WO2019201830A1 - Procede d'obtention d'un hydrolysat peptidique a partir de proteines de sang d'animaux, et hydrolysat peptidique ainsi obtenu - Google Patents

Procede d'obtention d'un hydrolysat peptidique a partir de proteines de sang d'animaux, et hydrolysat peptidique ainsi obtenu Download PDF

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Pascal Dhulster
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products

Definitions

  • the present invention relates to a process for obtaining a peptide hydrolyzate from slaughterhouse blood proteins and a peptide hydrolyzate obtained by such a process.
  • peptide hydrolysates derived from hemoglobin have been demonstrated. These include opioid, antihypertensive, analgesic, bradykinin potentiating, hematopoietic, coronary-constrictor, bacterial growth stimulating, lipid-lowering activities (Nedjar-Arroume, et al., 2008. Peptides, 29, 969-977).
  • peptide hydrolysates derived from blood could potentially be used in many fields, for example in the food, as a preservative, or therapeutic or nutraceutical, as an alternative to antibiotics, especially in animal nutrition, but also as active substances intended to destroy, repel or render harmless the pests, to prevent their action or to combat them in agriculture.
  • the nucleic acids likely to be obtained from poultry blood can find applications in pharmacy, in cosmetics, in nutrition and in the field of diagnostics.
  • the methods for obtaining peptide blood hydrolysates of the state of the art involve, after blood collection, a separation step of the plasma and the cruor.
  • the cruor which is almost exclusively composed of hemoglobin, is preserved and the hemoglobin it contains is then subjected to enzymatic digestion using an enzyme, for example porcine pepsin.
  • Some methods of the state of the art also propose to extract hemoglobin from red blood cells by hemolysis. After enzymatic digestion, a fraction enriched in peptides is obtained. At the end of this process, the peptide fraction obtained has a coloration identical to that of the cruor.
  • the solutions or products obtained from the blood are strongly colored by the heme carried by the hemoglobin.
  • the presence of colored compounds is undesirable and incompatible with the applications of the peptide hydrolysates envisaged, in particular when it is envisaged to use them as preservatives or to destine them to food or therapy.
  • the iron contained in Theme activates the oxidation of food in the formulations.
  • the presence of the molecules responsible for this coloration gives an undesirable taste and odor.
  • an object of the present invention is to provide a standardized and controlled process for obtaining a peptide hydrolyzate from blood, which is eco-responsible, ecological and economic, so as to maximize the value of blood, and thanks to which the peptide hydrolysates obtained are both functional in terms of biological activities, such as those mentioned above, and directly usable in any kind of industry, or for any food, agri-food, agricultural, therapeutic or nutraceutical application, and which to do this, does not present staining phenomena.
  • the invention relates to a process for obtaining a peptide hydrolyzate from animal blood, comprising obtaining blood, adding an anticoagulant, an enzymatic hydrolysis reaction, stopping the hydrolysis reaction, the decolorization of the hydrolysis product and the separation of the hydrolysis product into a fraction containing a peptide hydrolyzate and a fraction containing the subject.
  • the process according to the invention is characterized in that the whole blood obtained is introduced into a reactor inside which all of the enzymatic hydrolysis and decolorization reactions are carried out, at ambient temperature, the enzymatic hydrolysis reaction.
  • the method according to the invention meets the expected objectives.
  • peptide hydrolyzate resulting from proteins of blood having a constant composition in peptides, devoid of heme or residues of heme susceptible of give it a color.
  • the peptides have biological activities, in particular opioids, antihypertensives, analgesics, potentiators of bradykinin, hematopoietic, coronaromotive, bacterial growth stimulation, lipid-lowering, such as those described in the state of the art.
  • the method is carried out on whole blood, as collected in slaughterhouses, that is to say without separation of plasma and cruor, or extraction of hemoglobin by hemolysis of red blood cells.
  • This characteristic of the process contributes to the eco-responsibility characteristic since it uses the totality of the raw material. It makes it possible to obtain a hydrolyzate enriched with peptides not only derived from hemoglobin but also from plasma proteins.
  • anticoagulant such as citrate or sodium phosphate, makes this raw material homogeneous and also prevents the loss of material by coagulation phenomena.
  • the enzymatic hydrolysis step is carried out at ambient temperature at an acidic pH, preferably between 3 and 4, so as to preserve the homogeneous medium, without precipitation of the heme, with complete hydrolysis of the proteins and chains. alpha and beta hemoglobin without loss of peptides.
  • Stopping the hydrolysis is done in an alkaline medium by adding base to a basic pH, preferably between 8.5 and 10, in order to irreversibly inactivate the enzyme and to maintain a homogeneous medium.
  • the bleaching step does not involve organic solvents, membranes, adsorbents, bleaches, high pressure treatments, or other complex intermediate step that can reduce the yield of peptides.
  • This step is carried out in a simple and effective manner, by lowering the pH to an acidic value, preferably between 4 and 5. During this step, 100% of the theme is precipitated and all the peptides obtained at the end of the hydrolysis is preserved.
  • the separation of the products of the hydrolysis is carried out by a physical separation method of the type known to those skilled in the art.
  • the peptide hydrolyzate fraction obtained at the end of the process contains more than 99.9% peptides and less than 0.1% heme.
  • the fraction enriched in peptides is directly recoverable. It can be advantageously neutralized, demineralised, concentrated, dried at low temperature and / or lyophilized if necessary.
  • the whole blood is blood of porcine, bovine, ovine, equine, rabbit or avian origin, poultry, or a mixture, preferably bovine or porcine blood.
  • this mixture is for example composed of 70% of bovine blood and 30% of pig blood.
  • the enzyme used during the enzymatic hydrolysis step is an active proteolytic enzyme at acidic pH, preferably porcine pepsin.
  • porcine pepsin EC 3.4.23.1 (classification according to the Enzyme Commission).
  • the enzymatic hydrolysis reaction is carried out according to an enzyme / substrate ratio (E / S) of between 1/10 and 1/1000.
  • the method comprises, prior to the enzymatic hydrolysis, a blood dilution step, so as to obtain a solution which contains between 1 and 12% by weight of hemoglobin.
  • this dilution is carried out using water.
  • the pH adjustments to acid values are carried out using hydrochloric acid, phosphoric acid or sulfuric acid mixture.
  • the adjustment of the pH to a basic value is, for its part, carried out using hydroxide or sodium carbonate, calcium hydroxide, ammonium hydroxide or a mixture of said compounds.
  • the method is carried out on blood rich in nucleic acids such as poultry blood and comprises, after stopping the hydrolysis reaction and before the bleaching of the hydrolysis product, a step of separating the nucleic acids from the remainder of the hydrolysis product and recovering this fraction.
  • the separation of the nucleic acids from the rest of the product of the hydrolysis is carried out by a physical separation method of the type known to those skilled in the art, for example by centrifugation.
  • the fraction obtained at the end of the process contains more than 93% of nucleic acids.
  • the invention also relates to a peptide hydrolyzate such as that obtained from the process described above.
  • a peptide hydrolyzate has the following characteristics:
  • the molecular profile is standardized and the composition of the peptides is constant.
  • peptides with opioid, antihypertensive, analgesic, bradykinin potentiating, hematopoietic, hypolipidemic or coronary-constricting activities are identified.
  • hydrolyzate is produced from whole blood, peptides derived from plasma proteins are advantageously obtained.
  • the invention also relates to the use of a peptide hydrolyzate obtained by means of a process according to the invention as a natural antimicrobial agent and / or an antioxidant, in particular as a food preservative such as that meat products, in particular intended for animals, as a nutritional supplement for animals, to strengthen the animal's immune defenses, to fight against stress and / or to improve the calm and well-being of animals, to regulate the food intake of animals, animals, the animals preferably being pets or livestock, and more preferably dogs or cats.
  • a natural antimicrobial agent and / or an antioxidant in particular as a food preservative such as that meat products, in particular intended for animals, as a nutritional supplement for animals, to strengthen the animal's immune defenses, to fight against stress and / or to improve the calm and well-being of animals, to regulate the food intake of animals, animals, the animals preferably being pets or livestock, and more preferably dogs or cats.
  • the invention also relates to a nucleic acid fraction obtainable by a method as defined above, from poultry blood, the fraction comprising at least 93% of nucleic acids, by weight.
  • the starting material is a mixture of whole blood 70% bovine 30% porcine, recovered from slaughterhouse. To this blood is added sodium citrate (concentration 10% by mass) as anticoagulant from the harvest in slaughterhouse to maintain a homogeneous medium and without loss of raw material. The blood is then introduced into a reactor. The whole is kept at 4 ° C. This step makes it possible to inhibit the growth of contaminants such as bacteria.
  • the hemoglobin concentration is determined and then adjusted to 10% by adding water on the day of the implementation of the process.
  • the solution is brought to ambient temperature (23 ° C.) and the pH is adjusted to 4 by the addition of phosphoric acid diluted to 1 ⁇ 4 volume.
  • phosphoric acid diluted to 1 ⁇ 4 volume.
  • 44000 AU of pepsin per g of hemoglobin are diluted in 0.2 M phosphate buffer at pH 3 and then added to 1 liter of the 70% bovine blood mixture. 30% pig, diluted to 10% hemoglobin.
  • the pH of the reactor is lowered to a value of 3 by adding phosph-volumic phosphoric acid without precipitation of the heme and in a homogeneous medium.
  • the mixture is stirred for 24 hours at 23 ° C.
  • Stopping the hydrolysis is carried out by adding a solution of 30% NaOH to a pH of 9 in the same reactor.
  • the peptide hydrolyzate obtained is homogeneous.
  • Discoloration of the product of the hydrolysis is then carried out by lowering the pH to 4 by adding or-volumic phosphoric acid.
  • the separation of the heme is carried out by centrifugation for 10 minutes at 5000 g.
  • the supernatant containing the recovered peptide hydrolyzate is decolorized. 100% of Theme is recovered in the pellet.
  • the supernatant is dried by lyophilization or atomization.
  • the peptide hydrolyzate obtained was analyzed by mass spectrometry so as to verify and validate the presence of peptides derived from hemoglobin and whose biological activities have been characterized.
  • Bibliographic references describing the known biological activities of each of these peptides are shown in Tables 1 to 8 below.
  • the starting material is poultry blood, recovered in slaughterhouse. It is immediately added at a level of 10% by weight of a solution of sodium citrate at 10% (weight / volume) as anticoagulant. The blood is then introduced into a reactor. The blood is kept at 4 ° C. with stirring.
  • the blood is diluted to a hemoglobin concentration of 10% (w / v) in the enzyme reactor.
  • the solution is brought to ambient temperature (23 ° C.) and the pH is adjusted to 3 by addition of dilute phosphoric acid (2M).
  • the enzyme a porcine pepsin, dissolved beforehand in a buffer of phosphoric acid and sodium hydrogen phosphate (0.1 M) at pH 3, is introduced into the reactor at an enzyme / substrate ratio of 1: 1. 50 (mole / mole).
  • the total duration of the hydrolysis is 24 hours from the introduction of the enzyme. It is carried out with constant stirring and thermostat.
  • the decolorization of the peptide hydrolyzate is carried out by lowering the pH to a value of 4 by adding dilute phosphoric acid (2 M).
  • Separation of the discolored hydrolyzate and the heme fraction is carried out by centrifugation (4000 g, 15 min).
  • the supernatant contains the discolored peptide hydrolyzate, that is to say without heme (at least 99% of peptides (weight)).
  • the pellet represents the fraction enriched in heme (at least 99% heme (weight)).
  • Adje E. Y., Balti, R., Kouach, M., Dhulster, P., Guillochon, D. & Nedjar-Arroume,
  • Barkhudaryan N.A., Oberthuer, W., Lottspeich, F. & Galoyan, A. (1992). "Structure of hypothalamic coronary-constrictory peptide factors”. Neurochemical Research, 17, 1217-1221.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'obtention d'un hydrolysat peptidique, à partir de protéines de sang issu d'abattoirs, ainsi qu'un hydrolysat peptidique obtenu par un tel procédé. A cet effet, le procédé comprend l'obtention du sang, l'ajout d'un anticoagulant, une réaction d'hydrolyse enzymatique, l'arrët de la réaction d'hydrolyse, la décoloration du produit d'hydrolyse et la séparation du produit d'hydrolyse en une fraction contenant un hydrolysat peptidique et une fraction contenant de l'hême, caractérisé en ce que le sang entier obtenu est introduit dans un réacteur à l'intérieur duquel l'ensemble des réactions d'hydrolyse enzymatique et de décoloration sont réalisées, à température ambiante, la réaction d'hydrolyse enzymatique étant réalisée sur le sang entier par l'ajout d'enzyme et l'ajustement du pH à une valeur acide inférieure à 4 pendant un temps de réaction s'étendant jusqu'à 48h, puis arrëtée par élévation du p H jusqu'à une valeur basique supérieure à 8,5, la décoloration du produit de l'hydrolyse étant ensuite réalisée par abaissement du pH jusqu'à une valeur acide inférieure à 5, puis les constituants du produit de l'hydrolyse étant séparés en une fraction décolorée contenant des peptides et une fraction contenant des résidus d'hême.

Description

PROCEDE D’OBTENTION D’UN HYDROLYSAT PEPTIDIQUE A PARTIR DE PROTEINES DE SANG D’ANIMAUX, ET HYDROLYSAT
PEPTIDIQUE AINSI OBTENU
La présente invention concerne un procédé d’obtention d’un hydrolysat peptidique, à partir de protéines de sang issu d’abattoirs, ainsi qu’un hydrolysat peptidique obtenu par un tel procédé.
La production de viande issue des abattoirs produit annuellement une grande quantité de co-produits, des déchets susceptibles d’engendrer des problèmes environnementaux et économiques. Dans ce contexte, la question de la valorisation de ces co-produits s’est développée. Ces co-produits contiennent, en effet, de la matière valorisable, telle que le sang. Le sang, composé de plasma, de globules blancs, de globules rouges et de plaquettes, est très riche en protéines, notamment en hémoglobine. De plus chez certaines espèces telle que la volaille, le sang est également une source d’acides nucléiques. En effet, dans le sang de volaille, contrairement au sang de mammifères, les érythrocytes possèdent un noyau renfermant l’information génétique sous forme d’acides nucléiques.
On sait aujourd’hui que les solutions riches en protéines, d’origine végétale ou animale, présentent de hautes valeurs biologiques. De nombreuses études ont ainsi été menées sur les activités biologiques d’hydrolysats de protéines issues de différentes sources, notamment d’hémoglobine.
Des études ont ainsi démontré que des peptides obtenus après hydrolyse enzymatique d’hémoglobine bovine présentaient une activité antimicrobienne (Nedjar- Arroume et al. ; Peptides, Volume 29, June 2008; pages 969-77). De telles propriétés sont tout à fait intéressantes et démontrent que ces hydrolysats peuvent être utilisés en tant que conservateurs, en particulier pour la conservation de produits périssables, par exemple des aliments. C’est notamment le cas du peptide al37-l4l, la néokyotorphine, obtenue à partir d’hémoglobine, dont les propriétés antimicrobiennes et antioxydantes utiles dans la conservation de la viande ont été validées (Rémi Przybylski, et al., Production of an antimicrobial peptide derived from slaughterhouse by-product and its potential application on méat as preservative, Food Chemistry, Volume 211, 15 November 2016, Pages 306-313).
D’autres propriétés tout à fait intéressantes des hydrolysats peptidiques issus de l’hémoglobine ont été par ailleurs démontrées. On citera notamment des activités opioïdes, antihypertensives, analgésiques, potentialisatrices de la bradykinine, hématopoïétiques, coronaro-constrictrices, de stimulation de la croissance bactérienne, hypolipidémiantes (Nedjar-Arroume, et al.. 2008. Peptides, 29, 969-977)
(Barkhudaryan, et al. 1993. FEBS Letters, 329, 215-218.) (Ivanov, V. T., et al. 1992. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 1271-1311.) (Kagawa, K., et al. Life Sciences, 58, 1745-1755.) (Nyberg, F., et al. (1997). Biopolymers, 43, 147-156.) (Piot, J. M., et al. 1992. FEBS Letters, 299, 75-79.) (Takagi, H., et al. 1982. Life Sciences, 31, 1733-1736.) (Zhao, Q., et al. l996a. Applied Microbiology and Biotechnology, 45(6), 778-784.) (Zhao, Q. Y. et al. l997b. Neuropeptides, 2, 147-153.).
Ainsi, de par leur propriétés biologiques, telles qu’antimicrobiennes, les hydrolysats peptidiques issus du sang pourraient potentiellement être utilisés dans de nombreux domaines, par exemple dans les domaines de l’alimentaire, en tant que conservateurs, ou de la thérapeutique ou nutraceutique, en tant qu’alternatives aux antibiotiques, notamment en nutrition animale, mais encore en tant que substances actives destinées à détruire, repousser ou rendre inoffensifs les organismes nuisibles, à en prévenir l'action ou à les combattre dans l’agriculture.
Les acides nucléiques susceptibles d’être obtenus de sang de volailles, peuvent trouver des applications en pharmacie, en cosmétique, en nutrition et dans le domaine des diagnostics.
Cependant, si l’intérêt de récupérer et de valoriser le sang issu des abattoirs, de manière à en obtenir des composés à activité biologique, tels que les hydrolysats peptidiques, une fraction héminique et/ou des acides nucléiques, est admis, il demeure encore le besoin de proposer des procédés de valorisation écologiques et économiques. En effet, un principe essentiel à respecter est que la valorisation des co-produits d’abattoirs ne doit pas être contrebalancée par des méthodes consommatrices d’énergie, peu économiques, ou qui nécessitent l’utilisation de matières ou de produits toxiques ou polluants. En outre, les hydrolysats peptidiques obtenus se doivent d’être efficaces sur le plan de leurs activités biologiques, et aptes à être utilisés sans générer aucune problématique.
Or, l’ensemble de ces objectifs n’est pas réalisé dans l’état de la technique. Les procédés d’obtention d’hydrolysats peptidiques de sang de l’état de la technique font intervenir, après la collecte de sang, une étape de séparation du plasma et du cruor. Le cruor, qui se trouve presque exclusivement composé d’hémoglobine, est conservé et l’hémoglobine qu’il contient est ensuite soumise à une digestion enzymatique à l’aide d’une enzyme, par exemple la pepsine porcine. Certains procédés de l’état de la technique proposent en outre d’extraire l’hémoglobine des globules rouges par hémolyse. Après digestion enzymatique, une fraction enrichie en peptides est obtenue. A l’issue de ce procédé, la fraction peptidique obtenue présente une coloration identique à celle du cruor. En effet, les solutions ou produits obtenus à partir du sang sont fortement colorés par l’hème portée par l’hémoglobine. Or, la présence de composés colorés est indésirable et incompatible avec les applications des hydrolysats peptidiques envisagées, en particulier lorsqu’il est envisagé de les utiliser en tant que conservateurs ou de les destiner à l’alimentation ou la thérapeutique. En effet le fer contenu dans Thème active l’oxydation des aliments dans les formulations. De plus, on note que la présence des molécules responsables de cette coloration confère un goût et une odeur indésirables.
Pour obtenir des hydrolysats peptidiques issus d’hémoglobine ne présentant pas de phénomènes de coloration, il est nécessaire de rompre la liaison entre les molécules d’hème et la globine ou les peptides. Toutefois, cette liaison est forte. Pour y parvenir, il a été proposé dans l’état de la technique différentes méthodes, telles que l’utilisation de traitements à hautes pressions hydrostatiques (Toldrà et al. 2011), l’utilisation de solvants (Ontiveros et al., 2014 ; Adje et al., 2011 ; Froidevaux et al., 2006), Tutilisation de procédés membranaires (Lebrun et al. 1998 ; Dhulster et al. 2002) ou encore Tutilisation d’agents absorbants (Autio et al., 1984 ; demande de brevet n° EP 0159231 Al (Piot et al. 1985) ; LEE et al., 1990). D’autres méthodes utilisant des agents blanchissants, tels que de l’eau oxygénée ou des alcools, tels que de l’éthanol, ont été également proposées.
Pour obtenir une fraction enrichie en acides nucléiques, les techniques identifiées dans l’état de l’art utilisent des détergents ou des alcools nécessitant des étapes lourdes de purification et de traitement et un nombre important d’étapes. Ces étapes sont destructrices pour le sang total : mis à part les acides nucléiques, rien d’autre ne peut être récupéré. Il ne peut donc pas y avoir de possibilité de produire un hydrolysat peptidique ou une fraction enrichie en hème. Pour l’ensemble de ces méthodes, on relève un grand nombre d’inconvénients, notamment l’utilisation de produits peu écologiques, voire toxiques, nécessitant la mise en place de solutions de recyclage, des étapes souvent complexes à l’aide d’appareils coûteux, l’augmentation du coût du procédé, une efficacité de décoloration non satisfaisante, l’apparition de produits secondaires indésirables, l’obtention de caractéristiques gustatives, olfactives ou visuelles peu satisfaisantes des hydrolysats ainsi décolorés.
C’est dans ce contexte qu’a travaillé la société déposante de manière à proposer un procédé d’obtention d’un hydrolysat peptidique à partir de sang, qui ne présente pas les inconvénients précités des procédés connus et utilisés à ce jour.
Ainsi, un but de la présente invention est de proposer un procédé standardisé et contrôlé d’obtention d’un hydrolysat peptidique à partir de sang, qui soit éco- responsable, écologique et économique, de manière à rendre maximale la valorisation du sang, et grâce auquel les hydrolysats peptidiques obtenus sont à la fois fonctionnels sur le plan des activités biologiques, telles que celles mentionnées précédemment, et directement utilisables dans tout genre d’industrie, ou pour toute application alimentaire, agroalimentaire, agricole, thérapeutique ou nutraceutique, et qui pour ce faire, ne présente pas de phénomènes de coloration.
A cet effet, l’invention concerne un procédé d’obtention d’un hydrolysat peptidique à partir de sang animal, comprenant l’obtention du sang, l’ajout d’un anticoagulant, une réaction d’hydrolyse enzymatique, l’arrêt de la réaction d’hydrolyse, la décoloration du produit d’hydrolyse et la séparation du produit d’hydrolyse en une fraction contenant un hydrolysat peptidique et une fraction contenant de Thème. Le procédé selon l’invention se caractérise en ce que le sang entier obtenu est introduit dans un réacteur à l’intérieur duquel l’ensemble des réactions d'hydrolyse enzymatique et de décoloration sont réalisées, à température ambiante, la réaction d’hydrolyse enzymatique étant réalisée sur le sang entier par l’ajout d’enzyme et l’ajustement du pH à une valeur acide inférieure à 4 pendant un temps de réaction s’étendant jusqu’à 48h, puis arrêtée par élévation du pH jusqu’à une valeur basique supérieure à 8,5, la décoloration du produit de l’hydrolyse étant ensuite réalisée par abaissement du pH jusqu’à une valeur acide inférieure à 5, puis les constituants du produit de l’hydrolyse étant séparés en une fraction décolorée contenant des peptides et une fraction contenant Thème. Le procédé selon l’invention répond aux objectifs attendus. Il permet de manière éco-responsable, écologique et économique, de valoriser des co-produits d’abattoirs en obtenant un hydrolysat peptidique issu de protéines de sang présentant une composition constante en peptides, dépourvu d’hème ou de résidus d’hème susceptibles de lui conférer une couleur. En outre, les peptides présentent des activités biologiques, notamment opioïdes, antihypertensives, analgésiques, potentialisatrices de la bradykinine, hématopoïétiques, coronaro-constructrices, de stimulation de la croissance bactérienne, hypolipidémiantes, telles que celles décrites dans l’état de la technique.
Le procédé est mis en œuvre sur du sang entier, tel que collecté dans les abattoirs, c’est-à-dire sans séparation du plasma et du cruor, ni extraction d’hémoglobine par hémolyse des globules rouges. Cette caractéristique du procédé participe à la caractéristique d’éco-responsabilité puisqu’il utilise la totalité de la matière première. Elle permet d’obtenir un hydrolysat enrichi en peptides non seulement issus d’hémoglobine mais également issus de protéines du plasma. De plus, l’ajout d’anticoagulant au sang entier, tel que le citrate ou le phosphate de sodium, rend cette matière première homogène et évite également la perte de matière par phénomènes de coagulation.
L’ensemble des étapes du procédé se déroule à température ambiante, c’est-à- dire entre 15 et 25°C, plus généralement à 23°C. Le seul facteur dont dépendent les étapes d’hydrolyse enzymatique, d’arrêt de l’hydrolyse et de décoloration, est le pH. Il convient en effet de noter que dans les procédés de l’état de la technique, l’étape d’hydrolyse enzymatique est au contraire menée à une température proche de 37°C. Le respect de la température ambiante est avantageux en termes de réduction de la consommation d’ énergie .
Ainsi, l’étape d’hydrolyse enzymatique est conduite à température ambiante à un pH acide, préférentiellement compris entre 3 et 4, de manière à conserver le milieu homogène, sans précipitation de l’hème, avec une hydrolyse totale des protéines et des chaînes alpha et bêta de l’hémoglobine sans perte de peptides.
L’arrêt de l’hydrolyse se fait en milieu alcalin par ajout de base jusqu’à un pH basique, préférentiellement compris entre 8,5 et 10, afin d’inactiver irréversiblement l’enzyme et de conserver un milieu homogène.
L’étape de décoloration ne fait intervenir ni solvants organiques, ni membranes, ni agents adsorbants, ni décolorants, ni traitements haute pression, ni autre étape intermédiaire complexe susceptible de diminuer le rendement d’obtention des peptides. Cette étape est réalisée de manière simple et efficace, par abaissement du pH à une valeur acide, préférentiellement comprise entre 4 et 5. Lors de cette étape, 100% de Thème est précipitée et la totalité des peptides obtenus à l’issue de l’hydrolyse est conservée.
II convient de noter que les étapes d’hydrolyse enzymatique, d’arrêt de l’hydrolyse et de décoloration, sont réalisées au sein d’un même réacteur de manière à rendre le procédé simple, sans perte de matière, et d’économiser le temps.
La séparation des produits de l’hydrolyse est réalisée par une méthode de séparation physique du type de celles connues de l’homme du métier. La fraction d’hydrolysat peptidique obtenue à l’issue du procédé contient plus de 99,9 % de peptides et moins de 0,1 % d’hème.
La fraction enrichie en peptides est directement valorisable. Elle peut être avantageusement neutralisée, déminéralisée, concentrée, séchée à basse température et/ou lyophilisée si nécessaire.
Selon une caractéristique de l’invention, le sang entier est du sang d’origine porcine, bovine, ovine, équine, lapine ou aviaire, de volailles, ou un mélange, préférentiellement du sang bovin ou porcin.
Lorsqu’il s’agit d’un mélange de sang de différents animaux, ce mélange est par exemple composé de 70 % de sang de bovin et de 30% de sang de porcin.
Avantageusement, l’enzyme utilisée lors de l’étape d’hydrolyse enzymatique est une enzyme protéolytique active à pH acide, de préférence de la pepsine porcine.
De manière préférée, il s’agira d’une pepsine porcine EC 3.4.23.1 (classification selon la Commission des Enzymes).
Avantageusement, la réaction d’hydrolyse enzymatique est réalisée selon un ratio enzyme/substrat (E/S) compris entre 1/10 et 1/1000.
Selon certains modes de réalisation, le procédé comporte, préalablement à l’hydrolyse enzymatique, une étape de dilution du sang, de manière à obtenir une solution qui contient entre 1 et 12 %, en poids, d’hémoglobine.
Avantageusement, cette dilution est réalisée à l’aide d’eau.
Avantageusement encore, dans le procédé selon l’invention, les ajustements du pH à des valeurs acides sont réalisés à l’aide d’acide chlorhydrique, d’acide phosphorique d’acide sulfurique ou d’un mélange. L’ajustement du pH à une valeur basique est, quant à lui, réalisé à l’aide d’hydroxyde ou de carbonate de sodium, d’hydroxyde de calcium, d’hydroxyde d’ammonium ou d’un mélange desdits composés.
Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, le procédé est réalisé sur du sang riche en acides nucléiques comme le sang de volaille et comprend, après l’arrêt de la réaction d’hydrolyse et avant la décoloration du produit d’hydrolyse, une étape de séparation des acides nucléiques du reste du produit d’hydrolyse et la récupération de cette fraction.
La séparation des acides nucléiques du reste du produit de l’hydrolyse est réalisée par une méthode de séparation physique du type de celles connues de l’homme du métier, par exemple, par centrifugation. La fraction obtenue à l’issue du procédé contient plus de 93 % d’acides nucléiques.
L’invention concerne encore un hydrolysat peptidique tel que celui obtenu à l’issu du procédé décrit précédemment. Un tel hydrolysat peptidique présente les caractéristiques suivantes :
- absence de protéines non hydrolysées,
- absence de résidus d’hème,
- 100% de peptides présentant un poids moléculaire inférieur à 10 000 Da.
Le profil moléculaire est standardisé et la composition des peptides est constante. Parmi ces peptides, sont identifiés des peptides à activités opioïdes, antihypertensives, analgésiques, potentialisatrices de la bradykinine, hématopoïétiques, hypolipidémiantes ou coronaro-constrictrices.
L’absence de protéines non hydrolysées permet de limiter, voire de supprimer, les éventuels phénomènes d’allergies lorsque l’hydrolysat selon l’invention est destiné à l’alimentation humaine ou animale.
L’hydrolysat étant produit à partir de sang entier, des peptides issus de protéines du plasma sont avantageusement obtenus.
L’invention concerne encore l’utilisation d’un hydrolysat peptidique obtenu à l’aide d’un procédé selon l’invention à titre d’agent antimicrobien naturel et/ou d’antioxydant, en particulier à titre de conservateur d’aliments tels que les produits carnés, notamment destinés aux animaux, à titre de supplément nutritionnel destiné aux animaux, pour renforcer les défenses immunitaires des animaux, lutter contre le stress et/ou améliorer le calme et le bien-être des animaux, réguler la prise alimentaire des animaux, les animaux étant de préférence des animaux de compagnie ou d’élevage, et de préférence encore des chiens ou des chats.
Enfin, l’invention concerne encore une fraction d’acides nucléiques susceptible d’être obtenu par un procédé tel que défini précédemment, à partir de sang de volaille, la fraction comprenant au moins 93 % d’acides nucléiques, en poids.
Les caractéristiques de l’invention mentionnées ci-dessus, ainsi que d’autres, apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante d’un de ses modes de réalisation.
Exemple 1 :
Le produit de départ est un mélange de sang entier 70% bovin 30% porcin, récupéré d’abattoir. A ce sang est ajouté du citrate de sodium (concentration 10% en masse) en tant qu’anticoagulant dès la récolte en abattoir pour conserver un milieu homogène et sans perte de matière première. Le sang est ensuite introduit dans un réacteur. L’ensemble est conservé à 4°C. Cette étape permet d’inhiber la croissance de contaminants tels que des bactéries.
La concentration en hémoglobine est dosée puis ajustée à 10% massique par ajout d’eau le jour de la mise en œuvre du procédé.
La solution est amenée à température ambiante (23 °C) et le pH est ajusté à 4 par l’ajout d’acide phosphorique dilué à ¼ volumique. Pour un rapport enzyme substrat de 1/50 (mole/mole), 44000 UA de pepsine par g d’hémoglobine sont dilués dans un tampon phosphate 0,2 M à pH 3 puis ajoutés à 1 litre du mélange de sang 70% bovin- 30% porcin, dilué à 10% en hémoglobine. Le pH du réacteur est abaissé à une valeur de 3 par ajout d’acide phosphorique ¼ volumique sans précipitation de l’hème et en milieu homogène.
L’ensemble est maintenu 24 heures sous agitation à 23°C.
L’arrêt de l’hydrolyse est réalisé par ajout d’une solution de NaOH à 30% jusqu’à un pH de 9 au sein du même réacteur. L’hydrolysat peptidique obtenu est homogène.
La décoloration du produit de l’hydrolyse est ensuite effectuée par abaissement du pH à 4 par ajout d’acide phosphorique ¼ volumique.
La séparation de l’hème est réalisée par centrifugation durant 10 minutes à 5000 g. Le surnageant contenant l’hydrolysat peptidique récupéré est décoloré. 100% de Thème est récupéré dans le culot. Le séchage du surnageant est réalisé par lyophilisation ou atomisation.
L’hydrolysat peptidique obtenu a été analysé par spectrométrie de masse de manière à vérifier et valider la présence de peptides issus de l’hémoglobine et dont les activités biologiques ont été caractérisées. Les références bibliographiques décrivant les activités biologiques connues de chacun de ces peptides sont indiquées dans les Tableaux 1 à 8 ci-dessous.
Tableau 1 : Peptides antimicrobiens
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
Tableau 2 : Peptides opioïdes
Position Séquence Références
(X137-141 TSKYR Takagi et al. (1982) al37-140 TSKY Blishchenko et al. (1996) al37-139 TSK Orts et al. (1978) al40-141 YR Fukui et al. (1983) b31 -40 LVVYPWTQRF Piot et al. (1992) b32-40 VVYPWTQRF Piot et al. (1992) b31 -39 LVVYPWTQR Glamsta et al. (1991) b32-39 VVYPWTQR Nyberg et al. (1997) b34-39 YPWTQR Nyberg et al. (1997) b31 -38 LVVYPWTQ Zhao et al. (1997b) b32-38 VVYPWTQ Zhao et al. (1997b) b34-38 YPWTQ Brantl et al. (1986) b31 -37 LVVYPWT Lignot et al. (1999) b32-37 VVYPWT Lignot et al. (1999) b34-37 YPWT Brantl et al. (1986)
Tableau 3 : Peptides antihypertenseurs
Position Séquence Références
TKAVEHLDDLPGALSELSDL- a67T06
HAHKLRVDPVNFKLLSHSLL LDDLPGALSELSDLHAHKL—
a73-105 Adje et al. (201 lb) — RVDPVNFKLLSHSL
a99-105 KLLSHSL
al00-105 LLSHSL
Tableau 4 : Peptide analgésique et potentialisateur de la bradykinine
Position Séquence Références a 110-125 ASHLPSDFTPAVHASL Zhao et al., 1996 al29-134 LANVST Piot et al. (1992) b 129-134 QKVVAG Piot et al., 1992 Tableau 5 : Peptides hématopoïétiques
Position Séquence Références
al-8 VLSAADKG Ivanov et al., 1992 al-13 VLS A ADKGN VK A A Ivanov et al., 1992 al-16 VLS A ADKGN VK A A W GK Ivanov et al., 1992 a3-10 S A ADKGN V Ivanov et al., 1992 al 6-28 KVGGHAAEYGAEA Ivanov et al., 1992 al 7-29 V GGH A AEY G AE AL Ivanov et al., 1992 al 7-28 V GGH A AE Y G AE A Ivanov et al., 1992 a22-29 AEYGAEAL Ivanov et al., 1992 a25-31 GAEALER Ivanov et al., 1992 a27-30 F, AT E Ivanov et al., 1992 b2-12 LT AEEK A A VT A Ivanov et al., 1992 b2-1 1 LTAEEKAAVT Ivanov et al., 1992 b2-10 LTAEEKAAV Ivanov et al., 1992 bΐ 6-31 KVKVDE Ivanov et al., 1992 b22-31 V GGE ALGRLL Ivanov et al., 1992 bΐ 15-122 RNFGKEFT Ivanov et al., 1992 a76-82 LPGALSE Vercaigne-Mai ko et al., 2000 b94-100 KLHVDPE Vercaigne-Marko et al., 2000
Tableau 6 : Peptides coronaro-constructeurs
Position Séquence Références b32-36 VVYPW Barkhudaryan et al. (1992) al-21 VLS A ADKGN VK A A W GK V GGH A Barkhudaryan et al. (1993) b133-145 V AG V AN AL AHR YH Barkhudaryan et al. (1993)
Tableau 7 : Peptide stimulateur de la croissance bactérienne
Position Séquence Références b48-52 STADA Zhao et al. (1996a)
Tableau 8 : Peptide hypolipidémiant
Position Séquence Références b32-35 VVYP Kagawa et al. (1996) Tableau 9 : Peptides inhibiteurs de l’angiotensine convertase (ECA-I)
Position* Séquence Références b129-134* KVVAGV Mito et al. (1996) b129-135* KVVAGVA Mito et al. (1996) bΐ 18-126* KEFTPVLQA Mito et al. (1996) b64-69* GKKVLQ Mito et al. (1996) b130-135* FKVVAG Mito et al. (1996) b130-136* FKVVAGV Mito et al. (1996) b34-46* FGFPTTKTYFPHF Yu et al. (2006) b34-39* VVYPWT Yu et al. (2006)
TKAVEHFDDFPG AFSEFS DF- a67-106 Yaba Adje et al. (2010)
-HAHKFRVDPVNFKFFSHSFF
FDDFPGAFSEFSDFHAHKF- a73-105 Yaba Adje et al. (2010)
-RVDPVNFKFESHSE a99-105 KEESHSE Yaba Adje et al. (2010) a100-105 EESHSE Yaba Adje et al. (2010)
Tableau 10 : Peptides inhibiteurs de la dipeptidyl-peptidase IV
Position Séquence Références al30-134 AN VS T Caron et al. (2016) a63-66 VAAA Caron et al. (2016) a68-73 TKAVEH Caron et al. (2016) b6- 10 KAAVT Caron et al. (2016) Tableau 11 : Peptides issus de l’hydrolyse de l’albumine bovine
Position Séquence Références
22-23 FR (Lafarga et al. 2016)
25-64 DTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPFDEHV (Bah et al. 2015)
103-105 SLR (Lafarga et al. 2016)
139-160 LKPDPNTLCDEFKADEKKFWGK (Bah et al. 2015)
168-199 RHP YF Y APELL Y Y ANKYNG VFQECCQ AEDKG A (Bah et al. 2015)
179-180 YY (Lafarga et al. 2016)
239-241 LAR (Di Bernardini et al. 2011)
318-340 KD AIPENLPPLTADFAEDKD V CK (Bah et al. 2015)
347-371 DAFLGSFLYEYSRRHPEY AVS VLLR (Bah et al. 2015)
400-408 LKHLVDEPQ (Bah et al. 2015)
421-433 LGE Y GFQNALIVR (Bah et al. 2015)
437-451 KVPQVSTPTLVEVSR (Bah et al. 2015)
467-468 ER (Lafarga et al. 2016)
467-482 ERMPCTED YLS LILNR (Bah et al. 2015)
508-521 RPCF S ALTPDET Y V (Bah et al. 2015)
558-580 HKPKATEEQLKTVMENF V AFVDK (Bah et al. 2015)
La présence de peptides issus de protéines de plasma a également été vérifiée. Ces peptides sont indiqués dans leTableau 12 ci-dessous.
Tableau 12 : peptides issus de protéines du plasma
Position Séquence Références
22-23 FR (Lafarga et al. 2016) 25-64 DTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPFDEHV (Bah et al. 2015)
103-105 SLR (Lafarga et al. 2016)
139-160 LKPDPNTLCDEFKADEKKFWGK (Bah et al. 2015)
168-199 RHP YF Y APELL Y Y ANKYNG VFQECCQAEDKG A (Bah et al. 2015)
179-180 YY (Lafarga et al. 2016)
239-241 LAR (Di Bernardini et al. 2011)
318-340 KD AIPENLPPLTADFAEDKD V CK (Bah et al. 2015)
347-371 DAFLGSFLYEYSRRHPEY AVS VLLR (Bah et al. 2015)
400-408 LKHLVDEPQ (Bah et al. 2015)
421-433 LGE Y GFQNALIVR (Bah et al. 2015)
437-451 KVPQV STPTLVEV SR (Bah et al. 2015)
467-468 ER (Lafarga et al. 2016)
467-482 ERMPCTED YLS LILNR (Bah et al. 2015)
508-521 RPCF S ALTPDET Y V (Bah et al. 2015)
558-580 HKPKATEEQLKTVMENF V AFVDK (Bah et al. 2015)
Exemple 2
Le produit de départ est un sang de volailles, récupéré en abattoir. À celui-ci est immédiatement ajouté à hauteur de 10% massique une solution de citrate de sodium à 10% (poids/volume) comme anticoagulant. Le sang est ensuite introduit dans un réacteur. Le sang est conservé à 4°C sous agitation.
Le sang est dilué jusqu’à atteindre une concentration d’hémoglobine égale à 10% (poids/volume) dans le réacteur enzymatique.
La solution est amenée à température ambiante (23°C) et le pH est ajusté à 3 par ajout d’acide phosphorique dilué (2M). L’enzyme, une pepsine porcine, dissoute préalablement dans un tampon d’acide phosphorique et d’hydrogénophosphate de sodium (0,1 M) à pH 3, est introduite dans le réacteur à hauteur d’un ratio enzyme/substrat de 1/50 (mole/mole).
La durée totale de l’hydrolyse est de 24 heures dès l’introduction de l’enzyme. Elle s’effectue sous agitation et thermostat constants.
L’arrêt de l’hydrolyse est réalisé avec une solution de NaOH (5 M) jusqu’à atteindre un pH de 8,5. Le produit d’hydrolyse est centrifugé (4000 g, 15 min). Le culot récupéré constitue une fraction enrichie en acides nucléiques, à plus de 93% (poids). Le surnageant est quant à lui redirigé dans le réacteur.
La décoloration de l’hydrolysat peptidique est effectuée par abaissement du pH à une valeur de 4 par ajout d’acide phosphorique dilué (2 M).
La séparation de l’hydrolysat décoloré et de la fraction héminique est réalisée par centrifugation (4000 g, 15 min). Le surnageant contient l’hydrolysat peptidique décoloré, c’est-à-dire sans hème (au moins 99% de peptides (poids)). Le culot représente la fraction enrichie en hème (au moins 99% d’hème (poids)).
Références bibliographiques des Tableaux 1 à 8 :
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N. (201 la). "Obtaining antimicrobial peptides by controlled peptic hydrolysis of bovine hemoglobin". International Journal of Biological Macromolecules, 49, 143-153.
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Barkhudaryan, N. A., Oberthuer, W., Lottspeich, F. & Galoyan, A. (1992). "Structure of hypothalamic coronaro-constrictory peptide factors". Neurochemical Research, 17, 1217-1221.
Blishchenko, E. Y., Mernenko, O. A., Mirkina, I. L, Satpaev, D. K., Ivanov, V. S., Tchikin, L. D., Ostrovsky, A. G., Karelin, A. A. & Ivanov, V. T. (1996). "Tumor cell cytolysis mediated by valorphin, an opioid-like fragment of hemoglobin b-chain". Peptides, 18, 79-85.
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Fukui, K., Shiomi, H., Takagi, H., Hayashi, K., Kiso, Y. & Kitagawa, K. (1983). "Isolation from bovine brain of a novel analgésie peptapeptide, neo-kyotorphin, containing the Tyr-Arg (kyotorphin) unit". Neuropharmacology, 22, 191-196.
Glamsta, E. L., Meyerson, B., Silberring, J., Terenius, L. & Nyberg, F. (1991). "Isolation of a hemoglobin-derived opioid peptide from cerebrospinal fluid of patients with cerebrovascular bleedings". Biochemical and Biophysical Research Communications, 184, 1060-1066.
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Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé d’obtention d’un hydrolysat peptidique à partir de sang d’animaux, comprenant l’obtention du sang, l’ajout d’un anticoagulant, une réaction d’hydrolyse enzymatique, l’arrêt de la réaction d’hydrolyse, la décoloration du produit d’hydrolyse et la séparation du produit d’hydrolyse en une fraction contenant un hydrolysat peptidique et une fraction contenant de Thème, caractérisé en ce que le sang entier obtenu est introduit dans un réacteur à l’intérieur duquel l’ensemble des réactions d'hydrolyse enzymatique et de décoloration sont réalisées, à température ambiante, la réaction d’hydrolyse enzymatique étant réalisée sur le sang entier par l’ajout d’enzyme et l’ajustement du pH à une valeur acide inférieure à 4 pendant un temps de réaction s’étendant jusqu’à 48h, puis arrêtée par élévation du pH jusqu’à une valeur basique supérieure à 8,5, la décoloration du produit de l’hydrolyse étant ensuite réalisée par abaissement du pH jusqu’à une valeur acide inférieure à 5, puis les constituants du produit de l’hydrolyse étant séparés en une fraction décolorée contenant des peptides et une fraction contenant des résidus d’hème.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sang entier est d’origine porcine, bovine, ovine, équine, lapine, aviaire, volailles, ou un mélange, préférentiellement du sang bovin, porcin ou de volailles.
3) Procédé selon Tune des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’enzyme est une pepsine porcine. 4) Procédé selon Tune des revendications précédentes, caractérisé en ce que la réaction d’hydrolyse enzymatique est réalisée selon un ratio enzyme/substrat (E/S) compris entre 1/10 et 1/1000.
5) Procédé selon Tune des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comporte une étape de dilution du sang entier de manière à obtenir une solution qui contient entre 1 et 12 %, en poids, d’hémoglobine, à l’aide d’eau. 6) Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les ajustements de pH à des valeurs acides sont réalisés à l’aide d’acide chlorhydrique, d’acide phosphorique, d’acide sulfurique ou d’un mélange. 7) Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’ajustement du pH à une valeur basique est réalisé à l’aide d’hydroxyde ou de carbonate de sodium, d’hydroxyde de calcium, d’hydroxyde d’ammonium ou d’un mélange desdits composés. 8) Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il est réalisé sur du sang de volaille et comprend, après l’arrêt de la réaction d’hydrolyse et avant la décoloration du produit d’hydrolyse, une étape de séparation des acides nucléiques du reste du produit d’hydrolyse et la récupération de cette fraction. 9) Hydrolysat peptidique susceptible d’être obtenu par un procédé tel que défini dans l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il présente les caractéristiques suivantes :
- absence de protéines non hydrolysées,
- absence de résidus d’hème,
- 100% de peptides présentant un poids moléculaire inférieur à 10 000 Da
10) Hydrolysat peptidique selon la revendication 9 pour son utilisation à titre d’agent antimicrobien naturel et/ou d’antioxydant, en particulier à titre de conservateur d’aliments tels que les produits carnés, notamment destinés aux animaux ou à titre de substance active destinée à détruire, repousser ou rendre inoffensifs les organismes nuisibles, à en prévenir l'action ou à les combattre, notamment en agriculture.
11) Hydrolysat peptidique selon la revendication 9 pour son utilisation à titre de supplément nutritionnel destiné aux animaux, pour renforcer les défenses immunitaires des animaux, lutter contre le stress et/ou améliorer le calme et le bien-être des animaux, pour réguler la prise alimentaire des animaux, les animaux étant de préférence des animaux de compagnie ou d’élevage, et de préférence encore des chiens ou des chats. 12) Fraction d’acides nucléiques susceptible d’être obtenu par un procédé tel que défini dans l’une des revendications 1 à 8, incluant la revendication 8, caractérisé en ce qu’elle comprend au moins 93 % d’acides nucléiques, en poids.
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