WO2020091423A1 - 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체, 이의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

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존슨엘딘 말리야칼
이한기
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    • B01J2231/49—Esterification or transesterification

Definitions

  • the present invention relates to a phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate, and more specifically, a novel substance formed by side chain-bonding a phenolic acid phytochemical to some sugars constituting the main chain of fructo-oligosaccharides, a method for producing the same, and a method for producing the same It is related to various uses based on.
  • Colorectal cancer is the third highest cancer mortality rate in the world, and more than 1 million people are reported to develop colorectal cancer each year.
  • the genetic risk of colon cancer invention is about 10%, while surprisingly the remaining 90% is due to unhealthy lifestyle and eating habits.
  • Most drugs and compounds developed to treat colorectal cancer are either synthetic or biosimilar, and they cause serious side effects such as complications or unintended problems that degrade quality of life to patients during or after treatment. do.
  • the survival rate of CRC patients is one of the biggest challenges in science, as most CRC patients get worse with severe complications when they receive traditional treatments such as radiation therapy, chemotherapy, and other interventional therapies.
  • an appropriate treatment plan with a low incidence of recurrence after the remission period during treatment should be developed.
  • phytochemical Phytochemical derived from food sources is a chemical contained in plants, and the plant itself interferes with the growth of competing plants or protects its body from various microorganisms or pests.
  • phytochemicals work to maintain health by inhibiting antioxidants and cell damage when they enter a person's body.
  • Phenolic compounds among phytochemicals are known to have various health benefits, but their beneficial properties are alleviated due to their low solubility and bioavailability.
  • ferrulic acid one of phytochemicals in the form of phenolic acid, is an antioxidant and reacts with free radicals such as reactive oxygen species (ROS) to oxidative stress. It is known to have the effect of reducing and improving DNA damage, cancer, and cell aging.
  • the present invention is derived under the conventional technical background, the purpose of the present invention is equivalent to or improved physiological activity of phenolic acid phytochemicals, and at the same time, it is hardly degraded in the oral, stomach and small intestine environments when administered orally, and most of the large intestine It is to provide a novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate that can reach.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing a novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate.
  • an object of the present invention is to provide a variety of medicinal uses based on the physiological activity of a novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate, health functional food use or cosmetic use.
  • the inventors of the present invention synthesized a novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate by combining phenolic acid-type phytochemical to some sugars constituting the main chain of fructooligosaccharide.
  • the synthesized novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugates are less degraded under the oral-gastrointestinal tract conditions than most phenolic acid-type phytochemicals, and most of them are in the large intestine. It was reached and at the same time, it was confirmed that the selective killing effect on cancer cells is excellent, and particularly, the effect of treating colon cancer is very excellent, and the present invention has been completed.
  • an example of the present invention provides a phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate represented by the following Chemical Formula I or Chemical Formula II.
  • 'PhA' represents a phytochemical in the form of phenolic acid
  • 'Glu' represents glucose
  • 'Fru' represents fructose
  • 'PhA' and 'Glu' are linked by ester bonds
  • 'Glu' and 'Fru' are linked by glycosidic bonds
  • 'Fru' and 'Fru' are glycosylated. It is linked by a cyclic bond
  • 'Fru' and 'PhA' are linked by an ester bond.
  • n in the general formula (I) is a number of repeating units composed of four 'Fru' linked by a glycosidic linkage and one 'PhA' linked to 'Fru' by an ester linkage, and is selected from an integer of 1 to 14.
  • n in Formula II is a number of 'Fru' linked by a glycosidic bond and is selected from an integer of 1 to 59.
  • an example of the present invention provides a pharmaceutically acceptable salt of the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate described above.
  • an example of the present invention is (a) a phenolic acid (Phenolic acid) phytochemical (Phytochemical) in the reaction solvent and a catalyst for the esterification reaction is added and dissolved and heated to phytochemical Proceeding an activation reaction of and obtaining a primary reaction mixture comprising an activated form of phytochemicals; And (b) adding the fructooligosaccharide represented by the following general structural formula to the primary reaction mixture and heating it under an inert gas atmosphere to proceed with the esterification reaction between fructooligosaccharides and phytochemicals. And it provides a method for producing a phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate comprising the step of obtaining a secondary reaction mixture comprising a phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate.
  • fructo-oligosaccharide In the general structural formula of fructo-oligosaccharide, 'Glu' represents glucose, 'Fru' represents fructose, and k is the number of fructose linked through a glycosidic bond and is selected from an integer of 2 to 60.
  • an example of the present invention provides a composition for anticancer comprising the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate described above or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • an example of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating colon cancer comprising the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate described above or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. do.
  • an example of the present invention provides a composition for inhibiting metastasis of colorectal cancer comprising the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate described above or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • an example of the present invention provides an antioxidant composition comprising the above-described novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate of the present invention has a structure in which phytochemicals in the form of phenolic acid are bound to some sugars constituting the fructooligosaccharide backbone.
  • the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate according to the present invention has excellent bioavailability in the large intestine when administered orally, as it can hardly decompose under the conditions of passage through the gastrointestinal tract and most can reach the large intestine compared to the corresponding phenolic acid phytochemical. .
  • the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate according to the present invention is safe for the human body because it is composed of natural substances derived from food sources.
  • the ferulic acid-fructo-oligosaccharide conjugate according to the present invention has excellent selective killing effect on colorectal cancer cells when compared to drugs for the treatment of commercial colorectal cancer, and is a food and drug material useful for preventing, improving or treating colorectal cancer Can be used as
  • the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate according to the present invention has excellent antioxidant activity, and thus can be used as a food or pharmaceutical material useful for preventing aging.
  • FA ferulic acid
  • FOS fructooligosaccharide
  • FA-FOS I with a Fourier-transform infrared spectroscopy.
  • FIG. 3 is a spectrum result of analyzing ferulic acid (FA), fructooligosaccharide (FOS) and FA-FOS II by a Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) spectroscopy.
  • FA ferulic acid
  • FOS fructooligosaccharide
  • FTIR Fourier-transform infrared spectroscopy
  • Figure 5 is the HT-29 cell line and Lovo cell line oxaliplatin (Oxaliplatin), FA-FOS I, FA-FOS II and ferulic acid (Ferulic acid, FA) treatment of cancer cell death induction progress when Annexin V and Propidium iodide After staining, the result was observed with a fluorescent microscope.
  • FIG. 6 shows fluorescence after TUNEL assay (terminal deoxynucleotidyl transferase-dUTP nick end labeling) and additional Hoechst 33342 staining of cancer cell death induction when HT-29 and Lovo cell lines were treated with FA-FOS I and FA-FOS II. This is the result observed under a microscope.
  • FIG. 7 schematically shows an experimental process for evaluating anticancer activity of ferulic acid-fructooligosaccharide conjugate using a mouse model in which colon cancer is induced by AOM-DSS.
  • FIG. 8 shows (a) the total number of tumor lesions in the colon, (b) colon index among experimental results evaluating the anticancer activity of the ferulic acid-fructooligosaccharide conjugate using a mouse model in which colon cancer was induced by AOM-DSS. , (c) Mice's body weight at the end of drug treatment and (d) Mice's body weight gain during 4 weeks of treatment regimen.
  • Figure 9 shows the results of immunological parameters among experimental results evaluating the anticancer activity of ferulic acid-fructooligosaccharide conjugate using a mouse model in which colon cancer was induced by AOM-DSS.
  • Figure 11 shows the results of experiments evaluating the anti-cancer activity of the ferulic acid-fructooligosaccharide conjugate FA-FOS II using a HT-29 tumor bearing xenograft mouse model (a) tumor volume after 4 weeks of treatment, (b) tumor growth rate , (c) tumor weight after 4 weeks of treatment, (d) weight after 4 weeks of treatment, (e) daily weight gain during treatment and (f) weight gain during treatment.
  • the terms “pharmaceutically acceptable” and “foodly acceptable” mean not significantly stimulating an organism and not inhibiting the biological activity and properties of the active substance administered.
  • colon cancer refers to a malignant tumor that occurs in the appendix, colon or rectum.
  • prevention means any action that suppresses the symptoms of a specific disease or delays the progression by administration of the composition of the present invention.
  • treatment refers to any act that ameliorates or beneficially alters the symptoms of a particular disease by administration of a composition of the invention.
  • the term “improvement” means any action that at least reduces the severity of parameters associated with the condition being treated, for example symptoms.
  • the term "administration" means providing a subject composition of the present invention to an individual in any suitable way.
  • the individual refers to all animals, such as humans, monkeys, dogs, goats, pigs or rats, who have a disease that can improve symptoms of a specific disease by administering the composition of the present invention.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat the disease at a reasonable benefit or risk ratio applicable to medical treatment, which is the type, severity, drug activity, drug of the individual. Sensitivity to, time of administration, route of administration and rate of discharge, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field can be determined.
  • a novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate capable of reaching the large intestine with little or no degradation in the oral, stomach, and small intestine environments while having the same or improved physiological activity as phytochemicals or at the same time as oral administration will be.
  • a novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate according to an embodiment of the present invention includes a fructooligosaccharide main chain represented by the following general structural formula; Phytochemical in the form of phenolic acid (Phenolic acid) linked by glucose and ester bonds present at one end of the main chain; And phytochemicals in the form of phenolic acids selectively linked by fructose and ester bonds present in the main chain.
  • 'Glu' represents glucose
  • 'Fru' represents fructose
  • j is the number of fructose linked through a glycosidic bond and is selected from an integer of 1 to 59.
  • j is preferably selected from an integer of 4 to 48, and is selected from an integer of 8 to 40 when considering the indigestibility of the fructooligosaccharide or the ease of preparation of a phytochemical-fructooligosaccharide conjugate. It is desirable to be.
  • the phytochemical in the form of phenolic acid which is a component of the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate according to an embodiment of the present invention, is not greatly limited as long as it exhibits physiological activity that can be used for pharmaceutical or health functional food applications.
  • phytochemical is preferably a main chain by ester linkage between a hydroxyl group located on the carbon 6 of the main chain and a carboxyl group present on the phytochemical. Essentially connected to.
  • phytochemical is preferably by an ester bond between a hydroxyl group located on the fructose 6 carbon of the main chain and a carboxyl group present on the phytochemical. It is selectively linked to the main chain.
  • novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate is selected from compounds represented by the following formula (I) or formula (II).
  • 'PhA' represents a phytochemical in the form of phenolic acid
  • 'Glu' represents glucose
  • 'Fru' represents fructose
  • 'PhA' and 'Glu' are linked by ester bonds
  • 'Glu' and 'Fru' are linked by glycosidic bonds
  • 'Fru' and 'Fru' are glycosylated. It is linked by a cyclic bond
  • 'Fru' and 'PhA' are linked by an ester bond.
  • n in the general formula (I) is a number of repeating units composed of four 'Fru' linked by a glycosidic linkage and one 'PhA' linked to 'Fru' by an ester linkage, and is selected from an integer of 1 to 14, , Preferably selected from an integer from 2 to 13 and more preferably selected from an integer from 4 to 12.
  • n is a number of 'Fru' linked by a glycosidic bond, selected from an integer of 1 to 59, preferably selected from an integer of 2 to 40, more preferably 4 to 20 It is selected from integers.
  • novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate is selected from the ferulic acid-fructo-oligosaccharide conjugate represented by the following formula (III) or formula (IV).
  • the phytochemical in the form of phenolic acid is ferrulic acid.
  • novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate according to a more preferred embodiment of the present invention has the same or improved anti-cancer activity (especially anti-colon cancer activity) compared to ferrulic acid, and oral administration when administered orally, It is excellent in bioavailability in the large intestine because it hardly decomposes in the gastric and small intestine environment and most of it reaches the large intestine.
  • M in Formula III is the number of repeating units composed of 4 fructose linked by a glycosidic bond and 1 1 ferulic acid linked to fructose by an ester bond, and is selected from an integer of 1 to 14, preferably Is selected from an integer from 2 to 13 and more preferably from an integer from 4 to 12.
  • n is a number of fructose linked by a glycosidic bond, selected from an integer of 1 to 59, preferably an integer of 2 to 40, more preferably an integer of 4 to 20 Is selected from.
  • the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate according to the most preferred embodiment of the present invention consists of a ferulic acid-fructo-oligosaccharide conjugate represented by the following formula V or includes it as a main component.
  • the inventors of the present invention named the ferulic acid-fructo-oligosaccharide complex containing the compound represented by the following formula V as a main component as 'FA-FOS I' and analyzed the physical properties, and were insoluble in water and micelle in an aqueous environment ( Micelle) has been shown to form spherical particles.
  • the ferulic acid-fructo-oligosaccharide complex FA-FOS I hardly decomposes in the oral, stomach, and small intestine environments, mostly reaches the large intestine, passes through mucus in the large intestine environment, attaches to cancer cells in acidic conditions, and then attaches cancer cells. It has been shown to induce death.
  • the ferulic acid-fructo-oligosaccharide conjugate FA-FOS I is very useful in inhibiting metastasis of colorectal cancer because it can selectively kill only metastatic colorectal cancer cells.
  • the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate according to the most preferred embodiment of the present invention is made of a ferulic acid-fructo-oligosaccharide conjugate represented by the following formula (VI) or contains it as a main component.
  • the inventors of the present invention named the ferulic acid-fructo-oligosaccharide complex containing the compound represented by the following formula (VI) as a main component, as 'FA-FOS II' and were water-soluble as a result of analyzing physical properties, in the oral, stomach and small intestine environments It was confirmed that it hardly decomposed and reached the large intestine.
  • the ferulic acid-fructo-oligosaccharide complex FA-FOS II is decomposed in the colon environment conditions simulated by the human colon microbiota, released in the form of feruloyl glucose and prevents and improves colon cancer. Or it is very useful for treatment.
  • One aspect of the present invention relates to the pharmacologically or foodly acceptable salts of the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugates described above.
  • an acid addition salt formed by a free acid is useful as a pharmacological or food acceptable salt of a novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate.
  • Acid addition salts are prepared by conventional methods, for example, by dissolving the compound in an excess of aqueous acid solution and precipitating the salt using a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • Equivalent amounts of the compound and acid or alcohol in water can be dried by evaporation and then the mixture is evaporated to dryness or the precipitated salt can be suction filtered.
  • an organic acid and an inorganic acid may be used as the free acid
  • hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, and tartaric acid may be used as the inorganic acid
  • methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, acetic acid, and trifluoro may be used as the organic acid.
  • Acetic acid, citric acid, maleic acid, succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, manderic acid, propionic acid, lactic acid, glycolic acid, gluconic acid, Galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, aspartic acid, ascorbic acid, carbonic acid, vanic acid, hydroiodic acid and the like can be used.
  • bases can be used to prepare pharmacologically or foodologically acceptable metal salts.
  • the alkali metal or alkaline earth metal salt is obtained, for example, by dissolving the compound in an excess of an alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the inexpensive compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • the metal salt it is particularly suitable to prepare sodium, potassium, or calcium salts, and the corresponding silver salt is obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (eg, silver nitrate).
  • the method for preparing a novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate comprises (a) adding, dissolving and heating a catalyst for phytochemical and esterification reaction in the form of phenolic acid in a reaction solvent Proceeding to the activation reaction of the phytochemical and obtaining a primary reaction mixture comprising the activated form of the phytochemical; And (b) adding the fructooligosaccharide represented by the following general structural formula to the primary reaction mixture and heating it under an inert gas atmosphere to proceed with the esterification reaction between fructooligosaccharides and phytochemicals.
  • the method for producing a novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate preferably (c) cools and leaves the secondary reaction mixture to precipitate the phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate and centrifuge and The washing may be sequentially performed to further include obtaining a purified phytochemical-fructooligosaccharide conjugate.
  • 'Glu' represents glucose
  • 'Fru' represents fructose
  • k is a number of fructose linked through a glycosidic bond, selected from an integer of 2 to 60, preferably selected from an integer of 5 to 49, and preferably selected from an integer of 9 to 41.
  • the phytochemical activation reaction of step (a) is preferably performed at 45 to 120 ° C for 2 to 20 hr, and 50 to 80 ° C It is more preferable to proceed for 5 to 18 hr.
  • the reaction solvent used in the step (a) is a phenolic acid (Phenolic acid) type of phytochemicals (Phytochemical), catalysts for the esterification reaction and fructooligosaccharides (Fructooligosaccharide) that can dissolve the type is greatly limited It can be selected from various organic solvents known in the art of organic synthesis.
  • the reaction solvent may be selected from polar organic solvents, and specific types thereof include dimethylsulfoxide, dimethylformamide, hexamethylphosphoramide, and N-methylpyrrolid. Don (N-methylpyrrolidone), tetrahydrofuran (tetrahydrofuran), ethyl acetate (ethyl acetate), acetone (acetone), acetonitrile (acetonitrile), propylene carbonate (propylene carbonate) and the like.
  • the catalyst for the esterification reaction used in step (a) may be selected from various known catalysts used for esterification reaction between carboxylic acid and alcohol or esterification reaction between carboxylic acid and hydroxyl group.
  • carbonyl diimidazole N, N'-carbonyldiimidazole, CDI
  • dicyclohexylcarbodiimide 2-bromo-1-methylpyridinium iodide (2-bromo- 1-methylpyridinium iodide).
  • the molar ratio of the phytochemical (Phytochemical) in the form of phenolic acid (Phyochemical), the catalyst for the esterification reaction, and the fructooligosaccharide used in the method for preparing a novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate according to an embodiment of the present invention It is preferably selected from the range 1: 1: 1 to 40: 40: 1, and preferably selected from the range 2: 2: 1 to 35: 35: 1.
  • the molar ratio of ferulic acid, the catalyst for the esterification reaction, and the fructooligosaccharide is preferably 20: 20: 1 to 35: 35: 1.
  • the molar ratio of ferulic acid, a catalyst for esterification reaction, and fructooligosaccharide is preferably 2: 2: 1 to 10: 10: 1.
  • esterification reaction of step (b) in the method of preparing a novel phytochemical-fructo-oligosaccharide complex according to an embodiment of the present invention is preferably carried out at 70 to 150 ° C for 2 to 15 hr, and 80 to 120 It is more preferable to proceed for 3 to 10 hr at °C.
  • a lower alcohol solvent having 2 to 5 carbon atoms may be used to wash the phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate of step (c) in the method for preparing a novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate according to an embodiment of the present invention.
  • the lower alcohol solvent includes ethanol, isopropyl alcohol, and the like.
  • step (a) can be represented as the following chemical reaction formula 1 as an activating step of ferulic acid
  • step (b) is the activating ferulic acid to fructooligosaccharide.
  • step (a) can be represented by the following chemical reaction scheme 2.
  • One aspect of the present invention relates to various pharmaceutical uses, health functional food uses or cosmetic uses based on the physiological activity of a novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate.
  • An example of the present invention provides a composition for anti-cancer using a novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate or a pharmaceutically (or foodologically) acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • an example of the present invention provides a composition for preventing, improving or treating colorectal cancer using the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate or a pharmaceutically (or foodologically) acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • an example of the present invention provides a composition for inhibiting metastasis of colorectal cancer using a novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • an example of the present invention provides a novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate or a composition for antioxidant using an pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate is preferably FA-FOS I or FA-FOS II described above.
  • the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate as an active ingredient in the composition for preventing, improving or treating colorectal cancer according to an embodiment of the present invention is preferably FA-FOS I or FA-FOS II described above, and FA-FOS It is more preferable that it is II.
  • the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate is preferably FA-FOS I or FA-FOS II, and FA-FOS I It is more preferable.
  • the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate as an active ingredient in the antioxidant composition according to an example of the present invention is preferably FA-FOS I or FA-FOS II, and more preferably FA-FOS I. .
  • the composition for anticancer, the composition for preventing, improving or treating colon cancer, the composition for inhibiting metastasis of colon cancer, or the composition for antioxidant according to an embodiment of the present invention is a pharmaceutical composition, food additive, food composition (especially health Functional foods) or feed additives, and the like.
  • the antioxidant composition according to an embodiment of the present invention may be embodied as a cosmetic composition for preventing skin aging.
  • the content of the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate as an active ingredient in various compositions according to an example of the present invention may be adjusted in various ranges depending on the specific form of the composition, purpose of use, and aspect.
  • the content of the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate as an active ingredient is not significantly limited, for example, 0.01 to 99% by weight, preferably 0.5 to 50% by weight, based on the total weight of the composition, More preferably, it may be 1 to 30% by weight.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include an additive such as a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in addition to the active ingredient.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical compositions of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate , Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain one or more known active ingredients having anti-cancer activity, particularly anti-colon cancer activity, in addition to the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a formulation for oral administration or a formulation for parenteral administration by a conventional method, and when formulated, a filler, a bulking agent, a binder, a wetting agent, a disintegrant, a surfactant, etc. It may be prepared using diluents or excipients. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc.
  • Solid preparations include at least one excipient in the active ingredient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose ), Lactose (Lactose) or gelatin can be prepared by mixing.
  • lubricants such as magnesium stearate talc may be used in addition to simple excipients.
  • Liquid preparations for oral administration include suspending agents, intravenous solutions, emulsions and syrups, but may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc. have.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • non-aqueous solvent and a suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used.
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, and glycerogelatin may be used.
  • it can be preferably formulated according to each disease or ingredient using methods disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA, or by appropriate methods in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally to mammals, including humans, according to the desired method, and the parenteral administration method is for external application to the skin, intraperitoneal injection, intrarectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, and muscle. Intra-injection or intra-thoracic injection.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically effective amount, and the range thereof depends on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate, and disease severity. Varies.
  • the typical daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but is preferably 10 to 9000 mg / kg, more preferably 100 to 5000 mg / kg, once a day based on the active ingredient. Or it can be divided into several times and administered.
  • the content of the novel phytochemical-fructo-oligosaccharide conjugate as an active ingredient is 0.01 to 99% by weight, preferably 0.1 to 50% by weight, more preferably 0.5 to 0.5% by weight based on the total weight of the composition. 25% by weight, but is not limited thereto.
  • Food composition of the present invention includes a form of pills, powders, granules, needles, tablets, capsules, or liquids, and examples of specific foods include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, Other dairy products, including noodles, gums, and ice creams, various soups, beverages, teas, functional waters, drinks, alcoholic beverages, and vitamin complexes, etc., which include all health functional foods in the ordinary sense.
  • the food composition of the present invention may contain, as an additional component, a food-acceptable carrier, various flavoring agents, or natural carbohydrates, etc., in addition to the active ingredient.
  • the food composition of the present invention is a variety of nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol , Carbonic acid used in carbonated beverages, and the like.
  • the cosmetic composition according to the present invention can be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactants -It may be formulated as a containing cleansing, oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition of the present invention may be prepared in the form of flexible lotion, nutrition lotion, nutrition cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • ferulic acid was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare a ferulic acid solution having a concentration of 5% (w / v).
  • carbonyl diimidazole N, N'-carbonyldiimidazole, CDI
  • the activated form of ferulic acid is Feruloyl imidazole.
  • fructooligosaccharide [about 2 to 60 D-fructose residues are linked by ⁇ (2 ⁇ 1) bonds to the reaction vessel, and one D-glucose on one end is ⁇ (1) to D-fructose.
  • ⁇ 2 ⁇ 1) bonds bonds to the reaction vessel, and one D-glucose on one end is ⁇ (1) to D-fructose.
  • ⁇ 2 ⁇ 2 bonds bonds to the reaction vessel, and one D-glucose on one end is ⁇ (1) to D-fructose.
  • ⁇ 2 ⁇ 2 ⁇ 2 ⁇ 2 ⁇ 1 bonds to the reaction vessel, and one D-glucose on one end is ⁇ (1) to D-fructose.
  • reaction vessel was increased to 90 ° C., and the reaction was performed by continuously stirring for about 7 hr under an inert gas (nitrogen) atmosphere to grafting activated ferulic acid into fructooligosaccharide.
  • inert gas nitrogen
  • the reaction mixture was cooled to room temperature, and ice-cold iso-propyl alcohol was added in an amount of about 3 times the volume of the reaction mixture, and left at about 4 ° C. overnight to allow the ferulic acid-fructooligosaccharide conjugate (FA). -FOS) was precipitated.
  • FA ferulic acid-fructooligosaccharide conjugate
  • reaction mixture was centrifuged (4000 ⁇ g, 20 minutes) to obtain pellets, and the obtained pellets were washed about 3 times with iso-propyl alcohol to remove unreacted ferulic acid, carbonyldiimidazole and feruloyl imidazole.
  • the final reaction product, FA-FOS I had a production yield of about 89%.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • ferulic acid was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare a ferulic acid solution having a concentration of 5% (w / v).
  • carbonyl diimidazole N, N'-carbonyldiimidazole, CDI
  • the activated form of ferulic acid is Feruloyl imidazole.
  • fructooligosaccharide [about 2 to 60 D-fructose residues are linked by ⁇ (2 ⁇ 1) bonds to the reaction vessel, and one D-glucose on one end is ⁇ (1) to D-fructose.
  • ⁇ 2 ⁇ 1) bonds bonds to the reaction vessel, and one D-glucose on one end is ⁇ (1) to D-fructose.
  • ⁇ 2 ⁇ 2 bonds bonds to the reaction vessel, and one D-glucose on one end is ⁇ (1) to D-fructose.
  • ⁇ 2 ⁇ 2 It is a polymer in a form connected by bonding] and dissolved, and then the reaction vessel was sealed.
  • the molar ratio of ferulic acid, carbonyldiimidazole and fructooligosaccharide present in the sealed reaction vessel was 4: 4: 1.
  • reaction vessel was increased to 90 ° C., and the reaction was performed by continuously stirring for about 7 hr under an inert gas (nitrogen) atmosphere to grafting activated ferulic acid into fructooligosaccharide.
  • inert gas nitrogen
  • the reaction mixture was cooled to room temperature, and ice-cold iso-propyl alcohol was added in an amount of about 3 times the volume of the reaction mixture, and left at about 4 ° C. overnight to allow the ferulic acid-fructooligosaccharide conjugate (FA). -FOS).
  • reaction mixture was centrifuged (4000 ⁇ g, 20 minutes) to obtain pellets, and the obtained pellets were washed about 3 times with iso-propyl alcohol to remove unreacted ferulic acid, carbonyldiimidazole and feruloyl imidazole.
  • ferulic acid-fructo-oligosaccharide conjugate II (abbreviated as 'FA-FOS II')
  • the final reaction product, FA-FOS II had a production yield of about 89%.
  • the degree of substitution of ferulic acid in FA-FOS I and FA-FOS II is defined as the average number of attached ferulic acids per basic unit of fructooligosaccharide.
  • FA-FOS I and FA-FOS II were respectively added to a 2M NaOH aqueous solution and incubated for 2 hr to release a ferrule group from the conjugate. Subsequently, a 6N concentration of an aqueous HCl solution was added to the NaOH aqueous solution to adjust the pH to 2, and the released ferrule group was acidified in the form of free ferulic acid. Thereafter, ferulic acid was extracted three times with ethyl acetate, and the amount of ferulic acid released was quantified by HPLC, and the degree of substitution of ferulic acid was calculated by the following equation.
  • Table 1 shows the substitution degree of% Ferulate and ferulic acid in FA-FOS I and FA-FOS II.
  • the degree of ferulic acid substitution of FA-FOS I was about 10 times higher than that of FA-FOS II.
  • FA-FOS I was insoluble in water and organic solvents, while FA-FOS II was immediately dissolved in water and organic solvents. It was confirmed that the higher the degree of substitution of ferulic acid, the lower the solubility of FA-FOS in water.
  • FA-FOS I was insoluble in water because of both amphiphilic properties and was immediately dissolved in ionic liquids such as Tetrabutyl Phosphonium Acetate and Tetra butyl ammonium acetate.
  • FIG. 1 is a spectral result of analyzing ferulic acid (FA), fructooligosaccharide (FOS) and FA-FOS I with a Fourier-transform infrared spectroscopy.
  • FA-FOS I was designated as 'FA FOS I'.
  • the modest peak of fructooligosaccharide (FOS) at 3400 cm -1 decreased significantly in FA-FOS I as the number of hydroxyl groups decreased.
  • the peak at 1726 cm -1 of FA-FOS I indicates a substitution or esterification reaction, and the two peaks occurring at 2947 cm -1 , 3008 cm -1 , and 2842 cm -1 are Feruloyl substitutions.
  • methyl and methylene CH stretching The peak between 900 and 1200 cm -1 of FOS is due to CO stretching, and the peak at 3074 cm -1 of FA-FOS I is due to the methanehydrogen-related CH stretching of the ring.
  • ferulic acid (FA), fructooligosaccharide (FOS), and FA-FOS I were analyzed by a solid state NMR spectrometer under 13C (L armor frequency: 400.25 MHz). Since FA-FOS I is not soluble in organic solvents such as dimethylsulfoxide (DMSO), solid state NMR was performed to explain its structure. In the 13C solid state NMR spectrum of FA-FOS I, aromatic carbon of ferulic acid was observed between 100 ppm and 150 ppm and carbonyl carbon (-COOH) migration of ferulic acid was in the region exceeding 150 ppm. Was observed.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • ferulic acid (FA), fructooligosaccharide (FOS) and FA-FOS I were analyzed by a solid state NMR spectroscopy under 1H (L armor Frequency: 400.66 MHz, spin rate: 14KHZ) conditions. .
  • the peak of 13.19 ppm in the FA 1H solid state NMR spectrum corresponds to the chemical shift of the carboxylic acid (R-COOH) present in ferulic acid.
  • R-COOH carboxylic acid
  • the peak of 13.19 ppm was not present and a strong peak was observed at 4.94 ppm because ferulic acid binds glucose and fructose, sugar molecules of fructooligosaccharide (FOS).
  • the strong peak at 4.94 ppm represents the -OH group attached to the aromatic group of ferulic acid in FA-FOS I.
  • the peak at 6.94 ppm observed in FA-FOS I corresponds to -H bonded to the aromatic ring of ferulic acid, and is not present in the NMR spectrum of pure fructooligosaccharide.
  • the apparent peak of 2.56 ppm observed in FA-FOS I is due to the carbonyl group in which ferulic acid is substituted for fructooligosaccharide, which is powerful for the conjugation of ferulic acid and fructooligosaccharide (FOS). It becomes evidence.
  • FA ferulic acid
  • FOS fructooligosaccharide
  • XRD X-ray diffraction
  • FA-FOS I was analyzed by UV-Vis spectroscopy (Ultraviolet-visible spectroscopy) and fluorescence spectrophotometer (Fluorescence spectrophotometer). As a result, FA-FOS I absorbed light at 280 nm and emitted light at 310 nm.
  • TGA thermal gravimetric analysis
  • FOS ferulic acid
  • FOS fructooligosaccharide
  • FA-FOS I showed a weight loss of about 41.5% at 400 ° C. It can be seen that FA-FOS I has higher thermal stability compared to FOS.
  • the zeta potential of FA-FOS I was measured, and particle size was measured using dynamic light scattering (DLS).
  • the zeta potential of FA-FOS I was found to be -14.5 ⁇ 4.88 mV, and the average particle diameter was found to be 1.839 ⁇ 0.339 ⁇ m.
  • the low zeta potential of FA-FOS I appears to be caused by the grafting of ferulic acid, and FA-FOS I is self-aggregated with a higher order structure that produces a homogeneous suspension in water. Can be.
  • the polydispersity index of FA-FOS I measured through DLS was 0.243, indicating homogeneity.
  • FA-FOS I as shown in Figure 2 has a disk-like structure having an average diameter of about 2 ⁇ m by self aggregation.
  • FA-FOS I having a disk-like structure is formed by layer-like sheet-like assembly with cavities.
  • FIG. 3 is a spectrum result of analyzing ferulic acid (FA), fructooligosaccharide (FOS) and FA-FOS II by a Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) spectroscopy.
  • FA-FOS II is designated as 'FA FOS II'.
  • the gentle peak at 3400 cm -1 of fructooligosaccharide (FOS) decreased in FA-FOS II as the number of hydroxyl groups decreased.
  • the small peak at 1717 cm -1 of FA-FOS II represents an esterified carbonyl group, and the peak between 900 and 1200 cm -1 is due to CO stretching derived from the FOS molecule.
  • FA-FOS II was analyzed by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy under 13C and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy under 1H.
  • the multiplets observed in the 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum of FA-FOS II are as follows.
  • 13C NMR (DMSO-d6) ⁇ : 104.25, 103.52, 103.38, 81.89, 76.88, 74.46, 62.33, 61.79, 40.64, 25.76.
  • the multiplets observed in the 1H nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum of FA-FOS II are as follows.
  • the main component of FA-FOS II is a ferulic acid-fructo-oligosaccharide binder represented by the following formula (VI).
  • VI ferulic acid-fructo-oligosaccharide binder
  • LC-MS liquid chromatography-mass spectrometry
  • MS-MS mass spectroscopy-mass spectroscopy
  • FA-FOS I and FA-FOS II were placed in simulated salivary fluid (SS), simulated gastric fluid (SGF) and simulated small intestine fluid (SSI), respectively, at 37 ° C. Stability characteristics when incubated for 0 min, 15 min, 30 min, and 1 hr to 4 hr were measured by HPLC.
  • the simulated salivary fluid (SS), simulated gastric fluid (SGF) and simulated small intestinal fluid (SIM) used in the experiment of measuring the stability characteristics of the ferulic acid-fructo-oligosaccharide complex in oral-gastric duct simulation conditions
  • the composition of Intestine fluid (SSI) is as follows.
  • the cultured medium was centrifuged to collect the supernatant, the pH of the supernatant was adjusted to 2 by adding a 6N aqueous solution of HCl to the collected supernatant, and free ferulic acid was extracted 3 times with twice the volume of ethyl acetate. Thereafter, the extract was evaporated under a nitrogen atmosphere to remove ethyl acetate and dissolved in a 50% aqueous methanol solution to prepare an analysis sample. Then, the analysis sample was analyzed by HPLC to determine the amount of free ferulic acid released under simulated colon environmental conditions.
  • the composition of the anaerobic minimal basal medium used in the above experiment is as follows.
  • Peptone 0.2g Yeast extract 0.1g, NaCl 0.01g, K 2 HPO 4 0.004g, KH 2 PO 4 0.004g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.001g, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O 0.001g, based on 100ml NaHCO 3 0.2g, Bile salts 0.05g, L-Cysteine HCl 0.05g, Tween 80 0.2ml, 0.05% Resazurin solution A 0.1ml, Hemin 0.0005g, 0.02 Mm Vitamin K 1 10 ⁇ l
  • Intestinal digestive enzyme solution is a liquid prepared by adding 0.02% (w / v) sodium azide solution to Cellulase, Endo-galactouranase, endo-carbohydrase, exo-glycosidase, and Feruloyl esterase produced by bacteria in the colon. It is a mixed enzyme solution and the pH is 6.
  • the intestinal digestive enzyme solution is Driselase (Amano enzymes, Japan) 50 mg, Protease M Amano (Amano enzymes, Japan) 50 mg, DEPOL 670L (Biocatalyst, UK) 50 ⁇ l, DEPOL 740L in 5 ml of MOPS buffer at pH 6.0 (Biocatalyst, UK) 50 ⁇ l and 0.02% (w / v) sodium azide dissolved.
  • the culture solution was centrifuged to collect the supernatant, and the collected supernatant was added with an aqueous 6N HCl solution to adjust the pH to 2, and free ferulic acid was extracted 3 times with 3 times the volume of ethyl acetate. Thereafter, the extract was evaporated under a nitrogen atmosphere to remove ethyl acetate and dissolved in a 50% aqueous methanol solution to prepare an analysis sample. Then, the analysis sample was analyzed by HPLC.
  • Table 2 shows the results of FA-FOS I stability experiments under the conditions of simulated oral-gastrointestinal tract, digestion characteristics under colon environment conditions simulated by a human microflora, and stability experiments on intestinal digestive enzymes.
  • Table 3 shows the results of the stability test under the conditions of FA-FOS II oral-gastrointestinal mimicry, digestion properties under the colonic environment simulated by the human microflora, and stability intestinal digestive enzymes.
  • Stability was expressed as a percentage by comparing the amount of ferulic acid contained in the ferulic acid-fructo-oligosaccharide conjugate before incubation with the amount of free ferulic acid released from the ferulic acid-fructo-oligosaccharide conjugate after incubation at 37 ° C.
  • Half-life is expressed as the time at which half of the ferulic acid contained in the ferulic acid-fructooligosaccharide conjugate is released into the medium.
  • FA-FOS I and FA-FOS II were simulated salivary. Little decomposition in fluid, SS), simulated gastric fluid (SGF), and simulated small intestine fluid (SSI).
  • FA-FOS I is more resistant to intestinal digestive enzymes than FA-FOS II, and the amount of free ferulic acid released is very small.
  • Human normal colon cell lines such as CCD 18Co (Normal Human colon fibroblast primary cell line), colon cancer cell lines such as Colorectal adenocarcinoma (capable of inducing tumor in mice), or Lovo (Duke's type C, grade IV, Colorectal adenocarcinoma capable) of metastasis) treated with oxaliplatin, 5-Fluorouracil, FA-FOS I, FA-FOS II, and ferrulic acid (FA) as drugs in metastatic colorectal cancer cell lines. The induction of death was observed.
  • CCD 18Co Normal Human colon fibroblast primary cell line
  • colon cancer cell lines such as Colorectal adenocarcinoma (capable of inducing tumor in mice), or Lovo (Duke's type C, grade IV, Colorectal adenocarcinoma capable) of metastasis) treated with oxaliplatin, 5-Fluorouracil, FA-FOS I, FA-FOS II
  • cell lines cultured in each well of a 96-well plate were dispensed at a density of 18,000 cells per well and incubated overnight, followed by treatment with cells dissolved in various concentrations in a culture medium and temperature of 37 ° C. in a humidified incubator. And 5% CO 2 for 72 hr. After the culture was completed, the medium was removed and replaced with 100 ⁇ l of PBS, followed by adding 10 ⁇ l of a Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Japan) solution and incubating for 3 hr to react. Thereafter, the degree of color development of the reaction solution was measured by absorbance at 450 nm, and the number of cell proliferation was calculated according to the manufacturer's instructions.
  • HT-29 cells were cultured in McCoy's 5A medium, LoVo cells were cultured in Ham's F-12K (Kaigh's) medium, CCD 18Co cells were cultured in DMEM, and 10% Fetal bovine serum and 100 U / ml penicillin, streptomycin was added.
  • Figure 5 is the HT-29 cell line and Lovo cell line oxaliplatin (Oxaliplatin), FA-FOS I, FA-FOS II and ferulic acid (Ferulic acid, FA) treatment of cancer cell death induction progress when Annexin V and Propidium iodide After staining, the result was observed with a fluorescent microscope.
  • FIG. 6 shows TUNEL assay (terminal deoxynucleotidyl transferase-dUTP nick end labeling) and additional Hoechst 33342 staining of cancer cell killing induction when FA-FOS I and FA-FOS II were treated on HT-29 and Lovo cell lines. It is the result observed with a fluorescence microscope.
  • IC 50 half maximal inhibitory concentration
  • SI Selectivity Index
  • SI Selectivity Index, IC 50 for Normal cell (CCD 18Co) / IC 50 for Cancer cell
  • FA-FOS I and FA-FOS II showed excellent colon cancer cell killing effects.
  • FA-FOS I was found to have a higher selectivity index when compared to the commercial drugs Oxaliplatin and 5-Fluorouracil.
  • FA-FOS I showed lower IC 50 values than FA.
  • TNFRSF9 is also called CD137 belonging to the TNF-receptor super family, is involved in clonal expansion, survival and development of T cells (immune cells), and activates T cells to cause an immune response, IL It is known to induce the secretion of -2 (Inter Lukin 2) and invasion of immune cells and remove tumors. Up-regulation of TNFRSF9 provides a clue as to the potential of FA-FOS I to remove tumor / cancer cells in vivo through immune cell mediation.
  • Cell Cycle Arrest is one of the functions of anticancer drugs by examining the proliferation of tumor cells by regulating a cell cycle check point modulator called Cyclin.
  • a cell cycle check point modulator called Cyclin.
  • FA-FOS I was treated at various concentrations, cultured for 24 hr for LoVo cell line, cultured for 72 hr for HT-29 cell line, and then the proliferated cells were stained with DAPI and the cell number was analyzed by FACS.
  • FA-FOS I stopped the cell cycle in a dose-dependent manner during the GO phase of the cell cycle.
  • the anticancer activity of FA-FOS I and FA-FOS II was evaluated using a mouse model in which colon cancer was induced with AOM (Azoxymethane) -DSS (Dextran Sodium sulfate). Five to six week old C57BL / 6 female mice were randomly assigned to each of the following 6 groups of 7 mice each, and the treatment required for each group was performed.
  • Control (ii): AOM-DSS-induced colon cancer-induced mice, and do not administer a separate drug
  • Oxaliplatin treatment group Drugs are prepared by dissolving oxaliplatin in water, and orally administered to mice based on the amount of oxaliplatin at a dose of 30 mg / kg (b.w).
  • Ferulic acid treatment group A drug is prepared by dissolving ferulic acid in water, and orally administered to a mouse at a dose of 100 mg / kg (b.w) based on the amount of ferulic acid.
  • FA-FOS I treatment group (v) FA-FOS I treatment group (FA FOS-I): A drug was prepared by suspending the ferulic acid-fructo-oligosaccharide complex FA-FOS I in water, and 500 mg / kg (based on the amount of FA-FOS I) bw) orally
  • FA-FOS II treatment group (FA FOS-II): A drug was prepared by dissolving the ferulic acid-fructo-oligosaccharide complex FA-FOS II in water, and based on the amount of FA-FOS II, 3890 mg / kg ( bw) orally
  • FIG. 7 schematically shows an experimental process for evaluating anticancer activity of ferulic acid-fructooligosaccharide conjugate using a mouse model in which colon cancer is induced by AOM-DSS.
  • FIG. 8 shows (a) the total number of tumor lesions in the colon, (b) colon index among experimental results evaluating the anticancer activity of the ferulic acid-fructooligosaccharide conjugate using a mouse model in which colon cancer was induced by AOM-DSS. , (c) Mice's body weight at the end of drug treatment and (d) Mice's body weight gain during 4 weeks of treatment regimen.
  • the number of tumor lesions in the FA-FOS II treated group was reduced by 77.1% (p ⁇ 0.001) compared to the control group.
  • the FA-FOS II treatment group showed a higher tumor reduction compared to the oxaliplatin treatment group and the ferulic acid treatment group.
  • the mouse colon index was not significantly different between the FA-FOS II treated group and the normal group.
  • FIG. 9 shows the results of immunological parameters among experimental results evaluating the anticancer activity of ferulic acid-fructooligosaccharide conjugate using a mouse model in which colon cancer was induced by AOM-DSS.
  • WBC white blood cells
  • b is the total number of bone marrow cells
  • c is the thymus index (thymus / weight)
  • d is the spleen index (spleen / weight)
  • e Is the concentration of interleukin 3 in plasma
  • (f) is the result of interferon gamma concentration in plasma.
  • FA ferulic acid
  • Ferulic acid (FA) administration group Prepare a drug by dissolving ferulic acid (FA) in water and orally administer it at a prescribed dose
  • FA-FOS II administration group FA-FOS II was dissolved in water to prepare a drug and administered orally at a prescribed dose.
  • Ferulic acid was orally administered at a dose of 100 mg / kg body weight based on the amount of ferulic acid (FA) in a state dissolved in sterile water.
  • FA-FOS II was orally administered at a dose of 3.89 g / kg body weight (equivalent to 100 mg / kg body weight in terms of ferulic acid) based on the amount of FA-FOS II in a state dissolved in sterile water.
  • rat blood was sampled continuously over 0, 0.5, 1, 3, 6, 8, 12, 24 hr. The sampled samples were subjected to LC MS / MS analysis in a multiple reaction monitoring (MRM) method with a material molecular weight of 193.0 / 133.9 Da (intact mass / fragment mass of FA) to quantify free FA in plasma.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • FIG. 10 shows the pharmacokinetic release profile of ferulic acid (FA) liberated from FA-FOS II in rat plasma.
  • the Tmax of FA liberated from FA-FOS II in the FA-FOS II administration group was about 30 minutes.
  • Tmax in the ferulic acid (FA) administration group was about 5 minutes.
  • the average residence time of FA liberated from FA-FOS II in the FA-FOS II administration group is about 240 minutes, compared with T 1/2 of about 30 minutes in the ferulic acid (FA) administration group It was a relatively long time.
  • the Cmax of free FA observed after FA-FOS II administration was 27.08 ⁇ M.
  • AUC Area under curve
  • the anti-cancer activity of FA-FOS II was evaluated using xenograft mice bearing HT-29 tumors. Specifically, BALB / c nude mice were randomly assigned to the following four groups, and treatment required for each group was performed. In addition, a xenograft mouse model carrying HT-29 tumor was prepared in the following manner. First, the HT-29 cell line was cultured and harvested in RPMI 1640 medium with 10% FBS under 5% CO 2 conditions. After diluting the harvested HT-29 cell line culture and injecting it into the right lateral subcutaneous area of BALB / c nude mice at an amount of 1 ⁇ 10 7 cells / 0.2 ml / mice, until the tumor volume reaches 150-200 mm 3 I waited.
  • 5-Fluorouracil treatment group (5-Fu): 5-Fluorouracil (5-Fluorouracil) was dissolved in 0.9% saline to prepare the drug, and IP was administered intraperitoneally / less than 0.2 ml for 1 week Administered once a day for 5 consecutive days, rested for 1 week, 1 week for 2 weeks at a dose of 15 mg / kg (bw) per mouse based on the amount of 5-Fluorouracil Administered twice in IP (this specific treatment regimen was chosen due to the side effects of 5-FU observed by the investigator)
  • FA-FOS II treatment group (iv) FA-FOS II treatment group (FA FOS II): A drug was prepared by dissolving the ferulic acid-fructo-oligosaccharide complex FA-FOS II in distilled water, and based on the amount of FA-FOS II, 3890 mg / kg (bw ), Orally administered daily for 4 weeks
  • Figure 11 shows the results of experiments evaluating the anti-cancer activity of the ferulic acid-fructooligosaccharide conjugate FA-FOS II using a HT-29 tumor bearing xenograft mouse model (a) tumor volume after 4 weeks of treatment, (b) tumor growth rate , (c) tumor weight after 4 weeks of treatment, (d) weight after 4 weeks of treatment, (e) daily weight gain during treatment and (f) weight gain during treatment.
  • the tumor volume in the FA-FOS II treated group was reduced by about 50% compared to the control group (p ⁇ 0.05).
  • the average seed weight was reduced by about 37.34% compared to the control group.
  • the body weight measured to indirectly examine the toxicity or side effects of drug treatment was increased by about 6% in the FA-FOS II treated group compared to the control group.
  • the daily weight gain rate was also increased by about 41.47% in the FA-FOS II treated group compared to the control group.
  • the weight gain in the FA-FOS II treated group during the entire treatment period was higher than that of the control group, and these results suggest that the ferulic acid-fructooligosaccharide conjugate FA-FOS II did not cause side effects.
  • the antioxidant activity of FA-FOS I was measured using ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)] cationic radical scavenging activity assay.
  • the ABTS cationic radical scavenging activity assay was performed according to Arda Serpen et al., 2007. Specifically, after adding lyophilized FA-FOS I in various amounts into an eppendorf tube, after adding 1.7 ml of a chemically generated ABTS cationic radical reagent using MnO 2, for 2 minutes The mixture was stirred uniformly and the reaction proceeded for 6 minutes.

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Abstract

본 발명은 페놀산(Phenolic acid) 형태의 파이토케미컬(Phytochemical)이 프럭토올리고당 주쇄를 구성하는 일부 당에 결합된 구조를 가지는 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체를 제공한다. 본 발명에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체는 이에 대응되는 페놀산 파이토케미컬에 비해 구강-위장관 통과 조건에서 거의 분해되지 않고 대부분이 대장에 도달할 수 있으므로 경구 투여시 대장에서 우수한 생체이용성을 갖는다. 특히, 본 발명에 따른 페룰산-프럭토올리고당 결합체는 상업적인 대장암 치료용 약물과 비교하였을 때 대장암 세포에 대한 선택적 사멸 효과가 우수하여, 대장암을 예방, 개선 또는 치료하는데에 유용한 식의약 소재로 사용될 수 있다.

Description

파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체, 이의 제조방법 및 이의 용도
본 발명은 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 등에 관한 것으로서, 더 상세하게는 프럭토올리고당의 주쇄를 구성하는 일부 당에 페놀산 형태의 파이토케미컬이 측쇄 결합되어 형성된 신규 물질, 이의 제조방법 및 이의 생리활성에 기반한 다양한 용도에 관한 것이다.
대장암(Colorectal cancer, CRC)은 세계적으로 암 사망률 중 3번째로 높은 질환이며 매년 백만 명 이상의 사람들이 대장암에 걸리는 것으로 보고되어 있다. 대장암 발명의 유전적 위험은 약 10%인 반면, 놀랍게도 나머지 90%는 건강하지 못한 생활방식과 식습관에 기인한다. 대장암을 치료하기 위해 개발된 대부분의 약물 및 화합물들은 합성물질이거나 바이오시밀러이고, 이들은 치료 과정 중 또는 치료 후에 환자들에게 합병증과 같은 심각한 부작용 또는 삶의 질을 떨어뜨리는 의도하지 않은 문제들을 야기한다. 방사선 요법, 화학 요법 및 다른 중재적 요법과 같은 전통적인 치료를 받았을 때 대부분의 CRC 환자들은 심각한 합병증으로 인해 상황이 악화되기 때문에 CRC 환자의 생존율은 과학 분야에서 가장 큰 도전 과제 중 하나이다. 또한, 치료 중의 차도 기간 후에 재발의 발생 빈도가 낮은 적절한 치료 계획이 개발되어야 한다. 현재 이용 가능한 치료 계획 내지 체계는 암을 제거하기 위한 최선의 노력에도 불구하고 암이 빈번하게 재발된다. 따라서, 부작용이 적거나 없고 환자의 회복율이 높은 암 치료법에 대해 높은 수요가 있다. 또한, 산화적 스트레스 및 이와 관련된 질환도 다양한 건강 문제 및 합병증에 책임이 있는 것으로 알려져 있다.
한편, 식품원으로부터 유래하는 파이토케미컬(Phytochemical)은 식물 속에 들어 있는 화학물질로 식물 자체에서는 경쟁 식물의 생장을 방해하거나, 각종 미생물 또는 해충 등으로부터 자신의 몸을 보호하는 역할 등을 한다. 또한, 파이토케미컬은 사람의 몸에 들어가면 항산화물질이나 세포 손상을 억제하는 작용을 해 건강을 유지시켜 주기도 하는데, 버드나무 껍질에서 추출한 아스피린, 말라리아 특효약인 퀴닌, 발암물질 생성을 억제하는 플라보노이드, 카로티노이드 등이 대표적이다. 파이토케미컬 중 페놀화합물(Phenolic compound) 다양한 건강상의 이익을 가지는 것으로 알려져 있지만, 낮은 용해도 및 생체이용율 때문에 이들의 유익한 특징이 경감된다. 또한, 대부분의 페놀화합물(Phenolic compound)은 소장에서 흡수되고 글루크론산화(glucuronidation), 설페이션(sulphation) 및 메틸레이션(methylation)과 같은 결합반응(conjugation reaction)에 의해 간에서 대부분 대사되므로 매우 낮은 농도의 자유 아글리콘(aglycone)만이 혈장 내에서 생물학적으로 이용된다. 예를 들어, 페놀산(Phenolic acid) 형태의 파이토케미컬(Phytochemical) 중 하나인 페룰산(Ferulic acid)은 항산화 물질로서 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)과 같은 자유라디칼과 반응하여 산화적 스트레스를 감소시키고 DNA 손상, 암, 세포 노화 등을 개선하는 효능을 가지는 것으로 알려져 있다. 그러나 경구로 투여되는 페룰산은 주로 위나 소장에서 분해 및 흡수되고 간에서 대사되기 때문에 대장까지는 매우 적은 양만이 도달된다[Cesare Mancuso et al. : Ferulic acid: Pharmacological and toxicological aspects., Food and Chemical Toxicology 65 (2014) 185-195 참조]. 따라서, 식물원에서 유래하고 생리활성을 가지는 페놀화합물(Phenolic compound)의 혈장 내 생체이용율을 증가시킬 필요가 있다. 또한, 페놀화합물(Phenolic compound)의 대장암 치료 효과를 향상시키기 위해 구강, 위 또는 소장에서 분해되지 않고 대장에 표적화되어 전달되는 페놀화합물 변형 기술이 요구된다. 상기 페놀화합물 변형 기술과 관련된 선행문헌으로는 일본등록특허공보 제5900792호, 일본공개특허공보 제2006-89437호 등이 있다.
본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 페놀산 형태의 파이토케미컬과 동등하거나 향상된 생리활성을 가지면서 동시에 경구 투여시 구강, 위 및 소장 환경에서 거의 분해되지 않고 대부분이 대장에 도달할 수 있는 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체를 제공하는데에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 제조방법을 제공하는데에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 생리활성에 기반한 다양한 의약 용도, 건강기능식품 용도 또는 화장품 용도를 제공하는데에 있다.
본 발명의 발명자들은 페놀산(Phenolic acid) 형태의 파이토케미컬(Phytochemical)을 프럭토올리고당의 주쇄를 구성하는 일부 당에 결합시켜 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체를 합성하였다. 또한, 본 발명의 발명자들은 합성된 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체가 이에 대응되는 페놀산(Phenolic acid) 형태의 파이토케미컬(Phytochemical)에 비해 구강-위장관 통과 조건에서 거의 분해되지 않고 대부분이 대장에 도달할 수 있으며 동시에 암 세포에 대한 선택적 사멸 효과가 우수하고, 특히 대장암 치료 효과가 매우 우수하다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 하기의 화학식 Ⅰ또는 화학식 Ⅱ로 표시되는 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체를 제공한다.
[화학식 Ⅰ]
Figure PCTKR2019014489-appb-img-000001
[화학식 Ⅱ]
PhA-Glu-(Fru) n-Fru
상기 화학식 Ⅰ 및 화학식 Ⅱ에서 'PhA'는 페놀산 형태의 파이토케미컬을 나타내고, 'Glu'는 글루코스를 나타내고, 'Fru'는 프럭토스를 나타내다. 또한, 상기 화학식 Ⅰ 및 화학식 Ⅱ에서 'PhA'와 'Glu'는 에스테르 결합에 의해 연결되고, 'Glu'와 'Fru'는 글리코시딕 결합에 의해 연결되고, 'Fru'와 'Fru'는 글리코시딕 결합에 의해 연결되고, 'Fru'와 'PhA'는 에스테르 결합에 의해 연결된다. 또한, 상기 화학식 Ⅰ에서 m은 글리코시딕 결합에 의해 연결된 4개의 'Fru' 및 에스테르 결합에 의해 'Fru'에 연결된 1개의 'PhA'로 구성된 반복 단위의 수로서 1 내지 14의 정수에서 선택된다. 또한, 상기 화학식 Ⅱ에서 n은 글리코시딕 결합에 의해 연결된 'Fru'의 수로서 1 내지 59의 정수에서 선택된다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 전술한 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 (a) 반응 용매에 페놀산(Phenolic acid) 형태의 파이토케미컬(Phytochemical) 및 에스테르화 반응용 촉매를 첨가 및 용해하고 가열하여 파이토케미컬의 활성화 반응을 진행하고 활성화된 형태의 파이토케미컬을 포함하는 1차 반응 혼합물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 1차 반응 혼합물에 하기의 일반 구조식으로 표시되는 프럭토올리고당(Fructooligosaccharide)을 첨가하고 불활성 가스 분위기하에서 가열하여 프럭토올리고당(Fructooligosaccharide)과 파이토케미컬(Phytochemical) 간의 에스테르화 반응을 진행하고 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체를 포함하는 2차 반응 혼합물을 수득하는 단계를 포함하는 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 제조방법을 제공한다.
[프럭토올리고당의 일반 구조식]
Glu-(Fru) k
상기 프럭토올리고당의 일반 구조식에서 'Glu'는 글루코스를 나타내고, 'Fru'는 프럭토스를 나타내고, k는 글리코시딕 결합을 통해 연결된 프럭토스의 수로서 2 내지 60의 정수에서 선택된다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 전술한 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 전술한 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 전술한 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 대장암 전이 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 전술한 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체는 페놀산(Phenolic acid) 형태의 파이토케미컬(Phytochemical)이 프럭토올리고당 주쇄를 구성하는 일부 당에 결합된 구조를 가진다. 본 발명에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체는 이에 대응되는 페놀산 파이토케미컬에 비해 구강-위장관 통과 조건에서 거의 분해되지 않고 대부분이 대장에 도달할 수 있으므로 경구 투여시 대장에서 우수한 생체이용성을 갖는다. 또한, 본 발명에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체는 식품원에서 유래한 천연물질들로 구성되어 있기 때문에 인체에 안전하다. 특히, 본 발명에 따른 페룰산-프럭토올리고당 결합체는 상업적인 대장암 치료용 약물과 비교하였을 때 대장암 세포에 대한 선택적 사멸 효과가 우수하여, 대장암을 예방, 개선 또는 치료하는데에 유용한 식의약 소재로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체는 우수한 항산화 활성을 가지기 때문에 노화 방지 등에 유용한 식의약 소재 또는 화장품 소재로 사용될 수 있다.
도 1은 페룰산(FA), 프럭토올리고당(FOS) 및 FA-FOS Ⅰ을 FTIR 분광기(Fourier-transform infrared spectroscopy)로 분석한 스펙트럼 결과이다.
도 2는 FA-FOS Ⅰ을 SEM(Scanning Electron Microscopy)으로 분석한 이미지 결과이다.
도 3은 페룰산(FA), 프럭토올리고당(FOS) 및 FA-FOS Ⅱ를 FTIR 분광기(Fourier-transform infrared spectroscopy)로 분석한 스펙트럼 결과이다.
도 4는 인간 대장 미생물총(Human microbiota)에 의해 모사된 대장 환경 조건에서 FA-FOS Ⅱ를 배양하였을 때의 분해 거동을 HPLC로 분석한 결과이다.
도 5는 HT-29 세포주 및 Lovo 세포주에 옥살리플라틴(Oxaliplatin), FA-FOS Ⅰ, FA-FOS Ⅱ 및 페룰산(Ferulic acid, FA)을 처리하였을 때의 암세포 사멸 유도 경과를 Annexin Ⅴ 및 Propidium iodide로 염색 후 형광 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 6은 HT-29 세포주 및 Lovo 세포주에 FA-FOS Ⅰ 및 FA-FOS Ⅱ를 처리하였을 때의 암세포 사멸 유도 경과를 TUNEL 어세이(terminal deoxynucleotidyl transferase-dUTP nick end labeling) 및 추가적인 Hoechst 33342 염색 후 형광 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 7은 AOM-DSS에 의해 결장암이 유발된 마우스 모델을 이용하여 페룰산-프럭토올리고당 결합체의 항암 활성을 평가하기 위한 실험 진행 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 8은 AOM-DSS에 의해 결장암이 유발된 마우스 모델을 이용하여 페룰산-프럭토올리고당 결합체의 항암 활성을 평가한 실험 결과 중 (a) 결장에서의 종양 병변의 총 수, (b) 콜론 인덱스, (c) 약물 치료 종료시 마우스의 체중 및 (d) 4 주의 치료 요법 동안 마우스의 체중 증가율을 나타낸 것이다.
도 9는 AOM-DSS에 의해 결장암이 유발된 마우스 모델을 이용하여 페룰산-프럭토올리고당 결합체의 항암 활성을 평가한 실험 결과 중 면역학적 파라미터 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 래트(Rat) 혈장에서 FA-FOS Ⅱ로부터 유리된 페룰산(FA)의 약동학적 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 11은 HT-29 종양 보유 이종 이식 마우스 모델을 이용하여 페룰산-프럭토올리고당 결합체 FA-FOS Ⅱ의 항암 활성을 평가한 실험 결과 중 (a) 4 주 치료 후 종양 부피, (b) 종양 성장률, (c) 4 주 치료 후 종양 무게, (d) 4 주 치료 후 체중 , (e) 치료 과정 동안 매일 체중 증가율 및 (f) 치료 동안 체중 증가 프로파일을 나타낸 것이다.
도 12는 FA-FOS Ⅰ의 항산화 활성을 ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)] 양이온 라디칼 소거능 분석법을 이용하여 측정한 결과이다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한" 및 "식품학적으로 허용가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "대장암"은 맹장, 결장 또는 직장에 생기는 악성 종양을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 특정 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면은 파이토케미컬과 동등하거나 향상된 생리활성을 가지면서 동시에 경구 투여시 구강, 위 및 소장 환경에서 거의 분해되지 않고 대부분이 대장에 도달할 수 있는 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체는 하기의 일반 구조식으로 표시되는 프럭토올리고당(Fructooligosaccharide) 주쇄; 상기 주쇄의 말단 일 측에 존재하는 글루코스와 에스테르 결합에 의해 연결된 페놀산(Phenolic acid) 형태의 파이토케미컬(Phytochemical); 및 상기 주쇄에 존재하는 프럭토스와 에스테르 결합에 의해 선택적으로 연결된 페놀산 형태의 파이토케미컬로 이루어진다.
[프럭토올리고당 주쇄의 일반 구조식]
Glu-(Fru) j-Fru
상기 프럭토올리고당 주쇄의 일반 구조식에서 'Glu'는 글루코스를 나타내고, 'Fru'는 프럭토스를 나타내고, j는 글리코시딕 결합을 통해 연결된 프럭토스의 수로서 1 내지 59의 정수에서 선택된다. 상기 프럭토올리고당 주쇄의 일반 구조식에서 j는 프럭토올리고당의 난소화성 또는 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 제조 용이성 등을 고려할 때 4 내지 48의 정수에서 선택되는 것이 바람직하고 8 내지 40의 정수에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 일 구성성분인 페놀산 형태의 파이토케미컬은 의약 또는 건강기능식품 용도로 사용될 수 있는 생리활성을 나타내는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 페룰산(Ferulic acid), 카페익산(Caffeic acid), 신남산(Cinnamic acid), 클로로겐산(Chlorogenic acid), 쿠마린(Coumarin), 시나픽산(Sinapinic acid), 치코르산(Cichoric acid), 다이페룰산(Diferulic acid), 쿠마르산(Coumaric acid), 살리실산(Salicylic acid), 3-하이드록시벤조산(3-Hydroxybenzoic acid), 4-하이드록시벤조산(4-Hydroxybenzoic acid), 바닐산(Vanillic acid), 갈산(Gallic acid) 또는 엘라그산(Ellagic acid)에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체에서 파이토케미컬은 바람직하게는 주쇄의 글루코스 6번 탄소에 위치하는 하이드록실기와 파이토케미컬에 존재하는 카르복실기 사이의 에스테르 결합에 의해 주쇄에 필수적으로 연결된다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체에서 파이토케미컬은 바람직하게는 주쇄의 프럭토스 6번 탄소에 위치하는 하이드록실기와 파이토케미컬에 존재하는 카르복실기 사이의 에스테르 결합에 의해 주쇄에 선택적으로 연결된다.
또한, 본 발명의 바람직한 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체는 하기의 화학식 Ⅰ또는 화학식 Ⅱ로 표시되는 화합물에서 선택된다.
[화학식 Ⅰ]
Figure PCTKR2019014489-appb-img-000002
[화학식 Ⅱ]
PhA-Glu-(Fru) n-Fru
상기 화학식 Ⅰ 및 화학식 Ⅱ에서 'PhA'는 페놀산 형태의 파이토케미컬을 나타내고, 'Glu'는 글루코스를 나타내고, 'Fru'는 프럭토스를 나타내다. 또한, 상기 화학식 Ⅰ 및 화학식 Ⅱ에서 'PhA'와 'Glu'는 에스테르 결합에 의해 연결되고, 'Glu'와 'Fru'는 글리코시딕 결합에 의해 연결되고, 'Fru'와 'Fru'는 글리코시딕 결합에 의해 연결되고, 'Fru'와 'PhA'는 에스테르 결합에 의해 연결된다. 또한, 상기 화학식 Ⅰ에서 m은 글리코시딕 결합에 의해 연결된 4개의 'Fru' 및 에스테르 결합에 의해 'Fru'에 연결된 1개의 'PhA'로 구성된 반복 단위의 수로서 1 내지 14의 정수에서 선택되고, 바람직하게는 2 내지 13의 정수에서 선택되고 더 바람직하게는 4 내지 12의 정수에서 선택된다. 또한, 상기 화학식 Ⅱ에서 n은 글리코시딕 결합에 의해 연결된 'Fru'의 수로서 1 내지 59의 정수에서 선택되고, 바람직하게는 2 내지 40의 정수에서 선택되고, 더 바람직하게는 4 내지 20의 정수에서 선택된다.
또한, 본 발명의 더 바람직한 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체는 하기의 화학식 Ⅲ 또는 화학식 Ⅳ로 표시되는 페룰산-프럭토올리고당 결합체에서 선택된다. 본 발명의 더 바람직한 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체에서 페놀산 형태의 파이토케미칼은 페룰산(Ferulic acid)이다. 본 발명의 더 바람직한 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체는 페룰산(Ferulic acid)과 비교하였을 때 동등하거나 향상된 항암 활성(특히 항-대장암 활성)을 가지면서 동시에 경구 투여시 구강, 위 및 소장 환경에서 거의 분해되지 않고 대부분이 대장에 도달하기 때문에 대장에서의 생체 이용성이 우수하다.
[화학식 Ⅲ]
Figure PCTKR2019014489-appb-img-000003
[화학식 Ⅳ]
Figure PCTKR2019014489-appb-img-000004
상기 화학식 Ⅲ에서 m은 글리코시딕 결합에 의해 연결된 4개의 프럭토스 및 에스테르 결합에 의해 프럭토스에 연결된 1개의 1개의 페룰산으로 구성된 반복 단위의 수로서 1 내지 14의 정수에서 선택되고, 바람직하게는 2 내지 13의 정수에서 선택되고 더 바람직하게는 4 내지 12의 정수에서 선택된다. 또한, 상기 화학식 Ⅳ에서 n은 글리코시딕 결합에 의해 연결된 프럭토스의 수로서 1 내지 59의 정수에서 선택되고, 바람직하게는 2 내지 40의 정수에서 선택되고, 더 바람직하게는 4 내지 20의 정수에서 선택된다.
또한, 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체는 하기 화학식 Ⅴ로 표시되는 페룰산-프럭토올리고당 결합체로 이루어지거나 이를 주성분으로 포함한다. 본 발명의 발명자들은 하기 화학식 Ⅴ로 표시되는 화합물을 주성분으로 포함하는 페룰산-프럭토올리고당 결합체를 'FA-FOS Ⅰ'로 명명하였고 물리적 특성을 분석한 결과 물에 대해 불용성이고 수계 환경에서 마이셀(Micelle) 구조의 구형 입자를 형성하는 것으로 나타났다. 또한, 페룰산-프럭토올리고당 결합체 FA-FOS Ⅰ은 구강, 위 및 소장 환경에서 거의 분해되지 않고 대부분 대장에 도달하며 대장 환경에서 점액(Mucus)을 통과하여 산성 조건의 암세포에 부착된 후 암세포의 사멸을 유도하는 것으로 나타났다. 특히, 페룰산-프럭토올리고당 결합체 FA-FOS Ⅰ은 전이가 가능한 대장암 세포만을 선별적으로 사멸시킬 수 있기 때문에 대장암의 전이 억제에 매우 유용하다.
[화학식 Ⅴ]
Figure PCTKR2019014489-appb-img-000005
또한, 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체는 하기 화학식 Ⅵ으로 표시되는 페룰산-프럭토올리고당 결합체로 이루어지거나 이를 주성분으로 포함한다. 본 발명의 발명자들은 하기 화학식 Ⅵ으로 표시되는 화합물을 주성분으로 포함하는 페룰산-프럭토올리고당 결합체를 'FA-FOS Ⅱ'로 명명하였고 물리적 특성을 분석할 결과 수용성이고, 구강, 위 및 소장 환경에서 거의 분해되지 않고 대부분 대장에 도달하는 것으로 확인되었다. 또한, 페룰산-프럭토올리고당 결합체 FA-FOS Ⅱ는 인간 대장 미생물총(Human microbiota)에 의해 모사된 대장 환경 조건에서 분해되어 페룰로일 글루코스(Feruloyl glucose) 형태로 방출되고 대장암의 예방, 개선 또는 치료에 매우 유용하다.
[화학식 Ⅵ]
Figure PCTKR2019014489-appb-img-000006
본 발명의 일 측면은 전술한 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다. 본 발명에서 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염으로는 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산 (maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산 (glycollic acid), 글루콘산 (gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산 (glutaric acid), 글루쿠론산 (glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다. 또한, 염기를 사용하여 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 금속염을 제조할 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명의 일 측면은 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 제조방법은 (a) 반응 용매에 페놀산(Phenolic acid) 형태의 파이토케미컬(Phytochemical) 및 에스테르화 반응용 촉매를 첨가 및 용해하고 가열하여 파이토케미컬의 활성화 반응을 진행하고 활성화된 형태의 파이토케미컬을 포함하는 1차 반응 혼합물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 1차 반응 혼합물에 하기의 일반 구조식으로 표시되는 프럭토올리고당(Fructooligosaccharide)을 첨가하고 불활성 가스 분위기하에서 가열하여 프럭토올리고당(Fructooligosaccharide)과 파이토케미컬(Phytochemical) 간의 에스테르화 반응을 진행하고 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체를 포함하는 2차 반응 혼합물을 수득하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 제조방법은 바람직하게는 (c) 상기 2차 반응 혼합물을 냉각 및 방치하여 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체를 침전시키고 원심분리 및 세척을 순차적으로 진행하여 정제된 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체를 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
[프럭토올리고당의 일반 구조식]
Glu-(Fru) k
상기 프럭토올리고당의 일반 구조식에서 'Glu'는 글루코스를 나타내고, 'Fru'는 프럭토스를 나타낸다. 또한, 상기 k는 글리코시딕 결합을 통해 연결된 프럭토스의 수로서 2 내지 60의 정수에서 선택되고, 5 내지 49의 정수에서 선택되는 것이 바람직하고 9 내지 41의 정수에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 제조방법에서 최종적으로 수득되는 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 구조적 특징은 전술한 부분을 참조하며 구체적인 설명을 생략한다.
본 발명의 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 제조방법에서 상기 (a) 단계의 파이토케미컬 활성화 반응은 45~120℃에서 2~20 hr 동안 진행되는 것이 바람직하고, 50~80℃에서 5~18 hr 동안 진행되는 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 (a) 단계에서 사용되는 반응 용매는 페놀산(Phenolic acid) 형태의 파이토케미컬(Phytochemical), 에스테르화 반응용 촉매 및 프럭토올리고당(Fructooligosaccharide)을 용해할 수 있는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 유기합성 분야에서 사용되는 공지의 다양한 유기 용매로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 상기 반응 용매는 극성 유기 용매에서 선택될 수 있고, 구체적인 종류로는 다이메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide), 다이메틸포름아마이드(Dimethylformamide), 헥사메틸포스포르아마이드(Hexamethylphosphoramide), N-메틸피롤리돈(N-methylpyrrolidone), 테트라하이드로푸란(tetrahydrofuran), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 아세톤(acetone), 아세토니트릴(acetonitrile), 프로필렌 카보네이트(propylene carbonate) 등이 있다. 또한, 상기 (a) 단계에서 사용되는 에스테르화 반응용 촉매는 카르복실산(Carboxylic acid)과 알코올 간의 에스테르화 반응 또는 카르복실산과 하이드록실기 간의 에스테르화 반응에 사용되는 다양한 공지의 촉매에서 선택될 수 있고, 구체적인 종류로는 카보닐다이이미다졸(N,N'-carbonyldiimidazole, CDI), 다이시클로헥실카보다이이미드(Dicyclohexylcarbodiimide), 2-브로모-1-메틸피리듐아이오다이드(2-bromo-1-methylpyridinium iodide) 등이 있다.
또한, 본 발명의 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 제조방법에서 사용된 페놀산(Phenolic acid) 형태의 파이토케미컬(Phytochemical), 에스테르화 반응용 촉매 및 프럭토올리고당의 몰 비는 1:1:1 내지 40:40:1의 범위에서 선택되는 것이 바람직하고, 2:2:1 내지 35:35:1의 범위에서 선택되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 페룰산-프럭토올리고당 결합체 FA-FOS Ⅰ을 제조하는 경우 페룰산, 에스테르화 반응용 촉매 및 프럭토올리고당의 몰 비는 20:20:1 내지 35:35:1인 것이 바람직하다. 또한, 페룰산-프럭토올리고당 결합체 FA-FOS Ⅱ를 제조하는 경우 페룰산, 에스테르화 반응용 촉매 및 프럭토올리고당의 몰 비는 2:2:1 내지 10:10:1인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 제조방법에서 상기 (b) 단계의 에스테르화 반응은 70~150℃에서 2~15 hr 동안 진행되는 것이 바람직하고, 80~120℃에서에서 3~10 hr 동안 진행되는 것이 더 바람직하다.
또한, 본 발명의 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 제조방법에서 상기 (c) 단계의 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체를 세척하기 위해 탄소수 2 내지 5의 저급 알코올 용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 저급 알코올 용매로는 에탄올, 이소프로필 알코올 등이 있다.
본 발명의 일 예에 따른 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 제조방법에서 페놀산(Phenolic acid) 형태의 파이토케미컬(Phytochemical)로 페룰산을 사용하고 에스테르화 반응용 촉매로 카보닐다이이미다졸(N,N'-carbonyldiimidazole, CDI)을 사용하는 경우 상기 (a) 단계는 페룰산의 활성화 단계로서 하기 화학 반응식 1과 같이 나타낼 수 있고, 상기 (b) 단계는 활성화된 페룰산을 프럭토올리고당에 그래프팅 하는 단계로서 하기 화학 반응식 2와 같이 나타낼 수 있다.
[화학 반응식 1]
Figure PCTKR2019014489-appb-img-000007
[화학 반응식 2]
Figure PCTKR2019014489-appb-img-000008
본 발명의 일 측면은 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 생리활성에 기반한 다양한 의약 용도, 건강기능식품 용도 또는 화장품 용도에 관한 것이다. 본 발명의 일 예는 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 또는 이의 약학적으로(또는 식품학적으로) 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 항암용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 일 예는 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 또는 이의 약학적으로(또는 식품학적으로) 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 대장암 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 일 예는 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 대장암의 전이 억제용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 일 예는 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 항산화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 예에 따른 항암용 조성물에서 유효성분인 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체는 전술한 FA-FOS Ⅰ 또는 FA-FOS Ⅱ인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 대장암 예방, 개선 또는 치료용 조성물에서 유효성분인 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체는 전술한 FA-FOS Ⅰ 또는 FA-FOS Ⅱ인 것이 바람직하고, FA-FOS Ⅱ인 것이 더 바람직하다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 대장암의 전이 억제용 조성물에서 유효성분인 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체는 전술한 FA-FOS Ⅰ 또는 FA-FOS Ⅱ인 것이 바람직하고, FA-FOS Ⅰ인 것이 더 바람직하다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 항산화용 조성물에서 유효성분인 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체는 전술한 FA-FOS Ⅰ 또는 FA-FOS Ⅱ인 것이 바람직하고, FA-FOS Ⅰ인 것이 더 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 항암용 조성물, 대장암 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 대장암의 전이 억제용 조성물 또는 항산화용 조성물은 사용 목적 내지 양상에 따라 약학 조성물, 식품 첨가제, 식품 조성물(특히 건강 기능 식품) 또는 사료 첨가제 등으로 구체화될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 항산화용 조성물은 피부 노화방지를 위한 화장료 조성물로 구체화될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 예에 따른 다양한 조성물에서 유효성분인 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 함량도 조성물의 구체적인 형태, 사용 목적 내지 양상에 따라 다양한 범위에서 조정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물에서 유효성분인 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 외에 항암 활성, 특히 항-대장암 활성을 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 의해 경구 투여를 위한 제형 또는 비경구 투여를 위한 제형으로 제제화될 수 있고, 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 인간을 포함한 포유류에 경구 투여되거나 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 방식으로는 피부 외용, 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등이 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 약학적으로 유효한 양이라면 크게 제한되지 않으며, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 크게 제한되지 않으나 바람직하게는 유효성분을 기준으로 할 때 10 내지 9000 ㎎/㎏이고, 더 바람직하게는 100 내지 5000 ㎎/㎏이며, 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 식품 조성물에서 유효성분인 신규 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 함량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.1~50 중량%, 더 바람직하게는 0.5~25 중량%이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐, 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 구체적인 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다. 본 발명의 식품 조성물은 유효성분 외에 식품학적으로 허용 가능한 담체, 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
1. 페룰산-프럭토올리고당 결합체의 제조 및 치환도 분석
(1) FA-FOS Ⅰ의 제조
반응용기에 다이메틸설폭사이드(Dimethyl Sulfoxide, DMSO) 및 페룰산을 첨가하고 페룰산을 다이메틸설폭사이드(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)에 용해시켜 5%(w/v) 농도의 페룰산 용액을 제조하였다. 이후, 반응용기에 카보닐다이이미다졸(N,N'-carbonyldiimidazole, CDI)을 첨가하고 약 60℃에서 약 16 hr 동안 교반하여 페룰산을 활성화시켰다. 상기 페룰산의 활성화 형태는 페룰로일 이미다졸(Feruloyl imidazole)이다. 이후, 반응용기에 프럭토올리고당[약 2~60개의 D-프럭토스 잔기들이 β(2→1) 결합에 의해 연결되어 있고 말단 일 측에 1개의 D-글루코스가 D-프럭토스에 α(1→2) 결합에 의해 연결된 형태의 중합체임]을 첨가하고 용해시킨 후 반응용기를 밀봉시켰다. 밀봉된 반응용기 내에 존재하는 페룰산, 카보닐다이이미다졸 및 프럭토올리고당의 몰 비는 32:32:1이었다. 이후, 반응용기의 온도를 90℃로 증가시키고, 불활성 가스(질소) 분위기하에서 약 7 hr 동안 연속적으로 교반하여 프럭토올리고당에 활성화된 페룰산을 그래프트팅(Grafting) 시키는 반응을 진행하였다. 반응 종료 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 여기에 얼음처럼 차가운 이소-프로필 알코올을 반응 혼합물의 약 3배 부피의 양으로 첨가하고 약 4℃에서 하룻밤 동안 방치하여 페룰산-프럭토올리고당 결합체(FA-FOS)을 침전시켰다. 이후, 반응 혼합물을 원심분리하여(4000×g, 20분) 펠렛을 수득하고, 수득한 펠렛을 이소-프로필 알코올로 약 3번 세척하여 미반응 페룰산, 카보닐다이이미다졸 및 페룰로일 이미다졸을 제거하고, 다시 증류수로 세척하여 최종 반응 산물인 페룰산-프럭토올리고당 결합체 Ⅰ('FA-FOS Ⅰ'로 약칭함)을 수득하였다. 최종 반응 산물인 FA-FOS Ⅰ의 제조 수율은 약 89% 이었다.
(2) FA-FOS Ⅱ의 제조
반응용기에 다이메틸설폭사이드(Dimethyl Sulfoxide, DMSO) 및 페룰산을 첨가하고 페룰산을 다이메틸설폭사이드(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)에 용해시켜 5%(w/v) 농도의 페룰산 용액을 제조하였다. 이후, 반응용기에 카보닐다이이미다졸(N,N'-carbonyldiimidazole, CDI)을 첨가하고 약 60℃에서 약 16 hr 동안 교반하여 페룰산을 활성화시켰다. 상기 페룰산의 활성화 형태는 페룰로일 이미다졸(Feruloyl imidazole)이다. 이후, 반응용기에 프럭토올리고당[약 2~60개의 D-프럭토스 잔기들이 β(2→1) 결합에 의해 연결되어 있고 말단 일 측에 1개의 D-글루코스가 D-프럭토스에 α(1→2) 결합에 의해 연결된 형태의 중합체임]을 첨가하고 용해시킨 후 반응용기를 밀봉시켰다. 밀봉된 반응용기 내에 존재하는 페룰산, 카보닐다이이미다졸 및 프럭토올리고당의 몰 비는 4:4:1이었다. 이후, 반응용기의 온도를 90℃로 증가시키고, 불활성 가스(질소) 분위기하에서 약 7 hr 동안 연속적으로 교반하여 프럭토올리고당에 활성화된 페룰산을 그래프트팅(Grafting) 시키는 반응을 진행하였다. 반응 종료 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 여기에 얼음처럼 차가운 이소-프로필 알코올을 반응 혼합물의 약 3배 부피의 양으로 첨가하고 약 4℃에서 하룻밤 동안 방치하여 페룰산-프럭토올리고당 결합체(FA-FOS)를 침전시켰다. 이후, 반응 혼합물을 원심분리하여(4000×g, 20분) 펠렛을 수득하고, 수득한 펠렛을 이소-프로필 알코올로 약 3번 세척하여 미반응 페룰산, 카보닐다이이미다졸 및 페룰로일 이미다졸을 제거하고, 최종 반응 산물인 페룰산-프럭토올리고당 결합체 Ⅱ('FA-FOS Ⅱ'로 약칭함)을 수득하였다. 최종 반응 산물인 FA-FOS Ⅱ의 제조 수율은 약 89% 이었다.
(3) FA-FOS Ⅰ 및 FA-FOS Ⅱ의 페룰산 치환도 분석
FA-FOS Ⅰ 및 FA-FOS Ⅱ에서 페룰산의 치환도(The degree of substitution)는 프럭토올리고당 기본 단위 당 부착된 치환기 페룰산의 평균 수로 정의된다. 2M 농도의 NaOH 수용액에 FA-FOS Ⅰ 및 FA-FOS Ⅱ를 각각 첨가하고 2 hr 동안 배양하여 결합체로부터 페룰레이트기(Ferulate group)를 방출시켰다. 이후, NaOH 수용액에 6N 농도의 HCl 수용액을 첨가하여 pH를 2로 조정하고 방출된 페룰레이트기(Ferulate group)를 자유 페룰산(Free ferulic acid) 형태로 산성화시켰다. 이후, 에틸아세이트로 페룰산을 3번 추출하고 방출된 페룰산의 양을 HPLC로 정량화하였고, 하기의 식으로 페룰산의 치환도(The degree of substitution)를 계산하였다.
Figure PCTKR2019014489-appb-img-000009
162 : 프럭토올리고당 기본 단위의 분자량
194.19 : 페룰산의 분자량
% Ferulate : 결합체 전체 중량을 기준으로 한 페룰레이트 중량 %
하기 표 1에 FA-FOS Ⅰ 및 FA-FOS Ⅱ의 % Ferulate 및 페룰산의 치환도를 나타내었다.
분석 시료 % Ferulate Degree of substitution
FA-FOS Ⅰ 20.93 0.2206
FA-FOS Ⅱ 2.575 0.02
상기 표에서 보이는 바와 같이 FA-FOS Ⅰ의 페룰산 치환도는 FA-FOS Ⅱ 보다 약 10배 가깝게 높았다. FA-FOS Ⅰ은 물 및 유기 용매에 용해되지 않는 반면, FA-FOS Ⅱ는 물 및 유기 용매에 즉시 용해되었다. 페룰산의 치환도가 높으면 높을수록 FA-FOS의 물에 대한 용해도는 낮아지는 것으로 확인되었다. FA-FOS Ⅰ은 양쪽 친매성 때문에 물에 대해 불용성이었고, 테트라부틸 포스포늄 아세테이트(Tetrabutyl Phosphonium Acetate), 테트라부틸 암모늄 아세테이트(Tetra butyl ammonium acetate)와 같은 이온성 액체에 즉시 용해되었다.
2. 페룰산-프럭토올리고당 결합체의 구조적 특징 분석
(1) FA-FOS Ⅰ
도 1은 페룰산(FA), 프럭토올리고당(FOS) 및 FA-FOS Ⅰ을 FTIR 분광기(Fourier-transform infrared spectroscopy)로 분석한 스펙트럼 결과이다. 도 1에서 FA-FOS Ⅰ은 'FA FOS Ⅰ'로 표시되었다. 도 1에서 보이는 바와 같이 프럭토올리고당(FOS)의 3400 ㎝ -1에서의 완만한 피크는 하이드록실기의 수가 감소함에 따라 FA-FOS Ⅰ에서 강도가 크게 감소하였다. FA-FOS Ⅰ의 1726 ㎝ -1에서의 피크는 치환 또는 에스테르화 반응을 나타내고, 2947 ㎝ -1, 3008 ㎝ -1, 및 2842 ㎝ -1에서 발생하는 2개의 피크는 페룰로일(Feruloyl) 치환과 관련된 메틸 및 메틸렌 C-H 스트레칭에 기인한다. FOS의 900~1200 ㎝ -1 사이의 피크는 C-O 스트레칭에 의한 것이고, FA-FOS Ⅰ의 3074 ㎝ -1에서의 피크는 링의 메탄하이드로겐 관련 C-H 스트레칭에 기인한 것이다.
또한, 페룰산(FA), 프럭토올리고당(FOS) 및 FA-FOS Ⅰ을 13C(L armor frequency: 400.25 ㎒) 조건의 고체상태 핵자기 공명(Solid state NMR) 분광기로 분석하였다. FA-FOS Ⅰ은 다이메틸설폭사이드(DMSO) 등의 유기 용매에 용해되지 않기 때문에 그 구조를 설명하기 위하여 고체상태 핵자기 공명(Solid state NMR)을 수행하였다. FA-FOS Ⅰ의 13C 고체상태 핵자기 공명(Solid state NMR) 스펙트럼에서 페룰산의 방향족 탄소는 100 ppm 내지 150 ppm 사이에서 관찰되었고 페룰산의 카보닐 탄소(-COOH) 이동이 150 ppm 초과 영역에서 관찰되었다. 순수한 페룰산의 피크 이동은 173.13 ppm에서 관찰되지만, FA-FOS Ⅰ의 경우 프럭토올리고당(FOS)과 페룰산의 에스테르 결합 형성으로 인해 피크 이동이 164.17 ppm에서 관찰되었다. 또한, 순수한 프럭토올리고당(FOS)에서 지방족 탄소는 50 ppm 내지 100 ppm에 걸쳐 다수의 좁은 피크들로 관찰되었으나 FA-FOS Ⅰ의 경우 프럭토올리고당의 지방족 탄소는 55.17 ppm에서 단일의 넓은 피크로 관찰되었다. 이러한 결과는 FA-FOS Ⅰ에서 프럭토올리고당(FOS)의 말단 글루코스와 페룰산이 결합하고 프럭토올리고당(FOS)의 프럭토스가 4개 간격으로 페룰산과 결합하기 때문이다. FA-FOS Ⅰ의 13C 고체상태 핵자기 공명(Solid state NMR) 스펙트럼에서 관찰된 다중선(multiplets)은 다음과 같다. 13C NMR (101MHz) : d = 263.9, 251.1, 233.4, 223.3, 217.4, 180.4, 164.4, 151.9, 148.1, 144.7, 142.2, 133.6, 124.2, 117.6, 109.0, 76.7, 65.0, 55.3, 43.1, 34.1, 24.4, 18.5 ppm
또한, 페룰산(FA), 프럭토올리고당(FOS) 및 FA-FOS Ⅰ을 1H(L armor Frequency: 400.66 ㎒, spin rate: 14KHZ) 조건의 고체상태 핵자기 공명(Solid state NMR) 분광기로 분석하였다. FA의 1H 고체상태 핵자기 공명(Solid state NMR) 스펙트럼에서 13.19 ppm의 피크는 페룰산에 존재하는 카르복실산(R-COOH)의 화학적 이동에 해당한다. 반면, FA-FOS Ⅰ에서는 페룰산이 프럭토올리고당(FOS)의 당 분자들인 글루코스 및 프럭토스와 결합하기 때문에 상기 13.19 ppm의 피크는 존재하지 않고 4.94 ppm에서 강한 피크가 관찰되었다. 상기 4.94 ppm에서 강한 피크는 FA-FOS Ⅰ에서 페룰산의 방향족기에 결합되어 있는 -OH 기를 나타낸다. 또한, FA-FOS Ⅰ에서 관찰되는 6.94 ppm에서의 피크는 페룰산의 방향족 고리에 결합된 -H에 해당하며, 순수한 프럭토올리고당의 NMR 스펙트럼에는 존재하지 않는다. 또한, FA-FOS Ⅰ에서 관찰되는 2.56 ppm의 확연한 피크는 페룰산이 프럭토올리고당에 치환되어 존재하는 카보닐기에 기인한 것이며, 이는 페룰산과 프럭토올리고당(FOS)의 컨쥬게이션(conjugation)에 대한 강력한 증거가 된다.
또한, 페룰산(FA), 프럭토올리고당(FOS) 및 FA-FOS Ⅰ을 XRD(X-ray Diffraction) 분광기로 분석하였다. 그 결과, FA FOS I은 약 17.65°(2θ)와 25.55°(2θ) 에서 강한 회절 피크를 나타 내고 10.5°, 12.70°, 20.31°, 23.73°, 28.07°(2θ) 에서는 작고 넓은 피크를 나타냈다. FA FOS I은 A형 결정질상과 비결정질상의 혼합이라고 보이며 FOS의 피크들과 비교하면 FOS에 비해 더 많은 결정 구조를 갖는다. 위의 결과로부터, FA FOS I에 존재하는 선형의 프럭토스들은 비정질 영역에 기여하고 말단 글루코스에서 페룰산과의 컨쥬게이션 및 4번째 프럭토스에서 프럭토스와의 컨쥬게이션은 결정영역에 기여한다고 볼 수 있다.
또한, FA-FOS Ⅰ을 UV-Vis 분광기(Ultraviolet-visible spectroscopy) 및 형광 분광광도계(Fluorescence spectrophotometer)로 분석하였다. 그 결과, FA-FOS Ⅰ은 280 ㎚에서 광을 흡수하고 310㎚에서 광을 방출하였다.
또한, 페룰산(FA), 프럭토올리고당(FOS) 및 FA-FOS Ⅰ의 열 중량 분석(Thermogravimetric analysis, TGA)을 수행하였다. 그 결과, FOS는 238℃에서 약 41.06%의 중량 손실을 나타냈고, FA-FOS Ⅰ은 400℃에서 약 41.5%의 중량 손실을 나타냈다. 이는 FA-FOS Ⅰ이 FOS와 비교하여 더 높은 열 안정성을 가지는 것으로 볼 수 있다.
또한, FA-FOS Ⅰ의 제타 전위를 측정하고 동적광산란법(Dynamic Light Scattering, DLS)을 이용하여 입자 크기를 측정하였다. 그 결과, FA-FOS Ⅰ의 제타 전위는 -14.5±4.88 ㎷ 인 것으로 나타났고, 입자 평균 직경은 1.839±0.339 ㎛인 것으로 나타났다. FA-FOS Ⅰ의 낮은 제타 전위는 페룰산의 그래프팅에 의해 야기된 것으로 보이며, FA-FOS Ⅰ은 물(water)에서 균질한 현탁액을 생성하는 고차 구조로 자체응집(self aggregation) 되어 있음을 알 수 있다. 또한, DLS를 통해 측정한 FA-FOS Ⅰ의 다분산 지수(polydispersity index)는 0.243로서, 균질함(homogeneity)을 나타낸다.
도 2는 FA-FOS Ⅰ을 SEM(Scanning Electron Microscopy)으로 분석한 이미지 결과이다. 도 2의 i은 디스크형 구조를 보여주는 저배열 이미지이고, ii는 디스크형 입자의 단면 이미지이고, iii은 디스크형 미세입자를 보여주는 고배율 이미지이다. 도 2에서 보이는 바와 같은 FA-FOS Ⅰ은 자체응집(self aggregation)에 의해 평균 직경이 약 2㎛인 디스크 형태의 구조를 가진다. 또한, 도 2의 iii에 의하면 디스크 형태의 구조를 가지는 FA-FOS Ⅰ은 공동(cavity)을 가진 층상의 쉬트 유사 조립화에 의해 형성된다.
FA-FOS Ⅰ의 구조적 특징을 분석한 결과로부터, FA-FOS Ⅰ의 주성분은 하기의 화학식 Ⅴ로 표시되는 페룰산-프럭토올리고당 결합체인 것을 알 수 있다.
[화학식 Ⅴ]
Figure PCTKR2019014489-appb-img-000010
(2) FA-FOS Ⅱ
도 3은 페룰산(FA), 프럭토올리고당(FOS) 및 FA-FOS Ⅱ를 FTIR 분광기(Fourier-transform infrared spectroscopy)로 분석한 스펙트럼 결과이다. 도 3에서 FA-FOS Ⅱ는 'FA FOS Ⅱ'로 표시되었다. 도 3에서 보이는 바와 같이 프럭토올리고당(FOS)의 3400 ㎝ -1에서의 완만한 피크는 하이드록실기의 수가 감소함에 따라 FA-FOS Ⅱ에서 강도가 감소하였다. FA-FOS Ⅱ의 1717 ㎝ -1에서의 작은 피크는 에스테르화된 카보닐기를 나타내고, 900~1200 ㎝ -1 사이의 피크는 FOS 분자에서 유래하는 C-O 스트레칭에 의한 것이다.
또한, FA-FOS Ⅱ를 13C 조건의 핵자기 공명(NMR) 분광기 및 1H 조건의 핵자기 공명(NMR) 분광기로 분석하였다. FA-FOS Ⅱ의 13C 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼에서 관찰된 다중선(multiplets)은 다음과 같다. 13C NMR (DMSO-d6) δ: 104.25, 103.52, 103.38, 81.89, 76.88, 74.46, 62.33, 61.79, 40.64, 25.76. FA-FOS Ⅱ의 1H 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼에서 관찰된 다중선(multiplets)은 다음과 같다. 1H NMR (DMSO-d6) δ: 6.82-6.61 (m, 0H), 5.11 (d, J = 5.7 Hz, 11H), 4.67 (d, J = 6.5 Hz, 10H), 4.56 (t, J = 5.3 Hz, 11H), 4.01 (t, J = 7.3 Hz, 10H), 3.82-3.72 (m, 12H), 3.59 (d, J = 8.5 Hz, 11H), 3.55 (s, 6H), 3.43 (d, J = 19.1 Hz, 15H), 3.35 (s, 11H), 2.47 (d, J = 1.8 Hz, 0H), 2.46 (s, 1H), 2.45 (d, J = 1.9 Hz, 0H), 1.00 (s, 1H), 0.98 (s, 1H).
FA-FOS Ⅱ의 구조적 특징을 분석한 결과로부터, FA-FOS Ⅱ의 주성분은 하기의 화학식 Ⅵ로 표시되는 페룰산-프럭토올리고당 결합체인 것을 알 수 있다. 또한, FA-FOS Ⅱ를 LC-MS(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) 및 MS-MS(Mass spectroscopy-mass spectroscopy)로 분석한 결과, FA-FOS Ⅱ의 주쇄에 존재하는 프럭토스의 수는 3~24개로 다양하게 분포되어 있었다.
[화학식 Ⅵ]
Figure PCTKR2019014489-appb-img-000011
3. 페룰산-프럭토올리고당 결합체의 구강-위장관 모사 조건 등에서의 안정성 및 분해 특성
(1) 구강-위장관 모사 조건에서의 안정성 실험
FA-FOS Ⅰ 및 FA-FOS Ⅱ를 각각, 모사된 침액(Simulated Salivary fluid, SS), 모사된 위액(Simulated Gastric Fluid, SGF) 및 모사된 소장액(Simulated Small Intestine fluid, SSI)에 넣고 37℃에서 0분, 15분, 30분, 그리고 1 hr 내지 4 hr 동안 배양하였을 때의 안정성 특성을 HPLC로 측정하였다. 페룰산-프럭토올리고당 결합체의 구강-위장관 모사 조건에서의 안정성 특성 측정 실험에 사용한 모사된 침액(Simulated Salivary fluid, SS), 모사된 위액(Simulated Gastric Fluid, SGF) 및 모사된 소장액(Simulated Small Intestine fluid, SSI)의 조성은 다음과 같다.
<모사된 침액 조성>
100㎖를 기준으로 CaCl 2·2H 2O 0.0228%, NaCl 0.1017%, Na 2HPO 4 0.0204%, MgCl 2 0.0061%, K 2CO 3 0.0603%, Na 2HPO 4 0.0273%, α-amylase 200 units, Lysozyme 0.0015%로 구성되고 pH는 7.4임
<모사된 위액 조성>
100㎖를 기준으로 Sodium taurocholate 80 μM, Lecithin 20 μM, Pepsin 0.01%, Lysozyme 0.01%, Sodium Chloride 34.2 mM로 구성되고, pH는 1.6임
<모사된 소장액 조성>
100㎖를 기준으로 Sodium taurocholate 3 mM, Lecithin 0.2 mM, Maleic acid 19.12 mM, Sodium hydroxide 34.8 mM, Sodium Chloride 68.62 mM, Pancreatin (4 USP/mg) 0.05g으로 구성되고 pH는 6.5임
(2) 인간 미생물총에 의해 모사된 대장 환경 조건에서의 소화 특성 실험
멸균된 혐기성 최소 기초 배지(anaerobic minimal basal medium) 10㎖가 수용된 각각의 바이얼에 멸균된 FA-FOS Ⅰ, FA-FOS Ⅱ 및 프럭토올리고당(FOS)을 0.05g 첨가하고 혐기 조건에서 인간 대변을 1%(w/v)의 양으로 접종하고 밀봉하였다. 이후, 밀봉된 바이얼을 37℃에서 12 hr, 24 hr, 그리고 36 hr 내지 48 hr 동안 배양하고 간헐적으로 교반하였다. 배양이 완료된 후 배양된 배지를 원심분리하여 상등액을 수거하고 수거한 상등액에 6N 농도의 HCl 수용액을 첨가하여 pH를 2로 조정하고 2배 부피의 에틸 아세테이트로 자유 페룰산을 3번 추출하였다. 이후, 추출액을 질소 분위기하에서 증발시켜 에틸 아세테이트를 제거하고 50% 메탄올 수용액에 용해시켜 분석시료를 준비하였다. 이후, 분석시료를 HPLC로 분석하여 모사된 대장 환경 조건에서의 자유 페룰산 방출량을 결정하였다. 상기 실험에 사용한 혐기성 최소 기초 배지(anaerobic minimal basal medium)의 조성은 다음과 같다.
<혐기성 최소 기초 배지의 조성>
100㎖를 기준으로 Peptone 0.2g, Yeast extract 0.1g, NaCl 0.01g, K 2HPO 4 0.004g, KH 2PO 4 0.004g, MgSO 4·7H 2O 0.001g, CaCl 2·2H 2O 0.001g, NaHCO 3 0.2g, Bile salts 0.05g, L-Cysteine HCl 0.05g, Tween 80 0.2㎖, 0.05% Resazurin solution A 0.1㎖, Hemin 0.0005g, 0.02 Mm Vitamin K 1 10 μl로 구성됨
(3) 장내 소화 효소에 대한 안정성 실험
250㎎의 FA-FOS Ⅰ 및 FA-FOS Ⅱ를 각각 장내 소화 효소액에 첨가하고 37℃에서 12 hr, 24 hr, 36 hr, 그리고 48 hr 동안 배양하였다. 장내 소화 효소액은 0.02%(w/v) 소듐아자이드(Sodium azide) 용액에 대장 내 서식 세균에 의해 생산되는 Cellulase, Endo-galactouranase, endo-carbohydrase, exo-glycosidase 및 Feruloyl esterase를 첨가하여 제조한 액상 혼합 효소액이고 pH는 6이다. 구체적으로, 상기 장내 소화 효소액은 pH 6.0의 MOPS buffer 5㎖에 Driselase(Amano enzymes, Japan) 50㎎, Protease M Amano(Amano enzymes, Japan) 50㎎, DEPOL 670L(Biocatalyst, UK) 50 μl, DEPOL 740L(Biocatalyst, UK) 50 μl 및 0.02%(w/v) 소듐아자이드(Sodium azide)가 용해된 것이다. 이후, 배양액을 원심분리하여 상등액을 수거하고, 수거한 상등액에 6N 농도의 HCl 수용액을 첨가하여 pH를 2로 조정하고 3배 부피의 에틸 아세테이트로 자유 페룰산을 3번 추출하였다. 이후, 추출액을 질소 분위기하에서 증발시켜 에틸 아세테이트를 제거하고 50% 메탄올 수용액에 용해시켜 분석시료를 준비하였다. 이후, 분석시료를 HPLC로 분석하였다.
(4) 실험 결과
하기 표 2는 FA-FOS Ⅰ의 구강-위장관 모사 조건에서의 안정성 실험, 인간 미생물총에 의해 모사된 대장 환경 조건에서의 소화 특성 실험 및 장내 소화 효소에 대한 안정성 실험 결과를 나타낸 것이다. 또한, 하기 표 3은 FA-FOS Ⅱ의 구강-위장관 모사 조건에서의 안정성 실험, 인간 미생물총에 의해 모사된 대장 환경 조건에서의 소화 특성 실험 및 장내 소화 효소에 대한 안정성 실험 결과를 나타낸 것이다.
모사 조건 안정성 *(%) 반감기 **(hr)
모사된 침액 99.06 > 4
모사된 위액 100 > 4
모사된 소장액 99.08 > 4
모사된 대장 환경 100 > 48
장내 소화 효소액 99.17 > 24
모사 조건 안정성 *(%) 반감기 **(hr)
모사된 침액 100 > 4
모사된 위액 100 > 4
모사된 소장액 99.96 > 4
모사된 대장 환경 100(소화 및 대사됨) < 24
장내 소화 효소액 54.39 36
* 안정성(Stability)은 배양 전의 페룰산-프럭토올리고당 결합체에 함유된 페룰산의 양과 37℃에서 배양 후 페룰산-프럭토올리고당 결합체로부터 방출되는 자유 페룰산의 양을 비교하여 백분율로 표시하였다.
** 반감기(Half-life)는 페룰산-프럭토올리고당 결합체에 함유된 페룰산의 절반이 배지 내로 방출되는 시간으로 표시하였다.
상기 표 2 및 표 3에서 보이는 바와 같이 구강-위장관 모사 조건에서의 FA-FOS Ⅰ 및 FA-FOS Ⅱ의 안정성 및 반감기 결과에 의하면, FA-FOS Ⅰ 및 FA-FOS Ⅱ는 모사된 침액(Simulated Salivary fluid, SS), 모사된 위액(Simulated Gastric Fluid, SGF) 및 모사된 소장액(Simulated Small Intestine fluid, SSI)에서 거의 분해되지 않았다.
상기 표 2에서 보이는 바와 같이 FA-FOS Ⅰ은 인간 대장 미생물총(Human microbiota)에 의해 거의 분해되지 않는 것으로 나타났다.
도 4는 인간 대장 미생물총(Human microbiota)에 의해 모사된 대장 환경 조건에서 FA-FOS Ⅱ를 배양하였을 때의 분해 거동을 HPLC로 분석한 결과이다. 상기 표 3 및 도 4에서 보이는 바와 같이 FA-FOS Ⅱ는 인간 대장 미생물총(Human microbiota)에 의해 페룰레이트(Ferulate) 형태로 분해되어 방출되는 것으로 나타났다. 또한, 인간 대장 미생물총(Human microbiota)에 의해 모사된 대장 환경 조건에서 FA-FOS Ⅱ를 배양하였을 때의 최종 대사 산물을 LC-MS(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) 및 MS-MS(Mass spectroscopy-mass spectroscopy)로 분석한 결과, 인간 대장 환경에서 FA-FOS Ⅱ의 최종 대사 산물은 페룰로일 글루코스(Feruloyl glucose)인 것으로 확인되었다.
상기 표 2 및 표 3에서 보이는 바와 같이 FA-FOS Ⅰ은 FA-FOS Ⅱ에 비해 장내 소화 효소에 대해 더 저항성을 가지며 방출되는 자유 페룰산의 양도 매우 적었다.
4. 페룰산-프럭토올리고당 결합체의 생체외(In-Vitro) 실험에서의 항암 활성
(1) 암세포 사멸 유도 경과 관찰 및 분석
CCD 18Co(Normal Human colon fibroblast primary cell line)와 같은 인간 정상 대장 세포주, HT-29(Colorectal adenocarcinoma, capable of inducing tumor in mice)와 같은 대장암 세포주 또는 Lovo(Duke’s type C, grade IV, Colorectal adenocarcinoma capable of metastasis)와 같은 전이성 대장암 세포주에 약물로 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil), FA-FOS Ⅰ, FA-FOS Ⅱ 및 페룰산(Ferulic acid, FA)을 처리하고 세포 사멸 유도 경과를 관찰하였다. 구체적으로 96-well 플레이트의 각 웰에 배양된 세포주를 웰당 18,000 세포수의 밀도로 분주하고 하룻밤 동안 배양한 후, 배양 배지에 다양한 농도로 용해한 약물로 세포를 처리하고 가습 배양기 내에서 37℃의 온도 및 5% CO 2 조건으로 72 hr 동안 배양하였다. 배양 완료 후 배지를 제거하고 100 μl의 PBS로 대체한 후 여기에 Cell Counting Kit-8(CCK-8; Dojindo, Japan) 용액 10 μl를 첨가하고 3 hr 동안 배양하여 반응시켰다. 이후, 반응액의 발색 정도를 450 ㎚에서의 흡광도로 측정하고 제조사의 지시에 따라 세포 증식 수를 계산하였다.
HT-29 세포는 McCoy’s 5A 배지에서 배양되었고, LoVo 세포는 Ham’s F-12K(Kaigh’s) 배지에서 배양되었고, CCD 18Co 세포는 DMEM에서 배양되었고, 모든 배지에는 사용전에 10% Fetal bovine serum 및 100 U/ml penicillin, streptomycin이 첨가되었다.
도 5는 HT-29 세포주 및 Lovo 세포주에 옥살리플라틴(Oxaliplatin), FA-FOS Ⅰ, FA-FOS Ⅱ 및 페룰산(Ferulic acid, FA)을 처리하였을 때의 암세포 사멸 유도 경과를 Annexin Ⅴ 및 Propidium iodide로 염색 후 형광 현미경으로 관찰한 결과이다. 또한, 도 6은 HT-29 세포주 및 Lovo 세포주에 FA-FOS Ⅰ 및 FA-FOS Ⅱ를 처리하였을 때의 암세포 사멸 유도 경과를 TUNEL 어세이(terminal deoxynucleotidyl transferase-dUTP nick end labeling) 및 추가적인 Hoechst 33342 염색 후 형광 현미경으로 관찰한 결과이다. 또한, 하기 표 4에 처리한 약물의 다양한 세포주에 대한 IC 50(half maximal inhibitory concentration) 값과 선택되 지수(Selectivity Index, SI) 값을 나타내었다.
Cell Line IC 50(단위 : ㎍/㎖) 및 SI
Oxaliplatin 5-Fluorouracil FA-FOS Ⅰ FA-FOS Ⅱ FA
CCD 18Co 0.100 0.014 5.926 6.723 0.583
HT-29 0.015(SI: 6.631) 0.008(SI:1.685) 0.127(SI: >46.490) 3.942(SI: >1.706) 0.200(SI: >2.918)
Lovo 0.068(SI: 1.473) 0.074(SI: 0.186) 0.111(SI: >53.571) 3.054(SI: >2.201) 0.244(SI: >2.389)
* SI = Selectivity Index, IC 50 for Normal cell(CCD 18Co)/ IC 50 for Cancer cell
도 5, 도 6 및 상기 표 4에서 보이는 바와 같이 FA-FOS Ⅰ 및 FA-FOS Ⅱ는 우수한 대장암 세포 사멸 효과를 보였다. 특히, FA-FOS Ⅰ은 상업적 약물인 옥살리플라틴(Oxaliplatin) 및 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil)과 비교하였을 때 더 높은 선택도 지수를 가지는 것으로 확인되었다. 또한, FA-FOS Ⅰ은 FA에 비해 더 낮은 IC 50 값을 보였다.
(2) 페룰산-프럭토올리고당 결합체 FA-FOS Ⅰ의 세포사멸 유도 기전 분석
FA-FOS I에 의한 세포사멸 유도 기전을 이해하기 위해 LoVo 세포주에 FA-FOS I을 0.198 ㎍/㎖의 농도로 12 hr 동안 처리한 후 유전자 발현을 프로파일링 하였다. 처리된 세포로부터의 총 m-RNA를 Qiagen m-RNA 추출 및 정제 키트를 사용하여 추출하고, Qiagen RT2 Profiler PCR array Human apoptosis kit을 이용하여 분석하였다. 하기 표 5에 FA-FOS I으로 처리된 LoVo 세포주에서 세포사멸과 관련하여 발현된 유전자의 프로파일링 결과를 나타내었다.
유전자 Fold Regulation(FA-FOS I 미처리 대비) 유전자 Fold Regulation(FA-FOS I 미처리 대비)
CASP 1 1.56 TNFSF8 1.49
CD27 1.58 PYCARD 1.11
CD40 4.38 BCL2A1 -33.55
CD40LG 2.97 BCL2L10 -2.49
CIDEA 1.49 BCL2 -1.50
FASLG 1.79 CASP5 -1.50
IL10 3.79 CRADD -1.69
LTA 2.62 TNFRSF25 -1.81
TNFRSF11B 1.95 TNF -1.16
TNFRSF9 32.94
상기 표 5에서 보이는 바와 같이 LoVo 세포주에 FA-FOS I 처리시 12 개의 유전자가 업레귤레이션 되고 7 개의 유전자가 다운 레귤레이션 되었다. 상기 표 5에서 업레귤레이션된 유전자인 TNFRSF9는 TNF-수용체 수퍼 패밀리에 속하는 CD137로도 불리며, T 세포(면역 세포)의 클론 확장, 생존 및 발달에 관여하고, T 세포를 활성화시켜 면역 반응을 일으키고, IL-2(Inter Lukin 2)의 분비와 면역 세포의 침윤을 유도하고 종양을 제거하는것으로 알려져있다. TNFRSF9의 업레귤레이션은 FA-FOS I 가 면역 세포 매개를 통해 생체 내 종양/암 세포를 제거하는 가능성에 대한 실마리를 제공한다
세포주기 정지(Cell Cycle Arrest)는 사이클린(Cyclin)이라 불리는 세포주기 체크 포인트 조절제를 조절함으로써 종양 세포의 증식을 검사하는 것으로 항암제의 기능 중 하나이다. 세포주기 정지에서 FA-FOS I의 기능을 조사하기 위해, LoVo 세포주와 HT-29 세포주 각각을 배양 플레이트에 시딩하고 FBS가없는 배양 배지를 사용하여 48 hr 동안 굶주리게 하여 동기화시킨 후 FA-FOS I과 FA를 여러 농도로 처리하고 LoVo 세포주에 대해 24 hr 동안 배양하고 HT-29 세포주에 대해 72 hr 동안 배양한 후 증식된 세포를 DAPI로 착색 후 세포수를 FACS로 분석하였다. FA-FOS I은 세포주기의 GO 단계에서 용량 의존적으로 세포주기를 정지시켰다. 구체적으로, HT-29 세포주에 FA-FOS I을 0.198 ㎍/㎖의 농도로 처리하는 경우 약 91.22%가 GO상에서 정지되었고, HT-29 세포주에 FA-FOS I을 0.988 ㎍/㎖의 농도로 처리하는 경우 약 94.16%가 GO상에서 정지되었다. 또한, LoVo 세포주에 FA-FOS I을 0.198 ㎍/㎖의 농도로 처리하는 경우 약 62.74%가 GO상에서 정지되었고, LoVo 세포주에 FA-FOS I을 0.988 ㎍/㎖의 농도로 처리하는 경우 약 79.52%가 GO상에서 정지되었으며, 이러한 결과는 대조군(무처리)의 48.64%에 비해 매우 높은 값이다.
또한, 세포주기 정지에 대한 FA-FOS I의 기능을 검증하기 위해 LoVo 세포주로부터 총 단백질을 추출하고, 사이클린 B1, E 및 사이클린 의존성 키나제 억제 단백질 p21의 발현 프로파일링을 밀도계(densitometry)로 분석하였다. 그 결과, FA-FOS I은 세포주기를 조절하는 모든 사이클린을 억제하는 p21의 발현을 업레귤레이션(Up-regulation)하고 G2 기에서 유사 분열로의 세포 프로그레션(cell progression)에 관여하는 사이클린 B1의 발현을 다운 레귤레이션(Down-regulation) 하며 G0/G1 상에서 S 상으로의 세포의 프로그레션에 관여하는 Cyclin E를 다운 레귤레이션 함으로써 세포주기 정지를 유도하는 것으로 나타났다.
또한, FA-FOS I을 0.198 ㎍/㎖의 농도로 24 hr 동안 처리한 LoVo 세포주를 사용하여 세포주기 관련 유전자의 발현 향상을 조사하였다. 유전자 발현량은 Qiagen의 RT2 Prolifer PCR Array Human Cell cycle를 사용하여 측정하였다. 하기 표 6에 FA-FOS I으로 처리된 LoVo 세포주에서 세포주기와 관련하여 발현된 유전자의 프로파일링 결과를 나타내었다. 하기 표 6에서 보이는 바와 같이 세포주기 진행 및 증식에 직접적으로 관여하는 9개의 주요 업레귤레이션 유전자 및 4개의 주요 다운레귤레이션 유전자가 있는 것으로 관찰되었다.
유전자 Fold Regulation(FA-FOS I 미처리 대비) 유전자 Fold Regulation(FA-FOS I 미처리 대비)
BRCA1 1.67 CDK 6 1.54
BCL2 1.61 CDKN2B 1.40
BRCA2 2.09 CDK5RAP1 1.41
ATM 1.39 MCM4 -1.13
ATR 1.63 SERATD1 -1.13
BCCIP 1.40 CDC34 -1.03
CCNG2 1.48 E2F1 -1.08
CCNT1 1.66
5. 페룰산-프럭토올리고당 결합체의 생체내(In-Vivo) 실험에서의 항암 활성
(1) AOM-DSS에 의해 결장암이 유발된 마우스 모델에서 페룰산-프럭토올리고당 결합체의 항암 활성
AOM(Azoxymethane)-DSS(Dextran Sodium sulfate)로 결장암이 유발된 마우스 모델을 이용하여 FA-FOS I 및 FA-FOS Ⅱ의 항암 활성을 평가하였다. 5~6 주령된 C57BL/6 암컷 마우스를 각각 7마리씩 아래의 6개군에 무작위로 할당하고 각 군에 필요한 처리를 하였다.
(i) 정상군(Naive)
(ii) 대조군(Conrtol) : AOM-DSS에 의해 결장암이 유발된 마우스로서, 별도의 약물을 투여하지 않음
(iii) 옥살리플라틴 처리군(Oxaliplatin) : 옥살리플라틴을 물(water)에 용해시켜 약물을 준비하고, 옥살리플라틴 양을 기준으로 마우스에 30 mg/㎏(b.w)의 용량으로 경구투여함
(iv) 페룰산 처리군(FA) : 페룰산을 물에 용해시켜 약물을 준비하고, 페룰산 양을 기준으로 마우스에 100 mg/㎏(b.w)의 용량으로 경구투여함
(v) FA-FOS I 처리군(FA FOS-I) : 페룰산-프럭토올리고당 결합체 FA-FOS I을 물에 현탁하여 약물을 준비하고, FA-FOS I 양을 기준으로 500 mg/㎏(b.w)의 용량으로 경구투여함
(vi) FA-FOS Ⅱ 처리군(FA FOS-Ⅱ) : 페룰산-프럭토올리고당 결합체 FA-FOS Ⅱ를 물에 용해시켜 약물을 준비하고, FA-FOS Ⅱ 양을 기준으로 3890 mg/㎏(b.w)의 용량으로 경구투여함
참고로, 페룰산-프럭토올리고당 결합체 FA-FOS I 및 FA-FOS Ⅱ를 페룰산의 양으로 환산하여 비교하면, FA-FOS I 500 mg 및 FA-FOS Ⅱ 3890 mg은 페룰산 100 mg에 해당한다.
도 7은 AOM-DSS에 의해 결장암이 유발된 마우스 모델을 이용하여 페룰산-프럭토올리고당 결합체의 항암 활성을 평가하기 위한 실험 진행 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 8은 AOM-DSS에 의해 결장암이 유발된 마우스 모델을 이용하여 페룰산-프럭토올리고당 결합체의 항암 활성을 평가한 실험 결과 중 (a) 결장에서의 종양 병변의 총 수, (b) 콜론 인덱스, (c) 약물 치료 종료시 마우스의 체중 및 (d) 4 주의 치료 요법 동안 마우스의 체중 증가율을 나타낸 것이다. 도 8에서 보이는 바와 같이 FA-FOS Ⅱ 처리군에서 종양 병변의 수가 대조군에 비해 77.1% (p <0.001) 감소되었다. 또한, FA-FOS Ⅱ 처리군은 옥살리플라틴 처리군 및 페룰산 처리군에 비교하여 더 높은 종양 감소를 보였다. 또한, 마우스 결장 지수는 FA-FOS Ⅱ 처리군과 정상군 간에서 유의한 차이가 없었다.
도 9는 AOM-DSS에 의해 결장암이 유발된 마우스 모델을 이용하여 페룰산-프럭토올리고당 결합체의 항암 활성을 평가한 실험 결과 중 면역학적 파라미터 결과를 나타낸 것이다. 도 9에서 (a)는 전체 혈액속의 백혈구(WBC) 수, (b)는 총 골수 세포 수, (c)는 흉선 지수 (흉선/체중), (d)는 비장 지수 (비장/체중) (e)는 혈장 내 인터루킨 3 농도, 그리고 (f)는 혈장 내 인터페론 감마 농도 결과이다. 도 9에서 보이는 바와 같이 면연 관련 파라미터 중 WBC의 수는 대조군과 비교할 때 FA-FOS I 처리군에서 약 6.90% 감소하였고(p <0.01) FA-FOS Ⅱ 처리군에서 약 5.38% 감소하였다(p < 0.05). 그러나 골수 세포 수, 흉선 지수 및 비장 지수 등을 고려할 때, FA-FOS I 처리 및 FA-FOS Ⅱ 처리에 의해 유도된 면역 억제는 없는 것으로 판단된다. 한편, 마우스의 혈장에 존재하는 IL-3 농도는 FA-FOS Ⅱ 처리군에서 대조군에 비해 약 15% 증가하였다(p <0.05). 이러한 결과는 FA-FOS Ⅱ에 의해 T 세포의 종양 항원에 대한 자극/감작이 존재함을 시사한다.
(2) 래트(rat)에서 FA-FOS Ⅱ의 생체내 약동학
FA-FOS Ⅱ의 생체내 약동학을 평가하기 위해 래트(rat)의 결장에서 FA-FOS Ⅱ로부터 유리된 페룰산(FA)의 방출 프로파일을 조사하였다. 구체적으로, 체중이 각각 180-250g 인 수컷 스프라그 다울리(Sprague Dawley) 래트를 아래와 같이 3개의 군으로 무작위 배정하였다.
(i) 정상군 : 별도의 약물을 투여하지 않음
(ii) 페룰산(FA) 투여군 : 페룰산(FA)을 물에 용해시켜 약물을 준비하고 소정의 용량으로 경구투여함
(iii) FA-FOS Ⅱ 투여군 : FA-FOS Ⅱ를 물에 용해시켜 약물을 준비하고 소정의 용량으로 경구투여함
페룰산(FA)은 멸균수에 용해된 상태에서 페룰산(FA)의 양을 기준으로 100mg/㎏ 체중의 용량으로 경구투여 되었다. 또한, FA-FOS Ⅱ는 멸균수에 용해된 상태에서 FA-FOS Ⅱ의 양을 기준으로 3.89g/㎏ 체중(페룰산의 양으로 환산하면 100mg/㎏ 체중에 해당함)의 용량으로 경구투여 되었다. 경구 섭식을 통한 단일 용량 투여 후, 래트 혈액을 0, 0.5, 1, 3, 6, 8, 12, 24 hr에 걸쳐 연속적으로 샘플링하였다. 샘플링한 시료에 대해 물질 분자량 193.0/133.9 Da(FA의 intact mass/fragment mass)의 다중 반응 모니터링(MRM) 방식으로 LC MS/MS 분석을 수행하여 혈장에서 유리된 FA를 정량화했다.
도 10은 래트(Rat) 혈장에서 FA-FOS Ⅱ로부터 유리된 페룰산(FA)의 약동학적 방출 프로파일을 나타낸 것이다. 도 10에서 보이는 바와 같이 FA-FOS Ⅱ 투여군에서 FA-FOS Ⅱ로부터 유리된 FA의 Tmax는 약 30분이었다. 반면, 페룰산(FA) 투여군에서 Tmax는 약 5분이었다. 또한, 도 10에서 보이는 바와 같이 FA-FOS Ⅱ 투여군에서 FA-FOS Ⅱ로부터 유리된 FA의 평균 체류 시간은 약 240분으로, 페룰산(FA) 투여군에서 T 1/2이 약 30분인 것과 비교할 때 비교적 긴 시간이었다. FA-FOS Ⅱ 투여 후 관찰된 유리 FA의 Cmax는 27.08 μM이었다. AUC(Area Under Curve)는 약물 분자가 신체에 노출 된 정도(혈장 내 약물 분자의 퍼짐)를 나타내는데, FA-FOS Ⅱ 투여군에서 AUC(Area Under Curve)는 6234.77 μM*Min/L 이었다. 이는 페룰산(FA)을 기준으로 동일 용량의 페룰산(FA)을 투여한 군에서의 AUC보다 약 2.02배 높은 값이다. 따라서, 페룰산(FA) 분자의 생체 이용률은 FA-FOS Ⅱ를 투여하였을 때 페룰산(FA) 자체를 투여한 것에 비해 약 2배가 되는 것을 알 수 있다.
(3) HT-29 종양(인간 종양) 보유 이종 이식 마우스 모델에서 FA-FOS Ⅱ의 항암 활성
HT-29 종양을 보유한 이종 이식 마우스를 사용하여 FA-FOS Ⅱ의 항암 활성을 평가하였다. 구체적으로 BALB/c 누드 마우스를 아래의 4개군에 무작위로 할당하고 각 군에 필요한 처리를 하였다. 또한, HT-29 종양을 보유한 이종 이식 마우스 모델은 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 먼저 HT-29 세포주를 5% CO 2 조건으로 10% FBS를 갖는 RPMI 1640 배지에서 배양하고 수확하였다. 수확한 HT-29 세포주 배양액을 희석하고 1×10 7 cells/0.2㎖/mice의 양으로 BALB/c 누드 마우스의 우측 측면 피하 영역에 주사한 후 종양 부피가 150-200 ㎜ 3에 도달 할 때까지 기다렸다.
(i) 정상군(Naive)
(ii) 대조군(conrtol) : HT-29 종양을 보유한 이종 이식 마우스로서, 별도의 약물을 투여하지 않음
(iii) 5-플루오로우라실 처리군(5-Fu) : 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil)을 0.9% 식염수에 용해시켜 약물을 준비하고, 복강 내 IP 투여함/ 0.2㎖ 이하로 1주일 동안 5일 연속으로 하루에 한 번 투여하고, 1주일 휴식하고, 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil) 양을 기준으로 마우스에 1회당 15 mg/㎏(b.w)의 용량으로 2주 동안 1주일에 2회 IP 투여함(이러한 특정 치료 요법은 연구자에 의해 관찰된 5-FU의 부작용으로 인해 선택됨)
(iv) FA-FOS Ⅱ 처리군(FA FOS Ⅱ) : 페룰산-프럭토올리고당 결합체 FA-FOS Ⅱ를 증류수에 용해시켜 약물을 준비하고, FA-FOS Ⅱ 양을 기준으로 3890 mg/㎏(b.w)의 용량으로 4주 동안 매일 경구투여함
도 11은 HT-29 종양 보유 이종 이식 마우스 모델을 이용하여 페룰산-프럭토올리고당 결합체 FA-FOS Ⅱ의 항암 활성을 평가한 실험 결과 중 (a) 4 주 치료 후 종양 부피, (b) 종양 성장률, (c) 4 주 치료 후 종양 무게, (d) 4 주 치료 후 체중 , (e) 치료 과정 동안 매일 체중 증가율 및 (f) 치료 동안 체중 증가 프로파일을 나타낸 것이다. 도 11에서 보이는 바와 같이 FA-FOS Ⅱ 처리군에서 종양 부피는 대조군과 비교할 때 약 50% 감소하였다(p <0.05). 또한, FA-FOS Ⅱ 처리군에서 평균 종량 중량은 대조군과 비교할 때 약 37.34% 감소하였다. 약물 치료의 독성 또는 부작용을 간접적으로 알아보기 위해 측정한 체중은 FA-FOS Ⅱ 처리군에서 대조군과 비교할 때 약 6% 증가하였다. 또한, 매일 체중 증가율도 FA-FOS Ⅱ 처리군에서 대조군과 비교할 때 약 41.47% 증가했다. 전체 치료 기간 동안 FA-FOS Ⅱ 처리군에서의 체중 증가가 대조군보다 더 높은 것을 보여주었고 이러한 결과는 페룰산-프럭토올리고당 결합체 FA-FOS Ⅱ가 부작용을 유발하지 않는다는 점을 시사한다.
6. 페룰산-프럭토올리고당 결합체의 항산화 활성
FA-FOS Ⅰ의 항산화 활성을 ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)] 양이온 라디칼 소거능 분석법을 이용하여 측정하였다. ABTS 양이온 라디칼 소거능 분석법은 Arda Serpen et al., 2007에 의거하여 수행되었다. 구체적으로, 에펜도르프 튜브(eppendorf tube) 내에 동결건조된 FA-FOS Ⅰ을 다양한 양으로 첨가한 후 여기에 MnO 2를 사용하여 화학적으로 미리 생성한 ABTS 양이온 라디칼 시약 1.7㎖를 첨가한 후 2분 동안 교반하여 균일하게 혼합하고 6분 동안 반응을 진행하였다. 이후, 반응 혼합물을 원심분리하여 상등액을 수거하고, UV-VIS 플레이트 판독기를 이용하여 상등액의 흡광도를 734 ㎚에서 측정하였다. 도 12는 FA-FOS Ⅰ의 항산화 활성을 ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)] 양이온 라디칼 소거능 분석법을 이용하여 측정한 결과이다. 도 12에서 'FA FOS Ⅰ'은 FA-FOS Ⅰ을 나타낸다. 또 12에서 보이는 바와 같이 FA-FOS Ⅰ은 우수한 항산화 활성을 보였고 FA-FOS Ⅰ의 EC 50은 약 7.16㎎ 이었다.
이상에서와 같이 본 발명을 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 화합물에서 선택되는 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 :
    [화학식 Ⅱ]
    PhA-Glu-(Fru) n-Fru
    상기 화학식 Ⅱ에서,
    'PhA'는 페놀산 형태의 파이토케미컬을 나타내고, 'Glu'는 글루코스를 나타내고, 'Fru'는 프럭토스를 나타내고;
    'PhA'와 'Glu'는 에스테르 결합에 의해 연결되고, 'Glu'와 'Fru'는 글리코시딕 결합에 의해 연결되고, 'Fru'와 'Fru'는 글리코시딕 결합에 의해 연결되고;
    n은 글리코시딕 결합에 의해 연결된 'Fru'의 수로서 1 내지 59의 정수에서 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 페놀산 형태의 파이토케미컬은 페룰산(Ferulic acid), 카페익산(Caffeic acid), 신남산(Cinnamic acid), 클로로겐산(Chlorogenic acid), 쿠마린(Coumarin), 시나픽산(Sinapinic acid), 치코르산(Cichoric acid), 다이페룰산(Diferulic acid), 쿠마르산(Coumaric acid), 살리실산(Salicylic acid), 3-하이드록시벤조산(3-Hydroxybenzoic acid), 4-하이드록시벤조산(4-Hydroxybenzoic acid), 바닐산(Vanillic acid), 갈산(Gallic acid) 또는 엘라그산(Ellagic acid)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 페놀산 형태의 파이토케미컬은 글루코스 6번 탄소에 위치하는 하이드록실기와 파이토케미컬에 존재하는 카르복실기 사이의 에스테르 결합에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체.
  4. 제1항에 있어서, 하기 화학식 Ⅳ로 표시되는 페룰산-프럭토올리고당 결합체에서 선택되는 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 :
    [화학식 Ⅳ]
    Figure PCTKR2019014489-appb-img-000012
    상기 화학식 Ⅳ에서 n은 1 내지 59의 정수에서 선택된다.
  5. 제4항에 있어서, 하기 화학식 Ⅵ로 표시되는 페룰산-프럭토올리고당 결합체로 이루어지거나 이를 주성분으로 포함하는 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체.
    [화학식 Ⅵ]
    Figure PCTKR2019014489-appb-img-000013
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서 선택되는 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체의 약학적으로 허용가능한 염.
  7. (a) 반응 용매에 페놀산(Phenolic acid) 형태의 파이토케미컬(Phytochemical) 및 에스테르화 반응용 촉매를 첨가 및 용해하고 가열하여 파이토케미컬의 활성화 반응을 진행하고 활성화된 형태의 파이토케미컬을 포함하는 1차 반응 혼합물을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 1차 반응 혼합물에 하기의 일반 구조식으로 표시되는 프럭토올리고당(Fructooligosaccharide)을 첨가하고 불활성 가스 분위기하에서 가열하여 프럭토올리고당(Fructooligosaccharide)과 파이토케미컬(Phytochemical) 간의 에스테르화 반응을 진행하고 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체를 포함하는 2차 반응 혼합물을 수득하는 단계를 포함하는 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 제조방법 :
    [프럭토올리고당의 일반 구조식]
    Glu-(Fru) k
    상기 프럭토올리고당의 일반 구조식에서 'Glu'는 글루코스를 나타내고, 'Fru'는 프럭토스를 나타내고, k는 글리코시딕 결합을 통해 연결된 프럭토스의 수로서 2 내지 60의 정수에서 선택된다.
  8. 제7항에 있어서, 하기의 단계를 더 포함하는 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 제조방법 :
    (c) 상기 2차 반응 혼합물을 냉각 및 방치하여 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체를 침전시키고 원심분리 및 세척을 순차적으로 진행하여 정제된 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체를 수득하는 단계.
  9. 제7항에 있어서, 상기 (a) 단계의 파이토케미컬 활성화 반응은 45~120℃에서 2~20 hr 동안 진행되는 것을 특징으로 하는 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 제조방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 (b) 단계의 에스테르화 반응은 70~150℃에서 2~15 hr 동안 진행되는 것을 특징으로 하는 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 제조방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 에스테르화 반응용 촉매는 카보닐다이이미다졸(N,N'-carbonyldiimidazole, CDI)인 것을 특징으로 하는 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 제조방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체를 제조하기 위해 사용된 페놀산(Phenolic acid) 형태의 파이토케미컬(Phytochemical), 에스테르화 반응용 촉매 및 프럭토올리고당의 몰 비는 2:2:1 내지 10:10:1의 범위에서 선택되는 것을 특징으로 하는 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 제조방법.
  13. 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항의 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
  14. 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항의 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항의 파이토케미컬-프럭토올리고당 결합체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 대장암 전이 억제용 조성물.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59792B2 (ja) 1981-04-09 1984-01-09 株式会社東芝 送受信装置
JP2006089437A (ja) 2004-09-27 2006-04-06 Sanwa Denpun Kogyo Kk 酸性オリゴ糖
JP2007106724A (ja) * 2005-10-17 2007-04-26 Sanwa Denpun Kogyo Kk 膵臓癌発生抑制剤
JP2012187099A (ja) * 2011-02-21 2012-10-04 Shinshu Univ フェルラ酸結合型糖質及びその製造方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59792B2 (ja) 1981-04-09 1984-01-09 株式会社東芝 送受信装置
JP2006089437A (ja) 2004-09-27 2006-04-06 Sanwa Denpun Kogyo Kk 酸性オリゴ糖
JP2007106724A (ja) * 2005-10-17 2007-04-26 Sanwa Denpun Kogyo Kk 膵臓癌発生抑制剤
JP2012187099A (ja) * 2011-02-21 2012-10-04 Shinshu Univ フェルラ酸結合型糖質及びその製造方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Remington's Pharmaceutical Science", MACK PUBLISHING COMPANY
CESARE MANCUSO ET AL.: "Ferulic acid: Pharmacological and toxicological aspects", FOOD AND CHEMICAL TOXICOLOGY, vol. 65, 2014, pages 185 - 195, XP028610011, DOI: 10.1016/j.fct.2013.12.024
KAMIJO, T.: "An Improved and Convenient Synthesis of Esters Using 1,1'-Carbonyldiimidazole and a Reactive Halide", CHEM. PHARM. BULL., 1984, pages 5044 - 5047, XP55704755 *
LEE, S. Y.: "A new phenylpropane glycoside from the rhizome of Sparganium stoloniferum", ARCH PHARM RES, 2010, pages 515 - 521, XP55704760 *
MESAIK, M. A.: "In silico and in vitro immunomodulatory studies on compounds of Lindelofia stylosa", CHEM BIOL DRUG DES, vol. 79, no. 3, 2012, pages 290 - 299, XP55704750 *

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