WO2020126419A1 - Verfahren zum betrieb einer probenkammer für eine mikroskopische bildgebung sowie vorrichtung und probenkammer - Google Patents

Verfahren zum betrieb einer probenkammer für eine mikroskopische bildgebung sowie vorrichtung und probenkammer Download PDF

Info

Publication number
WO2020126419A1
WO2020126419A1 PCT/EP2019/083222 EP2019083222W WO2020126419A1 WO 2020126419 A1 WO2020126419 A1 WO 2020126419A1 EP 2019083222 W EP2019083222 W EP 2019083222W WO 2020126419 A1 WO2020126419 A1 WO 2020126419A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
sample chamber
space
chamber
scanner
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2019/083222
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Kalkbrenner
Ralf Wolleschensky
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Original Assignee
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Microscopy GmbH filed Critical Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority to US17/309,793 priority Critical patent/US12259538B2/en
Priority to JP2021535872A priority patent/JP7399168B2/ja
Publication of WO2020126419A1 publication Critical patent/WO2020126419A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/34—Microscope slides, e.g. mounting specimens on microscope slides
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0036—Scanning details, e.g. scanning stages
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/24—Base structure
    • G02B21/26—Stages; Adjusting means therefor
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
    • G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison

Definitions

  • the invention relates to a method for operating a sample chamber for microscopic imaging and a device for performing the method.
  • the invention further relates to a sample chamber which is used in particular in the method according to the invention.
  • these can be treated chemically in such a way that structures deep in the tissue or organ are also visible.
  • the tissues or organs - hereinafter generally referred to as a sample - are subjected to a treatment with certain chemicals, which is also referred to as "clearing".
  • the action of the chemicals removes or replaces existing lipids, for example, while supporting structures remain unchanged.
  • the structures that have been preserved can be made visible and imaged using fluorescent markings.
  • the effective penetration depth of microscopy methods can be significantly increased, for example, because of a reduced scatter of illuminating or detection radiation due to lipids removed in this way.
  • Methods for "clarifying" samples, for example of brains are for example from Silvestri, L. et al. (2016): Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of biomedical optics, 21 (8): 081205 or from Richardson, DS & Lichtman, JW (2015): Clarifying tissue clearing, Cell, 162 (2): 246-257.
  • Specimen clarification is used in particular for brain examinations.
  • Typical samples are cleared brains from mice. Their size of 8 - 10 mm requires an optical penetration depth of at least about 10 mm.
  • the chemicals used for clarification are sometimes very aggressive or also toxic and often expensive. If the immersion arrangements customary in the prior art are used, undesirable imaging errors can occur. If, for example, a clearing medium used for clarification ultimately forms the immersion as a sample medium, then aberrations can be caused by unknown or non-fully compensated optical properties of the clearing medium (refractive index, Abbe number). In addition, the lens comes into contact with the aggressive and / or toxic chemicals, which can damage the lens and mean increased effort in ensuring occupational safety and health protection and a reduction in the service life of the optical components.
  • the object of the invention is to propose a possibility both on the process side and on the device side with which the disadvantages occurring in the prior art are reduced.
  • the object is achieved by a method for operating a sample chamber for microscopic imaging according to claim 1, by a sample chamber according to claim 10 and a device for acquiring image data according to claim 14.
  • the invention also relates to a sample holder for receiving at least one sample chamber according to the invention.
  • the method for operating a sample chamber for microscopic imaging comprises the steps of providing a sample chamber in an illumination beam path and detecting it a detection radiation.
  • the sample chamber used encompasses a sample space in which a sample can or is positioned.
  • the sample chamber has at least one wall delimiting the sample space with an outside facing away from the sample space.
  • the illumination beam path is directed through the outside into the sample space.
  • the section of the illumination beam path directed into the sample space through the outside is also referred to and understood as the illumination axis.
  • a detection radiation caused by an illumination radiation directed into the sample space along the illumination axis is detected along a detection axis running through the wall of the sample chamber from the sample space.
  • the detection axis is part of a detection beam path.
  • the method is characterized in that a sample chamber is used, the outside of which has the shape of a spherical section with a circular disk as the base, which is also referred to below as a spherical shape.
  • the sample chamber and the detection axis are rotated and / or pivoted relative to one another about the center of the circular disk, so that different angular relative positions of the sample chamber and detection axis are set. With different angular relative positions of the sample chamber and the detection axis, image data are acquired.
  • the detection axis always runs through the spherical outside.
  • the essence of the invention is the use of a sample chamber with a spherical outside, as will be described in more detail below.
  • the design of at least one outside of the sample chamber as a sphere (spherical section) and the movement of the sample chamber around the center of the circular disk advantageously enables the setting of a large number of different angular relative positions.
  • an angle of the detection axis relative to the outside is kept constant.
  • the detection axis always coincides with a normal of the outside, regardless of which angular relative position is set.
  • This constancy of the orientation of the detection axis is only limited by the actual shape of the sample chamber, in particular by the covered angular range on the outside and the arc length on the outside.
  • Equivalent are other shapes of the base of the sample chamber than that of a circular disk, for example as a polygon or free form.
  • sample chamber advantageously allows a lens used for the detection of the detection radiation to be separated from the sample medium.
  • image data acquisitions are carried out in at least two different z relative positions in a respective angular relative position.
  • a respective Z relative position is set in that the sample chamber and / or a focal plane of an imaging optical system are displaced relative to one another along the detection axis.
  • the direction of the detection axis is referred to as the z-direction (z-axis).
  • Az relative position denotes a position of the focal plane along the detection axis.
  • a z stack of image data is acquired under an angular relative position and a number of z relative positions.
  • an image of the focal plane (Field of View; FoV) is acquired and imaged. If image data is recorded in two different z-relative positions under the same angular relative position, a sample volume is imaged if the two focal planes in the z-direction do not completely overlap or adjoin one another (Volume of View; VoV). If a stack (z-stack) of image data of mutually adjacent or overlapping focal planes is recorded in this way, a (volume) section of the sample can be completely recorded along the detection axis and under the relevant relative angle position.
  • FoV Field of View
  • the illuminating radiation is advantageously formed into a light sheet and irradiated into the sample space. Illuminating the sample with a light sheet is particularly advantageous for large and scattering samples.
  • the illuminating radiation is advantageously used in the form of a non-diffractive beam.
  • a non-diffractive beam is, for example, a beam limited in terms of its frequency spectrum by means of a sinc filter, as described in DE 10 2012 013 163 A1 (also referred to as a Sinc 3 beam).
  • the Sinc 3 beam does not have to be scanned laterally to generate a light sheet.
  • lateral scanning is required for other non-diffractive beams that can be used, such as a Mathieu beam or a Bessel beam.
  • a Sinc 3 beam in particular, light sheets with a small thickness in the Z direction can potentially be generated.
  • Non-diffractive rays that can be used to generate the light sheet are, in particular, Airy rays, circular Airy rays [circular airy beam], coherent Bessel rays (coherent Bessel beam; Gao, L. et al. (2012), Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens; Cell 151: 1370 - 1385] and structured light sheets [lattice light sheet; Chen, Bi-Chang, et al. (2014), Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution; Science 346: 1257998]
  • a light sheet with a known beam shape for example a scanned or Gaussian beam shaped by means of cylinder optics.
  • a known beam shape for example a scanned or Gaussian beam shaped by means of cylinder optics.
  • the advantages of non-diffractive beam shapes cannot be used.
  • the refraction of the light sheet on the wall of the spherical sample chamber must be taken into account. This is particularly true when image data are acquired in different z-relative positions. It doesn't matter whether the sample chamber is moved or the lens.
  • the angle of incidence of the light sheet is changed as a function of the z relative position (z position). The angle of incidence is understood to be the angle between the illuminating beam and a normal of the point of incidence of the illuminating beam on the outside.
  • a portion of the volume of the sample can be imaged using the process design described above.
  • image data from adjacent or overlapping partial areas of the sample are acquired as z-stacks at different angular relative positions of the sample chamber and detection axis.
  • the angular relative position is changed in such a way that, for example, after a completed detection of a z-stack, a further angular relative position is set and a further z-stack is recorded.
  • parameters such as focus position, angle of incidence and light sheet position can be stored as lookup tables.
  • a light sheet can advantageously be combined with a plenoptic detection or light field detection [e.g. B. Prevedel, R. et al. (2014): Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature methods, 11: 727]
  • plenoptic detection a thicker and longer light sheet can be generated and irradiated.
  • the light field detection can be used to reconstruct part of the sample in the z direction along the thickness of the light sheet from the additionally available angle information with an exposure. In this way, the required total exposure time can be significantly reduced, since in addition to the lateral parallelization (wide field), parallelization is also carried out along the detection axis (Plenoptics).
  • the problem of non-focal background fluorescence, which complicates the plenoptic reconstruction, is advantageously reduced by the light sheet illumination.
  • the illumination can take place using a point or multipoint scanner.
  • the image data can be detected confocal, in the wide field or by means of plenoptic detection (see further below).
  • the sample chamber is designed for use in the field of microscopy. It encompasses a sample space for positioning a sample and has at least one wall delimiting the sample space with an outside facing away from the sample space.
  • the sample chamber is characterized in that the outside of the wall has the shape of a spherical section with a circular disk as the base. There is also a sample holder for holding the sample in the plane of the circular disk.
  • the spherical section covers an angular range of at least 90 °, but preferably at least 120 °.
  • Sample chambers with a covered angular range of at least 150 °, in particular 180 °, are well suited for the microscopic examination of clarified samples.
  • the angular range covered by the spherical section can also be more than 180 °, for example 210 °, 240 ° or 270 °.
  • the sample chamber advantageously allows the positioning of a sample with an extension in each spatial direction of at least 3 mm, for example at least 5 or 10 mm.
  • the sample chamber can advantageously be sealed with a further wall, so that, for example, a sample medium is held in the sample chamber and cannot accidentally emerge from it.
  • This further wall can be a separate wall and also serve as a sample holder.
  • an inside of the further wall extends in the plane of the circular area.
  • the sample holder in the form of a further wall can also be a sample carrier with at least one carrier surface.
  • a parking space can have, for example, a structure such as an elevation and / or an annular depression. The sample chamber can be put over the elevation and is held by this at the parking space.
  • a depression can also be a lateral guide for the sample chamber.
  • the depression can also contain or accommodate a seal so that the sample chamber is closed in a liquid-tight manner.
  • a sealing effect can be achieved in further embodiments by the surfaces of the areas of the sample chamber placed in the depression and / or the surface of the depression having a high accuracy of fit to one another and being sealed, for example, by adhesive forces or capillary forces of the surfaces or a liquid film located between them.
  • a sample holder can have at least two sample chambers arranged on the sample holder.
  • Such a sample carrier with sample chambers can be handled in the sense of a multiwell plate, as is known from laboratory operations.
  • the latter has a plurality of carrier surfaces which are arranged at an angle to one another.
  • the offset can be in one plane or spatial.
  • support surfaces can be arranged around an axis. The individual carrier surfaces can be moved into a detection position in a controlled manner while the other carrier surfaces are in a waiting position.
  • sample chambers which are closed, for example, with a separate wall, or sample carriers can have channels for supplying and / or discharging media into or out of the sample space.
  • Different media such as chemicals for clarifying and / or rinsing the sample and sample media can be fed in and out via the channels.
  • the channels are advantageously in fluid communication with pumps and media reservoirs.
  • sensors and a control unit are advantageously present.
  • the sample carrier has at least one carrier surface.
  • a circumferential wall stands on this, which encloses a parking space as a lateral boundary and, together with the sample holder, forms a hollow cylinder which is open on one of its end faces.
  • the sample chamber is arranged on the position, the hollow cylinder can be filled with an immersion medium into which a lens can be immersed.
  • This additional chamber also called “dipping chamber” for simplicity, can also have a different cross-section in other versions, for example rectangular or polygonal with, for example, 5, 8, 10 or 20 corners.
  • the sample chamber is arranged in a vessel, for example placed on the floor.
  • Such a design of a sample carrier with a sample chamber enables a complete separation of the optics, in particular the objective, from the aggressive media within the sample chamber despite the use of an immersion medium.
  • the immersion medium present in the hollow cylinder higher numerical apertures can be realized than would be the case with an air gap. It is advantageous if the immersion medium in the dipping chamber has the same refractive index as the sample medium. A further improvement in the imaging quality can be achieved if the immersion medium and sample medium have the same Abbe number and even the same partial dispersion.
  • the refractive index, Abbe number and / or partial dispersion are often from New or further developed media for clarification not known or only roughly known.
  • the refractive index of the immersion medium can be dynamically adjusted by mixing two or more suitable starting media. When working with a dynamically mixed immersion medium, it is advantageous if the refractive index of the wall material of the sample chamber is close to the refractive index of the sample medium and / or immersion medium.
  • the method according to the invention can be carried out by means of a device for acquiring image data with a sample chamber or with a combination of sample carrier and sample chamber.
  • the device has a light source for providing illuminating radiation along an illuminating beam path.
  • beam-shaping optics for shaping the illuminating radiation into a light sheet are provided, which cooperate with a first scanner, which is arranged in or near a pupil of the illuminating beam path and serves to deflect the illuminating radiation.
  • the device is characterized in that a second scanner that is movable about a pivot point is arranged near an intermediate image in the illumination beam path.
  • the scanning optics map the pivot point of the second scanner to an entry point of the light sheet on the outside of the sample chamber.
  • the functions of the first scanner and the second scanner consist in tracking the angle of incidence of the light sheet by the first scanner and a displacement of the light sheet by means of the second scanner.
  • the angle tracking is implemented by the first scanner, which can be a conventional galvanometric scanning mirror. Since the movement of the angle tracking does not have to be fast in the sense of a scanning movement of a laser scanning microscope (LSM), other actuators are also possible. For example, piezo actuators, DC motors or stepper motors with e.g. Spindle drive can be used.
  • LSM laser scanning microscope
  • a displacement of the light sheet is necessary in real operation of the device, for example, in order to e.g. correct aberration-related focus deviations.
  • the second scanner is used for this. In contrast to a typical scanner arrangement in an LSM, not both scanners are in one pupil of the illuminating beam path.
  • the optical path lengths in the sample medium also change. It may therefore be necessary to correct the focus along the light sheet propagation direction. Such a correction can be done, for example, by moving the illumination lens or a tube lens or by other focusing optics.
  • the first and the second scanner move in one plane, while in a classic scanner arrangement in an LSM the scan planes are orthogonal to one another.
  • a beam shape should be selected to generate the light sheet that requires lateral “smearing” by a scanning movement, this can be done by a third scanner, which - comparable to the classic LSM arrangement - is close to the first scanner.
  • Such beam shapes are, for example Sinc 3 beam or the radially symmetrical Bessel beam.
  • the first and the third scanner are therefore in such an arrangement close to the pupil.
  • the third scanner causes a rapid movement of the light sheet orthogonal to the plane of movement of the first scanner.
  • Adaptive optical elements or units can advantageously be used to correct them. Suitable adaptive Optical units are, for example, deformable mirrors, spatial light modulators (SLM) and their combinations. The use of optical auxiliary structures, for example a so-called Guide Star, is possible.
  • the adaptive optical elements can be arranged in the illumination beam path and / or in the detection beam path.
  • the invention is particularly suitable for displaying clarified and large samples such as brains of mice.
  • imaging methods that are suitable for thick, dense and scattering samples, i.e. in particular multiphoton methods (point scanner, temporal focusing)
  • lenses or imaging systems with rather moderate magnifications are advantageously used.
  • These are advantageously combined with cameras with very large numbers of pixels (“macroscope”) in order to take into account a mapping of the entire brain, for example, with as few individual images as possible.
  • the advantages of the invention lie in particular in the separation of sample medium and objective. If the sample carrier is equipped with microfluidics, i.e. channels, clearing protocols can be carried out automatically and reproducibly. It is not necessary to change the sample carrier or the sample chamber between the clarification and imaging steps.
  • the sample chamber according to the invention can be integrated in a “lab on the chip” environment. In addition to the automated execution of clarification protocols and image acquisition, storage of the sample with controlled media exchange is also possible.
  • Figure 1 is a schematic representation of an embodiment of a sample chamber according to the prior art.
  • FIG. 2 shows a schematic illustration of a first exemplary embodiment of a sample chamber according to the invention in a sectional illustration (FIG. 2a) and a top view from below (FIG. 2b);
  • FIG. 3 shows a schematic illustration of an exemplary embodiment of a sample chamber according to the invention and a sample carrier
  • FIG. 4 shows a schematic illustration of a first embodiment of the method according to the invention, with FIG. 4a capturing image data in a first angular relative position and a first Z relative position;
  • FIG. 4b shows the acquisition of image data in a second angular relative position and a second Z relative position and
  • FIG. 4c shows the acquisition of image data in the second angular relative position and a third Z relative position;
  • 5a to 5c show a schematic illustration of a sequential detection of z-stacks at different angular relative positions and a resulting covering of the sample with a number of z-stacks; 6 shows a schematic illustration of a coordinate transformation of a z stack into a horizontally oriented coordinate system;
  • FIG. 7 shows a schematic illustration of a coordinate transformation of a z stack into a spherical coordinate system
  • FIG. 8 shows a schematic illustration of an exemplary embodiment of an imaging system with the possibility of selecting different imaging methods as a function of the sample
  • FIG. 9 shows a schematic illustration of an exemplary embodiment of an optical arrangement for location and angle tracking in the case of light sheet illumination on a sample chamber according to the invention, and a schematic illustration of the angle tracking (insert figure);
  • FIG. 10 shows a schematic illustration of a first exemplary embodiment of a sample carrier with a number of sample chambers according to the invention.
  • FIG. 11 shows a schematic illustration of a second exemplary embodiment of a sample carrier with a number of sample chambers and channels according to the invention for supplying and / or discharging media.
  • the sample chamber 1 shows a sample chamber 1 known from the prior art, which encloses a sample space 2, in which a sample 3 can be positioned.
  • the sample space 2 is filled with a sample medium 4, into which a lens 5 of an imaging optics of an optical device, not shown, can be immersed.
  • the sample medium 4, which also functions as an immersion medium 14, has a first refractive index n1 and is in direct contact with the objective 5. If the sample medium 4 is a chemical or a mixture of chemical components, such as those used for clarifying the sample 3, there is a risk of damage to the objective 5 due to their often aggressive properties.
  • the sample space 2 is enclosed on three sides by a wall 6 which in the prior art is essentially formed from flat partial surfaces, the partial surfaces not having to be optically effective, for example not transparent.
  • the sample 3 can be illuminated with an illuminating radiation along an illuminating beam path 7 coinciding with an optical axis OA of the objective 5.
  • a detection radiation caused in the sample 3 is detected with the objective 5 along a detection axis DA detection beam path 8, the optical axis OA and the detection axis DA coinciding.
  • a first exemplary embodiment of a sample chamber 1 according to the invention is shown in a side sectional view in FIG. 2a.
  • the sample space 2 is delimited by a wall 6, an outer side 6.1 of the wall 6 having the shape of a spherical section (FIG. 2a).
  • the spherical section covers a circular surface 9 with a center point 10 (see also FIG. 2b).
  • the sample space 2 is delimited by a further wall 11, which extends in the plane of the circular surface 9.
  • the sample chamber 1 is provided so that when it is used as intended, the Illumination beam path 7 through the outside 6.1 into the sample space 2 and the detection beam path 8 likewise through the outside 6.1. Illumination beam path 7 and detection beam path 8 can coincide or, as symbolized in FIG. 2a, be separated from one another.
  • the spherical sample chamber 1 encloses the sample 3, for example a brain to be imaged, as closely as possible.
  • the sample medium 4 used for clarification is located in the sample chamber 1. Detection of detection radiation can take place using an objective 5 designed as an air objective (see, for example, FIGS. 4a to 4c).
  • the sample chamber 1 is placed on a carrier surface 12 of a sample carrier 13 and surrounded by a wall 15 in the form of a hollow cylinder standing on the carrier surface 12 (FIG. 3).
  • Sample carriers 13 and carrier surface 12 can also form an open vessel together in further versions.
  • the wall 15 or cylinder wall can have a different, for example an angular or oval, shape in plan view.
  • An existing space 16 above the sample chamber 1 is filled with air or with an immersion medium 14, in which the objective 5 is immersed or can be immersed.
  • the immersion medium 14 has a second refractive index n2 and serves to increase the numerical aperture (NA) of the objective 5.
  • NA numerical aperture
  • a non-aggressive chemical compound or such a mixture of substances can be selected as the immersion medium 14, which is also usually inexpensive.
  • the first and second refractive indices nl, n2 and possibly also their Abbe number vl or v2 can be chosen to be approximate or identical.
  • the thickness of the wall 6 is then as small as possible and / or the wall 6 consists of a material whose refractive index is close to the refractive index n1 or n2.
  • the immersion medium 14 can also be mixed from two or more suitable components and so the refractive indices n1 and n2 can be matched to one another as best as possible.
  • Such an adaptation of the composition of the immersion medium 14 can also take place dynamically in further embodiments of the invention, in that components of the immersion mixture 14 or an already mixed immersion medium 14 are supplied to the room 16 in a controlled manner via supply and discharge lines (not shown). In this way, such a “dipping chamber” can be flexibly adapted to different operating conditions.
  • a sample chamber 1 is brought into a first angular relative position. This means that it is inclined by a certain angle in relation to a reference coordinate system, for example the Cartesian coordinate system shown with the axes x, y and z orthogonal to one another.
  • a reference coordinate system for example the Cartesian coordinate system shown with the axes x, y and z orthogonal to one another.
  • the circular surface 9 runs parallel to a plane spanned by the axes x and y.
  • illuminating radiation is irradiated into the sample space 2 through the outside 6.1 at an angle of incidence a.
  • the illuminating radiation is refracted when it passes through the wall 6 and then runs approximately horizontally through the sample space 2 and the sample 3.
  • the positioning of the refracted section of the illuminating beam path 7 along the Z axis z gives one first z relative position.
  • the objective 5 is focused on the broken section of the illuminating beam path 7, which can in particular be designed as a light sheet 17.
  • An optical axis OA of the objective 5 used for detecting detection radiation is directed perpendicular to the broken section of the illuminating beam path 7 and through the center 10. Using the lens 5, image data of a part of the illuminated areas, in particular an illuminated plane, of the sample 3 can now be acquired.
  • a so-called z-stack 18 (see FIG. 5) of object planes in different z-relative positions is recorded (symbolized by the vertical double arrow) and subsequently assembled (see also FIG. 5). Any necessary corrections to the angle of incidence a of the illuminating beam path 7 are explained with reference to FIG. 9.
  • the sample chamber 1 is therefore pivoted and / or rotated around the center 10, as shown in FIGS. 4b and 4c.
  • the sample chamber 1 in FIG. 4b is brought into a further angular relative position and a further z relative position.
  • a z-stack 18 can again be acquired (FIG. 4c), stored and finally assembled into a representation of the sample 3.
  • corresponding relative angular positions can be freely selected and z-stacks 18 can be acquired.
  • a first z stack 18 is detected along a detection beam path 8 in the direction of the Z axis z and stored together with data on the respective angular relative position and z relative position (FIG. 5a).
  • the sample chamber 1 is then pivoted and / or rotated about the center point 10 by a certain angle.
  • a z-stack 18 of image data is again acquired from the sample 3 thus brought into a second or a further angular relative position (FIG. 5b).
  • Occurring overlaps of the individual z-stacks 18 can be used to improve the data quality, for example by carrying out an evaluation using a multiview fusion algorithm. Remaining aberrations can be corrected using adaptive optical elements (see, for example, FIG. 8).
  • the image data obtained by means of the method according to the invention can be represented in different coordinates. 6 and 7, a transformation of a tilted z-stack 18 into a horizontal orientation (FIG. 6) or a tilted z-stack into spherical coordinates (FIG. 7) is shown only as a representative.
  • a weighted interpolation can be used to transform the coordinates.
  • detected intensity values l x, y, z of four points of a z-stack 18 are shown, which lead to a transformed intensity value l X ' y , z - a point (coordinate) of the horizontal (FIG. 6) or the spherical coordinate system (FIG. 7) be interpolated.
  • a schematic representation of an exemplary embodiment of an imaging system with the possibility of selecting different imaging methods depending on the sample 3 comprises a beam shaping unit 19 for providing and shaping an illuminating radiation to form a light sheet 17 and / or a laser scanning microscope LSM (hereinafter also briefly : LSM).
  • An adaptive optical unit 20 can optionally be present in the illumination beam path 7 of the beam shaping unit 19 and / or the LSM.
  • at least one optical lens 23 and a beam splitter 21 are arranged in the illumination beam path 7 of the LSM.
  • the illuminating radiation is directed to the objective 5 by the action of the beam splitter 21 and is radiated into the sample space 2 of the sample chamber 1.
  • a detection radiation produced in the sample 3 passes through the objective 5 and the beam splitter 21 which is transparent to the detection radiation along the detection beam path 8 to a tube lens 22 and further to a detector 25, for example a camera.
  • the beam splitter 21 can optionally be inserted or swiveled into the illumination beam path 7 and / or the detection beam path 8.
  • the illumination of the sample 3 can optionally take place by means of a light sheet 17, by means of a point scanner of an LSM or by means of a multipoint scanner of an LSM.
  • the LSM or the beam shaping unit 19 serve as a light source.
  • the detection radiation can be recorded confocal, in the wide field or plenoptically.
  • the latter variant can be carried out using a microlens array 26.
  • a correspondingly controllable adaptive optical unit 20 can be arranged in the detection beam path 8.
  • the microlens array 26 can optionally be inserted or swiveled into the detection beam path 8 using appropriate adjusting devices (not shown).
  • the sample chamber 1 can be pivoted about each of the axes X, Y and Z by means of a sample table 27 which can be driven and displaced along these axes. Rotation around the Z axis is possible.
  • the sample chamber 1 is pivoted about the center 10 (see FIGS. 4a to 5c) and optionally rotated about an axis running through the center 10 and in the direction of the Z axis Z (see, for example, FIG. 4a to 5).
  • the objective 5 is designed to be positioned in the direction of the Z-axis z by means of a controllable drive 30.
  • the sample chamber 1 can be shifted in a controlled manner along the axes x, y and in particular in the direction of the Z axis z by means of the sample table 27, in order to position the sample chamber 1 relative to the illumination beam path 7, for example.
  • the possibility of movement along the Z axis z represents an option for the detection of the z stack 18.
  • the angle relative positions and / or the z relative positions can be set by a corresponding movement of the objective 5. It is also possible that, for example, the settings of the angular relative positions and / or the z relative positions are set by combinations of the movements of objective 5 and sample table 27.
  • a control unit 28 for example a computer or a correspondingly configured part of a computer, is provided to control the sample table 27 and the various actuating devices or at least one drive 30, and with the sample table 27, the drives 30, in a manner suitable for transmitting data and control commands (only one shown by way of example) and optionally connected to the camera 25 (shown only indicated).
  • the z-stacks 18 can be moved as a z-relative position by moving the sample 3 and / or by moving the lens 5 and changing the respective focal plane be included.
  • the rotation of the sample chamber 1 described above has no optical effect if the pivot point and center point 10 coincide (see, for example, FIG. 5).
  • a relocation may be necessary to correct aberration-related focus shifts that occur in practice.
  • angular tracking and relocation are possible with a device shown in FIG. 9.
  • FIG. 9 various angles of a sample chamber 1, an illumination beam path 7 and a light sheet 17 are shown schematically.
  • the sample chamber 1 and the illumination beam path 7 are shown with continuous solid lines in a first Z-relative position and with interrupted solid lines in a second Z-relative position.
  • the illuminating radiation passes through a medium with the first refractive index na.
  • the sample chamber 1 with the sample medium 4 has a second refractive index nb with nb> na.
  • the respective angle of incidence a n is measured between the respective illumination beam path 7 and a normal on the outside 6.1.
  • the wall 6, in particular its outside 6.1, is designed as a spherical section with a radius R, an extension of the normal extends through the center 10 and closes an angle with another wall 11 functioning as the bottom of the sample chamber 1 or with the plane of the circular surface 9 gh a.
  • the illuminating radiation is directed along the illuminating beam path 7 at a first angle of incidence ai onto the outside 6.1 of the spherically shaped wall 6 of the sample chamber 1.
  • the extension of the normal occurs at an angle y1 through the center 10.
  • the illuminating beam path 7 is refracted in accordance with the differences in the refractive indices na and nb.
  • the angle of incidence al is selected such that the broken section of the illuminating beam path 7 runs parallel to the plane of the circular surface 9 and image data can be acquired, for example, by means of a lens 5 along the detection axis DA.
  • the broken section of the illuminating beam path 7 forms an angle ⁇ 1 with the extension of the normal.
  • image data can be acquired with the focus position of the objective 5 remaining the same if an angle of incidence a2 is set.
  • the extension of the normal at an angle g2 now occurs through the center 10.
  • the broken section of the illuminating beam path 7 forms an angle ⁇ 2 with the extension of the normal, where ⁇ 1> 32.
  • the optical arrangement for tracking the position and angle in the case of light sheet illumination on a sample chamber according to the invention in accordance with the illustrated exemplary embodiment has the beam shaping unit 19, in which an illuminating radiation provided by a light source (not shown in more detail) is shaped into a light sheet 17.
  • a light source not shown in more detail
  • the first scanner S1 is located in or near a pupil P of the illumination beam path 7 and is used for relocation. It is designed, for example, in the form of a galvanometric scanning mirror. An angle in the pupil P corresponds to a location in the sample 3, which is why a change in the angle of the first scanner S1 leads to a displacement of the light sheet 17 in the direction of the z-axis z.
  • a second scanner S2 is arranged between the beam shaping unit 19 and the first scanner S1. This is located near an intermediate image ZB. The two scanners S1 and S2 deflect the illumination beam path 7 in the same movement planes.
  • the pivot point of the second scanner S2 is imaged onto the outside 6.1 by means of the scanning optics 24.
  • the second scanner S2 changes an angle in the intermediate image ZB, which corresponds to a change in location in the pupil P and on the first scanner S1 and an angle in the sample 3. Since the angle is to be set shortly before sample 3, an angular deviation can be corrected accordingly by axially displacing the optical lens 23.
  • a necessary correction of the focusing along the direction of propagation of the light sheet 17 can take place, for example, by moving the objective 5, the tube lens 22 or by other focus optics.
  • a correction of the focusing may be necessary since the optical path length in the sample medium 4 is different at different Z-relative positions and therefore changes during the acquisition of a z-stack 18.
  • a third scanner S3 (not shown) can be arranged close to the pupil and, for example, close to the first scanner S1.
  • the action of the third scanner S3 causes the light sheet 17 to move rapidly perpendicular to the plane of the drawing.
  • a beam shape that requires lateral “smearing” e.g. Bessel beam
  • a plurality of sample chambers 1 can be arranged on a sample carrier 13.
  • the sample holder 13, which has a plurality of storage spaces for sample chambers 1, can be of flat design (FIG. 10).
  • a sample chamber 1 to be observed in each case is delivered to the objective 5 by a corresponding control of the sample table 27 and / or the objective 5 is delivered to the respective sample chamber 1.
  • a first z stack 18 can be detected in a first angular relative position.
  • the objective 5 can be pivoted and / or the sample carrier 13 can be pivoted around the center 10 of the sample chamber 1 currently to be detected.
  • a sample carrier 13 for a number of sample chambers 1 according to the invention, the latter has carrier surfaces 12 offset from one another, on each of which a sample chamber 1 is arranged or can be arranged.
  • the carrier surfaces 12 can be circumferential surfaces of a carousel or revolver, for example. Such an embodiment increases the accessible angular range compared to an embodiment according to FIG. 10, under which angular relative positions can be set.
  • a sample carrier 13 can have at least one channel 29 which opens at one of the parking spaces (FIG. 11).
  • the channel 29 serves for the supply and / or discharge of sample medium 4 into and from the sample space 2.
  • the sample chamber 1 is delimited in the plane of the circular surface 9 by the support surface 12 or in a further wall 11 there are openings corresponding to some or all of the channels (indicated indicated). In further versions, these openings can be equipped with a valve or a Closure may be provided to enable the sample chamber 1 to be removed from the carrier surface 12.
  • sample chamber 1 can have the wall 6 and for a closure in the plane of the circular surface 9 to be formed by a surface of the support surface 12 as a further wall 11.
  • the sample space 2 can be supplied with a sample medium 4 via the channel 29 or the channels 29.
  • the sample medium 4 can be, for example, a compound for clarifying the sample 3, a nutrient solution, a buffer or a compound for supporting the storage of the sample 3.
  • FIG. 11 shows carrier surfaces 12 offset from one another, on each of which a sample chamber 1 is placed on a parking space.
  • a support surface 12 with the sample chamber 1 provided thereon can be brought into a detection position, which in the example shown is the middle position in which the support surface 12 located in the detection position is oriented orthogonally to the optical axis OA of the objective 5.
  • the objective 5 can be pivoted relative to the sample chamber 1 and different focus planes can be captured, so that the sample chamber 1 and objective 5 can be brought into different angular relative positions and / or z relative positions with respect to one another .
  • the mutually angularly offset and angled arrangement of the support surfaces 12 enables better access to the respective sample chamber 1 to be recorded, since the respectively adjacent sample chambers 1 are swung out of the plane of the sample chamber 1 to be recorded.
  • the current alignment of the sample carrier 13 and the supply and / or discharge of media via the channels 29 are controlled by means of the control unit 28 and by means of drives 30 and / or pumps 30.
  • sample carriers 14 immersion medium

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Multimedia (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Betrieb einer Probenkammer (1) für eine mikroskopische Bildgebung. Dazu wird eine Probenkammer(1) in einem Beleuchtungsstrahlengang (7) bereitgestellt, die einen Probenraum (2) zur Positionierung einer Probe (3) umfängt und mindestens eine den Probenraum (2) begrenzende Wand (6) mit einer dem Probenraum (2) abgewandten Außenseite (6.1) aufweist. Der Beleuchtungsstrahlengang (7) ist durch die Außenseite (6.1) in den Probenraum (2) gerichtet. Eine Detektionsstrahlung wird entlang einer von dem Probenraum (2) durch die Wand (6) der Probenkammer (1) verlaufenden Detektionsachse (DA) erfasst. Erfindungsgemäß wird eine Probenkammer (1) verwendet, deren Außenseite (6.1) die Form eines Kugelabschnitts mit einer Kreisscheibe (9) als Grundfläche aufweist. Die Probenkammer (1) und die Detektionsachse (DA) werden um den Mittelpunkt (10) der Kreisscheibe (9) relativ zueinander rotiert und/oder geschwenkt, sodass unterschiedliche Winkelrelativlagen von Probenkammer (1) und Detektionsachse (DA) eingestellt und Bilddaten bei unterschiedlichen Winkelrelativlagen von Probenkammer (1) und Detektionsachse (DA) erfasst werden. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Probenkammer (1), einen Probenträger (13) mit Probenkammern (1) sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Description

Verfahren zum Betrieb einer Probenkammer für eine mikroskopische Bildgebung sowie Vorrichtung und Probenkammer
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Betrieb einer Probenkammer für eine mikroskopische Bildgebung sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Probenkammer, die insbesondere in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird.
Um Gewebe und Organe mit bildgebenden Verfahren, insbesondere mittels mikroskopischer Verfahren, ex vivo zu untersuchen, können diese chemisch so behandelt werden, dass auch tief in dem Gewebe oder dem Organ befindliche Strukturen sichtbar werden.
Dazu werden die Gewebe beziehungsweise Organe - im Weiteren verallgemeinernd als Probe bezeichnet - einer Behandlung mit bestimmten Chemikalien unterzogen, was auch als„Klären" (engl. „Clearing") bezeichnet wird. Durch Wirkung der Chemikalien werden beispielsweise vorhandene Lipide entfernt oder ersetzt, wobei beispielsweise Stützstrukturen unverändert bleiben. Die erhalten gebliebenen Strukturen können mittels Fluoreszenzmarkierungen sichtbar gemacht und abgebildet werden. Die wirksame Eindringtiefe von Mikroskopieverfahren kann beispielsweise wegen einer reduzierten Streuung einer Beleuchtungs- oder Detektionsstrahlung aufgrund auf diese Weise entfernter Lipide deutlich erhöht werden. Methoden zum„Klären" von Proben, beispielsweise von Gehirnen, sind beispielsweise aus Silvestri, L. et al. (2016): Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of biomedical optics, 21(8): 081205 oder aus Richardson, D. S. & Lichtman, J. W. (2015): Clarifying tissue Clearing. Cell, 162(2): 246-257 bekannt.
Das Klären von Proben wird insbesondere für die Untersuchung von Gehirnen eingesetzt. Dabei ist es zum Verständnis von Aufbau und Funktion des Gehirns und seiner neuronalen Strukturen wichtig, die geklärten Gehirne möglichst in ihrer Gesamtheit untersuchen zu können. Typische Proben sind dabei geklärte Gehirne von Mäusen. Deren Größe von 8 - 10 mm bedingt eine optische Eindringtiefe von mindestens etwa 10 mm.
Die zum Klären eingesetzten Chemikalien (clearing-Medien) sind teils sehr aggressiv beziehungsweise auch toxisch und oftmals teuer. Werden die im Stand der Technik üblichen Immersionsanordnungen eingesetzt, kann es zu unerwünschten Abbildungsfehlern kommen. Bildet beispielweise ein zum Klären verwendetes clearing-Medium als Probenmedium letztendlich die Immersion, dann können Aberrationen durch unbekannte beziehungsweise nicht vollständig im Objektiv kompensierte optische Eigenschaften des clearing-Mediums (Brechungsindex, Abbe-Zahl) verursacht werden. Außerdem gelangt das Objektiv mit den aggressiven und/oder toxischen Chemikalien in Kontakt, was zu Beschädigungen des Objektivs führen kann und einen erhöhten Aufwand bei der Sicherstellung der Arbeitssicherheit und des Gesundheitsschutzes sowie eine Reduzierung der Standzeiten der optischen Komponenten bedeutet.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, sowohl verfahrensseitig als auch vorrichtungsseitig eine Möglichkeit vorzuschlagen, mit der die im Stand der Technik auftretenden Nachteile verringert werden.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zum Betrieb einer Probenkammer für eine mikroskopische Bildgebung gemäß Anspruch 1, durch eine Probenkammer gemäß Anspruch 10 und eine Vorrichtung zur Erfassung von Bilddaten gemäß Anspruch 14 gelöst. Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Probenträger zur Aufnahme mindestens einer erfindungsgemäßen Probenkammer gemäß Anspruch 11.
Das Verfahren zum Betrieb einer Probenkammer für eine mikroskopische Bildgebung, umfasst die Schritte des Bereitstellens einer Probenkammer in einem Beleuchtungsstrahlengang und des Erfassens einer Detektionsstrahlung. Die verwendete Probenkammer umfängt einen Probenraum, in dem eine Probe positioniert werden kann beziehungsweise positioniert wird. Die Probenkammer weist mindestens eine den Probenraum begrenzende Wand mit einer dem Probenraum abgewandten Außenseite auf. Außerdem ist der Beleuchtungsstrahlengang durch die Außenseite in den Probenraum gerichtet. Der durch die Außenseite in den Probenraum gerichtete Abschnitt des Beleuchtungsstrahlengangs wird auch als Beleuchtungsachse bezeichnet und verstanden.
Im Schritt des Erfassens der Detektionsstrahlung wird eine mittels einer entlang der Beleuchtungsachse in den Probenraum gerichteten Beleuchtungsstrahlung bewirkte Detektionsstrahlung entlang einer von dem Probenraum durch die Wand der Probenkammer verlaufenden Detektionsachse erfasst. Die Detektionsachse ist Teil eines Detektionsstrahlengangs.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Probenkammer verwendet wird, deren Außenseite die Form eines Kugelabschnitts mit einer Kreisscheibe als Grundfläche aufweist, was nachfolgend auch als sphärische Form bezeichnet wird. Außerdem werden die Probenkammer und die Detektionsachse um den Mittelpunkt der Kreisscheibe relativ zueinander rotiert und/oder geschwenkt, sodass unterschiedliche Winkelrelativlagen von Probenkammer und Detektionsachse eingestellt werden. Bei unterschiedlichen Winkelrelativlagen von Probenkammer und Detektionsachse werden Bilddaten erfasst. Die Detektionsachse verläuft dabei immer durch die sphärische Außenseite.
Der Kern der Erfindung besteht in der Verwendung einer Probenkammer mit einer sphärischen Außenseite, wie diese weiter unten noch ausführlicher beschrieben wird. Die Gestaltung wenigstens einer Außenseite der Probenkammer als eine Sphäre (Kugelabschnitt) sowie die Bewegung der Probenkammer um den Mittelpunkt der Kreisscheibe ermöglicht vorteilhaft die Einstellung einer Vielzahl unterschiedlicher Winkelrelativlagen. Gleichzeitig wird ein Winkel der Detektionsachse relativ zur Außenseite konstant gehalten. Beispielsweise fällt die Detektionsachse immer mit einer Normalen der Außenseite zusammen, unabhängig welche Winkelrelativlage eingestellt ist. Diese Konstanz der Orientierung der Detektionsachse wird nur durch die tatsächliche Ausprägung der Probenkammer, insbesondere durch den überdeckten Winkelbereich der Außenseite und die Bogenlänge der Außenseite begrenzt. Äquivalent sind andere Formen der Grundfläche der Probenkammer als der einer Kreisscheibe, beispielsweise als Polygon oder Freiform.
Die Verwendung der Probenkammer erlaubt vorteilhaft eine Trennung eines für die Erfassung der Detektionsstrahlung verwendeten Objektivs von dem Probenmedium.
In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in einer jeweiligen Winkelrelativlage Bilddatenerfassungen in mindestens zwei unterschiedlichen z-Relativlagen ausgeführt. Dabei wird eine jeweilige Z-Relativlage eingestellt, indem die Probenkammer und/oder eine Fokusebene einer abbildendenden Optik entlang der Detektionsachse relativ zueinander verschoben werden. Die Richtung der Detektionsachse wird als z-Richtung (z-Achse) bezeichnet. Eine z-Relativlage bezeichnet eine Position der Fokusebene entlang der Detektionsachse. Ein z-Stapel von Bilddaten wird unter einer Winkelrelativlage und einer Anzahl von z-Relativlagen erfasst.
Werden Bilddaten in einer ersten z-Relativlage erfasst, wird ein Bild der Fokusebene (Field of View; FoV) erfasst und abgebildet. Werden unter derselben Winkelrelativlage Bilddaten in zwei verschiedenen z-Relativlagen erfasst, wird ein Probenvolumen abgebildet, wenn sich die beiden Fokusebenen in z-Richtung nicht vollständig überlappen oder aneinander angrenzen (Volume of View; VoV). Wird in dieser Weise ein Stapel (z-Stapel) von Bilddaten aneinander angrenzender beziehungsweise einander überlappender Fokusebenen erfasst, kann ein (Volumen-)Ausschnitt der Probe entlang der Detektionsachse und unter der betreffenden Winkelrelativlage vollständig erfasst werden. Um jeweils nur eine Fokusebene zu beleuchten und unerwünschte Bildinformationen von außerhalb der Fokusebene zu reduzieren, wird vorteilhaft die Beleuchtungsstrahlung zu einem Lichtblatt geformt und in den Probenraum eingestrahlt. Die Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt ist insbesondere für große und streuende Proben vorteilhaft.
Zur Erzeugung des Lichtblatts wird die Beleuchtungsstrahlung vorteilhaft in Form eines nicht- diffraktiven Strahls verwendet. Ein solcher nicht-diffraktiver Strahl ist beispielsweise ein mittels Sinc- Filter hinsichtlich seines Frequenzspektrums limitierter Strahl, wie er in der DE 10 2012 013 163 Al beschrieben wird (auch als Sinc3-Strahl bezeichnet). Zur Erzeugung eines Lichtblatts muss der Sinc3- Strahl nicht lateral gescannt werden. Ein laterales Scannen ist jedoch bei weiteren verwendbaren nicht-diffraktiven Strahlen wie zum Beispiel einem Mathieu-Strahl oder einem Besselstrahl erforderlich. Insbesondere mit einem Sinc3-Strahl können potenziell Lichtblätter mit einer geringen Dicken in Z- Richtung erzeugt werden. Der Vorteil eines dünnen, mit einer nicht-diffraktiven Strahlform erzeugten Lichtblatts besteht in einer nahezu isotropen System-PSF (Punktbildverwaschungsfunktion; point spread function; PSF). Eine solche isotrope System-PSF zeigt in allen drei Raumrichtungen eine ähnliche Auflösung, was wiederum für eine mögliche Koordinatentransformation vorteilhaft ist.
Weitere zur Erzeugung des Lichtblatts verwendbare nicht-diffraktive Strahlen sind insbesondere Airy- Strahlen, zirkuläre Airy-Strahlen [circular Airy-beam), kohärente Besselstrahlen (coherent Bessel-beam; Gao, L. et al. (2012), Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens; Cell 151: 1370 - 1385] und strukturierte Lichtblätter [lattice light sheet; Chen, Bi-Chang, et al. (2014), Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution; Science 346: 1257998]
Die Erzeugung eines Lichtblatts mit einer bekannten Strahlform, zum Beispiel einem gescannten oder mittels Zylinderoptik geformten Gauß-Strahl, ist alternativ ebenfalls möglich. Allerdings können dann nicht die Vorteile nicht-diffraktiver Strahlformen genutzt werden.
Sind die Brechungsindizes der Medien in der Probenkammer und außerhalb der Probenkammer voneinander verschieden, dann muss die Brechung des Lichtblatts an der Wand der sphärischen Probenkammer berücksichtigt werden. Dies trifft insbesondere dann zu, wenn Bilddaten in unterschiedlichen z-Relativlagen erfasst werden. Dabei spielt es zunächst keine Rolle, ob die Probenkammer bewegt wird oder das Objektiv. Der Einstrahlwinkel des Lichtblatts wird dabei als Funktion der z-Relativlage (z-Position) verändert. Als Einstrahlwinkel wird der Winkel zwischen dem Beleuchtungsstrahl und einer Normalen des Auftreffpunkts des Beleuchtungsstrahls auf der Außenseite verstanden.
Der Einstrahlwinkel kann anhand der Beziehung a(z) = ArcSin ((nb/na*R)z) angepasst werden, wobei na der Brechungsindex eines Mediums außerhalb der Probenkammer; nb der Brechungsindex eines Mediums innerhalb der Probenkammer, R der Radius des Kugelabschnitts der Außenseite und z die jeweilige z-Position entlang der Detektionsachse sind.
Mittels der oben beschriebenen Verfahrensausgestaltung kann ein Anteil des Volumens der Probe abgebildet werden. Um einen größeren Volumenanteil der Probe oder die Probe als Ganzes zu erfassen, werden unter verschiedenen Winkelrelativlagen von Probenkammer und Detektionsachse Bilddaten von an einander angrenzenden oder einander überlappenden Teilbereichen der Probe als z-Stapel erfasst. Dazu wird die Winkelrelativlage gesteuert so verändert, dass beispielsweise nach einer abgeschlossenen Erfassung eines z-Stapels eine weitere Winkelrelativlage eingestellt und ein weiterer z-Stapel erfasst wird. Für unterschiedliche z-Stapel können Parameter wie Fokuslage, Einstrahlwinkel und Lichtblattposition als Lookup-Tabellen hinterlegt werden. Aufgrund der Schwenkbewegung und/oder Rotation überlappen die erfassten Bereiche der Probe zwangsläufig, wenn die Probe weitgehend oder vollständig erfasst wird (siehe auch Fig. 5). Diese teilweise Redundanz der Bilddaten kann genutzt werden, um Abbildungsfehler zu reduzieren und die Qualität der Bilddaten zu erhöhen. So können vorteilhaft Aberrationen sowie Streuungen, die mit zunehmender Probentiefe ebenfalls zunehmen, reduziert werden, indem zum Beispiel Bilddaten sich überlappender Teilbereiche der Probe mittels eines Multi-View-Fusions-Algorithmus ausgewertet und Bildfehler reduziert werden.
Die Verwendung eines Lichtblatts lässt sich vorteilhaft mit einer plenoptischen Detektion oder Lichtfeld-Detektion kombinieren [z. B. Prevedel, R. et al. (2014): Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature methods, 11: 727] Bei Nutzung einer plenoptischen Detektion kann ein dickeres und längeres Lichtblatt erzeugt und eingestrahlt werden. Die Lichtfeld-Detektion kann dazu genutzt werden, aus der zusätzlich vorhandenen Winkelinformation mit einer Belichtung ein Teil der Probe auch in z-Richtung entlang der Dicke des Lichtblatts zu rekonstruieren. So kann die erforderliche Gesamtaufnahmezeit deutlich reduziert werden, da zusätzlich zur lateralen Parallelisierung (Weitfeld) auch entlang der Detektionsachse parallelisiert wird (Plenoptik). Dabei wird das Problem der außerfokalen Hintergrundfluoreszenz, die die plenoptische Rekonstruktion erschwert, durch die Lichtblattbeleuchtung vorteilhaft verringert.
Alternativ zu einer Beleuchtung der Probe beziehungsweise der Probenkammer mit einem Lichtblatt kann die Beleuchtung mittels eines Punkt- oder Multipunktscanners erfolgen. Die Detektion der Bilddaten kann konfokal, im Weitfeld oder mittels plenoptischer Detektion (siehe dazu weiter unten) erfolgen.
Die Probenkammer ist für die Verwendung auf dem Gebiet der Mikroskopie ausgelegt. Sie umfängt einen Probenraum zur Positionierung einer Probe und weist mindestens eine den Probenraum begrenzende Wand mit einer dem Probenraum abgewandten Außenseite auf.
Gekennzeichnet ist die Probenkammer dadurch, dass die Außenseite der Wand die Form eines Kugelabschnitts mit einer Kreisscheibe als Grundfläche aufweist. Außerdem ist eine Probenhalterung zur Halterung der Probe in der Ebene der Kreisscheibe vorhanden.
In einer vorteilhaften Ausführung der Probenkammer überdeckt der Kugelabschnitt einen Winkelbereich von mindestens 90°, bevorzugt aber mindestens 120°. Gut für die mikroskopischen Untersuchungen geklärter Proben eignen sich Probenkammern mit einem überdeckten Winkelbereich von mindestens 150°, insbesondere 180°. In weiteren Ausführungen kann der durch den Kugelabschnitt überdeckte Winkelbereich auch mehr als 180°, beispielsweise 210°, 240° oder 270° betragen.
Die Probenkammer erlaubt vorteilhaft die Positionierung einer Probe mit einer Ausdehnung in jeder Raumrichtung von mindestens 3 mm, beispielsweise mindestens 5 oder 10 mm.
Vorteilhaft ist die Probenkammer mit einer weiteren Wand dicht verschließbar, sodass beispielsweise ein Probenmedium in der Probenkammer gehalten wird und nicht ungewollt aus dieser austreten kann.
Diese weitere Wand kann eine separate Wand sein und zugleich als Probenhalterung dienen. Dazu erstreckt sich eine Innenseite der weiteren Wand in der Ebene der Kreisfläche. Die Probenhalterung in Form einer weiteren Wand kann in weiteren Ausführungsformen auch ein Probenträger mit mindestens einer Trägerfläche sein. Auf einer Trägerfläche ist mindestens ein Stellplatz vorhanden, auf den eine Probenkammer angeordnet, beispielsweise abgestellt, aufgesteckt oder in anderer Weise befestigt werden kann. Ein Stellplatz kann beispielsweise eine Struktur wie eine Erhebung und/oder eine ringförmige Vertiefung aufweisen. Die Probenkammer kann über die Erhebung gestülpt werden und wird durch diese an dem Stellplatz gehalten. Eine Vertiefung kann ebenfalls eine seitliche Führung für die Probenkammer darstellen. Die Vertiefung kann zudem eine Dichtung enthalten oder eine solche aufnehmen, sodass die Probenkammer flüssigkeitsdicht verschlossen wird. Ein Dichtwirkung kann in weiteren Ausführungen erreicht werden, indem die Oberflächen der in die Vertiefung gestellten Bereiche der Probenkammer und/oder die Oberfläche der Vertiefung eine hohe Passgenauigkeit zueinander aufweisen und beispielsweise durch Adhäsionskräfte oder Kapillarkräfte der Oberflächen oder eines dazwischen befindlichen Flüssigkeitsfilms abgedichtet werden.
Um eine automatisierte Flandhabung insbesondere einer größeren Anzahl von Proben zu erleichtern, kann ein Probenträger mindestens zwei auf dem Probenträger angeordnete Probenkammern aufweisen. Ein solcher Probenträger mit Probenkammern lässt sich im Sinne einer Multiwellplatte handhaben, wie diese aus dem Laborbetrieb bekannt sind.
In weiteren Ausführungen des Probenträgers hat dieser mehrere Trägerflächen, die gegeneinander winkelversetzt angeordnet sind. Der Versatz kann dabei in einer Ebene oder räumlich sein. Beispielsweise können Trägerflächen um eine Achse angeordnet sein. Die einzelnen Trägerflächen können gesteuert in eine Erfassungsposition bewegt werden, während sich die jeweils anderen Trägerflächen in einer Warteposition befinden.
Einzelne Probenkammern, die beispielsweise mit einer separaten Wand verschlossen sind oder aber Probenträger können Kanäle zur Zu-und/oder Abführung von Medien in beziehungsweise aus dem Probenraum aufweisen. Über die Kanäle können unterschiedliche Medien wie Chemikalien zum Klären und/oder Spülen der Probe sowie Probenmedien zu- und abgeführt werden. Um dies in einer gesteuerten Weise geschehen zu lassen, stehen die Kanäle vorteilhaft mit Pumpen und Medienreservoiren in strömungstechnischer Verbindung. Zudem sind vorteilhaft Sensoren und eine Steuerungseinheit vorhanden.
Aberrationen treten beispielsweise infolge von Medien unterschiedlicher Brechungsindizes auf, die von der Beleuchtungsstrahlung und/oder der Detektionsstrahlung durchlaufen werden. In einer möglichen Ausführung des Probenträgers weist dieser wenigstens eine Trägerfläche auf. Auf dieser steht eine umlaufende Wand auf, die einen Stellplatz als eine seitliche Begrenzung umfängt und zusammen mit dem Probenträger einen an einer seiner Stirnflächen offenen Hohlzylinder bildet. Ist die Probenkammer auf dem Stellplatz angeordnet, kann der Hohlzylinder mit einem Immersionsmedium gefüllt werden, in das ein Objektiv eingetaucht werden kann. Diese vereinfachend auch als„Dipping-Kammer" bezeichnete zusätzliche Kammer kann in weiteren Ausführungen auch einen anderen Querschnitt, beispielsweise rechteckig oder vieleckig mit beispielsweise 5, 8, 10 oder 20 Ecken, aufweisen. In einer weiteren Ausführungsmöglichkeit ist die Probenkammer in einem Gefäß angeordnet, beispielsweise auf dessen Boden gestellt.
Eine solche Ausführung eines Probenträgers mit Probenkammer ermöglicht eine komplette Trennung der Optik, insbesondere des Objektivs, von den aggressiven Medien innerhalb der Probenkammer trotz Verwendung eines Immersionsmediums. Mittels dem in dem Hohlzylinder vorhandenem Immersionsmedium können höhere numerische Aperturen realisiert werden, als dies mit einem Luftspalt der Fall wäre. Es ist von Vorteil, wenn das Immersionsmedium in der Dipping-Kammer den gleichen Brechungsindex wie das Probenmedium besitzt. Eine weitere Verbesserung der Abbildungsqualität kann erreicht werden, wenn Immersionsmedium und Probenmedium die gleiche Abbe-Zahl und sogar die gleiche Teildispersion aufweisen.
Eine exakte Anpassung der Brechungsindizes beziehungsweise der Abbe-Zahl und der Teildispersion ist in der Praxis schwierig. So sind oftmals der Brechungsindex, Abbe-Zahl und/oder Teildispersion von neu- oder weiterentwickelten Medien zum Klären nicht oder nur ungefähr bekannt. Der Brechungsindex des Immersionsmediums kann durch Mischen von zwei oder mehr geeigneten Ausgangsmedien dynamisch angepasst werden. Wenn mit einem dynamisch gemischten Immersionsmedium gearbeitet wird, ist es vorteilhaft, wenn der Brechungsindex des Wandmaterials der Probenkammer nahe am Brechungsindex von Probenmedium und/oder Immersionsmedium liegt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mittels einer Vorrichtung zur Erfassung von Bilddaten mit einer Probenkammer oder mit einer Kombination von Probenträger und Probenkammer ausgeführt werden. Die Vorrichtung weist eine Lichtquelle zum Bereitstellen einer Beleuchtungsstrahlung entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs auf. Außerdem ist eine strahlformende Optik zur Formung der Beleuchtungsstrahlung zu einem Lichtblatt vorhanden, die mit einem ersten Scanner zusammenwirkt, der in oder nahe einer Pupille des Beleuchtungsstrahlengangs angeordnet ist und zur Auslenkung der Beleuchtungsstrahlung dient.
Gekennzeichnet ist die Vorrichtung neben der Nutzung einer erfindungsgemäßen Probenkammer dadurch, dass ein um einen Pivotpunkt beweglicher zweiter Scanner nahe eines Zwischenbildes im Beleuchtungsstrahlengang angeordnet ist. Die Scanoptik bildet den Pivotpunkt des zweiten Scanners auf einen Eintrittspunkt des Lichtblatts auf der Außenseite der Probenkammer ab.
Die Funktionen des ersten Scanners und des zweiten Scanners bestehen in der Nachführung des Einfallswinkels des Lichtblatts durch den ersten Scanner und einer Ortsverlagerung des Lichtblatts mittels des zweiten Scanners.
Die Winkelnachführung wird durch den ersten Scanner realisiert, der ein üblicher galvanometrischer Scanspiegel sein kann. Da die Bewegung der Winkelnachführung nicht schnell im Sinne einer Scanbewegung eines Laserscanningmikroskops (LSM) sein muss, sind auch andere Aktoren möglich. Beispielsweise können Piezo-Aktoren, Gleichstrommotoren oder Schrittmotoren mit z.B. Spindeltrieb verwendet sein.
Eine Ortsverlagerung des Lichtblatts ist im realen Betrieb der Vorrichtung beispielsweise erforderlich, um z.B. aberrationsbedingte Fokusabweichungen zu korrigieren. Dazu dient der zweite Scanner. Im Gegensatz zu einer typischen Scanneranordnung bei einem LSM stehen nicht beide Scanner in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlengangs.
Werden Bilddaten unter verschiedenen z-Relativlagen erfasst, ändern sich auch die optischen Weglängen im Probenmedium. Es kann daher erforderlich sein, die Fokussierung entlang der Lichtblatt-Ausbreitungsrichtung zu korrigieren. Eine solche Korrektur kann zum Beispiel durch Verschieben des Beleuchtungsobjektivs oder einer Tubuslinse oder durch andere Fokussieroptiken erfolgen. Der erste und der zweite Scanner bewegen sich in einer Ebene, während in einer klassischen Scanner-Anordnung in einem LSM die Scanebenen orthogonal zueinander liegen.
Sollte zur Erzeugung des Lichtblatts eine Strahlform gewählt werden, die ein laterales „Verschmieren" durch eine Scanbewegung erfordert, kann dies durch einen dritten Scanner erfolgen, der - vergleichbar zur klassischen LSM-Anordnung - dicht bei dem ersten Scanner steht. Solche Strahlformen sind beispielsweise der Sinc3-Strahl oder der radialsymmetrische Bessel-Strahl. Der erste und der dritte Scanner stehen daher in einer solchen Anordnung pupillennah. Der dritte Scanner bewirkt eine schnelle Bewegung des Lichtblatts orthogonal zur Bewegungsebene des ersten Scanners.
Die für eine Kartographierung von z. B. Neuronen in einem vollständigen Mäusehirn von mehreren Millimetern Größe in der Regel erforderlichen Eindringtiefen führen auch bei bestmöglichen Clearing- Protokollen und zusätzlicher Anpassung der Brechungsindizes zu Aberrationen. Zu deren Korrektur können vorteilhaft adaptive optische Elemente oder Einheiten eingesetzt werden. Geeignete adaptive optische Einheiten sind beispielsweise deformierbare Spiegel, räumliche Lichtmodulatoren (spatial light modulator, SLM) und deren Kombinationen. Die Verwendung von optischen Hilfsstrukturen, beispielsweise eines sogenannten Guide Star, ist möglich. Die adaptiven optischen Elemente können im Beleuchtungsstrahlengang und/oder im Detektionsstrahlengang angeordnet sein.
Die Erfindung eignet sich insbesondere zur Darstellung geklärter und großer Proben wie Gehirnen von Mäusen. Neben dem Einsatz von Abbildungsverfahren, die für dicke, dichte und streuende Proben geeignet sind, also insbesondere Multiphotonen-Verfahren (Punktscanner, temporal focussing), werden vorteilhaft Objektive beziehungsweise Abbildungssysteme mit eher moderaten Vergrößerungen verwendet. Diese werden vorteilhaft mit Kameras mit sehr großen Pixelzahlen („Makroskop") kombiniert, um einer Kartographierung beispielsweise des gesamten Hirns mit möglichst wenigen Einzelaufnahmen Rechnung zu tragen.
Die Vorteile der Erfindung liegen insbesondere in einer Trennung von Probenmedium und Objektiv. Ist der Probenträger mit einer Mikrofluidik, also mit Kanälen, versehen, können Clearing-Protokolle automatisch und reproduzierbar ausgeführt werden. Ein Wechsel des Probenträgers bzw. der Probenkammer zwischen den Schritten des Klärens und der Abbildung ist nicht erforderlich. Die erfindungsgemäße Probenkammer kann in eine„Lab on the chip"-Umgebung integriert werden. Dabei ist neben der automatisierten Ausführung von Klärungsprotokollen und Bildererfassung auch eine Lagerung der Probe bei gesteuerten Medienaustausch möglich.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer Probenkammer gemäß dem Stand der Technik;
Fig. 2 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Probenkammer in einer Schnittdarstellung (Fig. 2a) und einer Draufsicht von unten (Fig. 2b);
Fig. 3 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Probenkammer und eines Probenträgers;
Fig. 4 eine schematische Darstellung einer ersten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei in Fig. 4a die Erfassung von Bilddaten in einer ersten Winkelrelativlage und einer ersten Z- Relativlage; in Fig. 4b die Erfassung von Bilddaten in einer zweiten Winkelrelativlage und einer zweiten Z-Relativlage und Fig. 4c die Erfassung von Bilddaten in der zweiten Winkelrelativlage und einer dritten Z-Relativlage gezeigt ist;
Fig. 5a bis 5c eine schematische Darstellung einer sequentiellen Erfassung von z-Stapeln unter verschiedenen Winkelrelativlagen und eine resultierende Überdeckung der Probe mit einer Anzahl von z-Stapeln; Fig. 6 eine schematische Darstellung einer Koordinatentransformation eines z-Stapels in ein horizontal ausgerichtetes Koordinatensystem;
Fig. 7 eine schematische Darstellung einer Koordinatentransformation eines z-Stapels in ein Kugelkoordinatensystem;
Fig. 8 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines abbildenden Systems mit der Möglichkeit der Wahl unterschiedlicher Abbildungsverfahren in Abhängigkeit von der Probe;
Fig. 9 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer optischen Anordnung zur Orts- und Winkelnachführung bei einer Lichtblattbeleuchtung an einer erfindungsgemäßen Probenkammer sowie eine schematische Darstellung der Winkelnachführung (Einschubfigur);
Fig. 10 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines Probenträgers mit einer Anzahl erfindungsgemäßer Probenkammern, und
Fig. 11 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines Probenträgers mit einer Anzahl erfindungsgemäßer Probenkammern und Kanälen zur Zu- und/oder Ableitung von Medien.
Die Ausführungsbeispiele sind schematisch dargestellt. Gleiche technische Elemente sind mit gleichen Bezugszeichen gekennzeichnet.
In der Fig. 1 ist eine aus dem Stand der Technik bekannte Probenkammer 1 dargestellt, die einen Probenraum 2 umfängt, in dem eine Probe 3 positioniert werden kann. Der Probenraum 2 ist mit einem Probenmedium 4 gefüllt, in das ein Objektiv 5 einer abbildenden Optik einer nicht näher dargestellten optischen Vorrichtung eingetaucht werden kann. Das zugleich als Immersionsmedium 14 fungierende Probenmedium 4 besitzt einen ersten Brechungsindex nl und steht mit dem Objektiv 5 in direktem Kontakt. Ist das Probenmedium 4 eine Chemikalie oder eine Mischung chemischer Komponenten, wie sie zum Klären der Probe 3 verwendet werden, besteht aufgrund deren oftmals aggressiven Eigenschaften die Gefahr einer Schädigung des Objektivs 5. Der Probenraum 2 ist auf drei Seiten durch eine Wand 6 umfangen, die im Stand der Technik im Wesentlichen aus ebenen Teilflächen gebildet ist, wobei die Teilflächen optisch nicht wirksam, beispielsweise nicht transparent, sein müssen. Die Probe 3 kann entlang eines mit einer optischen Achse OA des Objektivs 5 zusammenfallenden Beleuchtungsstrahlengangs 7 mit einer Beleuchtungsstrahlung beleuchtet werden. Eine in der Probe 3 bewirkte Detektionsstrahlung wird mit dem Objektiv 5 entlang einer Detektionsachse DA Detektionsstrahlengangs 8 erfasst, wobei die optische Ache OA und die Detektionsachse DA zusammenfallen.
Ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Probenkammer 1 ist in der Fig. 2a in einer seitlichen Schnittdarstellung gezeigt. Der Probenraum 2 wird durch eine Wand 6 begrenzt, wobei eine Außenseite 6.1 der Wand 6 die Form eines Kugelabschnitts aufweist (Fig. 2a). Der Kugelabschnitt überdeckt eine Kreisfläche 9 mit einem Mittelpunkt 10 (siehe auch Fig. 2b). Der Probenraum 2 ist durch eine weitere Wand 11 begrenzt, die sich in der Ebene der Kreisfläche 9 erstreckt. Die Probenkammer 1 ist dafür vorgesehen, dass bei ihrer bestimmungsgemäßen Nutzung der Beleuchtungsstrahlengang 7 durch die Außenseite 6.1 in den Probenraum 2 hinein und der Detektionsstrahlengang 8 ebenfalls durch die Außenseite 6.1 verlaufen. Beleuchtungsstrahlengang 7 und Detektionsstrahlengang 8 können zusammenfallen oder, wie in Fig. 2a symbolisiert, voneinander getrennt sein.
Die sphärische Probenkammer l umschließt die Probe 3, beispielsweise ein abzubildendes Gehirn, möglichst eng. Das zum Klären verwendete Probenmedium 4 befindet sich in der Probenkammer 1. Eine Erfassung von Detektionsstrahlung kann mit einem als Luft-Objektiv ausgebildetem Objektiv 5 erfolgen (siehe z. B. Fig. 4a bis 4c).
In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist die Probenkammer l auf eine Trägerfläche 12 eines Probenträgers 13 gestellt und von einer Wand 15 in Form eines auf der Trägerfläche 12 aufstehenden Hohlzylinders umfangen (Fig. 3). Probenträger 13 und Trägerfläche 12 können zusammen in weiteren Ausführungen auch ein offenes Gefäß bilden. Die Wand 15 oder Zylinderwand kann in weiteren Ausführungen in der Draufsicht eine andere, beispielsweise eine eckige oder ovale Form aufweisen. Ein vorhandener Raum 16 oberhalb der Probenkammer l ist mit Luft oder mit einem Immersionsmedium 14 gefüllt, in welches das Objektiv 5 eingetaucht ist beziehungsweise eingetaucht werden kann.
Das Immersionsmedium 14 besitzt einen zweiten Brechungsindex n2 und dient der Erhöhung der Numerischen Apertur (NA) des Objektivs 5. Als Immersionsmedium 14 kann eine nicht-aggressive chemische Verbindung oder ein derartiges Stoffgemisch ausgewählt sein, das zudem meist auch kostengünstig ist.
Die ersten und zweiten Brechungsindizes nl, n2 und gegebenenfalls auch deren Abbe-Zahl vl beziehungsweise v2 können einander angenähert oder identisch gewählt werden. Die Dicke der Wand 6 ist dann möglichst gering und/oder die Wand 6 besteht aus einem Material, dessen Brechungsindex nahe am Brechungsindex nl bzw. n2 liegt.
Das Immersionsmedium 14 kann auch aus zwei oder mehr geeigneten Komponenten gemischt und so die Brechungsindizes nl und n2 bestmöglich aneinander angepasst werden. Eine solche Anpassung der Zusammensetzung des Immersionsmediums 14 kann in weiteren Ausführungen der Erfindung auch dynamisch erfolgen, indem über Zu- und Ableitungen (nicht gezeigt) Komponenten der Immersionsmischung 14 oder ein bereits gemischtes Immersionsmedium 14 gesteuert dem Raum 16 zugeführt werden. Auf diese Weise kann eine solche„Dipping-Kammer" flexibel an unterschiedliche Betriebsbedingungen angepasst werden.
In den Fig. 4a bis 4c wird der Ablauf einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens schematisch gezeigt. In der Fig. 4a ist eine Probenkammer 1 in eine erste Winkelrelativlage gebracht. Das bedeutet, sie ist gegenüber einem Referenzkoordinatensystem, beispielsweise dem dargestellten kartesischen Koordinatensystem mit den zueinander orthogonalen Achsen x, y und z, um einen bestimmten Winkel geneigt. Im gezeigten Beispiel verläuft die Kreisfläche 9 parallel zu einer durch die Achsen x und y aufgespannten Ebene. Entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs 7 und einer Beleuchtungsachse BA ist eine Beleuchtungsstrahlung unter einem Einstrahlwinkel a durch die Außenseite 6.1 in den Probenraum 2 eingestrahlt. Aufgrund der Unterschiede der Brechzahlen von Umgebung und Probenmedium 4 wird die Beleuchtungsstrahlung beim Durchgang durch die Wand 6 gebrochen und verläuft anschließend etwa horizontal durch den Probenraum 2 und die Probe 3. Die Positionierung des gebrochenen Abschnitts des Beleuchtungsstrahlengangs 7 entlang der Z-Achse z gibt eine erste z-Relativlage an. Das Objektiv 5 ist auf den gebrochenen Abschnitt des Beleuchtungsstrahlengangs 7, der insbesondere als ein Lichtblatt 17 ausgebildet sein kann, fokussiert. Eine optische Achse OA des zur Erfassung von Detektionsstrahlung verwendeten Objektivs 5 ist senkrecht zum gebrochenen Abschnitt des Beleuchtungsstrahlengangs 7 und durch den Mittelpunkt 10 gerichtet. Mittels des Objektivs 5 können nun Bilddaten eines Teils der beleuchteten Bereiche, insbesondere einer beleuchteten Ebene, der Probe 3 erfasst werden. Um ein Volumen der Probe 3 entlang der optischen Achse OA zu erfassen, wird ein sogenannter z-Stapel 18 (siehe Fig. 5) von Objektebenen in unterschiedlichen z-Relativlagen erfasst (durch den vertikalen Doppelpfeil symbolisiert) und nachfolgend zusammengesetzt (siehe auch Fig. 5). Dabei eventuell erforderliche Korrekturen des Einstrahlwinkels a des Beleuchtungsstrahlengangs 7 werden zu Fig. 9 erläutert.
Mit diesem Vorgehen kann das Volumen einer größeren Probe 3 nicht vollständig abgebildet werden, da nur eine begrenzte laterale (= Field of view) und vertikale Ausdehnung (=Schärfentiefe) der Fokusebene - tatsächlich eines Fokusvolumens - erfasst werden kann, wie diese schematisch durch das Rechteck in den Fig. 4b und 4c veranschaulicht ist. Würde allerdings die Probenkammer 1 zur vollständigen Erfassung der Probe 3 relativ zum Objektiv 5 lateral bewegt, würden aufgrund der Wölbung der Probenkammer 1 erhebliche Aberrationen auftreten. Erfindungsgemäß wird daher die Probenkammer 1 um den Mittelpunkt 10 geschwenkt und/oder rotiert, wie dies in den Fig. 4b und 4c gezeigt ist. So ist die Probenkammer 1 in Fig. 4b in eine weitere Winkelrelativlage und eine weitere z- Relativlage gebracht. Unter dieser Winkelrelativlage kann wieder ein z-Stapel 18 erfasst (Fig. 4c), abgespeichert und abschließend zu einer Darstellung der Probe 3 zusammengesetzt werden. Für eine vollständige Erfassung der Probe 3 können frei wählbar entsprechende Winkelrelativlagen eingestellt und z-Stapel 18 erfasst werden.
Diese Vorgehensweise ist in den Teilfiguren Fig. 5a bis 5c vereinfacht gezeigt. In einer ersten Winkelrelativlage der Probenkammer 1 wird ein erster z-Stapel 18 entlang eines Detektionsstrahlengangs 8 in Richtung der Z-Achse z erfasst und zusammen mit Daten zur jeweiligen Winkelrelativlage und z-Relativlage abgespeichert (Fig. 5a). Anschließend wird die Probenkammer 1 einen bestimmten Winkel um den Mittelpunkt 10 geschwenkt und/oder rotiert. Von der so in eine zweite oder weitere Winkelrelativlage gebrachten Probe 3 wird erneut ein z-Stapel 18 von Bilddaten erfasst (Fig. 5b). Nach einer Anzahl N solcher Erfassungen von z-Stapeln 18 ist das gesamte Volumen des Probenraums 2 und der nicht dargestellten Probe 3 erfasst und die abgespeicherten einzelnen z- Stapel 18 können zu einer Darstellung des Gesamtvolumens der Probe 3 zusammengefügt werden, wie dies schematisch in der Fig. 5c symbolisiert ist.
Auftretende Überlappungen der einzelnen z-Stapel 18 können zur Verbesserung der Datenqualität verwendet werden, indem beispielsweise eine Auswertung mittels eines Multiview-Fusions- Algorithmus ausgeführt wird. Verbleibende Aberrationen können mittels adaptiver optischer Elemente (siehe z. B. Fig. 8) korrigiert werden.
Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Bilddaten können in unterschiedlichen Koordinaten dargestellt werden. Lediglich stellvertretend sind in den Fig. 6 und 7 eine Transformation eines gekippten z-Stapels 18 in eine horizontale Ausrichtung (Fig. 6) beziehungsweise eines gekippten z-Stapels in Kugelkoordinaten (Fig. 7) gezeigt. Zur Transformation der Koordinaten kann zum Beispiel eine gewichtete Interpolation angewendet werden. Beispielhaft sind erfasste Intensitätwerte lx,y,z von vier Punkten eines z-Stapels 18 gezeigt, die zu einem transformierten Intensitätswert lX'y,z- eines Punktes (Koordinate) des horizontalen (Fig. 6) beziehungsweise des Kugelkoordinatensystems (Fig. 7) interpoliert werden.
Eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines abbildenden Systems mit der Möglichkeit der Wahl unterschiedlicher Abbildungsverfahren in Abhängigkeit von der Probe 3 (Fig. 8) umfasst eine Strahlformungseinheit 19 zur Bereitstellung und Formung einer Beleuchtungsstrahlung zu einem Lichtblatt 17 und/oder ein Laserscanningmikroskop LSM (nachfolgend auch kurz: LSM). Im Beleuchtungsstrahlengang 7 der Strahlformungseinheit 19 und/oder des LSM kann optional eine adaptive optische Einheit 20 vorhanden sein. Im Beleuchtungsstrahlengang 7 des LSM sind beispielsweise wenigstens eine optische Linse 23 und ein Strahlteiler 21 angeordnet. Die Beleuchtungsstrahlung wird durch Wirkung des Strahlteilers 21 zu dem Objektiv 5 gelenkt und in den Probenraum 2 der Probenkammer 1 eingestrahlt. Eine in der Probe 3 hervorgerufene Detektionsstrahlung gelangt durch das Objektiv 5 und den für die Detektionsstrahlung durchlässigen Strahlteiler 21 entlang des Detektionsstrahlengangs 8 zu einer Tubuslinse 22 und weiter zu einem Detektor 25, beispielsweise einer Kamera. Der Strahlteiler 21 kann optional in den Beleuchtungsstrahlengang 7 und/oder den Detektionsstrahlengang 8 eingeschoben oder eingeschwenkt werden.
Die Beleuchtung der Probe 3 kann wahlweise per Lichtblatt 17, mittels eines Punktscanners eines LSM oder mittels eines Multipunktscanners eines LSM erfolgen. Das LSM beziehungsweise die Strahlformungseinheit 19 dienen als Lichtquelle.
Die Erfassung der Detektionsstrahlung kann konfokal, im Weitfeld oder plenoptisch erfolgen. Letztere Variante kann unter Verwendung eines Mikrolinsenarrays 26 erfolgen. Um auftretende Aberrationen zu korrigieren kann eine entsprechend ansteuerbare adaptive optische Einheit 20 im Detektionsstrahlengang 8 angeordnet sein. Das Mikrolinsenarray 26 kann unter Verwendung entsprechender Stellvorrichtungen (nicht gezeigt) optional in den Detektionsstrahlengang 8 eingeschoben oder eingeschwenkt werden.
Die Probenkammer 1 kann mittels eines gesteuert antreibbaren Probentisches 27 um jede der Achsen X, Y und Z geschwenkt und entlang dieser Achsen verschoben werden. Um die Achse Z ist eine Rotation möglich. Um das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen, wird die Probenkammer 1 um den Mittelpunkt 10 (siehe Fig. 4a bis 5c) geschwenkt und optional um eine durch den Mittelpunkt 10 und in Richtung der Z-Achse Z verlaufende Achse rotiert (siehe z. B. Fig. 4a bis 5). Zusätzlich oder alternativ zu einer Zustellbewegung entlang der Z-Achse z ist das Objektiv 5 dazu ausgebildet, um mittels eines ansteuerbaren Antriebs 30 in Richtung der Z-Achse z positioniert zu werden.
Optional kann es möglich sein, dass die Probenkammer 1 mittels des Probentisches 27 entlang der Achsen x, y und insbesondere in Richtung der Z-Achse z gesteuert verschoben werden kann, um beispielsweise die Probenkammer 1 relativ zum Beleuchtungsstrahlengang 7 zu positionieren. Die Bewegungsmöglichkeit entlang der Z-Achse z stellt eine Option für die Erfassung der z-Stapel 18 dar.
In weiteren möglichen Ausführungen der Erfindung kann die Einstellung der Winkelrelativlagen und/oder der z-Relativlagen durch eine entsprechende Bewegung des Objektivs 5 erfolgen. Auch ist es möglich, dass beispielsweise die Einstellungen der Winkelrelativlagen und/oder der z-Relativlagen durch Kombinationen der Bewegungen von Objektiv 5 und Probentisch 27 eingestellt werden.
Zur Ansteuerung des Probentischs 27 sowie der diversen Stellvorrichtungen beziehungsweise mindestens eines Antriebs 30 ist eine Steuerungseinheit 28, beispielsweise ein Rechner oder ein entsprechend konfigurierter Teil eines Rechners, vorhanden und in einer zur Übertragung von Daten und Steuerbefehlen geeigneten Weise mit dem Probentisch 27, den Antrieben 30 (beispielhaft nur einer dargestellt) und optional mit der Kamera 25 verbunden (lediglich angedeutet gezeigt).
Erfolgt die Beleuchtung/Detektion durch das Objektiv 5, können die z-Stapel 18 (sieh z. B. Fig. 5a bis 5c) durch Bewegung der Probe 3 und/oder durch Bewegung des Objektivs 5 und Veränderung der jeweiligen Fokusebene als z-Relativlage aufgenommen werden. Die oben beschriebene Rotation der Probenkammer 1 hat dabei keine optische Auswirkung, wenn Drehpunkt und Mittelpunkt 10 zusammenfallen (sieh z. B. Fig. 5). Insbesondere bei einer Beleuchtung der Probe 3 mit einem Lichtblatt 17 kann es erforderlich sein, den Einstrahlwinkel an in Abhängigkeit einer jeweils aktuellen Z-Relativlage im Sinne einer Winkelnachführung anzupassen. Zusätzlich kann eine Ortsverlagerung nötig sein, um in der Praxis auftretende aberrationsbedingte Fokusverlagerungen zu korrigieren. Vorrichtungsseitig sind Winkelnachführung und Ortsverlagerung mit einer in Fig. 9 gezeigten Vorrichtung möglich.
In der Einschubfigur der Fig. 9 sind schematisch verschiedene Winkel einer Probenkammer 1, eines Beleuchtungsstrahlengangs 7 und eines Lichtblatts 17 gezeigt. Die Probenkammer 1 und der Beleuchtungsstrahlengang 7 ist dabei mit durchgehenden Volllinien in einer ersten Z-Relativlage und mit unterbrochenen Volllinien in einer zweiten Z-Relativlage dargestellt. Außerhalb der Probenkammer 1 durchläuft die Beleuchtungsstrahlung ein Medium mit dem ersten Brechungsindex na. Die Probenkammer l mit dem Probenmedium 4 weist einen zweiten Brechungsindex nb mit nb>na auf. Der jeweilige Einfallswinkel an wird zwischen dem jeweiligen Beleuchtungsstrahlengang 7 und einer Normalen auf der Außenseite 6.1 gemessen. Da die Wand 6, insbesondere deren Außenseite 6.1, als Kugelabschnitt mit einem Radius R ausgebildet ist, verläuft eine Verlängerung der Normalen durch den Mittelpunkt 10 und schließt mit einer als Boden der Probenkammer 1 fungierenden weiteren Wand 11 beziehungsweise mit der Ebene der Kreisfläche 9 einen Winkel gh ein.
In der ersten Z-Relativlage ist die Beleuchtungsstrahlung entlang des Beleuchtungsstrahlengangs 7 unter einem ersten Einfallswinkel ai auf die Außenseite 6.1 der sphärisch geformten Wand 6 der Probenkammer l gerichtet. Die Verlängerung der Normalen tritt unter einem Winkel yl durch den Mittelpunkt 10. Der Beleuchtungsstrahlengang 7 wird entsprechend der Unterschiede der Brechungsindizes na und nb gebrochen. Dabei ist der Einfallswinkel al so gewählt, dass der gebrochene Abschnitt des Beleuchtungsstrahlengangs 7 parallel zur Ebene der Kreisfläche 9 verläuft und beispielsweise mittels eines Objektivs 5 entlang der Detektionsachse DA Bilddaten erfasst werden können. Der gebrochene Abschnitt des Beleuchtungsstrahlengangs 7 schließt mit der Verlängerung der Normalen einen Winkel ßl ein.
Wird die Probenkammer 1 um eine Distanz Dz in Richtung der Z-Achse z in die zweite Z-Relativlage verschoben, kann eine Erfassung von Bilddaten mit gleichbleibender Fokuslage des Objektivs 5 erfolgen, wenn ein Einstrahlwinkel a2 eingestellt wird. Dabei tritt nun die Verlängerung der Normalen unter einem Winkel g2 durch den Mittelpunkt 10. Der gebrochene Abschnitt des Beleuchtungsstrahlengangs 7 schließt mit der Verlängerung der Normalen einen Winkel ß2 ein, wobei ßl > 32 ist.
Ohne eine solche Korrektur des Einfallswinkels an würde der gebrochene Abschnitt des Beleuchtungsstrahlengangs 7 in der zweiten Z-Relativlage nicht mehr parallel zur Ebene der Kreisfläche 9 verlaufen.
Die optische Anordnung zur Orts- und Winkelnachführung bei einer Lichtblattbeleuchtung an einer erfindungsgemäßen Probenkammer gemäß dem dargestellten Ausführungsbeispiel weist die Strahlformungseinheit 19 auf, in der eine von einer nicht näher dargestellten Lichtquelle bereitgestellte Beleuchtungsstrahlung zu einem Lichtblatt 17 geformt wird. Im Beleuchtungsstrahlengang 7 folgen mindestens eine optische Linse 23, ein erster Scanner Sl, eine Scanoptik 24, eine Tubuslinse 22 und ein Objektiv 5, das als Beleuchtungsobjektiv fungiert.
Der erste Scanner Sl steht in oder nahe einer Pupille P des Beleuchtungsstrahlengangs 7 und dient der Ortsverlagerung. Er ist beispielsweise in Form eines galvanometrischen Scanspiegels ausgebildet. Ein Winkel in der Pupille P entspricht einem Ort in der Probe 3, weshalb eine Winkeländerung des ersten Scanners Sl zu einer Verschiebung des Lichtblatts 17 in Richtung der z-Achse z führt. Zum Zwecke der Winkelnachführung ist zwischen der Strahlformungseinheit 19 und dem ersten Scanner S1 ein zweiter Scanner S2 angeordnet. Dieser befindet sich nahe eines Zwischenbilds ZB. Die beiden Scanner S1 und S2 lenken den Beleuchtungsstrahlengang 7 in den gleichen Bewegungsebenen ab. Dadurch unterscheiden sie sich von einer Scanneranordnung eines typischen LSM, bei der die Bewegungsebenen orthogonal zueinander liegen. Zur Ortsverlagerung des Auftreffpunkts des Beleuchtungsstrahlengangs 7 auf die Außenseite 6.1 der Probenkammer l wird der Pivotpunkt des zweiten Scanners S2 mittels der Scanoptik 24 auf die Außenseite 6.1 abgebildet. Der zweite Scanner S2 verändert einen Winkel im Zwischenbild ZB, was einer Ortsveränderung in der Pupille P und auf dem ersten Scanner S1 sowie einem Winkel in der Probe 3 entspricht. Da der Winkel kurz vor der Probe 3 eingestellt werden soll, kann mittels axialem Verschieben der optischen Linse 23 eine Winkelabweichung entsprechend korrigiert werden.
Eine erforderliche Korrektur der Fokussierung entlang der Ausbreitungsrichtung des Lichtblatts 17 kann beispielsweise durch Verschieben des Objektivs 5, der Tubuslinse 22 oder durch andere Fokusoptiken erfolgen. Eine Korrektur der Fokussierung kann nötig sein, da die optische Weglänge im Probenmedium 4 an verschiedenen Z-Relativlagen verschieden ist und sich daher während der Erfassung eines z-Stapels 18 verändert.
In einer weiteren Ausführung der optischen Anordnung kann ein dritter Scanner S3 (nicht gezeigt) pupillennah und beispielsweise nahe am ersten Scanner S1 angeordnet sein. Durch Wirkung des dritten Scanners S3 wird eine schnelle Bewegung des Lichtblatts 17 senkrecht zur Zeichnungsebene bewirkt. Eine solche Anordnung kann verwendet werden, wenn zur Erzeugung des Lichtblatts 17 eine Strahlform gewählt wird, die ein laterales„Verschmieren" erfordert (z.B. Bessel-Strahl).
Um beispielsweise eine automatisierte Erfassung von Bilddaten zu erleichtern, können mehrere Probenkammern 1 auf einem Probenträger 13 angeordnet sein beziehungsweise angeordnet werden. Der mehrere Stellplätze für Probenkammern 1 aufweisende Probenträger 13 kann flächig ausgebildet sein (Fig. 10). Eine jeweils zu beobachtenden Probenkammer 1 wird durch eine entsprechende Ansteuerung des Probentischs 27 dem Objektiv 5 zugestellt und/oder das Objektiv 5 wird der jeweiligen Probenkammer 1 zugestellt. Ein erster z-Stapel 18 kann in einer ersten Winkelrelativlage erfasst werden. Zur Erfassung weiterer z-Stapel 18 kann das Objektiv 5 geschwenkt und/oder der Probenträger 13 um den Mittelpunkt 10 der aktuell zu erfassenden Probenkammer 1 geschwenkt werden.
In einer weiteren Ausführung eines Probenträgers 13 für eine Anzahl von erfindungsgemäßen Probenkammern 1 weist dieser gegeneinander winkelversetzte Trägerflächen 12 auf, auf denen jeweils eine Probenkammer 1 angeordnet ist beziehungsweise angeordnet werden kann. Die Trägerflächen 12 können beispielsweise Umfangsflächen eines Karussells oder Revolvers sein. Eine solche Ausführung erhöht gegenüber einer Ausführung gemäß Fig. 10 den zugänglichen Winkelbereich, unter dem Winkelrelativlagen eingestellt werden können.
Ein Probenträger 13 nach einem der vorherigen Ausführungsbeispiele kann mindestens einen Kanal 29 aufweisen, der an einem der Stellplätze mündet (Fig. 11). Der Kanal 29 dient der Zuleitung und/oder Ableitung von Probenmedium 4 in beziehungsweise aus dem Probenraum 2.
Es können in weiteren Ausführungen je Stellplatz beziehungsweise je Probenkammer 1 mindestens je ein Kanal 29 als Medienzuleitung und mindestens je ein Kanal 29 als Medienableitung vorhanden sein. Um eine Zuführung beziehungsweise Abführung von Medien zu erlauben, ist die Probenkammer 1 in der Ebene der Kreisfläche 9 durch die Trägerfläche 12 begrenzt oder in einer weiteren Wand 11 sind entsprechend zu einigen oder allen Kanälen korrespondierende Öffnungen (angedeutet gezeigt) vorhanden. Diese Öffnungen können in weiteren Ausführungen mit einem Ventil oder einem Verschluss versehen sein, um ein Abnehmen der Probenkammer l von der Trägerfläche 12 zu ermöglichen.
Es ist auch möglich, dass die Probenkammer 1 die Wand 6 aufweist und ein Abschluss in der Ebene der Kreisfläche 9 durch eine Oberfläche der Trägerfläche 12 als weitere Wand 11 gebildet ist. Der Probenraum 2 kann über den Kanal 29 beziehungsweise die Kanäle 29 mit einem Probenmedium 4 versorgt werden. Dabei kann das Probenmedium 4 beispielsweise eine Verbindung zum Klären der Probe 3, eine Nährlösung, ein Puffer oder eine Verbindung zur Unterstützung der Lagerung der Probe 3 sein.
Das in der Fig. 11 dargestellte Ausführungsbeispiel zeigt gegeneinander winkelversetzte Trägerflächen 12, auf denen jeweils auf einem Stellplatz eine Probenkammer 1 aufgesetzt ist. Es kann jeweils eine Trägerfläche 12 mit der darauf vorhandenen Probenkammer 1 in eine Erfassungsposition gebracht werden, die im gezeigten Beispiel die mittlere Position ist, in der die in der Erfassungsposition befindliche Trägerfläche 12 orthogonal zur optischen Achse OA des Objektivs 5 ausgerichtet ist. Um wie bereits oben beschrieben eine Anzahl von z-Stapeln 18 zu erfassen, kann das Objektiv 5 relativ zur Probenkammer 1 geschwenkt und verschiedene Fokusebene erfasst werden, so dass Probenkammer 1 und Objektiv 5 zueinander in verschiedene Winkelrelativlagen und/oder z-Relativlagen gebracht werden können.
Die gegeneinander winkelversetzte und abgewinkelte Anordnung der Trägerflächen 12 ermöglicht eine bessere Zugänglichkeit der jeweils zu erfassenden Probenkammer 1, da die jeweils benachbart angeordneten Probenkammern 1 aus der Ebene der zu erfassenden Probenkammer 1 ausgeschwenkt sind. Die Steuerung der aktuellen Ausrichtung des Probenträgers 13 sowie der Zuleitung und/oder Ableitung von Medien über die Kanäle 29 erfolgt mittels der Steuerungseinheit 28 sowie mittels Antrieben 30 und/oder Pumpen 30.
Bezugszeichen
1 Probenkammer
2 Probenraum
3 Probe
4 Probenmedium
5 Objektiv
6 Wand
6.1 Außenseite (der Wand)
7 Beleuchtungsstrahlengang
8 Detektionsstrahlengang
9 Kreisfläche
10 Mittelpunkt
11 weitere Wand
12 Trägerfläche
13 Probenträger 14 Immersionsmedium
15 Wand (auf Trägerfläche aufstehend)
16 Raum
17 Lichtblatt
18 z-Stapel
19 Strahlformungseinheit
20 adaptives optisches Element
21 Strahlteiler
22 Tubuslinse
23 optische Linse
24 Scanoptik
25 Kamera, Detektor
26 Mikrolinsenarray
27 Probentisch
28 Steuerungseinheit
29 Kanal
30 Antrieb, Pumpe
et Einfallswinkel
ß Winkel
T Winkel
BA Beleuchtungsachse
DA Detektionsachse
Intensitätswert
Ic'U,z' transformierter Intensitätswert
LSM Laserscanningmikroskop na erster Brechungsindex
nb zweiter Brechungsindex
OA optische Achse
P Pupille
51 erster Scanner
52 zweiter Scanner
53 dritter Scanner
ZB Zwischenbild

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Betrieb einer Probenkammer (1) für eine mikroskopische Bildgebung, umfassend die Schritte:
Bereitstellen einer Probenkammer (1) in einem Beleuchtungsstrahlengang (7),
wobei die Probenkammer (1) einen Probenraum (2) zur Positionierung einer Probe (3) umfängt und
mindestens eine den Probenraum (2) begrenzende Wand (6) mit einer dem Probenraum (2) abgewandten Außenseite (6.1) aufweist, und
der Beleuchtungsstrahlengang (7) entlang einer Beleuchtungsachse (BA) durch die Außenseite (6.1) in den Probenraum (2) gerichtet ist;
Erfassen einer mittels einer entlang der Beleuchtungsachse (BA) in den Probenraum (2) gerichteten Beleuchtungsstrahlung bewirkten Detektionsstrahlung entlang einer von dem Probenraum (2) durch die Wand (6) der Probenkammer (1) verlaufenden Detektionsachse (DA);
dadurch gekennzeichnet, dass
eine Probenkammer (1) verwendet wird, deren Außenseite (6.1) die Form eines Kugelabschnitts mit einer Kreisscheibe (9) als Grundfläche aufweist,
und die Probenkammer (1) und die Detektionsachse (DA) um den Mittelpunkt (10) der Kreisscheibe (9) relativ zueinander rotiert und/oder geschwenkt werden, sodass unterschiedliche Winkelrelativlagen von Probenkammer (1) und Detektionsachse (DA) eingestellt werden,
und Bilddaten bei unterschiedlichen Winkelrelativlagen von Probenkammer (1) und Detektionsachse (DA) erfasst werden beziehungsweise erfasst werden können.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in einer Winkelrelativlage Bilddatenerfassungen in mindestens zwei unterschiedlichen z-Relativlagen ausgeführt werden, wobei die Probenkammer (1) und/oder eine Fokusebene einer abbildendenden Optik entlang der Detektionsachse (DA) zur Einstellung einer jeweiligen z-Relativlage relativ zueinander verschoben werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsstrahlung zu einem Lichtblatt (17) geformt und in den Probenraum (2) eingestrahlt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsstrahlung in Form eines nicht-diffraktiven Strahls zur Erzeugung des Lichtblatts (17) verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Einstrahlwinkel (a) des Lichtblatts (17) in den Probenraum (2) in Abhängigkeit der jeweiligen z-Relativlage angepasst wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Einstrahlwinkel (a) anhand der Beziehung a(z) = ArcSin ((nb/na*R)z) angepasst wird, wobei na der Brechungsindex eines Mediums außerhalb der Probenkammer (1); nb der Brechungsindex eines Mediums innerhalb der Probenkammer (1), R der Radius des Kugelabschnitts der Außenseite (6.1) und z die jeweilige Position entlang der Detektionsachse (DA) sind.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass unter verschiedenen Winkelrelativlagen von Probenkammer (1) und Detektionsachse (DA) Bilddaten von an einander angrenzenden oder sich überlappenden Teilbereichen der Probe (3) erfasst werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Bilddaten sich überlappender Teilbereiche der Probe (3) mittels eines Multi-View-Fusions-Algorithmus ausgewertet und Bildfehler reduziert werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass Bilddaten mittels plenoptischer Detektion erfasst werden.
10. Probenkammer (1) für die Mikroskopie, die
einen Probenraum (2) zur Positionierung einer Probe (3) umfängt und
mindestens eine den Probenraum (2) begrenzende Wand (6) mit einer dem Probenraum (2) abgewandten Außenseite (6.1) aufweist;
dadurch gekennzeichnet, dass
die Außenseite (6.1) der Wand (6) die Form eines Kugelabschnitts mit einer Kreisscheibe (9) als Grundfläche aufweist,
und eine Probenhalterung zur Halterung der Probe (3) in der Ebene der Kreisscheibe (9) vorhanden ist.
11. Probenträger (13) mit gegeneinander winkelversetzt angeordneten Trägerflächen (12) zur Aufnahme je mindestens einer Probenkammer (1) nach Anspruch 10 auf einem Stellplatz und mit wenigstens einer Probenkammer (1) nach Anspruch 10 je Trägerfläche (12).
12. Probenträger (13) nach einem der Ansprüche 10 oder 11, gekennzeichnet durch Kanäle (29) zur Zu- und/oder Abführung von Medien in beziehungsweise aus dem Probenraum (2).
13. Probenträger (13) nach einem der Ansprüche 11 oder 12 mit wenigstens einer Trägerfläche (12), auf der eine umlaufende und auf der Trägerfläche (12) aufstehende Wand (15) vorhanden ist und die Wand (15) einen Stellplatz einer Probenkammer (1) als seitliche Begrenzung umfängt.
14. Vorrichtung zur Erfassung von Bilddaten mit einer Probenkammer (1) nach Anspruch 10 oder mit einer Kombination von Probenträger (13) und Probenkammer (1) nach einem der Ansprüche 11 bis 13, aufweisend
eine Strahlformungseinheit (19) zum Bereitstellen einer Beleuchtungsstrahlung entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs (7) und zur Formung der Beleuchtungsstrahlung zu einem Lichtblatt (17), und einen ersten Scanner (Sl) in oder nahe einer Pupille (P) des Beleuchtungsstrahlengangs (7), zur Auslenkung der Beleuchtungsstrahlung,
dadurch gekennzeichnet, dass
ein um einen Pivotpunkt beweglicher zweiter Scanner (S2) nahe eines Zwischenbildes (ZB) im Beleuchtungsstrahlengang (7) angeordnet ist, wobei der Pivotpunkt des zweiten Scanners S2 auf einen Eintrittspunkt (des Lichtblatts) auf die Außenseite (6.1) der Probenkammer (1) abbildet
und erster Scanner (Sl) und zweiter Scanner (S2) in einer gemeinsamen Bewegungsebene schwingen.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, gekennzeichnet durch einen dritten Scanner (S3), der pupillennah im Beleuchtungsstrahlengang (7) angeordnet ist und dessen Bewegungsebene orthogonal zur Bewegungsebene des ersten und zweiten Scanners (Sl, S2) verläuft.
PCT/EP2019/083222 2018-12-19 2019-12-02 Verfahren zum betrieb einer probenkammer für eine mikroskopische bildgebung sowie vorrichtung und probenkammer Ceased WO2020126419A1 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/309,793 US12259538B2 (en) 2018-12-19 2019-12-02 Method for operating a sample chamber for microscopic imaging, apparatus, and sample chamber
JP2021535872A JP7399168B2 (ja) 2018-12-19 2019-12-02 顕微鏡画像化用の試料チャンバの作動方法、装置、及び試料チャンバ

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102018222271.1 2018-12-19
DE102018222271.1A DE102018222271A1 (de) 2018-12-19 2018-12-19 Verfahren zum Betrieb einer Probenkammer für eine mikroskopische Bildgebung sowie Vorrichtung und Probenkammer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020126419A1 true WO2020126419A1 (de) 2020-06-25

Family

ID=68766759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2019/083222 Ceased WO2020126419A1 (de) 2018-12-19 2019-12-02 Verfahren zum betrieb einer probenkammer für eine mikroskopische bildgebung sowie vorrichtung und probenkammer

Country Status (4)

Country Link
US (1) US12259538B2 (de)
JP (1) JP7399168B2 (de)
DE (1) DE102018222271A1 (de)
WO (1) WO2020126419A1 (de)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024162288A1 (ja) * 2023-01-31 2024-08-08 国立研究開発法人理化学研究所 光学観察用の構造及びその作成方法、試料の観察方法、顕微鏡観察用のマウント液
EP4614207A1 (de) * 2024-03-05 2025-09-10 Leica Microsystems CMS GmbH Probenpositionierungsvorrichtung und lichtblattmikroskop
WO2025240986A1 (en) * 2024-05-21 2025-11-27 Gmi - Gregor-Mendel-Institut Für Molekulare Pflanzenbiologie Gmbh Microscope and microscopy method

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007065711A1 (en) * 2005-12-09 2007-06-14 Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) Miscroscope specimen holder
DE102012013163A1 (de) 2012-07-02 2014-04-10 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Mikroskop und Verfahren zur SPIM Mikroskopie
DE102013211426A1 (de) * 2013-06-18 2014-12-18 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren und optische Vorrichtung zum mikroskopischen Untersuchen einer Vielzahl von Proben
US20170139195A1 (en) * 2015-11-14 2017-05-18 Guy Kennedy Microscopy Safety Dome
WO2018166744A1 (de) * 2017-03-15 2018-09-20 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Anordnung, mikroskop und verfahren zur tirf-mikroskopie
WO2019063782A2 (de) * 2017-09-29 2019-04-04 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Optische linse zur verwendung in einer medienzuführungsvorrichtung sowie objektiv, medienzuführungsvorrichtung und mikroskop

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2635871A4 (de) 2010-11-07 2014-06-04 Council Scient Ind Res On-chip-4d-lichtfeldmikroskop
DE102013107298B4 (de) 2013-07-10 2025-07-17 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Anordnung zur Lichtblattmikroskopie
DE102013021542A1 (de) 2013-12-18 2015-06-18 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Mikroskop und Verfahren zur SPIM Mikroskopie
WO2016030464A1 (en) * 2014-08-28 2016-03-03 Single Technologies Ab High throughput biochemical screening
JP2017146442A (ja) 2016-02-17 2017-08-24 オリンパス株式会社 標本の観察方法
DE102016212019A1 (de) 2016-07-01 2018-01-04 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Neigungsmessung und -korrektur des Deckglases im Strahlengang eines Mikroskops
US10310248B2 (en) * 2016-08-18 2019-06-04 Olympus Corporation Microscope including a medium container containing an immersion medium in which a specimen container containing an immersion medium and a sample is immersed

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007065711A1 (en) * 2005-12-09 2007-06-14 Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) Miscroscope specimen holder
DE102012013163A1 (de) 2012-07-02 2014-04-10 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Mikroskop und Verfahren zur SPIM Mikroskopie
DE102013211426A1 (de) * 2013-06-18 2014-12-18 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren und optische Vorrichtung zum mikroskopischen Untersuchen einer Vielzahl von Proben
US20170139195A1 (en) * 2015-11-14 2017-05-18 Guy Kennedy Microscopy Safety Dome
WO2018166744A1 (de) * 2017-03-15 2018-09-20 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Anordnung, mikroskop und verfahren zur tirf-mikroskopie
WO2019063782A2 (de) * 2017-09-29 2019-04-04 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Optische linse zur verwendung in einer medienzuführungsvorrichtung sowie objektiv, medienzuführungsvorrichtung und mikroskop

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BI-CHANG ET AL.: "Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution", SCIENCE, vol. 346, 2014, pages 1257998
GAO, L. ET AL.: "Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens", CELL, vol. 151, 2012, pages 1370 - 1385, XP028960573, DOI: 10.1016/j.cell.2012.10.008
PREVEDEL, R. ET AL.: "Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy", NATURE METHODS, vol. 11, 2014, pages 727
RICHARDSON, D. S.LICHTMAN, J. W.: "Clarifying tissue clearing", CELL, vol. 162, no. 2, 2015, pages 246 - 257, XP055553805, DOI: 10.1016/j.cell.2015.06.067
SILVESTRI, L. ET AL.: "Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective", JOURNAL OF BIOMEDICAL OPTICS, vol. 21, no. 8, 2016, pages 081205, XP060075164, DOI: 10.1117/1.JBO.21.8.081205

Also Published As

Publication number Publication date
DE102018222271A1 (de) 2020-06-25
US12259538B2 (en) 2025-03-25
JP7399168B2 (ja) 2023-12-15
JP2022521567A (ja) 2022-04-11
US20220043244A1 (en) 2022-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2107408B1 (de) Mikroskop mit der Beobachtungsrichtung senkrecht zur Beleuchtungsrichtung
EP3479158B1 (de) Anordnung zur mikroskopie und zur korrektur von aberrationen
DE102013107297B4 (de) Anordnung zur Lichtblattmikroskopie
DE102018210603B4 (de) Verfahren zum Erzeugen eines Übersichtsbilds unter Verwendung eines hochaperturigen Objektivs
EP3069188B1 (de) Optisches übertragungssystem und mikroskop mit einem solchen übertragungssystem
DE102013112596B4 (de) Anordnung zur Lichtblattmikroskopie
EP2887117B1 (de) Mikroskop und Verfahren zur SPIM Mikroskopie
DE102013112595B4 (de) Anordnung zur Lichtblattmikroskopie
WO2014009080A1 (de) Mikroskop
DE102012020240A1 (de) Mikroskop und Verfahren zur SPIM Mikroskopie
DE102013105586B4 (de) Vorrichtung zur Abbildung einer Probe
EP2535754A1 (de) Abtastmikroskop und Verfahren zur lichtmikroskopischen Abbildung eines Objektes
DE102015209756A1 (de) Anordnung und Verfahren zur Lichtblattmikroskopie
EP3499177A2 (de) Verfahren zur bestimmung der dicke einer probenhalterung im strahlengang eines mikroskops
DE102017119480A1 (de) Optische Anordnung zum Scannen von Anregungsstrahlung und/oder Manipulationsstrahlung in einem Laser-Scanning-Mikroskop und Laser-Scanning-Mikroskop
WO2020126419A1 (de) Verfahren zum betrieb einer probenkammer für eine mikroskopische bildgebung sowie vorrichtung und probenkammer
WO2019038404A1 (de) Optische anordnung zum scannen von anregungsstrahlung und/oder manipulationsstrahlung in einem laser-scanning-mikroskop und laser-scanning-mikroskop
EP3867861B1 (de) Verfahren zur digitalen korrektion einer optischen abbildung einer probe mittels eines mikroskops und mikroskop
DE102014118025B4 (de) Vorrichtung zur Lichtblattmikroskopie
DE102022125117A1 (de) Lichtblattmikroskop
WO2018189187A1 (de) Lichtblattmikroskop
DE102016120312B3 (de) Verfahren zum Beleuchten von Fokuspositionen objektseitig eines Objektivs eines Mikroskops und Mikroskop
DE102021107821B4 (de) Lichtblatt-fluoreszenzmikroskop und verfahren zur tomographischen darstellung
DE102024205127A1 (de) Bildgebungsverfahren für lichtdurchlässige Proben, optische Anordnung und Mikroskop
DE102024118478A1 (de) Mikroskop, slidereader und verfahren zur mikroskopie

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19813494

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021535872

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19813494

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 17309793

Country of ref document: US