WO2020060165A1 - 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 조성물 - Google Patents

박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 조성물 Download PDF

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WO2020060165A1
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culture
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박지호
권민영
김태현
김기수
이재우
이여준
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Hyundai Bioland Jiangsu Co Ltd
Hyundai Bioland Co Ltd
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SK Bioland Haimen Co Ltd
SK Bioland Co Ltd
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    • C08J5/00—Manufacture of articles or shaped materials containing macromolecular substances
    • C08J5/18—Manufacture of films or sheets
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Definitions

  • the present invention relates to a composition for culturing a bacterial cellulose production strain.
  • the sheet-type mask used in the cosmetic field is largely (i) a non-woven fabric made of vegetable cellulose fibers such as cotton and pulp or synthetic fibers such as nylon and dupont is soaked in a fresh water body of a cosmetic fluid and used as a mask-shaped support.
  • Cellulose masks used (ii) hydrogel masks made from natural polysaccharides such as natural agar, carrageenan, locust bean gum, and (iii) bacterial cellulose (biocellulose) made through microbial culture
  • bacterial cellulose biocellulose
  • the sheet-type mask pack used in the cosmetic field is attracting attention in the cosmetics market because it is possible to obtain a moisturizing and clean effect as the most important advantage as attaching a sheet made in the form of a face without having to apply by hand.
  • Cellulose (aka bacterial cellulose) made through microbial culture has recently been used as a material for burn healers for cosmetics or cosmetic mask packs.
  • Cellulose is the most abundant biomaterial resource in nature.
  • cellulose produced by acetic acid bacteria has attracted much attention as a high-value industrial new material as well as food additives.
  • cellulose produced by bacteria has excellent physical and chemical properties, unlike cellulose produced by plants.
  • the production of common bacterial cellulose is mainly through cell culture in a culture of fruit juice such as citrus juice.
  • Acetobacter genus, Rhizobium genus, and Agrobacterium genus are the most popular strains for producing bacterial cellulose.
  • Acetobacter xylinium is the most well-known strain (Korea Registered Patent). No. 10-0405776).
  • Cellulose production efficiency of microorganisms producing such bacterial cellulose is influenced by the composition of the culture medium, and thus, there is an urgent need to develop a composition for culture that can improve the cellulosic production efficiency of microorganisms.
  • the present inventors have investigated the change of the quality and production efficiency of bacterial cellulose according to the discovery of new strains and the sugar content of the culture medium in order to develop a composition for culturing which can improve the production efficiency of bacterial cellulose.
  • the present invention was completed by identifying a new Komagataeibacter rhaeticus KOSS15 strain, and identifying that the strain has high cellulose production capacity when cultured in a culture medium containing honey as a sugar source . Was done.
  • an object of the present invention is to provide a composition for culturing a bacterial cellulose production strain.
  • the present invention provides a composition of (a) honey, or glucose and fructose; And (b) provides a composition for culturing a bacterial cellulose production strain comprising proline.
  • the present inventors have investigated the change of the quality and production efficiency of bacterial cellulose according to the discovery of new strains and the sugar content of the culture medium in order to develop a composition for culturing which can improve the production efficiency of bacterial cellulose.
  • the present invention was completed by identifying a new Komagataeibacter rhaeticus KOSS15 strain, and identifying that the strain has high cellulose production capacity when cultured in a culture medium containing honey as a sugar source . Was done.
  • cellulose refers to a polysaccharide in which ⁇ -D-glucose forms a polymer through a glucoside bond, the formula is (C 6 H 10 O 5 ) n, and the unit is cellobiose. do.
  • bacterial cellulose refers to cellulose produced by culturing bacteria.
  • the term "honey” is a viscous substance collected by bees collected from wheat plants of plants, and includes a high content of glucose and fructose, as well as a substance containing various vitamin, protein, and mineral components.
  • the culture medium composition for culturing the bacterial cellulose production strain of the present invention contains a sugar.
  • the present invention provides a medium composition for culturing a bacterial cellulose-producing strain comprising (a) honey, or (b) glucose and fructose as sugars.
  • the honey is honey, acacia honey, or wildflower honey (honey).
  • the type and concentration of the sugar source is (a) 0.1 to 5 volumes (v / v) of honey or (b) glucose and fructose 0.1 to 5% by weight (w / v).
  • the medium composition of the present invention is 0.1-5% by volume of honey, 0.1-4% by volume, 0.1-3% by volume, 0.1-2.5% by volume, 0.1-2% by volume, 0.1-1.5% It is included in a concentration of volume% or 0.1 to 1% by volume.
  • the medium composition of the present invention contains 0.1 to 3.0% by volume of honey, 0.2 to 3.0% by volume, 0.3 to 3.0% by volume, 0.4 to 3.0% by volume, 0.5 to 3.0% by volume, 0.6 to 3.0% Volume%, 0.7-3.0 volume%, 0.8-3.0 volume%, 0.9-3.0 volume%, 1-3.0 volume%, 0.1-2.0 volume%, 0.2-2.0 volume%, 0.3-2.0 volume%, 0.4-2.0 volume% , 0.5 to 2.0 vol%, 0.6 to 2.0 vol%, 0.7 to 2.0 vol%, 0.8 to 2.0 vol%, 0.9 to 2.0 vol%, 0.1 to 1.9 vol%, 0.1 to 1.8 vol%, 0.1 to 1.7 vol%, 0.1 To 1.6 vol%, 0.1 to 1.5 vol%, 0.1 to 1.4 vol%, 0.1 to 1.3 vol%, 0.1 to 1.2 vol%, 0.1 to 1.1 vol%, 0.2 to 1.8 vol%, 0.2 to 1.6 vol%, 0.2 to 1.4 Volume%, 0.1 to 1.3 vol
  • the medium composition of the present invention is a combination of glucose and fructose 0.1 to 5% by weight, 0.1 to 4% by weight, 0.1 to 3% by weight, 0.1 to 2.5% by weight, 0.1 to 2% by weight , 0.1 to 1.5% by weight, or 0.1 to 1% by weight.
  • the medium composition of the present invention comprises 0.1 to 3.0% by weight of glucose and fructose, 0.2 to 3.0% by weight, 0.3 to 3.0% by weight, 0.4 to 3.0% by weight, 0.5 to 3.0% by weight , 0.6 to 3.0 wt%, 0.7 to 3.0 wt%, 0.8 to 3.0 wt%, 0.9 to 3.0 wt%, 1 to 3.0 wt%, 0.1 to 2.0 wt%, 0.2 to 2.0 wt%, 0.3 to 2.0 wt%, 0.4 To 2.0 wt%, 0.5 to 2.0 wt%, 0.6 to 2.0 wt%, 0.7 to 2.0 wt%, 0.8 to 2.0 wt%, 0.9 to 2.0 wt%, 0.1 to 1.9 wt%, 0.1 to 1.8 wt%, 0.1 to 1.7 Wt%, 0.1-1.6 wt%, 0.1-1.5 wt%, 0.1-1.4 wt%, 0.1-1.3
  • the medium composition of the present invention comprises glucose and fructose in a weight ratio of 2: 3.
  • the 2: 3 ratio is derived from the ratio of glucose and fructose contained in royal jelly.
  • the medium composition for culturing the bacterial cellulose production strain of the present invention further includes proline.
  • the proline is 0.01 to 1.0 wt%, 0.02 to 1.0 wt%, 0.03 to 1.0 wt%, 0.04 to 1.0 wt%, 0.05 to 1.0 wt%, 0.06 to 1.0 wt%, 0.07 to 1.0 wt% to the medium composition of the present invention , 0.08 to 1.0 wt%, 0.01 to 0.8 wt%, 0.01 to 0.6 wt%, 0.01 to 0.4 wt%, 0.01 to 0.2 wt%, 0.02 to 0.6 wt%, 0.03 to 0.6 wt%, 0.04 to 0.6 wt%, 0.05 To 0.4 wt%, 0.06 to 0.3 wt%, 0.04 to 0.3 wt%, 0.04 to 0.2 wt%, or 0.05 to 0.15 wt%, but is not limited thereto.
  • the fructose, glucose, and proline are the main sugars and amino acids constituting the royal jelly, and in the cultivation of the Komagatabacter larcus KOSS15 strain, the main sugar and amino acids (proline) constituting the royal jelly instead of honey are added to bacterial cellulose. Can be produced.
  • the culture medium composition for culturing a cellulose-producing strain of the present invention may further include a carbon source, a nitrogen source, and a phosphorus source in addition to the above-described components.
  • the carbon source is one selected from the group consisting of ethanol, glucose, sucrose, fructose, galactose, soluble stark, inositol, glycerol, xylose, dextrose, lactose, dextrin, adonitol, mannitol, mannose, maltose, and raffinose.
  • the above carbon sources include, but are not limited to.
  • the nitrogen source is at least one organic nitrogen source selected from the group comprising yeast extract, peptone, soytone, casamino acid, tryptone and malt extract, NH 4 Cl, (COONH 4 ) 2 , NH 4 H 2 PO 4 , (NH 4 ) 2 HPO 4 , NH 4 NO 3 , NaNO 3 and (NH 4 ) 2 SO 4 includes at least one inorganic nitrogen source selected from the group comprising, but is not limited to.
  • the personnel includes, but is not limited to, one or more personnel selected from the group comprising potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, and disodium hydrogen phosphate.
  • the culture medium composition for culturing the cellulose-producing strain is MgSO 4 , CaCl 2 , KCl, BaCl 2 , Li 2 SO 4 , MnSO, MnSO 4 , ZnSO 4 , FeSO 4 , Na 2 MoO 4 , KH 2 to add trace elements.
  • PO 4 and FeCl 3 may be further included, but are not limited thereto.
  • the medium may further include cellulase.
  • the cellulase is added to prevent the phenomenon of pellicle when culturing the cellulose-producing strain, and when adding cellulase during the cultivation of acetobacter xylinum IFO13693, a bad sheet is generated and cannot be applied, but the coma of the present invention In the case of the Gatebacter larcus KOSS15 strain, pellicle formation can be prevented, and the quality of the sheet becomes better.
  • the medium composition containing the cellulase may be used for pre-cultivation of cellulose-producing strains.
  • pre-cultivation refers to a step of culturing a cellulose-producing strain in a relatively small scale (eg, 100 L or less) to activate or increase the cellulosic-producing strain.
  • the pre-culture medium may include 0.0005 to 0.05% by weight, 0.001 to 0.05% by weight, 0.003 to 0.05% by weight, 0.001 to 0.03% by weight, 0.001 to 0.02% by weight, or 0.001 to 0.01% by weight of cellulase.
  • the pre-culture medium (proliferation medium) composition is 0.1 to 10.0% by weight of yeast extract, 0.002 to 0.2% by weight of MgSO 4, 0.002 to 0.2% by weight of CaCl 2 , 0.2 to 20.0% by weight of ethanol % And cellulase from 0.0005 to 0.05% by weight or combinations thereof.
  • the pre-culture medium is 0.2 to 20.0 wt% of ethanol, 0.5 to 20.0 wt%, 1.0 to 20.0 wt%, 1.5 to 20.0 wt%, 1.0 to 20.0 wt%, 1.0 to 17.0 wt%, 1.0 to 14.0 wt%, 1.0 To 11.0 wt%, 1.0 to 8.0 wt%, 1.0 to 5.0 wt%, or 1.0 to 3.0 wt%.
  • the culture medium composition for culturing the bacterial cellulose production strain of the present invention may further include MgSO 4 , CaCl 2 , sodium acetate and acetic acid, or a combination thereof.
  • the medium may be used for main culture or sheet conversion culture (sheet production) of bacterial cellulose sheets.
  • main culture refers to a large scale (eg, 500 L or more and 50,000 L or less) of bacterial cellulose-producing strains up to the stage immediately before “sheet conversion culture” in which the “pre-cultured” culture medium is actually producing a bacterial cellulose sheet. Means to incubate with.
  • sheet conversion culture refers to a step in which the bacterial cellulose producing strain produces a bacterial cellulose sheet by statically culturing the main culture solution containing the bacterial cellulose producing strain.
  • composition of the MgSO 4 0.002 to 0.2% by weight, 0.005 to 0.2% by weight, 0.008 to 0.2% by weight, 0.01 to 0.2% by weight, 0.013 to 0.2% by weight, 0.015 to 0.2% by weight, 0.01 to 0.15% by weight, 0.01 to 0.1 wt%, 0.01 to 0.05 wt%, 0.01 to 0.03 wt% or 0.015 to 0.03 wt%.
  • the composition is 0.002 to 0.2% by weight of CaCl 2 , 0.005 to 0.2% by weight, 0.008 to 0.2% by weight, 0.01 to 0.2% by weight, 0.013 to 0.2% by weight, 0.015 to 0.2% by weight, 0.01 to 0.15% by weight, 0.01 to 0.1 wt%, 0.01 to 0.05 wt%, 0.01 to 0.03 wt% or 0.015 to 0.03 wt%.
  • the composition is 0.01 to 1.0 wt% sodium acetate, 0.02 to 1.0 wt%, 0.03 to 1.0 wt%, 0.04 to 1.0 wt%, 0.05 to 1.0 wt%, 0.06 to 1.0 wt%, 0.07 to 1.0 wt%, 0.08 to 1.0 wt%, 0.01 to 0.8 wt%, 0.01 to 0.6 wt%, 0.01 to 0.4 wt%, 0.01 to 0.2 wt%, 0.02 to 0.6 wt%, 0.03 to 0.6 wt%, 0.04 to 0.6 wt%, 0.05 to 0.4 wt% %, 0.06 to 0.3% by weight, 0.04 to 0.3% by weight, 0.04 to 0.2% by weight, or 0.05 to 0.15% by weight.
  • the composition may include 0.02 to 2.0 wt%, 0.05 to 2.0 wt%, 0.1 to 2.0 wt%, 0.15 to wt%, 0.1 to 1.5 wt%, 0.1 to 1.0 wt% or 0.1 to 0.5 wt% acetic acid.
  • composition for culturing a bacterial cellulose-producing strain of the present invention can produce bacterial cellulose by culturing bacteria having a cellulosic production ability.
  • the bacterium is a strain of K. mycobacteracter Lactus KOSS15 with accession number KCCM12270P.
  • the strain of Mycobacterium bacterium Lattice KOSS15 is derived from black tea mushroom strain (kombucha).
  • the black tea mushroom species are called by many names such as gombucha, black tea mushroom yeast, red mushroom, and longevity mushroom. It is a type of organic acid-producing bacteria (lactic acid bacteria) in which bacteria and yeast coexist with a thread-like hyphae.
  • Black tea mushrooms are bacteria and Bretanomyces that increase the acidity by fermenting alcohol produced by yeast such as acetobacter xylinum with acetic acid and other acids, and Zygosaccharomyces ( Zygosaccharomyces). It is a symbiosis of yeasts such as Candida, Skizosaccharomyces and Saccharomyces.
  • the present invention provides a composition for culturing a bacterial cellulose-producing strain.
  • Komagatabacter laticus Komagataeibacter rhaeticus
  • KOSS15 strain When culturing KOSS15 strain, high cellulose that can reduce the amount of sugar required to prepare cellulose sheets of the same weight 5-6 times compared to acetobacter xylinum , which is known as the microorganism having the best yield of cellulose production It represents production capacity.
  • Figure 1 shows the phylogenetic tree of the Komaga bacterial Lactus KOSS15 strain.
  • Figure 2 shows the production process of cellulose using a strain of Komaga bacterial Lactus KOSS15.
  • Figure 3 schematically shows the manufacturing process of the cellulosic sheet through passage culture of the Komaga bacterial bacterium Lacusis KOSS15 strain.
  • Figure 4 shows a cellulose sheet prepared through the cultivation of the Komaga bacterial Bacillus KOSS15 strain.
  • FIG. 5 shows the cellulose sheet of Comagathebacter laticus KOSS15 and Acetobacter xylinum IFO13693 according to cellulase treatment.
  • Figure 6 shows an image of a cellulose sheet prepared by Komaga tate bacterium Laticus KOSS15 according to the honey concentration in the medium.
  • Figure 7 shows an image of a cellulose sheet prepared by Komaga tate bacterium Laticus KOSS15 according to the type of honey in the medium.
  • % used to indicate the concentration of a specific substance, unless otherwise specified, solids / solids (weight / weight)%, solids / liquids (weight / volume)%, and The liquid / liquid is (volume / volume)%.
  • bacteria were taken from one experimental group, and 2% glucose, 1% yeast extract, 0.02% magnesium sulfate, 0.02% calcium chloride, and 1.8% agar were added.
  • an agar medium was prepared.
  • One of the five liquids (agar green tea mushrooms of Jirisan) selected from 5 liquids of agar medium was spread on 0.1 ml and cultured at 28 ° C for 7 days.
  • a medium solution containing 60 ml of glucose 2%, yeast extract 1%, magnesium sulfate 0.02%, and calcium chloride 0.02% was sterilized. Then, 10 ml of the sterilized medium solution was dispensed, and 6 colonies were inoculated therein.
  • Acetobactor xylinum (IFo13693) was used as a control for comparing the cellulose bioconversion efficiency of Komagateibacter laticus KOSS15.
  • the acetobacter xylinum is a representative cellulose production strain.
  • Acetobacter xylinum IFO13693 was inoculated with 2.0x10 7 CFU / ml in a culture medium containing 2% glucose, 1.0% yeast extract, 0.02% MgSO 4, 0.02% CaCl 2 and 2% ethanol, and 160 rpm under 30 ° C at Flask. It was stirred and pre-incubated for 48 hours.
  • the slurry (residue) produced from the pre-culture was filtered through an 80 mesh sieve and inoculated with 10% of the main culture.
  • the main culture medium was prepared by adding glucose 3%, MSG ((monosodium glutamate) 0.5%, MgSO 4 0.02%, CaCl 2 0.02%, sodium acetate 0.1% and acetic acid 0.2%. Incubated for 48 hours under the condition of vvm (aeration volume / medium volume / minute).
  • acetobacter xylinum IFO13693 was inoculated and mixed with 5-10% of the culture medium and dispensed into a tray, and incubated for 3 days at 0 rpm and 0.3 vvm conditions to induce cellulose sheet conversion (FIG. 2 and 3).
  • the prepared cellulose sheet was dehydrated, and 0.1% of NaOH was treated to remove and wash the excess strain.
  • 5% of sodium percarbonate was treated to remove proteins and impurities and washed to obtain a sheet (FIG. 4).
  • KOSS15 was inoculated at 1.0x10 8 CFU / ml and pre-incubated for 48 hours at 80-160 rpm under stirring at 30 ° C in Flask. The cellulase was added to prevent the phenomenon of pellicle during pre-cultivation, and when the cellulase was added to the pre-culture medium of acetobacter xylinum IFO13693 in (1), a bad sheet was generated and was not applied ( Fig. 5).
  • the whole culture was inoculated 10% compared to the main culture medium.
  • the main culture medium was prepared by adding sugar (0.6% fructose and 0.4% glucose; or 1% honey), 0.1% proline, 0.02% MgSO 4, 0.02% CaCl 2 , 0.1% sodium acetate, and 0.2% acetic acid.
  • the main culture was incubated with stirring at 48 rpm and 0.3 vvm for 48 hours.
  • the cellulose sheet produced by the Komagateibacter laticus KOSS15 is characterized in that when the sheet is first immersed in an aqueous NaOH solution before dehydration, the sheet becomes hard and the strength is excellent. There was.
  • the washed cellulose sheets were flattened, cut to 18.15x18.15 cm, and weighed. After the measurement, the dried oven was dried at 95 ° C for 1 hour, and the weight was measured to obtain the weight before and after drying.
  • the content of sugar in the medium of Table 1 below refers to the content of sugar in the culture medium during cellulosic sheet conversion culture.
  • the comagatabacter laticus KOSS15 can reduce the content of sugar in the medium by about 6 times compared to acetobacter xylinum IFO13693.
  • fructose and glucose contained in a ratio of 3: 2 instead of honey were used as sugar sources, an equivalent effect was exhibited.
  • the content of the constituent sugars of the cellulose sheet was confirmed.
  • the tensile strength of the sheet was measured using a tester applying a constant speed elongation method (20 mm / min) to the sheet (KS M ISO 1924-2).
  • wet burst strength of the sheet was measured by increasing the fluid pressure (KS M ISO 2758).
  • Cellulose sheets were prepared in the same manner as in Example 2, except that 0.3% of honey, 0.5% of honey, and 1.0% of honey were used as shown in Table 4 below, respectively, as shown in Table 4 below. .
  • the types and contents of sugar in the medium were measured according to the concentration of honey before and after cultivation, and the physical properties of the cellulose sheets produced by the concentration of honey contained in the medium were compared (Table 4).
  • the sugar source of the medium used in the sheet conversion culture step is 0.5% of specification honey, 0.5% of acacia honey, and 0.5% of wild flower honey (hybrid honey) as shown in Table 5 below.
  • a cellulose sheet was produced in the same manner as in Example 2, except that one was used. The type and content of sugar in the medium were measured according to the type of honey before and after cultivation, and the dry weight of the cellulose sheet produced by the type of honey contained in the medium was compared.

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Abstract

본 발명은 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에 코마가테이박터 래티커스(Komagataeibacter rhaeticus) KOSS15 균주를 배양하는 경우, 종래 셀룰로오스의 생산 수율이 가장 우수한 미생물로 알려진 아세토박터 자일리넘과 비교하여 동일한 중량의 셀룰로오즈 시트를 제조하는데 필요한 당원의 함량을 5-6배 절감할 수 있는 높은 셀룰로오스 생산능을 나타낸다.

Description

박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 조성물
본 특허출원은 2018년 9월 17일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2018-0111101호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 조성물에 관한 것이다.
화장품 분야에서 사용되는 시트(sheet) 타입의 마스크는 크게, (i) 코튼 및 펄프와 같은 식물성 셀룰로오스 섬유나 나일론 및 듀폰과 같은 합성 섬유로 만든 부직포를 화장유액의 담수체에 담가 마스크 모양의 지지체로 사용하는 셀룰로오스 마스크, (ii) 천연 아가(agar), 카라기난, 로커스트빈검과 같은 천연 다당체로 만든 하이드로겔마스크, 및 (iii) 미생물 배양을 통해 만들어진 박테리아 셀룰로오스(bacterial cellulose, biocellulose)를 이용하여 화장품용 담수체에 담가 마스크 모양의 지지체로 사용하는 박테리아 셀룰로오스 마스크의 3가지 타입이 있다.
이처럼 화장품 분야에서 사용되는 시트 타입의 마스크팩은 손으로 바를 필요 없이 얼굴 형태로 제작된 시트를 붙이는 것으로서 가장 큰 장점으로는 보습 및 청정 효과 등을 얻을 수 있기 때문에 화장품 시장에서의 각광을 받고 있다.
미생물 배양을 통해 만들어진 셀룰로오스(일명, 박테리아 셀룰로오스)는 의약품용 화상치유제나 화장용 마스크 팩의 소재로 최근 들어 그 활용도가 높아지고 있다. 셀룰로오스는 자연계에 가장 풍부한 생체물질 자원이며 특히, 초산균이 생성하는 셀룰로오스는 식품의 첨가제뿐만 아니라 고부가가치의 산업용 신소재로 많은 주목을 받고 있다. 또한, 박테리아가 생성하는 셀룰로오스는 식물체가 생성하는 셀룰로오스와 달리 물리화학적 성질이 뛰어나다.
일반적인 박테리아 셀룰로오스의 제조는 주로 감귤 착즙과 같은 과일주스의 배양액에서의 균체 배양을 통해서 이루어진다. 박테리아 셀룰로오스의 생산 균주로 아세토박터(Acetobacter)속, 라이조비움(Rhizobium)속, 그리고 아그로박터(Agrobacterium)속 등이 있으며, 생산수율이 우수한 균주로 아세토박터 자일리늄이 가장 많이 알려져 있다(한국등록특허 제10-0405776호)이다.
이러한 박테리아 셀룰로오스를 생산하는 미생물의 셀룰로오스 생산 효율은 그 배양 배지의 조성에 영향을 받으며, 따라서, 미생물의 셀룰로오스 생산효율을 향상시킬 수 있는 배양용 조성물의 개발이 절실히 필요한 실정이다.
본 발명자들은 박테리아의 셀룰로오스 생산효율을 향상시킬 수 있는 배양용 조성물을 개발하고자 새로운 균주의 발굴 및 배양액의 당원에 따른 박테리아 셀룰로오스의 품질 및 생산 효율 변화를 연구하였다. 그 결과, 신규한 코마가테이박터 래티커스(Komagataeibacter rhaeticus) KOSS15 균주를 동정하고, 상기 균주가 꿀을 당원으로 하는 배양 배지에서 배양되는 경우에 높은 셀룰로오스 생산능을 가짐을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 꿀, 또는 포도당 및 과당의 당원; 및 (b) 프롤린을 포함하는 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 박테리아의 셀룰로오스 생산효율을 향상시킬 수 있는 배양용 조성물을 개발하고자 새로운 균주의 발굴 및 배양액의 당원에 따른 박테리아 셀룰로오스의 품질 및 생산 효율 변화를 연구하였다. 그 결과, 신규한 코마가테이박터 래티커스(Komagataeibacter rhaeticus) KOSS15 균주를 동정하고, 상기 균주가 꿀을 당원으로 하는 배양 배지에서 배양되는 경우에 높은 셀룰로오스 생산능을 가짐을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 명세서에서 용어"셀룰로오스(cellulose)"는 β-D-글루코오스가 글루코시드 결합을 통해 중합체를 이루고, 화학식은 (C6H10O5)n이고, 단위체는 셀로비오스(cellobiose)인 다당류를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "박테리아 셀룰로오스"는 박테리아의 배양에 의해 제조된 셀룰로오스를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "꿀"은 꿀벌들이 식물의 밀선(蜜腺)에서 수집한 점도성 있는 물질로서 높은 함량의 포도당, 과당을 포함하며 이외에 다양한 비타민, 단백질, 미네랄 성분을 포함하는 물질을 의미한다.
본 발명의 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 배지 조성물은 당원을 포함한다.
본 발명은 (a) 꿀, 또는 (b) 포도당 및 과당을 당원으로 포함하는 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 꿀은 사양꿀, 아카시아꿀, 또는 야생화꿀(잡꿀)이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 당원의 종류 및 농도는 (a) 꿀 0.1~5 부피(v/v) 또는 (b) 포도당 및 과당 0.1~5 중량%(w/v)이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 배지 조성물은 꿀을 0.1~5 부피%, 0.1~4 부피%, 0.1~3 부피%, 0.1~2.5 부피%, 0.1~2 부피%, 0.1~1.5 부피%, 또는 0.1~1부피%의 농도로 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 배지 조성물은 꿀을 0.1 내지 3.0 부피%, 0.2 내지 3.0 부피%, 0.3 내지 3.0 부피%, 0.4 내지 3.0 부피%, 0.5 내지 3.0 부피%, 0.6 내지 3.0 부피%, 0.7 내지 3.0 부피%, 0.8 내지 3.0 부피%, 0.9 내지 3.0 부피%, 1 내지 3.0 부피%, 0.1 내지 2.0 부피%, 0.2 내지 2.0 부피%, 0.3 내지 2.0 부피%, 0.4 내지 2.0 부피%, 0.5 내지 2.0 부피%, 0.6 내지 2.0 부피%, 0.7 내지 2.0 부피%, 0.8 내지 2.0 부피%, 0.9 내지 2.0 부피%, 0.1 내지 1.9 부피%, 0.1 내지 1.8 부피%, 0.1 내지 1.7 부피%, 0.1 내지 1.6 부피%, 0.1 내지 1.5 부피%, 0.1 내지 1.4 부피%, 0.1 내지 1.3 부피%, 0.1 내지 1.2 부피%, 0.1 내지 1.1 부피%, 0.2 내지 1.8 부피%, 0.2 내지 1.6 부피%, 0.2 내지 1.4 부피% 또는 0.2 내지 1.2 부피% 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 배지 조성물은 포도당 및 과당을 도합 0.1~5 중량%, 0.1~4 중량%, 0.1~3 중량%, 0.1~2.5 중량%, 0.1~2 중량%, 0.1~1.5 중량%, 또는 0.1~1중량%의 농도로 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 배지 조성물은 포도당 및 과당을 도합 0.1 내지 3.0 중량%, 0.2 내지 3.0 중량%, 0.3 내지 3.0 중량%, 0.4 내지 3.0 중량%, 0.5 내지 3.0 중량%, 0.6 내지 3.0 중량%, 0.7 내지 3.0 중량%, 0.8 내지 3.0 중량%, 0.9 내지 3.0 중량%, 1 내지 3.0 중량%, 0.1 내지 2.0 중량%, 0.2 내지 2.0 중량%, 0.3 내지 2.0 중량%, 0.4 내지 2.0 중량%, 0.5 내지 2.0 중량%, 0.6 내지 2.0 중량%, 0.7 내지 2.0 중량%, 0.8 내지 2.0 중량%, 0.9 내지 2.0 중량%, 0.1 내지 1.9 중량%, 0.1 내지 1.8 중량%, 0.1 내지 1.7 중량%, 0.1 내지 1.6 중량%, 0.1 내지 1.5 중량%, 0.1 내지 1.4 중량%, 0.1 내지 1.3 중량%, 0.1 내지 1.2 중량%, 0.1 내지 1.1 중량%, 0.2 내지 1.8 중량%, 0.2 내지 1.6 중량%, 0.2 내지 1.4 중량% 또는 0.2 내지 1.2 중량% 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 배지조성물은 포도당 및 과당을 2:3의 중량 비율로 포함한다. 상기 2:3의 비율은 로얄젤리에 포함된 포도당 및 과당의 비율에서 도출한 것이다.
또한, 본 발명의 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 배지 조성물은 프롤린을 추가적으로 포함한다. 상기 프롤린은 본 발명의 배지 조성물에 0.01 내지 1.0 중량%, 0.02 내지 1.0 중량%, 0.03 내지 1.0 중량%, 0.04 내지 1.0 중량%, 0.05 내지 1.0 중량%, 0.06 내지 1.0 중량%, 0.07 내지 1.0 중량%, 0.08 내지 1.0 중량%, 0.01 내지 0.8 중량%, 0.01 내지 0.6 중량%, 0.01 내지 0.4 중량%, 0.01 내지 0.2 중량%, 0.02 내지 0.6 중량%, 0.03 내지 0.6 중량%, 0.04 내지 0.6 중량%, 0.05 내지 0.4 중량%, 0.06 내지 0.3 중량%, 0.04 내지 0.3 중량%, 0.04 내지 0.2 중량% 또는 0.05 내지 0.15 중량% 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 과당, 포도당 및 프롤린은 로얄젤리를 구성하는 주요당 및 아미노산으로, 코마가테이박터 래티커스 KOSS15 균주의 배양에 있어 꿀 대신 로얄젤리를 구성하는 주요당 및 아미노산(프롤린)을 첨가하여 박테리아 셀룰로오스를 제조할 수 있다.
본 발명의 셀룰로오스 생산 균주 배양용 배지 조성물은 상술한 성분 이외에 탄소원, 질소원 및 인(phosphorus)원을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 탄소원은 에탄올, 글루코스, 수크로스, 프록토스, 갈락토오스, 솔루블스타크, 이노시톨, 글리세롤, 자일로스, 덱스트로스, 락토오스, 덱스트린, 아도니톨, 만니톨, 만노스, 말토오스 및 라피노스로 이루어지는 군 중에서 선택된 하나 이상의 탄소원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 질소원은 효모 추출물, 펩톤, 소이톤, 카사미노산, 트립톤 및 맥아 추출물을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유기 질소원, NH4Cl, (COONH4)2, NH4H2PO4, (NH4)2HPO4, NH4NO3, NaNO3및 (NH4)2SO4를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 무기 질소원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 인원은 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 인산이수소나트륨 및 인산수소이나트륨을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 셀룰로오스 생산 균주 배양용 배지 조성물은 미량요소를 첨가하기 위하여, MgSO4, CaCl2, KCl, BaCl2, Li2SO4, MnSO, MnSO4, ZnSO4, FeSO4, Na2MoO4, KH2PO4 및 FeCl3을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 배지는 셀룰라아제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 셀룰라아제는 셀룰로오스 생산 균주의 배양시 펠리클(pellicle)이 생기는 현상을 방지하기 위해 첨가되는 것이며, 아세토박터 자일리넘 IFO13693의 배양시에는 셀룰라아제를 첨가하면 불량시트가 생성되어 적용될 수 없으나, 본 발명의 코마가테이박터 래티커스 KOSS15 균주의 경우 펠리클(pellicle)이 생기는 현상을 방지할 수 있고, 시트의 품질에 더 우수해진다.
본 발명에 있어서, 상기 셀룰라아제를 포함하는 배지 조성물은 셀룰로오스 생산균주의 전배양을 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어, “전배양”이란, 셀룰로오스 생산 균주를 활성화 또는 증균시키기 위하여 스탁된 셀룰로오스 생산 균주를 비교적 소량의 규모(예컨대 100 L 이하)로 배양하는 단계를 의미한다.
상기 전배양 배지는 셀룰라아제를 0.0005 내지 0.05 중량%, 0.001 내지 0.05 중량%, 0.003 내지 0.05 중량%, 0.001 내지 0.03 중량%, 0.001 내지 0.02 중량% 또는 0.001 내지 0.01 중량% 포함할 수 있다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 상기 전배양 배지(증균용 배지) 조성물은 효모추출물 0.1 내지 10.0 중량%, MgSO4 0.002 내지 0.2 중량%, CaCl2 0.002 내지 0.2 중량%, 에탄올 0.2 내지 20.0 중량% 및 셀룰라아제 0.0005 내지 0.05 중량% 또는 이들의 조합을 포함한다.
상기 전배양 배지는 에탄올을 0.2 내지 20.0 중량%, 0.5 내지 20.0 중량%, 1.0 내지 20.0 중량%, 1.5 내지 20.0 중량%, 1.0 내지 20.0 중량%, 1.0 내지 17.0 중량%, 1.0 내지 14.0 중량%, 1.0 내지 11.0 중량%, 1.0 내지 8.0 중량%, 1.0 내지 5.0 중량% 또는 1.0 내지 3.0 중량% 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 배지 조성물은 MgSO4, CaCl2, 초산나트륨 및 초산, 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 상기 배지는 박테리아 셀룰로오스 시트의 본배양 또는 시트전환배양(시트 생산)용도로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어, “본배양”이란 “전배양”된 배양액을 실제 박테리아 셀룰로오스 시트를 생산하는 “시트전환 배양” 바로 전 단계에 이르기 까지 박테리아 셀룰로오스 생산 균주를 대규모(예컨대 500 L 이상 50,000 L 이하)로 배양하는 단계를 의미한다.
본 명세서에서 용어 “시트전환 배양”은 박테리아 셀룰로오스 생산 균주를 포함하는 본배양액을 정치 배양하여 박테리아 셀룰로오스 생산 균주가 박테리아 셀룰로오스 시트를 생산하는 단계를 의미한다.
상기 조성물은 MgSO4을 0.002 내지 0.2 중량%, 0.005 내지 0.2 중량%, 0.008 내지 0.2 중량%, 0.01 내지 0.2 중량%, 0.013 내지 0.2 중량%, 0.015 내지 0.2 중량%, 0.01 내지 0.15 중량%, 0.01 내지 0.1 중량%, 0.01 내지 0.05 중량, 0.01 내지 0.03 중량% 또는 0.015 내지 0.03 중량% 포함할 수 있다.
상기 조성물은 CaCl2을 0.002 내지 0.2 중량%, 0.005 내지 0.2 중량%, 0.008 내지 0.2 중량%, 0.01 내지 0.2 중량%, 0.013 내지 0.2 중량%, 0.015 내지 0.2 중량%, 0.01 내지 0.15 중량%, 0.01 내지 0.1 중량%, 0.01 내지 0.05 중량, 0.01 내지 0.03 중량% 또는 0.015 내지 0.03 중량% 포함할 수 있다.
상기 조성물은 초산나트륨을 0.01 내지 1.0 중량%, 0.02 내지 1.0 중량%, 0.03 내지 1.0 중량%, 0.04 내지 1.0 중량%, 0.05 내지 1.0 중량%, 0.06 내지 1.0 중량%, 0.07 내지 1.0 중량%, 0.08 내지 1.0 중량%, 0.01 내지 0.8 중량%, 0.01 내지 0.6 중량%, 0.01 내지 0.4 중량%, 0.01 내지 0.2 중량%, 0.02 내지 0.6 중량%, 0.03 내지 0.6 중량%, 0.04 내지 0.6 중량%, 0.05 내지 0.4 중량%, 0.06 내지 0.3 중량%, 0.04 내지 0.3 중량%, 0.04 내지 0.2 중량% 또는 0.05 내지 0.15 중량% 포함할 수 있다.
상기 조성물은 초산을 0.02 내지 2.0 중량%, 0.05 내지 2.0 중량%, 0.1 내지 2.0 중량%, 0.15 내지 중량%, 0.1 내지 1.5 중량%, 0.1 내지 1.0 중량% 또는 0.1 내지 0.5 중량% 포함할 수 있다.
본 발명의 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 조성물은 셀룰로오스 생산능을 갖는 박테리아를 배양함으로써 박테리아 셀룰로오스를 제조할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 박테리아는 수탁번호 KCCM12270P인 코마이가테이박터 래티커스 KOSS15 균주이다. 상기 코마이가테이박터 래티커스 KOSS15 균주는 홍차버섯종균(kombucha) 유래이다.
홍차버섯종균은 곰부차, 홍차버섯효모, 홍버섯, 장수버섯 등 여러 이름으로 불리며, 박테리아와 효모가 실 같은 균사를 모체로 공생하는 유기산생성균(유산균)의 일종이다. 홍차버섯종균은 아세토박터 자이리눔(A. xylinum)과 같은 효모에 의해 생성된 알코올을 아세트산 및 다른 산으로 발효시켜 산성을 증가시키는 박테리아 및 브레타노마이세스(Brettanomyces), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces). 칸디다(Candida), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 및 사카로마이세스(Saccharomyces)와 같은 효모의 공생체이다.
본 발명은 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에 코마가테이박터 래티커스(Komagataeibacter rhaeticus) KOSS15 균주를 배양하는 경우, 종래 셀룰로오스의 생산 수율이 가장 우수한 미생물로 알려진 아세토박터 자일리넘과 비교하여 동일한 중량의 셀룰로오즈 시트를 제조하는데 필요한 당원의 함량을 5-6배 절감할 수 있는 높은 셀룰로오스 생산능을 나타낸다.
도 1은 코마가테이박터 래티커스 KOSS15 균주의 계통수를 나타낸다.
도 2는 코마가테이박터 래티커스 KOSS15 균주를 이용한 셀룰로오스 제조과정을 나타낸다.
도 3은 코마가테이박터 래티커스 KOSS15 균주의 계대 배양을 통한 셀룰로오스시트의 제조과정을 모식도로 나타낸다.
도 4는 코마가테이박터 래티커스 KOSS15 균주의 배양을 통해 제조한 셀룰로오스 시트를 나타낸다.
도 5는 셀룰라아제 처리에 따른 코마가테이박터 래티커스 KOSS15 및 아세토박터 자일리넘 IFO13693의 셀룰로오스 시트를 나타낸다.
도 6은 배지 내 꿀 농도에 따른 코마가테이박터 래티커스 KOSS15에 의해 제조된 셀룰로오스 시트의 이미지를 나타낸다.
도 7은 배지 내 꿀 종류에 따른 코마가테이박터 래티커스 KOSS15에 의해 제조된 셀룰로오스 시트의 이미지를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
1. 균주 선별
물 1L에 현미녹차 3팩을 우려내어 설탕을 30%(w/v) 첨가하고, 플라스크에 500 ml씩 분주한 다음, 121℃에서 30분간 멸균 및 냉각하였다. 입수한 홍차버섯종균액 5종류(베트남 홍차버섯; 지리산 녹차 홍차버섯; 보성녹차 홍차버섯; 중국 운남성 홍차버섯; 티벳 홍차 버섯)를 각각 10%(v/v) 접종하여 인큐베이터에서 28℃ 조건에서 정치 배양하였다. 배양 2주부터 셀룰로오즈가 형성되는 것을 확인한 후, 한 개의 실험구에서 균을 취하여 포도당 2%, 효모 추출물 1%, 황산마그네슘 0.02%, 염화칼슘 0.02% 및 한천 1.8%을 첨가하였다. 초산으로 배지의 pH가 4.0이 되도록 조절한 후, 한천배지를 제조하였다. 한천배지의 5개액 중 선발된 한 개의 액(지리산 녹차 홍차버섯)을 0.1 ml 도말하여 28℃에서 7일 동안 배양하였다. 형태와 균모양이 동일한 콜로니를 6개 그룹으로 분리한 후 60 ml의 포도당 2%, 효모 추출물 1%, 황산마그네슘 0.02% 및 염화칼슘 0.02%를 포함하는 배지 액을 멸균하였다. 그 후, 멸균한 배지액을 10 ml씩 분주하고, 여기에 6개의 콜로니를 각각 접종하였다.
28℃에서 3일간 배양한 후, 40 ml에 초산 전배양 배지를 만들고 3일 배양한 4 ml의 액을 초산 전배양 배지에 넣고 28℃에서 정치배양하여 4일 후 셀룰로오즈가 형성되는 형태를 관찰하였다. 최종적으로, 셀룰로오즈 형태가 양호한 콜로니를 표시하고 균 스탁을 제조하였다. 6개의 실험구 중 가장 형성이 잘된 콜로니를 칭하여 KOSS15로 명명하고 한국미생물보존센터에 특허기탁하여 수탁번호 KCCM12270P를 부여받았다.
2. 균주 배양
(1) 아세토박터 자일리넘 (Acetobactorxylinum) IFO13693 균주의 배양
1) 전배양(1계대)
코마가테이박터 래티커스 KOSS15의 셀룰로오스 생물전환 효율을 비교하기 위한 대조군으로 아세토박터 자일리넘(Acetobactor xylinum)IFO13693를 이용하였다. 상기 아세토박터 자일리넘은 대표적인 셀룰로오스 생산 균주이다.
포도당 2%, 효모추출물 1.0%, MgSO4 0.02%, CaCl2 0.02% 및 에탄올 2%를 포함하는 배양배지에 아세토박터 자일리넘 IFO13693를 2.0x107 CFU/ml로 접종하여 Flask에서 30℃하에 160 rpm으로 교반하며 48 시간 동안 전배양하였다.
2) 본배양(2계대)
이어서 전배양물에서 생성된 슬러리(찌꺼기)를 80 mesh의 체로 여과하고 본배양액 대비 10%를 접종하였다. 상기 본배양 배지는 포도당 3%, MSG((monosodium glutamate) 0.5%, MgSO4 0.02%, CaCl2 0.02%, 초산나트륨 0.1% 및 초산 0.2%를 첨가하여 제조하였다. 상기 본배양은 0 rpm, 0.3 vvm (aeration volume/medium volume/minute)의 조건으로 48시간 동안 정치배양 하였다.
3) 시트전환 배양(본배양액 혼합 및 트레이 분주) 및 세척
마지막으로, 아세토박터 자일리넘 IFO13693의 상기 본배양물을 배양배지 대비 5-10% 접종 및 혼합하여 트레이에 분주하고 0 rpm 및 0.3 vvm 조건에서 3일 동안 정치 배양하여 셀룰로오스 시트 전환을 유도하였다(도 2 및 3). 배양이 끝난 후 제조된 셀룰로오스 시트를 탈수시킨 뒤, NaOH 0.1%를 처리하여 여분의 균주를 제거하고 세척하였다. 그 다음 과탄산나트륨 5%를 처리하여 단백질 및 불순물을 제거하고 세척하여 시트를 수득하였다(도 4).
(2) 코마가테이박터 래티커스 KOSS15 (KCCM12270P)의 배양
1) 전배양(1계대)
당원(과당 0.6% 및 포도당 0.4%; 또는 꿀 1%), 효모추출물 1.0%, MgSO4 0.02%, CaCl2 0.02%, 에탄올 2% 및 셀룰라아제 0.005%를 포함하는 배양배지에 코마가테이박터 래티커스 KOSS15를 1.0x108 CFU/ml로 접종하여 Flask에서 30℃ 하에 80-160 rpm으로 교반하며 48 시간 동안 전배양하였다. 상기 셀룰라아제는 전배양 시 펠리클(pellicle)이 생기는 현상을 방지하기 위해 첨가하였으며, 상기 (1)의 아세토박터 자일리넘 IFO13693의 전배양 배지에는 셀룰라아제를 첨가하는 경우에 불량시트가 생성되어 적용하지 않았다(도 5).
2) 본배양(2계대)
다음으로 전배양물을 본배양 배지 대비 10% 접종하였다. 상기 본배양 배지는 당원(과당 0.6% 및 포도당 0.4%; 또는 꿀 1%), 프롤린 0.1%, MgSO4 0.02%, CaCl2 0.02%, 초산나트륨 0.1% 및 초산 0.2%를 첨가하여 제조하였다. 상기 본배양은 80 rpm, 0.3 vvm 의 조건으로 48시간 동안 교반 배양하였다.
3) 시트전환 배양(본배양액 혼합 및 트레이 분주) 및 세척
마지막으로 코마가테이박터 래티커스 KOSS15의 본배양물을 배양배지 대비 5-10% 접종 및 혼합하여 트레이에 분주하고 0 rpm 및 0.3 vvm 조건에서 2일 동안 정치 배양하여 셀룰로오스 시트 전환을 유도하였다(도 2 및 3). 배양이 끝난 후, NaOH 0.1%를 하룻밤(overnight) 처리하여 여분의 균주를 제거하고 탈수시킨 뒤 세척하였다. 이어서 과탄산나트륨 5%를 처리하여 단백질 및 불순물을 제거하고 세척하여 시트를 수득하였다(도 4). 상기 코마가테이박터 래티커스 KOSS15이 생산한 셀룰로오스 시트는, 아세토박터 자일리넘 IFO13693이 생산한 셀룰로오스 시트와 달리, 시트를 탈수하기 전에 NaOH 수용액에 먼저 침지하는 경우 시트가 단단해지면서 강도가 우수해진다는 특징이 있었다.
3. 셀룰로오스 시트의 제조
3.1. 배지 내 당원의 종류 및 함량에 따른 셀룰로오스시트의 건조중량
세탁된 셀룰로오즈 시트를 평평하게 펴서 18.15x18.15 cm로 자른 후, 무게를 측정하였다. 측정 후, 건조오븐에서 95℃, 1시간 건조하고 무게를 측정하여 건조 전후의 무게를 구하였다.
하기 표 1의 배지내 당원의 함량은 셀룰로오스 시트 전환 배양 시의 배양배지 내 당원의 함량을 의미한다.
균종 배지내 당원의 함량 셀룰로오스시트의 건조 중량(18.15cm x 18.15cm당 g)
K.rhaeticus KOSS15 꿀 0.3%(과당 0.18%+포도당 0.12%) 0.22
꿀 0.5%(과당 0.3%+포도당 0.2%) 0.35
꿀 1.0%(과당 0.6%+포도당 0.4%) 0.55
A.xylinum IFO13693 포도당 2.0% 0.25
포도당 3.0% 0.30
포도당 5.0% 0.53
따라서, 동일한 중량의 시트를 제조하는 경우, 코마가테이박터 래티커스 KOSS15는 아세토박터 자일리넘 IFO13693과 비교하여 배지 내 당원의 함량을 약 6배 절감할 수 있음을 확인하였다. 또한, 꿀 대신 3:2의 비율로 포함된 과당 및 포도당을 당원으로 사용한 경우에도 동등한 효과가 나타남을 확인하였다.
3.2. 배지 내 당원 및 함량에 따른 셀룰로오스 시트의 구성
셀룰로오스 시트의 구성당의 함량을 확인하였다.
균주 및 당원 당원 포도당(%) 셀로비오스(%) 기타(%) 시트형성상태
A. xylinum IFO13693 포도당2.5% 18.9 54.7 26.4 양호
과당2.5% 16.4 58.9 24.7 양호
설탕2.5% - - - 불량
꿀2.5% - - - 불량
K. rhaeticus KOSS15 포도당2.5% 22.6 65.0 12.4 불량
과당2.5% 27.7 67.1 5.2 양호
설탕2.5% - - - 불량
꿀2.5% 32.3 59.4 8.3 양호
3.3. 배지 내 당원에 따른 셀룰로오스 시트의 물성
시트를 정속 신장률법(20 mm/min)을 적용하는 실험기를 사용하여 시트의 인장강도를 측정하였다(KS M ISO 1924-2).
또한, 유체압력을 증가시켜 시트의 습윤 파열 강도를 측정하였다(KS M ISO 2758).
균주 및 당원 습윤 인장강도-세로 (kN/m) 습윤 신장률-세로 (%) 습윤 파열강도(kPa) 시트형성상태
A.xylinum IFO13693(포도당) 0.32 7.9 149 양호
A.xylinum IFO13693(과당) 0.49 12.5 104 양호
A.xylinum IFO13693(설탕) - - - 불량
A.xylinum IFO13693(꿀) - - - 불량
K. rhaeticus KOSS15(포도당) 1.30 9.0 193 불량
K. rhaeticus KOSS15(과당) 0.41 6.2 68 양호
K. rhaeticus KOSS15(설탕) - - - 불량
K. rhaeticus KOSS15 (꿀) 1.03 9.1 264 양호
3.4. 배지 내 꿀 농도에 따른 구성당 및 셀룰로오스 시트의 물성 비교
시트전환 배양 단계에서 사용되는 배지의 당원의 종류 및 함량을 각각 하기 표 4와 같이 꿀 0.3%, 꿀 0.5%, 꿀 1.0%로 한 것을 제외하고 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 셀룰로오스 시트를 제작하였다. 배양 전후의 꿀 농도에 따른 배지 내 당원의 종류 및 함량을 측정하였으며, 배지내 함유된 꿀의 농도별로 제작된 셀룰로오스 시트의 물성을 비교하였다(표 4).
꿀 농도 단계 과당(%) 포도당(%) 설탕(%) 건조중량(g) 시트물성
0.3% 배양전 0.14 0.00 0.03 - 촉감양호, 미끌미끌함
배양후 0.11 0.00 0.06 0.22
0.5% 배양전 0.23 0.07 0.05 - 촉감양호, 미끌미끌함
배양후 0.13 0.00 0.06 0.35
1.0% 배양전 0.45 0.21 0.08 - 촉감양호, 두꺼운느낌
배양후 0.17 0.00 0.10 0.55
표 4에 나타낸 바와 같이, 배지 내 함유된 꿀의 농도에 비례하여 구성당의 비율 및 시트의 건조중량이 증가됨을 확인하였다.
3.5. 배지 내 꿀의 종류에 따른 구성당 및 셀룰로오스 시트의 건조중량 비교
꿀의 종류에 따른 셀룰로오스 시트의 생산 효율을 확인하기 위하여, 시트전환 배양 단계에서 사용되는 배지의 당원을 각각 하기 표 5와 같이 사양꿀 0.5%, 아카시아꿀 0.5%, 야생화꿀(잡꿀) 0.5%로 한 것을 제외하고 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 셀룰로오스 시트를 제작하였다. 배양 전후의 꿀의 종류에 따른 배지 내 당원의 종류 및 함량을 측정하였으며, 배지내 함유된 꿀의 종류별로 제작된 셀룰로오스 시트의 건조중량을 비교하였다.
결과는 표 5에 나타내었다.
꿀 종류 샘플상태 과당(%) 포도당(%) 설탕(%) 건조중량(g)
사양꿀 멸균전 0.27 0.18 0.00 0.31
멸균후 0.22 0.13 0.00
배양후 0.08 0.00 0.18
아카시아꿀 멸균전 0.27 0.14 0.00 0.42
멸균후 0.24 0.13 0.00
배양후 0.10 0.00 0.17
야생화꿀(잡꿀) 멸균전 0.28 0.14 0.00 0.44
멸균후 0.24 0.13 0.00
배양후 0.08 0.00 0.16
표 5에 나타낸 바와 같이, 셀룰로오스 제작에 이용되는 꿀의 종류에 따른 건조 중량(생산효율)은 모두 우수한 것으로 확인되었으나, 그 중에서도 아카시아꿀과 야생화꿀(잡꿀)이 더 우수하였으며, 야생화꿀(잡꿀)이 가장 우수함을 확인하였다(도 6 및 7).
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM12270P
수탁일자 : 20180530
Figure PCTKR2019012010-appb-I000001

Claims (10)

  1. (a) 꿀, 또는 (b) 포도당 및 과당의 당원; 및 프롤린을 포함하는 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 배지 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 꿀은 사양꿀, 아카시아꿀, 또는 야생화꿀인, 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 배지 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 포도당 및 과당은 2:3의 중량 비율로 포함되는, 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 배지 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프롤린은 0.01 내지 1.0 중량%의 농도로 포함되는, 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 배지 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 셀룰라아제를 추가적으로 포함하는, 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 배지 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 배지는 박테리아 셀룰로오스 생산 균주의 증균용인, 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 배지 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 MgSO4, CaCl2, 초산나트륨 및 초산, 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함하는, 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 배지 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 배지는 박테리아 셀룰로오스 시트 생산용인, 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 배지 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 셀룰로오스 생산 균주는 코마가테이박터 래티커스(Komagataeibacter rhaeticus) 균주인, 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 배지 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 셀룰로오스 생산 균주는 코마가테이박터 래티커스(Komagataeibacter rhaeticus) 균주인, 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 배지 조성물.
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