WO2019229253A1 - TRAITEMENT DES TROUBLES NEUROLOGIQUES AVEC LE PlGF - Google Patents

TRAITEMENT DES TROUBLES NEUROLOGIQUES AVEC LE PlGF Download PDF

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WO2019229253A1 PCT/EP2019/064216 EP2019064216W WO2019229253A1 WO 2019229253 A1 WO2019229253 A1 WO 2019229253A1 EP 2019064216 W EP2019064216 W EP 2019064216W WO 2019229253 A1 WO2019229253 A1 WO 2019229253A1
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pigf
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Bruno Gonzalez
Stéphane MARRET
Soumeya BEKRI
Annie Laquerriere
Maryline LECOINTRE
Cécile LEGER
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Centre Hospitalier Universitaire de Rouen
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Universite de Rouen
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Centre Hospitalier Universitaire de Rouen
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    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors

Definitions

  • microorganisms which are suitable for the purpose of the invention include yeasts (Buckholz RG, Current Opinion in Biotechnology v. 4, No. 5, 1993, pages 538-42) and bacteria (Olins and Lee, Current Opinion in Biotechnology, Vol 4, No. 5, 1993, pp. 520-5).
  • yeasts Bact al.
  • bacteria Bact al.
  • eukaryotic cells include cells from animals such as mammals (Edwards CP and Aruffo A, Current Opinion in Biotechnology Vol 4, No. 5, 1993, pages 558-63), reptiles, and the like. The plant cells can also be used.
  • PIGF analogs can be synthesized using the technique described by Zheng et al. (Acta Ophthalmologica 2012 90 (7): e512 - e523).
  • the subject of the present invention is a PIGF for its use in the prevention and treatment of a neurological disorder in a subject, in particular a neurological disorder related to a deficit in cortical organization, and even more particularly in a patient. subject having been exposed to alcohol in utero.
  • central nervous system refers to a system consisting of the brain including the brain, and more particularly the cerebral cortex, the brainstem, and the cerebellum located in the cranial box, and the spinal cord. spine located in the spinal canal.
  • the role of the central nervous system is to receive, record, and interpret the signals that arrive from the periphery, and to organize the response to be sent.
  • the central nervous system is often opposite to the peripheral nervous system which is constituted by the cranial nerves and the spinal nerves, attached to the central nervous system.
  • the elements of the central nervous system are the nerve cells, namely: neurons and glial cells.
  • the term "the establishment of the cortical organization” means the processes leading to the organization of the cerebral cortex (or also called neocortex in the present description).
  • the establishment of the cerebral cortex is a complex operation involving the production of a remarkable variety of excitatory and inhibitory neurons, which are then assembled into functional circuits that are organized into layers and areas.
  • cortical organization deficit is meant here any alteration of the organization of the cerebral cortex.
  • the pathologies of cortical development are numerous and varied; they play an important role in the etiology of many neuropsychiatric pathologies.
  • MDC cortical development
  • MDC are responsible epilepsy, neurological and cognitive disorders of varying severity, in relation to the stage of onset of the disorders and the extent of the malformation.
  • this alteration concerns the proliferation, migration, differentiation, synaptogenesis and apoptosis of the neuronal cells and / or glial cells that constitute the cerebral cortex.
  • fetal exposure to alcohol alters the migration of nerve cells and / or glial cells.
  • neurons or neuronal cells denote a cell anatomically and physiologically specialized in the reception, integration and transmission of information. Neurons thus have their own structures (axons, dendrites and synapses) enabling them to exert nerve transmission.
  • neuronal and / or glial cell proliferation refers to the ability of neuronal and glial stem cells to multiply, which ultimately results in the production of neurons and radial glia. which are necessary for the definitive formation of a neuronal structure, especially for the formation of the cerebral cortex.
  • this affected proliferation is reflected, for example, by a modification, most often by a decrease in the number of neuronal and / or glial cells in several brain structures. In particular, it may be a change in the number of neurons in the neocortex.
  • exogenous factors such as exposure to toxic compounds and in particular, in utero exposure to alcohol.
  • the result of an affected cell migration is a dysfunction of the neuronal structure to which the nerve and / or glial cells were to migrate.
  • the endogenous and / or exogenous factors mentioned above may also cause increased migration of nerve cells resulting in an abnormal increase in the density of neuronal structures which also impede their functioning.
  • an alteration of the migration of neuronal cells and / or glial cells most frequently leads to a reorganization of the cerebral cortex which results in microcephaly. Alteration of the migration of NMDA neurons and GABAergic interneurons will most often lead to a loss of equilibrium between CNS excitation and inhibition processes.
  • a failure of this process may, for example, result in the impossibility for the glial cells to differentiate into oligodendrocytes or astrocytes involved in the processes of cell migration, myelinization of nerve fibers and regulation of nerve homeostasis.
  • genes specific to neurons and / or glial cells for example the GluN1 gene coding for a subunit of the NMDAR receptor of GABAergic interneurons
  • disorganization of the cerebrovascular network and / or exposure to toxic external factors, in particular alcohol consumption during pregnancy often result in one or more of the neurodevelopmental disorders mentioned above.
  • the neurodevelopmental disorder is a failure of the establishment of the cortical (or neocortical) organization.
  • PIGF is used in the prevention and / or treatment of a neurodevelopmental disorder which is a failure in the establishment of cortical organization.
  • disorders of neurodevelopment in particular those resulting from the exposure of a subject to alcohol in utero, are associated with the disturbance of astrocyte and / or oligodendrocyte gliogenesis, with a disturbance of neuronal progenitor production, or ventriculomegaly associated with abnormalities of the basal ganglia, corpus callosum, hippocampus, hypothalamus, pituitary gland, cerebellum, olfactory bulb, diencephalon or brainstem.
  • interneurons refers to a bi or multipole neuron that establishes multiple connections between an afferent network and an efferent network.
  • the majority of interneurons are inhibitors and secrete a characteristic neurotransmitter, GABA (g-aminobutyric acid).
  • the neurological disorder is an interneuronopathy.
  • interneuronopathy refers to a group of diseases related to altered development, migration and / or function of interneurons.
  • Interneuronopathies as understood here include, for example, schizophrenia, autism, epileptic encephalitis, including West syndrome (WS), Ohtahara syndrome (OS) and Dravet syndrome (DS). , classic lissencephaly, central nervous system inflammation (CNS), and Miller-Dieker syndrome.
  • GABAergic interneurons refers to interneurons using GABA as a neurotransmitter. These interneurons represent 20 to 30% of the cortical neurons and are located around the excitatory pyramidal neurons to ensure their regulation. In humans there are two lineages of GABAergic interneuron precursors distinct by their embryonic origins. The first lineage, which accounts for 65% of GABAergic cortical innervation, originates from the ZV and ZSV of the dorsal telencephalon. The second lineage originates from the ganglionic eminences (EG) of the ventral telencephalon and represents 35% of GABAergic interneurons. In the mature cerebral cortex, homeostasis of neuronal activity is ensured by a balance between the excitatory and inhibitory neuronal systems. The inhibitory component is mainly provided by GABAergic interneurons.
  • the term "migration of GABAergic interneurons” designates a process that starts with the migration of progenitors.
  • GABAergic telencephalon where they are generated to reach their final position in the neocortex but also in the stratum of the hippocampus or in the olfactory bulbs. In humans, some of these neurons migrate radially and the other tangentially. There are two different tangential migration pathways: a superficial or pial pathway and a deep or periventricular pathway.
  • the main wave of cortical neuron migration extends from the 10th to the 25th SG, although some GABAergic progenitors begin to migrate before this period.
  • the GABAergic progenitors will use the vascular network already established as a physical support and as a guide for their migration. Indeed, the endothelial cells of the cerebrovascular network will secrete GABA which will bind to the GABA-A and GABA-B receptors expressed by GABAergic precursors in migration. The binding of GABA will thus act as a guiding signal ensuring communication between the migrating cell and the endothelial cell.
  • GABA interneurons also use radiative glia as a migration medium and as a structural support for their positioning in the neocortex.
  • PIGF is used to prevent and / or treat a neurodevelopmental disorder caused by a failure of proliferation, growth, migration and / or differentiation of glial cells, particularly by failure of oligodendrocyte migration. More preferably, this failure is caused by alcohol in utero.
  • oligodendrocyte refers to a cell of the central nervous system belonging to the interstitial neuroglia (it is a support cell). These cells are found in both the gray and the white matter. In the gray matter, oligodendrocytes have a position close to the pericaryons (cell bodies) of neurons and have a metabolic role. In the white matter, they have the role of axonal myelination. They come from precursors of glial cells (glioblasts) of the embryonal neuronal tube.
  • oligodendrocytes that colonize the corpus callosum and the neocortex are generated at the level of ganglionic eminences and migrate according to a vasculo-dependent process (Tsai et al., Science, 2016).
  • the present invention relates to a PIGF for its use in the prevention and / or treatment of a neurodevelopmental disorder related to a disruption of the activity of matrix metalloproteinases (MMP) and / or an inhibitor of it. More preferably, this disturbance is caused by an alcoholization in utero.
  • MMP matrix metalloproteinases
  • matrix metalloproteinase or MMP refers to a family of proteases capable of degrading elements of the endothelial basal lamina of the extracellular matrix when activated.
  • the present invention relates to a PIGF for its use in the prevention and / or treatment of a neurodevelopmental disorder related to a disruption of the activity of ALMR-2 and / or MMP-9 matrix metalloproteases, preferably MMP-9.
  • the disruption of the activity of MMP-9 and / or tPA depends in particular on the manner in which exposure to alcohol in utero occurs, namely, chronically (alcohol, even in small amounts absorbed regularly during pregnancy) or in an acute manner (a large amount of alcohol even absorbed once during pregnancy).
  • the inventors have demonstrated that acute treatment with alcohol (absorption of a significant amount of alcohol at one time) leads to inhibition of the MMP-9 activity and / or tPA at the level of the pathway. of migration which reduces neuronal and / or glial migration.
  • the neurological disorders and in particular the neurodevelopmental disorders are preferably those which are typically manifested early during development. They are characterized by development deficits that lead to impaired functioning personal, social, academic or professional. Neurodevelopmental disorders are sometimes expressed by mental retardation and more often by learning difficulties, difficulty of memorization, loss of concentration, hyperactivity, depression, emotional instability and behavioral disorders etc. Such disorders are selected for example from the group comprising schizophrenia, multiple sclerosis, autism, epileptic encephalitis, including West syndrome (WS), Ohtahara syndrome (OS) and Dravet (DS), classic lissencephaly, central nervous system (CNS) inflammation, Miller-Dieker syndrome, and fetal alcohol spectrum disorder (FASD).
  • WS West syndrome
  • OS Ohtahara syndrome
  • DS Dravet
  • CNS central nervous system
  • FASD fetal alcohol spectrum disorder
  • a subject exposed in utero to alcohol said disorder being manifested by one or more symptoms selected from the group consisting of decreased cervical mass, hyperactivity, loss of attention, difficulty of learning, difficulty with memory, depression, anxiety, emotional disturbances, excessive irritability and behavioral problems.
  • the treated subject is a subject having been exposed in utero to the alcohol which is chosen from an embryo, a fetus or a child, preferably a fetus or a child, in particular, a premature child.
  • the present invention relates to a PIGF for its use in the treatment and / or prevention of a neurological disorder due to in utero exposure to alcohol in a premature child.
  • the period between the 30th gestational week and the term of pregnancy is essential for brain corticogenesis. It is thus particularly preferred to administer the PIGF to a fetus, in particular to a fetus exposed in utero to alcohol at this precise time.
  • the treatment when the subject is a premature child, the treatment will consist in supplementing in PIGF this subject on the ex utero period corresponding to lost weeks of intrauterine life.
  • the treatment window can extend from the 30th gestational week to the theoretical term (40 gestational weeks), during which time cerebral angiogenesis in humans is particularly intense.
  • subject means a human, and preferably an embryo, a fetus or a child.
  • An "embryo” as it is understood here corresponds to a fertilized oocyte less than three months old.
  • fetus is meant an individual taken before birth and whose gestational age is between 3 and 9 months. After childbirth, the subject becomes a child.
  • child is meant according to the invention an individual whose age is less than 3 years.
  • newborns whose age is between 0 and 1 month
  • infants who are between 1 month and 2 years
  • the children themselves who are at least 2 years old.
  • premature children may as well be born at term as it is premature.
  • premature refers to a child born alive before 37 weeks of amenorrhea. This term covers three sub-categories: extreme prematurity ( ⁇ 28 weeks); extreme prematurity (between the 28th and 32nd week); average prematurity or late (between the 32nd and the 37th week).
  • premature children treated with PIGF are preferably in the category of medium or even late prematurity.
  • the subject is a subject with fetal alcohol disorder (FASD subject) or a FAS subject (fetal alcohol syndrome).
  • a subject with fetal alcohol spectrum disorder or FASD subject as used herein refers to an embryo, fetus or subject, particularly human, who is exposed to or likely to be exposed to alcohol utero and who suffers from fetal alcohol disorders or who is in danger of developing because of maternal alcohol consumption one of the conditions associated with fetal alcohol disorders, for example, a neurological disorder.
  • a FASD subject is affected in particular by a FAS, it is referred to in this case as a SAF subject.
  • treatment is meant here any action to reduce or eradicate the symptoms or causes of neurological disorders.
  • a treatment within the meaning of the invention may comprise the administration of PIGF (or supplementation with PIGF), a pharmaceutical composition or a product comprising it with or without a psychotherapeutic follow-up.
  • prevention is meant here any action to completely or partially prevent the risk of onset of symptoms or causes of neurological disorders due to fetal alcohol.
  • Prevention within the meaning of the present invention comprises the administration of IGF, of a pharmaceutical composition, to a subject exposed in utero to alcohol or to a subject having been exposed in utero to alcohol but for which the symptoms of neurological disorders have not yet appeared and brain development is still ongoing.
  • the inventors take advantage of the fact that PIGF is a placental factor naturally present at these stages of fetal development in a healthy subject, which has the advantage of easy use of IFIG by compensation in the prevention of neurological disorders.
  • the placental growth factor is administered in a therapeutically effective amount to a subject having been exposed to the alcohol in utero.
  • a therapeutically effective amount means an amount sufficient to influence the therapeutic course of a particular disease state.
  • a therapeutically effective amount is also one in which all the toxic or secondary effects of the agent are offset by the therapeutically beneficial effects of the active ingredient used.
  • the placental growth factor (PIGF) is administered in utero and / or ex utero. It is thus conceivable to start a treatment (or prevention) by the administration of IGFI during the intrauterine period and to continue it after delivery especially when the child is born prematurely and therefore loses the physiological contribution of placental PIGF.
  • the PIGF will be administered alone or in a pharmaceutical composition systemically, particularly intravenously, intramuscularly, intradermally, intraperitoneally, subcutaneously, or orally. More preferably, the PIGF will be administered several times, spread over time. In particular, when the administration of IGF is carried out in utero, it preferably takes place directly at the placental level in order to reach the fetal brain more quickly and prevent the degradation of the protein by the maternal organism.
  • IFIG When the administration of IFIG takes place after birth, preferably it is administered parenterally, preferably intravenously, especially if it is a premature child or a newborn.
  • Optimal modes of administration, dosages and dosage forms may be determined according to the criteria generally considered in establishing a patient-specific treatment such as, for example, the age or body weight of the patient, the severity of his or her general condition, tolerance to treatment and side effects noted.
  • PIGF When PIGF is administered as pharmaceutical compositions, for subcutaneous, intramuscular, intravenous, transdermal local administration, PIGF can be administered in unit dosage forms, in admixture with conventional pharmaceutical carriers to the subject in need thereof. . Suitable unit dosage forms include intramuscular, intravenous forms.
  • Forms for parenteral administration are conventionally obtained by mixing PIGF with buffers, stabilizing agents, preservatives, solubilizing agents, isotonic agents and suspending agents. In accordance with known techniques, these mixtures are then sterilized and then packaged in the form of intravenous injections.
  • buffers based on organic phosphate salts.
  • suspending agents include methylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, acacia and sodium carboxymethylcellulose.
  • useful stabilizers according to the invention are sodium sulfite and sodium metasulfite, while sodium p-hydroxybenzoate, sorbic acid, cresol and chlorocresol can be mentioned as preservatives.
  • the dosage depends of course on the form in which the PIGF will be administered, the mode of administration, the therapeutic indication, the age of the patient and his condition.
  • the dose to be administered is preferably from 0.001 to 250 mg / kg of PIGF per day, preferably from 0.01 to 100 mg / kg of PIGF per day, more preferably from 0.1 to 50 mg / kg of PIGF per day. day and even more preferably from 1 to 25 mg / kg of PIGF per day.
  • the unit dose of PIGF preferably comprises from 0.1 to 50 mg / kg of this compound.
  • the initially administered dose of PIGF may be adjusted if necessary during treatment depending on the response to this treatment of the subject being treated.
  • Those skilled in the art based on this general knowledge and on the present description will be able to adjust the dose of PIGF so as to optimize its therapeutic effect.
  • composition of the present invention can also be used to improve the migration of neurons and / or glial cells from brain development, particularly migration to the neocortex, of a subject suffering from one of the diseases selected from the group consisting of schizophrenia, multiple sclerosis, autism, epileptic encephalitis, including West syndrome (WS), Ohtahara syndrome (OS) and Dravet syndrome (DS), classical lissencephaly, central nervous system (CNS) inflammation, Miller-Dieker syndrome, autism, alcohol-in-utero exposure disorders (FASD).
  • diseases selected from the group consisting of schizophrenia, multiple sclerosis, autism, epileptic encephalitis, including West syndrome (WS), Ohtahara syndrome (OS) and Dravet syndrome (DS), classical lissencephaly, central nervous system (CNS) inflammation, Miller-Dieker syndrome, autism, alcohol-in-utero exposure disorders (FASD).
  • composition according to the invention can be in various forms and be administered in different ways as indicated above in detail.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a PIGF as an active ingredient in a concentration of between 0.001 mg / kg and 250 mg / kg by weight relative to the total weight of the subject to whom the pharmaceutical composition will be administered. .
  • the concentration of PIGF is between 0.01 mg / kg and 100 mg / kg by weight relative to the weight of the subject to which the pharmaceutical composition will be administered and even more particularly, between 0.15 mg / kg and 50 mg / kg. kg by weight relative to the weight of the subject to which the pharmaceutical composition will be administered or between 1 mg / kg and 25 mg / kg by weight relative to the total weight of the subject to which the composition will be administered.
  • the inventors have demonstrated that the increase in the amount of PIGF is particularly effective in the restoration of cerebral corticogenesis thus making it possible to correct the neuronal damage induced by the endogenous and / or exogenous factors mentioned above, such as exposure to alcohol in utero, including neuronal damage related to a cortical deficit.
  • the PIGF or the pharmaceutical composition comprising it is therefore used for the treatment and / or the prevention of neurological disorders, in particular neurological disorders related to a cortical deficit, more particularly neurological disorders due to exposure to alcohol in utero.
  • PIGF PIGF-induced neurodegenerative disorders
  • these disorders are related to a cortical deficit; in a more preferred embodiment, these disorders are due to exposure to alcohol in utero.
  • the present invention thus relates to a PIGF or a pharmaceutical composition comprising it for its use in the prevention and / or treatment of neurological disorders, in particular neurodevelopmental disorders.
  • these disorders are related to a cortical deficit; in a more preferred embodiment, these disorders are due to exposure to alcohol in utero of a subject.
  • a fourth aspect of the invention relates to a method for treating neurological disorders, preferably neurodevelopmental disorders.
  • these disorders are related to a cortical deficit; in a more preferred embodiment, these disorders are due to fetal alcoholization in a subject.
  • the method comprises a step of administering or overexpressing PIGF or administering a pharmaceutical composition comprising same to a subject having such disorders.
  • This method of treatment may comprise a prior stage of diagnosis of neurological disorders, particularly neurodevelopmental disorders.
  • these disorders are related to a cortical deficit; in a more preferred embodiment, these disorders are due to exposure to the subject's alcohol in utero.
  • biological sample any sample that can be taken from a subject.
  • the biological sample is a sample from the placenta, including the umbilical cord.
  • PIGF is expressed by placental cells throughout pregnancy. This makes it possible to assay the PIGF without compromising the integrity of the subject, in particular when the subject is an embryo or a fetus.
  • the biological sample must allow the determination of the level of expression of PIGF.
  • the test sample may be used as obtained directly from the biological source or as a result of pretreatment to change the character of the sample.
  • pretreatment may include plasma preparation from blood, dilution of viscous fluids, and so on.
  • Pre-treatment methods may also involve filtration, precipitation, dilution, distillation, mixing, concentration, inactivation of disrupting components, addition of reagents, lysis, etc.
  • it may be beneficial to modify a solid test sample to form a liquid medium or to release the analyte.
  • PIGF protein is a secreted protein (DeFalco, Exp Mol Med 44 (1): 1-9, 2012).
  • Preferred biological samples for determining the level of expression of said protein include in particular blood, plasma, or lymph samples.
  • the biological sample is a blood sample.
  • the biological sample is a sample of placental blood or cord blood. This is usually collected during childbirth. Blood from placental vessels can then be obtained to measure the rate of PIGF.
  • the subject when the amount of PIGF measured in step a) is less than the reference, the subject is determined to be suffering from or having a risk of developing a neurological disorder and in particular a neurodevelopmental disorder.
  • these disorders are related to a cortical deficit; in a more preferred embodiment, these disorders are due to exposure to alcohol in utero.
  • the amount of PIGF is measured when a subject has at least one symptom that may be related to a neurological disorder and in particular a neurodevelopmental disorder.
  • the amount of PIGF will also be measured when a subject does not present one or more particular risk factor-related disorders (endogenous factors, such as genetic mutation, cerebral vascular network alteration, etc., or exogenous factors such as exposure to toxic compounds and in particular, in utero exposure to alcohol) but for whom exposure to such a risk factor during this period has been proven or suspected.
  • risk factor-related disorders endogenous factors, such as genetic mutation, cerebral vascular network alteration, etc., or exogenous factors such as exposure to toxic compounds and in particular, in utero exposure to alcohol
  • the amount of PIGF is measured when a subject has at least one symptom of at least one disorder that may be related to intrauterine alcohol exposure.
  • the amount of PIGF will also be measured when a subject does not have one or more symptoms of particular disorders related to intrauterine alcohol exposure but for whom exposure to alcohol during that period has been proven or suspected .
  • measuring the amount of PIGF as described above will confirm or deny a neurological disorder or the risk of developing one before the therapeutic management.
  • the amount of PIGF is determined by measuring the amount of transcripts encoding the PIGF or the amount of the polypeptide.
  • the level of gene expression or protein can be measured by many methods that are available to those skilled in the art. There may be several intermediate steps between taking the biological sample and measuring the PIGF expression, said steps corresponding to extracting from said sample an mRNA sample (or corresponding cDNA) ) or a protein sample. This can then be directly used to measure the expression of PIGF. Preparation or extraction of mRNA (as well as retrotranscription thereof into cDNA) or proteins from a cell sample are only routine procedures well known to those skilled in the art.
  • mRNA level i.e., all mRNAs or cDNAs
  • proteins ie all proteins present in the sample
  • any technology usually used by those skilled in the art can be implemented.
  • These technologies for analyzing the level of gene expression include well-known methods such as PCR (Polymerase Chain Reaction, based on DNA) and RT-PCR (reverse transcription). Transcription-PCR, starting from RNA) or quantitative RT-PCR or nucleic acid chips (including DNA chips and oligonucleotide chips) for higher throughput.
  • the probes may be nucleic acids such as cDNAs (cDNA chips), mRNAs (mRNA chips) or oligonucleotides (oligonucleotide chips), said oligonucleotides typically being between about 25 and 60 nucleotides in length.
  • cDNA chips cDNA chips
  • mRNA chips mRNA chips
  • oligonucleotides oligonucleotide chips
  • said oligonucleotides typically being between about 25 and 60 nucleotides in length.
  • tissue chips also known as TMAs: "tissue microarrays”
  • the tests usually used with tissue chips include immunohistochemistry and fluorescent in situ hybridization.
  • the tissue chips can be coupled with fluorescent in situ hybridization.
  • RNA-Seq or "Whole Transcriptome Shotgun Sequencing”
  • mass sequencing in parallel. Such methods are described in, for example, US 4,882,127, US 4,849,077; US 7,556,922; US 6,723,513; WO 03/066896; WO 2007/111924; US 2008/0020392; WO 2006/084132; US 2009/0186349; US 2009/0181860; US 2009/0181385; US 2006/0275782; EP-B1-1141399; Shendure has Ji, Nat Biotechnol. , 26 (10): 1135-45.
  • the expression of the PIGF is measured at the protein level by a method selected from immunohistology, immunoprecipitation, western blot, dot blot, ELISA or ELISPOT, protein chips, microarray chips.
  • the amount of PIGF is determined by a method chosen from immunoprecipitation, immunohistology, western blot, dot blot, ELISA or ELISPOT, protein chips, antibody chips, or tissue chips coupled with immunohistochemistry.
  • Antibodies directed against PIGF are commercially available (see, for example, R & D Systems, Santa Cruz, Abcam, etc.) and can be used in the methods of the invention. Even more preferably, the expression of PIGF is measured by Western Blot or ELISA.
  • the amount of PIGF is normalized with respect to a control marker which may be a gene selected from B2M, TF RC, YWHAZ, RPLO, 18S, GUSB, UBC, TBP, GAPDH, PPIA, POLR2A, ACTB, PGK1, HPRT1. , IP08 and HMBS, or a polypeptide selected from the product of said genes.
  • a control marker which may be a gene selected from B2M, TF RC, YWHAZ, RPLO, 18S, GUSB, UBC, TBP, GAPDH, PPIA, POLR2A, ACTB, PGK1, HPRT1. , IP08 and HMBS, or a polypeptide selected from the product of said genes.
  • the rate of PIGF thus measured is subsequently compared to a reference level of PIGF expression to determine whether it is a subject suffering from a neurological disorder due to exposure to alcohol in particular. utero.
  • a level of expression of reference PIGF is meant within the meaning of the present application any rate of expression of said factor used for reference.
  • a reference expression level can be obtained by measuring the level of expression of PIGF in a biological sample, for example a placenta or umbilical blood, of a healthy subject, i.e. a subject who has not been exposed to alcohol in utero.
  • Figure 1 Effects of placental overexpression of IFN in utero on the positioning of oligodendrocytes and GABA interneurons in the fetal brain during intrauterine exposure to alcohol.
  • A A PGF / CRISPR / dCas9 activation approach coupled with electroporation of the placenta in utero was performed at 13 days of gestation (GD13) and overexpression of PIGF was monitored at GD20. In the "Alcohol" group, in utero exposure to alcohol takes place between GD15 and GD20.
  • B C: Visualization of the positioning and density of oligodendrocyte precursors and GABA intemeurones using the markers Olig2 and Lhx6, respectively.
  • Figure 2 Effects of acute in vitro treatment of organotypic slices of 2-day-old mouse cortex on the endothelial activity of MMP9.
  • A Gel zymography showing that glutamate increases MMP9 activity while ethanol decreases it.
  • B C: in situ zymography demonstrating that the MMP9 activity is endothelial and localized at the level of the path of migration of GABA interneurons.
  • D Quantification of the effects of glutamate and alcohol on the degradation kinetics of the DQ-gelatin-FITC substrate at the level of the pial migration route.
  • B Demonstration of the lack of effect of glutamate on the activation of ALMR9 in tPA 'mice.
  • CE in situ zymography demonstrating that the tPA-like activity is endothelial and localized at the level of the GABA intemeurones p86 migration pathway.
  • F Quantification of the effects of glutamate and alcohol on the degradation kinetics of the DQ-casein-FITC substrate (tPA-like substrate) at the level of the pial migration route.
  • G Quantification of effects glutamate and alcohol on the kinetics of degradation of the DQ-gelatin-FITC (MMP-like) substrate at the level of the pial migration pathway in mice tPA ⁇
  • Figure 4 Demonstration of a direct effect of glutamate and alcohol on the activity of neonatal cortical endothelial cells.
  • A, B Immunohistochemical visualization of the essential subunit GluN1 of the NMDA receptor on cortical microvessels and endothelial cells at P2.
  • C, D Effect of glutamate on the calcium activity (D) of the endothelial cells previously loaded by the calcium probe FURA2 (C).
  • E Effect of alcohol on calcium activity stimulated by glutamate on endothelial cells.
  • Figure 5 Effect of chronic alcohol in utero on endothelial activity and expression of NMDA receptor subunits.
  • A, B In contrast to acute effects characterized in vitro, chronic in utero exposure to alcohol from E15 to E20 exacerbates the effects of glutamate on calcium mobilization.
  • C-E Chronic exposure in utero will notably induce an increase in the expression of the GluN1 subunit of the NMDA receptor.
  • F, G In utero chronic exposure will also exacerbate MMP9-like activity at the level of the pial migration route.
  • In utero alcoholization induces an increase in the density of Gad67GFP interneurons in the superficial layers.
  • D-F Effect of alcohol in utero on the expression of GFP and GABA interneuron markers.
  • G, H Effect of alcohol in utero on the expression density of dendritic spines of interneurons Gad67GFP.
  • overexpression of PIGF can be used effectively as a drug in the treatment of neurological disorders, in particular, neurodevelopmental disorders related to a failed neocortical organization due to in utero exposure to alcohol.

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Abstract

La présente invention concerne un facteur de croissance placentaire (PlGF) en tant que médicament pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'un trouble neurologique, particulièrement un trouble neurodéveloppemental. Ces troubles sont notamment liés à un déficit cortical,chez un sujet ayant été exposé in utero à l'alcool. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique ou un produit comprenant le PlGF pour ces mêmes applications thérapeutiques.

Description

Traitement des troubles neurologiques avec le P1GF
INTRODUCTION
La présente invention concerne le domaine des troubles neurologiques, en particulier des troubles neurodéveloppementaux, leur prévention et/ou leur traitement.
Les troubles neurologiques sont des maladies qui affectent le système nerveux, central comme périphérique. Ils touchent plus d’un milliard de personnes à travers le monde. Près de 200 millions en Europe seule seraient touchées par au moins un trouble du cerveau. Les lésions cérébrales représentent notamment la première cause de décès ou de handicap acquis chez le nouveau-né. Les troubles neurologiques sont donc un problème majeur de santé publique dans nos sociétés.
Les troubles neurologiques sont des pathologies touchant le système nerveux, central ou périphérique. Ils peuvent notamment être associés à un défaut d’organisation corticale ; ce défaut pouvant lui-même résulter d’une altération de la neurogénèse, comme par exemple un défaut de migration ou de prolifération des neurones et/ou des cellules gliales. Ainsi, il est connu depuis longtemps que les causes de la schizophrénie comportent un aspect neurodéveloppemental (Weinberger, 1996, Neuropsychopharmacology. 14 : 1 s- 11 s ; McGrath & Feron, 2003, Ann Med, 35(2) : 86-93). Le déficit de maturation des neurones GABA pourrait ainsi causer l’hypofonction du récepteur NMDA, laquelle est liée à la schizophrénie (Hardinghamet al., 2016, ; Nat Rev Neurosci. 17(2) : 125-134 Nakazawa et al., 2017, NPJ Schizophr. 3 : 7-1 1 ). On peut aussi citer l’épilepsie (Bui et al, 2015, Cold Spring Harb Perspect Med. 5(11 )) dont la cause pourrait être un dysfonctionnement de la maturation, de la migration et de l’intégration des interneurones (Katsarou et al., 2017, Epilepsia Open. 2(3) : 284-306) ou des cellules gliales (Niu et al., 2019, Nat Neurosci. 22(5) : 709-718). Par ailleurs, un défaut de migration des oligodendrocytes entraîne l’apparition d’une sclérose en plaque. De façon plus générale, un ensemble de troubles neuronaux semble résulter d’un défaut de migration des neurones GABA et/ou des oligodendrocytes (voir, par exemple, Ramamoorthi & Lin, 2011 , Trends Mol Med. 17(8) : 452-462 ; Katsarou et al., 2017).
L’alcool est un tératogène responsable d’atteintes physiques et comportementales. Chez l’Homme, l’exposition prénatale à l’alcool peut conduire à des altérations du neurodéveloppement. Ainsi, la consommation d’alcool au cours de la grossesse (alcoolisation fœtale) constitue la première cause de handicap et notamment de retard mental d’origine non génétique au monde et également en France.
Les dommages varient selon la période où le fœtus a été exposé, les taux d'alcoolémie, les facteurs génétiques et environnementaux, le mode de consommation (chronique, binge drinking, etc. ). Ils peuvent entraîner dans leurs manifestations les plus prononcées des anomalies physiques et des troubles des fonctions cognitives.
Les effets délétères d’une exposition in utero à l’alcool sur le cerveau en développement sont maintenant bien décrits (Archibald et al. , 2001 , Dev. Med. Child Neurol. 43, 148- 154 ; Riley et al. , 201 1 , Neuropsychol. Rev. 21 , 73-80). Plus précisément, il a été mis en évidence qu’une exposition in utero à l’alcool dégradait de nombreuses structures cérébrales, telles que le corps calleux, entraînant des troubles cognitifs et comportementaux chez ces enfants (Bakoyiannis ét al. , 2014, Rev. Neurosci. 25, 631 -639). En particulier, il a été décrit que cette exposition perturbait la migration cellulaire dans diverses structures cérébrales telles que les ganglions de la base, le cortex frontal ou encore le cervelet (Jones and Smith, 1973, Lancet Lond. Engl. 302, 999-1001 ). De nombreuses études se sont intéressées aux mécanismes impliqués dans les effets délétères d’une exposition à l’alcool pendant le neurodéveloppement. Elles ont permis de démontrer que l’alcool altérait très tôt le développement cérébral en impactant la formation du tube neural (Haghighi Poodeh et al. , 2014, Biochem. Biophys. Res. Commun. 446, 173-178), la neurogenèse (Olateju et ai , 2017, Metab. Brain Dis. 1 -14), la migration neuronale (Shenoda, 2017, Neurochem. Res. 42, 1279-1287), la mort des cellules neurales par apoptose (Ikonomidou et ai , 2000, Science 287, 1056-1060), la gliogenèse (Rubert et al. , 2006, J. Neurosci. Res. 84, 483-496) ou encore la myélinisation par les oligodendrocytes (Pons-Vâzquez et al. , 2011 , Alcohol Alcohol. Oxf. Oxfs. 46, 514-522).
Cibler les troubles neurologiques et en particulier les troubles neurodéveloppementaux liés à un défaut d’organisation corticale, notamment ceux dus à l’exposition in utero à l’alcool, apparaît donc comme une stratégie thérapeutique afin de prévenir et/ou traiter le plus tôt possible l’apparition de maladies neuropsychiatriques graves. Plus particulièrement, dans le cas de l’exposition in utero à l’alcool, une telle stratégie pourrait permettre de réduire, voire éviter la présence des symptômes comme l’hyperactivité, la perte de l’attention, la dépression, l’anxiété, les troubles émotionnels, les troubles d’apprentissage, l’irritabilité excessive et les problèmes comportementaux qui se révèlent souvent entre 4 et 5 ans avec la scolarisation et sont susceptibles d’impacter à long terme sur l’intégration sociale et professionnelle de ces futurs adultes. II n’existe à ce jour aucun traitement à visée curative et/ou préventive des troubles neurologiques et en particulier des troubles neurodéveloppementaux dus à l’exposition in utero à l’alcool d’un sujet.
De nouvelles thérapeutiques des troubles liés à l’alcoolisation in utero sont donc requises, afin de traiter les troubles neurologiques et en particulier, les troubles du développement neuronal et les symptômes qui y sont associés.
Il existe donc de façon plus générale un besoin visant à développer une nouvelle stratégie thérapeutique des troubles neuronaux, notamment ceux liés à un déficit d’organisation corticale.
DESCRIPTION De façon surprenante, les inventeurs ont maintenant montré que le PIGF a la capacité de rétablir la mise en place de l’organisation corticale via le rétablissement de l’organisation et du fonctionnement des interneurones et/ou des cellules gliales. Le PIGF offre donc une possibilité de traitement des troubles neurologiques, notamment ceux liés à un défaut d’organisation corticale. Les inventeurs ont précédemment démontré que le dosage placentaire du facteur de croissance placentaire (PIGF) permet d’identifier, parmi les enfants exposés in utero à l’alcool, ceux qui ont subi des atteintes cérébrales (FR1555727). Ces enfants présentent notamment une diminution des taux de PIGF placentaire qui correspond à une angiogenèse cérébrale altérée. Les inventeurs ont maintenant mis en évidence que l’exposition in utero à l'alcool impacte la mise en place de deux populations de cellules nerveuses, les oligodendrocytes et les interneurones GABAergiques, notamment en agissant sur la régulation de ces dernières par les cellules endothéliales. Ils ont notamment montré qu'une exposition in utero à l'alcool perturbe l'activité de deux régulateurs de la migration cellulaire, à savoir la métalloprotéinase ALMR-9 et la protéase tPA, dans les microvaisseaux localisés le long de la voie de migration des interneurones (en particulier, la voie de migration piale). Cette perturbation endothéliale est en outre corrélée à une activation des récepteurs du NMDA et à une augmentation de la mobilisation calcique dans les cellules endothéliales corticales, démontrant un effet direct de l'alcool sur l'activité des cellules endothéliales néonatales. D'autre part, les inventeurs ont révélé qu'une exposition chronique à l’alcool in vivo induit une dysfonction endothéliale associée à une dérégulation de l'expression des sous-unités du récepteur NMDA. L’exposition in utero à l'alcool, via ces différents mécanismes, conduit à une perturbation de la corticogénèse des interneurones. En particulier, elle entraîne une augmentation de la densité des interneurones GABAergiques dans les couches corticales superficielles néonatales.
De manière surprenante, les inventeurs ont découvert dans un modèle pré-clinique d’alcoolisation in utero, qu’une supplémentation en PIGF placentaire corrige l’action de l’alcool sur des processus impliqués dans le neurodéveloppement au niveau embryonnaire et après la naissance, en particulier au stade néonatal. Ces processus sont ceux impliqués principalement dans la genèse, la prolifération et la migration et le positionnement neuronal et/ou glial, en particulier dans le cortex cérébral.
En particulier, une supplémentation en PIGF placentaire, de préférence par surexpression après électroporation placentaire in utero, corrige les effets délétères neurologiques de l'alcool en rétablissant le positionnement et la densité corticale des oligodendrocytes et des interneurones GABAergiques.
Le facteur de croissance placentaire (PIGF) a été décrit dans l’art antérieur comme une cible pour le traitement des maladies cardiovasculaires, des rétinopathies, des maladies cutanées ou encore de cancers (Lu et al. , Discov Med, 2016 21 : 349-61 , Aprile et al., Crit Rev Oncol Hematol, 2015 95:165-78 et Shibuya, Endocr Metab Immune Disord Drug Targets, 2015, 15:135-44). Plus spécifiquement, le PIGF a été décrit dans le traitement de rétinopathies chez l’adulte (US2015013359) et chez l’enfant (Hard et al., Fondation Act Paediatrica 2011 100, pp. 1063-1065). Néanmoins, aucune étude ne suggère l’effet thérapeutique de PIGF dans le traitement des troubles neurologiques et en particulier, des troubles liés au neurodéveloppement. En outre, des traitements permettant de corriger l’effet néfaste de l’alcool sur le développement neuronal n’ont pas été suggérés. La présente invention ouvre ainsi une nouvelle voie dans la prévention et/ou le traitement des troubles neurologiques (dont les symptômes sont tels que l’hyperactivité, la perte de l’attention, la dépression, l’anxiété, les troubles émotionnels, irritabilité excessive, problèmes comportementaux, etc.) dus particulièrement à des migrations neuronales et oligodendrocytaires anormales au niveau cérébral.
Dans un premier aspect, la présente invention concerne ainsi un facteur de croissance placentaire (PIGF) pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’un trouble neurologique chez un sujet. Plus particulièrement, la présente invention concerne le PIGF pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’un trouble neurologique lié à un défaut d’organisation corticale chez un sujet. Encore plus particulièrement, la présente invention concerne le PIGF pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’un trouble neurologique chez un sujet ayant été exposé à l’alcool in utero.
On entend par « PIGF » ou « Placental growth factor » ou « facteur de croissance placentaire » (tous ces termes sont synonymes) une protéine de la famille des facteurs de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF). Plus particulièrement, PIGF au sens de l’invention est une protéine de 149 acides aminés hautement similaire à VEGF-A qui est reconnue par le même récepteur que ce dernier, le VEGF-R1 , mais qui n’est pas reconnue par le récepteur VEGF-R2. PIGF est fortement exprimé par le placenta, mais pas par le fœtus et en particulier par le cerveau fœtal. PIGF glycosylé en N -terminal est sécrété et fonctionne en dimère pour contrôler l’angiogenèse. Le terme « PIGF » se réfère notamment à l’ensemble des 4 isoformes PIGF1 -4 : PlGF-1 et PlGF-3 sont des isoformes qui ne lient pas l’héparine tandis que PlGF-2 et PlGF-4 contiennent des domaines supplémentaires qui permettent de fixer l’héparine. Encore plus préférentiellement, on entend par PIGF une protéine humaine dont la séquence est choisie parmi l’une quelconque des isoformes identifiées par les numéros d’accession Uniprot P49763-2 (PIGF- 1 dont la séquences d’acides aminés correspond à la SEQ ID NO :1 ) ; P49763-3 (PlGF-2 dont la séquences d’acides aminés correspond à la SEQ ID NO :2) ; P49763-1 (PlGF-3 dont la séquences d’acides aminés correspond à la SEQ ID NO :3) ; P49763-4 (PlGF-4 dont la séquences d’acides aminés correspond à la SEQ ID NO :4) présentées dans le listage de séquences annexé à la présente demande. Selon un mode de réalisation de la présente invention, un PIGF recombinant ou des analogues protéiques du PIGF humain peuvent être également utilisés dans la prévention et/ou le traitement d’un trouble neurologique. Dans un mode de réalisation préféré, ledit trouble neurologique est lié à un déficit d’organisation corticale ; plus préférentiellement, il est présent chez un sujet ayant été exposé à l’alcool in utero.
Particulièrement, le PIGF de la présente invention est obtenu, en utilisant un système de production de protéine recombinante procaryote ou eucaryote, notamment en i) cultivant un microorganisme ou des cellules eucaryotes transformé(es) à l'aide d'une séquence nucléotidique codant le PIGF humain (numéro d’accession NCBI du gène 5228; numéro d’accession des transcrits NM_002632.5 (SEQ ID NO :5), NM001207012.1 (SEQ ID NO :6), NM_001293643.1 (SEQ ID NO :7)) et ii) isolant la protéine produite par ledit microorganisme ou lesdites cellules eucaryotes. Cette technique est bien connue de l'homme du métier. Pour plus de détails la concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après : Recombinant DNA Technology I, Editors Aies Prokop, Raskesh K Bajpai ; Annals of the New-York Academy of Sciences, Volume 646, 1991. La protéine PIGF est de préférence purifiée / isolée à partir de lysats de cellules et/ou de surnageants de cellules par lesquelles elle est exprimée et/ou sécrétée. Cette purification peut se faire par tout moyen connu de l’homme du métier. De nombreuses techniques de purification sont décrites dans Voet D et Voet JG, Techniques de purification des protéines et des acides nucléiques.
Les systèmes de production de protéine recombinante utilisent des vecteurs nucléotidiques comprenant des acides nucléiques codant les polypeptides à synthétiser, qui sont introduits dans des cellules hôtes qui produisent lesdits polypeptides (pour plus de détails, se référer à « Recombinant DNA Technology I », Editors Aies Prokop, Raskesh K Bajpai ; Annals of the New-York Academy of Sciences, Volume 646, 1991 ).
De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte (par exemple, les plasmides sont de préférence introduits dans des cellules bactériennes, tandis que les YACs sont de préférence utilisés dans des levures). Ces vecteurs d'expression peuvent être des plasmides, des YACs, des cosmides, des rétrovirus, des épisomes dérivés d'EBV, et tous les vecteurs que l'homme du métier peut juger appropriés à l'expression desdites chaînes.
Les vecteurs selon l’invention comprennent l’acide nucléique codant le PIGF, ou une séquence similaire, ainsi que les moyens nécessaires à son expression. On entend par « moyen nécessaire à l'expression d'un peptide », le terme peptide étant utilisé pour toute molécule peptidique, telle que protéine, polyprotéine, polypeptide, etc., tout moyen qui permet d'obtenir le peptide, tel que notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication et de préférence un marqueur de sélection. Les moyens nécessaires à l'expression d'un peptide sont liés de façon opérationnelle à la séquence d'acides nucléiques codant pour le fragment polypeptidique de l’invention. Par « liés de façon opérationnelle », on entend une juxtaposition desdits éléments nécessaires à l'expression du gène codant pour le fragment polypeptidique de l’invention, lesquels sont en une relation telle que cela leur permet de fonctionner de façon attendue. Par exemple, il peut exister des bases supplémentaires entre le promoteur et le gène codant le fragment polypeptidique de l’invention tant que leur relation fonctionnelle est préservée. Les moyens nécessaires à l'expression d'un peptide peuvent être des moyens homologues, c'est-à-dire naturellement compris dans le génome du vecteur utilisé, ou bien être hétérologues, c’est-à-dire rajouté de façon artificielle à partir d’un autre vecteur et/ou organisme. Dans ce dernier cas, lesdits moyens sont clonés avec le fragment polypeptidique à exprimer. Des exemples de promoteurs hétérologues comprennent les promoteurs viraux tels que le promoteur SV40 (Virus simien 40), le promoteur du gène de la thymidine-kinase du virus simplex de l'Herpès (TK-HSV-1 ), le LTR du virus du sarcome de Rous (RSV), le promoteur premier immédiat du cytomégalovirus (CMV) et le promoteur dernier majeur adénoviral (MLP), ainsi que tout promoteur cellulaire qui contrôle la transcription des gènes codant pour des peptides chez des eucaryotes supérieurs, tel que le promoteur du gène de phosphoglycérate-kinase (PGK) constitutif (Adra et al. , Gene Volume 60, Issue 1 , 1987, Pages 65-74), le promoteur des gènes spécifiques du foie alphal - antitrypsine et FIX et le promoteur SM22 spécifique des cellules du muscle lisse (Moessler et al. , Development 1996 Aug;122(8):2415-25). Les méthodes de suppression et d'insertion de séquences d'ADN dans des vecteurs d'expression sont largement connues de l'homme du métier et consistent notamment en des étapes de digestion enzymatique et ligature. Les vecteurs de l'invention peuvent également comprendre des séquences nécessaires au ciblage des peptides vers des compartiments cellulaires particuliers. Un exemple de ciblage peut être le ciblage vers le réticulum endoplasmique obtenu en utilisant des séquences d'adressage du type de la séquence leader issue de la protéine E3 de l'adénovirus (Ciernik I. F., et al. , The Journal of Immunology, vol. 162, 1999, pages 3915 -3925).
Le terme « terminateur de transcription >> désigne ici une séquence du génome qui marque la fin de la transcription d'un gène ou d'un opéron, en ARN messager. Le mécanisme de terminaison de la transcription est différent chez les procaryotes et chez les eucaryotes. L’homme du métier connaît les signaux à utiliser en fonction des différents types cellulaires. Par exemple, si la cellule dans laquelle le vecteur va être introduit est une bactérie, il utilisera un terminateur Rho-indépendant (séquence répétée inversée suivie d'une série de T (uraciles sur l'ARN transcrit) ou un terminateur Rho-dépendant (constitué d'une séquence consensus reconnue par la protéine Rho).
Le terme « origine de réplication >> (aussi appelée ori) est une séquence unique d'ADN permettant l'initiation de la réplication. C'est à partir de cette séquence que débute une réplication unidirectionnelle ou bidirectionnelle. L’homme du métier sait que la structure de l'origine de réplication varie d'une espèce à l'autre ; elle est donc spécifique d’une espèce bien qu'elle ait certaines caractéristiques communes entre espèces. Un complexe protéique se forme au niveau de cette séquence et permet l'ouverture de l'ADN et le démarrage de la réplication.
Les vecteurs comprenant la séquence génétique codant PIGF sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l’homme du métier. Les clones résultants peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards connues de l'homme du métier pour introduire des polynucléotides dans une cellule hôte. De telles méthodes peuvent être la transformation à l'aide de dextrane, la précipitation par du phosphate de calcium, la transfection à l'aide de polybrène, la fusion de protoplastes, l'électroporation, l'encapsulation des polynucléotides dans des liposomes, l'injection biolistique et la micro injection directe d'ADN dans le noyau. On peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu'un transporteur comme un nanotransporteur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant l’électroporation associée à des liposomes.
À titre d'exemples de microorganismes qui conviennent aux fins de l'invention, on peut citer les levures (Buckholz RG, Current Opinion in Biotechnology v ol. 4, no. 5, 1993, pages 538 - 42) et les bactéries (Olins et Lee, Current Opinion in Biotechnology vol. 4, no. 5, 1993, pages 520 - 5). À titre d'exemples de cellules eucaryotes, on peut citer les cellules provenant d'animaux tels que les mammifères (Edwards CP et Aruffo A, Current Opinion in Biotechnology vol. 4, no. 5, 1993, pages 558 - 63), les reptiles, et équivalent. On peut également utiliser les cellules de plantes. Parmi les cellules de mammifère, on peut notamment utiliser les cellules d’ovaire de hamster chinois (CHO), du singe (cellules COS et Vero), du rein de hamster nain (cellules BHK), du rein de cochon (cellules PK 15) et du rein de lapin (cellules RK13, les lignées cellulaires humaines de l'ostéosarcome (cellules 143 B), les lignées cellulaires humaines HeLa et les lignées cellulaires humaines de l'hépatome (du type cellules Hep G2). Il est également possible d’utiliser des cellules d’insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en œuvre des baculovirus par exemple (Luckow VA, Journal of Virology vol. 67, no. 8, 1993, pages 4566 - 79). Dans un mode de réalisation préféré de l’invention, la cellule hôte utilisée pour produire le fragment de l’invention est une bactérie, de préférence la bactérie E. coli.
L’homme du métier connaît les conditions dans lesquelles cultiver ces cellules, ainsi que les conditions expérimentales nécessaires à l’expression des fragments polypeptidiques par ces cellules. Le procédé de production de PIGF recombinant peut comprendre les étapes suivantes : a) la culture dans un milieu et conditions de culture appropriés d’une cellule hôte comprenant le vecteur codant pour PIGF ; et b) l’isolement du PIGF produit à l’étape a). Le PIGF peut être isolé (purifié) à partir de la cellule l’exprimant. Dans ce cas, une étape préalable de lyse desdites cellules pourra être nécessaire.
Les milieux et conditions de culture associées à chaque type cellulaire utilisé pour la production de protéines recombinantes sont bien connus de l’homme du métier.
L’isolement (ou la purification) de PIGF peut se faire par tout moyen connu de l’homme du métier. On citera par exemple la précipitation différencielle ou l’ultracentrifugation. Il peut être également avantageux de purifier le PIGF par chromatographie d’échange ionique, par chromatographie d’affinité, par tamisage moléculaire, ou par isofocalisation. Toutes ces techniques sont décrites dans Voet D et Voet JG, Techniques de purification des protéines et des acides nucléiques, chapitre 6, Biochimie, 2nde édition.
Plus précisément, dans une première étape, le matériel dont on veut extraire la protéine (tissu animal ou végétal, bactéries, etc. ) est généralement broyé. Divers appareils (« Waring Blender », appareil Potter-Eveljhem, « Polytron », etc. ) peuvent être employés à cette fin. Cette homogénéisation se fait dans un tampon de composition appropriée, bien connue de l’homme du métier. L'homogénat ainsi obtenu est ensuite clarifié, le plus souvent par centrifugation, pour éliminer les grosses particules peu ou mal broyées ou encore pour obtenir la fraction cellulaire contenant la protéine recherchée. Si la protéine est justement dans un compartiment cellulaire, on utilise généralement un détergent doux (Triton X-100, Tween 20, désoxycholate de sodium, etc. ) pour la libérer en dissolvant les membranes de ce compartiment. L'emploi de détergent doit souvent être fait de façon contrôlée car ils peuvent briser les lysosomes, ce qui libère des enzymes hydrolytiques (protéases, nucléases, etc. ) qui peuvent attaquer et détruire les protéines ou autres molécules qu'on veut isoler. Des précautions particulières doivent être prises si on travaille avec des protéines sensibles à la dégradation ou peu nombreuses. Une solution fréquente à ce problème est l'inclusion dans les solutions d'inhibiteurs de protéases qui sont physiologiques (inhibiteurs de trypsine, antipaïne, leupeptine, etc.) ou artificiels (E64, PMSF, etc. ). Ensuite diverses techniques existent pour isoler la protéine recherchée.
Une des méthodes se prêtant le mieux à de gros volumes est la précipitation différentielle au sulfate d'ammonium. Les chromatographies d'échange ionique ou les chromatographies d ' affinité, applicables aussi à de gros volumes d'échantillon mais ayant un assez bon pouvoir de séparation, constituent de bonnes méthodes intermédiaires. Pour finaliser la purification, le tamisage moléculaire ou l'isofocalisation sont souvent utilisés. Ces techniques permettent de raffiner la pureté, mais nécessitent de très petits volumes de protéines concentrées. Il est souvent avantageux, entre ces étapes, d’éliminer les sels ou produits utilisés dans ces chromatographies. Ceci peut être obtenu par dialyse ou par ultrafiltration.
Il peut aussi être avantageux d’utiliser un vecteur portant une séquence permettant d’identifier le PIGF de l’invention. De plus, il peut être avantageux de faciliter la sécrétion dans un système procaryote ou eucaryote. En effet, dans ce cas, la protéine recombinante d’intérêt sera présente dans le surnageant de la culture cellulaire plutôt qu’à l’intérieur des cellules hôtes.
Le PIGF peut être produit à des taux atteignant au moins 1 mg par litre, de préférence 2 mg par litre, de manière encore plus préférée, 5mg par litre de culture cellulaire.
De manière alternative, il est possible de préparer le PIGF par synthèse chimique. L’homme du métier connaît les procédés de synthèse chimique, par exemple les techniques mettant en œuvre des phases solides ou utilisant des phases solides partielles, par condensation de la protéine ou par une synthèse en solution classique. Les fragments de l'invention peuvent par exemple être synthétisés par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production. Cette synthèse chimique peut être couplée à une approche de génie génétique ou par génie génétique seul en utilisant les techniques bien connues de l’homme du métier et décrites par exemple dans Sambrook J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 1989. Les réactifs et produits de départ sont commercialement disponibles, ou peuvent être synthétisés par des techniques conventionnelles bien connues (voir par exemple, WO 00/12508, WO 2005/085260).
En particulier des analogues de PIGF peuvent être synthétisés en utilisant la technique décrite par Zheng et al. (Acta Ophthalmologica 2012 90(7) : e512 - e523). Comme indiqué précédemment, la présente invention a pour objet un PIGF pour son utilisation dans la prévention et le traitement d’un trouble neurologique chez un sujet, en particulier un trouble neurologique lié à un déficit d’organisation corticale, et encore plus particulièrement chez un sujet ayant été exposé à l’alcool in utero.
On entend par trouble neurologique des pathologies touchant le système nerveux, central ou périphérique, c’est-à-dire l’ensemble des troubles dus à une atteinte des nerfs, de la moelle épinière, du tronc cérébral, du cervelet ou du cerveau (dont l'ensemble constitue le système nerveux). Les troubles neurologiques ont souvent pour effet des troubles moteurs, des troubles cognitifs, des troubles sensitifs et/ou sensoriels. Les troubles neurologiques au sens de l’invention comprennent entre autres la schizophrénie, la sclérose en plaque, l’autisme, l’encéphalite épileptique, notamment le syndrome de West (WS), le syndrome de d’Ohtahara (OS) et le syndrome de Dravet (DS), la lissencéphalie classique, l’inflammation du système nerveux central (CNS), le syndrome de Miller-Dieker, les troubles causés par l’alcoolisation fœtale (TCAF), la maladie d’Alzheimer, la démence à corps de Lewy (DCL), la dégénérescence fronto-temporale (DFT), l’atrophie multisystématisée, la chorée de Huntington, la maladie de Charcot, les dystonies, la maladie de Parkinson, les troubles bipolaires, la dépression, troubles obsessionnels compulsifs (TOC), etc.
On entend par système nerveux un système biologique animal responsable de la coordination des actions avec l'environnement extérieur et de la communication rapide entre les différentes parties du corps. Plus particulièrement, le système nerveux selon l’invention est un groupe organisé de cellules spécialisées pour la conduction des stimuli électrochimiques à partir des récepteurs sensoriels à travers un réseau vers le site auquel une réponse se produit. On distingue le système nerveux central et le système nerveux périphérique.
Dans le contexte de la présente invention, le terme système nerveux central ou SNC désigne un système constitué par l’encéphale comprenant le cerveau, et plus particulièrement le cortex cérébral, le tronc cérébral, et le cervelet situés dans la boîte crânienne, et la moelle épinière située dans le canal rachidien. Le rôle du système nerveux central est de recevoir, enregistrer et interpréter les signaux qui parviennent de la périphérie, et d’organiser la réponse à envoyer. Le système nerveux central est souvent opposé au système nerveux périphérique qui est constitué par les nerfs crâniens et les nerfs spinaux, rattachés au système nerveux central. Les éléments du système nerveux central sont les cellules nerveuses, à savoir : les neurones et les cellules gliales.
Par « cortex cérébral », on entend ici la substance grise périphérique des hémisphères cérébraux. Le cortex se compose de trois couches (pour l'archi- et le paléo-cortex) à six couches (pour le néocortex) renfermant différentes classes de neurones, notamment les interneurones, et de cellules gliales. La formation du cortex cérébral au cours du développement fait intervenir la multiplication des précurseurs des neurones, suivie de leur migration vers des zones spécifiques du cortex. Les cellules gliales se multiplient et migrent de façon similaire, leurs progéniteurs étant différents de ceux des neurones. Toute altération de ce processus de multiplication et/ou de migration des cellules nerveuses conduit à une défaillance de la mise en place de l’organisation corticale, entraînant un déficit d’organisation corticale.
Dans le contexte de la présente invention, on entend par « la mise en place de l’organisation corticale » les processus aboutissant à l’organisation du cortex cérébral (ou encore nommé néocortex dans la présente description). La mise en place du cortex cérébral est une opération complexe qui met en jeu la production d’une variété remarquable de neurones excitateurs et inhibiteurs, qui sont ensuite assemblés en circuits fonctionnels qui s’organisent en couches et en aires. Par « déficit d’organisation corticale », on entend ici toute altération de l’organisation du cortex cérébral. Les pathologies du développement cortical sont nombreuses et variées ; elles jouent un rôle important dans l’étiologie de nombreuses pathologies neuropsychiatriques. Dans certains cas, il s’agit de pathologies sévères de la mise en place du cortex à des stades précoces du développement comme des malformations et des désordres de lamination, mais il peut aussi s’agir d’altérations plus subtiles de la formation et du raffinement des connexions nerveuses qui altèrent la balance excitation/inhibition. Par exemple, une altération du balance excitation/inhibition peut être due à un déficit de maturation des interneurones GABAérgiques causé par une diminution de la fonction des récepteurs NMDAR. Ces altérations de l’organisation corticale comprennent notamment les malformations dues à une anomalie du développement cortical (MDC), lesquelles désignent un large spectre de malformations cérébrales constituées pendant l'embryogenèse. Les MDC sont responsables d'épilepsie, de troubles neurologiques et cognitifs de sévérité variable, en relation avec le stade de survenue des troubles et l'étendue de la malformation. On distingue entre autres les troubles de la prolifération neuronale et gliale (hémimégalencéphalie, sclérose tubéreuse de Bourneville, dysplasie corticale focale type Taylor [DCFT], tumeur dysembryoplasique neuroépithéliale [DNT] et gangliogliome), les troubles de la migration neuronale (lissencéphalie, hétérotopie laminaire sous-corticale et nodulaire périventriculaire ou sous-corticale) et les troubles de l'organisation corticale (polymicrogyrie, schizencéphalie). En ce qui concerne les effets de l’exposition fœtale à l’alcool, ceux-ci peuvent notamment se traduire par une altération du développement du cortex cérébral qui intervient entre le 3ème et le 7ème mois de grossesse à partir de la partie dorsale du télencéphale. Particulièrement, cette altération concerne la prolifération, la migration, la différenciation, la synaptogénèse et l’apoptose des cellules neuronales et/ou des cellules gliales qui constituent le cortex cérébral. Spécifiquement, l’exposition fœtale à l’alcool altère la migration des cellules nerveuses et/ou des cellules gliales.
Dans le contexte de la présente invention, les termes neurones ou cellules neuronales désignent une cellule anatomiquement et physiologiquement spécialisée dans la réception, l’intégration et la transmission d’informations. Les neurones possèdent ainsi des structures propres (axones, dendrites et synapses) leur permettant d’exercer la transmission nerveuse.
Dans le contexte de la présente invention, le terme cellules gliales désigne les cellules qui constituent le tissu de soutien du système nerveux. Elles assurent le lien avec les vaisseaux sanguins et apportent les nutriments essentiels au fonctionnement métabolique du système nerveux. On distingue plusieurs types de cellules gliales, comme par exemple, les astrocytes, les oligodendrocytes, la microglie, et les cellules épendymaires.
Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention a pour objet un PIGF pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’un trouble neurologique chez un sujet ayant été exposé à l’alcool in utero, ledit trouble neurologique étant un trouble de neurodéveloppement. Préférentiellement, le trouble neurologique est lié à un déficit d’organisation corticale. Plus préférentiellement, le sujet souffrant dudit trouble neurologique a été exposé à l’alcool in utero. Dans le contexte de la présente invention, le terme trouble de neurodéveloppement ou trouble du développement neurologique ou trouble neurodéveloppemental se rapporte à un ensemble d’affections qui débutent au stade embryonnaire et qui affectent le développement du système nerveux, en particulier le développement du système nerveux central.
Selon un mode de réalisation préféré, le trouble neurodéveloppemental est une défaillance dans la mise en place du système nerveux central, notamment du cortex cérébral. Celle-ci affecte préférentiellement, la prolifération, la migration la croissance et/ou la différenciation des cellules nerveuses et ou des cellules gliales, en particulier chez un sujet exposé à l’alcool in utero.
Dans le contexte de la présente invention l’expression la mise en place du système nerveux central signifie la compartimentalisation du SNC à laquelle aboutit le neurodéveloppement. Cette compartimentalisation peut être affectée par différents facteurs endogènes, tels qu’une mutation génétique, une altération de réseau vasculaire cérébral etc., ou des facteurs exogènes tel que l’exposition à des composés toxiques et en particulier, l’exposition in utero à l’alcool, ce qui aboutit par exemple à la mise en place d’agrégats de neurones, localisés ou diffus.
Dans le contexte de la présente invention, l’expression la prolifération de cellules neuronales et/ou des cellules gliales désigne la capacité des cellules souches neuronales et gliales à se multiplier, ce qui résulte ultimement dans la production des neurones et de la glie radiale, lesquels sont nécessaires à la formation définitive d’une structure neuronale, notamment à la formation du cortex cérébral. Lorsque la prolifération des cellules nerveuses est affectée suite à une exposition in utero à l’alcool, cette prolifération affectée, se traduit par exemple, par une modification, le plus souvent, par une diminution du nombre des cellules neuronales et/ou gliales de manière générale dans plusieurs structures cérébrales. En particulier, il peut s’agir d’une modification du nombre de neurones dans le néocortex. La désorganisation du réseau vasculaire cérébral qui participe à la migration des cellules nerveuses peut entraîner par exemple une altération de la migration des neurones GABAergiques vers le cortex cérébral (Won et al., 2013, Nat Commun. , 4 : 2149 ) . Dans le contexte de la présente invention, l’expression « la migration des cellules neuronales et/ou des cellules gliales » désigne le processus par lequel ces cellules migrent d’un endroit ou d’une structure du système nerveux central où elles sont normalement produites vers un autre endroit ou une autre structure de ce système où elles participent à la formation d’une structure neuronale particulière et à son fonctionnement. La migration cellulaire neuronales et/ou gliale peut être diminuée, voir totalement empêchée, à cause de différents facteurs endogènes, tels qu’une mutation génétique, une altération de réseau vasculaire cérébral etc. , ou de facteurs exogènes tel que l’exposition à des composés toxiques et en particulier, l’exposition in utero à l’alcool. Le résultat d’une migration cellulaire affectée est un dysfonctionnement de la structure neuronale vers laquelle les cellules nerveuses et/ou gliales devaient migrer. Alternativement, les facteurs endogènes et/ou exogènes mentionnés plus haut (comme par exemple l’exposition fœtale à l’alcool) peuvent provoquer également une migration accrue des cellules nerveuses entraînant une augmentation anormale de la densité des structures neuronales qui empêchent également leur fonctionnement. Par exemple une altération de la migration des cellules neuronales et/ou des cellules gliales entraîne le plus fréquemment une réorganisation du cortex cérébral qui se traduit par une microcéphalie. Une altération de la migration des neurones NMDA et des interneurones GABAérgiques entraînera le plus souvent une perte d’équilibre entre les processus d’excitation et d’inhibition du SNC.
Particulièrement, ces facteurs endogènes et/ou exogènes, comme par exemple l’alcoolisation fœtale, peuvent affecter les migrations radiale et tangentielle de cellules nerveuses dans le cortex cérébral et empêcher ainsi une corticogenèse correcte.
Dans le contexte de la présente invention, l’expression « la croissance des cellules neuronales et/ou des cellules gliales » désigne le processus par lequel ces cellules accumulent de la masse et augmentent leur taille physique. Une altération de la croissance de ces cellules sous l’effet des facteurs endogènes et/ou exogènes mentionnés plus haut (comme par exemple l’exposition fœtale à l’alcool) peut notamment provoquer un retard de croissance morphologique intra-utérine, une microcéphalie ou à la réduction de la taille du cortex préfrontal. Dans le contexte de la présente invention, l’expression « la différenciation des cellules nerveuses » renvoie au processus par lequel des cellules précurseurs se différencient en cellules neuronales et/ou gliales ayant des structures et des fonctions spécifiques. Une défaillance de ce processus peut, par exemple, se traduire par l’impossibilité pour les cellules gliales de se différencier en oligodendrocytes ou en astrocytes impliqués dans les processus de migration cellulaire, de myélinisation des fibres nerveuses et de régulation de l’homéostasie nerveuse.
L’altération de l’expression de gènes spécifiques des neurones et/ou des cellules gliales (par exemple le gène GluN1 codant une sous-unité du récepteur NMDAR des interneurones GABAérgiques), la désorganisation du réseau vasculaire cérébrale et/ou l’exposition à des facteurs extérieurs toxiques, en particulier, la consommation d’alcool pendant la grossesse, entraînent souvent l’apparition d’un ou plusieurs des troubles neurodéveloppementaux mentionnés ci-dessus.
Selon un mode de réalisation plus préféré de la présente invention, le trouble neurodéveloppemental est une défaillance de la mise en place de l’organisation corticale (ou néocorticale).
Ainsi, selon la présente invention, le PIGF est utilisé dans la prévention et/ou le traitement d’un trouble neurodéveloppemental qui est une défaillance dans la mise en place de l’organisation corticale. Selon un autre mode de réalisation, les troubles du neurodéveloppement, notamment ceux résultant de l’exposition d’un sujet à l’alcool in utero, sont associés à la perturbation de la gliogenèse des astrocytes et/ou des oligodendrocytes, à une perturbation de la productions des progéniteurs neuronaux, ou encore à une ventriculomégalie associée à des anomalies des ganglions de la base, du corps calleux, de l’hippocampe, de l’hypothalamus, de l’hypophyse, du cervelet, du bulbe olfactif, du diencéphale ou du tronc cérébral.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, le trouble neurodéveloppemental est une défaillance de la migration des cellules neuronales et/ou des cellules gliales ou une défaillance de leur prolifération. De manière préférée, le trouble neurodéveloppemental est une défaillance de la migration des cellules neuronales et/ou des cellules gliales.
De manière encore plus préférée, cette défaillance est une défaillance dans la migration des interneurones GABAergiques et/ou des oligodendrocytes.
Dans le contexte de la présente invention, le terme « interneurone » désigne un neurone bi ou multipolaire qui établit de multiples connexions entre un réseau afférent et un réseau efférent. La majorité des interneurones sont inhibiteurs et sécrètent un neurotransmetteur caractéristique, le GABA (acide g-aminobutyrique).
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, le trouble neurologique est une interneuronopathie. Le terme « interneuronopathie » désigne un groupe de maladies liées à un développement, à une migration et/ou à un fonctionnement altéré des interneurones. Les interneuronopathies telles qu’on les entend ici comprennent par exemple la schizophrénie, l’autisme, l’encéphalite épileptique, notamment le syndrome de West (WS), le syndrome de d’Ohtahara (OS) et le syndrome de Dravet (DS), la lissencéphalie classique, l’inflammation du système nerveux central (CNS) et le syndrome de Miller-Dieker.
Dans le contexte de la présente invention, le terme « interneurones GABAergiques » désigne des interneurones utilisant le GABA comme neurotransmetteur. Ces interneurones représentent 20 à 30 % des neurones corticaux et sont localisés autour des neurones pyramidaux excitateurs afin d’en assurer leur régulation. Il existe chez l’Homme deux lignages de précurseurs d’interneurones GABAergiques distincts par leurs origines embryonnaires. Le premier lignage, qui représente 65 % de l’innervation corticale GABAergique, est originaire des ZV et ZSV du télencéphale dorsal. Le second lignage est originaire des éminences ganglionnaires (EG) du télencéphale ventral et représente 35 % des interneurones GABAergiques. Dans le cortex cérébral mature, l’homéostasie de l’activité neuronale est assurée par une balance entre les systèmes neuronaux excitateur et inhibiteur. La composante inhibitrice est assurée en majorité par les interneurones GABAergiques.
Au sens de la présente invention, l’expression « migration des interneurones GABAergiques » désigne un processus qui débute par la migration des progéniteurs GABAergiques du télencéphale où ils sont générés pour atteindre leur position définitive dans le néocortex mais également au niveau du stratum de l’hippocampe ou encore dans les bulbes olfactifs. Chez l’Homme, une partie de ces neurones migrent par voie radiale et l’autre par voie tangentielle. Ils existent deux voies de migration tangentielle différentes : une voie superficielle ou piale et une voie profonde ou périventriculaire. La principale vague de migration des neurones corticaux s’étend de la 10ème à la 25ème SG, même si certains progéniteurs GABAergiques commencent à migrer avant cette période. Pendant leur phase de migration tangentielle, les progéniteurs GABAergiques vont se servir du réseau vasculaire déjà mis en place comme support physique et comme guide de leur migration. En effet, les cellules endothéliales du réseau vasculaire cérébral vont sécréter du GABA qui va se fixer sur les récepteurs GABA-A et GABA-B exprimés par les précurseurs GABAergiques en migration. La fixation du GABA va ainsi agir comme un signal de guidage assurant la communication entre la cellule en migration et la cellule endothéliale. Une fois leur migration tangentielle achevée, les précurseurs GABAergiques doivent migrer radialement afin d’atteindre leur destination finale au sein de la plaque corticale. Les interneurones GABA utilisent également la glie radiaire comme support de migration et comme support structural de leur positionnement dans le néocortex.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, le PIGF est utilisé pour prévenir et/ou traiter un trouble neurodéveloppemental causé par la défaillance de la migration de la voie piale des interneurones GABAergiques. Plus préférentiellement, ladite défaillance de la migration de la voie piale des interneurones GABAergiques est induite par l’alcoolisation in utero, par exemple à travers une dysfonction endothéliale
Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, le PIGF est utilisé pour prévenir et/ou traiter un trouble neurodéveloppemental causé par une défaillance de la prolifération, la croissance, la migration et/ou la différenciation des cellules gliales, en particulier par une défaillance de la migration des oligodendrocytes. Plus préférentiellement, cette défaillance est causée par une alcoolisation in utero.
Dans le contexte de la présente invention, le terme « oligodendrocyte » désigne une cellule du système nerveux central appartenant à la névroglie interstitielle (il s'agit d'une cellule de soutien). On la retrouve ces cellules aussi bien dans la substance grise que dans la substance blanche. Dans la substance grise, les oligodendrocytes ont une position proche des péricaryons (corps cellulaires) des neurones et ont un rôle métabolique. Dans la substance blanche, ils ont le rôle de myélinisation axonale. Elles proviennent des précurseurs de cellules gliales (glioblastes) du tube neuronal embryonnaire. Chez les mammifères, les oligodendrocytes qui vont coloniser le corps calleux et le néocortex sont générés au niveau des éminences ganglionnaires et migrent selon un processus vasculo- dépendant (Tsai et al., Science, 2016).
Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un PIGF pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’un trouble neurodéveloppemental lié à une perturbation de l’activité des métalloprotéinases matricielle (MMP) et/ou d’un inhibiteur de celle-ci. Plus préférentiellement, cette perturbation est causée par une alcoolisation in utero.
Dans le contexte de la présente invention, le terme « métalloprotéinase matricielle ou MMP » désigne une famille des protéases capables de dégrader des éléments de la lame basale endothéliale de la matrice extracellulaire lorsqu’elles sont activées.
Dans le contexte de la présente invention le terme « inhibiteur de métalloprotéase » désigne une a-macroglobuline ou des protéines inhibitrices telles que TIMP « Tissue Inhibitors of Matrix Metalloprotease », qui peuvent former des complexes non covalents avec la métalloprotéinase sous sa forme active.
Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne un PIGF pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’un trouble neurodéveloppemental lié à une perturbation de l’activité des métalloprotéases matricielle ALMR-2 et/ou MMP-9, préférablement MMP-9.
Dans le contexte de la présente invention, le terme « MMP-9 » (dont la séquence d’acides aminés correspond à la SEQ ID NO :8 ; référence Uniprot : P14780 et référence NCBI correspondant à la séquence d’acides nucléiques : Genbank : NG_01 1468.1 ) désigne une métalloprotéinase qui appartient à la famille des gélatinases et est principalement sécrétée par les cellules endothéliales et en petite quantité par les astrocytes. Le glutamate, via le récepteur NMDA, peut entraîner l’activation de ces MMP-9 en induisant la sécrétion de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA dont la séquence d’acides aminés correspond à la SEQ ID NO :9 ; référence Uniprot : P00750 et référence NCBI correspondant à la séquence d’acides nucléiques : Genbank : NG_023264.1 ) endothélial qui va alors provoquer le clivage du plasminogène en plasmine, permettant ainsi le clivage du prodomaine des ALMR-9 et son activation (Figure 3).
Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un PIGF pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’un trouble neurodéveloppemental lié à une perturbation de l’activité de l’inhibiteur tPA (l'activateur tissulaire du plasminogène). Plus préférentiellement, cette perturbation est causée par une alcoolisation in utero.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la présente invention concerne un PIGF pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’un trouble neurodéveloppemental lié à une perturbation de l’activité de la métalloprotéase matricielle MMP-9 et/ou de l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Plus préférentiellement, cette perturbation est causée par une alcoolisation in utero.
Dans ce cas particulier, la perturbation de l’activité de MMP-9 et/ou de tPA dépend notamment de la manière dont se passe l’exposition à l’alcool in utero, à savoir, de manière chronique (de l’alcool, même en faible quantité absorbée de manière régulière au cours de la grossesse) ou de manière aigüe (une forte quantité d’alcool même absorbée une seule fois au cours de la grossesse).
Les inventeurs ont démontré qu’un traitement aigu à l’alcool (absorption d’une quantité d’alcool importante en une seule fois) conduit à une inhibition de l’activité de MMP-9 et/ou de tPA au niveau de la voie de migration piale ce qui diminue la migration neuronale et/ou gliale.
Au contraire, une exposition chronique à l’alcool exacerbe l’activité de MMP-9 et/ou de tPA provoquant ainsi une migration accrue des interneurones GABAergiques vers le néocortex ou leur densité se trouve augmenter plus que la normale.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, les troubles neurologiques et en particulier les troubles neurodéveloppementaux sont de préférence ceux qui se manifestent typiquement précocement durant le développement. Ils sont caractérisés par des déficits du développement qui entraînent une altération du fonctionnement personnel, social, scolaire ou professionnel. Les troubles du développement neurologique s’exprimant parfois par un retard mental et plus souvent par des difficultés d’apprentissage, difficulté de mémorisation, perte de concentration, hyperactivité, dépression, instabilité émotionnelle et troubles comportementaux etc. De tels troubles sont choisis par exemple dans le groupe comprenant la schizophrénie, la sclérose en plaque, l’autisme, l’encéphalite épileptique, notamment le syndrome de West (WS), le syndrome de d’Ohtahara (OS) et le syndrome de Dravet (DS), la lissencéphalie classique, l’inflammation du système nerveux central (CNS), le syndrome de Miller-Dieker et les troubles causés par l’alcoolisation fœtale (TCAF). La majorité des enfants qui ont été exposés à l’alcool in utero présente des troubles neurologiques qui s’expriment par des troubles d’inadaptation et du comportement qui se révèlent progressivement avec l’âge (comprenant des difficultés d’allaitement et d’alimentation, des troubles du sommeil puis, à l’âge scolaire, des anomalies du comportement, des troubles cognitifs retentissant sur l’apprentissage, des déficits intellectuels avec un Ql abaissé de 20 points (1 à 2 écarts type), des difficultés d’apprentissage de la lecture (dyslexie) et plus encore du calcul (dyscalculie), des troubles de l’attention accompagnés d’hyperactivité ou d’hypercinésie. Ils sont connus sous le nom de Syndrome Déficitaire de l’Attention avec hyper kinésie (SDAH) (ou Attention Déficit Hyperactivity Desorder (ADHD) en anglais). Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne un PIGF pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d’un trouble neurologique chez un sujet exposé in utero à l’alcool, ledit trouble se manifestant par un ou plusieurs symptômes choisis dans le groupe comprenant la diminution de la masse cervicale, l’hyperactivité, la perte de l’attention, la difficulté d’apprentissage, la difficulté de mémorisation, la dépression, l’anxiété, les troubles émotionnels, l’irritabilité excessive et les problèmes comportementaux.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention le sujet traité est un sujet ayant été exposé in utero à l’alcool qui est choisi parmi un embryon, un fœtus ou un enfant, de préférence un fœtus ou un enfant, en particulier, un enfant prématuré. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne un PIGF pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d’un trouble neurologique dû à l’exposition in utero à l’alcool chez un enfant prématuré.
La période entre la 30ème semaine gestationnelle et le terme de la grossesse est essentielle pour la corticogenèse cérébrale. Il est ainsi particulièrement préféré d’administrer le PIGF à un fœtus, notamment à un fœtus exposé in utero à l’alcool à cette période précisément.
Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, lorsque le sujet est un enfant prématuré, le traitement consistera à supplémenter en PIGF ce sujet sur la période ex utero correspondante aux semaines de vie intra-utérines perdues. De préférence, la fenêtre de traitement peut s’étendre de la 30ème semaine gestationnelle au terme théorique (40 semaines gestationnelles), période durant laquelle l’angiogenèse cérébrale chez l’Homme est particulièrement intense.
On entend par « sujet » selon l’invention un humain, et de préférence un embryon, un fœtus ou un enfant. Un « embryon », tel qu’on l’entend ici, correspond à un ovocyte fécondé de moins de trois mois. Par « fœtus », on entend ici un individu pris avant la naissance et dont l’âge gestationnel est compris entre 3 et 9 mois. Après l’accouchement, le sujet devient un enfant. Par « enfant », on entend selon l’invention un individu dont l’âge est inférieur à 3 ans. Sont ainsi compris dans la catégorie des enfants selon l’invention, les nouveau-nés, dont l’âge est compris entre 0 et 1 mois, les nourrissons, qui ont entre 1 mois et 2 ans, et les enfants proprement dits, qui sont âgés d’au moins 2 ans. Un « nouveau-né », comme on l’entend ici, peut aussi bien être né à terme qu’être prématuré. Dans le contexte de la présente demande le terme « prématuré » désigne un enfant né vivant avant 37 semaines d'aménorrhée. Ce terme recouvre trois sous-catégories : la prématurité extrême (<28 semaines); la grande prématurité (entre la 28e et la 32e semaine); la prématurité moyenne, voire tardive (entre la 32e et la 37e semaine). Dans la présente invention les enfants prématurés traités par PIGF sont de préférence dans la catégorie de prématurité moyenne, voire tardive.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, le sujet est un sujet avec des troubles d'alcoolisation fœtale (sujet TCAF) ou un sujet SAF (atteint du syndrome d’alcoolisation fœtale). L'expression un sujet avec des troubles d'alcoolisation fœtale ou sujet TCAF telle qu’utilisée ici se rapporte à un embryon, un fœtus ou un sujet, en particulier humain, qui est exposé ou susceptible d’être exposé à l'alcool in utero et qui souffre de troubles d'alcoolisation fœtale ou qui est en danger de développer en raison de la consommation maternelle d'alcool une des conditions liées aux troubles d'alcoolisation fœtale par exemple, un trouble neurologique. Lorsqu’un sujet TCAF est atteint en particulier par un SAF, on parle dans ce cas d’un sujet SAF .
Par traitement , on entend ici toute action permettant de diminuer ou d’éradiquer les symptômes ou les causes des troubles neurologiques. Un traitement au sens de l’invention peut comprendre l’administration de PIGF (ou la supplémentation par PIGF), d’une composition pharmaceutique ou d’un produit le comprenant avec ou sans un suivi psychothérapeutique.
Par prévention , on entend ici toute action permettant de prévenir complètement ou partiellement le risque d’apparition des symptômes ou les causes des troubles neurologiques dus à l’alcoolisation fœtale. Une prévention au sens de la présente invention comprend l’administration de PIGF, d’une composition pharmaceutique, à un sujet exposé in utero à l’alcool ou à un sujet ayant été exposé in utero à l’alcool mais pour lequel les symptômes des troubles neurologiques ne sont pas encore apparus et le développement cérébral est toujours en cours. Les inventeurs mettent à profit le fait que le PIGF est un facteur placentaire naturellement présent à ces stades du développement fœtal chez un sujet sain ce qui présente l’avantage d’une utilisation aisée de PIGF par compensation dans la prévention des troubles neurologiques.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, le facteur de croissance placentaire est administré en une quantité thérapeutiquement efficace à un sujet ayant été exposé à l’alcool in utero.
Dans le contexte de l’invention, une quantité thérapeutiquement efficace signifie une quantité suffisante pour influencer le cours thérapeutique d'un état pathologique particulier. Une quantité thérapeutiquement efficace est également celle à laquelle tous les effets toxiques ou secondaires de l'agent sont compensés par les effets thérapeutiquement bénéfiques du principe actif utilisé. Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, le facteur de croissance placentaire (PIGF) est administré in utero et/ou ex utero. Il est ainsi envisageable de débuter un traitement (ou une prévention) par l’administration de PIGF durant la période intra-utérine et de le continuer après l’accouchement notamment lorsque l’enfant est né prématurément et qu’il perd par conséquent l’apport physiologique du PIGF placentaire.
De préférence, le PIGF sera administré seul ou dans une composition pharmaceutique par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, sous-cutanée, ou orale. De manière plus préférée, le PIGF sera administré à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps. En particulier, lorsque l’administration de PIGF est effectuée in utero, celle-ci a lieu de préférence directement au niveau placentaire afin d’atteindre plus rapidement le cerveau fœtal et éviter la dégradation de la protéine par l’organisme maternel.
Lorsque l’administration de PIGF a lieu après la naissance, de préférence, celui-ci est administré par voie parentérale, de préférence intraveineuse surtout s’il s’agit d’un enfant prématuré ou d’un nouveau-né.
Les modes d’administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l’établissement d’un traitement adapté à un patient comme par exemple l’âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés.
Lorsque le PIGF est administré sous forme de compositions pharmaceutiques, pour l’administration sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique locale, le PIGF peut être administré sous formes unitaires d’administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques au sujet en ayant besoin. Les formes unitaires d’administration appropriées comprennent les formes par voie intramusculaire, intraveineuse.
Comme indiqué ci-dessus, le choix de la voix d’administration la plus appropriée dépendra du moment où cette administration sera effectuée. En particulier, lorsque l’administration d’une composition cosmétique comprenant PIGF est effectuée in utero, celle-ci se fera par voie intermusculaire ou voie intraveineuse, de préférence au niveau placentaire. L’administration de la composition pharmaceutique comprenant le PIGF à un enfant nouveau-né ou un en enfant prématuré est faite de préférence par voie intraveineuse. Pour une administration parentérale, intranasale ou intraoculaire, on utilise des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion et/ou des agents mouillants pharmacologiquement compatibles.
Les formes pour l'administration parentérale sont obtenues de façon conventionnelle par mélange du PIGF avec des tampons, des agents stabilisants, des conservateurs, des agents solubilisant, des agents isotoniques et des agents de mise en suspension. Conformément aux techniques connues, ces mélanges sont ensuite stérilisés puis conditionnés sous la forme d'injections intraveineuses.
A titre de tampon, l'homme du métier pourra utiliser des tampons à base de sels de phosphate organique. Des exemples d'agents de mise en suspension englobent le méthylcellulose, l'hydroxyéthylcellulose, l'hydroxypropylcellulose, l'acacia et la carboxyméthylcellulose sodique. En outre, des stabilisants utiles selon l'invention sont le sulfite de sodium et le métasulfite de sodium, tandis que l'on peut citer le p- hydroxybenzoate de sodium, l'acide sorbique, le crésol et le chlorocrésol en tant que conservateurs.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées de manière à être administrées au patient par une unique voie ou par des voies différentes.
La posologie dépend naturellement de la forme sous laquelle le PIGF sera administré, du mode d'administration, de l'indication thérapeutique, de l'âge du patient et de son état. La dose à administrer est préférablement de 0,001 à 250 mg/kg de PIGF par jour, de préférence de 0,01 à 100 mg/kg de PIGF par jour, de manière plus préférée de 0,1 à 50 mg/kg de PIGF par jour et de manière encore plus préférée de 1 à 25 mg/kg de PIGF par jour. La dose unitaire du PIGF comprend de préférence de 0,1 à 50 mg/kg de ce composé.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, la dose initialement administrée du PIGF pourra être ajustée si nécessaire au cours d’un traitement en fonction de la réponse à ce traitement du sujet traité. L’Homme du métier se basant sur ces connaissances générales et sur la présente description saura ajuster la dose de PIGF de manière à optimiser son effet thérapeutique.
Comme mentionné plus haut dans la description, le facteur de croissance placentaire (PIGF) peut être utilisé également sous la forme de principe actif dans une composition pharmaceutique. Selon un second aspect, la présente invention concerne ainsi une composition pharmaceutique comprenant un facteur de croissance placentaire (PIGF) tel que défini ci- dessus et un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des troubles neurologiques, notamment des troubles neurologiques causés par l’alcoolisation fœtale in utero. La composition pharmaceutique selon la présente invention peut être utilisée dans la prévention et/ou le traitement de différents types de troubles neurologiques dus à l’exposition à l’alcool in utero d’un sujet comme décrit pour le PIGF ci-dessous. En particulier, ces TCAF sont des troubles neurodéveloppementaux dues à l’exposition à l’alcool in utero. La composition de la présente invention peut être également utilisée pour améliorer la migration des neurones et/ou des cellules gliales leur du développement cérébral, particulièrement la migration vers le néocortex, d’un sujet souffrant d’une parmi les maladies sélectionnées dans le groupe comprenant la schizophrénie, la sclérose en plaque, l’autisme, l’encéphalite épileptique, notamment le syndrome de West (WS), le syndrome de d’Ohtahara (OS) et le syndrom de Dravet (DS), la lissencéphalie classique, l’inflammation du système nerveux central (CNS), le syndrome de Miller-Dieker, l’autisme, les troubles causés par l’exposition à l’alcool in utero (TCAF).
On entend par « véhicule pharmaceutiquement acceptable » au sens de la présente invention, toute matière qui est appropriée à une utilisation dans un produit pharmaceutique. À titre d’exemple de véhicule pharmaceutiquement acceptable, on peut citer le lactose, l’amidon éventuellement modifié, la cellulose, l’hydroxypropylméthyl cellulose, le mannitol, le sorbitol, le xylitol, le dextrose, le sulfate de calcium, le phosphate de calcium, le lactate de calcium, les dextrates, l’inositol, le carbonate de calcium, la glycine, la bentonite et leurs mélanges.
La composition pharmaceutique selon l’invention peut se présenter sous différentes formes et être administrée de différentes manières comme indiquées plus haut en détails.
Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique de la présente invention comprend un PIGF en tant que principe actif en une concentration comprise entre 0.001 mg/kg et 250 mg/kg en poids par rapport au poids total du sujet auquel la composition pharmaceutique sera administrée.
Préférentiellement, la concentration de PIGF est comprise entre 0,01 mg/kg et 100 mg/kg en poids par rapport au poids du sujet auquel la composition pharmaceutique sera administrée et encore plus particulièrement, entre 0, 15 mg/kg et 50 mg/kg en poids par rapport au poids du sujet auquel la composition pharmaceutique sera administrée ou encore, entre 1 mg/kg et 25 mg/kg en poids par rapport au poids total du sujet auquel la composition sera administrée.
Les inventeurs ont démontré que l’augmentation de la quantité de PIGF est particulièrement efficace dans le rétablissement de la corticogenèse cérébrale permettant ainsi de corriger les atteintes neuronales induites par les facteurs endogènes et/ou exogènes mentionnés plus haut, comme par exemple l’exposition à l’alcool in utero, notamment les atteintes neuronales liées à un déficit cortical.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, le PIGF ou la composition pharmaceutique le comprenant est donc utilisé pour le traitement et/ou la prévention des troubles neurologiques, notamment des troubles neurologiques liés à un déficit cortical, plus particulièrement des troubles neurologiques dus à l’exposition à l’alcool in utero.
En outre, les inventeurs ont également démontré que l’augmentation de la quantité de PIGF permet d’atténuer ou de faire disparaître les symptômes par lesquels se manifestent les troubles neurologiques, en particulier les troubles neurodéveloppementaux. Dans un mode préféré de réalisation, ces troubles sont liés à un déficit cortical ; dans un mode plus préféré de réalisation, ces troubles sont dus à l’exposition à l’alcool in utero.
Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne ainsi un PIGF ou une composition pharmaceutique le comprenant pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des troubles neurologiques, en particulier des troubles neurodéveloppementaux. Dans un mode préféré de réalisation, ces troubles sont liés à un déficit cortical ; dans un mode plus préféré de réalisation, ces troubles sont dus à l’exposition à l’alcool in utero d’un sujet.
Un quatrième aspect de l’invention a pour objet une méthode de traitement de troubles neurologiques, de préférence des troubles neurodéveloppementaux. Dans un mode préféré de réalisation, ces troubles sont liés à un déficit cortical ; dans un mode plus préféré de réalisation, ces troubles sont dus à l’alcoolisation fœtale chez un sujet. Ladite méthode comprend une étape d’administration ou surexpression de PIGF ou l’administration d’une composition pharmaceutique le comprenant à un sujet présentant de tels troubles.
Cette méthode de traitement peut comprendre au préalable une étape de diagnostic de troubles neurologiques, particulièrement des troubles neurodéveloppementaux. Dans un mode préféré de réalisation, ces troubles sont liés à un déficit cortical ; dans un mode plus préféré de réalisation, ces troubles sont dus à l’exposition à l’alcool in utero du sujet. Selon un cinquième aspect la présente invention concerne le facteur de croissance placentaire (PIGF), une composition pharmaceutique ou un produit le comprenant selon l’invention pour l’utilisation dans le traitement d’un trouble neurologique, ladite utilisation comprenant une étape préalable à l’identification du sujet, ladite identification comprenant les étapes suivantes: a) mesure de la quantité de PIGF dans un échantillon biologique dudit sujet, de préférence provenant du placenta ou du sang du cordon ombilical ; b) comparaison de la quantité de PIGF de l’étape a) avec une référence qui est une mesure de la quantité de PIGF dans un individu sain, et c) détermination d’un trouble neurologique ou du risque de développer un trouble neurologique chez ledit sujet.
On entend par échantillon biologique selon l’invention tout échantillon qui peut être prélevé à partir d'un sujet. Alternativement, l’échantillon biologique est un échantillon provenant du placenta, notamment du cordon ombilical. En effet, le PIGF est exprimé par des cellules du placenta tout au long de la grossesse. Cela permet de doser le PIGF sans attenter à l’intégrité du sujet, en particulier quand celui-ci est un embryon ou un fœtus. De façon générale, l’échantillon biologique doit permettre la détermination du taux d'expression de PIGF. L'échantillon à tester peut être utilisé comme obtenu directement à partir de la source biologique ou à la suite d'un prétraitement pour modifier le caractère de l'échantillon. Par exemple, un tel prétraitement peut inclure la préparation de plasma à partir de sang, la dilution de fluides visqueux et ainsi de suite. Des procédés de prétraitement peuvent aussi impliquer la filtration, la précipitation, la dilution, la distillation, le mélange, la concentration, l'inactivation de composants perturbateurs, l'addition des réactifs, une lyse, etc. En outre, il peut être bénéfique de modifier un échantillon d'essai solide pour former un milieu liquide ou pour libérer l'analyte.
La protéine PIGF est une protéine sécrétée (DeFalco, Exp Mol Med. 44(1 ): 1 -9, 2012). Les échantillons biologiques préférés pour la détermination du taux d'expression de ladite protéine comprennent en particulier les échantillons de sang, de plasma, ou de lymphe. De préférence, l'échantillon biologique est un échantillon de sang. De façon encore plus préférée, l’échantillon biologique est un échantillon de sang du placenta ou de sang de cordon. Celui-ci est en effet habituellement recueilli lors de l’accouchement. Le sang des vaisseaux placentaires peut alors être obtenu pour mesurer le taux de PIGF.
Selon un mode de réalisation de la présente méthode, lorsque la quantité de PIGF mesurée à l’étape a) est inférieure à la référence le sujet est déterminé comme souffrant de ou ayant un risque de développer un trouble neurologique et en particulier un trouble neurodéveloppemental. Dans un mode préféré de réalisation, ces troubles sont liés à un déficit cortical ; dans un mode plus préféré de réalisation, ces troubles sont dus à l’exposition à l’alcool in utero. Selon la présente invention, la quantité de PIGF est mesurée lorsqu’un sujet présente au moins un symptôme pouvant être lié à un trouble neurologique et en particulier un trouble neurodéveloppemental. La quantité de PIGF sera également mesurée lorsqu’un sujet ne présente pas un ou plusieurs troubles particuliers liés à un facteur de risque (facteurs endogènes, tels qu’une mutation génétique, une altération de réseau vasculaire cérébral etc., ou facteurs exogènes tels que l’exposition à des composés toxiques et en particulier, l’exposition in utero à l’alcool) mais pour qui l’exposition à un tel facteur de risque pendant cette période a été avérée ou supposée.
Dans un mode particulier de réalisation , la quantité de PIGF est mesurée lorsqu’un sujet présente au moins un symptôme d’au moins un trouble pouvant être lié à l’exposition à l’alcool intra-utérine. La quantité de PIGF sera également mesurée lorsqu’un sujet ne présente pas un ou plusieurs symptômes de troubles particuliers liés à l’exposition d’alcool intra-utérine mais pour qui l’exposition à l’alcool pendant cette période a été avérée ou supposée. Ainsi, la mesure de la quantité de PIGF comme décrit ci-dessus permettra de confirmer ou d’infirmer un trouble neurologique ou le risque d’en développer un avant la prise en charge thérapeutique.
Selon un mode de réalisation, la quantité de PIGF est déterminée en mesurant la quantité de transcrits codant le PIGF ou la quantité du polypeptide.
Le taux d’expression génique ou protéique peut être mesuré par de nombreuses méthodes qui sont à la disposition de l’homme du métier. Il peut y avoir plusieurs étapes intermédiaires entre le prélèvement de l’échantillon biologique et la mesure de l’expression de PIGF, lesdites étapes correspondant à l’extraction à partir dudit échantillon d’un échantillon d’ARNm (ou de l’ADNc correspondant) ou d’un échantillon de protéine. Celui-ci peut ensuite être directement utilisé pour mesurer l’expression de PIGF. La préparation ou l’extraction d’ARNm (ainsi que la rétrotranscription de celui-ci en ADNc) ou de protéines à partir d’un échantillon cellulaire ne sont que des procédures de routine bien connues de l’homme du métier.
Une fois qu’un échantillon d’ARNm (ou d’ADNc correspondant) ou de protéine est obtenu, l’expression de PIGF, au niveau soit des ARNm (c’est-à-dire dans l’ensemble des ARNm ou des ADNc présents dans l’échantillon), soit des protéines (c’est-à-dire dans l’ensemble des protéines présentes dans l’échantillon), peut être mesurée. La méthode utilisée pour ce faire dépend alors du type de transformation (ARNm, ADNc ou protéine) et du type d’échantillon disponible.
Quand l’expression de PIGF est mesurée au niveau de l’ARNm (ou d’ADNc correspondant), n’importe quelle technologie habituellement utilisée par l’homme du métier peut être mise en œuvre. Ces technologies d’analyse du niveau d’expression des gènes, comme par exemple l’analyse du transcriptome, incluent des méthodes bien connues telles que la PCR (Polymerase Chain Reaction, si on part d’ADN), la RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, si on part d’ARN) ou la RT-PCR quantitative ou encore les puces d’acides nucléiques (dont les puces à ADN et les puces à oligonucléotides) pour un plus haut débit.
Par puces d’acides nucléiques , on entend ici plusieurs sondes d’acides nucléiques différentes qui sont attachées à un substrat, lequel peut être une micropuce, une lame de verre, ou une bille de la taille d’une microsphère. La micropuce peut être constituée de polymères, de plastiques, de résines, de polysaccharides, de silice ou d’un matériau à base de silice, de carbone, de métaux, de verre inorganique, ou de nitrocellulose.
Les sondes peuvent être des acides nucléiques tels que les ADNc ( puce à ADNc ), les ARNm ( puce à ARNm ) ou des oligonucléotides ( puce à oligonucléotides ), lesdits oligonucléotides pouvant typiquement avoir une longueur comprise entre environ 25 et 60 nucléotides. Pour déterminer le profil d’expression d’un gène particulier, un acide nucléique correspondant à tout ou partie dudit gène est marqué, puis mis en contact avec la puce dans des conditions d’hybridation, conduisant à la formation de complexes entre ledit acide nucléique cible marqué et les sondes attachées à la surface de la puce qui sont complémentaires de cet acide nucléique. La présence de complexes hybridés marqués est ensuite détectée.
Ces technologies permettent de suivre le niveau d’expression d’un gène en particulier ou de plusieurs gènes voire même de tous les gènes du génome (full genome ou full transcriptome) dans un échantillon biologique (cellules, tissus ...). Ces technologies sont utilisées en routine par l’homme du métier et il n’est donc pas besoin de les détailler ici. Alternativement, il est possible d’utiliser toute technologie actuelle ou future permettant de déterminer l’expression des gènes sur la base de la quantité d’ARNm dans l’échantillon. Par exemple, l’homme du métier peut mesurer l’expression d’un gène par hybridation avec une sonde d’acide nucléique marquée, comme par exemple par Northern blot (pour l’ARNm) ou par Southern blot (pour l’ADNc), mais aussi par des techniques telles que la méthode d'analyse sérielle de l'expression des gènes (SAGE) et ses dérivés, tels que LongSAGE, SuperSAGE, DeepSAGE, etc. Il est aussi possible d’utiliser des puces à tissu (aussi connues en tant que TMAs : « tissue microarrays »). Les tests habituellement employés avec les puces à tissu comprennent l’immunohistochimie et l’hybridation fluorescente in situ. Pour l’analyse au niveau de l’ARNm, les puces à tissu peuvent être couplées avec l’hybridation fluorescente in situ. Enfin, il est possible d’utiliser le séquençage massif en parallèle pour déterminer la quantité d’ARNm dans l’échantillon (RNA-Seq ou « Whole Transcriptome Shotgun Sequencing »). À cet effet, plusieurs méthodes de séquençage massif en parallèle sont disponibles. De telles méthodes sont décrites dans, par exemple, US 4,882, 127, U.S. 4,849,077; U.S. 7,556,922; U. S. 6,723,513; WO 03/066896; WO 2007/111924; US 2008/0020392; WO 2006/084132; US 2009/0186349; US 2009/0181860; US 2009/0181385; US 2006/0275782; EP-B1 -1141399; Shendure a Ji, Nat Biotechnol. , 26(10): 1135-45. 2008; Pihlak et al. , Nat Biotechnol., 26(6) : 676- 684, 2008 ; Fuller et al. , Nature Biotechnol., 27(1 1 ): 1013-1023, 2009; Mardis, Genome Med., 1 (4): 40, 2009; Metzker, Nature Rev. Genet., 1 1 (1 ): 31 -46, 2010.
De préférence, l’expression du PIGF est mesurée au niveau protéique par une méthode sélectionnée parmi l’immunohistologie, l’immunoprécipitation, le western blot, le dot blot, l’ELISA ou l’ELISPOT, les puces à protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à l’immunohistochimie, les techniques de FRET ou de BRET, les méthodes de microscopie ou d’histochimie, dont notamment les méthodes de microscopie confocale et de microscopie électronique, les méthodes basées sur l’utilisation d’une ou plusieurs longueurs d’onde d’excitation et d’une méthode optique adaptée, comme une méthode électrochimique (les techniques voltamétrie et d’ampérométrie), le microscope à force atomique, et les méthodes de radiofréquence, comme la spectroscopie résonance multipolaire, confocale et non-confocale, détection de fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorbance, réflectance, transmittance, and biréfringence ou index de réfraction (par exemple, par résonance des plasmons de surface, par ellipsométrie, par méthode de miroir résonnant, etc. ), cytométrie de flux, imagerie par résonance radioisotopique ou magnétique, analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS- PAGE); par spectrophotométrie HPLC-Mass, par chromatographie liquide/spectrophotométrie de masse/spectrométrie de masse (LC-MS/MS). Plus préférentiellement, la quantité de PIGF est déterminée par une méthode choisie parmi l’immunoprécipitation, l’immunohistologie, le western blot, le dot blot, l’ELISA ou l’ELISPOT, les puces à protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à l’immunohistochimie. Des anticorps dirigés contre PIGF sont disponibles commercialement (voir par exemple, R&D Systems, Santa Cruz, Abcam, etc.) et peuvent être utilisés dans les méthodes de l’invention. Encore plus préférablement, l’expression du PIGF est mesurée par Western Blot ou par ELISA.
En outre, la quantité de PIGF est normalisée par rapport à un marqueur témoin qui peut être un gène choisi parmi B2M, TF RC, YWHAZ, RPLO, 18S, GUSB, UBC, TBP, GAPDH, PPIA, POLR2A, ACTB, PGK1 , HPRT1 , IP08 et HMBS, ou un polypeptide choisi parmi le produit desdits gènes.
Le taux de PIGF ainsi mesuré est comparé par la suite à un taux d’expression de PIGF de référence afin de déterminer s’il s’agit d’un sujet atteint d’un trouble neurologique dû à l’exposition à l’alcool in utero.
Par « un taux d’expression de PIGF de référence », on entend au sens de la présente demande tout taux d’expression dudit facteur utilisé à titre de référence. Par exemple, un taux d’expression de référence peut être obtenu en mesurant le taux d’expression de PIGF dans un échantillon biologique, par exemple un placenta ou le sang ombilical, d’un sujet sain, c’est-à-dire un sujet qui n’a pas été exposé à l’alcool in utero.
L’invention sera décrite plus précisément au moyen des exemples ci-dessous. Lesdits exemples sont fournis ici à titre d'illustration et ne sont pas, sauf indication contraire, destinés à être limitatifs. LÉGENDES DES FIGURES
Figure 1. Effets de la surexpression placentaire de PIGF in utero sur le positionnement des oligodendrocytes et des interneurones GABA dans le cerveau fœtal lors de l'exposition intra-utérine à l'alcool. A : Une approche d'activation PGF/CRISPR/dCas9 couplée à une électroporation du placenta in utero a été réalisée à 13 jours de gestation (GD13) et la surexpression de PIGF a été contrôlée à GD20. Dans le groupe « Alcool », l'exposition in utero à l'alcool a lieu entre GD15 et GD20. B,C : Visualisation du positionnement et de la densité des précurseurs des oligodendrocytes et des intemeurones GABA à l'aide des marqueurs respectifs Olig2 et Lhx6. Les immunohistochimies ont été effectuées chez le foetus E20 issues de souris gravides exposées à du NaCI (« Control ») ou de l'alcool (« Alcohol »). Il est à noter chez les sujets « CRISPR-Pgf-Act -» du groupe « Alcohol », le fort rétrécissement de la couche d'oligodendrocytes (B) et d'interneurones GABA (C) en migration après une exposition à l'alcool. D : Quantification de l'aire associée à l'immunomarquage Olig2 après traitement d'image par segmentation. Barre d'échelle : 400 pm.
Figure 2. Effets d'un traitement in vitro aigu de tranches organotypiques de cortex de souris âgées de 2 jours sur l'activité endothéliale de la MMP9. A : zymographie sur gel montrant que le glutamate accroît l'activité MMP9 alors que l'éthanol la diminue. B,C : zymographie in situ démontrant que l'activité MMP9 est endothéliale et localisée au niveau de la route de migration piale des interneurones GABA. D : Quantification des effets du glutamate et de l'alcool sur la cinétique de dégradation du substrat DQ-gelatin-FITC au niveau de la route de migration piale.
Figure 3. Effets d'un traitement in vitro aigu de tranches organotypiques de cortex de souris âgées de 2 jours sur l'activité MMP9 chez la souris invalidée pour le tPA. A :
Rappel de l'interaction fonctionnelle entre le tPA et la MMP9. B : Démonstration de l'absence d'effet du glutamate sur l'activation de la ALMR9 chez la souris tPA ' . C-E : zymographie in situ démontrant que l'activité tPA-like est endothéliale et localisée au niveau de la route de migration piale des intemeurones GABA. F : Quantification des effets du glutamate et de l'alcool sur la cinétique de dégradation du substrat DQ-casein-FITC (substrat tPA-like) au niveau de la route de migration piale. G : Quantification des effets du glutamate et de l'alcool sur la cinétique de dégradation du substrat DQ-gelatin-FITC (MMP-like) au niveau de la route de migration piale chez la souris tPA·
Figure 4. Démonstration d'un effet direct du glutamate et de l'alcool sur l'activité des cellules endothéliales corticales de nouveau-né. A, B : Visualisation par immunohistochimie de la sous-unité indispensable GluN1 du récepteur NMDA sur des microvaisseaux corticaux et des cellules endothéliales à P2. C,D : Effet du glutamate sur l'activité calcique (D) des cellules endothéliales préalablement chargées par la sonde calcique FURA2 (C). E : Effet de l'alcool sur l'activité calcique stimulée par le glutamate sur les cellules endothéliales.
Figure 5. Effet d'une alcoolisation chronique in utero sur l'activité endothéliale et l'expression des sous-unités du récepteur NMDA. A, B : Contrairement aux effets aigus caractérisés in vitro, une exposition chronique in utero à l'alcool de E15 à E20, exacerbe les effets du glutamate sur la mobilisation calcique. C-E : L'exposition chronique in utero va notamment induire une augmentation de l'expression de la sous-unité GluN1 du récepteur NMDA. F, G : L'exposition chronique in utero va également exacerber l'activité MMP9-like au niveau de la route de migration piale.
Figure 6 Effet d'une alcoolisation chronique in utero sur le positionnement des interneurones GABA au niveau des couches corticales superficielles. A-C :
L'alcoolisation in utero induit une augmentation de la densité des interneurones Gad67GFP dans les couches superficielles. D-F : Effet de l'alcoolisation in utero sur l'expression de la GFP et de marqueurs d'interneurones GABA. G, H : Effet de l'alcoolisation in utero sur l'expression la densité des épines dendritiques des interneurones Gad67GFP.
Figure 7. Effet du traitement par l’éthanol aigu sur l’activation de la caspase-3 dans les éminences ganglionnaires des coupes cultivées E15. A-C: Immunohistochimie montrant l'immunomarquage de la caspase-3 basale clivée observée dans des coupes de cerveau E15 dans des conditions témoins après 3 heures de culture dans un milieu aCSF (artificial cerebrospinal fluid ;A). Le carré en pointillés indique la région de l'éminence ganglionnaire visualisée à un grossissement plus élevé (B,C). L'immunoréactivité étant cytoplasmique (flèches) ou associée à des cellules fragmentées (tête de flèche). D: Quantification au cours du temps par Western blot du clivage de la caspase-3 dans des éminences ganglionnaires microdisséquées cultivées dans de l’aCSF en l'absence ou en présence d'éthanol (50 mM). De la kétamine (100 uM) a été utilisée comme témoin positif. E: Quantification en fonction du temps de l'activité de type caspase-3 dans des éminences ganglionnaires microdisséquées exposées à un CSF en l'absence ou en présence d'éthanol (50 mM). De la kétamine (100 uM) a été utilisée comme témoin positif. Pour chaque expérience (Western blot et activité caspase), la contre-hémi-tranche a été utilisée comme témoin de l'hémi-tranche traitée. * p <0,05; *** p <0,001 vs hémi-tranche témoin en utilisant un test t apparié.
EXEMPLES Matériels et méthodes Animaux
Les souris NMRI (Naval Medical Research Institute), de type sauvage et transgénique ont été achetées auprès de Janvier (Le Genest Saint Isle, France). Des souris transgéniques FVB-Tg (GadGFP) 45704Swn (# 003718) ont été obtenues auprès du Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Dans ces souris trangéniques, les interneurones GABAergiques issus des éminences ganglionnaires (GE) expriment une protéine fluorescente verte sous le contrôle du promoteur du gène Gad1 de la souris. Des souris knockout tPA (tPA - / -) en C57B16 / 129 (tPA - / - en rapport 87,5 / 12,5%) ont été développées et fournies par le Centre de Biologie Moléculaire et Vasculaire, Université de Louvain, Belgique (Carmeliet et al., 1993). Les animaux ont été maintenus dans une pièce à température contrôlée (21 ± 1 °
C) avec un cycle lumière / obscurité de 12h / 12h (lumières allumées de 7h à 19h) et accès libre aux aliments et à l'eau du robinet. Le soin et la manipulation des animaux sont conformes aux recommandations des directives françaises et européennes pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (Directive du Conseil 86/609 / CEE, numéro de licence 21 CAE035) et sous la surveillance des enquêteurs autorisés (BJG, autorisation n ° 7687 du ministère de l'Agriculture et de la Pêche). Produits chimiques
Les produits chimiques utilisés dans les présents exemples sont : le glutamate, le bleu de Coomassie, l'isolectine-B4-TRITC / FITC, le tampon phosphate salin (PBS), la sérumalbumine bovine (BSA), le Triton X-100 et l'anticorps primaire b-actine qui proviennent de Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France) ; le gel Tris-glycine SDS- PAGE (contenant 0,1 % de gélatine comme substrat de gélatinases), le tampon de renaturation, le tampon de développement, la DQ-gélatine-FITC, la DQ-caséine-FITC qui proviennent d'Invitrogen (Cergy Pontoise, France) ; le paraformaldéhyde (PFA), obtenu auprès de Labonord (Templemars, France), L'anticorps primaire GFP provient d'Abcam (Cambridge, Royaume-Uni), l'anticorps primaire de la somatostatine provenait de Santa Cruz Biotechnology (CA, USA), l'anticorps primaire caspase-3 clivé provenait de Cell Signaling (Massachusetts, USA), les anticorps secondaires Alexa Fluor® 488 âne anti-lapin IgG (A-21206) utilisé pour immunohistochimie provenaient d'Invitrogen, le kit de caspase homogène 3/7 Apo-ONE provient de Promega (Fitchburg, Wl, USA). Exposition in utero-éthanol
De l'éthanol absolu (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) a été dilué dans du chlorure de sodium à 0,09% (NaCl). Les souris gravides ont reçu une injection sous-cutanée unique (s.c. ) par jour de 3 g / kg d'éthanol ou de NaCl à 0,09% entre le jour de gestation 15 (GD15) et le GD20 à 1 1 heures. La dose administrée d'éthanol était basée sur une étude antérieure (Jégou et al., 2012, Ann. Neurol. 72, 952-960) et a abouti à un taux d'alcoolémie (BAL) de 1 ,5 g / L 30 min après l'injection. Cette valeur de BAL représentative de l'ivresse chez l'homme était inférieure à 0,5 g / L après 3 heures. Les traitements ont été réalisés chez des souris de type sauvage et Gad67GFP.
Préparation et traitement de coupes cérébrales cultivées à partir d'embryons de souris et de souris nouveau-nés
Des coupes de cerveau ont été obtenues à partir de souris embryonnaires de jour E15 ou de souris postnatales 2 (P2). Des études antérieures démontrent qu’à ce stade, de nombreux interneurones immatures GABAergiques migrant toujours le long de la voie migratoire (Inada et al. , 2011 , PloS One 6, e27048). Les souris ont été sacrifiées par décapitation et les cerveaux rapidement disséqués pour isoler les hémisphères. Le néocortex a été immédiatement placé dans le liquide céphalorachidien artificiel (aCSF) glacé (en mM): NaCl, 125; KCL, 3; CaCl2, 2; NaH2P04, 1 ,2; NaHC03, 26; D-glucose, 10; pH 7,4. Des coupes transversales (250 pm) ont été coupées à 4 ° C en utilisant un vibrateur VT1000S Leica (Rueil-Malmaison, France), puis transférées dans des plaques Costar 24 puits (Cambridge, MA) récupération de 30 min. 37 ° C dans un incubateur humidifié sous atmosphère contrôlée de 5% de C02 / 95% d'air. Ensuite, les coupes ont été lavées avec l'aCSF frais et traités 3h à 37 ° C avec du glutamate (100 uM) et de l'éthanol (50 mM) seul ou en combinaison. Mesure de l'activité caspase-3
Pour mesurer l’activité caspase-3, des coupes cérébrales E15 de souris NMRI ont été microdisséquées, homogénéisées dans 500 pL de tampon de lyse hypotonique et 20 pg de protéines incubées à 30 °C avec 100 pL de tampon caspase-3, 1 pL du substrat de la caspase- 3 Z-DEVD-R110 fourni avec le kit homogène caséase-3/7 Apo-ONE (Promega). Pour chaque condition, le côté contralatéral de la tranche a été utilisé comme témoin. L'intensité de fluorescence a été quantifiée toutes les 5 minutes pendant 2 heures à une excitation sur des longueurs d'onde d'émission de 485 et 520 nm, respectivement, en utilisant un lecteur de plaque de caméléon (Mustionkatu, Turku, Finlande).
Immunohistochimie Des tranches de cerveau préalablement fixées avec 4% de PFA dans du P BS ont été incubées pendant une nuit à 4 ° C avec divers anticorps primaires dilués dans du tampon d'incubation (PBS contenant 1% de BSA et 3% de Triton X-100). Ensuite, les tranches ont été rincées deux fois avec du PBS pendant 20 minutes et incubées avec le même tampon d'incubation contenant l'anticorps secondaire adéquat. Les noyaux cellulaires ont été visualisés en incubant des coupes pendant 5 min avec 1 ug / ml de Hoechst 33258 dans du PBS. Des signaux fluorescents ont été observés avec un microscope Leica DMI 6000B. Le contrôle de la liaison non spécifique de l'anticorps secondaire a été effectué en omettant les anticorps primaires. SDS-PAGE zymographie de la gélatine
Les zymogrammes de la gélatine ont révélé des activités des métalloprotéases matricielles-2 et -9 (MMP-2 et -9) dans les cortex microdisséqués P2. Les tranches de cerveau cultivées ont été incubées pendant 3 h dans différents traitements. Des cortices microdisséquées à partir de coupes ont été lavées dans de l'aCSF frais et homogénéisées dans 50 pL de tampon de lyse (Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, glycérophosphate 10 mM, fluorure de natrium 100 mM, Triton X100 1%). Après centrifugation des homogénats (20 000 g x 15 min), les surnageants ont été recueillis et les concentrations en protéines ont été déterminées par le test de Bradford. Les protéines ont été chargées (30 pg / puits) et séparées par électrophorèse. Ensuite, les gels ont été incubés dans un tampon de renaturation pendant 30 min à la température ambiente, et dans le tampon de développement pendant 30 autres minutes à température ambiante. Après transfert dans du tampon de développement frais, les gels ont été incubés pendant 5 jours à 37° C, colorés dans du bleu de Coomassie à 0,5% pendant 1 heure et rincés pendant 1 heure dans de l'eau distillée. Des bandes claires sur fond bleu indiquent la digestion de la gélatine dans le gel par les gélatinases. Les images numériques des gels ont été acquises et les bandes de digestion ont été quantifiées en utilisant le logiciel Explora Nova Mercator (La Rochelle, France). Des expériences ont été réalisées dans des coupes cultivées de souris de type sauvage et de tPA - / - pour des traitements aigus et à partir d'un modèle chronique d'exposition à l'alcool in vivo.
Zymographie de la caséine in situ
La zymographie de la caséine in situ a été réalisée sur des coupes de cerveau de 250 pm préalablement colorées par l'isolectine-B4-TRITC afin de localiser le réseau vasculaire de la voie de migration piale. Après 2 lavages pendant 10 min avec un CSF, les tranches ont été incubées pendant 3 h avec DQ-caséine-FITC (1 /125), en présence de glutamate (100 mM) et d'alcool (50 mM) seul ou en association. La quantification de la fluorescence FITC, indicative d'une digestion cellulaire spécifique du substrat a été réalisée par vidéo- microscopie en utilisant un système vidéo-microscope fluorescent DMI 6000B Leica (Reuil- Malmaison, France) comme décrit pour la zymographie in situ de la gélatinase. Des expériences ont été réalisées dans des coupes de culture de souris de type sauvage pour des traitements aigus (exposition à une quantité d’alcool importante de manière non chronique) et à partir d'un modèle chronique d'exposition à l’alcool in vivo.
Cultures de cellules endothéliales corticales P2
Des cellules endothéliales microvasculaires de cerveau primaire de souris C57BL 6 isolées à partir de tissu cérébral de souris P2 ont été achetées chez Cell Biologics (Chicago, IL, USA). Les cellules ont été cultivées à 37° C, dans un environnement humidifié, en présence de 5% de C02. Elles ont été supplémentées tous les 2 jours avec un milieu de culture complet de cellules endothéliales de souris, sur des boîtes de 60 mm de diamètre ou des plaques de 12 puits. Deux jours après la confluence, les cellules ont été incubées pendant 24 h avec un milieu sans sérum. Les cellules ont ensuite été traitées avec de l'éthanol 50 mM ou un CSF pendant 30 min avant le test de calcimétrie.
Mesure des taux de calcium intracellulaire
Des cultures de cellules endothéliales ou des tranches de cerveau organotypiques obtenues à partir de souris P2 ont été incubées pendant 15 min dans un CSF contenant 10 uM de fura-2 AM et 0,03% de F-127 pluronique. Les cultures ou coupes endothéliales ont ensuite été lavées deux fois pendant 5 minutes dans un CSF à 37° C et les coupes ont été transférées dans une boîte de 35 mm contenant 1 mL d'aCSF et immobilisées en utilisant une maille de nylon. La température de l'aCSF a été maintenue constante à 37°C et les cellules cultivées ou les tranches ont été rincées avec un CSF. Un volume de glutamate 400 uM seul ou en présence d'éthanol 100 mM a été perfusé dans un volume égal d'aCSF baignant la tranche pour atteindre une concentration finale de 200 uM et 50 uM, respectivement. Les signaux fluorescents associés à Fura-2 sans calcium et lié au calcium ont été mesurés en excitant alternativement les coupes à 340 et 380 nm en utilisant un microscope fluorescent Leica DM équipé d'une roue à obturateur rapide. La fluorescence émise a été recueillie à 510 nm et le rapport des deux signaux a été calculé en utilisant un logiciel métamorphique (Roper Scientific, Evry, France). Les données ont été exportées vers le logiciel de biostatistique Prism (GraphPad Inc., San Diego, CA, USA), qui a été utilisé pour calculer l'intensité de fluorescence maximale et l'aire sous la courbe (AUC). Des expériences ont été réalisées dans des coupes de culture de souris de type sauvage pour des traitements aigus (exposition à une quantité d’alcool importante de manière non chronique) et à partir d'un modèle chronique d'exposition à l'alcool in vivo.
Western blot
Des cortex micro-disséqués de souris Gad67-GFP ont été rapidement homogénéisés dans du tampon de lyse glacé. Après centrifugation, les surnageants ont été recueillis et les concentrations en protéines ont été déterminées par dosage de Bradford. Le culot a été dénaturé à 100 ° C pendant 5 min dans 50 ul de Tris / HCl (pH 7,5) contenant 20% de glycerol, 0,7 M de 2-mercaptoéthanol, 0,004% (poids / volume) de bleu de bromophénol et 3% (poids / volume) le dodécylsulfate de sodium (SDS) est ensuite soumis à une électrophorèse sur un gel SDS-polyacrylamide à 10%. Après séparation, les protéines ont été transférées électriquement sur une membrane de polyvinyldifluoridine (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA). La membrane a été incubée avec une solution bloquante (1 % BSA dans une solution saline tamponnée au Tris contenant 0,05% de Tween 20) à température ambiante pendant 1 h et incubée pendant la nuit avec des anticorps primaires dirigés contre la somatostatine, GluN1 , GluN2A, GluN2B, clivée-caspase3, GFP, Dlx1 et l'actine (cf. tableau 1 ci-dessous). Après incubation avec les anticorps secondaires correspondants couplés à la peroxydase (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), les protéines ont été visualisées en utilisant un système de détection d'immunoblotting par chimiluminescence ECL Plus amélioré (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Allemagne). L'intensité des bandes immunoréactives a été quantifiée à l'aide d'un système d'analyse par blot (Laboratoires Bio-Rad, Marne la coquette, France) et la b-actine a été utilisée comme témoin de chargement. Les marqueurs commerciaux (norme Seeblue prestained, Invitrogen) ont été utilisés comme standards de poids moléculaire.
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Tableau 1 : Origine et caractéristiques des anticorps primaires utilisés pour les études immunohistochimiques et le Western blot réalisés dans des tissus de souris.
Quantification des interneurones GFP-positifs chez les souris Gad67-GPF Pour la mesure de la densité cellulaire positive GFP chez des souris Gad67-GFP P15, les images ont été acquises et enregistrées au format TIFF en utilisant un microscope Leica DMI 6000B. Les images ont ensuite été ouvertes dans le logiciel Mercator et les régions d'intérêt (ROI) ont été dessinées. Ensuite, une trame de comptage a été définie dans la ROI et un seuil a été établi afin de différencier les cellules positives FITC de l'arrière- plan. Par un processus de segmentation, l'ordinateur a calculé le nombre et la zone cumulée d'objets dans la ROI, donnant le nombre de cellules et la densité cellulaire, respectivement. Quantification de la morphologie du rachis et de la densité du rachis chez des souris transgéniques Gad67-GFP
Le réseau fin de dendrites secondaires et tertiaires a été acquis chez des souris Gad67-GFP en utilisant un système d'imagerie laser confocal Le ica TCS SP2 AOBS (Leica Microsystems AG). La série d'images Z-stack a ensuite été déconnectée à l'aide du logiciel AutoQuant X3 et chargée dans le logiciel d'imagerie I MARIS (Bitplane, Zurich, Suisse) pour la reconstruction 3D. La fonction Traceur de filaments a été utilisée pour attribuer et classer les épines, donnant la densité de la colonne vertébrale et les catégories de rachis (trapus, filopodes ou en forme de champignon). Pour une tranche donnée, 2 ROI ont été définies, 2 à 3 dendrites ont été quantifiées par ROI et le nombre total de neurites quantifiés a été fixé à 20 par groupe.
Analyse statistique
Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel biostatistique Prism. Les tests utilisés pour chaque expérience, le nombre d'expériences indépendantes et les valeurs p ont été résumés dans le tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 : Analyse statistique
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Résultats
Effets de la surexpression placentaire de PIGF in utero sur le positionnement des oligodendrocytes et des interneurones GABA lors de l'exposition intra-utérine à l'alcool Les résultats montrés dans la Figure 1 indiquent que l’alcoolisation in utero altère fortement le positionnement des oligodendrocytes en migration (Olig2 ; Figure 1 B) et des interneurones GABA en migration (Lhx6 ; Figure 1 C). La surexpression du PIGF placentaire (CRISPR-PIGF-Act+) restaure un profil histologique comparable aux contrôles. D’un point de vue quantitatif, la surexpression de PIGF après l'électroporation in utero des plasmides PGF/CRISPR-dCas9 (sujets « CRIPR-P/gf-Act +»), n'a pas d’effet sur la densité des cellules nerveuses dans les groupes « Contrôles ». En revanche, elle augmente l'épaisseur de la couche d'oligodendrocytes dans le groupe « Alcohol » compensant ainsi les effets néfastes de l'alcool sur l'organisation nerveuse et permet de rétablir un phénotype proche de celui des contrôles. VL/LV : ventricule latéral. Les mêmes résultats ont été obtenus pour les interneurones GABA ce qui démontre la capacité de PIGF à améliorer la migration vasculo- dépendante de ces cellules nerveuses dans le néocortex.
L'alcool altère l'activité endothéliale de la MMP-9 dans la route de migration piale de coupes corticales cultivées des souriceaux nouveau-nés P2
Des expériences de zymographie en gel réalisées à P2 lorsque les interneurones GABA migrent le long de la voie migratoire piale (Anderson et al. , 2001 , Development. 128, 353- 363. ; Xu et al., 2011 , J. Neuropathol. Exp. Neurol. 70, 841 -858), ont révélé que le traitement des tranches corticales avec du glutamate (100 mM) de l'activité MMP-9 (p <0,001 ; Figure 2A) augmente l’activité MMP-9. La co-incubation des tranches avec de l'alcool (50 mM) empêche significativement l'effet du glutamate sur l'activité MMP-9 (p <0,01 ; Figure 2A). Les images par zymographies in situ réalisées dans des coupes corticales cultivées ont montré que la fluorescence (qui résulte du clivage de la DQ-gélatine-FITC, un substrat des MMPs) est principalement endothéliale et localisée au niveau des vaisseaux tangentiels de la voie migratoire piale (Figure 2B, C; flèches) et le long des microvaisseaux radiaux dans les couches superficielles corticales (Figure 2B,C; têtes de flèches). Comme observé dans les expériences de gel SDS-page, l’incubation de tranches de culture avec du glutamate (100 uM) a augmenté de manière significative l'activité MMP-endothélial associée (Figure 2D) et cet effet a été nettement bloqué par l'éthanol (50 mM, Figure 2D). Ces résultats montrent pour la première fois que l’alcool perturbe l’activité des cellules endothéliales de la voie de migration piale.
L'alcool altère l'activité du tPA endothélial dans les coupes corticales cultivées chez des souriceaux nouveau-nés
Il a été démontré que l'activation de la MMP-9 endothéliale est régulée par la protéase endothéliale tPA (Jin et al., 2010, Neurobiol. Dis. 38, 376-385. ; Omouendze et al., 2013, PloS One 8, e71263, Figure 3A). Les inventeurs ont étudié l'effet de l'alcool sur l'activité du tPA. Les images obtenues par zymographie sur gel de coupes corticales P2 ont montré que le glutamate (100 uM) a augmenté l'activité de tPA (Figure 3B). Comme pour MMP-9, des expériences de zymographie in situ ont été menées dans des coupes corticales cultivées en utilisant le substrat tPA DQ-caséine-FITC afin de visualiser l'activité de type tPA (Figure 3C-E). Le co-marquage des microvaisseaux corticaux avec l'isolectine-TRITC a démontré que le signal fluorescent résultant de l'activité protéolytique était principalement endothélial et co-localisé avec les vaisseaux de la voie de migration piale (Figure 3C-E) et les microvaisseaux radiaux apicaux (Figure 3C-E; flèches). La cinétique de la protéolyse DQ-caséine-FITC dans les microvaisseaux a montré que l'alcool (50 mM) inhibait significativement l'activité de type tPA induite par le glutamate (Figure 3F). Dans des tranches de culture d'animaux inactivés par le tPA (tPA -/-), le glutamate (100 mM) et l'alcool (50 mM) n'ont pas réussi à réguler l'activité MMP-9 endothéliale démontrant ainsi une activation de MMP9 dépendante du Tpa (Figure 3G).
Le glutamate et l'alcool régulent directement l'activité des cellules endothéliales néonatales
Alors que les tranches cultivées présentent l'avantage d'interactions cellule-cellule semi- conservées, ce modèle ne permet pas de discriminer les effets directs ou indirects. Parce qu'il a été montré récemment que les cellules endothéliales néonatales expriment des récepteurs fonctionnels NMDA (Legros et al., 2009), les inventeurs ont recherché, par calcimétrie, un effet direct de l'alcool sur des cellules endothéliales cultivées à partir de microvaisseaux corticaux P2 (Figure 4). Les expériences d'immunohistochimie ont confirmé l'expression de la sous-unité GluN1 du récepteur NMDA à la fois sur des microvaisseaux isolés et sur des cellules endothéliales néonatales en culture (Figure 4A,B). Quatre jours après l'ensemencement, les cellules endothéliales étaient confluentes et des expériences de calcimétrie ont été menées après chargement des cellules avec la sonde ratiométrique FURA2 (Figure 4C). La perfusion de cellules cultivées avec du glutamate (200 mM) induit une augmentation des taux de calcium intracellulaire ([Ca2 +]¾; Figure 4D,E). Le pourcentage de cellules répondantes est de 45% ± 5%. La co-perfusion d'alcool (50 mM) réduit significativement la mobilisation de [Ca2 +] induite par le glutamate (Figure 4E).
Les résultats ci-dessus démontrent que lorsqu'ils sont coadministrés, l'alcool inhibe significativement l’effet du glutamate à la fois dans les tranches cultivées et dans les cellules endothéliales cultivées. Ces résultats constituent ainsi la première démonstration d'une interaction fonctionnelle directe glutamate / alcool sur les cellules endothéliales néonatales cultivées le long de la voie de la migration piale des interneurones GABAergiques.
Effet de l'exposition in utero chronique à l’alcool sur l'activité MMP-9 endothéliale
Afin de confirmer in vivo les effets obtenus in vitro sur des coupes en culture et des cellules endothéliales suite à une exposition à l'éthanol, les inventeurs ont étudié l’effet du glutamate sur la mobilisation de Ca2 + et l'activité endothéliale des nouveau-nés précédemment exposés in utero à l'alcool (Figure 5). De manière inattendue, la quantification de la mobilisation du calcium dans les couches corticales superficielles a révélé que l'effet du glutamate (100 mM) sur [Ca2
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était nettement exacerbé dans les tranches de nouveau-nés précédemment exposés in utero à l'alcool (Figure 5A, B). Fait intéressant, cet effet fonctionnel de l'alcool a été associée à une surexpression majeure de la sous-unité corticale GluN1 du récepteur NMDA (Figure 5C) et une tendance similaire a été trouvée pour les sous-unités GluN2A et GluN2B (Figure 5D, E). En ce qui concerne les activités de la protéase endothéliale, le traitement des coupes corticales P2 chez les nouveau-nés précédemment exposés in utero à l'alcool et au glutamate (100 uM) a entraîné une activité exacerbée MMP-9 dans les microvaisseaux de la voie de migration piale (Figure 5F, G).
Ces résultats indiquent que les effets de l’alcool au niveau cérébral sur la voie de migration piale endothéliale des interneurones GABAergiques vont différés selon le mode d’exposition (chronique ou aigu).
L'exposition à l'alcool in vivo altère la densité des interneurones GABA corticaux
Puisque les interneurones GABAergiques migrant le long de la voie de migration piale peuplent préférentiellement les couches corticales superficielles (Miyoshi et Fishell, 2011 , Cereb. Cortex N. Y. N 1991 21 , 845-852), les inventeurs ont étudié l'effet de l'exposition in vivo et in utero à l'alcool sur le positionnement de interneurons Gad67GFP. En effet, les données décrites dans Oliva et al., 2000, (J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 20, 3354- 3368) ont montré que ces interneurones étaient préférentiellement localisés dans les couches corticales ll-IV. Au stade P15 du développement fœtal de la souris, le positionnement des neurones Gad67GFP est achevé (Southwell et al. , 2012, Nature 491 , 109-1 13. ). L'analyse morphométrique indique que l'exposition à l'alcool in utero augmente significativement (18,4% ± 3,9; p <0,05) la densité des interneurones Gad67GFP dans les couches superficielles (Figure 6A-C). Cet effet a été observé à la fois chez les femelles et les mâles (Figure 6C). Les résultats du Western blot ont confirmé les données histologiques et ont révélé un effet encore plus prononcé de l'exposition à l’alcool in utero aux niveaux de protéines eGFP (150% ± 48; p <0,01 ), suggérant que l'alcool altérait non seulement la densité des interneurones, mais aussi leur taux d'expression (Figure 6D).
Des expériences de Western blot ont également été réalisées pour cibler deux marqueurs des interneurones GABA, Dlx1 et la somatostatine, SSt (Figure 6E, F). En comparaison avec le groupe témoin, l'exposition à l'alcool in utero a augmenté significativement les niveaux de Dlx1 dans les extraits de cortex microdisséqué (Figure 6E). L'effet a été retrouvé chez les mâles et les femelles. En revanche, aucun effet significatif n'a été trouvé concernant SSt même si, contrairement à Dlx1 , les niveaux de SSt ont tendance à diminuer (Figure 6F).
Puisque la morphologie des épines dendritiques constitue une bonne indication du processus de différenciation neuronale (Bourne et Harris, 2008, Annu. Rev. Neurosci. 31, 47-67 ;Dailey et Smith, 1996, J. Neurosci. 16, 2983-2994), les inventeurs ont étudié les effets de l'exposition à l'alcool in utero en se basant sur l’observation des épines des interneurones Gad67-GFP (Figure 6G, H). La visualisation et la quantification de différents sous- types d’épines dendritiques ont montré que l'exposition in utero à l'alcool ne modifiait pas la distribution des filipodia, des stubbies et des champignons (Figure 6G). En revanche, l'exposition in utero à l’alcool augmente significativement la densité cellulaire des épines dendritiques (Figure 6H).
Enfin, le traitement des coupes corticales à de l'éthanol (50 mM) ne modifie pas significativement ni le clivage ni l’activité de la caspase-3 (Figure 7).
L’ensemble de ces résultats indiquent que l’exposition chronique à l’alcool exacerbe l’activité des protéases endothéliales MMP-9 et tPA au niveau de la voie de migration piale et se traduit par une augmentation anormale de la densité des interneurones GABAergiques au niveau des couches corticales superficielles. Ainsi, en favorisant la dégradation de la matrice extracellulaire, une alcoolisation chronique favoriserait la migration vasculo-dépendante des interneurones GABA le long de la voie de migration piale.
Conclusion
Au vu des différents résultats obtenus par les inventeurs chez la Souris gravide, il apparaît que :
• la surexpression de PIGF au niveau placentaire permet l’amélioration de la neurogénèse et l’organisation neuronale embryonnaires et chez les nouveau-nés après une exposition in utero à l’alcool ;
• la surexpression de PIGF dans le placenta d’une souris gravide exposée à l’alcool permet de corriger, chez les souriceaux, les anomalies de migration corticale de cellules nerveuses telles que les interneurones GABAergiques et les oligodendrocytes qui utilisent un mode de migration vasculo-dépendant ;
• la surexpression de PIGF peut être utilisée efficacement en tant que médicament dans le traitement des troubles neurologiques, en particulier, des troubles neurodéveloppementaux liés à une organisation néocorticale défaillante due à l’exposition in utero à l’alcool.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Facteur de croissance placentaire (PIGF) pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’un trouble neurologique chez un sujet.
2. PIGF pour son utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le trouble neurologique est lié à un déficit cortical.
3. PIGF pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le sujet a été exposé à l’alcool in utero.
4. PIGF pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le trouble neurologique est un trouble neurodéveloppemental.
5. PIGF pour son utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que le trouble neurodéveloppemental est une défaillance dans la mise en place du système nerveux central, particulièrement une défaillance choisie parmi une défaillance de la prolifération, de la migration, de la croissance et/ou de la différenciation des cellules neuronales et/ou des cellules gliales.
6. PIGF pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le trouble neurologique est une interneuronopathie.
7. PIGF pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisée en ce que le trouble neurodéveloppemental est une défaillance de la migration des cellules neuronales et/ou des cellules gliales, particulièrement une défaillance dans la migration des interneurones GABAergiques et/ou des oligodendrocytes.
8. PIGF pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisée en ce que le trouble neurodéveloppemental est causé par une perturbation de l’activité d’une métalloprotéinase matricielle lors d’une alcoolisation in utero, en particulier de l’activité de la métalloprotéinase matricielle MMP-9 et/ou de l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA).
9. PIGF pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le trouble neurologique se manifeste par un ou plusieurs symptômes choisis dans le groupe comprenant la diminution de la masse cervicale, l’hyperactivité, la perte de l’attention, la difficulté d’apprentissage, la difficulté de mémorisation, la dépression, l’anxiété, les troubles émotionnelles, l’irritabilité excessive et les problèmes comportementaux.
10. PIGF pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le trouble neurologique est sélectionné dans le groupe comprenant la schizophrénie, la sclérose en plaque, l’autisme, l’encéphalite épileptique, notamment le syndrome de West (WS), le syndrome de d’Ohtahara (OS) et le syndrome de Dravet (DS), la lissencéphalie classique, l’inflammation du système nerveux central (CNS), le syndrome de Miller-Dieker et les troubles causés par l’alcoolisation fœtale (TCAF).
11 . PIGF pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ledit PIGF possède la séquence représentée par une parmi SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO :4.
12. PIGF pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 1 1 , caractérisée en ce que ledit PIGF est obtenu par génie génétique ou par synthèse chimique.
13. PIGF pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 3 à 12, caractérisée en ce que le sujet ayant été exposé à l’alcool in utero est choisi parmi un embryon, un fœtus et un enfant, en particulier un enfant prématuré.
14. Composition pharmaceutique pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’un trouble neurologique, préférentiellement un trouble neurologique lié à un déficit cortical, chez un sujet, notamment un sujet exposé à l’alcool in utero, ladite composition pharmaceutique comprenant un PIGF tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 13 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
15. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que ledit trouble est une interneuronopathie et/ou une défaillance dans la mise en place du système nerveux central, particulièrement une défaillance choisie parmi une défaillance de la prolifération, de la migration, de la croissance et/ou de la différenciation des cellules gliales.
16. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce que ledit trouble neurologique est sélectionné dans le groupe comprenant la schizophrénie, la sclérose en plaque, l’autisme, l’encéphalite épileptique, notamment le syndrome de West (WS), le syndrome de d’Ohtahara (OS) et le syndrome de Dravet (DS), la lissencéphalie classique, l’inflammation du système nerveux central (CNS), le syndrome de Miller-Dieker et les troubles causés par l’alcoolisation fœtale (TCAF).
17. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que ledit trouble est un TCAF.
18. PIGF pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 13 ou composition pharmaceutique pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 14 à 17, caractérisés en ce que ladite utilisation comprend une étape préalable d’identification du sujet, ladite identification comprenant les étapes suivantes : a) mesure de la quantité de PIGF dans un échantillon biologique dudit sujet, de préférence provenant du placenta ou du sang du cordon ombilical ; b) comparaison de la quantité de PIGF de l’étape a) avec une référence qui est une mesure de la quantité de PIGF chez un sujet sain, et c) détermination d’un trouble neurologique ou risque de développer un tel trouble chez ledit sujet.
19. PIGF ou composition pour leur utilisation selon la revendication 18, caractérisés en ce que le sujet souffre d’un trouble neurologique ou risque de développer un tel trouble si la quantité mesurée de PIGF à l’étape a) est inférieure à la référence de l’étape b).
20. PIGF ou composition pour leur utilisation selon la revendication 18 ou 19, caractérisés en ce que le trouble neurologique est lié à un déficit cortical.
21 . PIGF ou composition pour leur utilisation selon l’une quelconque des revendications 18 à 20, caractérisés en ce que le sujet a été exposé à l’alcool in utero.
22. PIGF ou composition pour leur utilisation selon l’une quelconque des revendications 18 à 21 , caractérisés en ce que la quantité de PIGF est déterminée en mesurant la quantité d’acide nucléique PIGF ou la quantité du polypeptide PIGF.
23. PIGF ou composition pour leur utilisation selon la revendication 22, caractérisés en ce que la quantité de PIGF est mesurée par une méthode sélectionnée parmi le Northern blot, le Southern blot, la PCR, la RT-PCR, la RT-PCR quantitative, le SAGE et ses dérivés, les puces d’acides nucléiques, notamment les puces à ADNc, les puces à oligonucléotides et les puces à ARNm, les puces à tissu et le RNA-Seq et/ou par une méthode sélectionnée parmi l’immunohistologie, l’immunoprécipitation, le western blot, le dot blot, l’ELISA ou l’ELISPOT, les puces à protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à l’immunohistochimie, les techniques de FRET ou de BRET, les méthodes de microscopie ou d’histochimie, dont notamment les méthodes de microscopie confocale et de microscopie électronique, les méthodes basées sur l’utilisation d’une ou plusieurs longueurs d’onde d’excitation et d’une méthode optique adaptée, comme une méthode électrochimique (les techniques voltamétrie et d’ampérométrie), le microscope à force atomique, et les méthodes de radiofréquence, comme la spectroscopie résonance multipolaire, confocale et non-confocale, détection de fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorbance, réflectance, transmittance, and biréfringence ou index de réfraction (par exemple, par résonance des plasmons de surface, par ellipsométrie, par méthode de miroir résonnant, etc. ), cytométrie de flux, imagerie par résonance radioisotopique ou magnétique, analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE); par spectrophotométrie HPLC-Mass, par chromatographie liquide/spectrophotométrie de masse/spectrométrie de masse (LC-MS/MS).
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