WO2020122405A1 - 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2020122405A1
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cells
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양철우
정병하
김경운
김보미
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Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University of Korea
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the present invention relates to mesenchymal stem cells having improved immunomodulatory ability and uses thereof, specifically, dedifferentiated stem cell-derived mesenchymal stem cells (iPS-MSC) having superior immune modulating ability compared to mesenchymal stem cells isolated directly from tissues. ) And pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of immune-related diseases including the same.
  • iPS-MSC dedifferentiated stem cell-derived mesenchymal stem cells
  • the immune system protects the body from harmful foreign substances, antigens.
  • antigens include bacteria, viruses, toxins, cancer cells, blood and tissues of other people or animals.
  • the immune system responds to these harmful substances and produces antibodies to eliminate them.
  • an autoimmune disorder occurs, the immune system cannot distinguish its healthy body organs from harmful antigens, destroying normal tissues, and autoimmune disease caused by this reaction occurs.
  • a reaction occurs to normal tissues of the body. The cause of autoimmune abnormalities is not clear, but there is a hypothesis that microorganisms or drugs, such as bacteria, cause disease in people born with genes prone to autoimmune diseases.
  • a number of chemical and biological immunotherapy methods have been developed for autoimmune treatment.
  • a typical treatment method is to weaken the body's immune response as a whole by using chemical agents such as steroids or anti-immune cell antibodies. For example, by administering an antibody that binds to CD22, CD20, CD19, CD74, or HLA-DR antigen, it weakens the body's overall immune response, including the normal function of B cells.
  • Republic of Korea Patent Publication No. 2008-0109705 relates to this increased mesenchymal stem cell-mediated autologous dendritic cells with immunosuppression, and discloses dendritic cells with improved T-cell suppression ability and their use of autoimmune diseases.
  • U.S. Patent No. 7,074,403 relates to a method of treating autoimmune diseases using antibodies targeting B cells, and discloses antibodies that specifically bind to B-cell antigens.
  • U.S. Patent No. 7,735,592 relates to a cell composition for the treatment of immune disease using cells from other subjects, and discloses a T cell composition coated with an anti-CD3, anti-CD28 antibody.
  • Conventional autoimmune disease treatment is to weaken the overall immune system of the body, causing the side effects of other diseases by dropping the body's immune function that can respond to external invasion.
  • mesenchymal stem cells are stem cells present in the whole body including bone marrow capable of differentiating into various cell systems such as adipocytes, bone cells and chondrocytes.
  • Mesenchymal stem cells have been isolated from a number of species including humans, mice, mice, dogs, goats, rabbits and cats. Recently, it has been reported that mesenchymal stem cells exert immunoregulatory ability by inhibiting several T lymphocyte activities in vitro and in vivo, and induced pluripotent stem cells (iPS) for smooth supply of mesenchymal stem cells. Although a method of using has been suggested, mesenchymal stem cells derived directly from mesenchymal stem cells derived from induced pluripotent stem cells have not been sufficiently studied for the difference in immune modulating ability.
  • the present inventors studied the immune modulating ability of dedifferentiated stem cell-derived mesenchymal stem cells (iPS-MSC) derived from cells isolated from healthy humans, iPS- compared to bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSC) It has been found that the immunomodulatory ability of MSC is excellent, and the invention of the composition for the treatment of autoimmune diseases or inflammatory diseases using iPS-MSC was completed.
  • iPS-MSC dedifferentiated stem cell-derived mesenchymal stem cells derived from cells isolated from healthy humans, iPS- compared to bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSC)
  • iPS-MSC differentiated stem cell-derived mesenchymal stem cell
  • Another object of the present invention is a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases or inflammatory diseases, including dedifferentiated stem cell-derived mesenchymal stem cells (iPS-MSC) with improved immune regulation compared to directly isolated MSC. Is to provide.
  • iPS-MSC dedifferentiated stem cell-derived mesenchymal stem cells
  • a further object of the present invention relates to a method for the prevention or treatment of inflammatory diseases, comprising the step of administering mesenchymal stem cells derived from dedifferentiated stem cells to a subject in need thereof.
  • mesenchymal stem cells iPS-MSC
  • iPS-MSC cultures derived from dedifferentiated stem cells which have improved immune regulation compared to directly isolated MSCs
  • iPS-MSC cultures from which cells have been removed are used as active ingredients. It relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of an autoimmune disease or an inflammatory disease.
  • dedifferentiated stem cells may be used interchangeably with “derived stem cells”, “derived pluripotent stem cells” or “induced pluripotent stem cells” (iPS).
  • derived stem cells derived pluripotent stem cells
  • iPS induced pluripotent stem cells
  • cell therapy refers to the proliferation and selection of living autologous, allogenic, and xenogenic cells in vitro to restore the function of cells and tissues, or the biological properties of cells by other methods. It refers to a medicine used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions such as changing.
  • the US has been managing cell therapy products as pharmaceuticals since 1993, and Korea since 2002.
  • These cell therapy products can be broadly classified into two fields, the first is “stem cell therapy” for tissue regeneration or long-term function recovery, and the second is the suppression of immune responses in vivo or the regulation of immune responses such as the improvement of immune responses. It can be classified as a therapeutic agent for immune cells.
  • An example of the present invention is to provide an induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cell (iPS-MSC) derived from normal cells, which has improved immune regulation, for example, increased anti-inflammatory factors and reduced inflammatory factors.
  • iPS-MSC induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cell
  • a further example of the present invention relates to a cell therapeutic agent comprising dedifferentiated stem cell-derived mesenchymal stem cells (iPS-MSC) derived from normal cells with improved immune regulation.
  • iPS-MSC dedifferentiated stem cell-derived mesenchymal stem cells
  • Another example of the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases or inflammatory diseases, including dedifferentiated stem cell-derived mesenchymal stem cells (iPS-MSC) derived from normal cells with improved immune regulation.
  • iPS-MSC dedifferentiated stem cell-derived mesenchymal stem cells
  • the mesenchymal stem cells (iPS-MSC) derived from dedifferentiated stem cells are derived from dedifferentiated stem cells derived from cells isolated from mammals, and thus MSCs isolated directly from tissues, such as bone marrow. It is distinguished from a derived mesenchymal stem cell (BM-MSC) or an embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cell driven from Embryonic stem cell (ES-MSC).
  • BM-MSC derived mesenchymal stem cell
  • ES-MSC embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cell driven from Embryonic stem cell
  • the iPS-MSC may be derived from cells isolated from normal humans.
  • MSC Mesenchymal Stem Cell
  • a stem cell obtained by being directly separated from bone marrow, blood, dermis and periosteum and is composed of various cells such as adipocytes, chondrocytes, and bone cells.
  • mesenchymal stem cells obtained directly from tissue are separated from mesenchymal stem cells from mammalian, preferably human, mesenchymal stem cell sources, such as blood or bone marrow (the bone marrow is tibia, femur, spinal cord).
  • the tissue-derived mesenchymal stem cells are umbilical cord mesenchymal stem cells, cord blood-derived mesenchymal stem cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, fat-derived mesenchymal stem cells, muscle-derived mesenchymal stem cells, nerve-derived mesenchymal stem cells, It may be one or more selected from the group consisting of skin-derived mesenchymal stem cells, amniotic-derived mesenchymal stem cells, and placental-derived mesenchymal stem cells.
  • IPS-MSC according to the present invention has an improved immunomodulatory ability compared to MSC isolated directly from tissues, for example, has an increased anti-inflammatory factor and a reduced inflammatory factor.
  • the degree of improvement of the immunomodulatory ability can be evaluated by an inflammatory index (R), and the inflammatory index (R) is expressed as an inflammatory cytokine expression level compared to an anti-inflammatory cytokine expression level (Equation 1 below). Specifically, the lower the value of the inflammatory index, it is evaluated that the immunomodulatory ability increased.
  • the inflammatory index of iPS-MSC according to the present invention may be expressed as 40% or less based on 100% of the inflammatory index of mesenchymal stem cells isolated directly from tissues.
  • the MSC directly separated from the iPS-MSC is in contact with synovial cells and co-cultured with synovial cells. It can be divided into cells and cultured alone, and can be expressed as a multiple ratio between iPS-MSC and directly separated MSC in the case of two cultures.
  • the inflammatory index of iPS-MSC has a lower value than the inflammatory index of MSC isolated directly from tissue, which has an excellent anti-inflammatory effect compared to MSC obtained by iPS-MSC directly isolated from tissue. Indicates.
  • the expression level of the cytokine can be used in the cytokine expression level measurement by a person skilled in the art freely selecting a method known in the art according to the purpose, for example, Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). ), flow cytometry, real-time polymerase chain reaction (real-time PCR), and confocal microscopy (confocal microscopy).
  • ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
  • flow cytometry flow cytometry
  • real-time polymerase chain reaction real-time PCR
  • confocal microscopy confocal microscopy
  • the inflammatory cytokine may be selected without limitation as long as it is an inflammatory cytokine known in the art.
  • the inflammatory cytokine is one selected from the group consisting of tumor necrosis factor alpha (TNF-a), interleukin 1 beta (IL-1b), IL-2, IL-6, IL-8, and IL-17.
  • TNF-a tumor necrosis factor alpha
  • IL-1b interleukin 1 beta
  • IL-2 interleukin 1 beta
  • IL-6 interleukin 1 beta
  • IL-8 interleukin 17
  • the above may be, and may be one or more selected from the group consisting of IL-6, IL-8 and IL-17, but is not limited thereto.
  • the anti-inflammatory cytokine may be selected without limitation as long as it is an anti-inflammatory cytokine known in the art.
  • it may be one or more selected from the group consisting of tumor necrosis factor beta (TNF-b), IL-4, IL-10, and IL-13, preferably TNF-b or IL-10, more preferably May be IL-10, but is not limited thereto.
  • the inflammatory index (R) of the iPS-MSC is 0.00001 to 15, 0.0001 to 15, 0.001 to 15, 0.01 to 15, 0.00001 to 10, 0.0001 to It may be 10, 0.001 to 10, 0.00001 to 8, 0.0001 to 8, 0.001 to 8, 0.00001 to 6, 0.0001 to 6, or 0.001 to 6, but is not limited thereto.
  • the inflammatory index (R) of the iPS-MSC is based on 100% of the inflammatory index of the MSC (eg, BM-MSC) isolated directly from the tissue, 40% or less, 35% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% or less, 10% or less, 5% or less, 1% or less, 0.5% or less, 0.3% or less, 0.2% or less, 0.1% Hereinafter, it may be 0.01% or less or 0.001% or less.
  • the inflammatory index of the iPS-MSC is based on 100% of the inflammatory index of the MSC (eg, BM-MSC) isolated directly from the tissue.
  • IL-6/IL-10 expression ratio (R) is 0.3% or less, 0.2% or less, 0.15% or less, 0.10% or less, 0.01% or less, 0.07% or less, 0.05% or less, 0.03% or less, 0.01% or less , Or a value in the range of 0.001% or less, and the expression ratio (R) of IL-8/IL-10 is 30% or less, 25% or less, 20% or less, 17% or less, 15% or less, 13% or less, or 10 Values in the range of% or less may be indicated.
  • the inflammatory index of iPS-MSC is IL-6/IL-10 (p ⁇ 0.01) and IL-8/IL-10
  • the expression level ratio of (p ⁇ 0.05) was statistically significantly lower than that of bone marrow-derived stem cells (BM-MSC).
  • BM-MSC bone marrow-derived stem cells
  • iPS-MSC The inflammatory index, such as the IL-6/IL-10 ratio showed a value of about 0.053% when the BM-MSC value was set at 100%, and the IL-8/IL-10 ratio was the value of the BM-MSC. When the value was set at 100%, it was about 15%.
  • the iPS-MSC has an excellent anti-inflammatory effect compared to the BM-MSC.
  • the ratio of IL-6/IL-10 of iPS-MSC has a p value of 0.01 or less and an inflammatory index value of 1 or less and/or IL
  • the ratio of -8/IL-10 may have a p value of 0.05 or less and an inflammatory index value of 10 or less.
  • the expression of the cytokine of iPS-MSC Ratio is 0.001 to 1.5, 0.01 to 1.5, 0.1 to 1.5, 0.2 to 1.5, 0.3 to 1.5, 0.001 to 1.0, 0.01 to 1.0, 0.1 to 1.0, 0.2 to 1.0, 0.3 to 1.0, 0.001 to 0.7, 0.01 to 0.7, 0.1 to 0.7, 0.2 to 0.7, or 0.3 to 0.7.
  • the ratio of the anti-inflammatory cytokine to the inflammatory cytokine is when mesenchymal stem cells (MSC) come into contact with synovial cells, for example, co-culture of synovial cells and mesenchymal stem cells or mesenchymal stem cells are injected into synovial cells.
  • MSC mesenchymal stem cells
  • R cytokine expression ratio
  • iPS-MSC cytokine expression ratio of iPS-MSC is 75% or less, 70% or less, 65% or less, 60% or less , 55% or less, 50% or less, 45% or less, 40% or less, 35% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% or less, or 5% or more and 15% or less.
  • human monocyte cells were stimulated with Th17 differentiation conditions and co-cultured with iPS-MSC or BM-MSC in order to confirm the immunomodulatory ability of iPS-MSC.
  • IL-17 production in cells decreased more than when co-cultured with BM-MSC, while the amount of Treg marker was not significantly different. That is, it was confirmed that iPS-MSC according to the present invention further suppresses inflammatory Th17 cells (IL-17 production) than bone marrow-derived stem cells (BM-MSC), while maintaining immunoregulatory T cells (Treg).
  • IL-17 production which is an inflammatory cytokine
  • IL-10 an anti-inflammatory cytokine
  • the iPS-MSC according to the present invention is derived from dedifferentiated stem cells, and first, cells, for example, monocytes are obtained from normal human blood, and coated with monocytes in 24-well plates with vitronectin (BD BioCoat TM ) and Dedifferentiated stem cells (iPS) were prepared through Sendai virus (SeV) (CytoTune®-iPS 2.0 Reprogramming kit, Life Technologies, Invitrogen).
  • the dedifferentiated stem cells are separated from colony-shaped cells to produce an EB (embryo body) and differentiated through b-FGF, rh TGF-b cytokines in ⁇ -Minimum Eagle's Medium culture medium containing 20% fetal calf serum.
  • iPS-MSC is obtained.
  • Methods for preparing dedifferentiated stem cells from the monocytes and obtaining iPS-MSC from dedifferentiated stem cells are well known.
  • the method of manufacturing iPS-MSC according to the present invention (1) isolates mononuclear cells from the blood of a normal person, and uses Sendai virus (SeV), CytoTune®-iPS 2.0 Reprogramming kit to reverse-differentiate stem cells ( iPS) and (2) b-FGF, rh TGF- in ⁇ -Minimum Eagle's Medium culture medium containing 20% fetal calf serum by tearing cells in colony form to produce an EB (embryo body).
  • b Differentiation through cytokines may include the step of preparing an iPS-MSC.
  • the dedifferentiated stem cell is selected from the group consisting of monocytes, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerves, skin, amniotic membranes and placenta 1 It may be from a species or higher.
  • normal or normal person means an individual or a person who is not an autoimmune disease or an inflammatory disease patient, and includes a state prior to the onset or diagnosis time point of an autoimmune disease or an inflammatory disease.
  • the individual may be a human, including a human, a primate such as a monkey, a mammal including a rodent such as a rat, a mouse, and preferably human, but is not limited thereto.
  • the inflammatory disease according to the present invention is a cytokine-mediated inflammatory disease
  • examples of the cytokine-mediated inflammatory disease include systemic lupus erythematosus, Hashimoto's thyroiditis, type 1 diabetes, hypothyroidism, hyperthyroidism, and Sjogren's syndrome ( Sjogren's syndrome), psoriasis, Crohn's disease, thyroiditis, and ulcerative colitis may include one or more selected from the group consisting of rheumatoid arthritis.
  • the pharmaceutical composition provided herein is an oral dosage form, such as powder, granule, tablet, capsule, suspension, emulsion, syrup, aerosol, formulated according to a conventional method, or suspension, emulsion, lyophilized preparation, It can be formulated and used as a parenteral formulation such as an external preparation, a suppository, a sterile injection solution, and an implantable formulation.
  • the pharmaceutically acceptable carrier included in the pharmaceutical composition of the present invention is commonly used in formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, silicic acid Calcium, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, but is not limited thereto. It is not.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., a talc, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, kaolin, kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, a talct, a talct, a talct, a stevia, glycerin, a stevia, glycerin, glycerin, g
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, preferably parenterally.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by intravenous infusion, subcutaneous infusion, intramuscular infusion and intraperitoneal infusion.
  • the pharmaceutical composition of the present invention it is preferable that the route of administration is determined according to the type of disease to be applied. For example, when applied to type I diabetes, intraperitoneal administration is most preferred, because the administered dendritic cells can effectively migrate to the pancreas without dilution.
  • the pharmaceutical composition of the present invention when applied to a patient with arthritis, it may be administered by intravenous injection, but most preferably, it is administered by intra-articular injection.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may be variously prescribed by factors such as formulation method, mode of administration, recipient's age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response sensitivity. Can be.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 1 x 10 3 to 1 x 10 12 cells/kg per day.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in a unit dose form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person skilled in the art to which the present invention pertains, or It can be manufactured by incorporating into a multi-dose container.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases or inflammatory diseases, including iPS-MSC, which has excellent immune-modulating ability compared to BM-MSC, and the supply of MSC compared to MSC directly isolated. It is easy and shows a significantly superior immunomodulatory effect compared to directly isolated MSC, and thus can be used for the prevention or treatment of autoimmune diseases or inflammatory diseases including rheumatoid arthritis.
  • Figure 1a is a photomicrograph showing the change in cell appearance in the process of preparing mesenchymal stem cells derived from pluripotent stem cells (hiPS) derived from normal humans (denoted as iMSC or iPS-MSC).
  • hiPS pluripotent stem cells
  • 1B is a graph confirming that iPS-MSC normally expresses MSC-specific markers in addition to external features.
  • Figure 1c is observed in the iPS-MSC formed by the method of Example 1 in the differentiation conditions to determine whether it has the ability to differentiate into chondrocytes, osteoblasts and adipocytes, as in the directly separated MSC, observed by staining the differentiated cells It is a picture.
  • 2A and 2B are graphs comparing the production of inflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines of iPS-MSC and BM-MSC.
  • Figures 3a and 3b is a specific marker for IL-17 and Treg cells produced by Th17 cells after co-culture with BM-MSC or iPS-MSC after inducing differentiation under Th17 differentiation conditions by separating human monocytes. It is a graph comparing the ratio of Foxp3 + CD4 + cells.
  • Figure 3c is a graph comparing the amount of IL-17 and IL-10 in the culture when human monocytes and BM-MSC or human monocytes and iPS-MSC are co-cultured under Th17 differentiation conditions.
  • Figures 4a and 4b is a graph analyzing the ratio of Th17 cells or Treg cells by co-culture with synovial cells isolated from patients with rheumatoid arthritis under i17-differentiation conditions with iPS-MSC.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of analyzing the amount of IL-17 and IL-10 involved in the inflammatory response by co-cultivating synovial cells and BM-MSC or iPS-MSC isolated from rheumatoid arthritis patients under Th17 differentiation conditions.
  • Example 1 Preparation of mesenchymal stem cells derived from dedifferentiated stem cells (iPS_MSC)
  • Monocytes were isolated from the blood of a healthy person (hereinafter referred to as a'normal person') who was not diagnosed with an immune disease, and used to produce dedifferentiated stem cells. Specifically, normal human blood was obtained from a normal donor at clergy Mall, and 10 mL of blood was centrifuged using Ficoll Paque TM PLUS (GE Healthcare) for 2,000 rpm for 30 minutes to separate mononuclear cells.
  • the isolated monocytes were cultured for 4 days in StemSpan TM ACF (Stem Cell Technologies) supplemented with StemSpan cc110. Subsequently, mononuclear cells were coated on 24-well plates with vitronectin (BD BioCoat ⁇ ) and Sendai virus (SeV) (CytoTune®-iPS 2.0 Reprogramming kit, Life Technologies, Invitrogen) to prepare dedifferentiated stem cells (iPS) Did. Medium was changed daily until iPS colonies formed. After manual picking, iPS lines were maintained in plates coated with vitronectin (Life Technologies, Invitrogen) in TeSR-E8 medium (Stem Cell Technologies). On day 12 after transduction, new iPS colonies were picked individually and expanded for characterization. After transfection, cells were cultured at 37°C and 5% CO 2 conditions from 3 to 21 days to obtain dedifferentiated stem cells.
  • StemSpan TM ACF StemSpan TM ACF (Stem Cell Technologies) supplemented with StemSpan cc110.
  • iPS-MSC mesenchymal stem cells
  • Dedifferentiated stem cells obtained by the method of Example 1-1 were PBS washed with iPS cells grown with 100% confluence in one 100mm dish to differentiate again with iMSC, and then washed with 1mg/ml type IV Collagenase solution in 100mm dish Into 3 ml, and reacted at 37°C for 10 minutes, and after adding 6 ml of media, centrifugation was performed at 1100 rpm for 3 minutes.
  • ⁇ -Minimum Eagle's Medium 0.1 mM nonessential amino acid (100x) gibco, 1 mM L-glutamine, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1% penicillin streptomycin
  • a change in cell morphology in the process of changing from iPS to iPS-MSC was observed using a microscope.
  • Cell samples for observation were prepared with cells with passage 5 or higher after growing iPS-MSC for about 4 weeks.
  • Figure 1a is a photomicrograph showing the change in cell appearance in the process of preparing mesenchymal stem cells derived from pluripotent stem cells (hiPS) derived from normal humans (denoted as iMSC or iPS-MSC). Colony formation was prominent in hiPS, but the appearance of these colonies was not observed in iMSC, so external changes were observed.
  • hiPS pluripotent stem cells
  • CD34, CD31, CD19, CD11, HALDR (Negative Marker), CD44, CD73, CD105, and CD90 (Positive Marker), known as MSC markers was examined for these iPS-MSCs. Specifically, after growing iMSC for about 4 weeks, it was confirmed by flow cytomery in cells with passage 5 or higher. 1B is a graph confirming that iPS-MSC normally expresses MSC-specific markers in addition to external features.
  • iPS-MSC induced by the method of Example 1-2 exhibits characteristics as mesenchymal stem cells.
  • the iPS-MSC of the present invention has a multipotential ability unique to mesenchymal stem cells and can differentiate into chondrocytes, osteoblasts, and adipocytes. Specifically, after performing safranin-O, alkaline phosphatase (ALP) substrate, and Oil Red O staining, it was performed by observing and visualizing with a Zeiss microscope (LSM 510 Meta, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany). The results are shown in Figure 1c. As can be seen in Figure 1c, it was confirmed that the iPS-MSC of the present invention has a multi-lineage differentiation that can differentiate into chondrocytes, osteoblasts, and adipocytes.
  • ALP alkaline phosphatase
  • FIG. 1c stains the differentiated cells after induction with each differentiation condition to confirm that the iPS-MSC formed by the method of Example 1 has differentiation ability into chondrocytes, osteoblasts, and adipocytes, as in the directly isolated MSC. It is a picture observed. Differentiation into all of chondrocytes, osteoblasts, and adipocytes was confirmed, indicating that iPS-MSC has the same function as MSC directly isolated.
  • the inflammatory cytokine or anti-inflammatory cytokine expression level was confirmed by ELISA.
  • iPS-MSC prepared in Example 1-2 was used as a control group after bone marrow-derived stem cells (BM-MSC) as a control group, and after growing stem cells with 90% confluence in a 100 mm dish. Place the ELISA microplates according to the manufacturer's instructions according to the inflammatory cytokines IL-6, IL-8, IL-2 and anti-inflammatory cytokines IL-10 and TGF-b (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). ELISA was performed using a absorbance reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) measured at 405 nm.
  • BM-MSC was purchased from the clergyman and used.
  • Mesenchymal stem cells were cultured in a 37°C, 5% carbon dioxide, humidity 95% incubator by adding 10% FBS and antibiotics to DMEM/F12 (Gibco).
  • 2A and 2B are graphs comparing the production of inflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines of iPS-MSC and BM-MSC.
  • IL-6 and IL-8 are inflammatory cytokines, IL-10, TGF-b corresponds to a non-inflammatory cytokine, it can be confirmed that the reduction of inflammatory cytokines is particularly pronounced.
  • Table 1 below shows the ratio of inflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines of iPS-MSC and BM-MSC.
  • the immune system maintains a balance like the seesaw, both immune tolerance and immune response, and is properly regulated.
  • the immunological homeostasis collapses, and the collapse of the immunological homeostasis causes various forms of immunologically related diseases.
  • This immunological balance can be controlled by inflammatory and anti-inflammatory cytokines.
  • the expression level of anti-inflammatory cytokines in iPS-MSC and BM-MSC is not different, but the expression level of inflammatory cytokines, i.e., IL-6/IL-10 and IL-8/IL-10, is iPS -Since it is statistically significantly reduced in MSC compared to BM-MSC, it can be predicted that the immunological control ability is excellent.
  • IL-6/IL-10 p ⁇ 0.01
  • IL-8/IL-10 The expression level ratio of p ⁇ 0.05
  • Th17 cells are known to be involved in various autoimmune diseases, such as arthritis, multiple sclerosis, psoriasis, and inflammatory bowel disease, by producing IL-17 that disrupts the cytokine immune system.
  • Th17 cells which produce a lot of specific cytokines IL-17, have been found to have a direct role in the autoimmune disease rheumatoid arthritis etiology through animal models and human cell research, and to host defense against pathogens or induce adverse immune responses.
  • immunoregulatory T cells suppress the immune response, and serve to prevent excessive immune response in the body.
  • monocyte cells of normal humans were subjected to Th17 cell differentiation conditions (anti-CD3 (1 ⁇ g/ml; BD Biosciences), anti-CD28 (1 ⁇ g/ml; BD Biosciences), IL-1 ⁇ (20 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), IL-6 (20 ng/ml; R&D Systems), IL-23 (20 ng/ml; R&D Systems), neutralizing antibodies 10% fetal calf in iPS-MSC or BM-MSC and RPMI 1640 medium medium by stimulation with against interferon-gamma (IFN- ⁇ ; 2 ⁇ g/ml; R&D Systems), IL-4 (2 ⁇ g/ml; R&D Systems) Serum (FCS), 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, and 2 mM L-glutamine were added, and air-cultured at 37°C and Th17 cell differentiation conditions (anti-CD3 (1 ⁇ g/ml; BD Biosciences
  • IL-17 (FIGS. 3A and 3B) and CD25 + Foxp3 + expression generated in immunoregulatory T cells were examined, and the contents of IL-17 and IL-10 in each culture were analyzed using ELISA (FIG. 3C). ).
  • FACS method is a cell surface staining method, monoclonal antibody anti-CD4-PE / Cy7 (RPA-T4, IgG1, BioLegend, San Diego, CA, USA) and anti-CD25-APC (M-A251, IgG1 , ⁇ , BD Biosciences), washed with cells by intracellular staining, made permeable, and monoclonal antibody anti-IL-17-PE (eBio64dec17, IgG1, ⁇ , eBioscience, San Diego, CA, USA) , Incubated with anti-IFN- ⁇ -FITC (4S.B3, IgG1, ⁇ ; eBioscience) and anti-Foxp3-FITC (PCH101, IgG2a, ⁇ ; eBioscience) antibodies. In addition, an appropriate isotype antibody was prepared and stained. Intracellular cytokines were analyzed with a flow cytometer (FACS Calibur; Becton Dickinson, San Diego, CA).
  • sandwich ELISA method monoclonal IL-6, IL-8, IL-2, IL-10, TGF-b, IL-17 (R&D systems, USA) in a 96 well plate (NUNC, Denmark) for Sandwich ELISA 50 ⁇ l/well at 4 ug/mL, and reacted overnight at 4° C., followed by blocking solution (1% (w/v) BSA/ PBS (Phosphate-Buffered Saline), 0.05% (v/v) tween 20/ PBS) was added at 200 uL/well and reacted at room temperature for 2 hours.
  • BSA/ PBS Phosphate-Buffered Saline
  • Recombinant IL-6, IL-8, IL-2, IL-10, TGF-b, IL-17 were used as a control group to measure concentrations of 5 ng/mL to 78 pg/mL, respectively.
  • the separated patient serum to be measured together with the standard sample was added at 50 uL/well and reacted for 2 hours at room temperature.
  • the reaction vessel was washed 4 times with a washing solution (0.05% (v/v)Tween 20/PBS) and the biotinylated IL-6, IL-8, IL-2, IL-10, TGF-b, and IL-17 antibodies were 200.
  • FIGS. 3A to 3C The analysis results are shown in FIGS. 3A to 3C.
  • Figures 3a and 3b is a specific marker for IL-17 and Treg cells produced by Th17 cells after co-culture with BM-MSC or iPS-MSC after inducing differentiation under Th17 differentiation conditions by separating human monocytes. This graph compares the percentage of Foxp3+CD4+ cells.
  • iPS-MSC further suppresses inflammatory Th17 cells (IL-17 production) than bone marrow-derived stem cells (BM-MSC), whereas immunoregulatory T cells (Treg) Confirmed that it was maintained.
  • IL-17 production which is an inflammatory cytokine, decreased and IL-10, an anti-inflammatory cytokine, increased.
  • FIG. 3c is a graph comparing the amount of IL-17 and IL-10 in the culture when human monocytes and BM-MSC or human monocytes and iPS-MSC are co-cultured under Th17 differentiation conditions.
  • the amount of inflammatory cytokine IL-17 was significantly reduced, and the anti-inflammatory cytokine IL-10 was significantly increased.
  • Table 17 shows the ratio of IL-17 to IL-10 as a result of Th17 differentiation conditions and co-culture with each MSC. Specifically, in the Th17 differentiation condition, the IL-17/IL-10 ratio was 2.3, but when co-cultured with BM-MSC, it fell to 1.6, and significantly decreased to 0.5 in iPS-MSC.
  • Rheumatoid arthritis is known to activate the disease by increasing the inflammatory cytokines as cells in the synovial membrane become active and infiltrate into joint tissue. It was intended to confirm whether the iPS-MSC of the present invention has a disease control effect against rheumatoid arthritis.
  • SFMC synovial fluid mononuclear cells isolated from synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis
  • SFMC of rheumatoid arthritis patients with Th17 cell differentiation condition After stimulation, when co-cultured with iPS-MSC, IL-17, a cytokine produced in Th17 cells, and CD25+Foxp3+ expression, a marker produced in immunoregulatory T cells (Treg), were examined by FACs.
  • synovial fluid from patients with rheumatoid arthritis was obtained from the Department of Internal Medicine, clergy University of Rheumatology.
  • Mononuclear cells were obtained from synovial fluid isolated from a patient with rheumatoid arthritis by the method described in Example 1 (RA SFMC; synovial fluid mononuclear cells from RA patients), and Th17 differentiation conditions were formed as described in Example 3 to form iPS-MSC and 37.
  • Air conditioning was performed for 48 hours at 5° C. and 5% CO 2 conditions.
  • the amount of IL-17 formed in Th17 from the culture and CD25+Foxp3+ expression generated in immunoregulatory T cells (Treg) were analyzed in substantially the same manner as FACS in Example 3, and the results were shown in FIGS. 4A and 4B. Shown.
  • Figures 4a and 4b is a graph analyzing the ratio of Th17 cells or Treg cells by co-culture with synovial cells isolated from patients with rheumatoid arthritis under i17-differentiation conditions with iPS-MSC.
  • the iPS-MSC derived from normal humans also has immunomodulatory ability against SFMC, which is an actual pathogen of rheumatoid arthritis, and confirmed the therapeutic effect on rheumatoid arthritis disease at the patient cell level.
  • Example 5 Evaluation of anti-inflammatory efficacy of rheumatoid arthritis of iPS-MSC
  • the ratio of inflammatory cytokines IL-17 and anti-inflammatory cytokines IL-10 was examined to confirm that the iPS-MSC of the present invention has superior inflammation control effect of rheumatoid arthritis compared to bone marrow-derived MSC (BM-MSC).
  • mononuclear cells were isolated by obtaining synovial fluid from a patient with rheumatoid arthritis in the same manner as in Example 4-1.
  • the isolated mononuclear cells were co-cultured with iPS-MSC or BM-MSC, and ELISA analysis was performed in substantially the same manner as in Example 3 ELISA to measure the content of cytokines in the cells, and the results are shown in FIG. 5.
  • Table 2 Table 2.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of analyzing the amount of IL-17 and IL-10 involved in the inflammatory response by co-cultivating synovial cells and BM-MSC or iPS-MSC isolated from rheumatoid arthritis patients under Th17 differentiation conditions.
  • the amount of inflammatory cytokine IL-17 in iPS-MSC is significantly reduced, and the amount of anti-inflammatory cytokine IL-10 is significantly increased compared to BM-MSC, resulting in iPS-MSC of the present invention. It can be seen that it exhibits an excellent anti-inflammatory effect compared to BM-MSC.

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Abstract

본 발명은, 체세포로부터 제작된 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC) 또는 그 조건 배지를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명이 제공하는 약학적 조성물은 조직으로부터 직접 분리된 중간엽 줄기세포에 비해 우수한 면역 제어 및 항염증 효과를 가지며, 공급이 용이하여 류마티스 관절염과 같은 자가면역 질환의 예방 및 치료에 효과적이다.

Description

역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 면역 조절능이 향상된 중간엽 줄기세포 및 이의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 조직에서 직접 분리된 중간엽 줄기세포에 비해 우수한 면역 조절능을 가지는 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)와 이를 포함하는 면역관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
면역체계는 해로운 외부물질인 항원으로부터 신체를 보호하는 역할을 한다. 이러한 항원의 종류로는 박테리아, 바이러스, 독소, 암세포, 다른 사람 혹은 동물의 혈액과 조직이 이에 해당된다. 면역체계는 이러한 해로운 물질에 반응하여 이를 제거하기 위하여 항체를 생산한다. 그러나 자가 면역에 이상이 생긴 경우, 면역체계는 자신의 건강한 신체 장기와 해로운 항원을 구분하지 못하여, 정상적인 조직을 파괴하게 되며, 이러한 반응으로 인해 야기되는 자가 면역 질환 (Autoimmune disease)이 발생하게 된다. 자가 면역에 이상이 생긴 경우에는 신체의 정상적인 조직을 대상으로 반응이 일어나게 된다. 자가면역 이상의 원인은 확실치 않으나, 박테리아와 같은 미생물 또는 약물이 자가 면역 질환에 걸리기 쉬운 유전자를 가지고 태어난 사람들에게 병을 유발하는 것이라는 가설이 있다.
자가면역 치료를 위해 다수의 화학적 및 생물학적 면역치료 방법이 개발되었다. 전형적 치료방법은 스테로이드 같은 화학제 또는 항-면역 세포항체를 이용하여 신체의 면역반응을 전체적으로 약화시키는 것이다. 예를 들어 CD22, CD20, CD19, CD74 또는 HLA-DR 항원에 결합하는 항체를 투여하여, B 세포의 정상기능을 포함한 신체의 전체적 면역반응을 약화시키는 것이다.
대한민국 공개특허공보 제2008-0109705호는 면역억제는 이 증가된 간엽줄기세포 매개 자가유래 수지상 세포에 관한 것으로, T-세포 억제능이 향상된 수지상 세포 및 이의 자가면역질환 용도를 개시한다. 미국특허 제 7,074,403호는 B 세포를 표적으로 하는 항체를 이용한 자가면역 질환의 치료법에 관한 것으로, B-세포 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 개시한다. 미국특허 제7,735,592호는 다른 대상체 유래의 세포를 사용한 면역질환 치료용 세포 조성물에 관한 것으로, 항-CD3, 항-CD28 항체로 코팅된 T 세포 조성물를 개시한다. 종래 자가 면역질환 치료는 신체의 전반적 면역시스템을 약화시키는 것으로, 외부의 침입에 대응할 수 있는 신체의 면역기능을 전반적으로 떨어뜨려 다른 질환에 걸리게 하는 부작용을 초래하였다.
한편, 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal Stem Cell; MSC)는 지방세포, 뼈세포 및 연골세포와 같은 여러 세포계통으로 분화할 수 있는 골수를 포함하는 전신에 존재하는 줄기세포이다. 중간엽 줄기세포는 인간, 마우스, 쥐, 개, 염소, 토끼 및 고양이를 포함하는 다수의 종으로부터 분리되었다. 최근 중간엽 줄기세포가 in vitro 및 in vivo에서 여러 T 림프구 활성을 억제하여 면역조절능력을 발휘한다는 보고가 있으며, 중간엽 줄기세포의 원활한 공급을 위해 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPS)를 이용하는 방법이 제시되어 왔으나, 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포와 직접 분리된 중간엽 줄기세포이 면역 조절능의 차이에 대해서는 충분한 연구가 이루어지지 않고 있다.
본 발명자들은 건강한 사람에게서 분리된 세포에서 유도된 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)의 면역 조절능을 연구한 결과, 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)에 비해 iPS-MSC의 면역 조절능이 우수함을 밝혀 iPS-MSC를 이용한 자가면역질환 또는 염증성 질환의 치료용 조성물 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 직접 분리된 MSC에 비해 면역 조절능이 향상된 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)와 이를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 직접 분리된 MSC에 비해 면역 조절능이 향상된 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)를 포함하는, 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 직접 분리된 MSC에 비해 면역 조절능이 향상된, 역분화 줄기세포로부터 유도된 중간엽 줄기세포(iPS-MSC), iPS-MSC 배양액, 또는 세포가 제거된 iPS-MSC 배양액을 유효성분으로 포함하는 세포치료제, 또는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서, "역분화 줄기세포"는 "유도줄기세포","유도만능줄기세포"또는 "iPS(induced pluripotent stem cell)"와 혼용되어 사용될 수 있으며. 체세포, 단핵구(monocyte) 등 분화가 이루어진 세포를 리프로그래밍하여 다시 다분화능(pluripotent)을 가지는 줄기세포로 유도된 세포를 의미한다.
본 명세서에서, "세포 치료제"란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 이종 (xenogenic) 세포를 체외에서 증식·선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포치료제는 크게 두 분야로 분류할 수 있으며 그 첫 번째는 조직재생 혹은 장기기능 회복을 위한 "줄기세포 치료제"이며, 두 번째는 생체 내 면역반응의 억제 혹은 면역반응의 항진 등 면역반응 조절을 위한 면역세포 치료제로 분류할 수 있다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 일 예는 면역 조절능이 향상된, 예를 들면 항염증인자가 증가되고 염증 인자가 감소된, 정상세포에서 유도된 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 일 예는 면역 조절능이 향상된 정상세포에서 유도된 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 면역 조절능이 향상된 정상세포에서 유도된 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)는, 포유동물에서 분리된 세포에서 유도된 역분화 줄기세포에서 유래된다는 점에서, 조직에서 직접 분리된 MSC, 예를 들면 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC), 또는 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell driven from Embryonic stem cell, ES-MSC)와 구별된다. 본 발명의 일 예에서, 상기 iPS-MSC는 정상인으로부터 분리된 세포에서 유래한 것일 수 있다.
일반적으로 "중간엽 줄기세포 (Mesenchymal Stem Cell; MSC)"는 골수(bone marrow), 혈액, 진피 및 골막에서 직접 분리되어 얻어지는 줄기세포로서, 다양한 세포, 예컨대 지방세포, 연골세포 및 뼈세포 등으로 분화할 수 있는 전능성 (pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포를 의미한다. 일반적으로 조직에서 직접 얻어지는 중간엽 줄기세포는, 포유동물, 바람직하게는, 인간의 중간엽 줄기세포 소스, 예컨대, 혈액 또는 골수로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계 (상기 골수는 경골, 대퇴골, 척수 또는 장골로부터 추출할 수 있다.); 분리된 세포를 적합한 배지에서 배양하는 단계; 및 배양과정에서 부유 세포를 제거하고 배양 플레이트에 부착된 세포들을 계대 배양하여, 최종적으로 구축된 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계를 통하여 얻을 수 있다.
상기 조직 유래 중간엽 줄기 세포는 제대 유래 중간엽 줄기 세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기 세포, 골수 유래 중간엽 줄기 세포, 지방 유래 중간엽 줄기 세포, 근육 유래 중간엽 줄기 세포, 신경 유래 중간엽 줄기 세포, 피부 유래 중간엽 줄기 세포, 양막 유래 중간엽 줄기 세포, 및 태반 유래 중간엽 줄기 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 iPS-MSC는 조직에서 직접 분리된 MSC에 비해 면역조절능이 향상된 특성을 가지며, 예를 들면 항염증인자가 증가되고 염증 인자가 감소된 특성을 가진다. 상기 면역조절능의 향상 정도는 염증성 지수(R)로 평가할 수 있으며, 상기 염증성 지수(R)는 항염증성 사이토카인의 발현량 대비 염증성 사이토카인 발현량으로 표현된다(하기 수학식 1). 구체적으로, 염증성 지수의 수치가 낮을수록, 면역조절능이 증가한 것으로 평가된다. 본 발명에 따른 iPS-MSC의 염증성 지수는 조직으로부터 직접 분리된 중간엽줄기세포의 염증성 지수 100%를 기준으로 40% 이하로 표시될 수 있다.
본 발명에 따른 iPS-MSC는 직접 분리된 MSC에 대해 항염증성 사이토카인 대비 염증성 사이토카인의 비율을 평가하고자 하는 경우, iPS-MSC 와 직접 분리된 MSC는 활액 세포와 접촉하여 공조배양하는 경우와 활액 세포없이 단독배양하는 경우로 구분하여 표시할 수 있으며, 두 가지 배양의 경우에 iPS-MSC의 비율과 직접 분리된 MSC의 비율간의 배수비로 표현할 수 있다. 상기 공조배양 및 단독 배양 모두에서, iPS-MSC의 염증성 지수가 조직으로부터 직접 분리된 MSC의 염증성 지수보다 적은 수치를 가지며, 이는 iPS-MSC가 조직에서 직접 분리한 MSC에 비해 우수한 항염증 효과를 가짐을 나타낸다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2019013764-appb-I000001
상기 사이토카인의 발현량은 통상의 기술자가 목적에 따라 당업계에 알려져 있는 방법을 자유롭게 선택하여 사이토카인 발현량 측정에 사용할 수 있으며, 예를 들어, 효소결합면역침강분석(Enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 유세포분석법(Flow cytometry), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR), 및 공촛점 현미경(confocal Microscopy)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 방법을 선택하여 측정될 수 있다.
상기 염증성 사이토카인은 당업계에 공지된 염증성 사이토카인이라면 제한없이 선택될 수 있다. 예를 들어, 염증성 사이토카인은 TNF-a(tumor necrosis factor alpha), IL-1b(interleukin 1 beta), IL-2, IL-6, IL-8, 및 IL-17로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 IL-6, IL-8 및 IL-17로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항염증성 사이토카인은 당업계에 공지된 항염증성 사이토카인이라면 제한 없이 선택될 수 있다. 예를 들어, TNF-b(tumor necrosis factor beta), IL-4, IL-10 및 IL-13으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 TNF-b 또는 IL-10, 더욱 바람직하게는 IL-10일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 iPS-MSC를 활액 세포없이 단독배양하는 경우, 상기 iPS-MSC의 염증성 지수(R)는, 0.00001 내지 15, 0.0001 내지 15, 0.001 내지 15, 0.01 내지 15, 0.00001 내지 10, 0.0001 내지 10, 0.001 내지 10, 0.00001 내지 8, 0.0001 내지 8, 0.001 내지 8, 0.00001 내지 6, 0.0001 내지 6, 또는 0.001 내지 6일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 iPS-MSC를 활액 세포없이 단독 배양하는 경우, 상기 iPS-MSC의 염증성 지수(R)는, 조직에서 직접 분리된 MSC (예, BM-MSC)의 염증성 지수 100%를 기준으로, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하, 0.3% 이하, 0.2% 이하, 0.1% 이하, 0.01% 이하 또는 0.001% 이하일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 iPS-MSC를 활액 세포없이 단독배양하는 경우, 상기 iPS-MSC의 염증성 지수는, 조직에서 직접 분리된 MSC (예, BM-MSC)의 염증성 지수를 100%를 기준으로, IL-6/IL-10의 발현 비율(R)은 0.3%이하, 0.2% 이하, 0.15% 이하, 0.10% 이하, 0.01% 이하, 0.07% 이하, 0.05% 이하, 0.03% 이하, 0.01% 이하, 또는 0.001% 이하 범위의 수치를 나타내고, IL-8/IL-10 의 발현 비율(R)은 30%이하, 25% 이하, 20% 이하, 17% 이하, 15% 이하, 13% 이하 또는 10% 이하 범위의 수치를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, iPS-MSC 또는 직접 분리된 MSC를 단독 배양한 경우, iPS-MSC의 염증성 지수는, IL-6/IL-10 (p<0.01) 및 IL-8/IL-10 (p<0.05)의 발현량 비율이 골수유래 줄기세포 (BM-MSC)와 비교하여 통계적으로 유의하게 낮은 수치를 나타냈다. 즉, iPS-MSC는 염증성 지수, 예를 들면 IL-6/IL-10 비율은, BM-MSC의 수치를 100%로 두었을 때 약 0.053%의 수치를 나타내었고, IL-8/IL-10 비율은 BM-MSC의 수치를 100%로 두었을 때 약 15% 수준으로 나타났다. 상기 실험결과를 고려할 때, iPS-MSC가 BM-MSC에 비해 항염증 효과가 현저히 뛰어남을 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 iPS-MSC와 BM-MSC의 염증성 지수를 비교하였을 때, iPS-MSC의 IL-6/IL-10의 비율값은 p 값이 0.01 이하이면서 염증성 지수 값이 1 이하 및/또는 IL-8/IL-10의 비율값은 p값이 0.05 이하이면서 염증성 지수 값이 10 이하일 수 있다.
본 발명에 따른 iPS-MSC를 활액 세포와 접촉하는 경우, 예를 들어 활액세포와 중간엽 줄기세포의 공조배양 또는 활액세포에 중간엽 줄기세포가 주입되는 경우, 상기 iPS-MSC의 사이토카인의 발현 비율(R)은, 0.001 내지 1.5, 0.01 내지 1.5, 0.1 내지 1.5, 0.2 내지 1.5, 0.3 내지 1.5, 0.001 내지 1.0, 0.01 내지 1.0, 0.1 내지 1.0, 0.2 내지 1.0, 0.3 내지 1.0, 0.001 내지 0.7, 0.01 내지 0.7, 0.1 내지 0.7, 0.2 내지 0.7, 또는 0.3 내지 0.7일 수 있다.
상기 항염증성 사이토카인 대비 염증성 사이토카인의 비율은 중간엽 줄기세포(MSC)가 활액 세포와 접촉하는 경우, 예를 들어 활액세포와 중간엽 줄기세포의 공조배양 또는 활액세포에 중간엽 줄기세포가 주입되는 경우, 직접 분리된 MSC의 사이토카인 발현 비율(R)을 100%으로 두었을 때, iPS-MSC의 사이토카인 발현 비율(R)은 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하 또는 5% 이상 15% 이하일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, iPS-MSC의 면역 조절능을 확인하기 위해 인간 단핵구 세포를 Th17 분화 조건으로 자극하여 iPS-MSC 또는 BM-MSC와 공조배양하였다. 그 결과 iPS-MSC와 공조배양한 경우, BM-MSC와 공조배양했을 때보다 세포 내 IL-17 생성량이 더 감소한 반면, Treg 마커의 양은 유의미한 차이가 없었다. 즉, 본 발명에 따른 iPS-MSC는 염증성 Th17세포 (IL-17생성)를 골수유래 줄기세포 (BM-MSC) 보다 더욱 억제하고, 반면 면역조절T세포 (Treg)는 유지함을 확인하였다. 또한, iPS-MSC 세포 배양액에서는 염증성 사이토카인인 IL-17 생성은 감소하고 항염증성 사이토카인인 IL-10은 더 증가함을 확인하였다. 세포 배양액의 IL-17과 IL-10의 양을 비교한 경우에도 iPS-MSC와 공조배양한 배양액 내의 IL-17 양은 BM-MSC의 공조배양액에서보다 더 큰 폭으로 감소하였으나, IL-10의 양은 iPS-MSC에서 큰 폭으로 증가하여, iPS-MSC가 BM-MSC에 비해 우수한 면역조절능 및 항염증 효과를 확인할 수 있었다. 즉, Th17 분화 조건 하에서 단핵구만을 배양한 경우, IL-17생성량이 증가하지만, MSC 존재 하에서는 IL-17양이 감소하고, 특히 iPS-MSC의 경우 단핵구 단독 배양시보다 IL-17 양성 세포의 수가 절반 가까이 줄어들어 BM-MSC에 비해 더 큰 감소폭을 보였다.
본 발명의 일 실시예에서 MSC와 류마티스 관절염 환자의 활액 세포를 Th17 분화 조건 하에서 공조배양한 경우, iPS-MSC가 없이 RA-SFMC만을 배양한 대조군에 비해, 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성이 Th17 분화 조건으로 자극하지 않았을 때와 유사한 수준으로 감소하였으며, 반면에 Treg의 CD25+Foxp3+ 발현은 3배 이상 증가하였다. 즉, iPS-MSC를 처리한 경우, IL17 양성 세포의 수는 Th17 분화 조건 처리를 하지 않은 경우와 유사하였으며, Treg 세포의 비율은 급격히 증가하여, 류마티스 환자에 대한 우수한 면역조절 효과를 암시한다(실시예 4).
본 발명에 따른 iPS-MSC는 역분화 줄기세포에서 유래된 것으로서, 먼저 정상인의 혈액으로부터 세포, 예를 들면 단핵구를 얻고, 이를 단핵구 세포를 24-well plate에 vitronectin으로 코팅후 (BD BioCoatTM) 및 Sendai virus (SeV) (CytoTune®-iPS 2.0 Reprogramming kit, Life Technologies, Invitrogen)를 통해 역분화줄기세포 (iPS)를 제조하였다. 상기 역분화 줄기세포를 EB(embryo body)를 생성시키기 위해 콜로니 형태로 세포를 뜯어서 20% 우태아 혈청이 포함된 α-Minimum Eagle's Medium 배양액에서 b-FGF, rh TGF-b 사이토카인을 통해 분화시켜 iPS-MSC를 얻는다. 상기 단핵구에서 역분화 줄기세포를 제조하고, 역분화 줄기세포로부터 iPS-MSC 를 얻은 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 iPS-MSC의 제조 방법은, (1)정상인의 혈액에서 단핵세포를 분리하고, Sendai virus (SeV), CytoTune®-iPS 2.0 Reprogramming kit 를 이용하여 역분화 줄기세포(iPS)를 제조하는 단계 및 (2) 상기 iPS를 EB(embryo body)를 생성시키기 위해 콜로니 형태로 세포를 뜯어서 20% 우태아 혈청이 포함된 α-Minimum Eagle's Medium 배양액에서 b-FGF, rh TGF-b 사이토카인을 통해 분화시켜 iPS-MSC를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 iPS-MSC를 제조하기 위한 역분화 줄기세포를 얻고자 하며, 상기 역분화 줄기세포는 단핵구 세포, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로부터 유래 것일 수 있다.
본 발명에서 "정상" 또는 "정상인"이란, 자가면역질환 또는 염증성 질환 환자가 아닌 개체 또는 사람을 의미하며, 자가면역질환 또는 염증성 질환의 발병 또는 진단 시점 이전의 상태를 포함한다.
상기 개체는 인간을 포함하는 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 염증성 질환은 사이토카인 매개성 염증성 질환이며, 상기 사이토카인 매개성 염증성 질환의 예는, 전신 홍반성 루프스, 하시모토 갑상선염, 제1형 당뇨, 갑상선기능저하증, 갑상선기능항진증, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 건선, 크론병, 갑상선염, 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1이상을 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 류마티스 관절염일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 약학 조성물은, 통상의 방법에 따라 제형화 된, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 외용제, 좌제, 멸균 주사 용액, 이식용 제제 등의 비경구용 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구로 투여된다. 비경구로 투여되는 경우, 본 발명의 약학 조성물은 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다. 예컨대 타입 I 당뇨병에 적용되는 경우, 복강투여가 가장 바람직하고, 이는 투여된 수지상세포가 희석되지 않고 효과적으로 췌장으로 이동할 수 있기 때문이다. 또한, 본 발명의 약학 조성물이 관절염 환자에 적용되는 경우에는 정맥내 주사로 투여될 수 있지만, 가장 바람직하게는 국부적으로 관절내 주입으로 투여된다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 수용자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 1 x 103 내지 1 x 1012 세포/kg 이다.
발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
본 발명은 BM-MSC에 비해 면역 우수한 면역 조절능을 가지는, iPS-MSC를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 직접 분리된 MSC에 비해 MSC의 공급이 용이하고, 직접 분리된 MSC에 비해 현저히 우수한 면역 조절 효과를 보여 류마티스 관절염을 비롯한 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료에 활용될 수 있다.
도 1a는 정상인의 단핵구유래 유도만능줄기세포(hiPS) 유래 중간엽 줄기세포(iMSC 또는 iPS-MSC로 표시됨)를 제조하는 과정에서 세포 외형의 변화를 나타낸 현미경 사진이다.
도 1b는 iPS-MSC가 외형적 특징 외에 MSC 특이적 마커를 정상적으로 발현하는지 확인한 그래프이다.
도 1c는 실시예 1의 방법으로 형성된 iPS-MSC가 직접 분리된 MSC와 마찬가지로 연골세포, 조골세포 및 지방세포로의 분화능을 가지는 지 확인하기 위해 각 분화 조건으로 유도 후 분화 완료된 세포를 염색하여 관찰한 사진이다.
도 2a 및 도 2b는 iPS-MSC와 BM-MSC의 염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 생산량을 비교한 그래프이다.
도 3a 및 도 3b는 인간의 단핵구를 분리해 Th17 분화 조건으로 분화를 유도한 후 BM-MSC 또는 iPS-MSC와 함께 공조배양한 후, Th17세포에서 생산하는 IL-17과 Treg 세포 특이적 마커인 Foxp3+CD4+ 세포의 비율을 비교한 그래프이다.
도 3c는 Th17분화조건 하에서 인간 단핵구와 BM-MSC 또는 인간 단핵구와 iPS-MSC를 공조배양하였을 때 배양액 내 IL-17 및 IL-10의 양을 비교한 그래프이다.
도 4a 및 도 4b는 류마티스 관절염 환자로부터 분리한 활액세포를 Th17 분화 조건 하에서 iPS-MSC와 공조배양하여 Th17세포 또는 Treg 세포의 비율을 분석한 그래프이다.
도 5는 류마티스 관절염 환자로부터 분리한 활액세포와 BM-MSC 또는 iPS-MSC를 Th17분화조건 하에서 공조배양하여 염증반응에 관여하는 IL-17 및 IL-10의 양을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 권리범위를 제한하지 않는다.
실시예 1. 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS_MSC)의 제작
1-1. 역분화 줄기세포(iPS)의 제작
면역 질환이 진단되지 않은 건강한 사람(이하 '정상인'이라 한다)의 혈액으로부터 단핵구를 분리하여 역분화 줄기세포 제작에 이용하였다. 구체적으로, 정상인의 혈액은 가톨릭 성모병원 정상인 기부자로부터 얻어 사용하였으며, 혈액10mL를 2,000rpm, 30분간 Ficoll Paque TM PLUS (GE Healthcare)를 사용하여 원심 분리하여 단핵세포를 분리하였다.
분리된 단핵구는 StemSpan cc110이 보충 된 StemSpanTM ACF (Stem Cell Technologies)에서 4 일 동안 배양되었다. 이후, 단핵구 세포를 24-well plate에 vitronectin으로 코팅후 (BD BioCoat 쪠) 및 Sendai virus (SeV) (CytoTune®-iPS 2.0 Reprogramming kit, Life Technologies, Invitrogen)를 통해 역분화줄기세포 (iPS)를 제조하였다. 배지는 iPS 콜로니가 형성 될 때까지 매일 바꾸었다. 수동 피킹 후, iPS 라인은 TeSR-E8 배지 (Stem Cell Technologies)에서 vitronectin (Life Technologies, Invitrogen)으로 코팅 된 플레이트에서 유지되었다. 형질 도입 후 12 일에 신생 iPS 콜로니를 개별적으로 골라 특성화를 위해 확대시켰다. 형질 도입 후 3 일부터 21 일까지 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하여 역분화 줄기세포를 얻었다.
1-2. 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)의 제작
실시예 1-1의 방법으로 얻은 역분화 줄기세포 (iPS)는 iMSC로 다시 분화하기 위해 1개의 100mm dish에서 100% confluence로 키운 iPS 세포를 PBS 세척한 후 1mg/ml type IV Collagenase용액을 100mm dish에 3ml 넣고 37℃, 10분 반응후, Media 6ml첨가후 1100rpm, 3분 원심분리 하였다. 6well ultra low attachment dishes에 100mm 1dish 당 2well에 3ml 배양액 20% α-Minimum Eagle's Medium (0.1mM nonessential amino acid(100x) gibco, 1 mM L-glutamine, 0.1mM 2-mercaptoethanol, 1% penicillin streptomycin)으로 resuspension후 b-FGF 1ng/ml로 자극하였다. 분화 4일째, EB outgrowth을 시키기 위해 1% Gelatin 코팅된 100mm dish에 rh TGF-b 자극하였다. 2일째 마다 같은 방법으로 배양액을 교체하면서 iPS-MSC를 배양하였다.
실시예 2: iPS-MSC의 세포 특성분석
2-1. iPS-MSC의 세포형태적 특성
실시예 1-2의 방법으로 제작된 iPS-MSC의 세포 외형, 줄기세포 마커의 발현 여부 및 다세포 분화능을 확인하여 그 결과를 도 1a 내지 도 1c에 나타내었다.
구체적으로, 현미경을 이용하여 iPS로부터 iPS-MSC로 변화하는 과정에서의 세포 형태 변화를 살폈다. 관찰을 위한 세포 시료는 iPS-MSC를 4주 정도 키운후 passage 5이상인 세포로 준비되었다.
도 1a는 정상인의 단핵구유래 유도만능줄기세포(hiPS) 유래 중간엽 줄기세포(iMSC 또는 iPS-MSC로 표시됨)를 제조하는 과정에서 세포 외형의 변화를 나타낸 현미경 사진이다. hiPS에서는 콜로니 형성이 두드러지게 나타났지만, iMSC에서는 이러한 콜로니의 모습이 관찰되지 않아, 외형적 변화가 관찰되었다.
2-2. iPS-MSC의 줄기세포 마커 발현 분석
이러한 iPS-MSC에 대해 MSC 마커로 알려져 있는 CD34, CD31, CD19, CD11, HALDR (Negative marker), CD44, CD73, CD105, CD90 (Positive marker)의 발현 여부를 조사하였다. 구체적으로 iMSC를 4주 정도 키운 후 passage 5 이상인 세포에서 flow cytomery로 확인하였다. 도 1b는 iPS-MSC가 외형적 특징 외에 MSC 특이적 마커를 정상적으로 발현하는지 확인한 그래프이다.
네거티브 마커로 알려져 있는 CD34, CD31, CD19, CD11 및 HALDR의 발현량 증가는 나타나지 않았으나, 포지티브 마커로 알려져 있는 CD44, CD73, CD105, 및 CD90가 검출되는 세포의 수는 증가하였다. 따라서, 실시예 1-2의 방법으로 유도된 iPS-MSC는 중간엽 줄기세포로서의 특징을 나타낸다.
2-3. iPS-MSC의 다세포 분화능 분석
본 발명의 iPS-MSC가 중간엽 줄기세포 특유의 다분화능을 가져 연골세포(chondrocyte), 조골세포(osteoblast), 및 지방세포(adipocyte)로 분화 가능 여부를 확인하였다. 구체적으로 safranin-O, alkaline phosphatase (ALP) 기질, 및 Oil Red O 염색을 수행후 Zeiss 현미경 (LSM 510 Meta, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하여 시각화하는 방법으로 수행하였다. 그 결과를 도 1c에 나타내었다. 도 1c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 iPS-MSC는 연골세포, 조골세포, 및 지방세포로 분화할 수 있는 다분화능(multi-lineage differentiation)을 가짐을 확인하였다.
구체적으로, 도 1c는 실시예 1의 방법으로 형성된 iPS-MSC가 직접 분리된 MSC와 마찬가지로 연골세포, 조골세포 및 지방세포로의 분화능을 가지는 지 확인하기 위해 각 분화 조건으로 유도 후 분화 완료된 세포를 염색하여 관찰한 사진이다. 연골세포, 조골세포 및 지방세포 모두로의 분화가 확인되어 iPS-MSC가 직접 분리된 MSC와 동일한 기능을 함을 알 수 있다.
실시예 3. iPS-MSC의 항염 활성 평가
iPS-MSC의 항염증 효과를 확인하기 위해 염증성 사이토카인 또는 항염증성 사이토카인 발현량을 ELISA를 이용하여 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1-2에서 제작된 iPS-MSC를 실험군으로 골수 유래 줄기세포(BM-MSC)를 대조군으로 하여, 100mm dish에서 90% confluence로 줄기세포를 키운 후에 수행하였다. 염증성 사이토카인 IL-6, IL-8, IL-2 및 항염증성 사이토카인 IL-10 및 TGF-b (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA)에 따라 제조업체의 지시 사항을 따라 ELISA 마이크로 플레이트를 사용하여 흡광도 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 405 nm에서 측정하여 ELISA를 수행하였다.
염증성 사이토카인 IL-6, IL-8, 및 항염증성 사이토카인 IL-10 및 TGF-b의 발현량을 측정하여 그 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다. 대조구로서 BM-MSC는 가톨릭세포치료 사업단으로부터 구입하여 사용하였다. 중간엽 줄기세포는 DMEM/F12 (Gibco)에 10% FBS와 antibiotics를 첨가하여 37℃, 5% 이산화탄소, 습도 95% 배양기에 배양하였다.
도 2a 및 도 2b는 iPS-MSC와 BM-MSC의 염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 생산량을 비교한 그래프이다.
도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, iPS-MSC에서는 염증성 사이토카인 중 IL-6과 IL-8의 발현량이 현저히 감소하였으나, 항염증성 사이토카인의 경우, IL-10과 TGF-b 모두 발현량에 유의미한 차이가 나타나지 않았다. 즉, IL-6 및 IL-8은 염증성 사이토카인, IL-10, TGF-b는 비염증성 사이토카인에 해당하며, 특히 염증성 사이토카인의 감소가 두드러짐을 확인할 수 있다.
항염증성 사이토카인 IL-10의 발현량 대비 IL-6 및 IL-8의 발현량 (pg/ml)을 측정하고 이의 비율을 항염증성 사이토카인의 발현량 대비 염증성 사이토카인의 발현량 비율(=염증성 사이토카인 발현량 / 항염증성 사이토카인의 발현량)로 계산하여 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표 1은 iPS-MSC와 BM-MSC의 염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 비율을 나타낸다.
면역계는 면역관용과 면역반응 두 가지가 시소와 같이 균형을 유지하며 적절히 조절되고 있다. 두 힘의 균형이 한쪽으로 치우치며 균형이 깨지는 경우에 면역학적 항상성이 붕괴되며, 이러한 면역학적 항상성의 붕괴는 다양한 형태의 면역학적 관련 질병 발병 원인이 된다. 이러한 면역학적 균형은 염증성과 항염증성 사이토카인에 의해 조절될 수 있다. iPS-MSC와 BM-MSC에서 항염증성 사이토카인의 발현량은 차이가 없으나, 항염증성 대비 염증성 사이토카인의 발현량 즉, IL-6/IL-10과 IL-8/IL-10 비율값이 iPS-MSC에서 BM-MSC와 비교하여 통계적으로 유의하게 감소되어 있으므로 면역학적 조절능이 뛰어남을 예측할 수 있다.
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상기 표 1에 의해 유도줄기세포 (iPS-MSC)에서 염증성 사이토카인과 항염증성 사이토카인의 비율을 비교하였을 때, IL-6/IL-10 (p<0.01) 및 IL-8/IL-10 (p<0.05)의 발현량 비율이 골수유래 줄기세포 (BM-MSC)와 비교하여 통계적으로 유의하게 감소되었다. 즉, iPS-MSC는 항염증성 사이토카인의 발현량 대비 염증성 사이토카인의 발현량 비율(=염증성 사이토카인 발현량 / 항염증성 사이토카인의 발현량)이 IL-6/IL-10 비율은, BM-MSC에 비해 1,990배 감소하였고, IL-8/IL-10 비율은 BM-MSC에 비해 약 6.7배 감소하였다. 상기 실험결과를 고려할 때, iPS-MSC가 BM-MSC에 비해 항염증 효과가 현저히 뛰어남을 예측할 수 있다.
실시예 3. iPS-MSC의 면역 조절능 확인
체내 면역 조절과 관련하여, Th17세포는 사이토카인 면역계를 교란시키는 IL-17을 생성하여, 관절염, 다발성 경화증, 건선, 및 염증성 장 질환 등의 여러 가지 자가면역질환에 관여하는 것으로 알려져 있다. 특이적인 사이토카인 IL-17을 많이 생산하는 Th17세포은 자가면역 질환인 류마티스 관절염 병인에서 동물모델과 인간세포 연구 결과들을 통해 직접적인 역할과 병원체에 대한 숙주 방어 또는 이상 면역반응 유도 등의 역할이 규명되어 있다. 반면, 면역조절 T세포(Treg)는 면역 반응을 억제하여, 체내의 과도한 면역 반응을 방지하는 역할을 한다.
본 발명의 iPS-MSC가 면역 조절능을 가지는 지 확인하기 위해, 정상인의 단핵구 세포를 Th17세포 분화 조건 (anti-CD3 (1 μg/ml; BD Biosciences), anti-CD28 (1 μg/ml; BD Biosciences), IL-1β (20 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), IL-6 (20 ng/ml; R&D Systems), IL-23 (20 ng/ml; R&D Systems), neutralizing antibodies against interferon-gamma (IFN-γ; 2 μg/ml; R&D Systems), IL-4 (2 μg/ml; R&D Systems) 으로 자극하여 iPS-MSC 또는 BM-MSC와 RPMI 1640 medium 배지에 10% fetal calf serum (FCS), 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, and 2 mM L-glutamine를 첨가하여, 37℃, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 공조배양하고, FACS를 이용하여 Th17세포에서 생성되는 IL-17 (도 3a 및 도 3b)과 면역조절 T 세포에서 생성되는 CD25+Foxp3+ 발현을 조사하고, 각 배양액에서 IL-17과 IL-10의 함량을 ELISA를 이용해 분석하였다(도 3c).
구체적으로, FACS 방법은, 세포 표면 염색 방법으로 단일 클론 항체 항 -CD4-PE / Cy7 (RPA-T4, IgG1, BioLegend, San Diego, CA, USA) 및 항 -CD25-APC (M-A251, IgG1, κ, BD Biosciences) 에 대하여 시행하였으며 세포내 염색법으로 세포를 씻어준 다음, 투과성으로 만들고, 단일 클론 항체 항-IL-17-PE (eBio64dec17, IgG1, κ, eBioscience, San Diego, CA, USA), 항-IFN-γ-FITC (4S.B3, IgG1, κ; eBioscience) 및 항-Foxp3-FITC (PCH101, IgG2a, κ; eBioscience) 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 또한 적절한 isotype 항체를 준비하여 염색하였다. 유세포 분석기(FACS Calibur; Becton Dickinson, San Diego, CA)로 세포 내 사이토카인을 분석하였다.
또한, sandwich ELISA 방법은, Sandwich ELISA용 96 well plate (NUNC, Denmark)에 단클론성 IL-6, IL-8, IL-2, IL-10, TGF-b, IL-17 (R&D systems, USA)를 각각 4 ug/mL로 50 ul/well씩 넣고 4℃에서 밤새 반응시킨 다음 차단용액 (1% (w/v) BSA/ PBS (Phosphate-Buffered Saline), 0.05% (v/v) tween 20/PBS)을 200 uL/well씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 대조군으로는 재조합 IL-6, IL-8, IL-2, IL-10, TGF-b, IL-17 (R&D, USA)를 이용 하여 각각 5 ng/mL~78 pg/mL 농도를 측정하였다. 표준시료와 함께 측정할 분리한 환자 혈청을 50 uL/well씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응용기를 세척용액 (0.05% (v/v)Tween 20/PBS)으로 4번 세척하고 biotinylated IL-6, IL-8, IL-2, IL-10, TGF-b, IL-17 항체를 200 ng/mL로 희석하여 50 uL/well씩 넣어 실온에서 2시간 반응시킨 후 세척용액으로 4번 세척하였다. 마지막으로는 Extravidin-Alkaline phosphatase conjugate (SIGMA, USA, #E2636)를 1 : 2,000으로 희석하여 50 uL/well씩 넣고 실온에서 2시간 반응시키고 세척 후 phosphate disodium salt hexahydrate (PNPP, Fluka)/Diethanolamine 용액(DEA, 97Ml, NaN3 0.2 g, MgCl2H2O 0.1 g, 1차 증류수 800 mL)을 1 mg/mL 농도로 녹여 50 uL/well씩 넣어 30분 후 0.2 M NaOH로 반응을 멈추고 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
도 3a 내지 3c에 분석 결과를 나타내었다. 도 3a 및 도 3b는 인간의 단핵구를 분리해 Th17 분화 조건으로 분화를 유도한 후 BM-MSC 또는 iPS-MSC와 함께 공조배양한 후, Th17세포에서 생산하는 IL-17과 Treg 세포 특이적 마커인 Foxp3+CD4+ 세포의 비율을 비교한 그래프이다.
도 3a 내지 도 3c에 나타낸 것과 같이, 본 발명에 따른 iPS-MSC는 염증성 Th17세포 (IL-17생성)를 골수유래 줄기세포 (BM-MSC) 보다 더욱 억제하고, 반면 면역조절T세포 (Treg)는 유지함을 확인하였다. 또한, iPS-MSC 세포 배양액에서는 염증성 사이토카인인 IL-17 생성은 감소하고 항염증성 사이토카인인 IL-10은 더 증가함을 확인하였다. 즉, Th17 분화 조건 하에서 단핵구만을 배양한 경우, IL-17생성량이 증가하지만, MSC 존재 하에서는 IL-17양이 감소하고, 특히 iPS-MSC의 경우 단핵구 단독 배양시보다 IL-17 양성 세포의 수가 절반 가까이 줄어들어 BM-MSC에 비해 더 큰 감소폭을 보였다. 도 3c는 Th17분화조건 하에서 인간 단핵구와 BM-MSC 또는 인간 단핵구와 iPS-MSC를 공조배양하였을 때 배양액 내 IL-17 및 IL-10의 양을 비교한 그래프이다. iPS-MSC와 공조배양한 경우 염증성 사이토카인인 IL-17의 양이 큰 폭으로 감소하였으며, 항염증성 사이토카인인 IL-10은 크게 증가하였다.
Th17 분화조건 및 각 MSC와 공조배양한 결과 IL-10 대비 IL-17의 비율을 표 2에 나타내었다. 구체적으로, Th17 분화 조건에서는 IL-17/IL-10 비가 2.3 수준이었으나, BM-MSC와 공조배양하였을 때에는 1.6 수준으로 떨어졌고, iPS-MSC에서는 0.5로 크게 감소하였다.
실시예 4. iPS-MSC의 류마티스 관절염의 SFMC 저해 효능 평가
4-1. 류마티스 환자 유래 활액 세포의 Th17 또는 Treg 세포 활성 조절 분석
류마티스 관절염은 관절 활막 내 세포들이 활성화되어 관절 조직 내로 침윤이 일어나면서 염증성 사이토카인의 증가에 의해 질병이 활성화되는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 iPS-MSC가 류마티스 관절염에 대한 질환 제어 효과를 가지는 지 확인하고자 하였다. 즉, 류마티스 관절염 환자의 활액에서 분리한 활액유래 단핵세포 (synovial fluid mononuclear cells from RA patients: RA SFMC)에서 iPS-MSC의 면역 조절능을 확인하기 위해, 류마티스 관절염 환자의 SFMC를 Th17세포 분화조건으로 자극 후 iPS-MSC와 공조배양을 하였을 때 Th17 세포에서 생성되는 사이토카인인 IL-17생성과 면역조절T세포 (Treg)에서 생성되는 마커인 CD25+Foxp3+ 발현을 FACs로 조사하였다.
구체적으로, 류마티스 관절염 환자의 활액은 가톨릭대학교 류마티스 내과로부터 얻었다. 류마티스 관절염 환자로부터 분리된 활액으로부터 실시예 1에 기재된 방법으로 단핵세포를 얻고 (RA SFMC; synovial fluid mononuclear cells from RA patients), 실시예 3에 기재된 바와 같이 Th17 분화 조건을 형성하여 iPS-MSC와 37℃, 5% CO2 조건에서 48시간 공조배양하였다. 상기 배양물로부터 Th17에서 형성된 IL-17 생성량과 면역조절 T세포(Treg)에서 생성되는 CD25+Foxp3+ 발현을, 실시예 3의 FACS과 실질적으로 동일한 방법으로 분석하여 그 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.
도 4a 및 도 4b는 류마티스 관절염 환자로부터 분리한 활액세포를 Th17 분화 조건 하에서 iPS-MSC와 공조배양하여 Th17세포 또는 Treg 세포의 비율을 분석한 그래프이다.
도 4a, 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, iPS-MSC와 RA-SFMC의 공조배양은, iPS-MSC가 없이 RA-SFMC만을 배양한 대조군에 비해, 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성이 Th17 분화 조건으로 자극하지 않았을 때와 유사한 수준으로 감소하였으며, 반면에 Treg의 CD25+Foxp3+ 발현은 3배 이상 증가하였다. 즉, iPS-MSC를 처리한 경우, IL17 양성 세포의 수는 Th17 분화 조건 처리를 하지 않은 경우와 유사하였으며, Treg 세포의 비율은 급격히 증가하여, 류마티스 환자에 대한 우수한 면역조절 효과를 암시한다.
따라서 정상인 유래의 iPS-MSC가 실제 류마티스 관절염 환의 병인세포인 SFMC에 대해서도 면역조절능을 가진다는 사실을 확인할 수 있으며, 류마티스 관절염 질환에 대한 치료 효과를 환자 세포 수준에서 확인하였다.
실시예 5: iPS-MSC의 류마티스 관절염의 항염효능 평가
본 발명의 iPS-MSC가 골수 유래 MSC(BM-MSC)에 비해 류마티스 관절염의 염증 제어 효과가 우수한 지 확인하기 위해 염증성 사이토카인 IL-17과 항염증성 사이토카인 IL-10의 비율을 조사하였다.
구체적으로, 실시예 4-1과 동일한 방법으로 류마티스 관절염 환자로부터 활액을 얻어 단핵세포를 분리하였다. 상기 분리한 단핵 세포를 iPS-MSC 또는 BM-MSC와 함께 공조배양하고, 실시예 3의 ELISA와 실질적으로 동일한 방법으로 ELISA 분석을 수행하여 세포 내 사이토카인의 함량을 측정하고, 그 결과를 도 5 및 표 2에 나타내었다.
Figure PCTKR2019013764-appb-T000002
도 5는 류마티스 관절염 환자로부터 분리한 활액세포와 BM-MSC 또는 iPS-MSC를 Th17분화조건 하에서 공조배양하여 염증반응에 관여하는 IL-17 및 IL-10의 양을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, iPS-MSC에서 염증성 사이토카인인 IL-17의 양이 현저히 감소하고, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 양이 BM-MSC 대비 현저히 증가하여 본 발명의 iPS-MSC가 BM-MSC에 비해 우수한 항염증 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
상기 표 2에 결과로부터, 류마티스 관절염 환자의 병인세포인 SFMC와 공조배양한 유도줄기세포 (iPS-MSC) 배양액에서 염증성 사이토카인과 항염증성 사이토카인의 비율을 비교하였을 때, IL-17/IL-10 (p<0.05 vs Th17 condition), IL-2/IL-10 (p<0.01 vs Th17 condition)의 비율이 통계적으로 유의하게 감소되어 있으며, 그러나 골수유래 줄기세포 (BM-MSC)는 IL-17/IL-10 (p>0.05 vs Th17 condition) ratio 값이 통계적으로 유의하게 감소시키지 못하였다.

Claims (11)

  1. 면역 조절능이 향상된 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC), 또는 상기 iPS-MSC의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 iPS-MSC의 면역 조절능은, iPS-MSC의 염증성 지수가, 조직으로부터 직접 분리된 중간엽줄기세포의 염증성 지수 100%을 기준으로 40%이하로 표시되며, 상기 염증성 지수는 항염증성 사이토카인의 발현량 (pg/ml)에 대한 염증성 사이토카인 발현량(pg/ml)의 비율로 표시되는 것인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 TNF-a(Tumor necrosis factor alpha), IL-1b(interleukin 1 beta), IL-2, IL-6, IL-8, 및 IL-17로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상인 것이거나, 상기 항염증성 사이토카인은 TNF-b(Tumor necrosis factor beta), IL-4, IL-10 및 IL-13로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 염증성 사이토카인이 IL-6이고, 상기 항염증성 사이토카인이 IL-10일 때, iPS-MSC의 염증성 지수가 조직에서 직접 분리된 MSC의 염증성 지수 100%를 기준으로 0.3% 이하인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 염증성 사이토카인이 IL-8이고, 상기 항염증성 사이토카인이 IL-10일 때, iPS-MSC의 염증성 지수가 조직에서 직접 분리된 MSC의 염증성 지수 100%를 기준으로 30% 이하인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 iPS-MSC는 Th17 세포의 증식을 억제하는 것인, 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 염증 질환은 IL-6, IL-8, 및 IL-17로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 사이토카인 매개성 염증 질환인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 사이토카인 매개성 염증 질환은 전신 홍반성 루프스, 하시모토 갑상선염, 제1형 당뇨, 갑상선기능저하증, 갑상선기능항진증, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 건선, 크론병, 갑상선염, 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1이상을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 류마티스 관절염인, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 iPS-MSC는 정상 개체로부터 분리된 세포에서 유래한 것인, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 조직으로부터 직접 분리된 중간엽 줄기 세포는 제대 유래 중간엽 줄기 세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기 세포, 골수 유래 중간엽 줄기 세포, 지방 유래 중간엽 줄기 세포, 근육 유래 중간엽 줄기 세포, 신경 유래 중간엽 줄기 세포, 피부 유래 중간엽 줄기 세포, 양막 유래 중간엽 줄기 세포, 및 태반 유래 중간엽 줄기 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 조성물.
  11. 면역 조절능이 향상된 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC), 또는 상기 iPS-MSC의 배양물을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법으로서,
    상기 iPS-MSC의 면역 조절능은, iPS-MSC의 염증성 지수가, 조직으로부터 직접 분리된 중간엽줄기세포의 염증성 지수 100%을 기준으로 40%이하로 표시되며, 상기 염증성 지수는 항염증성 사이토카인의 발현량(pg/ml)에 대한 염증성 사이토카인 발현량(pg/ml)의 비율로 표시되는 것인, 조성물.
    염증성 질환의 예방 또는 치료 방법.
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