WO2019203302A1 - ヘモグロビン分析方法 - Google Patents

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博暁 太平
栄一郎 砂村
松田　康平
卓也 與谷
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Sekisui Medical Co Ltd
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Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing hemoglobin.
  • Hemoglobin is a chromoprotein composed of hem (pigment part) that binds to oxygen and globin that holds heme, and is involved in the transport of oxygen to cells throughout the body.
  • a normal human globin polypeptide has four types of subunits, ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ chains, which constitute a tetramer composed of two ⁇ chains and two non- ⁇ chains.
  • HbA mainly includes HbA0 and glycated HbA1c, and HbA1c is used as a marker for diabetes and the like.
  • An abnormality in the three-dimensional structure of the globin subunit causes abnormal Hb disease, while dysplasia of the globin subunit causes thalassemia, all of which cause anemia and, in severe cases, hemolysis, growth failure and bone deformation.
  • Abnormal Hb disease is generally diagnosed by detecting abnormal Hb such as HbS, HbC, HbE, HbD.
  • Thalassemia is roughly classified into ⁇ -thalassemia due to poor formation of ⁇ -chain and ⁇ -thalassemia due to poor formation of ⁇ -chain, and is generally diagnosed using high values such as HbA2 and HbF as indicators.
  • Patent Document 2 describes that HbA0, HbS, and HbC were separated by ion exchange liquid chromatography using an eluent containing an ion-pairing reagent and having a pH in the range of 7.1 to 7.3. ing. According to Patent Document 3, hemoglobin S is analyzed using a pH 6.88 to 7.50 eluent or hemoglobin A2 using a pH 6.60 to 6.80 eluent by cation exchange high performance liquid chromatography. How to do is described.
  • the present invention relates to a method for separating and detecting various hemoglobins including abnormal hemoglobin and thalassemia marker from a blood sample.
  • the present invention provides the following.
  • a method for analyzing hemoglobin Separating hemoglobin in the sample by cation exchange chromatography, In the separation of the hemoglobin, an eluent having a pH of 8.1 or more and an osmotic pressure of 40 mOsm / kg or less is used.
  • Method. [2] The method according to [1], wherein the eluent contains a buffer containing no metal ions. [3] The method according to [2], wherein the buffer is Bicine, Tricine or TES. [4] The method according to [2] or [3], wherein the concentration of the buffer in the eluent is 2 to 17 mmol / L.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the eluent contains a hemoglobin denaturant.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein hemoglobin is separated by gradient elution using the eluent.
  • [7] The method according to [6], wherein the ratio of the eluent is increased from 0% to 100% in the gradient.
  • [8] The method according to any one of [1] to [7], wherein at least one abnormal hemoglobin selected from the group consisting of HbS, HbC, HbE, HbD, and HbO-Arab is separated.
  • [17] Use of a liquid composition having a pH of 8.1 or more and an osmotic pressure of 40 mOsm / kg or less for producing an eluent for separating hemoglobin by cation exchange chromatography.
  • the buffer is Bicine, Tricine or TES.
  • the use according to [18] or [19], wherein the concentration of the buffer in the liquid composition is 2 to 17 mmol / L.
  • HbA1c, abnormal Hb, thalassemia marker, and the like can be rapidly and highly sensitively separated from a blood sample in addition to HbA0, which is the main hemoglobin.
  • the present invention is useful for simple, rapid and highly sensitive diagnosis of abnormal Hb disease or thalassemia.
  • the hemoglobin analysis method of the present invention includes separating hemoglobin in a sample by ion exchange chromatography.
  • a sample used in the method of the present invention a blood sample containing hemoglobin used for normal hemoglobin analysis can be used.
  • a blood sample obtained by hemolyzing or diluting blood collected from a human can be used.
  • the chromatography performed by the method of the present invention is preferably liquid chromatography, more preferably high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the ion exchange chromatography in the present invention can be performed using a known liquid chromatography system, that is, an ion exchange column connected to a system including a pump, a sampler, a detector and the like for feeding an eluent.
  • the ion exchange chromatography performed by the method of the present invention is cation exchange chromatography using a cation exchange column.
  • the cation exchange column used in the method of the present invention may be a column packed with a stationary phase having a cation exchange group.
  • the cation exchange group include a carboxyl group, a phosphoric acid group, and a sulfonic acid group, and among these, a sulfonic acid group is preferable.
  • Examples of the stationary phase of the cation exchange column include filler particles and porous bodies, and filler particles are preferred.
  • the filler particles include inorganic particles and organic particles.
  • Examples of the inorganic particles include particles composed of silica, zirconia and the like.
  • Examples of the organic particles include natural polymer particles such as cellulose, polyamino acid and chitosan, and synthetic polymer particles such as polystyrene and polyacrylate.
  • a preferred example of the stationary phase having a cation exchange group is obtained by polymerizing a mixture of a non-crosslinkable hydrophilic acrylic monomer and a polyglycidyl ether disclosed in JP 2011-047858 A. And a filler containing a layer of an acrylic monomer having a cation exchange group polymerized on the surface of the crosslinked polymer particle.
  • the eluent used in the hemoglobin analysis method of the present invention is an eluent used for hemoglobin separation by ion exchange chromatography. More preferably, the eluent is an eluent used for elution of hemoglobin from a cation exchange column in cation exchange chromatography.
  • an eluent having a high pH and a low osmotic pressure is used as compared with the conventional hemoglobin analysis method.
  • the eluent used in the present invention preferably has a pH of 8.1 or higher. More specifically, the pH of the eluent is preferably 8.1 or higher, more preferably 8.2 or higher, even more preferably 8.3 or higher, while preferably 10.0 or lower, more preferably Is 9.0 or less, more preferably 8.6 or less. If the eluent is less than pH 8.1, hemoglobin, particularly HbC, may be insufficiently eluted from the column, while if it exceeds pH 10, separation of HbS and HbC may be particularly insufficient.
  • the pH range of the eluent used in the present invention includes pH 8.1 to 10.0, pH 8.1 to 9.0, pH 8.1 to 8.6, pH 8.2 to 10.0, pH 8.2. -9.0, pH 8.2-8.6, pH 8.3-10.0, pH 8.3-9.0, and pH 8.3-8.6.
  • the pH of the eluent used in the conventional hemoglobin analysis method is usually about pH 5.0 to 8.0.
  • the osmotic pressure of the eluent used in the present invention is preferably 40 mOsm / kg or less. More specifically, the osmotic pressure of the eluent is preferably 40 mOsm / kg or less, more preferably 37 mOsm / kg or less, still more preferably 36 mOsm / kg or less, while preferably 15 mOsm / kg or more, more preferably 19 mOsm / kg or more, more preferably 26 mOsm / kg or more.
  • the osmotic pressure of the eluent is less than 15 mOsm / kg, hemoglobin, particularly HbA0 and HbA2, may be insufficiently eluted. On the other hand, if it exceeds 40 mOsm / kg, hemoglobin species, particularly HbA0 and HbA2, The separation of becomes worse.
  • the osmotic pressure ranges of the eluent used in the present invention are 15-40 mOsm / kg, 15-37 mOsm / kg, 15-36 mOsm / kg, 19-40 mOsm / kg, 19-37 mOsm / kg, 19-36 mOsm.
  • the composition of the eluent has not been designed from the viewpoint of adjusting the osmotic pressure, and the pH of the eluent conventionally used is usually 125 to 570 mOsm / kg. Degree.
  • the value of the osmotic pressure in this specification means the value of the osmotic pressure measured by the freezing point depression method.
  • the osmotic pressure can be measured using a commercially available osmometer, for example, an osmometer 3250 (manufactured by Advanced Instruments). Further, in the present specification, the unit of osmotic pressure mOsm / kg means mOsm / kgH 2 O, which is sometimes expressed as mOsm / L or mOsm.
  • the eluent contains a buffer that does not contain metal ions. Since a buffer solution generally used in a conventional eluent such as a phosphate buffer contains a metal ion, it is difficult to realize high pH and low osmotic pressure at the same time. Examples of the buffering agent not containing the metal ion include a Good buffering agent.
  • Bicine N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine
  • Tricine N- [tris (hydroxymethyl) methyl) Glycine
  • TES N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid
  • TES is more preferred.
  • the concentration of the above-mentioned buffering agent in the eluent used in the present invention should be such that the pH and osmotic pressure of the final eluent can be adjusted to the above ranges in consideration of the effects of additives and the like described later. That's fine.
  • the concentration of the buffer in the eluent is preferably 2 mmol / L or more, more preferably 2.5 mmol / L or more, even more preferably 5 mmol / L or more, while preferably 17 mmol / L or less, more preferably 15 mmol / L or less, more preferably 12.5 mmol / L or less.
  • the concentration range of the buffer in the eluent used in the present invention is 2 to 17 mmol / L, 2 to 15 mmol / L, 2 to 12.5 mmol / L, 2.5 to 17 mmol / L, and 2. 5-15 mmol / L, 2.5-12.5 mmol / L, 5-17 mmol / L, 5-15 mmol / L, and 5-12.5 mmol / L.
  • the eluent used in the present invention is a solution liquid composition containing Bicine, Tricine or TES as a buffering agent.
  • concentration of the buffer in the eluent is 2 to 17 mmol / L
  • the eluent has an osmotic pressure of 15 to 40 mOsm / kg, and a pH of preferably 8.1 to 10.0.
  • the pH is preferably 8.2 to 9.0, more preferably pH 8.2 to 8.6, and still more preferably pH 8.3 to 8.6.
  • the eluent used in the present invention contains Bicine, Tricine or TES as a buffer, and the concentration of the buffer in the eluent is 2.5 to 15 mmol / L.
  • the solution has an osmotic pressure of 15 to 37 mOsm / kg, and a pH of preferably 8.1 to 10.0, more preferably pH 8.2 to 9.0, still more preferably pH 8.2 to 8.6, The pH is preferably 8.3 to 8.6.
  • the eluent used in the present invention contains Bicine, Tricine or TES as a buffer, and the concentration of the buffer in the eluent is 5 to 15 mmol / L.
  • the osmotic pressure is 19 to 37 mOsm / kg, and the pH is preferably 8.1 to 10.0, more preferably pH 8.2 to 9.0, still more preferably pH 8.2 to 8.6, still more preferably. Has a pH of 8.3 to 8.6.
  • the eluent used in the present invention contains Bicine, Tricine or TES as a buffer, and the concentration of the buffer in the eluent is 5 to 15 mmol / L.
  • the eluent used in the present invention contains Bicine, Tricine or TES as a buffer, and the concentration of the buffer in the eluent is 5 to 12.5 mmol / L.
  • the liquid has an osmotic pressure of 26 to 36 mOsm / kg and a pH of 8.3 to 8.6.
  • the eluent used in the present invention contains a solvent and additives such as a hemoglobin modifier, a binder to trivalent heme iron, a pH adjuster, and a surfactant in addition to the above-described buffer. Also good.
  • the eluent used in the present invention contains a hemoglobin denaturant.
  • the hemoglobin denaturing agent may be any oxidizing agent capable of generating methemoglobin by changing the hemoglobin of hemoglobin from divalent to trivalent.
  • examples of such an oxidizing agent include nitrite, potassium ferricyanide, methylene blue, hydrogen peroxide, ascorbic acid, hydrogen sulfide and the like. Of these, nitrite is preferable, and sodium nitrite or potassium nitrite is more preferable.
  • the concentration of the hemoglobin denaturing agent in the eluent is preferably 0.05 to 15 mmol / L, more preferably 1.0 to 10 mmol / L.
  • the eluent used in the present invention contains a binder to trivalent heme iron.
  • the binding agent to the trivalent heme iron stabilizes methemoglobin produced by the hemoglobin denaturant and stabilizes its elution behavior.
  • the binder to the trivalent heme iron include azide and cyanide.
  • azides include sodium azide, diphenyl phosphate azide, 4-dodecylbenzenesulfonyl azide, 4-acetylaminobenzenesulfonyl azide, potassium azide, lithium azide, iron azide, hydrogen azide, lead azide , Mercury azide, copper azide, silver azide and the like.
  • cyanide examples include potassium cyanide, hydrogen cyanide, sodium cyanide, silver cyanide, mercury cyanide, copper cyanide, lead cyanide, iron cyanide, lithium cyanide, ammonium cyanide and the like.
  • the binder to trivalent heme iron is an azide, more preferably sodium azide.
  • the concentration of the binder to the trivalent heme iron in the eluent is preferably 0.05 to 15 mmol / L, more preferably 0.5 to 10 mmol / L.
  • Examples of the pH adjuster include known acids and bases.
  • Examples of the acid include hydrochloric acid, phosphoric acid, nitric acid, sulfuric acid and the like.
  • Examples of the base include sodium hydroxide, potassium hydroxide, water. Examples thereof include lithium oxide, magnesium hydroxide, barium hydroxide, and calcium hydroxide.
  • the solvent examples include water-soluble organic solvents such as methanol, ethanol, acetonitrile, and acetone.
  • concentration of the solvent is preferably such that salts and the like do not precipitate. For example, 80% (v / v) or less is preferable, and a more preferable range is 0.1% (w / w) to 50% (w / w). )
  • hemoglobin is separated by gradient elution using the eluent.
  • the eluent is the eluent B (hereinafter referred to as B liquid or simply B), and another eluent is the eluent A (hereinafter referred to as A liquid or simply A).
  • B liquid or simply B the eluent B
  • a liquid or simply A another eluent
  • a gradient is applied between the liquid A and the liquid B so that the ratio of the liquid B increases stepwise.
  • the eluent A only needs to contain a buffer containing a known salt compound.
  • the buffer that can be contained in the eluent A include a buffer containing an organic acid or an inorganic acid.
  • organic acids include citric acid, succinic acid, tartaric acid, malic acid, and salts thereof
  • inorganic acids include hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, boric acid, acetic acid, perchlorine. Examples include acids and the like, and salts thereof.
  • the buffer used in the eluent A can contain any one or a combination of two or more of these organic acids and inorganic acids.
  • a buffer solution containing phosphate, succinate or perchlorate is preferable.
  • the phosphate include sodium salt and potassium salt, and monosodium phosphate and disodium phosphate are preferable.
  • succinate include sodium and potassium salts, with monosodium succinate and disodium succinate being preferred.
  • An example of a perchlorate is sodium perchlorate.
  • the eluent A is the same solvent and additive as those that can be contained in the above-described eluent B (for example, the above-described hemoglobin denaturing agent, binder to trivalent heme iron, pH adjusting agent) , A surfactant, etc.).
  • the pH of the eluent A is preferably 5.0 or higher, more preferably 5.2 or higher, preferably 6.0 or lower, more preferably 5.8 or lower.
  • the pH range of the eluent A is preferably 5.0 to 6.0, more preferably 5.2 to 5.8.
  • the osmotic pressure of the eluent A is preferably 130 mOsm / kg or more, more preferably 150 mOsm / kg or more, preferably 210 mOsm / kg or less, more preferably 190 mOsm / kg or less.
  • the range of the osmotic pressure of the eluent A is preferably 130 to 210 mOsm / kg, more preferably 150 to 190 mOsm / kg.
  • the eluent A has a pH of 5.0 to 6.0 and an osmotic pressure of 130 to 210 mOsm / kg, more preferably 150 to 190 mOsm / kg.
  • the eluent A has a pH of 5.2 to 5.8 and an osmotic pressure of 130 to 210 mOsm / kg, more preferably 150 to 190 mOsm / kg.
  • the liquid A is passed through 100% (liquid B 0%), then the gradient is applied to increase the ratio of liquid B, and the ratio of liquid B is increased to 100%. increase.
  • the size of the gradient may be adjusted as appropriate according to the performance of the column, and is not particularly limited.
  • the hemoglobin analysis method of the present invention is used for detection of abnormal hemoglobin.
  • the abnormal hemoglobin detected by the method of the present invention includes at least one selected from the group consisting of HbS, HbC, HbE, HbD, and HbO-Arab, preferably selected from the group consisting of HbC and HbS. At least one kind.
  • each of the abnormal hemoglobins listed above can be separated and detected by a single analysis.
  • the hemoglobin analysis method of the present invention is used for detecting thalassemia markers.
  • the thalassemia marker detected by the method of the present invention includes at least one selected from the group consisting of HbA2, HbF, HbH, HbBart ', and HbConstant Spring, preferably HbA2.
  • HbA2 the group consisting of HbA2, HbF, HbH, HbBart ', and HbConstant Spring, preferably HbA2.
  • each of the thalassemia markers listed above can be separated and detected by a single analysis.
  • both the abnormal hemoglobin and the thalassemia marker listed above can be detected. Furthermore, the abnormal hemoglobin and / or thalassemia marker can be detected, and HbA0 or glycated hemoglobin HbA1c can be detected. Therefore, by the hemoglobin analysis method of the present invention, the presence or absence of abnormal hemoglobin and thalassemia marker in the sample can be analyzed at once, and the presence or absence of abnormal hemoglobin, thalassemia marker, and HbA1c in the sample can also be analyzed at once. Is possible. Therefore, since the method of the present invention can detect various types of hemoglobin with a single analysis, it enables simple and rapid diagnosis of abnormal Hb disease and thalassemia.
  • the obtained mixture was dispersed in 5 L of an aqueous solution of 4% by weight of polyvinyl alcohol (“GOHSENOL GH-20” manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd.), heated to 80 ° C. in a nitrogen atmosphere with stirring, and polymerized for 1 hour. Reaction was performed. After cooling the temperature to 30 ° C., 100 g of 2-methacrylamide-2-methylpropanesulfonic acid (manufactured by Toa Gosei Co., Ltd.) as an acrylic monomer having a cation exchange group was added to the reaction system, and the mixture was again heated to 80 ° C. The polymerization reaction was carried out for 1 hour with warming.
  • polyvinyl alcohol (“GOHSENOL GH-20” manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd.
  • the obtained crosslinked polymer particles were washed with ion exchanged water and acetone to obtain crosslinked polymer particles having sulfonic acid groups introduced therein.
  • the obtained column filler for separating hemoglobin was packed into a stainless steel column having an inner diameter of 4 mm and a length of 20 mm to prepare a cation exchange column for separating hemoglobin.
  • Sample A A sample was prepared by appropriately diluting a blood sample collected from a healthy person with a phosphate buffer solution (pH 7.00) containing 0.1% Triton X-100.
  • Specimen B Lyphocheck (registered trademark) Hemoglobin A2 Control Level 2 (manufactured by Bio-Rad, containing HbA0, HbA2, and HbS) is appropriately diluted with a phosphate buffer (pH 7.00) containing 0.1% Triton X-100.
  • a sample was prepared.
  • Specimen C A specimen was prepared by appropriately diluting AFSC hemocontrol (manufactured by Helena Laboratories, Inc., containing HbA0, HbS and HbC) with a phosphate buffer solution (pH 7.00) containing 0.1% Triton X-100.
  • Sample D A sample was prepared by appropriately diluting Hemoglobin A2 (manufactured by Sigma Aldrich, containing HbA2) with a phosphate buffer solution (pH 7.00) containing 0.1% Triton X-100.
  • Table 3 shows the analysis results of Samples A to C in Examples 1 to 6.
  • the chromatograms of specimens A to C obtained in Examples 1, 2, and 3 are shown in FIGS. 1, 2, and 3, respectively.
  • HbA0, HbA2, HbS, and HbC were detected as separate peaks. From this result, it was shown that HbA0, HbA2, HbS, and HbC can be detected by using an eluent containing a buffering agent TES, Tricine, or Bicine.
  • Test 2 The samples A to C prepared in Reference Example 2 were subjected to hemoglobin analysis. Conditions other than the eluent B and gradient conditions were the same as in Test 1. As the eluent B, the eluents listed in Tables 4 to 6 were used. As the gradient conditions, the mixing ratio of the eluent A and the eluent B was appropriately determined so that HbA0 was eluted at 2.1 min. In order to confirm HbC elution, the time for the eluent B concentration of 100% was appropriately extended.
  • Test 3 The specimen B and specimen D prepared in Reference Example 2 were subjected to hemoglobin analysis.
  • the analysis conditions other than the gradient and eluent B were the same as those in Test 1.
  • the eluent B an eluent containing a buffer containing sodium phosphate and sodium perchlorate having pH and osmotic pressure shown in Table 7 was used.
  • the composition of the eluent shown in Table 7 was based on the composition of the eluent containing a phosphate buffer generally used in conventional hemoglobin analysis.
  • the gradient conditions were as shown in Table 8.
  • Table 7 shows the analysis results.
  • the chromatograms of Comparative Examples 5 to 8 are shown in FIGS.
  • Sample B contained about 5 to 7% by mass of HbA2, but in Comparative Examples 5 to 8, the HbA0 peak and the HbA2 peak overlapped, and the peaks of both types were not sufficiently separated. From this result, it was shown that HbA0 and HbA2 could not be sufficiently detected with a conventionally used eluent having a pH of 8.0 or less and an osmotic pressure of 130 mOsm / kg or more.
  • Test 4 The samples A to C prepared in Reference Example 2 were subjected to hemoglobin analysis using the eluent B containing the phosphate buffer described in Table 9. Conditions other than the eluent B were the same as in Test 2. As the eluent B, an eluent containing a phosphate buffer described in Table 9 was used.
  • Table 9 shows the analysis results.
  • Comparative Examples 9 and 10 the separation of the peaks of HbA0 and HbA2 was not sufficient, and either or both of HbS and HbC were not detected.
  • Comparative Examples 11 to 14 HbS and HbC were detected, but the peaks of HbA0 and HbA2 were not sufficiently separated.
  • the eluent B of Comparative Examples 9 to 14 has a higher osmotic pressure and higher or lower pH than the eluents of the above-described examples, and is a condition of pH 8.0 or higher and osmotic pressure 40 mOsm / kg or lower. Can not be achieved. This was considered to have led to insufficient hemoglobin detection in Comparative Examples 9-14.
  • Test 5 The samples A to C prepared in Reference Example 2 were subjected to hemoglobin analysis. Conditions other than the eluent B and gradient conditions were the same as in Test 1. As the eluent B, the eluents listed in Table 10 were used. The gradient conditions were as shown in Table 11. The analysis results are shown in Table 10. In both Examples 19 and 20, the peaks of HbA0 and HbA2 were well separated, and the peaks of HbS and HbC were also well separated, and HbA0, HbA2, HbS and HbC could be detected.

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Abstract

異常ヘモグロビン及びサラセミアマーカーを含む各種ヘモグロビンを分離及び検出する方法の提供。ヘモグロビン分析方法であって、カチオン交換クロマトグラフィーにより試料中のヘモグロビンを分離することを含み、該ヘモグロビンの分離において、ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の溶離液が用いられる、方法。

Description

ヘモグロビン分析方法
　本発明は、ヘモグロビンの分析方法に関する。
　ヘモグロビン（Ｈｂ）は、酸素と結合するヘム（色素部分）と、ヘムを抱えるグロビンからなる色素タンパク質であり、全身の細胞への酸素の運搬に関わる。正常ヒトグロビンのポリペプチドには、α、β、γ、δ鎖という４種類のサブユニットがあり、これらが２本のα鎖と２本の非α鎖からなるテトラマーを構成する。正常ヒトＨｂにはＨｂＡ（α２β２）、ＨｂＡ２（α２δ２）及びＨｂＦ（α２γ２）の３種類が存在するが、その大部分はＨｂＡである。ＨｂＡには主にＨｂＡ０と糖化したＨｂＡ１ｃが含まれ、ＨｂＡ１ｃは糖尿病などのマーカーとして使用される。
　グロビンサブユニットの立体構造の異常は異常Ｈｂ症を、一方、グロビンサブユニットの形成不全はサラセミアを引き起こし、いずれも貧血や、さらに重症例では溶血、発育不全、骨変形などをもたらす。異常Ｈｂ症は、一般にＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ、ＨｂＤなどの異常Ｈｂを検出することで診断される。サラセミアは、α鎖の形成不全によるαサラセミアとβ鎖の形成不全によるβサラセミアに大別され、一般にＨｂＡ２、ＨｂＦなどの高値を指標に診断される。
　高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてヘモグロビンの異常を検出する方法がある。特許文献１には、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）及びリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を異なる比率で含む複数の溶離液を順次送液するグラジエント溶出を用いたＨＰＬＣにより、異常ＨｂであるＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ及びＨｂＤや、サラセミアマーカーＨｂＡ２及びＨｂＦを分離可能であることが記載されている。特許文献２には、イオン対試薬を含有し、ｐＨが７．１～７．３の範囲にある溶離液を用いたイオン交換液体クロマトグラフィーにより、ＨｂＡ０、ＨｂＳ及びＨｂＣを分離したことが記載されている。特許文献３には、カチオン交換高速液体クロマトグラフィーにより、ｐＨ６．８８～７．５０の溶離液を用いてヘモグロビンＳを分析、又はｐＨ６．６０～６．８０の溶離液を用いてヘモグロビンＡ２を分析する方法が記載されている。
特開２０１６－２７３２６号公報 特開２０１０－２３７１１０号公報 国際公開公報第２０１１／０９６４２０号
　本発明は、血液試料から、異常ヘモグロビン及びサラセミアマーカーを含む各種ヘモグロビンを分離及び検出する方法に関する。
　したがって、本発明は、以下を提供する。
〔１〕ヘモグロビン分析方法であって、
　カチオン交換クロマトグラフィーにより試料中のヘモグロビンを分離することを含み、
　該ヘモグロビンの分離において、ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の溶離液が用いられる、
方法。
〔２〕前記溶離液が金属イオンを含まない緩衝剤を含有する、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記緩衝剤がＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳである、〔２〕記載の方法。
〔４〕前記溶離液中の前記緩衝剤の濃度が２～１７ｍｍｏｌ／Ｌである、〔２〕又は〔３〕記載の方法。
〔５〕前記溶離液がヘモグロビン変性剤を含有する、〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕前記溶離液を用いたグラジエント溶離によりヘモグロビンを分離する、〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕前記グラジエントにおいて前記溶離液の割合が０％から１００％まで増加する、〔６〕記載の方法。
〔８〕ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ、ＨｂＤ、及びＨｂＯ－Ａｒａｂからなる群より選択される少なくとも１種の異常ヘモグロビンを分離する、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕ＨｂＡ２、ＨｂＦ、ＨｂＨ、ＨｂＢａｒｔ’、及びＨｂＣｏｎｓｔａｎｔ　Ｓｐｒｉｎｇからなる群より選択される少なくとも１種のサラセミアマーカーを分離する、〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載の方法。
〔１０〕前記クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィーである、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１１〕ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である、カチオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離用溶離液。
〔１２〕金属イオンを含まない緩衝剤を含有する、〔１１〕記載の溶離液。
〔１３〕前記緩衝剤がＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳである、〔１２〕記載の溶離液。
〔１４〕前記溶離液中の前記緩衝剤の濃度が２～１７ｍｍｏｌ／Ｌである、〔１２〕又は〔１３〕記載の溶離液。
〔１５〕前記溶離液がヘモグロビン変性剤を含有する、〔１１〕～〔１４〕のいずれか１項記載の溶離液。
〔１６〕ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である液体組成物の、カチオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離用溶離液としての使用。
〔１７〕ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である液体組成物の、カチオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離用溶離液の製造のための使用。
〔１８〕前記液体組成物が金属イオンを含まない緩衝剤を含有する、〔１６〕又は〔１７〕記載の使用。
〔１９〕前記緩衝剤がＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳである、〔１８〕記載の使用。
〔２０〕前記液体組成物中の前記緩衝剤の濃度が２～１７ｍｍｏｌ／Ｌである、〔１８〕又は〔１９〕記載の使用。
〔２１〕前記液体組成物がヘモグロビン変性剤を含有する、〔１６〕～〔２０〕のいずれか１項記載の使用。
　本発明によれば、血液試料から、主要なヘモグロビンであるＨｂＡ０に加えて、ＨｂＡ１ｃ、異常Ｈｂ、サラセミアマーカーなどを迅速かつ高感度に分離することができる。本発明は、異常Ｈｂ症又はサラセミアの簡便、迅速かつ高感度な診断に有用である。
ＴＥＳ含有溶離液を用いたカチオン交換クロマトグラフィーによる実施例１でのＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣの分析結果。 Ｔｒｉｃｉｎｅ含有溶離液を用いたカチオン交換クロマトグラフィーによる実施例２でのＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣの分析結果。 Ｂｉｃｉｎｅ含有溶離液を用いたカチオン交換クロマトグラフィーによる実施例３でのＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣの分析結果。 比較例５でのＨｂＡ０、ＨｂＡ２及びＨｂＳの分析結果。 比較例６でのＨｂＡ０、ＨｂＡ２及びＨｂＳの分析結果。 比較例７でのＨｂＡ０、ＨｂＡ２及びＨｂＳの分析結果。 比較例８でのＨｂＡ０、ＨｂＡ２及びＨｂＳの分析結果。
　本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
　本発明のヘモグロビン分析方法は、イオン交換クロマトグラフィーにより試料中のヘモグロビンを分離することを含む。当該本発明の方法に用いられる試料としては、通常のヘモグロビン分析に用いられるヘモグロビンを含む血液試料を用いることができる。例えば、ヒトから採取した血液を溶血又は希釈した血液試料を用いることができる。
　本発明の方法で行われるクロマトグラフィーは、好ましくは液体クロマトグラフィーであり、より好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。本発明におけるイオン交換クロマトグラフィーは、公知の液体クロマトグラフィーシステム、すなわち、溶離液送液用のポンプ、サンプラ、検出器等を備えたシステムに接続したイオン交換カラムを用いて行うことができる。
　好ましくは、本発明の方法で行われるイオン交換クロマトグラフィーは、カチオン交換カラムを用いた、カチオン交換クロマトグラフィーである。本発明の方法で用いられるカチオン交換カラムは、カチオン交換基を有する固定相が充填されたカラムであればよい。該カチオン交換基としては、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基などが挙げられ、このうちスルホン酸基が好ましい。
　該カチオン交換カラムの固定相としては、充填剤粒子、多孔質体等が挙げられ、充填剤粒子が好ましい。該充填剤粒子としては、無機系粒子、有機系粒子等が挙げられる。該無機系粒子としては、シリカ、ジルコニア等で構成される粒子が挙げられる。該有機系粒子としては、セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子や、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子が挙げられる。該カチオン交換基を有する固定相の好ましい例として、特開２０１１－０４７８５８号公報に開示されている、非架橋性の親水性アクリル系単量体とポリグリシジルエーテル類との混合物を重合して得られる架橋重合体粒子と、該架橋重合体粒子の表面に重合されたカチオン交換基を有するアクリル系単量体の層とを含む充填剤が挙げられる。
　本発明のヘモグロビン分析方法では、従来のイオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分析と同様に、試料中のヘモグロビンをイオン交換カラムに吸着させた後、該カラムに溶離液を流して該カラムからヘモグロビンを溶離させることにより、試料中のヘモグロビンを分離する。したがって、本発明のヘモグロビン分析方法で使用される溶離液は、イオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離のために使用される溶離液である。より好ましくは、該溶離液は、カチオン交換クロマトグラフィーにおいて、カチオン交換カラムからのヘモグロビンの溶離のために使用される溶離液である。
　本発明のヘモグロビン分析方法では、従来のヘモグロビン分析方法と比べて高ｐＨかつ低浸透圧の溶離液を用いる。本発明で使用される該溶離液は、ｐＨ８．１以上が好適である。より詳細には、該溶離液のｐＨは、好ましくは８．１以上、より好ましくは８．２以上であり、さらに好ましくは８．３以上であり、一方、好ましくは１０．０以下、より好ましくは９．０以下、さらに好ましくは８．６以下である。該溶離液がｐＨ８．１未満であると、カラムからのヘモグロビン、特にＨｂＣの溶出が不十分になることがあり、一方、ｐＨ１０を超えると、特にＨｂＳとＨｂＣの分離が不十分になることがある。本発明で使用される該溶離液のｐＨ範囲としては、ｐＨ８．１～１０．０、ｐＨ８．１～９．０、ｐＨ８．１～８．６、ｐＨ８．２～１０．０、ｐＨ８．２～９．０、ｐＨ８．２～８．６、ｐＨ８．３～１０．０、ｐＨ８．３～９．０、及びｐＨ８．３～８．６が挙げられる。一方、従来のヘモグロビン分析方法で用いられていた溶離液のｐＨは、通常ｐＨ５．０～８．０程度である。
　本発明で使用される該溶離液の浸透圧は、４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下が好適である。より詳細には、該溶離液の浸透圧は、好ましくは４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、より好ましくは３７ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、さらに好ましくは３６ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であり、一方、好ましくは１５ｍＯｓｍ／ｋｇ以上、より好ましくは１９ｍＯｓｍ／ｋｇ以上、さらに好ましくは２６ｍＯｓｍ／ｋｇ以上である。該溶離液の浸透圧が１５ｍＯｓｍ／ｋｇ未満であると、ヘモグロビン、特にＨｂＡ０とＨｂＡ２の溶出が不十分になることがあり、一方、４０ｍＯｓｍ／ｋｇを超えると、ヘモグロビン種間、特にＨｂＡ０とＨｂＡ２との分離が悪くなる。本発明で使用される該溶離液の浸透圧の範囲としては、１５～４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、１５～３７ｍＯｓｍ／ｋｇ、１５～３６ｍＯｓｍ／ｋｇ、１９～４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、１９～３７ｍＯｓｍ／ｋｇ、１９～３６ｍＯｓｍ／ｋｇ、２６～４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２６～３７ｍＯｓｍ／ｋｇ、及び２６～３６ｍＯｓｍ／ｋｇが挙げられる。一方、従来のクロマトグラフィーによるヘモグロビン分離において、浸透圧調整の観点で溶離液の組成を設計することは行われておらず、また従来用いられていた溶離液のｐＨは、通常１２５～５７０ｍＯｓｍ／ｋｇ程度である。本明細書における浸透圧の値は、凝固点降下法により測定された浸透圧の値をいう。浸透圧は、市販の浸透圧計、例えばオズモメーター３２５０（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）等を用いて測定することができる。また本明細書において、浸透圧の単位ｍＯｓｍ／ｋｇとは、ｍＯｓｍ／ｋｇＨ２Ｏを意味し、これはｍＯｓｍ／Ｌ又はｍＯｓｍとも表記されることがある。
　上記のｐＨと浸透圧の範囲を有する溶離液を調製するために、本発明においては、該溶離液に金属イオンを含まない緩衝剤を含有させる。リン酸緩衝液等の従来の溶離液で一般に使用されている緩衝液は、金属イオンを含むため、高ｐＨ性と低浸透圧性を同時に実現することは困難である。該金属イオンを含まない緩衝剤の例としては、グッド緩衝剤が挙げられ、なかでも、Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン）、又はＴＥＳ（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸）が好ましく、ＴＥＳがより好ましい。
　本発明で使用される該溶離液における上述した緩衝剤の濃度は、後述する添加剤等の影響を考慮した上で、最終的な溶離液のｐＨ及び浸透圧を上記範囲に調整できる濃度であればよい。該溶離液における該緩衝剤の濃度は、好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは２．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、一方、好ましくは１７ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。本発明で使用される該溶離液における該緩衝剤の濃度の範囲としては、２～１７ｍｍｏｌ／Ｌ、２～１５ｍｍｏｌ／Ｌ、２～１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、２．５～１７ｍｍｏｌ／Ｌ、２．５～１５ｍｍｏｌ／Ｌ、２．５～１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、５～１７ｍｍｏｌ／Ｌ、５～１５ｍｍｏｌ／Ｌ、及び５～１２．５ｍｍｏｌ／Ｌが挙げられる。
　好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、緩衝剤としてＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳを含有する溶液状の液体組成物である。該溶離液中の該緩衝剤の濃度は２～１７ｍｍｏｌ／Ｌであり、該溶離液は、浸透圧が１５～４０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、かつｐＨが、好ましくは８．１～１０．０、より好ましくはｐＨ８．２～９．０、さらに好ましくはｐＨ８．２～８．６、なお好ましくはｐＨ８．３～８．６である。
　より好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、緩衝剤としてＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳを含有し、該溶離液中の該緩衝剤の濃度は２．５～１５ｍｍｏｌ／Ｌであり、該溶離液は、浸透圧が１５～３７ｍＯｓｍ／ｋｇであり、かつｐＨが、好ましくは８．１～１０．０、より好ましくはｐＨ８．２～９．０、さらに好ましくはｐＨ８．２～８．６、なお好ましくはｐＨ８．３～８．６である。
　さらに好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、緩衝剤としてＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳを含有し、該溶離液中の該緩衝剤の濃度は５～１５ｍｍｏｌ／Ｌであり、該溶離液は、浸透圧が１９～３７ｍＯｓｍ／ｋｇであり、かつｐＨが、好ましくは８．１～１０．０、より好ましくはｐＨ８．２～９．０、さらに好ましくはｐＨ８．２～８．６、なお好ましくはｐＨ８．３～８．６である。
　さらにより好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、緩衝剤としてＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳを含有し、該溶離液中の該緩衝剤の濃度は５～１５ｍｍｏｌ／Ｌであり、該溶離液は、浸透圧が２６～３６ｍＯｓｍ／ｋｇであり、かつｐＨが好ましくはｐＨ８．２～９．０、さらに好ましくはｐＨ８．２～８．６、なお好ましくはｐＨ８．３～８．６である。
　なお好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、緩衝剤としてＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳを含有し、該溶離液中の該緩衝剤の濃度は５～１２．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、該溶離液は、浸透圧が２６～３６ｍＯｓｍ／ｋｇであり、かつｐＨがｐＨ８．３～８．６である。
　本発明で使用される該溶離液は、上述した緩衝剤以外に、溶媒、及びヘモグロビン変性剤、三価ヘム鉄への結合剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などの添加剤を含有していてもよい。
　好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、ヘモグロビン変性剤を含有する。ヘモグロビン変性剤は、ヘモグロビンのヘム鉄を二価から三価に変化させ、メトヘモグロビンを生成することができる酸化剤であればよい。そのような酸化剤の例としては、亜硝酸塩、フェリシアン化カリウム、メチレンブルー、過酸化水素、アスコルビン酸、硫化水素などが挙げられる。このうち、亜硝酸塩が好ましく、亜硝酸ナトリウム又は亜硝酸カリウムがより好ましい。該溶離液における該ヘモグロビン変性剤の濃度は、好ましくは０．０５～１５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．０～１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
　また好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、三価ヘム鉄への結合剤を含有する。該三価ヘム鉄への結合剤は、該ヘモグロビン変性剤により生成されたメトヘモグロビンを安定化させて、その溶出挙動を安定化させる。該三価ヘム鉄への結合剤の例としては、アジ化物、シアン化物等が挙げられる。アジ化物の例としては、アジ化ナトリウム、ジフェニルリン酸アジド、４－ドデシルベンゼンスルフォニルアジド、４－アセチルアミノベンゼンスルフォニルアジド、アジ化カリウム、アジ化リチウム、アジ化鉄、アジ化水素、アジ化鉛、アジ化水銀、アジ化銅、アジ化銀等が挙げられる。シアン化物の例としては、シアン化カリウム、シアン化水素、シアン化ナトリウム、シアン化銀、シアン化水銀、シアン化銅、シアン化鉛、シアン化鉄、シアン化リチウム、シアン化アンモニウム等が挙げられる。好ましくは、該三価のヘム鉄への結合剤はアジ化物であり、より好ましくはアジ化ナトリウムである。該溶離液における該三価ヘム鉄への結合剤の濃度は、好ましくは０．０５～１５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５～１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
　該ｐＨ調整剤としては、公知の酸及び塩基が挙げられ、酸の例としては、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸などが挙げられ、塩基の例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウムなどが挙げられる。
　該溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒が挙げられる。該溶媒の濃度は、塩等が析出しない程度であることが好ましく、例えば８０％（ｖ／ｖ）以下が好ましく、より好ましい範囲は０．１％（ｗ／ｗ）以上５０％（ｗ／ｗ）以下である。
　好ましくは、本発明のヘモグロビン分析方法では、上記溶離液を用いたグラジエント溶離により、ヘモグロビンを分離する。好ましくは、本発明の方法では、上記溶離液を溶離液Ｂ（以下、Ｂ液、又は単にＢと称する）とし、別の溶離液を溶離液Ａ（以下、Ａ液、又は単にＡと称する）として、Ｂ液の割合が段階的に高くなるように、Ａ液とＢ液の間でグラジエントをかける。
　溶離液Ａは、公知の塩化合物を含む緩衝剤を含有するものであればよい。該溶離液Ａに含まれ得る緩衝剤の例としては、有機酸又は無機酸を含む緩衝液が挙げられる。有機酸の例としては、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等、及びこれらの塩が挙げられ、無機酸の例としては、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸、過塩素酸等、及びこれらの塩が挙げられる。該溶離液Ａに用いられる緩衝液は、これらの有機酸及び無機酸のいずれか１種又は２種以上を組み合わせて含有することができる。このうち、リン酸塩、コハク酸塩、又は過塩素酸塩を含む緩衝液が好ましい。リン酸塩の例としては、ナトリウム塩及びカリウム塩などが挙げられ、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウムが好ましい。コハク酸塩の例としては、ナトリウム塩及びカリウム塩などが挙げられ、コハク酸一ナトリウム、コハク酸二ナトリウムが好ましい。過塩素酸塩の例としては、過塩素酸ナトリウムが挙げられる。これらのリン酸塩、コハク酸塩及び過塩素酸塩は、単独で用いられてもよく、２種以上で併用されてもよい。
　溶離液Ａは、上述した緩衝剤以外に、上述した溶離液Ｂに含有され得るものと同様の溶媒、及び添加剤（例えば上述したヘモグロビン変性剤、三価ヘム鉄への結合剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤など）を含有していてもよい。
　溶離液ＡのｐＨは、好ましくは５．０以上、より好ましくは５．２以上であり、好ましくは６．０以下、より好ましくは５．８以下である。溶離液ＡのｐＨ範囲は、好ましくは５．０～６．０であり、より好ましくは５．２～５．８である。また、溶離液Ａの浸透圧は、好ましくは１３０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上、より好ましくは１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上であり、好ましくは２１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、より好ましくは１９０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である。溶離液Ａの浸透圧の範囲は、好ましくは１３０～２１０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、より好ましくは１５０～１９０ｍＯｓｍ／ｋｇである。好ましい実施形態において、溶離液Ａは、ｐＨ５．０～６．０であり、かつ浸透圧が１３０～２１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは１５０～１９０ｍＯｓｍ／ｋｇである。より好ましい実施形態において、溶離液Ａは、ｐＨ５．２～５．８であり、かつ浸透圧が１３０～２１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは１５０～１９０ｍＯｓｍ／ｋｇである。
　好ましくは、本発明の方法におけるグラジエント溶離では、まず、Ａ液１００％（Ｂ液０％）で通液し、次いでグラジエントをかけてＢ液の割合を増加させ、Ｂ液の割合を１００％まで上げる。グラジエントの大きさは、カラムの性能等に合わせて適宜調整すればよく、特に限定されない。グラジエントの一例は、Ａ：Ｂ＝１００：０　→　Ｂの割合を５０～９８容量％（好ましくは７０～９５容量％）まで増加　→　段階的にＢの割合をさらに増加　→　Ａ：Ｂ＝０：１００である。グラジエントの別の一例は、Ａ：Ｂ＝１００：０　→　溶離液が全体でｐＨ６．５～８．０、浸透圧２０～１００ｍＯｓｍ／ｋｇになるようＢの割合を増加　→　段階的にＢの割合をさらに増加　→　Ａ：Ｂ＝０：１００である。必要に応じて、この後に再びＡ：Ｂ＝１００：０の通液時間を設けてもよい。
　一実施形態において、本発明のヘモグロビン分析方法は、異常ヘモグロビンの検出に利用される。本発明の方法で検出される異常ヘモグロビンとしては、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ、ＨｂＤ、及びＨｂＯ－Ａｒａｂからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられ、好ましくはＨｂＣ及びＨｂＳからなる群より選択される少なくとも１種である。本発明の方法においては、上記に挙げた異常ヘモグロビンの各々を、一度の分析で全て分離検出することが可能である。
　別の一実施形態において、本発明のヘモグロビン分析方法は、サラセミアマーカーの検出に利用される。本発明の方法で検出されるサラセミアマーカーとしては、ＨｂＡ２、ＨｂＦ、ＨｂＨ、ＨｂＢａｒｔ’、及びＨｂＣｏｎｓｔａｎｔ　Ｓｐｒｉｎｇからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられ、好ましくはＨｂＡ２である。本発明の方法においては、上記に挙げたサラセミアマーカーの各々を、一度の分析で全て分離検出することが可能である。
　さらに、本発明のヘモグロビン分析方法においては、上記に挙げた異常ヘモグロビン及びサラセミアマーカーの両方を検出することができる。さらに、該異常ヘモグロビン及び／又はサラセミアマーカーを検出するとともに、ＨｂＡ０、又は糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ｃを検出することができる。したがって、本発明のヘモグロビン分析方法により、試料中における異常ヘモグロビン及びサラセミアマーカーの有無を一度に分析することができ、さらに試料中における異常ヘモグロビン、サラセミアマーカー、及びＨｂＡ１ｃの有無を一度に分析することも可能である。したがって、本発明の方法は、一度の分析で多種のヘモグロビンを検出することができるので、異常Ｈｂ症やサラセミアの簡便かつ迅速な診断を可能にする。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（参考例１：ヘモグロビン分離用カラムの調製）
　非架橋性の親水性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールモノメタクリレート（日油社製）２００ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（日油社製）２００ｇを混合した単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた混合物を、４重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ－２０」）水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、カチオン交換基を有するアクリル系単量体として２－メタクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸（東亜合成社製）１００ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた架橋重合体粒子をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、スルホン酸基が導入された架橋重合体粒子を得た。得られたヘモグロビン分離用カラム充填剤を、内径４ｍｍ、長さ２０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビン分離用カチオン交換カラムを調製した。
（参考例２：検体の調製）
　検体Ａ：健常人から採取した血液検体を０．１％トリトンＸ－１００含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．００）で適宜希釈して検体を調製した。
　検体Ｂ：Ｌｙｐｈｏｃｈｅｃｋ（登録商標）Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　Ａ２　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｌｅｖｅｌ　２（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２及びＨｂＳ含有）を０．１％トリトンＸ－１００含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．００）で適宜希釈して検体を調製した。
　検体Ｃ：ＡＦＳＣヘモコントロール（ヘレナ研究所社製、ＨｂＡ０、ＨｂＳ及びＨｂＣ含有）を０．１％トリトンＸ－１００含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．００）で適宜希釈して検体を調製した。
　検体Ｄ：Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　Ａ２（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ＨｂＡ２含有）を０．１％トリトンＸ－１００含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．００）で適宜希釈して検体を調製した。
（試験１）
　参考例２で調製した検体Ａ～Ｃについてヘモグロビン分析を行った。分析条件を以下に示す。
　ＨＰＬＣ装置：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ２０Ａシリーズ（島津製作所社製）
　　検出器：ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）
　　送液ポンプ：ＬＣ－２０ＡＤ（島津製作所社製）
　　脱気ユニット：ＤＧＵ－２０Ａ５Ｒ（島津製作所社製）
　　カラムオーブン：ＣＴＯ－２０ＡＣ（島津製作所社製）
　　オートサンプラー：ＳＩＬ－２０ＡＣ（島津製作所社製）
　カラム：参考例１で作成したヘモグロビン分離用カチオン交換カラム
　流速：１．１ｍＬ／ｍｉｎ
　検出波長：４１５ｎｍ
　試料注入量：１０μＬ
　溶離液
　　溶離液Ａ：４０ｍｍｏｌ/Ｌコハク酸ナトリウム、４５ｍｍｏｌ/Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ/Ｌアジ化ナトリウムを含有する緩衝液（ｐＨ５．３、浸透圧１７０ｍＯｓｍ／ｋｇ）
　　溶離液Ｂ：溶離液Ｂ１～Ｂ６（表１）
　　グラジエント：表２のとおり
　ｐＨメーター：Ｆ－５２（堀場製作所製）
　浸透圧計：オズモメーター３２５０（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例１～６での検体Ａ～Ｃの分析結果を表３に示す。また、実施例１、２及び３で得られた検体Ａ～Ｃのクロマトグラムを図１、図２、及び図３にそれぞれ示す。実施例１～６において、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、及びＨｂＣがそれぞれ別個のピークとして検出された。本結果より、緩衝剤ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｅｎ又はＢｉｃｉｎｅを含む溶離液を用いることで、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、及びＨｂＣを検出できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（試験２）
　参考例２で調製した検体Ａ～Ｃについてヘモグロビン分析を行った。溶離液Ｂ及びグラジエント条件以外の条件は、試験１と同様にした。溶離液Ｂとしては、表４～６に記載の溶離液を用いた。グラジエント条件は、ＨｂＡ０を２．１ｍｉｎに溶出させるよう、溶離液Ａと溶離液Ｂの混合割合を適宜決定した。また、ＨｂＣ溶出確認のため、溶離液Ｂ濃度１００％の時間を適宜延長した。
　分析結果を表４～６に示す。表６に示すとおり、ｐＨ８．０の溶離液Ｂを用いた比較例１～３ではＨｂＣが検出されなかった。また、浸透圧が４０ｍＯｓｍ／ｋｇを超える溶離液Ｂを用いた比較例３～４では、ＨｂＡ０のピークショルダーにＨｂＡ２が重なり、両種のピークが十分に分離されなかった。一方、表４～５に示すとおり、ｐＨが８．０より高く、かつ浸透圧が４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である実施例７～１８では、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣがそれぞれ検出された。ただし実施例１０、１１では、ＨｂＡ２の溶出がやや早くなり、ＨｂＡ０とＨｂＡ２のピークが接近する傾向がみられた（データ示さず）。これらの結果より、ｐＨ８．１以上、かつ浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の溶離液Ｂが、各種ヘモグロビンの分析に適していることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（試験３）
　参考例２で調製した検体Ｂ及び検体Ｄについてヘモグロビン分析を行った。グラジエントと溶離液Ｂ以外の分析条件は、試験１と同じとした。溶離液Ｂには、表７に記載のｐＨ及び浸透圧を有するリン酸ナトリウムと過塩素酸ナトリウムを含有する緩衝液を含む溶離液を用いた。なお、表７に記載の溶離液の組成は、従来のヘモグロビン分析で一般的に用いられているリン酸緩衝液を含む溶離液の組成を基にした。グラジエント条件は表８に示すとおりとした。
　分析結果を表７に示す。また比較例５～８のクロマトグラムを図４～７に示す。検体ＢにはＨｂＡ２が５～７質量％程度含有されていたが、比較例５～８では、ＨｂＡ０のピークとＨｂＡ２のピークが重なり、両種のピークが十分に分離されなかった。この結果より、ｐＨ８．０以下、浸透圧が１３０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上であるような従来使用される溶離液では、ＨｂＡ０とＨｂＡ２を十分に検出できないことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 （試験４）
　参考例２で調製した検体Ａ～Ｃについて、表９に記載のリン酸緩衝液を含む溶離液Ｂを用いてヘモグロビン分析を行った。溶離液Ｂ以外の条件は試験２と同様にした。溶離液Ｂとしては、表９に記載のリン酸緩衝液を含む溶離液を用いた。
　分析結果を表９に示す。比較例９、１０では、ＨｂＡ０とＨｂＡ２とのピークの分離が十分でなく、さらにＨｂＳ及びＨｂＣのいずれか又は両方が検出されなかった。比較例１１～１４では、ＨｂＳ及びＨｂＣは検出されたが、ＨｂＡ０とＨｂＡ２とのピークの分離が十分でなかった。比較例９～１４の溶離液Ｂは、上述した実施例の溶離液と比べて浸透圧が高く、またｐＨもより高いか又はより低くなり、ｐＨ８．０以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の条件を達成することができなかった。このことが、比較例９～１４における不十分なヘモグロビン検出につながったと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（試験５）
　参考例２で調製した検体Ａ～Ｃについてヘモグロビン分析を行った。溶離液Ｂ及びグラジエント条件以外の条件は試験１と同様にした。溶離液Ｂとしては表１０に記載の溶離液を用いた。グラジエント条件は表１１のとおりとした。分析結果を表１０に示す。実施例１９及び２０の両方で、ＨｂＡ０とＨｂＡ２のピークが良好に分離され、かつＨｂＳとＨｂＣのピークも良好に分離され、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣを検出することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011

Claims (21)

  1. 　ヘモグロビン分析方法であって、
    　カチオン交換クロマトグラフィーにより試料中のヘモグロビンを分離することを含み、
    　該ヘモグロビンの分離において、ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の溶離液が用いられる、
    方法。
  2. 　前記溶離液が金属イオンを含まない緩衝剤を含有する、請求項１記載の方法。
  3. 　前記緩衝剤がＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳである、請求項２記載の方法。
  4. 　前記溶離液中の前記緩衝剤の濃度が２～１７ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項２又は３記載の方法。
  5. 　前記溶離液がヘモグロビン変性剤を含有する、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　前記溶離液を用いたグラジエント溶離によりヘモグロビンを分離する、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　前記グラジエントにおいて前記溶離液の割合が０％から１００％まで増加する、請求項６記載の方法。
  8. 　ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ、ＨｂＤ、及びＨｂＯ－Ａｒａｂからなる群より選択される少なくとも１種の異常ヘモグロビンを分離する、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
  9. 　ＨｂＡ２、ＨｂＦ、ＨｂＨ、ＨｂＢａｒｔ’、及びＨｂＣｏｎｓｔａｎｔ　Ｓｐｒｉｎｇからなる群より選択される少なくとも１種のサラセミアマーカーを分離する、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
  10. 　前記クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィーである、請求項１～９のいずれか１項記載の方法。
  11. 　ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である、カチオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離用溶離液。
  12. 　金属イオンを含まない緩衝剤を含有する、請求項１１記載の溶離液。
  13. 　前記緩衝剤がＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳである、請求項１２記載の溶離液。
  14. 　前記溶離液中の前記緩衝剤の濃度が２～１７ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１２又は１３記載の溶離液。
  15. 　前記溶離液がヘモグロビン変性剤を含有する、請求項１１～１４のいずれか１項記載の溶離液。
  16. 　ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である液体組成物の、カチオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離用溶離液としての使用。
  17. 　ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である液体組成物の、カチオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離用溶離液の製造のための使用。
  18. 　前記液体組成物が金属イオンを含まない緩衝剤を含有する、請求項１６又は１７記載の使用。
  19. 　前記緩衝剤がＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳである、請求項１８記載の使用。
  20. 　前記液体組成物中の前記緩衝剤の濃度が２～１７ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１８又は１９記載の使用。
  21. 　前記液体組成物がヘモグロビン変性剤を含有する、請求項１６～２０のいずれか１項記載の使用。 
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2021182599A1 (ja) * 2020-03-13 2021-09-16
JP2021179337A (ja) * 2020-05-12 2021-11-18 積水メディカル株式会社 ヘモグロビン分析方法
WO2023223176A1 (en) * 2022-05-14 2023-11-23 Shanmukha Innovations Private Limited An apparatus, kit and methods for detecting thalassemia hemoglobin in a sample
WO2024241529A1 (ja) * 2023-05-24 2024-11-28 東ソー株式会社 ヘモグロビンの分離用溶離液およびその分離方法

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10227780A (ja) * 1997-02-14 1998-08-25 Sekisui Chem Co Ltd 糖化ヘモグロビンの測定方法および装置
US5801053A (en) * 1996-05-06 1998-09-01 Primus Corporation Chromatographic method for the identification and characterization of hemoglobin variants in blood
JPH11295286A (ja) * 1998-04-10 1999-10-29 Sekisui Chem Co Ltd ヘモグロビン類の測定方法
JP2001221788A (ja) * 2000-02-07 2001-08-17 Sekisui Chem Co Ltd ヘモグロビン類の測定方法
JP2002520338A (ja) * 1998-07-10 2002-07-09 バイオピュア コーポレーション ヘモグロビンの精製方法
JP2010237110A (ja) 2009-03-31 2010-10-21 Sekisui Medical Co Ltd ヘモグロビン類の分析方法及び蛋白質の分析方法
JP2011047858A (ja) 2009-08-28 2011-03-10 Sekisui Medical Co Ltd ヘモグロビン類分離用カラム充填剤、ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法、並びに、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法
WO2011096420A1 (ja) 2010-02-02 2011-08-11 積水メディカル株式会社 ヘモグロビンｓの分析方法、ヘモグロビンａ２の分析方法、及び、ヘモグロビンａ０の分析方法
WO2011125484A1 (ja) * 2010-03-31 2011-10-13 積水メディカル株式会社 ヘモグロビン類の分析方法
JP2012168055A (ja) * 2011-02-15 2012-09-06 Sekisui Medical Co Ltd 液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法、液体クロマトグラフィーによる試料の測定方法、及び、ヘモグロビン類の測定方法
JP2012168054A (ja) * 2011-02-15 2012-09-06 Sekisui Medical Co Ltd 液体クロマトグラフィー用カラム充填剤、液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法、及び、ヘモグロビン類の測定方法
JP2016027326A (ja) 2014-06-26 2016-02-18 アークレイ株式会社 測定方法、測定装置および溶離液

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3763136A (en) * 1971-12-07 1973-10-02 Diagnostic Data Inc One step chromatographic isolation of orgotein
US3763137A (en) * 1971-12-07 1973-10-02 Diagnostic Data Inc Isolation of orgotein from red blood cells
US4108603A (en) * 1977-05-18 1978-08-22 Purdue Research Foundation Method for rapid analysis of hemoglobin variants by high speed liquid chromatography
US4246084A (en) * 1979-05-29 1981-01-20 Beckman Instruments, Inc. Electrophoretic technique for assaying the relative distribution of lactate dehydrogenase isoenztimes and buffers for use therein
US4407961A (en) * 1981-03-16 1983-10-04 Sanders James L Ion-exchange system and method for isolation and determination of glycosylated hemoglobin in human blood
US4517241A (en) * 1982-12-02 1985-05-14 Alpert Andrew J Chromatographic support material
CA1312009C (en) * 1986-11-10 1992-12-29 Carl W. Rausch Extra pure semi-synthetic blood substitute
US4970171A (en) * 1987-11-09 1990-11-13 Miles Inc. Denaturant reagents for convenient determination of hemoglobin derivatives in blood
US6150506A (en) * 1989-05-10 2000-11-21 Baxter Biotech Technology Sarl Modified hemoglobin-like compounds and methods of purifying same
US6828125B1 (en) * 1989-05-10 2004-12-07 Baxter Biotech Technology, S.A.R.L. DNA encoding fused di-alpha globins and use thereof
JP2619537B2 (ja) * 1989-09-18 1997-06-11 株式会社日立製作所 液体クロマトグラフの方法，その装置，そのシステム，及びその分離カラム
CZ281912B6 (cs) * 1990-11-29 1997-03-12 The Upjohn Company Směs hemoglobinu síťovaného imidoesterem a způso b její výroby
US5260419A (en) * 1991-03-20 1993-11-09 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Purification of active and inactive/latent forms of plasminogen activator inhibitor-1
JPH05113440A (ja) * 1991-04-17 1993-05-07 Tosoh Corp 糖化ヘモグロビンの分析方法
JP2669255B2 (ja) * 1992-04-01 1997-10-27 株式会社日立製作所 ヘモグロビン類の分析方法，分析装置およびそれに用いるカラム劣化抑制液
US5264555A (en) * 1992-07-14 1993-11-23 Enzon, Inc. Process for hemoglobin extraction and purification
CA2106612C (en) * 1993-09-21 2001-02-06 Diana Pliura Displacement chromatography process
US5753465A (en) * 1994-08-30 1998-05-19 Carnegie Mellon University Unmodified recombinant human adult hemoglobin production
US5843888A (en) * 1995-05-01 1998-12-01 Carnegie Mellon University Low oxygen affinity mutant hemoglobin
US5691453A (en) * 1995-06-07 1997-11-25 Biopure Corporation Separation of polymerized hemoglobin from unpolymerized hemoglobin on hydroxyapatite using HPLC
WO1999004269A1 (en) * 1997-07-17 1999-01-28 Primus Corporation High speed chromatographic method for hemoglobin variants screening and quantification of hemoglobins a2 and f
IT1294312B1 (it) * 1997-08-07 1999-03-24 Sgs Thomson Microelectronics Processo per la fabbricazione di un dispositivo di memoria non volatile programmabile elettricamente
JPH11304782A (ja) * 1998-04-24 1999-11-05 Sekisui Chem Co Ltd 液体クロマトグラフによる試料の分離方法
EP1103812B1 (en) * 1998-08-07 2015-11-18 Sekisui Chemical Co., Ltd. Method for determining hemoglobins
JP4094776B2 (ja) * 1999-07-06 2008-06-04 積水化学工業株式会社 溶血試薬及びこれを用いたヘモグロビン類の測定方法
JP4420539B2 (ja) * 1999-09-24 2010-02-24 積水化学工業株式会社 ヘモグロビンａ２の分離方法
JP2003014714A (ja) * 2001-06-29 2003-01-15 Sekisui Chem Co Ltd ヘモグロビン類の測定方法
JP4139333B2 (ja) * 2001-11-09 2008-08-27 キネティック バイオシステムズ インコーポレイテッド クロマトグラフィー用の方法及び組成物
HUE034672T2 (hu) * 2003-05-01 2018-02-28 Merial Inc Kutya GHRH-gén, polipeptidek és eljárások alkalmazásukra
FR2878033B1 (fr) 2004-11-18 2007-05-04 Sebia Sa Procede d'analyse de l'hemoglobine par electrophorese capillaire, trousse pour electrophorese capillaire et utilisation de ralentisseur de flux dans un tel procede
CN101198350A (zh) 2005-06-17 2008-06-11 巴克斯特国际公司 含胃动素样肽的稳定的缓冲的药物组合物
AU2008266938A1 (en) * 2007-06-13 2008-12-24 Opk Biotech Llc Targeted oxygen delivery via intravenous or intra-arterial infusion of oxygenated polymerized hemoglobin solutions
JP6370792B2 (ja) * 2012-10-03 2018-08-08 ツェー・エス・エル・ベーリング・アクチエンゲゼルシャフト タンパク質の精製方法
WO2018012607A1 (ja) * 2016-07-13 2018-01-18 キッコーマン株式会社 反応促進剤
US11208675B2 (en) * 2016-07-13 2021-12-28 Kikkoman Corporation Reaction accelerating agent

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5801053A (en) * 1996-05-06 1998-09-01 Primus Corporation Chromatographic method for the identification and characterization of hemoglobin variants in blood
JPH10227780A (ja) * 1997-02-14 1998-08-25 Sekisui Chem Co Ltd 糖化ヘモグロビンの測定方法および装置
JPH11295286A (ja) * 1998-04-10 1999-10-29 Sekisui Chem Co Ltd ヘモグロビン類の測定方法
JP2002520338A (ja) * 1998-07-10 2002-07-09 バイオピュア コーポレーション ヘモグロビンの精製方法
JP2001221788A (ja) * 2000-02-07 2001-08-17 Sekisui Chem Co Ltd ヘモグロビン類の測定方法
JP2010237110A (ja) 2009-03-31 2010-10-21 Sekisui Medical Co Ltd ヘモグロビン類の分析方法及び蛋白質の分析方法
JP2011047858A (ja) 2009-08-28 2011-03-10 Sekisui Medical Co Ltd ヘモグロビン類分離用カラム充填剤、ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法、並びに、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法
WO2011096420A1 (ja) 2010-02-02 2011-08-11 積水メディカル株式会社 ヘモグロビンｓの分析方法、ヘモグロビンａ２の分析方法、及び、ヘモグロビンａ０の分析方法
WO2011125484A1 (ja) * 2010-03-31 2011-10-13 積水メディカル株式会社 ヘモグロビン類の分析方法
JP2012168055A (ja) * 2011-02-15 2012-09-06 Sekisui Medical Co Ltd 液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法、液体クロマトグラフィーによる試料の測定方法、及び、ヘモグロビン類の測定方法
JP2012168054A (ja) * 2011-02-15 2012-09-06 Sekisui Medical Co Ltd 液体クロマトグラフィー用カラム充填剤、液体クロマトグラフィー用カラム充填剤の製造方法、及び、ヘモグロビン類の測定方法
JP2016027326A (ja) 2014-06-26 2016-02-18 アークレイ株式会社 測定方法、測定装置および溶離液

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3783359A4

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2021182599A1 (ja) * 2020-03-13 2021-09-16
WO2021182599A1 (ja) 2020-03-13 2021-09-16 積水メディカル株式会社 ヘモグロビン分析方法
CN115315626A (zh) * 2020-03-13 2022-11-08 积水医疗株式会社 血红蛋白分析方法
CN115315626B (zh) * 2020-03-13 2024-08-20 积水医疗株式会社 血红蛋白分析方法
JP7694887B2 (ja) 2020-03-13 2025-06-18 積水メディカル株式会社 ヘモグロビン分析方法
JP2021179337A (ja) * 2020-05-12 2021-11-18 積水メディカル株式会社 ヘモグロビン分析方法
JP7355471B2 (ja) 2020-05-12 2023-10-03 積水メディカル株式会社 ヘモグロビン分析方法
WO2023223176A1 (en) * 2022-05-14 2023-11-23 Shanmukha Innovations Private Limited An apparatus, kit and methods for detecting thalassemia hemoglobin in a sample
WO2024241529A1 (ja) * 2023-05-24 2024-11-28 東ソー株式会社 ヘモグロビンの分離用溶離液およびその分離方法

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