WO2020060264A1 - 설포라판 유도체를 포함하는 근위축 및 근감소 예방, 치료 또는 개선용 조성물 - Google Patents

설포라판 유도체를 포함하는 근위축 및 근감소 예방, 치료 또는 개선용 조성물 Download PDF

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    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing, treating or improving muscle atrophy and muscle loss, comprising a sulforaphane derivative.
  • the present invention was made with the support of the Korean government under Task No. 1345272268 of the Korea Research Foundation, "Study on the Anti-Atrophy Effect and Mechanism of Sulforaphane and Its Derivatives in Cancerous Cachexia".
  • Muscle atrophy refers to the loss of muscle cell and muscle tissue size and mass in various catabolic conditions due to hormonal imbalance, severe injury, sepsis, cancer and aging. Muscular atrophy causes muscle loss, causing muscle weakness and fatigue, and exacerbating complications. Muscle atrophy is diagnosed through creatine kinase (CK), electromyography, muscle biopsy, molecular biological genetic testing, and cytogenetic testing.
  • CK creatine kinase
  • electromyography muscle biopsy
  • molecular biological genetic testing cytogenetic testing.
  • cytogenetic testing Currently, as a method for treating muscular dystrophy, physical therapy is generally performed, and occupational therapy, respiratory therapy, and supportive therapy for the prevention of complications, malformations, and functional disorders are combined, but such therapy is symptomatic therapy. In view of its limitations, the development of therapeutic agents for muscular dystrophy is urgent.
  • Dexamethasone is used to treat various diseases such as cancer, but the ubiquitin-proteasome system reduces the rate of protein synthesis in skeletal muscle and increases the rate of proteolysis, causing muscle atrophy.
  • Two muscle ubiquitin ligase are related to Atrogin-1 and MuRF1, and dexamethasone lowers myoD (myogenic differentiation antigen) through Atrogin-1, and the muscle mass decreases through this mechanism.
  • glucoraphanin is a glucosinolate (glucosinolate) compound found in young shoots such as broccoli and cauliflower, which is known to exhibit anti-cancer and antibacterial activity, but has yet to be reported for muscle atrophy improvement activity. There is no bar.
  • DL-Sulforaphane N-acetyl-L-cysteine DL-Sulforaphane N-acetyl-L-cysteine
  • berteroin is known to inhibit the growth and metastasis of tumor cells, but has not been reported about the activity of improving muscle atrophy.
  • the present inventor completed the present invention by conducting a study to find a therapeutic agent that can effectively improve muscle atrophy and muscle loss.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating muscle atrophy comprising a sulforaphane derivative.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating muscular dystrophy, comprising administering the composition to a subject.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving muscle atrophy comprising a sulforaphane derivative.
  • One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating muscle atrophy comprising a sulforaphane derivative.
  • the sulforaphane derivatives are glucoraphanin, DL-sulforapan N-acetyl-L-cysteine (DL-Sulforaphane N-acetyl-L-cysteine) and verteroin It may be any one compound selected from the group consisting.
  • the muscular atrophy may be caused by any one selected from the group consisting of cancerous cachexia, muscle reduction, aging, obesity, long-term administration of steroid drugs, and space flight.
  • the steroid agent may be dexamethasone.
  • Another aspect of the present invention provides a method of treating muscular dystrophy, comprising administering the composition to a subject.
  • Another aspect of the present invention provides a food composition for preventing or improving muscle atrophy comprising a sulforaphane derivative.
  • the sulforaphane derivative may be any one compound selected from the group consisting of glucopyranin, DL-sulforapane N-acetyl-L-cysteine and verteroin.
  • the muscular atrophy may be caused by any one selected from the group consisting of cancerous cachexia, muscle reduction, aging, obesity, long-term administration of steroid drugs, and space flight.
  • the steroid agent may be dexamethasone.
  • composition for the prevention, treatment or improvement of muscle atrophy and muscle reduction which includes a sulforaphane derivative, it is possible to effectively suppress muscle atrophy without being toxic to C2C12 cells, and thus can be usefully used for prevention, treatment or improvement of muscle atrophy. .
  • Figure 1 shows the cytotoxicity by concentration (0.01, 0.1, 1, 5 and 10 ⁇ M) and hourly (24 hours (A) and 48 hours (B)) of glucoraphanin for C2C12 myoblasts (myoblast) It is a graph.
  • Figure 2 is a graph showing the cytotoxicity by concentration (0.01, 0.1, 1, 5 and 10 ⁇ M) and hourly (24 hours (A) and 48 hours (B)) of glucorapanin for C2C12 myotube.
  • FIG. 3 shows four major myosin heavy chain (MHC) MHCIIb (A), MHCIb (B), and MHCIIa (C2C12 root canal cells according to the concentration of glucoraphanin by concentration (1, 5, and 10 ⁇ M) treatment.
  • MHC myosin heavy chain
  • MHCIIb A
  • B MHCIb
  • MHCIIa C2C12 root canal cells according to the concentration of glucoraphanin by concentration (1, 5, and 10 ⁇ M) treatment.
  • C) and MHCIIx (D) are graphs showing mRNA levels.
  • FIG. 4 shows muscle differentiation markers MyoD (A), Myogenin (B) and muscle atrophy markers Atrogin-1 (C) according to the concentration (1, 5 and 10 ⁇ M) treatment of glucopanin in C2C12 myotubes (myotube). ), Is a graph showing the mRNA level of MuRF1 (D).
  • FIG. 5 shows muscle atrophy following glucopanin (1, 5 and 10 ⁇ M) alone, or simultaneous treatment of glucorapanin (0, 1, 5 and 10 ⁇ M) and dexamethasone (DEX) (5 ⁇ M) in C2C12 myotube. It is a graph showing the mRNA levels of the markers Atrogin-1 (A) and MuRF1 (B).
  • Figure 6 is a diagram showing the analysis of the levels of Atrogin-1, MuRF1 and MyoD according to the treatment of dexamethasone (DEX) and glucorapanin, or glucoraphanin alone by Western blot.
  • DEX dexamethasone
  • Figure 7 is a diagram showing the analysis of the level of p-Akt (S473) according to the treatment of dexamethasone (DEX) and glucorapanin, or glucorapanin alone by Western blot.
  • DEX dexamethasone
  • FIG. 8 is a diagram showing the levels of FOXO1 and FOXO3a according to treatment with dexamethasone (DEX) and glucorapanin, or glucorapanin alone, by Western blot.
  • DEX dexamethasone
  • FIG. 9 is a picture of MHC fluorescence staining analysis showing myotube cells according to treatment with dexamethasone (DEX) and glucorapanin, or glucorapanin alone.
  • DEX dexamethasone
  • FIG. 10 DL-Sulforaphane N-acetyl-L-cysteine (DL-Sulforaphane N-acetyl-L-cysteine: SFN-NAC) for C2C12 myoblast (A) and myotube (B) It is a graph showing cytotoxicity by concentration (0.01, 0.1, 1, 5 and 10 ⁇ M).
  • FIG. 11 shows four major myosin heavy chain (MHC) MHCIIb (A), MHCIb (B) according to treatment of 1 ⁇ M DL-sulforapane N-acetyl-L-cysteine (NAC) on C2C12 root canal cells. It is a graph showing the mRNA levels of MHCIIa (C) and MHCIIx (D).
  • MHC myosin heavy chain
  • FIG. 12 shows muscle differentiation markers MyoD (A), Myogenin (B) and muscle atrophy markers Atrogin-1 according to treatment of 1 ⁇ M DL-sulfolapan N-acetyl-L-cysteine (NAC) on C2C12 myotubes (myotube).
  • A muscle differentiation markers MyoD
  • B Myogenin
  • Atrogin-1 muscle atrophy markers Atrogin-1 according to treatment of 1 ⁇ M DL-sulfolapan N-acetyl-L-cysteine (NAC) on C2C12 myotubes (myotube).
  • C It is a graph showing the mRNA level of MuRF1 (D).
  • FIG. 13 shows C2C12 myotube 1 ⁇ M DL-sulforapane N-acetyl-L-cysteine (SFN-NAC) alone, or DL-sulforapane N-acetyl-L-cysteine (0, 0.1 and 1 ⁇ M) and dexamethasone (DEX) ) (5 ⁇ M) is a picture showing the analysis of p-Akt (S473), Atrogin-1, MuRF1 and MyoD levels by Western blot.
  • SFN-NAC DL-sulforapane N-acetyl-L-cysteine
  • DEX dexamethasone
  • FIG. 14 is a MHC fluorescence staining analysis picture showing the root canal cells according to the treatment of dexamethasone (DEX) and DL-sulforapane N-acetyl-L-cysteine or DL-sulforapane N-acetyl-L-cysteine alone.
  • DEX dexamethasone
  • 15 is a graph showing the cytotoxicity (0.01, 0.1, 1, 5 and 10 ⁇ M) by concentration of berteroin for C2C12 myoblast (A) and myotube (B).
  • Figure 16 is a graph showing the mRNA levels of MHCIIb, MHCIb, MHCIIa and MHCIIx, four major myosin heavy chains (MHC), according to treatment of 1 ⁇ M verteroin in C2C12 root canal cells.
  • MHC myosin heavy chains
  • 17 is a graph showing the mRNA levels of muscle differentiation markers MyoD, Myogenin and muscle atrophy markers Atrogin-1 and MuRF1 according to treatment of 1 ⁇ M verteroin on C2C12 myotubes (myotube).
  • FIG. 18 is Atrogin, a muscle atrophy marker according to the simultaneous treatment of verteroin (BTR) (1 ⁇ M) with C2C12 myotube (myotube), or simultaneous treatment of verteroin (0, 0.1 and 1 ⁇ M) and dexamethasone (DEX) (5 ⁇ M)
  • BTR verteroin
  • DEX dexamethasone
  • FIG. 19 shows p-Akt, p-mTOR, and p- following the simultaneous treatment of C2C12 myotubes with 1 ⁇ M verteroin alone or with verteroin (0, 0.1 and 1 ⁇ M) and dexamethasone (DEX) (5 ⁇ M). It is a figure showing the levels of p70S6K1, p-4E-BP1 (A), FOXO1 / FOXO3a / Smad3 (B) and ubiquitin (C) analyzed by Western blot.
  • FIG. 20 is a picture (B) of MHC fluorescence staining analysis showing root canal cells according to the treatment of dexamethasone (DEX) and verteroin or verteroin alone (A) and MHC levels by Western blot.
  • DEX dexamethasone
  • A verteroin or verteroin alone
  • One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating muscle atrophy comprising a sulforaphane derivative.
  • muscle atrophy refers to the size and mass loss of muscle cells and muscle tissue, and such muscular atrophy is in a state of inability to move for a long time due to aging, severe disease, nerve damage, etc. It may be caused by various causes such as disability.
  • Sulforaphane is a compound represented by the following Chemical Formula 1, and is an isothiocyanate contained in cruciferous vegetables such as cauliflower, broccoli, kale, and cabbage.
  • the sulforaphane derivative of the present invention may include sulforaphane and a precursor of sulforaphane.
  • the sulforaphane derivatives are glucoraphanin, DL-sulforapan N-acetyl-L-cysteine (DL-Sulforaphane N-acetyl-L-cysteine) and verteroin It may be any one compound selected from the group consisting.
  • the sulforaphane derivative of the present invention may be a compound represented by the following Chemical Formula 2, glucorapanine.
  • the sulforaphane derivative of the present invention may be DL-sulforapane N-acetyl-L-cysteine, which is a compound represented by Formula 3 below.
  • the sulforaphane derivative of the present invention may be verteroin, which is a compound represented by Chemical Formula 4 below.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier included in the pharmaceutical composition of the present invention is commonly used in the manufacture of pharmaceuticals, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin , Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil. It is not limited.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., a lubricant, a wetting agent, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington: the science and practice of pharmacy 22nd edition (2013).
  • the pharmaceutical composition according to an embodiment of the present invention may be administered with a substance that is active in the prevention or treatment of one or more muscular dystrophy.
  • composition according to an embodiment of the present invention may be used alone or in combination with methods using procedures, hormonal therapy, drug therapy and / or biological response modifiers for the treatment of muscular dystrophy.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include various bases and / or additives necessary and appropriate for the formulation of the formulation, and non-ionic surfactants, silicone polymers, extenders, flavors, preservatives within a range that does not impair the effect. , Fungicides, oxidation stabilizers, organic solvents, ionic or nonionic thickeners, softening agents, antioxidants, free radical destroyers, opacifying agents, stabilizers, emollients, silicones, ⁇ -hydroxy acids, antifoaming agents, moisturizers , Vitamins, insect repellents, fragrances, preservatives, surfactants, anti-inflammatory agents, substance P antagonists, fillers, polymers, propellants, basicizing or acidifying agents, or coloring agents.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the invention are variously prescribed by factors such as formulation method, mode of administration, patient's age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and response sensitivity. Can be.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be 0.001 to 1000 mg / kg on an adult basis.
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in various dosage forms when administered orally, and may be administered in the form of solid preparations such as pills, powders, granules, tablets or capsules, and various excipients, such as wetting agents and sweeteners. , Fragrances, preservatives, and the like.
  • solid preparations such as pills, powders, granules, tablets or capsules
  • excipients such as wetting agents and sweeteners. , Fragrances, preservatives, and the like.
  • the composition of the present invention when formulated in the form of a powder, granule, tablet or capsule, it may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in its preparation.
  • the carrier, excipients and diluents include, for example, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and / or mineral oil may be used, but is not limited thereto.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc., which are generally used for formulation, may be prepared, and in addition to the excipients, lubricants such as magnesium stearate or talc may be further included. .
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a variety of formulations when parenterally administered, the solid formulation includes tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and liquid formulations include suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups In addition to water, liquid, and paraffin, which are commonly used simple diluents, various excipients may be included, for example, wetting agent sweeteners, fragrances, and preservatives.
  • formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions and lyophilized preparations.
  • non-aqueous solvent and a suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used.
  • calcium or vitamin D3 may be added to improve the efficacy of the therapeutic agent.
  • compositions can be presented in unit-dose (single serving) or multi-dose (several servings) containers, e.g., sealed ampoules and vials, and immediately before use in sterile liquid carriers, e.g. water for injection. Can be stored under freeze-drying conditions requiring only the addition of.
  • sterile liquid carriers e.g. water for injection.
  • Instant use and suspending agents can be prepared from sterile powders, granules and tablets.
  • the muscular atrophy may be caused by any one selected from the group consisting of cancerous cachexia, muscle reduction, aging, obesity, long-term administration of steroid drugs, and space flight.
  • the steroid agent may be dexamethasone.
  • Atrophy occurs in a variety of catabolic conditions, including hormonal imbalance, severe injury, sepsis, cancer, obesity, space flight and / or aging.
  • decomposition of muscle-related proteins is promoted by administration of dexamethasone.
  • Glucorapanin, DL-sulforapane N-acetyl-L-cysteine and verteroin contained in the pharmaceutical composition of the present invention can inhibit such atrophy, particularly, muscle atrophy caused by dexamethasone. It can be useful in the prevention or treatment of.
  • Another aspect of the present invention provides a method of treating muscular dystrophy, comprising administering the composition to a subject.
  • Sulforaphane derivatives specifically, glucorapanin, DL-sulforapane N-acetyl-L-cysteine and verteroin show remarkable improvement effects on muscle atrophy, and therefore, a composition comprising the compound as an active ingredient in a muscular dystrophy patient By administration, treatment of muscular dystrophy is possible.
  • Another aspect of the present invention provides a food composition for preventing or improving muscle atrophy comprising a sulforaphane derivative.
  • the sulforaphane derivative may be any one compound selected from the group consisting of glucopyranin, DL-sulforapane N-acetyl-L-cysteine and verteroin.
  • composition of the present invention is prepared as a food composition, in addition to sulforaphane derivatives as an active ingredient, for example, glucopyranin, DL-sulporaphane N-acetyl-L-cysteine or verteroin, it is usually added during food preparation
  • Ingredients may include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavoring agents.
  • carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides, etc .; And polysaccharides, for example, conventional sugars such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • flavoring agents natural flavoring agents (tauumatin, stevia extract (eg, rebaudioside A, glycyrrhizine, etc.)) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • the food composition of the present invention is prepared as a drink agent
  • the sulforaphane derivatives of the present invention specifically, glucorapanin, DL-sulporaphane N-acetyl-L-cysteine or verteroin, citric acid, liquid fructose, sugar , Glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, beetle extract, jujube extract and / or licorice extract may be further included.
  • the food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, coloring agents and neutralizing agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alginic acid and It may contain salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonic acid used in carbonated beverages, and the like.
  • various nutrients vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, coloring agents and neutralizing agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alginic acid and It may contain salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonic acid used in carbonated beverages, and the like.
  • ingredients may be used independently or in combination, and the proportion of these additives may be selected from 0 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the food composition of the present invention, but is not limited thereto.
  • the muscular atrophy may be caused by any one selected from the group consisting of cancerous cachexia, muscle reduction, aging, obesity, long-term administration of steroid drugs, and space flight.
  • the steroid agent may be dexamethasone.
  • Example 1 Method for analyzing the effect of improving muscular dystrophy
  • C2C12 myoblast was purchased from American Type Culture Collection (ATCC), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin (P / S) Medium), and cultured at 37 ° C under 5% CO 2 conditions. To induce differentiation into myotubes, when C2C12 myoblasts were 80% confluent, the medium was changed daily for 4 days with DMEM containing 2% FBS and 1% P / S. .
  • ATCC American Type Culture Collection
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's
  • FBS fetal bovine serum
  • P / S penicillin-streptomycin
  • glucoraphanin at a concentration of 1, 5, 10 ⁇ M
  • DL-Sulforaphane N-acetyl-L-cysteine at a concentration of 0.1, 1 ⁇ M
  • concentration at 0.1, 1 ⁇ M Root canal cells were treated with berteroin.
  • muscle atrophy was induced using 5 ⁇ M dexamethasone, and dexamethasone was treated alone or simultaneously with glucopyranin, DL-sulfoparapan N-acetyl-L-cysteine, or verteroin.
  • the root canal cells are divided into 100 ⁇ l of 2 ⁇ 10 5 cells / ml C2C12 myoblasts in 96-well plates, differentiated for 4 days in differentiation medium, and then glucopyranin, DL-sulfolapan N-acetyl-L-cysteine, or Bertheroin was treated with 0.01, 0.1, 1, 5 and 10 ⁇ M in each well, and cultured for 24 hours or 48 hours at 37 ° C. under 5% CO 2 .
  • MTT 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazolium bromide
  • Sigma a solution of MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazolium bromide) (Sigma) was added to each well so that the final concentration was 2 mg / ml.
  • 100 ⁇ l of DMSO was added and stirred.
  • UV absorbance was measured at 570 nm using a microplate reader (Molecular Device, Sunnyvale, Cam USA). The cell viability (%) was expressed as a percentage of the absorbance value of the normal control group not treated with glucoraphanin.
  • RNA expression was analyzed using a LightCycler96 real-time PCR instrument (Roche, Basel, Switzerland). The forward and reverse primer sequences used are shown in Table 1 below.
  • Example 1-1 After washing the root canal cells of Example 1-1 with PBS, RIPA buffer containing the protease inhibitor cocktail (GenDEPOT, Barker, TX, USA) and phosphatase inhibitor cocktail (GenDEPOT, Barker, TX, USA) (Thermo Scientific, Rockford , IL, USA).
  • the lysate was boiled in sample buffer [50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.14 M 2-mercaptoethanol, 10% glycerol, and 0.001% bromophenol blue] and then separated by electrophoresis.
  • sample buffer 50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.14 M 2-mercaptoethanol, 10% glycerol, and 0.001% bromophenol blue
  • the sample was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to PVDF membrane, and then phosphate-buffered saline (PBS) containing Tween-20 in 5% skim milk powder. Blocked. Then, Atrogin-1, MyoD, MuRF1, Akt, p-Akt (S473), mTOR, p-mTOR, p-p70S6K1, p-4EBP1, FOXO1, p-FOXO1, FOXO3a, p-FOXO3a, Smad3, p- The primary antibody against Smad3, ubiquitin, MHC and ⁇ -tubulin (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) was incubated overnight at 4 ° C., and then reacted with the secondary antibody for 1 hour at room temperature. Antibody-antigen complexes were detected using an enhanced chemiluminescent kit (Pierce, Rockford, IL, USA), and signal intensity was measured using a Fusion Solo 2 image image analyzer
  • Example 1-1 After the root canal cells of Example 1-1 were grown on the cover glass, the cover glass was washed with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes. After fixing, Triton-X100 was washed three times for 5 minutes with PBS containing 0.2%, and blocked with 5% BSA at 37 ° C for 30 minutes.
  • the MHC antibody (MF20, Developmental Studies Hybridoma Bank, IA, USA) was diluted 1: 100 in 2% BSA and treated at 4 ° C for 12 hours.
  • Triton-X100 was washed three times for 5 minutes with PBS containing 0.2%, and glucopyranin and DL-sulfolapan N-acetyl-L-cysteine were goat anti mouse IgG-FITC (Invitrogen, IL, USA).
  • Loin was diluted 1: 200 in goat anti mouse IgG-Alexa Fluor 568 (Invitrogen, IL, USA) at 2% BSA and treated at 37 ° C for 1 hour.
  • the cover glass treated in this way was mounted using a fluorescent mount solution (Fluoroshield with DAPI, Sigma, MO, USA) containing DAPI on the microscope slide.
  • Results were expressed as mean ⁇ standard deviation (SD). After one-way ANOVA was performed using GraphPad PRISM (GraphPad Software, San Diego, CA, USA), statistical significance between each group was post-tested with Tukey's multiple comparison test, resulting in a P value of 0.05. When less than, it was considered significant.
  • Example 1-2 For myoblasts and myotubes, in order to confirm the cell viability according to glucopyranin treatment, Example 1-2 was performed, and the effect of glucopyranin on cell viability was analyzed.
  • the four major myosin heavy chains represent muscle types and muscle metabolism. Therefore, after the glucorapanin treatment, in order to confirm the expression change of the myosin heavy chain, mRNA levels of four major myosin heavy chains were analyzed by performing Examples 1-3.
  • MyoD and Myogenin are markers of muscle differentiation, and Atrogin-1 and MuRF1 are markers of muscle atrophy. Therefore, after glucopanin treatment, mRNA levels for these markers were analyzed by performing Examples 1-3 to confirm muscle differentiation and muscular atrophy.
  • Example 1-4 was performed to perform the level of p-Akt (S473) and downstream of Akt ( downstream) The levels of target FOXO1 and FOXO3a were analyzed.
  • C2C12 myotubes were analyzed by MHC fluorescence staining according to Example 1-5 to confirm muscle differentiation and muscle atrophy.
  • Example 1-2 For myoblasts and myotubes, in order to confirm the cell viability according to DL-sulforapane N-acetyl-L-cysteine treatment, Example 1-2 was performed, and DL-sulforapane N-acetyl-L-cysteine was used for cell viability. The impact was analyzed.
  • the four major myosin heavy chains represent muscle types and muscle metabolism. Therefore, after the DL-sulforapane N-acetyl-L-cysteine treatment, in order to confirm the expression change of the myosin heavy chain, mRNA levels of four major myosin heavy chains were analyzed by performing Examples 1-3.
  • MyoD and Myogenin are markers of muscle differentiation, and Atrogin-1 and MuRF1 are markers of muscle atrophy. Therefore, after the DL-sulforapane N-acetyl-L-cysteine treatment, mRNA levels for these markers were analyzed by performing Examples 1-3 to confirm muscle differentiation and muscular atrophy.
  • Akt signal activity is observed in most atrophy models.
  • Example 1-4 was performed to increase the level of p-Akt (S473). Analysis.
  • C2C12 myotube cells were analyzed by MHC fluorescence staining according to Example 1-5 to confirm muscle differentiation and muscular atrophy.
  • Example 1-2 For myoblasts and myotubes, in order to confirm the cell viability according to Berteroin treatment, Example 1-2 was performed, and the effect of Berteroin on cell viability was analyzed.
  • the four major myosin heavy chains represent muscle types and muscle metabolism. Therefore, after verteroin treatment, in order to confirm the expression change of the myosin heavy chain, mRNA levels of the four major myosin heavy chains were analyzed by performing Examples 1-3.
  • MyoD and Myogenin are markers of muscle differentiation
  • Atrogin-1 and MuRF1 are markers of muscle atrophy. Therefore, after verteroin treatment, in order to confirm muscle differentiation and muscular atrophy, mRNA levels for these markers were analyzed by performing Examples 1-3.
  • mRNA levels of MyoD, Myogenin, Atrogin-1 and MuRF1 measured after treatment with Berteroin, compared to mRNA levels of MyoD, Myogenin, Atrogin-1 and MuRF1 when not treated with Berteroin There was no significant difference in (Fig. 17).
  • the mRNA levels of Atrogin-1 and MuRF1 were significantly increased, confirming that muscular atrophy was induced, and when dexamethasone and verteroin were treated simultaneously, Atrogin-1 ( It was confirmed that mRNA levels of FIGS. 18A) and MuRF1 (FIG. 18B) were significantly reduced compared to the dexamethasone alone treatment group.
  • Akt Reduced Akt signal activity is observed in most atrophy models.
  • p-Akt S473 was performed by performing Examples 1-4 to confirm whether verteroin affects the Akt / mTOR signaling pathway involved in muscle-related protein synthesis.
  • p-mTOR, p-p70S6K1, p-4E-BP1 levels were analyzed.
  • FOXO3a is known to mediate signal transduction that modulates ubiquitin and Atrogin-1 / MAFbx expression. It is also known that MSTN (Myostatin) / Smad signal transduction inhibits muscle protein synthesis and activates muscle protein degradation to induce muscle atrophy.
  • MSTN Myostatin
  • Smad3a Smad3a signal transduction inhibits muscle protein synthesis and activates muscle protein degradation to induce muscle atrophy.
  • Example 1-4 was performed to perform FOXO1
  • the expression levels of FOXO3a, Smad3 and ubiquitin were analyzed.
  • the atrophy can be improved by using verteroin, and the verteroin improves the atrophy by activating Akt signaling.
  • C2C12 myotube cells were analyzed by MHC fluorescence staining according to Example 1-5 to confirm muscle differentiation and muscle atrophy.
  • protein levels for MHC markers were analyzed by performing Examples 1-4.
  • verteroin improves muscle atrophy by restoring root canal cells.

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Abstract

본 발명은 설포라판 유도체를 포함하는 근위축 및 근감소 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, C2C12 세포에 독성이 없으면서도, 근위축을 효과적으로 억제할 수 있으므로, 근위축 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

설포라판 유도체를 포함하는 근위축 및 근감소 예방, 치료 또는 개선용 조성물
본 발명은 설포라판 유도체를 포함하는 근위축 및 근감소 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 한국연구재단의 과제번호 1345272268, "암성 악액질에서 sulforaphane과 이의 유도체들의 항근위축 효능 및 기전 연구"에 따른 한국 정부의 지원을 받아 이루어졌다.
근위축(muscle atrophy)은 호르몬 불균형, 심한 부상, 패혈증, 암 및 노화로 인한 여러 가지 이화 상태(catabolic condition)에서 발생하는 근육세포와 근조직의 크기 및 질량적 손실을 의미한다. 근위축은 근육의 손실을 유발하여 근육 약화 및 피로감을 유발하고 합병증을 악화시킨다. 근위축은 크레아틴 키나아제(Creatine kinase: CK), 근전도검사, 근육생검, 분자생물학적 유전자검사, 세포유전학적 검사 등을 통해 진단이 이루어진다. 현재 근위축을 치료하기 위한 방법으로써, 물리치료가 일반적으로 수행되며, 합병증, 기형 및 기능 장애 예방을 위한 작업치료, 호흡치료 및 지지요법(supportive therapy)등이 병행되고 있으나, 이러한 치료는 대증요법으로써의 한계를 갖는다는 점에서, 근위축에 대한 치료제 개발이 절실한 상황이다.
근위축의 병인기전은 아직까지 명확히 규명되지 않았으며, 현재까지 근위축 발병의 주 원인으로 보고된 것으로써, 산화물질 증가에 의한 근세포 손상, 스트레스 단백질 발현 감소로 인한 근단백질 생성 및 재생 감소, 프로테아좀-유비퀴틴 활성화에 따른 근단백질 분해 촉진 등이 알려져 있다. 또한, 항염증제로 잘 알려진 합성 글루코코르티코이드인 덱사메타손(DEX)의 투여에 의하여 근육량과 관련된 단백질의 분해가 촉진된다는 사실이 많은 연구에서 보고되었다.
덱사메타손은 암과 같은 여러 질병을 치료하는데 사용되지만, 유비퀴틴-프로 테아좀 시스템을 통해 골격근에서 단백질 합성 속도를 감소시키고, 단백질 분해 속도를 증가시켜 근위축을 유발한다. 2개의 근육 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)는 Atrogin-1 및 MuRF1과 관련이 있는데, 덱사메타손은 Atrogin-1을 통해 MyoD(myogenic differentiation antigen)를 저하시키고, 이와 같은 기전을 통하여 근육량이 감소하게 된다.
따라서, 근위축, 특히 덱사메타손에 의해 유도되는 근위축을 치료하기 위한 치료제의 개발이 진행되고 있으나, 현재까지 근위축에 대한 효과적인 치료제는 개발되지 않은 상황이며, 노인성 근감소증(Sarcopenia)에 대해 미국 FDA 허가된 치료제도 전무한 상황으로, 향후 근감소증 관련 기술 분야 개발 선점을 위한 연구가 경쟁적으로 진행될 것으로 전망된다. 또한, 인구의 노령화, 우주개발 및 삶의 질을 추구하는 사회적 인식의 변화로 인하여, 근위축에 대한 치료제의 요구가 점차 증가할 것으로 예상되며, 세계 근육질환 치료제 시장은 노인인구 증가와 비례해 연평균 3.8%의 성장률로, 2020년 130억 달러 이상의 시장을 형성할 것으로 전망되고 있다.
한편, 글루코라파닌(glucoraphanin)은 브로콜리 및 콜리플라워 등의 어린 새싹에서 발견되는 글루코시놀레이트(glucosinolate) 화합물로써, 항암 및 항균활성을 나타내는 것으로 알려져 있으나, 근위축 개선 활성에 대해서는 아직까지 보고된 바 없다. 또한, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인(DL-Sulforaphane N-acetyl-L-cysteine)은 항암 및 항염증 활성을 나타내는 것으로 알려져 있으나, 근위축 개선 활성에 대해서는 아직까지 보고된 바 없다. 또한, 베르테로인(berteroin)은 종양 세포의 성장 및 전이를 억제하는 것으로 알려져 있으나, 근위축 개선 활성에 대해서는 아직까지 보고된 바 없다.
이에 본 발명자는 근위축 및 근손실을 효과적으로 개선할 수 있는 치료제를 발굴하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 설포라판 유도체를 포함하는 근위축(muscle atrophy) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 근위축의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 설포라판 유도체를 포함하는 근위축 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 설포라판 유도체를 포함하는 근위축(muscle atrophy) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 설포라판 유도체는 글루코라파닌(glucoraphanin), DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인(DL-Sulforaphane N-acetyl-L-cysteine) 및 베르테로인(berteroin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 근위축은 암성 악액질, 근감소, 노화, 비만, 스테로이드제 장기투여 및 우주비행으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의하여 발생하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 스테로이드제는 덱사메타손일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 근위축의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은 설포라판 유도체를 포함하는 근위축(muscle atrophy) 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 설포라판 유도체는 글루코라파닌, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인 및 베르테로인으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 근위축은 암성 악액질, 근감소, 노화, 비만, 스테로이드제 장기투여 및 우주비행으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의하여 발생하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 스테로이드제는 덱사메타손일 수 있다.
설포라판 유도체를 포함하는 근위축 및 근감소 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 따르면, C2C12 세포에 독성이 없으면서도, 근위축을 효과적으로 억제할 수 있으므로, 근위축 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 C2C12 근아세포(myoblast)에 대한 글루코라파닌(glucoraphanin)의 농도별(0.01, 0.1, 1, 5 및 10μM) 및 시간별(24시간(A) 및 48시간(B)) 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 C2C12 근관세포(myotube)에 대한 글루코라파닌의 농도별(0.01, 0.1, 1, 5 및 10μM) 및 시간별(24시간(A) 및 48시간(B)) 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 C2C12 근관세포에 글루코라파닌의 농도별(1, 5 및 10μM) 처리에 따른, 4종의 주요 미오신 중쇄(myosin heavy chain: MHC)인 MHCIIb(A), MHCIb(B), MHCIIa(C) 및 MHCIIx(D)의 mRNA 수준을 나타낸 그래프이다.
도 4는 C2C12 근관세포(myotube)에 글루코라파닌의 농도별(1, 5 및 10μM) 처리에 따른, 근육 분화 마커인 MyoD(A), Myogenin(B) 및 근위축 마커인 Atrogin-1(C), MuRF1(D)의 mRNA 수준을 나타낸 그래프이다.
도 5는 C2C12 근관세포(myotube)에 글루코라파닌(1, 5 및 10μM) 단독, 또는 글루코라파닌(0, 1, 5 및 10μM)과 덱사메타손(DEX)(5μM)의 동시 처리에 따른 근위축 마커인 Atrogin-1(A) 및 MuRF1(B)의 mRNA 수준을 나타낸 그래프이다.
도 6은 덱사메타손(DEX) 및 글루코라파닌, 또는 글루코라파닌 단독의 처리에 따른 Atrogin-1, MuRF1 및 MyoD의 수준을 웨스턴 블롯으로 분석하여 나타낸 그림이다.
도 7은 덱사메타손(DEX) 및 글루코라파닌, 또는 글루코라파닌 단독의 처리에 따른 p-Akt(S473)의 수준을 웨스턴 블롯으로 분석하여 나타낸 그림이다.
도 8은 덱사메타손(DEX) 및 글루코라파닌, 또는 글루코라파닌 단독의 처리에 따른 FOXO1 및 FOXO3a의 수준을 웨스턴 블롯으로 분석하여 나타낸 그림이다.
도 9는 덱사메타손(DEX) 및 글루코라파닌, 또는 글루코라파닌 단독의 처리에 따른 근관세포를 나타낸 MHC 형광염색분석 사진이다.
도 10은 C2C12 근아세포(myoblast)(A) 및 근관세포(myotube)(B)에 대한 DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인(DL-Sulforaphane N-acetyl-L-cysteine: SFN-NAC)의 농도별(0.01, 0.1, 1, 5 및 10μM) 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 11은 C2C12 근관세포에 1μM DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인(NAC)의 처리에 따른, 4종의 주요 미오신 중쇄(myosin heavy chain: MHC)인 MHCIIb(A), MHCIb(B), MHCIIa(C) 및 MHCIIx(D)의 mRNA 수준을 나타낸 그래프이다.
도 12는 C2C12 근관세포(myotube)에 1μM DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인(NAC)의 처리에 따른, 근육 분화 마커인 MyoD(A), Myogenin(B) 및 근위축 마커인 Atrogin-1(C), MuRF1(D)의 mRNA 수준을 나타낸 그래프이다.
도 13은 C2C12 근관세포(myotube)에 1μM DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인(SFN-NAC) 단독, 또는 DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인(0, 0.1 및 1μM)과 덱사메타손(DEX)(5μM)의 동시 처리에 따른 p-Akt(S473), Atrogin-1, MuRF1 및 MyoD의 수준을 웨스턴 블롯으로 분석하여 나타낸 그림이다.
도 14는 덱사메타손(DEX) 및 DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인, 또는 DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인 단독의 처리에 따른 근관세포를 나타낸 MHC 형광염색분석 사진이다.
도 15는 C2C12 근아세포(myoblast)(A) 및 근관세포(myotube)(B)에 대한 베르테로인(berteroin)의 농도별(0.01, 0.1, 1, 5 및 10μM) 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 16은 C2C12 근관세포에 1μM 베르테로인의 처리에 따른, 4종의 주요 미오신 중쇄(myosin heavy chain: MHC)인 MHCIIb, MHCIb, MHCIIa 및 MHCIIx의 mRNA 수준을 나타낸 그래프이다.
도 17은 C2C12 근관세포(myotube)에 1μM 베르테로인의 처리에 따른, 근육 분화 마커인 MyoD, Myogenin 및 근위축 마커인 Atrogin-1, MuRF1의 mRNA 수준을 나타낸 그래프이다.
도 18은 C2C12 근관세포(myotube)에 베르테로인(BTR)(1μM) 단독, 또는 베르테로인(0, 0.1 및 1μM)과 덱사메타손(DEX)(5μM)의 동시 처리에 따른 근위축 마커인 Atrogin-1(A), MuRF1(B)의 mRNA 수준을 나타낸 그래프와 Atrogin-1, MuRF-1 및 MyoD(C)의 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 분석하여 나타낸 그림이다.
도 19는 C2C12 근관세포(myotube)에 1μM 베르테로인 단독, 또는 베르테로인(0, 0.1 및 1μM)과 덱사메타손(DEX)(5μM)의 동시 처리에 따른 p-Akt, p-mTOR, p-p70S6K1, p-4E-BP1(A), FOXO1/FOXO3a/Smad3(B) 및 유비퀴틴(C)의 수준을 웨스턴 블롯으로 분석하여 나타낸 그림이다.
도 20은 덱사메타손(DEX) 및 베르테로인, 또는 베르테로인 단독의 처리에 따른 근관세포를 나타낸 MHC 형광염색분석 사진(A) 및 MHC 수준을 웨스턴 블롯으로 분석하여 나타낸 그림(B)이다.
본 발명의 일 양상은 설포라판 유도체를 포함하는 근위축(muscle atrophy) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "근위축"은 근육세포와 근조직의 크기 및 질량적 손실을 말하며, 이러한 근위축은 노화, 중증질병, 신경손상 등으로 인해 오랫동안 움직일 수 없는 상태에 처하거나, 영양공급장애 등 다양한 원인에 의하여 유발되는 것일 수 있다.
설포라판은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로써, 콜리플라워, 브로콜리, 케일 및 양배추 등 십자화과 채소에 포함된 이소티오시아네이트(isothiocyanate)이다.
Figure PCTKR2019012203-appb-img-000001
본 발명의 설포라판 유도체는 설포라판 및 설포라판의 전구체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 설포라판 유도체는 글루코라파닌(glucoraphanin), DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인(DL-Sulforaphane N-acetyl-L-cysteine) 및 베르테로인(berteroin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물일 수 있다.
글루코라파닌은 미로시나아제(myrosinase)의 작용으로 설포라판이 되고, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인은 설포라판의 주요 대사 산물이며, 베르테로인은 non-oxidized sulfur(-N=C=S)를 갖는 설포라판 아날로그(analog)이다.
본 발명의 설포라판 유도체는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 글루코라파닌일 수 있다.
Figure PCTKR2019012203-appb-img-000002
본 발명의 설포라판 유도체는 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물인 DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인일 수 있다.
Figure PCTKR2019012203-appb-img-000003
본 발명의 설포라판 유도체는 하기 화학식 4로 표시되는 화합물인 베르테로인일 수 있다.
Figure PCTKR2019012203-appb-img-000004
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 약제의 제조에 통상적으로 이용되는 것으로써, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington: the science and practice of pharmacy 22nd edition (2013)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 근위축의 예방 또는 치료에 활성을 나타내는 물질과 함께 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 근위축의 치료를 위하여 단독으로, 또는 시술, 호르몬 치료, 약물치료 및/또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001~1000㎎/kg일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여 시 다양한 제형으로 투여될 수 있는데, 환제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 등의 고형제제 형태로 투여될 수 있으며, 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물을 분말, 과립, 정제 또는 캅셀 형태로 제형화 할 경우, 이의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 예를 들어, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 인산칼슘, 규산칼슘, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및/또는 광물유가 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 제제화에 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함하여 조제될 수 있으며, 상기 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 또는 탈크 같은 윤활제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여시 다양한 제형으로 투여될 수 있는데, 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 구체적으로, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 및 동결건조제제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 또한, 치료제의 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D3를 첨가할 수 있다.
이러한 조성물은 단위-용량(1회분) 또는 다중-용량(수 회분) 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰플 및 바이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면, 주사용 수의 부가만을 요구하는 동결-건조 조건하에 저장할 수 있다. 즉석의 사용제 및 현탁제는 멸균성 산제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 근위축은 암성 악액질, 근감소, 노화, 비만, 스테로이드제 장기투여 및 우주비행으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의하여 발생하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 스테로이드제는 덱사메타손일 수 있다.
근위축은 호르몬 불균형, 심한 부상, 패혈증, 암, 비만, 우주비행 및/또는 노화 등 다양한 카타볼릭 상태(catabolic condition)에서 발생한다. 또한, 덱사메타손(dexamethasone)의 투여에 의하여 근육과 관련된 단백질의 분해가 촉진된다는 보고가 있었다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 글루코라파닌, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인 및 베르테로인은 이와 같은 근위축, 특히, 덱사메타손에 의하여 유발된 근위축을 억제할 수 있으므로, 근위축의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 근위축의 치료 방법을 제공한다.
설포라판 유도체, 구체적으로, 글루코라파닌, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인 및 베르테로인은 근위축에 대한 현저한 개선 효과를 나타내므로, 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물이 근위축 환자에 투여됨으로써 근위축의 치료가 가능하다.
본 발명의 또 다른 양상은 설포라판 유도체를 포함하는 근위축 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 설포라판 유도체는 글루코라파닌, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인 및 베르테로인으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물일 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로써 설포라판 유도체, 예를 들어, 글루코라파닌, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인 또는 베르테로인 외에, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다. 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 향미제로서 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 설포라판 유도체, 구체적으로, 글루코라파닌, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인 또는 베르테로인 외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액 및/또는 감초 추출액 등이 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 근위축은 암성 악액질, 근감소, 노화, 비만, 스테로이드제 장기투여 및 우주비행으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의하여 발생하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 스테로이드제는 덱사메타손일 수 있다.
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 근위축 개선 효과 분석 방법
1-1. 세포배양 및 시약 처리
C2C12 근아세포(myoblast)는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하였으며, 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin: P/S)이 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서, 37℃의 5% CO 2 조건으로 배양하였다. 근관세포(myotube)로의 분화를 유도하기 위하여, C2C12 근아세포가 80% 컨플루언트(confluent)가 되었을 때, 2% FBS 및 1% P/S를 포함하는 DMEM으로 4일 동안 매일 배지를 교체하였다. 그 후, 1, 5, 10μM 농도의 글루코라파닌(glucoraphanin), 0.1, 1μM 농도의 DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인(DL-Sulforaphane N-acetyl-L-cysteine), 또는 0.1, 1μM 농도의 베르테로인(berteroin)으로 근관세포를 처리하였다.
한편, 근위축은 5μM의 덱사메타손을 사용하여 유도하였으며, 덱사메타손은 단독으로, 또는 글루코라파닌, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인, 또는 베르테로인과 동시에 처리되었다.
1-2. 세포 생존율 분석
96-웰 플레이트에 2×10 5 cells/㎖의 C2C12 근아세포를 100㎕씩 분주하고, 하루 배양한 후, 글루코라파닌, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인 또는 베르테로인을 0.01, 0.1, 1, 5 및 10μM로 각 웰에 처리하고, 37℃의 5% CO 2의 조건에서 24 및 48시간 동안 배양하였다. 근관세포는 96-웰 플레이트에 2×10 5 cells/㎖의 C2C12 근아세포를 100㎕씩 분주하고, 분화배지에서 4일간 분화시킨 후 글루코라파닌, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인, 또는 베르테로인을 0.01, 0.1, 1, 5 및 10μM로 각 웰에 처리하고, 37℃의 5% CO 2의 조건에서 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 최종농도가 2㎎/㎖이 되도록 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)(Sigma) 용액을 각 웰에 넣은 다음, 배양기에서 4시간 동안 반응시키고, MTT 용액을 제거한 후, DMSO 100㎕를 넣어 교반하였다. 완전히 교반되면, 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)(Molecular Device, Sunnyvale, Cam USA)를 이용하여 570㎚에서 UV 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(％)은 글루코라파닌을 처리하지 않은 정상대조군의 흡광도값에 대한 백분율로 나타냈다.
1-3. Real-time PCR 분석
TRI 시약(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)을 사용하여 실시예 1-1의 C2C12 세포로부터 총 RNA를 분리한 후, Atrogin-1, MuRF1, MyoD, Myogenin, MHCIb, MHCIIa, MHCIIb, MHCIIx 및 18sRNA mRNA의 발현을 LightCycler96 실시간(real-time) PCR 기기(Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 분석하였다. 사용한 forward 및 reverse 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.
프라이머 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
Atrogin-1 forward CTCTGTACCATGCCGTTCCT 서열번호 1
reverse GGCTGCTGAACAGATTCTCC 서열번호 2
MuRF1 forward TGTCTGGAGGTCGTTTCCG 서열번호 3
reverse TGCCGGTCCATGATCACTT 서열번호 4
MyoD forward ACTACAGTGGCGACTCAGATGC 서열번호 5
reverse CCGCTGTAATCCATCATGCCATC 서열번호 6
Myogenin forward TCCCAACCCAGGAGATCATTTGC 서열번호 7
reverse ACGTAAGGGAGTGCAGATTGTGG 서열번호 8
MHCIb forward GAGGAAGAGTGAGCGGCG 서열번호 9
reverse GCCGCAGTAGGTTCTTCCTGT 서열번호 10
MHCIIa forward TACAACCTCAAAGAGCGTTATGCA 서열번호 11
reverse AAGGGTTGACGGTGACACAGA 서열번호 12
MHCIIb forward GAGATCGATGATCTCGCTAGTAACAT 서열번호 13
reverse GGGTGCGGCACATCTTC 서열번호 14
MHCIIx forward ACAGATCGGGAGAACCAGTCTATT 서열번호 15
reverse CGTTTCGTGTTCACAGTCTTCC 서열번호 16
18sRNA forward CGATGCTCTTAGCTGAGTGT 서열번호 17
reverse GGTCCAAGAATTTCACCTCT 서열번호 18
1-4. 웨스턴 블롯 분석
실시예 1-1의 근관세포를 PBS로 씻어낸 후, protease inhibitor cocktail(GenDEPOT, Barker, TX, USA)과 phosphatase inhibitor cocktail(GenDEPOT, Barker, TX, USA)을 함유한 RIPA 버퍼(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)에 용해하였다. 용해물을 샘플 버퍼[50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% sodium dodecyl sulfate(SDS), 0.14 M 2-mercaptoethanol, 10% glycerol, 및 0.001% bromophenol blue]에서 끓인 후, 전기영동으로 분리하였다. 샘플을 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)으로 분석하고, PVDF멤브레인으로 옮긴 후, 5% 탈지분유 중 Tween-20을 함유하는 인산염 완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 블로킹하였다. 그 후, Atrogin-1, MyoD, MuRF1, Akt, p-Akt(S473), mTOR, p-mTOR, p-p70S6K1, p-4EBP1, FOXO1, p-FOXO1, FOXO3a, p-FOXO3a, Smad3, p-Smad3, ubiquitin, MHC 및 α-tubulin(Cell Signaling, Danvers, MA, USA)에 대한 일차 항체와 4℃에서 밤새 배양한 다음, 실온에서 1시간 동안 2차 항체와 반응시켰다. 항체-항원 복합체는 향상된 화학발광(chemiluminescent) 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 검출하였고, 신호 강도는 Fusion Solo 2 화상이미지 분석기(Vilber Lourmat, Paris, France)를 사용하여 측정하였다.
1-5. 근관세포 형광염색분석
덮개유리에 실시예 1-1의 근관세포를 키운 후, 덮개유리를 PBS로 씻어내고, 4% 파라포름알데하이드로 15분간 고정하였다. 고정 후, Triton-X100이 0.2% 함유된 PBS로 5분씩 3번 세척하고, 5% BSA로 37℃에서 30분간 블로킹하였다. MHC 항체(MF20, Developmental Studies Hybridoma Bank, IA, USA)를 2% BSA에 1:100으로 희석하여 4℃에서 12시간 처리하였다. 이후, Triton-X100이 0.2% 함유된 PBS로 5분씩 3번 세척하고, 글루코라파닌 및 DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인은 goat anti mouse IgG-FITC(Invitrogen, IL, USA)를, 베르테로인은 goat anti mouse IgG-Alexa Fluor 568(Invitrogen, IL, USA)를 2% BSA에 1:200으로 희석하여 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 이와 같은 방법으로 처리한 덮개유리는 현미경 슬라이드에 DAPI가 포함된 형광용 마운트 용액(Fluoroshield with DAPI, Sigma, MO, USA)을 이용하여 마운팅(mounting)되었다.
1-6. 통계 분석
결과는 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었다. GraphPad PRISM(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 이용하여 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 실시한 후, 각 그룹 간의 통계적 유의성은 Tukey's multiple comparison test로 사후검정을 수행하여 P값이 0.05 미만일 때 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 2. 글루코라파닌의 근위축 개선 효과 확인
2-1. 근아세포 및 근관세포의 세포 생존율 확인
근아세포 및 근관세포에 대하여, 글루코라파닌 처리에 따른 세포 생존율 확인하기 위하여, 실시예 1-2를 수행하여, 글루코라파닌이 세포 생존율에 미치는 영향을 분석하였다.
그 결과, 10μM까지 글루코라파닌을 처리하여도 근아세포(도 1) 및 근관세포(도 2)에 대한 세포 생존율에 유의적인 감소가 없음을 확인하여, 글루코라파닌은 근아세포 및 근관세포에 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
2-2. 주요 미오신 중쇄의 발현 수준 확인
4종의 주요 미오신 중쇄(myosin heavy chain: MHC)(MHCIb, MHCIIa, MHCIIb 및 MHCIIx)는 근육 유형 및 근육 신진대사를 나타낸다. 따라서, 글루코라파닌 처리 후, 미오신 중쇄의 발현 변화를 확인하기 위하여, 4종의 주요 미오신 중쇄의 mRNA 수준을 실시예 1-3을 수행하여 분석하였다.
그 결과, 글루코라파닌을 처리하지 않은 경우의 MHCIb, MHCIIa, MHCIIb 및 MHCIIx의 mRNA 수준과 비교하였을 때, 글루코라파닌을 처리한 후에 측정한 MHCIb, MHCIIa, MHCIIb 및 MHCIIx의 mRNA 수준에서 유의적인 차이는 나타나지 않음을 확인하였다(도 3). 즉, 글루코라파닌은 정상 근관세포의 주요 미오신 중쇄의 발현에 영향을 주지 않음을 확인하였다.
2-3. 근위축 개선 효과 확인
MyoD 및 Myogenin은 근육 분화(muscle differentiation)의 마커이고, Atrogin-1 및 MuRF1은 근위축(muscle atrophy)의 마커이다. 따라서, 글루코라파닌 처리 후, 근육 분화 및 근위축 여부를 확인하기 위하여, 이들 마커에 대한 mRNA 수준을 실시예 1-3을 수행하여 분석하였다.
그 결과, 글루코라파닌을 처리하지 않은 경우의 MyoD, Myogenin, Atrogin-1 및 MuRF1의 mRNA 수준과 비교하였을 때, 글루코라파닌을 처리한 후에 측정한 MyoD, Myogenin, Atrogin-1 및 MuRF1의 mRNA 수준에서 유의적인 차이는 나타나지 않았다(도 4). 즉, 글루코라파닌은 정상 근관세포의 근육 분화 및 근위축에 영향을 주지 않음을 확인하였다.
한편, 5μM의 덱사메타손을 근관세포에 처리한 경우, Atrogin-1 및 MuRF1의 mRNA 수준이 증가하여, 근위축이 유도됨을 확인하였으며, 덱사메타손과 글루코라파닌을 동시에 처리한 경우, Atrogin-1 및 MuRF1의 mRNA 수준은 글루코라파닌의 농도 의존적으로 감소하여 정상대조군과 유사한 수준으로 회복됨을 확인하였다(도 5). 또한, 웨스턴 블롯 결과에 따르면, 5μM의 덱사메타손을 근관세포에 처리한 경우, Atrogin-1 및 MuRF1의 수준이 증가하고, MyoD의 수준은 감소하였으나, 덱사메타손과 글루코라파닌을 동시에 처리한 경우, 글루코라파닌의 농도의존적으로 Atrogin-1과 MuRF1의 수준은 감소하고 MyoD의 수준은 증가하는 것을 확인하였다(도 6). 즉, 글루코라파닌을 사용하여 근위축을 개선할 수 있음을 확인하였다.
2-4. Akt/FOXO 신호전달을 통한 근위축 개선 효과 확인
감소된 Akt 신호 활성은 대부분의 근위축 모델에서 관찰된다. 덱사메타손에 의해 유도된 근위축 모델에서, 글루코라파닌이 Akt, FOXO1 및 FOXO3a의 발현에 영향을 주는지 확인하기 위하여, 실시예 1-4를 수행하여 p-Akt(S473)의 수준 및 Akt의 하류(downstream) 표적인 FOXO1 및 FOXO3a의 수준을 분석하였다.
그 결과, 덱사메타손을 처리할 경우, p-Akt(S473)의 수준이 유의하게 감소하였으나, 덱사메타손과 글루코라파닌을 동시에 처리한 경우, p-Akt(S473)의 정상대조군과 유사한 수준으로 회복됨을 확인하였다(도 7).
한편, 덱사메타손을 처리할 경우, p-FOXO1 및 p-FOXO3a의 수준이 감소되었으나, 덱사메타손과 글루코라파닌을 동시에 처리한 경우, p-FOXO1 및 p-FOXO3a의 수준이 정상대조군과 유사한 수준으로 회복됨을 확인하였다(도 8).
상기 결과를 통하여, 글루코라파닌은 Akt 신호 전달을 활성화시킴으로써 근위축을 개선함을 확인하였다.
2-5. MHC 형광염색분석에 따른 근위축 개선 효과 확인
글루코라파닌 처리 후, 근육 분화 및 근위축 여부를 확인하기 위하여, 실시예 1-5에 따라 C2C12 근관세포를 MHC 형광염색하여 분석하였다.
그 결과, 덱사메타손을 처리한 경우, 근관세포의 직경이 감소하여 근위축이 발생한 것을 확인한 반면, 덱사메타손과 글루코라파닌을 동시에 처리한 경우, 근관세포의 지름이 대조군 및 글루코라파닌 단독 처리군과 유사한 수준으로 회복되었음을 확인하였다(도9).
상기 결과를 통하여, 글루코라파닌은 근관세포를 회복시킴으로써 근위축을 개선함을 확인하였다.
실시예 3. DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인의 근위축 개선 효과 확인
3-1. 근아세포 및 근관세포의 세포 생존율 확인
근아세포 및 근관세포에 대하여, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인 처리에 따른 세포 생존율 확인하기 위하여, 실시예 1-2를 수행하여, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인이 세포 생존율에 미치는 영향을 분석하였다.
그 결과, 1μM까지 DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인을 처리하여도 근아세포(도 10A) 및 근관세포(도 10B)에 대한 세포 생존율에 유의적인 감소가 없음을 확인하여, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인은 1μM 이하의 농도에서 근아세포 및 근관세포에 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
3-2. 주요 미오신 중쇄의 발현 수준 확인
4종의 주요 미오신 중쇄(myosin heavy chain: MHC)(MHCIb, MHCIIa, MHCIIb 및 MHCIIx)는 근육 유형 및 근육 신진대사를 나타낸다. 따라서, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인 처리 후, 미오신 중쇄의 발현 변화를 확인하기 위하여, 4종의 주요 미오신 중쇄의 mRNA 수준을 실시예 1-3을 수행하여 분석하였다.
그 결과, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인을 처리하지 않은 경우의 MHCIb, MHCIIa, MHCIIb 및 MHCIIx의 mRNA 수준과 비교하였을 때, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인을 처리한 후에 측정한 MHCIb, MHCIIa, MHCIIb 및 MHCIIx의 mRNA 수준에서 유의적인 차이는 나타나지 않음을 확인하였다(도 11). 즉, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인은 정상 근관세포의 주요 미오신 중쇄의 발현에 영향을 주지 않음을 확인하였다.
3-3. Akt 신호 전달 활성화에 따른 근위축 개선 효과 확인
MyoD 및 Myogenin은 근육 분화(muscle differentiation)의 마커이고, Atrogin-1 및 MuRF1은 근위축(muscle atrophy)의 마커이다. 따라서, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인 처리 후, 근육 분화 및 근위축 여부를 확인하기 위하여, 이들 마커에 대한 mRNA 수준을 실시예 1-3을 수행하여 분석하였다.
그 결과, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인을 처리하지 않은 경우의 MyoD, Myogenin, Atrogin-1 및 MuRF1의 mRNA 수준과 비교하였을 때, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인을 처리한 후에 측정한 MyoD, Myogenin, Atrogin-1 및 MuRF1의 mRNA 수준에서 유의적인 차이는 나타나지 않았다(도 12). 즉, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인은 정상 근관세포의 근육 분화 및 근위축에 영향을 주지 않음을 확인하였다.
또한, 웨스턴 블롯 결과에 따르면, 5μM의 덱사메타손을 근관세포에 처리한 경우, Atrogin-1 및 MuRF1의 수준이 증가하고, MyoD의 수준은 감소하였으나, 덱사메타손과 DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인을 동시에 처리한 경우, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인의 농도의존적으로 Atrogin-1과 MuRF1의 수준은 감소하고, MyoD의 수준은 증가하는 것을 확인하였다(도 13). 즉, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인을 사용하여 근위축을 개선할 수 있음을 확인하였다.
한편, 감소된 Akt 신호 활성은 대부분의 근위축 모델에서 관찰된다. 덱사메타손에 의해 유도된 근위축 모델에서, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인이 Akt의 발현에 영향을 주는지를 확인하기 위하여, 실시예 1-4를 수행하여 p-Akt(S473)의 수준을 분석하였다.
그 결과, 덱사메타손을 처리할 경우, p-Akt(S473)의 수준이 유의하게 감소하였으나, 덱사메타손과 DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인을 동시에 처리한 경우, p-Akt(S473)의 정상대조군과 유사한 수준으로 회복됨을 확인하였다(도 13).
상기 결과를 통하여, 즉, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인을 사용하여 근위축을 개선할 수 있으며, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인은 Akt 신호 전달을 활성화시킴으로써 근위축을 개선함을 확인하였다.
3-4. MHC 형광염색분석에 따른 근위축 개선 효과 확인
DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인 처리 후, 근육 분화 및 근위축 여부를 확인하기 위하여, 실시예 1-5에 따라 C2C12 근관세포를 MHC 형광염색하여 분석하였다.
그 결과, 덱사메타손을 처리한 경우, 근관세포의 직경이 감소하여 근위축이 발생한 것을 확인한 반면, 덱사메타손과 DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인을 동시에 처리한 경우, 근관세포의 지름이 대조군 및 DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인 단독 처리군과 유사한 수준으로 회복되었음을 확인하였다(도 14).
상기 결과를 통하여, DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인은 근관세포를 회복시킴으로써 근위축을 개선함을 확인하였다.
실시예 4. 베르테로인의 근위축 개선 효과 확인
4-1. 근아세포 및 근관세포의 세포 생존율 확인
근아세포 및 근관세포에 대하여, 베르테로인 처리에 따른 세포 생존율 확인하기 위하여, 실시예 1-2를 수행하여, 베르테로인이 세포 생존율에 미치는 영향을 분석하였다.
그 결과, 1μM까지 베르테로인을 처리하여도 근아세포(도 15A) 및 근관세포(도 15B)에 대한 세포 생존율에 유의적인 감소가 없음을 확인하여, 1μM 이하의 베르테로인은 근아세포 및 근관세포에 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
4-2. 주요 미오신 중쇄의 발현 수준 확인
4종의 주요 미오신 중쇄(myosin heavy chain: MHC)(MHCIb, MHCIIa, MHCIIb 및 MHCIIx)는 근육 유형 및 근육 신진대사를 나타낸다. 따라서, 베르테로인 처리 후, 미오신 중쇄의 발현 변화를 확인하기 위하여, 4종의 주요 미오신 중쇄의 mRNA 수준을 실시예 1-3을 수행하여 분석하였다.
그 결과, 베르테로인을 처리하지 않은 경우의 MHCIb, MHCIIa, MHCIIb 및 MHCIIx의 mRNA 수준과 비교하였을 때, 베르테로인을 처리한 후에 측정한 MHCIb, MHCIIa, MHCIIb 및 MHCIIx의 mRNA 수준에서 유의적인 차이는 나타나지 않음을 확인하였다(도 16). 즉, 베르테로인은 정상 근관세포의 주요 미오신 중쇄의 발현에 영향을 주지 않음을 확인하였다.
4-3. Akt/FOXO 신호전달을 통한 근위축 개선 효과 확인
MyoD 및 Myogenin은 근육 분화(muscle differentiation)의 마커이고, Atrogin-1 및 MuRF1은 근위축(muscle atrophy)의 마커이다. 따라서, 베르테로인 처리 후, 근육 분화 및 근위축 여부를 확인하기 위하여, 이들 마커에 대한 mRNA 수준을 실시예 1-3을 수행하여 분석하였다.
그 결과, 베르테로인을 처리하지 않은 경우의 MyoD, Myogenin, Atrogin-1 및 MuRF1의 mRNA 수준과 비교하였을 때, 베르테로인을 처리한 후에 측정한 MyoD, Myogenin, Atrogin-1 및 MuRF1의 mRNA 수준에서 유의적인 차이는 나타나지 않았다(도 17). 한편, 5μM의 덱사메타손을 근관세포에 처리한 경우, Atrogin-1 및 MuRF1의 mRNA 수준이 현저하게 증가하여, 근위축이 유도됨을 확인하였으며, 덱사메타손과 베르테로인을 동시에 처리한 경우, Atrogin-1(도 18A) 및 MuRF1(도 18B)의 mRNA 수준이 덱사메타손 단독 처리군과 비교하여 현저히 감소되는 것을 확인하였다.
웨스턴 블롯 결과에 따르면, 5μM의 덱사메타손을 근관세포에 처리한 경우, Atrogin-1 및 MuRF1의 수준이 증가하고, MyoD의 수준은 감소하였으나, 덱사메타손과 베르테로인을 동시에 처리한 경우, 베르테로인의 농도의존적으로 Atrogin-1과 MuRF1의 수준은 감소하고, MyoD의 수준은 증가하는 것을 확인하였다(도 18C). 즉, 베르테로인을 사용하여 근위축을 개선할 수 있음을 확인하였다.
감소된 Akt 신호 활성은 대부분의 근위축 모델에서 관찰된다. 덱사메타손에 의해 유도된 근위축 모델에서, 베르테로인이 근육관련 단백질 합성에 관여하는 Akt/mTOR 신호전달경로에 영향을 주는지를 확인하기 위하여, 실시예 1-4를 수행하여 p-Akt(S473), p-mTOR, p-p70S6K1, p-4E-BP1의 수준을 분석하였다.
그 결과, 덱사메타손을 처리할 경우, p-Akt(S473), p-mTOR, p-p70S6K1, p-4E-BP1의 수준이 유의하게 감소하였으나, 덱사메타손과 베르테로인을 동시에 처리한 경우, p-Akt(S473), p-mTOR, p-p70S6K1, p-4E-BP1의 수준이 정상대조군과 유사한 수준으로 회복됨을 확인하였다(도 19A).
한편, 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 유도 근위축에 있어서, FOXO3a는 유비퀴틴 및 Atrogin-1/MAFbx 발현을 조정하는 신호 전달을 매개하는 것으로 알려져 있다. 또한 MSTN(Myostatin)/Smad 신호 전달은 근단백질 합성을 저해하고 근단백질 분해를 활성화시켜 근위축을 유도하는 것으로 알려져 있다. 덱사메타손에 의해 유도된 근위축 모델에서, 베르테로인이 Akt의 하류(downstream) 표적인 FOXO1 및 FOXO3a의 발현과 Smad3의 발현에 영향을 주는지를 확인하기 위하여, 실시예 1-4를 수행하여 FOXO1, FOXO3a, Smad3 및 유비퀴틴의 발현 수준을 분석하였다.
그 결과, 덱사메타손을 처리할 경우, p-FOXO1 및 p-FOXO3a의 수준이 감소되었으나, 덱사메타손과 베르테로인을 동시에 처리한 경우, p-FOXO1 및 p-FOXO3a의 수준이 증가하는 것을 확인하였다(도 19B). 또한, 덱사메타손을 처리할 경우, p-Smad3가 증가하였으나, 덱사메타손과 베르테로인을 동시에 처리한 경우, 농도의존적으로 p-Smad3의 수준이 감소됨을 확인하였으며(도 19B), 베르테로인의 처리에 의해 유비퀴틴 역시 농도의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(도 19C).
상기 결과를 통하여, 즉, 베르테로인을 사용하여 근위축을 개선할 수 있으며, 베르테로인은 Akt 신호 전달을 활성화시킴으로써 근위축을 개선함을 확인하였다.
4-4. MHC 형광염색분석에 따른 근위축 개선 효과 확인
베르테로인 처리 후, 근육 분화 및 근위축 여부를 확인하기 위하여, 실시예 1-5에 따라 C2C12 근관세포를 MHC 형광염색하여 분석하였다.
그 결과, 덱사메타손을 처리한 경우, 근관세포의 직경이 감소하여 근위축이 발생한 것을 확인한 반면, 덱사메타손과 베르테로인을 동시에 처리한 경우, 근관세포의 지름이 대조군 및 베르테로인 단독 처리군과 유사한 수준으로 회복되었음을 확인하였다(도 20A).
또한, MHC 마커에 대한 단백질 수준을 실시예 1-4를 수행하여 분석하였다.
그 결과, 덱사메타손을 처리한 경우, MHC의 수준이 감소되었으나, 덱사메타손과 베르테로인을 동시에 처리한 경우, 덱사메타손 단독처리와 비교하여 MHC 수준이 증가하는 것을 확인하였다(도 20B).
상기 결과를 통하여, 베르테로인은 근관세포를 회복시킴으로써 근위축을 개선함을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

  1. 설포라판 유도체를 포함하는 근위축(muscle atrophy) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 설포라판 유도체는 글루코라파닌(glucoraphanin), DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인(DL-Sulforaphane N-acetyl-L-cysteine) 및 베르테로인(berteroin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물인 것인 근위축 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 근위축은 암성 악액질, 근감소, 노화, 비만, 스테로이드제 장기투여 및 우주비행으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의하여 발생하는 것인 근위축 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 스테로이드제는 덱사메타손인 것인 근위축 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1 항의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 근위축의 치료 방법.
  6. 설포라판 유도체를 포함하는 포함하는 근위축(muscle atrophy) 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 설포라판 유도체는 글루코라파닌(glucoraphanin), DL-설포라판 N-아세틸-L-시스테인(DL-Sulforaphane N-acetyl-L-cysteine) 및 베르테로인(berteroin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물인 것인 근위축 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 근위축은 암성 악액질, 근감소, 노화, 비만, 스테로이드제 장기투여 및 우주비행으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의하여 발생하는 것인 근위축 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 스테로이드제는 덱사메타손인 것인 근위축 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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