WO2020138487A1 - ＴｆＲに結合するバイスペシフィック抗体 - Google Patents

ＴｆＲに結合するバイスペシフィック抗体 Download PDF

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了輔 中野
正之 甲斐
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Definitions

  • the present invention encodes a bispecific antibody, a bispecific antibody fragment, a bispecific antibody or a bispecific antibody fragment containing an antigen-binding site that binds to transferrin receptor (TfR) and an antigen-binding site that binds to a cell surface antigen.
  • DNA a vector containing the DNA, a hybridoma and a transformant producing the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment, a method for producing the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment, the bispecific antibody or the bispecific antibody
  • the present invention relates to a therapeutic and diagnostic agent containing a fragment, a therapeutic and diagnostic method using the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment, and a detection or measurement reagent containing the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment.
  • Antibodies are glycoproteins present in serum and tissue fluids of all mammals, and recognize foreign antigens in vivo. Antibodies such as phagocytic ability of FcR-expressing cells, antibody-dependent cytotoxicity, mediator releasing ability, and antigen presenting ability through activation of the complement system and binding to a receptor (FcR) existing on the cell surface. Activates effector functions and participates in biological defense.
  • FcR receptor
  • 1 molecule of antibody consists of two homologous light chains (L chains) and two homologous heavy chains (H chains), and has two antigen binding sites.
  • the class and subclass of an antibody is determined by the heavy chain, and each class and subclass has a different unique function.
  • IgG is further classified into subclasses of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, and IgA is classified into subclasses of IgA1 and IgA2 (Charles A. J. et al., Immunobiology, 1997, Current Biology Ltd/Garland Publishing Inc.) ..
  • Multivalent antibody is an antibody with multiple antigen-binding sites in one molecule.
  • a hybrid hybridoma is used to express H chains and L chains derived from two different types of antibodies in one cell, and thereby monovalently bind to two different types of antigens. It was reported that a bivalent antibody was produced (Non-Patent Document 1). However, in this method, about 10 combinations of antibody H and L chains occur. Therefore, the amount of a polyvalent antibody having a desired combination of H chain and L chain produced is low, and it is difficult to selectively isolate and purify such a multivalent antibody, so that the yield of the desired antibody decreases. To do.
  • an antibody containing a single chain Fv (scFv) in which the antigen binding sites of H chain and L chain are linked by one polypeptide is known. Furthermore, the CH1 domain of the H1 constant region of IgG1 or a partial fragment of the domain and the L chain constant region, or a flexible linker (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) was used to link the two antigen-binding sites. Antibodies and the like have been reported (Patent Documents 1 and 2).
  • the conventional multivalent antibodies had the drawbacks that they were easily aggregated and had low stability and productivity.
  • a multivalent antibody having a plurality of antigen-binding sites in a single H-chain polypeptide and the antibody heavy chain variable region bound via a linker having the amino acid sequence of an immunoglobulin domain or a fragment thereof. Has been found to have high stability and good productivity (Patent Document 3).
  • Transferrin receptor (hereinafter also referred to as TfR) was identified as a cell membrane structure expressed on the surface of reticulocytes.
  • TfR has a function of taking up iron bound to transferrin (hereinafter also referred to as Tf) into cells. Since iron is an essential metal for maintaining cell homeostasis and cell proliferation, TfR for uptake of it is trophoblast cells of placenta, reticulocytes, activated lymphocytes and normal tissues with high iron uptake. Is often expressed in. It is also known that it is highly expressed in various tumor cells that actively grow (Non-patent Documents 3 and 4). It is known that when TfR is crosslinked on the cell membrane, internalization by clathrin-dependent endocytosis is promoted and degraded (Non-Patent Documents 5 and 6).
  • TfR Since the expression level of TfR in normal cells other than bone marrow cells is low and the expression level in active cancer cells is high, TfR has long been recognized as a molecular target for cancer therapy.
  • a TfR neutralizing antibody showing a strong drug effect in a mouse tumor-bearing model is known (Patent Document 4).
  • Non-patent Document 7 an antibody drug targeting an epidermal growth factor receptor (hereinafter referred to as EGFR) for colon cancer and head and neck cancer has been clinically confirmed to be effective.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • EGFR is a tyrosine kinase-type receptor discovered as a receptor for Epidermal growth factor (hereinafter referred to as EGF).
  • EGF Epidermal growth factor
  • EGFR is a transmembrane membrane glycoprotein with a molecular weight of 170 kDa, which forms a dimer when bound with a ligand and activates a downstream intracellular signal transduction pathway, thereby promoting cell proliferation, differentiation, invasion, metastasis, etc. prompt.
  • EGFR is expressed in various cells of epithelial system, mesenchymal system, and nervous system, it is highly expressed in many cancer cells such as brain tumor and squamous cell carcinoma (Non-patent document 8, Non-patent document 9). Therefore, it is known as a cancer antigen.
  • one antigen molecule can be used as a scaffold to internalize and decompose the other antigen molecule by using a molecule that can bind to two types of membrane proteins (Patent Documents 5 and 6). Further, when a peptide that recognizes a cancer cell-specific membrane protein and a peptide that recognizes TfR are chemically bound or linked by a hybridoma fusion method, both antigens are expressed under the condition of adding an iron chelating agent. It has been reported to exhibit a growth inhibitory activity on cells (Patent Document 7).
  • the present invention provides a novel bispecific antibody that binds to TfR and a cell surface antigen, the bispecific antibody fragment, a DNA encoding the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment, a vector containing the DNA, the bispecific antibody or the bispecific antibody.
  • Hybridomas and transformants that produce specific antibody fragments, methods for producing the bispecific antibody or bispecific antibody fragment, therapeutic and diagnostic agents containing the bispecific antibody or bispecific antibody fragment, the bispecific antibody or bispecific antibody fragment. It is an object of the present invention to provide a therapeutic and diagnostic method using, and a detection or measurement reagent containing the bispecific antibody or bispecific antibody fragment.
  • the present invention provides a polypeptide having an antigen-binding site for a cell surface antigen (also referred to as N-terminal polypeptide) on the N-terminal side of an IgG portion that binds to TfR, directly or by a linker.
  • a cell surface antigen also referred to as N-terminal polypeptide
  • a linker Provided is a bispecific antibody or a bispecific antibody fragment that binds to TfR and a cell surface antigen, which binds via TGFR.
  • the present invention relates to the following.
  • a bispecific antibody or a bispecific antibody fragment comprising an IgG portion that binds to a Transferrin Receptor (TfR) and an N-terminal side polypeptide that binds to a cell surface antigen, wherein the polypeptide is N of the heavy chain of the IgG portion.
  • a bispecific antibody or a bispecific antibody fragment thereof which binds to a TfR and a cell surface antigen, which is bound to the terminus directly or via a linker.
  • the IgG portion is From the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32, at least one selected from the substitution of the second tyrosine with alanine or phenylalanine and the substitution of the third threonine with alanine or glycine A complementarity determining region (CDR) containing an amino acid sequence modified by substitution 1, From the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:33 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:33, substitution of the first valine with alanine, substitution of the second isoleucine with alanine or leucine, and glutamic acid of the seventh valine Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 and a CDR2 containing an amino acid sequence modified by at least one substitution selected from the following substitutions: 10th substitution of aspartic acid with alanine and 13th substitution of aspartic acid with proline.
  • CDR complementarity determining region
  • VH Heavy chain variable region containing a CDR3 containing an amino acid sequence modified by at least one substitution selected from the following substitutions: a substitution of 7th tyrosine with alanine or phenylalanine, and a 13th substitution of valine with leucine.
  • VL light chain variable region
  • the IgG portion comprises VH comprising the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 26, 31, 36, 41 and 46, and VL comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 Or the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment according to 2 above. 5.
  • the IgG portion contains a VL containing CDR1 to 3 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 17 to 19 and one VH selected from the following (a) to (m): Or a bispecific antibody fragment thereof.
  • A CDR2 and 3 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 33 and 34, respectively, and the amino acid modified from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 by substitution of the second tyrosine with alanine or phenylalanine VH containing CDR1 containing sequence
  • B CDR2 and 3 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 33 and 34, respectively, and an amino acid modified from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 by substitution of threonine at position 3 with alanine or glycine VH containing CDR1 containing sequence
  • C CDR1 and 3 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 32 and 34, and an amino acid sequence modified by substitution of the first amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 with valine at alanine.
  • CDR2 including VH D
  • E CDR1 and 3 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 32 and 34, respectively, and an amino acid sequence modified from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 by substitution of valine at position 7 with glutamic acid.
  • the CDR1 and 2 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 32 and 33, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 were modified by substitution of glutamine at position 3 with alanine or aspartic acid.
  • VH containing CDR3 containing amino acid sequence (I)
  • VH containing CDR3 containing amino acid sequence From CDRs 1 and 2 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 32 and 33, respectively, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34, alanine, tyrosine, serine, aspartic acid, glutamine of the fourth proline, VH containing CDR3 containing an amino acid sequence modified by substitution with glutamic acid, threonine, arginine, glycine, lysine, methionine, valine, leucine, isoleucine, tryptophan, phenylalanine or histidine (K) CDR1 and 2 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 32 and 33, respectively, and substitution of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 with alanine, phenylalanine, histidine or tyrosine at the 5th tryptophan.
  • the IgG portion is VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, and from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31, Y32A, Y32F, T33A represented by the EU index by Kabat et al. (hereinafter, EU index), At least 1 selected from the substitution of T33G, L45A, V48A, V50A, I51A, I51L, V55E, D58A, D61P, Q97A, Q97D, W99A, W99F, W99H, W99Y, Y100AA, Y100AF, V102L, and P98 with any amino acid. 2.
  • the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment according to 1 above which comprises a VH containing an amino acid sequence modified by one substitution. 7. From the VL in which the IgG portion includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31, Y32A, Y32F, T33A, T33G, L45A, V48A, V50A, I51A represented by EU index , I51L, V55E, D58A, D61P, Q97A, Q97D, W99A, W99F, W99H, W99Y, Y100AA, Y100AF, V102L, P98A, P98Y, P98S, P98D, P98Q, P98E, P98T, P98R, P98G, P98P, P98K, P98P, P98K, P98P, P98K, P98P, P98K, P98P, P98K, P98P, P98K, P98P, P98K,
  • the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment according to 1 above which comprises a VH containing an amino acid sequence modified by the substitution.
  • the IgG portion has at least one amino acid residue selected from the 352nd Asp, the 355th Ser, the 356th Asp, and the 358th Lys of the amino acid sequence of TfR represented by SEQ ID NO: 6, and 365.
  • the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment according to 1 above which recognizes at least one amino acid residue selected from the second Met, the 366th Val, and the 369th Glu. 9.
  • Antibody fragment 13.
  • Said N-terminal polypeptide is Fab of an antibody against EGFR, said antibody comprising CDRs 1 to 3 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 60 to 62 or SEQ ID NOs: 65 to 67, respectively;
  • 20. A DNA encoding the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment according to any one of 1 to 19 above.
  • 21. A recombinant vector containing the DNA according to the above 20.
  • 22. A transformant obtained by introducing the recombinant vector according to 21 above into a host cell.
  • the transformant described in 22 above is cultured in a medium, and the bispecific antibody or bispecific antibody fragment according to any one of 1 to 19 above is produced and accumulated in the culture, and the bispecific antibody is produced from the culture.
  • a therapeutic and/or diagnostic agent for a disease involving at least one of human TfR and a cell surface antigen which comprises the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment described in any one of 1 to 19 above as an active ingredient.
  • 26. A method for treating and/or diagnosing a disease associated with at least one of human TfR and a cell surface antigen, which uses the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment according to any one of 1 to 19 above. 27. 27.
  • the cancer associated with at least one of human TfR and cell surface antigen is cancer.
  • a reagent for detecting or measuring at least one of human TfR and cell surface antigen which comprises the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment according to any one of 1 to 19 above.
  • a novel bispecific antibody that binds to TfR and a cell surface antigen, the bispecific antibody fragment, the DNA encoding the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment, the vector containing the DNA, the bispecific antibody or the bispecific antibody Hybridomas and transformants that produce specific antibody fragments, methods for producing the bispecific antibody or bispecific antibody fragment, therapeutic and diagnostic agents containing the bispecific antibody or bispecific antibody fragment, the bispecific antibody or bispecific antibody fragment It is possible to provide a therapeutic and diagnostic method using, and a detection or measurement reagent containing the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment.
  • FIG. 1 shows an example of the structure of the bispecific antibody of the present invention.
  • FIG. 1(A) shows a bispecific antibody in which the N-terminal polypeptide is Fab and the polypeptide containing VH of Fab is bound to the N-terminus of the IgG portion.
  • FIG. 1(B) shows a bispecific antibody in which the N-terminal polypeptide is VHH.
  • FIG. 1(C) shows a bispecific antibody in which the N-terminal polypeptide is Fab, and the polypeptide containing the VL of Fab is bound to the N-terminus of the IgG portion.
  • FIG. 2 shows the results of evaluation of antigen expression levels in various cancer cell lines by flow cytometry.
  • 2A to 2C show OE21 cells, T.
  • FIG. 3 shows the results of evaluation of the antigen expression level in liver cancer cell lines by flow cytometry.
  • FIGS. 3(A) to 3(C) show the results of evaluating the expression level of GPC3 in HepG2 cells, HuH-7 cells and HLE cells by a flow cytometer, respectively.
  • FIGS. 3D to 3F show the results of evaluating the TfR expression level in HepG2 cells, HuH-7 cells, and HLE cells by a flow cytometer, respectively.
  • FIGS. 3(G) to (I) show the results of evaluating the EGFR expression level in HepG2 cells, HuH-7 cells, and HLE cells by a flow cytometer, respectively.
  • the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity.
  • the solid line represents the binding of anti-GPC3 antibody, anti-TfR antibody or anti-EGFR antibody, and the gray-filled histogram represents the binding of negative control isotype antibody or anti-DNP antibody.
  • 4(A) to (I) show the results of evaluation of the binding properties of each antibody to OE21 cells by a flow cytometer. The vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity.
  • the solid line shows the binding of the anti-EGFR antibody or the anti-TfR antibody, and the gray-filled histogram shows the binding of the secondary antibody as a negative control.
  • FIG. 5 shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of each TfR antibody on OE21 cells.
  • the vertical axis represents the cell viability, which is represented by the relative value of the amount of ATP in living cells with respect to the negative control.
  • the black bar graph shows the result when only the monoclonal antibody was added, and the white bar graph shows the result when the cross-linked antibody was added to cross-link the monoclonal antibody.
  • FIG. 6 shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of each EGFR antibody on OE21 cells.
  • the vertical axis represents the cell viability, which is represented by the relative value of the amount of ATP in living cells with respect to the negative control.
  • FIG. 7A shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of various bispecific antibodies against OE21 cells.
  • the vertical axis represents the cell viability, which is represented by the relative value of the amount of ATP in living cells with respect to the negative control.
  • FIG. 7B shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of various bispecific antibodies against OE21 cells.
  • the vertical axis represents the cell viability, which is represented by the relative value of the amount of ATP in living cells with respect to the negative control.
  • FIG. 7C shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of various bispecific antibodies against OE21 cells.
  • the vertical axis represents the cell viability, which is represented by the relative value of the amount of ATP in living cells with respect to the negative control.
  • FIG. 8A shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of the EGFR-TfR bispecific antibody against OE21, which is a cancer cell line expressing EGFR.
  • the vertical axis represents the cell viability, which is shown by the relative value of the amount of ATP in living cells with respect to the negative control.
  • FIG. 8B is a schematic diagram of EGFR expressing cancer cell line T.
  • 5 shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of EGFR-TfR bispecific antibody against Tn.
  • the vertical axis represents the cell viability, which is shown by the relative value of the amount of ATP in living cells with respect to the negative control.
  • FIG. 8A shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of the EGFR-TfR bispecific antibody against OE21, which is a cancer cell line expressing EGFR.
  • the vertical axis represents the cell viability, which is shown by the relative value of the amount of ATP in living cells with respect to the negative control.
  • FIG. 8C shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of the EGFR-TfR bispecific antibody against U-937, which is a cancer cell line expressing EGFR.
  • the vertical axis represents the cell viability, which is shown by the relative value of the amount of ATP in living cells with respect to the negative control.
  • FIG. 9 shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of GPC3-TfR bispecific antibody against HepG2 cells.
  • the vertical axis represents the cell viability, which is represented by the relative value of the amount of ATP in living cells with respect to the negative control.
  • FIG. 10A shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of GPC3-TfR bispecific antibody against HepG2, which is a hepatoma cell line expressing GPC3.
  • the vertical axis represents the cell viability, which is shown by the relative value of the amount of ATP in living cells with respect to the negative control.
  • FIG. 10B shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of the GPC3-TfR bispecific antibody against HuH-7, which is a hepatoma cell line expressing GPC3.
  • the vertical axis represents the cell viability, which is shown by the relative value of the amount of ATP in living cells with respect to the negative control.
  • FIG. 10C shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of the GPC3-TfR bispecific antibody against HLE, which is a hepatoma cell line expressing GPC3.
  • FIGS. 11A to 11E show the results of evaluation of the inhibitory activity of each antibody or bispecific antibody against the binding of TfR and Tf on OE21 cells.
  • the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity.
  • the thin solid line is the binding activity when the fluorescently labeled transferrin is added after the addition of the negative control
  • the thick solid line is the binding activity when the fluorescently labeled transferrin is added after the addition of the antibody or the bispecific antibody
  • the gray filled histogram is fluorescently labeled. Represents a negative control with no transferrin added.
  • FIGS. 12 shows the results of evaluation by Western blotting of the effect of adding EGFR-TfR bispecific antibody to OE21 cells on the EGFR downstream signal and TfR expression level. Each band represents the expression level of each protein shown on the right side of the figure when each bispecific antibody or antibody was added at the concentration shown at the top of the figure.
  • pEGFR is phosphorylated EGFR protein
  • AKT is a downstream signal protein of EGFR
  • pAKT is phosphorylated AKT protein
  • TFRC is TfR protein
  • ACTB is ⁇ -actin.
  • FIG. 13(A) to (D) show the results of evaluation of the TfR expression level on the cell surface when a EGFR-TfR bispecific antibody was added to OE21 cells using a flow cytometer.
  • the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity.
  • the thin solid line shows the binding activity when the negative control was added and the fluorescently labeled transferrin was added after the culture for 24 hours, and the thick solid line is when the antibody or the bispecific antibody was added and the fluorescently labeled transferrin was added after the culture for 24 hours. Binding activity of H., gray-filled histograms represent negative controls without the addition of fluorescently labeled transferrin.
  • FIG. 14 shows the results of evaluation whether the growth inhibitory activity when the EGFR-TfR bispecific antibody was added to OE21 cells was due to iron depletion.
  • the vertical axis represents the cell viability, which is shown by the relative value of the amount of ATP in living cells with respect to the negative control under the condition that PBS is added and FAS is not added.
  • the black bar graph shows the survival rate when the antibody or the bispecific antibody alone was added, and the hatched bar graph shows the survival rate when the FAS was added together with the antibody or the bispecific antibody.
  • FIG. 15 shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity when the EGFR-TfR bispecific antibody was added to OE21 cells.
  • the vertical axis represents the ratio (%) of cells in the well.
  • FIG. 16 shows the results of evaluating the growth inhibitory activity when the EGFR-TfR bispecific antibody was added to GEMM.
  • the vertical axis represents the survival rate when the amount of ATP in living cells when PBS was added was 100%.
  • FIG. 17A shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of the EGFR-TfR bispecific antibody.
  • FIG. 17B shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of the EGFR-TfR bispecific antibody.
  • FIG. 18(A) is a schematic diagram showing the structure of the EGFR-TfR bispecific antibody prepared in Example 6.
  • FIG. 18B is a schematic diagram showing the structure of the heterodimeric antibody prepared in Example 23.
  • FIG. 19A shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of the EGFR-TfR bispecific antibody.
  • FIG. 19B shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of the EGFR-TfR bispecific antibody.
  • FIG. 20 shows the results of evaluating the growth inhibitory activity of the EGFR-TfR bispecific antibody using the growth inhibitory activity against cancer cell lines as an index.
  • FIG. 21 shows the results of evaluation of the growth inhibitory activity of the EGFR-TfR bispecific antibody.
  • the present invention relates to TfR and cells in which a polypeptide having an antigen-binding site for a cell surface antigen (also referred to as N-terminal side polypeptide) is bound to the N-terminal side of an IgG portion that binds to TfR directly or via a linker.
  • the present invention relates to a bispecific antibody that binds to a surface antigen or the bispecific antibody fragment (hereinafter referred to as the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention).
  • TfR in the present invention is used synonymously with CD71, TFR1, TR, T9, p90, and IMD46.
  • TfR include GenBank accession No. in NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  • SEQ ID NO: 6, GenBank accession No. NP — 003225 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is composed of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and includes a polypeptide having a TfR function.
  • SEQ ID NO: 6 GenBank accession No. NP — 003225 or a polypeptide containing an amino acid sequence having 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and most preferably 95%, 96% or 97.
  • Polypeptides consisting of amino acid sequences having homology of 98%, 98% and 99% or more and having the function of TfR are also included in the TfR of the present invention.
  • SEQ ID NO: 6 GenBank accession No. NP_003225 or a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is a site-directed mutagenesis method [Molecular Cloning, A-Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Laboratory ⁇ Press (1989), Current Protocols in in Molecular Biology, John Wiley&Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. ,USA.
  • GenBank accession No. It can be obtained by introducing a site-specific mutation into DNA encoding NP — 003225 or the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:8.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is preferably 1 to several tens, for example 1 to 20, more preferably 1 to several, for example 1 to 5 amino acids. Is.
  • Examples of the gene encoding TfR include SEQ ID NO: 5 or GenBank accession No. Examples include the human TfR base sequence represented by NM_003234, and the monkey TfR base sequence represented by SEQ ID NO:7. In addition, for example, SEQ ID NO: 5, GenBank accession No. NM_003234 or a gene consisting of a nucleotide sequence having one or more bases deleted, substituted or added in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, and containing a DNA encoding a polypeptide having a TfR function, SEQ ID NO: 5, GenBank accession No.
  • a gene comprising a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of NM — 003234 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 and that contains a DNA encoding a polypeptide having the function of TfR also has the TfR of the present invention. Included in the encoding gene. ..
  • DNA that hybridizes under stringent conditions for example, SEQ ID NO: 5 or GenBank accession No. It means a hybridizable DNA obtained by a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, a DNA microarray method, or the like, which uses a DNA having the nucleotide sequence represented by NM_003234 as a probe. .. Specifically, the presence of 0.7 to 1.0 mol/L of sodium chloride is obtained by using a filter or a slide glass on which DNA derived from hybridized colony or plaque, or PCR product or oligo DNA having the sequence is immobilized.
  • hybridizable DNA for example, SEQ ID NO: 5 or GenBank accession No.
  • a DNA having a homology of 60% or more with the nucleotide sequence represented by NM_003234, a DNA having a homology of 80% or more, more preferably a DNA having a homology of 95% or more can be mentioned.
  • Gene polymorphisms are often found in the nucleotide sequences of genes that encode eukaryotic proteins.
  • a gene having a small-scale mutation in the nucleotide sequence due to such a polymorphism is also included in the gene encoding TfR of the present invention.
  • the numerical value of homology in the present invention may be a numerical value calculated using a homology search program known to those skilled in the art, unless otherwise specified.
  • BLAST Japanese Mol. ., 215, 403 (1990)
  • amino acid sequences such as the values calculated using the default parameters
  • BLAST2 Nucleic Acids Research, 25, 3389 (1997), Genome Research, 7, 649 (1997), [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]
  • numerical values calculated using default parameters are included. ..
  • the default parameters are 5 when G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 when an amino acid sequence, 2 when -E (Cost to extend gap) is a base sequence, and 1 when an amino acid sequence.
  • -Q (Penalty for nucleotides mismatch) is -3
  • -r (reward for nucleotides match) is 1
  • -e (expect value) is 10
  • -W wordsize
  • amino acid sequence In case of 3 residues, -y [Dropoff(X)for blast extensions in bits] is blastn, 20 in programs other than blastn, -X (X dropoff value for gapped alignment in bits) and 15 are -X (X dropoff value for gapped alignment in bits).
  • a polypeptide consisting of a partial sequence of the amino acid sequence of TfR can be produced by a method known to those skilled in the art.
  • SEQ ID NO: 6, GenBank accession No. It can be prepared by deleting a part of the DNA encoding the amino acid sequence represented by NP — 003225 or SEQ ID NO: 8 and culturing a transformant into which an expression vector containing this is introduced.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the partial sequence of NP — 003225 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 can be obtained.
  • a polypeptide consisting of a partial sequence of the amino acid sequence of TfR, or a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the partial sequence of the amino acid sequence of TfR is fluorenylmethyloxycarbonyl. It can also be produced by a chemical synthesis method such as the (Fmoc) method and the t-butyloxycarbonyl (tBoc) method.
  • TfR extracellular region of TfR in the present invention
  • GenBank accession No. The amino acid sequence of human TfR shown in NP — 003225 can be obtained by using the known transmembrane region prediction program SOSUI (http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html), TMHMM ver. 2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) or ExPASy Proteomics Server (http://Ca.expasy.org/).
  • SOSUI transmembrane region prediction program
  • TMHMM ver. 2 http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
  • ExPASy Proteomics Server http://Ca.expasy.org/.
  • TfR The functions of TfR include the uptake of iron, which is essential for cell survival and proliferation.
  • iron When the complex of iron and transferrin binds to TfR, it is taken up into the cell by endocytosis. When the pH in the endosome is lowered, iron is released from transferrin, migrates into the cytoplasm via DMT1, and is used for cell growth and energy production. It is known that the transferrin-TfR complex in which iron is released is not normally decomposed and re-migrates to the cell surface (Reference: Yamashiro DJ et al., Cell 37 37-789-800, 1984).
  • TfR-expressing cells include, for example, many normal tissue cells such as bone marrow and placenta cells, colon cancer, head and neck cancer, brain tumor, hematopoietic tumor, liver cancer, and esophageal cancer. Many types of cancer cells, HT29, HSC-2, RAMOS, K562, HepG2, OE21, T. Many cancer cell lines such as Tn, U-937, HuH-7, and HLE can be mentioned.
  • the cell surface antigen of the present invention refers to an antigen other than TfR among antigens such as proteins and peptide chains expressed on the cell membrane of cancer cells.
  • the cell surface antigen of the present invention may be any as long as it can bind to a protein or polypeptide such as an antibody, but is preferably a cell surface antigen that is internalized and/or degraded by the binding of a protein or polypeptide such as an antibody. ..
  • a protein highly expressed in cancer cells or a cell population involved in a specific disease is preferable.
  • Preferred examples of such cell surface antigens include EGFR and GPC3.
  • EGFR in the present invention is used synonymously with ERBB, ERBB1, HER1, PIG61, MENA, NISBD2, SA7, and c-Erb-1.
  • SEQ ID NO: 14, NP005219 or GenBank accession No. A polypeptide having an EGFR function and comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in XP — 005549616.1.
  • polypeptide comprising an amino acid sequence having a homology of preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more with the amino acid sequence shown in XP — 005549616.1, most preferably 95%, 96%, 97.
  • Polypeptides consisting of amino acid sequences having homology of at least 98%, 98% and 99% and having EGFR function are also included in the EGFR of the present invention.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues have been deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in XP — 005549616.1 can be prepared by, for example, SEQ ID NO: 14 using the site-directed mutagenesis method described above. , NP005219 or GenBank accession No. It can be obtained by introducing a site-specific mutation into the DNA encoding the amino acid sequence shown in XP — 005549616.1.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is preferably 1 to several tens, for example 1 to 20, more preferably 1 to several, for example 1 to 5 amino acids. Is.
  • the gene encoding EGFR in the present invention includes, for example, Genbank accession No.
  • An example is a human EGFR gene containing NM_005228 or the base sequence shown in SEQ ID NO:13.
  • SEQ ID NO: 13 Genbank accession No.
  • a gene comprising DNA encoding a polypeptide having a function of EGFR which consists of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence represented by NM_005228, SEQ ID NO: 13 or Genbank accession No.
  • a gene containing a DNA encoding a polypeptide having a function and SEQ ID NO: 13 or Genbank accession No.
  • a gene comprising a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA containing the nucleotide sequence represented by NM_005228 and that contains a DNA encoding a polypeptide having an EGFR function is also a gene encoding EGFR of the present invention. included.
  • GenBank accession No. The amino acid sequence of human EGFR shown in NP005219 can be obtained by using the known transmembrane region prediction program SOSUI (http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html), TMHMM ver. 2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) or ExPASy Proteomics Server (http://Ca.expasy.org/). Specifically, SEQ ID NO: 10 or GenBank accession No. The amino acid sequence shown from the 25th position to the 645th position of NP005219 can be mentioned.
  • EGFR functions as a receptor with EGF, forms a dimer after binding EGF, and through signals such as Ras/Raf/MAPK pathway, PI3K/Akt pathway, Jak/STAT pathway, It includes promoting cell proliferation, survival, invasion, migration and the like. It is known that EGFR on the cell membrane is internalized when EGF binds, and is transferred to lysosomes by endocytosis and degraded (Ebner R et al., Cell Regul. 2 599-612, 1991). ..
  • Cells expressing EGFR include, for example, epithelial cells of normal tissues such as skin, large intestine and lung, epithelial cancer cells including large intestine cancer, head and neck cancer, lung cancer, esophageal cancer, HT29, HSC-2, NCI-H1975, OE21, T.I. Cancer cell lines such as Tn and A431 can be mentioned.
  • the GPC3 in the present invention is used synonymously with DGSX, GTR2-2, MXR7, OCI-5, SDYS, SGB, SGBS, SGBS1.
  • GPC3 The function of GPC3 is, for example, to be involved in the cell division and proliferation of cancer cells such as liver cancer by binding to proteins related to Wnt pathway and Frizzled pathway.
  • Genbank accession No. Human GPC3 including the amino acid sequence shown in P51654 can be mentioned.
  • the extracellular region of GPC3 in the present invention includes, for example, GenBank accession No.
  • GenBank accession No. The amino acid sequence of human GPC3 shown in P51654 is the known transmembrane region prediction program SOSUI (http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html), TMHMM ver. 2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) or ExPASy Proteomics Server (http://Ca.expasy.org/).
  • SOSUI Transmembrane region prediction program
  • TMHMM ver. 2 http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
  • ExPASy Proteomics Server http://Ca.expasy.org/.
  • GenBank accession No. The amino acid sequences shown as 1st to 559th of P51654 are mentioned.
  • Examples of cells expressing GPC3 include fetal liver cells, cancer cells such as liver cancer, and cancer cell lines such as HepG2 and HuH-7.
  • An antibody is a gene that encodes all or part of a heavy chain variable region and a heavy chain constant region, and a light chain variable region and a light chain constant region that make up an immunoglobulin (referred to as “antibody gene”). Is a protein derived from.
  • the antibody of the present invention includes an antibody or an antibody fragment having any immunoglobulin class and subclass.
  • Heavy chain refers to the polypeptide with the larger molecular weight of the two types of polypeptides that make up the immunoglobulin molecule. Heavy chains determine the class and subclass of antibody. IgA, IgD, IgE, IgG and IgM have ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain and ⁇ chain as heavy chains, respectively, and the constant regions of the heavy chains are characterized by different amino acid sequences.
  • the light chain (L chain) refers to the polypeptide having the smaller molecular weight of the two types of polypeptides constituting the immunoglobulin molecule. In the case of human antibodies, there are two types of light chains, the ⁇ chain and the ⁇ chain.
  • variable region usually refers to a highly diverse region existing in the amino acid sequence on the N-terminal side of immunoglobulin. Since the portion other than the variable region has a structure with little diversity, it is called a constant region (C region).
  • C region constant region
  • variable region corresponds to the amino acid sequence from the 1st to 117th in the EU index of Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 1991 Fifth edition) and the constant region It corresponds to the 118th and subsequent amino acid sequences.
  • amino acid sequence from the 1st to 107th in the numbering (Kabat numbering) by Kabat et al. corresponds to the variable region
  • amino acid sequence from the 108th to the constant region corresponds to the constant region.
  • the heavy chain variable region or the light chain variable region is abbreviated as VH or VL.
  • An antigen-binding site is a site that recognizes and binds an antigen in an antibody and refers to a site that forms a three-dimensional structure complementary to an antigenic determinant (epitope).
  • the antigen binding site produces strong intermolecular interactions with the antigenic determinant.
  • the antigen binding site is composed of VH and VL containing at least three complementarity determining regions (CDRs). For human antibodies, VH and VL each have three CDRs. These CDRs are referred to as CDR1, CDR2 and CDR3 in order from the N-terminal side.
  • the heavy chain constant region or the light chain constant region is expressed as CH or CL, respectively.
  • CH is classified by the heavy chain subclasses ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain and ⁇ chain.
  • CH is composed of a CH1 domain, a hinge domain, a CH2 domain, and a CH3 domain arranged in order from the N-terminal side, and the CH2 domain and the CH3 domain are collectively referred to as an Fc region.
  • CL is classified into two subclasses called C ⁇ chain and C ⁇ chain.
  • Monoclonal antibody is an antibody secreted by antibody-producing cells that retain monoclonality and recognizes a single epitope (also called an antigenic determinant). Monoclonal antibody molecules have the same amino acid sequence (primary structure) and have a single structure. Polyclonal antibody refers to a population of antibody molecules secreted by antibody-producing cells of different clones. An oligoclonal antibody refers to a population of antibody molecules in which a plurality of different monoclonal antibodies are mixed.
  • An epitope is a structural site of an antigen that an antibody recognizes and binds to.
  • Examples of the epitope include a single amino acid sequence recognized and bound by a monoclonal antibody, a three-dimensional structure consisting of an amino acid sequence, a three-dimensional structure consisting of an amino acid sequence bound to a sugar chain and an amino acid sequence bound to a sugar chain. ..
  • Examples of the monoclonal antibody in the present invention include an antibody produced by a hybridoma and a gene recombinant antibody produced by a transformant transformed with an expression vector containing an antibody gene.
  • a hybridoma can be prepared, for example, by preparing an antigen, obtaining an antibody-producing cell having antigen specificity from an animal immunized with the antigen, and further fusing the antibody-producing cell with a myeloma cell. it can.
  • the desired monoclonal antibody can be obtained by culturing the hybridoma, or by administering the hybridoma to an animal to cause ascites tumor in the hybridoma and separating and purifying the culture medium or ascites.
  • an animal to be immunized with the antigen any animal can be used as long as a hybridoma can be produced, and mouse, rat, hamster, rabbit and the like are preferably used. It is also possible to obtain cells having antibody-producing ability from such immunized animals, immunize the cells in vitro, and then fuse the cells with myeloma cells to prepare hybridomas.
  • the gene recombinant antibody in the present invention examples include recombinant mouse antibody, recombinant rat antibody, recombinant hamster antibody, recombinant rabbit antibody, human chimeric antibody (also referred to as chimeric antibody), humanized antibody (CDR-grafted antibody). (Also referred to as) and human antibodies, and antibodies produced by gene recombination techniques.
  • the variable region and constant region of the heavy and light chains derived from any animal species can be determined according to the target animal species and purpose. For example, when the target animal species is human, the variable region can be derived from a non-human animal such as human or mouse, and the constant region and the linker can be derived from human.
  • Chimeric antibody refers to an antibody composed of VH and VL of antibodies of non-human animals (non-human animals) and CH and CL of human antibodies.
  • non-human animal any animal such as mouse, rat, hamster and rabbit can be used as long as a hybridoma can be produced.
  • a chimeric antibody is obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL from a hybridoma derived from a non-human animal producing a monoclonal antibody, and inserting the cDNAs into animal cell expression vectors having DNAs encoding CH and CL of human antibody, respectively. It can be produced by constructing a chimeric antibody expression vector, introducing it into an animal cell and expressing it.
  • Humanized antibody refers to an antibody in which CDRs of non-human animal antibody VH and VL are transplanted to corresponding CDRs of human antibody VH and VL. Regions other than CDRs of VH and VL are called framework regions (hereinafter referred to as FR).
  • the humanized antibody includes a cDNA encoding a VH amino acid sequence consisting of the VH CDR amino acid sequence of a non-human animal antibody and the VH FR amino acid sequence of any human antibody, and the VL CDR amino acid of a non-human animal antibody.
  • a cDNA encoding the amino acid sequence of VL consisting of the sequence and the amino acid sequence of FR of VL of any human antibody is constructed and inserted into an expression vector for animal cells having DNAs encoding CH and CL of the human antibody, respectively It can be produced by constructing a modified antibody expression vector, introducing it into an animal cell and expressing it.
  • the human antibody originally refers to an antibody that naturally exists in the human body, but a human antibody phage library and a human antibody-producing transgene produced by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering techniques. Antibodies obtained from transgenic animals are also included.
  • Antibodies that naturally occur in the human body are obtained by, for example, immunizing human peripheral blood lymphocytes with EB virus or the like to immortalize and cloning the lymphocytes producing the antibody, and culturing the lymphocytes producing the antibody from the culture supernatant. It can be obtained by purifying the antibody.
  • the human antibody phage library is a library in which antibody fragments such as Fab and scFv are expressed on the phage surface by inserting an antibody gene prepared from human B cells into the phage gene. Phage expressing an antibody fragment having a desired antigen-binding activity on the surface can be recovered from the library by using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule consisting of two complete H chains and two complete L chains by a genetic engineering technique.
  • Human antibody-producing transgenic animal means an animal in which a human antibody gene is incorporated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic mouse can be produced by introducing a human antibody gene into a mouse ES cell, transplanting the ES cell into an early embryo of a mouse, and then developing an individual.
  • Human antibody-producing human antibodies are derived from transgenic animals by producing and accumulating the antibodies in the culture supernatant by obtaining and culturing the hybridomas using the hybridoma production method that is usually performed in non-human animals.
  • the CH of the gene recombinant antibody may be any as long as it belongs to a human immunoglobulin, but a human immunoglobulin G (hIgG) class is preferable. Further, any of the subclasses belonging to the hIgG class, such as hIgG1, hIgG2, hIgG3 and hIgG4, can be used.
  • the CL of the recombinant antibody may be any CL as long as it belongs to human immunoglobulin, and CL of the ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • a bispecific antibody refers to a polypeptide or protein that specifically binds to each of two different types of epitopes.
  • Each antigen binding site of a bispecific antibody may bind to different epitopes of a single antigen or may bind to different antigens.
  • binding of a polypeptide, an antibody or an antibody fragment thereof or a bispecific antibody or a bispecific antibody fragment to any one of a cell surface antigen such as EGFR or GPC3 and TfR is known, for example, in known immunology. It can be confirmed by a method for confirming the binding property between the cell surface antigen or the TfR-expressing cells to be evaluated and the antibody using a dynamic detection method, preferably a fluorescent cell staining method.
  • the antigen binding site that binds to a cell surface antigen such as EGFR or GPC3 or TfR may be any as long as it specifically recognizes and binds to a cell surface antigen such as EGFR or GPC3 or TfR. ..
  • polypeptides, protein molecules and fragments thereof that can be produced by gene recombination techniques such as antibodies, ligands, receptors, and naturally occurring interacting molecules, and conjugates of the protein molecules with small molecules or natural products It may be in any form.
  • the antigen-binding site may be a binding protein that is recombined using a binding domain of a known binding molecule such as an antibody, a ligand, and a receptor.
  • a recombinant protein containing the CDR of an antibody that binds to each antigen is used.
  • examples include proteins, antibody variable regions containing CDRs, recombinant proteins containing antibody variable regions and the binding domains of ligands that bind to each antigen.
  • the antigen binding site is preferably the variable region of the antibody.
  • the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention includes, for example, a bispecific antibody having the TfR internalization and/or degrading activity or the bispecific antibody fragment.
  • the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention is a cell such as EGFR or GPC3 that does not show TfR internalization and/or degrading activity in cells that do not express cell surface antigens such as EGFR or GPC3.
  • a bispecific antibody or a bispecific antibody fragment thereof that exhibits TfR internalization and/or degradation activity only in cells that express the surface antigen is preferred.
  • Such a bispecific antibody or the bispecific antibody fragment expresses a cell surface antigen such as EGFR or GPC3, and selectively exhibits TfR internalization and/or degrading activity in pathogenic cells such as cancer cells. It is preferable in that it does not cause side effects associated with nonspecific TfR internalization and/or degradation.
  • the internalizing and/or degrading activity of TfR possessed by the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention means that the cell surface antigen such as EGFR or GPC3 on cells and TfR are both bispecific antibodies or the bispecific antibody fragments.
  • the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention may bind to a cell surface antigen such as EGFR or GPC3 expressed on the same cell and TfR, or EGFR expressed on a different cell or although it may bind to a cell surface antigen such as GPC3 and TfR, it preferably binds to a cell surface antigen such as EGFR or GPC3 expressed on the same cell and TfR.
  • the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention induces internalization and/or degradation of TfR to induce cell death of cells expressing a target cell surface antigen such as EGFR or GPC3. Those that induce are preferred.
  • the internalization and/or degradation activity of TfR possessed by the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention can be determined by, for example, OE21, T.R.
  • Cell surface and intracellular TfR protein amount of cells expressing TfR such as Tn, TE-8, U-937, HepG2, HuH-7 and HLE, viable cell number, cell proliferation rate, cell viability or cell It can be confirmed by evaluating the uptake of iron.
  • the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention specifically, the bispecific antibody or the bispecific antibody that induces the degradation of TfR when bound to both TfR and a cell surface antigen such as EGFR or GPC3.
  • the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention specifically, the bispecific antibody or the bispecific antibody that induces the degradation of TfR when bound to both TfR and a cell surface antigen such as EGFR or GPC3.
  • Examples include bispecific antibody fragments.
  • the number of binding domains for a given antigen possessed by one molecule of bispecific antibody is called the valency of binding.
  • the bispecific antibody binds to EGFR and TfR with divalent antigens, respectively. Join with.
  • the bispecific antibody of the present invention includes an antibody having a plurality of antigen-binding sites bound via an appropriate linker such as a linker containing an immunoglobulin domain or a fragment thereof.
  • the bispecific antibody of the present invention can be produced by existing production techniques ([Nature Protocols, 9, 2450-2463 (2014)], International Publication No. 1998/050431, International Publication No. 2001/7734, International Publication No. 2002/002773. And International Publication No. 2009/131239).
  • a polypeptide capable of binding to a cell surface antigen binds to the N-terminus of the heavy chain of the IgG portion that binds to TfR directly or via a linker. It has a structure.
  • the immunoglobulin domain has, as a minimum unit, a peptide having an amino acid sequence similar to that of an immunoglobulin and consisting of about 100 amino acid residues having at least two cysteine residues.
  • the immunoglobulin domain also includes a polypeptide containing a plurality of the above-mentioned minimum unit immunoglobulin domains. Examples of the immunoglobulin domain include VH, CH1, CH2 and CH3 of immunoglobulin heavy chain, and VL and CL of immunoglobulin light chain.
  • the animal species of immunoglobulin is not particularly limited, but human is preferred.
  • the subclass of the constant region of the immunoglobulin heavy chain may be any of IgD, IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 and IgE, preferably IgG-derived and IgM-derived.
  • the subclass of the constant region of immunoglobulin light chain may be either ⁇ or ⁇ .
  • the immunoglobulin domain also exists in proteins other than immunoglobulins, and for example, an immunoglobulin domain included in proteins belonging to the immunoglobulin superfamily such as major histocompatibility complex (MHC), CD1, B7, and T cell receptor (TCR). Are listed.
  • MHC major histocompatibility complex
  • CD1, B7 CD1, B7, and T cell receptor (TCR).
  • TCR T cell receptor
  • CH1 refers to the region having the amino acid sequence of 118th to 215th amino acids shown by EU index.
  • CH2 refers to a region having an amino acid sequence from the 231st to 340th position shown by the EU index of Kabat et al.
  • CH3 refers to a region having an amino acid sequence from the 341st to 447th position shown by the EU index of Kabat et al. ..
  • a hinge region hereinafter sometimes referred to as a hinge).
  • the hinge region refers to a region having an amino acid sequence from the 216th position to the 230th position shown by the EU index of Kabat et al.
  • CL is a region having the amino acid sequence from 108th to 214th indicated by Kabat numbering in the case of human antibody ⁇ chain, and a region having the 108th to 215th amino acid sequence in the case of ⁇ chain. Refer to each.
  • the IgG type antibody of the present invention which is also referred to as an IgG portion, refers to a partial structure of IgG constituting the bispecific antibody of the present invention or an IgG having a modified Fc portion, and is composed of one light chain and one heavy chain. It has a heterotetramer structure in which two heterodimers are associated.
  • the IgG portion that binds to TfR of the present invention refers to an IgG portion that recognizes TfR, that is, an IgG portion that specifically recognizes and binds to the extracellular region of TfR.
  • the heavy chain constant region of IgG may be any of IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 subclasses.
  • a part of those amino acid sequences may be deleted, added, substituted, and/or inserted.
  • all or part of the amino acid sequence consisting of CH1, hinge, CH2, and CH3 of the heavy chain of IgG can be appropriately combined and used.
  • those amino acid sequences can be partially deleted or the order can be changed.
  • the subclass of IgG used for the IgG part is not particularly limited, but IgG4 variant in which the Ser residue at position 228 of the heavy chain constant region of IgG4, IgG4 is replaced with Pro and the Leu residue at position 235 is replaced with Asn, respectively.
  • IgG4PE an IgG4 mutant
  • IgG4PE R409K an IgG4 mutant
  • the constant region of the heavy chain (CH1-hinge-CH2-CH3 in order from the N-terminal side) comprises an IgG portion consisting of IgG4PE containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:86, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:84.
  • IgG part consisting of IgG4PE R409K containing is preferred.
  • the two variable regions contained in the IgG portion of the present invention preferably recognize the same antigen. It is also preferable that they have the same structure and amino acid sequence.
  • the N-terminal side polypeptide that binds to a cell surface antigen is a partial structure constituting the bispecific antibody of the present invention, which exists on the N-terminal side of the heavy chain or light chain of the IgG part, and is present in each cell.
  • a polypeptide that specifically recognizes and binds to the extracellular region of a surface antigen is present in each cell.
  • the bispecific antibody of the present invention may have one N-terminal polypeptide at each of the N-terminals of the heavy chains or light chains of both of the two heterodimers constituting the IgG portion, or one heterodimer. Although it may have one at the N-terminal of each of them, it is preferable to have one at the N-terminals of both heavy chains or light chains. When both heavy chains or light chains have one N-terminal polypeptide at each N-terminal, they may be the same or different, but they are the same N-terminal polypeptide. Is preferred.
  • the N-terminal polypeptide of the present invention may be a single chain or a multimer composed of a plurality of polypeptide chains, as long as it has the ability to bind to a cell surface antigen.
  • Examples of the N-terminal side polypeptide include Fab, Fab', scFv, dsFv and VHH which are antibodies against cell surface antigens, and Fab or VHH is preferable.
  • ligand molecules and receptor molecules for cell surface antigens can be used in the same manner.
  • Antibodies against cell surface antigens refer to monoclonal antibodies that specifically recognize and bind to the extracellular region of each cell surface antigen.
  • anti-EGFR antibody and anti-GPC3 antibody refer to monoclonal antibodies that specifically recognize and bind to the extracellular regions of EGFR and GPC3, respectively.
  • the linker may have any molecular structure as long as it binds the IgG part and the N-terminal side polypeptide, but a peptide chain is preferable.
  • the amino acid sequence of the peptide chain includes, for example, a sequence consisting of a repeating sequence of ES, ESKYG, ESKYGPP, GGGGS, or GGGGS, or a sequence consisting of part or all of the constant region of the antibody hinge region and CH1 domain. And so on.
  • the light chain contained in the Fab and the light chain of the IgG part may be the same or different. , And preferably the same.
  • the light chain may be either ⁇ chain or ⁇ chain, but is preferably ⁇ chain.
  • the antibody fragment thereof is also included in the bispecific antibody of the present invention or the antibody fragment thereof.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and/or added is 1 or more, and the number is not particularly limited. Molecular Cloning, The Second Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Current Protocols in in Molecular Biology , John Wiley&Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985) etc., deletion, substitution, insertion or addition by well-known techniques such as site-directed mutagenesis It is the number that can be done. For example, it is usually 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5.
  • deletion, substitution, insertion or addition of one or more amino acid residues in the above amino acid sequence of the bispecific antibody of the present invention means the following. It means that there is a deletion, substitution, insertion or addition of one or more amino acid residues in any one or more amino acid sequences in the same sequence. In addition, deletion, substitution, insertion or addition may occur at the same time, and the amino acid residue to be substituted, insertion or addition may be natural type or non-natural type.
  • natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L -Arginine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine and L-cysteine.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group C asparagine, glutamine
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • F group serine, threonine, homoserine
  • G group phenylalanine, tyrosine
  • the bispecific antibody or the antibody fragment of the present invention includes an antibody containing any post-translationally modified amino acid residue.
  • Post-translational modifications include, for example, deletion of a lysine residue at the C-terminus of the H chain [lysine clipping] and substitution of a glutamine residue at the N-terminus of a polypeptide with pyroglutamine (pyroGlu). [Beck et al, Analytical Chemistry, 85, 715-736 (2013)].
  • bispecific antibody of the present invention include any one bispecific antibody selected from the group consisting of the following (1) to (4).
  • a bispecific antibody comprising a Fab containing a variable region of an antibody against a cell surface antigen and an IgG portion binding to TfR, wherein the Fab directly binds to the N-terminus of the heavy chain of the IgG portion
  • a bispecific antibody comprising a VH containing CDR1 to 3 of VH and a VL containing CDR1 to 3 of VL of an antibody against a cell surface antigen, and a bispecific antibody containing an IgG portion binding to TfR, wherein the Fab is an IgG portion.
  • Antibody that binds directly to the N-terminus of the heavy chain of (3) Bispecific antibody containing Fab containing VH and VL of antibody to cell surface antigen and IgG portion binding to TfR, wherein the Fab directly binds to N terminus of heavy chain of IgG portion And (4) a bispecific antibody comprising a VHH that binds to a cell surface antigen and an IgG portion that binds to TfR, wherein the VHH directly binds to the N-terminus of the heavy chain of the IgG portion.
  • the VL of the IgG portion that binds to TfR and the VL of the Fab may be the same or different, but they are the same. preferable.
  • VL including CDR1, 2 and 3 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 17, 18 and 19 and CDR1 to 3 shown in 1) to 3) below are included.
  • Examples include IgG moieties that bind to TfR, including VH.
  • CDR1 comprising an amino acid sequence modified by one substitution.
  • substitution of the first valine with alanine substitution of the second isoleucine with alanine or leucine, and substitution of the seventh valine A CDR2 comprising an amino acid sequence modified by at least one substitution selected from glutamic acid substitution, 10th aspartic acid substitution with alanine and 13th aspartic acid substitution with proline.
  • CDR3 including substitution of proline at position 4 with any natural amino acid, for example, alanine, tyrosine, serine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, threonine, arginine, glycine, lysine, methionine, valine, leucine, isoleucine, tryptophan. , Phenylalanine or histidine.
  • any natural amino acid for example, alanine, tyrosine, serine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, threonine, arginine, glycine, lysine, methionine, valine, leucine, isoleucine, tryptophan.
  • Phenylalanine or histidine substitution of proline at position 4 with any natural amino acid, for example, alanine, tyrosine, serine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, threonine, arginine, glycine
  • the IgG portion that binds to TfR of the present invention includes the amino acid sequences of CDR1 to 3 of VH shown in SEQ ID NOs: 32, 33 and 34, and the amino acid sequences of CDR1 to 3 of VL shown in SEQ ID NOs: 17 to 19, respectively.
  • the IgG part that binds to TfR of the present invention also includes the antibodies described in (ai) or (aii) below.
  • An IgG moiety that binds to TfR that competes with an anti-TfR antibody that comprises TfR.
  • VL containing CDR1, 2 and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 17, 18 and 19, respectively, and VH containing the CDR1, 2 and 3 containing amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 32, 33 and 34, respectively.
  • An IgG portion that binds to TfR that binds to the same epitope as an anti-TfR antibody that comprises.
  • the TfR-binding IgG portion of the present invention also includes the antibodies described in (bi) or (bii) below.
  • VL containing CDR1, 2 and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 17, 18 and 19, respectively, and VH containing the CDR1, 2 and 3 containing amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 42, 43 and 44, respectively.
  • the IgG moiety that binds to TfR of the present invention also includes the antibody described in (ci) or (cii) below.
  • a VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 and a TfR containing VH containing the amino acid sequence represented by 26, 31, 36, 41, 46 or 106 Included are the IgG moieties that bind.
  • the IgG portion that binds to TfR of the present invention binds to TfR that includes VL including CDR1 to 3 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 17 to 19 and 1 VH selected from the following, respectively.
  • An IgG portion is included.
  • A CDR2 and 3 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 33 and 34, respectively, and the amino acid modified from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 by substitution of the second tyrosine with alanine or phenylalanine VH containing CDR1 containing sequence
  • B CDR2 and 3 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 33 and 34, respectively, and an amino acid modified from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 by substitution of threonine at position 3 with alanine or glycine VH containing CDR1 containing sequence
  • C CDR1 and 3 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 32 and 34, and an amino acid sequence modified by substitution of the first amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 with valine at alanine.
  • CDR2 including VH D
  • E CDR1 and 3 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 32 and 34, respectively, and an amino acid sequence modified from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 by substitution of valine at position 7 with glutamic acid.
  • the CDR1 and 2 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 32 and 33, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 were modified by substitution of glutamine at position 3 with alanine or aspartic acid.
  • VH containing CDR3 containing amino acid sequence (I)
  • VH containing CDR3 containing amino acid sequence From CDRs 1 and 2 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 32 and 33, respectively, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34, alanine, tyrosine, serine, aspartic acid, glutamine of the fourth proline, VH containing CDR3 containing an amino acid sequence modified by substitution with glutamic acid, threonine, arginine, glycine, lysine, methionine, valine, leucine, isoleucine, tryptophan, phenylalanine or histidine (K) CDR1 and 2 containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 32 and 33, respectively, and substitution of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 with alanine, phenylalanine, histidine or tyrosine at the 5th tryptophan.
  • the VL including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 are used to determine the EU index (hereinafter, EU index) by Kabat et al. Any amino acid of Y32A, Y32F, T33A, T33G, L45A, V48A, V50A, I51A, I51L, V55E, D58A, D61P, Q97A, Q97D, W99A, W99F, W99H, W99Y, Y100AA, Y100AF, V102L, and P98 shown.
  • the IgG portion that binds to TfR of the present invention at least one selected from the 352nd Asp, 355th Ser, 356th Asp, and 358th Lys of the amino acid sequence of TfR represented by SEQ ID NO: 6.
  • IgG portion that binds to TfR that recognizes one amino acid residue and at least one amino acid residue selected from Met at position 365, Val at position 366, and Glu at position 369.
  • at least two amino acid residues of the 352nd Asp, the 355th Ser, the 356th Asp and the 358th Lys, and the 365th Met, 366 are included.
  • IgG part that binds to TfR that recognizes at least two amino acid residues of the second Val and the 369th Glu; at least 3 selected from the 352nd Asp, the 355th Ser, the 356th Asp, and the 358th Lys IgG moiety that binds to TfR that recognizes one amino acid residue and all amino acid residues of Met at position 365, Val at position 366, and Glu at position 369; Asp at position 352, Ser at position 355, Asp at position 356.
  • anti-EGFR antibody of the present invention any one selected from VL containing CDR1, 2 and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 17, 18 and 19 and (2a) to (2b) below, respectively.
  • Anti-EGFR antibodies including VH are included.
  • the anti-EGFR antibody of the present invention comprises the amino acid sequences of CDR1 to 3 of VH shown in any one of (2a) to (2b) above and the amino acid sequences of CDR1 to 3 of VL shown in SEQ ID NOs: 17 to 19, respectively. And at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, respectively. , At least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% homologous, including anti-EGFR antibodies comprising the VH and VL CDR1-3 amino acid sequences.
  • the anti-EGFR antibody of the present invention also includes the antibodies described in (i) or (ii) below.
  • anti-EGFR antibody of the present invention include one bispecific antibody selected from the following (a) to (e).
  • (b) containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 110 Antibody containing VH and VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:111
  • VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 116 and sequence Antibody containing VL containing the amino acid sequence represented by No. 117
  • an N-terminal polypeptide and an IgG portion that binds to TfR are included, the N-terminal polypeptide is Fab, and the C-terminal of VH-CH1 of the Fab binds to the TfR. Also included are bispecific antibodies linked to the N-terminus of the heavy chain directly or via a linker.
  • the polypeptide comprises an N-terminal side polypeptide and an IgG portion that binds to TfR, the N-terminal side polypeptide is Fab, and the C-terminal of VL-CL of the Fab binds to the TfR.
  • bispecific antibodies that are attached to the N-terminus of the heavy chain of the IgG moiety either directly or via a linker.
  • One aspect of the present invention is a bispecific antibody containing an IgG portion that binds to TfR and an N-terminal polypeptide that binds to EGFR.
  • bispecific antibody of the present invention includes bispecific antibodies represented by the following (i) to (iv).
  • a specific antibody A bispecific antibody in which the Fab binds to the N-terminus of the heavy chain of the IgG portion that binds to the TfR directly or via a linker.
  • A VH containing CDR1, 2 and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 22, 23 and 24, respectively
  • B VH containing CDR1, 2 and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 27, 28 and 29, respectively
  • C VH containing CDR1, 2 and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 32, 33 and 34, respectively
  • D VH containing CDR1, 2 and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 37, 38 and 39, respectively
  • E VH containing CDR1, 2 and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 42, 43 and 44, respectively
  • F VH containing CDR1, 2 and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 47, 48 and 49, respectively
  • (Iv) Fab of anti-EGFR antibody including VL containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 16 and VH containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 59, and VL containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO:
  • a bispecific antibody comprising an IgG portion that binds to TfR, comprising a VH comprising an amino acid sequence represented by 21, 26, 31, 36, 41 or 46, comprising:
  • a bispecific antibody in which the Fab binds to the N-terminus of the heavy chain of the IgG portion that binds to the TfR directly or via a linker.
  • V Fab of anti-EGFR antibody, including VL including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 and VH including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 64, and VL including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO:
  • a bispecific antibody in which the Fab binds to the N-terminus of the heavy chain of the IgG portion that binds to the TfR directly or via a linker.
  • (Vi) Fab of anti-EGFR antibody including VL containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 16 and VH containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 69, and VL containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO:
  • a bispecific antibody in which the Fab binds to the N-terminus of the heavy chain of the IgG portion that binds to the TfR directly or via a linker.
  • VL-CL As the bispecific antibody represented by the above (i) to (vi), even if the Fab VH-CH1 is bound directly or via a linker to the heavy chain N-terminus of the IgG portion that binds to the TfR, VL-CL may be used, but VH-CH1 is preferable.
  • a bispecific antibody in which a polypeptide at the N-terminal side binds to the C-terminal of the heavy chain of an IgG part that binds to TfR directly or via a linker, wherein Bispecific antibodies that are IgG1, IgG4 or variants thereof are mentioned.
  • the heavy chain constant region of the IgG portion that binds to the TfR contains IgG4PE or IgG4PE R409K
  • a bispecific antibody in which the N-terminal polypeptide is bound to the N-terminal of the heavy chain of the IgG portion that binds to the TfR directly or via a linker is included.
  • an IgG part that binds to TfR and an N-terminal side polypeptide that binds to EGFR are included, the N-terminal side polypeptide is Fab, and Fab is a heavy chain N-terminal of the IgG part via a linker.
  • Bispecific antibodies that are bound are included.
  • a more preferable embodiment is a bispecific antibody in which the amino acid sequence of the linker is one selected from the repeating sequences of ES, ESKYG, ESKYGPP, GGGGS, or GGGGS.
  • bispecific antibody of the present invention examples include E08-TfR1071 or E12-TfR1071.
  • the bispecific antibody or the antibody fragment of the present invention also includes an antibody having the effector activity or the antibody fragment.
  • the effector activity refers to antibody-dependent cytotoxic activity caused through the Fc region of the antibody, and includes, for example, antibody-dependent cytotoxic activity (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity; ADCC activity), complement-dependent cytotoxicity. Activity (Complement-Dependent Cytotoxicity; CDC activity), antibody-dependent phagocytic activity such as macrophage and dendritic cells (Antibody-dependent cellular phagocytosis activity; ADCP activity, etc.) and ADCP activity.
  • ADCC activity and CDC activity can be measured using a known measurement method [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)].
  • ADCC activity means that the antibody bound to the antigen on the target cell activates immune cells (natural killer cells, etc.) by binding to the Fc receptor of immune cells through the Fc region of the antibody, and damages the target cells. Activity.
  • Fc receptor is a receptor that binds to the Fc region of an antibody, and induces various effector activities upon binding of the antibody.
  • Each FcR corresponds to a subclass of antibody, and IgG, IgE, IgA, and IgM specifically bind to Fc ⁇ R, Fc ⁇ R, Fc ⁇ R, and Fc ⁇ R, respectively.
  • Fc ⁇ R has subtypes of Fc ⁇ RI (CD64), Fc ⁇ RII (CD32) and Fc ⁇ RIII (CD16), and each of the subtypes has Fc ⁇ RIA, Fc ⁇ RIB, Fc ⁇ RIC, Fc ⁇ RIIA, Fc ⁇ RIIB, Fc ⁇ RIIC, Fc ⁇ RIIIA and Fc ⁇ RIIIA isoforms.
  • Fc ⁇ RIIIB is specifically expressed on neutrophils
  • Fc ⁇ RIIIA is expressed on monocytes, natural killer cells (NK cells), macrophages and some T cells.
  • NK cell-dependent ADCC activity is elicited through binding of the antibody to Fc ⁇ RIIIA.
  • CDC activity refers to the activity in which an antibody bound to an antigen on a target cell activates a series of cascades (complement activation pathway) consisting of a group of complement-related proteins in blood to damage the target cell.
  • cascades complement activation pathway
  • migration and activation of immune cells are induced by protein fragments generated by activation of complement.
  • the cascade of CDC activity is initiated by C1q binding to the Fc region and then to the two serine proteases C1r and C1s to form the C1 complex.
  • the CDC activity or the ADCC activity of the bispecific antibody or the antibody fragment of the present invention against the cells expressing the antigen can be evaluated by a known measurement method [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)].
  • the ADCC activity of the antibody can be increased or decreased.
  • a bispecific antibody is expressed using a host cell deficient in ⁇ 1,6-fucosyltransferase gene. By doing so, a bispecific antibody having high ADCC can be obtained.
  • the antibody was expressed using a host cell into which ⁇ 1,6-fucosyltransferase gene was introduced. By doing so, a bispecific antibody having low ADCC activity can be obtained.
  • ADCC activity and CDC activity can be increased or decreased by modifying the amino acid residue of the Fc region of the bispecific antibody.
  • the CDC activity of a bispecific antibody can be increased by using the amino acid sequence of the Fc region described in US Patent Application Publication No. 2007/0148165.
  • ADCC activity can be obtained by making amino acid modifications described in US Pat. No. 6,737,056, US Pat. No. 7,297,775, US Pat. No. 7,317,091, and the like.
  • CDC activity can be increased or decreased.
  • the stability of the bispecific antibody of the present invention can be evaluated by measuring the amount of aggregates (oligomers) formed in a sample stored under a purification process or under certain conditions. That is, when the amount of aggregates is reduced under the same conditions, the stability of the antibody is evaluated as improved.
  • the amount of aggregates can be measured by separating the aggregated antibody from the non-aggregated antibody using an appropriate chromatography including gel filtration chromatography.
  • the productivity of the bispecific antibody of the present invention can be evaluated by measuring the amount of antibody produced in the culture medium from antibody-producing cells. More specifically, it can be evaluated by measuring the amount of antibody contained in the culture supernatant obtained by removing the producing cells from the culture broth by an appropriate method such as the HPLC method or the ELISA method.
  • the antibody fragment is a protein having an antigen-binding site and having an antigen-binding activity with respect to the antigen.
  • a peptide containing Fab, Fab′, F(ab′) 2 , scFv, Diabody, dsFv, VHH or CDR and the like can be mentioned.
  • Fab is a fragment obtained by treating an IgG antibody with papain, which is a proteolytic enzyme (cleaved at the 224th amino acid residue of the H chain), and the N-terminal half of the H chain and the entire L chain are disulfides. It is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having an antigen-binding activity, which is bound by a bond (SS bond).
  • the Fab heavy chain containing VH and CH1 is referred to as VH-CH1.
  • the L chain of Fab containing VL and CL is referred to as VL-CL.
  • F(ab′) 2 is a fragment obtained by treating IgG with the proteolytic enzyme pepsin (which is cleaved at the 234th amino acid residue of the H chain), and Fab is mediated by the SS bond in the hinge region. It is an antibody fragment having a molecular weight of about 100,000 and having an antigen-binding activity, which is slightly larger than that of the antibody.
  • Fab′ is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having antigen-binding activity, which is obtained by cleaving the SS bond in the hinge region of F(ab′) 2 .
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (P) of 12 residues or more, and antigen-binding It is an antibody fragment having activity.
  • Diabody is an antibody fragment in which scFv having the same or different antigen-binding specificity forms a dimer, and has divalent antigen-binding activity for the same antigen or specific antigen-binding activity for different antigens. Is.
  • DsFv refers to a polypeptide obtained by substituting a cysteine residue for each one amino acid residue in VH and VL, and binding the polypeptide via an SS bond between the cysteine residues.
  • VHH also called Nanobody
  • VHH refers to the heavy chain variable region in VHH antibodies and is capable of binding antigen in the absence of other polypeptides.
  • VHH antibody is an antibody that exists in camelid animals such as alpaca and cartilage fish such as sharks. It consists of only heavy chain without light chain and CH1.
  • a peptide containing CDR is constituted by including at least one region of CDR of VH or VL.
  • a peptide containing a plurality of CDRs can be produced by binding CDRs directly or via an appropriate peptide linker.
  • the peptide containing CDR is constructed by constructing DNAs encoding CDRs of VH and VL of the bispecific antibody of the present invention, inserting the DNA into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and It can be expressed and produced by introduction into an organism or a eukaryote.
  • the peptide containing CDR can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method.
  • the bispecific antibody fragment is a bispecific antibody fragment having an antigen-binding activity with respect to two types of antigens, which essentially consists of a partial structure of the bispecific antibody.
  • a fusion protein in which the Fc of the bispecific antibody of the present invention is bound to an antibody fragment, an Fc fusion protein in which the Fc is bound to a naturally occurring ligand or receptor (also referred to as immunoadhesin), and a plurality of Fc regions are included.
  • the fused Fc fusion protein and the like are also included in the present invention.
  • the Fc region containing amino acid residue modifications for the purpose of enhancing or lacking antibody effector activity, stabilizing antibody, and controlling blood half-life can also be used in the bispecific antibody of the present invention.
  • a radioisotope, a low molecular drug, a high molecular drug, a protein or an antibody drug is chemically added to the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention.
  • it includes a derivative of an antibody that is genetically coupled.
  • the derivative of the antibody in the present invention is the N-terminal side or C-terminal side of the H chain or L chain of the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention, an appropriate substituent or side chain in the antibody or the antibody fragment thereof.
  • a chemical method such as a radioisotope, a low-molecular drug, a high-molecular drug, an immunostimulant, a protein or an antibody drug can be chemically applied to the sugar chain in the antibody or the antibody fragment thereof [Introduction to antibody engineering, native people] It can be manufactured by combining them according to Shokan (1994)].
  • the derivative of the antibody in the present invention is a DNA encoding the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention and a DNA encoding a desired protein or an antibody drug, which is inserted into an expression vector, It can be produced by a genetic engineering technique in which the expression vector is introduced into an appropriate host cell and expressed.
  • radioisotope examples include 111 In, 131 I, 125 I, 90 Y, 64 Cu, 99 Tc, 77 Lu, or 211 At.
  • the radioisotope can be directly bound to the antibody by the chloramine T method or the like.
  • a substance that chelate a radioisotope may be bound to the antibody.
  • the chelating agent include 1-isothiocyanatebenzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA) and the like.
  • low molecular weight agents examples include alkylating agents, nitrosourea agents, antimetabolites, antibiotics, plant alkaloids, topoisomerase inhibitors, hormone therapeutic agents, hormone antagonists, aromatase inhibitors, P-glycoprotein inhibitors, platinum.
  • anti-cancer agents such as M-phase inhibitors or kinase inhibitors [Clinical Oncology, Cancer and Chemotherapy (1996)]
  • steroid agents such as hydrocortisone or prednisone
  • nonsteroidal agents such as aspirin or indomethacin
  • gold thiomalate gold thiomalate
  • Immunomodulators such as penicillamine
  • immunosuppressants such as cyclophosphamide or azathioprine
  • anti-inflammatory agents such as antihistamines such as chlorpheniramine maleate or clemacitin [inflammation and anti-inflammatory therapy, Ito Denshaku Publishing Co., Ltd. (1982 )] and the like.
  • anticancer agent examples include amifostine (ethiol), cisplatin, dacarbazine (DTIC), dactinomycin, mechlorethamine (nitrogen mustard), streptozocin, cyclophosphamide, ifosfamide, carmustine (BCNU), lomustine (CCNU), doxorubicin.
  • amycin epirubicin
  • gemcitabine gemcitabine
  • daunorubicin procarbazine
  • mitomycin cytarabine
  • etoposide 5-fluorouracil, fluorouracil, vinblastine, vincristine, bleomycin, daunomycin, peplomycin, estramustine, paclitaxel (taxataxel), estramustine, paclitaxel, taxataxel.
  • nogitecan mitoxantrone, topotecan, leuprolide, megestrol, melphalan, mercaptopurine, hydroxycarbamide, plicamycin, mitotan, pegasparagase, pentostatin, pipobroman, streptozocin, tamoxifen, goserelin, leuprorenin, flutamide.
  • STI571 STI571
  • erlotinib FMS-like tyrosine kinase 3 (Flt3) inhibitor
  • Flt3 FMS-like tyrosine kinase 3
  • VFGFR vascural endothreptorghre receptor
  • VGFR fibroblast ghrephthorphate receptor
  • Radicicol 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin, rapamycin, amsacrine, all-trans retinoic acid, sa Lidomide, lenalidomide, anastrozole, fadrozole, letrozole, exemestane, gold thiomalate, D-penicillamine, bucillamine, azathioprine, mizoribine, cyclosporine, rapamycin, hydrocortisone, bexarotene (talgretin), tamoxifen, dexamethasone, progestins, estrogens, estrogens.
  • Strozole (Arimidex), Leuprine, Aspirin, Indomethacin, Celecoxib, Azathioprine, Penicillamine, Gold thiomalate, Chlorpheniramine maleate, Chloropheniramine, Clemacitin, Tretinoin, Bexarotene, Arsenic, Bortezomib, Allopurinol, Calicaremycin, Ibritumomabuchi. Examples include oxetane, targretin, ozogamimine, clarithromasin, leucovorin, ketoconazole, aminoglutethimide, suramin, methotrexate or maytansinoid or derivatives thereof.
  • Examples of the method for binding the low molecular weight drug to the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention include, for example, a method for binding the drug and the amino group of the antibody via glutaraldehyde, or a water-soluble carbodiimide. Examples include a method of linking the amino group of the drug and the carboxyl group of the antibody via
  • high-molecular drugs examples include polyethylene glycol (PEG), albumin, dextran, polyoxyethylene, styrene-maleic acid copolymer, polyvinylpyrrolidone, pyran copolymer, and hydroxypropylmethacrylamide.
  • a method of reacting with a PEGylation modifying reagent and the like can be mentioned [Bioconjugate drug, Hirokawa Shoten (1993)].
  • the PEGylation modifying reagent include a modifier for the ⁇ -amino group of lysine (JP-A 61-178926) and a modifier for the carboxyl group of aspartic acid and glutamic acid (JP-A 56-23587). (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-119920) and the like, or a modifier for the guanidino group of arginine.
  • an agent that enhances immunity is ⁇ (1 ⁇ 3) glucan (for example, lentinan or sizofiran), or ⁇ -galactosylceramide ( KRN7000) and the like.
  • proteins examples include cytokines or growth factors or toxin proteins that activate immunocompetent cells such as NK cells, macrophages or neutrophils.
  • cytokines or growth factors examples include interferon (hereinafter referred to as IFN)- ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , interleukin (hereinafter referred to as IL)-2, IL-12, IL-15, IL- 18, IL-21, IL-23, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte/macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) or macrophage colony stimulating factor (M-CSF).
  • IFN interferon
  • IFN- ⁇ interleukin-2
  • IL-12 interleukin
  • IL-15 interleukin
  • IL-12 interleukin
  • IL-15 interleukin- 18, IL-21
  • IL-23 granulocyte colony stimulating factor
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte/macrophage colony stimulating factor
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • toxin proteins examples include ricin, diphtheria toxin, and ONTAK, and also include protein toxins in which a protein has been mutated to control toxicity.
  • a fusion antibody with a protein or an antibody drug is prepared by ligating a cDNA encoding a protein to a cDNA encoding the bispecific antibody or antibody fragment of the present invention to construct a DNA encoding the fusion antibody, and synthesizing the DNA in a prokaryote or an eukaryote. It can be produced by inserting it into an expression vector for nuclear organisms and introducing the expression vector into prokaryotes or eukaryotes for expression. ..
  • the agent that binds to the bispecific antibody or the antibody fragment thereof of the present invention can be used for usual immunological detection.
  • a label used in the measuring method may be mentioned.
  • the label include enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase or luciferase, luminescent substances such as acridinium ester or lophine, fluorescein isothiocyanate (FITC) or tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC), Alexa (registered trademark).
  • fluorescent substances such as Fluor 488 and R-phycoerythrin (R-PE).
  • the present invention includes a bispecific antibody having a cytotoxic activity such as CDC activity or ADCC activity, and the bispecific antibody fragment.
  • a cytotoxic activity such as CDC activity or ADCC activity
  • the CDC activity or ADCC activity of the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention on the cells expressing the antigen can be evaluated by a known measurement method [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)].
  • the present invention also provides a composition containing a bispecific antibody or a bispecific antibody fragment that specifically recognizes and binds to a cell surface antigen such as TfR and EGFR, or a composition containing the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment as an active ingredient.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for a disease associated with at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR, preferably a disease involving cells expressing cell surface antigens such as TfR and EGFR.
  • the disease related to at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR may be any disease related to at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR, and examples thereof include malignant tumors and And so on.
  • examples of the malignant tumor and cancer include colorectal cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, glioma, malignant melanoma, thyroid cancer, renal cell cancer, leukemia, lymphoma, T Cellular lymphoma, gastric cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, bile duct cancer, esophageal cancer, liver cancer, head and neck cancer, skin cancer, urinary tract cancer, Bladder cancer, prostate cancer, choriocarcinoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, mesothelioma, pleural tumor, male embryo, endometrial hyperplasia, endometriosis, germinoma, fibrosarcoma, Kaposi's sarcoma , Hemangiomas, cavernous hemangiomas, hemangioblastoma, retinoblastoma, astrocytoma, neurofibromas,
  • the therapeutic agent containing the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention, or a derivative thereof contains the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment as an active ingredient, or a derivative thereof alone, However, it is usually preferable to provide it as a pharmaceutical preparation produced by any method known in the technical field of pharmaceutics by mixing it with one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • oral administration or parenteral administration such as buccal, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular or intravenous administration.
  • parenteral administration such as buccal, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular or intravenous administration.
  • intravenous administration is preferred.
  • dosage forms include sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments or tapes.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 ⁇ g/kg to 10 mg/kg per day for an adult.
  • the present invention provides a reagent for immunological detection or measurement of at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR containing the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention, or a reagent such as TfR and EGFR.
  • the present invention relates to a diagnostic agent for diseases associated with at least one of cell surface antigens, preferably diseases involving cells expressing cell surface antigens such as TfR and EGFR.
  • the present invention also provides a method for immunologically detecting or measuring at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR using the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention, and a cell such as TfR and EGFR.
  • a method for treating a disease involving at least one of surface antigens preferably a disease involving cells expressing cell surface antigens such as TfR and EGFR, or a disease involving at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR, preferably The present invention relates to a method for diagnosing a disease involving cells expressing cell surface antigens such as TfR and EGFR.
  • any known method can be used as a method for detecting or measuring the amount of at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR.
  • immunological detection or measurement method and the like can be mentioned.
  • the immunological detection or measurement method is a method of detecting or measuring the amount of antibody or the amount of antigen using a labeled antigen or antibody.
  • immunological detection or measurement methods include radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA or ELISA), fluorescent immunoassay (FIA), luminescent immunoassay, and western blotting.
  • RIA radioimmunoassay
  • EIA or ELISA enzyme immunoassay
  • FIA fluorescent immunoassay
  • luminescent immunoassay luminescent immunoassay
  • western blotting Alternatively, a physicochemical method may be used.
  • At least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR is expressed using the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention.
  • at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR is Related diseases, preferably diseases involving cells expressing cell surface antigens such as TfR and EGFR can be diagnosed.
  • Known immunological detection methods can be used to detect cells expressing at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR.
  • immunoprecipitation method immune cell staining method
  • immunohistological staining method can be used.
  • Method or fluorescent antibody staining method can be used.
  • a fluorescent antibody staining method such as FMAT8100HTS system (manufactured by Applied Biosystems) can be used.
  • cell surface antigens such as TfR and EGFR
  • tissue cells for example, tissue cells, blood, plasma, serum, pancreatic juice, urine, feces, tissue fluid or culture fluid
  • cell surface antigens such as TfR and EGFR
  • a diagnostic agent containing the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention, or a derivative thereof includes a reagent for carrying out an antigen-antibody reaction and a reagent for detecting the reaction, depending on the intended diagnostic method. But it's okay.
  • reagents for carrying out the antigen-antibody reaction include buffers and salts.
  • the detection reagent examples include a labeled secondary antibody that binds to the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment, or a derivative thereof, or a conventional immunological detection or measurement method for a substrate corresponding to the label.
  • the method for producing a monoclonal antibody in the present invention includes the following working steps. That is, (1) at least one of purification of the antigen used as an immunogen and preparation of cells in which the antigen is overexpressed on the cell surface, (2) after immunizing an animal with the antigen, blood is collected and its antibody titer is assayed.
  • the time to remove the spleen and the like to prepare antibody-producing cells (3) preparation of myeloma cells (myeloma), (4) cell fusion between antibody-producing cells and myeloma, (5) purpose Selection of antibody-producing hybridoma group, (6) isolation of monoclonal cells from the hybridoma group (cloning), (7) culture of hybridoma for producing a large amount of monoclonal antibody, or hybridoma And (8) examination of physiological activity of the monoclonal antibody thus produced and its antigen-binding specificity, or assay of characteristics as a labeling reagent.
  • the method for producing a monoclonal antibody that binds to a TfR and a cell surface antigen such as EGFR used for producing a bispecific antibody that binds to a cell surface antigen such as TfR and EGFR in the present invention is described above. It will be described in detail along with the process.
  • the method for producing the antibody is not limited to this, and for example, antibody-producing cells other than spleen cells and myeloma may be used.
  • a cell surface antigen such as EGFR or TfR can be transformed into Escherichia coli, yeast, insect cells or animal cells by using an expression vector containing a cDNA encoding the full length or a partial length of the cell surface antigen such as EGFR or TfR. It can be obtained by introducing it.
  • at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR is purified from various human tumor cell cultures or human tissues that express a large amount of at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR and used as an antigen. You can Further, the tumor-cultured cells or the tissue can be used as an antigen as it is.
  • a cell surface antigen such as EGFR or a synthetic peptide having a partial sequence of TfR can be prepared by a chemical synthesis method such as Fmoc method or tBoc method and used as an antigen.
  • Cell surface antigens such as EGFR or TfR used in the present invention are Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997). It can be produced by expressing a DNA encoding a cell surface antigen such as EGFR or TfR in a host cell using the method described in 1) or the like, for example, by the following method. ..
  • a recombinant vector is prepared by inserting a full-length cDNA containing a cell surface antigen such as EGFR or a portion encoding TfR downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding a polypeptide prepared based on the full-length cDNA may be used.
  • the obtained recombinant vector is introduced into a host cell suitable for the expression vector, whereby a transformant producing a cell surface antigen such as EGFR or TfR can be obtained. ..
  • the expression vector is one that can autonomously replicate in the host cell to be used or can be integrated into the chromosome, and contains a suitable promoter at a position where the DNA encoding the cell surface antigen such as EGFR or TfR can be transcribed. Any of them can be used.
  • a microorganism belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli, yeast, insect cell or animal cell can be used as long as it can express the gene of interest.
  • the recombinant vector is capable of autonomous replication in a prokaryote and is a DNA containing a promoter, a ribosome binding sequence, a cell surface antigen such as EGFR, or a portion encoding TfR. , And a vector containing a transcription termination sequence.
  • the transcription termination sequence is not necessarily required in the recombinant vector, but it is preferable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • the recombinant vector may contain a gene that controls a promoter.
  • the recombinant vector it is preferable to use a plasmid in which the Shine-Dalgarno sequence which is a ribosome binding sequence and the initiation codon are adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • the base sequence of the cell surface antigen such as EGFR or the DNA encoding TfR can be substituted so that it becomes an optimal codon for expression in the host, and thus the target EGFR The production rate of cell surface antigen or TfR can be improved.
  • Any expression vector can be used as long as it can exhibit the function in the host cell to be used.
  • pBTrp2, pBTac1, pBTac2 above, manufactured by Roche Diagnostics
  • pKK233-2 Pharmacia
  • pSE280 Invitrogen
  • pGEMEX-1 Promega
  • pQE-8 Qiagen
  • pKYP10 Japanese Patent Laid-Open No. 58-110600
  • pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)]
  • pLSA1 Agric.Biol. Chem., 53, 277 (1989)]
  • pGEL1 Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the promoter may be any promoter that functions in the host cell used. Examples thereof include promoters derived from Escherichia coli or phage such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter or T7 promoter. In addition, for example, artificially designed and modified promoters such as tandem promoter, tac promoter, lacT7 promoter, or let I promoter in which two Ptrp are connected in series are also included.
  • promoters derived from Escherichia coli or phage such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter or T7 promoter.
  • trp promoter trp promoter
  • lac promoter lac promoter
  • PL promoter PL promoter
  • PR promoter PR promoter
  • T7 promoter trp promoter
  • artificially designed and modified promoters such as tandem promoter, tac promoter, lacT7 promoter, or let I promoter in which
  • Examples of host cells include E. coli XL1-Blue, E. coli XL2-Blue, E. coli DH1, E. coli MC1000, E. coli KY3276, E. coli W1485, E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli No. 49, Escherichia coli W3110, E. coli NY49, Escherichia coli DH5 ⁇ and the like.
  • any method for introducing a recombinant vector into a host cell any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into a host cell to be used.
  • a method using calcium ion Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982), Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)]. ..
  • any expression vector can be used as long as it functions in the animal cell.
  • pcDNAI Invitrogen
  • pcDM8 Frakoshi
  • pAGE107 [Japan JP-A-3-22979; Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • pAS3-3 JP-A-2-227075
  • pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)]
  • pcDNAI/Amp Invitrogen
  • pcDNA3.1 manufactured by Invitrogen
  • pREP4 manufactured by Invitrogen
  • pAGE103 [J.Biochemistry, 101, 1307 (1987)]
  • any promoter can be used as long as it can exhibit a function in animal cells.
  • the promoter of the immediate early (IE) gene of cytomegalovirus (CMV) the early promoter of SV40, the promoter of retrovirus.
  • IE immediate early
  • SV40 the early promoter of SV40
  • retrovirus the promoter of retrovirus.
  • Metallothionein promoter heat shock promoter
  • SR ⁇ promoter Moloney murine leukemia virus promoter or enhancer.
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • host cells include human Burkitt's lymphoma cell Namalwa, African green monkey kidney-derived cell COS, Chinese hamster ovary-derived cell CHO, and human leukemia cell HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-000299).
  • any method for introducing a recombinant vector into a host cell any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into an animal cell.
  • electroporation [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075
  • lipofection method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] and the like. ..
  • a transformant derived from a microorganism or an animal cell having a recombinant vector incorporating a cell surface antigen such as EGFR or a DNA encoding TfR obtained as described above is cultured in a medium,
  • the cell surface antigen such as EGFR or TfR can be produced by producing and accumulating at least one of the TfR and the cell surface antigen such as EGFR and collecting from the culture.
  • the method for culturing the transformant in a medium can be carried out according to a usual method used for culturing a host.
  • a cell surface antigen such as EGFR or TfR having a sugar or sugar chain added thereto can be obtained.
  • an inducer may be added to the medium if necessary.
  • an inducer may be added to the medium if necessary.
  • indole acrylic acid or the like may be added to each medium.
  • a medium for culturing the transformant obtained by using animal cells as a host for example, a commonly used RPMI1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science , 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)], Include's Modified Examples thereof include Dulbecco's Medium (IMDM) medium, and a medium obtained by adding fetal bovine serum (FBS) or the like to these mediums.
  • IMDM Dulbecco's Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Culturing is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40° C. and 5% CO 2 in the presence.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture, if necessary.
  • a method for expressing a gene encoding a cell surface antigen such as EGFR or TfR in addition to direct expression, methods such as secretory production or fusion protein expression [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989 )] can be used.
  • Examples of the method for producing a cell surface antigen such as EGFR or TfR include a method for producing inside a host cell, a method for secreting outside a host cell, and a method for producing on a host cell outer membrane.
  • a suitable method can be selected by changing the structure of cell surface antigen such as EGFR or TfR to be produced.
  • DNA encoding the amino acid sequence of the extracellular region DNA encoding the Fc region of an antibody, DNA encoding glutathione S-transferase (GST), DNA encoding FLAG tag or DNA encoding Histidine tag, etc.
  • An antigen fusion protein can be prepared by preparing a DNA ligated with, expressing it, and purifying it. Specifically, for example, an Fc fusion protein in which a cell surface antigen such as EGFR or the extracellular region of TfR is bound to the Fc region of human IgG, a cell surface antigen such as EGFR or the extracellular region of TfR, and glutathione S-transferase ( GST) and fusion proteins.
  • a cell surface antigen such as EGFR or the extracellular region of TfR
  • GST glutathione S-transferase
  • a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene and the like can be used to increase the production amount of cell surface antigens such as EGFR or TfR.
  • the produced cell surface antigen such as EGFR or TfR can be isolated and purified as follows, for example.
  • a cell surface antigen such as EGFR or TfR When a cell surface antigen such as EGFR or TfR is expressed in a dissolved state in the cells, the cells are collected by centrifugation after the completion of the culture, suspended in an aqueous buffer solution, and then ultrasonically disrupted, French press, Mantongaulin. The cells are disrupted using a homogenizer or Dynomill to obtain a cell-free extract.
  • a usual protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylaminoethyl ( DEAE)-sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kagaku) and other anion exchange chromatography methods, resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia) and other cation exchange chromatography methods, Butyl sepharose, hydrophobic chromatography using a resin such as phenyl sepharose, gel filtration using a molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, or an electrophoretic method such as isoelectric focusing.
  • a purified protein can be obtained by using it alone or in combination.
  • a cell surface antigen such as EGFR or TfR When a cell surface antigen such as EGFR or TfR is expressed by forming an insoluble substance in the cells, the cells are collected, crushed and centrifuged in the same manner as described above to give a precipitate fraction to the cells such as EGFR. The surface antigen or insoluble matter of TfR is collected. The recovered cell surface antigen such as EGFR or the insoluble matter of TfR is solubilized with a protein denaturing agent. The solubilized solution is diluted or dialyzed to restore the cell surface antigen such as EGFR or TfR to a normal three-dimensional structure, and then a purified protein of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above. ..
  • a cell surface antigen such as EGFR or a derivative such as TfR or a sugar modified product thereof is secreted extracellularly
  • the cell surface antigen such as EGFR or TfR, or a derivative such as a sugar modified product thereof is added to the culture supernatant.
  • a soluble fraction is obtained by treating the culture supernatant with a method such as centrifugation in the same manner as above, and a purified protein is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. be able to.
  • the cell surface antigen such as EGFR or TfR used in the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as Fmoc method or tBoc method.
  • a chemical synthesis method such as Fmoc method or tBoc method.
  • a peptide synthesizer manufactured by Advanced Chemtech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthesel-Vega, Perceptive, or Shimadzu. can be used for chemical synthesis.
  • Immunization is performed by administering the antigen with Freund's complete adjuvant or with an appropriate adjuvant such as aluminum hydroxide gel and B. pertussis vaccine.
  • the immunogen administration method for immunizing a mouse may be any of subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intradermal injection, intramuscular injection or foot pad injection, but intraperitoneal injection, foot pad injection or intravenous injection. Is preferred.
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA (bovine serum albumin) or KLH (Keyhole Limpet hemocyanin) is prepared and used as an immunogen.
  • ⁇ Antigen is administered 5 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Blood is collected from the fundus venous plexus 3 to 7 days after each administration, and the antibody titer of the serum is measured using an enzyme immunoassay [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] or the like. If an animal whose serum has a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization is used as the source of the fusion antibody-producing cells, the effect of the subsequent operation can be enhanced.
  • the tissue containing antibody-producing cells such as spleen is extracted from the immunized animal, and the antibody-producing cells are collected.
  • Antibody-producing cells are lymphocytes that are plasma cells and their progenitor cells, which may be obtained from any part of an individual, and are generally spleen, lymph nodes, bone marrow, tonsils, peripheral blood, or a combination thereof. , But spleen cells are most commonly used. When spleen cells are used, the spleen is shredded and loosened, then centrifuged, and red blood cells are removed to obtain fusion antibody-producing cells.
  • Myeloma preparation step As the myeloma, cells derived from mammals such as mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit or human, which are not capable of producing autoantibodies, can be used. Established cell lines, for example, 8-azaguanine resistant mouse (BALB/c-derived) myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)], P3- NS1/1-Ag41 (NS-1) [European J.
  • BALB/c-derived myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)]
  • P3- NS1/1-Ag41 (NS-1) [European J.
  • the cell line may be a suitable medium such as 8-azaguanine medium [RPMI-1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, FCS and 8-azaguanine], Iscove's Modified Dulbecco's medium.
  • IMDM IMDM
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • the above-mentioned cell lines are subcultured in a normal medium (for example, DMEM medium containing 10% FCS) 3 to 4 days before cell fusion, and 2 ⁇ 10 7 or more cells are secured on the day of the fusion.
  • a normal medium for example, DMEM medium containing 10% FCS
  • MEM Minimum Essential Medium
  • MEM medium After adding 1 to 2 mL of MEM medium several times every 1 to 2 minutes, MEM medium is added so that the total amount becomes 50 mL. After centrifugation, the supernatant is removed, the precipitated cell clumps are gently loosened, and then the cells are gently suspended in HAT medium [normal medium containing hypoxanthine, thymidine and aminopterin]. This suspension is cultured at 37° C. in a 5% CO 2 incubator for 7 to 14 days.
  • HAT medium normal medium containing hypoxanthine, thymidine and aminopterin
  • cell fusion can be performed by the following method. Spleen cells and myeloma cells were thoroughly washed with serum-free medium (for example, DMEM) or phosphate buffered saline (hereinafter referred to as “phosphate buffer solution”), and the ratio of the number of spleen cells to myeloma cells was 5: Mix so as to be about 1 to 10:1 and centrifuge. After removing the supernatant and thoroughly loosening the precipitated cell clumps, 1 mL of a serum-free medium containing 50% (w/v) polyethylene glycol (molecular weight 1000-4000) is added dropwise with stirring. Then, 10 mL of serum-free medium is slowly added, followed by centrifugation.
  • serum-free medium for example, DMEM
  • phosphate buffer solution phosphate buffered saline
  • HAT medium hypoxanthine/aminopterin/thymidine
  • IL-2 human interleukin-2
  • the myeloma cells used for fusion are 8-azaguanine-resistant strains, that is, if they are hypoxanthine/guanine/phosphoribosyl transferase (HGPRT)-deficient strains, unfused myeloma cells and myeloma cells Fused cells cannot survive in HAT medium.
  • HGPRT hypoxanthine/guanine/phosphoribosyl transferase
  • HT medium a medium obtained by removing aminopterin from the HAT medium
  • a part of the culture supernatant is collected, and the antibody-producing hybridoma can be selected by using the antibody titer measuring method described later.
  • the method for measuring the antibody titer include various known techniques such as radioisotope immunoassay (RIA method), solid-phase enzyme immunoassay (ELISA method), fluorescent antibody method and passive hemagglutination method.
  • RIA method or the ELISA method is preferable from the viewpoints of detection sensitivity, rapidity, accuracy, and possibility of automation of operation.
  • this cloning method include, for example, a limiting dilution method of diluting and culturing so that one cell contains one cell, a soft agar method of culturing in a soft agar medium to collect colonies, and a micromanipulator. Examples include a method for isolating individual cells, a method for isolating single cells by a cell sorter, and the like.
  • a hybridoma strain producing a monoclonal antibody against a cell surface antigen such as TfR or EGFR is selected from wells in which antibody titers are recognized, for example, cloning by the limiting dilution method is repeated 2 to 4 times, and those in which stable antibody titers are recognized. To choose as. ..
  • Ascites fluid was collected from this mouse, centrifuged to remove solids, salted out with 40 to 50% ammonium sulfate, and purified by a caprylic acid precipitation method, a DEAE-Sepharose column, a protein A column or a gel filtration column, The IgG or IgM fractions are collected and used as a purified monoclonal antibody.
  • a caprylic acid precipitation method for example, BALB/c
  • Nu/Nu mouse, rat, guinea pig, hamster or rabbit it binds to a cell surface antigen such as TfR or EGFR.
  • Ascites fluid containing a large amount of monoclonal antibodies can be obtained.
  • the subclass of the antibody is determined by enzyme immunoassay using a subclass typing kit.
  • Binding Assay of Monoclonal Antibody to Cell Surface Antigens such as TfR or EGFR The binding activity of monoclonal antibodies to cell surface antigens such as TfR or EGFR can be determined by the Ouchterlony method, ELISA method, RIA method, flow cytometry method ( FCM) or surface plasmon resonance (SPR).
  • the octerlonie method is simple, but if the antibody concentration is low, concentration is necessary.
  • the culture supernatant is reacted with the antigen-adsorbing solid phase as it is, and further, by using various immunoglobulin isotypes and antibodies corresponding to subclasses as secondary antibodies, the antibody isotype, It is possible to identify the subclass and measure the binding activity of the antibody.
  • purified or partially purified cell surface antigen such as recombinant EGFR or TfR is adsorbed on a solid phase surface such as a 96-well plate for ELISA, and the solid phase surface on which the antigen is not adsorbed is used as an antigen.
  • Blocking is performed with an irrelevant protein such as bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the serially diluted primary antibody eg mouse serum, culture supernatant, etc.
  • the antibody is bound to the immobilized antigen.
  • biotin an enzyme (horse radish peroxidase; HRP, alkalin phosphatase; ALP, etc.) as a second antibody, an anti-immunoglobulin antibody labeled with a chemiluminescent substance, a radiation compound, or the like was dispensed, and the first antibody bound to the plate The second antibody is reacted with the antibody. After thorough washing with Tween-PBS, a reaction depending on the labeling substance of the second antibody is performed to select a monoclonal antibody that specifically reacts with the target antigen.
  • HRP horseradish peroxidase
  • ALP alkalin phosphatase
  • the binding activity of the antibody to the antigen-expressing cells can be measured [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)].
  • the binding of the antibody to the membrane protein antigen expressed on the cell membrane means that the antibody recognizes and binds to the naturally occurring three-dimensional structure of the antigen.
  • the SPR method includes kinetics analysis by Biacore.
  • Biacore T100 kinetics in the binding between the antigen and the test substance is measured, and the result is analyzed by the analysis software attached to the device.
  • an anti-mouse IgG antibody is immobilized on a sensor chip CM5 by an amine coupling method, and then a test substance such as a hybridoma culture supernatant or a purified monoclonal antibody is flowed to bind an appropriate amount, and the concentration is further known. Multiple concentrations of antigen are run and binding and dissociation is measured. Next, the obtained data is subjected to kinetics analysis by a 1:1 binding model using software attached to the device, and various parameters are acquired.
  • a cell surface antigen such as EGFR or TfR is immobilized on a sensor chip by, for example, an amine coupling method, and then purified monoclonal antibodies at a plurality of known concentrations are flown to measure binding and dissociation.
  • the obtained data is subjected to kinetics analysis by a bivalent binding model using software attached to the device, and various parameters are acquired.
  • an antibody that binds to a cell surface antigen such as TfR or EGFR by competing with an antibody against a cell surface antigen such as TfR or EGFR is prepared by reacting a test antibody in the binding assay system described above. , Can be selected. That is, it is possible to obtain an antibody that competes with the antibody obtained above for binding to a cell surface antigen such as TfR or EGFR by screening an antibody whose binding to the antigen is inhibited when a test antibody is added. it can.
  • the epitope recognized and bound by the antibody can be identified as follows.
  • partial deletions and variants of the antigen may be obtained as a secretory protein using an appropriate host cell such as Escherichia coli, yeast, plant cell or mammalian cell, or on the cell membrane of the host cell. It may be expressed to prepare an antigen-expressing cell.
  • a membrane-type antigen it is preferable to express it on the membrane of a host cell in order to express it while maintaining the three-dimensional structure of the antigen. It is also possible to confirm the reactivity of the antibody by preparing a synthetic peptide that mimics the primary or tertiary structure of the antigen. Examples of the synthetic peptide include a method of producing various partial peptides of the molecule using a known peptide synthesis technique.
  • a chimeric protein is prepared by appropriately combining the domains constituting each region, and the reactivity of the antibody against the protein is confirmed to confirm that the antibody Can be identified. After that, further finely synthesizing oligopeptides of the corresponding portions, or mutants of the peptides, etc., by variously synthesizing using oligopeptide synthesis techniques well known to those skilled in the art, and confirming the reactivity of the antibody against the peptides Can be specified.
  • kits eg, SPOTs kit (manufactured by Genosis Biotechnology), a series of multipin peptide synthesis kits using multipin synthesis method (manufactured by Chiron), etc.] ] Can also be used.
  • An antibody that binds to the same epitope as an epitope bound by an antibody that binds to a cell surface antigen such as TfR or EGFR identifies the epitope of the antibody obtained in the above-mentioned binding assay system, and a partial synthetic peptide of the epitope, It can be obtained by preparing and immunizing a synthetic peptide imitating the three-dimensional structure of the epitope or a recombinant of the epitope.
  • the epitope when the epitope is a membrane protein, a recombinant fusion protein in which the whole extracellular region or a part of the extracellular domain is linked to an appropriate tag, for example, FLAG tag, Histidine tag, GST protein or antibody Fc region, etc.
  • an appropriate tag for example, FLAG tag, Histidine tag, GST protein or antibody Fc region, etc.
  • Acquisition of cDNA encoding V region of monoclonal antibody from hybridoma Acquisition of cDNA encoding VH and VL of monoclonal antibody can be performed, for example, as follows.
  • mRNA is extracted from a hybridoma producing a monoclonal antibody to synthesize cDNA.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or a plasmid to prepare a cDNA library.
  • a recombinant phage or a recombinant plasmid having a cDNA encoding VH or VL is isolated using a DNA encoding the C region portion or V region portion of the antibody as a probe.
  • the entire base sequence of VH or VL in the isolated recombinant phage or recombinant plasmid is determined, and the entire amino acid sequence of VH or VL is deduced from the base sequence.
  • a non-human animal used for producing a hybridoma a mouse, a rat, a hamster, a rabbit or the like is used, but any animal can be used as long as a hybridoma can be produced.
  • RNA easy kit Qiagen
  • oligo(dT)-immobilized cellulose column method For preparation of mRNA from total RNA, oligo(dT)-immobilized cellulose column method [Molecular Cloning, Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], or Oligo-dT30 ⁇ Super>mRNA Purification Kit
  • a kit such as (manufactured by Takara Bio Inc.) is used.
  • mRNA can be prepared using a kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen) or QuickPrep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia).
  • Any vector can be used as a vector into which the cDNA synthesized by using the mRNA extracted from the hybridoma as a template is incorporated when the cDNA library is prepared.
  • any Escherichia coli can be used as long as the cDNA library can be introduced, expressed and maintained.
  • XL1-Blue MRF' [Strategies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)], K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)], or JM105 [Gene, 38, 275 (1985)].
  • PCR method Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edit , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989 ), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)
  • PCR method Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edit , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989 ), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)
  • a plasmid such as pBluescript SK(-) (manufactured by Stratagene) and the nucleotide sequence of the cDNA is determined by a commonly used nucleotide sequence analysis method.
  • a reaction such as dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)]
  • A. L. F. The analysis is performed using an automatic nucleotide sequence analyzer such as a DNA sequencer (Pharmacia).
  • the total amino acid sequences of VH and VL are deduced from the determined total nucleotide sequences, and compared with the total amino acid sequences of VH and VL of the known antibody [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] By doing so, it is confirmed whether or not the obtained cDNA encodes the complete amino acid sequences of VH and VL of the antibody including the secretory signal sequence.
  • amino acid sequences of the CDRs of VH and VL should be estimated by comparison with the amino acid sequences of VH and VL of known antibodies [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and and Human Services (1991)]. You can estimate the amino acid sequences of VH and VL of known antibodies [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and and Human Services (1991)]. You can
  • the BLAST method [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)] using any database such as SWISS-PROT or PIR-Protein etc. It is possible to confirm whether or not the complete amino acid sequences of the VH and VL are novel by conducting a homology search using.
  • the gene recombinant antibody expression vector can be constructed by cloning a DNA encoding at least one of CH and CL of a human antibody into an animal cell expression vector. ..
  • CH and CL of any human antibody can be used, for example, CH of ⁇ 1 subclass of human antibody and CL of ⁇ class can be used.
  • cDNA is used as the DNA encoding the CH and CL of the human antibody, chromosomal DNA consisting of exons and introns can also be used.
  • any expression vector can be used as long as it can express by incorporating a gene encoding the C region of human antibody, for example, pAGE107 [Cytotechnol., 3, 133 (1990)], pAGE103 [J.Biochem., 101, 1307 (1987)], pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)], pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the promoter and enhancer of the expression vector for animal cells include SV40 early promoter [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], Moloney murine leukemia virus LTR. [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987)], CMV promoter (US Pat. No. 5,168,062) or immunoglobulin H chain promoter [Cell, 41, 479 (1985)]. And enhancers [Cell, 33, 717 (1983)] and the like can be used.
  • Expression of the gene recombinant antibody includes antibody H chain and L chain from the viewpoints of easiness of constructing a vector, easiness of introduction into an animal cell, and balance of expression levels of antibody H chain and L chain in cells.
  • a vector carrying both genes of the chain (tandem type vector) [J. Immunol. Methods, 167, 2761, 271 (1994)] is used, but multiple vectors carrying separate genes for the antibody H and L chains (separate) Type vector) can also be used in combination.
  • pKANTEX93 International Publication No. 97/10354
  • pEE18 Hybridoma, 17, 17, 559 (1998)]
  • N5KG1val US Pat. No. 6,001,358
  • N5KG4PE R409K described in International Publication No. 2006/033386
  • N5KG2 vector described in International Publication No. 2003/033538
  • Tol2 transposon vector International Publication No. 2010/143698
  • a chimeric antibody expression vector can be constructed by cloning cDNAs encoding VH or VL, respectively.
  • the base sequence of the linking portion encodes an appropriate amino acid.
  • VH and VL cDNAs designed to have appropriate restriction enzyme recognition sequences are prepared.
  • the prepared VH and VL cDNAs are expressed in an appropriate form upstream of each gene encoding the human antibody CH or CL in the recombinant antibody expression vector obtained in (2). And clone each to construct a chimeric antibody expression vector.
  • a cDNA encoding VH or VL of a non-human antibody is amplified by PCR using synthetic DNAs having appropriate restriction enzyme recognition sequences at both ends, and is used for expression of the recombinant antibody obtained in (2).
  • a chimeric antibody expression vector can also be constructed by cloning into a vector.
  • cDNA encoding V region of humanized antibody cDNA encoding VH or VL of humanized antibody can be prepared as follows. First, the amino acid sequences of the framework regions (hereinafter, referred to as FR) of human antibody VH or VL to which the CDR amino acid sequences of non-human antibody VH or VL obtained in (1) are transplanted are selected.
  • FR framework regions
  • Any amino acid sequence of FR can be used as long as it is derived from a human antibody.
  • the FR amino acid sequence of human antibody registered in databases such as Protein Data Bank or the common amino acid sequence of each subgroup of FR of human antibody [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services ( 1991)] and the like.
  • an amino acid sequence of human FR having a high homology (60% or more) with the amino acid sequence of FR of VH or VL of the original non-human antibody is selected.
  • the amino acid sequence of the CDR of the original non-human antibody is transplanted to the amino acid sequence of the FR of VH or VL of the selected human antibody to design the amino acid sequence of VH or VL of the humanized antibody.
  • the designed amino acid sequence into a DNA sequence considering the frequency of codon usage found in the nucleotide sequence of antibody genes [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]
  • the VH or VL cDNA sequences of the purified antibody are designed respectively.
  • the recombinant antibody expression vector obtained in (2) can be easily transformed into VH or VL of humanized antibody.
  • the cDNA coding for can be cloned.
  • the amplified product was cloned into a plasmid such as pBluescript SK(-) (manufactured by Stratagene), and the nucleotide sequence was determined by the same method as described in (1) to obtain the desired humanized antibody.
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH or VL is obtained.
  • a humanized antibody has the same antigen-binding activity as that obtained by transplanting only CDRs of VH and VL of non-human antibody to FRs of VH and VL of human antibody. Compared to non-human antibodies of [BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)]. Therefore, of the VH and VL FR amino acid sequences of human antibodies, the amino acid residues that are directly involved in antigen binding, the amino acid residues that interact with the CDR amino acid residues, and the three-dimensional structure of the antibody are maintained. By identifying the amino acid residues indirectly involved in the binding to the antigen and replacing those amino acid residues with the amino acid residues of the original non-human antibody, the reduced antigen-binding activity of the humanized antibody Can be raised.
  • VH and VL FR amino acid residues of the human antibody can be modified by performing the PCR reaction described in (4) using synthetic DNA for modification.
  • the nucleotide sequence is determined by the method described in (1), and it is confirmed that the desired modification has been made.
  • each gene is cloned upstream of each gene encoding CH or CL of the human antibody in the gene recombinant antibody expression vector obtained in (2) so that they can be expressed in an appropriate form.
  • any cell can be used as long as it can express the recombinant antibody.
  • COS-7 cell American Type Culture Collection (ATCC) number: CRL1651] can be used.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • the DEAE-dextran method Method of Nucleic Acids Res., CRC press (1991)
  • the lipofection method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 ( 1987)] and the like.
  • the expression level and the antigen-binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant were analyzed by the enzyme-linked immunosorbent assay [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory (1988), monoclonal antibody experiment manual, Kodansha Scientific (1987)] and the like. ..
  • Examples of the introduction of the expression vector into the host cell include electroporation method [JP-A-2-257891, Cytotechnology, 3, 133 (1990)], calcium ion method, electroporation method, spheroplast. Method, lithium acetate method, calcium phosphate method, lipofection method and the like.
  • Examples of the method for introducing a gene into an animal described below include a microinjection method, a method for introducing a gene into ES cells by electroporation or lipofection, and a nuclear transfer method.
  • any cell can be used as long as it can express the gene recombinant antibody.
  • mouse SP2/0-Ag14 cells ATCC CRL1581
  • mouse P3X63-Ag8.653 cells ATCC CRL1580
  • Chinese hamster CHO-K1 cells ATCC CCL-61
  • DUKXB11 ATCC CCL-9096
  • Cells ATCC CCL-1781
  • CHO-S cells Life Technologies, Cat No. 11619
  • CHO cells deficient in the dihydrofolate reductase gene (dhfr) CHO/DG44 cells
  • a protein such as an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose, a sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-bonded complex sugar chain
  • a host cell having a decreased or deleted activity of a protein such as an enzyme involved in GTP, or a protein involved in the transport of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus
  • the ⁇ 1,6-fucosyltransferase gene is deficient CHO cells (WO 2005/035586, WO 02/31140) and the like can also be used.
  • a transformant that stably expresses the recombinant antibody is selected by culturing in an animal cell culture medium containing a drug such as G418 sulfate (hereinafter referred to as G418) ( Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891).
  • RPMI1640 medium (Invitrogen), GIT medium (Nippon Pharmaceutical), EX-CELL301 medium (JR), EX-CELL302 medium (JR), EX -CELL325 medium (manufactured by JR H), IMDM medium (manufactured by Invitrogen) or Hybridoma SFM medium (manufactured by Invitrogen), or a medium prepared by adding various additives such as FBS to these media is used.
  • the recombinant antibody is expressed and accumulated in the culture supernatant.
  • the expression level and antigen-binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant can be measured by the ELISA method or the like.
  • the expression level of the gene recombinant antibody produced by the transformed strain can be increased by utilizing a DHFR amplification system (Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891).
  • Recombinant antibodies can be purified from the culture supernatant of transformants using a protein A column [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. It is also possible to combine and purify the methods used for protein purification, such as gel filtration, ion exchange chromatography, and ultrafiltration.
  • the molecular weight of purified H-chain, L-chain or whole antibody molecule of the recombinant antibody is determined by polyacrylamide gel electrophoresis [Nature, 227, 680 (1970)] or Western blotting [Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] and the like.
  • the bispecific antibody of the present invention can be produced by designing an N-terminal polypeptide and an IgG portion, respectively, and designing a bispecific antibody in which they are linked.
  • IgG part is the same as in 1.
  • Monoclonal antibodies were obtained using the method described in 2. above, and the CDR and variable region cDNA sequences of each antibody were determined as described in 2. above. It can be obtained by designing the IgG portion containing the CDR or variable region of the antibody, as determined by the method described in 1.
  • N-terminal side polypeptide When the CDR or variable region of the antibody is included in the N-terminal side polypeptide, the above 1. And 2.
  • the antibody can be prepared by determining the DNA sequence of the CDR or variable region of the antibody and designing the N-terminal side polypeptide containing them by the method described in 1.
  • Such an N-terminal polypeptide may be a single chain such as scFv in which VH and VL are linked directly or via an appropriate linker, or a double chain such as Fab and dsFv. , Those designed for S—S binding after expression, VHH and the like can also be used.
  • the antigen-binding activity of the N-terminal side polypeptide can be evaluated by the above-mentioned method, and those having the antigen-binding activity can be selected.
  • bispecific antibody 4-1 Preparation of light chain common type bispecific antibody A bispecific antibody in which the N-terminal side polypeptide is Fab and the light chain of the IgG part is common to the Fab can be specifically prepared as follows.
  • Light chain non-common type bispecific antibody in which N-terminal side polypeptide is Fab is specifically prepared as follows. can do. A DNA encoding a polypeptide in which VL-CL of the N-terminal side polypeptide and VH of the IgG portion are linked, a DNA encoding VH-CH1 of the N-terminal side polypeptide, and a DNA encoding the VL of the IgG portion are synthesized. , These DNAs as described in 2. It can be produced by incorporating the gene recombinant antibody expression vector described in (2) and expressing the bispecific antibody. When the IgG portion and the N-terminal side polypeptide are linked via a linker, the DNA including the linker sequence is also synthesized.
  • the bispecific antibody in which the N-terminal polypeptide is VHH can be specifically produced as follows. DNAs encoding a polypeptide in which VHH and VH of the IgG portion are ligated and DNAs encoding VL of the IgG portion were synthesized, and these DNAs were prepared as described in 2. above. It can be produced by incorporating the gene recombinant antibody expression vector described in (2) and expressing the bispecific antibody. When the VHH and the IgG portion are bound via a linker, the DNA encoding the linker sequence is also included in the synthesis.
  • the bispecific antibody which is a polypeptide other than the above (1) and (2), in which the N-terminal polypeptide contains scFv, dsFv or CDR, can be specifically produced as follows.
  • the N-terminal side polypeptide is a single chain
  • DNA in which the DNA encoding the N-terminal side polypeptide and the DNA encoding VH of the IgG portion are linked is synthesized.
  • the N-terminal side polypeptide is an association consisting of two single-chain polypeptides, one of the single-chain polypeptides constituting the N-terminal side polypeptide is ligated to the VH-encoding DNA of the IgG part.
  • DNA encoding the other main chain polypeptide constituting the N-terminal side polypeptide is also synthesized.
  • DNA encoding VL of the IgG portion is also synthesized.
  • the DNA including the linker sequence is also synthesized.
  • the bispecific antibody of the present invention can be specifically prepared as follows. ..
  • the N-terminal side polypeptide is a single chain
  • a DNA in which the N-terminal side polypeptide-encoding DNA and the IgG portion VH-encoding DNA are linked is synthesized.
  • the N-terminal side polypeptide is an aggregate consisting of two or more single-chain polypeptides
  • one single-chain polypeptide constituting the N-terminal side polypeptide encodes VH of the IgG portion.
  • DNA encoding the remaining single-chain polypeptide constituting the N-terminal side polypeptide is also synthesized.
  • DNA encoding VL of the IgG portion is also synthesized.
  • the DNA including the linker sequence is also synthesized.
  • DNAs are used in the above 2. It can be produced by incorporating the gene recombinant antibody expression vector described in (2) and expressing the bispecific antibody. When the IgG portion and the N-terminal side polypeptide are bound via a linker, the DNA encoding the linker sequence is also included in the synthesis.
  • the antigen binding site is the same as in 1.
  • it can be isolated and obtained by techniques such as the Phase Display method and the Yeast display method [Emmanuelle Laffy et al., Human Antibodies 14,33-55, (2005)].
  • each antigen-binding site contained in the bispecific antibody becomes a specific antigen. Screening using a phage display method or the like is performed so as to react, and each VH most suitable for a single VL is selected.
  • the animal is immunized with the first antigen to produce a hybridoma from its spleen, and the DNA sequence encoding the first antigen-binding site is cloned. Then, the animal is immunized with the second antigen, a cDNA library is prepared from the spleen, and the DNA encoding the amino acid sequence of VH is obtained from the library by PCR.
  • a scFv-expressing phage library in which VH obtained by immunization with the second antigen and VL of the first antigen-binding site was linked was prepared, and the phage library was used to perform second panning using the phage library.
  • the phage that displayed scFv that specifically binds to the antigen is selected. From the selected phage, the DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH of the second antigen binding site is cloned.
  • the N-terminal polypeptide when the N-terminal polypeptide is Fab, it encodes the amino acid sequence of a polypeptide in which VH of the first antigen-binding site and VH of the second antigen-binding site are CH1 or CH1 and a linker are linked.
  • the expression vector for the bispecific antibody of the present invention can be constructed.
  • activity evaluation of bispecific antibody or antibody fragment thereof of the present invention The activity evaluation of the purified bispecific antibody or the bispecific antibody fragment can be carried out as follows.
  • the binding activity of the bispecific antibody of the present invention to a cell line expressing at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR is 1. It can be measured using the binding assay system described in (7).
  • the CDC activity or ADCC activity on cells expressing at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR can be measured by a known measurement method [Cancer Immunol. Immunol., 36, 373 (1993)].
  • the anti-cell activity (also called growth inhibitory activity) of the bispecific antibody of the present invention can be measured by the following method. For example, cells are seeded on a 96-well plate, an antibody is added thereto, and the cells are cultured for a certain period of time. Then, WST-8 reagent (manufactured by Dojindo) is reacted, and the absorbance at 450 nm is measured by a plate reader to determine the survival of the cells. Measure the rate.
  • Signal transduction from cell surface antigens such as TfR or EGFR into cells can be evaluated by detecting phosphorylation of intracellular proteins by Western blot or the like.
  • the bispecific antibody or bispecific antibody fragment of the present invention is a disease associated with at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR, preferably TfR. Also, it can be used for treating diseases involving cells expressing cell surface antigens such as EGFR. Examples of the disease associated with at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR include malignant tumors and cancers.
  • malignant tumors and cancers are colon cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, glioma, malignant melanoma (melanoma), thyroid cancer, renal cell cancer, leukemia, lymphoma, T cell lymphoma, gastric cancer.
  • sarcoma sarcoma, leiomyosarcoma
  • the therapeutic agent containing the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention, or a derivative thereof may contain only the antibody or the antibody fragment as an active ingredient, or a derivative thereof, Usually, it is mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers, and provided as a pharmaceutical preparation produced by a method known in the technical field of pharmaceutics.
  • the route of administration includes, for example, oral administration or parenteral administration such as buccal, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular or intravenous administration.
  • Dosage forms include, for example, sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments or tapes.
  • Various preparations include commonly used excipients, fillers, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizing agents, preservatives, colorings. It can be produced by a conventional method using a flavor, a flavoring agent, a stabilizer and the like.
  • Excipients include, for example, lactose, fructose, glucose, corn starch, sorbitol, crystalline cellulose, sterilized water, ethanol, glycerol, physiological saline and buffer solutions.
  • examples of the disintegrant include starch, sodium alginate, gelatin, calcium carbonate, calcium citrate, dextrin, magnesium carbonate and synthetic magnesium silicate.
  • binder examples include methyl cellulose or a salt thereof, ethyl cellulose, gum arabic, gelatin, hydroxypropyl cellulose, polyvinylpyrrolidone and the like.
  • Lubricants include, for example, talc, magnesium stearate, polyethylene glycol and hydrogenated vegetable oils.
  • the stabilizer examples include amino acids such as arginine, histidine, lysine and methionine, human serum albumin, gelatin, dextran 40, methyl cellulose, sodium sulfite, sodium metasulfite and the like.
  • additives include, for example, syrup, petrolatum, glycerin, ethanol, propylene glycol, citric acid, sodium chloride, sodium nitrite and sodium phosphate.
  • Formulations suitable for oral administration include, for example, emulsions, syrups, capsules, tablets, powders or granules.
  • Liquid preparations such as emulsions or syrups can be prepared with water, sugars such as sucrose, sorbitol or fructose, glycols such as polyethylene glycol or propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil or soybean oil, p-hydroxybenzoic acid. It is produced using an antiseptic such as ester or a flavor such as strawberry flavor or peppermint as an additive. ..
  • Capsules, tablets, powders or granules include excipients such as lactose, glucose, sucrose or mannitol, disintegrating agents such as starch or sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate or talc, polyvinyl alcohol, hydroxy. It is produced using a binder such as propylcellulose or gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin as an additive.
  • Formulations suitable for parenteral administration include, for example, injections, suppositories or sprays.
  • the injection is manufactured by using a carrier such as a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are manufactured using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the propellant is produced by using a carrier which does not irritate the oral cavity and airway mucosa of the recipient and disperses the monoclonal antibody or the antibody fragment thereof of the present invention as fine particles to facilitate absorption.
  • the carrier include lactose, glycerin and the like. It can also be manufactured as an aerosol or dry powder. Further, also in the above-mentioned parenteral preparation, the components exemplified as the additive in a formulation suitable for oral administration can be added.
  • the effective amount of the bispecific antibody of the present invention is 0.0001 mg to 100 mg per 1 kg of body weight, and the effective amount is 2 days. To 8 weeks apart.
  • Method for diagnosing a disease using the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention Cells in which at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR is expressed using the bispecific antibody of the present invention or the bispecific antibody fragment By detecting or measuring, it is possible to diagnose a disease associated with at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR, preferably a disease involving cells expressing cell surface antigens such as TfR and EGFR.
  • Diagnosis of a malignant tumor or cancer which is a disease related to at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR is performed by detecting or measuring at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR as follows. be able to.
  • the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention or a derivative thereof, using the immunological method described below, such as TfR and EGFR
  • the immunological method described below such as TfR and EGFR
  • At least one of the cell surface antigens is detected or measured, and the abundance of at least one of the cell surface antigens such as TfR and EGFR in the biological sample of a healthy person is examined.
  • the abundance of at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR is similarly examined in the biological sample of the subject, and the abundance is compared with the abundance of healthy subjects.
  • the abundance of at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR in a subject is increased as compared with a healthy subject, the subject is diagnosed with cancer.
  • Other diseases associated with at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR can be diagnosed by the same method.
  • the immunological method is a method of detecting or measuring the amount of antibody or the amount of antigen using a labeled antigen or antibody.
  • a radioactive substance-labeled immunoantibody method an enzyme immunoassay method, a fluorescence immunoassay method, a luminescence immunoassay method, a Western blotting method, a physicochemical method and the like can be mentioned.
  • the radioactive substance-labeled immunoantibody method includes, for example, reacting the antigen or cells expressing the antigen with the bispecific antibody of the present invention or the antibody fragment thereof, and further reacting with a radiolabeled anti-immunoglobulin antibody or binding fragment. After the treatment, a method of measuring with a scintillation counter or the like can be mentioned.
  • the enzyme immunoassay for example, the antigen or cells expressing the antigen is reacted with the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention, and further with a labeled anti-immunoglobulin antibody or binding fragment.
  • a method of measuring the coloring dye with an absorptiometer can be mentioned.
  • a sandwich ELISA method and the like can be mentioned.
  • a known enzyme label [enzyme immunoassay, Medical Shoin (1987)] can be used.
  • an alkaline phosphatase label, a peroxidase label, a luciferase label, a biotin label, or the like is used.
  • the sandwich ELISA method is a method of binding an antibody to a solid phase, trapping an antigen to be detected or measured, and reacting the trapped antigen with a second antibody.
  • a second antibody two kinds of antibodies or antibody fragments that bind to an antigen to be detected or measured and have different antigen-binding sites are prepared, and the first antibody or antibody fragment is pre-plated (for example, 96 Then, the second antibody or antibody fragment is labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme such as peroxidase, or biotin.
  • the antibody-adsorbed plate was reacted with cells or a disrupted solution thereof, a tissue or a disrupted solution thereof, a cell culture supernatant, serum, pleural effusion, ascites fluid, ocular fluid, or the like, which was separated from the living body, and then labeled.
  • An antibody or antibody fragment is reacted and a detection reaction according to the labeling substance is performed.
  • the antigen concentration in the test sample is calculated from a calibration curve prepared by serially diluting an antigen of known concentration.
  • the antibody used in the sandwich ELISA method either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used, and an antibody fragment such as Fab, Fab′, or F(ab) 2 may be used.
  • the combination of two types of antibodies used in the sandwich ELISA method may be a combination of monoclonal antibodies or antibody fragments that bind to different epitopes, or a combination of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof.
  • fluorescence immunoassay for example, the method described in the literature [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), monoclonal antibody experiment manual, Kodansha Scientific (1987)] is used. ..
  • the label used in the fluorescent immunoassay a known fluorescent label [fluorescent antibody method, Soft Science Co. (1983)] can be used. For example, FITC or RITC is used.
  • luminescence immunoassay for example, the method described in the literature [Bioluminescence and Chemiluminescence Clinical Laboratory 42, Hirokawa Shoten (1998)] is used.
  • the label used in the luminescent immunoassay include known luminescent labels such as acridinium ester or lophine.
  • the antigen or cells expressing the antigen is fractionated by SDS (sodium dodecyl sulfate)-PAGE [Antibodies-A Laboratory Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988)], and the gel is then polyvinylidene fluoride (1988).
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • the membrane is reacted with an antibody or antibody fragment that binds to an antigen, and a fluorescent substance such as FITC, an enzyme label such as peroxidase, or a biotin-labeled anti-IgG antibody or It is measured by visualizing the label after reacting the antibody fragment.
  • FITC fluorescent substance
  • an enzyme label such as peroxidase
  • biotin-labeled anti-IgG antibody a biotin-labeled anti-IgG antibody
  • cells or tissues expressing a polypeptide having a desired amino acid sequence are lysed, and 0.1 to 30 ⁇ g of protein per lane is electrophoresed by the SDS-PAGE method under reducing conditions.
  • the electrophoresed protein is transferred to a PVDF membrane and reacted with PBS containing 1 to 10% BSA (hereinafter referred to as BSA-PBS) for 30 minutes at room temperature to perform a blocking operation.
  • BSA-PBS PBS containing 1 to 10% BSA
  • the bispecific antibody of the present invention is reacted, washed with PBS containing 0.05 to 0.1% Tween-20 (Tween-PBS), and reacted with peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG for 2 hours at room temperature. ..
  • the antigen is detected by washing with Tween-PBS and detecting the band bound with the antibody using ECL Western Blotting Detection Reagents (manufactured by Amersham).
  • ECL Western Blotting Detection Reagents manufactured by Amersham.
  • an antibody used for detection by Western blotting an antibody that can bind to a polypeptide that does not have a native three-dimensional structure is used.
  • a physicochemical method for example, by binding at least one of the cell surface antigens such as TfR and EGFR, which are antigens, and the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention, an aggregate is formed, The aggregate is detected.
  • a physicochemical method a capillary method, a one-dimensional immunodiffusion method, an immunoturbidimetric method or a latex immunoturbidimetric method [Clinical Test Method Recommendation, Kanehara Shuppan (1998)] and the like can be used.
  • a carrier such as polystyrene latex having a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m sensitized with an antibody or an antigen is used, and when an antigen-antibody reaction is caused by the corresponding antigen or antibody, the reaction solution in the reaction solution is The scattered light increases and the transmitted light decreases. By detecting this change as absorbance or integrated turbidity, the antigen concentration in the test sample is measured.
  • a known immunological detection method can be used for the detection or measurement of cells expressing at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR, but immunoprecipitation method and immune cell staining method are preferable. Immunohistochemical staining method or fluorescent antibody staining method is used.
  • cells expressing at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR are reacted with the bispecific antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, and then specific to immunoglobulin such as protein G sepharose.
  • a carrier having binding ability is added to precipitate the antigen-antibody complex.
  • the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention is immobilized on a 96-well plate for ELISA and then blocked with BSA-PBS.
  • BSA-PBS blocked with BSA-PBS.
  • a lysate of cells or tissues expressing at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR is reacted.
  • the immunoprecipitate is extracted from the well-washed plate with a sample buffer for SDS-PAGE, and then detected by Western blotting as described above.
  • the immunocytostaining method or the immunohistostaining method means that cells or tissues expressing an antigen are treated with a surfactant or methanol in order to improve the permeability of the antibody, and then the bispecific method of the present invention is used. After reacting with an antibody and further reacting with an anti-immunoglobulin antibody or a binding fragment thereof which has been subjected to a fluorescent label such as FITC, an enzyme label such as peroxidase or a biotin label, the label is visualized and observed under a microscope. Is the way.
  • the bispecific antibody or the bispecific antibody fragment of the present invention can detect at least one of cell surface antigens such as TfR and EGFR expressed on the cell membrane by a fluorescent antibody staining method.
  • the fluorescent antibody staining method when the FMAT8100HTS system (manufactured by Applied Biosystems) or the like is used, the formed antibody-antigen complex and free radicals not involved in the formation of the antibody-antigen complex are used.
  • the amount of antigen or the amount of antibody can be measured without separating the antibody or the antigen.
  • Example 1 Preparation of soluble human and monkey TfR antigens and soluble human and monkey EGFR antigens Preparation of Human TfR and Monkey TfR Soluble Antigens Human and monkey TfR extracellular domain proteins with N-terminally added FLAG-Fc were prepared by the methods described below.
  • the nucleotide sequence encoding the human TfR extracellular domain is SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is SEQ ID NO: 2
  • the nucleotide sequence encoding the monkey TfR extracellular domain is SEQ ID NO: 3
  • the nucleotide sequence is The amino acid sequence deduced from is shown in SEQ ID NO:4.
  • FLAG-Fc- human TfR and FLAG-Fc-monkey TfR produce human TfR gene sequences of the vector (Genbank Accession Number: NM _ 003234.2 , SEQ ID NO: 5; amino acid sequence encoded by the gene is the SEQ ID NO: 6 Based on the above), a gene fragment of the extracellular domain of human TfR consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 was synthesized.
  • a FLAG-Fc-human TfR expression vector was prepared by digesting an INPEP4 vector (manufactured by Biogen-IDEC) containing FAG regions of FLAG-tag and human IgG with restriction enzymes BamHI and KpnI and inserting the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 into Was produced.
  • the gene of the extracellular domain of monkey TfR consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 based on the monkey TfR gene sequence (SEQ ID NO: 7; the amino acid sequence encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 8)
  • SEQ ID NO: 7 the amino acid sequence encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 8
  • a FLAG-Fc-monkey TfR expression vector containing the fragment was created.
  • the culture supernatant was affinity-purified using Protein A resin (MabSelect, manufactured by GE Healthcare).
  • the antibody adsorbed to protein A is referred to as Dulbecco's phosphate buffered saline [D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid; hereinafter D-PBS(-). Nacalai Tesque, Inc.] and eluted with 100 mM sodium citrate buffer (pH 3.5), and collected in a tube containing 2M Tris-HCl (pH 8.5).
  • Human EGFR gene sequence Human EGFR cells comprising the nucleotide sequence of SEQ based on (Genbank Accession Number NM _ 005228.4, SEQ ID NO: 13 said gene shows the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 14): 9 A gene fragment of the outer domain was synthesized. Similarly, a gene fragment of the extracellular domain of monkey EGFR consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 was synthesized. Human and monkey EGFR-FLAG-Fc proteins and human and monkey EGFR-GST proteins were obtained in the same manner as in 1-(1) and (2).
  • the concentration of the obtained protein was calculated by measuring the absorbance at a wavelength of 280 nm and using the extinction coefficient estimated from the amino acid sequence of each protein.
  • Example 2 Preparation of human or monkey TfR membrane-expressing CHO cells
  • the human TfR gene shown in SEQ ID NO: 5 was cloned into pKANTEX (described in US Pat. No. 6,423,511), and a human TfR expression vector pKANTEX-human for membrane expression was cloned. TfR full was obtained.
  • the obtained expression vector pKANTEX-human TfR full was introduced into CHO cells and cultured to express the protein in a transient expression system. After gene introduction, single cell cloning was performed to obtain human TfFR/CHO cells.
  • the monkey TfR gene shown in SEQ ID NO: 7 was cloned by the same method to obtain monkey TfR/CHO cells.
  • CFSE Carblxyl fluorescein succinininidyl ester
  • the cells were centrifuged and washed with 1% BSA-PBS (Nacalai Tesque, Inc.) containing 0.02% EDTA and 0.05% NaN 3 .
  • BSA-PBS Nacalai Tesque, Inc.
  • the obtained CFSE-stained cells were cryopreserved in Cellbanker 1 (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.).
  • Example 3 Immunization of human antibody-producing animals
  • FLAG-Fc-human TfR and human EGFR-FLAG-Fc mixed with an adjuvant in human antibody-producing animals were used. Immunized 4-5 times. Serum was collected from the immunized animal, and the binding activity to human TfR and human EGFR was analyzed by ELISA to confirm that the antibody titer was increased.
  • Example 4 Acquisition of anti-TfR antibody Preparation of TfR Immunized Human Antibody M13 Phage Library with A27 Light Chain RNA from spleen cells or peripheral blood mononuclear cells (PBMC) obtained from immunized animals using RNeasy Mini kit (QIAGEN) was extracted, the cDNA was amplified with the SMARTer RACE cDNA amplification kit (manufactured by Clontech), and the VH gene fragment was further amplified by PCR.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • VH gene fragment and the human antibody germ-line sequence, A27 sequence consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15, were inserted into the phagemid pCANTAB 5E (manufactured by Amersham Pharmacia) to transform E. coli TG1 (manufactured by Lucigen).
  • the plasmid was obtained by conversion.
  • the A27 sequence encodes the human antibody light chain variable region (VL) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, and CDRs 1, 2 and 3 of the VL (also referred to as LCDR1, 2 and 3 respectively)
  • VL human antibody light chain variable region
  • CDRs 1, 2 and 3 of the VL also referred to as LCDR1, 2 and 3 respectively
  • the amino acid sequences of are shown in SEQ ID NOs: 17, 18 and 19, respectively.
  • the phage was eluted with 0.1 M Gly-HCl (pH 2.2), and the eluate was neutralized with 2 M Tris-HCl (pH 8.5).
  • AAD 7-aminoactinomycin D
  • BD Biosciences 7-aminoactinomycin D
  • flow cytometer The 7-AAD-negative live cell fraction and the CFSE-positive antigen-expressing cell fraction were sorted by BD Bioscience, FACS Aria III).
  • APC-positive phage-binding fractions were sorted in addition to the above. Phages were eluted from the sorted cells with 0.1 M Gly-HCl (pH 2.2), and the eluate was neutralized with 2 M Tris-HCl (pH 8.5).
  • TG1 was infected with the concentrated phages, and SOBAG plates (2.0% tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.05% NaCl, 2.0% glucose, 10 mM MgCl 2 , 100 ⁇ g/mL ampicillin, 1.5) were used. % Agar) to form colonies.
  • a single clone phage was obtained by infecting with VCSM13 Interference Resistant Helper Phase and culturing again.
  • clones that bind to both human and monkey TfR were selected by flow cytometry (Millipore, Guava Easy Cyt HT).
  • Flow cytometry was performed by adding a phage clone to the human or monkey TfR/CHO of Example 2. After reacting at 4°C for 30 minutes, each well was washed 3 times with PBS-T.
  • ELISA was performed to confirm TfR reactivity of the cloned phage. Specifically, a phage solution diluted with PBS-T containing 10% Block Ace (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to a 96-well immunoplate (Nunc) on which an antigen protein was immobilized, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. After reacting for a time, washed with PBS-T, added anti-M13 antibody (manufactured by GE Healthcare) labeled with horseradish peroxidase diluted with 1% BSA-PBS, and reacted at room temperature for 1 hour. went.
  • PBS-T 96-well immunoplate
  • TMB color development substrate solution manufactured by DAKO
  • 2N HCl solution was added to stop the color development reaction
  • the absorbance at wavelength 450 nm (reference wavelength 570 nm) was measured with a plate reader (Emax; Molecular Devices).
  • Table 1 shows the obtained full-length nucleotide sequence of each anti-TfR antibody, the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence, and the CDR1 to 3 of VH (hereinafter sometimes referred to as HCDR1 to 3). The sequence number of the amino acid sequence is shown. In addition, "-" in the table indicates that sequence information is not described.
  • the cell suspension was centrifuged (900 rpm, 5 minutes) to gently loosen the cells in the obtained precipitate fraction, and the concentration of spleen cells was then added using Esclone cloning medium to which HAT SUPPLEMENT (Thermo Fisher Scientific) was added.
  • HAT SUPPLEMENT Thermo Fisher Scientific
  • Thermo Fisher Scientific was added.
  • the HAT-added cloning medium was dispensed at 100 ⁇ L/well into a 96-well culture plate in advance, and the cell suspension was dispensed at 100 ⁇ L/well, and the CO 2 incubator (5% CO 2 , 37° C.) was dispensed. ) For 8 to 10 days.
  • the SMARTer RACE Kit (Clontech) was used for the synthesis of the RACE cDNA.
  • the amplified antibody variable region fragment was cloned using TOPO TA cloning (Invitrogen) to confirm the nucleotide sequence of the DNA fragment.
  • amino acid sequences deduced from the nucleotide sequences encoding the variable regions of the heavy and light chains of clone 2230 are shown in SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54, respectively.
  • the VH gene was subcloned into N5KG4PE or N5KG4PE R409K to obtain an expression vector of an anti-TfR monoclonal antibody having a constant region of human IgG4PE or a constant region of human IgG4PE R409K.
  • an expression vector was prepared in order to use the anti-TfR monoclonal antibodies TfR434 and TfR435 that are TfR neutralizing antibodies described in WO2012/153707 as positive control antibodies for the anti-TfR antibody.
  • the amino acid sequences of VH of TfR434 and TfR435 are shown in SEQ ID NOs: 55 and 56, and the amino acid sequence of VL is shown in SEQ ID NO: 57, respectively.
  • Example 5 Acquisition of antibody against cell surface antigen (1) Preparation of EGFR antibody 1. Preparation of EGFR-immunized human antibody M13 phage library By the same method as in 1. of Example 4, EGFR immunization having the VL gene consisting of A27 sequence or the VL gene of anti-TfR antibody 2230 and VH gene was made into a library. A human antibody M13 phage library was obtained.
  • This operation was repeated 3 to 5 times to concentrate the phages displaying the scFv that specifically bind to human and monkey EGFR-Fc.
  • the clones that specifically recognize human and monkey EGFR-Fc were confirmed by ELISA.
  • the ELISA was carried out in the same manner as in Example 4 with the human or monkey EGFR-Fc of Example 1 immobilized.
  • an anti-EGFR antibody having the same VL as the anti-TfR antibody 2230 was obtained.
  • the amino acid sequences deduced from the nucleotide sequences encoding the variable regions of the heavy chains of clones KME07, KME09 and KME11 are shown in SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 and SEQ ID NO: 75, respectively.
  • a soluble IgG expression vector incorporating the obtained anti-EGFR antibody gene was prepared in the same manner as in Example 4.
  • the constant region the constant region of human IgG4PE or human IgG4PE R409K was used.
  • Cetuximab an antibody having a variable region of the anti-EGFR monoclonal antibody C225 described in International Publication No. 1996/040210 (hereinafter referred to as Cetuximab) was produced.
  • the amino acid sequence of VH of Cetuximab is shown in SEQ ID NO:76.
  • the amino acid sequence of Cetuximab VL is shown in SEQ ID NO: 77.
  • VH1 and VH2 are either the VHs of the antibodies obtained in Example 4 or Example 5, and VH1 and VH2 are the VHs of antibodies against different antigens.
  • the gene encoding the amino acid sequence of the linker is referred to as a linker gene.
  • a linker sequence of the bispecific antibody produced in the following steps a part of the hinge region of IgG4 (ES (SEQ ID NO: 79), ESKYG (SEQ ID NO: 80), ESKYGPP (SEQ ID NO: 81), etc.) was linked. Or a GS linker (GGGGGS (SEQ ID NO: 82) or GGGGS three times repeated sequence) was used.
  • IgG4PE or the heavy chain constant region of IgG4PE R409K described in WO 2006/033386 base sequence of SEQ ID NO: 83 and amino acid sequence of SEQ ID NO: 84 was used.
  • EGFR-TfR bispecific antibody a bispecific antibody containing the variable region of the anti-EGFR antibody in the N-terminal side polypeptide and the variable region of the anti-TfR antibody in the IgG portion.
  • EGFR-TfR bispecific antibody an EGFR-TfR bispecific antibody containing the variable region of the anti-EGFR antibody E12 and the variable region of the anti-TfR antibody TfR1071 is described as E12-TfR1071.
  • TfR-EGFR bispecific antibody a bispecific antibody containing the variable region of the anti-TfR antibody in the N-terminal side polypeptide and the variable region of the anti-EGFR antibody in the IgG portion.
  • TfR-EGFR bispecific antibody containing the variable region of the anti-TfR antibody TfR1071 and the variable region of the anti-EGFR antibody E12 is described as TfR1071-E12.
  • An antibody having a linker between the N-terminal polypeptide and the IgG portion is described as EGFR-linker-TfR bispecific antibody.
  • the EGFR-linker-TfR bispecific antibody having ES as a variable region of the anti-EGFR antibody E08, the variable region of the anti-TfR antibody TfR1071 and a linker is referred to as E08-ES-TfR1071.
  • the GS linker (SEQ ID NO: 82) is described as GS, and the sequence obtained by repeating the GS linker three times is described as GS3.
  • Table 3 shows the name, structure, linker, clone name of the anti-TfR antibody used for preparing the antibody and clone name of the antibody against the cell surface antigen of the bispecific antibody.
  • "-" in the table indicates that a linker is not used and there is no corresponding sequence.
  • the antibody shown in Fig. 1(B) consists of one type of vector.
  • the A27 gene encoding VL was subcloned into the pCI-OtCAG-G4PE R409K vector containing the nucleotide sequence encoding the constant region of human IgG4PE R409K.
  • the constant region sequence of the pCI-OtCAG_hG4PE R409K vector has a Ser residue at position 228 in the EU-index of the heavy chain constant region of human IgG4 as Pro, a Leu residue at position 235 as Glu, and an Arg residue at 409. It is a heavy chain constant region of an IgG4 mutant [hereinafter referred to as IgG4PE R409K (WO 2006/033386)] in which the groups are respectively replaced by Lys.
  • these vectors are vectors prepared by total synthesis by introducing a restriction enzyme site necessary for expressing a human antibody gene with the pCI vector from Promega as a common main skeleton.
  • pCI was obtained by fully synthesizing the VH gene of the antibody obtained in Example 5, the gene of the linker if there was a linker, and the nucleotide sequence of the polypeptide linked to the VH gene of the anti-TfR antibody obtained in Example 4. -Subcloned into A27 to obtain an expression vector.
  • Example 7 Preparation of monoclonal antibody binding to TfR, monoclonal antibody binding to cell surface antigen and bispecific antibody Anti-TfR monoclonal antibody subcloned into antibody expression vector in Examples 4 to 6, monoclonal against cell surface antigen Antibodies and bispecific antibodies having binding sites for both antigens were expressed and purified by the following methods.
  • the antibody expression vector was co-transfected into Expi293 cells by Expi293 (trademark) Expression System (Thermo Fisher), and 12 to 16 hours later, Transfection Enhancer was added to express the antibody or bispecific antibody in a transient expression system. It was
  • the culture supernatant was collected 4 to 7 days after the introduction of the vector, filtered through a membrane filter (Millipore) having a pore size of 0.22 ⁇ m, and the antibody was affinity-purified using Protein A resin (MabSelect SuRe, GE Healthcare). .. D-PBS(-) was used as a washing solution.
  • the antibody or bispecific antibody adsorbed to Protein A was eluted with 100 mM sodium citrate buffer (pH 3.5) and collected in a tube containing 2 M Tris-HCl buffer (pH 8.5).
  • the solution was concentrated using VIVASPIN (manufactured by Sartrius stealin), and the buffer solution was replaced with D-PBS(-) using Nap Column (manufactured by GE Healthcare). Furthermore, when purifying the monomer, AKTA FPLC (manufactured by GE Healthcare) and Superdex High-performance Columns (manufactured by GE Healthcare) are used to prepare a monomer fraction from the antibody or bispecific antibody solution. The fraction was collected. The purified antibody or the purified bispecific antibody was obtained by filtration sterilization with a membrane filter (Millex-GV, manufactured by MILLIPORE) having a pore diameter of 0.22 ⁇ m in the AKTA system.
  • VIVASPIN manufactured by Sartrius stealin
  • D-PBS(-) Nap Column
  • AKTA FPLC manufactured by GE Healthcare
  • Superdex High-performance Columns manufactured by GE Healthcare
  • the absorbance of the thus obtained antibody solution or bispecific antibody solution at a wavelength of 280 nm is measured, and the concentration of the purified antibody or the purified bispecific antibody is calculated using the extinction coefficient estimated from the amino acid sequence of each antibody or bispecific antibody. did.
  • Example 8 Evaluation of Bispecific Antibody Binding to Antigen by Biacore
  • SPR method surface plasmon resonance method
  • the FLAG-Fc-human TfR, FLAG-Fc-monkey TfR, human EGFR-GST and monkey EGFR-GST prepared in Example 1 were used.
  • a binding test was performed.
  • Biacore T100 manufactured by GE Healthcare
  • the Anti-human IgG antibody was immobilized on a CM5 sensor chip (manufactured by GE Healthcare) using a Human Antibody Capture Kit (manufactured by GE Healthcare) according to the package insert.
  • a test bispecific antibody prepared at 1 to 3 ⁇ g/mL was added to the flow cell at a flow rate of 10 ⁇ L/min for 10 seconds.
  • an antigen protein solution (diluted with HBS-EP+ containing 0.1% BSA (manufactured by GE Healthcare)) diluted 3-fold in 5 steps from 1 or 9 nM was added as an analyte at a flow rate of 30 ⁇ L/min.
  • the binding reaction between each bispecific antibody and the analyte was measured for 2 minutes, and the dissociation reaction was measured for 10 minutes.
  • the measurement was performed by the single cycle kinetics method.
  • the obtained sensorgram was analyzed using Bia Evaluation Software (manufactured by GE Healthcare), and the kinetic constant of each antibody was calculated.
  • the K D values of the EGFR-TfR bispecific antibody for human TfR and monkey TfR were in the order of 10 ⁇ 8 to 10 ⁇ 9 M.
  • the EGFR-TfR bispecific antibody had a K D value for monkey TfR between 1/10 and 10 times the K D value for human TfR, indicating that there is cross-species between human TfR and monkey TfR.
  • the K D values of the EGFR-TfR bispecific antibody for human EGFR and monkey EGFR were in the order of 10 ⁇ 9 M to 10 ⁇ 10 M.
  • the K D value for monkey EGFR was between 1/10 and 10 times the K D value for human EGFR, indicating that there is cross-species between human EGFR and monkey EGFR.
  • Example 9 Measurement of antigen expression level of cancer cells by flow cytometer and evaluation of binding property of obtained antibody Various antigen expression levels in various cancer cell lines were measured by fluoresence activated cell sorting (FACS) method according to the following procedure. evaluated. A PE-labeled anti-human CD71 antibody (BD Pharmingen) and an AlexaFluor488-labeled anti-EGFR antibody (Santa Cruz) were used for evaluation.
  • FACS fluoresence activated cell sorting
  • TfR and EGFR The expression levels of TfR and EGFR in various cancer cell lines were evaluated as follows.
  • OE21 cells were suspended in Staining Buffer (SB) of D-PBS(-) containing 0.1% NaN 3 and 1% FBS at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells/mL, and a 96-well round bottom plate was prepared at 100 ⁇ L/well.
  • SB Staining Buffer
  • the expression level of GPC3 in HepG2 cells, HuH-7 cells and HLE cells was also evaluated. Specifically, cells were prepared in the same manner as above, HN3 antibody was used as the primary antibody, and then Alexa Fluor (registered trademark) 488 goat anti-human IgG (H+L) (Molecular Probes) was used as the secondary antibody. In addition, the cells were incubated at ice temperature for 30 minutes and the fluorescence intensity was measured by the same method.
  • 2(A) to (C) show OE21 cells and T.O.
  • the result of having evaluated the expression level of EGFR in Tn cell and U-937 cell by a flow cytometer is shown.
  • 2(D) to (G) show OE21 cells, T.
  • the result of having evaluated the expression level of TfR in Tn cell and U-937 cell by a flow cytometer is shown.
  • OE21 cells showed high expression of EGFR, T. Tn cells were expressed in EGFR and U-937 cells were low in EGFR expression.
  • FIGS. 3(A) to 3(C) show the results of evaluating the expression level of GPC3 in HepG2 cells, HuH-7 cells and HLE cells by a flow cytometer, respectively. Further, FIGS. 3(D) to (F) show the results of evaluation of the TfR expression level in HepG2 cells, HuH-7 cells and HLE cells by a flow cytometer, respectively. As shown in FIG. 3, HepG2 cells were high in GPC3 expression, HuH-7 cells were in GPC3 expression, and HLE cells were GPC3 negative. In addition, HepG2 cells, HuH-7 cells, and HLE cells all had low EGFR expression.
  • 4A to 4I show the results of E08, E12, E17, KME07, KME09, KME11, TfR1071, 2230, and T14, respectively.
  • KME11 As a result, among the anti-EGFR antibodies, only KME11 could not be confirmed to bind to OE21 cells. KME11 was selected as an antibody that binds to the soluble EGFR protein as described in Example 5, but the above results indicate that it does not bind to cell surface membrane EGFR. Further, among the anti-TfR antibodies, only T14 was not confirmed to bind to OE21 cells. T14 was selected as an antibody that binds to the soluble TfR protein by ELISA as described in Example 4, but the above results showed that it did not bind to the membrane-type TfR on the cell surface.
  • Example 10 Evaluation of antiproliferative activity of anti-TfR antibody The antiproliferative activity of the TfR monoclonal antibody obtained in Example 4 was evaluated as follows using the antiproliferative activity against cancer cell lines as an index.
  • test antibody was evaluated by adding 10 ⁇ g/mL of an anti-human IgG polyclonal antibody (Sigma) (hereinafter also referred to as a cross-link antibody) together with the test antibody to crosslink the test antibody.
  • an antibody that did not show growth inhibitory activity with the monoclonal antibody alone was selected as a TfR non-neutralizing antibody.
  • Example 11 Evaluation of growth inhibitory activity of antibody against cell surface antigen Using the growth inhibitory activity against cancer cell lines as an index, the growth inhibitory activity of the antibody against the cell surface antigen obtained in Example 5 was evaluated as follows. did.
  • OE21 cells 1 ⁇ 10 3 cells of OE21 cells were seeded on a flat-bottom 96-well plate (manufactured by Falcon), and test antibodies diluted to various concentrations with RPMI1640 medium containing 10% FBS (manufactured by Sigma-Aldrich) were added, and the temperature was 37° C., 5 After culturing in 0.0% carbon dioxide gas for 4 to 6 days, CellTiter-Glo (registered trademark) Luminescent CellViality Assay (Promega) was added, and the fluorescence intensity was measured using a microplate reader (1420 ARVO multilabel counter: WALLAC). ). Under each condition, three independent wells were used for evaluation, and an average value was calculated. The obtained fluorescence intensity value reflects the amount of ATP in living cells in each well. An anti-DNP antibody was used as a negative control.
  • OE21 cells were used to evaluate the growth inhibitory activity of the anti-EGFR antibody. Results for OE21 cells are shown in FIG. As shown in FIG. 6, Cetuximab and clone E08 showed strong growth inhibitory activity, E17 showed weak growth inhibitory activity, and clone E12 did not show growth inhibitory activity. This result is considered to reflect the EGF neutralizing activity of each antibody.
  • Example 12 Evaluation of growth inhibitory activity of bispecific antibody The growth inhibitory activity of the bispecific antibody obtained in Example 6 was evaluated as follows using the growth inhibitory activity against cancer cell lines as an index.
  • OE21 cells were used to evaluate the growth inhibitory activity of the bispecific antibody.
  • 7A to C show the evaluation results of the bispecific antibody having the variable region of the anti-EGFR antibody E08, the bispecific antibody having the variable region of the anti-EGFR antibody E12, and the bispecific antibody having the variable region of the anti-TfR antibody 2230, respectively. ..
  • variable region of a clone (TfR1071 or the like) that had growth inhibitory activity when crosslinked with a cross-linking antibody in Example 10 was placed on the IgG portion side, and the variable region of the anti-EGFR antibody was placed at the N-terminus.
  • the variable region of the anti-EGFR antibody was placed at the N-terminus.
  • ES amino acid sequence of the hinge region of IgG4
  • ESKYG ESKYGPP
  • Example 9 since the anti-TfR antibody T14 does not react with TfR on the cell surface, the growth inhibitory activity of E08-T14 and T14-E08 is purely E08-derived EGFR signal inhibitory activity (Example It is considered to be derived from 11).
  • a bispecific antibody containing the variable region of the clones (R327, TfR1071, TfR4016, cyno186 and cyno292) that exhibited growth inhibitory activity when crosslinked with a cross-linking antibody in Example 10 in the IgG portion.
  • the bispecific antibody containing the variable region in the IgG portion of the clones (PSM4072, TfR1007 and cyno163) that did not show growth inhibitory activity even when crosslinked with a cross-linking antibody.
  • KME07-2230, KME09-2230, and KME11-2230 showed growth inhibitory activity, as shown in FIG. 7C.
  • KME11 does not bind to EGFR on cells, it was revealed that the bispecific antibody KME11-2230 exerts cell growth inhibitory activity independently of EGFR.
  • a clone having such characteristics is likely to be toxic to EGFR-negative and TfR-positive normal cells such as bone marrow cells.
  • bispecific antibody having a variable region of an anti-TfR antibody which does not show growth inhibitory activity by itself such as R327, TfR1071, TfR4016, cyno186, cyno292, and which shows growth inhibitory activity when cross-linked, in an IgG portion
  • the cell surface antigen selectively shows strong growth inhibitory activity.
  • the growth inhibitory activity of bispecific antibodies was not affected by the presence or absence of a linker.
  • E12-TfR1071 shows a strong growth inhibitory activity against OE21 cells and a moderate growth inhibitory activity against T.Tn cells, but shows a strong growth inhibitory activity against U-937 cells. Showed no growth inhibitory activity. From this, it was found that E12-TfR1071 exhibits growth inhibitory activity in an EGFR expression level-dependent manner.
  • HepG2 cells were used to evaluate the growth inhibitory activity of various GPC3-TfR bispecific antibodies. As shown in FIG. 9, HN3-TfR1071, HN3-GS-TfR1071 and HN3-GS3-TfR1071 showed very strong growth inhibitory activity.
  • the growth inhibitory activity of the bispecific antibody HN3-TfR1071 obtained in Example 6 was examined using cell lines with different GPC3 expression levels. Evaluation was carried out in the same manner as in Example 10.
  • Example 9 the results using HepG2 cells as GPC3 high-expressing cells are shown in FIG. 10A, the results using HuH-7 cells as medium-expressing cells are shown in FIG. 10B, and the results using HLE cells as negative cells. Is shown in FIG. 10C.
  • HN3-TfR1071 showed a strong growth inhibitory activity against HepG2 cells highly expressing GPC3 and a moderate growth inhibitory activity against HuH-7 cells expressing GPC3. However, it showed no growth inhibitory activity on GPC3-negative HLE cells. From this, it was found that HN3-TfR1071 exhibits a growth inhibitory activity in a GPC3 expression level-dependent manner.
  • the bispecific antibody having the variable region of the anti-TfR antibody in the IgG portion shows a strong cell growth inhibitory activity in a cell surface antigen-dependent manner.
  • Example 13 Binding Inhibitory Activity of Anti-TfR Antibody and Bispecific Antibody against TfR and Transferrin
  • EGFR-TfR bispecific antibody Whether the binding of TfR and transferrin on cancer cells was inhibited was evaluated as follows using a flow cytometer.
  • the EGFR-TfR bispecific antibody of the present invention has no TfR neutralizing activity and does not inhibit the binding between TfR and transferrin on the cell surface.
  • OE21 cells 1 ⁇ 10 6 cells of OE21 cells were seeded on a flat-bottom 6- well plate (manufactured by Falcon) with RPMI1640 medium (manufactured by Sigma-Aldrich) containing 10% FBS, and a test antibody was added thereto, and the test antibody was added thereto at 37° C. and 5.0% carbonic acid. It was cultured under gas for 24 hours. Then, the mixture was left to stand on ice and washed once with PBS(-), then RIPA buffer (Thermo Fisher Co.) containing Protease/Phosphase Inhibitor Cocktail (CST Japan Co.) was added, and a lysis solution was used using a cell scraper (Co.). Was recovered.
  • RPMI1640 medium manufactured by Sigma-Aldrich
  • Prestain protein size marker III (Wako) was used as a standard for electrophoresis.
  • the electrophoresed gel was set on a blotter (ATTO) together with a filter paper (ATTO) and a membrane (ATTO), and the gel was blotted at 125 mA for 1 hour.
  • the membrane after blotting was shaken for 1 hour at room temperature or overnight at 4° C. using a blocking buffer solution (PIERCE).
  • TBS-T After washing 3 times with TBS-T (Wako), a secondary antibody against each primary antibody (Streptavidin antibody-HRP or anti-rabbit IgG antibody-HRP; Cell Signaling Technology) was added and shaken at room temperature for 1 hour. .. After washing three times with TBS-T, ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) was added and detected by Amersham Imager 600 (GE Healthcare).
  • the EGFR phosphorylated by the addition of E08-TfR1071 and the phosphorylated AKT were decreased similarly to the positive control Cetuximab, but the addition was not observed by the addition of E12-TfR1071.
  • the amount of TfR protein was decreased by the addition of E08-TfR1071 and E12-TfR1071, but was not decreased by Cetuximab.
  • E08-TfR1071 has EGFR signal inhibitory activity and TfR degrading activity, and E12-TfR1071 does not have EGFR signal inhibitory activity but only TfR degrading activity.
  • Example 15 Evaluation of the effect of EGFR-TfR bispecific antibody on TfR expression To clarify the mechanism of action of the growth inhibitory activity of bispecific antibody on cancer cells, EGFR-TfR bispecific antibody The effect on the expression level was evaluated as follows.
  • FIG. 13(A) to (D) show the results of Cetuximab, TfR1071 antibody, E08-TfR1071 bispecific antibody, and E12-TfR1071 bispecific antibody, respectively.
  • TfR1071 antibody when the TfR1071 antibody was added, the amount of transferrin bound to the cell surface did not decrease, whereas when the EGFR-TfR bispecific antibody was added, the transferrin bound to the cell surface. The amount of transferrin was reduced.
  • TfR-mediated growth inhibitory activity of the EGFR-TfR bispecific antibody of the present invention is due to the degradation of the TfR protein of cancer cells and the reduction of the TfR on the cell surface. It was
  • Example 16 Evaluation of influence of EGFR-TfR bispecific antibody on iron uptake In order to confirm whether iron is involved in the growth inhibitory activity against cancer cells of EGFR-TfR bispecific antibody, the following evaluation was performed.
  • Example 17 Comparison of Efficacy of EGFR-TfR Bispecific Antibody and EGFR Signal Inhibitor IncuCyte (Sartorius) was used to evaluate the activity between EGFR signal inhibition, TfR inhibition and two growth inhibition mechanisms.
  • TfR inhibition maintains the cell growth inhibitory activity even after the removal of the inhibitor, as compared with the EGFR signal inhibition.
  • human bone marrow cells are induced to differentiate into a multipotential hematopoetic stem cell (hereinafter referred to as GEMM), Recombinant Human SCF (Peprotech) at a final concentration of 50 ng/mL and Human IL-3 (Humanen IL-3) are human IL-3 (Human IL).
  • Human IL-6 Sigma-Aldrich
  • Human GM-CSF Human GM-CSF
  • G-CSF Miltenyi Biotec
  • the TfR neutralizing antibody TfR435 showed growth inhibitory activity, whereas the bispecific antibodies E08-TfR1071 and E12-TfR1071 did not show growth inhibitory activity.
  • the bispecific antibody of the present invention does not show a growth inhibitory activity on normal bone marrow cells expressing TfR. Therefore, the bispecific antibody of the present invention is expected to have reduced myelotoxicity as compared with the TfR neutralizing antibody.
  • Example 19 Growth-inhibitory activity of amino acid-modified EGFR-TfR bispecific antibody
  • the growth-inhibitory activity of E12-TfR1071 bispecific antibody in which the amino acid of VH of TfR1071 was modified was determined in the same manner as in Example 12 using OE21 cells. It was evaluated by.
  • an amino acid-modified EGFR-TfR bispecific antibody was prepared as follows.
  • Expression and preparation of the amino acid-modified bispecific antibody were performed according to the method described in Example 7. The following were prepared as amino acid-modified bispecific antibodies.
  • Y32A means that the 32nd amino acid residue Y (tyrosine) in the EU index is replaced with A (alanine).
  • 52A and 100A are branch numbers that mean the amino acid residues “between the 52nd and 53rd” and “between the 100th and 101st” in the EU index, respectively.
  • N52A-D means that the 52A-th amino acid residue in the EU index is replaced by N to A
  • Y100A-A means that the 100A-th amino acid residue in the EU index is replaced by Y-A.
  • the N52A-A and N52A-D variants of clone TfR1071 showed no growth inhibitory activity, and the V55E, W99A, and W99H variants had slightly reduced growth inhibitory activity.
  • the variant showed the same strong growth inhibitory activity as before the modification
  • N52 is important for exhibiting the growth inhibitory activity. Further, it was suggested that P98 exhibited the same growth inhibitory activity even if it was substituted with various other amino acids, and that it could be substituted with any other natural amino acid.
  • Example 20 Epitope identification of anti-TfR antibody
  • the epitope of anti-TfR antibody 1071 was identified as follows. Based on the sequence information described in WO 2014/189973, the anti-TfR antibodies 15G11v5, 7A4v15, and 16F6v4 that bind to the human TfR Apical domain, and the anti-TfR antibody 7G7v1 that recognizes the Protease-like domain are described in Example 7. It was prepared in the same manner as the method described in 1.
  • the extracellular domain protein of human TfR described in Example 1 was prepared. Further, among the extracellular domains of human TfR, a chimera in which the Apical domain or the Protease-like domain is replaced with the corresponding domain of mouse TfR (including the amino acid sequence shown in GenBank accession No. NP_001344227 or the amino acid shown in SEQ ID NO: 87) The protein was made. Specifically, the nucleotide sequences encoding these amino acid sequences were subcloned into a His tag-introduced pCI-OtCMV vector to obtain a protein expression vector.
  • His-huTfR is a His-tagged human TfR extracellular domain
  • huTfR with mouse apical domain is a His-tagged human TfR extracellular domain in which the Apical domain is replaced with the corresponding sequence of the mouse
  • huTfR with mouse-useliteotease Shows a His-tagged human TfR extracellular domain in which the Protease-like domain has been replaced with the corresponding mouse sequence.
  • chimeric TfRs A01 to A16 were prepared by substituting some amino acid residues of the human TfR Apical domain with corresponding amino acid residues of mouse TfR.
  • the amino acid sequences of the chimeric TfRs produced in Table 5 are shown in SEQ ID NOs: 90 to 105, respectively.
  • Table 5 shows the sites of amino acid substitution in each chimeric protein.
  • Q285K-T286N-T362S of A01 is 285th amino acid from Q to K, 286th amino acid from T to N, and 362th amino acid. Means that T is replaced with S. Amino acids were deleted when the corresponding mouse amino acid was absent, such as V210 of A08.
  • TfR epitope analysis of various TfR antibodies was performed.
  • the reactivity of the anti-TfR antibody produced in the present invention to human TfR/CHO produced in Example 2 and mouse TfR/CHO produced in the same manner as in Example 2 was examined by the same method as in Example 9. It was analyzed by flow cytometry.
  • R327, TfR1071, cyno186, cyno292 and 2230 all bound to human TfR but not mouse TfR.
  • 15G11v5, 7A4v15, 16F6v4, and 7G7v1 do not cross into mice (WO2014/189973).
  • the binding activity of the anti-TfR antibody to the various chimeric TfRs prepared above was analyzed by ELISA, and the binding domain of the anti-TfR antibody and the recognition epitope were identified.
  • the amino acid residue substituted in the chimeric TfR was identified as an epitope.
  • ELISA was performed by the following method. 1% (w/v) BSA-PBS (-) pH 7.0 without KCl (hereinafter referred to as blocking solution, Nacalai Tesque) was added to a 96-well immunoplate (Nunc) on which antigen proteins were immobilized. After blocking at room temperature, anti-TfR antibody diluted with the same solution was added and reacted at room temperature for 1 hour. After that, Anti-Human IgG (Fc) was washed with 0.05% (w/v)-tPBS (1x) without KCl (pH 7.2) (hereinafter referred to as a washing solution. Nacalai Tesque, Inc.) and diluted with a blocking solution.
  • Goat IgG Fab''-HRP (IBL) was added, reacted at room temperature for 1 hour, washed with a washing solution, and added with 1-Step (registered trademark) Ultra TMB-ELISA Substrate Solution (Thermo) at room temperature.
  • the reaction was performed under the following conditions to stop the color reaction by adding a 5N HCl solution, and the absorbance at a wavelength of 450 nm (reference wavelength 570 nm) was measured by a plate reader (EPOCH2: Bio Tek).
  • N/A in the table indicates that data is not acquired.
  • the value obtained by subtracting the absorbance at the reference wavelength of 570 nm from the absorbance at a wavelength of 450 nm is regarded as the binding activity to various antigenic proteins, and the value obtained by dividing the binding activity to various chimeric TfRs by the binding activity to His-huTfR is 0.5 or more.
  • T14, R327, TfR1071, cyno186, cyno292, 15G11v5, 7A4v15, and 16F6v4 recognize the Apical domain
  • 2230 and 7G7v1 recognize the Protease-like domain.
  • T14 is the amino acid substitution site of A05
  • R327, TfR1007, TfR1071 and cyno292 are the amino acid substitution sites of A02 and A07
  • cyno186 is the amino acid substitution of A02, A07 and A14.
  • 15G11v5 recognized the amino acid substitution sites of A02, A03, and A04
  • 7A4v15 and 16F6v4 recognized the amino acid substitution sites of A02.
  • the amino acid residue recognized by TfR1071 was shown to be the site where the amino acid substitution was made with A02 and A07. Therefore, it was suggested that the amino acid residues recognized by TfR1071 are 7 amino acid residues of D352, S355, D356, K358, M365, V366, and E369. The same applies to R327, TfR1007, and cyno292.
  • Example 21 Anti-TfR antibody epitope and growth inhibitory activity of EGFR-TfR bispecific antibody To analyze the relationship between the growth inhibitory activity of the bispecific antibody of the present invention and the epitope of the variable region of the IgG portion that binds to TfR. , E12-TfR bispecific antibody was prepared with various anti-TfR antibodies having different epitopes, and the growth inhibitory activity was evaluated.
  • a bispecific antibody having a structure as shown in FIG. 18(A) was produced by the method described in Example 6.
  • Penta-His Antibody Qiagen
  • His-huTfR was added, and the binding activity of each bispecific antibody to TfR as an analyte was measured to prepare.
  • Kinetic constants of various bispecific antibodies were calculated. The results are shown in Table 7.
  • the EGFR-TfR bispecific antibody using R327, TfR1007, TfR1071, cyno186 and cyno292 had stronger maximum activity than the other bispecific antibodies. From this result and the results of Example 20, by using the amino acid substitution sites of R327, TfR1007, TfR1071, and cyno292 whose epitopes are A02 and A07, and cyno186 whose epitopes are the amino acid substitution sites of A02, A07, and A14. It was found that the growth inhibitory activity of the specific antibody was high. Therefore, it was shown that including the amino acid substitution sites of A02 and A07 in the epitope is important for high growth inhibitory activity.
  • the bispecific antibody using TfR1071 and R327 showed the highest activity from the lowest concentration, and these clones showed high activity. Among them, it was shown that TfR1071 and R327 are particularly excellent.
  • EGFR-TfR bispecific antibody growth inhibitory activity using various anti-EGFR antibodies and TfR1071 An EGFR-TfR bispecific antibody was prepared with an anti-EGFR antibody and a TfR antibody TfR1071 and the growth inhibitory activity was evaluated.
  • Bispecific antibodies of anti-EGFR antibody (Cetuximab, Panitumumab, Necitumumab, Nimotuzumab) and TfR antibody TfR1071 were prepared in the same manner as in Example 6.
  • the sequences of the variable regions of Cetuximab, Panitumumab, Necitumumab, and Nimotuzumab are described in International Publication No. WO 1996/040210, International Publication No. 1998/050433, International Publication No. 2011/116387, and US Patent Application Publication No. 2012/03085576, respectively.
  • the one described in 1. was used.
  • a schematic diagram of the structure of the prepared bispecific antibody is shown in FIG. 1(c).
  • the EGFR-TfR bispecific antibody having the CDR of TfR1071 exhibited a strong growth inhibitory activity regardless of the variable region of any anti-EGFR antibody.
  • Example 23 Comparison of Growth Inhibitory Activity with Heterodimeric Bispecific Antibody
  • an anti-EGFR antibody was analyzed.
  • a heterodimeric bispecific antibody (hereinafter referred to as a heterodimeric antibody) having one antigen-binding domain of E12 and one antigen-binding domain of the anti-TfR antibody TfR1071 was prepared, and its growth inhibitory activity was evaluated.
  • FIG. 18B shows a schematic diagram of the structure of the produced heterodimeric antibody.
  • a bispecific antibody Hetero E12-TfR1071 having one E12 and one TfR1071 antigen-binding domain was prepared by the method described in the patent document (US Patent Application Publication No. 2014/0348839), and the same procedure as in Example 11 was performed. The growth inhibitory activity was evaluated by the method. The results are shown in Fig. 21.
  • Example 24 TfR binding activity of E12-TfR1071YE bispecific antibody
  • the E12-TfR1071YE bispecific antibody having the above was prepared by a conventional method. Similar to the method described in Example 20, the binding activity to human TfR protein was analyzed by ELISA. As a result, E12-TfR1071YE showed the same binding activity as E12-TfR1071.
  • SEQ ID NO: 1 human TfR extracellular domain nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 2 human TfR extracellular domain amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 3 monkey TfR extracellular domain nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 4 monkey TfR extracellular domain amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 5 Human TfR nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 6 Human TfR amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 8 Cynomolgus TfR amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 9 Human EGFR extracellular domain nucleotide sequence (signal sequence Including)
  • SEQ ID NO: 10 Human EGFR extracellular domain amino acid sequence (including signal sequence)
  • SEQ ID NO: 11 Base sequence of monkey EGFR extracellular domain (including signal sequence)
  • SEQ ID NO: 12 Amino acid sequence of monkey EGFR extracellular domain (including signal sequence)

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Abstract

本発明は、ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分にＮ末端側ポリペプチドが結合したバイスペシフィック抗体、該バイスペシフィック抗体断片、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を生産するハイブリドーマおよび形質転換株、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の製造方法、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む治療および診断薬、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いる治療および診断方法、ならびに該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む検出または測定試薬に関する。

Description

ＴｆＲに結合するバイスペシフィック抗体
　本発明は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合する抗原結合部位と細胞表面抗原に結合する抗原結合部位を含むバイスペシフィック抗体、該バイスペシフィック抗体断片、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を生産するハイブリドーマおよび形質転換株、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の製造方法、該バイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片を含む治療および診断薬、該バイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片を用いる治療および診断方法、ならびに該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む検出または測定用試薬に関する。
　抗体は、あらゆる哺乳動物の血清や組織体液中に存在する糖タンパク質であり、生体内において外来抗原を認識する。抗体は、補体系の活性化や、細胞表面に存在するレセプター（ＦｃＲ）への結合を介して、ＦｃＲ発現細胞の貪食能、抗体依存性細胞傷害能、メディエーターの遊離能、及び抗原提示能といったエフェクター機能を活性化し、生体防御に関与する。
　１分子の抗体は、２本の相同な軽鎖（Ｌ鎖）と２本の相同な重鎖（Ｈ鎖）とから成り、２つの抗原結合部位を備える。抗体のクラス及びサブクラスはＨ鎖によって決定され、各クラス及びサブクラスは異なる固有の機能を有する。ヒトの抗体には、５つの異なるクラス、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する。ＩｇＧはさらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに、ＩｇＡは、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラスに各々分類される（Charles A. J. et al., Immunobiology, 1997, Current Biology Ltd/Garland Publishing Inc.）。
　多価抗体は、１分子内に複数の抗原結合部位を備えた抗体である。多価抗体の例としては、まず、ハイブリッドハイブリドーマを用いて、二種類の異なる抗体由来のＨ鎖およびＬ鎖を１つの細胞で発現させることにより、異なる二種類の抗原にそれぞれ一価で結合する二価抗体を作製したことが報告された（非特許文献１）。しかしながら、本法では、抗体のＨ鎖とＬ鎖との組み合わせが１０通り程度生じる。そのため、所望のＨ鎖とＬ鎖との組み合わせを有する多価抗体の生成量は低く、またそのような多価抗体を選択的に単離精製することも難しいため、所望の抗体の収量は減少する。
　この問題点を克服するため、複数の抗原結合部位を連結して単一のポリペプチド鎖として発現することにより、サブユニット間の組み合わせのバリエーションを減らし、所望の組み合わせを有する抗体を生産する試みが報告されている。
　一例として、Ｈ鎖とＬ鎖の抗原結合部位を１つのポリペプチドで連結したｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む抗体（非特許文献２）が知られている。さらに、ＩｇＧ１のＨ鎖定常領域のＣＨ１ドメインもしくは該ドメインの部分断片及びＬ鎖定常領域、又はフレキシブルリンカー（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）を用いて、二つの抗原結合部位を連結させた抗体などが報告されている（特許文献１、特許文献２）。
　これらの従来の多価抗体は、凝集し易く、安定性や生産性が低いという欠点を有していた。しかし一方で、単一のＨ鎖ポリペプチド中に複数の抗原結合部位を有し、抗体重鎖可変領域がイムノグロブリンドメインまたはその断片のアミノ酸配列を有するリンカーを介して結合している多価抗体は、安定性が高く、生産性も良いことが見出されている（特許文献３）。
　トランスフェリンレセプター（以下ＴｆＲとも記載する）は、網状赤血球表面に発現する細胞膜構造として同定された。ＴｆＲはトランスフェリン（以下Ｔｆとも記載する）に結合した鉄を細胞内に取り込む機能を有している。鉄は細胞の恒常性の維持や細胞増殖に必要不可欠な金属であるため、それを取り込むためのＴｆＲは胎盤の栄養膜細胞、網状赤血球、活性化されたリンパ球や鉄取り込みが盛んな正常組織で多く発現している。また、増殖が活発な様々な腫瘍細胞（非特許文献３、非特許文献４）においても多く発現していることが知られている。ＴｆＲは細胞膜上で架橋されるとクラスリン依存的なエンドサイトーシスによる内在化が促進され、分解されることが知られている（非特許文献５、非特許文献６）。
　骨髄細胞以外の正常細胞におけるＴｆＲの発現量は低く、増殖が活発ながん細胞では発現が高いため、ＴｆＲは古くからがん治療の分子標的として認識されている。ＴｆＲを標的とした分子として、たとえば、マウス担がんモデルにおいて強い薬効を示すＴｆＲ中和抗体が知られている（特許文献４）。
　正常細胞と比較してがん細胞では特定の膜タンパク質の発現が亢進していることが知られている。このような膜タンパク質を選択的に認識する抗体によってがん細胞のみを殺す機能を有する医薬品が開発されている。たとえば大腸がんや頭頸部がんに対してＥｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（以下ＥＧＦＲと記載する）を標的とした抗体医薬品は臨床で有効性が確認されている（非特許文献７）。
　ＥＧＦＲは、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（以下ＥＧＦと記載する）の受容体として発見されたチロシンキナーゼ型の受容体である。ＥＧＦＲは分子量が１７０ｋＤａの膜貫通型膜糖タンパク質で、リガンドが結合すると二量体を形成し、下流の細胞内シグナル伝達経路を活性化することにより、細胞の増殖、分化、浸潤、転移などを促す。
　ＥＧＦＲは上皮系、間葉系、神経系の多様な細胞で発現しているが、脳腫瘍や扁平上皮がんなど多くのがん細胞で高発現している（非特許文献８、非特許文献９）ことから、がん抗原として知られている。
　二種類の膜タンパク質に結合できる分子を用いることで、一方の抗原分子を足場にもう一方の抗原分子を内在化、分解できることが知られている（特許文献５、特許文献６）。また、がん細胞特異的な膜タンパク質を認識するペプチドとＴｆＲを認識するペプチドを化学的に結合、またはハイブリドーマフュージョン法で連結させると、鉄キレート剤添加条件下で両方の抗原が発現している細胞に対して増殖阻害活性を示すことが報告されている（特許文献７）。
米国特許出願公開第２００７／００７１６７５号明細書 国際公開第２００１／０７７３４２号 国際公開第２００９／１３１２３９号 国際公開第２０１２／１５３７０７号 国際公開第２０１３／１３８４００号 欧州特許出願公開第２８０８０３５号明細書 米国特許第５７０５６１号明細書
Suresh et al., Methods Enzymol. 121, 210-228, 1986 Kranz et al., J. Hematother. 5, 403-408, 1995 Hamilton TA et al., PNAS USA 76 6406-10, 1979 Larson SM et al., J Natl Cancer Inst. 64 41-53, 1980 Liu AP et al., J Cell Biol. 191 1381-93, 2010 Weissman AM et.al., J Cell Biol. 102 951-8, 1986 Erbitux 米国添付文書（２０１８年６月改訂） Libermann TA et al., Cancer Res. 44 753-60, 1984 Hendler FJ et al., J Clin Invest. 74 647-51, 1984
　本発明は、ＴｆＲおよび細胞表面抗原に結合する新規なバイスペシフィック抗体、該バイスペシフィック抗体断片、該バイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該バイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片を生産するハイブリドーマおよび形質転換株、該バイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片の製造方法、該バイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片を含む治療および診断薬、該バイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片を用いる治療および診断方法、ならびに該バイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片を含む検出または測定用試薬を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するための手段として、本発明はＴｆＲに結合するＩｇＧ部分のＮ末端側に、細胞表面抗原への抗原結合部位を有するポリペプチド（Ｎ末端側ポリペプチドとも言う）が直接またはリンカーを介して結合する、ＴｆＲおよび細胞表面抗原に結合するバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片などを提供する。
　すなわち本発明は、以下に関する。
１．Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴｆＲ）に結合するＩｇＧ部分、および細胞表面抗原に結合するＮ末端側ポリペプチドを含むバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片であって、該ポリペプチドが該ＩｇＧ部分の重鎖のＮ末端に直接またはリンカーを介して結合する、ＴｆＲおよび細胞表面抗原に結合するバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
２．前記ＩｇＧ部分が、
　配列番号３２で表されるアミノ酸配列もしくは配列番号３２で表されるアミノ酸配列から、２番目のチロシンのアラニンもしくはフェニルアラニンへの置換および３番目のスレオニンのアラニンもしくはグリシンへの置換から選ばれる少なくとも１つの置換により改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）１、
　配列番号３３で表されるアミノ酸配列もしくは配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、１番目のバリンのアラニンへの置換、２番目のイソロイシンのアラニンもしくはロイシンへの置換、７番目のバリンのグルタミン酸への置換、１０番目のアスパラギン酸のアラニンへの置換および１３番目のアスパラギン酸のプロリンへの置換から選ばれる少なくとも一つの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および
　配列番号３４で表されるアミノ酸配列もしくは配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、３番目のグルタミンのアラニンもしくはアスパラギン酸への置換、４番目のプロリンの任意の天然アミノ酸への置換、５番目のトリプトファンのアラニン、フェニルアラニン、ヒスチジンもしくはチロシンへの置換、７番目のチロシンのアラニンもしくはフェニルアラニンへの置換および１３番目のバリンのロイシンへの置換から選ばれる少なくとも１つの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに
　それぞれ配列番号１７～１９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、前記１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
３．前記ＩｇＧ部分が、以下の（ａｉ）～(ｃｉ)から選ばれる１のＶＨ、およびそれぞれ配列番号１７～１９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＬを含む、前記１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
（ａｉ）それぞれ配列番号３２～３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ
（ｂｉ）それぞれ配列番号４２～４４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ
（ｃｉ）それぞれ配列番号４７～４９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ
４．前記ＩｇＧ部分が、配列番号２６、３１、３６、４１、および４６のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、前記１または２に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
５．前記ＩｇＧ部分が、それぞれ配列番号１７～１９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＬ、および、以下の（ａ）～(ｍ)から選ばれる１のＶＨを含む、前記１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
（ａ）それぞれ配列番号３３および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および３、ならびに、配列番号３２で表されるアミノ酸配列から、２番目のチロシンのアラニンまたはフェニルアラニンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ
（ｂ）それぞれ配列番号３３および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および３、ならびに、配列番号３２で表されるアミノ酸配列から、３番目のスレオニンのアラニンまたはグリシンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ
（ｃ）それぞれ配列番号３２および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および３、ならびに、配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、１番目のバリンのアラニンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ
（ｄ）それぞれ配列番号３２および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および３、ならびに、配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、２番目のイソロイシンのアラニンまたはロイシンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ
（ｅ）それぞれ配列番号３２および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および３、ならびに、配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、７番目のバリンのグルタミン酸への置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ
（ｆ）それぞれ配列番号３２および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および３、ならびに、配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、１０番目のアスパラギン酸のアラニンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ
（ｇ）それぞれ配列番号３２および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および３、ならびに、配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、１３番目のアスパラギン酸のプロリンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ
（ｈ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、３番目のグルタミンのアラニンまたはアスパラギン酸への置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
（ｉ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、４番目のプロリンの任意の天然アミノ酸への置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
（ｊ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、４番目のプロリンのアラニン、チロシン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、スレオニン、アルギニン、グリシン、リジン、メチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニンもしくはヒスチジンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
（ｋ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、５番目のトリプトファンのアラニン、フェニルアラニン、ヒスチジンまたはチロシンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
（ｌ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、７番目のチロシンのアラニンまたはフェニルアラニンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
（ｍ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、バリンのロイシンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
６．前記ＩｇＧ部分が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ、ならびに配列番号３１で表されるアミノ酸配列から、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックス（以下、ＥＵインデックス）により示されるＹ３２Ａ、Ｙ３２Ｆ、Ｔ３３Ａ、Ｔ３３Ｇ、Ｌ４５Ａ、Ｖ４８Ａ、Ｖ５０Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｉ５１Ｌ、Ｖ５５Ｅ、Ｄ５８Ａ、Ｄ６１Ｐ、Ｑ９７Ａ、Ｑ９７Ｄ、Ｗ９９Ａ、Ｗ９９Ｆ、Ｗ９９Ｈ、Ｗ９９Ｙ、Ｙ１００ＡＡ、Ｙ１００ＡＦ、Ｖ１０２Ｌ、およびＰ９８の任意のアミノ酸への置換から選ばれる少なくとも１つの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＶＨを含む、前記１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
７．前記ＩｇＧ部分が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ、ならびに配列番号３１で表されるアミノ酸配列から、ＥＵインデックスにより示されるＹ３２Ａ、Ｙ３２Ｆ、Ｔ３３Ａ、Ｔ３３Ｇ、Ｌ４５Ａ、Ｖ４８Ａ、Ｖ５０Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｉ５１Ｌ、Ｖ５５Ｅ、Ｄ５８Ａ、Ｄ６１Ｐ、Ｑ９７Ａ、Ｑ９７Ｄ、Ｗ９９Ａ、Ｗ９９Ｆ、Ｗ９９Ｈ、Ｗ９９Ｙ、Ｙ１００ＡＡ、Ｙ１００ＡＦ、Ｖ１０２Ｌ、Ｐ９８Ａ、Ｐ９８Ｙ、Ｐ９８Ｓ、Ｐ９８Ｄ、Ｐ９８Ｑ、Ｐ９８Ｅ、Ｐ９８Ｔ、Ｐ９８Ｒ、Ｐ９８Ｇ、Ｐ９８Ｋ、Ｐ９８Ｍ、Ｐ９８Ｖ、Ｐ９８Ｌ、Ｐ９８Ｉ、Ｐ９８Ｗ、Ｐ９８Ｆ、およびＰ９８Ｈから選ばれるいずれか１つの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＶＨを含む、前記１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
８．前記ＩｇＧ部分が、配列番号６で表されるＴｆＲのアミノ酸配列の３５２番目のＡｓｐ、３５５番目のＳｅｒ、３５６番目のＡｓｐ、および３５８番目のＬｙｓから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基、並びに、３６５番目のＭｅｔ、３６６番目のＶａｌ、および３６９番目のＧｌｕから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を認識する、前記１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
９．前記ＩｇＧ部分の重鎖定常領域が配列番号８４または配列番号８６で表されるアミノ酸配列を含む前記１～８のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
１０．前記細胞表面抗原がＥＧＦＲまたはＧＰＣ３である、前記１～９のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
１１．前記細胞表面抗原がＥＧＦＲである、前記１～１０のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
１２．前記Ｎ末端側ポリペプチドが前記細胞表面抗原に対する抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびＶＨＨのいずれか１つである、前記１～１１のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
１３．前記Ｎ末端側ポリペプチドが、前記細胞表面抗原に対する抗体のＦａｂである、前記１～１２のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
１４．前記Ｎ末端側ポリペプチドが、ＥＧＦＲに対する抗体のＦａｂであって、該抗体がそれぞれ配列番号６０～６２またはそれぞれ配列番号６５～６７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ、およびそれぞれ配列番号１７～１９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＬを含む抗体である、前記１～９のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
１５．前記ＥＧＦＲに対する抗体が、以下の（ａ）～（ｅ）から選ばれる１の抗体である、前記１４に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
（ａ）配列番号５９または配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体
（ｂ）配列番号１１０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体
（ｃ）配列番号１１２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体
（ｄ）配列番号１１４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体
（ｅ）配列番号１１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体
１６．前記Ｆａｂの重鎖Ｃ末端が前記ＩｇＧ部分の重鎖Ｎ末端に直接結合する、前記１３～１５のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
１７．前記Ｆａｂの重鎖Ｃ末端がＩｇＧ部分の重鎖Ｎ末端にリンカーを介して結合する、前記１３～１５のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
１８．上記リンカーのアミノ酸配列がＩｇＧのヒンジ領域のアミノ酸配列の一部または全部からなる、前記１７に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
１９．前記Ｆａｂおよび前記ＩｇＧ部分が同一のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む前記１３～１８のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
２０．前記１～１９のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡ。
２１．前記２０に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
２２．前記２１に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
２３．前記２２に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に前記１～１９のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を生産蓄積させ、該培養物からバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を採取することを特徴とする前記１～１９のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の製造方法。
２４．前記１～１９のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を有効成分として含有する、ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断薬。
２５．ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患ががんである前記２４に記載の治療薬および／または診断薬。
２６．前記１～１９のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いる、ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断方法。
２７．ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患ががんである前記２６に記載の方法。
２８．ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断に使用するための、前記１～１９のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
２９．ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患ががんである前記２８に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
３０．ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断剤の製造のための、前記１～１９のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の使用。
３１．ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患ががんである前記３０に記載の使用。
３２．前記１～１９のいずれか１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む、ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方を検出または測定するための試薬。
　本発明により、ＴｆＲおよび細胞表面抗原に結合する新規なバイスペシフィック抗体、該バイスペシフィック抗体断片、該バイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該バイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片を生産するハイブリドーマおよび形質転換株、該バイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片の製造方法、該バイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片を含む治療および診断薬、該バイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片を用いる治療および診断方法、ならびに該バイスペシフィック抗体またはバイスペシフィック抗体断片を含む検出または測定用試薬を提供できる。
図１は、本発明のバイスペシフィック抗体の構造の一例を示す。図１（Ａ）はＮ末端側ポリペプチドがＦａｂであり、ＦａｂのＶＨを含むポリペプチドがＩｇＧ部分のＮ末端に結合しているバイスペシフィック抗体を表す。図１（Ｂ）はＮ末端側ポリペプチドがＶＨＨであるバイスペシフィック抗体を表す。図１（Ｃ）はＮ末端側ポリペプチドがＦａｂであり、ＦａｂのＶＬを含むポリペプチドがＩｇＧ部分のＮ末端に結合しているバイスペシフィック抗体を表す。 図２は各種がん細胞株における抗原発現量をフローサイトメトリーで評価した結果を表す。図２（Ａ）～（Ｃ）はそれぞれ、ＯＥ２１細胞、Ｔ．Ｔｎ細胞およびＵ－９３７細胞におけるＥＧＦＲの発現量をフローサイトメーターで評価した結果を示す。図２（Ｄ）～（Ｆ）はそれぞれ、ＯＥ２１細胞、Ｔ．Ｔｎ細胞およびＵ－９３７細胞におけるＴｆＲの発現量をフローサイトメーターで評価した結果を示す。縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度を表す。実線は抗ＴｆＲ抗体または抗ＥＧＦＲ抗体の結合性、灰色で塗りつぶしたヒストグラムは陰性対照のアイソタイプ抗体の結合性を表す。 図３は肝がん細胞株における抗原発現量をフローサイトメトリーで評価した結果を表す。図３（Ａ）～（Ｃ）はそれぞれ、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｕＨ－７細胞およびＨＬＥ細胞におけるＧＰＣ３の発現量をフローサイトメーターで評価した結果を示す。図３（Ｄ）～（Ｆ）はそれぞれ、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｕＨ－７細胞およびＨＬＥ細胞におけるＴｆＲ発現量をフローサイトメーターで評価した結果を示す。図３（Ｇ）～（Ｉ）はそれぞれ、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｕＨ－７細胞、およびＨＬＥ細胞におけるＥＧＦＲ発現量をフローサイトメーターで評価した結果を示す。縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度を表す。実線は抗ＧＰＣ３抗体、抗ＴｆＲ抗体または抗ＥＧＦＲ抗体の結合性、灰色で塗りつぶしたヒストグラムは陰性対照のアイソタイプ抗体または抗ＤＮＰ抗体の結合性を表す。 図４（Ａ）～（Ｉ）はＯＥ２１細胞に対する各抗体の結合性をフローサイトメーターで評価した結果を表す。縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度を表す。実線は抗ＥＧＦＲ抗体または抗ＴｆＲ抗体の結合性、灰色で塗りつぶしたヒストグラムは陰性対照の二次抗体の結合性を表す。 図５はＯＥ２１細胞に対する各ＴｆＲ抗体の増殖阻害活性を評価した結果を表す。縦軸は陰性対照に対する生細胞中ＡＴＰ量の相対値で示した、細胞の生存率を表す。黒色の棒グラフがモノクローナル抗体のみを添加したときの結果、白色の棒グラフがクロスリンク抗体を添加してモノクローナル抗体を架橋したときの結果を表す。 図６はＯＥ２１細胞に対する各ＥＧＦＲ抗体の増殖阻害活性を評価した結果を表す。縦軸は陰性対照に対する生細胞中ＡＴＰ量の相対値で示した、細胞の生存率を表す。 図７ＡはＯＥ２１細胞に対する各種バイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を評価した結果を表す。縦軸は陰性対照に対する生細胞中ＡＴＰ量の相対値で示した、細胞の生存率を表す。 図７ＢはＯＥ２１細胞に対する各種バイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を評価した結果を表す。縦軸は陰性対照に対する生細胞中ＡＴＰ量の相対値で示した、細胞の生存率を表す。 図７ＣはＯＥ２１細胞に対する各種バイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を評価した結果を表す。縦軸は陰性対照に対する生細胞中ＡＴＰ量の相対値で示した、細胞の生存率を表す。 図８ＡはＥＧＦＲを発現するがん細胞株であるＯＥ２１に対するＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を評価した結果を表す。縦軸は、陰性対照に対する生細胞中ＡＴＰ量の相対値で示した、細胞の生存率を表す。 図８ＢはＥＧＦＲを発現するがん細胞株であるＴ．Ｔｎに対するＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を評価した結果を表す。縦軸は、陰性対照に対する生細胞中ＡＴＰ量の相対値で示した、細胞の生存率を表す。 図８ＣはＥＧＦＲを発現するがん細胞株であるＵ－９３７に対するＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を評価した結果を表す。縦軸は、陰性対照に対する生細胞中ＡＴＰ量の相対値で示した、細胞の生存率を表す。 図９はＨｅｐＧ２細胞に対するＧＰＣ３―ＴｆＲバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を評価した結果を表す。縦軸は陰性対照に対する生細胞中ＡＴＰ量の相対値で示した、細胞の生存率を表す。 図１０ＡはＧＰＣ３を発現する肝がん細胞株であるＨｅｐＧ２に対するＧＰＣ３－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を評価した結果を表す。縦軸は、陰性対照に対する生細胞中ＡＴＰ量の相対値で示した、細胞の生存率を表す。 図１０ＢはＧＰＣ３を発現する肝がん細胞株であるＨｕＨ－７に対するＧＰＣ３－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を評価した結果を表す。縦軸は、陰性対照に対する生細胞中ＡＴＰ量の相対値で示した、細胞の生存率を表す。 図１０ＣはＧＰＣ３を発現する肝がん細胞株であるＨＬＥに対するＧＰＣ３－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を評価した結果を表す。縦軸は、陰性対照に対する生細胞中ＡＴＰ量の相対値で示した、細胞の生存率を表す。 図１１（Ａ）～（Ｅ）はＯＥ２１細胞上のＴｆＲとＴｆの結合に対する各抗体またはバイスペシフィック抗体の阻害活性を評価した結果を表す。縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度を表す。細い実線は陰性対照添加後に蛍光標識したトランスフェリンを添加したときの結合活性、太い実線は抗体またはバイスペシフィック抗体添加後に蛍光標識したトランスフェリンを添加したときの結合活性、灰色で塗りつぶしたヒストグラムは蛍光標識したトランスフェリンを添加していない陰性対照を表す。 図１２は、ＯＥ２１細胞にＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体を添加した際のＥＧＦＲ下流シグナルおよびＴｆＲ発現量に対する影響を、ウェスタンブロッティングにより評価した結果を表す。それぞれのバンドは、図の上部に記載の濃度で各バイスペシフィック抗体または抗体を添加したときの、図の右に記載の各タンパク質の発現量を表す。ｐＥＧＦＲはリン酸化されたＥＧＦＲタンパク質、ＡＫＴはＥＧＦＲの下流シグナルのタンパク質、ｐＡＫＴはリン酸化されたＡＫＴタンパク質、ＴＦＲＣはＴｆＲタンパク質、ＡＣＴＢはβ－アクチンを示す。 図１３（Ａ）～（Ｄ）はＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体をＯＥ２１細胞に添加したときの細胞表面上のＴｆＲ発現量をフローサイトメーターで評価した結果を表す。縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度を表す。細い実線は陰性対照を添加して２４時間培養後に蛍光標識したトランスフェリンを添加したときの結合活性、太い実線は、抗体またはバイスペシフィック抗体を添加して２４時間培養後に蛍光標識したトランスフェリンを添加したときの結合活性、灰色で塗りつぶしたヒストグラムは、蛍光標識したトランスフェリンを添加していない陰性対照を表す。 図１４はＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体をＯＥ２１細胞に添加したときの増殖阻害活性が鉄枯渇によるものか評価した結果を表す。縦軸は、ＰＢＳを添加し、ＦＡＳを添加しない条件の陰性対照に対する生細胞中ＡＴＰ量の相対値で示した、細胞の生存率を表す。黒色の棒グラフは抗体またはバイスペシフィック抗体のみを添加したとき、斜線の棒グラフが抗体またはバイスペシフィック抗体と共にＦＡＳを添加したときの生存率を表す。 図１５はＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体をＯＥ２１細胞に添加したときの増殖阻害活性を評価した結果を表す。縦軸は、細胞がウェルに占める割合（％）を表す。黒色の棒グラフが抗体またはバイスペシフィック抗体存在下で７日間培養したとき、斜線の棒グラフが抗体またはバイスペシフィック抗体存在下で７日間培養し、培地交換により抗体を除いてさらに７日間培養したときの細胞がウェルに占める割合（％）を表す。 図１６はＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体をＧＥＭＭに添加したときの増殖阻害活性を評価した結果を示す。縦軸はＰＢＳを添加したときの生細胞中ＡＴＰ量を１００％としたときの生存率を表す。 図１７ＡはＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を評価した結果を示す。 図１７ＢはＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を評価した結果を示す。 図１８（Ａ）は実施例６で作製したＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の構造を示す模式図である。図１８（Ｂ）は実施例２３で作製したヘテロ二量体抗体の構造を示す模式図である。 図１９ＡはＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を評価した結果を示す。 図１９ＢはＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を評価した結果を示す。 図２０は、がん細胞株に対する増殖阻害活性を指標として、ＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を評価した結果を示す。 図２１はＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を評価した結果を示す。
　本発明は、ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分のＮ末端側に、細胞表面抗原への抗原結合部位を有するポリペプチド（Ｎ末端側ポリペプチドとも言う）が直接またはリンカーを介して結合する、ＴｆＲおよび細胞表面抗原に結合するバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片（以下、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片と記載する）に関する。
　本発明におけるＴｆＲは、ＣＤ７１、ＴＦＲ１、ＴＲ、Ｔ９、ｐ９０、ＩＭＤ４６と同義として使用される。ＴｆＲとしては例えば、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）においてＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００３２２５または配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むヒトＴｆＲ、および配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むサルＴｆＲなどが挙げられる。また、例えば、配列番号６、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００３２２５または配列番号８に示されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴｆＲの機能を有するポリペプチドが挙げられる。
　配列番号６、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００３２２５　または配列番号８に示されるアミノ酸配列と通常７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％および９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＴｆＲの機能を有するポリペプチドも本発明のＴｆＲに包含される。
　配列番号６、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００３２２５または配列番号８に示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、部位特異的変異導入法［Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons （1987-1997）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 （1982）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 （1982）、Gene, 34, 315 （1985）、Nucleic Acids Research, 13, 4431（1985）、Proceeding of the National Academy of Sciences in USA, 82, 488 （1985）］などを用いて、例えば、配列番号６、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００３２２５または配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡに、部位特異的変異を導入することにより得ることができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個～数十個、例えば、１～２０個、より好ましくは１個～数個、例えば、１～５個のアミノ酸である。
　ＴｆＲをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号５またはＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００３２３４に示されるヒトＴｆＲの塩基配列、および配列番号７に示されるサルＴｆＲの塩基配列などが挙げられる。また、例えば配列番号５、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００３２３４または配列番号７に示される塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつＴｆＲの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、配列番号５、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００３２３４または配列番号７に示される塩基配列と好ましくは６０％以上の相同性を有する塩基配列、より好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＴｆＲの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、並びに配列番号５、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００３２３４または配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつＴｆＲの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども、本発明のＴｆＲをコードする遺伝子に包含される。　
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば配列番号５またはＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００３２３４に示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、またはＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。具体的には、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のＤＮＡ、または該配列を有するＰＣＲ産物若しくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルターまたはスライドガラスを用いて、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃にてハイブリダイゼーション［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons （1987-1997）、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University （1995）］を行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターまたはスライドガラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば、配列番号５またはＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００３２３４に示される塩基配列と好ましくは６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、より好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
　真核生物のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子内に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明のＴｆＲをコードする遺伝子に包含される。
　本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Nucleic Acids Research,25, 3389（1997）、Genome Research, 7, 649 （1997）、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。　
　デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｏｐｅｎ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、－Ｅ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｅｘｔｅｎｄ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、－ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｓｍａｔｃｈ）が－３、－ｒ（ｒｅｗａｒｄ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍａｔｃｈ）が１、－ｅ（ｅｘｐｅｃｔ　ｖａｌｕｅ）が１０、－Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、－ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ　ｂｌａｓｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎ　の場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、－Ｘ（Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）が１５および－Ｚ（ｆｉｎａｌ　Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html）。　
　ＴｆＲのアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号６、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００３２２５または配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。また、上記の方法で作製されるポリペプチドまたはＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、例えば、配列番号６、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００３２２５または配列番号８に示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。さらに、ＴｆＲのアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド、またはＴｆＲのアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法、ｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
　本発明におけるＴｆＲの細胞外領域としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００３２２５に示されるヒトＴｆＲのアミノ酸配列を公知の膜貫通領域予測プログラムＳＯＳＵＩ（http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html）、ＴＭＨＭＭ　ｖｅｒ．２（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）またはＥｘＰＡＳｙ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　Ｓｅｒｖｅｒ（http://Ca.expasy.org/）などを用いて予測された領域などが挙げられる。具体的には、配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００３２２５の８９番目～７６０番目に示されるアミノ酸配列が挙げられる。
　ＴｆＲの機能としては、細胞の生存、増殖に必須な鉄の取り込みが挙げられる。鉄とトランスフェリンの複合体がＴｆＲに結合すると、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。エンドソーム内のｐＨが低下すると鉄がトランスフェリンから遊離し、ＤＭＴ１を介して細胞質内に移行して、細胞増殖やエネルギー産生に利用される。鉄が遊離したトランスフェリンとＴｆＲの複合体は通常分解されず、細胞表面まで再び移動することが知られている（文献：Yamashiro DJ et al., Cell 37 789-800, 1984）。
　ＴｆＲを発現する細胞は例えば、骨髄、胎盤細胞を始めとする多くの正常組織の細胞や、大腸がん、頭頸部がん、脳腫瘍、造血器腫瘍、肝臓がん、食道がんを始めとする多くの種類のがん細胞や、ＨＴ２９、ＨＳＣ－２、ＲＡＭＯＳ、Ｋ５６２、ＨｅｐＧ２、ＯＥ２１、Ｔ．Ｔｎ、Ｕ－９３７、ＨｕＨ－７、ＨＬＥなど多くのがん細胞株が挙げられる。
　本発明の細胞表面抗原は、がん細胞などの細胞膜上に発現するタンパク質やペプチド鎖等の抗原のうち、ＴｆＲ以外のものをいう。本発明の細胞表面抗原としては、抗体などのタンパク質またはポリペプチドが結合できればどのようなものでもよいが、抗体などのタンパク質またはポリペプチドの結合により内在化および／または分解される細胞表面抗原が好ましい。また本発明の細胞表面抗原として、がん細胞や特定の疾患に関与する細胞集団において高発現しているタンパク質が好ましい。このような細胞表面抗原の好ましい例として、ＥＧＦＲ、ＧＰＣ３などが挙げられる。
　本発明におけるＥＧＦＲは、ＥＲＢＢ、ＥＲＢＢ１、ＨＥＲ１、ＰＩＧ６１、ＭＥＮＡ、ＮＩＳＢＤ２、ＳＡ７、ｃ－Ｅｒｂ－１と同義として用いられる。
　ＥＧＦＲとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ００５２１９若しくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むヒトＥＧＦＲ；ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＸＰ＿００５５４９６１６．１に示されるアミノ酸配列を含むサルＥＧＦＲが挙げられる。また、例えば、配列番号１４、ＮＰ００５２１９またはＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＸＰ＿００５５４９６１６．１に示されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥＧＦＲの機能を有するポリペプチドが挙げられる。
　配列番号１４、ＮＰ００５２１９またはＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＸＰ＿００５５４９６１６．１に示されるアミノ酸配列と好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％および９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＥＧＦＲの機能を有するポリペプチドも本発明のＥＧＦＲに包含される。
　配列番号１４、ＮＰ００５２１９またはＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＸＰ＿００５５４９６１６．１に示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、前述の部位特異的変異導入法などを用いて、例えば配列番号１４、ＮＰ００５２１９またはＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＸＰ＿００５５４９６１６．１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡに、部位特異的変異を導入することにより得ることができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個～数十個、例えば、１～２０個、より好ましくは１個～数個、例えば、１～５個のアミノ酸である。
　本発明におけるＥＧＦＲをコードする遺伝子としては、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００５２２８または配列番号１３に示される塩基配列を含むヒトＥＧＦＲの遺伝子が挙げられる。
　また、例えば、配列番号１３、Ｇｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００５２２８に示される塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつＥＧＦＲの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、配列番号１３またはＧｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００５２２８に示される塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＥＧＦＲの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、及び配列番号１３またはＧｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００５２２８に示される塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつＥＧＦＲの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども、本発明のＥＧＦＲをコードする遺伝子に含まれる。
　本発明におけるＥＧＦＲの細胞外領域としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ００５２１９に示されるヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列を公知の膜貫通領域予測プログラムＳＯＳＵＩ（http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html）、ＴＭＨＭＭ　ｖｅｒ．２（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）またはＥｘＰＡＳｙ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　Ｓｅｒｖｅｒ（http://Ca.expasy.org/）などを用いて予測された領域などが挙げられる。具体的には、配列番号１０またはＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ００５２１９の２５番目～６４５番目に示されるアミノ酸配列が挙げられる。
　ＥＧＦＲの機能としては、例えばＥＧＦとの受容体としての機能、ＥＧＦの結合後に二量体を形成し、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫ経路、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ経路などのシグナルを介して、細胞増殖、生存、浸潤、遊走などを促進することが挙げられる。細胞膜上のＥＧＦＲは、ＥＧＦが結合することにより内在化し、エンドサイトーシスによりリソソームへ移行して分解されることが知られている（Ebner R et al., Cell Regul. 2 599-612, 1991）。
　ＥＧＦＲを発現する細胞は例えば、皮膚、大腸、肺を始めとする正常組織の上皮細胞や、大腸がん、頭頸部がん、肺がん、食道がんを始めとする上皮がん細胞や、ＨＴ２９、ＨＳＣ－２、ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＯＥ２１、Ｔ．Ｔｎ、Ａ４３１などのがん細胞株が挙げられる。
　本発明におけるＧＰＣ３は、ＤＧＳＸ、ＧＴＲ２－２、ＭＸＲ７、ＯＣＩ－５、ＳＤＹＳ、ＳＧＢ、ＳＧＢＳ、ＳＧＢＳ１と同義として用いられる。
　ＧＰＣ３の機能としては、例えばＷｎｔ経路やＦｒｉｚｚｌｅｄ経路に関連するタンパク質と結合して、例えば肝臓がんなどの癌細胞の細胞分裂や増殖に関与することが挙げられる。
　ＧＰＣ３としては、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｐ５１６５４に示されるアミノ酸配列を含むヒトＧＰＣ３が挙げられる。
　本発明におけるＧＰＣ３の細胞外領域としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｐ５１６５４に示されるヒトＧＰＣ３のアミノ酸配列を公知の膜貫通領域予測プログラムＳＯＳＵＩ（http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html）、ＴＭＨＭＭ　ｖｅｒ．２（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）またはＥｘＰＡＳｙ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　Ｓｅｒｖｅｒ（http://Ca.expasy.org/）などを用いて予測された領域などが挙げられる。具体的には、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｐ５１６５４の１番目～５５９番目に示されるアミノ酸配列が挙げられる。
　ＧＰＣ３を発現する細胞は例えば、胎児期の肝臓の細胞や、肝臓がんなどのがん細胞、ＨｅｐＧ２やＨｕＨ－７などのがん細胞株などが挙げられる。
　抗体とは、イムノグロブリンを構成する重鎖の可変領域および重鎖の定常領域、並びに軽鎖の可変領域および軽鎖の定常領域の全部または一部をコードする遺伝子（「抗体遺伝子」と称する）に由来するタンパク質である。本発明の抗体は、いずれのイムノグロブリンクラスおよびサブクラスを有する抗体または抗体断片をも包含する。
　重鎖（Ｈ鎖）とは、イムノグロブリン分子を構成する２種類のポリペプチドのうち、分子量が大きい方のポリペプチドを指す。重鎖は抗体のクラスとサブクラスを決定する。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭは、それぞれα鎖、δ鎖、ε鎖、γ鎖およびμ鎖を重鎖として有し、重鎖の定常領域は異なるアミノ酸配列で特徴付けられる。軽鎖（Ｌ鎖）とは、イムノグロブリン分子を構成する２種類のポリペプチドのうち、分子量が小さい方のポリペプチドを指す。ヒトの抗体の場合、軽鎖にはκ鎖とλ鎖の２種類が存在する。
　可変領域（Ｖ領域）とは、通常は、イムノグロブリンのＮ末端側のアミノ酸配列内に存在する多様性に富んだ領域を指す。可変領域以外の部分は多様性の少ない構造をとることから、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。重鎖と軽鎖の各可変領域は会合して抗原結合部位を形成し、抗原への抗体の結合特性を決定する。
　ヒトの抗体の重鎖では、可変領域はＫａｂａｔらのＥＵインデックス（Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 1991 Fifth edition）における１番目から１１７番目までのアミノ酸配列に該当し、定常領域は１１８番目以降のアミノ酸配列に該当する。ヒトの抗体の軽鎖ではＫａｂａｔらによる番号付け（Ｋａｂａｔ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）における１番目から１０７番目までのアミノ酸配列が可変領域に該当し、１０８番目以降のアミノ酸配列が定常領域に該当する。以下、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を、ＶＨまたはＶＬと略記する。
　抗原結合部位は、抗体において抗原を認識し結合する部位であり、抗原決定基（エピトープ）と相補的な立体構造を形成する部位を指す。抗原結合部位は、抗原決定基との間に強い分子間相互作用を生じる。抗原結合部位は、少なくとも３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＶＨおよびＶＬにより構成される。ヒトの抗体の場合、ＶＨおよびＶＬはそれぞれ３つのＣＤＲを有する。これらのＣＤＲを、それぞれＮ末端側から順番にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称する。
　定常領域のうち、重鎖定常領域または軽鎖定常領域は、それぞれＣＨまたはＣＬと表記される。ＣＨは、重鎖のサブクラスであるα鎖、δ鎖、ε鎖、γ鎖およびμ鎖によって分類される。ＣＨは、Ｎ末端側より順に整列したＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインから構成され、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを併せてＦｃ領域という。一方、ＣＬは、Ｃλ鎖およびＣκ鎖とよばれる２つのサブクラスに分類される。
　モノクローナル抗体は、単一性（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｉｔｙ）を保持した抗体産生細胞が分泌する抗体であり、単一のエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識する。モノクローナル抗体分子同士は同一のアミノ酸配列（１次構造）を有し、単一の構造をとる。ポリクローナル抗体とは、異なるクローンの抗体産生細胞が分泌する抗体分子の集団をいう。オリゴクローナル抗体とは、複数の異なるモノクローナル抗体を混合した抗体分子の集団をいう。
　エピトープは、抗体が認識し、結合する抗原の構造部位をいう。エピトープとしては、例えば、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、糖鎖が結合したアミノ酸配列および糖鎖が結合したアミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。
　本発明におけるモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより産生される抗体、および抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により産生される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。
　ハイブリドーマは、例えば、抗原を調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性を有する抗体産生細胞を取得し、さらに、該抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させることによって、調製することができる。該ハイブリドーマを培養するか、または該ハイブリドーマを動物に投与して該ハイブリドーマを腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより、所望のモノクローナル抗体を取得することができる。抗原を免疫する動物としては、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができるが、マウス、ラット、ハムスターおよびラビットなどが好適に用いられる。また、このような被免疫動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞にｉｎ　ｖｉｔｒｏで免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマを作製することもできる。
　本発明における遺伝子組換え抗体としては、例えば、組換えマウス抗体、組換えラット抗体、組換えハムスター抗体、組換えラビット抗体、ヒト型キメラ抗体（キメラ抗体ともいう）、ヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体ともいう）およびヒト抗体などの、遺伝子組換え技術により製造される抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体においては、対象とする動物種や目的に応じて、どの動物種由来の重鎖および軽鎖の可変領域並びに定常領域を適用するかを決定することができる。例えば、対象とする動物種がヒトの場合には、可変領域をヒトまたはマウスなどの非ヒト動物由来とし、定常領域およびリンカーをヒト由来とすることができる。
　キメラ抗体とは、ヒト以外の動物（非ヒト動物）の抗体のＶＨおよびＶＬと、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬとからなる抗体を指す。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスターおよびラビットなど、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産する非ヒト動物由来のハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してキメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることによって、製造することができる。
　ヒト化抗体とは、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト抗体のＶＨおよびＶＬの対応するＣＤＲに移植した抗体を指す。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ以外の領域はフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）と称される。ヒト化抗体は、非ヒト動物抗体のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡと、非ヒト動物抗体のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して発現させることによって、製造することができる。
　ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
　ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球にＥＢウイルスなどを感染させて不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養し、該培養上清より該抗体を精製することにより取得することができる。
　ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することにより、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として、所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へ変換することができる。
　ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組み込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、個体を発生させることにより、ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物由来のヒト抗体は、通常の非ヒト動物で行われているハイブリドーマ作製法を用いてハイブリドーマを取得し、培養することで、培養上清中に抗体を産生、蓄積させることにより調製できる。
　遺伝子組換え抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリンに属すればいかなるものでもよいが、ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｇ（ｈＩｇＧ）クラスのものが好ましい。さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３およびｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、遺伝子組換え抗体のＣＬとしては、ヒトイムノグロブリンに属すればいずれのものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
　本発明において、バイスペシフィック抗体とは、異なる２種類のエピトープそれぞれに特異的に結合するポリペプチドまたはタンパク質をいう。バイスペシフィック抗体のそれぞれの抗原結合部位は、単一の抗原の異なるエピトープに結合してもよいし、異なる抗原に結合してもよい。
　本発明において、ポリペプチド、抗体もしくは該抗体断片またはバイスペシフィック抗体もしくは該バイスペシフィック抗体断片がＥＧＦＲまたはＧＰＣ３などの細胞表面抗原およびＴｆＲのいずれか１つに結合することは、例えば、公知の免疫学的検出法、好ましくは蛍光細胞染色法等を用いて、評価したい細胞表面抗原またはＴｆＲを発現した細胞と抗体との結合性を確認する方法により確認することができる。また、公知の免疫学的検出法［Monoclonal Antibodies - Principles and Practice, Third Edition, Academic Press（1996）、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（1987）］などを組み合わせて用いることもできる。
　本発明において、ＥＧＦＲもしくはＧＰＣ３などの細胞表面抗原またはＴｆＲに結合する抗原結合部位は、ＥＧＦＲもしくはＧＰＣ３などの細胞表面抗原またはＴｆＲをそれぞれ特異的に認識し、結合するものであればいかなるものでもよい。例えば、抗体、リガンド、受容体、および天然に存在する相互作用分子など遺伝子組換え技術によって作製可能なポリペプチド、タンパク質分子およびその断片、並びに該タンパク質分子の低分子または天然物とのコンジュゲート体などいずれの形態であってもよい。
　また、抗原結合部位としては、抗体、リガンドおよび受容体など既知の結合分子の結合ドメインを利用して組換えた結合タンパク質でもよく、具体的には各抗原に結合する抗体のＣＤＲを含む組換えタンパク質、ＣＤＲを含む抗体可変領域、抗体可変領域および各抗原に結合するリガンドの結合ドメインを含む組換えタンパク質などが挙げられる。なかでも、本発明においては、抗原結合部位は抗体の可変領域であることが好ましい。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片としては、例えばＴｆＲの内在化および／または分解活性を有するバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が挙げられる。本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片としては、ＥＧＦＲまたはＧＰＣ３などの細胞表面抗原を発現していない細胞にはＴｆＲの内在化および／または分解活性を示さず、ＥＧＦＲまたはＧＰＣ３などの細胞表面抗原を発現した細胞にのみＴｆＲの内在化および／または分解活性を示すバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が好ましい。このようなバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片は、ＥＧＦＲまたはＧＰＣ３などの細胞表面抗原を発現する、がん細胞などの病因細胞に選択的にＴｆＲの内在化および／または分解活性を示すため、非特異的なＴｆＲの内在化および／または分解に伴う副作用を生じない点で好ましい。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が有するＴｆＲの内在化および／または分解活性は、細胞上のＥＧＦＲまたはＧＰＣ３などの細胞表面抗原およびＴｆＲの両方にバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が結合することにより、ＴｆＲを細胞表面抗原の内在化および／または分解経路に引き込み、内在化および／または分解を誘導する活性などをいう。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片は、同一細胞上に発現しているＥＧＦＲまたはＧＰＣ３などの細胞表面抗原およびＴｆＲに結合してもよいし、異なる細胞上に発現しているＥＧＦＲまたはＧＰＣ３などの細胞表面抗原およびＴｆＲに結合してもよいが、同一細胞上に発現しているＥＧＦＲまたはＧＰＣ３などの細胞表面抗原およびＴｆＲに結合するものが好ましい。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片としては、ＴｆＲの内在化および／または分解を誘導することにより、標的とするＥＧＦＲまたはＧＰＣ３などの細胞表面抗原を発現している細胞の細胞死を誘導するものが好ましい。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片が有するＴｆＲの内在化および／または分解活性は、例えばＯＥ２１、Ｔ．Ｔｎ、ＴＥ－８、Ｕ－９３７、ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ－７およびＨＬＥなどのＴｆＲを発現する細胞の細胞表面および細胞内のＴｆＲタンパク量、生存細胞数、細胞の増殖率、細胞の生存率または細胞の鉄の取込みなどを評価することにより確認することができる。
　すなわち、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片として、具体的には、ＥＧＦＲまたはＧＰＣ３等の細胞表面抗原およびＴｆＲの両方に結合したときに、ＴｆＲの分解を誘導するバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片などが挙げられる。
　一分子のバイスペシフィック抗体が有する、ある抗原に対する結合ドメインの数を、結合の価数と呼ぶ。例えば、本発明において、一分子のバイスペシフィック抗体が、ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位およびＴｆＲに結合する抗原結合部位を二つずつ有する場合、かかるバイスペシフィック抗体は、ＥＧＦＲおよびＴｆＲに、それぞれ二価で結合する。
　また、イムノグロブリンドメインまたはその断片を含むリンカーなど、適切なリンカーを介して結合させた複数の抗原結合部位を含む抗体も本発明のバイスペシフィック抗体に含まれる。
　本発明のバイスペシフィック抗体は、既存の作製技術（［Nature Protocols, 9, 2450-2463 (2014)］、国際公開第１９９８／０５０４３１号、国際公開第２００１／７７３４号、国際公開第２００２／００２７７３号および国際公開第２００９／１３１２３９号）などにより作製することができる。
　本発明のバイスペシフィック抗体は、ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の重鎖Ｎ末端に、直接またはリンカーを介して、細胞表面抗原に対する結合能を有するポリペプチド（Ｎ末端側ポリペプチドとも言う）が結合している構造を有している。
　本発明において、イムノグロブリンドメインとは、イムノグロブリンに類似したアミノ酸配列を持ち、少なくとも２個のシステイン残基が存在する約１００個のアミノ酸残基からなるペプチドを最小単位とする。本発明において、イムノグロブリンドメインは、上記の最小単位のイムノグロブリンドメインを複数含むポリペプチドをも包含する。イムノグロブリンドメインとしては、例えば、イムノグロブリン重鎖のＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、並びにイムノグロブリン軽鎖のＶＬおよびＣＬなどが挙げられる。
　イムノグロブリンの動物種は特に限定されないが、ヒトであることが好ましい。また、イムノグロブリン重鎖の定常領域のサブクラスは、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２およびＩｇＥのいずれでもよく、好ましくは、ＩｇＧ由来およびＩｇＭ由来が挙げられる。また、イムノグロブリン軽鎖の定常領域のサブクラスは、κおよびλのいずれでもよい。
　また、イムノグロブリンドメインはイムノグロブリン以外のタンパク質にも存在し、例えば主要組織適合抗原（ＭＨＣ）、ＣＤ１、Ｂ７およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などのイムノグロブリンスーパーファミリーに属するタンパク質が含むイムノグロブリンドメインが挙げられる。本発明のバイスペシフィック抗体に用いるイムノグロブリンドメインとしては、いずれのイムノグロブリンドメインも適用することができる。
　ヒトのＩｇＧの場合、ＣＨ１は、ＥＵインデックスで示される１１８番目から２１５番目のアミノ酸配列を有する領域を指す。同様に、ＣＨ２はＫａｂａｔらのＥＵインデックスで示される２３１番目から３４０番目のアミノ酸配列を有する領域を、ＣＨ３はＫａｂａｔらのＥＵインデックスで示される３４１番目から４４７番目のアミノ酸配列を有する領域を各々指す。ＣＨ１とＣＨ２の間には、ヒンジ（蝶番）領域（以下ヒンジと記載することもある）と呼ばれる柔軟性に富んだアミノ酸領域が存在する。ヒンジ領域は、ＫａｂａｔらのＥＵインデックスで示される２１６番目から２３０番目のアミノ酸配列を有する領域を指す。
　ＣＬは、ヒトの抗体のκ鎖の場合には、Ｋａｂａｔ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇで示される１０８番目から２１４番目のアミノ酸配列を有する領域を、λ鎖の場合には、１０８番目から２１５番目のアミノ酸配列を有する領域を各々指す。
　本発明のＩｇＧ型抗体とは、ＩｇＧ部分とも言い、本発明のバイスペシフィック抗体を構成するＩｇＧまたはＦｃ部分を改変したＩｇＧの部分構造を指し、１本の軽鎖および１本の重鎖からなるヘテロダイマーが２つ会合してなるヘテロテトラマー構造を有する。本発明のＴｆＲに結合するＩｇＧ部分とは、ＴｆＲを認識するＩｇＧ部分、すなわちＴｆＲの細胞外領域を特異的に認識し、かつ結合する機能を有するＩｇＧ部分をいう。
　前記ＩｇＧの重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のどのサブクラスでもよい。また、それらのアミノ酸配列の一部を欠失、付加、置換、および／または挿入してもよい。また、ＩｇＧの重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３からなるアミノ酸配列の、全部または一部の断片を適宜組み合わせて用いることができる。また、それらのアミノ酸配列を部分的に欠損、または順番を入れ替えて使用することもできる。また、ＩｇＧ部分に使用するＩｇＧのサブクラスは特に限定されないが、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４の重鎖定常領域の２２８番目のＳｅｒ残基をＰｒｏに、２３５番目のＬｅｕ残基をＡｓｎにそれぞれ置換したＩｇＧ４変異体（以下、ＩｇＧ４ＰＥと記載する）、またはＩｇＧ４の重鎖定常領域の２２８番目のＳｅｒ残基をＰｒｏに、２３５番目のＬｅｕ残基をＡｓｎに、および４０９番目のＡｒｇ残基をＬｙｓにそれぞれ置換したＩｇＧ４変異体（以下、ＩｇＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋと記載する）であることが好ましい。
　例えば、重鎖の定常領域（Ｎ末端側から順にＣＨ１―ヒンジ―ＣＨ２―ＣＨ３）が、配列番号８６で表されるアミノ酸配列を含むＩｇＧ４ＰＥからなるＩｇＧ部分や、配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含むＩｇＧ４ＰＥ　Ｒ４０９ＫからなるＩｇＧ部分が好ましい。
　本発明のＩｇＧ部分に含まれる２つの可変領域は、同一の抗原を認識することが好ましい。また、同一の構造およびアミノ酸配列を有していることが好ましい。
　本発明において、細胞表面抗原に結合するＮ末端側ポリペプチドとは、本発明のバイスペシフィック抗体を構成する部分構造であり、ＩｇＧ部分の重鎖または軽鎖のＮ末端側に存在し、各細胞表面抗原の細胞外領域を特異的に認識し、かつ結合するポリペプチドをいう。
　本発明のバイスペシフィック抗体は、Ｎ末端側ポリペプチドを、ＩｇＧ部分を構成する２つのヘテロダイマー両方の重鎖または軽鎖のＮ末端に１つずつ有していてもよいし、一方のヘテロダイマーのＮ末端にのみ１つ有していても良いが、両方の重鎖または軽鎖のＮ末端に１つずつ有していることが好ましい。両方の重鎖または軽鎖のＮ末端に１つずつＮ末端側ポリペプチドを有している場合、それらは同一であっても異なっていてもよいが、同一のＮ末端側ポリペプチドであることが好ましい。
　本発明のＮ末端側ポリペプチドは、細胞表面抗原に対する抗原結合能を有していれば、単鎖であっても複数のポリペプチド鎖からなる多量体であってもよい。Ｎ末端側ポリペプチドとしては、例えば細胞表面抗原に対する抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびＶＨＨが挙げられるが、ＦａｂまたはＶＨＨであることが好ましい。　また、細胞表面抗原に対するリガンド分子やレセプター分子も同様に用いることができる。
　細胞表面抗原に対する抗体とは、それぞれ、各細胞表面抗原の細胞外領域を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体をいう。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体および抗ＧＰＣ３抗体とは、それぞれＥＧＦＲおよびＧＰＣ３の細胞外領域を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体をいう。
　本発明においてリンカーとは、ＩｇＧ部分とＮ末端側ポリペプチドを結合させる分子構造であればどのようなものでもよいが、ペプチド鎖が好ましい。ペプチド鎖のアミノ酸配列としては、例えば、ＥＳ、ＥＳＫＹＧ、ＥＳＫＹＧＰＰ、ＧＧＧＧＳ、もしくはＧＧＧＧＳの繰返し配列からなるもの、または、抗体のヒンジ領域およびＣＨ１ドメインなどの定常領域の一部もしくは全部の配列からなるものなどが挙げられる。
　本発明のバイスペシフィック抗体が、Ｎ末端側ポリペプチドとして細胞表面抗原に対する抗体のＦａｂを有する場合、該Ｆａｂに含まれる軽鎖とＩｇＧ部分の軽鎖は同一であっても異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。また、軽鎖はλ鎖とκ鎖のいずれでもよいが、κ鎖であることが好ましい。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該抗体断片を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸残基が欠失、付加、置換または挿入され、かつ上述の抗体またはその抗体断片と同様な活性を有する抗体またはその抗体断片も、本発明のバイスペシフィック抗体またはその抗体断片に包含される。
　欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、Molecular Cloning, The Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons（1987-1997）、Nucleic Acids Research, 10, 6487（1982）、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409（1982）、Gene, 34, 315 （1985）、Nucleic Acids Research, 13, 4431（1985）、Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488（1985）などに記載の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換、挿入若しくは付加できる程度の数である。例えば、通常１～数十個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個である。
　上記の本発明のバイスペシフィック抗体のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、次のことを示す。同一配列中の任意、かつ１若しくは複数のアミノ酸配列中において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味する。また、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じる場合もあり、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。
　天然型アミノ酸残基としては、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリンおよびＬ－システインなどが挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
　Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
　Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
　Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
　Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
　Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
　Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
　Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　本発明のバイスペシフィック抗体または該抗体断片は、翻訳後修飾されたいかなるアミノ酸残基を含む抗体をも包含する。翻訳後修飾としては、例えば、Ｈ鎖のＣ末端におけるリジン残基の欠失［リジン・クリッピング（ｌｙｓｉｎｅ　ｃｌｉｐｐｉｎｇ）］およびポリペプチドのＮ末端におけるグルタミン残基のピログルタミン（ｐｙｒｏＧｌｕ）への置換などが挙げられる［Beck et al, Analytical Chemistry, 85, 715-736(2013)］。
　本発明のバイスペシフィック抗体として具体的には、例えば下記（１）～（４）からなる群より選ばれる、いずれか一つのバイスペシフィック抗体などが挙げられる。
（１）細胞表面抗原に対する抗体の可変領域を含むＦａｂおよびＴｆＲに結合するＩｇＧ部分を含むバイスペシフィック抗体であって、該ＦａｂがＩｇＧ部分の重鎖のＮ末端に直接結合するバイスペシフィック抗体、
（２）細胞表面抗原に対する抗体のＶＨのＣＤＲ１～３を含むＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１～３を含むＶＬを含むＦａｂならびにＴｆＲに結合するＩｇＧ部分を含むバイスペシフィック抗体であって、該ＦａｂがＩｇＧ部分の重鎖のＮ末端に直接結合するバイスペシフィック抗体、
（３）細胞表面抗原への抗体のＶＨおよびＶＬを含むＦａｂならびにＴｆＲに結合するＩｇＧ部分を含むバイスペシフィック抗体であって、該ＦａｂがＩｇＧ部分の重鎖のＮ末端に直接結合するバイスペシフィック抗体、ならびに
（４）細胞表面抗原に結合するＶＨＨおよびＴｆＲに結合するＩｇＧ部分を含むバイスペシフィック抗体であって、該ＶＨＨがＩｇＧ部分の重鎖のＮ末端に直接結合するバイスペシフィック抗体。
　上記（１）～（３）に記載のバイスペシフィック抗体は、ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分のＶＬとＦａｂのＶＬとが同一であってもよいし、異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。
　本発明のＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の一例として、それぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびに以下の１）～３）に示すＣＤＲ１～３を含むＶＨを含むＴｆＲに結合するＩｇＧ部分が挙げられる。
１）配列番号３２で表されるアミノ酸配列もしくは配列番号３２で表されるアミノ酸配列から、２番目のチロシンのアラニンもしくはフェニルアラニンへの置換および３番目のスレオニンのアラニンもしくはグリシンへの置換から選ばれる少なくとも１つの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ１。
２）配列番号３３で表されるアミノ酸配列もしくは配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、１番目のバリンのアラニンへの置換、２番目のイソロイシンのアラニンもしくはロイシンへの置換、７番目のバリンのグルタミン酸への置換、１０番目のアスパラギン酸のアラニンへの置換および１３番目のアスパラギン酸のプロリンへの置換から選ばれる少なくとも一つの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２。
３）配列番号３４で表されるアミノ酸配列もしくは配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、３番目のグルタミンのアラニンもしくはアスパラギン酸への置換、４番目のプロリンの任意の天然アミノ酸への置換、５番目のトリプトファンのアラニン、フェニルアラニン、ヒスチジンもしくはチロシンへの置換、７番目のチロシンのアラニンもしくはフェニルアラニンへの置換および１３番目のバリンのロイシンへの置換から選ばれる少なくとも１つの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３。４番目のプロリンの任意の天然アミノ酸への置換としては、例えば、アラニン、チロシン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、スレオニン、アルギニン、グリシン、リジン、メチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニンもしくはヒスチジンへの置換が挙げられる。
　本発明のＴｆＲに結合するＩｇＧ部分は、それぞれ配列番号３２、３３および３４で示されるＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号１７～１９で示されるＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列と、それぞれ少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相同である、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含むＴｆＲに結合するＩｇＧ部分をも包含する。
　本発明のＴｆＲに結合するＩｇＧ部分は、下記（ａｉ）または（ａｉｉ）に記載される抗体をも包含する。
（ａｉ）それぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびにそれぞれ配列番号３２、３３および３４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨを含む抗ＴｆＲ抗体と、競合してＴｆＲに結合するＴｆＲに結合するＩｇＧ部分。
（ａｉｉ）それぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびにそれぞれ配列番号３２、３３および３４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨを含む抗ＴｆＲ抗体と同じエピトープに結合するＴｆＲに結合するＩｇＧ部分。
　本発明のＴｆＲに結合するＩｇＧ部分は、下記（ｂｉ）または（ｂｉｉ）に記載される抗体をも包含する。
（ｂｉ）それぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびにそれぞれ配列番号４２、４３および４４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨを含む抗ＴｆＲ抗体と、競合してＴｆＲに結合するＩｇＧ部分。
（ｂｉｉ）それぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびにそれぞれ配列番号４２、４３および４４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨを含む抗ＴｆＲ抗体と同じエピトープに結合する、ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分。
　本発明のＴｆＲに結合するＩｇＧ部分は、下記（ｃｉ）または（ｃｉｉ）に記載される抗体をも包含する。
（ｃｉ）それぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびにそれぞれ配列番号４７、４８および４９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨを含む抗ＴｆＲ抗体と、競合してＴｆＲに結合するＩｇＧ部分。
（ｃｉｉ）それぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびにそれぞれ配列番号４７、４８および４９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨを含む抗ＴｆＲ抗体と同じエピトープに結合する、ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分。
　本発明のＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の他の一例として、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬおよび２６、３１、３６、４１、４６または１０６で示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含むＴｆＲに結合するＩｇＧ部分が挙げられる。
　本発明のＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の一例として、それぞれ配列番号１７～１９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＬ、および、以下から選ばれる１のＶＨを含む、ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分が挙げられる。
（ａ）それぞれ配列番号３３および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および３、ならびに、配列番号３２で表されるアミノ酸配列から、２番目のチロシンのアラニンまたはフェニルアラニンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ
（ｂ）それぞれ配列番号３３および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および３、ならびに、配列番号３２で表されるアミノ酸配列から、３番目のスレオニンのアラニンまたはグリシンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ
（ｃ）それぞれ配列番号３２および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および３、ならびに、配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、１番目のバリンのアラニンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ
（ｄ）それぞれ配列番号３２および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および３、ならびに、配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、２番目のイソロイシンのアラニンまたはロイシンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ
（ｅ）それぞれ配列番号３２および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および３、ならびに、配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、７番目のバリンのグルタミン酸への置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ
（ｆ）それぞれ配列番号３２および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および３、ならびに、配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、１０番目のアスパラギン酸のアラニンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ
（ｇ）それぞれ配列番号３２および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および３、ならびに、配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、１３番目のアスパラギン酸のプロリンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ
（ｈ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、３番目のグルタミンのアラニンまたはアスパラギン酸への置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
（ｉ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、４番目のプロリンの任意の天然アミノ酸への置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
（ｊ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、４番目のプロリンのアラニン、チロシン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、スレオニン、アルギニン、グリシン、リジン、メチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニンもしくはヒスチジンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
（ｋ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、５番目のトリプトファンのアラニン、フェニルアラニン、ヒスチジンまたはチロシンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
（ｌ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、７番目のチロシンのアラニンまたはフェニルアラニンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
（ｍ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、バリンのロイシンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
　本発明のＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の一例として、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ、ならびに配列番号３１で表されるアミノ酸配列から、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックス（以下、ＥＵインデックス）により示されるＹ３２Ａ、Ｙ３２Ｆ、Ｔ３３Ａ、Ｔ３３Ｇ、Ｌ４５Ａ、Ｖ４８Ａ、Ｖ５０Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｉ５１Ｌ、Ｖ５５Ｅ、Ｄ５８Ａ、Ｄ６１Ｐ、Ｑ９７Ａ、Ｑ９７Ｄ、Ｗ９９Ａ、Ｗ９９Ｆ、Ｗ９９Ｈ、Ｗ９９Ｙ、Ｙ１００ＡＡ、Ｙ１００ＡＦ、Ｖ１０２Ｌ、およびＰ９８の任意のアミノ酸への置換から選ばれる少なくとも１つの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＶＨを含むＴｆＲに結合するＩｇＧ部分が挙げられる。
　本発明のＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の一例として、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ、ならびに配列番号３１で表されるアミノ酸配列から、ＥＵインデックスにより示されるＹ３２Ａ、Ｙ３２Ｆ、Ｔ３３Ａ、Ｔ３３Ｇ、Ｌ４５Ａ、Ｖ４８Ａ、Ｖ５０Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｉ５１Ｌ、Ｖ５５Ｅ、Ｄ５８Ａ、Ｄ６１Ｐ、Ｑ９７Ａ、Ｑ９７Ｄ、Ｗ９９Ａ、Ｗ９９Ｆ、Ｗ９９Ｈ、Ｗ９９Ｙ、Ｙ１００ＡＡ、Ｙ１００ＡＦ、Ｖ１０２Ｌ、Ｐ９８Ａ、Ｐ９８Ｙ、Ｐ９８Ｓ、Ｐ９８Ｄ、Ｐ９８Ｑ、Ｐ９８Ｅ、Ｐ９８Ｔ、Ｐ９８Ｒ、Ｐ９８Ｇ、Ｐ９８Ｋ、Ｐ９８Ｍ、Ｐ９８Ｖ、Ｐ９８Ｌ、Ｐ９８Ｉ、Ｐ９８Ｗ、Ｐ９８Ｆ、およびＰ９８Ｈから選ばれるいずれか１つの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＶＨを含むＴｆＲに結合するＩｇＧ部分が挙げられる。
　本発明のＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の一例として、配列番号６で表されるＴｆＲのアミノ酸配列の３５２番目のＡｓｐ、３５５番目のＳｅｒ、３５６番目のＡｓｐ、および３５８番目のＬｙｓから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基、並びに、３６５番目のＭｅｔ、３６６番目のＶａｌ、および３６９番目のＧｌｕから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を認識するＴｆＲに結合するＩｇＧ部分が挙げられる。該ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の一態様としては、例えば、３５２番目のＡｓｐ、３５５番目のＳｅｒ、３５６番目のＡｓｐおよび３５８番目のＬｙｓのうち少なくとも２つのアミノ酸残基、並びに３６５番目のＭｅｔ、３６６番目のＶａｌおよび３６９番目のＧｌｕのうち少なくとも２つのアミノ酸残基を認識するＴｆＲに結合するＩｇＧ部分；３５２番目のＡｓｐ、３５５番目のＳｅｒ、３５６番目のＡｓｐおよび３５８番目のＬｙｓから選ばれる少なくとも３つのアミノ酸残基、並びに３６５番目のＭｅｔ、３６６番目のＶａｌおよび３６９番目のＧｌｕのすべてのアミノ酸残基を認識するＴｆＲに結合するＩｇＧ部分；３５２番目のＡｓｐ、３５５番目のＳｅｒ、３５６番目のＡｓｐおよび３５８番目のＬｙｓのすべてのアミノ酸残基、並びに３６５番目のＭｅｔ、３６６番目のＶａｌおよび３６９番目のＧｌｕのすべてのアミノ酸残基を認識するＴｆＲに結合するＩｇＧ部分；が挙げられる。
　本発明の抗ＥＧＦＲ抗体の一例として、それぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびに以下の（２ａ）～（２ｂ）から選ばれるいずれか１つのＶＨを含む抗ＥＧＦＲ抗体が挙げられる。
（２ａ）それぞれ配列番号６０、６１および６２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ、
（２ｂ）それぞれ配列番号６５、６６および６７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ。
　本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、上記（２ａ）～（２ｂ）のいずれか１つに示されるＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列およびそれぞれ配列番号１７～１９で示されるＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列と、それぞれ少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相同である、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含む抗ＥＧＦＲ抗体をも包含する。
　本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載される抗体をも包含する。
（ｉ）それぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびに上記（２ａ）～（２ｂ）のいずれか１つに示されるＶＨを含む抗ＥＧＦＲ抗体と、競合してＥＧＦＲに結合する抗体。
（ｉｉ）それぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびに上記（２ａ）～（２ｂ）のいずれか１つに示されるＶＨを含む抗ＥＧＦＲ抗体と同じエピトープに結合する抗体。
　本発明の抗ＥＧＦＲ抗体の他の例として、以下の（ａ）～（ｅ）から選ばれる１のバイスペシフィック抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号５９または配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体
（ｂ）配列番号１１０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体
（ｃ）配列番号１１２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体
（ｄ）配列番号１１４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体
（ｅ）配列番号１１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体
　本発明の一態様として、Ｎ末端側ポリペプチドとＴｆＲに結合するＩｇＧ部分を含み、該Ｎ末端側ポリペプチドがＦａｂであり、該ＦａｂのＶＨ－ＣＨ１のＣ末端が前記ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の重鎖Ｎ末端に直接またはリンカーを介して結合しているバイスペシフィック抗体も挙げられる。
　また、本発明の一態様として、Ｎ末端側ポリペプチドとＴｆＲに結合するＩｇＧ部分を含み、該Ｎ末端側ポリペプチドがＦａｂであり、該ＦａｂのＶＬ－ＣＬのＣ末端が前記ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の重鎖Ｎ末端に直接またはリンカーを介して結合しているバイスペシフィック抗体も挙げられる。
　本発明の一態様として、ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分とＥＧＦＲに結合するＮ末端側ポリペプチドを含むバイスペシフィック抗体が挙げられる。
　本発明のバイスペシフィック抗体としてより具体的には、以下の（ｉ）から(ｉｖ)で表されるバイスペシフィック抗体が挙げられる。
（ｉ）それぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびにそれぞれ配列番号６０、６１および６２で表されるＶＨを含む、抗ＥＧＦＲ抗体のＦａｂならびにそれぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、ならびに以下の（ａ）～（ｆ）のいずれか１つのＶＨを含むＴｆＲに結合するＩｇＧ部分を含むバイスペシフィック抗体であって、
該ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の重鎖Ｎ末端に直接またはリンカーを介して該Ｆａｂが結合するバイスペシフィック抗体。
　（ａ）それぞれ配列番号２２、２３および２４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
　（ｂ）それぞれ配列番号２７、２８および２９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
　（ｃ）それぞれ配列番号３２、３３および３４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
　（ｄ）それぞれ配列番号３７、３８および３９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
　（ｅ）それぞれ配列番号４２、４３および４４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
　（ｆ）それぞれ配列番号４７、４８および４９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
（ｉｉ）それぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびにそれぞれ配列番号６５、６６および６７で表されるＶＨを含む、抗ＥＧＦＲ抗体のＦａｂならびにそれぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、ならびに以下の（ａ）～（ｆ）のいずれか１つのＶＨを含むＴｆＲに結合するＩｇＧ部分を含むバイスペシフィック抗体であって、
該ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の重鎖Ｎ末端に直接またはリンカーを介して該Ｆａｂが結合するバイスペシフィック抗体。
　（ａ）それぞれ配列番号２２、２３および２４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
　（ｂ）それぞれ配列番号２７、２８および２９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
　（ｃ）　それぞれ配列番号３２、３３および３４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
　（ｄ）それぞれ配列番号３７、３８および３９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
　（ｅ）それぞれ配列番号４２、４３および４４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
　（ｆ）それぞれ配列番号４７、４８および４９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬならびにそれぞれ配列番号７０、７１および７２で表されるＶＨを含む、抗ＥＧＦＲ抗体のＦａｂならびにそれぞれ配列番号１７、１８および１９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＬ、ならびに以下の（ａ）～（ｆ）のいずれか１つのＶＨを含むＴｆＲに結合するＩｇＧ部分を含むバイスペシフィック抗体であって、
該ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の重鎖Ｎ末端に直接またはリンカーを介して該Ｆａｂが結合するバイスペシフィック抗体。
　（ａ）それぞれ配列番号２２、２３および２４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
　（ｂ）それぞれ配列番号２７、２８および２９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
　（ｃ）それぞれ配列番号３２、３３および３４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
　（ｄ）それぞれ配列番号３７、３８および３９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
　（ｅ）それぞれ配列番号４２、４３および４４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
　（ｆ）それぞれ配列番号４７、４８および４９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、２および３を含むＶＨ
　（ｉｖ）配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬおよび配列番号５９で示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む、抗ＥＧＦＲ抗体のＦａｂならびに配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、および配列番号２１、２６、３１、３６、４１または４６で示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む、ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分を含むバイスペシフィック抗体であって、
該ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の重鎖Ｎ末端に直接またはリンカーを介して該Ｆａｂが結合するバイスペシフィック抗体。
　（ｖ）配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬおよび配列番号６４で示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む、抗ＥＧＦＲ抗体のＦａｂならびに配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、および配列番号２１、２６、３１、３６、４１または４６で示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む、ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分を含むバイスペシフィック抗体であって、
該ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の重鎖Ｎ末端に直接またはリンカーを介して該Ｆａｂが結合するバイスペシフィック抗体。
　（ｖｉ）配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬおよび配列番号６９で示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む、抗ＥＧＦＲ抗体のＦａｂならびに配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、および配列番号２１、２６、３１、３６、４１または４６で示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む、ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分を含むバイスペシフィック抗体であって、
該ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の重鎖Ｎ末端に直接またはリンカーを介して該Ｆａｂが結合するバイスペシフィック抗体。
　上記（ｉ）～（ｖｉ）で表されるバイスペシフィック抗体として、前記ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の重鎖Ｎ末端に直接またはリンカーを介して結合するのが前記ＦａｂのＶＨ－ＣＨ１であってもＶＬ－ＣＬでもよいが、ＶＨ－ＣＨ１が好ましい。
　本発明の一態様として、ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の重鎖Ｃ末端に直接またはリンカーを介してＮ末端側ポリペプチドが結合するバイスペシフィック抗体であり、該ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の定常領域がＩｇＧ１、ＩｇＧ４またはそれらの改変体であるバイスペシフィック抗体が挙げられる。本発明のさらに好ましい一態様としては、該ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の重鎖定常領域にＩｇＧ４ＰＥまたはＩｇＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋを含み、
該ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の重鎖Ｎ末端に直接またはリンカーを介してＮ末端側ポリペプチドが結合するバイスペシフィック抗体が挙げられる。
　本発明の一態様として、ＴｆＲに結合するＩｇＧ部分とＥＧＦＲに結合するＮ末端側ポリペプチドを含み、Ｎ末端側ポリペプチドがＦａｂであり、ＦａｂがＩｇＧ部分の重鎖Ｎ末端にリンカーを介して結合しているバイスペシフィック抗体が挙げられる。更に好ましい一態様として、前記リンカーのアミノ酸配列がＥＳ、ＥＳＫＹＧ、ＥＳＫＹＧＰＰ、ＧＧＧＧＳ、またはＧＧＧＧＳの繰返し配列から選ばれる１つであるバイスペシフィック抗体が挙げられる。
　本発明のバイスペシフィック抗体の例として、Ｅ０８－ＴｆＲ１０７１またはＥ１２－ＴｆＲ１０７１が挙げられる。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該抗体断片には、エフェクター活性を有する抗体または該抗体断片も包含される。
　エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の細胞傷害活性を指し、例えば、抗体依存性細胞傷害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＡＤＣＣ活性）、補体依存性細胞傷害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ；　ＣＤＣ活性）、マクロファージや樹状細胞などの食細胞による抗体依存性貪食活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ　ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＡＤＣＰ活性）およびオプソニン効果などが挙げられる。
　本発明においてＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性は、公知の測定方法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373（1993）］を用いて測定することができる。
　ＡＤＣＣ活性とは、標的細胞上の抗原に結合した抗体が、抗体のＦｃ領域を介して免疫細胞のＦｃ受容体と結合することで免疫細胞（ナチュラルキラー細胞など）を活性化し、標的細胞を傷害する活性をいう。
　Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体であり、抗体の結合によりさまざまなエフェクター活性を誘発する。各ＦｃＲは抗体のサブクラスに対応し、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭはそれぞれＦｃγＲ、ＦｃεＲ、ＦｃαＲ、ＦｃμＲに特異的に結合する。さらにＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のサブタイプが存在し、それぞれのサブタイプにはＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、ＦｃγＲＩＣ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢのアイソフォームが存在する。これらの異なるＦｃγＲは異なる細胞上に存在する［Annu. Rev. Immunol. 9:457-492(1991)］。ヒトにおいては、ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球に特異的に発現しており、ＦｃγＲＩＩＩＡは単球、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージおよび一部のＴ細胞に発現する。ＦｃγＲＩＩＩＡへの抗体の結合を介して、ＮＫ細胞依存的なＡＤＣＣ活性が誘発される。
　ＣＤＣ活性とは、標的細胞上の抗原に結合した抗体が血液中の補体関連タンパク質群からなる一連のカスケード（補体活性化経路）を活性化し、標的細胞を傷害する活性をいう。また、補体の活性化により生じるタンパク質断片により、免疫細胞の遊走および活性化が誘導される。ＣＤＣ活性のカスケードは、まずＣ１ｑがＦｃ領域に結合し、次に２つのセリンプロテアーゼであるＣ１ｒおよびＣ１ｓと結合することで、Ｃ１複合体を形成し開始される。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該抗体断片の抗原発現細胞に対するＣＤＣ活性、またはＡＤＣＣ活性は、公知の測定方法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373（1993）］により評価することができる。
　本発明のバイスペシフィック抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体のＦｃ領域（ＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる定常領域）の２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ－結合複合型糖鎖の還元末端に存在するＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα－１，６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号および国際公開第００／６１７３９号）や、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基の改変により制御する方法（国際公開第００／４２０７２号）などが知られている。
　バイスペシフィック抗体に付加するフコースの量を制御することで、抗体のＡＤＣＣ活性を増加または低下させることができる。例えば、抗体のＦｃに結合しているＮ－結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を低下させる方法として、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損した宿主細胞を用いてバイスペシフィック抗体を発現することで、高いＡＤＣＣを有するバイスペシフィック抗体を取得することができる。一方、バイスペシフィック抗体のＦｃに結合しているＮ－結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法として、α１，６－フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させることで、低いＡＤＣＣ活性を有するバイスペシフィック抗体を取得することができる。
　また、バイスペシフィック抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性を増加または低下させることができる。例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、バイスペシフィック抗体のＣＤＣ活性を増加させることができる。また、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、米国特許第７，２９７，７７５号明細書または米国特許第７，３１７，０９１号明細書などに記載のアミノ酸改変を行うことで、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を、増加させることも低下させることもできる。
　さらに、上述の方法を組み合わせることにより、エフェクター活性が制御されたバイスペシフィック抗体を取得してもよい。
　本発明のバイスペシフィック抗体の安定性は、精製過程や一定条件下で保存されたサンプルにおいて形成される凝集体（オリゴマー）量を測定することによって評価することができる。すなわち、同一条件下で凝集体量が低減する場合を、抗体の安定性が向上したものと評価する。凝集体量は、ゲルろ過クロマトグラフィーを含む適当なクロマトグラフィーを用いて凝集した抗体と凝集していない抗体とを分離することによって測定することができる。
　本発明のバイスペシフィック抗体の生産性は、抗体産生細胞から培養液中に産生される抗体量を測定することによって評価することができる。より具体的には、培養液から産生細胞を除いた培養上清に含まれる抗体の量をＨＰＬＣ法やＥＬＩＳＡ法などの適当な方法で測定することによって評価することができる。
　本発明において、抗体断片とは、抗原結合部位を含み、該抗原に対する抗原結合活性を有するタンパク質である。例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＶＨＨまたはＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
　Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体とがジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）で結合した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。ＶＨおよびＣＨ１を含むＦａｂのＨ鎖を、ＶＨ－ＣＨ１と記載する。また、ＶＬおよびＣＬを含むＦａｂのＬ鎖をＶＬ－ＣＬと記載する。
　Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ－Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のＳ－Ｓ結合を切断した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを１２残基以上の適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ－Ｐ－ＶＬまたはＶＬ－Ｐ－ＶＨポリペプチドであり、抗原結合活性を有する抗体断片である。
　Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片であり、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性、または異なる抗原に対し各々特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
　ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中の各１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のＳ－Ｓ結合を介して結合させたものをいう。
　ＶＨＨ（ナノボディともいう）は、ＶＨＨ抗体における重鎖可変領域を指し、他のポリペプチドの存在なしで抗原に結合することができる。
　ＶＨＨ抗体は、アルパカ等のラクダ科の動物およびサメ等の軟骨魚に存在する抗体であり、軽鎖とＣＨ１がなく、重鎖のみからなる。
　ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、ＣＤＲ同士を直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることで作製することができる。ＣＤＲを含むペプチドは、本発明のバイスペシフィック抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
　本発明において、バイスペシフィック抗体断片とは、本質的にバイスペシフィック抗体の部分構造からなり、２種類の抗原に対する抗原結合活性を有するバイスペシフィック抗体断片である。
　本発明のバイスペシフィック抗体のＦｃと抗体断片とが結合した融合タンパク質、該Ｆｃと天然に存在するリガンドまたは受容体とが結合したＦｃ融合タンパク質（イムノアドヘシンともいう）、および複数のＦｃ領域を融合させたＦｃ融合タンパク質等も本発明に包含される。また、抗体のエフェクター活性の増強または欠損、抗体の安定化、および血中半減期の制御を目的としたアミノ酸残基改変を含むＦｃ領域も、本発明のバイスペシフィック抗体に用いることができる。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片としては、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、タンパク質または抗体医薬などを化学的または遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
　本発明における抗体の誘導体は、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片のＨ鎖またはＬ鎖のＮ末端側或いはＣ末端側、該抗体またはその抗体断片中の適当な置換基或いは側鎖、さらには該抗体またはその抗体断片中の糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、免疫賦活剤、タンパク質または抗体医薬などを化学的手法［抗体工学入門、地人書館（１９９４）］により結合させることで製造することができる。
　また、本発明における抗体の誘導体は、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡと、所望のタンパク質または抗体医薬をコードするＤＮＡとを連結させて、発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し発現させる、遺伝子工学的手法により製造することができる。
　放射性同位元素としては、例えば、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、９９Ｔｃ、７７Ｌｕまたは２１１Ａｔなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、例えば、１－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
　低分子の薬剤としては、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤若しくはキナーゼ阻害剤などの抗癌剤［臨床腫瘍学、癌と化学療法社（１９９６）］、ハイドロコーチゾン若しくはプレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン若しくはインドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート若しくはペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド若しくはアザチオプリンなどの免疫抑制剤またはマレイン酸クロルフェニラミン若しくはクレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社（１９８２）］などが挙げられる。
　抗癌剤としては、例えば、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、５－フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、１０－ヒドロキシ－７－エチル－カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、メスナ、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、ＦＭＳ－ｌｉｋｅ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　３（Ｆｌｔ３）阻害剤、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｏｔｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）阻害剤、タルセバなどのｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）阻害剤、ラディシコール、１７－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール－トランスレチノイン酸、サリドマイド、レナリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、金チオマレート、Ｄ－ペニシラミン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（タルグレチン）、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、カリケアマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タルグレチン、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、スラミン、メトトレキセート若しくはメイタンシノイドまたはその誘導体などが挙げられる。
　低分子の薬剤と本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と該抗体のアミノ基間を結合させる方法、または水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と該抗体のカルボキシル基とを結合させる方法などが挙げられる。
　高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、またはヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。これらの高分子化合物を本発明のバイスペシフィック抗体または抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的若しくは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、または（３）免疫原性の消失若しくは抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。
　例えば、ＰＥＧと本発明のバイスペシフィック抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などが挙げられる［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε－アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１－１７８９２６号公報）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６－２３５８７号公報）、またはアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２－１１７９２０号公報）などが挙げられる。
　免疫賦活剤としては、イムノアジュバントとして知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤が、β（１→３）グルカン（例えば、レンチナンまたはシゾフィラン）、またはαガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）などが挙げられる。
　タンパク質としては、例えば、ＮＫ細胞、マクロファージまたは好中球などの免疫担当細胞を活性化するサイトカイン若しくは増殖因子または毒素タンパク質などが挙げられる。
　サイトカインまたは増殖因子としては、例えば、インターフェロン（以下、ＩＦＮと記す）－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）またはマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）などが挙げられる。
　毒素タンパク質としては、例えば、リシン、ジフテリアトキシンまたはＯＮＴＡＫなどが挙げられ、毒性を調節するためにタンパク質に変異を導入したタンパク毒素も含まれる。
　タンパク質または抗体医薬との融合抗体は、本発明のバイスペシフィック抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡにタンパク質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物または真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。　
　上記抗体の誘導体を検出方法、定量方法、検出用試薬、定量用試薬または診断薬として使用する場合に、本発明のバイスペシフィック抗体またはその抗体断片に結合する薬剤としては、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体が挙げられる。標識体としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ若しくはルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル若しくはロフィンなどの発光物質、またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ（登録商標）　Ｆｌｕｏｒ　４８８、Ｒ－ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（Ｒ－ＰＥ）などの蛍光物質などが挙げられる。
　本発明には、ＣＤＣ活性またはＡＤＣＣ活性などの細胞傷害活性を有するバイスペシフィック抗体および該バイスペシフィック抗体断片が包含される。本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の抗原発現細胞に対するＣＤＣ活性またはＡＤＣＣ活性は公知の測定方法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 （1993）］により評価することができる。
　また、本発明は、ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原を特異的に認識し結合するバイスペシフィック抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片を含む組成物、または該バイスペシフィック抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片を有効成分として含有する、ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患、好ましくはＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の発現細胞が関与する疾患の治療薬に関する。
　ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患としては、ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方が関係している疾患であればいかなるものでもよいが、例えば、悪性腫瘍およびがんなどが挙げられる。
　本発明において、悪性腫瘍およびがんとしては、例えば、大腸がん、結腸直腸がん、肺がん、乳がん、グリオーマ、悪性黒色腫（メラノーマ）、甲状腺がん、腎細胞がん、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃がん、膵臓がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、卵巣がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、頭頚部がん、皮膚がん、尿路がん、膀胱がん、前立腺がん、絨毛がん、咽頭がん、喉頭がん、中皮腫、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、膠芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫およびウィルムス腫瘍などが挙げられる。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する治療薬は、有効成分としての該バイスペシフィック抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが好ましい。
　投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内または静脈内などの非経口投与が挙げられる。中でも、静脈内投与が好ましい。
　投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏またはテープ剤などが挙げられる。
　投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢および体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇである。
　さらに、本発明は、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含有する、ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方の免疫学的検出用若しくは測定用試薬、またはＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患、好ましくはＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の発現細胞が関与する疾患の診断薬に関する。また、本発明は、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いた、ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方の免疫学的検出用若しくは測定用方法、ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患、好ましくはＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の発現細胞が関与する疾患の治療方法、またはＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患、好ましくはＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の発現細胞が関与する疾患の診断方法に関する。
　本発明においてＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方の量を検出または測定する方法としては、任意の公知の方法が挙げられる。例えば、免疫学的検出または測定方法などが挙げられる。
　免疫学的検出または測定方法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的検出または測定方法としては、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット法または物理化学的手法などが挙げられる。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いてＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方が発現した細胞を検出または測定することにより、ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患、好ましくはＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の発現細胞が関与する疾患を診断することができる。
　ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方が発現している細胞の検出には、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、例えば、免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法または蛍光抗体染色法などが挙げられる。また、例えば、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などの蛍光抗体染色法なども挙げられる。
　本発明においてＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方を検出または測定する対象となる生体試料としては、例えば、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液または培養液など、ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方が発現した細胞を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。
　本発明のバイスペシフィック抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する診断薬は、目的とする診断方法に応じて、抗原抗体反応を行なうための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行なうための試薬としては、例えば、緩衝剤、塩などが挙げられる。
　検出用試薬としては、例えば、前記バイスペシフィック抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体に結合する標識された二次抗体、または標識に対応した基質などの通常の免疫学的検出または測定法に用いられる試薬が挙げられる。
　以下、本発明のバイスペシフィック抗体の作製方法、該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の活性評価方法、並びに該バイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いた疾患の治療方法および診断方法について具体的に記載する。
１．モノクローナル抗体の作製方法
　本発明におけるモノクローナル抗体の製造方法は、下記の作業工程を包含する。すなわち、（１）免疫原として使用する抗原の精製および細胞表面に抗原が過剰発現した細胞の作製の少なくとも一方、（２）抗原を動物に免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓などを摘出する時期を決定し、抗体産生細胞を調製する工程、（３）骨髄腫細胞（ミエローマ）の調製、（４）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、（５）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、（６）ハイブリドーマ群からの単クローン（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）細胞の分離（クローニング）、（７）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、またはハイブリドーマを移植した動物の飼育、（８）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性およびその抗原結合特異性の検討、または標識試薬としての特性の検定、などである。
　以下、本発明におけるＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原に結合するバイスペシフィック抗体を作製するために使用する、ＴｆＲに結合するモノクローナル抗体およびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原に結合するモノクローナル抗体の作製方法を上記の工程に沿って詳述する。該抗体の作製方法はこれに制限されず、例えば脾臓細胞以外の抗体産生細胞およびミエローマを使用することもできる。
（１）抗原の精製　
　ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲを発現させた細胞は、ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲの全長またはその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞または動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方を多量に発現している各種ヒト腫瘍培養細胞またはヒト組織などからＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方を精製し、抗原として使用することができる。また、該腫瘍培養細胞または該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によりＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲの部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
　本発明で用いられるＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲは、Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)やCurrent Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997)などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させることで製造することができる。　
　ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲをコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲを生産する形質転換体を得ることができる。　
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製または染色体中への組込みが可能で、かつＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲをコードするＤＮＡを転写できる位置に適当なプロモーターを含有しているものであれば、いずれも用いることができる。
　宿主細胞としては、例えば、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞または動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
　大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であるとともに、プロモーター、リボソーム結合配列、ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲをコードする部分を含むＤＮＡ、並びに転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターは、プロモーターを制御する遺伝子を含んでもよい。
　該組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば、６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
　また、該ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲをコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲの生産率を向上させることができる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３－２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Agricultural Biological Chemistry, 48, 669（1984）］、ｐＬＳＡ１［Agric. Biol. Chem., 53, 277（1989）］、ｐＧＥＬ１［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306（1985）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－４００）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６７９８）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４，６８６，１９１号明細書、米国特許第４，９３９，０９４号明細書、米国特許第５，１６０，７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［J. Bacteriol., 172, 2392 （1990）］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）またはｐＭＥ１８ＳＦＬ３（東洋紡社製）などが挙げられる。
　プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターまたはＴ７プロモーターなどの、大腸菌またはファージなどに由来するプロモーターが挙げられる。また、例えば、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、またはｌｅｔ　Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども挙げられる。
　宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、または大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110（1972）、Gene, 17, 107（1982）、Molecular & General Genetics, 168, 111（1979）］が挙げられる。　
　動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡＩ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３－２２９７９号公報；Cytotechnology, 3, 133 （1990）］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８［Nature, 329, 840 （1987）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochemistry, 101, 1307 （1987）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３またはｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）などが挙げられる。
　プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーターまたはモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
　宿主細胞としては、例えば、ヒトバーキットリンパ腫細胞Ｎａｍａｌｗａ、アフリカミドリザル腎臓由来細胞ＣＯＳ、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞ＣＨＯ、またはヒト白血病細胞ＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３－０００２９９号公報）などが挙げられる。
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Cytotechnology, 3, 133 (1990）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、またはリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413（1987）］などが挙げられる。　
　以上のようにして得られるＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲをコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、または動物細胞などに由来する形質転換体を培地中で培養し、培養物中に該ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲを製造することができる。該形質転換体を培地中で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖または糖鎖が付加されたＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲを得ることができる。
　誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する際には、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを、各々培地に添加してもよい。
　動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［The Journal of the American Medical Association, 199, 519（1967）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Science, 122, 501 （1952）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地[Virology, 8, 396（1959）］、199培地［Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950）］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、またはこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１～７日間行う。また、培養中に、必要に応じて、カナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
　ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲをコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産または融合タンパク質発現などの方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）］を用いることができる。ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲの生産方法としては、例えば、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、または宿主細胞外膜上に生産させる方法が挙げられ、使用する宿主細胞や、生産させるＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲの構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
　例えば、細胞外領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに、抗体のＦｃ領域をコードするＤＮＡ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードするＤＮＡ、またはＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡまたはＨｉｓｔｉｄｉｎｅタグをコードするＤＮＡなどを連結したＤＮＡを作製して、発現し精製することで抗原融合タンパク質を作製することができる。具体的には、例えばＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲの細胞外領域をヒトＩｇＧのＦｃ領域に結合させたＦｃ融合タンパク質、ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲの細胞外領域とグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質が挙げられる。
　ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲが宿主細胞内または宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989）］、ロウらの方法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 （1989）、Genes Develop., 4, 1288（1990）］、日本国特開平０５－３３６９６３号公報、または国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２－２２７０７５号公報）を利用してＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲの生産量を上昇させることもできる。
　生産したＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲは、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。
　ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、またはダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離して得られる上清から、通常のタンパク質の単離精製法、すなわち溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、または等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を、単独でまたは組み合わせて用いることで、精製タンパク質を得ることができる。
　ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲの不溶体を回収する。回収した該ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲの不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲを正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製タンパク質を得ることができる。
　ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲまたはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲ、またはその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養上清を上記と同様に遠心分離などの手法を用いて処理することにより、可溶性画分を取得し、該可溶性画分から上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製タンパク質を得ることができる。
　また、本発明において用いられるＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲは、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。具体的には、例えば、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル－ベガ社製、パーセプチブ社製、または島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することができる。
（２）抗体産生細胞の調製工程
　マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ウシ、またはアルパカなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾臓、リンパ節または末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、動物としては、例えば、富塚らの文献［Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 97、722,（2000）］に記載されているヒト由来抗体を産生するトランスジェニックマウス、免疫原性を高めるためにＴｆＲまたはＥＧＦＲ等の細胞表面抗原のコンディショナルノックアウトマウスなどが被免疫動物として挙げられる。
　免疫は、フロイントの完全アジュバント、または水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。マウス免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射または足蹠注射などいずれでもよいが、腹腔内注射、足蹠注射または静脈内注射が好ましい。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、またはＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリアタンパク質とのコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
　抗原の投与は、１回目の投与の後、１～２週間おきに５～１０回行う。各投与後３～７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し上記の血清が十分な抗体価を示した動物を、融合用抗体の産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効果を高めることができる。
　抗原の最終投与後３～７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞は、形質細胞およびその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾臓、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、またはこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾臓細胞が最も一般的に用いられる。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断してほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去することにより、融合用抗体産生細胞を取得する。
（３）ミエローマの調製工程
　ミエローマとしては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のない細胞を用いることが出来るが、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば、８－アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）ミエローマ細胞株Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）［Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1（1978）］、Ｐ３－ＮＳ１／１－Ａｇ４１（ＮＳ－１）［European J. Immunology, 6, 511 （1976）］、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ－２）［Nature, 276, 269（1978）］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）［J. Immunology, 123, 1548 （1979）］、またはＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）［Nature, 256, 495（1975）］などが用いられる。該細胞株は、適当な培地、例えば８－アザグアニン培地［グルタミン、２－メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、ＦＣＳおよび８－アザグアニンを加えたＲＰＭＩ－１６４０培地］、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＩＭＤＭ」という）、またはダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地で継代培養する。細胞融合の３～４日前に上記の細胞株を正常培地（例えば、１０％　ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地）で継代培養し、融合を行う当日に２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合
　（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られるミエローマ細胞を、Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、融合用抗体産生細胞：ミエローマ細胞＝５：１～１０：１になるように混合し、遠心分離した後、上清を除く。沈澱した細胞集塊をよくほぐした後、ポリエチレングリコール－１０００（ＰＥＧ－１０００）、ＭＥＭ培地およびジメチルスルホキシドの混合液を、３７℃にて攪拌しながら加える。さらに１～２分間毎にＭＥＭ培地１～２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除き、沈澱した細胞集塊を緩やかにほぐした後、ＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを加えた正常培地］中に緩やかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて７～１４日間培養する。　
　また、以下の方法でも細胞融合を行うことができる。脾臓細胞とミエローマ細胞とを無血清培地（例えばＤＭＥＭ）、またはリン酸緩衝生理食塩液（以下「リン酸緩衝液」という）でよく洗浄し、脾臓細胞とミエローマ細胞の細胞数の比が５：１～１０：１程度になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞集塊をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０００～４０００）を含む無血清培地を滴下する。その後、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液およびヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）を含む正常培地（以下、ＨＡＴ培地という）中に懸濁して培養用プレート（以下、プレートという）の各ウェルに分注し、５％炭酸ガス存在下、３７℃にて２週間程度培養する。途中適宜ＨＡＴ培地を補う。
（５）ハイブリドーマ群の選択
　融合に用いたミエローマ細胞が８－アザグアニン耐性株である場合、すなわちヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株である場合は、融合しなかったミエローマ細胞およびミエローマ細胞同士の融合細胞は、ＨＡＴ培地中では生存することができない。一方、抗体産生細胞同士の融合細胞および抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは、ＨＡＴ培地中で生存することができるが、抗体産生細胞同士の融合細胞はやがて寿命に達する。したがって、ＨＡＴ培地中での培養を続けることによって、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマのみが生き残り、結果的にハイブリドーマを取得することができる。
　コロニー状に生育してきたハイブリドーマについて、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地（以下、ＨＴ培地という）への培地交換を行う。その後、培養上清の一部を採取し、後述する抗体価測定法を用いて、抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。抗体価の測定方法としては、例えば、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法および受身血球凝集反応法など種々の公知技術が挙げられるが、検出感度、迅速性、正確性および操作の自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法またはＥＬＩＳＡ法が好ましい。
　抗体価を測定することにより、所望の抗体を産生することが判明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。このクローニング法としては、例えば、プレートの１ウェルに１個の細胞が含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個の細胞を単離する方法、セルソーターによって１個の細胞を単離する方法などが挙げられる。
　抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２～４回繰り返し、安定して抗体価の認められたものを、ＴｆＲまたはＥＧＦＲ等の細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株として選択する。　
（６）モノクローナル抗体の調製
　プリスタン処理［２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８～１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（５）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０～２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０～５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ－セファロースカラム、プロテインＡカラムまたはゲル濾過カラムによる精製を行い、ＩｇＧまたはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。また、同系統のマウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ）若しくはＮｕ／Ｎｕマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の腹腔内で該ハイブリドーマを増殖させることにより、ＴｆＲまたはＥＧＦＲ等の細胞表面抗原に結合するモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。
　（５）で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ添加を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、ＧＩＴ培地、または５％ダイゴＧＦ２１を添加したＨｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ培地等に懸濁し、フラスコ培養、スピナー培養またはバック培養などにより３～７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ　ＧＩＩキット；アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を利用することもできる。
　抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍＬ］より算出する方法により行うことができる。
（７）ＴｆＲまたはＥＧＦＲ等の細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体の結合アッセイ
　ＴｆＲまたはＥＧＦＲ等の細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体の結合活性は、オクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、フローサイトメトリー法（ＦＣＭ）または表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）などのバインディングアッセイ系により測定することができる。
　オクテルロニー法は簡便ではあるが、抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定すると共に、抗体の結合活性を測定することが可能である。
　手順の具体例としては、精製または部分精製した組換えＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲをＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によりブロッキングを行う。ＥＬＩＳＡプレートをｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）および０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳ）などで洗浄後、段階希釈した第１抗体（例えばマウス血清、培養上清など）を反応させ、プレートに固定化された抗原へ抗体を結合させる。次に、第２抗体としてビオチン、酵素（ｈｏｒｓｅ　ｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ、ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＡＬＰなど）、化学発光物質または放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して、プレートに結合した第１抗体に第２抗体を反応させる。Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳでよく洗浄した後、第２抗体の標識物質に応じた反応を行い、標的抗原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
　ＦＣＭ法では、抗体の抗原発現細胞に対する結合活性を測定することができる［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)］。抗体が細胞膜上に発現している膜タンパク質抗原に結合することは、当該抗体が天然に存在する抗原の立体構造を認識し、結合することを意味する。
　ＳＰＲ法としては、Ｂｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析が挙げられる。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００を用い、抗原と被験物質との間の結合におけるｋｉｎｅｔｉｃｓを測定し、その結果を機器付属の解析ソフトウェアで解析をする。手順の具体例としては、抗マウスＩｇＧ抗体をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリング法により固定した後、ハイブリドーマ培養上清または精製モノクローナル抗体などの被験物質を流して適当量を結合させ、さらに濃度既知の複数濃度の抗原を流して、結合および解離を測定する。次に、得られたデータについて、機器付属のソフトウェアを用いて１：１バインディングモデルによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。または、ＥＧＦＲ等の細胞表面抗原またはＴｆＲをセンサーチップ上に、例えばアミンカップリング法により固定した後、濃度既知の複数濃度の精製モノクローナル抗体を流して、結合および解離を測定する。得られたデータについて、機器付属のソフトウェアを用いてバイバレントバインディングモデルによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。
　また、本発明において、ＴｆＲまたはＥＧＦＲ等の細胞表面抗原に対する抗体と競合してＴｆＲまたはＥＧＦＲ等の細胞表面抗原に結合する抗体は、上述のバインディングアッセイ系に被験抗体を共存させて反応させることにより、選択することができる。すなわち、被検抗体を加えた時に抗原との結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ＴｆＲまたはＥＧＦＲ等の細胞表面抗原への結合について、前記で取得した抗体と競合する抗体を得ることができる。
（８）ＴｆＲまたはＥＧＦＲ等の細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体のエピトープの同定
　本発明において、抗体が認識し結合するエピトープの同定は以下のようにして行うことができる。
　例えば、抗原の部分欠損体、種間で異なるアミノ酸残基を改変した変異体、または特定のドメインを改変した変異体を作製し、該欠損体または変異体に対する抗体の反応性が低下すれば、欠損部位またはアミノ酸改変部位が該抗体のエピトープであることが明らかになる。このような抗原の部分欠損体および変異体は、適当な宿主細胞、例えば大腸菌、酵母、植物細胞または哺乳動物細胞などを用いて、分泌タンパク質として取得してもよいし、宿主細胞の細胞膜上に発現させて抗原発現細胞として調製してもよい。膜型抗原の場合は、抗原の立体構造を保持したまま発現させるために、宿主細胞の膜上に発現させることが好ましい。また、抗原の１次構造または立体構造を模倣した合成ペプチドを作製し、抗体の反応性を確認することもできる。合成ペプチドは、公知のペプチド合成技術を用いて、その分子の様々な部分ペプチドを作製する方法等が挙げられる。
　例えば、ヒトおよびマウスのＴｆＲまたはＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の細胞外領域について、各領域を構成するドメインを適宜組み合わせたキメラタンパク質を作製し、該タンパク質に対する抗体の反応性を確認することで、抗体のエピトープを同定することができる。その後、さらに細かく、その対応部分のオリゴペプチド、または該ペプチドの変異体等を、当業者に周知のオリゴペプチド合成技術を用いて種々合成し、該ペプチドに対する抗体の反応性を確認することでエピトープを特定することができる。多種類のオリゴペプチドを得るための簡便な方法として、市販のキット［例えば、ＳＰＯＴｓキット（ジェノシス・バイオテクノロジーズ社製）、マルチピン合成法を用いた一連のマルチピン・ペプチド合成キット（カイロン社製）等］を利用することもできる。
　ＴｆＲまたはＥＧＦＲ等の細胞表面抗原に結合する抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体は、上述のバインティングアッセイ系で得た抗体のエピトープを同定し、該エピトープの部分的な合成ペプチド、該エピトープの立体構造を模した合成ペプチド、または該エピトープの組換え体等を作製し、免疫することで取得することができる。
　例えば、エピトープが膜タンパク質であれば、全細胞外領域または一部の細胞外ドメインを、適当なタグ、例えば、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅタグ、ＧＳＴタンパク質または抗体Ｆｃ領域などに連結した組換え融合タンパク質を作製し、該組換えタンパク質を免疫することで、より効率的に該エピトープ特異的な抗体を作製することができる。
２．遺伝子組換え抗体の作製
　遺伝子組換え抗体の作製例として、P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY、P. Shepherd and C. Dean. Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESSおよびJ. W. Goding., Monoclonal Antibodies:principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESSなどに概説されているが、以下にキメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体の作製方法を示す。また、遺伝子組換えマウス、ラット、ハムスターおよびラビット抗体についても、同様の方法で作製することができる。
（１）ハイブリドーマからのモノクローナル抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得
　モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの取得は、例えば以下のようにして行うことができる。
　まず、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマよりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。次に、合成したｃＤＮＡをファージまたはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、抗体のＣ領域部分またはＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用いて、ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。単離した組換えファージまたは組換えプラスミド内のＶＨまたはＶＬの全塩基配列を決定し、当該塩基配列よりＶＨまたはＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
　ハイブリドーマの作製に用いる非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスターまたはウサギなどを用いるが、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
　ハイブリドーマからの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン－トリフルオロ酢酸セシウム法［Methods in Enzymol., 154, 3 （1987）］、またはＲＮＡ　ｅａｓｙ　ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。　
　全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）］、またはＯｌｉｇｏ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）またはＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いて、ｍＲＮＡを調製することもできる。
　ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons（1987-1997）］またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）若しくはＺＡＰ－ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。
　ｃＤＮＡライブラリーの作製の際に、ハイブリドーマから抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターとしては、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。
　例えば、ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓ［Strategies, 5, 58（1992）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）［Nucleic Acids Research, 17, 9494（1989）］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49（1985）］、Ｌａｍｂｄａ　ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３－１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２［Mol. Cell. Biol., 3, 280（1983）］またはｐＵＣ１８［Gene, 33, 103（1985）］などを用いる。
　ファージまたはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’［Strategies, 5, 81（1992）］、Ｃ６００［Genetics, 39, 440（1954）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Science, 222, 778（1983）］、ＮＭ５２２［J. Mol. Biol., 166, 1（1983）］、Ｋ８０２［J. Mol. Biol., 16, 118（1966）］、またはＪＭ１０５［Gene, 38, 275（1985）］などを用いる。
　ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープ若しくは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、またはプラーク・ハイブリダイゼーション法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）］などを用いる。
　また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と表記する、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition , Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons（1987-1997）］を行うことにより、ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
　選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。例えば、ジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463（1977）］などの反応を行った後、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いて解析する。
　決定した全塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services（1991）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが、分泌シグナル配列を含めて抗体のＶＨおよびＶＬ各々の完全なアミノ酸配列をコードしているか否かを確認する。
　分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬ各々の完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services（1991）］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定することができ、さらにそれらが属するサブグループを同定することができる。
　また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列は、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services（1991）］と比較することによって推定することができる。
　また、得られたＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列について、例えば、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴまたはＰＩＲ－Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースを用いてＢＬＡＳＴ法［J. Mol. Biol., 215, 403（1990）］などによる相同性検索を行うことで、当該ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものであるか否かを確認することができる。
（２）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬの少なくとも一方をコードするＤＮＡをクローニングすることにより構築することができる。
　ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬを用いることができ、例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどを用いることができる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡとしてはｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。
　動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組み込んで発現できるものであれば、いかなるものでも用いることができ、例えば、ｐＡＧＥ１０７［Cytotechnol., 3, 133 （1990）］、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochem., 101, 1307（1987）］、ｐＨＳＧ２７４［Gene, 27, 223 （1984）］、ｐＫＣＲ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 （1981）］、pSG1bd2-4［Cytotechnol., 4, 173 （1990）］、またはｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１－３［Cytotechnol., 13, 79 （1993）］、ＩＮＰＥＰ４（Ｂｉｏｇｅｎ－ＩＤＥＣ社製）、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６，００１，３５８号明細書）、Ｎ５ＫＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋ（国際公開第２００６／０３３３８６号に記載）、Ｎ５ＫＧ２ベクター（国際公開第２００３／０３３５３８号に記載）、トランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）などを用いることができる。
　動物細胞用発現ベクターのプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーター［J. Biochem., 101, 1307 （1987）］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ
［Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987）］、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号明細書）または免疫グロブリンH鎖のプロモーター［Cell, 41, 479 （1985）］とエンハンサー［Cell, 33, 717（1983）］などを用いることができる。
　遺伝子組換え抗体の発現には、ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、細胞内における抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量の均衡性などの観点から、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の両遺伝子を搭載したベクター（タンデム型ベクター）［J. Immunol. Methods, 167, 271 （1994）］を用いるが、抗体Ｈ鎖とＬ鎖の各遺伝子を別々に搭載した複数のベクター（セパレート型ベクター）を組み合わせて用いることもできる。
　タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８［Hybridoma, 17, 559（1998）］、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６，００１，３５８号明細書）、Ｎ５ＫＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋ（国際公開第２００６／０３３３８６号に記載）、Ｎ５ＫＧ２ベクター（国際公開第２００３／０３３５３８号に記載）、Ｔｏｌ２トランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）などを用いる。
（３）キメラ抗体発現ベクターの構築
　（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクター内のヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードする遺伝子の各々の上流に、（１）で得られる非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを各々クローニングすることで、キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
　まず、非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨまたはＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを作製する。次に、作製したＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクター内のヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードする遺伝子の各々の上流に、それらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、キメラ抗体発現ベクターを構築する。
　また、非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることで、キメラ抗体発現ベクターを構築することもできる。
（４）ヒト化抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの作製
　ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして作製することができる。まず、（１）で得られる非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨまたはＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列をそれぞれ選択する。
　選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであればいずれのものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services（1991）］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるために、元の非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（６０％以上）を有するヒトＦＲのアミノ酸配列を選択する。
　次に、選択したヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、元の非ヒト抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を、抗体遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services（1991）］を考慮してＤＮＡ配列に変換することで、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのｃＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
　設計したｃＤＮＡ配列に基づき、１００～１５０塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応における反応効率および合成可能なＤＮＡ長の観点から、好ましくはＨ鎖およびＬ鎖に対し各々４～６本の合成ＤＮＡを設計する。また、可変領域全長の合成ＤＮＡを合成して用いることもできる。
　さらに、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターに、容易にヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（１）に記載の方法と同様の方法により塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（５）ヒト化抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
　ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［BIO/TECHNOLOGY, 9, 266（1991）］。そのため、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列のうち、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体の立体構造を維持し間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下したヒト化抗体の抗原結合活性を上昇させることができる。　
　抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［J. Mol. Biol., 112, 535（1977）］またはコンピューターモデリング［Protein Engineering, 7, 1501（1994）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築および解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで、必要な抗原結合活性を有する改変ヒト化抗体を取得できる。
　ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変することができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について、（１）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的とする改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト化抗体発現ベクターの構築
　（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築したヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。
　例えば、（４）および（５）で得られるヒト化抗体のＶＨまたはＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクター内のヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードする各遺伝子の上流に、それらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
（７）ヒト抗体発現ベクターの構築
　ヒト抗体を産生する動物を被免疫動物として用いて、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立した場合には、（１）において、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列を得ることができる。そこで、（２）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、（１）で得たヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることで、ヒト抗体発現ベクターを構築することができる。
（８）遺伝子組換え抗体の一過性発現
　（３）、（６）および（７）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクター、またはそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体を一過性に発現させ、得られた多種類の遺伝子組換え抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
　発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えばＣＯＳ－７細胞［American Type Culture Collection（ATCC）番号：CRL1651］を用いる。ＣＯＳ－７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ－デキストラン法［Methods in Nucleic Acids Res., CRC press（1991）］、またはリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413（1987）］などを用いる。
　発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性を、酵素免疫抗体法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press（1996）、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを用いて測定する。　
（９）遺伝子組換え抗体の安定的発現株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
　（３）、（６）および（７）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定的に発現する形質転換株を得ることができる。
　宿主細胞への発現ベクターの導入としては、例えば、エレクトロポレーション法［日本国特開平２－２５７８９１号公報、Cytotechnology, 3, 133（1990）］、カルシウムイオン方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などが挙げられる。また、後述の動物に遺伝子を導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、ＥＳ細胞にエレクトロポレーションやリポフェクション法を用いて遺伝子を導入する方法、および核移植法などが挙げられる。
　遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５８０）、チャイニーズハムスターＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）、ＤＵＫＸＢ１１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ　Ｎｏ．１１６１９）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）が欠損したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞）［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216（1980）］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３細胞［Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55（1986）］、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２）などを用いる。
　また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースの合成に関与する酵素などのタンパク質、Ｎ－グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などのタンパク質、または細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースのゴルジ体への輸送に関与するタンパク質などの活性が低下または欠失した宿主細胞、例えばα１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）などを用いることもできる。
　発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定的に発現する形質転換株を、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２－２５７８９１号公報）。
　動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０２培地（ジェイアールエイチ社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３２５培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）若しくはＨｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、またはこれらの培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。得られた形質転換株を培地中で培養することで、培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現、蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定することができる。また、ＤＨＦＲ増幅系（日本国特開平２－２５７８９１号公報）などを利用して、形質転換株の産生する遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。
　遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press（1996）、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過など、タンパク質の精製で用いられる方法を組み合わせて精製することもできる。
　精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖または抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Nature, 227, 680（1970）］、またはウェスタンブロッティング法［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press（1996）、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（1988）］など用いて測定することができる。 
３．バイスペシフィック抗体の設計
　本発明のバイスペシフィック抗体は、Ｎ末端側ポリペプチドとＩｇＧ部分とをそれぞれ設計し、それらを連結させたバイスペシフィック抗体を設計することによって作製することができる。
３－１．ＩｇＧ部分の設計
　ＩｇＧ部分は、上記１．に記載の方法を用いてモノクローナル抗体を取得し、各抗体のＣＤＲおよび可変領域のｃＤＮＡ配列を上記２．に記載の方法を用いて決定し、抗体のＣＤＲまたは可変領域を含むＩｇＧ部分を設計することにより得ることができる。
３－２．Ｎ末端側ポリペプチドの設計
　Ｎ末端側ポリペプチドに、抗体のＣＤＲまたは可変領域が含まれる場合、上記１．および２．に記載の方法で、抗体のＣＤＲまたは可変領域のＤＮＡ配列を決定し、それらを含むＮ末端側ポリペプチドを設計することによって作製することができる。このようなＮ末端側ポリペプチドとしては、ｓｃＦｖなどのようにＶＨとＶＬを直接もしくは適当なリンカーを介して結合させた１本鎖のもの、ＦａｂおよびｄｓＦｖなどのように２本鎖で発現させ、発現後にＳ－Ｓ結合するよう設計したもの、またはＶＨＨなども用いることができる。Ｎ末端側ポリペプチドの抗原結合活性は、上記方法で評価し、抗原結合活性を保持しているものを選択することができる。　
４．バイスペシフィック抗体の作製
４－１．軽鎖共通型バイスペシフィック抗体の作製
　Ｎ末端側ポリペプチドがＦａｂであり、該ＦａｂとＩｇＧ部分の軽鎖が共通であるバイスペシフィック抗体は、具体的に以下のように作製することができる。
　Ｎ末端側ポリペプチドのＶＨ－ＣＨ１とＩｇＧ部分のＶＨを連結したポリペプチドをコードするＤＮＡを合成すると共に、各抗体のＶＬをコードするＤＮＡを合成し、これらのＤＮＡを上記２．（２）に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクターに組み込み、当該バイスペシフィック抗体を発現させることで、作製することができる。ＩｇＧ部分とＮ末端側ポリペプチドがリンカーを介して結合している場合、そのリンカー配列をコードするＤＮＡも含めて合成する。
４－２．Ｎ末端側ポリペプチドにＣＤＲを含む、軽鎖非共通型バイスペシフィック抗体の作製
（１）Ｎ末端側ポリペプチドがＦａｂである軽鎖非共通型バイスペシフィック抗体は、具体的に以下のように作製することができる。
　Ｎ末端側ポリペプチドのＶＬ－ＣＬとＩｇＧ部分のＶＨを連結したポリペプチドをコードするＤＮＡ、Ｎ末端側ポリペプチドのＶＨ－ＣＨ１をコードするＤＮＡ、およびＩｇＧ部分のＶＬをコードするＤＮＡを合成し、これらのＤＮＡを上記２．（２）に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクターに組み込み、当該バイスペシフィック抗体を発現させることで、作製することができる。ＩｇＧ部分とＮ末端側ポリペプチドがリンカーを介して結合している場合、そのリンカー配列をコードするＤＮＡも含めて合成する。
（２）Ｎ末端側ポリペプチドがＶＨＨであるバイスペシフィック抗体は、具体的には以下のように作製することができる。
　ＶＨＨとＩｇＧ部分のＶＨを連結したポリペプチドをコードするＤＮＡ、およびＩｇＧ部分のＶＬをコードするＤＮＡを合成し、これらのＤＮＡを上記２．（２）に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクターに組み込み、当該バイスペシフィック抗体を発現させることで、作製することができる。該ＶＨＨとＩｇＧ部分がリンカーを介して結合している場合、そのリンカー配列をコードするＤＮＡも含めて合成する。
（３）Ｎ末端側ポリペプチドがｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＣＤＲを含む上記（１）、（２）以外のポリペプチドであるバイスペシフィック抗体は、具体的には以下のように作製することができる。
　Ｎ末端側ポリペプチドが１本鎖の場合は、Ｎ末端側ポリペプチドをコードするＤＮＡとＩｇＧ部分のＶＨをコードするＤＮＡとを連結したＤＮＡを合成する。Ｎ末端側ポリペプチドが２つの一本鎖ポリペプチドからなる会合体の場合は、Ｎ末端側ポリペプチドを構成する一方の一本鎖ポリペプチドを、ＩｇＧ部分のＶＨをコードするＤＮＡと連結して合成するとともに、Ｎ末端側ポリペプチドを構成するもう一方の本鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡも合成する。また、ＩｇＧ部分のＶＬをコードするＤＮＡも合成する。ＩｇＧ部分とＮ末端側ポリペプチドがリンカーを介して結合している場合、そのリンカー配列をコードするＤＮＡも含めて合成する。これらのＤＮＡを上記２．（２）に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクターに組み込み、当該バイスペシフィック抗体を発現させることで、作製することができる。
４－３．Ｎ末端側ポリペプチドが上記以外であるバイスペシフィック抗体の作製
　Ｎ末端側ポリペプチドが上記以外のポリペプチドである場合、本発明のバイスペシフィック抗体は具体的には以下のように作製することができる。
　Ｎ末端側ポリペプチドが1本鎖の場合は、Ｎ末端側ポリペプチドをコードするＤＮＡとＩｇＧ部分のＶＨをコードするＤＮＡとを連結したＤＮＡを合成する。Ｎ末端側ポリペプチドが２本以上の一本鎖ポリペプチドからなる会合体の場合は、Ｎ末端側ポリペプチドを構成するうちの1本の一本鎖ポリペプチドを、ＩｇＧ部分のＶＨをコードするＤＮＡと連結して合成するとともに、Ｎ末端側ポリペプチドを構成する残りの一本鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡも合成する。また、ＩｇＧ部分のＶＬをコードするＤＮＡも合成する。ＩｇＧ部分とＮ末端側ポリペプチドがリンカーを介して結合している場合、そのリンカー配列をコードするＤＮＡも含めて合成する。これらのＤＮＡを上記２．（２）に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクターに組み込み、当該バイスペシフィック抗体を発現させることで、作製することができる。
　これらのＤＮＡを上記２．（２）に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクターに組み込み、当該バイスペシフィック抗体を発現させることで、作製することができる。ＩｇＧ部分とＮ末端側ポリペプチドがリンカーを介して結合している場合、そのリンカー配列をコードするＤＮＡも含めて合成する。
　抗原結合部位は、上記１．に記載のハイブリドーマを用いた方法の他、Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ法、Ｙｅａｓｔ　ｄｉｓｐｌａｙ法などの技術により単離し、取得することが出来る［Emmanuelle Laffy et al., Human Antibodies 14, 33-55, （2005）］。
　また、複数のＶＨと単一のＶＬから成るバイスペシフィック抗体（軽鎖共通型バイスペシフィック抗体ともいう）を作製する場合には、バイスペシフィック抗体に含まれる各抗原結合部位が各々の特異的抗原に反応するように、ファージディスプレイ法等を用いたスクリーニングを行い、単一のＶＬに最も適した各々のＶＨを選択する。
　具体的には、まず、上記１．に記載の方法を用いて、第１の抗原で動物を免疫してその脾臓からハイブリドーマを作製し、第１の抗原結合部位をコードするＤＮＡ配列をクローニングする。次に、第２の抗原で動物を免疫して、その脾臓からｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーからＰＣＲによりＶＨのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを取得する。
　続いて、第２の抗原の免疫で得られたＶＨと第１の抗原結合部位のＶＬとを連結したｓｃＦｖを発現するファージライブラリーを作製し、該ファージライブラリーを用いたパニングにより、第２の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖを提示したファージを選択する。選択したファージから、第２の抗原結合部位のＶＨのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をクローニングする。
　さらに、Ｎ末端側ポリペプチドがＦａｂの場合は、第１の抗原結合部位のＶＨと第２の抗原結合部位のＶＨとを、ＣＨ１またはＣＨ１およびリンカーが連結してなるポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計し、該ＤＮＡ配列と単一のＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とを、例えば上記２．（２）に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクターに挿入することにより、本発明のバイスペシフィック抗体の発現ベクターを構築することができる。
５．本発明のバイスペシフィック抗体またはその抗体断片の活性評価
　精製したバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。
　ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方を発現した細胞株に対する本発明のバイスペシフィック抗体の結合活性は、前述の１．（７）記載のバインディングアッセイ系を用いて測定することができる。
　ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方を発現した細胞に対するＣＤＣ活性、またはＡＤＣＣ活性は公知の測定方法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373（1993）］により測定することができる。
　本発明のバイスペシフィック抗体の抗細胞活性（増殖阻害活性ともいう）は次の方法で測定することができる。例えば、細胞を９６穴プレートに播種し、抗体を添加して一定期間培養した後に、ＷＳＴ－８試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を反応させ、プレートリーダーにより４５０ｎｍの吸光度を測定することにより、細胞の生存率を測定する。
　ＴｆＲまたはＥＧＦＲ等の細胞表面抗原から細胞内へのシグナル伝達は、細胞内のタンパク質のリン酸化をウェスタンブロットなどにより検出することにより評価することができる。
６．本発明のバイスペシフィック抗体またはその抗体断片を用いた疾患の治療方法
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片は、ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患、好ましくはＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の発現細胞が関与する疾患の治療に用いることができる。ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患としては、例えば、悪性腫瘍およびがんなどが挙げられる。
　悪性腫瘍およびがんとしては、例えば、大腸がん、結腸直腸がん、肺がん、乳がん、グリオーマ、悪性黒色腫（メラノーマ）、甲状腺がん、腎細胞がん、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃がん、膵臓がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、卵巣がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、頭頚部がん、扁平上皮癌、皮膚がん、尿路がん、膀胱がん、前立腺がん、絨毛がん、咽頭がん、喉頭がん、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、膠芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫およびウィルムス腫瘍などが挙げられる。
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する治療薬は、有効成分としての該抗体若しくは該抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
　投与経路としては、例えば、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内若しくは静脈内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏またはテープ剤などが挙げられる。各種製剤は、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、浸潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、着色料、香味剤、および安定化剤などを用いて常法により製造することができる。
　賦形剤としては、例えば、乳糖、果糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット、結晶セルロース、滅菌水、エタノール、グリセロール、生理食塩水および緩衝液などが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、澱粉、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、炭酸マグネシウムおよび合成ケイ酸マグネシウムなどが挙げられる。
　結合剤としては、例えば、メチルセルロースまたはその塩、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースおよびポリビニルピロリドンなどが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコールおよび硬化植物油などが挙げられる。
　安定化剤としては、例えば、アルギニン、ヒスチジン、リジン、メチオニンなどのアミノ酸、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストラン４０、メチルセルロース、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウムなどが挙げられる。
　その他の添加剤としては、例えば、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硝酸ソーダおよびリン酸ナトリウムなどが挙げられる。
　経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などが挙げられる。
　乳剤またはシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール若しくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油若しくは大豆油などの油類、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、またはストロベリーフレーバー若しくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造される。　
　カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトールなどの賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、またはグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造される。
　非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤または噴霧剤などが挙げられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、またはその両者の混合物からなる担体などを用いて製造される。
　座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて製造される。噴霧剤は、受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造される。担体としては、例えば、乳糖またはグリセリンなどが挙げられる。また、エアロゾルまたはドライパウダーとして製造することもできる。さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
　本発明のバイスペシフィック抗体の有効量と適切な希釈剤および薬理学的に使用し得るキャリアとの組合せとして投与される有効量は、１回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ～１００ｍｇであり、２日から８週間間隔で投与される。
７．本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いた疾患の診断方法
　本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いて、ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方が発現した細胞を検出または測定することにより、ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患、好ましくはＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の発現細胞が関与する疾患を診断することができる。
　ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患である悪性腫瘍またはがんの診断は、例えば、以下のようにＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方を検出または測定して行うことができる。
　まず、複数の健常者の生体から採取した生体試料について、本発明のバイスペシフィック抗体若しくは該バイスペシフィック抗体断片、またはこれらの誘導体を用い、下記の免疫学的手法を用いて、ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方の検出または測定を行い、健常者の生体試料中のＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方の存在量を調べる。
　次に、被験者の生体試料中についても同様にＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方の存在量を調べ、その存在量を健常者の存在量と比較する。被験者のＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方の存在量が健常者と比較して増加している場合には、該被験者はがんであると診断される。その他のＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患の診断についても、同様の方法で診断できる。
　免疫学的手法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。例えば、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウェスタンブロット法または物理化学的手法などが挙げられる。
　放射性物質標識免疫抗体法としては、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明のバイスペシフィック抗体または該抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法が挙げられる。
　酵素免疫測定法としては、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を反応させ、さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法が挙げられる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。
　酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知の酵素標識［酵素免疫測定法、医学書院（１９８７）］を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、またはビオチン標識などを用いる。
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出または測定対象である抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。該ＥＬＩＳＡ法では、検出または測定したい抗原に結合する抗体または抗体断片であって、抗原結合部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、第１の抗体または抗体断片をあらかじめプレート（例えば、９６穴プレート）に吸着させ、次に第２の抗体または抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、またはビオチンなどで標識しておく。上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された細胞若しくはその破砕液、組織若しくはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、または眼液などを反応させた後、標識した抗体または抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知の抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出する。
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ）２などの抗体断片を用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープに結合するモノクローナル抗体または該抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体またはその抗体断片との組み合わせでもよい。
　蛍光免疫測定法としては、例えば、文献［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition,Academic Press（1996）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などに記載された方法で測定する。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、公知の蛍光標識［蛍光抗体法、ソフトサイエンス社（１９８３）］を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣまたはＲＩＴＣなどを用いる。
　発光免疫測定法としては、例えば、文献［生物発光と化学発光　臨床検査４２、廣川書店（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、公知の発光体標識が挙げられ、例えば、アクリジニウムエステルまたはロフィンなどを用いる。
　ウェスタンブロット法としては、抗原または抗原を発現した細胞などをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）－ＰＡＧＥ［Antibodies - A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory（1988）］で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原に結合する抗体または抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、またはビオチン標識などを施した抗ＩｇＧ抗体またはその抗体断片を反応させた後、該標識を可視化することによって測定する。一例を以下に示す。
　まず、所望のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞や組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりのタンパク量として０．１～３０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により泳動する。次に、泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし１～１０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳと表記する）に室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。ここで本発明のバイスペシフィック抗体を反応させ、０．０５～０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳ）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム社製）などを用いて該抗体が結合したバンドを検出することにより、抗原を検出する。ウェスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体が用いられる。
　物理化学的手法としては、例えば、抗原であるＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方と本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片とを結合させることにより、凝集体を形成させて、該凝集体を検出する。この他に物理化学的手法として、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法またはラテックス免疫比濁法［臨床検査法提要、金原出版（１９９８）］などを用いることもできる。
　ラテックス免疫比濁法では、抗体または抗原を感作させた粒径０．１～１μｍ程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原または抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度または積分球濁度として検出することにより、被験サンプル中の抗原濃度などを測定する。
　一方、ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方が発現している細胞の検出または測定には、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、好ましくは免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法または蛍光抗体染色法などを用いる。
　免疫沈降法としては、ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方を発現した細胞などを本発明のバイスペシフィック抗体またはその抗体断片と反応させた後、プロテインＧセファロースなどのイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて、抗原抗体複合体を沈降させる。
　または、以下のような方法によっても行なうことができる。まず、ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートに本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を固相化した後、ＢＳＡ－ＰＢＳによりブロッキングする。次に、ＢＳＡ－ＰＢＳを捨てＰＢＳでよく洗浄した後、ＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方を発現している細胞や組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより、免疫沈降物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで抽出し、上記のウェスタンブロッティングにより検出する。
　免疫細胞染色法または免疫組織染色法とは、抗原を発現した細胞または組織などを、場合によっては抗体の透過性を良くするために界面活性剤やメタノールなどで処理した後、本発明のバイスペシフィック抗体と反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識またはビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体またはその結合断片と反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡する方法である。また、蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フローサイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］により検出を行うことができる。特に、本発明のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片は、蛍光抗体染色法により、細胞膜上に発現しているＴｆＲおよびＥＧＦＲ等の細胞表面抗原の少なくとも一方を検出することができる。
　また、蛍光抗体染色法のうち、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いた場合には、形成された抗体－抗原複合体と、抗体－抗原複合体の形成に関与していない遊離の抗体または抗原とを分離することなく、抗原量または抗体量を測定することができる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］可溶性ヒトおよびサルＴｆＲ抗原ならびに可溶性ヒト、サルＥＧＦＲ抗原の調製１．ヒトＴｆＲおよびサルＴｆＲの可溶性抗原の調製
　Ｎ末端にＦＬＡＧ－Ｆｃが付加されたヒトおよびサルＴｆＲの細胞外ドメインタンパク質をそれぞれ以下に記載する方法で作製した。ヒトＴｆＲ細胞外ドメインをコードする塩基配列を配列番号１に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２に、サルＴｆＲ細胞外ドメインをコードする塩基配列を配列番号３に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号４に示す。
（１）ＦＬＡＧ－Ｆｃ－ヒトＴｆＲおよびＦＬＡＧ－Ｆｃ－サルＴｆＲベクターの作製
　ヒトＴｆＲ遺伝子配列（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００３２３４．２、配列番号５；該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号６に示す）を基に配列番号１で示される塩基配列からなるヒトＴｆＲの細胞外ドメインの遺伝子断片を合成した。
　ＦＬＡＧ－ｔａｇおよびヒトＩｇＧのＦｃ領域を含むＩＮＰＥＰ４ベクター（Ｂｉｏｇｅｎ－ＩＤＥＣ社製）を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで消化し、配列番号１で示される塩基配列挿入して、ＦＬＡＧ－Ｆｃ－ヒトＴｆＲ発現ベクターを作製した。
　同様の方法で、サルＴｆＲの遺伝子配列（配列番号７；該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号８に示す）を基に配列番号３で示される塩基配列からなるサルＴｆＲの細胞外ドメインの遺伝子断片を含むＦＬＡＧ－Ｆｃ－サルＴｆＲ発現ベクターを作製した。
（２）ＦＬＡＧ－Ｆｃ－ヒトＴｆＲおよびＦＬＡＧ－Ｆｃ－サルＴｆＲタンパク質の作製　ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）　２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて、１－（１）で作製したＦＬＡＧ－Ｆｃ－ヒトＴｆＲ発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入して培養し、一過性発現系でタンパク質を発現させた。ベクター導入５日後に培養上清を回収し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過した。
　この培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥヘルスケア社製）を用いてアフィニティー精製を行った。プロテインＡに吸着させた抗体を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水［Ｄ－ＰＢＳ（－）　ｗｉｔｈｏｕｔ　Ｃａ　ａｎｄ　Ｍｇ，ｌｉｑｕｉｄ；以下Ｄ－ＰＢＳ（－）と記載する。ナカライテスク社製］にて洗浄し、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）により溶出して、２ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を含むチューブに回収した。
　次に、ＶＩＶＡＳＰＩＮ（Ｓａｒｔｒｉｕｓ　ｓｔｅａｌｉｎ社製）を用いた限外ろ過により、Ｄ－ＰＢＳ（－）に置換した後、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターＭｉｌｌｅｘ－Ｇｖ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）でろ過滅菌し、ＦＬＡＧ－Ｆｃ－ヒトＴｆＲタンパク質を作製した。同様の方法で、１－（１）で作製したＦＬＡＧ－Ｆｃ－サルＴｆＲ発現ベクターを用い、ＦＬＡＧ－Ｆｃ－サルＴｆＲタンパク質を作製した。取得したタンパク質の濃度は、波長２８０ｎｍの吸光度を測定して、各タンパク質のアミノ酸配列から推定される吸光係数を用いて算出した。
２．ヒトＥＧＦＲおよびサルＥＧＦＲの可溶性抗原の調製
　Ｃ末端にＦＬＡＧ－ＦｃまたはＧＳＴが付加されたヒトまたはサルＥＧＦＲの細胞外ドメインタンパク質をそれぞれ以下に記載する方法で作製した。ヒトＥＧＦＲのシグナル配列および細胞外ドメインをコードする塩基配列を配列番号９に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１０に、サルＥＧＦＲのシグナル配列および細胞外ドメインをコードする塩基配列を配列番号１１に、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
　ヒトＥＧＦＲ遺伝子配列（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００５２２８．４、配列番号１３；該遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号１４に示す）を基に配列番号９で示される塩基配列からなるヒトＥＧＦＲの細胞外ドメインの遺伝子断片を合成した。同様にして配列番号１１で示される塩基配列からなるサルＥＧＦＲの細胞外ドメインの遺伝子断片を合成した。１－（１）および（２）に記載の方法と同様にして、ヒトおよびサルＥＧＦＲ－ＦＬＡＧ－Ｆｃタンパク質ならびにヒトおよびサルＥＧＦＲ-ＧＳＴタンパク質をそれぞれ得た。
　取得したタンパク質の濃度は、波長２８０ｎｍの吸光度を測定して、各タンパク質のアミノ酸配列から推定される吸光係数を用い算出した。
［実施例２］ヒト又はサルＴｆＲ膜発現ＣＨＯ細胞の作製
　ｐＫＡＮＴＥＸ（米国特許第６４２３５１１号明細書に記載）に配列番号５に示すヒトＴｆＲ遺伝子をクローニングし、膜発現用ヒトＴｆＲ発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ヒトＴｆＲ　ｆｕｌｌを得た。
　取得した発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ヒトＴｆＲ　ｆｕｌｌをＣＨＯ細胞に導入して培養し、一過性発現系でタンパク質を発現させた。遺伝子導入後、シングルセルクローニングし、ヒトＴｆＦＲ／ＣＨＯ細胞を得た。
　同様の方法で配列番号７に示すサルＴｆＲ遺伝子をクローニングし、サルＴｆＲ／ＣＨＯ細胞を得た。
　Ｃａｒｂｌｘｙｌ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｓｕｃｃｉｎｉｎｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ（ＣＦＳＥ）染色された細胞の調製は以下の方法でおこなった。ヒトＴｆＦＲ／ＣＨＯ細胞、サルＴｆＲ／ＣＨＯ細胞を０．０２％ＥＤＴＡ－ＰＢＳ（ナカライテスク社）で剥離して回収した後、ＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を最終濃度が０．２μＭになるように添加して室温で１０分間反応させた後、１０％ウシ胎仔血清含有Ｄ－ＰＢＳ（－）（ナカライテスク社）を添加して３７℃で１０分間インキュベートした。反応後の細胞を遠心分離した後、０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３を含有した１％ＢＳＡ－ＰＢＳ（ナカライテスク社）で洗浄した。得られたＣＦＳＥ染色細胞はセルバンカー１（日本全薬工業社）にて凍結保存した。
［実施例３］ヒト抗体産生動物への免疫
　ヒトＴｆＲ、ヒトＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体を取得するために、ヒト抗体産生動物にアジュバントで混合したＦＬＡＧ－Ｆｃ－ヒトＴｆＲ、ヒトＥＧＦＲ－ＦＬＡＧ－Ｆｃを計４～５回免疫した。被免疫動物から血清を回収し、ヒトＴｆＲ、ヒトＥＧＦＲに対する結合活性をＥＬＩＳＡにより解析し、抗体価が上がっていることを確認した。
［実施例４］抗ＴｆＲ抗体の取得
１．軽鎖がＡ２７のＴｆＲ免疫ヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリーの作製
　免疫動物から得られた脾臓細胞または末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｕｌｅａｒ　ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）からＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを抽出し、ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）にてｃＤＮＡを増幅し、さらにＰＣＲにてＶＨ遺伝子断片を増幅させた。該ＶＨ遺伝子断片およびヒトの抗体ｇｅｒｍ－ｌｉｎｅ配列であり、配列番号１５で示される塩基配列からなるＡ２７配列をファージミドｐＣＡＮＴＡＢ　５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に挿入し、大腸菌ＴＧ１（Ｌｕｃｉｇｅｎ社製）を形質転換してプラスミドを得た。
　なお、Ａ２７配列は配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなる、ヒト抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードしており、該ＶＬのＣＤＲ１、２および３（それぞれＬＣＤＲ１、２および３とも表す）のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１７、１８および１９で示される。
　得られたプラスミドをＶＣＳＭ１３　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｈｅｌｐｅｒ　Ｐｈａｇｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に感染させることで、Ａ２７配列からなるＶＬ遺伝子を有し、ＶＨ遺伝子がライブラリー化されたＴｆＲ免疫ヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリーを得た。
２．軽鎖がＡ２７の抗ＴｆＲモノクローナル抗体の取得
　このＴｆＲ免疫ヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリーを用いて、下記のファージディスプレイ法により、Ａ２７にコードされるＶＬを有する抗ＴｆＲモノクローナル抗体を取得した。
（１）タンパク質固層化チューブを用いたタンパク質パニング
　ヒトＴｆＲ（ＢＢＩ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）を固相化し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ　Ｂｌｏｃｋｉｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いてヒトＴｆＲが結合していない部位をブロックしたＭＡＸＩＳＯＲＰ　ＳＴＡＲＴＵＢＥ（ＮＵＮＣ社製）と、ヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリーを室温下で１～２時間反応させ、Ｄ－ＰＢＳ（－）および０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下ＰＢＳ－Ｔと記載する。和光純薬工業社製）でそれぞれ３回洗浄後に０．１ＭのＧｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）でファージを溶出し、溶出液を２ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で中和した。
（２）膜発現ヒトＴｆＲまたはサルＴｆＲ発現ＣＨＯ細胞パニング
　ＣＨＯ細胞にヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリーを氷上で３０分間反応させ、遠心分離により細胞を除いた上清を回収してＣＨＯ細胞と反応後のファージ溶液を調製した。このファージ液と、実施例１で取得したＣＦＳＥ染色されたヒトＴｆＲ／ＣＨＯを氷上で３０分間～１時間反応させた後、遠心分離により上清を除去した。５％ウシ胎仔血清、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１％ＮａＮ３を含有したＤ－ＰＢＳ（－）（以下ＳＭバッファーと記載する）で洗浄を複数回繰り返し行った後、１次抗体として抗Ｍ１３抗体（ＧＥヘルスケア社）を加えて氷上で３０分間反応させた。遠心分離により上清を除去し、ＳＭバッファーによる洗浄を複数回繰り返し行った後、２次抗体としてＡＰＣ標識Ｇｏａｔ抗ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を加えて氷上で３０分間反応させた。遠心分離により上清を除去し、ＳＭバッファーによる洗浄を複数回繰り返し行った後、７－ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ　Ｄ（ＡＡＤ）（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を添加し、氷上で１０分間反応させた後、フローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ　ＡｒｉａＩＩＩ）で７－ＡＡＤ陰性の生細胞画分かつＣＦＳＥ陽性の抗原発現細胞画分のソーティングをおこなった。なお、抗原発現細胞結合ファージの濃縮が確認できたラウンドにおいては上記に加えてさらにＡＰＣ陽性のファージ結合画分をソートした。ソートされた細胞から０．１ＭのＧｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）でファージを溶出し、溶出液を２ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で中和した。
　サル／ＣＨＯ細胞を用いた細胞パニングも同様の方法でおこなった。溶出したファージは、ＴＧ１コンピテントセルに感染させ、ファージを増幅した。上記（１）または（２）の操作を２回または３回繰り返し、ヒトＴｆＲに特異的に結合するｓｃＦｖを提示したファージを濃縮した。濃縮されたファージをＴＧ１に感染させ、ＳＯＢＡＧプレート（２．０％　トリプトン、０．５％　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、０．０５％　ＮａＣｌ、２．０％　グルコース、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍＬ　アンピシリン、１．５％　アガー）に播種してコロニーを形成させた。
　コロニーを植菌して培養後、ＶＣＳＭ１３　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｈｅｌｐｅｒ　Ｐｈａｇｅを感染させて、再度培養することで単クローンのファージを得た。得られた単クローンのファージを用いて、フローサイトメトリー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｇｕａｖａ　Ｅａｓｙ　Ｃｙｔｅ　ＨＴ）にてヒトおよびサルＴｆＲのいずれにも結合するクローンを選択した。
　フローサイトメトリーは、実施例２のヒトまたはサルＴｆＲ／ＣＨＯにファージクローンを加えておこなった。４℃下で３０分間反応させた後、各ウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。
　ＥＬＩＳＡは、単クローン化したファージのＴｆＲ反応性を確認するために行った。具体的には、抗原タンパク質を固相化した９６ウェルイムノプレート（Ｎｕｎｃ社）に、１０％ブロックエース（大日本製薬株式会社製）含有ＰＢＳ－Ｔで希釈したファージ溶液を添加し、室温で１時間反応させた後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗Ｍ１３抗体（ＧＥヘルスケア社製）を添加し、室温で１時間反応させることにより行った。プレートを、ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ＴＭＢ発色基質液（ＤＡＫＯ社製）を加え、室温下で反応させ、２ＮのＨＣｌ溶液を加えて発色反応を止め、波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をプレートリーダー（Ｅｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で測定した。
　ヒトおよびサルＴｆＲのいずれにも結合したクローンについて、配列解析を行い、Ａ２７にコードされるＶＬを有する抗ＴｆＲ抗体を取得した。表１に、取得したそれぞれの抗ＴｆＲ抗体のＶＨをコードする全塩基配列および当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列、およびＶＨのＣＤＲ１～３（以下ではＨＣＤＲ１～３と記載することもある）のアミノ酸配列の配列番号を示す。なお、表中の「―」は配列情報を記載していないことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
３．軽鎖がＡ２７以外の抗ＴｆＲ抗体の取得
（１）細胞融合によるハイブリドーマ作製
　マウスミエローマ細胞株　Ｐ３－Ｕ１（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１５９７）をエスクロンクローニングメディウム（エーディア社）で培養して無血清馴化したのち、細胞融合の親株として用いた。被免疫動物の脾臓を無菌的に採取しＲＥＤ　ＢＬＯＯＤ　ＣＥＬＬ　ＬＹＳＩＮＧ　ＢＵＦＦＥＲ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で溶血後、ＰＢＳで２回洗浄し、脾細胞とＰ３－Ｕ１の細胞数が、脾臓細胞：Ｐ３－Ｕ１＝８：１になるよう混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した。
　得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら３７℃にて１ｇのポリエチレングリコール－１０００（ＰＥＧ－１０００、純正化学社）、１ｍＬのＭＥＭ培地（ナカライテスク社）および０．３５ｍＬのジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）の混液を０．５ｍＬ加え、そこに１分間毎に１ｍＬのＭＥＭ培地を５回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにした。
　細胞懸濁液を遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）し、得られた沈澱画分の細胞をゆるやかにほぐした後、ＨＡＴ　ＳＵＰＰＬＥＭＥＮＴ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加したエスクロンクローニングメディウムで脾臓細胞の濃度が１．５×１０７細胞／９ｍＬとなるように懸濁した。事前に９６ウェル培養用プレートにはＨＡＴ添加クローニングメディウムを１００μＬ／ウェルで分注しておき、そこへ細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルずつ分注し、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）で８～１０日間培養した。
（２）ハイブリドーマのスクリーニング
　ハイブリドーマ培養上清に含まれる抗体のＴｆＲへの結合活性をＥＬＩＳＡで評価した。被験サンプルにはハイブリドーマ培養上清を使用し、測定は上記２．（２）と同様の手順で実施した。
（３）ハイブリドーマのサブクローニング
　スクリーニングで陽性であったウェルの細胞についてサブクローニングを行い、クローニングメディウム中で約７～１０日間培養した。
（４）抗体可変領域遺伝子のクローニングと配列決定
　クローニングしたハイブリドーマからＲｎｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、５’－ＲＡＣＥ法により抗体遺伝子を増幅させた。ＲＡＣＥ用ｃＤＮＡの合成にはＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いた。増幅させた抗体可変領域断片を、ＴＯＰＯ　ＴＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングして該ＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。
　取得された抗ＴｆＲ抗体のうち、クローン２２３０の重鎖および軽鎖の可変領域をコードする塩基配列から推定されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５３および配列番号５４に示す。
４．取得した抗ＴｆＲ抗体を発現するベクターの構築
　取得した抗ＴｆＲ抗体の遺伝子が組み込まれた可溶性ＩｇＧの発現ベクターをそれぞれ作製した。まず、共通のＶＬをコードするＡ２７遺伝子をＮ５ＫＧ４ＰＥ（ＩＤＥＣ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）またはＮ５ＫＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋ（国際公開第２００６／０３３３８６号に記載）にサブクローニングした。
　その後、ＶＨ遺伝子をＮ５ＫＧ４ＰＥまたはＮ５ＫＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋにサブクローニングして、ヒトＩｇＧ４ＰＥの定常領域またはヒトＩｇＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋの定常領域をもつ抗ＴｆＲモノクローナル抗体の発現ベクターを得た。
　また、国際公開第２０１２／１５３７０７号に記載された、ＴｆＲ中和抗体である抗ＴｆＲモノクローナル抗体ＴｆＲ４３４およびＴｆＲ４３５を抗ＴｆＲ抗体の陽性対照抗体として使用するため、発現ベクターを作製した。ＴｆＲ４３４およびＴｆＲ４３５のＶＨのアミノ酸配列を配列番号５５および５６に、ＶＬのアミノ酸配列を配列番号５７にそれぞれ示す。
　ＴｆＲ４３５のＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を合成し、Ｎ５ＫＧ１ベクター（国際公開第２００３／０３３５３８号に記載）にサブクローニングして、ヒトＩｇＧ１の定常領域をもつ抗ＴｆＲモノクローナル抗体ＴｆＲ４３５の発現ベクターを得た。
　以降、モノクローナル抗体はクローン名で記載する。
［実施例５］細胞表面抗原に対する抗体の取得
（１）ＥＧＦＲ抗体の作製
１．ＥＧＦＲ免疫ヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリーの作製
　実施例４の１.と同様の方法により、Ａ２７配列からなるＶＬ遺伝子または抗ＴｆＲ抗体２２３０のＶＬ遺伝子を有し、ＶＨ遺伝子がライブラリー化されたＥＧＦＲ免疫ヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリーを得た。
２．抗ＥＧＦＲ抗体の取得
　実施例１で取得したヒトＥＧＦＲ－ＦｃまたはサルＥＧＦＲ－Ｆｃを固相化し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ　Ｂｌｏｃｋｉｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて抗原が結合していない部位をブロックしたＭＡＸＩＳＯＲＰ　ＳＴＡＲＴＵＢＥ（ＮＵＮＣ社製）と、ＥＧＦＲ免疫ヒト抗体Ｍ１３ファージライブラリーを用い、実施例４の２と同様の方法によりヒトＥＧＦＲ及びサルＥＧＦＲに特異的に結合するｓｃＦｖを提示したファージを単クローン化した。
　この操作を３回～５回繰り返し、ヒト及びサルＥＧＦＲ―Ｆｃに特異的に結合するｓｃＦｖを提示したファージを濃縮した。
　ヒト及びサルＥＧＦＲ－Ｆｃを特異的に認識するクローンの確認はＥＬＩＳＡ法でおこなった。ＥＬＩＳＡは、実施例１のヒトまたはサルＥＧＦＲ－Ｆｃを固相化し、実施例４と同様の方法でおこなった。
　ヒト及びサルＥＧＦＲのいずれにも結合したクローンの中から、アフィニティーがＣｅｔｕｘｉｍａｂと同等程度に高かった以下の３クローンを選択した。この３クローンの配列解析を行い、Ａ２７にコードされるＶＬを有する抗ＥＧＦＲ抗体を取得した。表１と同様の表示方法で、各抗ＥＧＦＲ抗体のＶＨの配列情報を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　同様に抗ＴｆＲ抗体２２３０と同じＶＬを有する抗ＥＧＦＲ抗体を取得した。取得された抗ＥＧＦＲ抗体のうち、クローンＫＭＥ０７、ＫＭＥ０９およびＫＭＥ１１の重鎖の可変領域をコードする塩基配列から推定されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７３、配列番号７４および配列番号７５に示す。
　取得した抗ＥＧＦＲ抗体の遺伝子が組み込まれた可溶性ＩｇＧの発現ベクターを実施例４と同様の方法で、それぞれ作製した。定常領域は、ヒトＩｇＧ４ＰＥまたはヒトＩｇＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋの定常領域を用いた。
　また、抗ＥＧＦＲ抗体の陽性対照抗体として、国際公開第１９９６／０４０２１０号に記載された抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体Ｃ２２５の可変領域をもつ抗体（以下Ｃｅｔｕｘｉｍａｂと記載する）を作製した。ＣｅｔｕｘｉｍａｂのＶＨのアミノ酸配列を配列番号７６に示す。また、ＣｅｔｕｘｉｍａｂのＶＬのアミノ酸配列を配列番号７７に示す。
　ＣｅｔｕｘｉｍａｂのＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を合成し、実施例４と同様の方法でＮ５ＫＧ１ベクターにサブクローニングし、ヒトＩｇＧ１の定常領域をもつＣｅｔｕｘｉｍａｂの発現ベクターを得た。
（２）抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３抗体の作製
　国際公開第２０１２／１４５４６９号に記載された抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３モノクローナル抗体ＨＮ３の可変領域をもつ抗体を作製した。ＨＮ３のＶＨのアミノ酸配列を配列番号７８に示す。ＨＮ３のＶＨをコードする遺伝子を合成し、実施例４と同様の方法で、Ｎ５ＫＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋにサブクローニングし、ヒトＩｇＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋの定常領域をもつ抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３モノクローナル抗体ＨＮ３の発現ベクターを得た。
［実施例６］ＴｆＲおよび細胞表面抗原に結合するバイスペシフィック抗体の発現ベクターの構築
　図１（Ａ）に記載する構造を有する、ヒト及びサルＴｆＲならびにヒト及びサルＥＧＦＲに結合するバイスペシフィック抗体を以下の方法で作製した。図１（Ａ）～（Ｃ）において、Ｎ末端側ポリペプチドに含まれるＶＨをＶＨ１、Ｃ末端側のＩｇＧ部分に含まれるＶＨをＶＨ２という。バイスペシフィック抗体の形状には国際公開第２００９／１３１２３９号に記載の形状を採用した。
　ＶＨ１およびＶＨ２は実施例４もしくは実施例５で得られた抗体のＶＨのいずれかであり、ＶＨ１とＶＨ２は異なる抗原に対する抗体のＶＨである。
　以下の記載では、Ｎ末端側ポリペプチドとＩｇＧ型抗体がリンカーを介して結合している場合、該リンカーのアミノ酸配列をコードする遺伝子をリンカー遺伝子と称する。
　以下の工程で作製されるバイスペシフィック抗体のリンカー配列としては、ＩｇＧ４のヒンジ領域の一部（ＥＳ（配列番号７９）、ＥＳＫＹＧ（配列番号８０）およびＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号８１）など）を連結させたもの、あるいはＧＳリンカー（ＧＧＧＧＳ（配列番号８２）やＧＧＧＧＳの3回繰り返し配列）を用いた。また、ＩｇＧ部分の重鎖定常領域として、ＩｇＧ４ＰＥまたは国際公開第２００６／０３３３８６号記載のＩｇＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋの重鎖定常領域（塩基配列を配列番号８３、アミノ酸配列を配列番号８４で示す）を用いた。
　以降、抗ＥＧＦＲ抗体の可変領域をＮ末端側ポリペプチドに含み、抗ＴｆＲ抗体の可変領域をＩｇＧ部分に含むバイスペシフィック抗体をＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体と記載する。また、例えば抗ＥＧＦＲ抗体Ｅ１２の可変領域および、抗ＴｆＲ抗体ＴｆＲ１０７１の可変領域を含むＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体をＥ１２－ＴｆＲ１０７１と記載する。同様に、抗ＴｆＲ抗体の可変領域をＮ末端側ポリペプチドに含み、抗ＥＧＦＲ抗体の可変領域をＩｇＧ部分に含むバイスペシフィック抗体をＴｆＲ－ＥＧＦＲバイスペシフィック抗体と記載する。
　また、例えば抗ＴｆＲ抗体ＴｆＲ１０７１の可変領域および抗ＥＧＦＲ抗体Ｅ１２の可変領域を含むＴｆＲ－ＥＧＦＲバイスペシフィック抗体をＴｆＲ１０７１－Ｅ１２と記載する。Ｎ末端側ポリペプチドとＩｇＧ部分の間にリンカーを有する抗体を、ＥＧＦＲ－リンカー－ＴｆＲバイスペシフィック抗体と記載する。
　また、例えば抗ＥＧＦＲ抗体Ｅ０８の可変領域、抗ＴｆＲ抗体ＴｆＲ１０７１の可変領域およびリンカーとしてＥＳを有するＥＧＦＲ－リンカー－ＴｆＲバイスペシフィック抗体を、Ｅ０８－ＥＳ－ＴｆＲ１０７１と記載する。なお、本表記方法においては、ＧＳリンカー（配列番号８２）はＧＳ、ＧＳリンカーを三回繰り返した配列はＧＳ３と記載する。
　当該バイスペシフィック抗体の名称、構造、リンカー、当該抗体作製に使用した抗ＴｆＲ抗体のクローン名および細胞表面抗原に対する抗体のクローン名を表３に示す。なお、表中の「－」はリンカーを使用しておらず該当する配列がないことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
１．軽鎖共通型バイスペシフィック抗体の発現ベクターの作製
　表３に記載されたバイスペシフィック抗体のうち、図１（Ａ）に示す軽鎖共通型バイスペシフィック抗体発現ベクターを以下に記載する方法で作製した。
　まず、共通のＶＬをコードするＡ２７遺伝子をＮ５ＫＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋ（国際公開第２００６／０３３３８６号に記載）にサブクローニングした。
　その後、ヒトＩｇＧ４のＣＨ１と同じアミノ酸配列をコードし使用コドンを変更した遺伝子（配列番号８５）を鋳型として、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、ＰＣＲにより該遺伝子断片を増幅させた。同様の方法で、実施例４または実施例５で取得した抗体のＶＨ遺伝子を鋳型として、ＶＨ２部分の遺伝子断片を増幅させた。
この二つの遺伝子断片を実施例４または実施例５で取得した抗体の発現ベクターのＶＨ１とＩｇＧ部分のＣＨ１の間にサブクローニングして、バイスペシフィック抗体発現ベクターを得た。
２．軽鎖非共通型バイスペシフィック抗体の発現ベクターの作製
　表３に記載されたバイスペシフィック抗体のうち、軽鎖非共通型バイスペシフィック抗体について、発現ベクターを以下に記載する方法で作製した。
　図１（Ｂ）に示す抗体は１種類のベクターで構成される。まず、ＶＬをコードするＡ２７遺伝子をヒトＩｇＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋの定常領域をコードする塩基配列を含むｐＣＩ－ＯｔＣＡＧ－Ｇ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋベクターにサブクローニングした。
　本ベクターをｐＣＩ－Ａ２７と記載する。ｐＣＩ－ＯｔＣＡＧ＿ｈＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋベクターが有する定常領域配列は、ヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域のＥＵ－ｉｎｄｅｘにおける２２８番目のＳｅｒ残基をＰｒｏに、２３５番目のＬｅｕ残基をＧｌｕに、および４０９番目のＡｒｇ残基をＬｙｓにそれぞれ置換したＩｇＧ４変異体［以下、ＩｇＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋ（国際公開第２００６／０３３３８６号）と記載する］の重鎖定常領域である。
　なおこれらのベクターは、Ｐｒｏｍｅｇａ社ｐＣＩベクターを共通主骨格としてヒト抗体遺伝子を発現させるために必要な制限酵素サイトを導入し、全合成によって作製されたベクターである。
　その後、実施例５で取得した抗体のＶＨ遺伝子、リンカーがある場合にはリンカーの遺伝子、実施例４で取得した抗ＴｆＲ抗体のＶＨ遺伝子を連結したポリペプチドの塩基配列を全合成したものをｐＣＩ－Ａ２７にサブクローニングして、発現ベクターを得た。
［実施例７］ＴｆＲに結合するモノクローナル抗体、細胞表面抗原に結合するモノクローナル抗体およびバイスペシフィック抗体の調製
　実施例４から実施例６で抗体発現ベクターにサブクローニングした抗ＴｆＲモノクローナル抗体、細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体、および両抗原に対する結合部位を有するバイスペシフィック抗体を下記の方法でそれぞれ発現させ、精製した。
　抗体発現ベクターをＥｘｐｉ２９３（商標）　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）によりＥｘｐｉ２９３細胞に共遺伝子導入し、１２～１６時間後にＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｅｎｈａｎｃｅｒを添加して、一過性発現系で抗体またはバイスペシフィック抗体を発現させた。
　ベクター導入４～７日後に培養上清を回収し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）で濾過した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ、ＧＥヘルスケア社）を用いて抗体をアフィニティー精製した。洗浄液としてＤ－ＰＢＳ（－）を用いた。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａに吸着させた抗体またはバイスペシフィック抗体を、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）により溶出し、２ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を含むチューブに回収した。
　次に、ＶＩＶＡＳＰＩＮ（Ｓａｒｔｒｉｕｓ　ｓｔｅａｌｉｎ社製）を用いて濃縮し、Ｎａｐ　Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてＤ－ＰＢＳ（－）へ緩衝液を置換した。さらに、単量体を精製する場合には、ＡＫＴＡ　ＦＰＬＣ（ＧＥヘルスケア社製）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ　Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、該抗体またはバイスペシフィック抗体溶液より単量体画分を分取した。ＡＫＴＡシステム孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）でろ過滅菌することにより精製抗体または精製バイスペシフィック抗体を得た。
　こうして得られた抗体溶液またはバイスペシフィック抗体溶液の波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、各抗体またはバイスペシフィック抗体のアミノ酸配列から推定される吸光係数を用いて、精製抗体または精製バイスペシフィック抗体の濃度を算出した。
［実施例８］ビアコアによるバイスペシフィック抗体の抗原に対する結合性の評価
　実施例７で得られたＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体のヒトＴｆＲおよびサルＴｆＲならびにヒトＥＧＦＲおよびサルＥＧＦＲそれぞれに対する結合活性と種交差性を確認することを目的として、実施例１で作製したＦＬＡＧ－Ｆｃ－ヒトＴｆＲ、ＦＬＡＧ－Ｆｃ－サルＴｆＲ、ヒトＥＧＦＲ－ＧＳＴおよびサルＥＧＦＲ－ＧＳＴを用いて、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）による結合性試験を実施した。測定機器として、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００（ＧＥヘルスケア社製）を使用した。
　Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　ａｎｔｉｂｏｄｙを、Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、添付文書に従いＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケア社製）に固定化した。フローセルに、１～３μｇ／ｍＬに調製した被験バイスペシフィック抗体を１０μＬ／ｍｉｎの流速で１０秒間添加した。
　次いで、アナライトとして１または９ｎＭより５段階に３倍希釈した抗原タンパク質溶液（０．１％ＢＳＡを含むＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥヘルスケア社製）で希釈）をそれぞれ３０μＬ／ｍｉｎの流速で添加し、各バイスペシフィック抗体とアナライトとの結合反応を２分間、解離反応を１０分間測定した。
　測定はシングルサイクルカイネティクス法で行った。得られたセンサーグラムを、Ｂｉａ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて解析し、各抗体の速度論定数を算出した。
　算出された各バイスペシフィック抗体のヒトおよびサルＥＧＦＲそれぞれに対する解離定数［ｋｄ／ｋａ＝ＫＤ］ならびにヒト抗原に対する解離定数をサル抗原に対する解離定数で割った値を表４に示す。表中のＮ／Ａは、測定していなことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示す通り、ＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体のヒトＴｆＲおよびサルＴｆＲに対するＫＤ値は、１０－８～１０－９Ｍオーダーであった。ＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体はサルＴｆＲに対するＫＤ値がヒトＴｆＲに対するＫＤ値の１／１０～１０倍の間にあり、ヒトＴｆＲとサルＴｆＲの種交差性があることが示された。
　同様に、ＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体のヒトＥＧＦＲおよびサルＥＧＦＲに対するＫＤ値は、１０－９Ｍ～１０－１０Ｍオーダーであった。サルＥＧＦＲに対するＫＤ値がヒトＥＧＦＲに対するＫＤ値の１／１０～１０倍の間にあり、ヒトＥＧＦＲとサルＥＧＦＲの種交差性があることが示された。
［実施例９］フローサイトメーターによるがん細胞の抗原発現量の測定及び取得抗体の結合性評価
　各種がん細胞株における各種抗原発現量を、以下の手順に従いｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）法により評価した。評価にはＰＥ標識抗ヒトＣＤ７１抗体（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）および、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＥＧＦＲ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）を用いた。
　各種がん細胞株におけるＴｆＲおよびＥＧＦＲの発現量の評価は以下のように行った。
　ＯＥ２１細胞を、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で０．１％　ＮａＮ３、１％　ＦＢＳ含有Ｄ－ＰＢＳ（－）のＳｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＢ）に懸濁し、１００μＬ／ｗｅｌｌで９６穴丸底プレート（ファルコン社製）に分注した。遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、２分間）の後、上清を除去し、ペレットへＰＥ標識抗ヒトＣＤ７１抗体またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＥＧＦＲ抗体を加え、氷温下３０分間インキュベートした。ＳＢで２回洗浄した後、ＳＢに懸濁し、フローサイトメーターＦＡＣＳ　ＣＡＮＴＯ　ＩＩ（ＢＤ社製）で各細胞の蛍光強度を測定した。同様にして、Ｔ．Ｔｎ細胞、Ｕ－９３７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｕＨ－７細胞およびＨＬＥ細胞におけるＴｆＲ発現をそれぞれ評価した。
　同様に、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｕＨ－７細胞およびＨＬＥ細胞におけるＧＰＣ３の発現量も評価した。具体的には、上記と同様にして細胞を調製し、一次抗体としてＨＮ３抗体を使用した後、二次抗体としてＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　４８８　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）を加え、氷温下３０分間インキュベートして同様の方法で蛍光強度を測定した。
　陰性対照にはMol Immunol. 1996 Jun;33(9):759-68.に記載のＤＮＰ－１抗体のＶＬおよびＶＨ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．：ＶＬ　Ｕ１６６８８、ＶＨ　Ｕ１１６６８７）をコードするベクターを用い、国際公開第２００６／０３３３８６号の実施例５記載の方法に準じて作製したＩｇＧ４抗体Ｒ４０９Ｋ変異体（以下抗ＤＮＰ抗体と記載する）およびＰＢＳを使用した。
　図２（Ａ）～（Ｃ）はそれぞれＯＥ２１細胞、Ｔ．Ｔｎ細胞およびＵ－９３７細胞におけるＥＧＦＲの発現量をフローサイトメーターで評価した結果を示す。また、図２（Ｄ）～（Ｇ）はそれぞれＯＥ２１細胞、Ｔ．Ｔｎ細胞およびＵ－９３７細胞におけるＴｆＲの発現量をフローサイトメーターで評価した結果を示す。図２に示すように、ＯＥ２１細胞はＥＧＦＲ高発現、Ｔ．Ｔｎ細胞はＥＧＦＲ中発現、Ｕ－９３７細胞はＥＧＦＲ低発現であった。
　図３（Ａ）～（Ｃ）はそれぞれＨｅｐＧ２細胞、ＨｕＨ－７細胞およびＨＬＥ細胞におけるＧＰＣ３の発現量をフローサイトメーターで評価した結果を示す。また、図３（Ｄ）～（Ｆ）はそれぞれＨｅｐＧ２細胞、ＨｕＨ－７細胞およびＨＬＥ細胞におけるＴｆＲ発現量をフローサイトメーターで評価した結果を示す。図３に示すように、ＨｅｐＧ２細胞はＧＰＣ３高発現、ＨｕＨ－７細胞はＧＰＣ３中発現、ＨＬＥ細胞はＧＰＣ３陰性であった。また、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｕＨ－７細胞、ＨＬＥ細胞いずれもＥＧＦＲ低発現であった。
　図２および図３に示すように、がん細胞株におけるＴｆＲの発現はどの細胞株もおおむね変わらず、低発現から中発現であった。
　次に、実施例４および実施例５で得られた抗ＴｆＲ抗体および抗ＥＧＦＲ抗体のＯＥ２１細胞に対する結合性をフローサイトメトリーにより確認した。図４（Ａ）～（Ｉ）は、それぞれＥ０８、Ｅ１２、Ｅ１７、ＫＭＥ０７、ＫＭＥ０９、ＫＭＥ１１、ＴｆＲ１０７１、２２３０、およびＴ１４の結果を示す。
　その結果、抗ＥＧＦＲ抗体のうち、ＫＭＥ１１についてのみＯＥ２１細胞に対する結合が確認できなかった。ＫＭＥ１１は、実施例５に記載した通り、可溶性ＥＧＦＲタンパク質に結合する抗体として選択されたが、上記結果より細胞表面の膜型ＥＧＦＲには結合しないことが示された。また、抗ＴｆＲ抗体のうち、Ｔ１４についてのみＯＥ２１細胞への結合が確認できなかった。Ｔ１４は、実施例４に記載した通りＥＬＩＳＡにより可溶性ＴｆＲタンパク質に結合する抗体として選択されたが、上記結果より、細胞表面の膜型ＴｆＲには結合しないことが示された。
［実施例１０］抗ＴｆＲ抗体の増殖阻害活性の評価
　がん細胞株に対する増殖阻害活性を指標として、実施例４で得られたＴｆＲモノクローナル抗体の増殖阻害活性を以下のように評価した。
　１×１０３ｃｅｌｌｓのＯＥ２１細胞を平底９６ｗｅｌｌプレート（ファルコン社製）に播種し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマアルドリッチ社製）で希釈した被験抗体を終濃度１μｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃、５．０％炭酸ガス下で４～６日間培養した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ＣｅｌｌＶｉａｌｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加して、蛍光強度をマイクロプレートリーダー（１４２０　ＡＲＶＯ　マルチラベルカウンター：ＷＡＬＬＡＣ社製）で測定した。各条件において、６つの独立したウェルを用いて評価し、平均値を算出した。得られた蛍光強度の値は、各ウェルの生細胞中ＡＴＰ量を反映している。陰性対照として抗ＤＮＰ抗体を用いた。
　また、被験抗体と共に抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社）（以下クロスリンク抗体とも記載する）を１０μｇ／ｍＬ加えて、被験抗体を架橋させる条件でも評価した。それぞれの抗体についての評価結果を図５に示す。被験抗体のうち、モノクローナル抗体単独では増殖阻害活性を示さなかった抗体を、ＴｆＲ非中和抗体として選択した。
　また、クロスリンク抗体を添加して被験抗体２分子を架橋すると、増殖阻害活性を示すクローン（ＴｆＲ１０７１、ＴｆＲ４０１６、ｃｙｎｏ１８６、ｃｙｎｏ２９２、２２３０）と示さないクローン（ＰＳＭ４０７２、ＴｆＲ１００７、ｃｙｎｏ１６３）が確認された。
［実施例１１］細胞表面抗原に対する抗体の増殖阻害活性の評価
　がん細胞株に対する増殖阻害活性を指標として、実施例５で得られた細胞表面抗原に対する抗体の増殖阻害活性を以下のように評価した。
　１×１０３ｃｅｌｌｓのＯＥ２１細胞を平底９６ｗｅｌｌプレート（ファルコン社製）に播種し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマアルドリッチ社製）で各種濃度に希釈した被験抗体を添加し、３７℃、５．０％炭酸ガス下で４～６日間培養した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ＣｅｌｌＶｉａｌｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加して、蛍光強度をマイクロプレートリーダー（１４２０　ＡＲＶＯ　マルチラベルカウンター：ＷＡＬＬＡＣ社製）で測定した。各条件において、３つの独立したウェルを用いて評価し、平均値を算出した。得られた蛍光強度の値は、各ウェルの生細胞中ＡＴＰ量を反映している。陰性対照として抗ＤＮＰ抗体を用いた。
　抗ＥＧＦＲ抗体の増殖阻害活性の評価にはＯＥ２１細胞を用いた。ＯＥ２１細胞に対する結果を図６に示す。図６に示すように、ＣｅｔｕｘｉｍａｂおよびクローンＥ０８は強い増殖阻害活性を、Ｅ１７は弱い増殖阻害活性を示し、クローンＥ１２は増殖阻害活性を示さなかった。この結果は、それぞれの抗体のＥＧＦ中和活性を反映していると考えられる。
［実施例１２］バイスペシフィック抗体の増殖阻害活性の評価
　がん細胞株に対する増殖阻害活性を指標として、実施例６で得られたバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を以下のように評価した。
　１×１０３ｃｅｌｌｓのがん細胞を平底９６ｗｅｌｌプレート（ファルコン社製）に播種し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマアルドリッチ社製）で各種濃度に希釈した被験抗体を添加し、３７℃、５．０％炭酸ガス下で４～６日間培養した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ＣｅｌｌＶｉａｌｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加して、蛍光強度をマイクロプレートリーダー（１４２０　ＡＲＶＯ　マルチラベルカウンター：ＷＡＬＬＡＣ社製）で測定した。各条件において、３つの独立したウェルを用いて評価し、平均値を算出した。得られた蛍光強度の値は、各ウェルの生細胞中ＡＴＰ量を反映している。陰性対照として抗ＤＮＰ抗体を用いた。
　バイスペシフィック抗体の増殖阻害活性の評価にはＯＥ２１細胞を用いた。抗ＥＧＦＲ抗体Ｅ０８の可変領域を有するバイスペシフィック抗体、抗ＥＧＦＲ抗体Ｅ１２の可変領域を有するバイスペシフィック抗体、および抗ＴｆＲ抗体２２３０の可変領域を有するバイスペシフィック抗体に関する評価結果をそれぞれ図７Ａ～Ｃに示す。
　図７Ａに示すように、実施例１０においてクロスリンク抗体で架橋したときに増殖阻害活性があったクローン（ＴｆＲ１０７１など）の可変領域をＩｇＧ部分側に配置し、抗ＥＧＦＲ抗体の可変領域をＮ末端側ポリペプチド側に配置したとき、強い増殖阻害活性を示した。その際、リンカーとしてＩｇＧ４のヒンジ領域のアミノ酸配列の一部（ＥＳ、ＥＳＫＹＧまたはＥＳＫＹＧＰＰ）を用いた場合も同様に増殖阻害活性を示した。一方で、
抗ＴｆＲ抗体の可変領域をＮ末端側ポリペプチドに含むバイスペシフィック抗体は、ほとんど増殖阻害活性を示さなかった。
　なお、実施例９の結果の通り、抗ＴｆＲ抗体Ｔ１４は細胞表面のＴｆＲに反応しないため、Ｅ０８－Ｔ１４およびＴ１４－Ｅ０８が示す増殖阻害活性は、純粋にＥ０８由来のＥＧＦＲシグナル阻害活性（実施例１１）に由来するものと考えられる。
　また、図７Ｂに示すように、実施例１０においてクロスリンク抗体で架橋したときに増殖阻害活性を示したクローン（Ｒ３２７、ＴｆＲ１０７１、ＴｆＲ４０１６、ｃｙｎｏ１８６およびｃｙｎｏ２９２）の可変領域をＩｇＧ部分に含むバイスペシフィック抗体は、クロスリンク抗体で架橋しても増殖阻害活性を示さなかったクローン（ＰＳＭ４０７２、ＴｆＲ１００７およびｃｙｎｏ１６３）の可変領域をＩｇＧ部分に含むバイスペシフィック抗体にくらべ、増殖阻害活性が強かった。
　抗ＴｆＲ抗体２２３０の可変領域を有するバイスペシフィック抗体については、図７Ｃに示すように、ＫＭＥ０７－２２３０、ＫＭＥ０９－２２３０、ＫＭＥ１１－２２３０が増殖阻害活性を示した。実施例９に示すように、ＫＭＥ１１は細胞上のＥＧＦＲに結合しないことから、バイスペシフィック抗体ＫＭＥ１１－２２３０はＥＧＦＲ非依存的に細胞増殖阻害活性を発揮することが明らかになった。このような特性を持つクローンは、骨髄細胞などＥＧＦＲ陰性でＴｆＲ陽性である正常細胞への毒性が懸念される。
　以上の結果から、Ｒ３２７、ＴｆＲ１０７１、ＴｆＲ４０１６、ｃｙｎｏ１８６、ｃｙｎｏ２９２のような、単独では増殖阻害活性を示さず、架橋すると増殖阻害活性を示す抗ＴｆＲ抗体の可変領域を、ＩｇＧ部分に有するバイスペシフィック抗体は、細胞表面抗原選択的に強い増殖阻害活性を示すことが示された。またバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性はリンカーの有無に影響を受けないことが示された。
　次に、ＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体による増殖阻害活性とＥＧＦＲ発現量の関係を検証するため、ＥＧＦＲ発現量が異なる細胞株を用いて、実施例６で得られたバイスペシフィック抗体Ｅ１２－ＴｆＲ１０７１の増殖阻害活性を評価した。実施例９の結果から、ＥＧＦＲ高発現の細胞としてＯＥ２１細胞を、中発現の細胞としてＴ．Ｔｎ細胞を、低発現の細胞としてＵ－９３７細胞を用いた。図８Ａ～Ｃに示すように、Ｅ１２－ＴｆＲ１０７１はＯＥ２１細胞に対しては強い増殖阻害活性を、Ｔ.Ｔｎ細胞に対しては中程度の増殖阻害活性を示すが、Ｕ－９３７細胞に対しては増殖阻害活性を示さなかった。このことから、Ｅ１２－ＴｆＲ１０７１はＥＧＦＲ発現量依存的に増殖阻害活性を示すことが分かった。
　各種ＧＰＣ３－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性の評価にはＨｅｐＧ２細胞を用いた。図９に示すように、ＨＮ３－ＴｆＲ１０７１、ＨＮ３－ＧＳ－ＴｆＲ１０７１およびＨＮ３－ＧＳ３－ＴｆＲ１０７１は非常に強い増殖阻害活性を示した。
　ＧＰＣ３－ＴｆＲバイスペシフィック抗体による増殖阻害活性とＧＰＣ３発現量の関係を検証するため、ＧＰＣ３発現量が異なる細胞株を用いて、実施例６で得られたバイスペシフィック抗体ＨＮ３－ＴｆＲ１０７１の増殖阻害活性を実施例１０と同様の方法で評価した。
　実施例９に示すようにＧＰＣ３高発現の細胞としてＨｅｐＧ２細胞を用いた結果を図１０Ａ、中発現の細胞としてＨｕＨ－７細胞を用いた結果を図１０Ｂ、陰性の細胞としてＨＬＥ細胞を用いた結果を図１０Ｃに示す。図１０Ａ～Ｃに示すように、ＨＮ３－ＴｆＲ１０７１は、ＧＰＣ３高発現のＨｅｐＧ２細胞に対しては強い増殖阻害活性を、ＧＰＣ３中発現のＨｕＨ－７細胞に対しては中程度の増殖阻害活性を示したが、ＧＰＣ３陰性のＨＬＥ細胞に対しては増殖阻害活性を示さなかった。このことから、ＨＮ３－ＴｆＲ１０７１はＧＰＣ３発現量依存的に増殖阻害活性を示すことが分かった。
　また、ＥＧＦＲ以外の細胞表面抗原に対しても、抗ＴｆＲ抗体の可変領域をＩｇＧ部分に有するバイスペシフィック抗体は、細胞表面抗原依存的に強い細胞増殖阻害活性を示すことが明らかとなった。
［実施例１３］ＴｆＲとトランスフェリンに対する抗ＴｆＲ抗体およびバイスペシフィック抗体の結合阻害活性
　バイスペシフィック抗体のがん細胞に対する増殖阻害活性の作用機序を明らかにするため、ＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体が、がん細胞上のＴｆＲとトランスフェリンの結合を阻害するかフローサイトメーターを用いて以下のように評価した。
　１×１０６ｃｅｌｌｓのＯＥ２１細胞をＵ底９６ｗｅｌｌプレート（ファルコン社製）に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマアルドリッチ社製）で播種し、１０μｇ／ｍｌの被験抗体を添加し、氷上で１時間静置した後、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８標識マウストランスフェリン（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を添加してさらに氷上で１時間静置した。ＳＢで２回洗浄した後、ＳＢに懸濁し、実施例９と同様にフローサイトメーターで各細胞の蛍光強度を測定した。
　図１１（Ａ）～（Ｄ）にはそれぞれ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、ＴｆＲ１０７１、Ｅ０８－ＴｆＲ１０７１、Ｅ１２－ＴｆＲ１０７１、およびＴｆＲ４３５の結果を示した。その結果、陽性対照のＴｆＲ中和抗体ＴｆＲ４３５はトランスフェリンとＴｆＲの結合を阻害したが、ＴｆＲ抗体ＴｆＲ１０７１ならびに、ＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体Ｅ０８－ＴｆＲ１０７１およびＥ１２－ＴｆＲ１０７１はいずれも陰性対象のＣｅｔｕｘｉｍａｂと同様に、トランスフェリンとＴｆＲの結合を阻害しなかった。
　この結果から、本発明のＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体にはＴｆＲ中和活性はなく、細胞表面上のＴｆＲとトランスフェリンの結合を阻害しないことが示された。
［実施例１４］ＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の薬効発揮メカニズム検証（細胞内ＥＧＦＲ量、ＴｆＲ量、ＥＧＦＲ下流シグナル）
　バイスペシフィック抗体のがん細胞に対する増殖阻害活性の作用機序を明らかにするため、がん細胞にＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体を添加したときの、ＥＧＦＲの下流シグナル、およびＴｆＲタンパク質の量への影響をウェスタンブロッティングにより以下のように評価した。
　１×１０6ｃｅｌｌｓのＯＥ２１細胞を平底６ｗｅｌｌプレート（ファルコン社製）に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマアルドリッチ社製）で播種し、被験抗体を添加して、３７℃、５．０％炭酸ガス下で２４時間培養した。その後、氷上に静置し、ＰＢＳ（－）で１回洗浄後、Ｐｒｏｔｅａｓｅ／Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＣＳＴジャパン社）含有ＲＩＰＡバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）を添加し、セルスクレイパー（社）を用いて溶解液を回収した。
　回収した溶解液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、５分間）した後、上清を回収し、上清の一部を用いてＰｉｅｒｃｅ　６６０ｎｍ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）で上清中のタンパク質濃度を定量した。上清に試料緩衝液（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用、６倍濃縮、還元剤含有。ナカライテスク社）を添加し、タンパク質１０μｇ分の容量をポリアクリルアミド既製ゲル（ＡＴＴＯ社）にロードし、電気泳動装置（ＡＴＴＯ社）で２５～８０分間泳動した。
　電気泳動のスタンダードとしてはプレステインタンパク質サイズマーカーＩＩＩ（Ｗａｋｏ社）を使用した。電気泳動したゲルをろ紙（ＡＴＴＯ社）、メンブレン（ＡＴＴＯ社）と共にブロッター（ＡＴＴＯ社）にセットし、ゲル１枚につき１２５ｍＡで１時間ブロッティングをおこなった。ブロッティング後のメンブレンはブロッキング緩衝液（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて室温で１時間または４℃で一晩振とうした。
　各種タンパク質の一次抗体（ビオチン化抗Ａｋｔ抗体、ビオチン化抗Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ抗体、ビオチン化抗ＥＧＦＲ抗体、ビオチン化抗Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＥＧＦＲ抗体およびウサギ抗ＣＤ７１抗体；全てＣｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｒｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）をそれぞれメンブレンに添加して室温で１時間または４℃で一晩振とうした。
　ＴＢＳ－Ｔ（Ｗａｋｏ社）で３回洗浄した後、各一次抗体に対する二次抗体（Ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ抗体－ＨＲＰまたは抗ウサギＩｇＧ抗体－ＨＲＰ；Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｒｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を添加して室温で１時間振とうした。ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、ＥＣＬ　Ｐｒｉｍｅ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社）を添加し、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｍａｇｅｒ　６００（ＧＥヘルスケア社）で検出した。
　図１２に示すように、Ｅ０８－ＴｆＲ１０７１添加によりリン酸化されたＥＧＦＲおよびリン酸化されたＡＫＴは、陽性対照のＣｅｔｕｘｉｍａｂと同様に減少したが、Ｅ１２－ＴｆＲ１０７１添加では減少が見られなかった。一方で、ＴｆＲタンパク質の量はＥ０８－ＴｆＲ１０７１およびＥ１２－ＴｆＲ１０７１の添加により減少したが、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂでは減少しなかった。
　この結果から、Ｅ０８－ＴｆＲ１０７１にはＥＧＦＲシグナル阻害活性およびＴｆＲ分解活性があり、Ｅ１２－ＴｆＲ１０７１にはＥＧＦＲシグナル阻害活性はなくＴｆＲ分解活性のみがあることが示された。
［実施例１５］ＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体のＴｆＲ発現への影響評価
　バイスペシフィック抗体のがん細胞に対する増殖阻害活性の作用機序を明らかにするため、ＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体が細胞膜上のＴｆＲ発現量に影響するか以下のように評価した。
　１×１０６ｃｅｌｌｓのＯＥ２１細胞を平底６ｗｅｌｌプレート（ファルコン社製）に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマアルドリッチ社製）で播種し、１０μｇ／ｍｌの被験抗体を添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、実施例９と同様に細胞を剥離し、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ，　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）を５μｇ／ｍＬ添加して４℃で３０分間静置し、実施例９と同様に洗浄した後、フローサイトメーターで各細胞の蛍光強度を指標に細胞表面上に結合したトランスフェリン量を測定した。
　図１３（Ａ）～（Ｄ）には、それぞれＣｅｔｕｘｉｍａｂ、ＴｆＲ１０７１抗体、Ｅ０８－ＴｆＲ１０７１バイスペシフィック抗体、およびＥ１２－ＴｆＲ１０７１バイスペシフィック抗体の結果を示した。図１３に示すように、ＴｆＲ１０７１抗体を添加したときは細胞表面上に結合したトランスフェリンの量が減少しなかったのに対して、ＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体を添加したときは細胞表面上に結合したトランスフェリンの量が減少した。
　これらの結果から、本発明のＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体のＴｆＲを介した増殖阻害活性は、がん細胞のＴｆＲタンパク質を分解し、細胞表面上のＴｆＲを減少させることに起因することが示された。
［実施例１６］ＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の鉄取り込みへの影響評価
　ＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体のがん細胞に対する増殖阻害活性に鉄が関係しているか確認するため、以下のように評価した。
　１×１０３ｃｅｌｌｓのＯＥ２１細胞を平底９６ｗｅｌｌプレート（ファルコン社製）に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマアルドリッチ社製）で播種し、被験抗体と共にＦｅｒｒｉｃ　Ａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｓｕｌｆａｔｅ（ナカライ社。以下ＦＡＳと記載する）を最終濃度が１０μＭになるように添加し、３７℃、５．０％炭酸ガス下で４～６日間培養した後、実施例１０と同様の方法で生細胞中ＡＴＰ量を測定した。
　図１４に示すように、ＦＡＳ未添加条件下において、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、ＴｆＲ中和抗体ＴｆＲ４３５またはバイスペシフィック抗体Ｅ１２－ＴｆＲ１０７１の添加により細胞の増殖が阻害された。一方で、ＦＡＳを添加すると、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂの増殖阻害活性には影響がなかったが、ＴｆＲ中和抗体ＴｆＲ４３５、バイスペシフィック抗体Ｅ１２－ＴｆＲ１０７１の増殖阻害活性は失われた。
　ＦＡＳ添加により、ＴｆＲを介さない経路で細胞内に鉄を供給できるようになる。よって、ＦＡＳを添加した条件下では、ＴｆＲ中和抗体によるＴｆＲ阻害やＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体によるＴｆＲ分解に伴う鉄枯渇状態が解除され、ＴｆＲに起因する増殖阻害活性が失われる。一方で、ＥＧＦＲのシグナル阻害による増殖阻害活性はＦＡＳ添加による鉄供給でも解除されない。したがって、Ｅ１２－ＴｆＲ１０７１の増殖阻害活性はＥＧＦＲのシグナル阻害ではなく、ＴｆＲ中和抗体と同様に、細胞内に鉄が供給されないことが原因であることが示された。
［実施例１７］ＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体とＥＧＦＲシグナル阻害剤の薬効比較
　ＥＧＦＲシグナル阻害とＴｆＲ阻害、２つの増殖阻害メカニズム間の活性を比較するため、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を用いて評価した。
　１×１０３ｃｅｌｌｓのＯＥ２１細胞を平底９６ｗｅｌｌプレート（社製）に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマアルドリッチ社製）で播種し、同培地で１０μｇ／ｍｌに希釈した被験抗体を添加し、ＩｎｃｕＣｙｔｅで２時間おきに１ｗｅｌｌあたり３視野を撮影する設定で、３７℃で５日間インキュベートした。培地交換を行い、１０μｇ／ｍｌの被験抗体を添加し、同様の方法でさらに２日間インキュベートした。その後、さらに培地交換を行い、被験抗体を添加せず、同様の方法で７日間インキュベートした。測定終了後、各撮影ポイントで細胞がウェルに占める割合をＩｎｃｕＣｙｔｅのソフトウェアで解析した。
　図１５に示すとおり、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂを添加した条件では抗体を除去すると増殖が再開したが、バイスペシフィック抗体Ｅ０８－ＴｆＲ１０７１もしくはＥ１２－ＴｆＲ１０７１を添加した条件では、抗体除去後も細胞の再増殖は見られなかった。ＴｆＲ中和抗体であるＴｆＲ４３５を添加した条件では、抗体除去後も細胞増殖阻害活性は認められたが、細胞増殖が再開する傾向が見られ、ＴｆＲの分解を誘導するＥ０８－ＴｆＲ１０７１もしくはＥ１２－ＴｆＲ１０７１の方がバイスペシフィック抗体除去後も強い増殖阻害活性を維持することが示唆された。
　この結果から、ＴｆＲ阻害はＥＧＦＲシグナル阻害と比べて、阻害剤の除去後も細胞増殖阻害活性が維持されることが示された。
［実施例１８］ＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体のヒト骨髄細胞への影響
　バイスペシフィック抗体Ｅ０８－ＴｆＲ１０７１およびＥ１２－ＴｆＲ１０７１の正常ヒト骨髄細胞（ＥＧＦＲ陰性、ＴｆＲ陽性）に対する影響を確認するため、以下のように評価した。
　７５００ｃｅｌｌｓのヒト骨髄細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社）を９６ｗｅｌｌプレート（ファルコン社製）にＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）　ＳＦＥＭＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で播種し、被験抗体を添加して、３７℃、５．０％炭酸ガス下で５日間培養した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ＣｅｌｌＶｉａｌｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加して、蛍光強度をマイクロプレートリーダー（１４２０　ＡＲＶＯ　マルチラベルカウンター：ＷＡＬＬＡＣ社製）で測定した。各条件において、２つの独立したウェルを用いて評価し、平均値を算出した。得られた蛍光強度の値は、各ウェルの生細胞中ＡＴＰ量を反映している。
　なお、ヒト骨髄細胞をＭａｔｕｒｅ　ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ（以下ＧＥＭＭと記載する）に分化誘導するため、培養時にＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を最終濃度５０ｎｇ／ｍＬで、Ｈｕｍａｎ　ＩＬ－３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）を最終濃度１０ｎｇ／ｍＬで、Ｈｕｍａｎ　ＩＬ－６（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を最終濃度２０ｎｇ／ｍＬで、Ｈｕｍａｎ　ＧＭ－ＣＳＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）を最終濃度２０ｎｇ／ｍＬで、Ｇ－ＣＳＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）を最終濃度２０ｎｇ／ｍＬで、Ｈｕｍａｎ　Ｆｌｔ３－Ｌｉｇａｎｄ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）を最終濃度５０ｎｇ／ｍＬで、エリスロポエチン（協和発酵キリン社）を最終濃度３Ｕ／ｍＬで、およびＨｕｍａｎ　ＴＰＯ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）を最終濃度３０ｎｇ／ｍＬで添加した。
　図１６に示すように、ＴｆＲ中和抗体ＴｆＲ４３５は増殖阻害活性を示したのに対して、バイスペシフィック抗体Ｅ０８－ＴｆＲ１０７１およびＥ１２－ＴｆＲ１０７１はいずれも増殖阻害活性を示さなかった。
　この結果から、本発明のバイスペシフィック抗体はＴｆＲを発現している正常骨髄細胞に対して増殖阻害活性を示さないことが確認された。よって、本発明のバイスペシフィック抗体はＴｆＲ中和抗体に比べて骨髄毒性が低減していることが期待される。
［実施例１９］アミノ酸改変したＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性
　ＴｆＲ１０７１のＶＨのアミノ酸を改変したＥ１２－ＴｆＲ１０７１バイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を、ＯＥ２１細胞を用いて実施例１２と同様の方法で評価した。まず、アミノ酸改変したＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体を以下のように作製した。アミノ酸改変（アミノ酸置換とも言う）したバイスペシフィック抗体の発現ベクターは、Ｅ１２－ＴｆＲ１０７１の発現ベクターにおいて、置換前のアミノ酸をコードする塩基配列を、置換後のアミノ酸をコードする塩基配列に置き換えたベクターを、実施例６に記載の方法に準じて作製した。アミノ酸改変したバイスペシフィック抗体の発現および調製は、実施例７に記載の方法に準じて行った。アミノ酸改変したバイスペシフィック抗体としては、以下のものを作製した。
（ＴｆＲ１０７１改変体）
Ｙ３２Ａ、Ｙ３２Ｆ、Ｔ３３Ａ、Ｔ３３Ｇ、Ｌ４５Ａ、Ｖ４８Ａ、Ｖ５０Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｉ５１Ｌ、Ｎ５２Ａ-Ａ、Ｎ５２Ａ-Ｄ、Ｖ５５Ｅ、Ｄ５８Ａ、Ｄ６１Ｐ、Ｑ９７Ａ、Ｑ９７Ｄ、Ｐ９８Ａ、Ｗ９９Ａ、Ｗ９９Ｆ、Ｗ９９Ｈ、Ｗ９９Ｙ、Ｙ１００Ａ-Ａ、Ｙ１００Ａ-Ｆ、Ｖ１０２Ｌ、Ｐ９８Ｙ、Ｐ９８Ｓ、Ｐ９８Ｄ、Ｐ９８Ｑ、Ｐ９８Ｅ、Ｐ９８Ｔ、Ｐ９８Ｒ、Ｐ９８Ｇ、Ｐ９８Ｋ、Ｐ９８Ｍ、Ｐ９８Ｖ、Ｐ９８Ｌ、Ｐ９８Ｉ、Ｐ９８Ｗ、Ｐ９８Ｆ、Ｐ９８Ｈ
　上記記号は、それぞれのＴｆＲ１０７１改変体に含まれるアミノ酸置換を示し、［置換前のアミノ酸残基の1文字表記］［ＥＵインデックスで示したＴｆＲ１０７１のＶＨ（配列番号３１）におけるアミノ酸残基の部位］［置換後のアミノ酸残基の1文字表記］を表す。以降、アミノ酸置換を同様に表記する。
　例えば、Ｙ３２ＡはＥＵインデックスにおける３２番目のアミノ酸残基Ｙ（チロシン）をＡ（アラニン）に置換したことを意味する。また、５２Ａ、１００Ａはそれぞれ、ＥＵインデックスにおいて「５２番目と５３番目の間」、「１００番目と１０１番目の間」のアミノ酸残基を意味する枝番である。例えば、Ｎ５２Ａ-ＤはＥＵインデックスにおける５２Ａ番目のアミノ酸残基をＮからＡに置換したことを、Ｙ１００Ａ-ＡはＥＵインデックスにおける１００Ａ番目のアミノ酸残基をＹからＡに置換したことを意味する。
　１×１０３ｃｅｌｌｓのがん細胞を平底９６ｗｅｌｌプレート（ファルコン社製）に播種し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマアルドリッチ社製）で各種濃度に希釈した被験抗体を添加し、３７℃、５．０％炭酸ガス下で４～６日間培養した後、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を添加して、吸光度をマイクロプレートリーダー（１４２０　ＡＲＶＯ　マルチラベルカウンター：ＷＡＬＬＡＣ社製）で測定した。各条件において、３つの独立したウェルを用いて評価し、平均値を算出した。得られた蛍光強度の値は、各ウェルの生細胞数を反映している。陰性対照として抗ＤＮＰ抗体を用いた。上記バイスペシフィック抗体の増殖阻害活性に関する評価結果をそれぞれ図１７Ａ、Ｂに示す。
　図１７Ａ、Ｂに示すように、クローンＴｆＲ１０７１のＮ５２Ａ－ＡおよびＮ５２Ａ－Ｄ改変体では増殖阻害活性が見られなくなり、Ｖ５５Ｅ、Ｗ９９ＡおよびＷ９９Ｈ改変体は増殖阻害活性がやや低下したが、それ以外の改変体は改変前と同等の強い増殖阻害活性を示した
　この結果から、本発明のバイスペシフィック抗体Ｅ１２－ＴｆＲ１０７１において、Ｎ５２が増殖阻害活性の発揮に重要であることが示された。また、Ｐ９８については様々な他のアミノ酸に置換しても同等の増殖阻害活性を示し、他の任意の天然アミノ酸に置換可能であることが示唆された。
［実施例２０］抗ＴｆＲ抗体のエピトープ同定
　抗ＴｆＲ抗体１０７１のエピトープを以下のように同定した。
　国際公開第２０１４／１８９９７３号に記載されている配列情報から、ヒトＴｆＲのＡｐｉｃａｌドメインに結合する抗ＴｆＲ抗体１５Ｇ１１ｖ５、７Ａ４ｖ１５、および１６Ｆ６ｖ４、ならびにＰｒｏｔｅａｓｅ－ｌｉｋｅドメインを認識する抗ＴｆＲ抗体７Ｇ７ｖ１を実施例７に記載した方法と同様にして作製した。
　実施例１に記載したヒトＴｆＲの細胞外ドメインタンパク質を作製した。また、ヒトＴｆＲの細胞外ドメインのうち、ＡｐｉｃａｌドメインまたはＰｒｏｔｅａｓｅ－ｌｉｋｅドメインをマウスＴｆＲ（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿００１３４４２２７に示されるアミノ酸配列または配列番号８７に示されるアミノ酸を含む）の対応ドメインに置換したキメラタンパク質を作製した。具体的には、これらのアミノ酸配列をコードする塩基配列を、Ｈｉｓタグが導入されたｐＣＩ－ＯｔＣＭＶベクターにサブクローニングして、タンパク質発現ベクターを得た。タンパク質発現ベクターを用いて、実施例１に記載の方法により、それぞれのタンパク質にＨｉｓタグが付加されたＨｉｓ－ｈｕＴｆＲ、ｈｕＴｆＲ　ｗｉｔｈ　ｍｏｕｓｅ　ａｐｉｃａｌ　ｄｏｍａｉｎ（配列番号８８）、及びｈｕＴｆＲ　ｗｉｔｈ　ｍｏｕｓｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ－ｌｉｋｅ　ｄｏｍａｉｎ（配列番号８９）を得た。
　Ｈｉｓ－ｈｕＴｆＲは、Ｈｉｓタグ付きヒトＴｆＲ細胞外ドメインを、ｈｕＴｆＲ　ｗｉｔｈ　ｍｏｕｓｅ　ａｐｉｃａｌ　ｄｏｍａｉｎは、Ａｐｉｃａｌドメインがマウスの対応配列に置換されたＨｉｓタグ付きヒトＴｆＲ細胞外ドメインを、ｈｕＴｆＲ　ｗｉｔｈ　ｍｏｕｓｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ－ｌｉｋｅ　ｄｏｍａｉｎは、Ｐｒｏｔｅａｓｅ－ｌｉｋｅドメインがマウスの対応配列に置換されたＨｉｓタグ付きヒトＴｆＲ細胞外ドメインを示す。
　同様にして、ヒトＴｆＲのＡｐｉｃａｌドメインの一部のアミノ酸残基を、マウスＴｆＲの対応するアミノ酸残基に置換した、キメラＴｆＲ　Ａ０１～Ａ１６を作製した。表５に作製したキメラＴｆＲを、配列番号９０～１０５にそれぞれのアミノ酸配列を示す。
　表５では、各々のキメラタンパク質においてアミノ酸置換の部位を表している。例えば、Ａ０１のＱ２８５Ｋ－Ｔ２８６Ｎ－Ｔ３６２Ｓは、配列番号６で表されるヒトＴｆＲのアミノ酸配列において、２８５番目のアミノ酸をＱからＫに、２８６番目のアミノ酸をＴからＮに、および３６２番目のアミノ酸をＴからＳに置換したことを意味する。Ａ０８のＶ２１０のように、対応するマウスアミノ酸がない場合はアミノ酸を欠失させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　次に、各種ＴｆＲ抗体のエピトープ解析を行った。まず、本発明で作製した抗ＴｆＲ抗体の、実施例２で作成したヒトＴｆＲ／ＣＨＯおよび実施例２と同様にして作成したマウスＴｆＲ／ＣＨＯへの反応性を、実施例９と同様の方法でフローサイトメトリーにより解析した。その結果、Ｒ３２７、ＴｆＲ１０７１、ｃｙｎｏ１８６、ｃｙｎｏ２９２および２２３０はいずれもヒトＴｆＲには結合したが、マウスＴｆＲには結合しなかった。また、１５Ｇ１１ｖ５、７Ａ４ｖ１５、１６Ｆ６ｖ４、及び７Ｇ７ｖ１はマウスには交差しないことが知られている（国際公開第２０１４／１８９９７３号）。
　更に、上記で作製した各種キメラＴｆＲに対する抗ＴｆＲ抗体の結合活性をＥＬＩＳＡにより解析し、抗ＴｆＲ抗体の結合ドメイン及び認識エピトープを同定した。あるキメラＴｆＲに対して結合活性が失われた場合、そのキメラＴｆＲにおいて置換したアミノ酸残基をエピトープと同定した。
　ＥＬＩＳＡは以下の方法で行った。抗原タンパク質を固相化した９６ウェルイムノプレート（Ｎｕｎｃ社）に、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ－ＰＢＳ（－）ｐＨ７．０　ｗｉｔｈｏｕｔ　ＫＣｌ（以下ブロッキング液と記載する。ナカライテスク社）を添加し室温下でブロッキングした後、同溶液で希釈した抗ＴｆＲ抗体を添加し室温で１時間反応させた。その後、０．０５％（ｗ／ｖ）－ｔＰＢＳ（１ｘ）ｗｉｔｈｏｕｔ　ＫＣｌ（ｐＨ７．２）（以下洗浄液と記載する。ナカライテスク社）で洗浄し、ブロッキング液で希釈したＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆｃ）　Ｇｏａｔ　ＩｇＧ　Ｆａｂ‘’－ＨＲＰ（ＩＢＬ社）を添加し、室温で１時間反応させた後、洗浄液で洗浄し、１－Ｓｔｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ　ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社）を加え、室温下で反応させ、５ＮのＨＣｌ溶液を加えて発色反応を止め、波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をプレートリーダー（ＥＰＯＣＨ２：Ｂｉｏ　Ｔｅｋ社）で測定した。
　結果を表６に示す。表中のＮ／Ａは、データを取得していないことを示す。また、波長４５０ｎｍの吸光度から参照波長５７０ｎｍの吸光度を引いた値を各種抗原タンパク質に対する結合活性とみなし、各種キメラＴｆＲに対する結合活性をＨｉｓ－ｈｕＴｆＲに対する結合活性で割った値が０．５以上のときに＋＋、０．２以上０．５未満のときに＋、０．２未満のときに－と表記した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　この結果から、Ｔ１４、Ｒ３２７、ＴｆＲ１０７１、ｃｙｎｏ１８６、ｃｙｎｏ２９２、１５Ｇ１１ｖ５、７Ａ４ｖ１５、および１６Ｆ６ｖ４はＡｐｉｃａｌドメインを、２２３０および７Ｇ７ｖ１はＰｒｏｔｅａｓｅ－ｌｉｋｅドメインを認識していることが示された。また、Ａｐｉｃａｌドメインを認識している抗体の中で、Ｔ１４はＡ０５のアミノ酸置換部位を、Ｒ３２７、ＴｆＲ１００７、ＴｆＲ１０７１およびｃｙｎｏ２９２はＡ０２およびＡ０７のアミノ酸置換部位を、ｃｙｎｏ１８６はＡ０２、Ａ０７およびＡ１４のアミノ酸置換部位を、１５Ｇ１１ｖ５はＡ０２、Ａ０３、およびＡ０４のアミノ酸置換部位を、７Ａ４ｖ１５および１６Ｆ６ｖ４はＡ０２のアミノ酸置換部位を認識していることが示された。
　ＴｆＲ１０７１の認識するアミノ酸残基は、Ａ０２およびＡ０７でアミノ酸置換した部位であることが示された。よって、ＴｆＲ１０７１の認識するアミノ酸残基は、Ｄ３５２、Ｓ３５５、Ｄ３５６、Ｋ３５８、Ｍ３６５、Ｖ３６６、およびＥ３６９の７アミノ酸残基であることが示唆された。Ｒ３２７、ＴｆＲ１００７、およびｃｙｎｏ２９２についても同様のことが言える。
［実施例２１］抗ＴｆＲ抗体のエピトープとＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性
　本発明のバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性とＴｆＲに結合するＩｇＧ部分の可変領域のエピトープの関連性を解析するため、エピトープの異なる各種抗ＴｆＲ抗体でＥ１２－ＴｆＲバイスペシフィック抗体を作製し、増殖阻害活性を評価した。
　抗ＴｆＲ抗体１５Ｇ１１ｖ５、７Ａ４ｖ１５、１６Ｆ６ｖ４および７Ｇ７ｖ１と抗ＥＧＦＲ抗体Ｅ１２とは軽鎖が異なるため、図１８（Ａ）に示すような構造のバイスペシフィック抗体を、実施例６に記載の方法で作製した。実施例８と同様にして、Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｑｉａｇｅｎ社）をＣＭ５センサーチップに固定化して、Ｈｉｓ－ｈｕＴｆＲを添加後、アナライトとして各バイスペシフィック抗体のＴｆＲに対する結合活性を測定し、作製した各種バイスペシフィック抗体の速度論定数を算出した。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示すように、作製されたバイスペシフィック抗体はどれもＴｆＲに強く結合することがわかった。
　得られたバイスペシフィック抗体のＯＥ２１に対する増殖阻害活性を、実施例１９と同様の方法で評価した結果を図１９ＡおよびＢに示す。
　図１９ＡおよびＢに示すように、Ｒ３２７、ＴｆＲ１００７、ＴｆＲ１０７１、ｃｙｎｏ１８６およびｃｙｎｏ２９２を用いたＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体は、その他のバイスペシフィック抗体よりも最大活性が強かった。この結果及び実施例２０の結果から、エピトープがＡ０２およびＡ０７のアミノ酸置換部位であるＲ３２７、ＴｆＲ１００７、ＴｆＲ１０７１、およびｃｙｎｏ２９２、ならびにエピトープがＡ０２、Ａ０７、およびＡ１４のアミノ酸置換部位であるｃｙｎｏ１８６を用いたバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性が高いことがわかった。よって、Ａ０２およびＡ０７のアミノ酸置換部位をエピトープに含むことが、高い増殖阻害活性に重要だということが示された。
　また、図１９Ａに示すように、Ａ０２およびＡ０７のアミノ酸置換部位をエピトープに含むバイスペシフィック抗体の中でも、ＴｆＲ１０７１およびＲ３２７を用いたバイスペシフィック抗体が最も低濃度から高い活性を示しており、これらのクローンの中でも特にＴｆＲ１０７１およびＲ３２７が優れていることが示された。
［実施例２２］各種抗ＥＧＦＲ抗体とＴｆＲ１０７１を用いたＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性
　バイスペシフィック抗体の増殖阻害活性にＴｆＲ１０７１が重要であるか確認するため、上市されているＥＧＦＲ阻害活性のある抗ＥＧＦＲ抗体とＴｆＲ抗体ＴｆＲ１０７１でＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体を作製し、増殖阻害活性を評価した。
　抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）とＴｆＲ抗体ＴｆＲ１０７１のバイスペシフィック抗体を、実施例６に記載の方法と同様にして作製した。Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ、Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂの可変領域の配列は、それぞれ国際公開第１９９６／０４０２１０号、国際公開第１９９８／０５０４３３号、国際公開第２０１１／１１６３８７号、米国特許出願公開第２０１２／０３０８５７６号明細書に記載のものを用いた。作製したバイスペシフィック抗体の構造の模式図を図１（ｃ）に示す。
　がん細胞株に対する増殖阻害活性を指標として、得られたバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性を実施例２０と同様にして評価した結果を図２０に示す。
　図２０に示すように、ＴｆＲ１０７１のＣＤＲを有するＥＧＦＲ－ＴｆＲバイスペシフィック抗体は、いずれの抗ＥＧＦＲ抗体の可変領域を有していても強い増殖阻害活性を示した。
　この結果から、ＩｇＧ部分にＴｆＲ１０７１のＣＤＲを有することが、本発明のバイスペシフィック抗体の高い増殖阻害活性に重要であることが示唆された。
［実施例２３］ヘテロ二量体型のバイスペシフィック抗体との増殖阻害活性の比較
　本発明のバイスペシフィック抗体の増殖阻害活性において、ＴｆＲとＥＧＦＲに結合する価数の影響を解析するため、抗ＥＧＦＲ抗体Ｅ１２と抗ＴｆＲ抗体ＴｆＲ１０７１の抗原結合ドメインをそれぞれ一つずつ有するヘテロ二量体型バイスペシフィック抗体（以下ヘテロ二量体抗体と記載する。）を作製し、増殖阻害活性を評価した。図１８（Ｂ）に、作製したヘテロ二量体抗体の構造の模式図を示す。
　特許文献（米国特許出願公開第２０１４／０３４８８３９号明細書）に記載の方法でＥ１２とＴｆＲ１０７１の抗原結合ドメインをそれぞれ一つずつ有するバイスペシフィック抗体Ｈｅｔｅｒｏ　Ｅ１２－ＴｆＲ１０７１を作製し、実施例１１と同様の方法で増殖阻害活性を評価した。結果を図２１に示す。
　図２１に示すように、Ｈｅｔｅｒｏ　Ｅ１２－ＴｆＲ１０７１はＥ１２－ＴｆＲ１０７１に比べて増殖阻害の最大活性および比活性ともに弱いことが分かった。この結果から、ＴｆＲとＥＧＦＲに対する価数がそれぞれ１価であるヘテロ二量体抗体に比べ、それぞれ２価である本発明のバイスペシフィック抗体は強い増殖阻害活性を有することが示された。
［実施例２４］Ｅ１２－ＴｆＲ１０７１ＹＥバイスペシフィック抗体のＴｆＲ結合活性
　ＴｆＲ１０７１のＶＨ配列（配列番号３１）の１番目のアミノ酸をＹ（チロシン）からＥ（グルタミン酸）に置換したＶＨ配列（配列番号１０６）を有する、Ｅ１２－ＴｆＲ１０７１ＹＥバイスペシフィック抗体を、常法により作製した。実施例２０に記載の方法と同様にして、ＥＬＩＳＡによりヒトＴｆＲタンパク質への結合活性を解析した。その結果、Ｅ１２－ＴｆＲ１０７１ＹＥはＥ１２－ＴｆＲ１０７１と同等の結合活性を示した
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１８年１２月２８日付けで出願された日本特許出願（特願２０１８－２４８３３４）に基づいており、その全体が引用により援用される。
配列番号１：ヒトＴｆＲ細胞外ドメインの塩基配列
配列番号２：ヒトＴｆＲ細胞外ドメインのアミノ酸配列
配列番号３：サルＴｆＲ細胞外ドメインの塩基配列
配列番号４：サルＴｆＲ細胞外ドメインのアミノ酸配列
配列番号５：ヒトＴｆＲの塩基配列
配列番号６：ヒトＴｆＲのアミノ酸配列
配列番号７：カニクイザルＴｆＲの塩基配列
配列番号８：カニクイザルＴｆＲのアミノ酸配列
配列番号９：ヒトＥＧＦＲ細胞外ドメインの塩基配列（シグナル配列を含む）
配列番号１０：ヒトＥＧＦＲ細胞外ドメインのアミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号１１：サルＥＧＦＲ細胞外ドメインの塩基配列（シグナル配列を含む）
配列番号１２：サルＥＧＦＲ細胞外ドメインのアミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号１３：ヒトＥＧＦＲの塩基配列
配列番号１４：ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列
配列番号１５：Ａ２７　ＶＬの塩基配列
配列番号１６：Ａ２７　ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１７：Ａ２７　ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１８：Ａ２７　ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１９：Ａ２７　ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２０：ＰＳＭ４０７２　ＶＨの塩基配列
配列番号２１：ＰＳＭ４０７２　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号２２：ＰＳＭ４０７２　ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２３：ＰＳＭ４０７２　ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２４：ＰＳＭ４０７２　ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２５：Ｒ３２７　ＶＨの塩基配列
配列番号２６：Ｒ３２７　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号２７：Ｒ３２７　ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２８：Ｒ３２７　ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２９：Ｒ３２７　ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３０：ＴｆＲ１０７１　ＶＨの塩基配列
配列番号３１：ＴｆＲ１０７１　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号３２：ＴｆＲ１０７１　ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３３：ＴｆＲ１０７１　ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３４：ＴｆＲ１０７１　ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３５：ＴｆＲ４０１６　ＶＨの塩基配列
配列番号３６：ＴｆＲ４０１６　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号３７：ＴｆＲ４０１６　ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３８：ＴｆＲ４０１６　ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３９：ＴｆＲ４０１６　ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４０：ｃｙｎｏ１８６　ＶＨの塩基配列
配列番号４１：ｃｙｎｏ１８６　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号４２：ｃｙｎｏ１８６　ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号４３：ｃｙｎｏ１８６　ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号４４：ｃｙｎｏ１８６　ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４５：ｃｙｎｏ２９２　ＶＨの塩基配列
配列番号４６：ｃｙｎｏ２９２　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号４７：ｃｙｎｏ２９２　ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号４８：ｃｙｎｏ２９２　ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号４９：ｃｙｎｏ２９２　ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号５０：ＴｆＲ１００７　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号５１：ｃｙｎｏ１６３　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号５２：２２３０　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号５３：２２３０　ＶＬのアミノ酸配列
配列番号５４：Ｔ１４　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号５５：ＴｆＲ４３４　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号５６：ＴｆＲ４３５　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号５７：ＴｆＲ４３４、４３５　ＶＬのアミノ酸配列
配列番号５８：Ｅ０８　ＶＨの塩基配列
配列番号５９：Ｅ０８　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号６０：Ｅ０８　ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号６１：Ｅ０８　ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６２：Ｅ０８　ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６３：Ｅ１２　ＶＨの塩基配列
配列番号６４：Ｅ１２　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号６５：Ｅ１２　ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号６６：Ｅ１２　ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６７：Ｅ１２　ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６８：Ｅ１７　ＶＨの塩基配列
配列番号６９：Ｅ１７　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号７０：Ｅ１７　ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号７１：Ｅ１７　ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号７２：Ｅ１７　ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７３：ＫＭＥ０７　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号７４：ＫＭＥ０９　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号７５：ＫＭＥ１１　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号７６：Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号７７：Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ　ＶＬのアミノ酸配列
配列番号７８：ＨＮ３　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号７９：リンカーのアミノ酸配列
配列番号８０：リンカーのアミノ酸配列
配列番号８１：リンカーのアミノ酸配列
配列番号８２：リンカーのアミノ酸配列
配列番号８３：ＩｇＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋ　定常領域の塩基配列
配列番号８４：ＩｇＧ４ＰＥ　Ｒ４０９Ｋ　定常領域のアミノ酸配列
配列番号８５：ＩｇＧ４　ＣＨ１の改変コドンの塩基配列
配列番号８６：ＩｇＧ４ＰＥ　定常領域のアミノ酸配列
配列番号８７：マウスＴｆＲのアミノ酸配列
配列番号８８：ヒトＴｆＲ細胞外ドメインのＡｐｉｃａｌドメインマウスキメラ体のアミノ酸配列
配列番号８９：ヒトＴｆＲ細胞外ドメインのＰｒｏｔｅａｓｅ－ｌｉｋｅドメインマウスキメラ体のアミノ酸配列
配列番号９０：Ａ０１のアミノ酸配列
配列番号９１：Ａ０２のアミノ酸配列
配列番号９２：Ａ０３のアミノ酸配列
配列番号９３：Ａ０４のアミノ酸配列
配列番号９４：Ａ０５のアミノ酸配列
配列番号９５：Ａ０６のアミノ酸配列
配列番号９６：Ａ０７のアミノ酸配列
配列番号９７：Ａ０８のアミノ酸配列
配列番号９８：Ａ０９のアミノ酸配列
配列番号９９：Ａ１０のアミノ酸配列
配列番号１００：Ａ１１のアミノ酸配列
配列番号１０１：Ａ１２のアミノ酸配列
配列番号１０２：Ａ１３のアミノ酸配列
配列番号１０３：Ａ１４のアミノ酸配列
配列番号１０４：Ａ１５のアミノ酸配列
配列番号１０５：Ａ１６のアミノ酸配列
配列番号１０６：ＴｆＲ１０７１　ＥＶＱＬで始まるＶＨのアミノ酸配列
配列番号１０７：ＴｆＲ１００７　ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１０８：ＴｆＲ１００７　ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１０９：ＴｆＲ１００７　ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１０：Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１１１：Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ　ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１１２：Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１１３：Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ　ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１１４：Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１１５：Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ　ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１１６：Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ　ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１１７：Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ　ＶＬのアミノ酸配列

Claims (32)

  1. 　Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴｆＲ）に結合するＩｇＧ部分、および細胞表面抗原に結合するＮ末端側ポリペプチドを含むバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片であって、該Ｎ末端側ポリペプチドが該ＩｇＧ部分の重鎖のＮ末端に直接またはリンカーを介して結合する、ＴｆＲおよび細胞表面抗原に結合するバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  2. 　前記ＩｇＧ部分が、
    　配列番号３２で表されるアミノ酸配列もしくは配列番号３２で表されるアミノ酸配列から、２番目のチロシンのアラニンもしくはフェニルアラニンへの置換および３番目のスレオニンのアラニンもしくはグリシンへの置換から選ばれる少なくとも１つの置換により改変されたアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）１、
    　配列番号３３で表されるアミノ酸配列もしくは配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、１番目のバリンのアラニンへの置換、２番目のイソロイシンのアラニンもしくはロイシンへの置換、７番目のバリンのグルタミン酸への置換、１０番目のアスパラギン酸のアラニンへの置換および１３番目のアスパラギン酸のプロリンへの置換から選ばれる少なくとも一つの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および
    　配列番号３４で表されるアミノ酸配列もしくは配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、３番目のグルタミンのアラニンもしくはアスパラギン酸への置換、４番目のプロリンの任意の天然アミノ酸への置換、５番目のトリプトファンのアラニン、フェニルアラニン、ヒスチジンもしくはチロシンへの置換、７番目のチロシンのアラニンもしくはフェニルアラニンへの置換および１３番目のバリンのロイシンへの置換から選ばれる少なくとも１つの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに
    　それぞれ配列番号１７～１９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  3. 　前記ＩｇＧ部分が、以下の（ａｉ）～(ｃｉ)から選ばれる１のＶＨ、およびそれぞれ配列番号１７～１９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＬを含む、請求項１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
    （ａｉ）それぞれ配列番号３２～３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ
    （ｂｉ）それぞれ配列番号４２～４４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ
    （ｃｉ）それぞれ配列番号４７～４９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ
  4. 　前記ＩｇＧ部分が、配列番号２６、３１、３６、４１、および４６のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１または２に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  5. 　前記ＩｇＧ部分が、それぞれ配列番号１７～１９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＬ、および、以下の（ａ）～(ｍ)から選ばれる１のＶＨを含む、請求項１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
    （ａ）それぞれ配列番号３３および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および３、ならびに、配列番号３２で表されるアミノ酸配列から、２番目のチロシンのアラニンまたはフェニルアラニンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ
    （ｂ）それぞれ配列番号３３および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２および３、ならびに、配列番号３２で表されるアミノ酸配列から、３番目のスレオニンのアラニンまたはグリシンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ１を含むＶＨ
    （ｃ）それぞれ配列番号３２および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および３、ならびに、配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、１番目のバリンのアラニンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ
    （ｄ）それぞれ配列番号３２および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および３、ならびに、配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、２番目のイソロイシンのアラニンまたはロイシンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ
    （ｅ）それぞれ配列番号３２および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および３、ならびに、配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、７番目のバリンのグルタミン酸への置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ
    （ｆ）それぞれ配列番号３２および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および３、ならびに、配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、１０番目のアスパラギン酸のアラニンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ
    （ｇ）それぞれ配列番号３２および３４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および３、ならびに、配列番号３３で表されるアミノ酸配列から、１３番目のアスパラギン酸のプロリンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含むＶＨ
    （ｈ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、３番目のグルタミンのアラニンまたはアスパラギン酸への置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
    （ｉ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、４番目のプロリンの任意の天然アミノ酸への置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
    （ｊ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、４番目のプロリンのアラニン、チロシン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、スレオニン、アルギニン、グリシン、リジン、メチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニンもしくはヒスチジンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
    （ｋ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、５番目のトリプトファンのアラニン、フェニルアラニン、ヒスチジンまたはチロシンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
    （ｌ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、７番目のチロシンのアラニンまたはフェニルアラニンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
    （ｍ）それぞれ配列番号３２および３３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および２、ならびに、配列番号３４で表されるアミノ酸配列から、バリンのロイシンへの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨ
  6. 　前記ＩｇＧ部分が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ、ならびに配列番号３１で表されるアミノ酸配列から、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックス（以下、ＥＵインデックス）により示されるＹ３２Ａ、Ｙ３２Ｆ、Ｔ３３Ａ、Ｔ３３Ｇ、Ｌ４５Ａ、Ｖ４８Ａ、Ｖ５０Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｉ５１Ｌ、Ｖ５５Ｅ、Ｄ５８Ａ、Ｄ６１Ｐ、Ｑ９７Ａ、Ｑ９７Ｄ、Ｗ９９Ａ、Ｗ９９Ｆ、Ｗ９９Ｈ、Ｗ９９Ｙ、Ｙ１００ＡＡ、Ｙ１００ＡＦ、Ｖ１０２Ｌ、およびＰ９８の任意のアミノ酸への置換から選ばれる少なくとも１つの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＶＨを含む、請求項１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  7. 　前記ＩｇＧ部分が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ、ならびに配列番号３１で表されるアミノ酸配列から、ＥＵインデックスにより示されるＹ３２Ａ、Ｙ３２Ｆ、Ｔ３３Ａ、Ｔ３３Ｇ、Ｌ４５Ａ、Ｖ４８Ａ、Ｖ５０Ａ、Ｉ５１Ａ、Ｉ５１Ｌ、Ｖ５５Ｅ、Ｄ５８Ａ、Ｄ６１Ｐ、Ｑ９７Ａ、Ｑ９７Ｄ、Ｗ９９Ａ、Ｗ９９Ｆ、Ｗ９９Ｈ、Ｗ９９Ｙ、Ｙ１００ＡＡ、Ｙ１００ＡＦ、Ｖ１０２Ｌ、Ｐ９８Ａ、Ｐ９８Ｙ、Ｐ９８Ｓ、Ｐ９８Ｄ、Ｐ９８Ｑ、Ｐ９８Ｅ、Ｐ９８Ｔ、Ｐ９８Ｒ、Ｐ９８Ｇ、Ｐ９８Ｋ、Ｐ９８Ｍ、Ｐ９８Ｖ、Ｐ９８Ｌ、Ｐ９８Ｉ、Ｐ９８Ｗ、Ｐ９８Ｆ、およびＰ９８Ｈから選ばれるいずれか１つの置換により改変されたアミノ酸配列を含むＶＨを含む、請求項１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  8. 　前記ＩｇＧ部分が、配列番号６で表されるＴｆＲのアミノ酸配列の３５２番目のＡｓｐ、３５５番目のＳｅｒ、３５６番目のＡｓｐ、および３５８番目のＬｙｓから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基、並びに、３６５番目のＭｅｔ、３６６番目のＶａｌ、および３６９番目のＧｌｕから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を認識する、請求項１に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  9. 　前記ＩｇＧ部分の重鎖定常領域が配列番号８４または配列番号８６で表されるアミノ酸配列を含む請求項１～８のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  10. 　前記細胞表面抗原がＥＧＦＲまたはＧＰＣ３である、請求項１～９のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  11. 　前記細胞表面抗原がＥＧＦＲである、請求項１～１０のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  12. 　前記Ｎ末端側ポリペプチドが前記細胞表面抗原に対する抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびＶＨＨのいずれか１つである、請求項１～１１のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  13. 　前記Ｎ末端側ポリペプチドが、前記細胞表面抗原に対する抗体のＦａｂである、請求項１～１２のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  14. 　前記Ｎ末端側ポリペプチドが、ＥＧＦＲに対する抗体のＦａｂであって、該抗体がそれぞれ配列番号６０～６２またはそれぞれ配列番号６５～６７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＨ、およびそれぞれ配列番号１７～１９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３を含むＶＬを含む抗体である、請求項１～９のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  15. 　前記ＥＧＦＲに対する抗体が、以下の（ａ）～（ｅ）から選ばれる１の抗体である、請求項１４に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
    （ａ）配列番号５９または配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体
    （ｂ）配列番号１１０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体
    （ｃ）配列番号１１２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体
    （ｄ）配列番号１１４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体
    （ｅ）配列番号１１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体
  16. 　前記Ｆａｂの重鎖Ｃ末端が前記ＩｇＧ部分の重鎖Ｎ末端に直接結合する、請求項１３～１５のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  17. 　前記Ｆａｂの重鎖Ｃ末端がＩｇＧ部分の重鎖Ｎ末端にリンカーを介して結合する、請求項１３～１５のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  18. 　上記リンカーのアミノ酸配列がＩｇＧのヒンジ領域のアミノ酸配列の一部または全部からなる、請求項１７に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  19. 　前記Ｆａｂおよび前記ＩｇＧ部分が同一のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む請求項１３～１８のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  20. 　請求項１～１９のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片をコードするＤＮＡ。
  21. 　請求項２０に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
  22. 　請求項２１に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
  23. 　請求項２２に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１～１９のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を生産蓄積させ、該培養物からバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を採取することを特徴とする請求項１～１９のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の製造方法。
  24. 　請求項１～１９のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を有効成分として含有する、ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断薬。
  25. 　ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患ががんである請求項２４に記載の治療薬および／または診断薬。
  26. 　請求項１～１９のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を用いる、ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断方法。
  27. 　ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患ががんである請求項２６に記載の方法。
  28. 　ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断に使用するための、請求項１～１９のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  29. 　ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患ががんである請求項２８に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片。
  30. 　ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患の治療および／または診断剤の製造のための、請求項１～１９のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片の使用。
  31. 　ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方が関係する疾患ががんである請求項３０に記載の使用。
  32. 　請求項１～１９のいずれか１項に記載のバイスペシフィック抗体または該バイスペシフィック抗体断片を含む、ヒトＴｆＲおよび細胞表面抗原の少なくとも一方を検出または測定するための試薬。
     
     
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