WO2020085812A1 - 압타민c를 유효성분으로 포함하는 점안액 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비타민 C 및 상기 비타민 C에 결합하는 압타머를 유효성분으로 포함하는 점안액 조성물에 관한 것으로, 본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 압타민C를 포함하는 점안액 조성물은 낮은 ROS level 유지 및 상피 세포 손상, 염증 반응이 개선되어서, 이러한 항산화 효과를 장시간 유지하는 압타머와 항산화제 복합체를 이용하여 안구 건조증의 개선 및 치료에 효과가 있다.

Description

압타민C를 유효성분으로 포함하는 점안액 조성물

본 발명은 압타민C를 유효성분으로 포함하는 점안액 조성물에 관한 것이다.

현대 사회에서는, 콘텍트 렌즈의 장용, 테크노 스트레스, 알레르기와의 접촉, 대기 오염 등에 의해 각막이나 결막이 받는 스트레스가 증대되고 있으며, 이에 따라 안구 건조(dry eye)에 걸리는 사람이 증가하는 경향이 있다. 안구 건조에 걸리면, 각막이나 결막의 정상적인 기능이 저하되고, 각막 상피 장해, 각막 상피 미란, 각막 궤양, 결막염, 각막염, 안감염증 등을 야기하기 쉬워진다.

종래, 안구 건조, 또는 각막이나 결막의 기능 저하를 동반하는 안질환의 예방 또는 치료에는, 콘드로이틴 황산, 히알루론산 등의 점탄성 물질을 포함하는 점안제의 점안에 의해 각막이나 결막을 보호하여 보수성을 부여하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 점탄성 물질을 포함하는 점안제에서는, 각막이나 결막에 대한 보호 작용이 불충분하며, 충분한 치료 효과가 얻어지지 않는 경우가 있어, 새로운 점안제의 개발이 요망되고 있었다.

안구 건조의 병태에 관해서는 완전히 분명해지지는 않았지만, 안구건조는 각결막 상피 장애를 야기하고, 궁극적으로는 시각 이상이 생기는 것이 알려져 있다. 따라서 안구건조에 의한 각결막 상피 장애를 조기에 적절하게 치료하는 것은 매우 중요하다.

현재, 안구 건조의 치료법으로는 점안 치료가 가장 일반적이며, 히알루론산나트륨을 함유하는 점안액이 안구 건조 치료에 범용되고 있다.

히알루론산나트륨을 함유하는 점안액(이하, 단순히 「히알루론산나트륨 점안액」이라고도 함)에 관해서는, 복수회에 걸쳐서 사용하는 것을 목적으로 하며, 캡 등의 개봉 및 재밀봉을 자유롭게 행할 수 있는 멀티도우즈형(히아레인(등록상표)점안액 0.1%, 히아레인(등록상표)점안액 0.3% 등), 및 1회의 사용을 목적으로 한 유닛도우즈형(히아레인(등록상표)미니 점안액 0.1%, 히아레인(등록상표)미니 점안액 0.3% 등)이 존재한다.

멀티도우즈형의 히알루론산나트륨 점안액에 관해서는, 캡의 개봉 및 재밀봉을 행하기 때문에 방부제로서 벤잘코늄염화물이 첨가되어 있는 한편, 유닛도우즈형은 1회의 사용(1회용)이기 때문에, 방부제는 첨가되어 있지 않다.

벤잘코늄염화물 등의 방부제는 각막 장애를 유발하는 위험성이 지적되어 있고, 예컨대, 벤잘코늄염화물에 관해서는, Clinical and Experimental Ophthalmology, 32, 180-184(2004)에 개시되어 있는 바와 같이, 농도 의존적으로 각막 상피 장애를 야기할 가능성이 있는 것이 알려져 있다. 전술한 바와 같이 안구 건조가 원래 각막 상피 장애를 수반하는 질환이기 때문에, 중증의 안구 건조 환자에게는 유닛도우즈형의 히알루론산나트륨 점안액이 이용되고 있다. 한편, 생산 비용의 문제 등 때문에, 모든 안구 건조 환자에게 유닛도우즈형의 히알루론산나트륨 점안액을 처방하는 것은 곤란하므로, 멀티도우즈형의 점안액 중의 방부제 농도를 감소시킴으로써 각막 상피 장애의 발생 리스크를 저감화하는 것도 고려된다. 그러나, 실제로는, 점안액 중의 방부제 농도를 감소시키면 멀티도우즈형으로서 사용하기에 충분한 보존 효력을 얻을 수 없고, 또, 방부제의 저감화에 따른 배합 성분의 변화에 의해, 상기 점안액의 물리 화학적 성질이 종래의 히알루론산나트륨 점안액과 상이한 것이 되는 것도 우려된다.

[선행특허 문헌]

국제특허공개번호 WO 2002/22131

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 안구건조증을 치료하기 위한 점안액 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 비타민 C 및 상기 비타민 C에 결합하는 압타머를 유효성분으로 포함하는 점안액 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 비타민 C에 결합하는 압타머는 서열번호 1의 염기서열(AGAGCTCGCGCCGGAGTTCTCAATGCAAGAGC)로 이루어진 것이 바람직하나, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 모든 압타머는 본 발명의 보호 범위에 포함된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 비타민 C 및 상기 비타민 C에 결합하는 압타머의 조성몰 비는 10000:1 내지 10:1 범위인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

이하 본 발명을 설명한다.

ROS에 의한 산화적 스트레스 signaling은 안구 표면의 상피세포 및 goblet cell 손상과 염증 반응을 일으켜 안구건조 주기를 촉진하는데 핵심적인 역할을 하며, 과도한 산화적 스트레스 signaling을 줄이기 위해 낮은 ROS level을 유지해 줄 필요가 있다.

본 발명은 항산화제(ex. Vitamin C)의 사용은 낮은 ROS level 유지 및 상피 세포 손상, 염증 반응이 개선되어서, 이러한 항산화 효과를 장시간 유지하는 압타머와 항산화제 복합체를 이용하여 안구 건조증의 개선 및 치료에 효과가 있다는 것을 확인하였다.

본 발명의 점안액을 조제하는 데에 있어서, 상기한 본 발명의 압타민C 복합체 이외에 필요한 경우에 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 글리세린, 프로필렌글리콜 등의 등장화제, 붕산, 붕사, 구연산, 인산수소2나트륨, ε-아미노카프론산 등의 완충제, 염화벤잘코늄, 글루콘산클로로헥시딘, 염화벤제토늄, 소르브산, 소르브산칼륨, 파라옥시안식향산에틸, 파라옥시안식향산부틸 등의 방부제 등의 약제학적으로 허용되는 여러 가지 첨가물을 배합할 수 있다.

본 점안액의 pH는 3∼8, 특히 4∼7로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 점안액의 조제 방법은 특별한 수법이나 조작을 필요로 하지 않으며, 통상 사용되고 있는 방법에 의해 조제할 수 있다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 압타민C를 포함하는 점안액 조성물은 낮은 ROS level 유지 및 상피 세포 손상, 염증 반응이 개선되어서, 이러한 항산화 효과를 장시간 유지하는 압타머와 항산화제 복합체를 이용하여 안구 건조증의 개선 및 치료에 효과가 있다.

도 1은 압타민C 에 의한 vitamin C의 환원력 유지를 나타낸 그래프로, OPDA (12-oxo-phytodienoic acid) assay (5 mM Vitamin C, 1 μM 압타민C) 결과를 나타낸 그래프.

도 2와 3은 인간 각질형성세포 (human keratinocyte (HaCaT cell line)에서 wound healing assay를 진행한 결과로, 비타민C 및 압타민C (비타민C에 결합하는 압타머)를 처리하였을 시, 상처가 회복되는 정도를 시간 별로 확인한 대표 그림.

본 실험에서는 압타민C를 1 μM (0.001%), 비타민 C를 0.5 mM (0.008%)로 처리하여 효력을 확인하였다. 본 실험의 결과, 압타민C와 비타민C를 혼합한 조성물을 처리하였을 시, 상처 회복이 가장 잘 되는 것을 확인하였다.

본 도면에서 비타민C(ascorbic acid)에 결합하는 압타머를 압타민C라고 명명하였다.

이하 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 본 발명의 조성물의 제조

상기 실시예 1에서 효과가 있는 합성된 압타머와 비타민C(DSM, 영국)를 상온에서 증류수에서 기재된 중량비로 혼합하여 본 발명의 조성물을 제조하였다.

예를 들어 증류수에 ascorbic acid 0.008%(w/v)와 상기 비타민 C에 결합하는 압타민C 0.001%(w/v)를 혼합하여 본 발명의 점안액 조성물을 제조하였다.

실시예 2: 압타머를 통한 비타민 C 환원력 유지

Annealing buffer에 녹인 압타민C를 95 ^oC 로 가열한 후 서서히 온도를 상온으로 내리면서 압타머의 이차 구조를 만든 후, 환원된 L-ascorbic acid와 혼합하여 압타머가 L-ascorbic acid와 결합할 수 있도록 약 30분간 반응시켰다. 이 후 과산화수소수를 첨가하여 산화조건을 만들어 준 후 L-ascorbic acid의 산화를 형광염료인 OPDA (o-phenylenediamine) 를 첨가하여 측정하였다. L-ascorbic acid의 산화물인 DHA가 OPDA와 반응하여 생성된 DHA-OPDA로 부터의 형광량을 측정하여 DHA의 생성 정도를 정량 분석할 수 있다. 위의 조건에서 DHA-OPDA의 형광량을 매 2분마다 12시간 동안 측정하였다.

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, OPDA assay 결과, Vitamin C와 압타민 C를 함께 처리하였을 때 vitamin C의 산화가 방지되는 결과를 얻었으므로, Vitamin C와 상기 비타민 C에 특이적으로 결합하는 압타머를 유효성분으로 포함하는 점안액 조성물은 Vitamin C의 산화 속도를 늦추어 안구 건조에 대한 치료 효능을 유지시켜줄 것으로 예상된다.

실시예 3:인간 각질형성세포 (human keratinocyte ( HaCaT cell line)에서 wound healing assay

6-웰 플레이트에 human keratinocyte (HaCaT cell 세포)[대한민국, 숙명여자대학교 생명시스템 연구소에서 분양](1 × 10 ⁵ cells/ml)을 500 μL/웰로 시딩하고,5% CO ₂에서 95% air, 37℃ 조건에서 DMEM에서 배양하였다.

200 μL 피펫 팁으로 배양물의 표면을 스크래칭하여 세포에 상처를 입혔다.

그 스크래치된 HaCaT 세포들을 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해서 신선한 배지로 세척하였다.

압타민C를 1 μM (0.001%), 비타민 C를 0.5 mM (0.008%), 그리고 압타민C와 비타민C를 혼합한 조성물을 각각 배지에 처리하고 24시간 동안 배양하였다.

inverted 위상차 광원 현미경을 사용하여 상기 세포의 이동을 측정하였다.

각 웰의 손상 부위를 촬영하고 Image J를 사용하여 그 면적을 측정하였다.

이동된 세포들의 edges 사이의 평균 면적을 Image J를 사용하여 결정하였다.

상기 압타민C, 및 비타민 C의 단독 처리, 그리고 압타민C와 비타민C를 혼합한 조성물에 대한 HaCaT 세포에 의한 손상 봉합의 퍼센트를 비교하였다.

Claims (3)

1. 비타민 C 및 상기 비타민 C에 결합하는 압타머를 유효성분으로 포함하는 점안액 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 비타민 C에 결합하는 압타머는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 점안액 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 비타민 C 및 상기 비타민 C에 결합하는 압타머의 조성몰 비는 10000:1 내지 10:1 범위인 것을 특징으로 하는 점안액 조성물.

Images