WO2020009320A1 - Oct4를 포함하는 골 관련 세포 직접교차분화 유도용 조성물 - Google Patents

Oct4를 포함하는 골 관련 세포 직접교차분화 유도용 조성물 Download PDF

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cells
composition
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황석연
김승현
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    • C12N2506/28—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from vascular endothelial cells
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a composition for inducing direct cross-differentiation of bone-related cells including OCT4, or a method for direct cross-differentiation using the same.
  • Induced pluripotent stem cells are artificially produced by artificially expressing and inducing specific genes from adult somatic cells which are non-pluripotent cells.
  • Induced pluripotent stem cells have been cited mainly in stem cell research because somatic cells can be used to obtain pluripotent stem cells without the need for embryos.
  • media such as viruses to modify adult somatic cell traits increases the likelihood of teratoma production, making it difficult to use in vivo tests.
  • To generate induced pluripotent stem cells reprogramming and redifferentiation steps are required. Must go through.
  • One of the aims of the present invention is to provide a means for promoting OCT4 expression in somatic cells.
  • One of the objects of the present invention is to provide a direct cross-differentiation method from somatic cells to bone-related cells.
  • One of the aims of the present invention is to provide bone related cells obtained through direct cross-differentiation and the use thereof.
  • One of the objects of the present invention is to provide a use for the prevention or treatment of bone-related diseases of OCT4 protein through direct cross-differentiation.
  • the present invention provides a means for promoting OCT4 expression in somatic cells, a method for direct cross-differentiation from somatic cells to bone-related cells, bone-related cells obtained through direct cross-differentiation and their use; And the prevention or treatment of bone related diseases of OCT4 protein through direct cross differentiation.
  • One embodiment of the invention is an OCTamer-binding transcription factor 4 (OCT4) expression promoting factor in somatic cells.
  • OCT4 OCTamer-binding transcription factor 4
  • the OCT4 expression promoting factor of the present invention means any physical, chemical, or biological means capable of elevating the expression of OCT4 protein in somatic cells.
  • the OCT4 expression promoting factor includes, but is not limited to, an OCT4 protein, a fusion or carrier thereof, a nucleic acid molecule encoding the protein, and a vector into which the nucleic acid molecule is introduced.
  • OCT4 octamer-binding transcription factor 4 protein
  • POU5F1 protein is also known as POU5F1 protein and is encoded by the POU5F1 gene.
  • OCT4 is one of the homeodomain transcription factors of the POU family.
  • OCT4 protein is known to be involved in autologous division of undifferentiated embryonic stem cells, but there is no information related to direct cross-differentiation from somatic cells to bone-related cells.
  • the genetic sequence of human OCT4 consists of SEQ ID NO: 1 (NM_002701.5), the human OCT4 protein consists of SEQ ID NO: 2 and NP_002692.2), and the gene sequence of mouse OCT4 consists of SEQ ID NO: 3 (NM_013633.3), the amino acid sequence of the mouse OCT4 protein consists of SEQ ID NO: 4 (NP_038661.2), and the OCT4 protein of the present invention has sequence homology or functional similarity with the OCT4 protein known in the art to which the present invention belongs. It may include a protein having.
  • the OCT4 protein may comprise OCT4 protein analogs in which one or more amino acids of the OCT4 protein are genetically and / or chemically modified and retain the biological activity of the parent protein.
  • OCT4 protein fusion means a complex in which a peptide or the like is chemically bonded or fused to one or more amino acids of the OCT4 protein while retaining the biological activity of the OCT4 protein.
  • the OCT4 protein fusion is an OCT4 (OCTamer-binding transcription factor 4) protein fused with a cell permeation transporter.
  • the cell permeation delivery material is a cell-penetrating peptide (CPP).
  • the cell permeable peptide is a peptide that is fused to the OCT4 protein and functions to enable the cellular passage of the OCT4 protein into the desired cell, the meaning of which is known in the art.
  • CPP may be a peptide having a specific sequence called a protein transduction domain (PTD) including a large amount of basic sequences such as arginine or lysine and having a high positively charged 8 to 16 amino acids, but is not limited thereto.
  • PTD protein transduction domain
  • CPP is 30K protein, Antp (Penetratin), HSV-1, VP22, pep-1, PTD4, TAT PTD, Hph-1, Vectocell, Lactoferrin, Sim-2, LPIN3, 2IL-1a, dNP2, nona- arginine (R9), including but not limited to.
  • the cell permeable peptide is a 30K protein.
  • 30K protein refers to a group of 30KDa protein in the silkworm body fluid, and includes the technical field to which the present invention belongs (eg, Korean Patent Application Publication Nos. 10-2011-0003889, 10-2014-0111178 or Korean Patent Registration No. 10-1626343). Is known.
  • the 30K protein may be a recombinant protein obtained from silkworm body fluids or produced from bacteria, plants or plant-derived cells, yeast, fungi, insect cells or vertebrate cells, including E. coli, by genetic recombination method, N- of OCT4 It may be attached at the terminal or C-terminus.
  • the 30K protein may include all analogs, variants, fragments, or subtypes of 30K protein having cell permeable properties in addition to the 30K protein known in the art, for example, may be 30KC19, 30KC ⁇ , PeP-C, etc. have.
  • the 30K protein is 30Kc19.
  • 30K protein has been shown as an example of the cell-penetrating peptide in the present invention, any peptide capable of cell passage of the OCT4 protein by conjugation or fusion to the OCT4 protein and into the desired cell can be used as a CPP for direct cross-differentiation of the present invention. have.
  • the fusion of the OCT4 protein is an OCT4 protein fusion to which bone tissue or bone marrow tissue specific delivery substances are bound.
  • the fusion of the OCT4 protein is an OCT4 protein fusion conjugated or fused to a cell permeable transporter, to which bone tissue or bone marrow tissue specific transporters are bound.
  • OCT4 protein carrier means a delivery material containing an OCT4 protein or a fusion thereof, which can efficiently deliver the OCT4 protein into a desired cell.
  • the OCT4 protein carrier includes, but is not limited to, nanoparticles, liposomes, micelles, or nanoemulsions comprising the OCT4 protein.
  • the nucleic acid molecule encoding the OCT4 protein is delivered intracellularly by methods known in the art, for example, naked DNA in the form of a vector, liposomes, cationic polymers and the like. It can be delivered into the cell using a combination of biological materials such as chemicals or peptides that enable or enable other cell specific targeting.
  • Liposomes are phospholipid membranes prepared by mixing cationic phospholipids, such as DOTMA or DOTAP, for gene delivery. Nucleic acid-liposomal complexes can be formed when cationic liposomes and anionic nucleic acids are mixed in a proportion.
  • vector refers to a gene delivery vehicle that is an expression vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell, and which includes essential regulatory elements operably linked to express a gene insert.
  • Vectors of the present invention include signal or leader sequences for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoters, operators, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals, enhancers, and can be prepared in various ways depending on the purpose.
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the expression vector includes a selectable marker for selecting a host cell containing the vector and, in the case of a replicable expression vector, a replication origin. Vectors can self replicate or integrate into host DNA.
  • Vectors in the present invention include plasmid vectors, cosmid vectors, viral vectors and the like.
  • the vector may be a non-viral vector, specifically, a plasmid.
  • the vector may be, but is not limited to, an plasmid vector comprising an OCT4 gene that induces direct cross-differentiation.
  • One embodiment of the present invention provides an OCT4 expression promoter (OCTamer-binding transcription factor 4) protein, a fusion or carrier thereof, a nucleic acid molecule encoding the protein, and a vector into which the nucleic acid molecule is introduced; And a method for direct cross-differentiation from somatic cells to bone-related cells, comprising the step of treating musculoskeletal growth factors with somatic cells.
  • OCT4 expression promoter OCTamer-binding transcription factor 4
  • direct reprogramming, direct conversion, transdifferentiation is a process of inducing conversion between mature (differentiated) cells having completely different cell types.
  • Direct cross-differentiation process unlike the process of reprogramming into induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) and re-differentiating them into the cells of interest, the conversion to the desired cells without going through the induced pluripotent stem cell stage It is clearly distinguished in that it is derived.
  • iPSCs induced Pluripotent Stem Cells
  • the term "somatic cell” may mean all cells except germ cells, for example, human, horse, sheep, pig, goat, camel, antelope, dog-derived or isolated from mammals Can be. In one embodiment the somatic cells may be isolated in vivo.
  • the somatic cells are fibroblasts, epithelial cells, muscle cells, nerve cells, hair cells, hair follicle cells, hair follicle cells, oral epithelial cells, somatic cells extracted from urine, gastric mucosa cells, goblet cells, G cells, B cells, May be, but is not limited to, endothelial cells, vascular endothelial cells, blood cells, astrocyte blood cells, neural stem cells, hematopoietic stem cells, adipocytes, or mesenchymal stem cells.
  • the somatic cells include, but are not limited to, one or more of the following: endothelial cells, mesenchymal stem cells, adipocytes, and fibroblasts.
  • the present inventors confirmed that bone-related cells induce direct cross-differentiation of OCT4 protein expression in human umbilical vein endothelial (HUVEC) cells, which are human vascular endothelial cells. Analyzes were performed to confirm that they had normal bone related cellular properties (Examples 1 to 3).
  • HUVEC umbilical vein endothelial
  • the bone-related cells are osteoblasts, osteogenic cells, osteoblasts (pre osteoblast), osteocytes (Osteocyte), osteochondroprogenitor cells (osteochondroprogenitor cells), Chondrocytes, osteoclasts (osteoclast), including, but not limited to.
  • the step of treating the somatic cells OCT4 protein expression promoter may further comprise the step of culturing somatic cells.
  • the step of culturing the somatic cells can be performed according to methods known in the art.
  • the medium used for somatic cell culture is any basic medium suitable for animal cell growth, EGM-2 medium, Minimal Essential Medium (MEM), Dulbecco modified Eagle Medium (DMEM), Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI), K-SFM (Keratinocyte Serum Free Medium), F12 (Ham's F-12 medium) medium, or DMEM / F12 mixed with DMEM and F12, and the like, but is not limited thereto.
  • EGM-2 medium Minimal Essential Medium (MEM), Dulbecco modified Eagle Medium (DMEM), Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI), K-SFM (Keratinocyte Serum Free Medium), F12 (Ham's F-12 medium) medium, or DMEM / F12 mixed with DMEM and F12, and the like, but is not limited thereto.
  • anabolic sources of carbon, nitrogen and micronutrients can be added, including but not limited to serum sources, growth factors
  • the method may further comprise the step of stabilizing the somatic cells in serum-free medium after the step of treating the somatic cells with the OCT4 expression promoting factor.
  • said musculoskeletal growth factor is at least one factor of IGF-1, TGF, BMP, osteogenin, Osx (Osterix), and Run-related transcription factor 2 (RUNX2).
  • said musculoskeletal growth factor is BMP, more specifically BMP4.
  • the musculoskeletal growth factor in the direct cross-differentiation method according to the present invention is a concentration of 0.1 to 500 ng / mL, specifically 0.5 to 100 ng / ml, more specifically 2 to 20 ng / may be added in mL.
  • the method may further comprise the step of culturing the somatic cells in bone differentiation medium.
  • Bone differentiation media that can be used in the present invention are known in the art.
  • One embodiment of the invention provides an OCT4 protein, a fusion or carrier thereof, a nucleic acid molecule encoding the protein, and at least one OCT4 expression promoting factor of the vector into which the nucleic acid molecule is introduced; And musculoskeletal growth factors, and composition for inducing direct cross-differentiation from somatic cells into bone-related cells.
  • the OCT4 expression promoting factor is as defined above.
  • the present invention is bone-related cells produced by performing a direct cross-differentiation method of bone-related cells produced by the direct cross-differentiation method of the present invention.
  • the bone-related cells are osteoblasts, osteogenic cells, osteoblasts (pre osteoblast), osteocytes (Osteocyte), osteochondroprogenitor cells (osteochondroprogenitor cells), It may be chondrocytes or osteoclasts, for example osteoblasts.
  • the expression level of osteoblast specific markers such as cbfa1, ALP and cal1 was confirmed to confirm the differentiation into osteoblasts according to the direct cross-differentiation method (Examples 1-4, Example 2). -6 etc.).
  • One embodiment of the present invention is a cell therapeutic agent for the prevention or treatment of bone-related diseases comprising the bone-related cells produced by the direct cross-differentiation method of the present invention as an active ingredient.
  • the "cell therapeutic agent” is a cell and tissue prepared by separating, culturing and special manipulation from human, and is a medicine used for the purpose of treatment, diagnosis and prevention, and the living autologous to restore the function of the cell or tissue, Drugs used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention are collectively referred to as a series of actions such as proliferating, selecting, or otherwise changing the biological properties of allogeneic or heterologous cells in vitro.
  • Bone-related cells prepared according to the cross-differentiation method of the present invention can be used for the treatment, diagnosis or prevention of bone-related diseases.
  • the bone-related disease is osteoporosis, osteomalacia, osteoopenia, bone atrophy, fibrous dysplasia, Paget's disease , Hypercalcemia, neoplastic destruction of bone, cancer-related bone resorption diseases, fractures, osteolysis, osteoarthritis and rheumatoid arthritis, osteoarthritis (Osteitis), one or more selected from the group consisting of Osteogenesis Imperfecta, but is not limited thereto.
  • the cell therapy agent is added at least one of diluents, excipients, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, buffers and the like commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions It can be included as.
  • One embodiment of the present invention is a method for screening a bone-related disease therapeutic substance using bone-related cells, including bone-related cells produced by the direct cross-differentiation method of the present invention.
  • it is useful for screening a therapeutic agent for bone-related diseases by a method for confirming the reactivity of bone-related cells prepared by direct cross-differentiation in the somatic cells of the present invention in the presence and absence of a candidate substance for the treatment of bone-related diseases.
  • a method for confirming the reactivity of bone-related cells prepared by direct cross-differentiation in the somatic cells of the present invention in the presence and absence of a candidate substance for the treatment of bone-related diseases. can be used.
  • a method for screening a bone-related disease therapeutic substance using bone-related cells is
  • Preparing a first bone related cell and a second bone related cell by performing a direct cross-differentiation method
  • the candidate substance is a candidate for treating bone-related disease. Determining the drug.
  • the candidate substance may include various small molecule chemical drugs, peptides, proteins, nucleic acid molecules, natural products, extracts of natural products, but is not limited thereto.
  • One embodiment of the invention is a composition for diagnosing bone-related diseases comprising bone-related cells produced by the direct cross-differentiation method of the present invention.
  • a bone-related disease diagnostic composition comprising bone-related cells prepared by a direct cross-differentiation method can be used in the diagnosis of bone-related diseases by contacting a sample collected from an individual and comparing it with a normal control group. have.
  • OCT4 protein for bone prevention or treatment through direct cross differentiation
  • One embodiment of the present invention provides a method for preventing bone-related diseases comprising OCT4 protein, a fusion or carrier thereof, a nucleic acid molecule encoding the protein, and at least one OCT4 expression promoting factor in a vector into which the nucleic acid molecule is introduced.
  • Therapeutic composition comprising OCT4 protein, a fusion or carrier thereof, a nucleic acid molecule encoding the protein, and at least one OCT4 expression promoting factor in a vector into which the nucleic acid molecule is introduced.
  • the composition for preventing or treating bone-related diseases may further include a substance capable of delivering OCT4 expression promoting factor to somatic cells.
  • the OCT4 protein fusion is an OCT4 protein fused to a cell permeable peptide.
  • Cell-permeable peptides are as defined above.
  • the cell permeable peptide is 30K protein, Antp (Penetratin), HSV-1, VP22, pep-1, PTD4, TAT PTD, Hph-1, Vectocell, Lactoferrin, Sim-2, LPIN3 , 2IL-1a, dNP2, nona-arginine (R9).
  • the 30K protein is 30Kc19.
  • the OCT4 protein fusion may be delivered into somatic cells, such as vascular endothelial cells.
  • the composition for preventing or treating bone-related diseases may further include a substance capable of delivering the OCT4 expression promoting factor to a bone site or bone marrow site.
  • said OCT4 protein fusion is an OCT4 protein in which a bone tissue specific delivery agent is fused to a conjugated or fused cell permeable peptide.
  • a bone tissue or bone marrow tissue specific delivery material means a material capable of targeting a substance to be delivered to bone tissue or bone marrow tissue after intravenous injection into an individual.
  • Bone or bone marrow tissue specific delivery materials include, for example, chemicals including bisphosphonate-based compounds, bone marrow homing peptide 1 (BMHP1), Bone or bone marrow homing peptides including PFS (PFSSTKT), and the like. It may be, but is not limited thereto, and may be bone tissue or bone marrow tissue specific delivery materials known in the art.
  • the bone tissue specific delivery material is a bisphosphonate family compound bound to the OCT4 protein fusion.
  • the bisphosphonate-based compound may be bound to, for example, the carboxy group of the OCT4 protein fusion, but is not limited thereto.
  • the bone-related disease is osteoporosis, osteomalacia, osteoopenia, bone atrophy, fibrous dysplasia, Paget's disease , Hypercalcemia, neoplastic destruction of bone, cancer-related bone resorption diseases, fractures, osteolysis, osteoarthritis and rheumatoid arthritis It is 1 or more types chosen from group.
  • the composition for preventing or treating bone related diseases according to the present invention does not increase the expression of Sox2, Klf4, C-Myc or Lin28 protein in somatic cells to be administered.
  • the composition does not include, for example, Sox2, Klf4, C-Myc or Lin28 protein or a fusion thereof, a nucleic acid encoding the protein, or a vector into which the nucleic acid has been introduced.
  • One embodiment of the invention comprises administering to a subject an effective amount of an OCT4 protein or a fusion thereof, a nucleic acid molecule encoding said protein, and at least one OCT4 expression promoting factor in a vector into which said nucleic acid molecule is introduced.
  • a method for preventing or treating a related disease comprises administering to a subject an effective amount of an OCT4 protein or a fusion thereof, a nucleic acid molecule encoding said protein, and at least one OCT4 expression promoting factor in a vector into which said nucleic acid molecule is introduced.
  • in the method of preventing or treating OCT4 expression promoting factor may be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, pulmonary administration, intrasplenically, or rectal administration.
  • said method of administration is intravenous injection or topical administration to a bone related disease site.
  • Bone-related cells prepared using a composition for inducing direct cross-differentiation from somatic cells comprising OCT4 expression promoting factors according to the present invention to bone-related cells are useful for cell therapy, screening for bone-related diseases, and for diagnosing bone-related diseases.
  • the composition may be administered to a subject to be useful for the prevention or treatment of a bone related disease.
  • FIG. 1 is a diagram showing the process of direct cross-differentiation through the expression of Oct4 gene in vascular endothelial cells.
  • Figure 2 (A) shows the results of confirming the expression of Oct4 gene introduced into vascular endothelial cells by PCR
  • Figure 2 (B) shows the result of confirming the presence or absence of OCT4 protein expressed in the cell by immunocytochemistry. .
  • FIG. 3 shows the results of confirming the expression levels of MBPRIA and BMPRII genes related to BMP4 receptor and SLUG and SNAIL genes related to endothelial-mesenchmal transition.
  • FIG. 7 is a graph of micro-CT photographs and BV / TV% for confirming bone regeneration in a cranial defect mouse model.
  • Figure 8 is a photograph confirming Masson's trichrome staining for confirming bone regeneration in a skull defect mouse model.
  • FIG. 9 shows a vector for preparing a CPP-OCT4 complex protein.
  • 10 to 12 are the results of sieve chromatography (Fast Protein Liquid Chromatography, FPLC) and SDS-PAGE confirming the concentration of the CPP-OCT4 complex protein.
  • Figure 13 is a diagram showing the results of LIVE / DEAD analysis of vascular endothelial cells.
  • vascular endothelial cell-specific genes CD31, VECAD, VEGFR-2
  • mesenchymal stem cell-specific genes VIPIN, TWIST, SLUG
  • CD31 vascular endothelial cell specific protein
  • ⁇ SMA mesenchymal endothelial cell specific protein
  • Figure 17 shows the results of fluorescence staining of cells with paloidine observed the formation of blood vessels.
  • 19 is a photograph confirming the degree of calcification of the cells by allinzarin staining.
  • FIG. 20 is a graph of micro-CT photographs and BV / TV% for confirming bone regeneration in a cranial defect mouse model.
  • 21 is a diagram for confirming the osteoporosis improvement effect according to administration of the CPP-OCT4 complex protein or BP-CPP-OCT4 complex protein.
  • Example 1-1 Osteoblast direct cross-differentiation method
  • HUVEC cells (Lonza, USA) were placed in a 100 mm cell culture dish coated with gelatin 0.1% solution for 20 minutes at 4 ⁇ 10 3 cells / cm. Inoculated at 2 density. Cultivate the cells in EGM-2 medium (Lonza, USA) containing 1% FBS and various growth factors (IGF, VEGF, FGF) until the culture dish is filled to about 90% at 37 ° C., 5% CO 2 culture conditions. It was. The cells in the culture dish were then separated using trypsin at 0.25% concentration.
  • a recombinant plasmid containing the OCT4 (Addgene # 13366) gene was introduced into a DH5alpha bacterial stock (Invitro) given a heat shock at 42 ° C. for 45 seconds.
  • the OCT4 transgenic bacteria were then inoculated in 4 mL LB medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin antibiotic (Sigma, USA) and seeded at 160 rpm in a 37 ° C. shaking incubator for 8 hours. It was.
  • plasmids were obtained from the bacteria using Midi-Prep (Qiagen, USA).
  • the recombinant plasmid was transformed by electroporation in the presence of an R buffer solution of Neon transfection system (Thermo Fisher) and vascular endothelial cells. Electroporation was performed with an electric field strength of 13.5 kV / cm and an impact time of 30 ms so that 15 ⁇ g of recombinant plasmid could be delivered to 2 ⁇ 10 6 cells. Thereafter, immunocytochemistry was performed using OCT4 antibodies (Abcam, USA) targeting OCT4 transcription factors to select transformed cells.
  • OCT4 antibodies Abcam, USA
  • the cells were incubated for 24 hours in serum-free EGM-2 medium at 37 ° C. and 5% CO 2 for stabilization of the cells. Thereafter, 10 ng / mL concentration of BMP4 (RnD systems, USA) was added to the serum-free medium and incubated for 48 hours.
  • BMP4 RnD systems, USA
  • Example 1-2 Expression of OCT4 gene in vascular endothelial cells
  • vascular endothelial cells expressing the OCT4 gene were established according to Example 1-1. RT-PCR and immunocytochemistry were performed on vascular endothelial cells subjected to electroporation.
  • vascular endothelial cells were washed with PBS and treated with Trizol (Thermo, USA) to elute the cells on ice for 20 minutes to separate RNA. Then, chloroform (chloroform, Sigma, USA) was added and shaken for 15 seconds, left at room temperature for 10 minutes, and then centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C. for 20 minutes. The transparent layer was then extracted separately in two separate layers (transparent layer and pink layer) and transferred to a new tube.
  • Trizol Thermo, USA
  • Isopropanol (isopropanol, Sigma, USA) was added and waited for 5 minutes to generate RNA precipitate at room temperature, and the resulting precipitate was separated by centrifugation at 15,000 rpm, 4 ° C. for 20 minutes. In the washing step, 75% ethanol was put into centrifuged RNA pellet, and once again centrifuged at 10,000 rpm and 4 ° C. for 20 minutes. The washed precipitate was denatured in molecular graded water (Sigma, USA) for 10 minutes at 60 °C.
  • RNA of each cell thus obtained was prepared as cDNA using a reverse-transcriptional PCR kit (Enzynomics) according to the manufacturer's protocol.
  • the prepared cDNA was subjected to quantitative real-time PCR using primers of each gene to be analyzed and SYBR green PCR Mastermix (Enzynomics). Primers used are shown in Table 1 below.
  • OCT4 0.1% triton-X100, 5% NGS, and 1% BSA / PBS were mixed at a ratio of 1: 500 and stored overnight at 4 ° C. The next day, wash three times for 10 minutes each day. The remaining first antibody was removed and the second antibody was treated at room temperature for 1.5 hours at a ratio of 1: 200 to the same lysis.
  • DAPI D9541, Sigma-aldrich
  • Example 1-3 Expression of specific genes following BMP4 treatment in transformed cells
  • Example 1-1 the expression levels of the MBPRIA and BMPRII genes associated with the BMP4 receptor and the SLUG and SNAIL genes associated with the endothelial-mesenchmal transition were determined using the RT described in Examples 1-2. Measured via PCR. Primer sequences used for RT-PCR are as follows.
  • Example 1 In order to confirm whether vascular endothelial cells were differentiated into osteoblasts according to the direct cross-differentiation method of Example 1-1, Examples and Comparative Examples (Comparative Example 1: Using vascular endothelial cells as it is, Comparative Example 2: to vascular endothelial cells Only BMP4 treatment, Comparative Example 3: Transformation of vascular endothelial cells with the gene with OCT4 only) was confirmed the expression level of the osteoblast specific markers cbfa1, ALP and cal1 genes.
  • cbfa1 core-binding factor subunit alpha-1
  • RUNX2 Rivt-related transcription factor 2
  • Alkaline phosphatase is present in almost all tissues, especially ALP, which is present in bone tissue, increases its activity when bone growth occurs actively.
  • ALP is an enzyme that plays an important role in osteoid formation and mineralization, and is well known as a marker of osteoblast activity.
  • col1 Type 1 Collagen
  • the cbfa1, ALP and cal1 genes were highly expressed in osteoblasts, and it was determined that vascular endothelial cells were differentiated into osteoblasts.
  • the expression levels of the cbfa1, ALP and cal1 genes were RT-PCR as described in Example 1-2 when the cells of Examples and Comparative Examples were cultured for 1 week or 2 weeks. Primers used are shown in Table 3 below.
  • Example 1 Using vascular endothelial cells as it is, 7 days or 14 days of culture of bone differentiation medium, Comparative Example 2: BMP4 treatment on vascular endothelial cells, Comparative Example 3: OCT4 on vascular endothelial cells Expression of cbfa1, ALP and cal1 genes of only transformation with genes was confirmed (FIG. 4).
  • Example 1 In order to confirm whether vascular endothelial cells were differentiated into osteoblasts according to the direct cross-differentiation method of Example 1-1, the Examples and Comparative Examples (Comparative Example 1) using immunochemical staining (immunocytochemistry) , Comparative Example 2: BMP4 treatment to vascular endothelial cells, Comparative Example 3: OCT4 to the vascular endothelial cells only transgenic) cells were confirmed the presence of osteocalcin (Osteocalcin) markers.
  • Comparative Example 1 Comparative Example 1 using immunochemical staining (immunocytochemistry)
  • Comparative Example 2 BMP4 treatment to vascular endothelial cells
  • Comparative Example 3 OCT4 to the vascular endothelial cells only transgenic cells were confirmed the presence of osteocalcin (Osteocalcin) markers.
  • Example and comparative cells were applied to the skull deficient mouse model to confirm that direct cross-differentiated osteoblasts regenerate bone tissue according to Example 1-1.
  • a skull defect model was made in the form of a 4 mm-sized hole surgically in a skull in an 8-week-old mouse model.
  • the experimental group used the sham-filled scaffold material without the cells in the sham and Example 1 and Comparative Example 1 (Comparative Example 1: using vascular endothelial cells as it is, Comparative Example 2: BMP4 treatment only for vascular endothelial cells , Comparative Example 3: Transformation of the vascular endothelial cells with the gene with OCT4 only. Mice were used as scaffolds containing the cells.
  • Example 2-1 Method for preparing CPP-OCT4 fusion protein complex
  • a CPP-OCT4 complex protein was prepared in which OCT4 protein was fused to cell penetrating protein (Cell Penetrating Peptide, CPP).
  • CPP Cell Penetrating Peptide
  • the cell permeable protein that binds to OCT4 was used 30kc19, which has been reported to have cell permeability.
  • the amino acid sequence of 30Kc19 used in this experiment is as follows (SEQ ID NO: 23).
  • the CPP-OCT4 fusion complex protein was purified by Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) and confirmed by staining with Coomassie Blue on SDS-PAGE gel.
  • the concentration of CPP-OCT4 complex protein was measured by comparing and contrasting the standard BSA concentrations (FIGS. 10-12).
  • Example 1-1 To differentiate vascular endothelial cells cultured according to the method described in Example 1-1 into osteoblasts, 40 ⁇ g of CPP-OCT4 complex protein and 10 ng / mL BMP4 (RnD systems, USA) were used in serum-free EGM-2 medium. ) For 24 hours. BMP4 was treated for 24 hours under the same conditions, and cultured in StemPro Osteogenesis medium (Thermo, USA), a bone differentiation medium, for 14 days to differentiate into osteoblasts.
  • StemPro Osteogenesis medium Thermo, USA
  • the obtained CPP-OCT4 complex protein was treated with vascular endothelial cells at 0, 20, 40, 60, 80 ⁇ g, and then cytotoxicity was confirmed by LIVE / DEAD analysis through staining. Green is live cells stained with Calcein components, and red is dead / dying cells stained with EtBr components (FIG. 13).
  • CPP-OCT4 complex protein is expressed in vascular endothelial cells by using a fluorescent antibody that binds to T7, which is part of the CPP-OCT4 complex protein. Treatment was performed for 24 hours to confirm cell permeation (FIG. 14).
  • vascular endothelial cell-specific genes CD31, VECAD, VEGFR-2
  • mesenchymal stem cell specificity in the cells of Examples and Comparative Examples
  • the expression level of the enemy genes was confirmed by the same RT-PCR as in Experiment 3-1 (Fig. 15).
  • vascular endothelial cell-specific protein CD31
  • ⁇ SMA mesenchymal endothelial cell-specific protein
  • vascular endothelial cell specific protein CD31
  • mesenchymal endothelial cell specific protein ⁇ SMA
  • osteoblast-specific markers Col1 collagen type-1
  • OPN osteopontin
  • Example 2-8 Confirm the regenerative effect of bone tissue
  • Example and Comparative cells were applied to a cranial defect mouse model.
  • Example 3-1 Method for preparing BP-CPP-OCT4 fusion protein complex
  • BP-CPP-OCT4 complex protein was prepared by binding bisphosphonate (BP) to CPP-OCT4 complex protein.
  • Bisphosphonate-based alendronate was used to bind to CPP.
  • BP-CPP-OCT4 complex protein was prepared by combining carboxyl group of CPP protein and amine group of alendronate using 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide).
  • EDC 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • Sulfo-NHS N-hydroxysulfosuccinimide
  • the prepared BP-CPP-OCT4 complex protein was dissolved in deuterium oxide (D2O) at a concentration of 5 mg / ml to determine whether or not bound by nuclear magnetic resonance.
  • D2O deuterium oxide
  • an animal model of osteoporosis was prepared by resecting the ovary in C3H female mice. After death, the femur was photographed with micor-CT to determine whether osteoporosis developed.
  • BP-CPP-OCT4 complex protein was administered to the osteoporosis-induced animal model.
  • Osteoporosis-induced animal model is an ovarian-resected mouse, divided into two groups of 2.5 mg of BP-CPP-OCT4 complex protein and 0.125 mg of alendronate after two weeks of ovarian ablation for 6 weeks of protein / kg / wk. After intravenous administration, it was confirmed whether osteoporosis was improved (FIG. 21).

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Abstract

본 발명은 OCT4 (OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질 또는 그의 융합체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자가 도입된 벡터 중 1종 이상의 OCT4 발현 촉진 인자 및 근골격계 성장인자를 체세포에 처리하는 단계를 포함하는, 체세포에서 골 관련 세포로의 직접교차분화 방법, 이를 통해 수득한 골 관련 세포, 이를 이용한 세포치료제, 치료물질 스크리닝 방법, 진단 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, OCT4 단백질 또는 그의 융합체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자가 도입된 벡터 중 1종 이상의 OCT4 발현 촉진 인자를 유효성분으로 포함하는 골 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물 또는 이를 이용한 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 세포투과용 전달물질이 융합된 OCT4 단백질 융합체 또는 골 조직 특이적 전달 물질이 결합된, 세포투과용 전달물질이 융합된 OCT4 단백질 융합체를 제공한다.

Description

OCT4를 포함하는 골 관련 세포 직접교차분화 유도용 조성물
본 발명은 OCT4를 포함하는 골 관련 세포 직접교차분화 유도용 조성물 또는 이를 이용한 직접교차분화 방법 등에 관한 것이다.
재생의학에서는 인간의 세포와 조직, 장기를 대체하거나 재생시켜 원래의 기능을 할 수 있도록 복원시키려는 연구가 계속되고 있다. 연구 소재로는 세포, 약물, 소재, 의료기기 등이 포함되며, 특히 면역 거부 현상을 해결하기 위한 관점에서 자가세포에 대한 연구가 집중되고 있다.
종래에는 목적으로 하는 세포를 수득하기 위하여 유도 만능 줄기세포를 이용한 연구가 주를 이루고 있다. 유도 만능 줄기세포는 비 만능 세포인 성체 체세포로부터 특정한 유전자를 인위적으로 발현 및 유도하여 인공적으로 만들어진 것이다.
체세포를 사용하기 때문에 배아의 사용을 필요로 하지 않고 만능줄기세포를 얻을 수 있으므로 유도만능줄기세포는 줄기세포 연구에 주로 인용되어 왔다. 그러나, 성체 체세포의 형질을 변형시키기 위하여 바이러스와 같은 매개체를 사용하면서 기형종(teratoma)의 생성 가능성이 높아지기 때문에 in vivo 시험에 사용하기 어렵고, 유도 만능 줄기세포를 생성하기 위해서는 리프로그래밍 및 재분화 단계를 반드시 거쳐야 한다.
이에, 점차 가속화되고 있는 고령화 사회에서 골, 연골, 골격근, 인대, 건 등과 같은 근골격계 관련 질환들에 대한 세포 치료로 유용하게 사용할 수 있는 제제에 대한 연구 및 시도가 이루어지고 있다.
본 발명의 목적 중 하나는 체세포 내 OCT4 발현을 촉진하기 위한 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적 중 하나는 체세포에서 골 관련 세포로의 직접교차분화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적 중 하나는 직접교차분화를 통해 수득한 골 관련 세포 및 그의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적 중 하나는 직접교차분화를 통한 OCT4 단백질의 골 관련 질환 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 체세포 내 OCT4 발현을 촉진하기 위한 수단, 체세포에서 골 관련 세포로의 직접교차분화 방법, 직접교차분화를 통해 수득한 골 관련 세포 및 그의 용도; 및 직접교차분화를 통한 OCT4 단백질의 골 관련 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
1. 체세포 내 OCT4 발현을 촉진하기 위한 수단
본 발명의 일 실시양태는 체세포 내 OCT4 (OCTamer-binding transcription factor 4) 발현 촉진 인자이다.
본 발명의 OCT4 발현 촉진 인자는 체세포 내에서 OCT4 단백질의 발현을 상승시킬 수 있는 모든 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단을 의미한다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, OCT4 발현 촉진 인자는 OCT4 단백질, 그의 융합체 또는 운반체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자가 도입된 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, “OCT4 (octamer-binding transcription factor 4) 단백질”은 POU5F1 단백질로도 알려져 있으며, POU5F1 유전자에 의하여 코딩된다. OCT4는 POU 패밀리의 호메오도메인 (homeodomain) 전사 인자 중 하나이다. OCT4 단백질은 분화되지 않은 배아줄기세포의 자가분열과 관계되어 있음이 알려져 있으나, 체세포로부터 골 관련 세포로의 직접교차분화와 관계된 내용은 전혀 알려진 바가 없다.
일 실시양태에서, 인간 OCT4의 유전자 서열은 서열번호 1로 구성되고(NM_002701.5), 인간 OCT4 단백질은 서열번호 2로 구성되고NP_002692.2), 마우스 OCT4의 유전자 서열은 서열번호 3으로 구성되고(NM_013633.3), 마우스 OCT4 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 4로 구성되며(NP_038661.2), 본 발명의 OCT4 단백질은 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지된 OCT4 단백질과 서열 상동성 또는 기능적 유사성을 갖는 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명에서, OCT4 단백질은 OCT4 단백질의 하나 이상의 아미노산이 유전학적 및/또는 화학적으로 변형되고 모 단백질의 생물학적 활성을 보유한 OCT4 단백질 유사체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 “OCT4 단백질 융합체”란 OCT4 단백질의 생물학적 활성을 보유하면서 OCT4 단백질의 1종 이상의 아미노산에 펩타이드 등이 화학적으로 결합 또는 융합된 복합체를 의미한다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, OCT4 단백질 융합체는 세포투과용 전달물질이 융합된 OCT4 (OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질이다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 세포투과용 전달물질은 세포 투과성 펩타이드(cell-penetrating peptide: CPP)이다.
본 발명에서, 세포 투과성 펩타이드(CPP)는 OCT4 단백질에 융합되어 목적하는 세포 내부로 OCT4 단백질의 세포 통과를 가능하도록 기능하는 펩타이드로서, 그 의미는 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있다. CPP는 아르기닌 또는 리신과 같은 염기성 서열을 다량 포함하고, 높은 양전하를 띄는 8 내지 16개의 아미노산으로 이루어진 PTD(protein transduction domain)라는 특정 서열을 가진 펩티드일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 CPP는 30K 단백질, Antp(Penetratin), HSV-1, VP22, pep-1, PTD4, TAT PTD, Hph-1, Vectocell, Lactoferrin, Sim-2, LPIN3, 2IL-1a, dNP2, nona-arginine(R9)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 30K 단백질이다. 30K 단백질은 누에 체액 내에 30KDa의 단백질 군을 지칭하며, 본 발명이 속하는 기술 분야(예컨대, 대한민국 공개특허 제10-2011-0003889호, 제10-2014-0111178호 또는 대한민국 등록특허 제10-1626343호)에 공지되어 있다. 상기 30K 단백질은 누에 체액으로부터 얻거나, 유전자 재조합 방법에 의하여 대장균을 포함하는 박테리아, 식물 또는 식물 유래 세포, 효모, 균류, 곤충 세포 또는 척추동물 세포로부터 생산된 재조합 단백질일 수 있으며, OCT4의 N-말단 또는 C-말단에 결합될 수 있다. 본 발명에서, 상기 30K 단백질은 당업계에 공지된 30K 단백질 외에도 세포투과성 특성을 갖는 30K 단백질의 유사체, 변형체, 단편, 또는 아형 등을 모두 포함할 수 있으며, 예컨대 30KC19, 30KCα, PeP-C일 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 30K 단백질은 30Kc19이다. 본 발명에서 세포 투과성 펩타이드의 일례로서 30K 단백질이 제시되었으나, OCT4 단백질에 컨쥬게이션 또는 융합되어 목적하는 세포 내부로 OCT4 단백질의 세포 통과를 가능하는 펩타이드라면 본 발명의 직접교차분화를 위한 CPP로 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 30K 단백질을 CPP의 예시로 사용한 CPP-OCT4 단백질 복합체를 제조하여 체세포에 투여한 결과, 상기 체세포 내 OCT4 단백질 농도가 증가하고, 골 관련 세포로의 직접교차분화가 효과적으로 일어남을 확인하였다(실시예 2).
본 발명의 일 실시양태에 따르면, OCT4 단백질의 융합체는 골 조직 또는 골수 조직 특이적 전달 물질이 결합된 OCT4 단백질 융합체이다. 일 실시양태에서, OCT4 단백질의 융합체는 골 조직 또는 골수 조직 특이적 전달 물질이 결합된, 세포투과용 전달물질이 컨쥬게이션 또는 융합된 OCT4 단백질 융합체이다.
본 발명에서 “OCT4 단백질 운반체”는 OCT4 단백질을 목적하는 세포 내로 효율적으로 전달할 수 있는, OCT4 단백질 또는 그의 융합체를 포함하는 전달물질을 의미한다. 일 실시양태에서, 상기 OCT4 단백질 운반체는 OCT4 단백질을 포함하는 나노입자, 리포좀, 마이셀, 또는 나노 에멀젼을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, OCT4 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대 벡터 형태의 네이키드 DNA로 세포내로 전달되거나, 리포좀 (Liposome), 양이온성 고분자 (Cationic polymer)등을 이용하거나 다른 세포 특이적인 타겟팅을 가능하게 하는 화학 물질 또는 펩타이드와 같은 생물학적 물질의 결합 등을 활용하여 세포 내로 전달될 수 있다. 리포좀은 유전자 전달을 위하여 예컨대 DOTMA 또는 DOTAP 등의 양이온성 인지질을 혼합하여 제조한 인지질 막으로, 양이온성의 리포좀과 음이온성의 핵산이 일정 비율로 혼합하면 핵산-리포좀 복합체가 형성될 수 있다.
본 발명에서 "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 전달체를 의미한다. 본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.
본 발명에서 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 본 발명에서 벡터는 비-바이러스성 벡터일 수 있으며, 구체적으로 플라스미드일 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 벡터는 직접교차분화를 유도하는 OCT4 유전자 포함 플라스미드 벡터일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
2. 체세포에서 골 관련 세포로의 직접교차분화 방법
본 발명의 일 실시양태는 OCT4 (OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질, 그의 융합체 또는 운반체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자가 도입된 벡터 중 1종 이상의 OCT4 발현 촉진 인자; 및 근골격계 성장인자를 체세포에 처리하는 단계를 포함하는, 체세포에서 골 관련 세포로의 직접교차분화 방법이다.
본 발명에서, 용어 "직접교차분화(Direct reprogramming, Direct conversion, Transdifferentiation)"는 전혀 다른　세포 타입을 가지는 성숙한(분화가 끝난)　세포간의 전환을 유도하는 과정이다. 직접교차분화 과정은 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)로　리프로그래밍하고 이를　재분화하여 목적하는　세포로 만들어야하는 과정과 달리,　유도만능줄기세포 단계를 거치지 않고 바로 목적하는　세포로의 전환을 유도한다는 점에서 명확히 구별된다.
본 발명에서 용어 "체세포"는, 생식세포를 제외한 모든 세포를 의미하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유 동물 유래의 것 또는 분리된 것일 수 있다. 일 실시양태에서 상기 체세포는 생체에서 분리된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 체세포는 섬유아세포, 상피세포, 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, B세포, 주피세포, 혈관내피세포, 혈액세포, 성상교세포 혈액세포, 신경 줄기세포, 조혈모 줄기세포, 지방세포, 또는 중간엽 줄기세포일 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 체세포는 혈관내피세포, 중간엽 줄기세포, 지방세포, 및 섬유아세포로 중 1종 이상의 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명자들은 최초로, 인간 혈관내피세포인 HUVEC (human umbilical vein endothelial cell) 세포 내에 OCT4 단백질의 발현을 골 관련 세포가 직접교차분화 유도됨을 확인하였고, 상기 체세포로부터 직접교차분화 유도된 골 관련세포의 특성 분석을 수행하여 정상적인 골 관련 세포 특성을 가지고 있음을 확인하였다 (실시예 1 내지 3).
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 골 관련 세포는 골아세포(osteoblast), 골형성계 세포(osteogenic cell), 조골아세포(pre osteoblast), 골세포(Osteocyte), 골연골전구세포(osteochondroprogenitor cell), 연골 세포(chondrocyte), 파골세포(osteoclast)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 OCT4 단백질 발현 촉진 인자를 체세포에 처리하는 단계 이전에, 체세포를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 체세포를 배양하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 체세포 배양에 사용되는 배지는 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지이며, EGM-2 배지, MEM(Minimal Essential Medium), DMEM(Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium), F12(Ham's F-12 medium) 배지, 혹은 DMEM과 F12를 혼합한 DMEM/F12 등일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 기본 배지에, 탄소, 질소 및 미량 영양소의 동화성 공급원, 비제한적인 예로서, 혈청 공급원, 성장 인자, 아미노산, 항생제, 비타민, 환원제, 및/또는 당 공급원이 첨가될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 방법은 OCT4 발현 촉진 인자를 체세포에 처리하는 단계 이후에, 체세포를 무혈청 배지에서 안정화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 근골격계 성장인자는 IGF-1, TGF, BMP, 오스테오제닌(osteogenin), Osx(Osterix), 및 RUNX2(Runt-related transcription factor 2) 중 1종 이상의 인자이다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 근골격계 성장인자는 BMP이며, 더욱 구체적으로 BMP4이다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 직접교차분화 방법에서 근골격계 성장인자는 0.1 내지 500 ng/mL의 농도, 구체적으로 0.5 내지 100 ng/ml의 농도, 보다 구체적으로 2 내지 20 ng/mL로 첨가될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 직접교차분화 방법에서 상기 체세포에 근골격계 성장인자를 첨가하는 단계를 수행한 이후, 체세포를 뼈 분화 배지에서 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 뼈 분화 배지는 본 발명이 속한 기술 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 일 실시양태는 OCT4 단백질, 그의 융합체 또는 운반체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자가 도입된 벡터 중 1종 이상의 OCT4 발현 촉진 인자; 및 근골격계 성장인자를 포함하는, 체세포로에서 골 관련 세포로의 직접교차분화 유도용 조성물이다. 여기서, OCT4 발현 촉진 인자는 상기에서 정의된 바와 같다.
3. 직접교차분화를 통해 수득한 골 관련 세포 및 그의 용도
본 발명의 일 실시양태는 본 발명의 직접교차분화 방법에 의해 제조된 골 관련 세포의 직접교차분화 방법을 수행하여 제조되는 골 관련 세포이다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 골 관련 세포는 골아세포(osteoblast), 골형성계 세포(osteogenic cell), 조골아세포(pre osteoblast), 골세포(Osteocyte), 골연골전구세포(osteochondroprogenitor cell), 연골 세포(chondrocyte) 또는 파골세포(osteoclast)일 수 있으며, 예컨대 골아세포일 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, cbfa1, ALP 및 cal1와 같은 골아세포 특이적 마커의 발현량을 확인하여 직접교차분화 방법에 따른 골아세포로의 분화를 확인하였다(실시예 1-4, 실시예 2-6 등).
본 발명의 일 실시양태는 본 발명의 직접교차분화 방법에 의해 제조된 골 관련 세포를 유효성분으로 포함하는 골 관련 질환 예방 또는 치료용 세포 치료제이다.
본 발명에서, “세포 치료제”는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 통칭한다.
본 발명의 교차분화방법에 따라 제조된 골 관련 세포는 골 관련 질환의 치료, 진단 또는 예방에 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 골 관련 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 페이젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 암(cancer)　관련 골재흡수 질병, 골절(fracture), 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis) 및 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골염(Osteitis), 골형성부전증(Osteogenesis Imperfecta)으로부터 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 세포치료제는 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 및 완충액 등 중 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태는 본 발명의 직접교차분화 방법에 의해 제조된 골 관련 세포를 포함하는 골 관련 세포를 이용한 골 관련 질환 치료 물질 스크리닝 방법이다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 골 관련 질환의 치료 후보 물질의 존재 및 부재하에서 본 발명의 체세포에서 직접교차분화되어 제조된 골 관련 세포의 반응성을 확인하는 방법으로 골 관련 질환 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 골 관련 세포를 이용한 골 관련 질환 치료 물질 스크리닝 방법은
직접교차분화 방법을 수행하여 제1 골 관련 세포 및 제2 골 관련 세포를 준비하는 단계;
상기 제1 골 관련 세포에 후보 물질을 접촉시키는 단계;
상기 제1 골 관련 세포에 골 관련 질환 치료 효과 또는 부작용 감소 효과를 측정하는 단계;
상기 후보 물질을 접촉시키지 않은 제2 골 관련 세포에서의 골 관련 질환 치료 효과 또는 부작용 감소 효과와 비교하는 단계; 및
상기 후보 물질을 접촉시킨 제1 골 관련 세포에서의 골 관련 질환 치료 효과가 후보 물질을 접촉시키지 않은 제2 골 관련 세포 시료에서 골 관련 질환 치료 효과보다 높은 경우, 상기 후보 물질을 골 관련 질환 치료 후보 약물로 결정하는 단계를 포함한다.
상기 후보 물질은 각종 소분자 화학 약물, 펩타이드, 단백질, 핵산분자, 천연물, 천연물의 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시양태는 본 발명의 직접교차분화 방법에 의해 제조된 골 관련 세포를 포함하는 골 관련 질환 진단용 조성물이다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 직접교차분화 방법에 의해 제조된 골 관련 세포를 포함하는 골 관련 질환 진단용 조성물을 개체로부터 수집한 시료와 접촉하여 정상 대조군과 비교함으로써 골 관련 질환의 진단에 이용할 수 있다.
4. 직접교차분화를 통한 OCT4 단백질의 골 관련 질환 예방 또는 치료 용도
본 발명의 일 실시양태는 OCT4 단백질, 그의 융합체 또는 운반체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자가 도입된 벡터 중 1종 이상의 OCT4 발현 촉진 인자를 유효성분으로 포함하는 골 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물이다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 골 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물은 OCT4 발현 촉진 인자를 체세포로 전달할 수 있는 물질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 OCT4 단백질 융합체는 세포투과성 펩티드가 융합된 OCT4 단백질이다. 세포 투과성 펩티드는 상기에서 정의한 바와 같다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 세포투과성 펩티드는 30K 단백질, Antp(Penetratin), HSV-1, VP22, pep-1, PTD4, TAT PTD, Hph-1, Vectocell, Lactoferrin, Sim-2, LPIN3, 2IL-1a, dNP2, nona-arginine(R9)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일 실시양태에서, 30K 단백질은 30Kc19이다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 OCT4 단백질 융합체는 체세포, 예컨대 혈관내피세포 내로 전달될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 골 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물은 상기 OCT4 발현 촉진 인자를 뼈 부위 또는 골수 부위로 전달할 수 있는 물질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 OCT4 단백질 융합체는 골 조직 특이적 전달 물질이 컨쥬게이션 또는 융합된 세포투과성 펩티드에 융합된 OCT4 단백질이다.
본 발명의 일 실시양태에서, 골 조직 또는 골수 조직 특이적 전달 물질은 개체 내에 정맥 주사된 후 골 조직 또는 골수 조직으로 전달하고자 하는 물질을 표적화할 수 있는 물질을 의미한다. 골 조직 또는 골수 조직 특이적 전달물질은 예를 들어 비스포스포네이트 계열 화합물등을 포함하는 화학물질, BMHP1 (bone marrow homing peptide 1), PFS (PFSSTKT) 등을 포함하는 Bone 혹은 Bone marrow homing peptide 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지된 골 조직 또는 골수 조직 특이적 전달물질일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 골 조직 특이적 전달 물질은 상기 OCT4 단백질 융합체에 결합된 비스포스포네이트(Bisphosphonate) 계열 화합물이다. 상기 비스포스포네이트 계열 화합물은 예컨대, OCT4 단백질 융합체의 카르복시기에 결합될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 골 관련 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 페이젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 암(cancer)　관련 골재흡수 질병, 골절(fracture), 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis) 및 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis)으로부터 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상이다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 골 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물은 투여되는 체세포 내에서 Sox2, Klf4, C-Myc 또는 Lin28 단백질의 발현을 증가시키지 않는다. 상기 조성물은 예컨대 Sox2, Klf4, C-Myc 또는 Lin28 단백질 또는 그의 융합체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 또는 상기 핵산이 도입된 벡터를 포함하지 않는다.
본 발명의 일 실시양태는 OCT4 단백질 또는 그의 융합체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자가 도입된 벡터 중 1종 이상의 OCT4 발현 촉진 인자를 유효량으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법이다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 예방 또는 치료 방법에서 OCT4 발현 촉진 인자는 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥 주사, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 비장내 (intrasplenically), 또는 직장내 투여 등으로 투여될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 투여방법은 정맥 주사 또는 뼈 관련 질환 부위에의 국소 투여이다.
본 발명에 따른 OCT4 발현 촉진 인자를 포함하는 체세포에서 골 관련 세포로의 직접교차분화 유도용 조성물을 이용하여 제조된 골 관련 세포는 세포 치료제, 골 관련 질환 치료 물질 스크리닝, 골 관련질환 진단에 유용하게 사용될 수 있으며, 상기 조성물은 개체에 투여되어 골 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 혈관내피세포에 Oct4 유전자의 발현을 통한 직접교차분화의 과정을 나타낸 도이다.
도 2의 (A)는혈관내피세포에 도입된 Oct4 유전자의 발현을 PCR로 확인한 결과를 나타내고, 도 2의 (B)는 세포내 발현되는 OCT4 단백질의 유무를 면역세포화학법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 BMP4 수용체와 관련된 MBPRIA 및 BMPRII 유전자 및 내피-중간엽 전환(endothelial-mesenchmal transition)과 관련된 SLUG 및 SNAIL 유전자의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 골아세포 특이적 마커의 발현 정도를 확인한 그래프이다.
도 5는 오스테오칼신의 존재여부를 면역화학염색법(immunocytochemistry)으로 확인한 사진이다.
도 6은 세포의 석회화 정도를 확인한 사진이다.
도 7은 두개골 결함 마우스 모델에서 골 재생을 확인하기 위한 micro-CT 사진 및 BV/TV %를 측정한 그래프이다.
도 8은 두개골 결함 마우스 모델에서 골 재생을 확인하기 위한 Masson's trichrome 염색을 확인한 사진이다.
도 9는 CPP-OCT4 복합체 단백질을 제조하기 위한 벡터를 나타낸다.
도 10 내지 도 12는 CPP-OCT4 복합체 단백질의 농도를 확인한 체 크로마토그래피(Fast Protein Liquid Chromatography, FPLC) 및 SDS-PAGE의 결과이다.
도 13은 혈관내피세포의 LIVE/DEAD 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 14는 CPP-OCT4 복합체 단백질의 세포 투과 여부를 확인한 도이다.
도 15는혈관내피세포 특이적 유전자(CD31, VECAD, VEGFR-2) 및 중간엽줄기세포 특이적 유전자 (VIMENTIN, TWIST, SLUG)의 발현 정도를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸다.
도 16은 혈관내피세포 특이적 단백질(CD31)과 중간엽내피세포 특이적 단백질(αSMA)에 대한 면역화학염색 결과를 나타낸다.
도 17은 팔로이딘으로 세포를 형광 염색하여 혈관 형성을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 18은 골아세포 특이적 마커의 발현 정도를 확인한 그래프이다.
도 19은 세포의 석회화 정도를 알린자린 염색으로 확인한 사진이다.
도 20은 두개골 결함 마우스 모델에서 골 재생을 확인하기 위한 micro-CT 사진 및 BV/TV %를 측정한 그래프이다.
도 21은 CPP-OCT4 복합체 단백질 또는 BP-CPP-OCT4 복합체 단백질 투여에 따른 골다공증 개선 효과를 확인하기 위한 도이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> OCT4 유전자 포함 재조합 벡터를 혈관내피세포에 도입한 골아세포의직접교차분화
실시예 1-1. 골아세포직접교차분화 방법
혈관내피세포인 HUVEC(human unbilical vein endothelial cells) 세포를 배양하기 위해, 젤라틴 0.1% 용액을 20분 동안 코팅한 100 mm 세포 배양 접시에 HUVEC 세포(Lonza사, USA)를 4 × 10 3 세포/cm 2 밀도로 접종하였다. 1% FBS 및 각종 성장인자(IGF, VEGF, FGF)를 포함하는 EGM-2 배지(Lonza사, USA)에서 37℃, 5% CO 2 배양 조건으로 배양 접시를 90% 가량 채울 때까지 세포를 배양하였다. 그 다음, 배양 접시의 세포를 0.25% 농도의 트립신을 이용하여 분리하였다.
OCT4 유전자를 포함하는 플라스미드 수득을 위해, DH5alpha 박테리아 스톡(Invitro사)에 OCT4(Addgene #13366) 유전자가 포함된 재조합 플라스미드를45초 동안 42℃에서 heat shock을 주어 도입하였다. 그 다음, 상기 OCT4 유전자 도입 박테리아를 100 μg/ml의 암피실린 항생제가 포함된 4 mL LB 배지(Sigma사, USA)에 접종하고, 8시간 동안 37 ℃ 진탕 배양기(shaking incubator)에서 160 rpm으로 종균배양하였다. 4 mL의 박테리아 배지는 글리세롤 15%와 함께 동결 튜브에 스톡으로 보관하고, 나머지 1mL의 박테리아 배지를 준비된 100 mL의 LB 배지에 넣어준 후 15 내지 16시간 동안 37 ℃ 진탕배양기에 200 rpm으로 배양하였다. 다음날, Midi-Prep(Qiagen사, USA)를 사용하여 플라스미드를 박테리아로부터 분리시켜 수득하였다.
상기 재조합 플라스미드를 Neon transfection system(Thermo Fisher사)의 R 완충용액 및 혈관내피세포의 존재 하에 전기천공법(electroporation)을 통해 형질전환시켰다. 전기천공은 15 μg의 재조합 플라스미드가 2 × 10 6 세포에 전달될 수 있도록 전기장 세기 13.5 kV/cm, 충격 시간 30 ms로 실시하였다. 그 후, 형질전환된 세포를 선별하기 위하여, OCT4 전사인자를 표적화하는 OCT4 항체(Abcam, USA)를 사용하여 면역세포화학법(immunocytochemistry)를 수행하였다.
전기천공 이후, 세포의 안정화를 위하여 37℃, 5%의 CO 2 조건으로 무혈청 EGM-2 배지에서 24 시간 동안 배양하였다. 그 후, 10 ng/mL 농도의 BMP4(RnD systems, USA)를 무혈청 배지에 첨가하고 48 시간 동안 배양하였다.
그 다음, 뼈 분화 배지인 StemPro Osteogenesis medium(Thermo, USA)에서 세포를 14 일 동안 배양하였다.
실시예 1-2. 혈관내피세포 내 OCT4 유전자 발현 확인
실시예 1-1에 따라 OCT4 유전자를 발현하는 혈관내피세포가 확립되었는지 확인하였다. 전기천공법을 실시한 혈관내피세포에 대해 RT-PCR 및 면역세포화학법(immunocytochemistry)를 수행하였다.
RT-PCR의 경우, 혈관내피세포를PBS로 워시한 후 Trizol(Thermo, USA)을 처리하여 얼음에 20분 동안 세포를 용출하여 RNA를 분리하였다. 그 후, 클로로포름(chloroform, Sigma, USA)을 넣어주고 15초간 흔들어주고, 10분 동안 실온에서 방치시킨 후, 15,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리 하였다. 이후, 분리된 두 개의 층(투명한 층과 분홍색 층) 중에 투명한 층을 따로 추출하여 새로운 튜브로 옮겨주었다. 이소프로판올(isopropanol, Sigma, USA)을 첨가하여 5분 동안 상온에서 RNA 침전물이 생성될 때까지 대기하고, 생성된 침전물은 원심분리기를 통하여 15,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 분리하였다. 세척 단계로 75% 에탄올을 원심분리된 RNA 펠렛(pellet)에 넣어 다시 한 번 10,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하였다. 세척된 침전물은 molecular graded water(Sigma, USA)에 60℃에서 10분간 변성 시켰다.
이렇게 수득된 각 세포의 RNA는 reverse-transcriptional PCR kit(Enzynomics사)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA로 제작되었다. 제조된 cDNA는 분석하고자 하는 각 유전자의 프라이머들과 SYBR green PCR Mastermix(Enzynomics사)를 사용하여 quantitative real-time PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머는 하기 표 1과 같다.
Figure PCTKR2019005103-appb-img-000001
면역세포화학법의 경우, OCT4 항체(Abcam, USA)를 사용하여 염색을 진행하였다. 이를 위해 세포를 4% 파라포름알데히드(Sigma-Aldrich, USA)를 이용하여 20 분간 상온에서 고정한 후, 5분간 phosphate buffer saline(PBS; Gibco,USA)으로 두 번 워시해주었다. 그후, 염색약 투과화(permeabilization)를 위해 0.2% triton-X100(sigma-aldrich)를1% bovine serum albumin/PBS (BSA/PBS; MP Biomedicals,USA)에 섞어 15 분간 처리해주었다. Blocking을 위해10% normal goad serum(Vector laboratories)를1% BSA/PBS에 섞어 한 시간 동안상온에 보관하였다. 첫 번째 항체인 OCT4를 붙이기 위해 0.1% triton-X100, 5% NGS, 1% BSA/PBS에 항체와 용해를 1:500 비율로 섞어 하룻밤 동안 4℃에서 보관하였다.다음날,10분씩 세 번 워시하여 남아있는 첫 번째 항체를 없애주고 두 번째 항체를 같은 용해에 1:200 비율로 1.5 시간 동안 상온에서 처리해주었다. 세포핵 염색을 위해 DAPI(D9541, Sigma-aldrich) 용액을 1:200 비율로 PBS에 섞은 후, 15분간 상온에서 처리해주었다.
그 결과, 실시예 1-1에 따라 OCT4 유전자가 혈관내피세포 내에 성공적으로 발현된 것을 확인하였다(도 2).
실시예 1-3. 형질전환된 세포에 BMP4 처리에 따른 특정 유전자 발현
실시예 1-1에 따라 수득한 세포에서, BMP4 수용체와 관련된 MBPRIA 및 BMPRII 유전자와 내피-중간엽 전환(endothelial-mesenchmal transition)과 관련된 SLUG 및 SNAIL 유전자의 발현 수준을 실시예 1-2에 기재된 RT-PCR을 통해 측정하였다. RT-PCR에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다.
Figure PCTKR2019005103-appb-img-000002
그 결과, OCT4 유전자를 형질전환시키고 BMP4 처리까지 해준 세포에서 BMPRIA, BMPRII, SLUG 및 SNAIL 발현량이 가장 높은 것을 확인하였다(도 3).
실시예 1-4. 골아세포 특이적 마커 유전자의 발현
실시예 1-1의 직접교차분화방법에 따라 혈관내피세포가골아세포로 분화되었는지 확인하기 위해, 실시예 및 비교예(비교예 1: 혈관내피세포를 그대로 사용, 비교예 2: 혈관내피세포에 BMP4만 처리, 비교예 3: 혈관내피세포에 OCT4로 유전자로 형질전환만 수행)의 세포에서 골아세포 특이적인 마커인 cbfa1, ALP 및 cal1 유전자의 발현 정도를 확인하였다.
상기 cbfa1(core-binding factor subunit alpha-1)의 다른 이름은 RUNX2(Runt-related transcription factor 2)로 조골세포의 분화, 연골세포의 성숙 및 골 형성에 관여한다. 골아세포가 분화하는 과정에서 cbfa1는 항상 높은 레벨로 발현된다.
염기성 인산분해 효소(Alkaline phosphatase, ALP)는 거의 모든 조직에 존재하며, 특히 골조직에 존재하는 ALP는 골 성장이 활발히 일어날 때 그 활성이 증가한다. 또한, ALP는 유골(osteoid) 형성과 무기질화(mineralization)에 중요한 역할을 하는 효소이며, 골아세포 활성도의 마커로서 잘 알려져 있다. col1(Type 1 Collagen)은 골아세포가 성숙되는 초기에 발현이 증가되는 인자이다. cbfa1, ALP 및 cal1 유전자들은 골아세포에서 높게 발현되는 유전자들로 혈관내피세포가골아세포로 분화되었는지는 cbfa1, ALP 및 cal1의 발현 정도가 높을수록 골아세포로 분화되었다고 판단하였다.
cbfa1, ALP 및 cal1 유전자의 발현 정도는 실시예 및 비교예의 세포를 배양 1 주 또는 2 주차때 실시예 1-2에 기재된 것과 같은 RT-PCR을 이용하였다. 사용된 프라이머는 하기 표 3과 같다.
Figure PCTKR2019005103-appb-img-000003
뼈 분화 배지 배양 7일 또는 14일째 실시예 1 및 비교예 세포(비교예 1: 혈관내피세포를 그대로 사용, 비교예 2: 혈관내피세포에 BMP4만 처리, 비교예 3: 혈관내피세포에 OCT4로 유전자로 형질전환만 수행)들의 cbfa1, ALP 및 cal1 유전자의 발현 정도를 확인하였다(도 4).
실시예 1-5. 오스테오칼신의 존재 확인
실시예 1-1의 직접교차분화방법에 따라 혈관내피세포가골아세포로 분화되었는지 확인하기 위해, 면역화학염색법(immunocytochemistry)을 이용하여 실시예 및 비교예(비교예 1: 혈관내피세포를 그대로 사용, 비교예 2: 혈관내피세포에 BMP4만 처리, 비교예 3: 혈관내피세포에 OCT4로 유전자로 형질전환만 수행)의 세포에서 조골세포 마커인 오스테오칼신(Osteocalcin) 존재를 확인하였다.
각 실시예 및 비교예 세포들을 PBS 버퍼(buffer)로 세척한 후, 세포를 고정하기 위해 4% 파라포름알데하이드(paraformaldegyde)를 이용하여 실온에서 20분 동안 처리하였다. PBS 버퍼로 세척한 후, 1% BSA(MP Biomedicals, USA)/PBS(Gibco, USA)에 0.2% Triton X-100(Sigma-Aldrich, USA)를 섞어 15분 동안 투과화(permeabilization)하여 항체(antibody)가 세포 안으로 들어갈 수 있게 처리하였다. 비특이적 항체 결합(Non-specific antibody binding)을 방지하기 위하여 차단(blocking) 단계에서 10% 정상염소혈청(Normal Goat Serum, Vector Laboratories, USA)을 1% BSA/PBS에 희석하여 1시간 동안 처리하였다.
0.1% Triton X-100, 5% 정상염소혈청(Normal Goat Serum), 1% BSA/PBS 용액(solution)에 각각 1차 항체를 반나절 동안 처리하였다. 사용된 1차 항체는 1:500으로 희석한 항-오스테오칼신(1:500; Abcam, USA; ab13420) 또는 1:200으로 희석한 OCT4 단백질을 사용하였다. 그 다음, 각 세포들을 1% BSA/PBS로 5분간 3씩 세척하고, 1:200으로 희석한 2차 항체(Jackson Immuno Research)를 1시간 반 동안 처리하였다. 핵 염색을 위하여 1:200으로 희석한 BAPI(Sigma-Aldrich, USA)을 PBS에 용해하여 15분간 처리하였다. 염색 결과는 EVOS(Thermo, USA)으로 관찰하였다.
실시예 및 비교예(비교예 1: 혈관내피세포를 그대로 사용, 비교예 2: 혈관내피세포에 BMP4만 처리, 비교예 3: 혈관내피세포에 OCT4로 유전자로 형질전환만 수행) 세포에서 조골세포 마커인 오스테오칼신(Osteocalcin) 존재를 확인한 결과, A:T 쌍이 주로 분포하고 있는 세포의 핵이 DAPI에 의해 푸른 형광으로 염색됨으로써, 세포의 존재를 확인할 수 있고, 붉은 색으로 염색된 오스테오칼신이 핵 주변에 분포되어 있음을 확인하였다(도 5).
실시예 1-6. 석회화 정도 확인
실시예 1-1의 직접교차분화방법에 따라 혈관내피세포가골아세포로 분화되었는지 확인하기 위해, 칼슘염을 염색하는 알리자린(alizarin) 염색을 이용하여 실시예 및 비교예에서 세포의 석회화 정도를 확인하였다.
각각의 세포들을 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 이용하여 상위 면역 화학 염색법에 쓰인 것과 같이 고정하였다. 이후, 증류수로 한차례 세척하고 40mM 알린자린 레드(alinzarin red, Sigma Aldrich) pH 4.2 용액을 처리하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 증류수로 2차례 세척한 후 PBS 용액으로 10분간 세척하고 염색 결과를 관찰하였다(도 6).
실시예 1-7. 직접교차분화에 따른 골 조직의 재생 효과 확인
실시예 1-1에 따라 직접교차분화된골아세포가 골 조직을 재생하는지 확인하기 위해 두개골 결함 마우스 모델에 실시예 및 비교예 세포들을 적용하였다.
해당 실험을 위해서 8주령 마우스 모델에서 두개골을 외과적으로 4mm 크기의구멍을 내는 형태로 두개골 결함 모델을 제작하였다. 실험군은 세포가 없는 스캐폴드(scaffold) 물질을 구멍에 채운 수술대조군(sham)과 실시예 1 및 비교예(비교예 1: 혈관내피세포를 그대로 사용, 비교예 2: 혈관내피세포에 BMP4만 처리, 비교예 3: 혈관내피세포에 OCT4로 유전자로 형질전환만 수행) 세포들을 넣은 스캐폴드를사용한 마우스로 분류하였다.
8주후, 각 실험군에서 골 재생을 확인하기 위해 뼈가 채워진 형태를 SkyScan1172 (SkyScan) micro-CT 장비로 촬영하고, ReCon Micro-CT이미지 분석 프로그램을 통해 BV/TV %를 측정하여 골 재생 정도를 확인하였다(도 7)
골 재생의 정도를 확인한 결과, 비교예 세포들을 투여하거나 수술대조군(sham) 대비 OCT4 유전자로 형질전환된혈관내피세포에 BMP4를 처리한 실시예 1 세포를 투여한 마우스에서 현저히 높은 골 재생이 나타났다.
각 실험군에서 골 재생의 정도를 조직학적으로 확인하기 위해 Masson's trichrome 염색으로 골 재생 정도를 확인하였다. 두개골을 뜨거운 파라핀에 고정한 후, -20도씨 정도 되는 차가운 plate에 굳혀블락을 만들어 준 뒤, 절편기(sectioning)를 이용하여 얇게 잘라 유리슬라이드에 붙였다.붙은 유리슬라이드에 있는 파라핀을 100%, 95%, 70% 알코올로 옮겨가며 없애주었다.그 뒤,물에5-10분간 담가 남아있는 알코올을 없애주었다.먼저 hematoxylin solution으로 10분간 염색해 주고,다시 10분간 물에 씻어 주었다.그 뒤,Biebrich scarlet-acid fuchsin solution에 10-15분간 염색 후 물에 씻어 주었다.마지막으로 phosphomolybdic-phosphotungstic acid solution에 10-15분간 염색하여 콜라겐을 destaining 한 후, aniline blue solution으로 5-10분간 염색하고 물에 잠시 씻은 뒤 1% acetic acid solution에 2-5분간 담가 주었다. Dehydration을 위해 물에 씻어 준 뒤, 95% ethyl alcohol, 100% ethyl alcohol, xylene에 옮겨 주었다.그 뒤,mounting solution에 mount 해 주었다.
그 결과, OCT4 유전자로 형질전환된혈관내피세포에 BMP4를 처리한 실시예 1 세포를 투여받은 마우스의 골 조직이 원래의 골 조직과 유사한 형태로 재생되는 것을 확인하였다(도 8).
<실시예 2>세포투과성 펩티드 및 OCT4 융합 단백질 복합체를 혈관내피세포에 도입한 골아세포의직접교차분화
실시예 2-1. CPP-OCT4 융합 단백질 복합체의 제조방법
세포 투과 단백질(Cell Penetrating Peptide, CPP)에 OCT4 단백질이 융합된 CPP-OCT4 복합체 단백질을 제조하였다. 먼저, OCT4와 결합되는 세포 투과성 단백질은 세포 투과성을 지닌 것으로 보고된 바 있는 30kc19을 사용하였다. 본 실험에 사용된 30Kc19의 아미노산 서열은 다음과 같다(서열번호 23).
Figure PCTKR2019005103-appb-img-000004
30kc19 유전자와 OCT4 유전자를 pET-23a 벡터에클로닝한 후, BL21 박테리아에 해당 OCT4유전자가 담긴 벡터를 삽입하였다.이후 37℃에서 박테리아 배양 이후 His Tag를 활용하여 CPP-OCT4 복합체 단백질을 정제하였다.
CPP-OCT4 융합 복합체 단백질은 고속 단백질 액체 크로마토그래피(Fast Protein Liquid Chromatography,FPLC)를 통해 정제하였고, 이를 SDS-PAGE 젤에 Coomassie Blue로 염색하여 확인하였다. CPP-OCT4 복합체 단백질의 농도는 표준 BSA 농도를 비교 대조하여 측정하였다(도 10 내지 도 12).
실시예 1-1에 기재된 방법에 따라 배양한 혈관내피세포를골아세포로 분화하기 위해 무혈청 EGM-2 배지에서 40 μg의 CPP-OCT4 복합체 단백질과 10 ng/mL 농도의 BMP4(RnD systems, USA)로 24시간 처리하였다. BMP4를 같은 조건을 24시간 처리하고, 뼈 분화 배지인 StemPro Osteogenesis medium(Thermo, USA)에 14일 동안 배양하여 골아세포로분화시켰다.
실시예 2-2. CPP-OCT4 복합체의 세포 안전성 및 투과
수득한 CPP-OCT4 복합체 단백질을 혈관내피세포에 0, 20, 40, 60, 80 μg으로 처리한 후, 염색을 통한 LIVE/DEAD 분석을 통해 세포 독성을 확인하였다. 초록색은 Calcein 성분으로 염색된 살아있는 세포이고, 붉은색은 EtBr 성분으로 염색된 죽은/죽어가는 세포이다(도 13).
또한, CPP-OCT4 복합체 단백질의 세포 투과 여부를 확인하기 위해, CPP-OCT4 복합체 단백질의 일부인 T7에 결합하는 형광 항체를 이용하여 CPP-OCT4 복합체 단백질을 혈관내피세포에 0, 4, 8, 12, 24 시간째 처리하여 세포 투과 여부를 확인하였다(도 14).
실시예 2-3. 세포 유전자 유형 변화
실시예 2-1의 직접교차분화방법에 따른 혈관내피세포의 변화를 확인하기 위해, 실시예 및 비교예의 세포에서 혈관내피세포 특이적 유전자(CD31, VECAD, VEGFR-2) 및 중간엽줄기세포 특이적 유전자 (VIMENTIN, TWIST, SLUG)의 발현 정도를 실험예 3-1과 동일한 RT-PCR로 확인하였다(도 15).
실시예 2-4. 단백질 발현 유형 변화
실시예 2-1의 직접교차분화방법에 따라 혈관내피세포의 변화를 확인하기 위해, 실시예 및 비교예의 세포에서 혈관내피세포 특이적 단백질(CD31) 및 중간엽내피세포 특이적 단백질(αSMA)의 발현 정도를 면역화학염색법(immunocytochemistry)을 통해 확인하였다.
그 결과, 비교예들에 비해 CPP-OCT4 복합체 단백질과 BMP4를 처리한 실시예 2에서 혈관내피세포 특이적 단백질(CD31)과 중간엽내피세포 특이적 단백질(αSMA)의 발현 정도가 높게 나타났다(도 16).
실시예 2-5. 혈관 형성 확인
실시예 2-1의 직접교차분화방법에 따른 혈관내피세포의 변화를 확인하기 위해, 형광 분석을 통해 혈관 형성을 확인하였다.
Matrigel (BD #354234)을 세포배양디쉬에 도포한 후 37도에서 30분 기다린 이후, 실시예 및 비교예의 세포를 matrigel 위에 VEGF(10ng/ml)과 FBS가 함량된 배지에서 12시간동안 배양하였다. 이후, 팔로이딘으로 세포를 형광 염색하여 혈관 형성을 관찰하였다(도 17).
실시예 2-6. 골아세포 특이적 마커 유전자의 발현
실시예 2-1의 직접교차분화방법에 따라 혈관내피세포가골아세포로 분화되었는지 확인하기 위해, 실시예 및 비교예의 세포에서 골아세포 특이적인 마커인 Col1(colagen type-1), OPN(Psteopontin) 및 BSP 유전자의 발현 정도를 RT-PCR로 확인하였다. 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다.
Figure PCTKR2019005103-appb-img-000005
실시예 및 비교예세포들에서골아세포 특정 유전자인 Cal1, OPN 및 BSP의 발현 정도를 확인한 결과, CPP-OCT4 복합체 단백질과 BMP4를 처리한 실시예 2에서 골아세포 특이적 유전자의 발현이 높게 유지되는 것을 확인하였다(도 18).
실시예 2-7. 석회화 정도 확인
실시예 2-1의 직접교차분화방법에 따라 혈관내피세포가골아세포로 분화되었는지 확인하기 위해, 칼슘염을 염색하는 알리자린(alizarin) 염색을 이용하여 실시예 및 비교예에서 세포의 석회화 정도를 확인하였다.
실시예 및 비교예 세포에서 석회화 정도를 확인한 결과, 비교예들에 비해 CPP-OCT4 복합체 단백질과 BMP4를 처리한 실시예 2에서 붉은색의 염색 부분이 많이 나타나므로 석회화가 가장 많이 진행된 것을 확인하였다(도 19).
실시예 2-8. 골 조직의 재생 효과 확인
실시예 2-1의 직접교차분화방법에 따라 혈관내피세포가골아세포로 분화되었는지 확인하기 위해, 두개골 결함 마우스 모델에 실시예 및 비교예 세포들을 적용하였다.
골 재생의 정도를 확인한 결과, 비교예 세포들을 투여하거나 수술대조군(sham) 대비 CPP-OCT4 복합체 단백질과 BMP4를 처리한 실시예 2 세포를 투여한 마우스에서 현저히 높은 골 재생 효과를 확인하였다(도 20).
<실시예 3> 비스포스포네이트가 결합된 세포투과성 펩티드 및 OCT4 융합 단백질 복합체를 혈관내피세포에 도입한 골아세포의직접교차분화
실시예 3-1. BP-CPP-OCT4 융합 단백질 복합체의 제조방법
골아세포의직접교차분화를 in vivo로 실행하기 위해서 CPP-OCT4 복합체 단백질에 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)를 결합한 BP-CPP-OCT4 복합체 단백질을 제조하였다.
비스포스포네이트 계열의 알렌드로네이트(alendronate)를 사용하여, CPP와 결합하였다. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 와 Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)를 이용하여 CPP 단백질의 카르복실기와알렌드로네이트의아민기를 결합하여 BP-CPP-OCT4 복합체 단백질을 제조하였다.
이후, 제조된 BP-CPP-OCT4 복합체 단백질은 5 mg/ml 농도로 deuterium oxide(D2O)에 녹여 핵자기 공명을 통해 결합 된 여부와 질양을 확인하였다.
실시예 3-2. 골다공증 유발 동물 모델 제조
본 발명에 따른 직접교차분화 방법에 따라 골다공증이 개선되는 지 확인하기 위해, C3H 암컷 마우스에서 난소를 절제하여 골다공증 동물모델를 제작하였다. 치사 후 대퇴골을 micor-CT로 촬영하여 골다공증 발병 여부를 확인하였다.
실시예 3-3. BP-CPP-OCT4 복합제를 이용한 골다공증 치료 효과 확인
BP-CPP-OCT4 복합체 단백질의 골다공증 개선 효과를 확인하기 위해, 골다공증 유발 동물모델에 BP-CPP-OCT4 복합체 단백질을 투여하였다.
골다공증 유발 동물모델은 외과 시술에 의해 난소가 절제된 마우스로, 난소 절제 2주 후에 2.5 mg의 BP-CPP-OCT4 복합체 단백질 투여군, 0.125 mg의 알렌드로네이트 투여군으로 나누어 6주간 단백질/kg/wk의 투여량으로 정맥 투여한 후 골다공증이 개선되었는지 확인하였다(도 21).
그 결과, BP-CPP-OCT4 복합체 단백질을 정맥 투여한 골다공증 질환 마우스에서 치료 효과를 확인하였다.

Claims (34)

  1. OCT4 (OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질, 그의 융합체 또는 운반체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자, 및 상기 핵산분자가 도입된 벡터 중 1 종 이상의 OCT4 발현 촉진 인자; 및
    근골격계 성장인자를 체세포에 처리하는 단계를 포함하는, 체세포에서 골 관련 세포로의 직접교차분화 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 체세포는 혈관내피세포, 중간엽 줄기세포, 지방세포, 및 섬유아세포 중 1종 이상의 세포인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 골 관련 세포는 골아세포인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 OCT4 발현 촉진 인자를 체세포에 처리하는 단계 이전에, 체세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 OCT4 발현 촉진 인자를 체세포에 처리하는 단계 이후에, 체세포를 무혈청 배지에서 안정화하는 단계를 더 포함하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 근골격계 성장인자는 IGF-1, TGF, BMP, 오스테오제닌(osteogenin), Osx(Osterix), 및 RUNX2(Runt-related transcription factor 2) 중 선택되는 1종 이상의 인자인 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 근골격계 성장인자는 BMP4인 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 근골격계 성장인자는 0.1 내지 500 ng/mL의 농도로 첨가되는 것인 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 체세포에 근골격계 성장인자를 첨가하는 단계를 수행한 이후, 체세포를 뼈 분화 배지에서 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
  10. 제 1 항의 직접교차분화 방법을 수행하여 제조되는 골 관련 세포.
  11. 제 10 항의 골 관련 세포를 유효성분으로 포함하는 골 관련 질환 예방 또는 치료용 세포 치료제.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 골 관련 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 페이젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 암(cancer)　관련 골재흡수 질병, 골절(fracture), 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골염(Osteitis) 및 골형성부전증(Osteogenesis Imperfecta)으로부터 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 세포 치료제.
  13. 제 10 항의 골 관련 세포를 이용한 골 관련 질환 치료 물질 스크리닝 방법.
  14. 제 10 항의 골 관련 세포를 포함하는 골 관련 질환 진단용 조성물.
  15. OCT4 (OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질 또는 그의 융합체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자가 도입된 벡터 중 1종 이상의 OCT4 발현 촉진 인자; 및
    근골격계 성장인자
    를 포함하는, 체세포에서 골 관련 세포로의 직접교차분화 유도용 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 OCT4 발현 촉진 인자는 OCT4 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 도입된 벡터인 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 OCT4 발현 촉진 인자는 비바이러스성 벡터인 조성물.
  18. 제 15 항에 있어서, 상기 OCT4 발현 촉진 인자는 세포투과성 펩티드가 융합된 OCT4 단백질인 조성물.
  19. 제 15 항에 있어서, Sox2, Klf4, C-Myc 또는 Lin28 단백질을 포함하지 않는 조성물.
  20. OCT4 (OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질, 그의 융합체 또는 운반체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자, 및 상기 핵산 분자가 도입된 벡터 중 1종 이상의 OCT4 발현 촉진 인자를 유효성분으로 포함하는 골 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 1종 이상의 OCT4 발현 촉진 인자를 혈관내피세포 내로 전달할 수 있는 물질을 더 포함하는 조성물.
  22. 제 20 항에 있어서, 상기 OCT4 단백질 융합체는 세포투과성 펩티드가 융합된 OCT4 단백질인 조성물.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 세포투과성 펩티드는 30K 단백질인 조성물.
  24. 제 20 항에 있어서, 상기 OCT4 단백질 융합체는 혈관내피세포 내로 전달될 수 있는 것인 조성물.
  25. 제 20 항에 있어서, 상기 1종 이상의 OCT4 발현 촉진 인자를 뼈 부위로 전달할 수 있는 물질을 더 포함하는 조성물.
  26. 제 20 항에 있어서, 상기 OCT4 단백질 융합체는 골 조직 혹은 골수 조직특이적 전달 물질이 컨쥬게이션 또는 융합된 세포투과성 펩티드에 융합된 OCT4 단백질인 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 골 조직 특이적 전달 물질은 상기 OCT4 단백질 융합체에 결합된 비스포스포네이트 계열 화합물인 조성물.
  28. 제 20 항에 있어서, 상기 골 관련 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 페이젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 암(cancer)　관련 골재흡수 질병, 골절(fracture), 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis) 및 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis)으로부터 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 조성물.
  29. OCT4 (OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질, 그의 융합체 또는 운반체, 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자, 및 상기 핵산분자가 도입된 벡터 중 1종 이상의 OCT4 발현 촉진 인자를 유효량으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 정맥 주사로 투여되는, 골 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법.
  31. 제 29 항에 있어서, 뼈 관련 질환 부위에 국소 투여되는, 골 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법.
  32. 세포투과용 전달물질이 융합된 OCT4 (OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질 융합체.
  33. 제 32 항에 있어서, 세포투과용 전달물질은 세포투과성 펩티드인 단백질 융합체.
  34. 골 조직 특이적 전달 물질이 결합된, 세포투과용 전달물질이 융합된 OCT4 (OCTamer-binding transcription factor 4) 단백질 융합체.
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