JPH0322979A - 新規プラスミノーゲン活性化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、組換えＤＮＡ技術により造或される新規なプ
ラスミノーゲン活性化因子、該活性化因子のべブチドを
コードするデ才キシリボ核酸（ＤＮＡ）　、該ＤＮＡを
含有する組換え体プラスミド、該組換え体ブラスミドで
形質転換した微生物細胞または動物細胞、および該微生
物細胞または動物細胞を用いる該プラスミノーゲン活性
化因子の製造法に関する。

本発明の新規なプラスミノーゲン活性化因子は、ウロキ
ナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を不活性型の２本
鎖に切断するプロテアーゼ（トロンビン）に対して安定
であり、このため純粋な形態で容易に精製・採取できる
。この新規なプラスミノーゲン活性化因子は、比活性が
増加しており、安定ですぐれた血栓溶解作用を有してい
る。従って、本発明の新規プラスミノーゲン活性化因子
は脳血栓、心筋梗塞などの治療薬としての利用が期待さ
れる。

従来の技術 現在使用されている血栓溶解剤としてはウロキナーゼ（
ＵＫ）、ストレブトキナーゼ（ＳＫ）、組織プラスミノ
ーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）がある。

ヒトウロキナーゼの１次構造は、ハイネッカーらにより
［Ｈｅｙｎｅｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　　：特開昭５９−
５１３００］明らかにされ、その折りたたみ構造も予想
された。

その構造を第１図に示す。この折りたたみ構造は他のタ
ンパク質との相同性から推定されたもので、以下に示す
３つのドメインに分けられる。Ｎ末端側の第１のドメイ
ンは、表皮或長因子と相同性があるドメインである。以
下、このドメインを“或長因子ドメイン”と呼ぶ。第２
のドメインは、“クリングル・ドメイン２と呼ばれる。

第３のドメイン、すなわちＣ末端のドメインは、いわゆ
るセリンブロテアーゼ領域である。以下、これを１プロ
テアーゼ・ドメイン”と呼ぶ。

ヒトウロキナーゼ（以下ＵＫと称す）には１本鎮型と２
本鎮型が存在している。１本鎮型のＵＫは、プロウロキ
ナーゼ（以下ｐｒｏ−ＵＫと称す）と呼ばれ、このまま
の構造では血栓溶解活性を持たず、プラスミンで２本鎖
に切断されてしめて血栓溶解活性を示す。ところが、プ
ラスミンの切断部位より２アミノ酸上流に切断部位を持
つトロンビンで２本鎖に切断されると、血栓溶解活性を
失う〔イチノセ（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ）ら：ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｌ
，　Ｃｈｅｍ，　）２６１　　．３４８６（１９８６）
］　．従って、ｐ　ｒ　ｏ　−ＵＫは、血中投与後、血
中に存在するトロンビンによって不活性な２本鎖に切断
される。またもし精製過程でトロンビン様プロテアーゼ
が混在すれば、そのプロテアーゼによって不活性な２本
鎖に切断される。

ｐ　ｒ　ｏ−ＵＫがトロンビン様プロテアーゼによって
切断されることを防止するために、トロンビン切断部位
のＰ，位もしくはＰ　，ｒ位にアミノ酸置換を導入した
ｐｒｏ−ＵＫ誘導体が開発されている　（ＢＰ　Ｏ　２
００　４５１および特開昭６２−１４３６８６＞。

しかし、トロンビン切断部位とブラスミン切断部位とは
２アミノ酸しか離れておらず、導入したアミノ酸置換が
ブラスミン切断部位近傍（Ｐ３位〜Ｐ１′位）の場合、
ブラスミンによる切断も起こりにくくなり、得られたｐ
ｒｏ−ＵＫ誘導体は活性型になりにくくなり、比活性の
低下につながる。

事実、上記のｐ　ｒ　ｏ−ＵＫＩＪＩ導体の場合、その
アミノ酸置換部位がブラスミン切断部位のＰ，位、Ｐ，
位であることからプラスミンに対する感受性の低下、す
なわち、比活性の低下が観察されている。

なお、切断される基質ペプチドのアミノ酸残基の番号付
けについては、切断されるペプチド結合を一Ｐ．−Ｐ，
’一とし、切断ペブチド結合のカルボキシル側を構或す
るアミノ酸からアミノ末端に向かってＰ　＋　、Ｐ　２
　、Ｐ　ｓ　、Ｐ−・・・と命名し、一方切断ベプチド
結合のアミノ側を構成するアミノ酸よりカルボキシル末
端側に向かってＰ，′ｐ，／　、ｐ，／　、ｐ４Ｌ　・
・・と命名する。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、ｐｒｏ−ＵＫを不活性化するトＯンビ
ン様プロテアーゼに対して安定であり、かつ、比活性低
下のない新規なｐｒｏ−ＵＫ誘導体の開発を行うことに
ある。

これまでにｐｒｏ−４ＪＫのプラスミン切断部位近傍に
あるトロンビン作用・点Ｐ，位（成熟型ｐｒｏ一〇Ｋの
１５６位のアミノ酸、ブラスミン作用点Ｐ，位）とトロ
ンビン作用点Ｐ１′位（戒熟型ｐｒｏｔＪＫの１５７位
のアミノ酸、ブラスミン作用点Ｐ，位）にアミノ酸置換
を導入することによりトロンビンによって切断しにくく
なったｐｒｏ−ＵＫＩ！ｌ！導体の造或について報告が
なされている。

これらの誘導体はアミノ酸置換の位置がブラスミン切断
位置とは２〜３アミノ酸しか離れておらず、得られたｐ
ｒｏ−ＵＫＩ導体はブラスミンに対する感受性の低下に
より比活性が低下する可能性がある。現に、本発明者は
或熟型ｐｒｏ−ＵＫの１５７位（プラスミンのＰ，位）
のアミノ酸置換により比活性が低下することをｍ認して
いる。また、１５７位のアミノ酸置換の場合、比活性低
下に加えて、トロンビンに対する完全な抵抗性が獲得さ
れていないという問題を有することもわかった。

問題を解決するための手段 本発明では、かかる問題を解決するために、これまでに
全く報告されていない部位のアミノ酸置換、すなわち、
戊熟型ｐｒｏ−ＵＫの１５５位のプロリン（Ｐ　ｒ　ｏ
）にアミノ酸置換を導入した。

その結果、驚くべきことに、１５５位にアミノ酸置換を
導入したｐｒｏ−ＵＫＩＭ導体はトロンビンに対する完
全な抵抗性を獲得したことに加えて、比活性が天然型ｐ
ｒｏ−ＵＫより高くなることを見い出し、本発明を完或
するに至った。

発明の具体的説明 本発明によれば、新規なプラスミノーゲン活性化因子、
該活性化因子のべブチドをコードするＤＮＡ，該ＤＮＡ
を組込んだ組換え体プラスミド、核プラスミドで形質転
換した微生物細胞または動物細胞、および該微生物また
は動物細胞を用いる該プラスミノーゲン活性化因子の製
造法が提供される。

本発明の新規ｆ，（プラスミノーゲン活性因子は、成熟
型ヒトブロウロキナーゼＮ末ｉ（セリン）から１５５番
目のプロリン残基を他のアミノ酸残基に酸換したヒトプ
ロウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子である。

このアミノ酸置換により、プラスミノーゲン活性化因子
とレＣの活性は向七し、かつトロンビン様プロテアーゼ
に対する抵抗性を獲得する。アミノ酸置換は、１５５番
目のプロリン残基をスレオニン残基に置換することが好
ましいが、トロンビン様プロテアーゼに対して抵抗性を
与えるアミノ酸残基であれば、いかなるアミノ酸残基に
も置換することができる。

また、１５５番目のアミノ酸置換と同時に、１５３番目
のロイシン残基を他のアミノ酸残基に置換することによ
ってもプロテアーゼに対する抵抗性を増加させることが
でき、この場合にもプラスミノーゲン活性化因子として
の活性は低下しない。

１５３番目のロイシン残基をアスパラギン残基、１５５
番目のプロリン残基をスレオニン残基に置換した新規な
プラスミノーゲン活性化因子は蛋白質を安定化しうるＮ
型糖鎮付加部位が新たに生じることから、このプラスミ
ノーゲン活性化因子を動物細胞で発現した場合には、１
５３番目のアスパラギン残基にＮ型糖鎮が付加されるこ
とが期待できる。

以下、本発明の新規なプラスミノーゲン活性化因子を、
ｐｒｏ−ＵＫ誘導体と略称する。

本発明の組換え体プラスミドは、上記ｐｒｏＵＫ誘導体
をコードするＤＮＡ断片が宿主細胞内でＤＮＡの発現機
能を持つ適当なブラスミドに組み込まれたものである。

本発明のｐｒｏ−ＵＫ誘導体をコードするＤＮＡ断片と
しては、ヒトＵＫｃＤＮＡにアミノ酸置換を起こす塩基
置換を導入することによって得られる。ヒトＵＫｃＤＮ
Ａとしては、ヒトＵＫをコードするメッセンジャーＲＮ
Ａから組換えＤＮＡ技術で逆転写して得られるｃＤＮＡ
および染色体ＤＮＡから得られるヒトＵＫｃＤＮＡをコ
ードするＤＮＡなどが利用できる。

ヒトＬＩＫｃＤＮＡとしては、ヒトＵＫをコードしてい
るものであればいかなるものも用いることができるが、
具体的にはプラスミドｐＵＫｌあるいはｐＵＫ１１のヒ
トＵＫｃＤＮＡを用いることができる。ｐＵＫ１、ｐＵ
Ｋ１１は、本発明者によって製造されたものであり、そ
のＩＩｌｉ造法は参考例１２、３に記載されている。

ｐＵＫ１とｐＵＫ１１の中のヒトＵＫｃＤＮＡはそれぞ
れＮ末端の一部を欠（ｐｒｏ−ＵＫおよびＣ末端の一部
欠（ｐｒｏ−ＵＫをコードしているが、それぞれのｃＤ
ＮＡの塩基配列は第４表に示す塩基配列の一部と一致し
ている。

なお、ｐＵＫ１を含む大腸菌は８ｓｃｈｅｒ　ｉｃｈ　
ｉａｃｏｌｉ　ＢＩＩＫＩ（ＦＥＩＲＭ　ＢＰ−１４６
３）として、およびｐＵＫｌ１を含む大腸菌はＢｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　ＥＩＩＫＩＩ（ＦＢＲＭ
ＢＰ−１４６４）として、工業技術院微生物工業技術研
究所（微工研）に昭和６２年９月３日付で寄託されてい
る。

ｐ　ｒ　ｏ−ｔＪＫ誘導体をコードするＤＮＡを組込む
プラスミドとしては、微生物細胞または動物細胞で該Ｄ
ＮＡが発現できるものなら、いかなるプラスミドも用い
ることができる。微生物細胞としては大腸菌を用いるの
が好ましい。大腸菌内でｐｒｏ−ＵＫｌｎ導体を発現さ
せるには、適当なプロモーター、例えば、ｔｒｐ系、Ｉ
ｌａｃ系のプロモーターの下流に外来ＤＮＡを挿入する
ことができ、しかもシャインーダルガーノ配列（以下Ｓ
Ｄ配列と略記する）と開始コドン（ＡＴＧ）の間を適当
な距離、例えば６〜ｌ８塩基に調整したブラスミドを用
いることができる。具体的に好適なプラスミドとしては
、本発明者らによって造成されたｐＫＹＰ１０（特開昭
５８−１１０６００）　、ｐＴ　ｒ　Ｓ３３（参考例４
）などがあげられる。

また、ｐｒｏ−ＵＫ誘導体ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを動物細胞で発現させる際に用いるブラスミドとし
ては、動物細胞で該ＤＮＡを発現できるものならいかな
るプラスミドも用いることができる。好ましくは、適当
なプロモーター、例えばＳＶ４　０初期プロモーター、
ＳＶ４０後期プロモーターなどの下流に外来ＤＮＡを挿
入することができ、しかも、ポリＡシグナル、スプライ
シングシグナルなどを有するブラスミドを用いることが
できる。

具体的に好適なブラスミドとしては、本発明者らによっ
て造或されたｐΔＧＥ１０３　　［水上ら：ジャーナＪ
Ｌ，・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．　Ｂ　ｉｏｃｈ
ｅｍ，，）　，１０１　，　１３０７〜１３１０（１９
８７）’］　、ｐｓＥＩＰＡ１ｓＥ１ｄｈｆｒｌ−９，
Ａ（以下、ｐｓＰＡｓｌ−９Ａと略記する）（参考例１
４）などがあげられる。

ｐＡＧＥ　１　０　３を含む大ｌｌ！菌はＥｓｃｈｅｒ
　ｉｃｈ　ｉａｃｏｌｉ　　ＥＡＧＥ１０３　　（ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−１３１２）として昭和６２年３月２３日
付で微工研に寄託されている。また、ジヒドロ葉酸還元
酵素（以下ｄｈｆｒと略記する）遺伝子を選択マーカー
として有するプラスミドとしては、例えば、ｐＳＶ２−
ｄｈｆｒ（ｘス・サブラマ＝　（Ｓ．　Ｓｕｂｒａｍａ
ｎｉ）ら：モレキコラー・アンド・セルラー・パイオロ
ジ４　　（Ｍｏｌ，　Ｃｅｌｌ，　８ｉｏｔ．）　　１
．　８５４（１９８１）　１などがあげられる。

各種ｐｒｏ−ＵＫ誘導体をコードするＤＮ八とベクター
ＤＮＡとの組換えは、制限酵素を用いて両ＯＮ＾を消化
後、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼを用いて結合する一般的組換
えＤＮＡ技法を用いて行うことができる。結合に際して
は、制限酵素を用いて消化したＤＮＡ断片の末端を、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ１・クレノー断片を用いる埋め込み反
応、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いる埋め込み反応また
は削り込み反応を利用して加工する方法やＤＮＡＩＪン
カーを用いる方法によっても行うことができる。

以下に、ｐｒｏ−ＵＫｃＤＮＡを持つプラスミドとして
ｐＵＫｌを用い、必要な場合には化学合成したＤＮＡ断
片を介在させて、各種ｐｒｏ−０１（３％導体をコード
するＤＮＡを組み込んだ組換え体ブラスミドを造成する
例、および各種ｐｒｏ−ｔＪＫ誘導体をコードするＤＮ
Ａを動物細胞発現ベクターｐＳＰＡＳ１−９Δ（参考例
１４）に組み込んだ組換え体ブラスミドを造或する例に
ついて述べる。

まず、ｐ　ｒ　ｏ−ＵＫｌｌ％導体（ＵＫ−Ｔ６）をコ
ードする組換え体プラスミドｐＵＫＴ６を造或する例を
述べる。

第２図に示したようにして、ｐＵＫ１からａｔｔされる
ｐｈＰＡ２　（参考例１０）ｆ−ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ
ｌｌ？で切断した後、約３．　４　ｋｂのＤＮＡ断片を
精魁する。一方、ｐＬＩＫｓ１　　（参考例１１）をＨ
ｉｎｄＩＩＩとＣｆｒｌで切断した後、約０．　７　５
　ｋｂのＤＮＡ断片をｗ４魁する。このようにして得ら
れる２種類のＤＮＡ断片に、第２図に示す２種の５′リ
ン酸化された合ａＤＮＡを加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼに
より結合し、Ｎ末端から１５５番目のＰｒｏがＴ　ｈ　
ｒ　ｔ：置換したｐｒｏ−ＵＫ誘導体（ＵＫ−Ｔ６．）
をコードずるｐｔＪ　Ｋ　Ｔ　６を得る。

次に、ｐ　ｒ　ｏ−ＵＫ誘導体（ＵＫ−Ｔ４）をコード
する組換え体ブラスミドｐＵＫ．Ｔ４、および、ｐｒｏ
−ＵＫ誘導体（ＵＫ−３３＞をコードする組換え体プラ
スミドｐＵＫｓ３を造成する例を述べる。

第３図に示したようにして、ｐｈＰＡ２　　（参考例１
０）をＥｃｏＲＩと｝｛ｉｎｄｌｌｌで切断した後、約
３．４ｋｂのＤＮＡ断片を精製する。一方、ｐ　Ｕ　Ｋ
３１（参考例１１）をＨｉｎｄＩＨとＣｆｒｌで切断し
た後、約０．　７　５　ｋｂのＤＮＡ断片を精製する。

このようにして得られる２種類のＤＮＡ断片に、第３図
に示す２種の５′−リン酸化された合戊ＤＮ八を加え、
Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼにより結合し、Ｎ末端から１．５
　３　ｍ目のＬｅｕがＳｅｔに置換し１５５番目のＰｒ
ｏがＴｈｒに置換したｐｒｏ−ＵＫ誘導体（ＬＩＫ−７
４）をコードするｐ　Ｕ　Ｋ　Ｔ４を得る。また、Ｎ末
端から１５３番目のｌ．　ｅ　ｕがＡｓｎに置換し、１
５５番目のＰｒｏがＴｈｒに置換したｐｒｏ−ＵＫ誘導
体（ｔＪＫ−３３）をコードするｐＬＩＫｓ３を得る。

動物細胞内で目的の各ｐｒｏ−ＵＫ誘導体（ＵＫ−Ｔ６
、ＴＪＫ−Ｔ４、ＵＫ−Ｓ３、ＵＫ−Ｔ）および天然型
ｐｒ○−ＵＫを発現しつるブラスミドＤＮＡを以下のよ
うにして得ることができる。

第４図に示したようにして、ｐＳＰＡＳ　ｌ−９Ａ（参
考例１４）をＸｈｏｒとＫｐｎ　Ｉで切断した後、約８
．６ｋｂＤＮＡ断片を精製する。また、ｐｓＥＩＬＩＫ
ｐｒｏｌ−１八（以下ｐｓＥＵＫ１−Ｉ八と略記する）
（参考例１３）をＸｈｏ　ＩとＢｇｌ■で切断した後、
約０．　７　５　ｋｂのＤＮＡ断片を精製する。一方、
ｐＵＫＴ６をＢｇＩＵとＫｐｎ　Ｉで切断した後、約１
．　１　５　ｋｂのＤＮＡ断片を精製する。

このようにして得られる３種類のＤＮＡ断片をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼにより結合し、ｐｒｏ−ＵＫ誘導体（ＵＫ−
Ｔ６）を発現しつるブラスミドｐＳＥＩＵＫＴ６ＳＥｄ
ｌ．−３　（以下、ｐＳＥＵＫＴ６と略記する）を得る
。

次に第５図に示したようにして、ｐＳＰＡＳ　１−９Ａ
（参考例１４）をＸｈｏ　ＩとＫｐｎ　Ｉで切断した後
、約８．　６　ｋｂのＤＮＡ断片を精製する。

また、ｐｓＥＵＫ１−ＩＡ　（′＃考例１３〉をｘｌ］
ｏＩとＢｇｌ．Ｕで切断した後、約０、７５ｋｂのＤＮ
Ａ断片を精製する。一方、ｐＵＫＴ４をＢｇＩｌｌＩと
Ｋｐｎｌで切断した後、約１．　１　５　ｋｂのＤＮＡ
断片を精製する。このようにして得られる３種類のＤＮ
Ａ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合し、ｐｒｏ−Ｕ
Ｋｙ４導体（ＵＫ−７４）を発現しつるブラスミドｐｓ
ＥＩＵＫＴ４ｓＥｄｌ−３　（以下、ｐｓＥｔＪＫＴ４
と略記する）を得る。

次に、第６図に示したようにして、ｐ　Ｓ　Ｐ　．Ａ　
Ｓ１−９Ａ　（参考例１４）をＸｈｏＴとＫｐｎｌで切
断した後、約８．　６　ｋｂのＤＮＡ断片を精製する。

また、ｐｓＥＵＫｉ−ＩＡ　（参考例１３）をＸ　ｈ．
　ｏ　ＩとＢｇＲｎで切断した後、約０．７５ｋｂのＤ
ＮＡ断片を精製する。一方、ｐｔＪＫｓ３をＢｇｌ■と
Ｋｐｎ　Ｉで切断した後、約Ｌ．　１　５　ｋｂのＤＮ
Ａ断片を精製する。このようにして得られる３種類のＤ
ＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼにより結合し、ｐｒｏ
−ＵＫｉ５ｉ導体（ＵＫ−Ｓ３）を発現しつるブラスミ
ドｐｓＥＩＵＫ３ｓＥｄｌ−３　（以下、ｐｓＥＵＫｓ
３と略記する）を得る。

ｐ　ｒ　ｏ−ＵＫｉｌ！導体ＵＫ−Ｔ６、ＵＫ−Ｔ３お
よびＵＫ−Ｓ　３のアミノ酸配列および相当する塩基配
列をそれぞれ第１、２および３表に示す。

第４表は天然ｐｒｏ−ＵＫのアミノ酸配列およびそれに
相当する塩基配列を示す。

ＩＪＵ　　　　ＩＪＩＩＩ　　　　Ｌｅｅ　　　　Ｉ−
ｅ　　　　ＯＥ　　　　＜ｅ：　　　　ｔＪ＠＜の　　
−１／）　　　←ト　　ーの　　トー　　ト０　　《一
上記組換え技法における反応の条件は、一般的に下記の
とおりである。

ＤＮＡの制限酵素による消化反応は通常０．１〜２０縄
のＤＮＡを２〜２００ｍＭ（好ましくはｌＯ〜４０−）
のＴｒ　ｉ　ｓ−ＨＣ１（ｐＨ６．０〜９．５好ましく
はｐＨ７．０〜８．０）　、Ｏ　〜２　０　０ｍＭのＮ
ａＣＲ、２〜２０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭ
ＭＣｉ２を含む反応液中で、制限酵素０．　１〜１００
単位（好ましくはｔｇのＤＮＡに対して１〜３単位〉を
用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素により
異なる）において、１５分間〜２４時間行う。反応の停
止は、通常５５〜７５℃で、５〜３０分間加熱すること
によるが、フェノールまたはジエチルビロカーボネート
などの試薬により制限酵素を失活させる方法も用いるこ
とができる。

制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の精製は、低融
点アガロースゲル電気泳勤法（以下、ＬＧＴ法と略記す
る）〔エル・ウィスラング−（Ｌ．　Ｗｉｅｓｌａｎｄ
ｅｒ）：アナリティカル・バイオケミストリイー（Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎｉｓｔｒｙ）　９
８．　３０５（１９７９）　〕あるいはアガロースゲル
・凍結融解法（以下、ＡＦＴ法と略記する）を用いて行
うことができる。このＡＦＴ法とは、ＤＮＡ断片を含む
アガロースゲル（０．７〜１．５％）のスライスに対し
て、等量のＴＢ緩衝液［１０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−｝ＩＣ
ｊ！　　（ｐＨ　７．５＞　、１　ｍＭ　ＥＤＴ＾）お
よび２倍量のフェノール（ＴＥ緩衝液で飽和したもの）
を加え、混合した後、−７０℃と６５℃での凍結一融解
を２回繰り返し、さらに遠心分離によって生じる上層の
水溶液を分取し、エタノール沈殿によってＤＮＡ断片を
回収する方法である。あるいは、ＤＮＡ断片回収機・マ
ックスイールド八Ｂ−３２４１型（アト一株式会社製）
を用いて、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルか
らＤＮＡ断片を電気泳動によって溶出し、精製できる（
以下、この方法を電気泳動的溶出法と略称する）。

ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００ｍＭ（好ましくは
１０〜４０ＩＩＩＭ）のＴ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣ　１　
（ｐＨ６．１〜９．５、好ましくはｐ｝１７．０〜８．
０＞　、２〜２　０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）の
Ｍ　ｇ　Ｃ　ｌ　ｚ　，　０．　１〜１０ｍＭ（好まし
くは０．　５　〜２．　Ｏ　ｒｎＭ）のＡＴＰ，１〜５
０ｎＭ（好ましくは５〜！（ｌｍ＆ｌ）のジチ才スレイ
トール（以下、Ｄ　′ｒ　Ｔと略記する）を含む反応液
中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１−１０００単位を用い、１
〜３７℃（好ましくは３〜２０℃）で１５分間〜７２時
間（好ましくは２〜２０時間）行う。

結合反応によって生じた組換え体ブラスミドＤＮＡは、
必要によりコーエンらの形質転換法〔エス・エヌ・コー
エン（Ｓ．　Ｎ．　Ｃｏｈｅｎ）ら：ブロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・才ブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔｌ．＾ｃａｄ，　Ｓｃｉ，）、
ＵＳＡ．　６９．　２１１０（１．９７２）：ｌあるい
はハナハンの形質転換法（｝Ｉａｃａｈａｎ　：ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイ才ロジー（Ｊ，　Ｍｏ
ｌ，　Ｂｉｏｌ，＞　１６６　，　５５７（１９８３）
　Ｅを用いて、大腸菌に導入する。

結合反応によって生じた組み換え体Ｍ１３ファ一ジＲＦ
ＤＮ八は、必要により公知のトランスフェクション法〔
口野嘉幸ら：蛋白質・核酸・酵素２９　，　２９４（１
９８４））によって、大腸１１ＪＭ１０５株〔ジエイ・
メシング（Ｊ，　Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら：ジーン（Ｇａｎ
ｅ）　３３　，１０３　（１９８５））に導入する。

組換え体ブラスミドＤＮＡおよび組み換え体Ｍ１３ファ
ージＲＦＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの単離は、バ
ーンボイムらの方法〔エイチ・シー・バーンボイム（Ｈ
．　Ｃ．　Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）　　ら：ヌクレイック・
アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒ
ｅｓ，）７．　１５１３（１９７９）：ｌなどを用いて
行う。

組み換え体Ｍ１３ファージからの一本ｍＤＮＡの単離は
公知の方法〔口野嘉幸ら；蛋白質・核酸・酵素２９　，
　２９４　（１９８４）：］に従って行う。

本発明で使用するデオキシオリゴヌクレ才チドは、リン
酸アミダイト法による固相合戊法ＣＳ，ｔ，，Ｂｅａｕ
ｃａｇｅら：テトラヘドロン●レターズ（７ｅｔｒａｈ
ｅｄｒａｎ　Ｌｅｔｔ．）　２２．　１８５９（１９８
］＞）　、およびＬ．　Ｊ．ＢｃＢｒｉｅら：同２４．
　２４５（１９８３）　］に従い、アブライド・バイオ
システムズ社３８０＾・ＤＮＡ合成機〔＾ｐｐｌｉｅｄ
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．，　Ｆｏｓｔｅｒ　
Ｃｉｔｙ，　Ｃ＾９４４０４　３を用いて合或すること
ができる。合或されたデオキシオリゴヌ々レオチドを他
のＤＮＡ断片と結合させる反応に用いる場合には、約２
０ビコモル（ｐｍｏｌｅｓ）のテ゛オキシオリゴヌクレ
才チドを２０〃のＴ４キナーゼ緩衝液［５０＋ｎＭ　Ｔ
ｒｉｓ−Ｈ［ｌ”Ｊ　（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ　　Ｍ
ｇＣＩＢ　、５ｍＭ　　ＤＴＴ，　０．１ｍＭＥＤＴＡ
，０．５ｍＭ　　八ＴＰ）中で、５単位のＴ４ＤＮＡキ
ナーゼを加えることにより、５′−リン酸化する。ハイ
ブリダイゼーション用のブローブとして用いる場合には
、上記のＴ４キナーゼ緩衝液の中の０．　５　ｍａｌ　
　Ａ　Ｔ　Ｐの代わりに２０〜５０μ［：ｉの５’　−
　Ｃ　ｒ　−　″２Ｐ　］　Ａ　Ｔ　Ｐ　（３０００　
Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマーシャム（＾ｍｅｒｓｈａｍ　ｓ
＾ｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ，　Ｕ　）を用い
て、その５′末端を放射能標識する。

ブラスミドＤＮＡの構造解析については、ブラスミドＤ
ＮＡを１〜１０種類の制限酵素で消化後アガロースゲル
電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り切断部位を調べる。さらにＤＮＡの塩基配列を決定す
る必要があるときはＭ１３ファージを用いたディテ′才
キシ・シークエンス（ｄｉｄｅｏｘｙ　ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ）法によって決定する。

本発明のｐ　ｒ　ｏ−ＵＫｔｓ導体ポリベプチドは大ｍ
菌あるいは動物細胞を宿主として用いることにより、以
下のようにして製造することができる。

以下に、動物細胞を宿主として該ｐｒｏ−ＵＫ誘導体ポ
リペプチドを生産する方法について述べる。

ｐ　ｒ　ｏ−ＵＫ誘導体ポリベプチドを発現させる際の
宿主としては、該ペプチドを発現できるものならいかな
る動物細胞も用いることができる。具体的に好適な動物
細胞としては、ｄｈｆｒが欠損したＣＨＯ細胞〔ジー・
ウルラウブ＆エル・エー・チェイシン（Ｇ．　Ｕｒｌａ
ｕｂ　＆　Ｌ，＾，　Ｃｈａｓｉｎ）　：　Ｐｒｏｃ，
Ｎａｔｌ．＾ｃａｄ，Ｓｃｉ，，　ＵＳＡ，７７．　４
２１６　（１９８０）　］などがあげられる。

以下に、ｐｒｏ−ＵＫＩＩ導体ＬＩＫ−Ｔ６を発現しつ
るブラスミドとしてｐｓＥＩＪＫＴ６および宿主として
ｄｈｆｒを欠損したＣＨＯ細胞を用いて該ｐｒｏ−ＵＫ
誘導体ポリベプチドを魁造する例を述べる。

すなわち、プラスミドｐｓＥＬＪＫＴ６を例えばリン酸
カルシウム法〔グラハム＆ファン・デル・エブ（Ｇｒａ
ｈａｍ　＆　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）　：ヴ４ｏｏジ４
　（Ｖｉｒｏ１＋）ｌｌＹ）５２．　５４６（１９７Ｂ
）　〕によりｄｈｆｒ欠損ＣＩ｛０株に導入する。ｐｓ
ＥＵＫＴ６を有する形質転換株は例えば０４１８および
透析ウシ胎児血清を含むＭＥＭＡＬＰＨＡ培地（リポ核
酸およびデオキシリボ核酸不含有；ギブコ・オリエンタ
ル社製９により選択することができる。さらに形質転換
株の中からメントレヰセートを用いて咳生理活性ポリペ
プチド遺伝子が増幅された形質転換株を得ることもでき
る。得られた形質転換株を培地に培養することにより培
養物中にｐ　ｒ　ｏ　−ＬＩＫ誘導体ポリベプチドを生
成させることができる。

培地としては、各種血清（例えばウシ胎児血清）を加え
たハムＦＩＯ培地、ハムＦ１２培地（以上フローラボ社
製）、ダルベツコＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地
（以上日水製薬社製）　、ＭＥＭ　ＡＬＰＩＩ八培地お
よびこれらの混合培地が用いられる。培地には必要によ
り、グルタミン０．　５〜５　ｍＭ，抗生物質〔ペニシ
リン（２５Ｕ／ｍ＋）　、ストレプトマイシン（２５ｇ
／ｍｌ）　、０　４　１　８　（０．　３　ｍｇ／＋ｍ
ｌ）など〕、重曹（０．０１％）などを適量加えてもよ
い。

培養には、種々の培養ビン、ディッシコ、ローラボトル
、スピンナーフラスコ、ジャーファーメンターなどを用
いることができる。培養は、通常種細胞密度５×１０４
〜ｌｘｌＯ＠細胞／ＩＩＩｌとし、３０〜４０℃、２〜
１０日間行うと、各細胞密度に応じ、本発明物質が主に
細胞外に分泌される。

培養物から細胞を遠心除去し、遠心後の上清よりｐｒｏ
−ＵＫ誘導体ポリペプチドを分離精製する。得られたｐ
　ｒ　ｏ−ＵＫ誘導体ポリペブチドのプラスミノーゲン
活性化活性は、フノブリン・プレート・アッセイ法（Ｇ
ｒａｎｅｌｌｉ−ＰｉｐｅｒｎｏとＲｅｉｃｈ：ジャー
ナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（　Ｊ，
　　Ｅｘｐ，Ｍａｄ．＞　１４８　．２２３（１９７８
））によって定量することができる。

以上、新規ｐｒｏ−ＵＫ誘導体（ＵＫ−７６）の製造法
について述べたが、その他のｐｒｏ−ＵＫｖｓ導体の場
合も同様に製造することができる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例ｌ ｐｒｏ−ＵＫ誘導体（ＵＫ−７６）をコードする組換え
体ブラスミドｐＵＫＴ６の造成（第２図参照）： 参考例１１で得られたｐＬＪＫｓ　１ブラスミドＤＮＡ
約２縄を３０ｄのＹ−１００緩衝液Ｃ１０ｍＭＴｒ　ｉ
　ｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７．５）　、１　０　０ｍＭＮａ
Ｃ１、？ｍＭ　　ＭｇＣＣ、６ｍＭ　　２−メルカブト
タノールを含む溶液〕に溶かし、１６単位のＣｆｒｌ（
宝酒造社製、以下特記しない限り、制限酵素は宝酒造社
製を用いた）とｌＯ単位のＨｉｎｄＩＩＩを加え、３７
℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処
理後、ＡＦＴ法を用いて約０．　７　５　ｋｂのＤＮＡ
断片を精製した。一方、参考例１０で得られたｌＰＡ２
プラスミドＤＮＡ約２■を３０−のＹ−１００緩衝液に
溶かし、１０単位のＨｉｎｄＩＩＩと１単位のＥＣＯＲ
Ｉを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、
ｌＯ分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約３．　４　ｋ
ｂのＤＮＡ断片を精製した。下記２種の合戊ＤＮＡ（４
３塩基と４３塩基） （４３塩基〉 をアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ−ＤＮＡ合
戊機を用いて合戊した。

次にこのようにして得られた合成ＤＮＡ２５ピコモル（
ｐｍｏｌｅｓ）ずつを１０〃の５０ｍＭＴｒｉｓＨＣ！
　（ｐＨ７．６）　、１　０ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ、５ｍ
Ｍ　　ＤＴＴ１０．１ｍＭ　　ＥＤＴ．Ａ％０．５ｍＭ
ＡＴＰを含む溶液（以下、Ｔ４キナーゼ緩衝液と略記す
る）中で、５単位のＴ４ＤＮＡキナーゼ（宝酒造社製）
を加え、３７℃で３０分間反応させることにより、５′
末端をリン酸化した。

このようにして得られたｐＵＫｓ１由来の約０．　７　
５　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．　１■）、ｐｈＰＡ２由
来の約３．　４　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１■）、お
よび５′リン酸化された２種の合成ＤＮＡ　（１ピコモ
ルずつ）を全量２０〃の２　０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　ｓ−
ＨＣｊ！（ｐＨ７．６）　、１０ｍＭ　　ＭｇＣ１．、
１０ｍＭＤＴＴおよび１ｍＭ　　ＡＴＰを含む緩衝液（
以下、“Ｔｌカーゼ緩衝液゜と略記する）に溶かし、３
００単位のＴ４リガーゼ（宝酒造社製）を加え、４℃で
１８時間結合反応を行った。得られた組換え体ブラスミ
ドの混合物を用いて、大腸菌ＭＭ２９４株ＣＦ−　ｈｓ
ｄＲ−　ｈｓｄＭ　”　ｅｎｄｏＩ　−　ｔｈｉ　］〔
＾ＴＣＣ３１４４６．　　Ｋ，Ｂａｃｋｍａｎら：Ｐｒ
ｏｃ，　Ｎａｔｌ，＾ｃａｄ．Ｓｃｉ，，ＵＳ＾　７３
　　．　４１７４　（１９７６）の論文中の大腸菌２９
４株と同一菌株である。〕を形質転換し、アンビシリン
（以下、Ａｐと略記する〉耐性株を得た。この形質転換
株からブラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消化による
構造解析およびＭ１３ディオキシ・シークエンス法によ
る塩基配列決定を行い、目的の構造を有しているブラス
ミドＤＮＡをｐＵＫＴ６とした。（第２図参照）。

実施例２ ｐ　ｒ　ｏ−ＵＫ誘導体ＵＫ−Ｔ４およびＵＫ−Ｓ３を
コードする組換えプラスミドｐＵＫＴ４およびｐＵＫＳ
３の造成（第３図参照） 参考例ｌ１で辱られたｐＵＫｓ１ブラスミドＤＮＡ約２
■を３０ｄのＹ−１００１１衝液に溶かし、１６単位の
Ｃｆｒｌと１０単位のＨ　ｉ　ｎｄＩｎを加え、３７℃
で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理
後、ＡＦＴ法を用いて約０，７５ｋｂのＤＮＡ断片を精
製した。一方、参考例１０で得られたｐｈＰＡ２ブラス
ミドＤＮＡ約２埒を３０犀のＹ−１００緩衝液に溶かし
、１０単位のＨｉｎｄＩ［［とｌ単位のＥｃｏＲＩを加
え、３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分
間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約３．４ｋｂのＤＮＡ
断片を精製した。実施例ｌに述べｔこ方法に従い、下記
２種の合成ＤＮＡ（４３塩基と４３塩基）を合或し、５
′末端のリン酸化を行った。

Ｇ ５’　−　ＧＧＣＣ＾＾＾＾ＧＡＣＴＡＴＴＣＧ＾＾Ｃ
ＧＣＧＴＴＴＴＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＧＡＧ−３
′ ３’　−　ＴＴＴＴＣＴＧＡＴ＾＾ＧＣＴＴＧＣＧＣ＾
＾＾＾ＴＴＣＴ＾＾ＴＡＡＣＣＣＣＣＴＣＴＴ＾＾−５
′Ｃ このようにして得られたｐＵＫ３１由来の約０．７５ｋ
ｂのＤＮＡ断片（約０．　１■）、ｐｈＰＡ２由来の約
３．　４　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１■）、および５
′リン酸化された２種の合ａＤＮＡ　（１ピコモルずつ
）を全量２０ｄのＴ４１Ｊガーゼ緩衝液に溶かし、３０
０単位のＴ４１Ｊガーゼを加え、４℃で１８時間結合反
応を行った。得られた組換え体ブラスミドの混合物を用
いて、大腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を
得た。この形質転換株からプラスミドＤＮＡを単離し、
制限酵素消化による構造解析およびＭ１３ディデオキシ
・シークエンス法による塩基配列決定を行った結果、目
的の構造を有し、Ｎ末端から１５３番目のＬｅｕと１５
５番目のＰｒｏがＳｅｒとＴｈｒにそれぞれ置換したア
ミノ酸配列をコードするプラスミドＤＮＡをｐＵＫＴ４
、そして、Ｎ末端から１５３番目のＬｅｕと１５５番目
のＰｒｏがＡｓｎとＴｈｒとにそれぞれ置換したアミノ
酸配列をコードするペブチドＤＮＡをｐＵＫｓ３と命名
したく第３図参照〉。

実施例３ ＵＫ−Ｔ６発現ブラスミドＤＮＡｐＳＥＵＫＴ６の造或
（第４図参照）： 参考例１４で得られたｐｓＰＡｓ　１−９八ブラスミド
ＤＮＡ約２■を３０犀のＹ−０緩衝液（１　０ｍＭ　　
Ｔｒ　ｉ　ｓ−ＨＣｉ　（ｐＨ７．５＞、７ｍＭ　　Ｍ
ｇＣｌ．　、６ｒｎＭ　　２−メルカブトエタノールを
含む溶液〕に溶かし、ｌＯ単位のＫｐｎ　Ｔを加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。続いて１．５〃の　２
Ｍ　　ＮａＣ１とｌＯ単位のＸｈｏｌを加え、さらに３
７℃で１時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱
処理後、ＡＦＴ法を用いて約８．６κｂのＤＮＡ断片を
精魁した。

また、ｐｓＥＵＫ１−ＩＡブラスミドＤＮＡ約３■を３
０−のＹ−１００ｆｆｌ衝液に溶かし、１２単位のＢｇ
ｌｎと１２単位のＸｈｏＩを加え、３７℃で２時間消化
反応を行った。６５℃、ｌＯ分間の熱処理後、ＡＦＴ法
を用いて約０，７５κｂのＤＮＡ断片を精製した。一方
、上で得られたｐＵＫＴ６プラスミドＤＮＡ約３■を３
０ＡＩ！のＹ−０緩衡液に溶かし、１５単位のＫｐｎ　
Ｉを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。続いて１
．５〃の２ＭＮａＣｆとｌ２単位のＢｇｌＵを加え、さ
らに３７℃で１時間消化反応を行った。

６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約１，
ｌ５κｂのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐｓＰＡｓ１−９Ａ由来の約８
．６κｂのＤＮＡ断片（約０．１■）、ｐＳＥＵＫＩ−
ＩＡ由来の約０、７５κｂのＤＮＡ断片（約０．０２■
）、およびｐＵＫＴ６由来の約１．　１　５　ＫｂのＤ
ＮＡ断片（約０．０２■）を全量　２０〃のＴ４リガー
ゼ級衝液に溶かし、１００単位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ
を加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この形
質転換株からブラスミドＤＮＡ，ｐＳＥＵＫＴ６を単離
し、制限酵素消化による構造解析を行ったところ、ｐｓ
ＥＵＴ６は目的の構造を有することを確認した（第４図
参照）。

実施例４ ＵＫ−Ｔ４発現ブラスミドＤＮＡｐＳＥＵＫＴ４の造戊
（第５図参照）： 参考例１４で得られたｐｓＰＡｓ１−９ＡプラスミドＤ
ＮＡ約２■を３０ｄのＹ−０緩衝液に溶かし、１０単位
のＫｐｎｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。

続いて１．５Ｈの２Ｍ　　ＮａＣｊ！と１０単位のＸｈ
ｏｌを加え、さらに３７℃で１時間消化反応を行った。

６５℃、ｌＯ分間の熱処理後、ＡＰＴ法を用いて約８．
　６　ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。また、ｐｓＥＵＫ
１−ＩＡブラスミドＤＮＡ約３鴻を３０〃のＹ−１００
緩衝液に溶かし、１２単位のＢｇｌｎと１２単位のＸｈ
ｏｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃
、ｌＯ分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約０．７５Ｋ
ｂのＤＮＡ断片を精製した。一方、上で得られたｐＵＫ
Ｔ４プラスミドＤＮＡ約３鴻を３０ｙのＹ−Ｏｔ１衝液
に溶かし、１５単位のＫｐｎ　Ｉを加え、３７℃で２時
間消化反応を行った。続いて１．　５　ｄの２Ｍ　　Ｎ
ａＣｉとｌ２単位のＢｇｌ＃を加え、さらに３７℃で１
時間消化反応を行った。

６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約１．
　１　５　ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐｓＰＡｓ１−９Ａ由来の約８
．６κｂのＤＮＡ断片（約０．１．）、ｐＳＥＵＫＩ−
ＩＡ由来の約０．７５κｂのＤＮＡ断片（約０．０２ｕ
ｇ）、およびｐＵＫ７４由来の約１．１５ＫｂのＤＮＡ
断片（約０．０２ｇ）を全量　２０ｕ１のＴ４リガーゼ
緩衝液に溶かし、１００単位の７４ＤＮＡリガーゼを加
え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体ブラスミドの混合物を用いて：大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡ，ｐＳＥＵＫＴ４を単離
し、制限酵素消化による構造解析を行ったところ、ｐ　
Ｓ　Ｅ　Ｕ　Ｋ　Ｔ　４は目的の構造を有することを確
認した（第５図参照）。

実施例５ ＵＫ−３３発現プラスミドｐＳＥＵＫＳ３の造或（第６
図参照）： 参考例ｌ４で得られたｐｓＰＡｓ１−９ＡブラスミドＤ
ＮＡ約２■を３０ｄのＹ−０緩衝液に溶かし、ｌＯ単位
のＫｐｎ　Ｉを加え、３７℃で２時間消化反応を行った
。続いて１．５〃の２Ｍ　　ＮａＣ１とｌＯ単位のＸｈ
ｏＩを加え、さらに３７℃で１時間消化反応を行った。

６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約８．
　６　ＫｂのＤＮＡ断片を＃ｉ製した。また、ｐｓＥＵ
Ｋ１−ＩＡブラスミドＤＮＡ約３塊を３０〃のＹ−１０
０緩衝液に溶かし、■２単位０）ＢｇｌＩＢ：１２単位
のｘｈＯＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。

６５℃、ｌＯ分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約０．
７５ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。一方、上で得られた
ｐＵＫｓ３プラスミドＤＮＡ約３ＡＬｇを３０〃のＹＯ
ｔｊ！衝液に溶かし、ｌ５単位のＫｐｎ　Ｔを加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。続いて１．５−の２Ｍ
　　ＮａＣｊ！と１２単位のＢｇＩＩＩを加え、さらに
３７℃で１時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の
熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約１，１５κｂのＤＮＡ断
片を精製した。

このようにして得られたｐＳＰＡＳ　１−９Ａ由来の約
８．６Ｋｂｌ７）ＤＮＡ断片（約０．１ｇ＞、ｐＳＥｔ
Ｊ　Ｋ．　１　−．　］．　Ａ由来の約０．　７　５　
ＫｂのＤＮＡ断片（約０．０２ｇ）、およびｐＵＫ３　
１由来の約１．１５κｂのＤＮＡ断片（約０．０２塊）
を全量　２０−のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、１００
単位の７４ＤＮＡＩＪガーゼを加え、４℃で１８時間結
合反応を行った。

得られた組換え体ブラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡ，ｐｓＥＵＫｓ３を単離
し、制限酵素消化による構造解析を行ったところ、ｐｓ
ＥＵＫｓ３は目的の構造を有することをｆＩ１認した（
第６図参照）。

実施例６ 各種ｐｒｏ−Ｌ！Ｋ誘堺体及び天然型ｐｒｏ−ＵＫの動
物細胞による生産： （１）　　ｐ　Ｓ　Ｅ　Ｕ　Ｋ　Ｔ　６を保有するＣ　
｝｛　Ｏ細胞によるＵＫ−７６ポリペブチドの生産： 実施例３で得られたｐＳＥＵＫＴ６のｄｈｆｒ欠損ＣＨ
Ｏ株への導入はリン酸カルシウム法に準じて行った。す
なわち、ＦＣＳＬ／１．０量および７．５％ＮａＨＣＯ
，溶液（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社１１）
　１／５０量を加えたＭＥＭα（非選択培地）５ｍｌに
ＩＸＩＯ’細胞／ｍｌになるように細胞を接種し〔培養
には直径６Ｃ−のデイツシコを使用した：　ＬＵＸ社製
（以下、培養にはＬＵＸ社のディッシ一を用いた））、
３７℃、Ｃ○，インキュベーターにて１日間培養した。

一方、ｐＳＥＵＫＴ６ＤＮＡ　　１０ｕｇを４５０犀の
１０ｍＭＴ　ｒ　ｉ　ｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７．５）溶液
に溶解し、この溶液に５００〃の２８０ｍＭ　　ＮａＣ
ｊ！、１．　５　ｍＭ　Ｎ　ａ　２Ｈ　Ｐ　Ｏ　ａ、５
　０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロヰシエチルピペ
ラジンーＮ′−２−エタンスルフォン酸）　　（ｐＨ７
．１）を含む溶液を加えて混合した。さらに５０〃の２
．５ＭＣ　ａ　Ｃ　Ｒ　２溶液を加えて混合し、室温で
５分間静置した。このＤＮＡ溶液全量を、培地を除き新
しいＭＥＭα（非選択培地）１０＋Ｉを加えてさら１時
間培養したｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ株に添加し、８時間イン
キユベートした。ＰＢＳで細胞を洗浄し、５ｍｌのＭＥ
Ｍα（非選択培地）を加えて１６時間培養した。細胞を
ＰＢＳ　ＣＮａＣＩｌ８ｇ／ｊ！，ＫＣｆ　　Ｏ．２ｇ
／１、Ｎａ２ＨＰ○，（無水）１．１　５　ｇ／ＲＳＫ
Ｈ．Ｐ○．０．２ｇ／ｉ！〕で洗浄し、０．０５％トリ
プシン、０．２％ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）
を含む溶液３ｍｌを加え、余分の溶液を除いた後、３７
℃に５分間インキユベートした（トリブシン処理）。透
析ＦＣＳ　（ギブコ・オリエンタル社製）をｌＯ％、７
，５％Ｎ　ａ　Ｈ　Ｃ　Ｏ　ｓ溶液を１／５０量、ｌ０
０×非必須アミノ酸溶液を１／１００量、０４１８（ギ
ブコ・オリエンタル社製）を０．３■／ｍｌになるよう
に加えたＭＥＭα（選択培地）を加えてよく細胞を懸濁
し、直径１０ｃｍのディッシュを用い、３７℃、Ｃ０２
インキコーベーターにて５日間培養した。ＰＢＳで細胞
を洗浄し、ＭＥＭα（選択培地）を加えて５日間培養し
た。同様の操作をして、さらに５日間培養した。ＰＢＳ
で細胞を洗浄した後、トリブシン処理し、１０ｍｌのＭ
ＥＭα（選択培地）を加えて細胞を懸濁し、直径６ｃｍ
のディッシュを用い、３７℃、Ｃ○，インキュベーター
にて３〜７日間培養した。出現してきたコロニーをトリ
プシン処理した後、５０ｎＭのＭＴＸを含む１０ｍｌの
ＭＥＭ（２（選択培地）を用いて細胞涜度５　Ｘ　１　
０　’／ｍｌになるように直径ｌｏａｎのディッシュ１
枚に植え込んだ。５日おきに上記培地を用いて培地の交
換を計３回行った。出現してきたＭＴＸ耐性のコロニー
を単コロニー分離し、各々直径・６備のディッシュを用
い、コンフルエントになるまで培養した。５ｍｌの５０
ｎＭ　　ＭＴＸを含むＭＥＭα（選択培地）に交換し、
１日後培養液中のＬＪＫ−７６の活性をフィブリン・プ
レート・アッセイ法［Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎ
ｏとＲｅｉｃｈ　：ジャーナル・才ブ・エクスペリメン
タル・メディシン（Ｊ．Ｂｘｐ．Ｍｅｄ，）　　１４８
．　２３３（１９７８）　）を用いて調べた。その結果
、クローンｋ２４の活性が最も高く、そのＵＫ−Ｔ６の
生産量は５■／１０’細胞・日であった。このクローン
を１００ｍｌの５０ｎＭ　　ＭＴＸを含むＭＥＭα（選
択培地）を含むファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）　３０２７
型ローラー・ボトルで培養し、コンフルエントになった
後、ＦＣＳを除去した１　０　ＫＩＤ／ｍｌアブロチニ
ン（ベーリンガー・マンハイム社）を含む上記培地を用
い、３日間培養した。この１００ｍｌの培養液は実施例
７で用いた。

（２）　　ｐＳＥＵＫＴ４を保有する動物細胞によるＵ
Ｋ−７４ポリペプチドの生産： 実施例４で得られた組換え体プラスミドｐｓＥＵＫＴ４
およびｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞株を用いて、上で述べた
手順と同様の手順でＵＫ−Ｔ４を生産する細胞株を得た
。この中でクローンＮＩ１８の活性が最も高く、そのＵ
Ｋ−７４の生産量は３■／ｌ０６細胞・日であった。こ
のク・ローンを、１００ｍｌの５０ｎＭ　　ＭＴＸを含
むＭＥＭα（選択培地）を含むファルコン３０２７型ロ
ーラー・ボトルで培養し、コンフルエントになった後、
ＦＣＳを除去した１　０　ＫＩＵ／ｍｌ７プロチニン　
（ペーリンガー・マンハイム社）ヲ含む上記培地を用い
、３日間培養した。この１００ｍｌの培養液は実施例７
で用いた。

（３）　　ｐ　Ｓ　Ｅ　［Ｉ　Ｋ　Ｓ　３を保有する動
物細胞によるＵＫ−３３ポリベプチドの生産： 実施例５で得られた組換え体プラスミドｐＳＥＵＫＳ３
およびｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞株を用いて、上で述べた
手順と同様の手順でＵＫＳ３を生産する細胞株を得た。

この中でクローン馳１３の活性が最も高く、そのＵＫ−
９３の生産量は３■／１０６細胞・日であった。このク
ローンを、１００ｍｌの５０ｎＭ　　ＭＴＸを含むＭＥ
Ｍα（選択培地）を含むファルコン３０２７型ローラー
・央トルで培養し、コンフルエントになった後、ＦＣＳ
を除去した１０κＩＩ／ｍｌアブロチニン（ベーリンガ
ー・マンハイム社）ヲ含む上記培地を用い、３日間培養
した。この１００ｍｌの培養液は実施例７で用いた。

（４）　　ｐｓＥＩＵＫＴ１−１ｄ　（以下、ｐｓＥＵ
ＫＴと略記する》を保有する動物細胞によるｐｒｏＬＩ
Ｋポリベプチドの生産： 参考例１６で得られた組換え体プラスミドｐｓＥＵＫＴ
およびｄｈｆｒ欠１ｆｉＣＨ○細胞株を用いて、上で述
べた手順と同様の手順でＵＫ−Ｔを生産する細胞株を得
た。この中でクローンＮ（Ｌ　２１の活性が最も高く、
そのＵＫ−Ｔ４の生産量は３■／１０６細胞・日であっ
た。このクローンを、１００ｍｌの５０ｎＭ　　ＭＴＸ
を含むＭＥＭα（選択培地）を含むファルコン３０２７
型ローラー・ボトルで培養し、コンフルエントになった
後、ＦＣＳを除去した１０κＩｌｌ／ｍｌアブロチニン
（ベーリンガー・マンハイム社》ヲ含む上記培地を用い
、３日間培養した。この１００ｍｌの培養液は実施例７
で用いた。

（５）　　ｐｓＥＵＫｌ−ＩＡを保有する動物細胞によ
るｐｒｏ−ＬＩＫポリペプチドの生産：参考例１３で得
られた組換え体プラスミドｐｓＥＵＫ１−ＩＡとｐＳＶ
２−ａｈｆｒおよびｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞株を用いて
、上で述べた手順と同様の手順でｐｒＯ−ＵＫを生産す
る細胞株を得た。この中でクローンＮａ５の活性が最も
高く、そのｐｒｏ−ＵＫの生産量は３ｇ／１０′細胞・
日であった。このクローンを、１００ｍｌの５０ｎＭ　
　ＭＴＸを含むＭＥＭａ（選択培地）を含むファルコン
３０２７型ローラー・ボトルで培養し、コンフルエント
になった後、ＦＣＳを除去した１０κＩＩ／ｍｌアブロ
チニン（ヘ−リンガー・マンハイム社）を含む上記培地
を用い、３日間培養した。この１００ｍｌの培養液は実
施例７で用いた。

実施例７ 天然型ｐｒｏ−ＵＫ及び各種ｐｒｏ−ＵＫ誘導体の動物
細胞培養液からの精製： 実施例６で得た天然型ｐ　ｒ　ｏ−ＵＫあるいはｐｒｏ
−ＵＫ誘導体を含有する無血清培養液２００ｍｌを０，
０１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　８　０と０。０５％Ｎ
　ａ　Ｎ　３および１００ｍＭ　　ＮａＣｆを含む５０
ｍＭ　　ＩＩＩン酸緩衡液（　ｐ　Ｈ　７．　５　）で
平衡化した４―の抗ＵＫモノクローナル抗体力ラム［フ
ァルマシア　ＣＮＢｒ一活性化セフ７０−ス（Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ）４Ｂ（ファルマシア・ジャパン株式会社（
ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）製
〕に抗ＵＫモノクローナル抗体〔抗ＵＫモノクローナル
抗体は、低分子型ウロキナーゼ（日本ケミカルリサーチ
株式会社製）を抗原としてミルスタインらの方法（Ｃ．
　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ　　２５６　．　４
９５−４９７．　　１９７５）に従い取得した。〕を結
合させたもの］に通した。その後、カラム平衡時に使用
した緩衝液を３ベッド体積分だけ流した。次に、０、０
１％Ｔｗｅｅｎ　８　０．　　０．　０　５％ＮａＮ．
、１００ｍＭ　　ＮａＣ１および２００ｍＭアルギニン
を含むリン酸−クエンｌｉｉｌ！級衝液（ｐＨ４．０）
１６蚊を用いて溶出し、１ｍｌずつ分画した。溶出液は
直ちにリン酸でｐＨ７．５に調整し、０．Ｏｌ％Ｔｗｅ
ｅｎ８０，０．０５％ＮａＮｓ、１００ｍＭＮａＣ！お
よび２００ｍＭアルギニンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７
．５）（以下、ＵＫ緩衝液と略記する）に４℃、１日透
析した。これを最終精製標品とし、以下の実験に使用し
た。この最終精製標品は、１本鎖であり、９５％以上の
純度であることをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
で確認した。また、ｐ　ｒ　ｏ−ＵＫＩＩｉ導体ＵＫ−
Ｓ３はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−というＮ−グリコシレーシ
ョン部位を持っており、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動より糖鎖の付加したものと思われる。

分子量の増加も確詔された。

実施例８ 天然型ｐｒｏ−ＵＫとｐｒｏ−ＬＩＫＩ導体の比活性の
比較： 実施例７で得られた天然型ｐ　ｒ　ｏ　−ＵＫまたはｐ
ｒｏ−ＵＫ＆？！導体を含む最終精製標品を逆相ＨＰＬ
Ｃ力ラム（ＴＳＫｇｅｌ　　ＯＤＳ−１２０Ｔ　東ソー
社製）にかけ、そのピーク面積を、ローリー法〔ローリ
ー（Ｌｏｗｒｙ）　ら：ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（Ｊ，Ｂｉｏｌ，　Ｃｈｅｍ．）　
１９３　，　２６５　（１９５１）　’］によって濃度
の決定された天然型ｐｒｏ−ＵＫのピーク面積と比較す
ることにより、各蛋白質の濃度を求めた。

活性はプイプリン・プレート・アッセイ法によって測定
した。

フィブリン・プレート・アッセイ法 フィブリン・プレートの作或 ５０ｍＭ　　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５−にウシ・
トロンビン（シグマ社製）　１．０　０　００ヲ溶解１
０．４５μｍのメンブレン・フィルターで滅菌枦過し、
トロンビン溶液を得る。次に、滅菌した５０ｍＭリン酸
ｒ１衝液（ｐＨ７．０）１００−にウシ・フィブリノー
ゲン（ナカライテスク社製）を３０分攪拌・溶解後、滅
菌したガラスウールで不溶物を除去し、フィブリノーゲ
ン溶液を得る。次に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）　　１　０　０ｍｃ＋に、寒天（シグマ社製）２ｇ
を加え、Ｌ５気圧、１２０℃、２０分で滅菌後、６０℃
に保温し、２％寒天溶液を得た。

プレート１枚に付き、トロンビン溶液０．２５ｍｆ＋、
プイプリノーゲン溶液５−、寒天溶液５−を入れ、攪拌
後静置し、寒天を固めてフィブリン・プレートを得た。

フィブリン・プレート・アッセイ法 スタンダードとして、ヒト・ウロキナーゼ（２本鎖型、
尿由来、日本・ケミカル・リサーチ社製）をＵＫ１１ｍ
液に溶解し、１０、１００，１，０００、１０，０００
１０／一に調整したものを使用した。サンプルは、ＵＫ
ｔｌ衡液を用い、０．５ｑ／ｍ＆’に調整した。

フィプリン・プレートに直径２凪の穴をスタンダードと
サン′ブルの数だけ開け、その穴にスタンダード、また
は上で調製したサンプルを５ｕＪｌ入れる。３７℃で２
４時間インキコベートした後、生じたハローの直径を測
定し、スタンダードによる検量線（活性：ハローの直径
）を基に、各サンプルの活性を求めた。

天然型ｐ　ｒ　ｏ−ＵＫと各ｐ　ｒ　ｏ−ＵＫｔｓ導体
の比活性を表５に示す。これより、ＵＫ−Ｔ６、ＵＫ−
Ｔ４、ＵＫ−Ｓ３の比活性は、天然型ｐｒｏ−ＵＫより
高くなっている（１．２〜１．８倍）のに対し、ｐｒｏ
−ＵＫ誘導体ＵＫ−Ｔ　（｝Ｏンビン切断部位のＰｌ′
位にアミノ酸置換を持つもの）の比活性は、天然型ｐｒ
ｏ−ＵＫの６０％であった。この比活性の低下は、プラ
スミン切断部位近傍（プラスミン切断部位のＰ２位）に
アミノ酸置換を導入したことにより、プラスミンによる
切断が起こりにくくなったことが原因と考えられる。

よって、比活性の点からもＰ，位にアミノ酸置換を導入
したｐｒｏ−ＵＫ誘導体（ＵＫ−Ｔ６、ＵＫ−Ｔ４、Ｕ
Ｋ−Ｓ３）のほうが有利である。

実施例９ 天然型ｐｒｏ−ＵＫとｐｒｏ−ＵＫ誘導体のトロンビン
に対する感受性の比較： 実施例７で得られた天然型ｐｒｏ−ＵＫまたはｐｒｏ−
ＵＫ誘導体を含む最終精製標品を逆相ＨＰＬＣカラム（
ＴＳＫｇｅｌ　　○ＤＳ−１　２　０Ｔ東ソー製）にか
け、そのピーク面積を基に３０■／−になるように実施
例７で得られた透析外液で希釈した。この希釈液１００
ｍに３０１０／一または６　０　０　１１１／ｍのヒト
・トロンビンを２０ＪｄＩ添加し、３７℃に保温した。

ヒト・トロンビンはシグマ（Ｓｉｇｍａ）社製のものを
用いた。また、ヒト・トロンピンは１０００１ｔｌのト
ロンビンに対シテ１０１１１のアブロチニンを加え、３
７℃で１．５時間反応させた標品を用いた。トロンビン
を添加した後、１５、３０，６０、１２０、２４０分後
に２４ｄずつサンプリングし、８４μＭのトロンビン阻
害剤（Ｔ｝ＩＲＯＭｓＴＯＰ　・＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社！ＩＩ！）を４ｄ加え、反応を
停止させた。また、トロンビン添加後、直ちにトロンビ
ン阻害剤を加えたサンプルも調整した（これをトロンビ
ン添加後０分のサンプルとした）。また、対照群として
、トロンビンを添加していないものを３７℃で保温した
。

トロンビンに対する感受性の比較は、上記反応液中の天
然型ｐｒｏ−ＵＫおよび各ｐ　ｒ　ｏ　−ＵＫ誘導体の
残存活性をフィブリン・プレート・アッセイ法（実施例
８参照）で測定することにより求めた。この結果、各ｐ
ｒｏ−ＵＫ銹導体は天然型ｐｒｏ−ＵＫより明らかにト
ロンビンに対する感受性が低下していることが示された
（第７　−（１）図参照）。とくにＵＫ−Ｔ６、ＵＫ−
Ｔ４、ＵＫ−Ｓ３はＵＫ−Ｔよりさらにトロンビンに対
する感受性が低下していることも示されたく第７−（２
）図参照）。

第　　　　５　　　　表 １０〃をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動〔レムリ
　（　Ｌａｅｍｍ　ｌ　ｉ）　：ネイチャ−　（Ｎａｔ
ｕｒｅ）　２２７、６８Ｇ　（１９７０））にかけた。

その結果、天然型ｐｒｏ−ＵＫがトロンビンで切断され
て行くのに対して、各ｐｒｏ−ＵＫ誘導体はほとんどト
口ンビンで切断されなかった（第７−（３）図）。これ
より、各ｐｒｏ−ＵＫ誘導体はトロンビンに対する感受
性は低下しており、フィブリン・プレート・アッセイの
結果とよく一致した。

ブラスミドｐｓＢＩＩＫｓ３　、プラスミドｐｓＢＩＩ
ＫＴ４およびブラスミドｐｓ［ｉＵＫＴ６を含む大腸菌
菌株はそれぞれ、Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　
ＢＳＢＩＩκＳ３、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　
ＢＳＥＵＫＴ４およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ　ＥＳＢＵＫＴ６として微工研にブダペスト条約の条
件で、平成ｌ年（１９８９年）６月１５日付でＰＥＲＭ
　ＯＰ−２４７８、ＦＥＲＭ　ＯＰ２４７９およびＦＢ
ＲＭ　ＢＰ−２４８０の番号で寄託してある。

さらに、この結果を確認するため、上記反応液以下に参
考例を示す。

参考例１． ヒトｔ−ＰＡｃＤＮＡを運ぶブラスミドｐｔｐ＾７の造
或： （１）　　Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞よりのポリ（＾）
ＲＮＡの調製ヒト咽頭ガン細胞株Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２
より、チオシアン酸グアニジンー塩化リチウム法〔カザ
ラ（Ｃａｔｈａｌａ）　ら：ディーエヌエイ　（ＤＮＡ
）２，３２９（１９８３）　３に従い、ポリ　（Ａ）を
有するＩＩＮ＾を下記のごとく調製した。

ヒト咽頭ガンＤｅｔｒｏｉｔ５６２　〔ビーターソン・
ダブリ５’デ４’ジュニア（Ｐａｔｅｒｓｏｎ，　Ｗ，
　Ｄ，，　Ｊｒ．）ら：ブロシーデインダス・オブ・ザ
・ソサイアティ・フォア・エクスベリメンタル・バイオ
ロジー−７ンド・メディシ：／　（Ｐｒｏｃ，　Ｓａｃ
，　Ｅｌ＋ｐ，Ｂｉｏｌ，Ｍｅｄ，）　１３６　．　１
１８７（１９７１））を、１０％仔牛胎児血清、ｌ００
×非必須アミノ酸溶液（Ｐｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ社製）を１／１００量、１ｍＭビルビン酸ナトリ
ウム、０．１％ラクトアルブミン水化物〈ギブコ・オリ
エンタル）を含む５０ｍｌのＭＥＭ培地（日水製薬社製
）を用い、ティシュ・カルチャー・フラスコ（コーニン
グ社製、１５０　ｃＩＩ１）内で生育させた。

３７℃でコンフルエント（００１ｆｌｕｅｎｔ）になる
まで培養した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１００ｎｇ／
ｍｌのフオルボール・ミリステート・アセテート（ＰＭ
＾：　Ｐｈｏｒｂｏｌ　ｍｙｒｉｓｔａｔｅ　ａｃｅｔ
ａｔｅ）を添加し、仔牛胎児血清を除いた上記培地３０
ｍｌを加え、さらに３７℃で２４時間培養した。続いて
細胞を０．０５％トリブシン、０．０２％ＥＤＴＡを含
む溶液１０ｍｌで処理し、細胞懸濁液を取得した。６本
の上記ティッシュ・カルチャー・フラスコから総計ＩＸ
ＩＯ●の細胞を取得した。細胞懸濁液から、１．１００
　Ｘｇ，　４℃、ｌＯ分間の遠心によって細胞を集め、
８０ｍｌのリン酸塩バッファーで洗浄した後、５Ｍチ才
シアン酸グアニジン、１０ｍＭ　ＢＵＴ＾、５０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ（ｐＨ７）および８％（Ｖ／Ｖ）　　
２−メルカブトエタノールからなる溶液１０＋ｎｌ中で
ボルテックス・ミキサーを用い可溶化した。この可溶化
物を遠心管に移し、４Ｍ　　ＬｉＣ１溶液８０ｍｌを加
えて攪拌した後、４℃　２０時間静置した。

？ｉｔａｃｈｉ　Ｒ　Ｐ　Ｒ　１００−ターにて９．Ｏ
ＯＯｒｐｍ．　９０分間遠心後、ＲＮＡを沈澱として回
収した。ＲＮ＾の沈澱を４Ｍ尿素および２Ｍ塩化リチウ
ムからなる溶液５０ｍｌに懸濁し、Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｒ
ＰＲＩＯローターにて９，０００ｒｐｍ，　６０分間遠
心後、再びＲＮＡを沈澱として回収した。ＲＮＡの沈澱
を０．１％ラウリル硫酸ナトリウム、１＋ｎＭ　　ＥＤ
ＴＡ，　１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐ｝１７．　
５＞からなる溶液１０ａ＋ｌに溶解し、フェノールーク
ロロホルムで抽出後、エタノール沈澱により回収した。

得られたＲＮＡ約２．５■をｌｏｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
１（ｐＨ８．０）および１ｍＭＦ！ＤＴ＾からなる溶液
１ｍｌに溶かした。６５℃、５分間インキユベートし、
０．１ｍｌの５Ｍ　　ＮａＣ１を加えた。混合物を才リ
ゴ（ｄＴ）セルロース・カラム〔ビー・．Ｔ−ルーバイ
オケミカル（ｐ−Ｉ　Ｑｉ■ｃｈｅｍｉｃａｌ）社製〕
クロマトグラフィー（カラム体積０．　５　ｍｌ）にか
けた。吸着したポＩＪ（Ａ）を有するｍＲＮ＾を１０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ（ｐＨ７．　５）および１ｍＭＥ
ＤＴ＾からなる溶液で溶出し、ボＩＪ（Ａ）を有するｍ
ＲＮ＾約９０．を得た。

（２）　ｃＤＮＡ合或と核ＤＮＡのベクターへの挿入オ
カヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ）の方法〔
モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ（Ｍｏ
ｌ，　　Ｃｅｌｌ，　　Ｂｉｏ！．）　　、２，　　１
６１（１９８２）　　］に従い、ｃＤＮＡの合成とそれ
を紐み込んだ組換え体プラスミドの造戊を行った。その
工程の概略を第８図に示す。

ｐｃＤＶＩ　　Ｃ才カヤマ・アンド・バーグ（Ｏｋａｙ
ａｍａ　＆　Ｂｅｒｇ）　：モレキコラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジイ（Ｍｏｌ，　Ｃｅｌｌ，　Ｂｉｏ
ｌ，）、３．２８０（１９８３）　）　４　０　０ｇｇ
を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−｝ＩＣｉ’　（ｐＨ７．　５）
、６　ｍＭ　ＭｇＣｊ！　ｚおよび１０ｍＭ　ＮａｌＪ
からなる溶液３００Ｈに加え、さらに５００単位のκｐ
ｎｌを加えて、３７℃、６時間反応させ、ブラスミド中
のＫｐｎ１部位で切断した。フェノールークロロホルム
抽出後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。

Ｋｐｎｌ切断した該ＤＮＡ約２００■を４０ｍＭカコジ
ル酸ナトリウム、３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ｌＣｌ（ｐＨ
６．　８＞、１　ｍＷ　ＣａＣＩｌ２およびＯ．ｌｍＭ
ジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記する）からなる
ｉ衝液（以下ＴｄＴ緩衝液と略記する〕にｄＴＴＰを０
．２５一となるよう加えた溶液２００ＪＪｔ！に加え、
さらに８１単位のターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ（以下ＴｄＴと略記する）（Ｐ−Ｌ　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加えて、３７℃、１
１分間反応させた。ここで、ｐｃＤＶ１のＫｐｎＩ切断
部位の３′末端にポ！Ｉ　（ｄＴ）鎮が約６７個付加さ
れた。該溶液からフェノールークロロホルム抽出、エタ
ノール沈澱により、ポ！Ｉ　（ｄＴ）ｔＪの付加したｐ
ｃＤＶ１ＩＩＮ＾約１００．を回収した。該ＤＮＡを１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ！　（ｐＨ７．５）　、６ｏ
＋Ｍ　ＭｇＣＪ！　２　、１００ｍＭＮａＣ１からなる
緩衝液ｌ５０〃に加え、さらに３６０単位のＥｃｏＲＩ
を加え、３７℃２時間反応させた。核反応液をＬＧＴ法
で処理後、約３．ｌｋｂのＤＮＡ断片を回収し、約６０
．のポリ　（ｄ　Ｔ）鎖付加ｐｃＤＶ１を得た。該ＤＮ
Ａを１０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＩＪ（ｐＨ８．　０）お
よび１ｍＭ　ＢＤＴ＾からなる溶液５００ｍに溶解し、
６５℃５分間インキュベート後、氷冷して５０〃の５Ｍ
　ＮａＣｊ！を加えた。混合物をオリゴ（ｄ＾）セルロ
ース力ラム（コラボレイティブリサーチ社製）クロマト
グラフィーにかけた。ポリ（ｄＴ）鎖長が充分なものは
カラムに吸着し、これを１０１ＩＩＭ　Ｔｒｉｓ−｝Ｉ
ＣＪ　（ｐＨ８．０）および１ｍＭ　ＢＤＴ＾からなる
溶液で溶出し、ポ！Ｉ　（ｄＴ）ｌの付加したｐｃＤＶ
１　　（以下ベクターブライマーと略記する＞　２７，
ｌＬｇを得た。

次にリンカーＤＮＡの調製を行った。

ｐＬ１　（オカヤマ・アンド・バーグ（Ｏｋａｙａｍａ
＆　Ｂｅｒｇ）　：モレキュラー・アンド・セルラー・
バイオロジ４　（Ｍｏｌ．［：ａｌｌ，　Ｂｉｏｌ，）
、３，　２８０（１９８３）　）約１４．を１ｆｌｎＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ’　（ｐ｝１７．５）　、６ｍＭ　
ＭｇＣ１　２および５０ｍＭ　　Ｎ　ａＣ　１からなる
緩衝液２００Ｈに加え、さらに５０単位のＰｓｔｌを加
え、３７℃４時間反応させ、ｐＬＩＤＮＡ中のＰｓｔＩ
ａＲ位で切断させた。

該反応物をフェノールークロロホルム抽出後、エタノー
ル沈澱を行い、ＰｓｔＩで切断したｐＬＩＤＮＡ約１３
■を回収した。該ＤＮＡ約１３■をＴｄＴ緩衡液に終濃
度０．　２５ｍＭのｄＧＴＰを含む溶液５０ＪＪＩに加
え、さらにＴ　ｄ　Ｔ　（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｌｓ社製）５４単位を加えて３７℃１３分間イン
キユベートし、ｐＬ１のＰｓｔｌ切断部位３′末端に（
ｄＧ）Ｍを約１４個付加した。フェノールークロロホル
ム抽出後エタノール沈澱にてＤＮＡを回収した。該Ｄ　
Ｎ　Ａ　１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉｓ−Ｈ　Ｃ　１　（ｐＨ７
．　５）、６ｍＭＭｇＣｊ！，および６０ｍＭ　　Ｎ　
ａ　Ｃ　ｊ！からなる緩衝液１００ｍに加え、さらに８
０単位のＨｉｎｄＩＩ［を加えて３７℃３時間インキユ
ベートし、ｐＬＩＤＮ＾のＨｉｎｄｎＩＢ位で切断した
。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０
，　５ｋｂの［ｌＮＡ断片をＤＥＡＥペーパー法〔ドレ
ツェン（Ｑｒｅｔｚｅｎ）ら：アナリティカル・バイオ
ケミストリイ（＾ｎａｌ．ＢｉｏｃｈｅＩＩ１，）、１
１２　．　２９５（１９８１）　）にて回収し、オリゴ
（ｄＧ）鎮付きのリンカーＤＮＡ　（以下単にリンカー
ＤＮＡと略記する）を得た。

上記で調製したポＱ　　（Ａ）ＲＮＡ約４■、ベクター
プライマー約１．４ｇを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−｝ＩＣｉ
！（ｐＨ８’．３）　、８ｍＭ　ＭｇＣ１．　、３０ｍ
Ｍ　　ＫＣＩ、０．３ｍＭ　ＤＴＴ，　２ｍＭ　ｄ　Ｎ
Ｔ　Ｐ　（ｄＡＴＰ％ｄＴＴＰ，　ｄＧＴＰおよびｄＣ
ＴＰ）および１０単位のりポヌクレアーゼインヒビター
（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）からなる溶
液２２．　３ｍに溶解し、ｌＯ単位の逆転写酵素（生化
学工業社ＩＩ）を加え、４１℃９０分間インキコベート
し、ｍＲＮ＾に相補的なＤＮＡを合戊させた。該反応物
をフェノールークロロホルム抽出、エタノール沈澱を行
い、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の付加したベクタープライマ
ーＤＮＡを回収した。ＩＤＮＡを６６μＭ　ｄＣＴＰお
よび０．２，ポリ（Ａ）を含むＴｄＴｌｌ衝液２０Ｊｄ
Ｉに溶かし、１４単位のＴ　ｄ　Ｔ　（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加えて３７℃２分間インキ
コベートし、ｃＤＮＡ３’末端に２０個の（ｄＣ）　Ｉ
ｌｌを付加した。該反応物をフェノールークロロホルム
抽出し、エタノール沈澱により（ｄＣ）鎖の付加したｃ
ＤＮＡ−ベクターブライマーＤＮＡを回収した。該ＤＮ
Ａを１０ｍＭＴｒｉｓ−｝１ｃＪ　（ｐＨ７．　５）　
、６ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃ　ｌ　ｚおよび６０ｍＭＮａＣ１
からなる液４０ｈ１に溶かし、２０単位のＨｉｎｄＩ［
［を加え、３７℃２時間インキユベートし、Ｈｉｎｄｌ
ｌ１部位で切断した。該反応物をフェノールークロロホ
ルム抽出、エタノール沈澱して０．５ピコモルの（ｄＣ
）　ａｌｌ付加ｃＤＮＡ−べクターブライマーＤＮＡを
得た。該ＤＮＡ０．２ピコモルおよび前記のリンカーＤ
ＮＡＯ、４ピコモルを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　
（ｐＨ７．５）　、０．　Ｉ　Ｍ　　ＮａＣｊ！および
１ｍＭ　　ＥＤＴＡからなる溶液ｌ００〃に溶かし、６
５℃、４２℃、０℃でそれぞれ１０分、２５分、３０分
間インキコベートしたｏ　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＮＣＲ
（ｐｌ１７．５＞　、４ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ　Ｉ　２、１０
ｍＭ　（ＮＬ｝ａｓＬ、０．１Ｍ　　ＫＣＩおよび０．
　１ｍＭβ一ＮＡＤの組成で、全量１０００ｄとなるよ
う反応液を調製した。該反応液に２５単位の大腸菌Ｄ　
Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼ（ニューイングランド・バイオラブ
ズ社製）を加え、１１℃１８時間インキコベートした。

咳反応液を各４０，ＩＪＭのｄＮＴＰ，　０．１５ｍＭ
　　β一ＮＡＤとなるよう或分を追加調魁し、１０単位
の大腸菌ＤＮＡＩＪガーゼ、２０単位の大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼＩ（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製
〉および１０単位の大腸菌リポヌクレアーゼＨ　（Ｐ−
Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加え、１２℃、
２５℃で順次１時間ずつインキコベートした。上記反応
で、ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの環状化と、ＲＮＡ−
ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡａｌＳ分がＤＮＡに置換され、完
全な二重鎮ＤＮＡの組換え体ブラスミドが生戊した。

（３）　　ヒトｔ−ＦＡ−ｃＤＮ八を含む組換えＤＮＡ
の選択： 次に、コロニー・ハイブリダイゼーションを用い、ヒト
ｔ−ＦＡ　−　ｃＤＮＡ　Ｃペニカ（Ｐｅｎｎｉｃａら
：ネイチ＋　一（Ｎａｔｕｒｅ）　３０１，　２１４（
１９８３）　〕のｔ−ＰＡシグナルペブチド領域の一部
の塩基配列と一致する塩基の合戒ＤＮＡ ５′−＾ＴＧＧＡＴＧＣ＾＾ＴＧ＾＾ＧＡＧ＾ＧＧＧＣ
ＴＣＴＧＣＴＧＴ−３’を３２ｐで標識し．たプローブ
と会合するクローンとして、ｔ−ＰＡ−ｃＤＮＡを以下
のようにして選択した。

まず、（２）で得た組換え体プラスミドを用い、大腸菌
Ｃ６００ＳＦ８株〔カメロン（Ｃａｍｅｒｏｎ）：プロ
シーディング・才ブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オ
プ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｉｌ＾ｃａｄ，　Ｓ
ｃｉ，”ｊ　ＵＳ＾７２．　３４１６（１９７５））を
ハナハンの方法［Ｈａｎａｈａｎ：ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジ−（Ｊ．　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．）　、１６Ｂ、５５７　（１９８３）　：］に従い形
質転換した。得られた約１０．　０００個のコロニーを
ハナハンとメセルソンの方法（ｆｌａｎａｈａｎ　ａｎ
ｄ　Ｍｅｓａｌｓｏｎ　：メソッド・イン・エンザイモ
ロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）１００　，　３３３（１９８３）　）に従い、ニトロ
セルロース・フィルター上に固定した。次に、フィルタ
ーのプレハイブリダイゼーションは、６ＸＮＥＴ（　１
　ｘ　ＮＥＴ＝１５０ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃ　１、１５ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ’（ｐＨ７．５）　、１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ〕、ＩＯＸデンハルト（Ｉｌｅｎｈａｒｄｅ）液、
および１０ｈｇ／＋Ｉの断片化した大腸菌染色体ＤＮＡ
を含む溶液中、６５℃、４時間またはそれ以上の時間行
った。このプレハイブリダイゼーション溶液に上述の３
２Ｐで標識したブローブを加え、フィルター上のＤＮＡ
と会合させた（６５℃、１６時間以上）。次に、フィル
ターを６ｘｓｓｃ　（ｌＸｓｓｃ＝１５０ｍＭ　ＮａＣ
ｉ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）で２回洗浄し（室温
、５分間ずツ）、６５℃の２ＸＳＳＣと０．１％Ｓ［］
Ｓを含む液で３０分間洗浄した。さらに６５℃の２×Ｓ
ＳＣと０．１％ＳＤＳを含む液で１５分間洗浄した後、
６ＸＳＳＣで室温で２回洗浄したく５分間ずつ〉。フィ
ルターを空気乾燥した後、オートラジオグラフィーによ
り陽性クローン１個を同定した。この陽性クロ・−ンが
持つプラスミドｐｔＰＡＴのｃＤＮＡの塩基配列を、Ｍ
１３ファ一ジを用いたディデオキシ・シークエンス法に
より決定した。その結果、ｐｔＰＡ７のｃＤＮ八は、ペ
ニカらが報告したｔ−ＰＡのアミノ酸配列ＣＰｅｎｎｉ
ｃａら：ネイチ＋　−　（Ｎａｔｕｒｅ）３０１，２１
４（１９！１３）コと完全に一致するｔ−ＰＡをコード
していることが判明した。ただし、戊熟型ｔ−ＰＡの９
５番目のアスパラギン酸のコドン（ＧＡＣ）と５１２番
目のスレオニンのコドン（ＡＣＡ）がそれぞれＧＡＴ，
ＡＣＣになっていることがわかった。

この菌株は、Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＥ　ｔ
　Ｐ　Ａ　７ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４６７として、微工
研に寄託されている。

参考例２。

ヒトｐｒｏ−ＵＫ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを運ぶブラスミドｐ
Ｕκ１の造戊： 参考例１で作威したＤｅｔｒｏｉｔ　５６２細胞のｃＤ
Ｎ＾ライブラリーをコロニー・ハイブリダイゼーション
法によりスクリーニングし、ヒトｐｒｏ−ＵＫｃＤＮＡ
クローンを単離した。すなわち、まず、参考例１で得た
組換え体プラスミドを用い、大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株〔
カメロン（Ｃａｍｅｒｏｍ）　　：ブロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミ４’オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔｌ，＾ｃａｄ，Ｓｃｉ，）　ＩＩ
ＳＡ　７２．　３４１６（１９７５））をハナハンの方
法（Ｈａｎａｈａｎ　　：ジャーナル●オブ●モレキュ
ラー・バイオロジ−（Ｊ．　Ｍｏｌ．Ｂｉａｌ．）　、
１６６　．　５５７（１９８３））に従い形質転換した
。得られた約３０．　０００個のコロニーをハナハンと
メセルソンの方法（Ｈａｎａｈａｎ　ａｎｄ　Ｍｅｓｅ
ｌｓｏｎ　：メソッド１イン１エンザイモロジー（Ｍｅ
ｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　１００　，
３３３（１９８３）　］に従い、ニトロセルロース・フ
ィルター上に固定した。次に、フィルターのプレハイブ
リダイゼーションは、６ｘＮＥＴ，１０ｘデンハルト（
Ｄｅｎｈａｒｄｔ）液、および１００，ｑ／ｍｌの断片
化した大腸菌染色体ＤＮＡを含む溶液中、６５℃、４時
間またはそれ以上の時間行った。

次に、ヒトｐｒｏ−ＵκｃＤＮＡ［ホルムズ（Ｈｏｌｍ
ｅｓ）ら：バイオテクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ）　３　．９２３（１９８５）　）のクリング
ル領域の一部の塩基配列と一致する４ｌ塩基の合ａＤＮ
Ａ ５’　−　ＧＧＧ＾＾ＴＧＧＴＣＡＣＴＴＴＴＡＣＣＧ
ＡＧＧ＾＾＾ＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＡＣ　−３’
（本発明者らが単離したヒ｝　ｐｒｏ−ＬＩＫ　ｃ　Ｄ
　Ｎ　Ａについていえば、第４表中の下線を付した塩基
配列に相当する）を３２ｐで標識したブローブを、上の
ブレハイブリダイゼーション溶液に加え、フィルター上
のＤＮＡと会合させた（６５℃、１６時間以上）。次に
、フィルターを６ＸＳＳＣで２回洗浄した（室温、５分
間ずつ）後、ＩＸＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む５７℃
の液で３０分間洗浄した。さらにＩＸｓｓｃと０．１％
ＳＤＳを含む５７℃の液で１５分間洗浄した後、６ＸＳ
ＳＣで２回洗浄した（室温、５分間ずつ〉。フィルター
を空気乾燥した後、オートラジオグラフィーにより陽性
クローン１個を同定した。この陽性クローンが持つブラ
スミドｐＵＫ１のｃＤＮ＾の塩基配列を、Ｍ１３ファー
ジを用いたディデオキシ・シークエンス法により決定し
た。

その結果、ｐＵＫ１のｃＤＮＡは第４表のｐｒｏ−１１
Ｋのアミノ酸残基の番号付けに従った場合、ｐｒｏＵκ
の４１番目のＣｙｓ残基より下流のｐｒｏ−Ｕκの翻訳
領域および３′非翻訳領域をコードしていることが明ら
かになった。ｐＵＫ１のｃＤＮＡがコードしているｐｒ
ｏ−Ｕκのアミノ酸配列は、ホルムズら［Ｉｏｌｍａｓ
ら：バイオテクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ）３，　９２３（１９８５）　）の報告したものと一
致していたが、以下に示す４つのアミノ酸のコドンの３
番目の塩基が異なっていた。

２５４番目のアミノ酸＾ｓｎ　　：ＡＡＣ−４ＡＡＴ３
４０番目のアミノ酸Ｌｅｕ　　：ＣＴＡ−ＣＴＧ３４５
番目のアミノ酸Ｐｒｏ　：ＣＣＣ−＋ＣＣＡ３４６番目
のアミンＩ１２ＧＩｎ　　：　ＣＡＡ−ＣＡＧこの菌株
は、［！ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　Ｅ　Ｕ　
Ｋ　１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１　４　６　３）として、
微工研に寄託されている。

参考例３． ヒトｐｒｏ−ＵκｃＤＮＡを運ぶブラスミドｐＵＫｌ１
の造成： 参考例２で得られたプラスミドｐＵＫ１がコードしてい
るｐｒｏ−１１Ｋ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａはｐｒｏ−ＵＫのシ
グナル領域と成長因子メドイン領域を含んでいないので
、以下に示す手順を用いて、これらの領域を含むｃＤＮ
Ａのクローン化を行った。

まず、ｃＤＮＡのクローン化に用いるベクターｐＣＣＫ
２の造戊を以下のようにして行った。

（１）組換えプラスミドｐｃｃＫｔの造成：桑野らが造
或した、ラット脳コレシストキニン（ＣＣＫ１前駆体の
ｃＤＮＡを有するプラス・ミドｐＲｃ１９［桑野ら：ジ
ャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ，　Ｂｉｏｃ
ｈｅ＋＋＋，）　９６，　９２３−９２６（１９８４）
）を持つ大腸菌ＨＢＩＯＩ株を培養し、培養菌体から常
法によりｐＲｃｌ９ＤＮＡをＷＡ！！した。得られたｐ
Ｒｃ１９ＤＮＡ約３縄を３０ｄのＹ−５０緩衝液［１０
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）　、５０ｍＭ
　　ＮａＣ１、７ｍＭＭｇＣｆａ、７ｍＭ　　２−メル
カブトエタノールを含む溶液〕に溶かし、１単位のＰｖ
ｕｌｌを加え、３７℃で１時間消化反応を行った。この
反応により、ＤＮＡはｐｖｕｌＩにより部分的に消化さ
れた。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用い、
約５３０ｂρのＤＮＡ断片を精製した。一方、ノルラン
ダーらが造成したブラスミドＤＮＡｐ　Ｕ　Ｃ　１９　
［Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ，　Ｊ，　　ら：ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）　２６．１０Ｎ１９８３）　　：　ｐＵｃ１９ブラ
スミドＤＮＡは宝酒造社より入手できる〕約１■を２０
ｍＭ　　Ｋ　Ｃ　ｌを含むＹ−Ｏ緩衡液３０〃に溶かし
、１６単位のＳｍａ■を加え、３０℃で２時間消化反応
を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用
い、約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐＲｃ１９由来の約５３０ｂｐ
のＤＮＡ断片（約０．０１■）とｐＵｃ１９由来の約２
．　７　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．０５■）とを２０〃
のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、２００単位のＴ４ＤＮ
ＡＩＪガーゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行った
。

得られた組換え体ブラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、＾ｐ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡ，ｐｃｃＫ１を単離し、
制限醒素による構造解析を行ったところ、目的の構造を
有することを確認した（第９図参照）。

（２）組換え体プラスミドｐｃｃＫ２の造成二上で得ら
れたｐｃｃＫ１ブラスミドＤＮＡ約２ｇを３０〃のＹ−
０緩衝液に溶かし、１２単位のＳ　ａｃ　Ｉを加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。

さらに、ｌ．！ｌ！の２Ｍ　ＮａＣｊ！と１０単位のＢ
ａｍＨＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６
５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約０．　
５５ｋｂのＤＮＡ断片をｗ４製した。一方、後述の参考
例４で得られたｐＴｒＳ３３プラスミドＤＮＡ約２■を
上と同じ反応に供し、生じた約２、８５ｋｂのＳａｃｌ
　−ＢａｍＨ　Ｉ断片をＡＦＴ法を用いて精製した。

このようにして得られたｐＣＣＫ　１由来の約０．　５
５ｋｂのＤＮＡ断片（約０．　０２．）とｐ’ｒｒｓ３
３由来の約２．　８５ｋｂのＤＮＡ断片（約０．　１■
）とを２０ｄのＴ４１Ｊガーゼ緩衝液に溶かし、５０単
位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを加え、４℃で１８時間結合
反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、＾ｐ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡρＣＣＫ２を単離し、制
限酵素による構造解析を行ったところ、目的の構造を有
することを確認した（第１０図参照）。

（３）　　ヒトｐｒｏ−ＵＫ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを運ぶブ
ラスミドｐＵＫ１ｌの単＃ｉ： 参考例１で調製したＤｅｔｒｏｉｔ　５６２細胞のポリ
（Ａ）ＲＮＡ　（ｍＲＮ八）約８ＡｇＣ’Ｂｄｌの１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７．　５＞−０．　５＋
ｍＭ　ＢＤＴ＾に溶解されている〕を６５℃で１０分間
加熱′した後、水中で急冷した。

この溶液を、５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ！　（ＰＨ
８．３）　、８ｍＭＭ　ｇ　Ｃ　ｌ　ｔ、３０ｍＭ　　
Ｋ　Ｃ　１、５ｍＭ　　ＤＴＴ，１ｍＷ　　ｄ　ＮＴ　
Ｐ　（ｄＡＴＰ　ＳｄＴＴＰ，　ｄＧＴＰおよびｄＣＴ
Ｐ＞、１０単位のりボヌクレアーゼインヒビター（Ｐ−
ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）、および５ｇ／ｍｌ
オリゴ（ｄＴ）＋ｉ−，　　（コラボレーティブ社製）
（全量８０−）となるように調整した後、４１ｔで１５
分間保温した。次いで、２０単位の逆転写酵Ｓ（生化学
工業社製）を加え、４１℃で９０分間保温し、ｍＲＮＡ
に相補的なｃＤＮＡを合戒した。該反応物をフェノール
ークロロホルム抽出、エタノール沈澱を行った後、４０
〃の０．３Ｍ　　ＮａＯＨに溶かし、３７℃に１５時間
放置することによって、ｍＲＮＡを加水分解した。次に
、１０−のＩＭＴｒｉｓＮＣＩ　（ｐＨ７．　５＞と４
０ｍの０．３Ｎ　　ＨＣＩを加えて中和した後、１本ｔ
ＪｃＤＮＡをエタノール沈澱によって回収し、２８．　
５ｄのＨｉＯに溶解した。

この溶液を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＩＪ　（ｐ｝１８
．３）　、８　ｍＭＭｇ　Ｃ　ｊ！　ｘ　、３０ｍＭ　
　ＫＣ　Ｉ、５ｍＭ　　ＤＴＴ，１ｍＭ　　ｄＮＴＰ　
（ｄＡＴＰＳｄＴＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）　、
および２．　５　Ｎ／＋ｎｌ合ｆｉ．ＤＮＡプライマー
ＣＡＴＧ＾ＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧ　（ヒトｐｒｏ−
１１Ｋのシグナル・ペプチド領域の一部の塩基配列と一
致する〉　（全量４０〃）となるように調整した後、６
５℃で１０分間、続いて４１℃で３０分間保温した。

次いで１０単位の逆転写酵素を加え、４１℃で６０分間
保温することにより、１本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを２本鎮ｃ
ＤＮＡに変換した。該反応物をフェノールークロロホル
ム抽出、エタノール沈澱を行った後、２５ｍＭ　　Ｎａ
Ｃｊ！を含むＹ−０緩衡液３０ｄに溶かし、２５単位の
ＢｓｓＨｎ（ニューイングランドバイオラブズ社製）を
加え、５０℃で２時間消化反応を行った。さらに、１．
２５ｄの２ＭＮａＣ１と１２単位のＢａｍＨＩを加え、
３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の
加熱後、ＡＦＴ法を用いて約１．１〜１．　４　ｋｂの
ｃＤＮＡ断片を精製した。

一方、上で得られたｐＣＣＫ２ブラスミドＤＮＡ約２．
を上と同様に１３ｓｓＨＩＩとＢａｍＨＩで切断した後
、ＡＦＴ法を用いて約２．　９　ｋｂのＢｓｓＨ　ＩＩ
　−　ＢａｍＨ　Ｉ断片を精製した。

このようにして得られた約１．１〜１．　４　ｋｂのｃ
ＤＮＡ断片（約０．　０　２　．）とｐＣＣＫ２由来の
約２．　９　ｋｂのＤＭＡ断片（約０．０５■）とを２
０〃のＴ４リガーゼ緩衡液に溶かし、２００単位の７４
ＤＮＡＩＪガーゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行
った。

得られた組換えプラスミド混合物を用いて、大腸菌Ｃ６
００ＳＦ８株を形質転換することにより、約２５，　０
００個の＾ｐ耐性株を取得し、これらの＾ｐ耐性株の中
から、参考例２に述べたコロニー、ハイブリダイゼーシ
ョン法を用いて、参考例２でｐｒｏ−ＬＪＫ　　ｃＤＮ
Ａの単離に用いたプローブと同一のブローブと会合する
陽性クローンを約１０００個取得した。なお、ハイブリ
ダイゼーションおよびフィルターの洗浄条件は参考例２
と同様であった。このようにして得られた陽性クローン
ｌ株が持つブラスミドｐＵＫ１１（第１１図参照）を単
離し、Ｐｒｏ−ＵＫのシグナル・ペブチド、成長因子ド
メイン、クリングル・ドメイン領域の塩基配列をＭ１３
ファージを用いたディデオキシ・シークエンス法により
決定した。

その結果、その塩基配列は、ホルムズ（ｌｏｌｍｅｓら
：バイオテクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
）　３　．９２３（１９８５）　）の報告したものと一
致していた。

参考例４． 組換え体ブラスミドｐＴｒＳ３３の造ｙ．：（１）　　
ＡＴＧベクターｐＴｒｓ２０の造戒：第１２図に示した
手順に従い、ＳＤ配列とＡＴＧ開始コドンの間の距離が
１４塩基で、かつＡＴＧコドンの直後にＳａｃｌサイト
を有するＡＴＧベクターｐＴｒｓ２０を造成した。

まず、特開昭５８−１１０６００−号公報記載の方法で
調製したｐＫＹＰ１０　　３■をＹ　−　１００緩衝液
３０−に溶かし、制限酵素ＢａｎＩ［Ｉと制限酵素Ｎｒ
ｕｌ　　（ニューイングランド・バイオラブズ社製）を
それぞれ６単位ずつ加え、３７℃で３時間切断反応を行
った。この反応液からＬＧＴ法によりＰｔｒｐを含む約
３．　８　ｋｂのＤＮＡ断片（Ｂａｎｌｌｌ−ＮｒｕＩ
断片）約０。５ｇを得た。

一方、Ｐｔｒｐの下流にＡＴＧ開始コドンを付与するた
めに下記のＤＮＡＩＪンカーをトリエステル法により合
成した。

１９−ｍａｒと１７−ｍａｒの合戒ＤＮＡ　（各々１０
ピコモルずつ）を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−｝ＩＣｆｌ（ｐ
Ｈ７．５）　、１０ｍＭ　　Ｍｇ　Ｃ　ｊ！．、５１Ｉ
ＩＭジチオスレイトール、０．１ｍＭ　　ＥＤＴＡおよ
び１ｍＭ　　ＡＴＰを含む全量２０ｍの溶液に溶かし、
Ｔ４ポリヌクレ才チドキナーゼ３単位（宝酒造社製）を
加えて、３７℃で６０分間リン酸化反応を行った。

次に上記で得たｐＫＹＰ　１　０由来のＢａ　ｎＩＩ［
−Ｎｒｕｌ断片（約３．８ｋｂ）０．１ｇと上記のＤＮ
Ａリンカー約０．５ピコモルをＴ４リガーゼ緩衝液２０
〃に溶かし、さらにＴ　４　ＤＮＡ　リガーゼ２単位を
加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用い警 て大腸菌ＨＢＩＯｌ株〔ボリバー（ロｏ１　ｉｖｅｒ）
ら：ジーン（Ｇｅｎｅ）　２　．　７５　（１９７７）
　］を形質転換し、Ａｐｒのコロニーを得た。このコロ
ニーの培養菌体からブラスミドＤＮＡを回収した。得ら
れたブラスミドの構造は制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＢａｎＩ
［［、ＨｉｎｄＩｆｆ、Ｓａｃ１％ＮｒｕＩで切断後、
アガロースゲル電気泳動によりＩ誌した。このプラスミ
ドをｐＴｒｓ２０と名付けた（第１２図）。ｐＴｒｓ２
０のＢａ　ｎＩＩ［、ＨｉｎｄＩＩＩサイト付近の塩基
配列は下記のとおりであることをＭ１３ファージを用い
たディデオキシ・シークエンス法を用いｌｉｉＩ＆詔し
た。

（２）　ｐＴｒｓ３３の造或： 上で得られたｐＴｒｓ２０プラスミドＤＮＡ約ａｕｇを
３０ｄのｙ−ｏａｔ液に溶かし、ｌ２単位のＳａｃＩを
加え、３７℃で２時間消化反応を行った。さらに１．５
−の２Ｍ　　ＮａＣ１と１０単位のＰｓｔｌを加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱
処理後、ＡＦＴ法により約１．１５ｋｂのＤＮＡ断片を
精製した。

一方、特開昭６２−　４８６９９号公報記載の方法で調
製したｐＫＹＰ２６　［ｐＫＹＰ２６を含む大腸菌はＢ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　Ｉ　ＫＹＰ２６　
（ＦＢＲＭ　ＢＰ−８６３）として微工研に寄託されて
いる〕２塊を３０ｄのＹ−１００１衝液に溶かし、８単
位のＰｓｔｌと１０単位のＢａｍＨＩを加え、３７℃で
２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後
、ＡＦＴ法により約１．　７　ｋｂのＤＮＡ断片を精製
した。また、Ｍ１３ｍｐｌ８Ｒ　Ｆ　Ｄ　Ｎ　Ａ　［：
Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ，Ｊ．ら：ジーン（Ｇｅｎｅ）　２
６　，　１０１（１９８３）　　：　Ｍ１３ｍｐ１８Ｒ
Ｆ　　ｔｌＮ＾は宝酒造社より入手したＥ２ｇを３０ｄ
のＹ−０緩衝液に溶かし、１０単位のＳａｃｌを加え、
３７℃で２時間消化反応を行った。さらに１．５−のＬ
Ｍ　　ＮａＣｌと１０単位のＣｌａＩを加え、３７℃で
２時間消化反応を行った。６５℃、ｌＯ分間の熱処理後
、ＡＦＴ法により約０．　６　５　ｋｂのＤＮＡ断片を
精製した。これらとは別に、第１３図に示す２種の合戊
ＤＮＡ（４３塩基と４５塩基）をアプライド・バイオシ
ステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成し、そ
れぞれ別々に上に述べた方法と同じ方法を用いて５′−
リン酸化した。

このようにして得られたｐＴｒ３２０由来の約１．１５
ｋｂのＤＮＡ断片（約０．　１■）　、ｐＫＹＰ２６由
来の約１．　７　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１ｕ）、Ｍ
１３ｍｐｌ８由来の約０．　６　５　ｋｂのＤＮＡ断片
（約０．０５Ｊｉｇ＞、および５′−リン酸化された上
記２種の合成ＤＮＡ　（それぞれ１１ｍｏｌｅずつ）を
２０犀のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、５０単位のＴ４
ＤＮＡ！Ｊガーゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行
った。

このようにして得られた組換え体ブラスミドの混合物を
用いて、大腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株
を得た。この形質転換株からプラスミドｐＴｒ’Ｓ３３
を単離し、制限酵素消化による構造解析およびＭ１３フ
ァージを用いたディデオキシ・シークエンス法により、
ｐＴｒＳ３３が目的の構造を有することを確認した（第
１３図参照）。

参考例５． 組換えプラスミドｐＴｅ　ｒｍ２の造或：ｐＫＹＰ２６
ブラスミドＤＮＡ　Ｃ特開昭６２−４８６９９号公報〕
約２塊を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−｝１ｃｉ！　（ｐｆｌ８
．０＞、７５ｍＭＮａＣｊ！１７ｍＭ　ＭｇＣＪ＊　、
６ｍＭ　　２−メルカブトエタノールを含む溶液３０〃
に溶かし、１６単位の＾ｓｐ７１８（ベーリンガー・マ
ンハイム社ＩＬｕ）ト１０１１位のＰｓｔｌを加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱
処理後、ＡＦＴ法を用いて約１，７ｋｂのＤＮＡ断片を
精製した。一方、参考例４の（１）で得られたｐＴｒｓ
２０プラスミドＤＮＡ約２■を３０−のＹ−１。（１１
）緩衝液に溶かし、８単位のＰｓｔｌと１０単位のＮｒ
ｕｌ　　（ベーリンガー・マンハイム社製）を加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、ｌＯ分間の熱
処理後、ＡＦＴ法を用いて約１．　５ｋｂのＤＮＡ断片
を精製した。また、第ｌ４図に示す２種の合戊ＤＮＡ　
（１９塩基と２３塩基）をアプライド・バイオシステム
ズ社３８０Ａ−ＤＮＡ合戊機を用いて合成し、それぞれ
を別々に上で述べた方法と同様の方法を用いて５′−リ
ン酸化した。

このようにして得られたｐＫＹＰ２６由来の約１．７ｋ
ｂのＤＮＡ断片（約０．１ｕｇ）　、ｐＴｒｓ２０由来
の約１．　１５ｋｂのＤＮＡ断片および５′−リン酸化
された２種の合或ＤＮＡ　（それぞれｌｐｍｏｌｅずつ
〉を２０−のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、５０単位の
Ｔ４ＤＮＡ！Ｉガーゼを加え、４℃で１８時間結合反応
を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、＾ｐ耐性株を得た。

この形質転換株からブラスミドＤＮＡ，ｐＴｅｒｍ２を
単離し、制限酵素消化による構造解析およびＭ１３ファ
ージを用いたディデ才キシ・シークエンス法により、ｐ
Ｔｅ　ｒｒ＋ｄが目的の構造を有することをｍ認したく
第１４図参照〉。

参考例６． 組換え体ブラスミドｐＴｋＳＳ４の造ｔＬ：（１．）　
　組換え体プラスミドｐ　Ｔ　Ｓ　Ｆ　１０の造或：参
考例ｌで得られたヒ｝ｔ−ＰＡｃＤＮＡを運ぶプラスミ
ドｐｔＰＡ７を持つ大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を培養し、
培養菌体から常法によりｐｔＰＡ７ＤＮＡを調製した。

得られたｐｔＰＡ？　　ＤＮＡ約２■をＹ−１００（ｌ
衡液３０〃に溶かし、Ｂｇｊ！ＩＩ８単位を加え、３７
℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処
理後、ＡＦＴ法を用い、約２．　０　ｋｂのＤＮＡ断片
を精製した。次にｐＴｒＳ３３ＤＮＡ　（参考例４）約
２■を３０ｕ１のＹ−１００緩衝液中でｌＯ単位の制限
酵素Ｂａｍ｝Ｉ　Ｉを加え、３７℃で２時間消化反応を
行った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用い
、約２．　８　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐｔＰＡ由来の約２．０ｋｂの
ＤＮＡ断片（約０．１ｇ）とｐＴｒ３３３由来の約２．
　８ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１■）とを、全量２０一
〇Ｔ４リガーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼ
５０単位を加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、＾ｐ耐性株を得た。この形
質転換株からブラスミドＤＮＡ、ｐＴｓＦ１０を単離し
、制限酵素消化による構造解析を行ったところ、目的の
構造を有することをｍ認した（第■５図参照）。

（２）組換え体プラスミドｐＴＡ４の造戒：上で得られ
たｐＴｓＦ１０プラスミドＤＮＡ約３ｕｇをＹ−０緩衝
液３０ｍに溶かし、１２単位のＫｐｎ　Ｉを加え、３７
℃で２時間消化反応を行った後、ｌ、５ｍの３Ｍ　　Ｎ
ａＣ１と１２単位のＢｓｔＥＩ　Ｕ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｈｓ社製）を加え、さらに６０℃で
２時間消化反応を行った。続いてＡＦＴ法を用い、約０
．　３　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

これとは別に、大腸菌ＩＧＨＡ２　（微工研ＦＥＲＭ　
　ＢＰ−４００）を培養し、培養菌体から常法によりｐ
ＧＨＡ２ブラスミドＤＮＡ（特開昭６０−　２２１０９
１）を調製した。得られたｐＧＨＡ２ＤＮＡ約２．を３
０ｄのＹ−１００緩衝液に溶かし、８単位のＰｓｔｌと
８単位のＢｇ１■を加え、３７℃で２時間消化反応を行
った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用い、
約０．　７　５　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

また、ｐｔＰＡ７ＤＮＡ　（参考例ｌ）約３ｇを３０−
の２ｈＭ　Ｔｒｉｓ−ＨｆＪ　（ｐＨ７．　６）　、１
５０ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃ　１、１ｍＷ　　ＭｇＣＩ２、６
ｍＭ　　２−メルカブトエタノールを含む溶液（以下、
′″Ｙ−１５０緩衝液”と略記する）に溶かし、１０単
位のＢｇ１ｍを加え、３７℃で２時間消化反応を行った
後、１２単位のＢｓ　ｔＥＩ［を加え、さらに６０℃で
２時間消化反応を行った。続いてＡＦＴ法を用い、約１
．５５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

また、参考例５で得られたｐＴｅ　ｒｍ２ＤＮＡ約２■
を３０ｕ１のＹ−０緩衝液中で１２単位のκｐｎｌを加
え、３７℃で２時間消化反応を行った後、１．５Ｈの２
Ｍ　　ＮａＣｌと８単位のｐｓｔｌを加え、さらに３７
℃で２時間消化反応を行った。続いてＡＦＴ法を用い、
約１．　？ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られた４種類のＤＮＡ断片（ｐＴｓＦ
１０由来の断片０．０３鴻、ｐＧＨＡ２由来の断片０．
０５■、ｐｔＰＡ？由来の断片０．１．ＳおよびｐＴｅ
ｒｍ２由来の断片０．１ｇ）を２０ｄのＴ４１Ｊガーゼ
緩衝液に溶かし、５０単位のＴ　４　ＤＮＡ　’Ｊガー
ゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸ｍ
　ＭＩＪ２９４株を形質転換し、＾ｐ耐性株を得た。こ
の形質転換株からプラスミドＤＮＡ，ｐＴＡ４を単離し
、制限酵素消化による構造解析を行ったところ、目的の
構造を有することを確詔した（第１６図参照）。

（３）組換え体ブラスミドｐＴｋｓＤ２１７の造戊：上
で得られたｐＴＡ４ブラスミドＤＮＡ，約１０ｕｇヲ１
００　ｔｄｌＯ：）Ｙ　−　１　０　０　＠衝液に溶か
し、約３０単位のＸｈｏｒを加え、３７℃で２時間消化
反応を行った。続いて、フェノール抽出およびクロロホ
ルム抽出を行った後、エタノール沈澱によってＤＮＡ断
片を回収し、５０ｄのＴＥ緩衝液［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｊ！　（ｐ｝１７．５）　、０．　５ｍＭ　ＥＤ
Ｔ＾〕に溶かした。このＤＮＡ溶液１０ｍに、５倍濃度
のＢＡＬ３１緩衝液［：１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐ｝１８．０）　、３ＭＮａＣ１、６０ｍＭ　　Ｃａ
Ｃ１ｓ　、６０ｍＷ　　ＭｇＣ１＊、５ｍＭＥＤＴ＾〕
を１０−、水を３’Ｏ　ｄ加え、さらに０．５単位のエ
キソヌクレアーゼＢＡＬ３１（宝酒造社製）を加え、３
０℃で５分間反応を行った。この反応条件は、Ｘｈｏｌ
末端から約０．　５　ｋｂのＯＮ＾が削れる条件である
。この反応をフェノール抽出によって止め、さらにクロ
ロホルム抽出を行った後、エタノール沈澱によりＤＮＡ
断片を回収した。このＤＮＡ断片を３０〃のＹ−１００
緩衝液に溶かし、１０単位のＢａｍＨＩを加え、３７℃
で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理
後、ＡＦＴ法を用イ、約１．５ｋｂ（７）ＤＮＡ断片を
精製した。

これとは別に、ｐＴｒＳ３３ブラスミドＤＮＡ（参考例
４〉約２Ｎを３０〃のＹ−０１衝液中で約１２単位のＳ
ａｃ　Ｉを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。フ
ェノール抽出とクロロホルム抽出の後、エタノール沈澱
によってＤＮＡ断片を回収し、全量４０ｍの５０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ’　（ｐＨ７．８）、７ｍＭ　　Ｍｇ
ＣＬ、６ｍＭ　　２−メルカプトエタノール、０．２５
ω−　ｄＡＴＰ．０．２５ｍＭ　　ｄＣＴＰ，０．２５
ａＭ　　ｄＧＴＰ，および０．　２５ｍＭ　　ｄ　Ｔ　
Ｔ　Ｐを含む緩衝液（以下、１ポリメラーゼ緩衝液“と
略称する）に溶かし、６単位のクレノー断片（κＩｅｎ
ｏｗ　　Ｐａｌ　ｒ　）　　（宝酒造社製）を加え、１
５℃で１時間反応させ、Ｓａｃ　Ｉ突出末端を削って平
坦末端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、
クロロホルム抽出を行った後、エタノール沈澱によって
ＤＮＡ断片を回収した。

このＤＮＡ断片を３０ｄのＹ−１００緩衝液に溶かし、
１０単位のＢａｍＨｒを加え、３７℃で２時間消化反応
を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用
い、約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐＴＡ４由来の約１．５ｋｂの
ＤＮＡ断片（約０．２，ｑ）とｐＴｒＳ３３由来の約２
．　８　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１Ａｇ）とを、全量
２０〃のＴ４１Ｊガーゼ緩衝液に溶かし、５０単位のＴ
４ＤＮＡＩＪガーゼを加え、４℃でｌ８時間結合反応を
行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、八ｐ耐性株を得た。この形
質転換株からブラスミドＤＮＡｐＴｋＳＤ２　１　７を
単離し、制限酵素消化による構造解析を行うとともに、
大腸菌トリプトファン・プロモーター（Ｐｔｒｐ）の下
流の塩基配列をＭ１３ファージを用いたディデ才キシ・
シークエンス（ｄｉｄｅｏｘｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）法
〔ジェイ１メシング（Ｊ，　Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら：ジー
ン（Ｇｅｎｅ）　１９．　２６９（１９８５）　：ｌに
よって決定した。その結果、ｐＴｋｓＤ２１７は目的の
構造を有しており、かつ該塩基配列はであることを確認
した（第１７図参照）。

（４）組換え体ブラスミドｐＴｋｓＬ１１の造成：上で
得られたｐＴｋＳＤ２　１　？ブラスミドＤＮＡ約３塊
を３０−のＹ−１００緩衝液に溶かし、１０単位のＨｉ
ｎｄＩＩ［と１５単位の３ｃａ　ｌを加え、３７℃で２
時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、
ＡＦＴ法を用い、約０．　２３ｋｂのＤＮＡ断片を精製
した。次に、参考例５で得られたｐＴｅｒｏ＋　２プラ
スミドＤＮＡ約２Ｊｉｇを３０〃のＹ−１００緩衝液に
溶かし、ｌＯ単位のＨｉｎｄＤＩと１０単位のＮｓｉｌ
（二１−イングランド・バイオラブズ社製）を加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱
処理後、ＡＦＴ法を用い、約２．　８　ｋｂのＤＮＡ断
片を精製した。

また、下記２種の合ｊｉ！ＤＮＡ　（３５塩基と３１塩
基〉をアプライド・バイオシステムズ社３８０＾・ＯＮ
＾合戊機を用いて合威し、それぞれ別々に上で述べた方
法を用いて５′−リン酸化した。

５’−ＡＣＴＧＴＧＡＣＧＴＣＣＣＣＡＧＣＴＧＴＴＣ
ＴＧＡＡＧＧ＾＾＾ＴＧＣ＾−３′３’−ＴＧＡＣＡＣ
ＴＧＣＡＧＧＧＧＴＣＧＡＣ＾＾ＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴ
−　５’このようにして得られたｐＴｋｓＤ２１７由来
の約０．　２　３　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．Ｏｌ■）
、ｐＴｅｒｍ２由来の約２．８ｋｂのＤＮＡ断片（約０
．１．１１）、および５′−リン酸化された２種の合ｔ
ＤＮＡ（ｌビコモルずつ）を全量２０ｄのＴ４リガーゼ
緩衝液に溶かし、３００単位の７４ＤＮＡＩＪガーゼを
加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、＾ｐ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡ，ｐＴｋｓＬ１１を単離
し、制限酵素消化による構造解析およびＭｌ３ディデオ
キシ・シークエンス法による塩基配列決定を行ったとこ
ろ、ｐＴｋｓＬ１１は目的の構造を有することを確認し
た（第１８図参照）。

（５）組換えブラスミドｐＴｋ　Ｓ　Ｓ　４の造成：参
考例ｌで得られたｐｔＰＡ７プラスミドＤＮＡ約２４を
３０一のＹ−１００！ｌ衡液に溶かし、１２単位の制限
酵素３ｃａ　ｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行っ
た。６５℃、ｌＯ分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約
２．　Ｏ　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。一方、上で得
られたｐＴｋｓＬ１１ブラスミドＤＮＡ約２縄を上と同
様の反応に供し、６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ
法を用いて約２．ＯｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐｔＰＡＴ由来の約２，　Ｏｋ
ｂのＤＮＡ断片（約０．　１■）とｐ’ｒｋＳＬ１１由
来の約２．　Ｏ　ｋｂのＤＮＡ断片〈約０．１ｕｇ）を
２０Ｊｄ！のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、７　４　０
Ｎ＾リガーゼ３００単位を加え、４℃で１８時間結合反
応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この形
質転換株からブラスミドＤＮＡ，ｐＴｋＳＳ４を単離し
、制限酵素消化による構造解析を行ったところ、ｐＴｋ
　Ｓ　Ｓ　４が、目的の構造を有することを確認した（
第ｌ９図参照）。

参考例７． 組換え体プラスミドｐＴｋｓＲ１ｇの造成：（１）　　
組換え体プラスミドｐＴｋｓＪ１の造ａ：参考例６の（
２）で得られたｐＴＡ４プラスミドＤＮＡ約２■を３０
−のＹ−０緩衝液に溶かし、ｌＯ単位のＥｃｏＲＩと３
０単位のＢｂｅｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行
った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用い、
約２．　８　ｋｂのＢｂｅ１−ＥｃｏＲＩ断片を精製し
た。別に、ｐＴＡ４ＤＮＡ約３Ｎを３０ＪｄｌのＹ−０
緩衡液に溶かし、１２単位のＫｐｎ　Ｉを加え３７℃で
２時間消化反応を行った。続いて、１．５Ｈの２Ｍ　　
ＮａＣ１と１単位のＥｃｏＲＩを加え、さらに３７℃で
１時間消化反応を行った。この反応により、ＤＮＡはＫ
ｐｎ　Ｉで完全に、ＥＣＯＲＩで部分的に消化された。

６５℃、ｌＯ分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用い、約１．
　４　ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎｌ断片を精製した。ま
た、下記２種の合成ＤＮＡ　（１６塩基と２４塩基）を
アプライド・バイオシステムズ社３８０＾・ＤＮＡ合成
機を用いて合威し、それぞれ別々に上で述べた方法と同
様の方法を用いて５′−リン酸化した。

５’　−　ＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＡＴＧＧ　−　３
’３’　−　ＣＧＣＧＧＡＧＧＡＣＧＧＡＧＧＧＴＡＣ
ＣＴＴＡ＾−５′このようにして得られたｐＴＡ４由来
の約２．８ｋｂのＢｂｅｌ−ＥｃｏＲ！断片（約０．１
ｇｇ）、ｐＴＡ４由来の約１．　４　ｋｂのＥｃ　ｏＲ
　Ｉ−Ｋｐｎ　１断片（約０．０５ｕｇ）および５′−
リン酸化された２種の合ＪｄｔＤＮＡ　（それぞれｌ　
ｐｍｏｌｅずつ）を２０４の７４１Ｊガーゼ緩衝液に溶
かし、５０単位の７４ＤＮＡＩＪガーゼを加え、４℃で
１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体ブラスミドの混合物を用いて、大ｍ菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、＾ｐ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡ、ｐＴｋｓＪ１を単離し
、制限酵素消化による構造解析およびＭ１３ファージを
用いたディデオキシ・シークエンス法により、ｐＴｋｓ
Ｊ１が目的の構造を有することを５ｍ認した（第２０図
参照）。

（２）組換え体ブラスミドｐＴｋＳＲ１１１の造或：上
で得られたｐＴｋｓＪ１プラスミドＤＮＡ約３４を３０
〃のＹ−１００ｔｌｉ衡液に溶かし、ｌＯ単位のＸｈｏ
ｌと１５単位の３ｃａ　ｌを加え、３７℃で２時間消化
反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＰＴ法
を用い、約０．　５　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。別
に、参考例４で得られたｐＴｒＳ３３プラスミドＤＮＡ
約２ｕｇを１５０ｍＭ　　ＫＣＩ！を含むＹ−０緩衝液
に溶かし、８単位のｐｖｕ　ｒとＩ５単位のＳａｆｌを
加え、３７℃　　で２時間消化反応を行った。６５℃、
１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用い、約１．　０　ｋ
ｂのＤＮＡ断片を精製した。また、参考例５で得られた
ｐＴｅｒｍ　２ブラスミドＤＮＡ約２■を３０ｄのＹ−
１５０ｔ！！衝液に溶かし、８単位のＰｖｕ【と８単位
のＮ　ｓ　ｉ　Ｉ　　（Ｎｅｗ　ＢｎｇＩａｎｄ　ａｉ
ｏｌａｂｓ社製）を加え、３７℃で２時間消化反応を行
った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用い、
約１．８５ｋｂのＯＮ＾断片を精製した。また、下記２
種の合或ＤＮ＾（３５塩基と３１塩基）をアプライド・
バイオシステムズ社３８０＾・ＤＮＡ合或機を用いて合
或し、それぞれを別々に上で述べた方法と同様の方法を
用いて５′−リン酸化した。

５’−ＡＣＴＧＴＧＡＣＧＴＣＣＣＣＡＧＣＴＧＴＴＣ
ＴＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＣＡ　−３’３’−ＴＧＡＣＡ
ＣＴＧＣＡＧＧＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＣＴＴＣＣＴＴ
Ｔ　−５’このようにして得られたｐＴｋｓＪ１由来の
約０。５ｋｂのＸｈｏＩ−Ｓｃａｌ断片（約０．０５ｇ
）、ｐＴｒＳ３３由来の約１．　０　ｋｂのＰｖｕｌ−
Ｓａｊ！１断片（約０．２Ａｇ＞　、ｐＴｅｒｍ２由来
の約１．８５ｋｂのＮｓｉｌ−Ｐｖｕｒ断片（約０．１
ｇ）、および５′−リン酸化された２種の合成ＤＮＡ　
（それぞれ１　ｐｍｏｌ６ずつ）を２ｈＪのＴ４リガー
ゼ緩衝液に溶かし、５０単位のＴ４ＤＮＡ　　’Ｊガー
ゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

このようにして得られた組換え体ブラスミドの混合物を
用いて、大腸！ｌＩ關２９４株を形質転換し、＾ｐ耐性
株を得た。この形質転換株からプラスミドＤＮＡ，ｐＴ
ｋＳＲ１Ｂを単離し、制限酵素消化による構造解析およ
びＭ１３ファージを用いたディデオキシ・シークエンス
法により、ｐＴｋＳＲ　１８が目的の構造を有すること
を確認した（第２１図参照）。

参考例８， 組換えブラスミドｐＬＪＫＢＩＯＩの造成：（１）　　
組換えプラスミドｐＵＫＡ２の造或：参考例２で得られ
たヒ｝　ｐｒｏ−ＵＫｃＤＮ＾を運ぶプラスミドｐＵＫ
１を持つ大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株からｐＵＫＩＤＮＡを
調製した。得られたｐＵＫＩＤＮＡ約２縄を１０ｍＭ　
　Ｙ−１００＄ｌ衡液３０Ａ１に溶かし、８単位の制限
酵素Ｎｃａｌと８ＪＩＬ位のＳｔｕｌを加え、３７℃で
２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後
、ＡＦＴ法を用いて約１．　２　ｋｂのＤＮＡ断片を精
製した。一方、参考例４で得られたｐＴｒＳ３３ブラス
ミドＤＮＡ約２塊を１０ｍＭＴｒｉｓ−ｔｌｃ１（ｐＨ
　７．５）、２５−κＣ１、７ａ＋Ｍ　ＭｇＣＩ＊　−
　６ｍＭ　　２−メルヵブトエタノールを含む溶液（以
下、“Ｋ−２５！ｌ衡液”と略称する冫３０〃に溶かし
、１６単位の制限酵素Ｓ＋ｙ＋ａ　Ｉを加え、３０℃で
２時間消化反応を行った。

続いて１．５〃のＩＭＮａＣ１と１０単位のＮｃｏ　Ｉ
を加え、さらに３７℃で２時間消化反応を行った。

６５℃、ｌＯ分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約２．
８５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐＬＩＫ１由来の約１．２ｋｂ
のＤＮＡ断片（約０．　０　５　ｇ＞とｐＴｒｓ３３由
来の約２．８５ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１■）を、全
量２０−の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．　６
）、１ｈＭ　ＭｇＣ１　，　１０ｍ−ジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ）および１ｍＭＡＴＰを含む緩衝液に溶かし
、Ｔ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ１００単位を加え、４℃で１８
時間結合反応を行った。

得られた組換え体ブラスミドの混合物を用いて、大ｆｌ
ｉｌｌＭＭ２　９　４株を形質転換し、アンビシリン（
Ａｐ）耐性株を得た。この形質転換株からプラスミドＤ
ＮＡＳｐＵＫＡ２を単離し、制限酵素消化による構造解
析を行ったところ、目的の構造を有することを確認した
（第２２図参照）。

（２）組換えプラスミドｐＵＫ８１０１の造成：上で得
られたｐＵＫＡ２プラスミドＤＮＡ約２ｕｇを、Ｙ−０
緩衝液３０ＪＪＪに溶かし、１２単位の制限酵素κｐｎ
ｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。続いて１
．５−の２　Ｍ　ＮａＣ１とｌＯ単位の）ｌｃｏ　Ｉを
加え、さらに３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃
、ｌＯ分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約１．　２　
ｋｂのＤＮＡ断片を精鶴した。一方、参考例４で得られ
たｐＴｒＳ３３プラスミドＤＮＡ約２ｕｇを３０ｄのＫ
−２５（ｌ衝液に溶かし、ｌ６単位のＳωａｌを加え、
３０℃で２時間消化反応を行った。

続いて１．５ｍの２ＭＮａＣ］と１０単位のＰｓｔ　Ｉ
を加え、さらに３７℃で２時間消化反応を行った。６５
℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約１．　１
　５　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。また、参考例５で
得られたｐＴｅｒｍ２ブラスミド［ｌＮＡ約２■を３０
〃のＹ−０緩衝液に溶かし、１２単位のκｐｎＩを加え
、３７で２時間消化反応を行った。続いて１．５−の２
Ｍ　ＮａＣ１とｌＯ単位のＰｓｔ　Ｉを加え、さらに３
７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱
処理後、ＡＦＴ法を用いて約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を
精製した。また、下記２種の合戊ＤＮＡ　（４１塩基と
４５塩基）をアプライド・バイオシステムズ社３８０＾
・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。

５’−ＧＧＧ＾＾ＴＧＧＴＣＡＣＴＴＴＴＡＣＣＧＡＧ
Ｇ＾＾＾ＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＡＣ−３’　（４
１塩基〉３’　−　ＣＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧ＾＾＾＾
ＴＧＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＴＧ
ＧＴＡＣ−　５’　（４５塩基）これらの合！ＤＮＡを
２０ピコモル（ｐｍｏｌｅｓ）ずつ別々に、２０ｕＩの
Ｔ４キナーゼ緩衝液中で５単位の７４ＤＮＡキナーゼを
加え、３７℃で３０分間反応させることにより、合ａＤ
ＮＡの５′末端をリン酸化した。

このようにして得られたｐＵＫＡ２由来の約１．　２　
ｋｂのＤＮＡ断片（約０．　０　５　ｇ）　、ｐＴｒ３
３３由来の約１．　１　５　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．
０５ｇ＞、ｐＴｅｒａ＋２由来の約１．　？　ｋｂのＤ
ＮＡ断片（約０．０５ｄ）、および５′リン酸化された
２種の合成ＤＮＡ（ｌピコモルずつ）を全量２０４のＴ
４リガーゼ緩衡液に溶かし、３００単位のＴ　４　ＤＮ
Ａ　！Ｉガーゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行っ
た。

得られた組換え体ブラスミドの混合物を用いて、大腸菌
聞２９４株を形質転換し、＾ｐ耐性株を得た。この形質
転換株からプラスミドＤＮＡ，ｐＵＫＢ１　０　１を単
離し、制限酵素消化による構造解析およびＭ１３ディデ
オキシ・シークエン｝法による塩基配列決定を行ったと
ころ、ｐ［ＩＫ８１０１は目的の構造を有することを確
認した（第２３図参照）。

参考例９． 組換えプラスミドｐＴＧ３の造成： 参考例６で得られたｐＴｋＳＳ４プラスミドＤＮＡ約２
塊を３０−のｙ−ｏａ衡液に溶かし、１０単位の制限酵
素Ｎａｒｌ（ニューイングランド・バイオラブズ社製）
を加え、３７℃で２時間消化反応を行った。続いてｌ．
０〃の２ＭＮａＣ１と１２単位の９ａｍＨ　Ｉを加え、
さらに３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０
分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約３．　３　ｋｂの
ＤＮＡ断片を精製した。一方、参考例７で得られたｐＴ
ｋｓＲ１ＢブラスミドＤＮＡ約３縄を上と同一の反応に
供し、６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＰＴ法を用いて
約０．　２　ｋｂのＯＮ＾断片を精製した。

このようにして得られたｐＴｋＳ３４由来の約３．３ｋ
ｂのＤＮＡ断片（約０．１■）とｐＴｋｓＲ１８由来の
約０．２ｋｂのＤＮＡ断片〈約０．ＯＩＭ）を２０ハの
Ｔ４リガーゼａｔ液に溶かし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０
０単位を加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸１
１ＭＭ２９４株を形質転換し、八ｐ耐性株を得た。この
形質転換株からプラスミドＤＮＡ，ｐＴＧ３を単離し、
制限酵素消化による構造解析を行ったところ、ｐＴＧ３
が目的の構造を有することを確認した（第２４図参照）
。

参考例１　０． 組換えプラスミドｐｈＰＡ２の造成： 参考例９で得られたｐ’ｒｃａプラスミドＤＮＡ約２μ
ｇをＹ−１００緩衝液３０〃に溶かし、１０単位のＥｃ
ｏＲＩとＰｖｕ　Ｉを加え、３７℃で２時間消化反応を
行った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用い
て約１．　７　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

また、参考例８で得られたｐｔＪＫＢ　１　０　１ブラ
スミドＤＮＡ約２Ｊ１ｇをＹ−１００緩衝液３０〃に溶
かし、１０単位のＮＣＯ　Ｉとｐ　ｖ　ｕ．　Ｉを加え
、３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間
の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約３，ＯｋｂのＤＮＡ断
片を精製した。

さらに、参考例７で得られたｐＴｋｓＲ１８プラスミド
ＤＮＡ約２■をＹ−１００緩衝液３０〃に溶かし、ＩＯ
単位のＨｉｎｄＩＩ［とＡａｔ■を加え、３７℃で２時
間消化反応を行った。

６５℃、ｌＯ分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約０．
　５　５　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

また、下記４種の合成ＤＮＡ（３７塩基と４１塩基およ
び４１塩基と４５塩基）をアプライド・バイオシステム
ズ社３８０Ａ−ＤＮＡ合戊機を用いて合或した。

｛４５塩基｝ これらの合成ＤＮＡを２０ピコモル（ｐｍｏｌｅｓ）ず
つ別々に、２０〃のＴ４キナーゼｖｌ衝液中で５単位の
Ｔ４ＤＮＡキナーゼ（宝酒造社塾）を加え、３７℃で３
０分間反応させることにより、合ｒ１ｊ，ＤＮＡの５′
末端をリン酸化した。

このようにして得られたｐ’ｒｃａ由来の約１、７ｋｂ
のＤＮＡ断片（約０．０５■）　、ｐＵＫｌｏ１由来の
約３．　Ｏ　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．０５ノＬｇ）、
ｐＴｋｓＲ１８由来の約０．　５　５　ｋｂのＤＮＡ断
片（約０．０５ｇ）、および５′リン酸化された４種の
合ｔＤＮＡ　（１ピコモルずつ）を全量２０〃のＴ４１
Ｊガーゼ緩衝液に溶かし３００単位のＴ４リガーゼを加
え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡ，ｐｈＰＡ２を単離し、
制限酵素消化による構造解析およびＭ１３ディデオキシ
・シークエンス法による塩基配列決定を行ったところ、
ｐｈｐＡ２は目的の構造を有することを確認した（第２
５図参照）。

参考例１１ ｐｒｏ−ＵＫ誘導体ＵＫ−Ｓ　１をコードする組換え体
ブラスミドｐＵＫＳＩの造戊：（１）　　鋳型１本鎮Ｄ
ＮＡ　（１本鎮ｐＵＫｍｐｓ１）の造或： 参考例２で得た約３μｇのｐＵＫ１を３０−のＹ−１０
０ｔｌ衝液に溶かし、制限酵素ＰｓｔｌとＢａｍＨＩを
それぞれ１０単位ずつ加え、３７℃で２時間消化反応を
行った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法〔バイ
オテクニクス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）２　　．
６６−６７（１９８４）　〕を用いて８９０ｂｐのＰｓ
ｔｌ−ＢａｍＨＩ　　ＤＮＡ断片を精製した。

一方、Ｍ１３ファージベクターであるＭ１３ｍｐ１　８
ＲＦ　　ＤＮＡ　（宝酒造社製）約ｌμｇを全量３０〃
のＹ−１００１１衝液に溶かし、制限酵素ＰｓｔｌとＢ
ａｍＨ’ｌとをそれぞれ１０単位ずつ加え、３７℃で２
時間消化反応を行った。

６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約７、
２ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐＵＫ１由来の８９０ｂｐのＤ
ＮＡ断片とＭ１３ｍｐｌ８ＲＦ由来の約７．２κｂのＤ
ＮＡ断片を全量２０一のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、
３００単位のＴ　４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼを加え、４℃
で１８時間結合反応を行った。

次に、公知の方法〔メシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら；メ
ソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｒ
＋　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１０１　．２０（１９８３
）　）に従い、上記反応液を用いて大８ｉ菌ＪＭ１０５
株をトランスフエクションし、組換え体ファージを得た
。続いて、公知の方法〔上記文献〕に従い、この組換え
体ファージを大腸菌ＪＭ１０５株に感染させた後、培養
液から１本鎖ファージＤＮＡを回収した。また、培養菌
体より、ブラスミドＤＮＡ回収法に準じて、２本鎖ファ
ージＤＮＡを回収した。この２本鎮ファージＤＮＡ　（
ｐＵＫｍｐＳ　１）の構造は制限酵素消化により確認し
た（第２６図参照）。

（２）オリゴヌクレ才チドを用いたＵＫ−ｃＤＮＡへの
変異の導入： （Ａ）変異導入用合成ＤＮＡの調製とリン酸化：ＵＫの
１６４番目のアミノ酸残基ＰｈｅをＡｓｎに変え、糖鎮
を付加したＵＫ誘導体（このＵＫ誘導体を以下、ＵＫ−
ＳＬと略記する）を製造するため、１７塩基の合戊ＤＮ
Ａ５’　−　ＧＧＧＧＡＧ＾＾＾＾ＣＡＣＣＡＣＣ−３
’をアブライド・バイオシステムズ社３ＢＯＡ−ＤＮＡ
合成機を用いて合成した。

次にこのようにして得られた合ｔＤＮＡ２５ピコモル（
ｐｍｏｌｅｓ）を１０ｄのＴ４キナーゼ緩衝液中で、５
単位の７４ＤＮＡキナーゼ（宝酒造社製）を加え、３７
℃で３０分間反応させることにより、５′末端をリン酸
化した。

（Ｂ）２種のオリゴヌクレオチド・ブライマーを用いる
部位特異的変異の導入： 上で得られた１本鎮の組換えファージＤＮＡ６．５ｍ（
約２４のＤＮＡを含む）とＩＩｄ！の１０倍濃度のポリ
メラーゼ緩衝液（５００ｍＭＴｒ　ｉ　ｓ−ＨＣＪ！　
（ｐＨ７．８）　、７　０ｍＭＭ　ｇ　Ｃ　Ｊ　ｘ、６
０ｍＭ　　２一メルカブトエタノール、０．２　５ｍＭ
　　ｄＡＴＰ，０．２　５ｍＭｄＣＴＰ，０．２　５ｍ
Ｍ　　ｄＧＴＰおよび０．２５ｍＭ　　ｄＴＴＰを含む
〕と上記で得られた変異導入用合成ＤＮＡ２ｍ（２．５
ピコモル）を混合した溶液を６５℃に５分間、５５℃に
５分間、３７℃に１０分間、２５℃に１０分間放置した
後、３単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー（
κＩｅｎｏｗ）断片（宝酒造社製）（以下、クレノー断
Ｋ表略記する〉を加え、２５℃で３０分間反応させた。

次いで、この反応液に、■〃の１０倍濃度のポリメラー
ゼ緩衝液と０．５ｐＩ！Ｉｏｌｅ／ＡＩｌのＭ１３プラ
イマ−Ｍ４　（宝酒造社１１）６ｄと３単位のクレノー
断片を加え、３７℃で１０分間、２５℃で４０分間反応
させた後、１０ｍＭ　　ＡＴＰを２−と３００単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼを加え、ｌｉｔで１８時間結合反応を
行った。この反応液に対して、フェノール抽出とクロロ
ホルム抽出を行った後、エタノール沈殿によってＤＮＡ
断片を回収した。このＤＮＡ断片を全量３０ｄのＹ−１
００緩衝液に溶かし、１２単位のＥｃｏＲＩと１２単位
のＰｓｔＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。

６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約ａｏ
ｏｂｐのＰｓ　ｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片を精製した。

（Ｃ）変異を導入したＤＮＡ断片のべクターへの組み込
み 参考例３で得られたｐＵＫ１１ブラスミドＤＮＡ約３■
を３０−のＹ−５０ｔｊＩ衡液に溶かし、ｌＯ単位のＡ
ａｔＩＩ（東洋紡縁社製）と８単位のＰｓｔｌを加え、
３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、ｌＯ分間の
熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約１．　Ｏ　ＫｂのＡａｔ
ＩＩ−ＰｓｔＩ断片を精製した。別に参考例８で得られ
たｐｔＪＫＥ３１０１プラスミドＤＮＡ約３■を３０ｄ
のＹ一５０緩衝液に溶かし、１０単位のＡａｔＩＩと１
０単位のＥｃｏＲｒを加え、３７℃で２時間消化反応を
行った。６５℃、１０分間の熱処理後、Ａ’ＦＴ法を用
い、約２．９κｂのＡａｔＩ［−ＥｃｏＲ■断片を精製
した。

このようにして得られたｐＵＫ１１由来のＡａｔＩＩ−
Ｐｓｔｌ断片（約０．０５ｇ）とｐＵＫＢＩ　Ｏ　１由
来の八ａｔＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約０．１４）と変異
を導入した約６００ｂｐのＰｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ断片と
を２０−のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、３００単位の
Ｔ４ＤＮＡ　ＩＪガーゼを加え、４℃で１８時間結合反
応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
Ｃ６００３Ｆ８株〔プロシーデイング・オブ・ず・ナシ
ョナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．＾ｃａｄ，　Ｓｃ　ｉ，　）　ＬＩＳ＾７２，
３４１．６（１９７５））を形質転換し、Ａｐ耐性株を
得た。

この形質転換株からコロニーハイブリダイゼーション法
を用いて、変異導入用合ｔＤＮＡ　（上述）の５′末端
を０Ｐで放射能標識したブローブとハイブリダイズする
組換えブラスミドｐｔＪＫＳ１を単離した。制限酵素消
化による構造解析およびＭ１３ファージを用いたディデ
オキシ・シークエンス法により、ｐＵＫｓ１が目的の構
造を有することを確認した（第２７図参照）。

参考例１　２． ｔ−ＰＡ発現プラスミドｐｓＥＩＰＡ１−９Ａの造或： （１）組換え体ブラスミドｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　１０５Ｍの
造ｔｊ．：本発明者らによって造成されたブラスミドｐ
ＡＧＥ２８［水上ら：ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー（Ｊ．日ｉｏｃｈｅｍ，）　１０１　　．　　１
３０７　−１３１０（１９８７））を持つ大腸菌ＨＢＩ
ＯＩ株を培養し．培養菌体から常法によりｐＡＧＥ２８
ＤＮＡを調製した。得られたｐＡＧＥ２８ＤＮＡ約２■
を３０ｄ（７）Ｙ−　１　０　０ｆＩ衡液に溶カシ、８
単位のＸｈｏｌと１２単位のＳｃａ　ｌを加え、３７℃
で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理
後、ＡＦＴ法を用いて約２、８ｋｂのＤＮＡ断片を精製
した。一方、本発明者らによって造戊されたプラスミド
ｐＡＧＥ１０３　　Ｃ水上ら：ジャーナル・オブ・バイ
オケミストリー　（Ｊ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ，）１０１　
，　１３０７−１３１０（１９８７）］を持つ大腸菌Ｈ
ＢＩＯＩ株を培養し、培養菌体から常法によりｐＡＧ［
！１０３ＤＮＡを調製した。得られたｐＡＧＢ１０３０
Ｎ＾約３４を３０ｄのＹ−１００緩衝液に溶かし、１０
単位のＥｃｏＲＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行
った。フェノール抽出とクロロホルム抽出の後、エタノ
ール沈澱によってＤＮＡ断片を回収した。

このＤＮＡ断片を全量４０〃のポリメラーゼ緩衝液に溶
かし、６単位のクレノー断片を加え、１５℃で１時間反
応させることにより、ＥｃｏＲＩ突出末端を平坦末端に
変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロロホ
ルム抽出を行った後、エタノール沈澱によってＤＮＡ断
片を回収した。このＤＮＡ断片を３０−のＹ−１００１
衝液に溶かし、１２単位のＸｈｏＩを加え、３７℃で２
時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、
ＡＦＴ法を用いて約０．　４　ｋｂのＤＮＡ断片を精製
した。またＯ’　Ｈａｒａらによって造或されたブラス
ミドｐＫＣＲ　Ｃ　Ｄ’Ｈａｒａら：ブロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔｌ．＾ｃａｄ．　Ｓｃｉ，　）
Ｕ　Ｓ　Ａ　７８　．　１５２７（１９８１））を持つ
大腸！ＩＨＢＩＯＩ株を培養し、培養菌体から常法によ
りｐＫＣＲ・ＤＮＡを調製した。得られたｐＫＣＲ−Ｄ
ＮＡ約２■を３ｂｌｌのＹ−１５０１１衝液に溶かし、
１２単位のＢａｍＨＩと１６単位のＳａｌｌを加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。フェノール抽出とクロ
ロホルム抽出の後、エタノール沈澱によってＤＮＡ断片
を回収した。このＤＮＡ断片を全量４０〃のポリメラー
ゼ緩衝液に溶かし、６単位のクレノー断片を加え、１５
℃で１時間反応させることにより、ＢａｍＨＩ突出末端
とＳａｊ！　１突出末端を平坦末端に変えた。６５℃、
１０分間の熱処理の後、ＡＦＴ法を用いて約１．　８　
５　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐＡＧＥ２８由来の約２，　８
　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．０　５ｇ）　、ｐＡＧＥ１
０３由来の約０．４ｋｂのＤＮＡ断片（約０．０３μｇ
）、およびｐＫＣＲ由来の約１．　８　５　ｋｂのＤＮ
Ａ断片（約０．　２　ｇ＞を２０〃のＴ４リガーゼｔ１
衝液に溶かし、３００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え
、４℃で１８時間結合反応を行った。

このようにして得られた組換え体プラスミドの混合物を
用いて、大腸菌ＭＭ２９４株を形質転換し、カナマイシ
ン（以下、Ｋｍと略記する）耐性株を得た。この形質転
換株からブラスミドｐＡＧＥ１　０　５Ｍを単離し、制
限酵素消化による構造解析を行ったところ、目的の構造
を有することをｆｉｆ１誌したく第２８図参照〉。

（２）組換え体ブラスミドｐＡＧＥ１０６の造或：上で
得られたｐＡＧＥ　１　０　５Ｍ−ＤＮＡ約２４を３０
ｄのＹ−１００緩衝液に溶かし、１２単位のＳｅａ　Ｉ
を加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、ｌ
Ｏ分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約５，　Ｏ　ｋｂ
のＤＮＡ断片を精製した。一方、２０ピコモル（ｐｍｏ
ｌｅｓ）のＥｃｏＲＩリンカー（ＧＧＡＡＴＴＣＣ　：
コラボレイティブ・リサーチ社製）を上で述べた方法と
同様の方法を用いて５′−リン酸化した。

このようにして得られたｐＡＧＥ　１　０　５Ｍ由来の
約５，　Ｏ　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．　１　ｇ）とｌ
　ｐＩＩＩｏｌｅの５′−リン酸化されたＥｃｏＲＩリ
ンカーを２０〃のＴ４１Ｊガーゼ１ｌ衝液に溶かし、１
００単位のＴ　４　ＤＮＡ　！Ｉガーゼを加え、４℃で
１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
間２９４株を形質転換し、Ｋｍ耐性株を得た。この形質
転換株からブラスミドＤＮＡｐＡＧＥ　１　０　６を単
離し、制限酵素消化による構造解析を行ったところ、ｐ
ＡＧＥ１０６は目的の構造を有することをｖＩ１認した
（第２９図参照）。

（３）　　ｔ　−　Ｐ　Ａ発現プラスミドＰＳＥＩＰＡ
Ｉ−５の造戊：上で得られたｐＡＧＥ　１　０　６ＤＮ
Ａ約２ｕｇを３０−のＹ−０緩衡液に溶かし、１２単位
のＫｐｎｒを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。

さらに、１．５−の２Ｍ　　ＮａＣ１とｌＯ単位のＢａ
ｍＨＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６５
℃、ｌＯ分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約５．　Ｏ
　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。一方、参考例ｌで得ら
れたｐｔＰＡ７プラスミドＤＮＡ約３縄を７５ｍＭＮａ
ｃＪ！を含むｙ−ｏｓ衡液３０ｍに溶かし、１２単位の
Ｆｏｋ　Ｉと１２単位のＥｃｏＲＩを加え、３７℃で２
時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、
ＡＦＴ法を用いて約０．　７　ｋｂのＯＮ＾断片を精製
した。別に、ｐＴＡ４ＤＮＡ約３題を３０ｄのＹ−０緩
衝液に溶かし、１２単位のＫｐｎ　Ｉを加え、３７℃で
２時間消化反応を行った。続いて、１．５ｍの２ＭＮａ
Ｃ１と１単位のＥｃｏＲＩを加え、さらに３７℃で１時
間消化反応を行った。この反応により、ＤＮＡをＫｐｎ
　ｒで完全に、ＥｃｏＲＩで部分的に消化させた。６５
℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用い、約１．　４
　ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片を精製した。また、
下記２種の合１１ｉ１ｉ：ＤＮＡ（２１塩基と２１塩基
）をアプライド・バイオシステムズ社３８０＾・ＤＮＡ
合戊機を用いて合威し、それぞれ別々に上で述べた方法
と同様の方法を用いて５′−リン酸化した。

５’　−　ＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣ＾＾Ｔ６＾＾Ｇ
＾−３′３’−ＧＴＡＣＣＴＡＣＧＴＴＡＣＴＴＣＴＣ
ＴＣＣ　−５’このようにして得られたｐＡＧＥ　１　
０　６由来の約５，　ＱｋｂのＤＮＡ断片（約０、Ｉ　
ＪＡｇ）　、ｐｔＰＡ？由来の約０．　７　ｋｂのＤＮ
Ａ断片〈約０．　１　４）、ｐＴＡ４由来の約１．　４
　ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎ■断片（約０．０５ｇ＞、
および上で得られた５′−リン酸化された２種の合Ｊ９
ＤＮＡ　（それぞれｌ　ｐｍｏｌｅずつ）を２０〃のＴ
４リガーゼ緩衝液に溶かし、５０単位のＴ４ＤＮＡＩＪ
ガーゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸１
１ＭＭ２９４株を形質転換し、Ｋｍ耐性株を得た。この
形質転換株からプラスミドＤＮＡｐｓＥＩＰＡ１−５を
単離し、制限酵素消化による構造解析およびＭｌ３ファ
ージを用いたデイデオキシ・シークエンス法により、ｐ
ｓＢＩＰ＾１−５が目的の構造を有することを確認した
（第３０図参照）。

（４）　ｔ−ＦＡ発現プラスミドｐｓＥＩＰＡ１−９の
造成： 上で得られたｐｓＥＩＰＡｉ−５ＤＮＡ約２■を３０Ｊ
ｄＩのＹ−０！衝液に溶かし、１２単位のＫｐｎｌを加
え、３７℃で２時間消化反応を行った。さらに、１．５
Ｈの２Ｍ　　ＮａＣ１と８単位のｌ｛　ｉ　ｎｄｌＩＩ
を加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、ｌ
Ｏ分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約５．　０　ｋｂ
のＤＮＡ断片を精製した。一方、ｐｓＥＩＰＡ１−５Ｄ
ＮＡ約２ｇを３０ＡＩ２のＹ一０１ｌ衡液に溶かし、ｌ
２単位のＫｐｎ　Ｉを加え、３７℃で２時間消化反応を
行った。さらに、Ｌ．０−の２Ｍ　　ＮａＣ１と１０単
位のＮｃｏｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った
。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約４
．　９　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。また、下記４種
の合或ＤＮＡ（４７塩基、４９塩基、４９塩基および４
７塩基；これらの合或ＤＮＡはｔ−ＰＡ−ｃＤＮＡの５
′非翻訳領域の一部を構成する）をアブライド・バイオ
システムズ社３８０＾・ＤＮＡ合戊機を用いて合成し、
それぞれ別々に上で述べた方法と同様の方法を用いて５
′−リン酸化した。

このようにして得られたｐｓＥＩＰＡ１−５由来の約５
．　Ｏ　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１■）、ｐｓＥＩＰ
Ａ１−５由来の約４．　９　ｋｂのＤＮＡ断片（約ｏ．
ｉＡｌｇ＞および５′−リン酸化された４種の合成ＤＮ
Ａ　（それぞれｌ　ｐｍｏｌｅずつ）を２０−のＴｌガ
ーゼ緩衝液に溶かし、５０単位のＴ４Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪ
ガーゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ｋｍ耐性株を得た。この形
質転換株からブラスミドＤＮＡｐｓＥＩＰＡ！−９を単
離し、制限酵素消化による構造解析およびＭ１３ファー
ジを用いたディデ才キシ・シークエンンス法により、ｐ
ｓＢＩＰ＾１−９が目的の構造を有することを確認した
（第３１図参照）。

（５）組換えプラスミドｐＵＣ１９Ｈの造或（＾ｐ耐性
遺伝子のポータブル化） ノルランダーらが造或したプラスミドＤＮＡ、ｐ　Ｕ　
Ｃ　１９　［Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ，　Ｊ，　　ら：ジー
ン（Ｇｅｎｅ）　２６，１０１（１９８３）　；　ｐ　
Ｕ　Ｃ　１９ブラスミドＤＮＡは宝酒造より入手できる
）ＤＮＡ約２Ｒを３０犀のＹ−５０緩衝液に溶かし、１
０単位のＨｉｎｄＩ［Ｉと、１単位のＤｒａＩを加え、
３７℃で１時間消化反応を行った。この反応により、Ｄ
ＮＡはＨｉｎｄＩ［Ｉで完全に、Ｄｒａｌで部分的に消
化された。６５℃、１０分間の熱処理後ＡＦＴ法を用い
、約１，５５ｋｂのＨ　ｉ　ｎｄＩＩＩ−Ｄｒ　ａ　Ｉ
断片と約１．１ｋｂのＤｒａｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の
２種のＤＮＡ断片を精製した。別に２０ｐｍｏｌｅｓの
ＨｉｎｄＩＩＩリンカー（Ｃ＾八ＧＣＴＴＧ　．ユラボ
レイティブ・リサーチ社製）を上で述べた方法と同様の
方法を用いて５′−リン酸化した。

このようにして得られたｐＵｃ１９由来の約１．５５ｋ
ｂのＤＮＡ断片と約１．１ｋｂのＤＮＡ断片、および２
　ｐｍｏｌｅの５′−リン酸化されたＨ　ｉ　ｎｄＩ［
［リンカーを２０〃のＴ４１Ｊガーゼ緩衝液に溶かし、
５０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃でｌ８時間
結合反応を行った。

得られた組換え体ブラスミドの混合物を用いて、大腸菌
關２９４株を形質転換し、＾ｐ耐性株を得た。この形質
転換株からプラスミドＤＮＡｐＬＩ　Ｃ　１９Ｈを単離
し、制限酵素消化による構造解析を行ったところ、目的
の構造を有することを確認した（第３２図参照）。

（６）紐換え体ブラスミドｐｓｉ！ＩＰ＾１−９＾の造
或：（ｐｓＥＩＰＡ１−９への＾ρ耐性遺伝子の挿入〉
　：上で得られたｐｌＪｃ１９ＨプラスミドＤＮＡ約２
Ａｇを３０ＡＩのＹ−５０１１衡液に溶かし、８単位の
｝｛ｉｎｄｌＩ［を加え、３７℃で２時間消化反応を行
った。フェノール抽出とクロロホルム抽出の後、エタノ
ール沈澱によってＤＮＡ断片を回収した。

このＤＮＡ断片を全量４０〃のポリメラーゼｔ１衡液に
溶かし、６単位のクレノー断片を加え、１５℃で１時間
反応させることにより、Ｈｉｎｄ［Ｉ突出末端を平坦末
端に変えた。反応をフェノール抽出によって止め、クロ
ロホルム抽出を行った後、エタノール沈澱によってＤＮ
Ａ断片を回収した。このＤＮＡ断片を３０〃のＹ−５０
！１衝液に溶かし、８単位のＰｖｕｌｌに加え、３７℃
で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理
後、ＡＦＴ法を用いて約１．　４　ｋｂのＤＮＡ断片を
精製した。一方、上で得られたｔ−ＰＡ発現ブラスミ｝
’ｐｓＥＩＰＡ１−９約２■を３０ｄノＹ−１５０１１
衡液に溶かし、８単位のＸｈｏｌと８単位のＥｃｏＲＶ
を加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１
０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約５．　９　ｋｂ
のＤＮＡ断片を精製した。

また、上でｌｉｌｌＬたｐＡＧＥ２８ブラスミドＯＮ＾
約３■を３０Ａ１！のＹ−１５０ｆｆｌ衝液に溶かし、
１０単位のＸｈｏｌとｌＯ単位のＥｃｏＲＶを加え、３
７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱
処理後、ＡＦＴ法を用いて約０．　８　５　ｋｂのＯＮ
＾断片を精製した。

このようにして得られたｐ　Ｕ　Ｃ　１９Ｈ由来の約１
．　４　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１■）　、ｐｓＢＩ
Ｐ＾１−９由来の約５．９ｋｂのＤＮＡ断片（約０．　
１■）およびｐＡＧＥ２Ｂ由来の約０．８５ｋｂのＤＮ
Ａ断片（約０．０５Ｍ．）を２０〃のＴ４リガーゼ緩衝
液に溶かし、１００単位のＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼを加え
、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、＾ｐとＫｍの両方に耐性に
なった株を得た。この形質転換株からプラスミドＤＮＡ
ｐＳＥＩＰＡ１−９Ａを単離し、制限酵素消化による構
造解析を行ったところ、目的の構造を有することを確認
した（第３３図参照）。

参考例１３． ヒ｝　ｐｒｏ−ＯＫ発現プ５　スミ｝’ｐｓＥＬＩＫ１
−１八の造ｔ２，＝（１）組換えプラスミドｐＵＫＦ２
の造或：参考例３で得られたｐＵＫ１１プラスミドＤＮ
Ａ約３■を３０〃のＹ−１００緩衝液に溶かし、■２単
位のＮｃｏ１と１２単位のＨｉｎｄＩ［Ｉを加え、３７
℃で２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処
理後、ＡＦＴ法を用いて約０．　４５ｋｂのＤＮＡ断片
を精製した。一方、参考例８−（１）で得られたｐＵＫ
Ａ２プラスミドＤＮＡ約２Ｎを３０ｄのＹ一〇緩衝液に
溶かし、１０単位のＫｐｎ　Ｉを加え、３７℃で２時間
消化反応を行った。続いて１．　５　ｄの２Ｍ　　Ｎａ
Ｃｊと１０単位のＮＣＯＩを加え、さらに３７℃で２時
間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、Ａ
ＦＴ法を用いて約Ｌ　２　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した
。また、参考例５で得られたｐＴｅ　ｒｍ２プラスミド
ＤＮＡ約２■を３０ｄのｙ−ｏｓ衝液に溶かし、１０単
位のκｐｎｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った
。続いて１．５−の２Ｍ　　ＮａＣ１と８単位のＨｉｎ
ｄＩ［［を加え、さらに３７℃で２時間消化反応を行っ
た。

６５℃、ｌＯ分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約２．
　８５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐＵＫｌｌ由来の約０．　４５
ｋｂのＤＮＡ断片（約０．０２■）、ｐＵＫＡ２由来の
約１．　２　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．０５■〉、およ
びｐＴｅ　ｒｍ２由来の２．　ａｓｋｈのＤＮＡ断片（
約０．０５■）を全量２０−のＴ４リガーゼ緩衡液に溶
かし、５０単位のＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼを加え、４℃で
１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸！
ＩＭＭ２９４株を形質転換し、＾ｐ耐性株を得た。この
形質転換株からプラスミドＤＮＡ，ｐＵＫＦ２を単離し
、制限酵素消化による構造解析を行ったところ、ｐＵＫ
Ｆ２は目的の構造を有することを確認した（第３４図参
照）。

（２）組換えプラスミドｐＵＫＦｐ　ｒｏの造ｒａｓ上
で得られたｐＵＫＦ２プラスミドＤＮＡ約２Ｒを３０ｄ
の２５ｍＭ　　Ｎ　ａ　Ｃ　１を含むＹ−０緩衡液に溶
かし、ｌＯ単位のＢｓｓＨ　Ｕ　（　ニューイングラン
ド・バイオラブズ社製）を加え、５０℃で２時間消化反
応を行った。続いて１．０−の２Ｍ　ＮａＣ１とｌＯ単
位の｝｛ｉｎｄＩ［［を加え、さらに３７℃で２時間消
化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ
法を用いて約４．　３　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

一方、下記６種の合成ＤＮＡ（３９塩基、４１塩基、４
１塩基、３９塩基、１７塩基、ｌ７塩基）を上で述べた
方法に従い、合威および５′一末端のリン酸化を行った
。

５’−ＣＡＴＧ　ＡＧ＾ＧＣＣ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　Ｇ−
３’　　（１７塩基〉３’−ＴＣＴ　ＣＧＧ　ＧＡＣ　
ＧＡＣ　Ｃ　ＧＣＧＣ−５’　　（１７塩基）このよう
にして得られたｐＵＫＦ２由来の約４．３ｋｂのＤＮＡ
断片（約０．１■）と５′−リン酸化された６種の合成
ＤＮＡ　（１ピコモルずつ）を全量２０−のＴ４１Ｊガ
ーゼ緩衝液に溶かし、３００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ
を加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、＾ｐ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡ，ｐＵＫＦｐ　ｒｏを単
離し、制限酵素消化による構造解析およびＭ１３ディデ
オキシ・シークエンス法による塩基配列決定を行ったと
ころ、１０κＦｐｒｏは目的の構造を有することを確Ｓ
忍したく第３５図参照）。

（３）組換え体ブラスミドＩ］ＳＢ［Ｉκ１−１＾の造
戊：参考例１２で得られたＰＳＥ！ｌＰＡ１．−９＾ブ
ラスミドＤＮＡ約２■を３０〃のｙ−ｏａ衝液に溶かし
、１０単位のＫｐｎ　Ｉを加え、３７℃で２時間消化反
応を行った。続いて１．　５−の２Ｍ’　ＮａＣ１と１
０単位のＨｉｎｄｎＩを加え、さらに３７℃で２時間消
化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ
法を用いて約６．３ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。一方
、上で得られたｐＵＫＦｐｒｏブラスミドＤＮＡ約３■
を３０−のＹ−０緩衝液に溶かし、１５単位のＫｐｎ　
Ｉを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。続いて１
．５−の２Ｍ　ＮａＣｌとｌＯ単位のＨｉｎｄＩＩＩを
加え、さらに３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃
、１０分間の熱処理後、ＡＰＴ法を用いて約１．　５　
５　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐｓＢＩＰ＾１−９Ａ由来の約
６，３ｋｂのＤＮＡ断片（約０．　１　Ｍ）とｐｕκＦ
ｐｒｏ由来の１．　５　５　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．
０５■）を全量２０−のＴ４１Ｊガーゼ緩衝液に溶かし
、１００単位の７４ＤＮＡＩＪガーゼを加え、４℃で１
８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、＾ｐ耐性株を得た。この形
質転換株からブラスミドＤＮＡｐｓＥＵＫ１−ＩＡを単
離し、制限酵素消化による構造解析を行ったところ、ρ
ＳＥ［Ｉκ１−ＩＡは目的の構造を有することをｍ認し
た（第３６図参照〉。

参考例１４， ｔ−ＦＡ発現ブラスミドｐＳＰＡＳ　ｌ−９Ａの造戊； （１）組換え体ブラスミドｐＳ［！１ｄｈｆｒｌＡの造
成：参考例１２−（２）で得られたｐＡＧＥ　１　０　
６ブラスミドＤＮＡ約２■を３０−のＹ−５０緩衝液に
溶かし、１２単位のΔｓｐ７１８　（ベーリンガー・マ
ンハイム社製）を加え、３７℃で２時間消化反応を行っ
た。フェノール抽出とクロロホルム抽出の後、エタノー
ル沈殿によってＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片
を全量４０〃のポリメラーゼ緩衝液に溶かし、６単位の
クレノー断片を加え、１５℃で１時間反応させることに
より、Ａｓｐ７１８突出末端を平坦末端に変えた。続い
てフェノール抽出とクロロホルム抽出の後、エタノール
沈殿によって回収したＤＮＡ断片を全量３０〃のＹ−１
５０緩衝液に溶かし、ｌＯ単位のＭ１ｕｌを加え、３７
℃で２時間消化反応を行った。６５℃、ＩＯ分間の熱処
理後、　ＡＦＴ法を用いて約３．３κｂのＤＮＡ断片を
精製した。

これとは別に、ｄｈｆｒ遺伝子を選ぶｐｓＶ２ｄｈｆｒ
プラスミドＤＮＡ　Ｃスブラマニ（Ｓｕｂｒａ−ｍａｎ
ｉ）　ラ：モレキコラー・セルラー・バイ才ロジ−（Ｍ
ｏｊ！．Ｃｅｆ　ｉｔ．　Ｂｉａｌ．　）　１　　，８
５４　（１９８１）〕約３縄を３０〃のＹ−１００緩衝
液に溶かし、１２単位のＢｇｊ！ＩＴを加え、３７℃で
２時間消化反応を行った。フェノール抽出とクロロホル
ム抽出の後、エタノール沈殿によってＤＮＡ断片を回収
した。このＤＮＡ断片を全量４０Ｈのポリメラーゼ緩衝
液に溶かし、６単位のクレノー断片を加え、ｌ５℃で１
時間反応させることにより、ＢｇＩＵ突出末端を平坦末
端に変えた。

続いて、フェノール抽出とクロロホルム抽出の後、エタ
ノール沈殿によって回収したＤＮＡ断片を全１３　０ｔ
ｍのＹ−１００緩衝液に溶かし、ｌ２単位のＨｉｎｄＩ
ＩＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃
、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約０．　７　
５　ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。また、参考例１２で
得られたｐＳＥＩＰＡＩ−９ＡプラスミドＤＮＡ約３ｕ
ｇを３０一〇Ｙ−１００１１衡液に溶かし、１２単位の
ＨｉｎｄｌＩ［を加え、３７℃で２時間消化反応を行っ
た。さらに、ｌ．５〃のＩＭ　　ＮａＣ１とｌ２単位の
ＭＪｕｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。６
５℃、ｌＯ分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約２．　
９　ＫｂのＤＮＡ断片を精魁した。

このようにして得られたｐＡＧＥ　１　０　６由来のＤ
ＮＡ断片《約０．１ｇ）とｐＳＶ２ｄｈ　ｆ　ｒ由来の
ＤＮＡ断片（約０．０３■）とｐＳＥＩＰＡ１−９Ａ由
来のＤＮＡ断片（約０．１Ａｇ＞を２０〃のＴ４ＤＮＡ
リガーゼ緩衡液に溶かし、１００単位のＴ４ＤＮＡ＋Ｊ
ガーゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を゜用いて、大腸
菌ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この
形質転換株からブラスミドＤＮＡｐＳＥ１ｄｈｆｒｌＡ
を単離し、制限酵素消化による構造解析を行ったところ
、目的の構造を有することをｖＩ１誌した（第３７図参
照）。

（２）組換え体ブラスミドｐｓＰＡｓ１−９Ａの造Ｔｆ
ｔ： 上で得られたｐＳＥ１ｄｈｆｒｌＡブラスミドＤＮＡ約
３■を３０〃のＹ−１００緩衝液に溶かし、１２単位の
）（ｈｏｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。

フェノール抽出とクロロホルム抽出の後、エタノール沈
殿によってＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を全
量４０ｍのポリメラーゼ緩衝液に溶かし、６単位のクレ
ノー断片を加え、１５℃で１時間反応させることにより
、Ｘｈｏｌ突出末端を平坦末端に変えた。続いて、フェ
ノール抽出とクロロホルム抽出の後、エタノール沈殿に
よって回収したＤＮＡ断片を全量３０−のＹ−１５０緩
衝液に溶かし、１２単位のＭｊ！ｕｌを加え、３７℃で
２時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱処理後
、ＡＦＴ法を用いて約４．４κｂのＤＮＡ断片を精製し
た。

これとは別に、参考例１２で得られたｐＳＥＩＰＡＩ−
９ＡプラスミドＤＮＡ約３ｕｇを３０−のＹ−５０緩衝
液に溶かし、ｌ２単位のＣｌａ■を加え、３７℃で２時
間消化反応を行った。

フェノール抽出とクロロホルム抽出の後、エタノール沈
殿によってＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を全
量４０〃のポリメラーゼ緩衝液に溶かし、６単位のクレ
ノー断片を加え、１５℃で１時間反応させることにより
、Ｃｆａｌ突出末端を平坦末端に変えた。続いて、フェ
ノール抽出とクロロホルム抽出の後、エタノール沈殿に
よって回収したＤＮＡ断片を全量３０−のＹ−１５０緩
衝液に溶かし、１２単位のＭｌｕｌを加え、３７℃で２
時間消化反応を行った。

６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約６．
　７　５　ＫｂのＤＮＡ断片を精製した。

このようにして得られたｐｓＥ１ｄｈ　ｆ　ｒ　ＩＡ由
来のＤＮＡ断片（約０．１■）とｐｓＥＩＰＡｔ−９Ａ
由来のＤＮＡ断片（約０．１■〉を２０〃のＴ４１Ｊガ
ーゼ緩衝液に溶かし、１００単位のＴ４ＤＮＡＩＪガー
ゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡｐＳＰＡＳ　１−９八を
単離し、制限酵素消化による構造解析を行ったところ、
目的の構造を有することをｌｉｌｌＭした（第３７図参
照）。

参考例１５３ ｐｒｏ−ＵＫ誘導体ＵＫ−Ｔをコードする組換え体ブラ
スミドｐＵＫＴ１の造或： 参考例３の（３）で得られたｐＵＫ１１ブラスミドＤＮ
Ａ約２■を３０−のｙ−ｔｏｏ緩衝液に溶かし、１６単
位のＥｃｏＯ１０９とｌＯ単位のＨｉｎｄｌＩ［を加え
、３７℃で２時間消化反応を行った。６５℃、ｌＯ分間
の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約０．　？　５　ｋｂの
ＤＮＡ断片を精製した。一方、参考例１０で得られたｐ
ｈＰＡ２ブラスミドＤＮＡ約２塊を３０〃のｙ−ｉｏｏ
ｉ衡液に溶かし、１０単位のＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲ
Ｉを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。

６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約３．
　４　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。下記２種の合成Ｄ
ＮＡ（４３塩基と４３塩基〉をすでに述べた方法に従い
、合或および５′末端のリン酸化を行った。

５’　一ＧＣＣＣＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧＧ
ＣＧＧＡＧ　−　３’３’−　ＧＧＣＣＣＴＣＴＴ［：
Ｔ＾＾Ｔ＾＾ＣＣＧＣＣＴＣＴＴ＾＾−５′このように
して得られたｐＵＫ１１由来の約０．　７　５　ｋｂの
ＤＮＡ断片（約０．１■）、ｐｈＰＡ２由来の約３。４
ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１■〉、および５′リン酸化
された２種の合戊ＤＮＡ　（１ピコモルずつ）を全量２
０〃のＴ４’Ｊガーゼ緩衝液に溶かし、３００単位のＴ
４１Ｊガーゼを加え、４℃で１８時間結合反応を行った
。得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸
菌ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この
形質転換株からプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消
化による構造解析およびＭ１３ディデオキシ・シークエ
ンス法による塩基配列決定を行ったところ、ｐＵＫＴ１
は目的の構造を有することを確認した（第３８図参照）
。

参考例１６， ＵＫ−Ｔ発現ブラスミドＤＮＡｐＳＥＵＫＴの造戊： 参考例１４で得られたｐｓＰＡｓｌ−９ＡプラスミドＤ
ＮＡ約２■を３０ｗ！のｙ−ｏａｔ液に溶かし、１０単
位のＫｐｎ　Ｉを加え、３７℃で２時間消化反応を行っ
た。続いて１．５−の２Ｍ　　ＮａＣ１と１０単位のＸ
ｈｏｌを加え、さらに３７℃で１時間消化反応を行った
。６５℃、１０分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約８
．　６　ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。また、ｐＳＥＵ
ＫＩ−ＩＡブラスミドＤＮＡ約３■を３０〃のＹ−１０
０１１衝液に溶かし、１２単位のＢｇＪＩＩと１２単位
のＸｈｏＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。

６５℃、ｌＯ分間の熱処理後、ＡＦＴ法を用いて約０．
　７５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。一方、上で得られ
たｐＵＫＴ１プラスミドＤＮＡ約３Ｎを３０ｄのＹ’−
０緩衝液に溶かし、１５単位のＫｐｎ　Ｉを加え、３７
℃で２時間消化反応を行った。続いて１，５〃の２Ｍ　
　ＮａＣ１と１２単位のＢｇｊ！ＩＩを加え、さらに３
７℃で１時間消化反応を行った。６５℃、１０分間の熱
処理後、ＡＦＴ法を用いて約１．１５ｋｂのＤＮＡ断片
を精製した。

このようにして得られたｐＳＰＡＳ　１−９Ａ由来の約
８．　６　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．１■）、ｐｓＥｔ
ＪＫ１．−１八由来の約０．　７　５　ｋｂのＤＮＡ断
片（約０．０２■）、およびｐｌＪＫ３　１由来の約１
．　１　５　ｋｂのＤＮＡ断片（約０．０２■〉を全量
２０ｄのＴ４リガーゼｔｌＬ衡液に溶かし、１００単位
の７　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼを加え、４℃で１８
時間結合反応を行った。

得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて、大腸菌
ＭＭ２９４株を形質転換し、Ａｐ耐性株を得た。この形
質転換株からプラスミドＤＮＡ、ｐｓＥＵＫＴを単離し
、制限酵素消化による構造解析を行ったところ、ｐｓＥ
ＵＫＴは目的の構造を有することを確認した（第３９図
参照）。

発明の効果 本発明によれば血栓溶解剤として利用可能なポリペプチ
ドが組換えＤＮＡ技法により工業的に供給される。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトｐｒｏ−（ＪＫの折りたたみ構造を示す。 第２図はプラスミドｐＵＫＴ６の造或工程を示す。 第３図はプラスミドｐＵＫＴ４およびｐｕＫｓ３の造成
工程を示す。 第４図はプラスミドｐｓＥＵＫＴ６の造成工程を示す。 第５図はプラスミドｐｓＥＵＫＴ４の造戊工程を示す。 第６図はブラスミドｐｓＥＵＫｓ３の造成工程を示す。 第７図一（１）と（２）は各種ｐｒｏ−ＵＫ誘導体と天
然型ｐｒｏ−ＵＫとのトロンビン抵抗性の比較である。 ●印は天然型ｐｒ〇一ＵＫを、Ｏ印はρｒｏ−ＵＫ誘導
体ＵＫ一Ｔ６を、Δ印はｐｒｏ−ＵＫ銹導体ＵＫ−Ｔ４
を、▲印はｐｒｏ−ＵＫ誘導体ＵＫ−Ｓ３を、口印はｐ
ｒｏ−ＵＫｌｌ！導体ＵＫＴを示す。（ｌ），（２）各
々のトロンビン濃度は５．０Ｉｔｌ／一および１　０　
０　ＩＩ／−である。 第７図−（３）は、５．　０　１Ｕ／ｒｒｌのトロンビ
ン処理をしたときの天然型ｐｒｏ−ＵＫおよび各種ｐｒ
ｏ−ＵＫｉ導体の１本鎖ポリペプチドの経時変化をＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動で比較したものである
。 第８図（１）と（２）はオカヤマ・バーグ法によるｃＤ
ＮＡ合成と談ＤＮＡを含む組換え体ブラスミドＤＮＡの
造戊工程を示す。 第９図はプラスミドＤＮＡｐＣＣＫ１の造戒工程を示す
。 第１０図はプラスミドｐＣＣＫ２の造成工程を示す。 第１１図はヒトｐｒｏ−ＵＫｃＤＮＡを運ぶプラスミド
ｐＵＫ１１の造戊工程を示す。 第１２図はブラスミドｐＴｒｓ２０の造成工程を示す。 第１３図はプラスミドｐＴｒＳ３３の造戊工程を示す。 第１４図はプラスミドｐＴｅ　ｒｍ２の造成工程を示す
。 第１５図はプラスミドｐＴｓＦ１０の造成工程を示す。 第１６図はプラスミドｐＴＡ４の造成工程を示す。 第１７図はブラスミドｐＴｋＳＤ２　１　’？の造成工
程を示す。 ｊｌｇ１８図はプラスミドｐＴｋＳＬｌ１の造戒工程を
示す。 第１９図はプラスミドｐＴｋ　Ｓ　Ｓ　４の造或工程を
示す。 第２０図はプラスミドｐＴｋＳＪ１の造成工程を示す。 第２１図はプラスミドｐＴｋｓＲ１８の造或工程を示す
。 第２２図はプラスミドｐＵＫＡ２の造成工程を示す。 第２３図はプラスミドｐＵＫＢ１０ｌの造戊工程を示す
。 第２４図はプラスミドｐ’ｒｃａの造或工程を示す。 第２５図はプラスミドｐｈＰＡ２の造或工程を示す。 第２６図は１本＊ｐｔＪＫｍｐＳ１の造或工程を示す。 第２７図はプラスミドｐＵＫｓ１の造戒工程を示す。 第２８図はプラスミドｐＡＧＥ１　０　５Ｍの造戊工程
を示す。 第２９図はプラスミドｐＡＧＥ１　０６の造成工程を示
す。 第３０図はプラスミドｐｓＥＩＰＡ１−５の造成工程を
示す。 第３１図はプラスミドｐｓＥＩＰＡ１−９の造或工程を
示す。 第３２図はブラスミドｐＵＣ１９Ｈの造成工程を示す。 第３３図はプラスミドｐｓＥＩＰＡ１−９Ａの造或工程
を示す。 第３４図はプラスミドｐＵＫＦ２の造成工程を示す。 第３５図はプラスミドｐＵＫＦｐｒｏの造或工程を示す
。 第３６図はブラスミドｐｓＥＵＫ１−ＩＡの造成工程を
示す。 第３７図はプラスミドｐｓＰＡｓ１−９Ａの造威工程を
示す。 第３８図はプラスミドｐＵＫＴＩの造或工程を示す。 第３９図はプラスミドｐＳＥＵＫＴの造戊工程を示す。 上記図中のヒ｝ｔ−ＰＡｃＤＮＡ領域内の略号で、Ｆは
フィンガー・ドメインを、Ｇは戊艮因子ドメインを、Ｋ
１はクリングル１を、Ｋ２はクリングル２を、Ｋ２′は
クリングル２の一部がクリングル１で置換されたクリン
グルを、およびＰはプロテアーゼ・ドメインを表わす。 また、図中のヒ｝ｐｒｏ−ＵＫｃＤＮＡ領域《点で打っ
た領域）中の略号で、Ｇは或長因子ドメインを、Ｋはク
リングルを、 およびＰはプロテアーゼ・ ドメインを 表わす。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）天然ヒトプロウロキナーゼペプチドのＮ末端（セ
   リン）から１５５番目のアミノ酸（プロリン）が他のア
   ミノ酸に置換され、Ｎ末端に所望によりメチオニンが付
   加した以外は天然ヒトプロウロキナーゼと同じペプチド
   配列を有する新規プラスミノーゲン活性化因子。
2. （２）該ペプチド配列のうち、Ｎ末端（セリン）から１
   ５３番目のアミノ酸（ロイシン）が他のアミノ酸に置換
   されたものである請求項１記載のプラスミノーゲン活性
   化因子。
3. （３）１５５番目のアミノ酸に置換すべきアミノ酸が、
   アスパラギン、アスパラギン酸、アラニン、アルギニン
   、イソロイシン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸
   、スレオニン、セリン、システイン、チロシン、トリプ
   トファン、バリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メ
   チオニン、リジンまたはロイシンである請求項１または
   ２記載のプラスミノーゲン活性化因子。
4. （４）１５５番目のアミノ酸に置換すべきアミノ酸がス
   レオニンである請求項１または２記載のプラスミノーゲ
   ン活性化因子。
5. （５）１５３番目のアミノ酸に置換すべきアミノ酸が、
   ロイシン、アスパラギンまたはセリンである請求項２記
   載のプラスミノーゲン活性化因子。
6. （６）１５３番目のアミノ酸に置換すべきアミノ酸がア
   スパラギンで１５５番目のアミノ酸に置換すべきアミノ
   酸がスレオニンである請求項２記載のプラスミノーゲン
   活性化因子。
7. （７）１５３番目のアミノ酸に置換すべきアミノ酸がセ
   リンで１５５番目のアミノ酸に置換すべきアミノ酸がス
   レオニンである請求項２記載のプラスミノーゲン活性化
   因子。
8. （８）第１表、第２表または第３表で示したペプチド配
   列を有する請求項２記載のプラスミノーゲン活性化因子
   。
9. （９）請求項１〜８から選ばれる請求項に記載のプラス
   ミノーゲン活性化因子のペプチドをコードするデオキシ
   リボ核酸（ＤＮＡ）。
10. （１０）請求項９記載のＤＮＡをベクターＤＮＡに組み
    込んでなる組換え体ＤＮＡ。
11. （１１）請求項１０記載の組換え体ＤＮＡを含有する微
    生物細胞または動物細胞。
12. （１２）請求項１１に記載の微生物細胞または動物細胞
    を培地に培養し、培養物中にプラスミノーゲン活性化因
    子を蓄積させ、該培養物からプラスミノーゲン活性化因
    子を採取することからなるプラスミノーゲン活性化因子
    の製造法。