WO2019155151A2 - Anticorps dirigé contre le sous-type a des récepteurs aux endothélines et ses utilisations - Google Patents

Anticorps dirigé contre le sous-type a des récepteurs aux endothélines et ses utilisations Download PDF

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WO2019155151A2
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Narciso COSTA
Jean-Yves Couraud
Jean-Philippe Hugnot
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention belongs to the technical field of antibodies, their therapeutic and diagnostic use as well as their use as a research tool.
  • Endothelin receptors (designated ET1, ET2 and ET3 in humans) belong to the family of receptors with 7 transmembrane domains also called GPCRs for "G-protein Coupled Receptors". Endothelin receptors have two main subtypes in humans: subtype A (ETA-R) and subtype B (ETB-R). The fact that these receptors are classified in the family of GPCRs gives them a complex three-dimensional structure, closely related to the membrane context in which they are located.
  • GPCRs G-protein Coupled Receptors
  • endothelin-receptor-overexpressing tumor cells are found in a microenvironment rich in ET-1 which will then bind to the endothelin A or B receptor resulting in a conformational change of endothelin in an "activated" configuration. Over-represented on the surface of these same tumor cells.
  • the endothelin receptor subtype A also has a modification of its level of expression, in particular in colorectal cancer, in breast cancer, ovarian cancer, in glioblastomas (brain tumors). ) and in cases of bladder cancer [9].
  • Kondoh et al, 1990 [12] describes the binding properties of 4 monoclonal antibodies (A2, G9, E7 and G10) to solubilized endothelin receptor complexes present on the surface of rat lung membranes.
  • the G9 and G10 antibodies are G-type and Isotype 2a immunoglobulins (IgG2a), whereas the A2 and E7 antibodies are IgG1 immunoglobulins. While these four antibodies are indeed specific for endothelin-solubilized receptors, Kondoh et al, 1990 [12] provides no information about the fine specificity of these antibodies (ETA-R and / or ETB-R), as to the recognition of receptors of human origin, nor as to their properties.
  • Patent application CA 2 971 491 [13] describes twelve antibodies specific for human endothelin receptor subtype A, designated A-1 to A-12. These antibodies have antagonistic properties and are capable of inhibiting the signaling pathway involving ET1. For this reason, patent application CA 2 971 491 envisages using these antibodies in the treatment of pulmonary arterial hypertension.
  • Rendomab-A63 or RA63 a monoclonal antibody directed against the subtype A endothelin receptors and in particular human subtype A, hereinafter called Rendomab-A63 or RA63.
  • This antibody does not antagonize the pharmacological properties of endothelin receptor subtype A (ETA-R).
  • the antibody according to the present invention is not capable of diminishing, inhibiting or blocking one or more biological activity (s) of ETA-R.
  • the antibody according to the present invention is capable of recognizing the particular conformers of the endothelin receptor subtype A expressed on the surface of cancerous cells and in particular of glioblastoma cells.
  • the present invention relates to an antibody directed against endothelin receptor subtype A, a fragment or derivative thereof. this.
  • antibody and “immunoglobulin” are equivalent and may be used interchangeably in the present invention.
  • An antibody is a glycoprotein comprising at least two heavy chains (H) and at least two light chains (L) interconnected by one or more disulfide bridges.
  • Each heavy chain comprises a variable region (or domain) (VH) and a constant region comprising 3 domains, usually designated CH1, CH2 and CH3.
  • Each light chain comprises a variable region (or domain) (VL) and a constant region comprising a single domain, usually designated CL.
  • the variable regions of the heavy and light chains involved in antigen recognition can be further subdivided into 3 hypervariable regions, also called complementarity determining regions (CDRs), framed by 4 more conserved regions, also called framework regions. (EN).
  • CDRs complementarity determining regions
  • each heavy chain (or light chain) variable region is, from the N-terminus to the C-terminus, as follows: FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4.
  • CDR and FR that has been used is that of the IMGT (the international ImMunoGeneTics database http://imgt.cines.fr:8104). The calculations of the percentages of identity of the CDR sequences mentioned and claimed hereafter are therefore to be taken into account on the basis of this annotation.
  • antibody fragment is meant, in the context of the present invention, both a monovalent fragment which has a single antigen-binding site and a divalent fragment which has two antigen-combining sites. .
  • a fragment according to the invention has at least one antigen binding site.
  • Fab fragment which retain the antigen binding site
  • Fd heavy chain
  • a fragment F (ab ') 2 is a divalent fragment corresponding to the association of two Fab fragments connected by the disulfide bridges present at the hinge region of immunoglobulins ("Hinge") located between the constant CH1 and CH2 domains.
  • a Fv fragment is a monovalent fragment consisting only of the variable regions VL and VH of the light and heavy chains of an antibody.
  • An scFv fragment is a monovalent polypeptide fragment, obtained only by genetic engineering, corresponding to the variable domains linked by a peptide bond.
  • a diabody is a recombinant and divalent antibody molecule consisting of two scFv molecules upside down because of a peptide link that is too short to allow the formation of scFv.
  • the fragments according to the invention also cover the fragments as mentioned above, the half-life of which has been increased by chemical modification, in particular by incorporation into a liposome or by the introduction of a poly (alkylene) glycol such as a polyethylene.
  • a poly (alkylene) glycol such as a polyethylene.
  • glycol (PEG) this technique being called “PEGylation” and giving fragments such as Fab-PEG, F (ab ') 2 -PEG or Fv-PEG.
  • antibody derivative is meant, in the context of the present invention, fragments of antibodies obtained by genetic engineering such as single chain Fv (scFv) and single domain (dAb) antibodies.
  • scFv single chain Fv
  • dAb single domain
  • the term also includes antibody-like molecules that can be produced using phage display techniques or other random selection techniques for molecules that bind to subtype A receptors. endothelins or specific regions of this subtype.
  • the "antibody fragments” and “antibody derivatives” cover all molecules that contain a structure, advantageously peptide, which is part of the recognition site (that is, the part of the antibody which binds to or combines with the epitope or antigen) of an antibody according to the present invention.
  • the fragments and antibody derivatives according to the present invention are able to recognize the particular conformers of the endothelin receptor subtype A expressed on the surface of cancer cells and in particular glioblastoma cells.
  • - CDRIL has at least 60% identity with the following amino acid sequence: SQSIVYSNGKIYL (SEQ ID NO: 2);
  • - CDR2L has at least 60% identity with the following amino acid sequence: KVS;
  • CDR3L has at least 60% identity with the following amino acid sequence: FQGSHLPLT (SEQ ID NO: 4); and
  • - CDRIH has at least 60% identity with the following amino acid sequence: GFTFNIYA (SEQ ID NO: 6);
  • amino acid sequences are given in accordance with the international 1-letter code.
  • the antibody according to the present invention has at least one light chain variable region whose CDR2 (ie CDR2L) has at least 60% identity, at least 65% identity, at least 70% identity, at least 75% identity, at least 80% identity, at least 85% identity, at least 90% identity, at least 95% identity, at least 98% identity with the acid sequence following amines: KVS.
  • CDR2L CDR2L
  • the antibody according to the present invention has at least one light chain variable region whose CDR3 (ie CDR3L) has at least 60% identity, at least 65% identity, at least 70% identity, at least 75% identity, at least 80% identity, at least 85% identity, at least 90% identity, at least 95% identity, at least 98% identity with the acid sequence following amino acids: FQGSHLPLT (SEQ ID NO: 4).
  • the identity percentages of the various CDRs in the light chain variable region are independent of one another.
  • CDR2L may have at least 65% with the following amino acid sequence: KVS
  • CDR3L may have at least 70% identity with the following amino acid sequence: FQGSHLPLT (SEQ ID NO: 4) .
  • FQGSHLPLT SEQ ID NO: 4
  • the antibody according to the present invention comprises at least one variable light chain region whose amino acid sequence:
  • CDRIL is SQSIVYSNGKIYL (SEQ ID NO: 2); - CDR2 L is KVS; and
  • CDR3 L is FQGSHLPLT (SEQ ID NO: 4).
  • the antibody according to the present invention comprises at least one light chain variable region whose amino acid sequence has at least 60% identity with the following sequence:
  • the antibody according to the present invention may comprise at least one light chain variable region whose amino acid sequence has at least 65% identity, at least 70% identity, at least 75% identity. , at least 80% identity, at least 85% identity, at least 90% identity, at least 95% identity, at least 98% identity with the sequence SEQ ID NO: 12.
  • the antibody according to the present invention may comprise at least one light chain variable region whose amino acid sequence corresponds to the sequence SEQ ID NO: 12.
  • the antibody according to the present invention has at least one heavy chain variable region whose CDR1 (ie CDRIH) has at least 60% identity, at least 65% identity, at least 70% identity, at least 75% identity, at least 80% identity, at least 85% identity, at least 90% identity, at least 95% identity, at least 98% identity with the acid sequence following amines: GFTFNIYA (SEQ ID NO: 6).
  • the antibody according to the present invention has at least one heavy chain variable region whose CDR2 (ie CDR2H) has at least 60% identity, at least 65% identity, at least 70% identity, at least 75% identity, at least 80% identity, at least 85% identity, at least 90% identity, at least 95% identity, at least 98% identity with the acid sequence following amines: I RSKSN NYAT (SEQ ID NO: 8).
  • the antibody according to the present invention has at least one heavy chain variable region whose CDR3 (ie CDR3H) has at least 60% identity, at least less than 65% identity, at least 70% identity, at least 75% identity, at least 80% identity, at least 85% identity, at least 90% identity, at least 95 % identity, at least 98% identity with the following amino acid sequence: VSSYYSGSFFAY (SEQ ID NO: 10).
  • the identity percentages of the various CDRs in the heavy chain variable region are independent of one another.
  • CDR2H may have at least 75% with the following amino acid sequence: RSKSNNYAT (SEQ ID NO: 8), while CDR3L may have at least 65% identity with the following amino acid sequence : VSSYYSGSFFAY (SEQ ID NO: 10).
  • RSKSNNYAT SEQ ID NO: 8
  • CDR3L may have at least 65% identity with the following amino acid sequence : VSSYYSGSFFAY (SEQ ID NO: 10).
  • the antibody according to the present invention comprises at least one heavy chain variable region whose amino acid sequence:
  • CDRIH is GFTFN IYA (SEQ ID NO: 6);
  • the antibody according to the present invention comprises at least one heavy chain variable region whose amino acid sequence has at least 60% identity with the following sequence:
  • the antibody according to the present invention may comprise at least one heavy chain variable region whose amino acid sequence has at least 65% identity, at least 70% identity, at least 75% identity. , at least 80% identity, at least 85% identity, at least 90% identity, at least 95% identity, at least 98% identity with the sequence SEQ ID NO: 14. More particularly, the antibody according to the present invention may comprise at least one heavy chain variable region whose amino acid sequence corresponds to the sequence SEQ. ID NO: 14
  • the antibody according to the invention has at least one light chain variable region comprising a CDRIL, a CDR2L and a CDR3L as defined above and at least one heavy chain variable region comprising a CDRIH, a CDR2H and a CDR3H such as than previously defined.
  • the light chain of the antibody according to the invention is typically a kappa light chain.
  • the heavy chain of the antibody according to the invention is in particular a gamma heavy chain 2b.
  • the antibody according to the present invention is a type G immunoglobulin.
  • the antibody according to the present invention is a lgG2b / kappa type immunoglobulin.
  • the antibody directed against the endothelin receptor subtype A, object of the present invention selectively binds extracellular segments of ETA-R.
  • antibody which selectively binds at least one specified domain or region of ETA-R, especially human ETA-R, is meant, in the context of the present invention, an antibody which binds the domain (s) specific with greater affinity than any other region of ETA-R.
  • the antibody binds the specified ETA-R domain (s) with an affinity of at least 2, or at least 5, or at least 10, or at least 50 times greater than that which it is present for any other region of ETA-R.
  • This binding can be determined by methods well known in the art such as flow cytometry, radioimmunoassay (RIA), confocal microscopy, enzymo-immunoassay labeling (EIA) by direct or indirect revelation of the antibody to test (ELISA).
  • the antibody which is the subject of the present invention may be obtained from an animal immunized with subtype A endothelin receptors or against a fragment of this receptor comprising the epitope (s) recognized by the antibody according to the present invention.
  • the immunized animal may be any animal usually used for the production of antibodies such as a mouse, a rat, a rabbit, a goat, a dog, a horse or a camelid such as camel or llama.
  • the antibody which is the subject of the present invention can also be obtained from a library of antibodies or antibody fragments selected against endothelin receptor subtype A or against a fragment of this receptor comprising (s) epitope (s) recognized by the antibody according to the present invention.
  • the library of antibodies or antibody fragments can be generated from any animal usually used for the production of antibodies such as a mouse, a rat, a rabbit, a goat, a dog, a horse or a camelid such as camel or lama but also from a non-human primate or a human.
  • the antibody thus obtained can be purified on an affinity column on which the endothelin receptor subtype A or one of the sequences recognized specifically by the antibody according to the invention has been immobilized beforehand.
  • This purification may also involve affinity chromatography on protein A.
  • the antibody may be a polyspecific or monospecific polyclonal antibody, or a monoclonal antibody.
  • the antibody of the present invention is monoclonal.
  • a “monoclonal antibody” refers, by definition in immunology, to an antibody obtained from a substantially homogeneous antibody population i.e. a population of identical antibodies, a relatively small amount of which may possibly have a mutation.
  • a monoclonal antibody is obtained from the proliferation of a single cell clone such as a hybridoma.
  • the antibody according to the present invention is the murine monoclonal antibody obtained from the hybridoma deposited at the CNCM (for "National Collection of Cultures of Microorganisms", Institut Pasteur, 25 rue du Dr. Roux, 75724 PARIS Cedex 15) October 18, 2017 under the number CNCM 1-5250 (Rendomab-A63).
  • the present invention also relates to such a hybridoma.
  • the antibody according to the present invention may be a chimeric antibody ie an antibody which contains variable regions or hypervariable regions of heavy and light chain (s) derived from an antibody of a species given in combination with heavy and light chain constant regions derived from an antibody of another species heterologous to the previous one.
  • a chimeric antibody ie an antibody which contains variable regions or hypervariable regions of heavy and light chain (s) derived from an antibody of a species given in combination with heavy and light chain constant regions derived from an antibody of another species heterologous to the previous one.
  • a first variant of the present invention corresponds to a chimericized antibody and in particular a chimeric monoclonal antibody, that is to say an antibody whose variable domains derived from the murine antibody previously described are associated with constant domains of human origin. . It should be recalled that several therapeutic antibodies used in humans are chimerised antibodies.
  • a second particularly advantageous variant may be a humanized antibody and in particular a humanized monoclonal antibody. Indeed, it is preferable to use a humanized antibody, if the latter is to be administered repeatedly to a human subject.
  • a humanized monoclonal antibody in the case of a humanized monoclonal antibody according to the present invention, the latter may be prepared by insertion of the CDRs of a murine antibody and in particular of the murine antibody derived from the hybridoma deposited at the CNCM on October 18, 2017 under the number CNCM 1-5250 in a human antibody, regardless of its isotype (IgG, IgA, IgM).
  • Humanized antibodies can be made using the techniques and approaches described in Verhoeyen et al, 1988 [16] and in US Patent 4,816,567 [17].
  • the antibodies may also be human antibodies in the sense that they have the amino acid sequence of human anti-ETA-R antibodies via methods of preparation known in the art that do not require vaccination of humans.
  • such antibodies can be obtained by gene immunization / transgenic mouse cell immunization boosters that are available and which essentially contain human immunoglobulin genes (see Vaughan et al, 1998 [18]).
  • such antibodies can be obtained by cloning cDNAs encoding human B cells against ETA-R.
  • the present invention also relates to an isolated polynucleotide chosen from the following polynucleotides:
  • polynucleotide in the context of the present invention a nucleic acid, a nucleic sequence, a nucleic acid sequence, an oligonucleotide, a polynucleotide sequence, a nucleotide sequence, a single-stranded DNA, a double DNA -branch or RNA.
  • a polynucleotide according to the present invention may comprise natural nucleotides and unnatural nucleotides.
  • the polynucleotide according to the invention does not correspond to a nucleotide sequence in its natural state i.e. in its natural chromosomal environment. On the contrary, the polynucleotide according to the invention has been isolated and optionally purified, and its environment has consequently been modified.
  • the polynucleotide according to the invention can also be obtained by genetic recombination or by chemical synthesis.
  • the conditions of high stringency correspond to temperature and ionic strength conditions which make it possible to maintain hybridization between two complementary nucleotide sequences.
  • Those skilled in the art will be able to determine the most stringent conditions of high stringency, in particular as a function of the size of the nucleotide sequences, and this, with reference to the teaching of Sambrook et al, 1989
  • the polynucleotide according to the present invention comprises: i ') at least one nucleotide sequence encoding a light chain variable region and comprising: - a sequence encoding the st CDRIL and having at least 60% identity with the nucleotide sequence: CAG AGC AGT ATT TAT AGT GTA AAT GGA AAA ATC TT A T AT (SEQ ID NO: 1);
  • a 2nd sequence coding for CDR2H has at least 60% identity with the following nucleotide sequence: ATA AGA AGT AAA AGT AAT AAT TAT GCA ACA (SEQ ID NO: 7);
  • the polynucleotide according to the present invention has at least one nucleotide sequence encoding a variable region light chain and having a sequence encoding the 2nd CDR2L, said 2 nd sequence having at least 60% identity, less than 65% identity, at least 70% identity, at least 75% identity, at least 80% identity, at least 85% identity, at least 90% identity, at least 95 % identity, at least 98% identity with the following nucleotide sequence: AAA GTT TCC.
  • the polynucleotide according to the present invention has at least one nucleotide sequence encoding a variable region light chain and having a sequence encoding the 3 rd CDR3L, said 3 rd sequence and has at least 60% identity, at least 65% identity , at least 70% identity, at least 75% identity, at least 80% identity, at least 85% identity, at least 90% identity, at least 95% identity, at least at least 98% identity with the following nucleotide sequence: TTT CAA GGT TCA CTC CATT CCG CTC ACG (SEQ ID NO: 3).
  • the identity percentages of the sequences encoding the different CDRs in a variable light chain region are independent of one another.
  • the sequence coding for CDR2L may have at least 65% with the following nucleotide sequence: AAA GTT TCC, while the sequence encoding CDR3L may have at least 70% identity with the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3 ).
  • SEQ ID NO: 3 the nucleotide sequence
  • the polynucleotide according to the present invention comprises at least one nucleotide sequence encoding a light chain variable region and comprising:
  • the polynucleotide according to the present invention comprises at least one nucleotide sequence encoding a light chain variable region whose nucleotide sequence corresponds to the sequence SEQ ID NO: 11.
  • the polynucleotide according to the present invention also has at least one nucleotide sequence encoding a variable heavy chain region and having a sequence encoding the the era CDRIH, the said sequence era having at least 60% identity, at least 65% identity , at least 70% identity, at least 75% identity, at least 80% identity, at least 85% identity, at least 90% identity, at least 95% identity, at least at least 98% identity with the following nucleotide sequence: GGA TTC ACC TTC ATC ATC TAC GCC (SEQ ID NO: 5).
  • the polynucleotide according to the present invention has at least one nucleotide sequence encoding a variable heavy chain region and having a sequence encoding the 3 rd CDR3H, said 3 rd sequence and has at least 60% identity, at least 65% identity , at least 70% identity, at least 75% identity, at least 80% identity, at least 85% identity, at least 90% identity, at least 95% identity, at least at least 98% identity with the following nucleotide sequence: GTG AGT TCC TAT TAC TCC GGT AGT TTT TTC CT TAC (SEQ ID NO: 9).
  • the identity percentages of the sequences encoding the different CDRs in a heavy chain variable region are independent of one another.
  • the sequence coding for CDR2H may have at least 75% with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 7, while the sequence coding for CDR3H may have at least 65% identity with the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 9 ).
  • SEQ ID NO: 9 the sequence coding for CDR3H may have at least 65% identity with the nucleotide sequence.
  • the polynucleotide according to the present invention comprises at least one nucleotide sequence encoding a heavy chain variable region and comprising:
  • the polynucleotide according to the present invention comprises at least one nucleotide sequence encoding a heavy chain variable region whose nucleotide sequence has at least 65% identity, at least 70% identity, at least 75% identity. , at least 80% identity, at least 85% identity, at least 90% identity, at least 95% identity, at least 98% identity with the sequence SEQ ID NO: 13.
  • the polynucleotide according to the present invention comprises at least one nucleotide sequence encoding a heavy chain variable region whose nucleotide sequence corresponds to the sequence SEQ ID NO: 13.
  • percentage identity between two amino acid sequences (or between two nucleotide sequences) is meant, in the context of the present invention, a percentage of identical amino acid residues (or nucleotides) between the two compared sequences, this percentage being obtained after implementation of the best alignment (optimum alignment) between the two sequences.
  • Those skilled in the art know different techniques for obtaining such a percentage of identity and involving homology algorithms or computer programs such as the BLAST program.
  • the percent identity is statistical and the differences between the two sequences are randomly distributed along these sequences.
  • the differences between the two sequences may consist of different types of sequence modifications: deletions, substitutions or additions of amino acid residues (or nucleotides).
  • the modifications implemented in the sequences result in substitutions with non-equivalent amino acids, ie amino acids having no structural homology. These modifications are likely to improve the biological properties of the antibody ie improved affinity and / or specificity, expanded recognition spectrum, increased stability, reduced immunogenicity etc.
  • these modifications, insertions or deletions may target a CDR essential or not to the properties of the antibody according to the invention.
  • these modifications, insertions or deletions may also target an RF region, knowing that such regions, within the variable domains of the antibodies, may, depending on the antibodies, also play a role in the expression of the properties. of the antibody according to the invention.
  • the present invention also relates to a cloning and / or expression vector containing at least one polynucleotide according to the present invention.
  • a cloning and / or expression vector containing at least one polynucleotide according to the present invention.
  • Such vector is especially useful for transforming a host organism and expressing in the latter an antibody according to the present invention.
  • the vector according to the present invention further comprises one (or more) element (s) which allows (s) the expression of the polynucleotide according to the present invention and / or the secretion of the product resulting from the translation of the polynucleotide according to the present invention.
  • element (s) which allows (s) the expression of the polynucleotide according to the present invention and / or the secretion of the product resulting from the translation of the polynucleotide according to the present invention.
  • elements mention may be made of a constitutive or inducible promoter, a transcription initiation signal or a transcription termination signal, a translation initiation sequence or an end of translation signal.
  • the vector according to the present invention comprises, operably linked, a promoter, a polynucleotide of the invention and a terminator element.
  • operably linked together according to the invention, elements linked together so that the operation of one of the elements is affected by that of another.
  • a promoter is operably linked to a coding sequence when it is able to affect the expression of the latter.
  • the regulatory elements for the transcription, translation and maturation of the peptides that the vector can comprise are known to those skilled in the art and the latter is capable of selecting them according to the host organism in which the expression or cloning must be done.
  • this method can be electroporation, lipofection, a biological transformation of a plant using Agrobacterium tumefasciens, a thermal shock or a chemical process.
  • the host organism is a microorganism such as a yeast, a bacterium or a fungus.
  • a microorganism such as a yeast, a bacterium or a fungus.
  • the transformation of such microorganisms makes it possible to produce the antibody of the invention on a semi-industrial or industrial scale.
  • the host organism is an animal cell such as a mammalian cell, a plant cell, an insect cell, an animal with the exception of a human, or a plant.
  • a method for producing an antibody according to the present invention comprises the steps of:
  • the antibody according to the present invention is also modifiable in order to a) generate an antibody labeled with a radioactive isotope, a pro-drug, an enzyme or a toxin, and b) modify the binding specificity and / or affinity, and / or the stability, and / or immunogenicity of said antibody targeting cells that overexpress ETA-R, including cancer cells such as glioblastoma etc.
  • the antibody according to the present invention is also modifiable in order to couple it chemically or genetically to a peptide molecule; a protein molecule; a nucleic molecule such as DNA, RNA, RNAi, aptamer, PNA or LNA; a lipid molecule; a carbohydrate molecule or a chemical molecule.
  • the present invention therefore relates to a compound comprising an antibody according to the present invention conjugated to an element selected from the group consisting of a cytotoxic group, an easily detectable group or an effector group.
  • cytotoxic group is meant a directly or indirectly toxic group for the cells targeted by the antibody according to the present invention.
  • directly cytotoxic is meant a group which is in itself cytotoxic.
  • indirectly cytotoxic is meant a group which, although not cytotoxic in itself, can induce cytotoxicity, for example by its action on another molecule or by an additional action on it.
  • the cytotoxic moiety is a cytotoxic chemotherapeutic agent.
  • cytotoxic chemotherapeutic agents that can be used in the context of the present invention.
  • the activity of these agents can be increased under irradiation.
  • alkylating agents such as mechlorethamine or chlorambucil; methotrexate; 5-fluorouracil; Vinblastine; gemcitabine; fludarabine; nicotinamide; doxorubicin; mitomycin; L-asparaginase; cisplatin; taxol and its analogues / derivatives.
  • the cytotoxic moiety is a (poly) peptide indirectly cytotoxic.
  • the term "indirectly cytotoxic poly (peptide) group” is intended to mean a polypeptide which has an enzymatic activity and can convert a relatively non-toxic pro-drug, especially as defined in the third embodiment, into a cytotoxic substance, in particular as defined in US Pat. the era of the form of implementation.
  • the cytotoxic moiety is a nucleic acid molecule which is directly or indirectly cytotoxic such as an antisense oligonucleotide or an aptamer.
  • the only constraint to be respected in the context of this conjugation is that the conjugated antibody retains its binding specificity for ETA-R, a property associated with those cytotoxic group.
  • asily detectable group is meant, in the context of the present invention, a group that can be detected by implementing a suitable noninvasive appropriate detection technique such as microscopy, scintigraphy and imaging. magnetic resonance (MRI).
  • MRI magnetic resonance
  • a compound according to the invention comprising such an easily detectable group is particularly suited to the field of imaging and diagnosis. In particular, it makes it possible to identify and locate sites where ETA-R is overexpressed because of the ETA-R binding specificity of the antibody present in this compound.
  • the easily detectable group may be an enzyme or a molecule capable of generating a detectable and possibly quantifiable signal under particular conditions, such as when placing a suitable substrate.
  • an enzyme or a molecule capable of generating a detectable and possibly quantifiable signal under particular conditions, such as when placing a suitable substrate.
  • biotin digoxygenine, 5-bromodeoxyuridine, alkaline phosphatase, peroxidase, acetylcholine esterase (AChE), glucose amylase and lysozyme.
  • the readily detectable moiety may be a fluorescent, bioluminescent or chimiofluorescent such as fluorescein and its derivatives; rhodamine and its derivatives; GFP (for "Green Fluorescent Protein") and its derivatives; umbelliferone and its derivatives; luminol; luciferase and luciferin.
  • fluorescent, bioluminescent or chimiofluorescent such as fluorescein and its derivatives; rhodamine and its derivatives; GFP (for "Green Fluorescent Protein") and its derivatives; umbelliferone and its derivatives; luminol; luciferase and luciferin.
  • the easily detectable moiety may be a radioactive label or isotope such as iodine-123, iodine-125, iodine-126, iodine-133, indium-111, indium-113m, bromine-77, gallium-67, gallium-68, ruthenium-95, ruthenium-97, technetium-99m, fluorine-18, carbon-13, nitrogen-15, oxygen-17, scandium-47, tellurium-122m, thulium-165 and yttrium-199.
  • some radioactive atoms used as easily detectable groups can also constitute cytotoxic groups due to the amount of radioactivity they can deliver.
  • conjugation of the antibody according to the invention with the cytotoxic groups applies mutatis mutandis to the conjugation of the antibody according to the invention with the easily detectable groups.
  • the conjugation of the antibody according to the invention with the easily detectable groups can also be carried out in relation to nano-objects, in order to densify their concentration, and thus to improve the emitted signal, the contrast or the toxicity. .
  • this easily detectable group is a radioactive marker
  • the latter can be introduced into the peptide sequence of the antibody according to the invention. This introduction can take place during the synthesis of the antibody using one or more labeled amino acids. Alternatively, this introduction can take place following this synthesis by fixing the radioactive label on residues of the peptide sequence of the synthesized antibody. For example, yttrium-90 can be attached via a lysine residue.
  • the radioactive marker may be indirectly attached to the antibody by known means. For example, EDTA or another chelating agent may be attached to the antibody of the invention and used to bind indium-111.
  • the present invention relates to the use of a compound comprising an antibody and an easily detectable moiety as a highly effective diagnostic, prognostic and in vivo monitoring tool in medical imaging.
  • the antibody format is chosen to generate the best signal-to-noise ratio and the best pharmacokinetics.
  • Such a method can be implemented to detect, diagnose, predict or follow a state in which the subtype A endothelin receptors is overexpressed and in particular to detect, diagnose, prognostic or follow a cancerous state (presence, size and evolution cancerous tumors).
  • a method for diagnosing a cancer such as glioblastoma, the latter comprises the steps of:
  • step (bi ') detecting the signal emitted by the easily detectable group and ci') determining the presence or absence of a cancer in said subject on the basis of the signal detected in step (bi ') possibly compared to a control signal .
  • control signal is meant, in the context of the present invention, a signal or an average value of signals obtained for a healthy subject or, conversely, a signal or a mean value of signals obtained (e) for a cancerous subject.
  • the diagnostic method according to the invention is a process carried out in vitro for which the biological sample such as a biopsy has been taken from the subject before the implementation of step (a). ).
  • this method may correspond to an in vivo imaging method in which an effective amount of the compound according to the invention has been previously administered to the subject.
  • effective amount is meant a quantity of compound sufficient for the imaging of cancers. This amount varies depending on the mode of administration, the formulation administered, the excipient and the cancer to be diagnosed. However, determining this effective amount is routine work for those skilled in the art.
  • effector group is meant, in the context of the present invention, a group capable of specifically recognizing a cancer marker, or which allows the recruitment of (i) an effector cell of the immune system, ie NK cells, cytotoxic T cells, macrophages or (ii) the complement system.
  • group capable of specifically recognizing a cancer marker is meant, in the context of the present invention, a ligand of a cancer marker; an antibody identical to or different from an antibody according to the present invention; a protein; a peptide; or a nucleic molecule such as DNA, RNA, RNAi, aptamer, PNA or LNA.
  • cancer marker both an ETA-R and another membrane marker are contemplated.
  • the effector group recognizes a cancer marker, identical to or different from ETA-R, expressed on the surface of the cancer cells, thus ensuring a better specificity of recognition and therefore an increased targeting of the cancer cells.
  • the effector moiety has recognition specificity for a marker specifically present on the surface of effector cells of the immune system, ie, NK cells, macrophages, or cytotoxic T cells.
  • a marker specifically present on the surface of effector cells of the immune system ie, NK cells, macrophages, or cytotoxic T cells.
  • Such recruitment provides targeted lysis of the cancer cells recognized by the antibody of the present invention.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as active ingredient, an antibody according to the present invention, or a polynucleotide according to the present invention or a compound according to the present invention and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • pharmaceutically acceptable carrier any substance that is added to an antibody, a polynucleotide or a compound according to the present invention to promote its transport, avoid its substantial degradation in said composition and / or increase its half -life.
  • a pharmaceutically acceptable vehicle is sterile and pyrogen-free. It is chosen according to the type of application of the pharmaceutical composition of the invention and in particular according to its mode of administration.
  • the pharmaceutical composition according to the invention consists of at least one antibody, or a polynucleotide or a compound according to the present invention in free form or in the form of an addition salt with a pharmaceutically acceptable acid, in the state pure or in the form of a composition in which it is associated with any other pharmaceutically compatible product.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention can be used systemically; parenterally, for example intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intrathecal, intraventricular, intrasternal, intracranial, intramuscular or subcutaneous; topically; oral; rectally; intranasally or by inhalation.
  • compositions for oral administration it is possible to use tablets, pills, powders, etc., in which the antibody, the polynucleotide or the compound according to the invention are mixed with one or more inert diluents conventionally used. and possibly other substances such as, for example, a lubricant, a colorant, a coating, etc.
  • compositions for oral or ocular administration suspensions, solutions, emulsions, syrups can be used.
  • the sterile compositions for parenteral administration may be aqueous solutions or not, suspensions or emulsions.
  • a solvent or vehicle water, propylene glycol, vegetable oils or other suitable organic solvents may be employed.
  • These compositions may also contain adjuvants, such as wetting agents, isotonic agents, emulsifiers, etc.
  • compositions for topical administration may be, for example, creams, lotions, mouthwashes, nasal or eye drops or aerosol.
  • the daily dose level of the antibody, polynucleotide or compound according to the present invention is usually 1 to 1000 mg per adult (i.e., about 0.015 to 15 mg / kg), administered in single or split doses. These doses are given for illustrative purposes only. In any case, the doctor will be able to determine the actual dose that is best for a given individual patient, and this varies according to the patient's age, weight and response.
  • the present invention relates to an antibody according to the present invention, a polynucleotide according to the present invention, a compound according to the present invention or a pharmaceutical composition according to the present invention for use in the treatment and / or prevention of a disorder or disorder.
  • pathology involving a dysfunction, directly or in combination with another physiological pathway, of the axis comprising an endothelin and at least one of its receptors such as, in particular, the subtype A endothelin receptors.
  • such a disorder or such a pathology is a cancer.
  • cancers there may be mentioned melanoma, colorectal cancer, colon cancer, Kaposi's sarcoma, glioblastoma, ovarian cancer and bladder cancer.
  • this disorder is a glioblastoma.
  • the present invention relates to a method for treating and / or preventing a disorder or pathology involving a dysfunction, direct or in combination with another physiological pathway, of the axis comprising an endothelin and at least one of its receptors such as, in particular, endothelin receptor subtype A in a patient suffering or likely to suffer from such a disorder or pathology.
  • This method comprises administering to said patient an effective amount of an antibody according to the present invention, a polynucleotide according to the present invention, a compound according to the present invention or a pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the present invention relates to the use of an antibody according to the present invention or a compound according to the present invention as a research tool particularly suitable for the study of signaling pathways associated with the endothelin axis / receptors. endothelin, as well as to progress in understanding the structural and functional characteristics of this family of receptors.
  • Figure 1 shows the binding curves of Rendomab-A63 on CHO cells overexpressing ETA-R (CHO-ETAR) or CHO not expressing ETA-R (CHO-WT) in the presence or absence of endothelin 1 (ET1) .
  • Figure 2 shows the binding curves of Rendomab-A63 on glioblastoma stem cells, GLI-7, overexpressing ETA-R.
  • Figure 3 shows the difference in level of expression of the EDNRA transcript encoding the endothelin A receptor in patients' glioblastoma cells (denoted GBM) compared to non-tumor neuronal cells (noted Non-tumor).
  • FIG. 4 shows immunofluorescence results on glioblastoma GLI-7 stem cells, in the presence of 1 mM of ET1-FAM (FIG. 4A), in the presence 30 nM of Rendomab-A63 (RA63) ( Figure 4B) or in the presence of 30 nM of a control antibody (NC) ( Figure 4C).
  • the nuclei are stained with DRAQ 5.
  • FIG. 5 shows the binding curve of the Rendomab Axx antibody which does not form part of the invention, on the CHO cells transfected with the endothelin type A receptor (CHO ETAR) (continuous black line) and in the presence of 100 nM endothelin 1 (ET1) (discontinuous gray line).
  • CHO ETAR endothelin type A receptor
  • ET1 endothelin 1
  • Figure 6 shows the immunofluorescence staining on glioblastoma GLI-7 stem cells in the presence of 30 nM Rendomab-Axx (RAxx) revealed by a secondary antibody labeled with Alexa fluor 488 (Raxx-AF488). The nuclei are stained with DRAQ.5. Both images are merged (Fusion).
  • Figure 7 shows the fluorescence in vivo imaging results on a preclinical model of xenografted nude mice in orthotopic position with GLI-7 cells.
  • Figure 7A shows the positive detection control of Rendomab A63- AF680 and AF750 Control.
  • Figure 7B shows the detection of fluorescence in vivo in the grafted mouse and the control mouse.
  • Figure 7C shows the detection of ex vivo fluorescence in the graft brain and the brain control.
  • Figure 8 shows the nucleotide sequences and amino acid sequences deduced from the variable domains of the Rendomab-A63 light chain and heavy chain.
  • the immunization and hybridoma screening strategy implemented in the present invention is identical to that implemented in international applications WO 2012/045776 [14] and WO 2017/220739 [15].
  • Rendomab-A63 After purification of Rendomab-A63 on Protein A - PropSep high capacity (Millipore), a characterization of its biochemical properties was carried out. Heavy and light chain isotyping of Rendomab-A63 was performed using Piercell's Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping kit. It is an immunoglobulin type G, isotype 2b for the heavy chain and kappa for the light chain. Rendomab-A63 is therefore a lgG2b / kappa type immunoglobulin.
  • ETA-R in its cellular context (CHO-ETAR and Gli-7 cells) by Rendomab-A63 was established by flow cytometry and immunofluorescent cell staining.
  • CHO-ETAR line CHO cells transfected stably, to allow strong expression of ETA-R and
  • glioblastoma stem cell line, Gli-7 established by Dr. Jean-Philippe Hugnot from a biopsy following the exeresis of a glioblastoma in a patient.
  • the affinity of RA63 for ETA-R expressed at the surface of Gli 7 cells is of the order of nanomolar (15 nM).
  • Glioblastoma tumor cells are known to overexpress GET-1 [20] and endothelin type A receptor (ETAR) as shown in the transcriptomic data of the public database Gliovis (http://gliovis.bioinfo.cnio.es /) shown in Figure 3. These data clearly indicate overexpression of the EDNRA transcript in patients' glioblastoma cells.
  • Figure 4 shows immunofluorescence results on Gli-7 glioblastoma stem cells under the following operating conditions:
  • the cores are stained with DRAQ.5 (Abcam abl08410) following the provider's protocol.
  • the Gli-7 cells were incubated for 12 h at 4 ° C. with either 1 ⁇ M of ETIFAM or 30 nM final of the RA63, ie 30 nM final of the NC.
  • the secondary antibody diluted 1/400, coupled to AF488 (Invitrogen-ref A10684) is added to the cells for 2 h at 4 ° C.
  • AF488 Invitrogen-ref A10684
  • FIG. 4A makes it possible to ascertain the presence of endothelin receptors capable of binding endothelin 1 on Gli-7 cells.
  • Figure 4B shows a very strong immunolabeling of Gli-7 cells with RA63 antibody recognizing endothelin A receptor, whereas a control negative (NC) antibody, of the same isotype as RA63 (IgG2b Kappa), does not generates no signal on Gli-7 cells ( Figure 4C). All of these results make it possible to conclude that there is a strong expression of ETA-R on the surface of Gli-7 cells demonstrated by the binding of the specific RA63 antibody of ETA-R. This binding is well mediated by the variable region of the RA63 antibody as shown by the absence of signal when using the control antibody.
  • Rendomab-Axx antibody directed against ETAR having an affinity nM but whose binding on the endothelin A receptor is displaced by a concentration of 100 nM ETl (FIG. 5).
  • This antibody therefore has properties comparable to those of the antibodies described in patent application CA 2 971 491 [13].
  • Figure 7 shows the fluorescence in vivo imaging results on a preclinical model of xenografted nude mouse in orthotopic position with Gli-7 cells.
  • a quantity range of the RA-AF680 and NC-AF750 tracers were imaged on a solid support to the FMT 1500 (Perking Elmer) to demonstrate the specificity of the filters used for the fluorescence detection is i) at 680 nm where only the RA63-AF680 emits a detectable fluorescence signal or either ii) at 750 nm where only the NC-AF750 emits a detectable fluorescence signal.
  • mice are imaged at 3 months post-xenograft.
  • Co-injection of the tracers RA63-AF680 (14 nmol of RA63 coupled with 8 nmol of AF680) and NC-AF750 (17 nmol of control antibody coupled to 7 nmol of AF750) were injected intraperitoneally (IP). to the nude xenograft mouse and the normal nude mouse (control mouse).
  • mice were imaged at FMT 1500 (Perkin Elmer). For each mouse, simultaneous acquisition at 680 nm and 750 nm was performed. A strong fluorescence at 680 nm is observed at the head of the xenografted mouse whereas on this same mouse, the tracer NC-AF750 generates no fluorescence at 750 nm. Thus, only the tracer RA63-AF680 was detected on the live xenografted mouse with the GLI-7 line. There is also no detection of tracers RA63-AF680 and NC-AF750 injected into the normal mouse.
  • mice were sacrificed, their brain removed and fixed with 4% paraformaldehyde solution (4% PFA) for 1h at 4 ° C.
  • the brains were imaged as before.
  • strong fluorescence is observed with the tracer RA63-AF680 in the brain invaded by the tumor cells, whereas no signal is detected with the tracer NC-AF750.
  • the absence of fluorescence is also seen with both tracers, RA63-AF680 and NC-AF750 in the control mouse brain.
  • the RA63 antibody can be used as a tracer (RA63-AF680) to diagnose the presence of glioblastoma (Gli-7) tumor cells for imaging applications.

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Abstract

La présente invention concerne des anticorps dirigés contre le sous-type A des récepteurs aux endothélines notamment monoclonaux, un fragment ou un dérivé de ceux-ci. La présente invention concerne également l'utilisation thérapeutique, diagnostique ou comme outil de recherche d'un tel anticorps dans le domaine des cancers et notamment du glioblastome.

Description

ANTICORPS DIRIGÉ CONTRE LE SOUS-TYPE A DES RÉCEPTEURS AUX ENDOTHÉLINES
ET SES UTILISATIONS
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention appartient au domaine technique des anticorps, de leur utilisation thérapeutique et diagnostique ainsi que de leur utilisation comme outil de recherche.
Plus particulièrement, la présente invention propose un anticorps, avantageusement monoclonal, spécifiques de la conformation native et fonctionnelle du sous-type A des récepteurs aux endothélines (ETA-R) et notamment des récepteurs humains aux endothélines exprimés à la surface des cellules gliales telles que des cellules de gliomes ou de glioblastomes.
La présente invention concerne également l'utilisation de ces anticorps à des fins thérapeutiques et diagnostiques ainsi qu'à des fins de recherche.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE
Les récepteurs des différentes endothélines (désignées ET1, ET2 et ET3 chez l'homme) appartiennent à la famille des récepteurs à 7 domaines transmembranaires également désignés RCPG pour « Récepteurs Couplés aux Protéines G ». Les récepteurs aux endothélines présentent, chez l'homme, deux principaux sous-types que sont le sous-type A (ETA-R) et le sous-type B (ETB-R). Le fait que ces récepteurs soient classés dans la famille des RCPG leur confère une structure tridimensionnelle complexe, intimement liée au contexte membranaire dans lequel ils se trouvent.
Par ailleurs, la modification conformationnelle des RCPG après fixation de leur ligand est largement décrite dans la littérature. La description de ces modifications conformationnelles associées à la liaison de différentes protéines intracellulaires induisant de nouvelles cascades de signalisation a valu le prix Nobel en 2012 aux Dr. Lefkowitz et Kobilka [1-3]. Plus récemment, les travaux des Pr. Doi et Nureki ont montré les changements conformationnels du récepteur B aux endothélines après fixation de son ligand l'endothéline 1 [4].
Ces derniers travaux sont à mettre en relation avec les publications de l'équipe du Pr. Bagnato qui a montré l'existence d'un « axe endothéline » constitué du récepteur de type A, du récepteur de type B et de leurs ligands dont le principal est l'endothéline 1 (ET-1) [5,6]. Ces travaux montrent que plusieurs types tumoraux (mélanomes pour le récepteur B, glioblastomes pour le récepteur A) surexpriment les récepteurs A ou/et B aux endothélines et que ces mêmes cellules tumorales sont capables de sécréter de l'ET-1 ou de capter GET-1 sécrétée dans le microenvironnement tumoral par les cellules endothéliales qui constituent les parois des vaisseaux tumoraux alimentant les tumeurs.
En d'autres termes, les cellules tumorales surexprimant les récepteurs aux endothélines se trouvent dans un microenvironnement riche en ET-1 qui va alors se fixer sur le récepteur A ou B des endothélines entraînant un changement de conformation de ces derniers dans une configuration « activée », sur-représentée à la surface de ces mêmes cellules tumorales.
Il convient de noter que les inventeurs ont déjà produit des anticorps permettant de distinguer les différentes conformations de ces récepteurs. Les travaux de cristallographie sur le récepteur de type B aux endothélines décrits par Shihoya et al, 2016
[4] confirment les observations réalisées sur les cellules de mélanome avec des anticorps produits par les inventeurs [7,8].
Concernant le sous-type A des récepteurs aux endothélines, ce dernier présente également une modification de son niveau d'expression en particulier dans le cancer colorectal, dans le cancer du sein, le cancer de l'ovaire, dans les glioblastomes (tumeurs du cerveau) et dans des cas de cancers de la vessie [9].
De plus, l'axe endothéline et ses récepteurs sont également impliqués dans plusieurs fonctions et dysfonctionnements physiopathologiques. A titre d'exemples non limitatifs, on peut citer l'hypertension artérielle, l'athérosclérose, les maladies coronariennes, les dysfonctionnements rénaux, les maladies cérébrovasculaires, la maladie de Crohn, la fibrose pulmonaire, l'asthme, etc. (voir la revue de Shah, 2007 [10]).
Ainsi, cibler les récepteurs aux endothélines et, plus particulièrement, du sous-type A des récepteurs aux endothélines apparaît donc particulièrement pertinent en biologie clinique humaine [6,11].
Différentes stratégies existent pour bloquer des récepteurs notamment à des fins thérapeutiques telles que l'utilisation d'antagonistes, peptidiques ou non, et l'utilisation d'anticorps monoclonaux ciblant ces récepteurs.
Toutefois, dans l'arsenal d'immunothérapie passive des cancers utilisant des anticorps monoclonaux (plus d'une soixantaine d'anticorps ont été approuvés à ce jour), aucun ne cible les RCPG. En effet, la difficulté pour obtenir des anticorps monoclonaux spécifiques des RCPG est une conséquence des problèmes liés à l'obtention de ces mêmes récepteurs, sous une forme native et fonctionnelle, en dehors de leur contexte membranaire.
Kondoh et al, 1990 [12] décrit les propriétés de liaison de 4 anticorps monoclonaux (A2, G9, E7 et G10) vis-à-vis de complexes solubilisés de récepteurs aux endothélines présents à la surface de membranes pulmonaires de rats. Les anticorps G9 et G10 sont des immunoglobulines de type G et d'isotype 2a (lgG2a), alors que les anticorps A2 et E7 sont des immunoglobulines IgGl. Si ces quatre anticorps sont bien spécifiques de récepteurs solubilisés aux endothélines, Kondoh et al, 1990 [12] ne fournit aucune information quant à la spécificité fine de ces anticorps (ETA-R et/ou ETB-R), quant à la reconnaissance des récepteurs d'origine humaine, ni quant à leurs propriétés.
La demande de brevet CA 2 971 491 [13] décrit douze anticorps spécifiques du sous-type A humain des récepteurs aux endothélines, désignés A-l à A-12. Ces anticorps présentent des propriétés antagonistes et sont aptes à inhiber la voie de signalisation impliquant ET1. Pour cette raison, la demande de brevet CA 2 971 491 envisage d'utiliser ces anticorps dans le traitement de l'hypertension artérielle pulmonaire.
Les inventeurs se sont donc fixé pour but l'obtention d'un anticorps apte à cibler des conformères particuliers du sous-type A du récepteur aux endothélines exprimés à la surface de cellules cancéreuses et, en particulier, à la surface de cellules cancéreuses humaines.
EXPOSÉ DE L'INVENTION
La présente invention permet de résoudre les problèmes techniques tels que précédemment définis et d'atteindre le but que se sont fixés les inventeurs.
En effet, les inventeurs ont développé et utilisé une stratégie d'immunisation et de sélection particulière déjà publiée pour préparer des anticorps spécifiques du sous-type B des récepteurs aux endothélines (Demandes internationales WO 2012/045776 [14] et WO 2017/220739 [15]). Cette stratégie couplée à une procédure de criblage des hybridomes en ELISA-cell puis par cytométrie de flux privilégie l'obtention d'anticorps monoclonaux spécifiques des récepteurs aux endothélines dans leur conformation native. Cette approche présente, en outre, l'avantage de ne pas avoir besoin du récepteur d'intérêt extrait et purifié, ce qui constitue toujours aujourd'hui un défi difficile à relever.
Par cette stratégie, les inventeurs ont pu sélectionner un anticorps monoclonal dirigé contre le sous-type A des récepteurs aux endothélines et notamment du sous-type A humain, nommé ci-après Rendomab-A63 ou encore RA63. Cet anticorps ne présente pas de caractère antagoniste des propriétés pharmacologiques du sous-type A des récepteurs aux endothélines (ETA-R). En d'autres termes, l'anticorps selon la présente invention n'est pas capable de diminuer, d'inhiber ou de bloquer une (ou plusieurs) activité(s) biologique(s) du ETA-R. Par contre, l'anticorps selon la présente invention est capable de reconnaître les conformères particuliers du sous-type A du récepteur aux endothélines exprimés à la surface de cellules cancéreuses et notamment des cellules de glioblastomes.
La présente invention concerne un anticorps dirigé contre le sous-type A des récepteurs aux endothélines, un fragment ou dérivé de celui. ci.
Avant d'entrer plus en détail dans la description de l'invention, nous rappelons ou proposons les définitions suivantes. Les termes « anticorps » et « immunoglobuline » sont équivalents et peuvent être utilisés de façon interchangeable dans la présente invention.
Un anticorps est une glycoprotéine comprenant au moins deux chaînes lourdes (H) et au moins deux chaînes légères (L) reliées entre elles par un ou plusieurs ponts disulfure. Chaque chaîne lourde comprend une région (ou domaine) variable (VH) et une région constante comprenant 3 domaines, habituellement désignés CH1, CH2 et CH3. Chaque chaîne légère comprend une région (ou domaine) variable (VL) et une région constante comprenant un seul domaine, habituellement désigné CL. Les régions variables des chaînes lourdes et des chaînes légères impliquées dans la reconnaissance de l'antigène peuvent encore être subdivisées en 3 régions hypervariables, également appelées « régions déterminant la complémentarité » (CDR), encadrées par 4 régions plus conservées, également appelées régions charpentes (FR). L'organisation de chaque région variable de chaîne lourde (ou de chaîne légère) est, de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C -terminale, comme suit : FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 et FR4. Dans le cadre de la présente invention, la définition des CDR et FR qui a été utilisée est celle de l'IMGT (the international ImMunoGeneTics database http://imgt.cines.fr:8104). Les calculs des pourcentages d'identité des séquences CDR mentionnés et revendiqués ci-après sont donc à prendre en compte sur la base de cette annotation.
De plus, le terme « anticorps » inclut, dans le cadre de la présente invention, non seulement des molécules d'anticorps complètes mais aussi des fragments et des dérivés de celui-ci.
Par « fragment d'anticorps », on entend, dans le cadre de la présente invention, aussi bien un fragment monovalent qui présente un seul site de liaison à l'antigène qu'un fragment divalent qui présente deux sites de combinaison à l'antigène. Ainsi, un fragment selon l'invention présente au moins un site de liaison à l'antigène. Parmi ces fragments, on peut citer les fragments Fab, F(ab')2, Fv, et d'autres fragments qui conservent le site de liaison à l'antigène (scFv et diabody). Un fragment Fab est un fragment monovalent constitué de la chaîne légère en entier et d'une partie de la chaîne lourde (Fd) comprenant les domaines VH et CH1 tels que précédemment définis. Un fragment F(ab')2 est un fragment divalent correspondant à l'association de deux fragments Fab reliés par les ponts disulfure présents au niveau de la région charnière des immunoglobulines (« Hinge ») située entre les domaines constants CH1 et CH2. Un fragment Fv est un fragment monovalent uniquement constitué des régions variables VL et VH des chaînes légère et lourde d'un anticorps. Un fragment scFv est un fragment polypeptidique monovalent, uniquement obtenu par génie génétique, correspondant aux domaines variables reliés par un lien peptidique. Un diabody est une molécule d'anticorps recombinante et divalente constituée de deux molécules de scFv tête-bêche en raison d'un lien peptidique trop court pour permettre la formation d'un scFv. Les fragments selon l'invention couvrent également les fragments tels que précédemment cités dont la demi-vie a été augmentée par modification chimique notamment par incorporation dans un liposome ou par introduction d'un poly(alkylene) glycol tel qu'un poly(ethylène) glycol (PEG), cette technique étant appelée « PEGylation » et donnant des fragments tels que Fab-PEG, F(ab')2-PEG ou Fv-PEG. Par voie recombinante, il est également possible de générer des fragments seuls ou fusionnés de l'anticorps selon la présente invention, présentant des propriétés de pénétrabilité des tumeurs solides et de pharmacocinétique plus efficaces et mieux contrôlées. Les fragments d'anticorps utiles dans le cadre de la présente invention peuvent être naturels ou recombinants.
Par « dérivé d'anticorps », on entend, dans le cadre de la présente invention, des fragments d'anticorps obtenus par génie génétique comme des molécules Fv à chaîne unique (scFv) et des anticorps simple domaine (dAb). Le terme inclut aussi des molécules du type anticorps qui peuvent être produites en utilisant des techniques d'exposition sur phage (pour « phage display ») ou d'autres techniques de sélection aléatoires pour des molécules qui se lient au sous-type A des récepteurs aux endothélines ou à des régions spécifiques de ce sous-type.
Ainsi, les « fragments d'anticorps » et « dérivés d'anticorps » couvrent toutes les molécules qui contiennent une structure, avantageusement peptidique, qui fait partie du site de reconnaissance (c'est-à-dire la partie de l'anticorps qui se lie à ou se combine à l'épitope ou à l'antigène) d'un anticorps selon la présente invention. De plus, les fragments et dérivés d'anticorps selon la présente invention sont capables de reconnaître les conformères particuliers du sous-type A du récepteur aux endothélines exprimés à la surface de cellules cancéreuses et notamment des cellules de glioblastomes.
La présente invention concerne un anticorps dirigé contre le sous-type A des récepteurs aux endothélines présentant :
i) au moins une région variable de chaîne légère dont la séquence en acides aminés :
- du CDRIL présente au moins 60% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : SQSIVYSNGKIYL (SEQ ID NO: 2) ;
- du CDR2L présente au moins 60% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : KVS ;
- du CDR3L présente au moins 60% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : FQGSHLPLT (SEQ. ID NO: 4) ; et
ii) au moins une région variable de chaîne lourde dont la séquence en acides aminés :
- du CDRIH présente au moins 60% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : GFTFNIYA (SEQ ID NO: 6) ;
- du CDR2H présente au moins 60% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : IRSKSNNYAT (SEQ ID NO: 8) ;
- du CDR3H présente au moins 60% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : VSSYYSGSFFAY (SEQ ID NO: 10),
un fragment de cet anticorps ou un dérivé de cet anticorps.
Dans le cadre de la présente invention, les séquences en acides aminés sont données conformément au code international à 1 lettre.
Parmi les anticorps décrits dans la demande de brevet CA 2 971 491 [13], les anticorps désignés A-7, A-8 et A-9 présentent au moins une région variable de chaîne légère proche en terme de séquence en acides aminés de la région variable de chaîne légère de l'anticorps selon l'invention mais les séquences en acides aminés de la région variable de chaîne lourde et notamment les séquences en acides aminés des CDR2H et CDR3H des anticorps A-7, A-8 et A-9 sont très éloignées de la séquence en acides aminés de la région variable de chaîne lourde de l'anticorps selon l'invention.
L'anticorps selon la présente invention présente au moins une région variable de chaîne légère dont le CDR1 (i.e. CDRIL) présente au moins 60% d'identité, au moins 65% d'identité, au moins 70% d'identité, au moins 75% d'identité, au moins 80% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 90% d'identité, au moins 95% d'identité, au moins 98% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : SQ.SIVYSNGKIYL (SEQ ID NO: 2).
L'anticorps selon la présente invention présente au moins une région variable de chaîne légère dont le CDR2 (i.e. CDR2L) présente au moins 60% d'identité, au moins 65% d'identité, au moins 70% d'identité, au moins 75% d'identité, au moins 80% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 90% d'identité, au moins 95% d'identité, au moins 98% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : KVS.
L'anticorps selon la présente invention présente au moins une région variable de chaîne légère dont le CDR3 (i.e. CDR3L) présente au moins 60% d'identité, au moins 65% d'identité, au moins 70% d'identité, au moins 75% d'identité, au moins 80% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 90% d'identité, au moins 95% d'identité, au moins 98% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : FQGSHLPLT (SEQ. ID NO: 4).
A noter que, dans l'anticorps selon la présente invention, les pourcentages d'identité des différents CDR dans la région variable de chaîne légère sont indépendants les uns des autres. Par exemple, le CDR2L peut présenter au moins 65% avec la séquence en acides aminés suivante : KVS, alors que le CDR3L peut présenter au moins 70% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : FQGSHLPLT (SEQ ID NO: 4). Ainsi, l'ensemble des combinaisons en termes de pourcentage d'identité pour les trois CDR de la région variable de chaîne légère sont envisagées dans la présente invention.
A titre d'exemple particulier, l'anticorps selon la présente invention comprend au moins une région variable de chaîne légère dont la séquence en acides aminés :
- du CDRIL est SQSIVYSNGKIYL (SEQ ID NO: 2) ; - du CDR2L est KVS ; et
- du CDR3L est FQGSHLPLT (SEQ I D NO: 4).
Typiquement, l'anticorps selon la présente invention comprend au moins une région variable de chaîne légère dont la séquence en acides aminés présente au moins 60% d'identité avec la séquence suivante :
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVYSNGKIYLEWYLQKPGQSPKLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHLPLTFGAGTKLELKR (SEQ. I D NO: 12).
En particulier, l'anticorps selon la présente invention peut comprendre au moins une région variable de chaîne légère dont la séquence en acides aminés présente au moins 65% d'identité, au moins 70% d'identité, au moins 75% d'identité, au moins 80% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 90% d'identité, au moins 95% d'identité, au moins 98% d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 12.
Plus particulièrement, l'anticorps selon la présente invention peut comprendre au moins une région variable de chaîne légère dont la séquence en acides aminés correspond à la séquence SEQ ID NO: 12.
L'anticorps selon la présente invention présente au moins une région variable de chaîne lourde dont le CDR1 (i.e. CDRIH) présente au moins 60% d'identité, au moins 65% d'identité, au moins 70% d'identité, au moins 75% d'identité, au moins 80% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 90% d'identité, au moins 95% d'identité, au moins 98% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : GFTFNIYA (SEQ I D NO: 6).
L'anticorps selon la présente invention présente au moins une région variable de chaîne lourde dont le CDR2 (i.e. CDR2H) présente au moins 60% d'identité, au moins 65% d'identité, au moins 70% d'identité, au moins 75% d'identité, au moins 80% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 90% d'identité, au moins 95% d'identité, au moins 98% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : I RSKSN NYAT (SEQ I D NO: 8).
L'anticorps selon la présente invention présente au moins une région variable de chaîne lourde dont le CDR3 (i.e. CDR3H) présente au moins 60% d'identité, au moins 65% d'identité, au moins 70% d'identité, au moins 75% d'identité, au moins 80% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 90% d'identité, au moins 95% d'identité, au moins 98% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : VSSYYSGSFFAY (SEQ I D NO: 10).
A noter que, dans l'anticorps selon la présente invention, les pourcentages d'identité des différents CDR dans la région variable de chaîne lourde sont indépendants les uns des autres. Par exemple, le CDR2H peut présenter au moins 75% avec la séquence en acides aminés suivante : I RSKSNNYAT (SEQ. I D NO : 8), alors que le CDR3L peut présenter au moins 65% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : VSSYYSGSFFAY (SEQ I D NO: 10). Ainsi, l'ensemble des combinaisons en termes de pourcentage d'identité pour les trois CDR de la région variable de chaîne lourde sont envisagées dans la présente invention.
A titre d'exemple particulier, l'anticorps selon la présente invention comprend au moins une région variable de chaîne lourde dont la séquence en acides aminés :
- du CDRIH est GFTFN IYA (SEQ ID NO: 6) ;
- du CDR2H est IRSKSN NYAT (SEQ ID NO: 8) ; et
- du CDR3H est VSSYYSGSFFAY (SEQ I D NO: 10).
Typiquement, l'anticorps selon la présente invention comprend au moins une région variable de chaîne lourde dont la séquence en acides aminés présente au moins 60% d'identité avec la séquence suivante :
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNIYAM NWIRQAPGKGLEWIARIRSK SNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQN MVYLQM NNLKTEDTAMYYCVSSYYSGSFFAYWGQGTLVTV SA (SEQ I D NO: 14).
En particulier, l'anticorps selon la présente invention peut comprendre au moins une région variable de chaîne lourde dont la séquence en acides aminés présente au moins 65% d'identité, au moins 70% d'identité, au moins 75% d'identité, au moins 80% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 90% d'identité, au moins 95% d'identité, au moins 98% d'identité avec la séquence SEQ I D NO: 14. Plus particulièrement, l'anticorps selon la présente invention peut comprendre au moins une région variable de chaîne lourde dont la séquence en acides aminés correspond à la séquence SEQ. ID NO: 14.
Avantageusement, l'anticorps selon l'invention présente au moins une région variable de chaîne légère et au moins une région variable de chaîne lourde telles que précédemment définies.
Ainsi, l'anticorps selon l'invention présente au moins une région variable de chaîne légère comprenant un CDRIL, un CDR2L et un CDR3L tels que précédemment définis et au moins une région variable de chaîne lourde comprenant un CDRIH, un CDR2H et un CDR3H tels que précédemment définis.
La chaîne légère de l'anticorps selon l'invention est typiquement une chaîne légère kappa.
La chaîne lourde de l'anticorps selon l'invention est notamment une chaîne lourde gamma 2b.
En particulier, l'anticorps selon la présente invention est une immunoglobuline de type G.
Plus particulièrement, l'anticorps selon la présente invention est une immunoglobuline de type lgG2b/kappa.
L'anticorps dirigé contre le sous-type A des récepteurs aux endothélines, objet de la présente invention lie sélectivement des segments extracellulaires du ETA-R. Par « anticorps qui lie sélectivement » au moins un domaine ou une région spécifié(e) du ETA-R notamment du ETA-R humain, on entend, dans le cadre de la présente invention, un anticorps qui lie le (ou les) domaine(s) spécifique(s) avec une plus grande affinité que toute autre région du ETA-R. Avantageusement, l'anticorps lie le (ou les) domaine(s) spécifié(s) du ETA-R avec une affinité au moins 2, ou au moins 5, ou au moins 10, ou au moins 50 fois supérieure à celle qu'il présente pour toute autre région du ETA-R. Cette liaison peut être déterminée par des procédés bien connus dans le domaine tels que cytométrie de flux, radio-immuno-dosage (RIA), microscopie confocale, enzymo-immuno-dosage marquage (EIA) par révélation directe ou indirecte de l'anticorps à tester (ELISA). L'anticorps objet de la présente invention peut être obtenu à partir d'un animal immunisé contre le sous-type A des récepteurs aux endothélines ou contre un fragment de ce récepteur comprenant le(s) épitope(s) reconnu(s) par l'anticorps selon la présente invention. L'animal immunisé peut être un quelconque animal habituellement utilisé pour la production d'anticorps tel qu'une souris, un rat, un lapin, une chèvre, un chien, un cheval ou un camélidé tel que chameau ou lama. L'anticorps objet de la présente invention peut également être obtenu à partir d'une banque d'anticorps ou de fragments d'anticorps sélectionné contre le sous-type A des récepteurs aux endothélines ou contre un fragment de ce récepteur comprenant le(s) épitope(s) reconnu(s) par l'anticorps selon la présente invention. La banque d'anticorps ou de fragments d'anticorps peut être générée à partir d'un quelconque animal habituellement utilisé pour la production d'anticorps tel qu'une souris, un rat, un lapin, une chèvre, un chien, un cheval ou un camélidé tel que chameau ou lama mais également à partir d'un primate non humain ou d'un humain.
L'anticorps ainsi obtenu peut être purifié sur une colonne d'affinité sur laquelle le sous-type A des récepteurs aux endothélines ou une des séquences reconnues spécifiquement par l'anticorps selon l'invention a été préalablement immobilisée. Cette purification peut également impliquer une chromatographie d'affinité sur protéine A.
Dans le cadre de la présente invention, l'anticorps peut être un anticorps polyclonal polyspécifique ou monospécifique, ou un anticorps monoclonal.
Avantageusement, l'anticorps de la présente invention est monoclonal. Un « anticorps monoclonal » se réfère, par définition habituelle en immunologie, à un anticorps obtenu à partir d'une population d'anticorps substantiellement homogènes i.e. une population d'anticorps identiques, une quantité relativement faible de ces derniers pouvant éventuellement présenter une mutation. Un anticorps monoclonal est obtenu à partir de la prolifération d'un seul clone de cellules tel qu'un hybridome.
Plus particulièrement, l'anticorps selon la présente invention est l'anticorps murin monoclonal obtenu à partir de l'hybridome déposé à la CNCM (pour « Collection Nationale de Cultures de Microorganismes », Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15) le 18 octobre 2017 sous le numéro CNCM 1-5250 (Rendomab-A63). La présente invention concerne également un tel hybridome.
En variante, l'anticorps selon la présente invention peut être un anticorps chimérique i.e. un anticorps qui contient des régions variables ou des régions hypervariables de chaîne(s) lourde(s) et légère(s) dérivées d'un anticorps d'une espèce donnée en combinaison avec les régions constantes de chaîne(s) lourde(s) et légère(s) dérivées d'un anticorps d'une autre espèce hétérologue à la précédente.
Une première variante de la présente invention correspond à un anticorps chimérisé et notamment un anticorps monoclonal chimérisé, c'est-à-dire un anticorps dont les domaines variables issus de l'anticorps murin précédemment décrits sont associés à des domaines constants d'origine humaine. Il convient de rappeler que plusieurs anticorps thérapeutiques en usage chez l'homme sont des anticorps chimérisés.
Une seconde variante particulièrement intéressante peut être un anticorps humanisé et notamment un anticorps monoclonal humanisé. En effet, il est préférable d'utiliser un anticorps humanisé, si ce dernier doit être administré de manière répétée à un sujet humain.
Dans le cas d'un anticorps monoclonal humanisé selon la présente invention, ce dernier pourra être préparé par insertion des CDR d'un anticorps murin et notamment de l'anticorps murin issu de l'hybridome déposé à la CNCM le 18 octobre 2017 sous le numéro CNCM 1-5250 au sein d'un anticorps humain, quel que soit son isotype (IgG, IgA, IgM). Les anticorps humanisés peuvent être fabriqués en utilisant les techniques et les approches décrites dans Verhoeyen et al, 1988 [16] et dans le brevet US 4,816,567 [17].
Les anticorps peuvent aussi être des anticorps humains dans le sens où ils ont la séquence d'acides aminés d'anticorps humains anti-ETA-R via des procédés de préparation connus dans le domaine qui ne nécessitent pas la vaccination d'humains. Par exemple, de tels anticorps peuvent être obtenus par immunisation génique/rappels d'immunisation cellulaires de souris transgéniques qui sont disponibles et qui contiennent par essence des gènes d'immunoglobulines humaines (voir Vaughan et al, 1998 [18]). En variante, de tels anticorps peuvent être obtenus par le clonage des ADNc codant à partir de lymphocytes B humains dirigés contre ETA-R. La présente invention concerne également un polynucléotide isolé choisi parmi les différents polynucléotides ci-après :
a) un polynucléotide codant un anticorps tel que précédemment défini ; b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide tel que défini au point (a) ;
y) un polynucléotide d'au moins 18 nucléotides, capable de s'hybrider dans des conditions de forte stringence aux polynucléotides tels que définis aux points (a) et (b).
Par « polynucléotide », on entend, dans le cadre de la présente invention un acide nucléique, une séquence nucléique, une séquence d'acide nucléique, un oligonucléotide, une séquence polynucléotidique, une séquence nucléotidique, un ADN simple-brin, un ADN double-brin ou un ARN. Un polynucléotide selon la présente invention peut comprendre des nucléotides naturels et des nucléotides non naturels.
Le polynucléotide selon l'invention ne correspond pas à une séquence nucléotidique dans son état naturel i.e. dans son environnement chromosomique naturel. Au contraire, le polynucléotide selon l'invention a été isolé et éventuellement purifié, son environnement a, par conséquent, été modifié. Le polynucléotide selon l'invention peut également être obtenu par recombinaison génétique ou par synthèse chimique.
Les conditions de forte stringence correspondent à des conditions de température et de force ionique qui permettent de maintenir une hybridation entre deux séquences nucléotidiques complémentaires. L'homme du métier saura déterminer les conditions de forte stringence les mieux adaptées notamment en fonction de la taille des séquences nucléotidiques et ce, en se référant à l'enseignement de Sambrook et al, 1989
[19]·
Le polynucléotide selon la présente invention comprend : i') au moins une séquence nucléotidique codant une région variable de chaîne légère et comprenant : - une lere séquence codant le CDRIL et présentant au moins 60% d'identité avec la séquence nucléotidique suivante : AGT CAG AGC ATT GTA TAT AGT AAT GGA AAA ATC T AT TT A (SEQ ID NO: 1) ;
- une 2ème séquence codant le CDR2L et présentant au moins 60% d'identité avec la séquence nucléotidique suivante : AAA GTT TCC ;
- une 3ème séquence codant le CDR3L et présentant au moins 60% d'identité avec la séquence nucléotidique suivante : TTT CAA GGT TCA CAT CTT CCG CTC ACG (SEQ ID NO: 3) ; et
ii') au moins une séquence nucléotidique codant une région variable de chaîne lourde et comprenant :
- une lère séquence codant le CDRIH présente au moins 60% d'identité avec la séquence nucléotidique suivante : GGA TTC ACC TTC AAT ATC TAC GCC (SEQ ID NO: 5) ;
- une 2ème séquence codant le CDR2H présente au moins 60% d'identité avec la séquence nucléotidique suivante : ATA AGA AGT AAA AGT AAT AAT TAT GCA ACA (SEQ ID NO: 7) ;
- une 3ème séquence codant le CDR3H et présentant au moins 60% d'identité avec la séquence nucléotidique suivante : GTG AGT TCC TAT TAC TCC GGT AGT TTC TTT GCT TAC (SEQ. ID NO: 9).
Le polynucléotide selon la présente invention présente au moins une séquence nucléotidique codant une région variable de chaîne légère et présentant une lère séquence codant le CDRIL, ladite lère séquence présentant au moins 60% d'identité, au moins 65% d'identité, au moins 70% d'identité, au moins 75% d'identité, au moins 80% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 90% d'identité, au moins 95% d'identité, au moins 98% d'identité avec la séquence nucléotidique suivante : AGT CAG AGC ATT GTA TAT AGT AAT GGA AAA ATC TAT TTA (SEQ ID NO: 1).
Le polynucléotide selon la présente invention présente au moins une séquence nucléotidique codant une région variable de chaîne légère et présentant une 2ème séquence codant le CDR2L, ladite 2ème séquence présentant au moins 60% d'identité, au moins 65% d'identité, au moins 70% d'identité, au moins 75% d'identité, au moins 80% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 90% d'identité, au moins 95% d'identité, au moins 98% d'identité avec la séquence nucléotidique suivante : AAA GTT TCC.
Le polynucléotide selon la présente invention présente au moins une séquence nucléotidique codant une région variable de chaîne légère et présentant une 3ème séquence codant le CDR3L, ladite 3ème séquence et présente au moins 60% d'identité, au moins 65% d'identité, au moins 70% d'identité, au moins 75% d'identité, au moins 80% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 90% d'identité, au moins 95% d'identité, au moins 98% d'identité avec la séquence nucléotidique suivante : TTT CAA GGT TCA CAT CTT CCG CTC ACG (SEQ ID NO: 3).
A noter que, dans le polynucléotide selon la présente invention, les pourcentages d'identité des séquences codant les différents CDR dans une région variable de chaîne légère sont indépendants les uns des autres. Par exemple, la séquence codant le CDR2L peut présenter au moins 65% avec la séquence nucléotidique suivante : AAA GTT TCC, alors que la séquence codant le CDR3L peut présenter au moins 70% d'identité avec la séquence nucléotidique (SEQ ID NO: 3). Ainsi, l'ensemble des combinaisons en termes de pourcentage d'identité pour les trois séquences codant les différents CDR de la région variable de chaîne légère sont envisagées dans la présente invention.
A titre d'exemple particulier, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique codant une région variable de chaîne légère et comprenant :
- une lère séquence codant le CDRIL dont la séquence nucléotidique est : AGT CAG AGC ATT GTA TAT AGT AAT GGA AAA ATC TAT TTA (SEQ ID NO: 1) ;
- une 2ème séquence codant le CDR2L dont la séquence nucléotidique est :
AAA GTT TCC ;
- une 3ème séquence codant le CDR3L dont la séquence nucléotidique est : TTT CAA GGT TCA CAT CTT CCG CTC ACG (SEQ ID NO: 3).
Il est clair que les trois séquences ci-dessus listées (i.e. SEQ ID NO: 1, AAA GTT TCC et SEQ ID NO: 3) doivent être organisées les unes par rapport aux autres de façon à ce que le polypeptide obtenu suite à la traduction du polynucléotide selon l'invention comprenne 3 séquences peptidiques présentant au moins 60% d'identité et avantageusement 100% d'identité avec les CDRIL, CDR2L et CDR3L de la région variable de la chaîne légère tels que précédemment définis.
Typiquement, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique codant une région variable de chaîne légère dont la séquence nucléotidique présente au moins 60% d'identité avec la séquence suivante :
GAT G TT TTG ATG ACC CAA ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCG TGC AGA T CT AGT CAG AGC ATT GTA TAT AGT AAT GGA AAA ATC TAT TTA G AA TGG TAC CTG CAG AAA CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTA ATC TAC AAA G TT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TC A GGG ACA GAT TTC ACA CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG G CT GAG GAT CTG GGA G TT TAT TAC TGC TTT CAA GGT TC A CAT CTT CCG CTC ACG TTC GGT G CT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGG (SEQ ID NO: 11).
En particulier, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique codant une région variable de chaîne légère dont la séquence nucléotidique présente au moins 65% d'identité, au moins 70% d'identité, a u moins 75% d'identité, au moins 80% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 90% d'identité, a u moins 95% d'identité, au moins 98% d'identité avec la séquence SEQ I D NO : 11.
Plus particulièrement, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique codant une région variable de chaîne légère dont la séquence nucléotidique correspond à la séquence SEQ I D NO: 11.
Le polynucléotide selon la présente invention présente également au moins une séquence nucléotidique codant une région variable de chaîne lourde et présentant une lère séquence codant le CDRIH, ladite lère séquence présentant au moins 60% d'identité, au moins 65% d'identité, au moins 70% d'identité, au moins 75% d'identité, au moins 80% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 90% d'identité, au moins 95% d'identité, au moins 98% d'identité avec la séquence nucléotidique suivante : GGA TTC ACC TTC AAT ATC TAC GCC (SEQ I D NO: 5). Le polynucléotide selon la présente invention présente au moins une séquence nucléotidique codant une région variable de chaîne lourde et présentant une 2ème séquence codant le CDR2H, ladite 2ème séquence présentant au moins 60% d'identité, au moins 65% d'identité, au moins 70% d'identité, au moins 75% d'identité, au moins 80% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 90% d'identité, au moins 95% d'identité, au moins 98% d'identité avec la séquence nucléotidique suivante : ATA AGA AGT AAA AGT AAT A AT T AT G CA ACA (SEQ ID NO: 7).
Le polynucléotide selon la présente invention présente au moins une séquence nucléotidique codant une région variable de chaîne lourde et présentant une 3ème séquence codant le CDR3H, ladite 3ème séquence et présente au moins 60% d'identité, au moins 65% d'identité, au moins 70% d'identité, au moins 75% d'identité, au moins 80% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 90% d'identité, au moins 95% d'identité, au moins 98% d'identité avec la séquence nucléotidique suivante : GTG AGT TCC TAT TAC TCC GGT AGT TTC TTT G CT TAC (SEQ ID NO: 9).
A noter que, dans le polynucléotide selon la présente invention, les pourcentages d'identité des séquences codant les différents CDR dans une région variable de chaîne lourde sont indépendants les uns des autres. Par exemple, la séquence codant le CDR2H peut présenter au moins 75% avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 7, alors que la séquence codant le CDR3H peut présenter au moins 65% d'identité avec la séquence nucléotidique (SEQ ID NO: 9). Ainsi, l'ensemble des combinaisons en termes de pourcentage d'identité pour les trois séquences codant les différents CDR de la région variable de chaîne lourde sont envisagées dans la présente invention.
A titre d'exemple particulier, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique codant une région variable de chaîne lourde et comprenant :
- une lère séquence codant le CDRIH dont la séquence nucléotidique est : GGA TTC ACC TTC AAT ATC TAC GCC (SEQ ID NO: 5) ;
- une 2ème séquence codant le CDR2H dont la séquence nucléotidique est : ATA AGA AGT AAA AGT AAT AAT TAT G CA ACA (SEQ ID NO: 7) ; - une 3eme séquence codant le CDR3L dont la séquence nucléotidique est : GTG AGT TCC TAT TAC TCC GGT AGT TTC TTT G CT TAC (SEQ I D NO: 9).
I l est clair que les trois séquences ci-dessus listées (i.e. SEQ. I D NO: 5, SEQ ID NO: 7 et SEQ I D NO : 9) doivent être organisées les unes par rapport aux autres de façon à ce que le polypeptide obtenu suite à la traduction du polynucléotide selon l'invention comprenne 3 séquences peptidiques présentant au moins 60% d'identité et avantageusement 100% d'identité avec les CDRIH, CDR2H et CDR3H de la région variable de la chaîne lourde tels que précédemment définis.
Typiquement, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique codant une région variable de chaîne lourde dont la séquence nucléotidique présente au moins 60% d'identité avec la séquence suivante :
GAG GTG CAG CTT GTT GAG TCT GGT GGA GGA TTG GTG CAG CCT AAA GGG TC A TTG AAA CTC TC A TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AAT ATC TAC GCC ATG AAC TGG ATC CGC CAG G CT CCA GGA AAG GGT TTG GAA TGG ATT G CT CGC ATA AGA AGT AAA AGT AAT AAT TAT G CA ACA TAT TAT GCC GAT TC A GTG AAA GAC AGG TTC ACC ATC TCC AGA GAT GAT TC A CAG AAT ATG GTC TAT CTG CAA ATG AAC AAC TTG AAA ACT GAG GAC ACA GCC ATG TAT TAC TGT GTG AGT TCC TAT TAC TCC GGT AGT TTC TTT G CT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA (SEQ ID NO: 13).
En particulier, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique codant une région variable de chaîne lourde dont la séquence nucléotidique présente au moins 65% d'identité, au moins 70% d'identité, a u moins 75% d'identité, au moins 80% d'identité, au moins 85% d'identité, au moins 90% d'identité, a u moins 95% d'identité, au moins 98% d'identité avec la séquence SEQ I D NO : 13.
Plus particulièrement, le polynucléotide selon la présente invention comprend au moins une séquence nucléotidique codant une région variable de chaîne lourde dont la séquence nucléotidique correspond à la séquence SEQ I D NO: 13.
Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides aminés (ou entre deux séquences nucléotidiques), on entend, dans le cadre de la présente invention, un pourcentage de résidus d'acides aminés (ou de nucléotides) identiques entre les deux séquences comparées, ce pourcentage étant obtenu après mise en œuvre du meilleur alignement (alignement optimum) entre les deux séquences. L'homme du métier connaît différentes techniques permettant d'obtenir un tel pourcentage d'identité et impliquant des algorithmes d'homologie ou des programmes d'ordinateur tels que le programme BLAST.
Le pourcentage d'identité est statistique et les différences entre les deux séquences sont réparties aléatoirement le long de ces séquences. Les différences entre les deux séquences peuvent consister en différents types de modifications des séquences : des délétions, des substitutions ou des additions de résidus d'acides aminés (ou de nucléotides).
Dans un 1er mode de réalisation, les modifications mises en œuvre dans les séquences résultent en des substitutions entre acides aminés équivalents i.e. des acides aminés présentant des homologies structurales ou ne modifiant pas substantiellement l'activité biologique des anticorps correspondants.
Dans un 2nd mode de réalisation, les modifications mises en œuvre dans les séquences résultent en des substitutions par des acides aminés non équivalents i.e. des acides aminés ne présentant pas d'homologie structurale. Ces modifications sont susceptibles d'améliorer les propriétés biologiques de l'anticorps i.e. affinité et/ou spécificité améliorées, spectre de reconnaissance élargi, augmentation de la stabilité, réduction de l'immunogénicité etc.
Appliquées aux deux modes de réalisation précédemment exposés, ces modifications, insertions ou délétions peuvent cibler un CDR essentiel ou non aux propriétés de l'anticorps selon l'invention.
Appliquées aux deux modes de réalisation précédemment exposés, ces modifications, insertions ou délétions peuvent également cibler une région FR, sachant que de telles régions, au sein des domaines variables des anticorps, peuvent selon les anticorps également jouer un rôle dans l'expression des propriétés de l'anticorps selon l'invention.
La présente invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression contenant au moins un polynucléotide selon la présente invention. Un tel vecteur est notamment utile pour transformer un organisme hôte et exprimer dans ce dernier un anticorps selon la présente invention.
Le vecteur selon la présente invention comprend en outre un (ou plusieurs) élément(s) qui permet(tent) l'expression du polynucléotide selon la présente invention et/ou la sécrétion du produit résultant de la traduction du polynucléotide selon la présente invention. Parmi ces éléments, on peut citer un promoteur constitutif ou inductible, un signal d'initiation de la transcription ou un signal de terminaison de la transcription, une séquence d'initiation de la traduction ou un signal de fin de traduction.
Avantageusement, le vecteur selon la présente invention comprend, liés entre eux de façon opérationnelle, un promoteur, un polynucléotide de l'invention et un élément terminateur. On entend par « liés entre eux de façon opérationnelle » selon l'invention, des éléments liés entre eux de façon à ce que le fonctionnement d'un des éléments soit affecté par celui d'un autre. A titre d'exemple, un promoteur est lié de façon opérationnelle à une séquence codante lorsqu'il est capable d'affecter l'expression de cette dernière. Les éléments régulateurs de la transcription, de la traduction et de la maturation des peptides que le vecteur peut comprendre sont connus de l'homme du métier et ce dernier est capable de les choisir en fonction de l'organisme hôte dans lequel l'expression ou le clonage doivent être réalisés.
Le vecteur selon la présente invention est avantageusement choisi parmi un plasmide, un cosmide, un bactériophage et un virus tel qu'un baculovirus. En particulier, le vecteur de l'invention est un vecteur à réplication autonome comportant des éléments permettant son maintien et sa réplication dans l'organisme hôte comme une origine de réplication. En outre, le vecteur peut comporter des éléments permettant sa sélection dans l'organisme hôte comme, par exemple, un gène de résistance à un antibiotique ou un gène de sélection qui assure la complémentation avec le gène respectif délété au niveau du génome de l'organisme hôte. De tels vecteurs de clonage et/ou d'expression sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
L'invention concerne également un organisme hôte transformé par ou comprenant un polynucléotide selon la présente invention ou un vecteur selon la présente invention. Par « organisme hôte », on entend tout organisme, isolé, uni- ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel un polynucléotide de l'invention est introduit pour la production d'un anticorps selon la présente invention.
L'homme du métier connaît différentes méthodes pour introduire de façon efficace un polynucléotide dans un organisme hôte et ce, afin que, dans l'organisme hôte, l'anticorps codé par ledit polynucléotide soit produit. A titre d'exemple et de façon non exhaustive, cette méthode peut être une électroporation, une lipofection, une transformation biologique d'un végétal en utilisant Agrobacterium tumefasciens, un choc thermique ou un procédé chimique.
Avantageusement, l'organisme hôte est un microorganisme tel qu'une levure, une bactérie ou un champignon. La transformation de tels microorganismes permet de produire l'anticorps de l'invention à échelle semi-industrielle ou industrielle.
En variante, l'organisme hôte est une cellule animale telle qu'une cellule de mammifère, une cellule végétale, une cellule d'insectes, un animal à l'exception d'un humain, ou une plante.
De tels organismes hôtes peuvent être utilisés pour produire un anticorps selon la présente invention. En effet, un procédé pour produire un anticorps selon la présente invention comprend les étapes consistant à :
a) mettre en culture un organisme hôte selon la présente invention et notamment un organisme hôte unicellulaire dans un milieu de culture et dans des conditions appropriées ;
b) récupérer ledit anticorps à partir du milieu de culture dudit organisme hôte cultivé ou à partir dudit organisme hôte cultivé.
L'anticorps selon la présente invention est également modifiable afin de a) générer un anticorps marqué par un isotope radioactif, une pro-drogue, une enzyme ou une toxine, et b) modifier la spécificité et/ou l'affinité de liaison, et/ou la stabilité, et/ou l'immunogénicité dudit anticorps assurant le ciblage des cellules qui surexpriment le ETA- R, notamment des cellules cancéreuses telles que des glioblastomes etc. L'anticorps selon la présente invention est également modifiable afin de le coupler chimiquement ou génétiquement à une molécule peptidique ; une molécule protéique ; une molécule nucléique telle qu'un ADN, un ARN, un ARNi, un aptamère, un PNA ou un LNA ; une molécule lipidique ; une molécule glucidique ou une molécule chimique.
La présente invention concerne donc un composé comprenant un anticorps selon la présente invention conjugué à un élément choisi dans le groupe constitué par un groupement cytotoxique, un groupement facilement détectable ou un groupement effecteur.
Par « groupement cytotoxique », on entend un groupement directement ou indirectement toxique pour les cellules ciblées par l'anticorps selon la présente invention. Par « directement cytotoxique », on entend un groupement qui est en lui-même cytotoxique. Par « indirectement cytotoxique », on entend un groupement qui, bien que non cytotoxique en lui-même, peut induire une cytotoxicité, par exemple par son action sur une autre molécule ou par une action supplémentaire sur lui.
Dans une lère forme de mise en œuvre, le groupement cytotoxique est un agent chimiothérapeutique cytotoxique. L'homme du métier connaît différents agents chimiothérapeutiques cytotoxiques utilisables dans le cadre de la présente invention. L'activité de ces agents peut être augmentée sous irradiation. A titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, on peut citer les agents alkylants comme la méchloréthamine ou le chlorambucile ; le méthotrexate ; la 5-fluoro-uracile ; la Vinblastine ; la gemcitabine ; la fludarabine ; la nicotinamide ; la doxorubicine ; la mitomycine ; la L-asparaginase ; le cisplatine ; le taxol et ses analogues/dérivés.
Dans une 2ème forme de mise en œuvre, le groupement cytotoxique est un groupement (poly)peptidique cytotoxique tel que la ricine, l'abrine, l'exotoxine de Pseudomonas, le TNFa et l'interleukine 2.
Dans une 3ème forme de mise en œuvre, le groupement cytotoxique est un agent chimiothérapeutique indirectement cytotoxique. Un tel agent également appelé pro-drogue n'est pas ou peu cytotoxique en tant que tel mais est apte à donner, notamment suite à une réaction enzymatique ou à une irradiation, une substance cytotoxique (ou drogue) notamment telle que définie dans la lère forme de mise en œuvre. A titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, on peut citer la méthotrexate-alanine ; la mitomycine phosphate, la 5-fluorocytosine ; la photofrine et la capécitabine.
Dans une 4ème forme de mise en œuvre, le groupement cytotoxique est un groupement (poly)peptidique indirectement cytotoxique. Par groupement poly(peptidique) indirectement cytotoxique, on entend un polypeptide qui présente une activité enzymatique et peut convertir une pro-drogue relativement non toxique notamment telle que définie dans la 3ème forme de mise en œuvre en une substance cytotoxique notamment telle que définie dans la lère forme de mise en œuvre. Parmi de tels groupements (poly)peptidiques indirectement cytotoxiques, on peut citer une peptidase telle qu'une carboxypeptidase, une aminopeptidase ou une endopeptidase ; une phosphatase ; une sulfatase ; une amidase ; une kinase ; une glycosidase ; une désaminase ; une réductase et une oxydase.
Dans une 5ème forme de mise en œuvre, le groupement cytotoxique est une molécule d'acide nucléique qui est directement ou indirectement cytotoxique telle qu'un oligonucléotide anti-sens ou un aptamère.
Dans une 6ème forme de mise en œuvre, le groupement cytotoxique est un isotope radioactif comme l'iode-131, ryttrium-90, le lutetium-177, le cuivre-67, le plomb-212.
L'homme du métier connaît différentes techniques permettant de conjuguer de tels groupements à un anticorps selon la présente invention une fois ce dernier obtenu ou produit.
Ces techniques permettent un couplage covalent entre un anticorps selon l'invention et un groupement cytotoxique en mettant à profit des groupes chimiques particuliers portés par l'anticorps selon l'invention et par le groupement cytotoxique. Parmi ces groupes chimiques particuliers, on peut citer un groupe thiol, un groupe ester, un groupe amino, un groupe acide et tout élément chimique susceptible d'être mis en œuvre dans la « click-chemistry ».
En variante et notamment lorsque le groupement cytotoxique est un groupement de nature peptidique, cette conjugaison peut consister à produire le composé selon l'invention sous forme d'un composé de fusion par les techniques de recombinaison génétique, dans lesquelles un polynucléotide comprend des régions respectives codant l'anticorps selon la présente invention et le groupement cytotoxique, adjacentes l'une à l'autre, juxtaposées ou séparées par une région codant un lieur peptidique qui ne détruit pas les propriétés souhaitées du composé hybride final.
Quelle que soit la technique utilisée pour conjuguer un anticorps selon la présente invention avec un groupement cytotoxique, la seule contrainte à respecter dans le cadre de cette conjugaison est que l'anticorps conjugué conserve sa spécificité de liaison pour ETA-R, propriété associée à celles du groupement cytotoxique.
Par « groupement facilement détectable », on entend, dans le cadre de la présente invention, un groupement qui peut être détecté par mise en œuvre d'une technique de détection appropriée avantageusement non invasive telle que la microscopie, la scintigraphie et l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Un composé selon l'invention comprenant un tel groupement facilement détectable est particulièrement adapté au domaine de l'imagerie et du diagnostic. Il permet notamment d'identifier et localiser des sites au niveau desquels le ETA-R est surexprimé du fait de la spécificité de liaison au ETA-R de l'anticorps présent dans ce composé.
Dans une lère forme de mise en œuvre, le groupement facilement détectable peut être une enzyme ou une molécule capable de générer un signal détectable et éventuellement quantifiable dans des conditions particulières comme lors de la mise en présence d'un substrat adapté. A titre d'exemples illustratifs et non limitatifs, on peut citer la biotine, la digoxygénine, la 5-bromodeoxyuridine, une phosphatase alcaline, une peroxydase, une acétylcholine estérase (AChE), une glucose amylase et un lysozyme.
Dans une 2ème forme de mise en œuvre, le groupement facilement détectable peut être un marqueur fluorescent, chimiofluorescent ou bioluminescent tels que la fluorescéine et ses dérivés ; la rhodamine et ses dérivés ; la GFP (pour « Green Fluorescent Protein ») et ses dérivés ; l'umbelliférone et ses dérivés ; le luminol ; la luciférase et la luciférine.
Dans une 3ème forme de mise en œuvre, le groupement facilement détectable peut être un marqueur ou isotope radioactif tel que l'iode-123, l'iode-125, l'iode-126, l'iode-133, l'indium-111, l'indium-113m, le brome-77, le gallium-67, le gallium- 68, le ruthénium-95, le ruthénium-97, le technetium-99m, le fluor-18, le carbone-13, l'azote-15, l'oxygène-17, le scandium-47, le tellurium-122m, le thulium-165 et l'yttrium- 199. Il convient de remarquer que certains atomes radioactifs utilisés comme groupements facilement détectables peuvent aussi constituer des groupements cytotoxiques du fait de la quantité de radioactivité qu'ils peuvent délivrer.
Tout ce qui a été précédemment expliqué pour la conjugaison de l'anticorps selon l'invention avec les groupements cytotoxiques s'applique mutatis mutandis à la conjugaison de l'anticorps selon l'invention avec les groupements facilement détectables. La conjugaison de l'anticorps selon l'invention avec les groupements facilement détectables, peut également être réalisée en relation avec des nano-objets, et ce afin de densifier leur concentration, et donc d'améliorer le signal émis, le contraste ou la toxicité.
Dans le cas où ce groupement facilement détectable est un marqueur radioactif, ce dernier peut être introduit dans la séquence peptidique de l'anticorps selon l'invention. Cette introduction peut avoir lieu lors de la synthèse de l'anticorps en utilisant un ou plusieurs acides aminés marqués. En variante, cette introduction peut avoir lieu suite à cette synthèse en fixant le marqueur radioactif sur des résidus de la séquence peptidique de l'anticorps synthétisée. Par exemple, l'yttrium-90 peut être fixé via un résidu lysine. En variante encore, le marqueur radioactif peut être indirectement fixé à l'anticorps par des moyens connus. Par exemple, de l'EDTA ou un autre agent chélateur peut être fixé à l'anticorps selon l'invention et utilisé pour fixer l'indium-111.
La présente invention concerne l'utilisation d'un composé comprenant un anticorps et un groupement facilement détectable comme un outil de diagnostic, de pronostic et de suivi in vivo très efficace en matière d'imagerie médicale. Le format d'anticorps est choisi de manière à générer le meilleur rapport signal sur bruit et la meilleure pharmacocinétique.
En d'autres termes, la présente invention concerne un procédé pour détecter et quantifier in vivo ou in vitro l'expression ou la surexpression du sous-type A des récepteurs aux endothélines, consistant à : ai) mettre en contact un échantillon biologique avec un composé selon la présente invention ;
bi) détecter l'éventuel complexe entre ledit composé et ledit sous-type A des récepteurs aux endothélines.
Un tel procédé peut être mis en œuvre pour détecter, diagnostiquer, prognostiquer ou suivre un état dans lequel le sous-type A des récepteurs aux endothélines est surexprimé et notamment pour détecter, diagnostiquer, prognostiquer ou suivre un état cancéreux (présence, taille et évolution des tumeurs cancéreuses). Dans le cas d'un procédé pour diagnostiquer un cancer tel qu'un glioblastome, ce dernier comprend les étapes consistant à :
ai') mettre en contact un échantillon biologique du sujet avec un composé selon la présente invention ;
bi') détecter le signal émis par le groupement facilement détectable et ci') déterminer la présence ou l'absence d'un cancer chez ledit sujet sur la base du signal détecté à l'étape (bi') éventuellement comparé à un signal contrôle.
Par « signal contrôle », on entend, dans le cadre de la présente invention, un signal ou une valeur moyenne de signaux obtenu(e) pour un sujet sain ou, au contraire, un signal ou une valeur moyenne de signaux obtenu(e) pour un sujet cancéreux.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de diagnostic selon l'invention est un procédé réalisé in vitro pour lequel l'échantillon biologique tel qu'une biopsie a été prélevé chez le sujet avant la mise en œuvre de l'étape (ai'). En variante, ce procédé peut correspondre à un procédé d'imagerie in vivo dans lequel une quantité efficace du composé selon l'invention a été préalablement administrée au sujet. Par "quantité efficace", on entend une quantité de composé suffisante pour l'imagerie de cancers. Cette quantité varie en fonction du mode d'administration, de la formulation administrée, de l'excipient et du cancer à diagnostiquer. Toutefois, déterminer cette quantité efficace est un travail de routine pour l'homme du métier.
Par « groupement effecteur », on entend, dans le cadre de la présente invention, un groupement capable de reconnaître spécifiquement un marqueur cancéreux, ou qui permette le recrutement (i) d'une cellule effectrice du système immunitaire i.e. des cellules NK, des cellules T cytotoxiques, des macrophages ou (ii) du système du complément. Par « groupement capable de reconnaître spécifiquement un marqueur cancéreux », on entend, dans le cadre de la présente invention, un ligand d'un marqueur cancéreux ; un anticorps identique ou différent à un anticorps selon la présente invention ; une protéine ; un peptide ; ou une molécule nucléique telle qu'un ADN, un ARN, un ARNi, un aptamère, un PNA ou un LNA. Par « marqueur cancéreux », on envisage aussi bien un ETA-R qu'un autre marqueur membranaire.
Dans une lère forme de mise en œuvre, le groupement effecteur reconnaît un marqueur cancéreux, identique à ou différent du ETA-R, exprimé à la surface des cellules cancéreuses, assurant ainsi une meilleure spécificité de reconnaissance et donc un ciblage accru des cellules cancéreuses.
Dans une 2nde forme de mise en œuvre, le groupement effecteur présente une spécificité de reconnaissance pour un marqueur spécifiquement présent à la surface de cellules effectrices du système immunitaire i.e. cellules NK, macrophages ou cellules T cytotoxiques. Un tel recrutement assure la lyse ciblée des cellules cancéreuses reconnues par l'anticorps de la présente invention.
Dans une 3ième forme de mise en œuvre, le groupement effecteur présente une spécificité de reconnaissance pour le système du complément et, en particulier, pour la protéine Cl ou sa forme tronquée Clq, qui initie la cascade des événements moléculaires qui aboutissent à la mort de la cellule ciblée. Un tel recrutement assure la lyse ciblée des cellules cancéreuses reconnues par l'anticorps de la présente invention.
Dans une 4ième forme de mise en œuvre, le groupement effecteur présente une spécificité de reconnaissance pour le système du complément et, en particulier, pour la protéine C3 ou sa forme tronquée C3b, assurant ainsi le recrutement de cellules effectrices du système immunitaire, cellules qui induisent la mort de la cellule ciblée. Un tel recrutement assure la lyse ciblée des cellules cancéreuses reconnues par l'anticorps de la présente invention. La présente invention concerne un anticorps selon la présente invention, un polynucléotide selon la présente invention ou un composé selon la présente invention pour utilisation comme médicament.
Ainsi, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant, en tant que principe actif, un anticorps selon la présente invention, ou un polynucléotide selon la présente invention ou un composé selon la présente invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Par « véhicule pharmaceutiquement acceptable », on entend selon la présente invention, toute substance qui est ajoutée à un anticorps, un polynucléotide ou un composé selon la présente invention pour favoriser son transport, éviter sa dégradation substantielle dans ladite composition et/ou augmenter sa demi-vie. Avantageusement, un tel véhicule pharmaceutiquement acceptable est stérile et apyrogène. Il est choisi en fonction du type d'application de la composition pharmaceutique de l'invention et notamment en fonction de son mode d'administration.
Ainsi, la composition pharmaceutique selon l'invention est constituée par au moins un anticorps, ou un polynucléotide ou un composé selon la présente invention sous forme libre ou sous forme d'un sel d'addition avec un acide pharmaceutiquement acceptable, à l'état pur ou sous forme d'une composition dans laquelle il est associé à tout autre produit pharmaceutiquement compatible. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être employées par voie systémique ; par voie parentérale, par exemple intraveineuse, intraartérielle, intrapéritonéale, intrathécale, intraventriculaire, intrasternale, intracrânienne, intramusculaire ou sous-cutanée ; par voie topique ; par voie orale ; par voie rectale ; par voie intranasale ou par inhalation.
A titre de compositions solides pour administration orale, on peut utiliser des comprimés, des pilules, des poudres, etc... dans lesquels l'anticorps, le polynucléotide ou le composé selon l'invention sont mélangés à un ou plusieurs diluants inertes classiquement utilisés, et éventuellement à d'autres substances telles que, par exemple, un lubrifiant, un colorant, un enrobage etc.
A titre de compositions liquides pour administration orale ou oculaire, on peut utiliser des suspensions, des solutions, des émulsions, des sirops pharmaceutiquement acceptables contenant des diluants inertes classiquement utilisés, et éventuellement d'autres substances comme des produits mouillants, édulcorants, épaississants, etc.
Les compositions stériles pour administration parentérale peuvent être des solutions aqueuses ou non, des suspensions ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer l'eau, le propylène-glycol, des huiles végétales ou d'autres solvants organiques convenables. Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants, comme des agents mouillants, isotonisants, émulsifiants, etc.
Les compositions pour administration topique peuvent être par exemple des crèmes, lotions, collutoires, gouttes nasales ou oculaires ou aérosol.
Le niveau de dose quotidien de l'anticorps, du polynucléotide ou du composé selon la présente invention est habituellement de 1 à 1 000 mg par adulte (c'est- à-dire d'environ 0,015 à 15 mg/kg), administrés en doses uniques ou fractionnées. Ces doses ne sont données qu'à titre illustratif. Le médecin, dans tous les cas, saura déterminer la dose réelle la plus adaptée à un patient individuel donné et cette dernière varie selon l'âge, le poids et la réponse du patient.
La présente invention concerne un anticorps selon la présente invention, un polynucléotide selon la présente invention, un composé selon la présente invention ou une composition pharmaceutique selon la présente invention pour utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'un trouble ou d'une pathologie impliquant un dysfonctionnement, direct ou en association avec une autre voie physiologique, de l'axe comprenant une endothéline et au moins un de ses récepteurs tel que, notamment, le sous-type A des récepteurs aux endothélines.
Avantageusement, un tel trouble ou une telle pathologie est un cancer. A titre de cancers, on peut citer un mélanome, un cancer colorectal, un cancer du côlon, un Sarcome de Kaposi, un glioblastome, un cancer des ovaires et un cancer de la vessie. Typiquement, ce trouble est un glioblastome.
En d'autres termes encore, la présente invention concerne un procédé pour traiter et/ou prévenir un trouble ou une pathologie impliquant un dysfonctionnement, direct ou en association avec une autre voie physiologique, de l'axe comprenant une endothéline et au moins un de ses récepteurs tel que, notamment, le sous-type A des récepteurs aux endothélines chez un patient souffrant ou susceptible de souffrir d'un tel trouble ou d'une telle pathologie. Ce procédé consiste à administrer audit patient une quantité efficace d'un anticorps selon la présente invention, d'un polynucléotide selon la présente invention, d'un composé selon la présente invention ou d'une composition pharmaceutique selon la présente invention.
Enfin, la présente invention concerne l'utilisation d'un anticorps selon la présente invention ou d'un composé selon la présente invention comme un outil de recherche particulièrement adapté à l'étude des voies de signalisation associées à l'axe endothéline/récepteurs aux endothélines, ainsi que pour progresser dans la compréhension des caractéristiques structurales et fonctionnelles de cette famille de récepteurs.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 présente les courbes de liaison du Rendomab-A63 sur des cellules CHO surexprimant ETA-R (CHO-ETAR) ou CHO n'exprimant pas ETA-R (CHO-WT) en présence ou non d'endothéline 1 (ET1).
La Figure 2 présente les courbes de liaison du Rendomab-A63 sur des cellules souches de glioblastome, GLI-7, surexprimant ETA-R.
La Figure 3 présente la différence du niveau d'expression du transcrit EDNRA codant pour le récepteur A aux endothélines dans des cellules de glioblastomes de patients (notées GBM) comparée à des cellules neuronales non tumorales (notées Non- tumor).
La Figure 4 présente des résultats d'immunofluorescence sur les cellules souches de glioblastome GLI-7, en présence de 1 mM d'ETl-FAM (Figure 4A), en présence de 30 nM du Rendomab-A63 (RA63) (Figure 4B) ou en présence de 30 nM d'un anticorps contrôle (NC) (Figure 4C). Les noyaux sont colorés avec du DRAQ 5.
La Figure 5 présente la courbe de liaison de l'anticorps Rendomab Axx qui ne fait pas partie de l'invention, sur les cellules CHO transfectées avec le récepteur de type A aux endothélines (CHO ETAR) (ligne noire continue) et en présence de 100 nM d'endothéline 1 (ET1) (ligne grise discontinue).
La Figure 6 présente le marquage par immunofluorescence sur les cellules souches de glioblastome GLI-7 en présence de 30 nM du Rendomab-Axx (RAxx) révélé par un anticorps secondaire marqué à l'Alexa fluor 488 (Raxx-AF488). Les noyaux sont colorés avec du DRAQ.5. Les deux images sont fusionnées (Fusion).
La Figure 7 présente les résultats d'imagerie in vivo par fluorescence sur un modèle préclinique de souris nude xénogreffée en position orthotopique avec des cellules GLI-7. La Figure 7A présente le contrôle positif de détection du Rendomab A63- AF680 et du Témoin-AF750. La Figure 7B présente la détection de la fluorescence in vivo dans la souris greffée et la souris contrôle. La Figure 7C présente la détection de la fluorescence ex vivo dans le cerveau greffé et le cerveau contrôle.
La Figure 8 présente les séquences nucléotidiques et les séquences en acides aminés déduites des domaines variables de la chaîne légère et de la chaîne lourde du Rendomab-A63.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
I. Matériels et méthodes.
La stratégie d'immunisation et de criblage des hybridomes mise en œuvre dans la présente invention est identique à celle mise en œuvre dans les demandes internationales WO 2012/045776 [14] et WO 2017/220739 [15].
II. Caractérisation biochimique.
Après purification du Rendomab-A63 sur Protein A - PropSep high capacity (Millipore), il a été procédé à la caractérisation de ses propriétés biochimiques. L'isotypage des chaînes lourde et légère du Rendomab-A63 a été réalisé à l'aide du kit « Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping » de chez Piercell. Il s'agit d'une immunoglobuline de type G, d'isotype 2b pour la chaîne lourde et kappa pour la chaîne légère. Le Rendomab-A63 est donc une immunoglobuline de type lgG2b/kappa.
La reconnaissance du ETA-R dans son contexte cellulaire (cellules CHO- ETAR et Gli-7) par le Rendomab-A63 a été établie par cytométrie de flux et marquage cellulaire par immunofluorescence.
Les courbes de liaison du Rendomab-A63 ont été réalisées
i) sur la lignée de cellules CHO (pour « Chinese Hamster Ovary ») n'exprimant pas ETA-R (CHO-WT),
ii) sur la lignée CHO-ETAR, cellules CHO transfectées, de manière stable, pour permettre une forte expression de ETA-R et
iii) sur la lignée de cellules souches de glioblastome, Gli-7, établie par le Dr Jean-Philippe Hugnot à partir d'une biopsie suite à l'exerèse d'un glioblastome chez un patient.
La quantification de la fluorescence est faite par cytométrie de flux sur un FACSCalibur™ (BD Bioscience). Une gamme de concentrations d'anticorps comprise entre, au maximum, 1 mM et, au minimum, 5 pM a été incubée pendant 2h à 4°C en présence ou non de 100 nM ET1 (préincubé pendant 30 min à 4°C). A 90% de confluence, les cellules sont décollées en présence de versène puis aliquotées en tubes (300 mI / 300 000 cellules) en présence d'un tampon saturation (PBS-SNC 5% - BSA 0,1%) conservé à 4°C. Après trois lavages en tampon PBS, 300 mI d'anticorps secondaire marqué à l'Alexa Fluor™ 488 (AF- 488) dilué au 1/400 a été ajouté et incubé pendant 60 min. à 4°C (Goat anti-mouse IgG, Invitrogen-ref A10684). Pour chaque point de concentration d'anticorps, après 3 lavages en PBS, 10 000 cellules ont été comptées au cytomètre de flux.
Les données ont été analysées dans le logiciel GraphPad Prism et les courbes modélisées selon le paramètre : un site de fixation spécifique. Les constantes apparentes de dissociation calculées ont donné les valeurs de Kd proches de 0,5 nM sur la lignée CHO-ETAR en présence ou non d'ETl (Figure 1). La fixation du RA63 n'est donc pas modifiée en présence d'ETl. De plus, on note l'absence de fixation du Rendomab-A63 sur les cellules CHO-WT démontrant ainsi la spécificité de fixation pour ETA-R.
Comme illustré à la Figure 2, l'affinité du RA63 pour ETA-R exprimé à la surface des cellules Gli 7 est de l'ordre du nanomolaire (15 nM).
III. Immunofluorescence sur les cellules souches de glioblastome Gli-7.
111.1. Remarques préliminaires.
Les cellules tumorales de glioblastome sont connues pour surexprimer GET-1 [20] et le récepteur de type A aux endothélines (ETAR) comme le montrent les données de transcriptomique de la base publique Gliovis (http://gliovis.bioinfo.cnio.es/) présentées sur la Figure 3. Ces données indiquent clairement une surexpression du transcrit EDNRA dans les cellules de glioblastomes des patients.
111.2. Résultats.
La Figure 4 présente des résultats d'immunofluorescence sur les cellules souches de glioblastome Gli-7 dans les conditions opératoires suivantes :
- en présence de 1 mM d'ETl-FAM (PhoenixPharmaceutical FG-023-01A)
(Figure 4A) ;
- en présence de 30 nM du Rendomab-A63 (Figure 4B) ; et
- en présence de 30 nM d'un anticorps contrôle (NC) et du même anticorps secondaire également dilué au 1/400 (Figure 4C).
Les noyaux sont colorés avec du DRAQ.5 (Abcam abl08410) en suivant le protocole du fournisseur. Les cellules Gli-7 ont été incubées 12h à 4°C avec soit 1 pM d'ETIFAM, soit 30 nM final du RA63, soit 30 nM final du NC. Après 3 lavages en PBS, pour les marquages avec les anticorps, on ajoute l'anticorps secondaire, dilué au 1/400, couplé à l'AF488 (Invitrogen - ref A10684) aux cellules pendant 2h à 4°C. Après 3 lavages en PBS, les cellules ont été montées en milieu aqueux, Aquatex® (VWR 1 08562 0050) sur des lames, pour être observées au microscope confocal (ZEISS). La Figure 4A permet de s'assurer de la présence des récepteurs aux endothélines capables de fixer l'endothéline 1 sur les cellules Gli-7. La Figure 4B montre un très fort immuno-marquage des cellules Gli-7 avec l'anticorps RA63 reconnaissant le récepteur A aux endothélines, alors qu'un anticorps négatif de contrôle (NC), du même isotype que RA63 (lgG2b Kappa), ne génère aucun signal sur les cellules Gli-7 (Figure 4C). L'ensemble de ces résultats permet de conclure à une forte expression du ETA-R à la surface des cellules Gli-7 mis en évidence par la fixation de l'anticorps RA63 spécifique du ETA-R. Cette fixation est bien médiée par la région variable de l'anticorps RA63 comme le montre l'absence de signal lors de l'utilisation de l'anticorps contrôle.
III.3. Résultats comparatifs.
Dans le processus d'immunisation qui a permis de générer l'anticorps RA63 selon l'invention, plusieurs anticorps monoclonaux ont été obtenus.
En particulier, l'anticorps Rendomab-Axx dirigé contre le ETAR ayant une affinité nM mais dont la liaison sur le récepteur A aux endothélines est déplacée par une concentration de 100 nM d'ETl (Figure 5). Cet anticorps présente donc des propriétés comparables à celles des anticorps décrits dans la demande de brevet CA 2 971 491 [13].
Ce même anticorps Raxx est incapable de se fixer sur les cellules de glioblastome comme le montre l'expérience d'immunofluorescence présentée sur la Figure 6. Cette expérience démontre l'existence d'une conformation du récepteur ETAR présente à la surface des cellules de glioblastome non reconnue par l'anticorps Raxx mais reconnue par l'anticorps RA63.
IV. Imagerie in vivo par tomographie de fluorescence sur un modèle animal préclinique.
La Figure 7 présente les résultats d'imagerie in vivo par fluorescence sur un modèle préclinique de souris nude xénogreffée en position orthotopique avec des cellules Gli-7.
Pour la Figure 7A, une gamme de quantité des traceurs RA-AF680 et NC- AF750 ont été imagés sur un support solide au FMT 1500 (Perking Elmer) afin de démontrer la spécificité des filtres employés pour la détection de la fluorescence soit i) à 680 nm où seul le RA63-AF680 émet un signal de fluorescence détectable ou soit ii) à 750 nm où seul le NC-AF750 émet un signal de fluorescence détectable.
Pour la Figure 7B, les souris sont imagées à Jo+3 mois post xénogreffe. Une co-injection des traceurs RA63-AF680 (14 nmoles de RA63 couplé avec 8 nmoles d'AF680) et NC-AF750 (17 nmoles d'anticorps contrôle couplés à 7 nmoles d'AF750) ont été injectés par voie intrapéritonéale (IP) à la souris nude xénogreffée et à la souris nude normale (souris contrôle).
Dix jours post injection IP, nécessaire à l'élimination des traceurs de la circulation sanguine, les souris ont été imagées au FMT 1500 (Perkin Elmer). Pour chaque souris, une acquisition simultanée à 680 nm et 750 nm a été réalisée. On observe une forte fluorescence à 680 nm au niveau de la tête de la souris xénogreffée alors que sur cette même souris, le traceur NC-AF750 ne génère aucune fluorescence à 750 nm. Ainsi, seul le traceur RA63-AF680 a été détecté sur la souris vivante xénogreffée avec la lignée GLI-7. On constate également l'absence de détection des traceurs RA63-AF680 et NC-AF750 injectés dans la souris normale.
Pour la Figure 7C, les souris ont été sacrifiées, leur cerveau prélevé et fixé avec une solution de paraformaldéhyde à 4% (PFA 4%) durant lh à 4°C. Les cerveaux ont été imagés comme précédemment. A nouveau, on observe une forte fluorescence avec le traceur RA63-AF680 dans le cerveau envahi par les cellules tumorales, alors qu'aucun signal n'est détecté avec le traceur NC-AF750. L'absence de fluorescence est également constatée avec les deux traceurs, RA63-AF680 et NC-AF750 dans le cerveau de la souris contrôle.
En conclusion, l'anticorps RA63 peut être utilisé comme traceur (RA63- AF680), pour diagnostiquer la présence de cellules tumorales de glioblastome (Gli-7) pour des applications d'imagerie.
V. Clonage moléculaire.
Le clonage des transcrits nucléiques codant la chaîne lourde et la chaîne légère du Rendomab-A63, a été réalisé à l'aide des kits: « Gene-Elute/ARN totaux » (Sigma) et « RACE-PCR » (Invitrogen). Les séquences nucléiques et déduites en acides aminés des domaines variables de la chaîne légère (VL) et de la chaîne lourde (VH) du Rendomab-A63 sont présentées à la Figure 8.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims

REVENDICATIONS
1) Anticorps dirigé contre le sous-type A des récepteurs aux endothélines présentant :
i) au moins une région variable de chaîne légère dont la séquence en acides aminés :
- du CDRIL présente au moins 60% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : SQSIVYSNGKIYL (SEQ ID NO: 2) ;
- du CDR2L présente au moins 60% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : KVS ;
- du CDR3L présente au moins 60% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : FQGSHLPLT (SEQ. ID NO: 4) ; et
ii) au moins une région variable de chaîne lourde dont la séquence en acides aminés :
- du CDRIH présente au moins 60% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : GFTFNIYA (SEQ ID NO: 6) ;
- du CDR2H présente au moins 60% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : IRSKSNNYAT (SEQ ID NO: 8) ;
- du CDR3H présente au moins 60% d'identité avec la séquence en acides aminés suivante : VSSYYSGSFFAY (SEQ ID NO: 10),
un fragment ou un dérivé de celui-ci.
2) Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend au moins une région variable de chaîne légère dont la séquence en acides aminés :
- du CDRIL est SQSIVYSNGKIYL (SEQ ID NO: 2) ;
- du CDR2L est KVS ; et
- du CDR3L est FQGSHLPLT (SEQ ID NO: 4). 3) Anticorps selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend au moins une région variable de chaîne légère dont la séquence en acides aminés présente au moins 60% d'identité avec la séquence suivante :
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVYSNGKIYLEWYLQKPGQSPKLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHLPLTFGAGTKLELKR (SEQ I D NO: 12).
4) Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend au moins une région variable de chaîne lourde dont la séquence en acides aminés :
- du CDRIH est GFTFN IYA (SEQ ID NO: 6) ;
- du CDR2H est IRSKSN NYAT (SEQ ID NO: 8) ; et
- du CDR3H est VSSYYSGSFFAY (SEQ I D NO: 10).
5) Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend au moins une région variable de chaîne lourde dont la séquence en acides aminés présente au moins 60% d'identité avec la séquence suivante :
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNIYAM NWIRQAPGKGLEWIARIRSK SNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMVYLQM NNLKTEDTAMYYCVSSYYSGSFFAYWGQGTLVTV SA (SEQ I D NO: 14).
6) Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit anticorps est une immunoglobuline de type lgG2b/kappa.
7) Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit anticorps est monoclonal.
8) Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit anticorps est l'anticorps murin monoclonal obtenu à partir de l'hybridome déposé à la CNCM le 18 octobre 2017 sous le numéro CNCM 1-5250. 9) Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit anticorps est un anticorps chimérisé.
10) Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit anticorps est un anticorps humanisé.
11) Hybridome déposé à la CNCM le 18 octobre 2017 sous le numéro
CNCM 1-5250.
12) Polynucléotide isolé choisi parmi les différents polynucléotides ci- après :
a) un polynucléotide codant un anticorps tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10 ;
b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide tel que défini au point (a) ;
g) un polynucléotide d'au moins 18 nucléotides, capable de s'hybrider dans des conditions de forte stringence aux polynucléotides tels que définis aux points (a) et (b).
13) Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant au moins un polynucléotide selon la revendication 12.
14) Organisme hôte transformé par ou comprenant un polynucléotide selon la revendication 12 ou un vecteur selon la revendication 13.
15) Composé comprenant un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 conjugué avec un élément choisi dans le groupe constitué par un groupement cytotoxique, un groupement facilement détectable, ou un groupement effecteur. 16) Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, polynucléotide selon la revendication 12 ou composé selon la revendication 15 pour utilisation comme médicament.
17) Composition pharmaceutique comprenant, en tant que principe actif, un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, un polynucléotide selon la revendication 12 ou un composé selon la revendication 15 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
18) Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, polynucléotide selon la revendication 12, composé selon la revendication 15 ou composition pharmaceutique selon la revendication 17, pour utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'un trouble ou d'une pathologie impliquant un dysfonctionnement, direct ou en association avec une autre voie physiologique, de l'axe comprenant une endothéline et au moins un de ses récepteurs tel que, notamment, le sous-type A des récepteurs aux endothélines.
19) Anticorps, polynucléotide, composé ou composition pharmaceutique pour utilisation selon la revendication 18, caractérisé en ce que ledit trouble ou ladite pathologie est un cancer.
20) Procédé pour diagnostiquer un cancer tel qu'un glioblastome in vitro comprenant les étapes consistant à :
ai') mettre en contact un échantillon biologique prélevé chez un sujet avec un composé selon la revendication 15 ;
bi') détecter le signal émis par le groupement facilement détectable et ci') déterminer la présence ou l'absence d'un cancer chez ledit sujet sur la base du signal détecté à l'étape (bi') éventuellement comparé à un signal contrôle.
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