WO2020122496A1 - 항암 활성을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 wikim0102 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물 - Google Patents

항암 활성을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 wikim0102 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물 Download PDF

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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to a novel Lactobacillus performance WiKim0102 (Lactobacillus fermentum, WiKim0102, accession number KCCM12356P) separated from kimchi and a composition comprising the same as an active ingredient.
  • WiKim0102 Lactobacillus fermentum, WiKim0102, accession number KCCM12356P
  • Cancer has a high mortality rate worldwide and is the most common cause of death after cardiovascular disease in Western societies.
  • colonization, breast cancer, and prostate cancer are continuously increasing due to the rapid increase in environmental pollutants and increased alcohol consumption due to the westernization of eating habits, and the smoking population along with the aging of the population.
  • Lung cancer is increasing due to the increase in and air pollution.
  • lactic acid bacteria are widely distributed in humans and animals such as oral, intestinal, vaginal, fecal, and fermented foods such as kimchi, and are closely related to human and animal health. Lactic acid bacteria show various health promoting effects such as intestinal action, suppression of harmful bacteria, immune regulation, lowering of blood cholesterol, and anti-cancer.
  • Korean Patent Publication No. 10-2015-0068061 discloses anticancer activity of Lactobacillus plantarum PNU (KCCM11352P) or Lactobacillus mesenteroides PNU (KCCM11353P), and registered Korean patent No. 10-1287120 discloses a pharmaceutical composition for treating cancer containing Lactobacillus plantarium DSR CK10 [Accession No.: KFCC-11433P] or Lactobacillus plantarium DSR M2 [Accession No.: KFCC-11432P] as an active ingredient.
  • KFCC-11433P Accession Inhibinitridium
  • KFCC-11432P Lactobacillus plantarium DSR M2
  • An object of the present invention is to provide a novel kimchi lactic acid bacteria Lactobacillus performance strain excellent in anticancer activity.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer, including the novel kimchi lactic acid bacteria Lactobacillus permantum strain as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition or food additive composition for the prevention or improvement of cancer, including the novel kimchi lactic acid bacteria Lactobacillus strain strain as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a feed composition or feed additive composition for the prevention or improvement of cancer, including the novel kimchi lactic acid bacteria Lactobacillus permantum strain as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer, wherein the composition is administered to an individual other than a human.
  • the present inventors tried to find a lactic acid bacteria strain that shows an excellent effect as a probiotic from kimchi and show the prevention and treatment effect of cancer, and as a result, a new lactobacillus genus lactic acid bacteria strain having anti-cancer activity, Lactobacillus performance WiKim0102 (Lactobacillus fermentum, WiKim0102) ) was separated and identified to complete the present invention.
  • Lactobacillus performance WiKim0102 Lactobacillus fermentum, WiKim0102
  • the present invention provides a Lactobacillus performance WiKim0102 strain excellent in anticancer activity.
  • the Lactobacillus performance WiKim0102 (Lactobacillus fermentum, WiKim0102) is a new strain of Lactobacillus performance derived from kimchi. Although the Lactobacillus performance WiKim0102 (Lactobacillus fermentum, WiKim0102) in the present invention was separated and identified from kimchi, its acquisition route is not limited thereto.
  • the Lactobacillus performance WiKim0102 of the present invention is a probiotic, and has a general suit effect and immune enhancing effect of lactic acid bacteria. It is well known that lactic acid bacteria in the genus Lactobacillus have a formal effect immune enhancing effect.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising Lactobacillus performance WiKim0102 (Lactobacillus fermentum, WiKim0102, accession number KCCM12356P) or a culture thereof as an active ingredient.
  • WiKim0102 Lactobacillus fermentum, WiKim0102, accession number KCCM12356P
  • the present invention provides a food composition or food additive composition for preventing or improving cancer comprising Lactobacillus performance WiKim0102 (Lactobacillus fermentum, WiKim0102, accession number KCCM12356P) or a culture thereof as an active ingredient.
  • WiKim0102 Lactobacillus fermentum, WiKim0102, accession number KCCM12356P
  • a culture thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a feed composition or feed additive composition for preventing or improving cancer in a livestock comprising Lactobacillus performance WiKim0102 (Lactobacillus fermentum, WiKim0102, accession number KCCM12356P) or a culture thereof as an active ingredient.
  • WiKim0102 Lactobacillus fermentum, WiKim0102, accession number KCCM12356P
  • a culture thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a lactic acid bacteria starter for fermentation comprising Lactobacillus performance WiKim0102 (Lactobacillus fermentum, WiKim0102, accession number KCCM12356P) or a culture thereof as an active ingredient.
  • Lactobacillus performance WiKim0102 Lactobacillus fermentum, WiKim0102, accession number KCCM12356P
  • KCCM12356P Lactobacillus fermentum
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, wherein the composition is administered to an individual other than a human.
  • Lactobacillus performance WiKim0102 shows excellent anticancer activity in existing animal models and animal models implanted with human cancer cells, it is useful as a composition for the treatment, prevention or improvement of cancer in humans or animals Can be used.
  • FIG. 1 is a photograph of a tumor portion of a mouse for observing a change in the size of a tumor cell over time after intravenous injection of a composition according to the present invention to a CT26 cell transplanted mouse once (Single) or three times (Serial) It is a diagram showing.
  • FIG. 2 is a view showing a graph measuring the volume change and growth rate of tumor cells over time after intravenous injection of a composition according to the present invention to a CT26 cell transplanted mouse once (Single) or three times (Serial).
  • FIG. 3 is a diagram showing a picture of a tumor portion of a mouse for observing that the size of a tumor cell changes over time after intravenous injection of a composition according to the present invention into an MC38 cell transplanted mouse.
  • FIG. 4 is a graph showing a change in the volume and growth rate of tumor cells over time after intravenous injection of a composition according to the present invention into an MC38 cell transplanted mouse.
  • FIG. 5 is a graph showing the intracellular distribution of Lactobacillus performance WiKim0102 after 1 hour and 24 hours after intravenous injection of CT26 cell-grafted mice according to the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the intracellular distribution of Lactobacillus performance WiKim0102 after 1 hour and 24 hours after intravenous injection of the composition according to the present invention into an MC38 cell transplanted mouse.
  • FIG. 7 is a mouse for observing a change in the size of tumor cells over time after one (Single) or three (Serial) intravenous injection of HCT116 human colon cancer cell transplanted composition according to the present invention It is a diagram showing a photograph of a tumor part.
  • FIG. 8 is a diagram showing a photograph of a tumor portion of a mouse for observing that the size of tumor cells changes over time after intravenous injection of a composition according to the present invention into a SW620 human colon cancer cell transplanted mouse.
  • FIG. 9 is a view showing a graph measuring the change in volume of tumor cells over time by intravenously injecting a composition according to the present invention into HCT116 human colorectal cell mice.
  • FIG. 10 is a diagram showing a graph measuring the change in volume of tumor cells over time by intravenously injecting a composition according to the present invention into a SW620 human colon cancer cell mouse.
  • FIG. 11 is a view showing a photograph of a tumor portion of a mouse for observing the change in the size of tumor cells over time after intravenous injection of a composition according to the present invention into a H1650 human non-small cell lung cancer cell transplant mouse.
  • FIG. 12 is a diagram showing a graph measuring the change in volume of tumor cells over time by intravenously injecting a composition according to the present invention into H1650 human non-small cell lung cancer cell mouse.
  • FIG. 13 is a graph showing lactobacillus performance WiKim0102 treated on human-derived pancreatic cancer ASPC1 cell line and PANC1 cell line, and measuring cell growth rate (cell viabiliy assay).
  • FIG. 14 is a diagram showing a graph obtained by treating Lactobacillus performance WiKim0102 on a human-derived liver cancer HepG2 cell line and measuring a cell viabiliy assay.
  • FIG. 15 is a diagram showing a graph obtained by treating Lactobacillus performance WiKim0102 in a human-derived bladder cancer T24 cell line and measuring cell viabiliy assay.
  • FIG. 16 is a diagram showing a graph obtained by treating Lactobacillus performance WiKim0102 on a mouse-derived skin cancer melanoma B16F10 cell line and measuring cell growth rate (cell viabiliy assay).
  • FIG. 17 is a graph showing lactobacillus performance WiKim0102 treated on a human-derived normal skin CCD-986-sk cell line and measuring cell viabiliy assay.
  • the Lactobacillus performance strain isolated from kimchi through an embodiment of the present invention was found to have a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 1).
  • the microorganism of the present invention having the 16S rRNA base sequence of SEQ ID NO: 1 was named Lactobacillus performance WiKim0102 (Lactobacillus fermentum, WiKim0102), dated October 31, 2018 to the Korea Microbial Conservation Center Deposited (Accession No. KCCM12356P).
  • probiotics in the present invention, is understood to mean a living microorganism that has a beneficial effect on the health of the host by improving the intestinal microbial environment of the host in the gastrointestinal tract of animals, including humans.
  • Probiotics which are living microorganisms with probiotic activity, may have a beneficial effect on the intestinal microflora of a host when fed in the form of dried or fermented products to humans or animals in the form of single or multiple strains.
  • composition comprising the Lactobacillus performance WiKim0102 of the present invention (Lactobacillus fermentum, WiKim0102, accession number KCCM12356P) or a culture thereof as an active ingredient has a prophylactic or therapeutic effect on cancer, and may be used as a pharmaceutical composition.
  • the cancer may include bladder cancer, breast cancer, melanoma, thyroid cancer, parathyroid cancer, rectal cancer, throat cancer, larynx cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, snow cancer, skin cancer, brain tumor, uterine cancer, bile duct cancer, oral cancer, colon cancer, anal cancer, liver cancer, lung cancer, and It may be any one selected from the group consisting of colorectal cancer, preferably colorectal cancer, lung cancer, pancreatic cancer, liver cancer, bladder cancer or skin cancer, but is not limited thereto.
  • the lung cancer may be non-small cell lung cancer.
  • Lactobacillus performance WiKim0102 included in the composition according to the present invention may exist as a living cell or a dead cell, and may also exist in a dried or lyophilized form. Forms and formulation methods of lactic acid bacteria suitable for inclusion in various compositions are well known to those skilled in the art.
  • composition can be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and rectal administration may be administered. It may be administered, but is not limited thereto.
  • Suitable dosages of the composition can be variously prescribed by factors such as the method of formulation, the mode of administration, the patient's age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and response sensitivity.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared using a pharmaceutically acceptable and physiologically acceptable adjuvant in addition to the active ingredient, and the adjuvant includes excipients, boron Release agents, sweeteners, binders, coating agents, expanding agents, lubricants, lubricants or flavoring agents may be used.
  • the pharmaceutical composition may be preferably formulated into a pharmaceutical composition by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredients described above for administration.
  • the active ingredient can be combined with an oral, non-toxic pharmaceutically acceptable inert carrier such as ethanol, glycerol, water, and the like.
  • suitable binders, lubricants, disintegrants and colorants can also be included in the mixture.
  • suitable binders include, but are not limited to, natural sugars such as starch, gelatin, glucose or beta-lactose, corn sweeteners, natural and synthetic gums such as acacia, trachocanth or sodium oleate, sodium stearate, magnesium stearate, sodium benzo Eight, sodium acetate, sodium chloride, and the like.
  • Disintegrants include, but are not limited to, starch, methylcellulose, agar, bentonite, xanthan gum, and the like.
  • a composition formulated as a liquid solution sterile and biocompatible, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and
  • saline sterile water
  • Ringer's solution buffered saline
  • albumin injection solution dextrose solution
  • maltodextrin solution glycerol
  • ethanol ethanol
  • One or more of these components can be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers and bacteriostatic agents can be added as necessary.
  • diluents such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, pills, capsules, granules or tablets.
  • composition comprising the Lactobacillus performance WiKim0102 of the present invention (Lactobacillus fermentum, WiKim0102, accession number KCCM12356P) or a culture thereof as an active ingredient may be used as a food composition or a food additive composition for preventing or improving cancer.
  • the food composition may be in the form of a health functional food.
  • the “health functional food” refers to food manufactured and processed using ingredients or ingredients with useful functionality in accordance with the Act on Health Functional Food (Article 3, No. 1), and “functional” is It means to control the nutrients for the structure and function of the human body or to obtain useful effects for health purposes such as physiological action (Article 2).
  • the food composition may further include a food additive, and whether or not it is suitable as a "food additive" is the standard for the relevant item and the standard and general test method of the food additives approved by the Korea Food and Drug Administration unless otherwise specified. Judging by the criteria.
  • Items listed in the "Food Additives Fair” include, for example, chemical compounds such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamon acid, natural additives such as chromosomes, licorice extract, crystalline cellulose, and guar gum, L- And mixed preparations such as sodium glutamate, noodle-added alkalis, preservatives, and tar colorants.
  • chemical compounds such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamon acid
  • natural additives such as chromosomes, licorice extract, crystalline cellulose, and guar gum
  • L- And mixed preparations such as sodium glutamate, noodle-added alkalis, preservatives, and tar colorants.
  • Foods containing the active ingredient of the present invention include breads, rice cakes, dried fruits, candy, chocolates, chewing gum, confectionary ice creams such as confections, ice creams, ice cream products such as ice cream powders, low fat milks, lactose milk, Processed milk, goat milk, fermented milk, butter oil, concentrated milk, milk cream, butter oil, natural cheese, processed cheese, milk powder, dairy products such as whey, meat processed products, egg processed products, meat products such as hamburger fish cake, ham, Fish products such as sausages, bacon, and other processed meat products such as ramen, dried noodles, raw noodles, fried noodles, luxurious dried noodles, improved noodles, frozen noodles, pasta, fruit fruits, vegetable drinks, carbonated drinks, soy milk, Beverages such as lactic acid bacteria drinks such as yogurt, soy sauce, miso, red pepper paste, chunjang, cheonggukjang, mixed vinegar, sauces, tomato ketchup, curry, seasoning foods such as curry, dressing, margarine, shorten
  • composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, And carbonated agents used in carbonated beverages.
  • composition of the present invention may include flesh for the preparation of natural fruit juice, fruit juice beverage and vegetable beverage. These ingredients can be used independently or in combination.
  • the beverage composition containing the active ingredient of the present invention is not particularly limited to other ingredients, and may contain various flavoring agents or natural carbohydrates, etc. as additional ingredients, such as ordinary drinks.
  • natural carbohydrates described above include monosaccharides (eg, glucose, fructose, etc.); Disaccharides (eg maltose, sucrose, etc.); And polysaccharides, common sugars such as (eg, dextrin, cyclodextrin, etc.), and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents such as taumatin and stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizine)
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • composition comprising the Lactobacillus performance WiKim0102 of the present invention (Lactobacillus fermentum, WiKim0102, accession number KCCM12356P) or a culture thereof as an active ingredient may be used as a feed composition or feed additive composition for preventing or improving cancer in livestock. .
  • the composition When the composition is prepared as a feed additive, the composition may be 20 to 90% highly concentrated or may be prepared in powder or granular form.
  • the feed additives include organic acids such as citric acid, humic acid, adipic acid, lactic acid, and malic acid, phosphates such as sodium phosphate, potassium phosphate, acid pyrophosphate, polyphosphate (polymeric phosphate), polyphenols, catechins, alpha-tocopherols, and rosemary Extract, vitamin C, green tea extract, licorice extract, chitosan, tannic acid, phytinic acid, etc. may further include any one or more of natural antioxidants.
  • the composition When prepared as a feed, the composition may be formulated in a conventional feed form, and may include common feed ingredients.
  • the feed and feed additives include grains, such as crushed or crushed wheat, oats, barley, corn and rice; Vegetable protein feeds, such as feeds based on rape, soybeans, and sunflower; Animal protein feeds, such as blood meal, meat meal, bone meal and fish meal; Sugars and dairy products, for example, may further include dry ingredients made of various milk powders and whey powders, and may further include nutritional supplements, digestion and absorption enhancers, growth promoters, and the like.
  • grains such as crushed or crushed wheat, oats, barley, corn and rice
  • Vegetable protein feeds such as feeds based on rape, soybeans, and sunflower
  • Animal protein feeds such as blood meal, meat meal, bone meal and fish meal
  • Sugars and dairy products for example, may further include dry ingredients made of various milk powders and whey powders, and may further include nutritional supplements, digestion and absorption enhancers, growth promoters, and the like.
  • the feed additive may be administered to animals alone or in combination with other feed additives in an edible carrier.
  • the feed additives can be easily administered to animals as topdressing or by mixing them directly into animal feed or in a separate oral formulation from feed.
  • a pharmaceutically acceptable edible carrier can be solid or liquid, for example corn starch, lactose, sucrose, soy flakes, peanut oil, olive oil, sesame oil and propylene glycol.
  • the feed additive can be a tablet, capsule, powder, troche or sugar-coated tablet or a top dressing in undispersed form.
  • the feed additive may be a gelatin soft capsule, or a syrup or suspension, emulsion, or solution formulation.
  • the feed and feed additives may contain adjuvants, such as preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solution accelerators, and the like.
  • the feed additive may be used by adding to animal feed by acupuncture, spraying, or mixing.
  • the feed or feed additive of the present invention is applicable to a number of animal diets including mammals, poultry and fish.
  • the mammal it can be used for pigs, cows, sheep, goats, laboratory animals, and laboratory animals, as well as pets (eg, dogs and cats), and as the poultry, chicken, turkey, duck, goose, pheasant, And quail, etc., and may be used as trout as the fish, but is not limited thereto.
  • composition comprising the Lactobacillus performance WiKim0102 (Lactobacillus fermentum, WiKim0102, accession number KCCM12356P) of the present invention or a culture thereof as an active ingredient may be used as a lactic acid bacteria starter for fermentation.
  • WiKim0102 Lactobacillus fermentum, WiKim0102, accession number KCCM12356P
  • the composition comprising the Lactobacillus performance WiKim0102 (Lactobacillus fermentum, WiKim0102, accession number KCCM12356P) of the present invention or a culture thereof as an active ingredient may be used as a lactic acid bacteria starter for fermentation.
  • the present inventor separated lactic acid bacteria from kimchi.
  • the stock solution of the kimchi extract was spread on MRS agar medium and incubated for more than 24 hours at 30°C. After culture, the single colonies formed were subcultured to select a homogeneous colony, and the selected homogeneous colonies were finally identified through 16S rRNA sequencing.
  • WiKim0102 was given a unique number of WiKim0102 from the Microbial Genetic Bank of the World Kimchi Research Institute and named it Lactobacillus fermentum WiKim0102, and deposited it with the Korea Microbial Conservation Center on October 31, 2018. (Accession No. KCCM12356P).
  • the strain isolated through the examples of the present invention was found to have the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Example 1-1 A single colony of the Lactobacillus performance WiKim0102 strain isolated and identified in Example 1-1 was inoculated into 10 ml of the MRS liquid medium and shake cultured at 200 rpm for 24 hours at 37°C. After incubation, the cells were centrifuged at 8,000 rpm for 5 minutes to remove the culture medium, and washed with PBS (Phosphate Buffered Saline) solution three times to remove the remaining medium components.
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • the experimental animals used in the experiment were supplied with a male 5-week-old BALB/c mouse (Orient Bio, Korea), and stabilized for 1 week in an animal breeding room in an SPF environment where room temperature was maintained at 20 ⁇ 2°C and humidity at 55 ⁇ 15%. After the period, it was kept for the duration of the experiment.
  • the feed was fed with a general pellet feed without antibiotics, and water was allowed to be consumed from time to time. All animal breeding, experiments and euthanasia were conducted according to the protocol approved by the Animal Experimental Ethics Committee of the World Kimchi Research Institute.
  • the observation of tumor size change was performed by measuring the volume of the tumor (mm 3 ) using the formula 3.14 x (length x height x width)/6.
  • CT26 mouse colon cancer cells (Korea Cell Line Bank, Korea) were purchased and used, and MC38 mouse colon cancer cells (Chonnam National University College of Medicine) were provided and used.
  • CT26, MC38 mouse colon cancer cells were cultured in 5% CO 2 and 37° C. conditions using DMEM medium (Hyclone, USA) containing 10% fetal calf serum and 1% penicillin-streptomycin.
  • mice 6 weeks old BALB/c mice (18-21 g) were used for the experiments for the production of CT26 cell transplant animal models, and 6 weeks old C57BL/6 mice (18-21 g) were used for MC38 cell transplant animal models.
  • the cultured mouse colon cancer cells CT26 and MC38 were harvested 1x10 5 cells, respectively, resuspended in 50 ⁇ l PBS, and injected into the right thigh of the mouse.
  • the tail of a CT26 cell transplanted mouse in which tumors were formed in a volume of about 80-100 mm 3 was intravenously injected with Lactobacillus performance WiKim0102.
  • Lactobacillus performance WiKim0102 was prepared by quantifying with 1 ⁇ 10 10 CFU/ml bacteria using PBS, and 0.1 ml (1 ⁇ 10 9 CFU) was injected intravenously into the tail once or three times in experimental animals, and the negative control was performed. PBS was administered.
  • Fig. 1 shows the results of visually confirming the change in colorectal cancer tumor size of CT26 cell transplanted mice over time.
  • the tail of a MC38 cell transplanted mouse in which tumors were formed in a volume of about 80-100 mm 3 was intravenously injected with Lactobacillus performance WiKim0102.
  • the Lactobacillus performance WiKim0102 was prepared by quantifying 1 ⁇ 10 10 CFU/ml bacteria using PBS, and 0.1 ml (1 ⁇ 10 9 CFU) was injected intravenously into the tail of each experimental animal, and PBS was used for the negative control.
  • Fig. 3 shows the results of visually confirming the change in colorectal cancer tumor size of MC38 cell transplanted mice over time.
  • the present inventors confirmed that the anti-tumor effect of Lactobacillus performance WiKim0102 is excellent, and in particular, it shows a better anti-tumor effect when continuously administered.
  • Lactobacillus performance WiKim0102 was intravenously injected into the tail of a mouse transplanted with CT26 cells and MC38 cells, and after 1 hour and 24 hours, the tumor tissue was extracted and homogenized, and then plated on MRS agar medium. After smearing, colonies produced by incubating at 37° C. for 24 hours were counted to calculate CFU/g tissue. To compare the degree of Lactobacillus performance WiKim0102 targeting of tumor tissues and other major organ tissues, the liver and spleen tissues were also homogenized under the same conditions to count bacteria, and the results were shown in FIGS. 5 (CT26 cell transplantation mouse) and FIG. 6 (MC38). Cell transplanted mice).
  • Lactobacillus performance WiKim0102 accumulates in tumor tissue and is effectively targeted in a mouse model in which CT26 cells and MC38 cells are transplanted.
  • Example 5 HCT116 , SW620 (human colon cancer) cells and H1650 (human non-small cell lung cancer) cells Analysis of antitumor effects in transplanted animal models
  • HCT116 human colorectal cancer cells and SW620 human colorectal cancer cells were purchased and used, and H1650 human non-small cell lung cancer cells (Chonnam National University Medical School) were provided and used.
  • HCT116, SW620 and H1650 cells were cultured at 5% CO 2 and 37° C. using RPMI 1640 medium (Hyclone, USA) containing 10% fetal calf serum and 1% penicillin-streptomycin.
  • HCT116, SW620 and H1650 cell transplant cancer animal models For the production of HCT116, SW620 and H1650 cell transplant cancer animal models, age-old BALB/c mice (17-20 g) were used in the experiment.
  • the cultured HCT116, SW620 and H1650 cells were harvested 5x10 6 cells, respectively, resuspended in 50 ⁇ l PBS, and then injected into the right thigh of the mouse.
  • the tail of a mouse transplanted with HCT116 and SW620 colorectal cancer cells in which tumors were formed in a volume of about 80-100 mm 3 was intravenously injected with Lactobacillus performance WiKim0102.
  • the Lactobacillus performance WiKim0102 was prepared by quantifying 1 ⁇ 10 10 CFU/mL bacteria or 5 ⁇ 10 9 CFU/mL using PBS.
  • the prepared Lactobacillus performance WiKim0102 is administered once every 0.1 ml (1 ⁇ 10 9 CFU) or 3 times at 6-day intervals, and 0.1 ml (5 ⁇ 10 8 CFU) 1
  • the mice were injected intravenously with the tail of the mouse 3 times at intervals of 6 times or 6 days, and in a cancer animal model transplanted with SW620 human colon cancer cells, 0.1 ml (1 ⁇ 10 9 CFU) of prepared Lactobacillus performance WiKim0102 was added to the tail of the mouse 1 It was injected intravenously.
  • PBS was administered in the same manner, and graphs showing the results of visually confirming changes in tumor size over time for 26 days and volume changes in tumor sizes are shown in FIGS. 7 to 10.
  • Lactobacillus performance WiKim0102 was injected intravenously into the tail of a H1650 non-small cell lung cancer cell transplant mouse in which tumors were formed in a volume of about 80-100 mm 3 .
  • the Lactobacillus performance WiKim0102 was prepared by quantifying 1 ⁇ 10 10 CFU/mL bacteria or 5 ⁇ 10 9 CFU/mL using PBS.
  • 0.1 ml (1 ⁇ 10 9 CFU) of prepared Lactobacillus performance WiKim0102 was injected intravenously into the tail of a mouse.
  • PBS was administered in the same manner, and graphs showing the results of visually confirming the change in tumor size over time for 21 days and the volume change in tumor size are shown in FIGS. 11 to 12.
  • a cell viabiliy assay was measured using Cell counting Kit-8.
  • the cells used for the anticancer activity efficacy test were human pancreatic cancer ASPC1, PANC1 cell line, human liver cancer HepG2 cell line, human bladder cancer T24 cell line, mouse dermal melanoma B16F10 cell line, and normal skin cell line CCD-986-sk cell line. Did.
  • ASPC1, PANC1, HepG2 and T24 cell lines were passaged at 5% CO 2 and 37°C using RPMI medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin. Cultured and tested using cells in the growth phase. The cultured ASPC1, PANC1, HepG2 and T24 cells were treated with 0.25% trypsin-EDTA at 37°C for 3 minutes to detach the cells, washed twice with DPBS, and prepared at 1 X 10 4 cells/well.
  • FBS fetal bovine serum
  • the mouse-derived skin melanoma B16F10 cell line was passaged at 5% CO 2 at 37°C using DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin. Cells were used to experiment. The cultured B16F10 cells were treated with 0.25% trypsin-EDTA in the incubator at 37°C for 3 minutes to detach the cells, washed twice with DPBS, and prepared at 1 X 10 4 cells/well.
  • FBS fetal bovine serum
  • Human-derived normal skin cell CCD-986-sk cell line was passaged at 5% CO 2 at 37°C using RPMI medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin. Cultured and tested using cells in the growth phase. The cultured CCD-986-na cells were treated with 0.25% trypsin-EDTA in the incubator at 37°C for 3 minutes to detach the cells, washed twice with DPBS, and prepared at 1 X 10 4 cells/well.
  • FBS fetal bovine serum
  • the present invention was to measure the cell viability assay of cells treated with Lactobacillus performance WiKim0102 after culturing cells of pancreatic cancer (2 types), liver cancer (1 type), bladder cancer (1 type), and skin cancer (1 type).
  • the anti-cancer activity efficacy of the cancer cells not treated with Lactobacillus performance WiKim0102 was confirmed based on a growth rate of 100%.
  • the cell growth rate (cell viability assay) was treated with MOI1 concentration, and then cultured for 72 hours. After incubation, the cell counting Kit-8 reagent was treated and absorbance (OD 450 nm) was measured. The growth rate of cells treated with Lactobacillus fermentum WiKim0102 was calculated based on 100% absorbance of cells not treated with Lactobacillus fermentum WiKim0102, and the experimental results are described below. Did.
  • cell growth rate of 26.3% in the human-derived pancreatic cancer ASPC1 cell line treated with Lactobacillus performance WiKim0102 and 49.4% in the human-derived pancreatic cancer cell line PANC1 was measured. From the above results, it can be seen that in the case of the pancreatic cancer cell line treated with Lactobacillus performance WiKim0102, the cell growth rate is significantly inhibited and thus has excellent anticancer activity efficacy against pancreatic cancer.
  • a cell growth rate of 31.4% was measured in a human-derived liver cancer HepG2 cell line treated with Lactobacillus performance WiKim0102. From the above results, it can be confirmed that in the case of a liver cancer cell line treated with Lactobacillus performance WiKim0102, the cell growth rate is remarkably inhibited and thus has excellent anticancer activity efficacy against liver cancer.
  • a cell growth rate of 66.8% was measured in a bladder cancer T24 cell line derived from humans treated with Lactobacillus performance WiKim0102. From the above results, it can be seen that in the case of the bladder cancer cell line treated with Lactobacillus performance WiKim0102, the cell growth rate is remarkably inhibited, so it has excellent anticancer activity efficacy against bladder cancer.
  • a cell growth rate of 39.7% was measured in a skin melanoma B16F10 cell line derived from a mouse treated with Lactobacillus performance WiKim0102. From the above results, it can be seen that in the case of a skin cancer cell line treated with Lactobacillus performance WiKim0102, cell growth rate is remarkably inhibited, and thus it has excellent anticancer activity efficacy against skin cancer.
  • the cell growth rate was measured to be 96.2% in the normal skin cell line treated with Lactobacillus performance WiKim0102, and it can be confirmed from the above results that Lactobacillus performance WiKim0102 has no toxicity to the normal skin cell line. .
  • the two-way test t-test determined statistically significant differences in tumor growth between the negative control group and the Lactobacillus performance WiKim0102 treatment group. P ⁇ 0.05 was considered significantly for all tumor growth graph analysis.

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Abstract

본 발명은 김치로부터 분리된 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102는 기존의 동물모델 및 인간 암 세포가 이식된 동물모델에서 우수한 항암 활성을 나타내므로, 사람 또는 동물의 암의 치료, 예방 또는 개선 등의 용도를 위한 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

항암 활성을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 WIKIM0102 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물
본 발명은 김치로부터 분리된 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
암은 세계적으로 높은 사망률을 보이며, 서구 사회에서는 심혈관 질환 다음으로 가장 일반적인 사망 원인이다. 특히, 식생활이 서구화되어 고지방식의 섭취가 일반화되고, 환경 오염 물질의 급격한 증가, 음주량의 증가 등으로 대장암, 유방암, 전립선암 등이 지속적으로 증가하는 추세에 있으며, 인구의 고령화와 더불어 흡연 인구의 증가 및 대기 오염으로 인해 폐암이 증가하고 있는 실정이다. 이러한 실정에서 암의 조기 예방 및 치료를 가능하게 하여 인간 건강의 증진, 건강한 삶의 질 향상 및 인류 보건 증진에 기여할 수 있는 항암 물질의 창출이 절실히 요구되고 있다.
한편, 유산균은 인간과 동물의 구강, 장, 질, 분변, 그리고 김치와 같은 발효식품 등에 널리 분포하면서 사람과 동물의 건강과 밀접한 관련을 맺고 있다. 유산균은 정장작용, 유해균 억제, 면역조절, 혈중 콜레스테롤 저하, 항암 등 다양한 건강증진 효과를 나타내고 있다.
현재, 한국공개특허 제10-2015-0068061호에서는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 락토바실러스 메센테로이드(Lactobacillus mesenteroides) PNU (KCCM11353P)의 항암 활성을 개시하고 있고, 한국등록특허 제10-1287120호에서는 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10[기탁번호: KFCC-11433P] 또는 락토바실러스 플란타륨 DSR M2[기탁번호: KFCC-11432P]를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학 조성물을 개시하고 있으나, 락토바실러스 퍼멘텀에 관한 항암 활성 및 우수성에 대해서는 보고된 바 없다.
본 발명의 목적은 항암 활성이 우수한 신규한 김치 유산균 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 신규한 김치 유산균 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 신규한 김치 유산균 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 식품 첨가제 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 신규한 김치 유산균 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하기 위한 것이다.
이에, 본 발명자들은 김치로부터 프로바이오틱스로서 우수한 효과를 나타내면서 암의 예방 및 치료 효과를 나타내는 유산균 균주를 찾고자 노력한 결과, 항암 활성을 갖는 신규한 락토바실러스 속 유산균 균주인 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102)를 분리, 동정하여 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항암 활성이 우수한 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102 균주를 제공한다.
상기 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102)는 김치 유래의 락토바실러스 퍼멘텀 신규 균주이다. 비록 본 발명에서의 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102)를 김치에서 분리, 동정하기는 했으나, 이의 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102는 프로바이오틱스로서, 유산균의 일반적인 정장 효과 및 면역 증강 효과를 갖는다. 락토바실러스 속의 유산균이 정장 효과 면역 증강 효과를 갖는 것은 잘 알려진 사실이다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 식품 첨가제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 가축의 암 예방 또는 개선용 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 발효용 유산균 스타터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102는 기존의 동물모델 및 인간 암 세포가 이식된 동물모델에서 우수한 항암 활성을 나타내므로, 사람 또는 동물의 암의 치료, 예방 또는 개선 등의 용도를 위한 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 조성물을 CT26 세포 이식 마우스에 1회(Single) 또는 3회(Serial) 정맥 주사한 후 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 크기가 변화하는 것을 관찰하기 위한 마우스의 종양 부분 사진을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 조성물을 CT26 세포 이식 마우스에 1회(Single) 또는 3회(Serial) 정맥 주사한 후 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 부피 변화 및 성장율을 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 조성물을 MC38 세포 이식 마우스에 정맥 주사한 후 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 크기가 변화하는 것을 관찰하기 위한 마우스의 종양 부분 사진을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 조성물을 MC38 세포 이식 마우스에 정맥 주사한 후 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 부피 변화 및 성장율을 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 조성물을 CT26 세포 이식 마우스에 정맥 주사한 후 1시간 및 24시간 경과 후 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102의 조직 내 분배를 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 조성물을 MC38 세포 이식 마우스에 정맥 주사한 후 1시간 및 24시간 경과 후 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102의 조직 내 분배를 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 조성물을 HCT116 인간 대장암 세포 이식 마우스에 1회(Single) 또는 3회(Serial) 정맥 주사한 후 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 크기가 변화하는 것을 관찰하기 위한 마우스의 종양 부분 사진을 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명에 따른 조성물을 SW620 인간 대장암 세포 이식 마우스에 정맥 주사한 후 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 크기가 변화하는 것을 관찰하기 위한 마우스의 종양 부분 사진을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 조성물을 HCT116 인간 대장암 세포 마우스에 정맥 주사하고 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 부피 변화를 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명에 따른 조성물을 SW620 인간 대장암 세포 마우스에 정맥 주사하고 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 부피 변화를 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명에 따른 조성물을 H1650 인간 비소세포폐암 세포 이식 마우스에 정맥 주사한 후 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 크기가 변화하는 것을 관찰하기 위한 마우스의 종양 부분 사진을 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명에 따른 조성물을 H1650 인간 비소세포폐암 세포 마우스에 정맥 주사하고 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 부피 변화를 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 13은 사람 유래 췌장암 ASPC1 세포주 및 PANC1 세포주에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리하고 세포 성장률(cell viabiliy assay)을 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 14는 사람 유래 간암 HepG2 세포주에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리하고 세포 성장률(cell viabiliy assay)을 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 15는 사람 유래 방광암 T24 세포주에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리하고 세포 성장률(cell viabiliy assay)을 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 16은 마우스 유래 피부암 흑색종 B16F10 세포주에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리하고 세포 성장률(cell viabiliy assay)을 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 17은 사람 유래 정상피부 CCD-986-sk 세포주에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리하고 세포 성장률(cell viabiliy assay)을 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 발명의 실시예를 통해 김치로부터 분리된 락토바실러스 퍼멘텀 균주는 미생물의 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 염기서열 분석 결과, 서열번호 1(SEQ ID NO: 1)의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다.
따라서, 서열번호 1(SEQ ID NO: 1)의 16S rRNA 염기서열을 갖는 본 발명의 미생물을 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102)로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2018년 10월 31일자로 기탁하였다(기탁번호 KCCM12356P).
본 발명에 있어서, '프로바이오틱스(probiotics)'는 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물'이라는 의미로 이해된다. 프로바이오틱스는 프로바이오틱 활성을 갖는 살아있는 미생물로 단일 또는 복합균주 형태로 사람이나 동물에 건조된 세포 형태나 발효산물 형태로 급여될 경우, 숙주의 장내 균총에 유익한 영향을 미칠 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 암의 예방 또는 치료 효과를 가지며, 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.
상기 암은 방광암, 유방암, 흑색종양, 갑상선암, 부갑상선암, 직장암, 인후암, 후두암, 식도암, 췌장암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 두담낭암, 구강암, 결장암, 항문 부근암, 간암, 폐암 및 대장암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 암일 수 있으며, 바람직하게는 대장암, 폐암, 췌장암, 간암, 방광암 또는 피부암일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 폐암은 비소세포폐암일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102는 생균체 또는 사균체로서 존재할 수 있으며, 또한 건조 또는 동결건조된 형태로 존재할 수도 있다. 다양한 조성물 내에 포함시키기 적합한 유산균의 형태 및 제제화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
상기 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐 내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 정맥 내 주입방법으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 활용될 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연당, 옥수수감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐아세테이트, 소듐클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
나아가 해당 분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 식품 첨가제 조성물로 이용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 건강기능식품의 형태일 수 있다.
상기 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률에 따라 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미(제3조 제1호)하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것(동조 제2호)을 의미한다.
상기 식품 조성물은 식품 첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 들을 들 수 있다.
본 발명의 유효성분이 포함된 식품으로는 빵, 떡류, 건과류, 캔디류, 초콜릿류, 츄잉껌, 쨈류와 같은 과자류 아이스크림류, 빙과류, 아이스크림 분말류와 같은 아이스크림 제품류 우유류, 저지방 우유류, 유당분해 우유, 가공유류, 산양유, 발효유류, 버터유류, 농축유류, 유크림류, 버터유, 자연치즈, 가공치즈, 분유류, 유청류와 같은 유가공품류 식육가공품, 알가공품, 햄버거와 같은 식육제품류 어묵, 햄, 소세지, 베이컨 등의 어육가공품과 같은 어육제품류 라면류, 건면류, 생면류, 유탕면류, 호화건먼류, 개량숙면류, 냉동면류, 파스타류와 같은 면류 과실음료, 채소류음료, 탄산음료, 두유류, 요구르트 등의 유산균음료, 혼합음료와 같은 음료 간장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 식초, 소스류, 토마토케첩, 카레, 드레싱과 같은 조미식품 마가린, 쇼트닝 및 피자를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 유효성분을 포함한 음료 조성물은 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, (예를 들어, 포도당, 과당 등); 디사카라이드, (예를 들어 말토스, 슈크로스 등); 및 폴리사카라이드, (예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등)과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 가축의 암 예방 또는 개선용 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물로 이용될 수 있다.
상기 조성물이 사료 첨가제로서 제조될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 제조될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화될 수 있으며, 통상의 사료 성분을 함께 포함할 수 있다.
상기 사료 및 사료 첨가제는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
상기 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료 첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
또한, 상기 사료 및 사료 첨가제는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료 첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 발명의 사료 또는 사료 첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다.
상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치동물, 및 실험용 설치동물뿐만 아니라, 애완동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 발효용 유산균 스타터로 이용될 수 있다.
실시예 1. 균주의 분리 및 배양
1-1. 균주의 분리 및 동정
본 발명자는 김치로부터 유산균을 분리하였다.
먼저 김치 시료를 파쇄한 후 김치 추출물의 원액을 MRS agar 배지에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 배양 후 형성된 단일 콜로니를 계대배양하여 균단일집락을 선별하였고, 선별된 균단일집락은 16S rRNA 염기서열 분석을 통하여 최종적으로 동정하였다. 그 중 효과가 뛰어난 1종의 유산균을 세계김치연구소 미생물 유전자은행으로부터 WiKim0102의 고유번호를 부여받아 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) WiKim0102라 명명하고, 한국미생물보존센터에 2018년 10월 31일자로 기탁하였다(기탁번호 KCCM12356P).
본 발명의 실시예를 통해 분리된 균주는 미생물의 동정을 위한 16S rRNA 염기서열 분석 결과, SEQ ID NO: 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다.
1-2. 균주의 배양
상기 실시예 1-1에서 분리 및 동정한 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102 균주의 단일 콜로니를 MRS 액체배지 10㎖에 접종 후 37℃에서 24시간 동안 200rpm으로 진탕배양하였다. 배양 후, 균체를 8,000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 배양액을 제거하고, PBS(Phosphate Buffered Saline)용액으로 3회 세척하여 남아 있는 배지 성분을 제거하였다.
실시예 2. 실험동물(마우스)의 조건
실험에 사용된 실험동물은 수컷 5주령의 BALB/c 마우스(오리엔트바이오, 한국)를 공급받았고, 실내 온도 20±2℃, 습도 55±15%가 유지되는 SPF 환경의 동물 사육실에서 1주일의 안정화 기간을 거쳐 실험기간 동안 사육하였다. 사료는 항생제가 첨가되지 않은 일반적인 팰렛 사료를 공급하였고, 물은 수시로 섭취할 수 있게 하였다. 실험 진행은 세계김치연구소 동물실험윤리위원회에서 승인된 프로토콜에 따라 모든 동물 사육, 실험 및 안락사를 실시하였다. 종양 크기 변화의 관찰은 3.14 x (길이 x 높이 x 넓이)/6의 식을 사용하여 종양의 부피(mm3)를 측정하여 진행하였다.
실시예 3. CT26 및 MC38 생쥐 대장암 세포 이식 동물모델에서의 항종양 효과 분석
3-1. 세포배양
CT26 생쥐 대장암 세포(한국세포주은행, 한국)는 구입하여 사용하였으며, MC38 생쥐 대장암 세포(전남대학교 의과대학)는 제공받아 사용하였다. CT26, MC38 생쥐 대장암 세포는 10% 우태아혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 포함한 DMEM 배지(Hyclone, 미국)를 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다.
3-2. 세포 이식 암 동물모델의 제작
CT26 세포 이식 동물모델 제작을 위해서 6주령 BALB/c 마우스(18-21g)를 실험에 이용하였고, MC38 세포 이식 동물모델 제작을 위해서는 6주령 C57BL/6 마우스(18-21g)를 이용하였다. 배양한 생쥐 대장암 세포 CT26과 MC38은 각각 1x105 cell을 수확(harvest)한 후, 50㎕의 PBS에서 재부유한 후 마우스의 오른쪽 대퇴부(thigh) 피하에 주입하였다.
3-3. 항종양 효과 분석
종양이 약 80~100mm3의 부피로 형성된 CT26 세포 이식 마우스의 꼬리에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 정맥 내 주사하였다. 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102는 PBS를 이용하여 1×1010 CFU/㎖ 균수로 정량하여 준비하였으며, 0.1㎖(1×109 CFU)씩 실험동물에 1회 또는 3회 꼬리에 정맥주사하고, 음성대조군에는 PBS를 투여하였다. 시간 경과에 따라 CT26 세포 이식 마우스의 대장암 종양 크기의 변화를 육안으로 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 음성대조군(PBS)에 비해 락토바실러스 퍼멘텀WiKim0102를 정맥 주입한 경우 12일이 경과한 후에 종양 세포가 육안으로 확인가능할 정도로 줄어든 것을 관찰하였다. 특히, 1회(Single) 주입한 경우보다, 3회(Serial) 주입한 경우가 종양의 크기가 더 크게 줄어들었음을 확인하였으며, 3회 주입한 경우 12일이 경과한 때에는 종양이 육안으로 관찰되지 않을 정도로 줄어들었음을 확인하였다.
또한, 시간 경과에 따라 CT26 세포 이식 마우스에서 종양 크기의 부피 변화를 측정한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, CT26 세포 이식 마우스의 대장암 종양 크기가 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 1회 주사하였을 경우 18일 후에 음성대조군 대비 약 4.2배의 항종양 효과가 있음을 확인할 수 있었고, 6일 간격으로 3회 주사하였을 경우 18일 후에 음성대조군 대비 약 27.2배의 항종양 효과가 관찰되었다.
또한, 종양이 약 80~100mm3의 부피로 형성된 MC38 세포 이식 마우스의 꼬리에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 정맥 내 주사하였다. 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102는 PBS를 이용하여 1×1010 CFU/㎖ 균수로 정량하여 준비하였으며, 0.1㎖(1×109 CFU)씩 실험동물에 1회 꼬리에 정맥주사하고, 음성대조군에는 PBS를 투여하였다. 시간 경과에 따라 MC38 세포 이식 마우스의 대장암 종양 크기의 변화를 육안으로 확인한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 음성대조군(PBS)에 비해 락토바실러스 퍼멘텀WiKim0102를 정맥 주입한 경우에 종양 세포가 육안으로 확인가능할 정도로 줄어든 것을 관찰할 수 있었다. 15일이 경과한 때에는 종양이 육안으로 관찰되지 않을 정도로 줄어들었음을 관찰할 수 있었다.
또한, 시간 경과에 따라 MC38 세포 이식 마우스에서 종양 크기의 부피 변화를 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, MC38 세포 이식 마우스의 대장암 종양 크기가 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 1회 주사하였을 경우 12일 후에 음성대조군 대비 약 23.8배의 항종양 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
상기 실험결과를 통해 본 발명자들은 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102의 항종양 효과가 우수하며, 특히 연속적인 투여를 한 경우에 더욱 우수한 항종양 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 락토바실러스 퍼멘텀WiKim0102 주사 후 생물학적 분배(biodistribution study)
락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 CT26 세포와 MC38 세포가 이식된 마우스의 꼬리에 정맥 주사한 후 1시간과 24시간이 경과한 후에 종양 조직을 적출하여 균질화한 후 MRS agar 배지에 도말하였다. 도말한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하여 생성된 콜로니를 계수하여 CFU/g 조직을 계산하였다. 종양 조직과 다른 주요 장기 조직의 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102 표적화 정도를 비교하기 위해 간장 및 비장 조직 역시 동일한 조건으로 균질화하여 박테리아를 계수하였고, 그 결과를 도 5(CT26 세포 이식 마우스) 및 도 6(MC38 세포 이식 마우스)에 나타내었다.
도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, CT26과 MC38 세포가 이식된 암 동물모델 모두의 경우에서 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102이 주사된 후 1시간 후부터 종양 조직에서 1×107 CFU/g 이상의 균수가 관찰되었고, 24시간 후에도 종양 조직의 균수가 유지되는 것이 확인되었다.
상기 결과로부터 CT26 세포와 MC38 세포가 이식된 마우스 모델에서 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102이 종양 조직에 축적되며, 효과적으로 표적화됨을 확인할 수 있었다.
실시예 5. HCT116 , SW620(인간 대장암)세포와 H1650(인간 비소세포폐암)세포 이식 동물모델에서의 항종양 효과 분석
5-1. 세포배양
HCT116인간 대장암 세포와 SW620 인간 대장암 세포(한국세포주은행, 한국)는 구입하여 사용하였으며, H1650 인간 비소세포폐암 세포(전남대학교 의과대학)는 제공받아 사용하였다. 이들 HCT116, SW620 및 H1650 세포는 10% 우태아혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 포함한 RPMI 1640 배지(Hyclone, 미국)를 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다.
5-2. HCT116, SW620 그리고 H1650 세포 이식 암 동물모델의 제작
HCT116, SW620 및 H1650 세포 이식 암 동물모델 제작을 위해서 주령 BALB/c 마우스(17-20g)를 실험에 이용하였다. 배양된 HCT116, SW620 및 H1650 세포는 각각 5x106 cell을 수확(harvest)한 후, 50㎕의 PBS에서 재부유한 후 마우스의 오른쪽 대퇴부(thigh) 피하에 주입하였다.
5-3. HCT116, SW620 대장암 세포에 대한 항종양 효과 분석
종양이 약 80~100mm3의 부피로 형성된 HCT116 및 SW620 대장암 세포 이식 마우스의 꼬리에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 정맥 내 주사하였다. 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102는 PBS를 이용하여 1×1010 CFU/㎖ 균수 또는 5×109 CFU/㎖로 정량하여 준비하였다. HCT116 인간 대장암 세포가 이식된 암 동물모델에는 준비된 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 0.1㎖(1×109 CFU) 씩 1회 또는 6일 간격으로 3회, 0.1㎖(5×108 CFU)씩 1회 또는 6일 간격으로 3회 마우스의 꼬리에 정맥 주사하였고, SW620 인간 대장암 세포가 이식된 암 동물모델에는 준비된 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 0.1㎖(1×109 CFU) 씩 마우스의 꼬리에 1회 정맥 주사하였다. 음성대조군에는 동일하게 PBS를 투여하고, 26일 동안 시간 경과에 따른 종양 크기의 변화를 육안으로 확인한 결과 및 종양 크기의 부피 변화를 나타낸 그래프를 도 7 내지 도 10에 나타내었다.
도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, HCT116 및 SW620 인간 대장암 세포가 이식된 암 동물모델에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 주입한 경우 종양의 크기가 육안으로 관찰이 가능할 만큼 줄어드는 것이 관찰되었으며, 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 0.1㎖(5×108CFU)로 투여한 경우보다 0.1㎖(1×109 CFU) 씩 투여한 경우에 종양 축소 효과가 우수함을 확인하였다. 특히, HCT116 인간 대장암 세포가 이식된 암 동물모델에서는 3회 투여한 경우 1회 투여한 경우보다 종양 크기의 축소 효과가 우수함을 확인하였다.
또한, 도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, HCT116 및 SW620 인간 대장암 세포가 이식된 암 동물모델에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 주입한 경우 종양 크기의 부피가 확연히 줄어드는 것을 수치적으로 확인할 수 있었다. HCT116 인간 대장암 세포가 이식된 암 동물모델에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 1×109 CFU/0.1㎖로 1회 또는 3회 주사하였을 경우 26일 후에 음성대조군과 비교하여 각각 약 4.2배와 약 27.2배의 항종양 효과가 관찰되었고, 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 5×108 CFU/0.1㎖로 3회 주사하였을 경우 26일 후에 음성대조군과 비교하여 약 2.9배의 항종양 효과가 관찰되었다. 한편, SW620 인간 대장암 세포가 이식된 암 동물모델에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 1×109 CFU/0.1㎖로 1회 주사하였을 경우 26일 후에 음성대조군과 비교하여 약 2.1배의 항종양 효과가 관찰되었다.
상기 결과로부터, 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102을 1회 주사하는 경우보다 3회 주사하는 경우 종양의 성장을 저해하는데 더욱 우수한 효과가 나타났다. 따라서 종양의 효과적인 치료를 위해서는 적절한 간격에 따른 주사 투여법이 1회 주사보다 더 효과적이며, 생쥐 대장암 세포 뿐 아니라 인간 대장암 세포가 이식된 동물모델에서도 우수한 항암 활성을 갖는다는 것을 확인하였다.
5-4. H1650 비소세포폐암에 대한 항종양 효과 분석
종양이 약 80~100mm3의 부피로 형성된 H1650 비소세포폐암 세포 이식 마우스의 꼬리에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 정맥 내 주사하였다. 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102는 PBS를 이용하여 1×1010 CFU/㎖ 균수 또는 5×109 CFU/㎖로 정량하여 준비하였다. H1650 인간 비소세포폐암 세포가 이식된 암 동물모델에는 준비된 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102 0.1㎖(1×109 CFU)를 마우스의 꼬리에 1회 정맥 주사하였다. 음성대조군에는 동일하게 PBS를 투여하고, 21일 동안 시간 경과에 따른 종양 크기의 변화를 육안으로 확인한 결과 및 종양 크기의 부피 변화를 나타낸 그래프를 도 11 내지 도 12에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, H1650 비소세포폐암 세포가 이식된 암 동물모델에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 주입한 경우 종양의 크기가 육안으로 관찰이 가능할 만큼 줄어드는 것이 관찰되었다.
또한, 도 12에 나타난 바와 같이, H1650 비소세포폐암 세포가 이식된 암 동물모델에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 주입한 경우 종양 크기의 부피가 확연히 줄어드는 것을 수치적으로 확인할 수 있었다. H1650 비소세포폐암 세포가 이식된 암 동물모델에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 주사하였을 경우 21일 후에 음성대조군과 비교하여 약 1.8배의 항종양 효과가 관찰되었다.
실시예 6. In vitro 항암 활성 효능 분석
6-1. 세포주의 준비
락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) WiKim0102의 항암 활성 효과를 관찰하기 위해 Cell counting Kit-8을 이용하여 세포 성장률(cell viabiliy assay)을 측정하였다. 항암 활성 효능실험에 사용된 세포는 사람 유래 췌장암 ASPC1, PANC1 세포주, 사람 유래 간암 HepG2 세포주, 사람 유래 방광암 T24 세포주, 마우스 유래 피부 흑색종 B16F10 세포주, 그리고 정상 피부 세포주인 CCD-986-sk 세포주를 이용하였다.
사람 유래 암세포 ASPC1, PANC1, HepG2 및 T24 세포주는 10% FBS(fetal bovine serum)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 첨가한 RPMI 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대배양하여 성장기의 세포를 사용하여 실험하였다. 배양된 ASPC1, PANC1, HepG2 및 T24세포는 0.25% trypsin-EDTA로 배양기에 37℃에서 3분간 처리하여 세포를 탈착한 다음 DPBS로 2회 세척 후 1 X 104 cells/well로 준비하였다.
마우스 유래 피부 흑색종 B16F10 세포주는 10% FBS(fetal bovine serum)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대배양하여 성장기의 세포를 사용하여 실험하였다. 배양된 B16F10 세포는 0.25% trypsin-EDTA로 배양기에 37℃에서 3분간 처리하여 세포를 탈착한 다음 DPBS로 2회 세척 후 1 X 104 cells/well로 준비하였다.
사람 유래 정상 피부 세포 CCD-986-sk 세포주는 10% FBS(fetal bovine serum)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 첨가한 RPMI 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대배양하여 성장기의 세포를 사용하여 실험하였다. 배양된 CCD-986-나 세포는 0.25% trypsin-EDTA로 배양기에 37℃에서 3분간 처리하여 세포를 탈착한 다음 DPBS로 2회 세척 후 1 X 104 cells/well로 준비하였다.
6-2. 세포 성장률(cell viabiliy assay) 측정 결과
본 발명은 췌장암(2종), 간암(1종), 방광암(1종), 피부암(1종) 세포를 배양한 후 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102 처리한 세포의 세포 성장률(cell viability assay)을 측정하였으며 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리하지 않는 암세포들의 흡광도를 100%의 성장률 기준으로 항암활성 효능을 확인하였다.
세포 성장률(cell viability assay)는 MOI1 농도로 처리한 다음 72시간 동안 배양하였고, 배양 후 Cell counting Kit-8 시약을 처리한 후 흡광도(OD 450nm)를 측정하였다. 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) WiKim0102를 처리하지 않은 세포(comtrol)의 흡광도를 100% 기준으로, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) WiKim0102를 처리한 세포의 성장률을 계산하였으며, 실험 결과를 하기에 기재하였다.
사람 유래 췌장암 ASPC1 세포주, 사람 유래 췌장암 세포주 PANC1에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리하여 세포 성장률을 측정한 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리한 사람 유래 췌장암 ASPC1 세포주에서 26.3%, 사람 유래 췌장암 세포주 PANC1에서 49.4%의 세포 성장률이 측정되었다. 상기 결과로부터 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리한 췌장암 세포주의 경우 세포 성장률이 현저하게 저해되므로 췌장암에 대해 우수한 항암 활성 효능을 가짐을 확인할 수 있다.
또한, 사람 유래 간암 HepG2 세포주에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리하여 세포 성장률을 측정한 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리한 사람 유래 간암 HepG2 세포주에서는 31.4%의 세포 성장률이 측정되었다. 상기 결과로부터 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리한 간암 세포주의 경우 세포 성장률이 현저하게 저해되므로 간암에 대해 우수한 항암 활성 효능을 가짐을 확인할 수 있다.
또한, 사람 유래 방광암 T24 세포주에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리하여 세포 성장률을 측정한 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리한 사람 유래 방광암 T24 세포주에서는 66.8%의 세포 성장률이 측정되었다. 상기 결과로부터 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리한 방광암 세포주의 경우 세포 성장률이 현저하게 저해되므로 방광암에 대해 우수한 항암 활성 효능을 가짐을 확인할 수 있다.
또한, 마우스 유래 피부 흑색종 B16F10 세포주에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리하여 세포 성장률을 측정한 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리한 마우스 유래 피부 흑색종 B16F10 세포주에서는 39.7%의 세포 성장률이 측정되었다. 상기 결과로부터 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리한 피부암 세포주의 경우 세포 성장률이 현저하게 저해되므로 피부암에 대해 우수한 항암 활성 효능을 가짐을 확인할 수 있다.
상기 실험과 대비하여 사람 유래 정상 피부 CCD-986-sk 세포주에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 처리하여 세포 성장률을 측정한 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102을 처리한 정상 피부 세포주에서는 세포 성장율이 96.2%로 측정되었으며, 상기 결과로부터 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102가 정상 피부 세포주에 대해서는 독성을 갖지 않음을 확인할 수 있다.
양방검정 t-test는 음성대조군과 락토바실러스 퍼멘텀WiKim0102 처리군 사이에 종양 성장에서 통계적으로 유의미한 차이를 결정하였다. P < 0.05는 모든 종양성장 그래프 분석에 대하여 유의미하게 고려되었다.
Figure WO-DOC-FIGURE-ro134

Claims (18)

  1. 서열번호 1로 나타나는 16S rRNA를 가지며, 기탁번호 KCCM12356P의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) WiKim0102.
  2. 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 암은 방광암, 유방암, 흑색종양, 갑상선암, 부갑상선암, 직장암, 인후암, 후두암, 식도암, 췌장암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 두담낭암, 구강암, 결장암, 항문 부근암, 간암, 폐암 및 대장암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 암인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 폐암은 비소세포폐암인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여의 방법으로 투여 가능한 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 비경구 투여의 방법은 정맥주사 투여인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 생균 형태인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 식품은 건강기능식품인, 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 식품은 빵, 떡, 캔디, 초콜릿, 껌, 아이스크림, 우유, 치즈, 식육가공품, 어육가공품, 김치, 간장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장, 식초, 케첩, 카레, 드레싱, 음료 및 발효유로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 식품인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  11. 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 첨가제 조성물.
  12. 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 가축의 암 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 가축은 돼지, 소, 말, 양, 토끼, 염소, 쥐, 햄스터, 기니피그, 개, 고양이, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 메추라기, 잉어, 붕어 및 송어로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 가축의 암 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  14. 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 가축의 암 예방 또는 개선용 사료 첨가제 조성물.
  15. 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 발효용 유산균 스타터.
  16. 제2항 내지 제7항 중 어느 하나의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 암의 예방 또는 치료 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 투여의 방법 및 투여량은 정맥주사의 방법으로 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 1×1010 CFU/㎖ 농도로 0.1㎖ 투여하는 것인, 암의 예방 또는 치료 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 투여의 기간 및 횟수는 6일 간격으로 3회 투여하는 것인, 암의 예방 또는 치료 방법.
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