WO2020004903A1 - 엑소좀 기반의 심근세포 교차분화 유도방법 - Google Patents

엑소좀 기반의 심근세포 교차분화 유도방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing cardiomyocyte cross-differentiation and more particularly to a method for inducing cardiomyocyte cross-differentiation based on exosomes.
  • cardiomyocytes lose cell division, and thus are not replenished once they are exposed to various stresses such as ischemia or myocarditis. As a result, the remaining cardiomyocytes try to maintain their function through target hypertrophy, but when this condition persists and exceeds the tolerance of the myocardial tissue, the cardiomyocytes become more or more bloody or dead, resulting in decreased myocardial function, That is, heart failure occurs.
  • Heart disease including heart failure, is one of the leading causes of death worldwide and is caused by cardiomyocyte loss or dysfunction.
  • Heart disease patients have a very poor prognosis, 5 year survival rate is only about 50%, and the cardiomyocytes have very limited regenerative capacity, so there is a lot of difficulty in curing.
  • cardiac insufficiency agents have been used, such as digitalis or xanthine preparations, which increase the contractile force of the myocardium, but these drugs are known to exacerbate the condition during long-term administration.
  • treatments using drugs that relieve excess heart area have been used by hyperactivity of the sympathetic nervous system or the renin-angiotensin system, such as ⁇ -blockers and ACE inhibitors, but these are only popular treatments and injured. It does not restore the heart tissue itself.
  • heart transplantation is a fundamental treatment for severe heart failure, but due to problems such as lack of organ donors, medical ethics, and physical or economic burden of the patient, there is a limit to use as a general treatment.
  • exosomes contain various bioactive substances as nano-vesicles (vesicles) secreted by cells for the exchange of information between cells.
  • stem cell-derived exosomes have the ability to differentiate and regenerate through various proteins and miRNAs, and are known to be widely applicable to the regeneration and treatment of various cells and tissues.
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 2013-0008560 discloses a method for proliferating cardiomyocytes using micro RNA.
  • the present invention is to solve a number of problems, including the above problems, stem cell-derived exosomes based on a direct reprogramming method secured through biocompatible non-viral exosomes and cardiomyocyte-induced chemical combinations It is an object of the present invention to provide a method of inducing cardiomyocyte cross-differentiation.
  • these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • the exosome separation step of separating the exosomes from the culture medium in the process of differentiating stem cells into cardiomyocytes A reprogramming step of fibroblasts culturing fibroblasts in the cardiomyocyte reprogramming medium to which the exosomes separated in the exosome separation step are added; And a cardiomyocyte induction step of culturing the fibroblast cells cultured in the reprogramming step of the fibroblasts in a cardiomyocyte-derived culture medium to which the exosomes isolated in the exosome separation step are added.
  • Differentiation methods are provided.
  • the exosome separation step of separating the exosomes from the culture medium in the process of differentiating stem cells into cardiomyocytes A first culture step of culturing fibroblasts in the cardiomyocyte reprogramming medium to which the exosomes separated in the exosome separation step are added; And a second culture step of culturing the fibroblasts cultured in the first culture step in a cardiomyocyte-derived culture medium to which the exosomes and cardiomyocyte differentiation inducing agent separated in the exosome separation step are added, from fibroblasts to cardiomyocytes.
  • a cross differentiation method of is provided.
  • composition for cross-differentiation of fibroblasts into cardiomyocytes including exosomes and cardiomyocyte differentiation inducing agents isolated from stem cells.
  • the exosome-based cardiomyocyte cross-differentiation induction method is introduced into the somatic cells stem cells-derived chemicals and cardiomyocyte-derived exosomes, stem cell intermediate step (iPSC) Cardiomyocytes can be directly induced from somatic cells without going through, and since the virus vector is not used, the safety in the body can be secured without fear of genetic variation due to viral infection.
  • iPSC stem cell intermediate step
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a method of inducing cardiomyocytes from mouse embryonic stem cells (E14tg2a).
  • Figure 2 is a schematic diagram showing a stem cell-derived exosomes extraction method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the chemical structure of the cardiomyocyte-derived chemicals used in the present invention.
  • Figure 4 is a schematic diagram showing a method of inducing cardiomyocytes using a cardiomyocyte-derived chemicals and stem cell-derived exosomes.
  • FIG. 5 is a series of photographs showing the morphology of cells from day 0 to day 15 after treatment with mouse embryonic fibroblasts derived from stem cells at 5 day intervals using an optical microscope.
  • Figure 6 is a fluorescent dye-binding anti- ⁇ -actin and anti- ⁇ -myosin heavy chains for treating fibroblasts treated with cardiomyocyte-derived chemicals and stem cell-derived exosomes to confirm direct reprogramming into cardiomyocytes.
  • a series of photographs showing the results of fluorescence immunocytochemical analysis after staining with ⁇ -MHC) antibody, respectively.
  • Figure 7 is to examine the morphology of myocardial cells (sarcomere) that is characteristic of the cardiomyocytes, cardiomyocytes monocellularized from cardiomyocyte cells prepared by treating the myocardial cell-derived drug and stem cell-derived exosomes fibroblasts.
  • myocardial cells searcomere
  • cardiomyocytes monocellularized from cardiomyocyte cells prepared by treating the myocardial cell-derived drug and stem cell-derived exosomes fibroblasts A series of photos showing the results of fluorescence immunocytochemical analysis by staining with fluorescent dye-binding anti- ⁇ -actin and anti- ⁇ -myosin heavy chain ( ⁇ -MHC) antibodies, respectively.
  • Figure 8 is an antibody to various cardiomyocyte-specific proteins derived from induced cardiomyocytes (iCM) prepared by treating fibroblasts with stem cell-derived exosomes and cardiomyocyte inducing agents to analyze the expression of cardiomyocyte-specific genes. It is a series of photographs showing the results of immunofluorescence staining using.
  • iCM induced cardiomyocytes
  • MEF mouse embryonic fibroblasts
  • iCM induced cardiomyocytes
  • H mouse cardiomyocytes
  • iCM mouse embryonic fibroblasts
  • iCM induced cardiomyocytes
  • CM cardiomyocytes
  • FIG. 11 is a series of graphs showing gene ontology (GO) term enrichment analysis of genes that exhibit five or more expression changes in iCM compared to MEF. Left, upstream gene; Right, down gene.
  • the GO term has been defined as cardiac contraction, myofibrilization and cardiac development.
  • Figure 12 shows chromatin remodeling-related miRNAs and cardiomyocyte formation process from MEF-exosomes, embryosomes, mexosomes and embryonic stem cell-derived exosomes (mESC-exosomes). ) Heatmaps of related miRNAs. miRNA target genes were analyzed by public database search and gene ontology (GO) analysis.
  • FIG. 13 is a series of graphs showing a comparison of the relative expression levels of miRNAs in embrisomes / MEF-derived exosomes and mexosomes / MEF-derived exosomes.
  • Expression levels of miRNAs were calculated using read counts, and miRNAs with higher expression levels in embryoosomes (A) and mexosomes (B) were examined than MEF and ESC-induced exosomes.
  • the expression levels of R-290 clusters, miR-302-367 clusters, and miR-200, which are associated with pluripotency, mesoderm induction, and somatic reprogramming, respectively, were particularly high in the embryosome and played an important role in cardiac development and function. miR-1 was highly expressed in mexosomes.
  • FIG. 14 is a series of graphs showing transient traces of calcium flux, i.e., cluster (top) and single cell (bottom) calcium in iCM at day 25 after induction.
  • exosome refers to extracellular vesicles, which are cell-derived vesicles that may be present in any biological fluid, including many culture media of blood, urine, and cell culture. Also called vesicles or microvesicles. Exosomes are known to be between 30 and 100 nm in size and are secreted from cells or directly through the cell membrane when the multivesicular body fuses with the cell membrane. Exosomes are known to play an important role in various processes such as coagulation, intercellular signaling, and management of metabolic waste.
  • embryonic body formation refers to exosomes obtained between the mesoderm-inducing stages of the embryonic body formation, and "mexosome” refers to mesoderm induction and cardiac maturation stages. Means the exosomes obtained in between.
  • direct cell conversion technique is a process that induces the transition between mature (differentiated) cells with completely different cell types in higher organisms. In other words, it is a technology that directly differentiates into other types of somatic cells. Unlike the process of reprogramming into induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) and reprogramming them into cells of interest, they induce the conversion to the cells of interest without going through the stages of induced pluripotent stem cells. There is a difference in that. Direct cross-differentiation is currently recognized for its potential use in disease modeling and drug discovery, and is expected to be applied to gene therapy and regenerative medicine in the future. Recently, studies have shown that reprogramming is possible from fibroblasts to various cells such as blood, blood vessels, muscles, etc. as well as organs that cannot regenerate tissues such as brain and heart cells. It is an increasing reality.
  • induced cardiomyocyte refers to cardiomyocytes cross-differentiated from fibroblasts by treatment with stem cell-derived exosomes and cardiomyocyte differentiation inducing agents according to one embodiment of the invention.
  • the exosome separation step of separating the exosomes from the culture medium in the process of differentiating stem cells into cardiomyocytes A reprogramming step of fibroblasts culturing fibroblasts in the cardiomyocyte reprogramming medium to which the exosomes separated in the exosome separation step are added; And a cardiomyocyte induction step of culturing the fibroblast cells cultured in the reprogramming step of the fibroblasts in a cardiomyocyte-derived culture medium to which the exosomes isolated in the exosome separation step are added.
  • Differentiation methods are provided.
  • the exosomes are separated from the first exosomes and cardiomyocyte maturation process separated during mesoderm induction. It may include a little and the mixing ratio of the first exo and the second exo bit may be 1:19 to 19: 1.
  • the cardiomyocyte reprogramming culture medium is KnockOut ® Serum Replacement 2 to 7% by weight, embryonic stem cell fetal bovine serum (ES-FBS) 10 to 17% by weight, N2 0.1 To 2% by weight, 1 to 3% by weight of B-27, 0.5 to 2% by weight of Glutamax, 0.5 to 2% by weight of non-essential amino acids (NEAA), 0.05 to 0.2 mM of ⁇ -mercaptoethanol, and 20 to 70 ⁇ g / ml ascorbic acid It may include.
  • the cardiomyocyte-derived culture medium is 12 to 20% by weight of fetal bovine serum, 20 to 70 ⁇ g / ml of ascorbic acid, and 0.5 to 2 insulin. ⁇ g / ml, and leukemia inhibitory factor 500-1,500 units / ml.
  • the cardiomyocyte induction culture medium may further include a cardiomyocyte differentiation inducing agent and the cardiomyocyte differentiation inducing agent CHIR99021, PD0325901, SB431542, Parnate (Tranylcypromine), Forskolin, It may be one or two or more mixtures selected from the group consisting of Repsox, TTNPB, and Valproic Acid (VPA) and the cardiomyocyte differentiation inducing agent may be added to the cardiomyocyte induction culture at a concentration of 1-50 ⁇ M.
  • a cardiomyocyte differentiation inducing agent CHIR99021, PD0325901, SB431542, Parnate (Tranylcypromine), Forskolin, It may be one or two or more mixtures selected from the group consisting of Repsox, TTNPB, and Valproic Acid (VPA) and the cardiomyocyte differentiation inducing agent may be added to the cardiomyocyte induction culture at a concentration of 1-50 ⁇ M.
  • the exosome separation step of separating the exosomes from the culture medium in the process of differentiating stem cells into cardiomyocytes A first culture step of culturing fibroblasts in the cardiomyocyte reprogramming medium to which the exosomes separated in the exosome separation step are added; And a second culture step of culturing the fibroblasts cultured in the first culture step in a cardiomyocyte-derived culture medium to which the exosomes and cardiomyocyte differentiation inducing agent separated in the exosome separation step are added, from fibroblasts to cardiomyocytes.
  • a cross differentiation method of is provided.
  • the exosomes are separated from the first exosomes and cardiomyocyte maturation process isolated during mesoderm induction.
  • the moths may be mixed.
  • composition for cross-differentiation of fibroblasts into cardiomyocytes comprising exosomes and cardiomyocyte differentiation inducing agents isolated from stem cells.
  • the exosomes may be prepared by mixing the first exosomes isolated during mesoderm induction and the second exosomes isolated during cardiomyocyte maturation.
  • the cardiomyocyte differentiation inducing agent from the group consisting of CHIR99021, PD0325901, SB431542, Tranylcypromine, Forskolin, Repsox, TTNPB and Valproic acid (VPA) It may be one or a mixture of two or more selected.
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • a method of inducing similar cardiomyocytes by inhibiting a specific signaling system using low molecular chemicals in an intermediate stage before fully acquiring pluripotency is obtained.
  • exosomes are a 50-150 nm size nano-vesicles (vesicles) secreted by cells for the exchange of information between cells contains a variety of bioactive substances.
  • Intracellular proteins, membrane proteins, lipids and nucleic acids such as RNA, miRNA, DNA, etc. are included, and because they contain various factors related to cell differentiation, growth, migration, and signaling, in particular, cell reprogramming inducing factors and the like It has unlimited potential as a carrier.
  • exosomes are cell-derived materials with excellent biocompatibility, and because they are composed of lipid bilayers such as cells, they can safely and efficiently deliver various active substances (drugs, genes, proteins).
  • stem cell-derived exosomes and cardiomyocyte-derived chemicals to expand and apply stem cell-derived exosomes to differentiation and regeneration through various proteins and miRNAs.
  • Somatic cells can be directly differentiated into cardiomyocytes without going through the intermediate step of the stem cells, and at the same time, it is confirmed that the biosafety is excellent unlike the viral vector, and the exosome-based cardiomyocyte cross-differentiation induction method of the present invention was completed (FIG. 1). .
  • Glutamax, N2, B-27, NEAA, ⁇ -mercaptoethanol, ascorbic acid, Knockout DMEM, Knockout serum replacement and ES-FBS used in the present invention were purchased from Thermofisher and CHIR99021, Repsox, Forskolin, VPA, PD0325901 and SB431542 from Sigmaaldrich. Parnate and TTNPB were purchased from Tocris. E14Tg2a cells were also purchased from ATCC and MEF from Lonza.
  • CDM Cardiomyocyte Induction Culture
  • Cardiac differentiation medium of the present invention is based on DMEM medium Fetal bovine serum (Fetal bovine serum) 15%, ascorbic acid 50 ⁇ g / ml, insulin (insulin) 1 ⁇ g / ml, leukemia inhibitory factor Leukemia inhibitory factor was set to a concentration of 1,000 units / ml and additionally 3 ⁇ M of CHIR99021 and 1 ⁇ M of PD0325901 were added to the medium.
  • the present inventors extracted the exosomes from the process of differentiation into cardiomyocytes using mouse embryonic stem cells (E14tg2a). Specifically, all of the cultured mouse embryonic stem cell medium was transferred to a tube, and then, ultracentrifuge, centrifuged for 10 minutes at 300 Xg (gravity acceleration), and the cells were separated and 2,000 Xg, Dead cells were isolated under conditions of 10 minutes. Thereafter, cell debris and impurities were separated under conditions of 10,000 Xg and 30 minutes, and the medium in which the cells, dead cells and cell debris were separated was centrifuged under conditions of 150,000 Xg and 70 minutes.
  • mouse embryonic stem cells E14tg2a
  • exosomes were extracted from the cultured mouse stem cells by centrifugation at 150,000 Xg and 70 minutes (FIG. 2).
  • the exosomes extracted during mesoderm induction were named the first exosome and the extracted exosomes during the cardiac specification and maturation process as the second exosome.
  • the two types of exosomes were mixed at 5: 5 and used for experiments.
  • the present inventors induced the differentiation into cardiomyocytes by adding the extracted exosomes and cardiomyocyte differentiation inducing agent to mouse embryo fibroblasts.
  • mouse embryonic fibroblasts were seeded in a Matrigel-coated 6-well dish at a density of 50,000 cells / well, cultured for 24 hours, and cardiomyocytes containing exosomes (50 ⁇ g / ml). The cells were incubated for two weeks in cardiac reprogramming media (CRM). Thereafter, the cells were further cultured for one week in cardiac differentiation media (CDM) containing exosomes (50 ⁇ g / ml) (FIG. 4).
  • CCM cardiac reprogramming media
  • the cardiomyocyte differentiation inducer added to the cardiomyocyte induction culture was used as a mixture of CHIR99021 and PD0325901, but in addition to SB431542, Parnate (Tranylcypromine), Forskolin, Repsox, TTNPB, and Valproic Acid (VPA) can be used. ).
  • mouse embryonic fibroblasts were cultured in DMEM with 37 ° C., 10% FBS, and 1% antibiotics (antibiotics).
  • the cultured cells were inoculated into 6-well plates at a density of 5 ⁇ 10 4 cells / well and cultured for 24 hours, and then the culture medium was exchanged with cell reprogramming culture (CRM), and the cells were kept at intervals of 5 days for 15 days.
  • CCM cell reprogramming culture
  • mouse embryo fibroblasts before cell reprogramming culture (CRM) replacement showed a proliferative form in the planar state, but after time of medium replacement, the cells formed clusters in the form of clusters.
  • multinuclear cells with 2-3 nuclei were observed in the media-replaced mouse fibroblast group, the cell proliferation rate was markedly decreased, and cells showing spontaneous beating were also observed (FIG. 5).
  • Such morphological changes suggest that the cell type has been switched.
  • mice embryo fibroblasts were seeded in 6-well plates at a density of 5 ⁇ 10 4 cells / well, and then cultured for 24 hours. Thereafter, the culture medium was incubated for 2 weeks after exchange with the cell reprogramming culture (CRM), followed by further culture for 1 week by replacing with cardiomyocyte induced culture (CDM), and for immunostaining, the culture procedure Cells obtained through were treated with trypsin, transferred to a 35 mm glass bottom dish and attached.
  • CCM cell reprogramming culture
  • CDM cardiomyocyte induced culture
  • Induced cardiomyocytes were washed twice with Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), treated with 0.25% Trypsin / EDTA (Thermo Scientific) and incubated at 37 ° C. for 2 minutes. The cells were gently resuspended three times with a P1000 pipette, incubated for 2 minutes at 37 ° C, gently mixed twice with the same amount of 10% FBS-PBS at 4 ° C and centrifuged at 125 xg for 3 minutes to obtain pellets.
  • DPBS Dulbecco's phosphate-buffered saline
  • Trypsin / EDTA Trypsin / EDTA
  • Induced cardiomyocytes were plated in glass bottom dishes (Nunc) coated with 0.1% A-type gelatin (Sigma-Aldrich) and grown for another 2 days. Cells were then fixed with 4% paraformaldehyde (Sigma-Aldrigh) for 15 minutes at room temperature and permeabilized with 0.1% Triton X-100 (Sigma Aldrich) for 10 minutes at room temperature.
  • iCM induced cardiomyocytes
  • mouse cardiomyocyte specific genes using cells derived from cardiac myocytes from mouse embryo fibroblasts. Specifically, mouse embryo fibroblasts were seeded in 6-well plates at a density of 5 ⁇ 10 4 cells / well, incubated for 24 hours, and cultured for 2 weeks in cell reprogramming culture (CRM), followed by cardiomyocyte induction culture ( CDM) was further incubated for 1 week. Then, for real-time PCR, cells obtained through the above process were treated with trypsin, and cDNA was synthesized from RNA through PrimeScript RTreagent kit according to the manufacturer's instructions.
  • CCM cell reprogramming culture
  • CDM cardiomyocyte induction culture
  • the primer concentrations were then normalized and the gene specific forward and reverse primer pairs were mixed at 5 pmol / ⁇ l concentrations, respectively, and 25 ⁇ l SYBR Green Mix (2x), 0.5 ⁇ l cDNA, 2 ⁇ l primer pair mix (5 pmol / ⁇ l).
  • Amplification of the mixture comprising 22.5 ⁇ l H 2 O, 1 cycle for 2 minutes at 50 ° C., 1 cycle for 10 minutes at 95 ° C., followed by 15 seconds at 95 ° C., 30 seconds at 60 ° C., and 72 ° C. 40 cycles were performed for 30 seconds.
  • the amplification was completed by performing one cycle for 10 minutes at 72 °C.
  • Table 1 The nucleic acid sequence of the primers used in the real-time PCR is summarized in Table 1 below.
  • H mouse cardiomyocytes
  • MEF mouse embryo fibroblasts
  • iCM chemically treated groups
  • RNA quantseq 3 ′ mRNA nucleic acid sequencing was performed for gene expression analysis of cells, and miRNA sequencing was performed for exosome analysis. Heartbeat colonies were picked out on designated days and total RNA was isolated using Trizol reagent (Thermo Scientific Inc). RNA quality was verified by Agilent 2100 bioanalyzer using RNA 6000 Nano Chip for Quanseq 3 ′ mRNA sequencing and RNA 6000 Pico Chip for exosome miRNA sequencing (both purchased from Agilent Technologies). RNA quantification was performed using a NanoDrop 2000 spectrophotometer system (Thermo Scientific).
  • QuantSeq 3 'mRNA-Seq Library Preparation Kit (Lexogen, Inc., Austria) was used for gene expression analysis and exosome miRNA sequencing was performed using the NEBNext Multiplex Small RNA Library Preparation Kit (New England BioLabs) for library construction. Performed according to the instructions. Yield and size distribution of small RNA libraries was verified with Agilent 2100 Bioanalyzer instrument for high sensitivity DNA analysis (Agilent Technologies) and high-throughput sequencing was performed using SingleSend 75 sequencing (Illumina). The sequences read with the Bowtie2 software tool were mapped to obtain a Bam file (sort file).
  • gene ontology (GO) term enrichment analysis showed that upregulated genes are involved in cardiac contraction, myofibrillar node organization, and cardiac development.
  • miRNA expression levels were calculated using the number of reads, and miRNAs with higher expression levels were examined in the embryoosomes and mexosomes than MEF and ESC-derived exosomes.
  • the intracellular pipette solution containing 25 mM KCl, 5 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0.1 mM EGTA, 1 mM MgCl 2 , 3 mM Mg-ATP was adjusted to pH 7.2 using KOH. After the experiment liquid junction potential compensation (10 mV) was applied.
  • Micro glass patch pipettes (World Precision Instruments) were prepared by pulling by PP-830 puller (Narishige, Japan).
  • An Axopatch 200B amplifier, Digdata 1550B AD-DA converter, and pClamp software 11 were used to record and analyze the action potentials.
  • fibroblasts can be directly reprogrammed into cardiomyocytes via exosomes and cardiomyocyte derived chemical agents derived from living organisms without transfection through non-viral vectors or viral infections.
  • the exosome-based cardiomyocyte cross-differentiation induction method of the present invention introduces a combination of biocompatible non-viral exosomes and cardiomyocyte-derived explosives into somatic cells to directly direct cardiomyocytes from somatic cells without intervening stem cells. Since it can be induced, it can be used as a new concept in vivo cell therapy platform technology for heart disease because it does not use a viral vector, thereby ensuring the safety of the body without fear of genetic variation due to viral infection.
  • Direct cross-differentiation method of fibroblasts into cardiomyocytes can be used very effectively in the production of cell therapy for the treatment of heart disease, which was difficult to develop therapeutics.
  • SEQ ID Nos. 1 to 30 show nucleic acid sequences of gene-specific primers used to identify gene expression patterns of induced cardiomyocytes prepared by the direct cross-differentiation method of fibroblasts into cardiomyocytes according to one embodiment of the present invention. Indicates.

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Abstract

본 발명은 엑소좀 기반의 심근세포 교차분화 유도방법에 관한 것으로 더 상세하게는 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 과정 중 배양액에서 엑소좀을 분리하는 단계; 분리된 상기 엑소좀을 포함하는 심근세포 리프로그래밍 배양액에서 섬유아세포를 배양하는 단계; 및 상기 심근세포 리프로그래밍 배양에서 배양된 섬유아세포를 상기 엑소좀을 포함하는 심근세포 유도 배양액에서 배양하는 단계를 포함하는, 섬유아세포의 심근세포로의 교차분화 방법을 제공한다.

Description

엑소좀 기반의 심근세포 교차분화 유도방법
본 출원은 2018년 6월 28일자로 출원된 한국 특허출원 제2018-0074648호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 특허출원은 전체적으로 본 문서에 참조로 삽입된다.
본 발명은 심근세포 교차분화 유도방법에 관한 것으로 더 상세하게는 엑소좀 기반의 심근세포 교차분화 유도방법에 관한 것이다.
생체에서 심근세포(cardiomyocytes)는 세포 분열능을 상실하므로, 허혈이나 심근염 등의 각종 스트레스에 노출되어 일단 괴사 또는 소실되면, 보충되지 않는다. 그 결과, 잔존하는 심근세포가 대상성 비대를 통해 기능을 유지하려고 하지만, 이러한 상태가 지속되어 심근 조직의 허용 범위를 넘어서게 되면, 심근세포는 더욱 더 피폐 또는 사멸되어, 최종적으로는 심근 기능의 저하, 즉 심부전이 발생하게 된다. 이러한 심부전(heart failure)을 비롯한 심장 질환은 전 세계적인 주요 사망원인 중 하나로서, 심근세포의 유실이나 기능장애에 의해 발생한다. 심장 질환 환자는 예후가 매우 나빠, 5년 생존율이 약 50%에 불과하며, 심근세포의 재생 능력이 매우 제한적이기 때문에 완치에는 많은 어려움이 있는 실정이다. 종래 심부전 치료제는 심근의 수축력을 높이는 디기탈리스 제제나 크산틴 제제 등의 강심제가 사용되어 왔지만, 이들 약제는 장기간 투여 시 오히려 병태를 악화시키는 경우도 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근에는 β-차단제나 ACE 저해제 등, 교감신경계 또는 레닌-안지오텐신 시스템의 항진에 의해, 과잉의 심장 부위를 경감시키는 약제를 이용한 치료가 이용되고 있으나, 이들은 대중적 치료법에 불과할 뿐, 상해를 입은 심장 조직 자체를 회복시키는 것은 아니다. 한편, 심장 이식은 중증 심부전에 대한 근본적인 치료법이지만, 장기 기증자의 부족, 의료 윤리, 환자의 육체적 또는 경제적 부담감 등의 문제로 인해, 일반적인 치료법으로서의 이용에는 한계가 있다.
한편, 엑소좀은 세포 간 정보교환을 위해서 세포가 분비하는 나노 소포체(vesicles)로서 다양한 생리활성물질을 함유하고 있다. 특히, 줄기세포 유래 엑소좀은 각종 단백질 및 miRNA를 통한 분화 및 재생 능력을 갖고 있어 각종 세포 및 조직의 재생과 치료에 확대 적용이 가능한 것으로 알려졌다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제2013-0008560호는 마이크로 RNA를 이용한 심근 세포의 증식 방법에 대해 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술의 경우, 대부분 바이러스 벡터를 이용하여 유전자를 도입하기 때문에 유전적 변이의 발생 가능성이 존재하여 안전성이 확보되지 못한다는 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 생체친화적인 비바이러스성 엑소좀 및 심근세포 유도 화약약물 조합을 통한 안전성이 확보된 직접적 리프로그래밍 방법인 줄기세포 유래 엑소좀 기반의 심근세포 교차분화 유도방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 과정 중 배양액에서 엑소좀을 분리하는 엑소좀 분리단계; 상기 엑소좀 분리단계에서 분리된 엑소좀이 첨가된 심근세포 리프로그래밍 배양액에서 섬유아세포를 배양하는 섬유아세포의 리프로그래밍 단계; 및 상기 섬유아세포의 리프로그램 단계에서 배양된 섬유아세포를 상기 엑소좀 분리단계에서 분리된 엑소좀이 첨가된 심근세포 유도 배양액에서 배양하는 심근세포 유도 단계를 포함하는, 섬유아세포에서 심근세포로의 교차분화 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 과정 중 배양액에서 엑소좀을 분리하는 엑소좀 분리단계; 상기 엑소좀 분리단계에서 분리된 엑소좀이 첨가된 심근세포 리프로그래밍 배양액에서 섬유아세포를 배양하는 제1배양 단계; 및 제1배양 단계에서 배양된 섬유아세포를 상기 엑소좀 분리단계에서 분리된 엑소좀 및 심근세포 분화 유도제가 첨가된 심근세포 유도 배양액에서 배양하는 제2배양 단계를 포함하는, 섬유아세포에서 심근세포로의 교차분화 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 및 심근세포 분화 유도제를 포함하는 섬유아세포의 심근세로로의 교차분화용 조성물이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 엑소좀 기반의 심근세포 교차분화 유도방법은 심근세포 유도용 화학약물 및 줄기세포 유래 엑소좀을 체세포로 도입하여, 줄기세포 중간단계(iPSC)를 거치지 않고 체세포로부터 심근세포를 직접 유도할 수 있어, 바이러스 벡터를 이용하지 않으므로 바이러스 감염에 의한 유전자 변이 등의 우려 없이 체내 안전성을 확보할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 마우스 배아 줄기세포(E14tg2a)로부터 심근세포를 유도하는 방법을 나타내는 개요도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 줄기세포 유래 엑소좀 추출 방법을 나타낸 개요도이다.
도 3은 본 발명에서 사용된 심근세포 유도 화학약물의 화학 구조를 나타내는 개요도이다.
도 4는 심근세포 유도용 화학약물 및 줄기세포 유래 엑소좀을 사용하여 심근 세포를 유도하는 방법을 나타내는 개요도이다.
도 5는 광학 현미경을 사용하여 5일 간격으로 줄기세포로부터 유래된 엑소 좀을 마우스 배아 섬유아세포에 처리한 후, 0일부터 15일까지의 세포의 형태를 나타내는 일련의 사진이다.
도 6은 심근세포로의 직접 재프로그래밍을 확인하기 위하여, 심근세포 유도용 화학약물 및 줄기세포 유래 엑소좀을 처리한 섬유아세포를 형광염료-결합 항-α-액틴 및 항-α-미오신 중쇄(α-MHC) 항체로 각각 염색하여 형광 면역세포화학분석을 수행한 결과를 나타낸 일련의 사진이다.
도 7은 심근세포의 특성인 근원섬유마디(sarcomere)의 형태를 조사하기 위하여, 섬유아세포에 심근세포 유도 약제 및 줄기세포 유래 엑소좀을 처리하여 제조한 심근세포 덩어리로부터 단일세포화 된 심근세포를 형광염료-결합 항-α-액틴 및 항-α-미오신 중쇄(α-MHC) 항체로 각각 염색하여 형광 면역세포화학분석을 수행한 결과를 나타낸 일련의 사진이다.
도 8은 심근세포-특이적 유전자의 발현을 분석하기 위하여, 줄기세포 유래 엑소좀 및 심근세포 유도 약제로 섬유아세포를 처리하여 제조된 유도 심근세포(iCM)를 다양한 심근세포 특이적 단백질에 대한 항체를 이용하여 염색하여 면역 형광염색한 결과를 나타내는 일련의 사진이다.
도 9는 마우스 배아 섬유아세포(MEF), 섬유아세포를 줄기세포 유래 엑소좀 및 심근세포 유도제로 처리하여 제조한 유도 심근세포(iCM) 및 마우스 심근세포(H)에서 마우스 심근세포-특이적 유전자인 Tnnt2, Ryr2, Nkx2.5 및 Gata4의 발현을 정량적 실시간 PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 일련의 그래프이다.
도 10은 Qunatseq 3' mRNA 서열 분석에 의해 분석된 마우스 배아 섬유아세포 (MEF), 유도 심근세포(iCM, 15 일 및 30 일) 및 심근세포(CM)에서 유전자 발현 양상을 보여주는 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. iCM에서 MEF에 비해 최대 5배 이상의 상향 조절 유전자 또는 하향 조절 유전자를 나타냈다. iCM은 nCM과 유사한 유전자 발현 프로파일을 공유한다는 것이 확인되었다.
도 11은 MEF와 비교하여 iCM에서 5배 이상의 발현 변화를 나타내는 유전자의 유전자 온톨로지(GO) 용어 농축 분석을 나타내는 일련의 그래프이다. 좌측, 상향 유전자; 우측, 하향 유전자. GO 용어는 심장 수축, 근원섬유마디 조직화 및 심장 발달로 규정되었다.
도 12는 MEF-유래 엑소좀(MEF-exosomes), 엠브리오좀(embryosomes), 멕소좀(mexosomes) 및 배아줄기세포-유래 엑소좀(mESC-exosomes)으로부터 염색질 리모델링 관련 miRNAs 및 심근세포 형성과정(cardiogenesis) 관련 miRNAs의 Heatmaps를 나타낸다. miRNA 표적 유전자는 공개 데이터베이스 검색 및 유전자 온톨로지(GO) 분석에 의해 분석되었다.
도 13은 엠브리오좀/MEF-유래 엑소좀 및 멕소좀/MEF-유래 엑소좀에서의 miRNA의 상대적인 발현수준의 비교를 나타내는 일련의 그래프이다. miRNA의 발현수준은 판독 수(read counts)를 이용하여 계산하였고, MEF 및 ESC-유도 엑소좀 보다 엠브리오좀(A) 및 멕소좀(B)에서 더 높은 발현수준을 갖는 miRNA를 조사하였다. 다분화능, 중배엽 유도, 및 체세포 리프로그램과 각각 관련되어 있는 R-290 클러스터, miR-302-367 클러스터, miR-200의 발현수준은 특히 엠브리오좀에서 높았고, 심장 발달 및 기능에 있어서 중요한 역할을 하는 miR-1은 멕소좀에서 높게 발현되었다.
도 14는 유도 후 25 일째에 iCM에서 칼슘 플럭스, 즉, 클러스터(상부) 및 단일 세포(하부)의 칼슘의 일시적인 흔적을 나타내는 일련의 그래프이다. iCM에서의 [Ca 2+] 평균 피크 진폭(피크 형광 강도 비, ΔF/F0)는 3.14±0.02(n = 6)로 신생아 또는 ESC-유래 심근세포와 유사함을 확인하였다.
용어의 정의
본 문서에서 사용되는 용어 "엑소좀(exosome)"은 많은 어쩌면 혈액, 소변, 및 세포배양의 배양배지를 포함하는 모든 생물학적 액체에 존재할지 모르는 세포-유래의 소포(vesicle)로 세포외 소포(extracellular vesicle) 또는 소수포(microvesicle)라고도 불리운다. 엑소좀이 크기는 30 및 100 nm 사이인 것으로 알려지고 있으며, 다소포체(multivesicular body)가 세포막과 융합할 때 세포로부터 분비되거나 세포막을 통해 직접 분비된다. 엑소좀은 응고, 세포간 신호전달, 및 대사폐기물의 관리와 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려지고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "엠브리오좀(embryosomes)"은 배아체(embryonic body)의 형성 단계 중배엽 유도 전단계 사이에 수득되는 엑소좀을 의미하고, "멕소좀(mexosome)"은 중배엽 유도와 심장 성숙단계 사이에 수득되는 엑소좀을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "세포교차분화기술(direct cell conversion technique)"은 고등생물에서 전혀 다른 세포타입을 갖는 성숙한(분화가 끝난) 세포간의 전환을 유도하는 과정으로 이미 분화가 끝난 세포의 운명을 다시 바꾸어 다른 종류의 체세포로 직접 분화시키는 기술이다. 이는 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)로 리프로그래밍(reprogramming)하고 이를 재분화하여 목적하는 세포로 만들어야 하는 과정과 달리, 유도만능줄기세포단계를 거치지 않고 바로 목적하는 세포로의 전환을 유도한다는 점에서 차이가 있다. 현재 직접교차분화는 질병모델링과 신약 발굴등에 이용될 가능성을 인정받고 있으며, 미래에는 유전자 치료 그리고 재생의학 등에도 응용될 수 있을 것이라 기대된다. 최근 들어 섬유아세포(fibroblast)에서 부터 뇌, 심장 세포 등 조직 재생이 불가능한 장기들 뿐 아니라혈액, 혈관, 근육, 등의 다양한 세포로 리프로그래밍이 가능하다는 연구들이 발표되고 있어, 치료제로서의 응용 가능성이 점차 높아지고 있는 현실이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유도 심근세포(iCM)"는 본 발명의 일 실시예에 따라 줄기세포-유래 엑소좀 및 심근세포 분화 유도 약제로 처리함으로써 섬유 아세포로부터 교차분화된 심근세포를 의미한다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 과정 중 배양액에서 엑소좀을 분리하는 엑소좀 분리단계; 상기 엑소좀 분리단계에서 분리된 엑소좀이 첨가된 심근세포 리프로그래밍 배양액에서 섬유아세포를 배양하는 섬유아세포의 리프로그래밍 단계; 및 상기 섬유아세포의 리프로그램 단계에서 배양된 섬유아세포를 상기 엑소좀 분리단계에서 분리된 엑소좀이 첨가된 심근세포 유도 배양액에서 배양하는 심근세포 유도 단계를 포함하는, 섬유아세포에서 심근세포로의 교차분화 방법이 제공된다.
상기 섬유아세포에서 심근세포로의 교차분화 방법에 있어서, 상기 엑소좀은 중배엽 유도(mesoderm induction) 과정에서 분리된 제1엑소좀 및 심근세포 성숙화단계(Cardiac specification and maturation)과정에서 분리된 제2엑소좀을 포함할 수 있고 상기 제1엑소좀 및 제2엑소좀의 혼합비율은 1:19 내지 19:1일 수 있다.
상기 섬유아세포에서 심근세포로의 교차분화 방법에 있어서, 상기 심근세포 리프로그래밍 배양액은 KnockOut ® Serum Replacement 2 내지 7 중량%, 배아 줄기세포 우태아 혈청(ES-FBS) 10 내지 17 중량%, N2 0.1 내지 2 중량%, B-27 1 내지 3 중량%, Glutamax 0.5 내지 2 중량%, 비필수아미노산(NEAA) 0.5 내지 2 중량%, β-mercaptoethanol 0.05 내지 0.2 mM, 및 아스코르브산 20 내지 70 μg/ml을 포함할 수 있다.
상기 섬유아세포에서 심근세포로의 교차분화 방법에 있어서, 상기 심근세포 유도 배양액은 우태아혈청(Fetal bovine serum) 12 내지 20 중량%, 아스코르브산 20 내지 70 μg/ml, 인슐린(insulin) 0.5 내지 2 μg/ml, 및 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor) 500 내지 1,500 units/ml을 포함할 수 있다.
상기 섬유아세포에서 심근세포로의 교차분화 방법에 있어서, 상기 심근세포 유도 배양액은 심근세포 분화 유도제를 추가로 포함할 수 있고 상기 심근세포 분화 유도제는 CHIR99021, PD0325901, SB431542, Parnate(Tranylcypromine), Forskolin, Repsox, TTNPB, 및 Valproic Acid(VPA)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물일 수 있으며 상기 심근세포 분화 유도제는 1 내지 50 μM의 농도로 상기 심근세포 유도 배양액에 첨가될 수 있다.
상기 CHIR99021은 GSK3β(IC 50 = 6.7 nM) 및 GSK3α(IC 50 = 10 nM)를 억제하는 WNT 활성화제로서 현재까지 보고된 활성제 중에서 가장 선택적 억제제이다. 이는 인간 배아 줄기세포(ES)와 유도만능 줄기세포(iPSC)의 심근세포 분화에도 사용되고 있다. 또한 PD0325901은 MEK의 활성화 및 하위 신호전달을 억제하는 MEK/ERK 경로의 억제제로 CHIR99021와 조합하여 마우스 배아 줄기세포(ES)의 미분화를 유지하는데 사용된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 과정 중 배양액에서 엑소좀을 분리하는 엑소좀 분리단계; 상기 엑소좀 분리단계에서 분리된 엑소좀이 첨가된 심근세포 리프로그래밍 배양액에서 섬유아세포를 배양하는 제1배양 단계; 및 제1배양 단계에서 배양된 섬유아세포를 상기 엑소좀 분리단계에서 분리된 엑소좀 및 심근세포 분화 유도제가 첨가된 심근세포 유도 배양액에서 배양하는 제2배양 단계를 포함하는, 섬유아세포에서 심근세포로의 교차분화 방법이 제공된다.
상기 섬유아세포의 심근세포로의 교차분화 방법에 있어서, 상기 엑소좀은 중배엽 유도(mesoderm induction) 과정에서 분리된 제1엑소좀 및 심근세포 성숙화단계(Cardiac specification and maturation) 과정에서 분리된 제2엑소좀이 혼합된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 줄기세포로부터 분리된 엑소좀 및 심근세포 분화 유도제를 포함하는 섬유아세포의 심근세포로의 교차분화용 조성물이 제공된다.
상기 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 중배엽 유도 과정에서 분리된 제1엑소좀 및 심근세포 성숙화 단계 과정에서 분리된 제2엑소좀을 혼합함으로써 제조 될 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 심근세포 분화 유도제는 CHIR99021, PD0325901, SB431542, 트라닐시프로민(Tranylcypromine), 포스콜린(Forskolin), 레프삭스(Repsox), TTNPB 및 발프로산(VPA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 혼합물 일 수 있다.
최근에는 유도 만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)로부터 심근세포를 획득하는 방식의 세포 기반 심장 치료에 대한 연구들이 각광받고 있지만 유도 만능줄기세포를 이용하는 경우, 양성 종양(teratoma)이 형성될 위험성 때문에 임상 적용에는 한계가 있고 체세포를 유도 만능줄기세포로 역분화시킨 후 다시 심근세포로 분화시켜야 하기 때문에 많은 시간이 소요되며, 그 전환 비율도 매우 낮다는 단점이 존재한다. 또한 유도 만능줄기세포 이외의 다른 대안으로 제시되는 세포 기반 치료에는 직접적 리프로그래밍(direct reprogramming) 방법이 있는데 심근유도 유전자를 도입하는 방식을 통하여 섬유아세포를 심근세포로 분화시키거나, 전분화능 유전자를 도입시킨 후 완전히 전분화능을 획득하기 전의 중간 단계에서 저분자 화학물질을 이용하여 특정 신호전달 체계를 저해함으로써 유사 심근세포를 유도하는 방법 등이 그 예이다.
한편, 엑소좀(exosome)은 세포 간 정보교환을 위해서 세포가 분비하는 50-150 nm 크기의 나노 소포체(vesicles)로서 다양한 생리활성물질을 함유하고 있다. 세포 내 단백질, 세포막 단백질, 지질 및 RNA, miRNA, DNA 등 핵산 등이 포함되어 있고 세포의 분화, 성장, 이동 및 신호전달에 관련된 여러 인자들을 복합적으로 포함하고 있으므로 특히 세포 리프로그래밍 유도 인자 및 이를 포함한 전달체로 활용 가능한 무한한 잠재력을 가지고 있다. 더욱이 엑소좀은 세포에서 유래한 물질로서 생체 적합성이 매우 우수하며, 세포와 같은 지질 이중층으로 구성되어 있기 때문에 다양한 활성물질(약물, 유전자, 단백질)을 안전하고 효율적으로 전달 가능하다. 그러나 다양한 기능을 지닌 여러 인자들이 혼재되어 있어 특정 방향으로 세포를 리프로그래밍하기에는 어려움이 있어 원하는 방향으로 세포의 거동 및 운명을 유도하기 위해서는 특정 기능을 특화 및 강화 시킬 수 있는 엑소좀 엔지니어링 기술이 요구되었다. 이에 본 발명자들은 줄기세포 유래 엑소좀이 각종 단백질 및 miRNA를 통한 분화 및 재생 능력을 갖고 있어 각종 세포 및 조직의 재생과 치료에 확대 적용하기 위해 줄기세포 유래 엑소좀 및 심근세포 유도용 화학약물들을 이용해 후성적 변이(Epigenetic manipulation)를 통한 안전성이 확보된 직접적 리프로그래밍 방법을 연구한 결과, 심근세포 유도에 관련이 많은 miRNA 및 단백질을 포함한 줄기세포 유래 엑소좀과 화학약물들을 세포 내로 효율적으로 전달하여, 줄기세포의 중간단계를 거치지 않고 체세포가 심근세포로 직접 분화 가능함과 동시에 바이러스 벡터와 달리 생체안전성이 우수함을 확인하고, 본 발명의 엑소좀 기반의 심근세포 교차분화 유도방법을 완성하였다(도 1).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
공시재료
본 발명에서 사용한 Glutamax, N2, B-27, NEAA, β-mercaptoethanol, 아스코르브산, Knockout DMEM, Knockout serum replacement 및 ES-FBS는 Thermofisher에서 구매하였고 CHIR99021, Repsox, Forskolin, VPA, PD0325901 및 SB431542는 Sigmaaldrich에서 구매하였으며 Parnate, TTNPB는 Tocris에서 구매하였다. 또한, E14Tg2a 세포는 ATCC에서 MEF는 Lonza에서 구매하였다.
세포 리프로그래밍 배양액(CRM)
본 발명의 세포 리프로그래밍 배양액(cardiac reprogramming media)은 Knock out DMEM 배지를 바탕으로 KnockOut ® Serum Replacement 5%, 배아 줄기세포 우태아 혈청(ES-FBS) 15%, N2 0.5%, B-27 2%, Glutamax 1%, 비필수아미노산(NEAA) 1%, β-mercaptoethanol 0.1mM, 아스코르브산 50μg/ml 농도가 되도록 제조하였다. 상기 KnockOut ® Serum Replacement의 조성을 하기 표 1에 요약하였다.
KnockOut ® Serum Replacement의 구성성분
분류 성분
아미노산 Glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-hydroxyproline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine
비타민/항산화제 Thiamine, reduced glutathione, ascorbic acid 2-PO 4
미량 원소 Ag +, Al 3+, Ba 2+, Cd 2+, Co 2+, Cr 3+, Ge 4+, Br -, I -, F -, Mn 2+, Si 4+, V 5+, Mo 6+, Ni 2+, Rb +, Sn 2+, Zr 4+
단백질 Transferrin(iron-saturated), insulin, lipid-rich albumin(AlbuMAX)
심근세포 유도 배양액(CDM)
본 발명의 심근세포 유도 배양액(cardiac differentiation medium, CDM)은 DMEM 배지를 바탕으로 우태아혈청(Fetal bovine serum) 15%, 아스코르브산 50 μg/ml, 인슐린(insulin) 1 μg/ml, 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor) 1,000 units/ml의 농도가 되도록 하였고 추가적으로 CHIR99021 3 μM 및 PD0325901 1 μM를 상기 배지에 첨가하였다.
실시예 1: 엑소좀 추출
본 발명자들은 마우스 배아줄기세포(E14tg2a)를 이용하여 심근세포로 분화되는 과정에서 나오는 엑소좀을 추출하였다. 구체적으로, 상기 배양한 마우스 배아줄기세포 배지를 모두 튜브에 옮긴 후 초원심기(ultracentrifuge)를 이용하여, 300 Xg(중력가속도)의 조건으로 10분 동안 원심분리를 수행하여 세포들을 분리하였고 2,000 Xg, 10분의 조건으로 죽은 세포(dead cell)를 분리하였다. 그 후, 10, 000 Xg, 30분의 조건으로 세포 파괴물(cell debris) 및 불순물을 분리하였고 상기 세포, 죽은 세포, 및 세포 파괴물이 분리된 배지를 150,000 Xg, 70분의 조건으로 원심분리 후 상층액을 제거하고 바닥에 뭉쳐있는 엑소좀 덩어리를 PBS로 다시 풀어주었으며 최종적으로 150,000 Xg, 70분 조건으로 원심분리하여 상기 배양한 마우스 줄기세포로 부터 엑소좀을 추출하였다(도 2). 중배엽 유도(mesoderm induction) 과정에서 추출된 엑소좀을 제1엑소좀, 심근세포 성숙화단계(Cardiac specification and maturation)과정에서의 추출된 엑소좀을 제2엑소좀이라고 명명하였다. 상기 두 종류의 엑소좀을 5:5로 혼합한 후 실험에 사용하였다.
실시예 2: 섬유아세포의 직접 교차분화
본 발명자들은 마우스 배아 섬유아세포(fibroblast)에 상기 추출한 엑소좀 및 심근세포 분화 유도제를 첨가하여 심근세포로의 분화를 유도하였다.
구체적으로, 마우스 배아 섬유아세포를 마트리젤(matrigel)이 코팅된 6-웰 접시에 50,000 cells/well의 밀도로 파종 한 후, 24시간 동안 배양하였고 엑소좀(50 ㎍/ml)을 포함하는 심근세포 리프로그래밍 배양액(cardiac reprogramming media, CRM)에서 2주 동안 배양하였다. 그 후, 마찬가지로 엑소좀(50 ㎍/ml)을 포함하는 심근세포 유도 배양액(cardiac differentiation media, CDM)에서 1주 동안 추가로 배양하였다(도 4). 상기 심근세포 유도 배양액에 첨가된 상기 심근세포 분화 유도제로는 CHIR99021 및 PD0325901의 혼합물을 사용하였으나 이외에도 SB431542, Parnate(Tranylcypromine), Forskolin, Repsox, TTNPB, 및 Valproic Acid(VPA)도 사용가능하다(도 3).
실시예 3: 세포 형태 분석
본 발명자들은 섬유아세포를 세포 리프로그래밍 배양액에서 배양 후 세포 형태를 관찰하였다. 구체적으로 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast)를 37℃, 10% FBS 및 1% 항생제(antibiotics)가 첨가된 DMEM에서 배양하였다. 상기 배양된 세포를 5×10 4 cells/well의 밀도로 6-웰 플레이트에 접종하여 24시간 배양 후, 배양 배지를 세포 리프로그래밍 배양액(CRM)으로 교환하였으며, 5일 간격으로 15일 동안 상기 세포의 형태를 광학현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 세포 리프로그래밍 배양액(CRM) 교체 전 마우스 배아 섬유아세포는 평면 상태에서의 증식형태를 나타내었으나 배지 교체 후 시간 경과에 따라 세포들끼리 뭉치는 형태로 군집(cluster)을 형성하는 것으로 나타났다. 또한, 상기 배지 교체된 마우스 섬유아세포 그룹에서 2-3개의 핵을 가진 다핵 세포가 관찰되었고, 세포 증식 속도는 현저하게 감소하였으며 자발적 박동을 보이는 세포(beating cells)도 관찰되었다(도 5). 상기와 같은 형태적 변화는 세포의 유형이 전환되었음을 시사한다.
실시예 4: 면역세포화학 분석(immunocytochemistry)
본 발명자들은 섬유아세포에서 심근 세포로의 직접 리프로그래밍을 확인하기 위해 면역세포화학 분석을 수행하였다. 구체적으로, 마우스 배아 섬유아세포를 5×10 4 cells/well의 밀도로 6-웰 플레이트에 파종한 후, 24 시간동안 배양하였다. 그 후, 배양 배지를 세포 리프로그래밍 배양액(CRM)으로 교환 후 2주 동안 배양하였고 이어서 심근세포 유도 배양액(CDM)으로 대체하여 1주간 추가 배양을 수행하였으며 면역염색(immunostaining)을 위해, 상기 배양과정을 통해 수득한 세포에 트립신으로 처리하고, 35 mm 유리 바닥 접시로 옮긴 후 부착시켰다.
그 후 실온에서 10분 동안 4% PFA로 고정하였고, 1% 혈청으로 차단 및 1차 항체(항-α-Actinin, 항-α-MHC)와 함께 배양하여 형광 표지하였다. 이어서 2차 항체와 함께 배양하였고 상기 α-Actinin 및 α-MHC(alpha-myosin heavy chain)의 발현을 공초점 현미경으로 분석하였다.
유도 심근세포(iCM)를 Dulbecco's phosphate-buffered saline(DPBS)으로 2 회 세척하고, 0.25% Trypsin/EDTA(Thermo Scientific)로 처리하고 37 ℃에서 2분간 배양하였다. 세포를 P1000 피펫으로 3회 부드럽게 재현탁하고 37 ℃에서 2분간 배양한 다음 4 ℃에서 10% FBS-PBS를 같은 양으로 두 번 부드럽게 섞고 125 xg에서 3 분 동안 원심분리하여 펠렛을 수득하였다 . 유도 심근세포(iCM)는 0.1% A-형 젤라틴(Sigma-Aldrich)로 코팅된 유리 바닥 접시(Nunc)에 도말하고 2 일 추가로 성장시켰다. 그런 다음, 세포를 실온에서 15 분간 4% 파라포름 알데히드(Sigma-Aldrigh)로 고정시키고 0.1% Triton X-100(Sigma Aldrich)로 실온에서 10 분간 투과 처리 하였다. 세포를 실온에서 1 시간 동안 5% BSA로 차단하고 항-alpha-MHC 마우스 IgG(ab50967, Abcam, 1:200), 항-cTnT 마우스 IgG(ab8295, Abcam, 1:200), 항-cTnI 토끼 IgG(ab47003, Abcam, 1:100), 항-Gata4 토끼 IgG(ab84593, Abcam, 1:200), 항-Mef2c 토끼 IgG(ab64644, Abcam, 1:200), 항-Nkx-2.5 마우스 IgG(ab91196, Abcam, 1:200), 항-Connexin-43 토끼 IgG(ab11370, Abcam, 1:200), 다클론성 토끼 IgG 다클론성 항-MLC2v 토끼 IgG(ab79935, Abcam, 1:200), 단일클론 항-Ki67 마우스 IgG(ab8191, Abcam, 1:200), 단일클론 항-α-actinin 토끼 IgG(7H1L69, Thermo Fisher Scientific, 1:100), 단일클론 항-MLC2a 마우스 IgG(#311011, Synaptic systems, 1:300), 다클론성 항-Isl1 토끼 IgG(LS-C334676, LifeSpan BioSciences, 1:100), 단일클론 항-SMA 마우스 IgG(A2547, Sigma Aldrich, 1:400), 다클론성 항-Calponin 2 염소 IgG(sc-16607, Santa Cruz, 1:100), 다클론성 항-PECAM 염소 IgG(sc-1506, Santa Cruz, 1:100), 또는 단일클론 항-VE-cadherin 마우스 IgG(sc-9989, Santa Cruz, 1:100)와 1% BSA를 포함하는 DPBS에서 밤새 4 ℃에서 반응을 시켰다. 이어 세포를 1% BSA를 포함하는 DPBST로 15 분간 두 번 세척하고, 암실에서 1 시간 동안 1% BSA를 포함하는 DPBS에서 2차 항체(1:2000 Alexa Fluor 488 염소 항-마우스 IgG(H&L), 1:2000 Alexa Fluor 488 당나귀 항-토끼 IgG(H&L), 1:2000 Alexa Fluor 647 염소 항-마우스 IgG(H&L), 1:2000 Alexa Fluor 647 당나귀 항-토끼 IgG(H&L), 1:2000 Alexa Fluor 488 당나귀 항-염소 IgG(H&L), or 1:2000 Alexa Fluor 647 당나귀 항-염소 IgG(H&L) (모두 Life Technologies로부터 구매함))와 반응시켰다. 세포를 상기와 같이 다시 세척하고, 핵을 DAPI(4,6-디아미노-2-페닐인돌, Sigma Aldrich)로 염색하고, TCS SP5 공초점 현미경(Leica Microsystems)으로 촬영하였다.
그 결과, 유도 심근세포(iCM)에서 심근 특이적 마커인 α-Actinin, 및 α-MHC의 발현을 관찰하였다(도 6). 또한, 마우스 배아 섬유아세포의 일부는 심근에서 일반적으로 나타나는 근원섬유마디(sarcomere) 구조가 관찰되었다(도 7).
또한, 면역형광염색 결과 후기 심장세포 표지자 및 심장 발달을 위한 중요한 전사인자인 Gata4, Mef2C 및 NkX2.5가 iCM에서 높게 발현되고, 세포간 통신을 위한갭 접합부의 구성요소 중 하나인 connexin43(cx43) 역시 발현되었다(도 8).
실시예 5: 실시간 중합효소 연쇄 반응 분석(real-time PCR)
본 발명자들은 마우스 배아 섬유아세포에서 심근세포로 유도한 세포를 이용하여 마우스 심근세포 특이적인 유전자의 발현을 관찰하였다. 구체적으로, 마우스 배아 섬유아세포를 5×10 4 cells/well의 밀도로 6-웰 플레이트에 파종한 후, 24시간동안 배양하였고 세포 리프로그래밍 배양액(CRM)에서 2주간 배양한 후 심근세포 유도 배양액(CDM)에서 1주간 추가 배양하였다. 이후, 실시간 중합효소 연쇄 반응 분석(real-time PCR)을 위해, 상기 과정을 통해 수득한 세포를 트립신으로 처리하였고, 제조사의 지침에 따라 PrimeScript RTreagent kit을 통해 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 그 후, 프라이머 농도를 노멀라이즈하고 유전자 특이적 순방향 및 역방향 프라이머 쌍을 각각 5 pmol/㎕ 농도로 혼합하였고 25 ㎕ SYBR Green Mix (2x), 0.5 ㎕ cDNA, 2 ㎕ primer pair mix (5 pmol/㎕ 각 프라이머), 22.5 ㎕ H 2O를 포함하는 혼합물의 증폭은 50℃에서 2분 동안 1사이클, 95℃ 10분 동안 1사이클로 수행하였고 이어서 95℃에서 15초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안 40사이클로 수행하였다. 추가적으로 72℃에서 10분 동안 1사이클로 수행하여 증폭을 완료하였다.상기 real-time PCR에 사용된 프라이머의 핵산서열을 하기 표 1에 요약하였다.
실시간 PCR에 사용된 프라이머 정보
표적 유전자 프라이머 핵산서열 (5'->3') 서열번호
Acta2 F GTCCCAGACATCAGGGAGTAA 1
Acta2 R TCGGATACTTCAGCGTCAGGA 2
CD31 F CCGAAGCAGCACTCTTGCAG 3
CD31 R CTGCAACTATTAAGGTGGCGATGA 4
CNN2 F TTCGAGAGCGGGAACATGAC 5
CNN2 R CAATGAAAACCCCAAAGCCCA 6
Flk1 F TTTGGCAAATACAACCCTTCAGA 7
Flk1 R GCAGAAGATACTGTCACCACC 8
Gata4 F CCTGGAAGACACCCCAATCTC 9
Gata4 R AGGTAGTGTCCCGTCCCATCT 10
Isl1 F AGATCAGCCTGCCTGCTTTTCAGC 11
Isl1 R AGGACTGGCTACCATGCTGT 12
Mesp1 F GTCACTCGGTCCTGGTTTAAG 13
Mesp1 R ACGATGGGTCCCACGATTCT 14
Myh11 F CATCCTGACCCCACGTATCAA 15
Myh11 R ATCGGAAAAGGCGCTCATAGG 16
Nanog F TCTTCCTGGTCCCCACAGTTT 17
Nanog R GCAAGAATAGTTCTCGGGATGAA 18
Nkx2.5 F GGTCTCAATGCCTATGGCTAC 19
Nkx2.5 R GCCAAAGTTCACGAAGTTGCT 20
Rex1 F CCCTCGACAGACTGACCCTAA 21
Rex1 R TCGGGGCTAATCTCACTTTCAT 22
Ryr2 F ACATCATGTTTTACCGCCTGAG 23
Ryr2 R TTTGTGGTTATTGAACTCTGGCT 24
Tie2 F TGCCCAGATATTGGTGTCCTTAAAC 25
Tie2 R TCCGCAGGGCAGTCAATTC 26
Tnnt2 F GCGGAAGAGTGGGAAGAGACA 27
Tnnt2 R CCACAGCTCCTTGGCCTTCT 28
VE-cadherin F TGGCTTGTCGAATTTGAAGCA 29
VE-cadherin R TCTGGTGAGTGGGTTAGAGGCTATC 30
상기 증폭을 통해 마우스 심근세포(H), 마우스 배아 섬유아세포(MEF), 엑소좀 및 화학약물을 처리한 그룹(iCM) 간의 상기 표 2에 기재된 표적유전자들의 발현정도를 비교하였다.
그 결과, 도 9에서 나타난 바와 같이, iCM에서 재조군인 MEF와 비교하여 심근세포 특이적 유전자인 Tnnt2, Ryr2, Nkx2.5 및 Gata4의 발현양이 증가함이 확인되었다.
실시예 6: iCM 및 엑소좀의 차세대 시퀀싱
Quantseq 3' mRNA 핵산서열 분석은 세포의 유전자 발현 분석을 위해, miRNA 시퀀싱은 엑소좀 분석을 위해 수행되었다. 박동 콜로니를 지정된 날에 골라 내고 Trizol 시약(Thermo Scientific Inc)을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. RNA 품질은 Quanseq 3' mRNA 시퀀싱을 위해서는 RNA 6000 Nano Chip를 이용하여, 엑소좀 miRNA 시퀀싱을 위해서는 RNA 6000 Pico Chip을 이용하는 Agilent 2100 bioanalyzer에 의해 검증하였다(둘 모두 Agilent Technologies사로부터 구매). NanoDrop 2000 분광 광도계 시스템(Thermo Scientific)을 사용하여 RNA 정량을 수행하였다. 라이브러리 구축을 위해 QuantSeq 3' mRNA-Seq 라이브러리 제조 키트(Lexogen, Inc., Austria)를 유전자 발현 분석에 사용하였고 NEBNext Multiplex Small RNA 라이브러리 제조 키트(New England BioLabs)를 사용하여 엑소좀 miRNA 시퀀싱을 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 작은 RNA 라이브러리의 수율 및 크기 분포는 고감도 DNA 분석 (Agilent Technologies)을 위한 Agilent 2100 Bioanalyzer 장비로 검증하였으며 고성능(high-throughput) 시퀀싱은 SingleSend 75 시퀀싱(Illumina )를 이용하여 수행하였다. Bam 파일(정렬 파일)을 얻기 위해 Bowtie2 소프트웨어 도구로 판독된 서열을 매핑하였다. 판독 횟수는 차별적으로 발현된 유전자 상으로 매핑이 되었고, 성숙한 miRNA 서열은 Bedtools(v2.25.0) 및 및 R(버전 3.2.2) 통계 프로그래밍 언어(R development Core Team, 2016)를 사용하는 Bioconductor를 사용하여 정렬 파일로부터 추출되었다. 판독 횟수는 miRNA의 발현수준을 결정하기 위해 사용되었다. Quantile 표준화 방법은 샘플 간의 비교를 위해 사용되었다. 유전자 분류는 DAVID(//david.abcc.ncifcrf.gov/)와 Medline 데이터베이스 (//www.ncbi.nlm.nih.gov/)가 수행한 검색을 기반으로 수행하였다. miRNA 표적 연구를 위해 miRWalk 2.0이 수행되었다. 계층적 클러스터 분석은 유클리드 거리 상관관계(Euclidean distance correlation)를 이용하여 평균 연관성을 갖는 거리 측정으로 수행되었다. 클러스터 및 히트 맵은 MeV 4.9.0을 통해 시각화되었다.
도 10에 도시된 바와 같이, MEF, iCM(15 일, 30 일) 및 심근세포의 전체적인 유전자 발현을 Quantseq 3' mRNA 시퀀싱으로 분석하였다. MEF와 비교하여 iCM에서 높게 발현되고 덜 발현된 유전자의 패턴은 심근세포 그룹과 매우 유사한 것으로 나타났다.
또한, 도 11에 도시된 바와 같이, 유전자 온톨로지(GO) 용어 농축 분석은 상향 조절된 유전자가 심장 수축, 근원섬유마디 조직화 및 심장 발달에 관여한다는 것을 보여 주었다.
또한, 도 12에 도시된 바와 같이, 공개 데이터베이스 검색을 통한 miRNA 표적 유전자 분석, 유전자 온톨로지(GO) 분석을 통해 엠브리오좀(embryosome) 및 멕소좀(mexosome)의 많은 miRNA가 염색질 리모델링과 심장 발달과 관련이 있음을 확인할 수 있었다.
아울러, 도 13에 도시된 바와 같이, miRNA 발현수준은 판독 횟수를 사용하여 계산하였으며, MEF 및 ESC-유래 엑소좀보다 엠브리오좀 및 멕소좀에서 더 높은 발현 수준을 갖는 miRNA가 조사되었다. 다분화능, 중배엽 유도 및 체세포 재프로그래밍과 각각 관련된 miR-290 클러스터, miR-302-367 클러스터 및 miR-200의 발현수준은 엠브리오좀에서 높았고, 심장 발달에 큰 영향을 미치는 miR-1의 발현 수준은 멕소좀(mexosome)에서 높았다.
실시예 8: 세포 내 칼슘 이온 농도 측정
칼슘 과도상태(calcium transient)를 기록하기 위해, 유도 심근세포(iCMs)에 2 μM Fluo-3 AM Ca 2+ 표지자(Thermo Scientific)를 제조사의 지침에 따라, 상기 염료의 탈-에스터화를 위해 37℃에서 20분간 적재하였다. 배지를 교체함으로써 배지 내의 잔존 염료를 제거한 후, BX51 Fluorescence Microscope(Olympus)와 저속도(time-lapse) 기록 시스템(Xcellence)을 사용하여 자발적인 Ca 2+ 과도상태를 37 ℃에서 기록하였다. 심근세포 클러스터에 대하여, 전체 클러스터 및 무세포 경계의 형광에서의 형광을 기록하기 위해 세포-프레이밍 아댑터를 조정하였고 세포를 제거한 후 정규화를 위한 말단 장의 시야로부터 배경 형광을 기록하였다.
도 13에 도시 된 바와 같이, 이러한 과도상태에서 피크 형광 강도 비(F/ F0)는 신생아 또는 배아 줄기세포 유래의 심근세포를 사용한 이전 측정과 유사하게 3.14 ± 0.02(n = 6)으로 측정되었다.
실시예 9 : 전기 생리학적 분석
통상적인 전-세포 패치 클램프가 수행되었다. 자발적으로 박동하는 유도 심근세포(iCM)를 활동전위(AP)를 기록하도록 선택하였다. iCM에 NaOH로 pH 7.4로 조정된 145 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1.8 mM CaCl 2, 10 mM HEPES 및 5 mM 포도당을 포함하는 정상 Tyrode 용액이 생리학적 온도인 35-37 ℃에서 관류되었으며, 있다. 25 mM KCl, 5 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0.1 mM EGTA, 1 mM MgCl 2, 3 mM Mg-ATP을 포함하는 세포 내 피펫 용액은 KOH를 이용하여 pH 7.2로 조정하였다. 실험 후 액체 접합 전위 보상(10 mV)을 가했다. 마이크로 유리 패치 피펫(World Precision Instruments)은 PP-830 풀러(Narishige, Japan)에 의해 잡아 당김으로써 제조하였다. Axopatch 200B 증폭기, Digdata 1550B AD-DA 변환기 및 pClamp 소프트웨어 11(Axon Instrument)가 활동전위 기록 및 분석에 사용되었다.
측정된 전기생리학적 지표
세포 유형 APA (mV) dv/dtMax (V/s) 주파수 (Hz) MDP (mV) APD90 (ms)
V-유사 (n = 10) 87.3±5.9 48.8±9.5 1.6±0.3 -73.9±2.7 59.6±21.0
A-유사 (n = 4) 81.1±5.3 40.6±15.8 2.6±0.9 -69.8±4.1 49.3±10.2
상기 표 3에서 볼 수 있듯이, 패치 클램프 기법을 이용하여 활동전위(AP)를 분석한 결과, 다수의 iCM은 평균 이완 전위(MDP)가 -73.9 mV인 심실형 AP 형태를 보였다.
종합적으로, 비-바이러스 성 벡터 또는 바이러스 감염을 통한 형질감염 없이 생체로부터 유래된 엑소좀 및 심근세포 유도 화학 제제를 통해 섬유아세포를 심근 세포로 직접 재프로그램 할 수 있음이 확인되었다.
결론적으로 본 발명의 엑소좀 기반의 심근세포 교차분화 유도방법은 생체친화적인 비바이러스성 엑소좀 및 심근세포 유도 화약약물 조합을 체세포로 도입하여, 줄기세포 중간단계를 거치지 않고 체세포로부터 심근세포를 직접 유도할 수 있어, 바이러스 벡터를 이용하지 않으므로 바이러스 감염에 의한 유전자 변이 등의 우려 없이 체내 안전성을 확보할 수 있으므로 심장 질환에 신개념의 생체 내 세포치료 플랫폼 기술로 활용될 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 섬유아세포의 심근세포로의 직접 교차분화 방법은 치료제 개발이 어려웠던 심장질환의 치료를 위한 세포치료제의 생산에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.
서열번호 1 내지 30은 본 발명의 일 실시예에 따른 섬유아세포의 심근세포로의 직접 교차분화 방법에 의해 제조된 유도 심근세포의 유전자 발현 양상을 확인하기 위해 사용된 유전자 특이적 프라이머의 핵산서열을 나타낸다.

Claims (13)

  1. 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 과정 중 배양액에서 엑소좀을 분리하는 엑소좀 분리단계;
    상기 엑소좀 분리단계에서 분리된 엑소좀이 첨가된 심근세포 리프로그래밍 배양액에서 섬유아세포를 배양하는 섬유아세포의 리프로그래밍 단계; 및
    상기 섬유아세포의 리프로그램 단계에서 배양된 섬유아세포를 상기 엑소좀 분리단계에서 분리된 엑소좀이 첨가된 심근세포 유도 배양액에서 배양하는 심근세포 유도 단계를 포함하는, 섬유아세포에서 심근세포로의 교차분화 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀은 중배엽 유도(mesoderm induction) 과정에서 분리된 제1엑소좀 및 심근세포 성숙화단계(Cardiac specification and maturation) 과정에서 분리된 제2엑소좀을 포함하는, 방법.
  3. 제3항에 있어서,
    상기 제1엑소좀 및 제2엑소좀의 혼합비율은 1:19 내지 19:1인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 심근세포 리프로그래밍 배양액은 KnockOut ® Serum Replacement 2 내지 7 중량%, 배아 줄기세포 우태아 혈청(ES-FBS) 10 내지 17 중량%, N2 0.1 내지 2 중량%, B-27 1 내지 3 중량%, Glutamax 0.5 내지 2 중량%, 비필수아미노산(NEAA) 0.5 내지 2 중량%, β-mercaptoethanol 0.05 내지 0.2 mM, 및 아스코르브산 20 내지 70 μg/ml을 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 심근세포 유도 배양액은 우태아혈청(Fetal bovine serum) 12 내지 20 중량%, 아스코르브산 20 내지 70 μg/ml, 인슐린(insulin) 0.5 내지 2 μg/ml, 및 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor) 500 내지 1500 units/ml을 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 심근세포 유도 배양액은 심근세포 분화 유도제를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 심근세포 분화 유도제는 CHIR99021, PD0325901, SB431542, Parnate(Tranylcypromine), Forskolin, Repsox, TTNPB, 및 Valproic Acid(VPA)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 혼합물인, 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 심근세포 분화 유도제는 1 내지 50 μM의 농도로 상기 심근세포 유도 배양액에 첨가되는, 방법.
  9. 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 과정 중 배양액에서 엑소좀을 분리하는 엑소좀 분리단계;
    상기 엑소좀 분리단계에서 분리된 엑소좀이 첨가된 심근세포 리프로그래밍 배양액에서 섬유아세포를 배양하는 제1배양 단계; 및
    제1배양 단계에서 배양된 섬유아세포를 상기 엑소좀 분리단계에서 분리된 엑소좀 및 심근세포 분화 유도제가 첨가된 심근세포 유도 배양액에서 배양하는 제2배양 단계를 포함하는, 섬유아세포에서 심근세포로의 교차분화 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 엑소좀은 중배엽 유도(mesoderm induction) 과정에서 분리된 제1엑소좀 및 심근세포 성숙화단계(Cardiac specification and maturation) 과정에서 분리된 제2엑소좀이 혼합된 것인, 방법.
  11. 줄기 세포로부터 분리된 엑소 좀 및 심근세포 분화 유도제를 포함하는, 섬유아세포의 심근세포로의 교차분화용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 엑소좀은 중배엽 유도(mesoderm induction) 과정에서 분리된 제1엑소좀 및 심근세포 성숙화단계(Cardiac specification and maturation) 과정에서 분리된 제2엑소좀을 혼합하여 제조된 것인, 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 심근세포 분화 유도제는 CHIR99021, PD0325901, SB431542, 트라닐시프로민(tranylcypromine), 포스콜린, 레프삭스(Repsox), TTNPB 및 발프로산(VPA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 또는 2 종 이상의 혼합물 인, 조성물.
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