도 28 및 도 29는 다양한 유형의 유방암 세포에서 DNP004 인간화 항체의 carbonic anhydrase 12항원에 대한 결합 양상 확인한 결과이 . 따라서 , 본 발명에. 따른 DNP004 인간화 항체는 ER,PR뿐만 아니라 HER2 ： 양성 유방암 세포에서도 모두양성 반웅을 보미므로, 삼중음성 유방암 (Triple negative breast cancer)뿐만 아니라 다양한 유형의 유방암에서도 치료제로 쓰일 수 있다. '
<실시예 18> 다양한고형암에 대한 인간화 항체의 치료효과 (ADCC) 다양한 고형암에서 항체의존성 세포독성 (ADCC)을 Luc if erase assay 으로 평가하였다. 표적세포로 유방암 세포주인 MDAMB-231과 MDAMB— 453， MCF7, SK-B 3, 폐암 세포주인 A549. 간암 세포주인 Huh7과 HEP3B, 위암 세포주인 KAT0 III, SNU719. MKN-45를 96-\vell pi ate에 1.25 x 104 eel ls/well로 plating 후 37 °C C02 incubator에서 20-24시간 배양한다. 각 웰 (well)의 배양액을 제거한 후 low IgG FBS 4%가 포함되어 있는 RPMI를 플레이팅되어 있는 well에 25ul씩 첨가한다. 실시예 15에 의한— DNP004 인간화 항체를 최대 10ug/ml에서 3-fold로 희석하여 최저 약 1.2ng/ml까지 low IgG FBS 4%가 포함되어 있는 RPMI를 사용하여 희석한 항체시료를 준비한다. 준비된 각각의 항체시료를 해당 well에 각 농도에 맞게 첨가한 후 plate의 뚜껑을 닫고 클린 벤치안에서 유지시켰다. 배양하고 있던 ADCC reporter eel 1 (ADCC Reporter Bi 5 oassay, Pr omega) 을 harvest 한 후 low IgG FBS 4%가 포함되어 있는 RPMI로 3xl06cel ls/ml이 되게 현탁하였다. 각 well에 ADCC reporter cell 현탁액을 25 ul씩 첨가한 후 37°C C02 incubator에서 24시간 배양하였다.
플레이트를 꺼내기 전 미리 얼려져 있는 luciferase substrate를 중탕기에 녹여 준비해둔다ᅳ 플레이트를 꺼내 실온에서 15분 방치 후 luciferase substrate를 각 well당 75ul씩 첨가한 후 암실에서 30분간 반응시킨 후 luminometer를 이용하여 발광도를 측정하였다.
도 30는 DNP004 인간화. 항체의 유방암 세포주에서의 항체 의존성 세포독성 효과 확인 결과이고, 도 31은 DNP004 인간화 힝체의 폐암 세포주 A549에서의 항체 의존성 세포독성 효과 확인 결과이고， 도 32은 DNP004 인간화 항체의 간암 세포주 Huh7과 HEP3B 에서의 항체 의존성 세포독성 효과를 확인 결과이고, 도 33은 DNP004 인간화 항체의 위암 세포주 KAT0 ί II, SNU719, MKN— 45에서와 항체 의존성 세포독성 효과를 확인 결과를 나타낸다.
따라서， 본 발명에 따른 DNP004 인간화 항체는 · DNP004항원 (CA XII， Carbonic anhydrase XII)이 발현되는 다양한 유형의 고형암 세포에서 항체 의존성 세포독성 효과에 의한 세포사멸기전이 있음을 입증하였다.
<실시예 19>마우스실험모델을 이용한 인간화항체의 치료효과평가
19-1： 유방암 동물모델 / 단일 농도의 항체、투여군 실험
사람의 유방암 동물 모델은 삼중음성 유방암 (triple negative breast cancer) 세포주인 MDA-MB-453 세포주로 확립하였다. 먼저, 1.5 X 107 세포수의 MDA-MB-453 세포를 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하고, 종양형성과 성장을 관찰하였으며. 종양 크기는 하기 수학식에 의해 계산하였다. (부피 =(a x b)/2 , a는 짧은직경 , b는 긴직경)
종양의 크기가 100 瞧3 ± 20 에 도달했을 때， 마우스를 무작위적으로 대조군 그룹 (5 마리) 과 처리군 그룹 (5 마리) 으로 분리하고, 처치군 그룹에 DNP004 인간화 항체는 10 mg/kg 양을 마우스 꼬리 정맥으로 투여하였다. 이 후， 종양은 실험 기간 동안 3—4 일 간격으로 일주일에 2 회 측정하고， 종양 성장곡선은 항체 투여시작일로부터 실험 종료 시점까지 하였으며, 상기 결과의 평균값을 도 34a 에 나타냈다. 따라서， 인간화 항체 투여군은 대부분의 종양 성장이 억제되는 결과를 보였다 (도 34) .
19-2 : 유방암 동물모델 / 복수의 농도의 항체 투여군 실험
상기 실시예 19-1 과 동일한 유방암 동물모델을 이용하여， DNP004 인간화 항체를 다양한 농도로 투여하는 실험을 진행하였다.
구체적으로.， 4 mg/kg , 8 mg/kg, 16 mg/kg . 32 mg/kg 로서 4 가자, 농도로 투여한 항체 투여군 (그룹)을 각 그룹 당 5마리씩 실험을 진행하였다. 16 mg/kg 용량의 항체 투여군에서는 부분적인 종양 :억제 효과를 보여 전체적으로 용량과 비례적으로 종양 억제 효과를 보이지는 않았지만， 종양 성징ᅳ이 완전히 억제되는 완전 관해 ( compl ete remi ss i on) 상태의 결과는 /항체 루여 용량이 높을수록. 증가하는 경향을 보였다 (도 35， 표 20) .
【표 20]
Figure imgf000069_0001
215 0
201 . 213
214 182
3 (DNP004 8 mg/kg) 189 0 (com lete remission)
196 0 (complete remission)
228 0 (complete remission)
224 333
217 486
4 (DNP004 16 mg/kg) 195 0 (com lete remission)
206 135
205 0 (complete remission)
222 0 (complete remi ssion)
234 175
5 (DNP004 32 mg/kg) 209 0 (complete remission)
200 0 (complete remission)
188 0 (com lete remission)
19-8： 신장암 동물모델 / 단일 농도의 항체 투여군 실험
인간화 항체 (DNP004)의 타깃 항원 (CA-XII)이 높게 발현되는- 신장암 (Renal cell cancer) 세포주인 786-0 세포를 이용하여， 마우스 동물모델 확립 및 항 종양 효과를 확인하였다 (도 36).
구체적으로， 누드 마우스에 1.5 X 107 세포수의 786-0 세포주를 피하 주사하였다. 그러나， 이 실험 세트의 경우 종양'형성은 위 유방암 세포주의 경우와 달리 매우 늦게 이뤄졌으며， 약 70 일 이후 종양 형성을 확인하였다. 상기 종양 형성이 확인된 처치군 그룹에 DNP004 인간화 항체는 32 mg/kg 양을 마우스 꼬라 정맥으로 투여하였다. 이 후， 종양은 실험 기간 동안 3-4 일 간격으로 일주일에 2 회 측정하고， 종양 성장곡선은 항체 투여시작일로부터 실험 종료 시점까지 하였으며， 대조군 3마리 대비 DNP004 인간화 항체 투여군 8 마리의 개별 마우스의 평균 종양 성장 곡선을 도 36에 나타냈다. 따라서， 유방암뿐만 아니라 신장암에서도 DNP004 인간화 항체의 ᅳ항암효과를 확인하였다.
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FORM BP/4

Claims

【청구의 범위】
【청구항 11
탄산 탈수소화 효소 XI I (carboni c anhydrase XI I , CA XI I )의 비촉매적 도메인 (non— catalyt i c domain)에 결합하는 항 _CA XI I 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 비촉매적 도메인에 항체가 결합하는 부위 (항원결정부위 (epi tope)는， 서열번호 5의 아미노산 서열 중에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하며 연속하는 7개 아미노산 내지 93개 아미노산의 길이를 갖는 펩타이드인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 3】
제 2항에 있어서, . 상기 비촉매적 도메인에 항체가 결합하는 부위 (항원결정부위 (epi tope)는， 서열번호 5의 아미노산 서열 중에서 서열번호 2의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하며 연속하는 14개 아미노산 내지 93개 아미.노산의 길이를 갖는 펩타이드인 항체 또는 이의 항¾ 결합 단편 .
【청구항 4]
제 3항에 있어서， 상기 항체의 항원결정부위 (epi tope)는， 서열번호 2의 아미노산 서열중에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 연속하는 7개 내지 14개 아미노산의 길이를 갖는 펩타이드인 항체 또는 이의 항원 결합 단편 .
【청구항 5】
제 1항에 있어서, 상기. 비촉매적 도메인에 항체가 결합하는 부위 (항원결정부위 (epi tope)는. 서열번호 5의 아미노산 서열 중에서 서열번호 3의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하며 연속하는 14개 아미노산 내지 93개 아미노산의 길이를 갖는 펩타이드인 항체 또는 이의 항원 결합 단편 .
【청구항 6】 제 5항에 있어서 , 상기 항체의 항원결정부위 (epitope)는 서열번호 5의 아미노산 서열 중에서 서열번호 4의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하며 연속하는 19개 아미노산 내지 93개 아미노산의 길이를 갖는 펩타이드인 항체 또는 이의 항원 결합 단편 .
【청구항 71
제 6항에 있어서， 상기 항체의 항원결정부위 (epitope)는. 서열번호 4의 아미노산 서열중에서 서열번호 3의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 연속하는 14개 내지 19개 아미노산의 길이를 갖는 펩타이드인 항체 또는 이의 항원 결합 단편 .
【청구항 8】
제 1항에 있어서， 상기 비촉매적 도메인에 항체가 결합하는 부위 (항원결정부위 (epitope)는， 서열번호 5의 아미노산 서열 중에서 서열번호 ᄂ 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 '이 ·미노산 서열을 포함하는 연속적인 7개 아미노산 내지 93개 아미노산 길이를 갖는 펩타이드인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 9】
제 2항에 있어서., 서열번호 6 내지 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역의 상보성 결정부위 (complementarity determining region; CDRs) 및 서열번호 9 내지 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역의 CDR를 포함하는 항체인 또는 이의 항원 결합 단편 .
【청구항 10】
제 5항에 있어서， 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체인 또는 이의 항원 결합 단편 .
【청구항 11】
제 5항에 있어서， 서열번호 14 내지 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역의 상보성 결정부위 (complementarity determining region; CDRs) 및 서열번호 17 내지 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역의 CDR를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 .
【청구항 12】
제 11항에 있어서， 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체인 또는 이의 항원 결합 단편 .
【청구항 13】
제 1항쎄 있어서， 상기 항체는 서열번호 14， 15 및 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역의 상보성 결정부위 (compl ementar i ty determining regi on ; CDRs) 및 서열번호 29， 30 및 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역의 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 14】
제 13항에 있어서， 상기 항체의 경쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 32 또는 33의 이"미노산 서열을 포함하는 것， 또는 경쇄 가변영역의 CDR2는 서열번호 33 내지 42로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편 .
【청구항 15】
제 13항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 43 내지 46의 아미노산 서열을 포함하는 중ᅵ쇄 '가변영역의 프레임워크를 추가로 포함하는 것인 함체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 16】
제 13항에 있어서， 상기 항체는 서열번호 47， 48 , 51 및 .52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역의 프레임워크를 추가로 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 17】
제 16항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역의 프레임워크는, 서열번호 49 또는 50의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 .
【청구항 18]
제 13항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 53의 VH 영역 아미노산 서열 및 서열번호 54 내지 63로 이루어지는 군에서 선택된 VL 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체인 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 19】
기탁번호 KCLRF-BP-00279 또는 KCLRF— BP-00280을 갖는 하이브리도마부터 생산된 항 CA-XII 항체의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR- LI, CDR-L2, 및 CDR-L3를 포함하는 항 CA-XII 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 20]
제 19항에 있어서， 기탁번호 KCLRF-BP-00279 또는 KCLRF-BP— 00280을 갖는 하이브리도마부터 생산된 항 CA-XII 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 .
[청구항 21】 제 1항 내지 제 20항 증 어느 한 항에 있어서， 상기 함 CA— XII 항체는 동물 항체, 키메릭 항체， 또는 인간화 항체인， 항 CA— XII 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 22】 제 1항 내^ 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, CA-XII에 대하여 작용제 (agonist) 활성을 갖는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 23] 제 1항 내지 제 20항중 어느 한항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 상기 항 CA-XII 항체의 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2인， 항 -CD66c 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 24】
제 1항 내지 제 20항증 어느 한항에 있어서. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표지기, 독성물질 또는 항암제가 추가로 결합된 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 25】
제 24항에 있어서， 상기 표지기는 방사선동위원소, 합텐, 형광 물질, 크로모젠 (chroniogen) 및 염색 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 26]
제 24항에 있어서， 상기 독성물질은 방사선동위원소， 소분자， 펩타이드, 또는 단백질인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
【청구항 27]
제 24항에 있어서， 상기 항체 또는 항원 결합 단편은, 독성 물질과 결합되어 융합단백질 ( fusion protein)을 형성하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편 .
[청구항 28】
제 1항에 있어서， 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 항체에 결합된 푸코오스 (FUC0SE)의 일부 또는 전부가 제거된 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편 .
[청구항 29】
제 1항 내지 제 20항중 어느 한항에 따른 탄산탈수소화 효소 (carboni c anhyclrase)의 비촉매적 도메인 (non-atalyt i c domain)에 결합하는 항체 또는 c !의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분지 - ,.
【청구항 30】
제丄항 내지 제 20항중 어느 한항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자가 도입된 백터.
【청구항 31】
제 1항 내지 제 20중 어느 한항에 따른 탄산 탈수소화 효소 ( carboni c anhyclrase)의 비촉매적 도메인 (non-atalyt i c domain)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하는 숙주.
【청구항 32】
제 31항에 있어서， 상기 숙주는 하이브리도만 세포인 숙주.
【청구항 33]
제 31항에 있어서， 상기 숙주는 탄산 탈수소화 효소 (carboni c anhyclrase)의 비촉매적 도메인 (non-ata lyt i c domain)을 인식하여 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하며 , 수탁번호 KCLRF-BP-00280 또는 KCLRF-BP-00279을 갖는 하이브리도마 세포인 것인 숙주.
【청구항 34】
제 1항 내지 제 20항중 어느 한항에 따른 탄산 탈수소 Sf 효소 (carboni c anhydrase)의 비촉매적 도메인 (non—atalyt i c ctomain)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 고형암의 예방ᅳ 경감 또는 치료용 약학 조성물.
【청구항 35】
제 34항에 있어서, 상기 고형암은 유방암, 폐암， 대장암， 위암, 전립선암， 간암인 약학 조성물.
【청구항 36】
제 35항에 있어서, 상기 고형암은 유방암은 삼중음성 유방암인 약학 조성물.
【청구항 37】
제 34항에. 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원결합단편은 독성물질이 추가로 결합된 것인 약학 조성물.
【청구항 38】
제 37항에 있어서， 상기 화학적 항암제 또는 상이한 항체 항암제가 추가로 포함하는 것인 약학 조성물.
【청구항 39】
제 38항에 있어서， 상기 약학 조성물의 투여는 방사선 항암방법과 함께 수행되는 것인 약학 조성물.
【청구항 40】
제 1항 내지 제 20항중 어느 한항에 따른 탄산 탈수소화 효소 (carboni c anhydrase)의 비촉매적 도메인 (non-ata lyt i c domain)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 대상 시료와 상기 항체 또는 항원결합단편의 양성반응을 나타내는 시료를 고형암으로 탐지하는 고형암의 검출용 조성물.
【청구항 41】 제 40항에 있어서， 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표지기가 결합된 것인 고형암의 검출용 조성물.
【청구항 42]
제 41항에 있어서， 상기 고형암은 유방암， 폐암， 대장암, 위암， 전립선암， 간암인 고형암의 검출용 조성물.
【청구항 43】
제 42항에 있어서, 상기 양성반응은 효소 반웅， 형광， 발광 또는 방사선을 검출하여 판단하는 것인 고형암의 검출용 조성물.
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