WO2019132045A1 - 金属錯体粒子及びそれを用いた免疫測定用試薬 - Google Patents

金属錯体粒子及びそれを用いた免疫測定用試薬 Download PDF

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秀平 大日方
脇屋　武司
真亜紗 家治
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    • C09K2211/182—Metal complexes of the rare earth metals, i.e. Sc, Y or lanthanide

Definitions

  • the present invention relates to metal complex particles and reagents for immunoassay using the same.
  • a biological substance such as a protein in a biological sample
  • methods for measuring or purifying a sample containing a biological substance, such as a protein in a biological sample are known.
  • a biological substance such as a protein in a biological sample
  • the particles are washed to recover the particles bound with the protein etc.
  • Examples include a method of measuring the amount of bound protein and a method of dissociating in a protein dissociation solution for purification.
  • Patent Documents 1 and 2 disclose that particles having magnetism are used because they can be easily separated and recovered by magnetic force.
  • Patent Document 3 discloses particles having magnetism and fluorescence by impregnating a polymer layer formed on the surface of ferrite particles with a europium chelate complex.
  • Patent Document 4 (3) finely cross-linked polymer-coated magnetic particles from which water has been removed by alcohol washing or the like are added to an acetone solution in which a europium chelate complex is dissolved to swell the polymer layer and simultaneously europium chelate complex A method is also described in which water is added, water is added, and acetone is evaporated to obtain an aqueous suspension of europium chelate complex-containing magnetic particles.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Publication No. 2005-062087 Patent Document 2 International Publication No. 2012-173002 Patent Document 3 Japanese Patent Application Publication No. 2008-127454 Patent Document 4 International Publication No. 2010-029739
  • Patent Document 3 since the maximum diameter of the magnetic particles obtained is 300 nm, the amount of phosphor or magnetic substance contained in one particle is small, and the separation by the magnet is performed. Since the separation speed is low and the fluorescence is absorbed by the ferrite, there is a problem that sufficient fluorescence can not be obtained and the sensitivity is low. Further, Patent Document 3 has no specific example of the method (1), and when acetone is considered to be preferable, an acetone solution of europium chelate complex is added to the polymer-coated magnetic particle water suspension At that time, it was difficult to precipitate the europium complex and to incorporate the necessary amount into the polymer layer.
  • An object of the present invention is to provide metal complex particles having excellent magnetism and having both magnetism and fluorescence and a reagent for immunoassay using the same.
  • the present invention relates to the following contents.
  • a metal complex particle comprising a magnetic substance and a particle size adjusting composition containing a hydrophobic polymer, wherein the magnetic substance is a metal having both magnetism and fluorescence, comprising a metal ion and a ligand Metal complex particles, comprising a complex, wherein the content of the particle size adjusting composition in the metal complex particles is less than 60% by weight.
  • the ligand forming the metal complex is (1) ⁇ -diketone based ligand is dibenzoylmethane or tenoyl fluoroacetone, (2) heterocyclic based ligand is 2,2 1'-bipyridyl, 2,2 ': 6,2'-terpyridine, or 1,10-phenanthrolin,
  • a reagent for immunoassay comprising the metal complex particle according to (10).
  • a metal complex particle having excellent magnetism and having both magnetism and fluorescence and a reagent for immunoassay using the same are provided.
  • FIG. 1A is a diagram showing an outline of metal distribution in a particle cross section
  • FIG. 1B is a partially enlarged view showing an outline of metal distribution in a particle cross section
  • FIGS. 2A and 2B each show an outline of the metal distribution of the particle cross section according to the prior art.
  • the present invention comprises a magnetic material and a particle size adjusting composition comprising a hydrophobic polymer
  • the magnetic substance relates to a metal complex particle comprising a metal complex having both magnetism and fluorescence, which comprises a metal ion and a ligand, and the content of the particle size adjusting composition in the metal complex particle is less than 60 w%.
  • the metal complex particles preferably contain only a metal complex as a substance having magnetism.
  • the metal complex particles of the present invention have a high content rate of the metal complex having magnetism, so that they have high magnetism and at the same time the amount of magnetism per particle becomes uniform. Response to the magnetic force is uniform, and the variation during separation is reduced.
  • the metal complex has not only magnetism but also fluorescence properties
  • the use of this metal complex particle as a reagent for immunoassays increases the detection sensitivity.
  • the type of metal complex it is possible to change the fluorescence spectrum of the metal complex particle, and the color of the metal complex particle is changed. Can be avoided.
  • the metal complex particle of the present invention has magnetism and fluorescence in the same metal complex as particles containing the magnetic substance and the phosphor, respectively, so there is no negative interaction between the magnetism expressing substance and the fluorescence expressing substance, and the magnetism is magnetic And fluorescence can be expressed effectively.
  • the metal complex particles of the present invention can increase the content of the metal complex, it is possible to express high magnetism.
  • the metal complex particles of the present invention have the same particle size, the response to the magnet is also uniform, so that uniform magnetism is exhibited.
  • the above-described particle size adjusting composition contains, as a main component, a polymer (hereinafter, also simply referred to as “polymer”) obtained by polymerizing (also including polycondensation) a polymerizable monomer (hereinafter also simply referred to as “monomer”)
  • the polymers also comprise copolymers of one or more polymerizable monomers.
  • polymer examples include (unsaturated) hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, (unsaturated) fatty acids, aromatic carboxylic acids, (unsaturated) ketones, aromatic ketones, (unsaturated) alcohols, aromatic alcohols, Examples thereof include polymers composed of one or more polymerizable monomers of (un) saturated amines, aromatic amines, (unsaturated) thiols, aromatic thiols, and organosilicon compounds.
  • polystyrene examples include polyolefins such as polyethylene, polypropylene, polybutylene, polymethylpentene and polybutadiene; polyethers such as polyethylene glycol, polypropylene glycol and tetramethylene glycol; polystyrene; poly (meth) acrylic acid; poly (meth) Acrylic acid ester, polyvinyl alcohol, polyvinyl ester, polyvinyl ether, phenol resin, melamine resin, benzoguanamine resin, allyl resin, furan resin, (un) saturated polyester, epoxy resin, polysiloxane, polyamide, polyimide, polyurethane, Teflon (registered trademark) Acrylonitrile / Styrene resin; Styrene / Butadiene resin; Halogenated vinyl resin; Polycarbonate; Polyacetal; Rusuruhon; polyphenylene oxide; polyetheretherketone; sugar; starch; cellulose; polypeptide, and polymers obtained by a variety of poly
  • polymers may be used alone or in combination of two or more.
  • the above-mentioned polymer is produced by radical polymerization, ionic polymerization, coordination polymerization, ring opening polymerization, isomerization polymerization, cyclopolymerization, elimination polymerization, polyaddition, polycondensation, addition condensation.
  • the above polymerizable monomers may be used alone or in combination of two or more in any proportion.
  • the combination of two or more kinds of polymerizable monomers is a combination of two or more kinds of monofunctional polymerizable monomers, a combination of two or more kinds of polyfunctional polymerizable monomers, one or more Or a combination of one or more of the monofunctional polymerizable monomers and one or more polyfunctional polymerizable monomers.
  • the molecular weight of these polymers is, for example, 80 or more and 30,000 or less, but is not particularly limited.
  • molecular weight means, for multimers, a weight average molecular weight measured by gel permeation chromatography (GPC) in terms of polystyrene.
  • GPC gel permeation chromatography
  • the weight average molecular weight described later is a value measured by the following measurement.
  • GPC device APC system (manufactured by Waters) Column: HSPgel HR MB-M (manufactured by Waters) 6.0 ⁇ 150 mm Eluent: tetrahydrofuran (THF), flow rate: 0.5 mL / min, column temperature: 40 ° C., injection amount: 10 ⁇ L, detector: RI
  • the above-mentioned polymerizable monomer (hereinafter, also simply referred to as "monomer”) is not particularly limited as long as it is a compound containing one or more polymerizable functional groups in one molecule, and one polymerizable functional group is contained in one molecule. Even if it is a monofunctional monomer containing, it may be a polyfunctional monomer containing two or more polymerizable functional groups in one molecule. Also, it may be an oligomer or prepolymer containing one or more polymerizable functional groups in one molecule.
  • the polymerizable functional group may be a radical polymerizable functional group, an ion polymerizable functional group, or a coordination polymerizable functional group, and is preferably a radical polymerizable functional group.
  • polymerizable groups such as an ethylenically unsaturated bond-containing group, an epoxy group, an oxetane group, and a methylol group can be mentioned, and an ethylenically unsaturated group is more preferable.
  • Examples of the ethylenically unsaturated group include (meth) acryloyloxy group, (meth) acryloyl group, vinyl group, aromatic vinyl group and allyl group, and (meth) acryloyl group, vinyl group and aromatic vinyl group Is more preferred.
  • the description of “(meth) acryloyl group” is used in the meaning of at least one of an acryloyl group and a methacryloyl group. The same applies to “(meth) acryloyloxy group”, “(meth) acrylate”, “(meth) acrylic” and the like.
  • polyfunctional monomers the number of polymerizable groups contained in the compound is two or more in one molecule.
  • monofunctional monomers having a (meth) acryloyl group methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, propyl (meth) acrylate, butyl (meth) acrylate, 2-ethylhexyl (meth) acrylate, lauryl (meth ) Acrylate, cetyl (meth) acrylate, stearyl (meth) acrylate, cyclohexyl (meth) acrylate, isobornyl (meth) acrylate, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, glycerol (meth) acrylate, polyoxyethylene (meth) acrylate, Glycidyl (meth) acrylate, trifluoromethyl (meth) acrylate, pentafluoroethyl (meth) acrylate, pentafluoroethyl (meth) acrylate, pentafluoroethyl (me
  • monofunctional monomers having an aromatic vinyl group examples include aromatic vinyl monomers such as styrene, ⁇ -methylstyrene, chlorostyrene, vinyl naphthalene, 4-vinylbiphenyl, p-styryltrimethoxysilane and the like.
  • polyfunctional monomers having a (meth) acryloyl group it is possible to use tramethylolmethane tetra (meth) acrylate, tetramethylolmethane tri (meth) acrylate, tetramethylolmethane di (meth) acrylate, trimethylolpropane tri (meth) acrylate , Dipentaerythritol hexa (meth) acrylate, dipentaerythritol penta (meth) acrylate, glycerol tri (meth) acrylate, glycerol di (meth) acrylate, (poly) ethylene glycol di (meth) acrylate, (poly) propylene glycol di (Meth) acrylate, (poly) tetramethylene glycol di (meth)
  • polyfunctional monomer having a vinyl group examples include 1,4-divinyloxybutane, divinyl sulfone, 9,9′-bis (4-allyloxyphenyl) fluorene, ethylmethyldivinylsilane and the like.
  • polyfunctional monomer having an aromatic vinyl group examples include aromatic vinyl monomers such as divinylbenzene, divinylnaphthalene and divinylbiphenyl.
  • allyl monomers such as triallyl (iso) cyanurate, triallyl trimellitate, diallyl phthalate, diallyl acrylamide, diallyl ether, 9,9'-bis (4-allyloxyphenyl) fluorene and the like It can be mentioned.
  • the particle size adjusting composition preferably contains a hydrophobic polymer.
  • hydrophobic polymer refers to a polymer having a water solubility of 5 w% or less at 25 ° C, a hydrophilic polymer having a functional group, or a hydrophilic block segment. Also included. In addition, those which can be dispersed in water with a predetermined probability are also included.
  • the magnetic substance is preferably a metal complex composed of a metal ion and a ligand. It is preferable to use what is listed below as a metal and a ligand which comprise a metal complex.
  • the metal constituting the metal complex is not particularly limited as long as the metal complex has a magnetic property and a fluorescence property as a metal complex to which a ligand described later is bonded.
  • metal ions it is a metal whose magnetic moment is 7.5 or more. Furthermore, it is preferable that it is 9.0 or more.
  • Examples of metals having a magnetic moment of 7.5 or more include terbium (Tb), dysprosium (Dy), holmium (Ho), erbium (Er), thulium (Tm) and the like. Among them, Tb, Dy, Ho, Er, etc. are particularly preferable because the magnetic moment is 9.0 or more. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the ligand forming the metal complex is not particularly limited as long as it forms a complex with the above metal and exhibits magnetism and fluorescence, but the particle size adjusting composition, in particular, the particle size adjusting composition Since it is easy to form metal complex particles by hydrophobic interaction with a hydrophobic polymer, ⁇ -diketone ligands and heterocyclic ligands represented by the formula (X), phosphorus hydrophobic neutral The order is preferred. These may be used alone or in combination of two or more. In order to obtain stronger magnetism and fluorescence, it is particularly preferable to use a ⁇ -diketone based ligand and a heterocyclic based ligand in combination or a heterocyclic based ligand.
  • R 1 and R 2 may be the same or different, and thienyl, trifluoromethyl, fluoromethyl, furyl, phenyl, naphthyl, benzyl, ter-butyl Group, methyl group etc.
  • a ⁇ -diketone ligand for example, thenoyltrifluoroacetone, naphthoyltrifluoroacetone, benzoyltrifluoroacetone, furoyltrifluoroacetone, pivaloyltrifluoroacetone, hexafluoroacetylacetone, trifluoroacetylacetone, fluoroacetylacetone, Mention may be made of dibenzoylmethane, dithenoylmethane and furoyl trifluoroacetone. Among these, tenoyltrifluoroacetone (TTA)
  • Heterocycle (anion having a heterocycle) based ligand As a heterocycle based ligand having a heterocycle containing a heteroatom such as nitrogen or oxygen, for example, 2,2'-bipyridyl, 4,4'-dimethyl -2,2'-bipyridyl, 6,6'-dimethyl-2,2'-bipyridyl, 5,5'-dimethyl-2,2'-bipyridyl, 2,2'-bipyrimidyl, 4,4'-diethyl- 2,2'-bipyridyl, 8-quinolinol, 2,2 ': 6,2'-terpyridine, 4,4'-dinonyl-2,2'-bipyridyl, di-tert-butylbipyridine, 1,10-phenanthroline 3,4,7,8-Tetramethyl-1,10-phenanthroline, bathophenanthroline, 5,6-dimethyl-1,10-phenan
  • hydrophobic neutral ligand having phosphorus examples include trioctyl phosphine oxide, tri-n-octyl phosphine, tributyl phosphate and the like. Among them, trioctyl phosphine oxide and tri-n-octyl phosphine are particularly preferable.
  • the metal complex particle As a preferred embodiment of the metal complex particle, a styrene-based or (meth) acrylate-based hydrophobic polymer as a particle size adjusting composition, a holmium ion, a terbium ion or dysprosium ion as a metal complex, a ⁇ -diketone ligand and
  • the metal complex particle which consists of a metal complex with at least any one of a heterocyclic ring ligand, or both ligands is mentioned.
  • the content of the metal complex is preferably 40% by weight or more and 98% by weight or less based on the total weight of the particles.
  • the content of the metal complex is preferably 40 w% or more and 98 w% or less depending on the type thereof. In the case of 40 w% or more, sufficient magnetism is exhibited. If it is 98 w% or less, the shape as particles can be maintained. More preferably, it is 50 w% or more, more preferably 60
  • the particle size of the metal complex particles of the present invention is not particularly limited, but in order to realize high magnetic flux collection, the particle size is preferably 500 nm or more and 10 ⁇ m or less. If it is 500 nm or more, the separation speed by the magnet is fast, and if it is 10 ⁇ m or less, the particles hardly settle.
  • the particle size is more preferably 1 ⁇ m to 5 ⁇ m.
  • the average particle diameter of the particles was determined by observing the particles with a scanning electron microscope and arithmetically averaging the maximum diameters of 50 arbitrarily selected particles in the observed image.
  • the coefficient of variation (CV value) of the metal complex particles of the present invention is preferably 20% or less in order to improve the reproducibility of the measurement results.
  • the magnetism will vary and the reproducibility of the measurement results may be reduced. More preferably, it is 10% or less.
  • the coefficient of variation is obtained by observing the particles with a scanning electron microscope and determining the standard deviation of the particle diameters of 50 arbitrarily selected particles in the observed image, and the CV value of the particle diameter of the particles according to the following equation I asked for.
  • CV value (%) ( ⁇ / Dn) ⁇ 100 ⁇ : standard deviation of particle size of particle Dn: average value of particle size of particle
  • the following manufacturing method is illustrated as a manufacturing method of the metal complex particle of this invention.
  • A A step of dissolving the particle size adjusting composition and the metal complex in a soluble hydrophobic solvent
  • B The solution obtained in step A was dissolved with a surfactant and / or a dispersion stabilizer
  • C a step of distilling off a hydrophobic solvent under heating or reduced pressure
  • D filtration, classification, etc.
  • B Emulsification, suspension, etc. in an aqueous solution in which a surfactant and / or a dispersion stabilizer is dissolved.
  • a step of forming D a step of polymerizing the particle size adjusting composition in the presence of the metal complex by heating and / or light irradiation, and a step of equalizing the particle size by filtration, classification and the like.
  • a hydrophobic solvent in which both the polymerizable monomer and the metal complex can be dissolved may be added.
  • a step of distilling off the hydrophobic solvent under heating or under reduced pressure is added.
  • a polymerizable monomer it may be the above-mentioned monofunctional monomer, or may be a polyfunctional monomer, and both may be used together.
  • a step of dispersing particles comprising a particle size adjusting composition as a template in water in which a surfactant and / or a dispersion stabilizer is dissolved
  • B above-mentioned template
  • C using the dispersion obtained in step A
  • step B Adding the obtained metal complex solution, absorbing the metal complex together with the hydrophobic organic solvent and / or the polymerizable monomer in the template particle
  • D polymerizing the polymerizable monomer by heating and / or light irradiation And evaporating the hydrophobic organic solvent under heating or under reduced pressure.
  • step B a hydrophobic polymerization initiator may be added.
  • step D the step of polymerization in step D is unnecessary.
  • particle sizes of metal complex particles obtained can be made uniform, and the amount of metal complex to be contained is uniform.
  • the method of (3) is preferably used because
  • the template particle composed of the particle size adjusting composition contains, as a main component, a polymer obtained by polymerizing a polymerizable monomer, and the polymer also contains a copolymer of one or more polymerizable monomers.
  • the polymer mainly constituting the template particle is not particularly limited as long as it is a hydrophobic polymer, and a polymer obtained by polymerizing the above-mentioned monofunctional polymerizable monomer by radical polymerization, ion polymerization, coordination polymerization or the like is used Be Among them, polymers / copolymers having an aromatic vinyl monomer, a (meth) acrylate monomer, and a vinyl ester monomer as a main component are preferably used because the polymerizable monomer has high solubility in a hydrophobic solvent described later. More preferred are aromatic vinyl monomers and (meth) acrylates.
  • emulsion polymerization As the method for producing the template particles, emulsion polymerization, suspension polymerization, soap free polymerization, dispersion polymerization, mini emulsion polymerization, micro suspension polymerization; phase inversion emulsification using a polymer solution, in-liquid drying method, etc. can be used.
  • soap-free polymerization and dispersion polymerization are preferably used because polymer particles with uniform particle diameter can be obtained.
  • the above-mentioned polymerizable monomer and initiator may be added and polymerized by heating or the like.
  • the use of a polyfunctional monomer is preferable because a crosslinked structure can be introduced into the particles.
  • the polymer obtained by polymerizing the added polymerizable monomer by heating or the like is a part of the particle size adjusting composition, and thus is also referred to as a “second particle size adjusting composition”.
  • the magnetic material (Fe 3 O 4 ) was present in the surface layer of the particles in a sectional view.
  • the magnetic substance (Fe 3 O 4 ) is magnetic on the resin (sea) near the core of the particles.
  • the particles (islands) were present locally, and the fluorescent dye (rare earth (Eu)) was present in the surface layer of the particles.
  • the particle in the metal complex particle of the present application, the particle is formed by the metal complex itself, so that in the cross sectional view of the metal complex particle, the center (point) from the surface layer (surface) of the particle ), A substantially uniform morphology is formed. That is, as described above, since the content of the metal complex is high, it has high magnetism and at the same time the amount of magnetism per particle becomes uniform. The response is uniform and the variation in separation is reduced.
  • the particle size adjusting composition may be locally distributed in the metal complex particles, in this case, the form in which the particle size adjusting composition (islands) is locally or scattered in the metal complex (sea). It becomes. Such an embodiment is also an aspect of the present invention.
  • the hydrophobic solvent to be used in the above-mentioned production methods (1), (2) and (3) is not particularly limited, but it has an SP value of 10 or less and a boiling point is higher than water to distill off the hydrophobic solvent later. Is also preferably low.
  • SP value ethyl acetate
  • benzene SP value: 9.2, boiling point: 80.1 ° C.
  • diisopropyl ether SP value: 6.9, boiling point: 69) C
  • chloroform SP value: 9.1, boiling point: 61.2 ° C.
  • ethyl acetate is preferred.
  • the SP value is the following formula (A) using the ⁇ F and ⁇ v values of various atomic groups according to Okitsu, described in Okitsu Toshinao, “Adhesion”, Polymer Journal, Vol. 40, No. 8 (1996) p 342-350.
  • ⁇ F and ⁇ v represent ⁇ F and molar volumes ⁇ v of various atomic groups by Okitsu, respectively.
  • hydrophobic polymerization initiator which can be melt
  • peroxides such as di-tert-butyl peroxide, tert-butyl hydroperoxide, benzoyl peroxide, methyl ethyl ketone peroxide, di (secondary butyl) peroxydicarbonate, azobisisobutyronitrile, 2, 2 '-Azobis (2-methylbutyronitrile) (V-59), 2,2'-azobis (2,4-dimethylvaleronitrile) (V-65), 2,2'-azobis (4-methoxy-2) And azo compounds such as 2,4-dimethylvaleronitrile) (V-70) and dimethyl 2,2'-azobis (isobutyrate) (V-601), but preferably tert-butyl-2-e
  • polyalkylene glycol polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, poly (meth) acrylic acid, a hydroxyl group in a side chain, a carboxyl group, polyalkylene glycol
  • water-soluble polymers such as poly (meth) acrylic acid and poly (meth) acrylate having a water-soluble group such as a group, colloidal silica, calcium carbonate and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the surfactant used in the above production methods (1), (2) and (3) is not particularly limited as long as it is water soluble, and is a nonionic surfactant such as polyalkylene glycol alkyl ether; alkyl sulfate, Anionic surfactants such as alkylbenzene sulfonates, alkyl carboxylates, alkyl phosphates and alkyl sulfates; Cationic surfactants such as alkylamines and quaternary alkyl ammoniums; Betaine type, sulfobetaine And amphoteric surfactants such as alkyl betaine type. These may be used alone or in combination of two or more.
  • additives may be used as needed.
  • potassium chloride, sodium chloride, sodium acetate, ammonium acetate, sodium acetate, sodium citrate, potassium sulfate, sodium sulfate, sodium dihydrogenphosphate, disodium hydrogenphosphate and the like as electrolytes can be mentioned. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the metal complex comprises a holmium ion, a terbium ion or dysprosium ion, and a ⁇ -diketone ligand and / or a heterocyclic ligand.
  • the hydrophobic polymer is preferably composed of a styrenic or (meth) acrylate hydrophobic polymer.
  • Immobilized metal complex particles can be prepared by immobilizing. This sensitized metal complex particle is also one of the present invention.
  • the substance to be measured in the present invention is not particularly limited as long as it is usually measured in this field.
  • biological body fluid such as serum, blood, plasma, urine and the like, lymph fluid, blood cells, various cells and the like
  • proteins, lipid proteins, nucleic acids, immunoglobulins, blood coagulation related factors, antibodies, enzymes, hormones, cancer markers, heart disease markers, various drugs and the like contained in the above samples are mentioned as typical ones.
  • proteins such as albumin, hemoglobin, myoglobin, transferrin, C-reactive protein (CRP) and the like; for example, high density lipoprotein (HDL), low density lipoprotein (LDL), very low density lipoprotein and the like Lipoproteins; nucleic acids such as deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA); eg alkaline phosphatase, amylase, acid phosphatase, ⁇ -glutamyl transferase ( ⁇ -GTP), lipase, creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), glutamate oxaloacetate transaminase (GOT), glutamate pyruvate transaminase (GPT), renin, protein kinase (PK), enzymes such as tyrosine kinase; eg IgG, IgM, IgA, IgD, IgE
  • Immunoglobulin (or fragments thereof such as, for example, Fc part, Fab part, F (ab) 2 part); for example, coagulation related factors such as fibrinogen, fibrin degradation product (FDP), prothrombin, thrombin etc .;
  • Antibody anti-human hepatitis B virus surface antigen antibody (HBs antigen), anti-human hepatitis C virus antibody, antibody such as anti-rheumatic factor; eg thyroid stimulating hormone (TSH), thyroid hormone (FT3, FT4, T3, T4) Hormones such as parathyroid hormone (PTH), human chorionic gonadotropin (hCG) estradiol (E2); eg ⁇ -fetoprotein (AFP), carcinoembryonic antigen (CEA), CA 19-9, prostate specific antigen (PSA) etc.
  • TSH thyroid stimulating hormone
  • hCG human chorionic gonadotropin
  • E2 eg ⁇ -fetoprotein
  • AFP carcinoembry
  • TnT Troponin T
  • NT-proBNP peptide precursor N-terminal fragment
  • antiepileptics antibiotics
  • drugs such as theophylline and the like.
  • the analog substance (analog) of the substance to be measured in the present invention can bind to the binding site to the substance to be measured which the substance specifically binding to the substance to be measured (the substance binding to the substance to be measured), in other words, measurement Any substance having a binding site to a substance to be measured which the substance has, in other words, any substance which can compete with the reaction if it coexists at the time of reaction of the substance to be measured and the substance to be measured may be used. .
  • Examples of the substance that specifically binds to the substance to be measured in the present invention include, for example, “antigen” -reaction between antibody, “sugar chain” -reaction between protein and “sugar chain” "Lectin” reaction, “enzyme”-"inhibitor” reaction, “protein”-”peptide chain” reaction, “chromosome or nucleotide chain”-"nucleotide chain” reaction, or “nucleotide chain”-”protein And the like, which bind to the measurement target substance or its similar substance by mutual reaction such as inter-reaction, etc., and in the above respective combinations, when any one is the measurement target substance or its similar substance, the other one is this It is a substance to be measured.
  • the substance to be measured or its analogue is "antigen”
  • the substance to be measured is “antibody”
  • the substance to be measured or its analogue is “antibody”
  • the substance to be measured is “antigen”
  • nucleotide chain oligonucleotide chain, polynucleotide chain
  • chromosome peptide chain (eg C-peptide, angiotensin I etc.); protein [eg procalcitonin, immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin E (IgA) IgE), immunoglobulin G (IgG), immunoglobulin M (IgM), immunoglobulin D (IgD), ⁇ 2-microglobulin, albumin, their degradation products, serum proteins such as ferritin]; enzymes [eg amylase (eg pancreatic type) , Salivary gland type, X type etc., alkaline phosphatase (eg hepatic, osseous, placental, small intestinal etc), acid phosphatase (eg PAP etc), ⁇ -glutamyl transferase (eg renal, pancreatic, hepatic etc) ), Lipase (eg, pancreatic
  • tuberculosis pneumococci, diphtheria bacteria, meningitis
  • Bacilli staphylococci, streptococcus, enterobacteria, E. coli, Helicobacter pylori etc.
  • viruses eg rubella virus, herpes virus, hepatitis virus, ATL virus, AIDS virus, influenza virus, adenovirus, enterovirus, polio virus , EB virus, HAV, HBV, HCV, HIV, HTLV etc.
  • fungi eg Candida, Cryptococcus etc.
  • spirochetes eg Leptospira, syphilis etc.
  • chlamydia microorganisms such as mycoplasma
  • various allergens causing allergy such as bronchial asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis etc.
  • house dust eg mites such as house dust mite, house dust mite etc.
  • Pollen such as cedar, cypress, bollhead birch, ragweed, timothy grass, harugaya, rye etc.
  • animals such as cat, dog, crab etc.
  • Tumor marker protein antigens eg PSA, PGI, PGII etc.
  • Carbohydrate antigens eg AFP (eg L1 to L3 etc.) HCG (hCG family), transferrin, IgG, thyroglobulin, Decay-accelerating-factor (DAF), carcinoembryonic antigen (eg CEA, NCA, NCA-2, NFA etc.), CA19-9, PIVKA-II, CA125 , Prostate specific antigen, cancer Tumor marker sugar chain antigen having special sugar chain produced by cells, ABO sugar chain antigen etc.]; sugar chain (eg hyaluronic acid, ⁇ -glucan, sugar chain possessed by the above sugar chain antigen etc.); Proteins (eg hyaluronic acid, ⁇ -glucan, sugar chain possessed by the above sugar chain antigen etc.); Proteins (eg hyaluronic acid, ⁇ -glucan, sugar chain possessed by the above sugar chain antigen etc.); Proteins
  • the antibodies used in the present invention include, in addition to immunoglobulin molecules themselves, proteolytic enzymes such as papain and pepsin, or degradation products such as Fab and F (ab ') 2 fragments produced by chemical degradation. Further, as the above-mentioned antibody, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used. The method for obtaining the above antibody can also be a commonly used method.
  • the substance to be measured or a similar substance is bound by a reaction between “antigen” and “antibody” or a reaction between “sugar chain and protein”.
  • an antibody to the substance to be measured or a similar substance, an antigen to which the substance to be measured or a similar substance binds, or a protein that binds to a substance to be measured or a similar substance is preferable, and the substance to be measured or a similar substance It is further preferable to use an antibody against S. or an antigen that binds to the substance to be measured or its analogue.
  • the above-mentioned particles capable of aggregating sensitized metal complex particles by a specific binding reaction may contain any of the concepts and forms, and should not be interpreted in a limited manner.
  • the method for producing the sensitized metal complex particles by immobilizing the support material on the metal complex particles of the present invention is not particularly limited.
  • a conventionally known method of immobilization by physical and / or chemical binding can be used.
  • the chemical bond include at least one organic compound selected from the group consisting of aldehyde, albumin, carbodiimide, streptavidin, biotin and epoxide, and / or amino group, carboxy group, hydroxyl group, mercapto group, glycidyloxy group And at least one functional group selected from a tosyl group etc. on the surface of the metal complex particle, and immobilizing the substance for support on the metal complex particle via them.
  • organic compounds containing a carboxy group and a tosyl group are particularly preferable from the viewpoint of the stability of the metal complex particles themselves and the immobilization efficiency of the substance for support.
  • the bonding amount of the support material in the sensitized metal complex particles of the present invention varies depending on the type of the support material to be used, and the optimum amount can be set experimentally as appropriate.
  • "support”, “sensitization” and “immobilization” have their usual meanings and are used synonymously.
  • the sensitized metal complex particles of the present invention obtained by such a method are subjected to a coating (blocking) treatment with various polymer compounds and proteins (for example, bovine serum albumin etc.), if necessary, to a suitable buffer solution It disperse
  • the sensitized metal complex particle dispersion can be used as a reagent for immunoassays, which is also one of the present invention.
  • the reagent for immunoassay of the present invention can be used as a measurement reagent kit by combining a diluent (buffer solution) used for measurement, a standard substance and the like, and the kit is also one of the present invention.
  • the dilution liquid is used to dilute a measurement sample or the like.
  • any buffer having a pH of 5.0 to 9.0 can be used.
  • phosphate buffer, glycine buffer, tris buffer, borate buffer, citrate buffer, Good buffer and the like can be mentioned.
  • the reagent or diluent for immunoassay of the present invention may contain various sensitizers for the purpose of improving the measurement sensitivity or promoting specific reaction between the substance to be measured and the substance to be carried.
  • the sensitizer include alkylated polysaccharides such as methyl cellulose and ethyl cellulose, pullulan and polyvinyl pyrrolidone.
  • the reagent and diluent for immunoassay of the present invention can be used to control various non-specific reactions caused by substances other than the substance to be measured present in the measurement sample, and to improve the stability of the measurement reagent, etc. And their decomposition products, amino acids, surfactants and the like.
  • examples of such additives include proteins such as albumin (bovine serum albumin, egg albumin), casein, gelatin and the like.
  • the method of measuring a substance to be measured according to the present invention is not particularly limited except that the method is performed using the metal complex particles according to the present invention, and, for example, a document (for example, “enzyme immunoassay method second version” usually performed in this field)
  • the method may be performed according to the sandwich method described in Eiji Ishikawa et al., Medical School, 1982), a competition method, etc.
  • a method of bringing a sample, metal complex particles, a substance to be labeled to be measured, a labeled substance to be measured, or a substance to be labeled to be measured into contact with it The metal complex particles may be dispersed by the
  • the reaction time may be appropriately set according to the difference between the substance to be measured, the substance to be measured and the substance to be used, the sandwich method, the competition method and the like.
  • the B / F separation (the separation of the bound labeled antibody and the unbound labeled antibody) in the method of measuring a substance to be measured according to the present invention utilizes, for example, the magnetism of the metal complex particles, and the metal complex particles from the outside of the reaction tank Are collected, the reaction solution is drained, and after the washing solution is added, the magnet is removed, and the metal complex particles are mixed, dispersed and washed. The above operation may be repeated 1 to 3 times.
  • the cleaning liquid is not particularly limited as long as it is generally used in this field.
  • a labeling substance used to label a substance to be measured a substance to be measured or a similar substance thereof, for example, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, peroxidase, microperoxidase used in enzyme immunoassay (EIA) Enzymes such as glucose oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, malate dehydrogenase, luciferase, tyrosinase, acid phosphatase and the like, such as 99 mTc 131 I used in radioimmunoassay (RIA) Radioisotopes such as 125 I, 14 C, 3 H, 32 P, eg fluorescein, dansyl, fluorescamine, coumarin, naphthylamine or derivatives thereof used in fluorescence immunoassay (FIA), green fluorescent proteins ( Fluorescent substances such as GFP), For example, light-emitting substances such as luciferin, iso-
  • the amount of labeling substance used may be appropriately set according to the type of labeling substance to be used.
  • it may be contained in a buffer generally used in the field such as Tris buffer, phosphate buffer, veronal buffer, borate buffer, Good buffer and the like.
  • a Tris buffer solution, a phosphate buffer solution, a Veronal buffer solution, a borate buffer solution etc. are used, for example normally used in this field
  • the pH is an antigen antibody The range is not limited as long as the reaction is not suppressed, and is usually 5 to 9.
  • such buffers may contain, for example, stabilizers such as albumin, globulin, water-soluble gelatin, polyethylene glycol, surfactants, saccharides, etc. as long as they do not inhibit the desired antigen-antibody reaction. You may leave it.
  • a method for measuring the labeling substance or the activity thereof a method which is usually performed can be used without particular limitation.
  • the optical instrument used in the measurement is not particularly limited, and typically, any biochemical autoanalyzer widely used in clinical examination can be used.
  • Preparation Example 2 Synthesis of Metal Complex (b) In the same manner as in Preparation Example 1 except that thenoyl trifluoroacetone (TTA) was used instead of DBM as the ligand, the metal ion was holmium and the ligand was bpy and TTA. To obtain a metal complex (b).
  • TTA thenoyl trifluoroacetone
  • Preparation Example 3 Synthesis of metal complex (c) In the same manner as in Preparation Example 1 except that dysprosium chloride (DyCl 3 ) was used instead of holmium chloride hexahydrate, the metal ion was dysprosium, and the ligands were bpy and DBM. Some metal complex (c) was obtained.
  • DyCl 3 dysprosium chloride
  • ligands were bpy and DBM.
  • Preparation Example 4 Synthesis of Metal Complex (d) In the same manner as in Preparation Example 1 except that terbium chloride hexahydrate (TbCl 3 ⁇ 6H 2 O) was used instead of holmium chloride hexahydrate, the metal ion was terbium, The metal complex (d) whose ligand is bpy and DBM was obtained.
  • terbium chloride hexahydrate TbCl 3 ⁇ 6H 2 O
  • Preparation Example 5 Synthesis of Metal Complex (e) In the same manner as in Preparation Example 1 except that 2,2 ′: 6,2 ′ ′-terpyridine (terpy) was used instead of bpy as the ligand, the metal ion was holmium , The metal complex (e) whose ligand is terpy and DBM was obtained.
  • Preparation Example 8 Preparation of template particles (I) 500 g of ion exchanged water in a reaction vessel, 50 g of methyl methacrylate (MMA) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a monomer constituting the particle size adjustment composition, potassium persulfate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.5g was added and it stirred at room temperature under nitrogen atmosphere for 2 hours. Then, the mixture was heated to 70 ° C. and polymerization was performed for 24 hours to obtain template particles (I) made of polymethyl methacrylate. The average particle size of the obtained template particles (I) was 1.06 ⁇ m, and the CV value was 3.3%.
  • MMA methyl methacrylate
  • potassium persulfate manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Template particles (II) consisting of polystyrene in the same operation, except that the monomer constituting the particle size adjusting composition is changed from MMA to styrene (St) (manufactured by NS Styrene Monomer) I got The average particle size of the obtained template particles (II) was 1.03 ⁇ m, and the CV value was 3.8%.
  • Example 1 Preparation of Metal Complex Particles (1)
  • the content of the template particles (I) was 0.1 g
  • the content of triethanolamine lauryl sulfate was 0.1 g.
  • Template particles (I) and triethanolamine lauryl sulfate (Emar TD, manufactured by Kao Corporation) were added to ion-exchanged water to obtain a dispersion of template particles (I).
  • a metal complex (a) solution prepared by dissolving 2.70 g of the metal complex (a) in 4.00 g of ethyl acetate was added to the dispersion of template particles (I).
  • metal complex particles (1) of the present invention By stirring at room temperature for 24 hours, composite droplets of the template particle (I) and the metal complex (a) were formed. Thereafter, the mixture was heated and stirred at 80 ° C. for 10 hours to remove ethyl acetate to obtain metal complex particles (1) of the present invention.
  • the average particle diameter of the obtained metal complex particles (1) was 3.21 ⁇ m, the CV value was 3.8%, and the metal complex content was 96.4 w%.
  • Example 2 The template particles (I) and lauryl sulfate so that the content of the template particles (I) is 0.1 g in 100 g of ion-exchanged water, and the content of triethanolamine lauryl sulfate is 0.1 g Triethanolamine (Emar TD, manufactured by Kao Corporation) was added to ion exchange water to obtain a dispersion of template particles (I).
  • Triethanolamine Emar TD, manufactured by Kao Corporation
  • metal complex (a) 0.20 g of methyl methacrylate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a monomer for the second particle size adjustment composition
  • di (secondary butyl) peroxydicarbonate Liuporox 225, Arkema Yoshitomi
  • metal complex (a) solution prepared by dissolving 0.02 g of H.com) in 4.00 g of ethyl acetate was added to the dispersion of template particles (I). The mixture was stirred at room temperature for 24 hours to form a composite droplet with the template particle (I) and the metal complex (a). Thereafter, the mixture is heated and stirred at 80 ° C.
  • metal complex particles (2) containing polymethyl methacrylate (pMMA) as a second particle size adjusting composition Obtained.
  • the average particle diameter of the obtained metal complex particles (2) was 3.20 ⁇ m, the CV value was 4.2%, and the metal complex content was 89.1 w%.
  • Example 3 The same procedure as in Example 2 was repeated except that divinylbenzene (DVB) (DVB 960, manufactured by NS Styrene Monomer Co., Ltd.) was used as a monomer for the second particle size adjusting composition, to obtain poly as a second particle size adjusting composition.
  • DVD divinylbenzene
  • Metal complex particles (3) containing divinylbenzene (pDVB) were obtained.
  • the average particle diameter of the obtained metal complex particles (3) was 3.18 ⁇ m, the CV value was 4.1%, and the metal complex content was 88.1 w%.
  • Example 4 The second particle size adjustment is performed in the same manner as in Example 2 except that styrene (St) (manufactured by NS Styrene Monomer Co., Ltd.) is used as a monomer for the second particle size adjusting composition using template particles (II).
  • Metal complex particles (4) containing polystyrene (pSt) as a composition were obtained.
  • the average particle diameter of the obtained metal complex particles (4) was 3.10 ⁇ m, the CV value was 4.3%, and the metal complex content was 89.0 w%.
  • Example 5 A metal complex particle (5) was obtained in the same manner as in Example 3, except that the metal complex (b) was used as the metal complex.
  • the average particle diameter of the obtained metal complex particles (5) was 3.12 ⁇ m, the CV value was 4.2%, and the metal complex content was 88.2 w%.
  • Example 6 A metal complex particle (6) is operated in the same manner as in Example 3 except that 2.00 g of metal complex (a), 0.70 g of divinylbenzene and 0.08 g of di (secondary butyl) peroxydicarbonate are used. I got The average particle diameter of the obtained metal complex particles (6) was 3.20 ⁇ m, the CV value was 3.8%, and the metal complex content was 71.4 w%.
  • Example 7 The same procedure as in Example 3 was repeated except that 1.60 g of the metal complex (a), 1.10 g of divinylbenzene and 0.11 g of di (secondary butyl) peroxydicarbonate were used, and metal complex particles (7) I got The average particle diameter of the obtained metal complex particles (7) was 3.18 ⁇ m, the CV value was 3.9%, and the metal complex content was 55.6 w%.
  • Example 8 The same procedure as in Example 3 was repeated except that 1.20 g of the metal complex (a), 1.50 g of divinylbenzene, and 0.15 g of di (secondary butyl) peroxydicarbonate were used, and metal complex particles (8) I got The average particle diameter of the obtained metal complex particles (8) was 3.17 ⁇ m, the CV value was 4.1%, and the metal complex content was 40.2 w%.
  • Example 9 2.50 g of the metal complex (a), 0.20 g of styrene, 13 g of chloroform, 0.002 g of di (secondary butyl) peroxydicarbonate, 5 wt% aqueous solution of polyvinyl alcohol (Gosenol GH20, manufactured by Nippon Gosei Co., Ltd.) 13 g of a mixture of 1.5 g of triethanolamine lauryl sulfate and 150 g of ion-exchanged water were mixed and stirred at 2500 rpm using a homogenizer.
  • polyvinyl alcohol Gosenol GH20, manufactured by Nippon Gosei Co., Ltd.
  • metal complex particles (9) containing polystyrene (pSt) as a particle size adjusting composition The average particle diameter of the obtained metal complex particles (9) was 3.31 ⁇ m, the CV value was 12.8%, and the metal complex content was 90.2 w%.
  • Example 10 The same operation as in Example 9 was carried out except changing the centrifugation conditions of the centrifugation operation after completion of the reaction in Example 9 and repeating the centrifugation operation to obtain metal complex particles (10) of the present invention.
  • the average particle diameter of the obtained metal complex particles (10) was 3.42 ⁇ m, the CV value was 17.8%, and the metal complex content was 91.3 w%.
  • Example 11 A metal complex particle (11) was obtained in the same manner as in Example 3, except that the metal complex (c) was used as the metal complex.
  • the average particle diameter of the obtained metal complex particles (11) was 3.22 ⁇ m, the CV value was 4.8%, and the metal complex content was 89.3 w%.
  • Example 12 A metal complex particle (12) was obtained in the same manner as in Example 3, except that the metal complex (d) was used as the metal complex.
  • the average particle diameter of the obtained metal complex particles (12) was 3.16 ⁇ m, the CV value was 4.4%, and the metal complex content was 88.7 w%.
  • Example 13 A metal complex particle (13) was obtained in the same manner as in Example 3, except that the metal complex (e) was used as the metal complex.
  • the average particle diameter of the obtained metal complex particles (13) was 3.22 ⁇ m, the CV value was 5.2%, and the metal complex content was 89.2 w%.
  • Example 14 A metal complex particle (14) was obtained in the same manner as in Example 3, except that the metal complex (f) was used as the metal complex.
  • the average particle diameter of the obtained metal complex particles (14) was 3.06 ⁇ m, the CV value was 4.9%, and the metal complex content was 87.5 w%.
  • Metal complex particles (15) were prepared in the same manner as in Example 3 except that the charge of the metal complex (a) was 0.50 g and the charge of divinylbenzene as the second particle size adjustment composition was 2.20 g. Got). The average particle diameter of the obtained metal complex particles (15) was 3.18 ⁇ m, the CV value was 5.1%, and the metal complex content was 14.8 w%.
  • Comparative Example 2 The same operation as in Example 9 was carried out except changing the centrifugation conditions of the centrifugation operation after completion of the reaction in Example 9 and repeating the centrifugation operation to obtain metal complex particles (16) of the present invention.
  • the average particle diameter of the obtained metal complex particles (16) was 3.33 ⁇ m, the CV value was 25.6%, and the metal complex content was 90.4 w%.
  • Comparative Example 3 A metal complex particle (17) was obtained in the same manner as in Example 3, except that the metal complex (g) was used as the metal complex.
  • the average particle diameter of the obtained metal complex particles (17) was 3.15 ⁇ m, the CV value was 4.8%, and the metal complex content was 88.6 w%.
  • Conductivity (%) [ ⁇ (absorbance after 5 seconds of sample injection)-(absorbance after 125 seconds of sample injection) ⁇ / (absorbance after 5 seconds of sample injection)] ⁇ 100 Equation (6)
  • Judgment criteria ⁇ : Collectivity of 61% or more :: Collectivity of 41% to less than 60% :: Collectivity of 21% to less than 40%

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Abstract

磁性体と、疎水性ポリマーを含む粒径調整組成物と、を備える金属錯体粒子であって、　前記磁性体は、金属イオンと配位子からなる、磁性及び蛍光の両方を有する金属錯体を含み、金属錯体粒子中の前記粒径調整組成物の含有率が６０ｗ％未満である、金属錯体粒子。

Description

金属錯体粒子及びそれを用いた免疫測定用試薬
　本発明は金属錯体粒子及びそれを用いた免疫測定用試薬に関する。
　従来、生体物質を含有する試料、例えば生体サンプル中のタンパク質等を測定又は精製する方法が知られている。例えば、タンパク質が結合し得る粒子表面に生体サンプル中のタンパク質等を結合させ、生体サンプル中の目的タンパク質等以外の不純物を除くために、粒子を洗浄しタンパク質等が結合した粒子を回収して、タンパク質の結合量を測定する方法やタンパク質解離溶液中に解離させて精製する方法が挙げられる。
　また、目的のタンパク質（抗原等）に対して、酵素で標識された抗体を作用させた後、当該酵素と発光試薬の反応による発光を光学的に測定することによって目的タンパク質を検出する方法（ＥＬＩＳＡ法）が広く利用されている。
　上記ＥＬＩＳＡ法においては、下記特許文献１、２には、磁力によって容易に分離、回収が可能であることから、磁性を有する粒子が用いられていることが開示されている。
　更に、磁性を有する粒子に蛍光を付与することで、蛍光標識を可能とした粒子が提案されている。例えば、特許文献３には、フェライト粒子表面に形成したポリマー層にユーロピウムキレート錯体を含侵させることで、磁性と蛍光を有する粒子が開示されている。
　また、特許文献３には、ユーロピウムキレート錯体を磁性粒子に内包させた水懸濁液を得る方法として、（１）具体例は示されてはいないが、ポリマー被覆磁性粒子の水懸濁液に、ユーロピウムキレート錯体を溶解させた水との親和性の高い低沸点非水系溶媒（好ましくはアセトン）溶液を添加し、ポリマー層を膨潤させると同時にユーロピウムキレート錯体も取り込ませた後、前記溶媒を蒸発させることで、ユーロピウムキレート錯体含有磁性粒子の水懸濁液を得る方法、（２）水を除去した微架橋ポリマー被覆磁性粒子を、ユーロピウムキレート錯体を溶解させたアセトン溶液に添加し、ポリマー層を膨潤させると同時にユーロピウムキレート錯体も取り込ませた後、アセトンを蒸発させ、水を添加することで、ユーロピウムキレート錯体含有磁性粒子の水懸濁液を得る方法が記載されている。
さらに、特許文献４には、（３）アルコール洗浄等で水を除いた微架橋ポリマー被覆磁性粒子を、ユーロピウムキレート錯体を溶解させたアセトン溶液に添加し、ポリマー層を膨潤させると同時にユーロピウムキレート錯体も取り込ませた後、水を添加し、アセトンを蒸発させることで、ユーロピウムキレート錯体含有磁性粒子の水懸濁液を得る方法が記載されている。
　　　特許文献１　特開２００５－０６２０８７号公報
　　　特許文献２　国際公開第２０１２－１７３００２号公報
　　　特許文献３　特開２００８－１２７４５４号公報
　　　特許文献４　国際公開第２０１０－０２９７３９号公報
　しかしながら、特許文献３には、記載されている製法では、得られる磁性粒子の最大径が３００ｎｍであることから、粒子１個に含まれる蛍光体や磁性体量が少なく、磁石による分離の際の分離速度が遅く、また、フェライトによる蛍光の吸収があるため、十分な蛍
光が得られず、感度が低いという問題があった。さらに特許文献３には、（１）の方法は具体的な例は無く、また、好ましいとされているアセトンを用いた場合、ユーロピウムキレート錯体のアセトン溶液をポリマー被覆磁性粒子水懸濁液に添加した時点で、ユーロピウム錯体が析出し、ポリマー層に必要量を取り込むことは困難であった。ユーロピウムキレート錯体が析出しないように、水に対して大量のアセトンを使用する場合、ユーロピウムキレート錯体の濃度が下がり充分に含有させることが出来なかった。（２）の方法では、アセトンを蒸発させる工程で、粒子同士が合着し、単粒子を得ることが困難であった。（３）の方法においても、水を添加した際、キレート錯体が析出し、取り除くことが極めて困難であった。
　上述の通り、磁石により分離／回収が迅速に行え、かつ、蛍光標識を可能とした、感度の高い磁性と蛍光とを具備した粒子は免疫測定用試薬としては実用化されていなかった。
　本発明は、集磁性に優れた、磁性と蛍光を併せ持つ、金属錯体粒子及びそれを用いた免疫測定用試薬を提供することを目的とする。
　本発明は以下の内容に関する。
（１）磁性体と、疎水性ポリマーを含む粒径調整組成物と、を備える金属錯体粒子であって、前記磁性体は、金属イオンと配位子からなる、磁性及び蛍光の両方を有する金属錯体を含み、前記金属錯体粒子中の前記粒径調整組成物の含有率が６０ｗ％未満である、金属錯体粒子。
（２）前記磁性体は蛍光を有さない磁性を有する金属錯体を含まない磁性体である、（１）に記載の金属錯体粒子。
（３）前記磁性体は前記金属錯体のみである、（１）に記載の金属錯体粒子。
（４）前記金属錯体を形成する金属イオンの磁気モーメントが７．５～１０．７である、（１）~（３）のいずれか１つに記載の金属錯体粒子。
（５）前記金属錯体を形成する金属イオンがテルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウムのイオンからなる群から選択される少なくとも一種である、（１）～（４）のいずれか１つに記載の金属錯体粒子。
（６）前記金属錯体を形成する配位子がβ―ジケトン系配位子及び複素環系配位子の両方又はいずれか一方である、（１）～（５）のいずれか１つに記載の金属錯体粒子。
（７）前記金属錯体を形成する配位子が、（１）β―ジケトン系配位子は、ジベンゾイルメタン、又はテノイルフルオロアセトン、（２）複素環系配位子は、２，２´‐ビピリジル、２，２´：６，２´´－テルピリジン、又は１，１０－フェナントロリン、
から選ばれる配位子である、（１）～（６）のいずれか１つに記載の金属錯体粒子。
（８）前記金属錯体粒子の平均粒径が１μｍ以上５μｍ以下である、（１）～（７）のいずれか１つに記載の金属錯体粒子。
（９）前記金属錯体中の前記金属錯体の含有量が、４０ｗ％以上９８ｗ％以下ある、（１）～（８）のいずれか１つに記載の金属錯体粒子。
（１０）前記金属錯体粒子の表面に担持用物質を備える、（１）～（９）のいずれか１つに記載の金属錯体粒子。
（１１）前記担持用物質が、検出対象物質と特異的に反応する抗体または抗原である、（１）～（１０）のいずれか１つに記載の金属錯体粒子。
（１２）（１０）に記載の金属錯体粒子を含む、免疫測定用試薬。
　本発明によれば、集磁性に優れた、磁性と蛍光を併せ持つ、金属錯体粒子及びそれを用いた免疫測定用試薬を提供される。
図１Ａは粒子断面の金属分布の概要を示す図であり、図１Ｂは粒子断面の金属分布の概要を示す一部拡大図である。 図２Ａ、図２Ｂはそれぞれ先行技術に係る粒子断面の金属分布の概要を示す図である。
　本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討した結果、複数ある希土類錯体の中に、磁性及び蛍光の両方を有する金属錯体が数種あることを知見した。そして、この金属錯体を粒径分布が揃った粒子として調製することにより、集磁性に優れ、かつ、蛍光発光特性を有する金属錯体粒子が得られることを見いだした。さらに、得られた粒子を免疫測定用試薬に用いることにより、高い集磁性と測定精度（視認性）の向上が図られ、上述の課題が解決されることとなった。以下に、実施形態を挙げて本発明の説明を行うが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
[金属錯体粒子]
　本発明は、磁性体と、疎水性ポリマーを含む粒径調整組成物と、を備え、
　磁性体は、金属イオンと配位子からなる、磁性及び蛍光の両方を有する金属錯体を含み、　金属錯体粒子中の前記粒径調整組成物の含有率が６０ｗ％未満である、金属錯体粒子に関する。金属錯体粒子は、磁性を有する物質として金属錯体のみを含有することが好ましい。
　本発明の金属錯体粒子は、磁性を有する金属錯体の含有率が高いため、高い集磁性を有すると同時に、粒子１個あたりの磁性量が均一となるため、磁力による分離の際、個々の粒子の磁力への応答が均一となり、分離の際のばらつきが小さくなる。更に、金属錯体が磁性の他に蛍光特性も有するため、この金属錯体粒子を免疫測定用試薬に用いることで、検出感度が高くなる。また、金属錯体種を変えることで、金属錯体粒子の蛍光スペクトルを変えることが可能となり、金属錯体粒子の色が変わるため、複数の検体を測定する際、試薬の取り違い等に起因する誤診断を回避できる。
本発明の金属錯体粒子は、磁性体と蛍光体をそれぞれ含有する粒子に比べ、同一金属錯体にて磁性と蛍光を有するため、磁性発現物質と蛍光発現物質との負の相互作用がなく、磁性、蛍光とも効果的に発現できる。また、本発明の金属錯体粒子は、金属錯体の高含有化が可能であるため、高い集磁性を発現することが可能である。さらに、本発明の金属錯体粒子は、粒径が揃っているので、磁石への応答性も均一となるため、均一な集磁性を発現する。
　上記粒径調整組成物は、重合性モノマー（以下、単に「モノマー」ともいう）を重合（重縮合も含む）して得られるポリマー（以下、単に「ポリマー」ともいう）を主成分とし、上記ポリマーは一種または二種以上の重合性モノマーのコポリマーも含む。
　上記ポリマーとしては、例えば、（不）飽和炭化水素、芳香族炭化水素、（不）飽和脂肪酸、芳香族カルボン酸、（不）飽和ケトン、芳香族ケトン、（不）飽和アルコール、芳香族アルコール、（不）飽和アミン、芳香族アミン、（不）飽和チオール、芳香族チオール、有機ケイ素化合物の１種以上の重合性モノマーからなるポリマーが挙げられる。
　上記ポリマーとしては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリメチルペンテン、ポリブタジエン等のポリオレフィン類；ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、テトラメチレングリコール等のポリエーテル；ポリスチレン；ポリ（メタ）アクリル酸；ポリ（メタ）アクリル酸エステル；ポリビニルアルコール；ポリビニルエステル；ポリビニルエーテル；フェノール樹脂；メラミン樹脂；ベンゾグアナミン樹脂；アリル樹脂；フラン樹脂；（不）飽和ポリエステル；エポキシ樹脂；ポリシロキ
サン；ポリアミド；ポリイミド；ポリウレタン；テフロン（登録商標）；アクリロニトリル／スチレン樹脂；スチレン／ブタジエン樹脂；ハロゲン化ビニル樹脂；ポリカーボネート；ポリアセタール；ポリエーテルスルホン；ポリフェニレンオキシド；ポリエーテルエーテルケトン；糖；澱粉；セルロース；ポリペプチド、及び、重合性官能基を有する種々の重合性モノマーを１種もしくは２種以上重合させて得られるポリマー等が挙げられる。これらのポリマーは単独で用いても、２種以上が併用されても良い。
　上記ポリマーは、ラジカル重合、イオン重合、配位重合、開環重合、異性化重合、環化重合、脱離重合、重付加、重縮合、付加縮合により製造される。
　上記重合性モノマーは、一種単独であってもよく、二種以上の任意の割合の組み合わせでもよい。また、二種以上の重合性モノマーを用いる場合、二種以上の重合性モノマーの組み合わせは、二種以上の単官能重合性モノマーの組み合わせ、二種以上の多官能重合性モノマーの組み合わせ、一種以上の単官能重合性モノマーと一種以上の多官能重合性モノマーとの組み合わせ、のいずれであってもよい。これらの重合体の分子量は、例えば８０以上３０，０００以下であるが、特に限定されるものではない。尚、本発明及び本明細書において分子量とは、多量体については、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によりポリスチレン換算で測定される重量平均分子量をいうものとする。後述する、重量平均分子量は、下記測定により測定された値である。
　　ＧＰＣ装置：ＡＰＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ社製）
　　カラム：ＨＳＰｇｅｌ　ＨＲ　ＭＢ－Ｍ　（Ｗａｔｅｒｓ社製）６．０×１５０ｍｍ
　　溶離液：テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、注入量：１０μＬ、検出器：ＲＩ
　上記重合性モノマー（以下、単に「モノマー」ともいう）とは、一分子中に一つ以上の重合性官能基を含む化合物であれば特に限定されず、重合性官能基を一分子に一つ含む単官能モノマーであっても、重合性官能基を一分子中に二つ以上含む多官能モノマーであっても良い。また、一分子中に重合性官能基を一つ以上含むオリゴマーやプレポリマー等であっても良い。
　上記重合性官能基は、ラジカル重合性官能基、イオン重合性官能基、配位重合性官能基であってもよく、ラジカル重合性官能基が好ましい。重合反応の反応性の観点からは、エチレン性不飽和結合含有基、エポキシ基、オキセタン基、メチロール基等の重合性基を挙げることができ、エチレン性不飽和基がより好ましい。エチレン性不飽和基としては、（メタ）アクリロイルオキシ基、（メタ）アクリロイル基、ビニル基、芳香族ビニル基、アリル基を挙げることができ、（メタ）アクリロイル基、ビニル基、芳香族ビニル基がより好ましい。なお、本発明及び本明細書において、「（メタ）アクリロイル基」との記載は、アクリロイル基、とメタクリロイル基の少なくともいずれかの意味で用いるものとする。「（メタ）アクリロイルオキシ基」、「（メタ）アクリレート」、「（メタ）アクリル」等も同様である。多官能モノマーについては、化合物に含まれる重合性基の数は１分子中に２つ以上である。
　上記エチレン性不飽和基を有する単官能モノマーの具体例としては、特に限定されず、
　例えば、（メタ）アクリロイル基を有する単官能モノマーとしては、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、セチル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート、ポリオキシエチレン（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、トリフルオロメチル（メタ）アクリレート、ペンタフルオロエチル（メタ）アクリレート、３－（メタ）アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３－（メタ）アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３－（メタ）アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３－（メタ）アクリロキシプロピルトリエトキシシラン等の（メタ）アクリレートモノマーが挙げられる 
　ビニル基を有する単官能モノマーとしては、ジイソブチレン、イソブチレン、リニアレン、エチレン、プロピレン等のオレフィンモノマー；イソプレン、ブタジエン等の共役ジエンモノマー；メチルビニルエーテル、エチルビニルエーテル、プロピルビニルエーテル等のビニルエーテルモノマー；酢酸ビニル、酪酸ビニル、ラウリン酸ビニル、ステアリン酸ビニル等のビニルエステルモノマー；塩化ビニル、フッ化ビニル等のハロゲン含有ビニルモノマー；
（メタ）アクリロニトリル等のニトリル含有ビニルモノマー；ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、ジメトキシメチルビニルシシラン、ジメトキシエチルビニルシラン、ジエトキシメチルビニルシラン、ジエトキシエチルビニルシラン、メチルビニルジメトキシシラン、エチルビニルジメトキシシラン、メチルビニルジエトキシシラン、エチルビニルジエトキシシラン等のシランアルコシキシド含有ビニルモノマーが挙げられる。
　芳香族ビニル基を有する単官能モノマーとしては、スチレン、α－メチルスチレン、クロルスチレン、ビニルナフタレン、４－ビニルビフェニル、ｐ－スチリルトリメトキシシラン、等の芳香族ビニルモノマーが挙げられる。
　上記エチレン性不飽和基を有する多官能モノマーの具体例としては、特に限定されず、
　例えば、（メタ）アクリロイル基を有する多官能モノマーとしては、トラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、グリセロールトリ（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）テトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４－ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、９，９－ビス［４－（２－アクリロイロキシエチロキシ）］フェニルフルオレン等の多官能（メタ）アクリレート系モノマー等が挙げられる。
　ビニル基を有する多官能モノマーとしては、１，４－ジビニロキシブタン、ジビニルスルホン、９，９´－ビス（４－アリルオキシフェニル）フルオレン、エチルメチルジビニルシラン等が挙げられる。
　芳香族ビニル基を有する多官能モノマーとしては、ジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、ジビニルビフェニル等の芳香族ビニルモノマーが挙げられる。
　アリル基を有する多官能モノマーとしては、トリアリル（イソ）シアヌレート、トリアリルトリメリテート、ジアリルフタレート、ジアリルアクリルアミド、ジアリルエーテル、９，９‘－ビス（４－アリルオキシフェニル）フルオレン等のアリルモノマーが挙げられる。
　上記粒径調整組成物としては、疎水性ポリマーを含んでいることが好ましい。尚、本明細書において、「疎水性ポリマー」とは、２５℃での水への溶解度が５ｗ％以下のポリマーをいい、親水性官能基を有する、又は、親水性のブロックセグメントを有するブロックポリマーも含まれる。また、所定の確率で、水中に分散され得るものも含まれる。
　磁性体としては、金属イオンと配位子からなる金属錯体であることが好ましい。金属錯体を構成する金属や配位子としては以下に挙げるものを用いることが好ましい。
　金属錯体を構成する金属は、後述の配位子が結合した、金属錯体として磁性特性および蛍光特性を有するものであれば特に限定されないが、金属錯体粒子として高い集磁性を実現するため、金属イオンの磁気モーメントが７．５以上の金属であることが好ましい。更
に、９．０以上であることが好ましい。磁気モーメントが７．５以上の金属としては、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）等が例示される。中でも、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ等が磁気モーメントが９．０以上であるため、特に好ましい。これらは単独で用いても良く、また２種以上を併用しても良い。
　金属錯体を形成する配位子は、上記金属と錯体を形成し、磁性と蛍光を発現するものであれば特に限定されないが、前記粒径調整組成物、特に、前記粒径調整組成物中の疎水性ポリマーとの疎水性相互作用によって、金属錯体粒子を形成させやすいことから、式（Ｘ）で示されるβ－ジケトン系配位子及び複素環系配位子、リン系疎水性中性配位子が好ましい。これらは、単独で用いても良く、また２種以上を併用しても良い。より強い磁性と蛍光を得るためにはβ－ジケトン系配位子及び複素環系配位子を併用または、複素環系配位子を用いる事が特に好ましい。
　β－ジケトン配位子としては、次式（Ｘ）で表されるものを用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 （上記式（Ｘ）中、Ｒ1及びＲ２は、同一でも異なっていても良く、チエニル基、トリフルオロメチル基、フルオロメチル基、フリル基、フェニル基、ナフチル基、ベンジル基、ｔｅｒ‐ブチル基、メチル基等を表す。）
　このようなβ－ジケトン配位子として、例えばテノイルトリフルオロアセトン、ナフトイルトリフルオロアセトン、ベンゾイルトリフルオロアセトン、フロイルトリフルオロアセトン、ピバロイルトリフルオロアセトン、ヘキサフルオロアセチルアセトン、トリフルオロアセチルアセトン、フルオロアセチルアセトン、ジベンゾイルメタン、ジテノイルメタン、およびフロイルトリフルオロアセトンを挙げることができる。なかでも、テノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＡ）、ジベンゾイルメタン（ＤＢＭ）が好ましい。
　複素環(ヘテロ環を持つ陰イオン)系配位子
　窒素や酸素などのヘテロ原子を含むヘテロ環を持つ複素環系配位子として、例えば、２，２´‐ビピリジル、４，４´－ジメチル－２，２´－ビピリジル、６，６´－ジメチル－２，２´－ビピリジル、５，５´－ジメチル－２，２´－ビピリジル、２，２´－ビピリミジル、４，４´－ジエチル－２，２´－ビピリジル、８－キノリノール、２，２´：６，２´´－テルピリジン、４，４´－ジノニル－２，２´－ビピリジル、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルビピリジン、１，１０－フェナントロリン、３，４，７，８－テトラメチル－１，１０－フェナントロリン、バトフェナントロリン、５，６－ジメチル－１，１０－フェナントロリン、フタロシアニン、５，１５－ジフェニルポルフィリン、テトラフェニルポルフィリン、５，１０，１５，２０－テトラ（４－ピリジル）ポルフィリン、３－ピラゾロン等が挙げられる。なかでも、２，２´‐ビピリジル、２，２´：６，２´´－テルピリジン、１，１０－フェナントロリンが好ましい。
　リン系疎水性中性配位子
　リンを有する疎水性中性配位子として、トリオクチルホスフィンオキシド、トリ－ｎ－オクチルホスフィン、リン酸トリブチル等が挙げられる。なかでも、トリオクチルホスフィンオキシド、トリ－ｎ－オクチルホスフィンが特に好ましい。
　粒子中の金属錯体の含有率Ａ（ｗ％）は、不活性ガス中で１０００℃まで加熱した際の、重合体及び配位子を分解した残渣から式（１）～式（３）によって計算される。
　粒子Ｘ（ｇ）を計量し、空気中１０００℃で焼成後、分子量３７７．８６（ｇ／ｍｏｌ）の酸化ホルミウムがＹ（ｇ）残存したとすると、粒子中に含まれる酸化ホルミウムの物重量Ｚ（ｍｏｌ）は、式（１）により計算される。
　Ｚ（ｍｏｌ）＝Ｙ（ｇ）／３７７．８６（ｇ／ｍｏｌ）　式（１）
使用した錯体の分子量をＭ（ｇ／ｍｏｌ）とすると、粒子中に含まれる金属錯体量ａ（ｇ）は、式（２）により計算される。
　ａ（ｇ）＝Ｍ（ｇ／ｍｏｌ）×Ｚ（ｍｏｌ）　　式（２）
よって粒子中に含まれる金属錯体の含有率Ａ（ｗ％）は、式（３）により算出される。
　Ａ（ｗ％）＝［ａ（ｇ）／Ｘ（ｇ）］×１００　　式（３）
　また前記残渣はＴＧ－ＤＴＡ６３００（日立ハイテック社製）装置を用いて、粒子を３５℃から１０００℃までを５℃／ｍｉｎで昇温した後、５分間１０００℃で維持させ、その際に残った量より求める事が出来る。
　金属錯体粒子の好ましい１態様としては、粒径調整組成物としてスチレン系又は（メタ）アクリレート系の疎水性ポリマー、金属錯体としてホルミウムイオン、テルビウムイオン又はジスプロシウムイオンと、β－ジケトン系配位子及び複素環系配位子の少なくともいずれか一方、又は両方の配位子との金属錯体からなる金属錯体粒子が挙げられる。金属錯体の含有量が、粒子の合計重量に対して４０ｗ％以上９８ｗ％以下であることが好ましい。
　金属錯体の含有量は、その種類にもよるが、４０ｗ％以上９８ｗ％以下であることが好ましい。４０ｗ％以上の場合、充分な集磁性が発現する。９８ｗ％以下であると、粒子としての形状を維持できる。より好ましくは、５０ｗ％以上、更に好ましくは６０ｗ％以上である。
　本発明の金属錯体粒子の粒径は特に限定されないが、高い集磁性を実現するため、粒径は５００ｎｍ以上１０μｍ以下が好ましい。５００ｎｍ以上であれば、磁石による分離速度が速く、また１０μｍ以下であれば、粒子が沈降しにくい。粒径は１μｍ以上５μｍ以下がより好ましい。
　なお、粒子の平均粒径は、粒子を走査型電子顕微鏡で観察し、観察された画像における任意に選択した５０個の各粒子の最大径を算術平均することにより求めた。
　本発明の金属錯体粒子の変動係数（ＣＶ値）は、測定結果の再現性を良好にするため、２０％以下が好ましい。２０％を超えると、集磁性にバラツキが生じ、測定結果の再現性が低下することがある。より好ましくは１０％以下である。
　なお、上記変動係数は、粒子を走査型電子顕微鏡で観察し、観察された画像における任意に選択した５０個の各粒子の粒径の標準偏差を求め、下記式により粒子の粒径のＣＶ値を求めた。
　ＣＶ値（％）＝（ρ／Ｄｎ）×１００
　ρ：粒子の粒径の標準偏差
　Ｄｎ：粒子の粒径の平均値
　本発明の金属錯体粒子の製造方法としては、以下の製法が例示される。
（１）Ａ：粒径調整組成物と金属錯体とを双方溶解可能な疎水性溶剤に溶解させる工程、Ｂ：工程Ａで得られた溶液を、界面活性剤及び／または分散安定剤が溶解した水溶液中に
添加して、乳化、転層乳化、懸濁等により、液滴を形成する工程、Ｃ：疎水性溶剤を加熱や減圧下にて留去する工程、Ｄ：フィルトレーション、分級等で粒径を揃える工程、による方法。
（２）Ａ：重合性モノマーと疎水性重合開始剤と金属錯体を溶解させる工程、Ｂ：界面活性剤及び／又は分散安定剤が溶解した水溶液中にて、乳化、懸濁等後により液滴を形成する工程、Ｄ：加熱及び／又は光照射により、金属錯体存在下で粒径調整組成物を重合する工程、Ｅ：フィルトレーション、分級等で粒径を揃える工程、による方法。尚、工程Ａにおいて、必要に応じて重合性モノマーと金属錯体の双方が溶解可能な疎水性溶剤を添加しても良い。その場合、工程Ｄの後、疎水性溶剤を加熱や減圧下にて留去する工程が追加される。また、重合性モノマーとしては、前述の単官能モノマーであっても、多官能モノマーであってもよく、両方を併用しても良い。
（３）Ａ：界面活性剤及び／又は分散安定剤が溶解した水に、テンプレートとなる粒径調整組成物からなる粒子（以下、「テンプレート粒子」ともいう）を分散させる工程、Ｂ：上記テンプレート粒子と金属錯体の双方を溶解可能な疎水性有機溶剤及び／または重合性モノマーに金属錯体を溶解させた金属錯体溶液を用意する工程、Ｃ：工程Ａで得られた分散液に、工程Ｂで得られた金属錯体溶液を添加し、前記テンプレート粒子内に、疎水性有機溶剤及び／または重合性モノマーと伴に金属錯体を吸収させる工程、Ｄ：重合性モノマーを加熱及び／又は光照射により重合し、疎水性有機溶剤を加熱や減圧下で留去する工程、による方法。尚、工程Ｂにおいて、疎水性重合開始剤を添加しても良い。また、工程Ｂにおいて、重合性モノマーが添加されていない場合は、工程Ｄにおける重合の工程は不要となる。
等が挙げられる。
　テンプレートとなる粒径調整組成物からなる粒子（テンプレート粒子）に、粒径の揃った粒子を用いることで、得られる金属錯体粒子の粒径を揃えられることと、内包させる金属錯体の量を均一にできることから、（３）の方法が好適に用いられる。
　上記粒径調整組成物からなるテンプレート粒子は、前述のとおり、重合性モノマーを重合して得られるポリマーを主成分とし、上記ポリマーは一種または二種以上の重合性モノマーのコポリマーも含む。
　上記テンプレート粒子を主として構成するポリマーとしては、疎水性ポリマーであれば特に限定されず、上述の単官能重合性モノマーをラジカル重合、イオン重合、配位重合等により、重合して得られるポリマーが用いられる。中でも、後述する疎水性溶媒への溶解性が高いことから、重合性モノマーが芳香族ビニルモノマー、（メタ）アクリルレートモノマー、ビニルエステルモノマーを主成分とするポリマー／コポリマーが好適に用いられる。芳香族ビニルモノマー、（メタ）アクリルレートが更に好ましい。
　上記テンプレート粒子の製法としては、乳化重合、懸濁重合、ソープフリー重合、分散重合、ミニエマルション重合、マイクロサスペンジョン重合；ポリマー溶液を用いた、転相乳化、液中乾燥法等を用いることができるが、粒径が揃ったポリマー粒子が得られるため、ソープフリー重合、分散重合が好適に用いられる。
　上記製法（１）又は（３）の場合、上述の重合性モノマーと開始剤とを添加し、加熱等により重合させても良い。中でも、多官能モノマーを用いた場合、粒子内に架橋構造を導入できるため、好ましい。尚、上記添加された重合性モノマーが加熱等により重合したポリマーは、粒径調整組成物の一部となるため、「第二粒径調整組成物」ともいう。
　上記金属錯体粒子中の粒径調整組成物の含有率は、上限値としては６０ｗ％未満が好ましく、５０ｗ％未満がより好ましい。下限値としては２ｗ％以上が好ましく、５ｗ％以上がより好ましい。２ｗ％以上であると、粒子の形状を維持しやすく、また、金属錯体の流出を防止することができる。また、本発明の金属錯体粒子は十分な集磁性を発現させるため、金属錯体の含有率は３０ｗ％以上が好ましいため、粒径調整組成物の含有率は、必然
的に７０ｗ％以下となる。尚、粒径調整組成物の含有率は、前述の式（１）～（３）の金属錯体の含有率を用いて、式（４）により算出される。
　粒径調整組成物の含有率（ｗ％）＝１００－金属錯体含有率（ｗ％）　　式（４）
　特開平１０－５５９１１に開示された従来の磁性粒子においては、図２Ａに示すように、断面視において、磁性体（Ｆｅ３Ｏ４）は粒子の表層部に存在していた。また特願２０１０-５２８６４０（特許第５５７４４９２号）に開示された従来の磁性粒子においては、図２Ｂに示すように磁性体（Ｆｅ３Ｏ４）は粒子の核付近の樹脂（海）上に磁性粒子（島）が局所的に存在し、蛍光色素（希土類（Ｅｕ））は粒子表層部に存在していた。しかし、本願の金属錯体粒子においては図１Ａ，図１Ｂに示すように、金属錯体そのものにより粒子が形成されていることより、金属錯体粒子の断面視において、粒子の表層（表面）から中心（点）までを、略均一なモルフォロジーが形成されている。つまり、上述のように、金属錯体の含有率が高いため、高い集磁性を有すると同時に、粒子１個あたりの磁性量が均一となるため、磁力による分離の際、個々の粒子の磁力への応答が均一となり、分離の際のばらつきが小さくなる。なお、粒径調整組成物が金属錯体粒子内に局所的に分布することもあり得るが、その場合は金属錯体（海）中に粒径調整組成物（島）が局所的または点在する形態となる。このような形態も本発明の一態様である。
　上述の製法（１）、（２）及び（３）で用いられる、疎水性溶剤としては、特に限定されないが、ＳＰ値が１０以下で、後に疎水性溶媒を留去するために沸点が水よりも低いことが好ましい。例えば、酢酸エチル（ＳＰ値：９．１、沸点：７７．１℃）、ベンゼン（ＳＰ値：９．２、沸点：８０．１℃）、ジイソプロピルエーテル（ＳＰ値：６．９、沸点：６９℃）、クロロホルム（ＳＰ値：９．１、沸点：６１．２℃）等が挙げられる。これらは、単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。なかでも、酢酸エチルが好ましい。
　ＳＰ値とは、沖津俊直、「接着」、高分子刊行会、４０巻８号（１９９６）ｐ３４２－３５０に記載された、沖津による各種原子団のΔＦ、Δｖ値を用い、下記式（Ａ）により算出した溶解性パラメーターδを意味する。また、混合物、共重合体の場合は、下記式（Ｂ）により算出した溶解性パラメーターδｍｉｘを意味する。
　δ＝ΣΔＦ／ΣΔｖ　　（Ａ）
　δｍｉｘ＝φ１δ１＋φ２δ２＋・・・φｎδｎ　　（Ｂ）
式中、ΔＦ、Δｖは、それぞれ、沖津による各種原子団のΔＦ、モル容積Δｖを表す。φは、容積分率又はモル分率を表し、φ１＋φ２＋・・・φｎ＝１である。
　上記製法（１）、（２）及び（３）に用いられる疎水性重合開始剤としては、上記疎水性溶媒に溶解可能な疎水性重合開始剤であれば特に限定されない。具体的には、ジ-ｔｅｒｔ-ブチルペルオキシド、ｔｅｒｔ-ブチルヒドロペルオキシド、過酸化ベンゾイル、メチルエチルケトンペルオキシド、ジ（セカンダリーブチル）パーオキシジカーボネート等の過酸化物、アゾビスイソブチロニトリル、２，２´-アゾビス（２－メチルブチロニトリル）（V‐５９）、２，２´-アゾビス（２，４－ジメチルバレロニトリル）（V－６５）、２，２´-アゾビス（４－メトキシ－２，４－ジメチルバレロニトリル）（V－７０）、ジメチル２，２´-アゾビス（イソブチレート）（V－６０１）等のアゾ系化合物が挙げられるが、好ましくはｔｅｒｔ－ブチル－２－エチルペルオキシヘキサノアート、ジ（セカンダリーブチル）パーオキシジカーボネート、アゾビスイソブチロニトリルが良い。
　上記製法（１）、（２）及び（３）に用いられる、分散剤としては、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（メタ）アクリル酸、側鎖に水酸基、カルボキシル基、ポリアルキレングリコール基等の水溶性基を有したポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリルレート等の水溶性ポリマー、コロイダルシリカ、炭酸カルシウム等が挙げられる。これらは単独で用いても、２種以上が併用されても良
い。
　上記製法（１）、（２）及び（３）に用いられる、界面活性剤としては、水溶性であれば特に限定されず、ポリアルキレングリコールアルキルエーテル等のノニオン性界面活性剤；アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルカルボン酸塩、アルキルリン酸エステル塩、アルキル硫酸エステル塩等のアニオン性界面活性剤；アルキルアミン塩、４級アルキルアンモニウム塩等のカチオン性界面活性剤；ベタイン型、スルホベタイン型、アルキルベタイン型等の両性界面活性剤が挙げられる。これらは単独で用いても、２種以上が併用されても良い。
　上記製法（１）、（２）及び（３）においては、必要に応じて、その他添加剤を用いても良い。
　　その他添加剤としては、電解質として塩化カリウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム等が挙げられる。これらは単独で用いても、２種以上が併用されても良い。
　金属錯体粒子の製造方法の１態様として、
　界面活性剤または水溶性ポリマーが溶解した水系媒体（ａ）を用意する工程と、
　上記水系媒体（ａ）に粒径調整組成物からなる粒子（テンプレート粒子）を分散させた、水系媒体分散液（Ａ）を用意する工程と、
　粒径調整組成物が溶解可能な疎水性溶剤（ｂ）を用意する工程と、
　上記疎水性溶剤（ｂ）に、磁性及び蛍光の両方を有する金属錯体を溶解させた、金属錯体溶解液（Ｂ）を用意する工程と、
　前記、（Ａ）と（Ｂ）を混合し、粒径調整組成物と金属錯体と疎水性溶剤（ｂ）からなる膨潤液滴（ｃ）を用意する工程と、
　上記膨潤液滴（ｃ）から疎水性溶剤（ｂ）を除去する工程と、を含む金属錯体粒子の製造方法が挙げられる。
　金属錯体が、ホルミウムイオン、テルビウムイオン又はジスプロシウムイオンと、β－ジケトン系配位子及び複素環系配位子の両方又はいずれか一方とからなることが好ましい。
　疎水性ポリマーは、スチレン系又は（メタ）アクリレート系の疎水性ポリマーからなることが好ましい。
　本発明の蛍光と磁性を併せ持つ金属錯体粒子を担体として、測定対象物質、測定対象物質の類似物質、または測定対象物質と特異的に結合する物質（以下、これらを総称して担持用物質と略記することがある）を固定化することで感作金属錯体粒子を作製することができる。この感作金属錯体粒子もまた、本発明の一つである。
　本発明における測定対象物質としては、通常この分野で測定されるものであれば特に限定はされず、例えば血清、血液、血漿、尿等の生体体液、リンパ液、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中に含まれるタンパク質、脂質タンパク質、核酸、免疫グロブリン、血液凝固関連因子、抗体、酵素、ホルモン、癌マーカー、心疾患マーカー及び各種薬物等が代表的なものとして挙げられる。更に具体的には、例えばアルブミン、ヘモグロビン、ミオグロビン、トランスフェリン、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）等のタンパク質；例えば高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低比重リポ蛋白質等のリポ蛋白；例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）等の核酸；例えばアルカリ性ホスファターゼ、アミラーゼ、酸性ホスファターゼ、γ－グルタミルトランスフェラーゼ（γ－ＧＴＰ）、リパーゼ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、レニン、プロテインキナーゼ（ＰＫ）、チロシンキナーゼ等の酵素；例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等の免疫グロブリン（或いはこれらの、例えばＦｃ部、Ｆａｂ部、Ｆ（ａｂ）２部等の断片）；例えばフィブリノーゲン、フィブリン分解産物（ＦＤＰ）、プロトロンビン、トロンビン等の血液凝固関連因子；例えば抗ストレプトリジンＯ抗体、抗ヒトＢ型肝炎ウイルス表面抗原抗体（ＨＢｓ抗原）、抗ヒトＣ型肝炎ウイルス抗体、抗リウマチ因子等の抗体；例えば甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、甲状腺ホルモン（ＦＴ３、ＦＴ４、Ｔ３、Ｔ４）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）エストラジオール（Ｅ２）等のホルモン；例えばα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９－９、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）等の癌マーカー；例えばトロポニンＴ（ＴｎＴ）、ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｎ端フラグメント（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）等の心疾患マーカー；例えば抗てんかん薬、抗生物質、テオフィリン等の薬物等が挙げられる。
　本発明における測定対象物質の類似物質（アナログ）は、測定対象物質と特異的に結合する物質（測定対象物質結合物質）が有する測定対象物質との結合部位と結合し得るもの、言い換えれば、測定対象物質が有する測定対象物質結合物質との結合部位を有するもの、更に言い換えれば、測定対象物質と測定対象物質結合物質との反応時に共存させると該反応と競合し得るものであれば何れでもよい。
　本発明における測定対象物質と特異的に結合する物質（測定対象物質結合物質）としては、例えば「抗原」－「抗体」間反応、「糖鎖」－「タンパク質」間反応、「糖鎖」－「レクチン」間反応、「酵素」－「インヒビター」間反応、「タンパク質」－「ペプチド鎖」間反応、「染色体又はヌクレオチド鎖」－「ヌクレオチド鎖」間反応、又は、「ヌクレオチド鎖」－「タンパク質」間反応等の相互反応によって測定対象物質又はその類似物質と結合するもの等が挙げられ、上記各組合せに於いて何れか一方が測定対象物質又はその類似物質である場合、他の一方がこの測定対象物質結合物質である。例えば、測定対象物質又はその類似物質が「抗原」であるとき測定対象物質結合物質は「抗体」であり、測定対象物質又はその類似物質が「抗体」であるとき測定対象物質結合物質は「抗原」である（以下、その他の上記各組合せにおいても同様である）。
　具体的には、例えばヌクレオチド鎖（オリゴヌクレオチド鎖、ポリヌクレオチド鎖）；染色体；ペプチド鎖（例えばＣ－ペプチド、アンジオテンシンＩ等）；タンパク質〔例えばプロカルシトニン、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、β２－ミクログロブリン、アルブミン、これらの分解産物、フェリチン等の血清タンパク質〕；酵素〔例えばアミラーゼ（例えば膵型、唾液腺型、Ｘ型等）、アルカリホスファターゼ（例えば肝性、骨性、胎盤性、小腸性等）、酸性ホスファターゼ（例えばＰＡＰ等）、γ－グルタミルトランスファラーゼ（例えば腎性、膵性、肝性等）、リパーゼ（例えば膵型、胃型等）、クレアチンキナーゼ（例えばＣＫ－１、ＣＫ－２、ｍＣＫ等）、乳酸脱水素酵素（例えばＬＤＨ１～ＬＤＨ５等）、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（例えばＡＳＴｍ、ＡＳＴｓ等）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（例えばＡＬＴｍ、ＡＬＴｓ等）、コリンエステラーゼ（例えばＣｈＥ１～ＣｈＥ５等）、ロイシンアミノペプチダーゼ（例えばＣ－ＬＡＰ、ＡＡ、ＣＡＰ等）、レニン、プロテインキナーゼ、チロシンキナーゼ等〕及びこれら酵素のインヒビター、ホルモン（例えばＰＴＨ、ＴＳＨ、インシュリン、ＬＨ、ＦＳＨ、プロラクチン等）、レセプター（例えばエストロゲン、ＴＳＨ等に対するレセプター）；リガンド（例えばエストロゲン、ＴＳＨ等）；例えば細菌（例えば結核菌、肺炎球菌、ジフテリア菌、髄膜炎菌、淋菌、ブドウ球菌、レンサ球菌、腸内細菌、大腸菌、ヘリコバクター・ピロリ等）、ウイルス（例えばルベラウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、ＡＴＬウイルス、ＡＩＤＳウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ポリオウイルス、ＥＢウイルス、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ等）、真菌（例えばカンジダ、クリプトコ
ッカス等）、スピロヘータ（例えばレプトスピラ、梅毒トレポネーマ等）、クラミジア、マイコプラズマ等の微生物；当該微生物に由来するタンパク質又はペプチド或いは糖鎖抗原；気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎等のアレルギーの原因となる各種アレルゲン（例えばハウスダスト、例えばコナヒョウダニ、ヤケヒョウダニ等のダニ類、例えばスギ、ヒノキ、スズメノヒエ、ブタクサ、オオアワガエリ、ハルガヤ、ライムギ等の花粉、例えばネコ、イヌ、カニ等の動物、例えば米、卵白等の食物、真菌、昆虫、木材、薬剤、化学物質等に由来するアレルゲン等）；脂質（例えばリポタンパク質等）；プロテアーゼ（例えばトリプシン、プラスミン、セリンプロテアーゼ等）；腫瘍マーカータンパク抗原（例えばＰＳＡ、ＰＧＩ、ＰＧＩＩ等）；糖鎖抗原〔例えばＡＦＰ（例えばＬ１からＬ３等）、ｈＣＧ（ｈＣＧファミリー）、トランスフェリン、ＩｇＧ、サイログロブリン、Ｄｅｃａｙ－ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ－ｆａｃｔｏｒ（ＤＡＦ）、癌胎児性抗原（例えばＣＥＡ、ＮＣＡ、ＮＣＡ－２、ＮＦＡ等）、ＣＡ１９－９、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＣＡ１２５、前立腺特異抗原、癌細胞が産生する特殊な糖鎖を有する腫瘍マーカー糖鎖抗原、ＡＢＯ糖鎖抗原等〕；糖鎖（例えばヒアルロン酸、β－グルカン、上記糖鎖抗原等が有する糖鎖等）；糖鎖に結合するタンパク質（例えばヒアルロン酸結合タンパク、βグルカン結合タンパク等）；リン脂質（例えばカルジオリピン等）；リポ多糖（例えばエンドトキシン等）；化学物質（例えばＴ３、Ｔ４、例えばトリブチルスズ、ノニルフェノール、４－オクチルフェノール、フタル酸ジ－ｎ－ブチル、フタル酸ジシクロヘキシル、ベンゾフェノン、オクタクロロスチレン、フタル酸ジ－２－エチルヘキシル等の環境ホルモン）；人体に投与・接種される各種薬剤及びこれらの代謝物；アプタマー；核酸結合性物質；およびこれらに対する抗体等が挙げられる。
　なお、本発明に用いる抗体としては、免疫グロブリン分子自体の他、パパインやペプシン等の蛋白質分解酵素、或いは化学的分解により生じるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等の分解産物も包含される。また、上記抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。上記抗体の取得方法も通常使用される方法を用いることができる。
　上記の如き測定対象物質結合物質としては、「抗原」－「抗体」間反応或いは「糖鎖－タンパク質」間反応によって測定対象物質又はその類似物質と結合するものが好ましい。具体的には、測定対象物質又はその類似物質に対する抗体、測定対象物質又はその類似物質が結合する抗原、或いは、測定対象物質又はその類似物質に結合するタンパク質が好ましく、測定対象物質又はその類似物質に対する抗体、或いは測定対象物質又はその類似物質に結合する抗原が更に好ましい。なお、本明細書において「抗原抗体反応」、「抗原」、「抗体」の語を用いる場合、通常の意味に加え、特異的な結合反応により感作金属錯体粒子を凝集させることができる上記の概念・形態のいずれをも含む場合があり、限定的に解釈してはならない。
　本発明の金属錯体粒子に担持用物質を固定化し感作金属錯体粒子を製造する方法は特に限定されない。従来公知の物理的および／または化学的結合によって固定化する方法を用いることができる。化学的結合の例としては、アルデヒド、アルブミン、カルボジイミド、ストレプトアビジン、ビオチン、エポキシドからなる群から選ばれる少なくとも一種の有機化合物、および／または、アミノ基、カルボキシ基、水酸基、メルカプト基、グリシジルオキシ基、トシル基等から選ばれる少なくとも一種の官能基を金属錯体粒子表面にもたせ、それらを介して担持用物質を金属錯体粒子に固定化させる等が挙げられる。このうち、金属錯体粒子自体の安定性および担持用物質固定化効率の観点から、カルボキシ基、トシル基を含む有機化合物が特に好ましい。
　本発明の感作金属錯体粒子における担持用物質の結合量は、用いる担持用物質の種類によって異なり、実験的に最適な量を適宜設定することができる。なお、本明細書において、「担持」「感作」「固定化」は通常の意味を有し、同義に使用している。
　このような方法により得られた本発明の感作金属錯体粒子は、必要に応じて各種高分子化合物やタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン等）で被覆（ブロッキング）処理を施し、適当な緩衝液に分散して感作金属錯体粒子分散液として用いる。感作金属錯体粒子分散液は、免疫測定用試薬として用いることができ、該測定試薬も本発明の一つである。本発明の免疫測定用試薬は、測定に用いる希釈液（緩衝液）や標準物質等を組み合わせて、測定試薬キットとして用いることができ、該キットも本発明の一つである。
　上記希釈液は、測定試料等の希釈に用いられる。上記希釈液としては、ｐＨ５．０～９．０の緩衝液であればどのようなものでも用いることができる。具体的には、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。
　本発明の免疫測定用試薬や希釈液は、測定感度の向上や、測定対象物質と担持用物質間の特異的反応の促進を目的に、種々の増感剤を含有してもよい。上記増感剤としては、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース等のアルキル化多糖類や、プルラン、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
　本発明の免疫測定用試薬や希釈液は、測定試料中に存在する測定対象物質以外の物質により起こる非特異反応の抑制や、測定試薬の安定性向上等を目的に、各種高分子化合物やタンパク質、およびその分解物、アミノ酸、界面活性剤等を含有してもよい。こういった添加物の例としては、アルブミン（牛血清アルブミン、卵性アルブミン）、カゼイン、ゼラチン等のタンパク質が挙げられる。
　本発明の測定対象物質測定方法は、上記本発明における金属錯体粒子を用いて行われる以外は特に限定されず、例えば、この分野で通常行われる、文献（例えば、「酵素免疫測定法第２版」石川栄治ら編集、医学書院、１９８２年）記載のサンドイッチ法、競合法等に準じて行えばよい。
　本発明の測定対象物質測定法において、試料、金属錯体粒子、標識された測定対象物質結合物質、標識測定対象物質又はその類似物質等を接触させる方法としては、通常なされる撹拌、混合等の処理により、金属錯体粒子が分散されればよい。反応時間は、測定対象物質、用いられる測定対象物質結合物質、サンドイッチ法、競合法等の違いに応じて適宜設定されればよい。
　本発明の測定対象物質測定方法におけるＢ／Ｆ分離（結合標識抗体と未結合標識抗体の分離）は、例えば、金属錯体粒子の磁性を利用し、反応槽の外側等から磁石等により金属錯体粒子を集めて、反応液を排出し、洗浄液を加えた後、磁石を取り除き、金属錯体粒子を混合して分散させ、洗浄することによりなされる。上記操作を１～３回繰り返してもよい。洗浄液としては、通常この分野で用いられるものであれば特に限定はされない。
　測定対象物質結合物質、測定対象物質又はその類似物質等を標識するために用いられる標識物質としては、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に於いて用いられるアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ルシフェラーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ等の酵素類、例えば放射免疫測定法（ＲＩＡ）に於いて用いられる99mＴｃ、131Ｉ、125Ｉ、14Ｃ、3Ｈ、32Ｐ等の放射性同位元素、例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）に於いて用いられるフルオレセイン、ダンシル、フルオレスカミン、クマリン、ナフチルアミン或いはこれらの誘導体、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光性物質、例えばルシフェリン、イソルミノール、ルミノール、ビス（２，４，６－トリフロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール、ナフトール、アントラセン或いはこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば４－アミノ－２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル、３－アミノ－２，２，５，５－テトラメチルピロリジン－１－オキシル、２，６－ジ－ｔ－ブチル－α－（３，５－ジ－ｔ－ブチル－４－オキソ－２，５－シクロヘキサジエン－１－イリデン）－ｐ－トリオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。これらの内、感度等の観点から、酵素、蛍光性物質が好ましく、更に好ましいのはアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ及びグルコースオキシダーゼであり、特に好ましいのはペルオキシダーゼである。
　上記した如き標識物質を測定対象物質結合物質、測定対象物質又はその類似物質等に結合させるには、通常この分野で用いられる方法、例えば自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ或いはＦＩＡ等に於いて一般に行われている自体公知の標識方法［例えば、医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、１９７１；図説　蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、１９８３；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、室井潔編、第２版、医学書院、１９８２等に記載のグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法又はピリジルジスルフィド法等］等を利用すればよい。
　標識物質の使用量は、用いる標識物質の種類により適宜設定すればよい。例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等の通常この分野で用いられている緩衝液中に含有させて用いればよい。尚、当該緩衝液としては、通常この分野で用いられている、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられ、そのｐＨは、抗原抗体反応を抑制しない範囲であればよく、通常５～９である。また、このような緩衝液中には、目的の抗原抗体反応を阻害しないものであれば、例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、ポリエチレングリコール等の安定化剤、界面活性剤、糖類等を含有させておいてもよい。
　標識物質又はその活性の測定方法としては、通常行われる方法を特に制限なく用いることができる。測定に際し用いる光学機器も特に限定されず、代表的には、臨床検査で広く使用されている生化学自動分析機であればいずれも使用することができる。
　以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定して解釈されることはない。
［調製例１］
金属錯体（ａ）の合成
　塩化ホルミウム６水和物（ＨｏＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）のエタノール溶液に、塩化ホルミウム６水和物に対し、１倍等量の２，２’‐ビピリジル（ｂｐｙ）、３倍等量のジベンゾイルメタン（ＤＢＭ）を添加し、混和後、更にジエタノールアミンを加えることで、ｐＨ６－７に調整した。室温で２４時間撹拌後、淡黄色の沈殿物が得られた。得られた沈殿物をろ過後、エタノールで洗浄することで、金属イオンがホルミウム、配位子がｂｐｙ及びＤＢＭである、金属錯体（ａ）を得た。
［調製例２］
金属錯体（ｂ）の合成
　配位子として、ＤＢＭの代わりにテノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＡ）を用いた以外は調製例１と同様の操作にて、金属イオンがホルミウム、配位子がｂｐｙ及びＴＴＡである、金属錯体（ｂ）を得た。
［調製例３］
金属錯体（ｃ）の合成
　塩化ホルミウム６水和物の代わりに塩化ジスプロシウム（ＤｙＣｌ３）を用いた以外は調製例１と同様の操作にて、金属イオンがジスプロシウム、配位子がｂｐｙ及びＤＢＭである、金属錯体（ｃ）を得た。
［調製例４］
金属錯体（ｄ）の合成
塩化ホルミウム６水和物の代わりに塩化テルビウム６水和物（ＴｂＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）を用いた以外は調製例１と同様の操作にて、金属イオンがテルビウム、配位子がｂｐｙ及びＤＢＭである、金属錯体（ｄ）を得た。
［調製例５］
金属錯体（ｅ）の合成
　配位子として、ｂｐｙの代わりに２，２´：６，２´´－テルピリジン（ｔｅｒｐｙ）を用いた以外は調製例１と同様の操作にて、金属イオンがホルミウム、配位子がｔｅｒｐｙ及びＤＢＭである、金属錯体（ｅ）を得た。
［調製例６］
金属錯体（ｆ）の合成
　配位子として、ｂｐｙの代わりに１，１０－フェナントロリン一水和物（ｐｈｅｎ）を用いた以外は調製例１と同様の操作にて、金属イオンがホルミウム、配位子がｐｈｅｎ及びＤＢＭである、金属錯体（ｆ）を得た。
［調製例７］
金属錯体（ｇ）の合成
　塩化ホルミウム６水和物の代わりに塩化ユーロピウム６水和物（ＥｕＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）を用い、配位子にテノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＡ）を用いた以外は調製例１と同様の操作にて、金属イオンがユーロピウム、配位子がＴＴＡである、金属錯体（ｇ）を得た。
［調製例８］
テンプレート粒子（Ｉ）の調整
　反応容器にイオン交換水５００ｇ、粒径調整組成物を構成するモノマーとしてメチルメタクリレート（ＭＭＡ）（和光純薬工業社製）５０g、過硫酸カリウム（和光純薬工業社製）０．５ｇを添加し、窒素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。その後７０℃に加熱し、２４時間重合を行うことで、ポリメチルメタクリレートからなるテンプレート粒子（Ｉ）を得た。
　得られたテンプレート粒子（Ｉ）の平均粒子径は１．０６μｍであり、ＣＶ値は３．３％であった。
［調製例９］
テンプレート粒子（ＩＩ）の調整
　粒径調整組成物を構成するモノマーをＭＭＡからスチレン（Ｓｔ）（ＮＳスチレンモノマー社製）に変更した以外は、同様の操作にて、ポリスチレンからなるテンプレート粒子（ＩＩ）を得た。
　得られたテンプレート粒子（ＩＩ）の平均粒子径は１．０３μｍであり、ＣＶ値は３．８％であった。
[実施例１]
金属錯体粒子（１）の調製
　イオン交換水１００ｇ中に上記テンプレート粒子（Ｉ）の含有量が０．１ｇとなるよう、また、ラウリル硫酸トリエタノールアミンの含有量が０．１ｇとなるよう、上記テンプレート粒子（Ｉ）とラウリル硫酸トリエタノールアミン（エマールＴＤ、花王社製）をイオン交換水へ添加し、テンプレート粒子（Ｉ）分散液を得た。次に、金属錯体（ａ）２．７０ｇを酢酸エチル４．００ｇに溶解させ調製した金属錯体（ａ）溶液を、上記テンプレート粒子（Ｉ）分散液に添加した。室温で２４時間撹拌することで、上記テンプレート粒子（Ｉ）と金属錯体（ａ）との複合液滴を形成した。その後８０℃で１０時間加熱撹拌を行い、酢酸エチルを除去することで、本発明の金属錯体粒子（１）を得た。
　得られた金属錯体粒子（１）の平均粒子径は３．２１μｍ、ＣＶ値は３．８％であり、金属錯体含有率は９６．４ｗ％であった。
［実施例２］
　イオン交換水１００ｇ中に上記テンプレート粒子（Ｉ）の含有量が０．１ｇとなるよう、また、ラウリル硫酸トリエタノールアミンの含有量が０．１ｇとなるよう、上記テンプレート粒子（Ｉ）とラウリル硫酸トリエタノールアミン（エマールＴＤ、花王社製）をイオン交換水へ添加し、テンプレート粒子（Ｉ）分散液を得た。次に、金属錯体（ａ）２．５０ｇ、第二粒径調整組成物用モノマーとしてメチルメタクリレート（和光純薬社製）０．２０ｇ、ジ（セカンダリーブチル）パーオキシジカーボネート（ルペロックス２２５、アルケマ吉富社製）０．０２ｇを酢酸エチル４．００ｇに溶解させ調製した金属錯体（ａ）溶液を、上記テンプレート粒子（Ｉ）分散液に添加した。室温で２４時間撹拌することで、上記テンプレート粒子（Ｉ）、金属錯体（ａ）との複合液滴を形成した。その後８０℃で１０時間加熱撹拌を行い、メチルメタクリレートを重合すると同時に酢酸エチルを除去することで、第二粒径調整組成物としてのポリメチルメタクリレート（ｐＭＭＡ）を含有する金属錯体粒子（２）を得た。
　得られた金属錯体粒子（２）の平均粒子径は３．２０μｍ、ＣＶ値は４．２％であり、金属錯体含有率は８９．１ｗ％であった。
［実施例３］
　第二粒径調整組成物用モノマーとして、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）（ＤＶＢ９６０、ＮＳスチレンモノマー社製）を用いたこと以外は実施例２と同様に操作し、第二粒径調整組成物としてのポリジビニルベンゼン（ｐＤＶＢ）を含有する金属錯体粒子（３）を得た。
　得られた金属錯体粒子（３）の平均粒子径は３．１８μｍ、ＣＶ値は４．１％であり、金属錯体含有率は８８．１ｗ％であった。
［実施例４］
　テンプレート粒子（ＩＩ）を用い、第二粒径調整組成物用モノマーとして、スチレン（Ｓｔ）（ＮＳスチレンモノマー社製）を用いた以外は、実施例２と同様に操作し、第二粒径調整組成物としてのポリスチレン（ｐＳｔ）を含有する金属錯体粒子（４）を得た。
　得られた金属錯体粒子（４）の平均粒子径は３．１０μｍ、ＣＶ値は４．３％であり、金属錯体含有率は８９．０ｗ％であった。
［実施例５］
　金属錯体として、金属錯体（ｂ）を用いた以外は、実施例３と同様に操作し、金属錯体粒子（５）を得た。
　得られた金属錯体粒子（５）の平均粒子径は３．１２μｍ、ＣＶ値は４．２％であり、金属錯体含有率は８８．２ｗ％であった。
［実施例６］
　金属錯体（ａ）を２．００ｇ、ジビニルベンゼンを０．７０ｇ、ジ（セカンダリーブチル）パーオキシジカーボネートを０．０８ｇ用いたこと以外は実施例３と同様に操作し、金属錯体粒子（６）を得た。
　得られた金属錯体粒子（６）の平均粒子径は３．２０μｍ、ＣＶ値は３．８％であり、金属錯体含有率は７１．４ｗ％であった。
［実施例７］
　金属錯体（ａ）を１．６０ｇ、ジビニルベンゼンを１．１０ｇ、ジ（セカンダリーブチル）パーオキシジカーボネートを０．１１ｇ用いたこと以外は実施例３と同様に操作し、金属錯体粒子（７）を得た。
　得られた金属錯体粒子（７）の平均粒子径は３．１８μｍ、ＣＶ値は３．９％であり、金属錯体含有率は５５．６ｗ％であった。
［実施例８］
　金属錯体（ａ）を１．２０ｇ、ジビニルベンゼンを１．５０ｇ、ジ（セカンダリーブチル）パーオキシジカーボネートを０．１５ｇ用いたこと以外は実施例３と同様に操作し、金属錯体粒子（８）を得た。
　得られた金属錯体粒子（８）の平均粒子径は３．１７μｍ、ＣＶ値は４．１％であり、金属錯体含有率は４０.２ｗ％であった。
［実施例９］
　金属錯体（ａ）を２．５０ｇ、スチレンを０．２０ｇ、クロロホルムを１３ｇ、ジ（セカンダリーブチル）パーオキシジカーボネートを０．００２ｇ、ポリビニルアルコール（ゴーセノールＧＨ２０、日本合成社製）５重量％水溶液を１３ｇ、ラウリル硫酸トリエタノールアミンを１．５g、イオン交換水を１５０ｇ混合し、ホモジナーザーを用いて、２５００ｒｐｍで撹拌後した。その後、反応槽へ移し、窒素気流下、２００ｒｐｍで２時間撹拌後、８０℃で１０時間加熱撹拌を行い、スチレンを重合すると同時にクロロホルムを除去した。反応終了後、遠心分離操作を繰り返すことで、粒径調整組成物としてポリスチレン（ｐＳｔ）を含有する金属錯体粒子（９）を得た。
　得られた金属錯体粒子（９）の平均粒子径は３．３１μｍ、ＣＶ値は１２．８％であり、金属錯体含有率は９０.２ｗ％であった。
［実施例１０］
　実施例９における反応終了後の遠心分離操作の遠心条件を変更して遠心分離操作を繰り返した以外は、実施例９と同様の操作を行い、本発明の金属錯体粒子（１０）を得た。
　得られた金属錯体粒子（１０）の平均粒子径は３．４２μｍ、ＣＶ値は１７．８％であり、金属錯体含有率は９１．３ｗ％であった。
［実施例１１］
　金属錯体として、金属錯体（ｃ）を用いた以外は、実施例３と同様に操作し、金属錯体粒子（１１）を得た。
　得られた金属錯体粒子（１１）の平均粒子径は３．２２μｍ、ＣＶ値は４．８％であり、金属錯体含有率は８９．３ｗ％であった。
［実施例１２］
　金属錯体として、金属錯体（ｄ）を用いた以外は、実施例３と同様に操作し、金属錯体粒子（１２）を得た。
　得られた金属錯体粒子（１２）の平均粒子径は３．１６μｍ、ＣＶ値は４．４％であり、金属錯体含有率は８８．７ｗ％であった。
［実施例１３］
　金属錯体として、金属錯体（ｅ）を用いた以外は、実施例３と同様に操作し、金属錯体粒子（１３）を得た。
得られた金属錯体粒子（１３）の平均粒子径は３．２２μｍ、ＣＶ値は５．２％であり、金属錯体含有率は８９.２ｗ％であった。
［実施例１４］
　金属錯体として、金属錯体（ｆ）を用いた以外は、実施例３と同様に操作し、金属錯体粒子（１４）を得た。
　得られた金属錯体粒子（１４）の平均粒子径は３．０６μｍ、ＣＶ値は４．９％であり、金属錯体含有率は８７.５ｗ％であった。
［比較例１］
　金属錯体（ａ）の仕込量を０．５０ｇ、第二粒径調整組成物としてのジビニルベンゼンの仕込量を２．２０ｇとしたこと以外は実施例３と同様に操作し、金属錯体粒子（１５）を得た。
　得られた金属錯体粒子（１５）の平均粒子径は３．１８μｍ、ＣＶ値は５．１％であり、金属錯体含有率は１４．８ｗ％であった。
［比較例２］
実施例９における反応終了後の遠心分離操作の遠心条件を変更して遠心分離操作を繰り返した以外は、実施例９と同様の操作を行い、本発明の金属錯体粒子（１６）を得た。
得られた金属錯体粒子（１６）の平均粒子径は３．３３μｍ、ＣＶ値は２５．６％であり、金属錯体含有率は９０．４ｗ％であった。
［比較例３］
　金属錯体として、金属錯体（ｇ）を用いた以外は、実施例３と同様に操作し、金属錯体粒子（１７）を得た。
得られた金属錯体粒子（１７）の平均粒子径は３．１５μｍ、ＣＶ値は４．８％であり、金属錯体含有率は８８．６ｗ％であった。
［評価方法］
　＊集磁性評価
　分光光度計（Ｕ‐３９００Ｈ　日立製作所社製）に予めスペーサー（Ｗ１０ｍｍ×Ｄ１０ｍｍ×Ｈ１０ｍｍ）を介し、磁石（３６８０Ｇ、Ｗ１０ｍｍ×Ｄ１０ｍｍ×Ｈ５ｍｍ）をあてた状態で分光光度計に設置した石英セルに試料（１．２ｍＬ）を投入し、５秒後から１２５秒後の吸光度を測定し、式（６）を用いて集磁率を算出した。
　集磁率（％）＝［｛（試料投入５秒後の吸光度）－（試料投入１２５秒後の吸光度）｝／（試料投入５秒後の吸光度）］×１００　　式（６）
［判定基準］
　　〇〇〇：集磁率が６１％以上
　　〇〇：集磁率が４１％以上６０％未満
　　〇：集磁率が２１％以上４０％未満
　　×：集磁率が２０％未満
　得られた結果をまとめて表１、表２、表３に示す。
［参考例１］
　特許文献３（特開２００８－１２７４５４号公報）の製法では、図２Ｂに示すように磁性体（Ｆｅ３Ｏ４）は粒子の核付近に局所的に、蛍光色素（希土類（Ｅｕ））は粒子表層
部に存在する。そのため、また粒子の色は、褐色～黒色をとる。また、粒径は約０．２μｍ、フェライト粒子含有量は約５ｗ％である。１２０ｓ集磁性は８％であり、相対蛍光強度は３６であった。
［参考例２］
　特開平１０－５５９１１記載の製法では、図２Ａに示すように磁性体（Ｆｅ３Ｏ４）は粒子の表層部に存在する。また、蛍光色素を含まないため、蛍光を有さない。フェライト含有率は１８．３ｗ％であり、１２０ｓ集磁性は８３％であった。
［参考例３］
　参考特許（特表昭５９－５００６９１）記載の製法では、磁性体（Ｆｅ３Ｏ４）は粒子の内部に存在する。また、蛍光色素を含まないため、蛍光を有さない。フェライト含有率は３１．２ｗ％であり、１２０ｓ集磁性は９５％であった。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004

Claims (12)

  1. 　磁性体と、疎水性ポリマーを含む粒径調整組成物と、を備える金属錯体粒子であって、
    　前記磁性体は、金属イオンと配位子からなる、磁性及び蛍光の両方を有する金属錯体を含み、
    　前記金属錯体粒子中の前記粒径調整組成物の含有率が６０ｗ％未満である、金属錯体粒子。
  2. 前記磁性体は蛍光を有さない磁性を有する金属錯体を含まない磁性体である、請求項１に記載の金属錯体粒子。
  3. 　前記磁性体は前記金属錯体のみである、請求項１に記載の金属錯体粒子。
  4. 　前記金属錯体を形成する金属イオンの磁気モーメントが７．５～１０．７である、請求項１~３のいずれか１項に記載の金属錯体粒子。
  5. 　前記金属錯体を形成する金属イオンがテルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウムのイオンからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１～４のいずれか１項に記載の金属錯体粒子。
  6. 　前記金属錯体を形成する配位子がβ―ジケトン系配位子及び複素環系配位子の両方又はいずれか一方である、請求項１～５のいずれか１項に記載の金属錯体粒子。
  7. 　前記金属錯体を形成する配位子が、
    （１）β―ジケトン系配位子は、ジベンゾイルメタン、又はテノイルフルオロアセトン、
    （２）複素環系配位子は、２，２´‐ビピリジル、２，２´：６，２´´－テルピリジン、又は１，１０－フェナントロリン、
    から選ばれる配位子である、請求項１～６のいずれか１項に記載の金属錯体粒子。
  8. 　前記金属錯体粒子の平均粒径が１μｍ以上５μｍ以下である、請求項１～７のいずれか１項に記載の金属錯体粒子。
  9. 　前記金属錯体中の前記金属錯体の含有量が、４０ｗ％以上９８ｗ％以下ある、請求項１～８のいずれか１項に記載の金属錯体粒子。
  10. 　前記金属錯体粒子の表面に担持用物質を備える、請求項１～９のいずれか１項に記載の金属錯体粒子。
  11. 前記担持用物質が、検出対象物質と特異的に反応する抗体または抗原である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の金属錯体粒子。
  12. 　請求項１０に記載の金属錯体粒子を含む、免疫測定用試薬。
     
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