WO2020144754A1 - サイズ分布計測装置、サイズ分布計測方法、サンプル容器 - Google Patents

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賢太郎 大澤
峯邑　浩行
西原　宏幸
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    • G01N2015/1493—Particle size

Definitions

  • the present invention relates to a technique for measuring the size distribution of particles contained in a liquid sample.
  • biopharmaceuticals are macromolecules, they are likely to aggregate, and aggregation may cause toxicity.
  • US Food and Drug Administration is trying to tighten regulations on the concentration control of aggregates. Therefore, there is a need for a technique for quantitatively measuring the size distribution of a desired density for aggregates in the submicron region of 0.1 to 1 ⁇ m.
  • Patent Document 1 describes a technique for detecting particles using optical measurement.
  • a single particle detection technique by a scanning molecule counting method that individually detects single particles using optical measurement using a confocal microscope or a multiphoton microscope, light emission in a plurality of specific wavelength bands is performed.
  • the technique for detecting a single particle in a sample solution according to the present invention is based on the position of a photodetection region of a microscope in a sample solution containing plural kinds of single particles that do not emit in different wavelength bands.
  • the light in the specific wavelength band from the light detection area is detected to generate the time-series light intensity data, and the single particle that does not emit light in the specific wavelength band in the time-series light intensity data
  • the decrease in light intensity that occurs when the light enters the detection region is individually detected as a signal indicating the presence of each single particle.
  • Patent Document 2 Provides a technology capable of reducing a measurement error when measuring a test object using light.
  • the correspondence relation describing the correspondence relation between the intensity of the reflected light and the size of the test subject when the test subject is irradiated with light. Data is acquired, and the size of the test object is acquired using the correspondence data and the intensity of the reflected light.
  • the optical measurement method according to the present invention by subtracting a component due to the inclination of the container of the test object from the detection signal representing the intensity of the reflected light when the light is irradiated to the test object, Correct the tilt of the container. ] Technology is described (see summary).
  • Patent Document 1 the position of the light detection region is moved faster than the Brownian motion of the particles to follow the Brownian motion of the particles (0016 of the same document).
  • the measurement light is not scanned in the depth direction (direction along the optical axis), it is considered difficult to measure the size of particles even if the presence of particles is detected.
  • the particle size is calculated by referring to the correspondence data using the reflected light intensity.
  • the reflected light from the stopped particles is used, and it is considered not to calculate the size of the particles that undergo Brownian motion in the depth direction.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to provide an optical measurement technique capable of quantitatively measuring the size distribution of particles that undergo Brownian motion in a sample.
  • the size distribution measuring device measures the reflected light intensity while scanning the focal position along the optical axis direction of the measurement light, and calculates the particle size distribution according to the largest reflected light intensity.
  • the size distribution measuring device of the present invention it is possible to quantitatively measure the size distribution of particles that undergo Brownian motion in three dimensions.
  • 1 is a configuration diagram of a size distribution measuring device 100 according to the first embodiment. It is a conceptual diagram explaining the outline
  • 10 is a flowchart illustrating details of the procedure described in FIG. 9.
  • 7 is a flowchart illustrating another operation example of the size distribution measuring device 100. It is a figure which shows the experimental result which the size distribution measuring apparatus 100 calculated the size distribution about the sample 110 containing the particle of the same size.
  • FIG. 6 is a configuration diagram of a size distribution measuring apparatus 100 according to the second embodiment.
  • FIG. FIG. 9 is a diagram showing a modified example of the size distribution measuring apparatus 100 according to the second embodiment.
  • FIG. 9 is a configuration diagram of a size distribution measuring device 100 according to a third embodiment. It is a figure explaining the procedure which switches a measuring method according to a particle diameter. It is a block diagram of the sample container 1900 which concerns on this Embodiment 5.
  • FIG. 11 is a diagram illustrating a procedure for forming a reference particle storage hole 1906. It is a block diagram of the sample container 2100 which concerns on Embodiment 6. It is a figure explaining the structure of the sample container 2200 which concerns on Embodiment 7. It is a side sectional view explaining the procedure which introduces sample 110 in sample container 2200. It is a side sectional view explaining the usage of the sample container 2200 concerning Embodiment 7. It is an example of correspondence data describing the correspondence between the reflected light intensity and the particle size.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating the relationship between the focal position of measurement light and the reflected light intensity (detection signal). Comparing the case where the focus position of the measurement light coincides with the position of the particle (FIG. 1A) and the case where it does not coincide (FIG. 1B), the reflected light intensity is the same even if the irradiation intensity is the same. Is different. The intensity of reflected light decreases as the positions of the two shift. In other words, when the focus position and the particle position match, the reflected light intensity becomes maximum. Further, the larger the particle size, the higher the reflected light intensity tends to be (Fig. 1(c)). By using these correspondence relationships, the particle size can be calculated using the reflected light intensity.
  • the reflected light intensity from particles with different sizes may be the same depending on the correspondence between particle size and focus position (see the dotted line in Fig. 1(c)). Therefore, in order to accurately calculate the particle size, it can be said that it is important to use the reflected light intensity from the focal position of the measurement light.
  • FIG. 2 is a schematic diagram for explaining Brownian motion of particles and scanning speed of measurement light.
  • the scanning speed of the measurement light is slower than the Brownian motion speed of the particle, the measurement light cannot follow the movement of the particle, and thus it is difficult to distinguish the particles (FIG. 2A).
  • the scanning speed of the measurement light is sufficiently fast with respect to the Brownian motion, the movement can be traced for each particle, so that individual particles can be distinguished (FIG. 2B). Specific set values will be described later.
  • the design parameters of the optical system of the size distribution measuring device will be described.
  • the spot size of the measurement light be slightly larger than the upper limit size of the particle to be measured. Therefore, when the wavelength of the measurement light is ⁇ and the numerical aperture of the objective lens is NA, the light spot diameter R particle can be expressed by the following equation 1.
  • ⁇ z can be defined as the distance at which the reflected signal intensity decreases from a maximum value to a certain threshold value (for example, half the maximum value) when the focal position is scanned in the z direction.
  • the image acquisition speed can be defined as the number of image acquisitions per second.
  • this numerical value is referred to as a frame rate. Since the particles in the liquid to be measured are in Brownian motion, it is necessary to acquire an image at a frame rate that can follow Brownian motion in order to obtain a correct particle size distribution.
  • the required frame rate will be described using an equation. Here, for simplicity of explanation, only Brownian motion in the z direction is considered.
  • the average moving amount L of the Brownian particles during the time t is given by the following expression 3.
  • Equation 3 is a particle diffusion constant, and is given by Equation 4 below using Boltzmann's constant k, absolute temperature T, fluid viscosity ⁇ , and particle diameter a.
  • n is a natural number of 1 or more, and is the average number of times a particle stays in the z resolution range.
  • Equation 8 can also be said to be a condition for being able to continuously detect the reflected light from the particles n times or more on average. Substituting equation 7 into equation 8 and rearranging yields equation 9 below.
  • n is expressed by the following formula 11 using a proportional coefficient ⁇ of 1 or less.
  • Formula 12 is a condition that the frame rate must meet in order to accurately measure the particle size distribution, which is predicted based on theoretical considerations.
  • the fact that the right side is proportional to the diffusion constant D means that the faster the movement of particles, the higher the frame rate required to follow the movement.
  • the right side is inversely proportional to the z resolution ⁇ z because the higher the z resolution, the smaller the amount of deviation from the focus position of the particle that is allowable in detecting reflected light, so a higher frame rate is required.
  • the fact that the right side is inversely proportional to the z-pitch ⁇ d indicates that a higher frame rate is required because the measurement speed in the z-direction decreases as the z-pitch becomes finer. Since it is difficult to predict the value of ⁇ only by theoretical consideration, it is desirable to determine it based on simulation or experiment.
  • the required frame rate becomes lower as ⁇ z and ⁇ d are increased.
  • ⁇ z is too large, the probability that a plurality of particles are present within the range of z resolution becomes high, and as a result, it becomes difficult to measure a sample having a high particle concentration.
  • the z-resolution should be determined by considering the particle concentration range of interest.
  • ⁇ d must be smaller than ⁇ z. Even if the range is smaller than ⁇ z, if ⁇ d is made too large, the probability that the particles are substantially focused is reduced, and as a result, the measurement accuracy of the particle size is reduced.
  • ⁇ d should be determined in consideration of particle size measurement accuracy.
  • the inventors further conducted a simulation study to verify the validity of the condition of Expression 12.
  • the simulation it is assumed that there is one Brownian-moving particle in the measurement area, and the reflection signal waveform from the particle obtained when the measurement area is measured at frame rate FR, z resolution ⁇ z, and z pitch ⁇ d is repeated 10,000 times.
  • the detection success rate of particles (the number of times one particle was detected/10,000) was evaluated by calculating and processing the obtained waveform with a predetermined algorithm.
  • the signal strength is standardized by the value when the positions of the particle and the focus match.
  • the frame rate is 0.1 fps to 10 fps, a plurality of maximum peaks are observed even though only one particle is present. This is because when the frame rate is low, the scanning speed in the z direction becomes equal to or lower than the Brownian motion speed of the particle, and the reflected light from the same particle is detected at a plurality of z positions.
  • the maximum peaks are interpreted as signals corresponding to different particles and the data is analyzed, the same particles are counted multiple times and the number of particles is overestimated.
  • the particle is a particle only when a reflection signal intensity equal to or higher than a threshold value is obtained at z positions consecutive a certain number of times (first number of times) or more, and then
  • the analysis method of determining that the measurement of the particle is completed can be effective when the reflected signal intensity equal to or less than the threshold value is obtained at z positions consecutive for a certain number of times (second number) or more.
  • the first number and the second number may be the same or different.
  • the threshold value is 0.1 and the first and second times are 5, the number of detected particles is 1 at 0.1 fps, 0 at 1 fps, 1 at 10 fps, and 1 at 100 fps. .. From this example, it can be seen that an accurate measurement result cannot be obtained if the frame rate is insufficient.
  • the broken line is the result of fitting the simulation result using the following Expression 13.
  • FIGS. 5, 6 and 7 are the results of plotting the minimum frame rate at which the detection success rate is 0.9 or more against ⁇ z and ⁇ d, respectively.
  • the broken line is a line drawn by using the equation 13 with the same value of ⁇ as in FIG. This result shows that the required frame rate is inversely proportional to ⁇ z and ⁇ d.
  • the simulation results of FIGS. 5, 6 and 7 are all substantially in agreement with the equation 12, and the validity of the equation 12 was confirmed from the above examination results.
  • the value of ⁇ in Expression 12 varies depending on the analysis algorithm and the experimental (simulation) conditions, but in most cases, ⁇ >4 is necessary for the detection success rate to exceed 0.9.
  • a large frame rate is preferable to bring the detection rate close to 1 as described above, but if the frame rate is increased more than necessary, noise increases and the particle size measurement accuracy decreases. This is because the frequency band of the signal increases as the frame rate increases. Considering the performance of a typical detector, it is desirable to keep the frame rate below 100 fps. Converting this to the value of ⁇ , the upper limit of ⁇ is about 10,000.
  • FIG. 8 is a configuration diagram of the size distribution measuring apparatus 100 according to the first embodiment of the present invention.
  • the laser light emitted from the light source 101 is converted into parallel light by the collimator lens 102, and the polarization is adjusted to 45 degree linear polarization by the ⁇ /2 plate 103 whose optical axis is set to about 22.5 degrees with respect to the horizontal direction.
  • the polarized beam splitter 104 splits the polarized light into the measurement light and the reference light.
  • the reference light After the polarization state of the reference light is adjusted by the ⁇ /2 plate 105, the reference light is reflected by the reference light mirror 106 and enters the polarization beam splitter 104 again.
  • the measurement light is condensed by the objective lens 108 so that the focal position matches the measurement position of the sample 110.
  • the XY-axis drive mechanism 107 scans the focal position of the measurement light on the XY plane (plane perpendicular to the depth direction of the sample 110).
  • the Z-axis drive mechanism 109 scans the focal position of the measurement light along the Z-axis direction (optical axis direction of the measurement light).
  • the reflected light reflected from the sample 110 enters the polarization beam splitter 104 again.
  • the reflected light and the reference light are combined by the polarization beam splitter 104 to be combined light.
  • the combined light is guided to the interference optical system 112 via the pinhole 111.
  • the combined light is split by the polarization beam splitter 113 into transmitted light and reflected light.
  • the reflected light passes through the ⁇ /4 plate 114 whose optical axis is set to about 45 degrees with respect to the horizontal direction, and then is condensed by the condenser lens 115 and is branched into two by the Wollaston prism 116. , The first interference light and the second interference light having a phase relationship different from each other by 180 degrees are generated.
  • the current differential type photodetector 117 detects the first and second interference lights and outputs a signal 122 proportional to the difference in their intensity.
  • the transmitted light after passing through the ⁇ /2 plate 118 whose optical axis is set to approximately 22.5 degrees with respect to the horizontal direction, is condensed by the condenser lens 119 and is branched into two by the Wollaston prism 120.
  • the current differential type photodetector 121 detects the third and fourth interference lights and outputs a signal 123 proportional to the difference in their intensities.
  • the signal processing unit 124 calculates the size distribution of particles contained in the sample 110 based on the signals 122 and 123. The principle of calculating the size distribution is as described above. Details of the calculation procedure will be described later.
  • the display unit 125 displays the calculation result of the signal processing unit 124.
  • FIG. 9 is a conceptual diagram illustrating an outline of a procedure in which the size distribution measuring apparatus 100 measures the size distribution of particles included in the sample 110. Each step of FIG. 9 will be described below, and then details of each step will be described using a flowchart described later.
  • the signal processing unit 124 acquires a plane image (observation image on the XY plane) of the sample 110 while scanning the focal position of the measurement light along the z-axis direction (step 1 in FIG. 9). For example, XY images are acquired at 100 different focal positions along the z-axis direction. The conditions regarding the scanning interval (z pitch) of the focus positions in the z-axis direction are as described above.
  • the signal processing unit 124 specifies the individual particles included in the XY image by comparing adjacent XY images with each other (step 2 in FIG. 9). For example, a light spot in the search window can be traced by setting a partial area in the XY image as a search window and comparing light spots contained therein in adjacent XY images. For example, as described with reference to FIG. 4, when the reflected light intensity is equal to or higher than the determination threshold in the three adjacent XY images, it can be determined that particles are present at that position. It is desirable that the size of the search window be set so that one particle is included.
  • the XY image number corresponds to the focus position in the z direction.
  • the reflected light intensity becomes maximum when the focus position and the particle position match. Therefore, when the correspondence relationship between the image number and the reflected light intensity is plotted, the signal waveform as shown in the middle part of FIG. 9 is obtained. Can be obtained.
  • the signal processing unit 124 acquires this signal waveform for each identified particle.
  • the signal processing unit 124 identifies the particle size by referring to the correspondence data in which the correspondence between the reflected light intensity and the particle size is defined in advance. Specifically, the size of each particle is acquired by referring to the correspondence data using the maximum reflected light intensity acquired in step 2.
  • the signal processing unit 124 calculates the particle size distribution, and the display unit 125 displays the calculation result. For example, as shown in the lower part of FIG. 9, a particle size number distribution can be output.
  • FIG. 10 is a flowchart explaining the details of the procedure described in FIG.
  • the size distribution measuring apparatus 100 calculates the size distribution of particles contained in the sample 110 according to this flowchart. Each step of FIG. 10 will be described below.
  • Step S1001 The user inputs measurement conditions to the size distribution measuring device 100.
  • the signal processor 124 receives the input.
  • the measurement conditions for example, the size range of particles to be measured, the range of the number of particles contained in the sample 110, the maximum measurement time, and the like can be considered.
  • the signal processing unit 124 scans the focal position in the z-axis direction and acquires the XY image at each focal position (S1002 to S1003).
  • the signal processing unit 124 may appropriately perform image sharpening processing such as gain correction and noise processing when tracking individual particles in the XY image (S1004).
  • the signal processing unit 124 identifies each particle in the XY image.
  • the signal processing unit 124 calculates a plot (corresponding to the plot in the middle part of FIG. 9) showing the correspondence between the focal position in the z-axis direction and the reflected light intensity for each specified particle (S1005). Since this processing requires a certain amount of time, the estimated remaining processing time may be displayed (S1006).
  • the signal processing unit 124 identifies the particle size by referring to the correspondence data using the maximum reflected light intensity (S1007).
  • Steps S1008 to S1009 If the measurement end condition is reached, the process proceeds to step S1009. If not, the process returns to step S1001 and the same process is repeated (S1008).
  • the measurement end condition here is, for example, the range of the number of particles or the maximum measurement time input in step S1001.
  • the signal processing unit 124 calculates the particle size distribution and displays it on the screen via the display unit 125 (S1009).
  • FIG. 11 is a flowchart illustrating another operation example of the size distribution measuring device 100.
  • This flowchart is the same as FIG. 10 except that step S1101 is performed before step S1001.
  • the size distribution measurement apparatus 100 performs a simple measurement for generally understanding the number of particles in the sample 110. For example, a small number of XY images are acquired using predetermined measurement conditions, and the number of particles is calculated using this. For example, when a clearly abnormal measurement result is obtained, it can be estimated that the actual number of particles is far from the specified measurement condition. As a result, the operator can roughly predict appropriate measurement conditions to be set in step S1001.
  • the steps after step S1001 are the same as those in FIG.
  • FIG. 12 is a figure which shows the experimental result which the size distribution measuring apparatus 100 calculated the size distribution about the sample 110 containing the particle of the same size.
  • the experimental results shown in the upper part of FIG. 12 show the results of measuring three types of particles having diameters of 0.2 ⁇ m, 0.5 ⁇ m, and 1.0 ⁇ m at a particle concentration of 1.5 ⁇ 10 7 particles/mL. Only a single particle size was detected at any particle size.
  • the lower part of FIG. 12 shows the result of similarly calculating the size distribution by changing the particle concentration variously. For all particle sizes, the experimental results in agreement with the calculated values were obtained when the particle concentration was within the range of approximately 10 7 to 10 8 particles/mL.
  • FIG. 13 is a diagram showing an experimental result in which the size distribution measuring apparatus 100 calculates the size distribution for the sample 110 containing particles of different sizes.
  • the left diagram of FIG. 13 shows the experimental results for the sample 110 in which two types of particle sizes are mixed.
  • the right diagram of FIG. 13 shows the experimental results for the sample 110 in which three types of particle sizes are mixed.
  • the mixing ratio of each particle size is also shown in FIG. It can be seen that the particle sizes can be accurately distinguished in all the experimental results.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of similarly calculating the size distribution by changing the particle concentration variously for the sample 110 containing particles of different sizes.
  • the left diagram of FIG. 14 shows the experimental results for the sample 110 in which two types of particle sizes are mixed.
  • the right diagram of FIG. 14 shows the experimental results for the sample 110 in which three types of particle sizes are mixed. At each particle concentration, good measurement results are obtained that are in good agreement with the calculated values.
  • the size distribution measuring apparatus 100 acquires an XY image of the sample 110 at each focus position while scanning the focus position of the measurement light along the optical axis direction.
  • the size distribution measuring apparatus 100 further specifies each particle on the XY image individually, and obtains the particle size using the reflected light intensity obtained from the position where the reflected light intensity is the largest among the focal positions in the z-axis direction. This makes it possible to accurately obtain the size distribution of particles that undergo Brownian motion along the z-axis direction.
  • the size distribution measuring apparatus 100 scans the measurement light in the z-axis direction at a speed faster than the Brownian motion velocity of the particles. This makes it possible to accurately count the number of particles by following the Brownian motion of the particles in the z-axis direction.
  • FIG. 15 is a configuration diagram of the size distribution measuring apparatus 100 according to the second embodiment of the present invention.
  • the Z-axis drive mechanism 109 scans the focal position of the measurement light in the z direction.
  • a variable focus lens 126 is provided instead of the objective lens 108 and the Z-axis drive mechanism 109.
  • the variable focus lens 126 can change the focal position in the z-axis direction. Therefore, also in the configuration example shown in FIG. 15, the same operation as that of the first embodiment can be performed.
  • FIG. 16 is a diagram showing a modified example of the size distribution measuring apparatus 100 according to the second embodiment.
  • an XYZ axis drive mechanism 127 is provided instead of the XY axis drive mechanism 107 and the Z axis drive mechanism 109.
  • the XYZ axis drive mechanism 127 can change the focal position in each of the xyz axis directions. Therefore, also in the configuration example shown in FIG. 16, the same operation as that of the first embodiment can be performed.
  • FIG. 17 is a configuration diagram of the size distribution measuring apparatus 100 according to the third embodiment of the present invention.
  • the size distribution measuring device 100 according to the third embodiment is configured as a confocal microscope.
  • the light emitted from the laser light source 1701 passes through the pinhole 1702, is converted into parallel light by the collimator lens 1703, and reaches the optical path separation element 1704 and the scanning mechanism 1705.
  • the scanning mechanism 1705 scans the focus position of the measurement light with respect to the sample 110.
  • the measurement light is applied to the sample 110 via the projection lens 1706, the imaging lens 1707, and the objective lens 1708.
  • the reflected light reflected from the sample 110 propagates through the optical path in the opposite direction and reaches the pinhole 1709 via the optical path separation element 1704.
  • the optical system is designed so that when the focal position of the measurement light in the z-axis direction is in focus with respect to the measurement position of the sample 110, the reflected light is also focused on the measurement surface of the measuring instrument 1710.
  • the size distribution measuring apparatus 100 according to the third embodiment can also perform the same operation as in the first and second embodiments by changing the focus position of the measurement light in each of the xyz axis directions.
  • Slits may be used instead of the pinholes 1702 and 1709.
  • An LED Light Emitting Diode
  • FIG. 18 is a diagram illustrating a procedure of switching the measurement method according to the particle diameter.
  • the particle size distribution can be measured by the method using the reflected light intensity described in the first to third embodiments.
  • the method using reflected light intensity is not desirable. This is because even if the measurement light is scanned, the reflected light intensity does not change significantly as in the middle part of FIG. Therefore, when the particle size is sufficiently large, it is possible to measure the particle size using the observation image of the sample 110. This is because if the particle size is sufficiently large, the particles can be identified on the observed image.
  • the ratio of particle size to spot size can be used as a standard for switching the measurement method.
  • a threshold value for example, 2 or less
  • the measurement result is adopted. If it is equal to or more than the threshold value, the particle size is measured again using the observed image.
  • the particle size/spot diameter is equal to or larger than the threshold value
  • the measurement result is adopted, and if the particle size/spot diameter is equal to or smaller than the threshold value, the particle size is measured again using the reflected light intensity. Any measuring method may be used at the boundary between the two methods.
  • the signal processing unit 124 can acquire an observation image of the sample 110 based on the same principle as that of a scanning optical microscope, for example. This is because the size distribution measuring device 100 uses an optical system that scans the measurement light.
  • the threshold for switching from the measurement based on the reflected light intensity to the measurement based on the observation image is the same as the threshold for switching the measurement based on the observation image to the measurement based on the reflected light intensity, but these thresholds may be different.
  • Embodiment 5 the method of calculating the particle size distribution by following the Brownian motion of the particles has been described.
  • the Brownian motion of particles can be suppressed to some extent depending on the structure of the sample container that houses the sample 110. From the viewpoint of measurement accuracy, it is desirable that air bubbles do not enter the sample 110. Depending on the structure of the sample container, the inclusion of bubbles can be suppressed to some extent. Therefore, in Embodiments 5 to 7 of the present invention, structural examples of the sample container suitable for use in Embodiments 1 to 4 will be described.
  • FIG. 19 is a configuration diagram of a sample container 1900 according to the fifth embodiment.
  • 19A is a top view
  • FIG. 19B is a BB sectional view
  • FIG. 19C is an AA sectional view
  • FIG. 19D is a top view of a modified example.
  • the sample container 1900 is a container that holds the sample 110.
  • the sample container 1900 includes a base material 1901, a bubble storage portion 1902, a storage hole 1904, a horizontal reference marker 1905, and a reference particle storage hole 1906.
  • the accommodation hole 1904 is a hole for accommodating the sample 110, and is formed so as to penetrate the base material 1901.
  • the depth of the accommodation hole 1904 is, for example, about 300 ⁇ m to 1.5 mm.
  • the bubble containing portion 1902 is a void portion protruding from the side surface of the containing hole 1904, and communicates with the containing hole 1904. Even if bubbles are generated when the sample 110 is introduced into the containing hole 1904, the bubbles can be released to the bubble containing portion 1902 (gas discharge port). This makes it possible to prevent bubbles from interfering with the measurement when measuring the sample 110 in the accommodation hole 1904.
  • the inner wall of the accommodation hole 1904 be rounded.
  • one bubble containing portion 1902 is arranged on the side wall of the containing hole 1904, but two bubble containing portions 1902 may be arranged.
  • the bubble accommodating portions 1902 may be arranged at positions facing each other with the center of the hole in between. If there are too many bubble containing portions 1902, it may be difficult for the bubbles to move, so one or two bubble containing portions 1902 are desirable for each containing hole 1904.
  • the width of the bubble accommodation portion 1902 is 0.5 mm and the length is 1. It was confirmed that the bubbles move smoothly from the accommodation hole 1904 to the bubble accommodation portion 1902 by setting the distance to about 5 mm.
  • FIG. 19D shows an example in which a storage hole 1904 to which one bubble storage portion 1902 is connected and a storage hole 1904 to which two bubble storage portions 1902 are connected are shown.
  • the horizontal reference marker 1905 can be used as a reference when the sample container 1900 is installed horizontally.
  • water containing bubbles may be contained in the horizontal reference marker 1905, and the sample container 1900 may be installed so that the center of the bubble is located at the center of the horizontal reference marker 1905.
  • the reference particle accommodating hole 1906 accommodates the reference particles approximately in the center in the depth direction.
  • the position of the reference particle can be used as a reference for the focus position of the measurement light in the z-axis direction. The procedure for sealing the reference particles will be described later.
  • the upper surface of the base material 1901 is sealed by a sealing substrate 1908, and the lower surface is sealed by a transparent substrate 1909. That is, the upper surface and the bottom surface of the accommodation hole 1904 are also sealed by these substrates.
  • the measurement light is applied to the sample 110 in the accommodation hole 1904 via the transparent substrate 1909. Due to the influence of the interface reflection from the substrates, the portion 1910 near the surface of each substrate in the space inside the accommodation hole 1904 is excluded from the measurement target. Therefore, the area 1911 is actually measured.
  • FIG. 20 is a diagram illustrating a procedure for forming the reference particle storage hole 1906.
  • a sealing material for example, an ultraviolet curable resin
  • the sealing material is injected into the empty hole (1).
  • the measurement reference height for example, the center in the depth direction of the hole
  • the sealing material is cured by ultraviolet irradiation or heating according to the property of the sealing material (2).
  • Standard particles for example, poly beads having a diameter of 1 ⁇ m
  • the reference particles are covered with the encapsulant (6) and similarly cured (7).
  • the reference particle accommodation hole 1906 in which the reference particles are arranged at the measurement reference height is completed (8).
  • the sample container 1900 according to the fifth embodiment includes a bubble container 1902 connected to the container hole 1904. Accordingly, even if bubbles are generated when the sample 110 is introduced into the storage hole 1904, the bubbles can be released to the bubble storage portion 1902. Accordingly, when the measurement is performed on the accommodation hole 1904, it is possible to prevent bubbles from hindering the measurement, and thus the measurement accuracy is improved.
  • FIG. 21 is a configuration diagram of a sample container 2100 according to the sixth embodiment of the present invention.
  • the upper stage is a top view and the lower stage is a sectional view taken along line AA.
  • a plurality of wells 2102 are arranged on the plate 2101, and an interval (pitch) between the wells 2102 is determined by, for example, a product standard.
  • the well 2102 is an accommodation hole for accommodating the sample 110.
  • the well 2102 is formed in a tapered shape from the top surface to the bottom surface.
  • An outlet 2103 is formed near the well 2102.
  • the bottom of the well 2102 and the bottom of the outlet 2103 are connected by a flow path 2104.
  • the upper surface of the well 2102 and the upper surface of the outlet 2103 are formed on the same plane as the upper surface of the plate 2101. After introducing the sample 110 into the well 2102, air bubbles can be released via the flow path 2104 and the outlet 2103.
  • the bottom surface of the plate 2101 is sealed by the transparent substrate 2106, so that the bottom of the well 2102 is also sealed.
  • the measurement light is applied to the sample 110 in the well 2102 via the transparent substrate 2106.
  • the top surface of the well 2102 is covered with a seal 2105 (eg, sealing tape).
  • a seal 2105 eg, sealing tape
  • the introduction port of the well 2102 is formed in a tapered shape, so that the sample 110 can be smoothly introduced. Accordingly, it is possible to suppress the generation of bubbles when introducing the sample 110. Further, even if bubbles are generated in the well 2102, the bubbles can be released via the flow path 2104 and the outlet 2103. With these structures, the particle size distribution can be calculated accurately even when the well 2102 having a regulated pitch is used.
  • FIG. 22A is a diagram illustrating the configuration of the sample container 2200 according to the seventh embodiment of the present invention.
  • the upper section of FIG. 22A is a side sectional view, and the lower section of FIG. 22A is a CC sectional view.
  • the sample container 2200 has a structure in which a member having a flow channel 2204 is sandwiched between transparent substrates 2209.
  • the depth of the flow path 2204 is, for example, about 300 ⁇ m to 1.5 mm, similar to the accommodation hole 1904 of the fifth embodiment.
  • FIG. 22B is a side sectional view for explaining the procedure of introducing the sample 110 into the sample container 2200.
  • the procedure proceeds from left to right in Figure 22B.
  • the sample 110 is housed in an appropriate member (eg, beaker or petri dish), and one end of the flow channel 2104 is brought into contact with the liquid surface.
  • the sample 110 is introduced into the channel 2104 by capillarity.
  • the sample container 2200 is pulled up from the liquid surface. Even if bubbles are introduced into the flow channel 2104, the bubbles can be escaped from the opposite end (gas discharge port) of the flow channel 2104.
  • FIG. 23 is a side sectional view illustrating a method of using the sample container 2200 according to the seventh embodiment.
  • the sample container 2200 includes a frame member 2301.
  • the frame member 2301 may be configured as a part of the sample container 2200, or may be configured as a member different from the sample container 2200.
  • the cassette member that holds the sample container 2200 can be configured as the frame member 2301.
  • the frame member 2301 is a member to which the sample container 2200 is attached. After introducing the sample 110 into the sample container 2200, the sample container 2200 is attached to the frame member 2301.
  • the frame member 2301 has a wall portion 2302 that covers one end of the flow path 2204.
  • the wall 2302 may cover either one end or both ends of the flow channel 2204 depending on how to handle the sample container 2200.
  • FIG. 23(4) is an example of covering both ends.
  • the wall portion 2302 can prevent the sample 110 contained in the sample container 1900 from being dried.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiment, but includes various modifications.
  • the above-described embodiments have been described in detail in order to explain the present invention in an easy-to-understand manner, and are not necessarily limited to those including all the configurations described.
  • a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.
  • FIG. 24 is an example of correspondence data describing the correspondence between reflected light intensity and particle size. This correspondence may differ depending on the photorefractive index of the sample solution. Therefore, as shown in FIG. 24, the correspondence relationship can be described for each refractive index of the sample solution.
  • the user specifies the refractive index of the sample solution to the size distribution measuring device 100, and the signal processing unit 124 acquires the particle size from the correspondence relationship corresponding to the refractive index.
  • the refractive index of the sample solution generally differs depending on the sample type, but if the samples of the same type have different refractive indices, the correspondence relationship may be described for each refractive index.
  • the XY axis drive mechanism 107 in the first embodiment for example, an acousto-optic deflection element (AOD), a polygon mirror, a co-vibration galvanometer mirror (MEMS mirror), or the like can be used.
  • AOD acousto-optic deflection element
  • MEMS mirror co-vibration galvanometer mirror
  • the same configuration can be used for the XY axis drive in the second to third embodiments.
  • the Z-axis drive mechanism 109 in the first embodiment for example, a mechanism that drives a stage on which the sample 110 is placed can be used.
  • variable focus lens 126 in the second embodiment for example, an ultrasonic variable focus lens, a liquid crystal variable focus mirror, a deformable mirror, or the like can be used.
  • the same configuration can be used when the XYZ axis drive mechanism 127 in the third embodiment scans the focal point in the z axis direction.
  • the signal processing unit 124 can be configured by using hardware such as a circuit device that implements the function, or is configured by executing software that implements the function by an arithmetic unit (Central Processing Unit: CPU, etc.). You can also do it.
  • hardware such as a circuit device that implements the function, or is configured by executing software that implements the function by an arithmetic unit (Central Processing Unit: CPU, etc.). You can also do it.
  • CPU Central Processing Unit
  • Size distribution measuring device 110 Sample 112: Interference optical system 124: Signal processing unit 1900: Sample container 2100: Sample container 2200: Sample container 2300: Sample container 2301: Frame member 2302: Wall part

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Abstract

本発明は、サンプル内でブラウン運動する粒子のサイズ分布を定量的に計測することができる光計測技術を提供することを目的とする。本発明に係るサイズ分布計測装置は、計測光の光軸方向に沿って焦点位置を走査しながら反射光強度を計測し、そのなかで最も大きい反射光強度にしたがって粒子のサイズ分布を算出する（図９参照）。

Description

サイズ分布計測装置、サイズ分布計測方法、サンプル容器
　本発明は、液体サンプルに含まれる粒子のサイズ分布を計測する技術に関する。
　近年、医薬品の開発対象は低分子薬からバイオ医薬品へシフトしつつある。バイオ医薬品は高分子であるがゆえに凝集しやすく、凝集すると毒性を生じる場合がある。例えばアメリカ食品医薬品局等は、凝集体の濃度管理規制を強めようとしている。そこで０．１～１ｕｍのサブミクロン領域における凝集体について、所望密度のサイズ分布を定量的に計測する技術が必要とされている。
　下記特許文献１は、光計測を用いて粒子を検出する技術について記載している。同文献は、『共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光計測を用いて単一粒子を個別に検出する走査分子計数法による単一粒子検出技術に於いて、複数種類の特定の波長帯域にて発光しない単一粒子が混在する試料溶液中にて単一粒子を種類毎に検出できるようにすること。』を課題として、『本発明による試料溶液中の単一粒子を検出する技術は、互いに異なる波長帯域で発光しない複数種類の単一粒子を含む試料溶液内に於ける顕微鏡の光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの特定の波長帯域の光を検出して時系列の光強度データを生成し、時系列光強度データに於いて特定の波長帯域にて発光しない単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下をその単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する。』という技術を記載している（要約参照）。
　下記特許文献２は、『光を用いて被検物を計測する際の計測誤差を低減することができる技術を提供する。』ことを課題として、『本発明に係る光計測方法は、被検物に対して光を照射したときの反射光の強度と前記被検物のサイズとの間の対応関係を記述した対応関係データを取得し、前記対応関係データと前記反射光の強度とを用いて前記被検物のサイズを取得する。また本発明に係る光計測方法は、被検物に対して光を照射したときの反射光の強度を表す検出信号から、被検物の容器の傾きに起因する成分を減算することにより、前記容器の傾きを補正する。』という技術を記載している（要約参照）。
特開２０１５－０８３９２２号公報 特開２０１７－１０２９３２号公報
　凝集体のサイズ分布を得るためには、粒子のサイズを計測する必要がある。光計測により粒子のサイズを計測するためには、粒子の平面位置を特定するのみならず、粒子の深さ方向に沿って光信号を得る必要があると考えられる。粒子は様々な深さ位置に存在しているからである。
　上記特許文献１においては、光検出領域の位置を粒子のブラウン運動よりも速く移動させることにより、粒子のブラウン運動に追従している（同文献の００１６）。しかし同文献においては、計測光を深さ方向（光軸に沿った方向）において走査していないので、粒子の存在を検出したとしてもそのサイズを計測することは困難であると考えられる。
　上記特許文献２においては、反射光強度を用いて対応関係データを参照することにより粒子サイズを算出している。しかし同文献においては、停止している粒子からの反射光を用いることが前提になっており、深さ方向においてブラウン運動する粒子のサイズを算出することは想定されていないと考えられる。
　本発明は、上記のような課題に鑑みてなされたものであり、サンプル内でブラウン運動する粒子のサイズ分布を定量的に計測することができる光計測技術を提供することを目的とする。
　本発明に係るサイズ分布計測装置は、計測光の光軸方向に沿って焦点位置を走査しながら反射光強度を計測し、そのなかで最も大きい反射光強度にしたがって粒子のサイズ分布を算出する。
　本発明に係るサイズ分布計測装置によれば、３次元的にブラウン運動する粒子のサイズ分布を定量的に計測することができる。
計測光の焦点位置と反射光強度（検出信号）との間の関係について説明する模式図である。 粒子のブラウン運動と計測光の走査速度について説明する模式図である。 シミュレーションにより得られた粒子からの反射信号波形の１例である。 Δｄ＝０．１μｍ、Δｚ＝１２．８７μｍ、ａ＝０．０５μｍ、０．１μｍ、０．２μｍとしたときのフレームレートと検出成功率の関係のシミュレーション結果である。 Δｄ＝０．１μｍ、Δｚ＝１２．８７μｍの条件において、検出成功率が０．９以上となる最小のフレームレートをａに対してプロットした結果である。 検出成功率が０．９以上となる最小のフレームレートをΔｚに対してプロットした結果である。 検出成功率が０．９以上となる最小のフレームレートをΔｄに対してプロットした結果である。 実施形態１に係るサイズ分布計測装置１００の構成図である。 サイズ分布計測装置１００がサンプル１１０内に含まれる粒子のサイズ分布を計測する手順の概要を説明する概念図である。 図９で説明した手順の詳細を説明するフローチャートである。 サイズ分布計測装置１００の別動作例を説明するフローチャートである。 同じサイズの粒子を含むサンプル１１０についてサイズ分布計測装置１００がサイズ分布を算出した実験結果を示す図である。 異なるサイズの粒子を含むサンプル１１０についてサイズ分布計測装置１００がサイズ分布を算出した実験結果を示す図である。 異なるサイズの粒子を含むサンプル１１０について粒子濃度を様々に変えて同様にサイズ分布を算出した結果を示す図である。 実施形態２に係るサイズ分布計測装置１００の構成図である。 実施形態２に係るサイズ分布計測装置１００の変形例を示す図である。 実施形態３に係るサイズ分布計測装置１００の構成図である。 粒子径に応じて計測方法を切り替える手順を説明する図である。 本実施形態５に係るサンプル容器１９００の構成図である。 基準粒子収容穴１９０６を形成する手順を説明する図である。 実施形態６に係るサンプル容器２１００の構成図である。 実施形態７に係るサンプル容器２２００の構成を説明する図である。 サンプル容器２２００内にサンプル１１０を導入する手順を説明する側断面図である。 実施形態７に係るサンプル容器２２００の使用方法を説明する側断面図である。 反射光強度と粒子サイズとの間の対応関係を記述した対応関係データの例である。
＜粒子のサイズを計測する基本原理について＞
　以下では本発明の理解を容易にするため、まず粒子のサイズを計測する基本原理について説明する。その後の本発明の実施形態に係るサイズ分布計測装置の具体的な構成例について説明する。
　図１は、計測光の焦点位置と反射光強度（検出信号）との間の関係について説明する模式図である。計測光の焦点位置が粒子の位置と一致している場合（図１（ａ））と一致していない場合（図１（ｂ））を比較すると、照射強度が同一であっても反射光強度は異なる。両者の位置がずれるほど反射光強度は小さい。換言すると、焦点位置と粒子位置が合致するとき、反射光強度が最大となる。また、粒子サイズが大きいほど反射光強度も大きい傾向がある（図１（ｃ））。これらの対応関係を用いることにより、反射光強度を用いて粒子サイズを算出することができる。
　ただし粒子サイズと焦点位置の対応関係によっては、異なるサイズを有する粒子からの反射光強度が同一となる場合がある（図１（ｃ）の点線部分を参照）。したがって粒子サイズを正確に算出するためには、計測光の焦点位置からの反射光強度を用いることが重要であるといえる。
　図２は、粒子のブラウン運動と計測光の走査速度について説明する模式図である。粒子のブラウン運動速度に対して計測光の走査速度が遅いと、計測光は粒子の動きに追従することができないので、粒子を区別することが困難である（図２（ａ））。これに対して計測光の走査速度がブラウン運動に対して十分速いと、粒子毎に動きを追跡することができるので、個々の粒子を区別することができる（図２（ｂ））。具体的な設定値については後述する。
　サイズ分布計測装置の光学系の設計パラメータについて説明する。反射光強度に基づいて粒径を計測するためには、計測光のスポットサイズは計測する粒子の上限サイズよりもわずかに大きくなるようにすることが望ましい。したがって、計測光の波長をλ、対物レンズの開口数をＮＡとすると、光スポット直径Ｒｐａｒｔｉｃｌｅは次の式１で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　粒子にほぼ焦点が結ばれた状態で反射光を検出するためには、ｚピッチ（Δｄ）はｚ方向の分解能Δｚよりも小さくする必要がある。すなわち下記式２が満たされる必要がある。Δｚは、焦点位置をｚ方向に走査したときに、反射信号強度が最大値からある閾値（例えば最大値の半分）まで減少する距離として定義することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　画像の取得速度は、画像取得の毎秒回数として定義することができる。この数値を以下ではフレームレートと呼ぶ。測定対象となる液中の粒子はブラウン運動しているので、正しい粒径分布を得るためにはブラウン運動に追従できるだけのフレームレートで画像を取得する必要がある。以下では要求されるフレームレートに関して式を用いて説明する。ここでは説明の簡略化のため、ｚ方向のブラウン運動についてのみ考慮する。ブラウン運動する粒子の時間ｔの間の平均移動量Ｌは下記式３で与えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　式３におけるＤは粒子の拡散定数であり、ボルツマン定数ｋ、絶対温度Ｔ、流体の粘性μ、粒子直径ａを用いて下記式４で与えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　必要なフレームレートについて検討する上では、測定ｚ位置が一定の時間間隔ごとにΔｄだけ動いているのではなく、粒子のｚ位置がブラウン運動に基づく成分とは独立にΔｄだけ移動しており、測定ｚ位置は原点に固定されていると解釈する方が見通しが良い。以下ではそのように解釈して説明する。この解釈の元では、時刻０において原点に配置された粒子のｍ回目の測定時（時刻ｔｍ）までの平均移動量Ｌｍは下記式５で表される。Δｔはフレームレートの逆数（Δｔ＝１／ＦＲ）、ｔｍ＝ｍΔｔである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　ｚ分解能をΔｚとすると、粒子がｚ分解能の範囲内に滞在する平均時間Ｔａｖｅは近似的に書き式６を満たすと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
　式６をＴａｖｅについて解くと下記式７が得られる。式の簡略化のためにα＝Δz／Δｄとおいた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
　粒子にほぼ焦点が結ばれた状態で粒子からの反射光を検出するためには、粒子がｚ分解能の範囲内に滞在している間に複数回画像が取得されなければならない。そのような条件は下記式８で表すことができる。ｎは１以上の自然数であり、粒子がｚ分解能能範囲内に滞在する平均回数である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
　式８は、粒子からの反射光を平均ｎ回以上連続で検出可能であるための条件とも言うことができる。式７を式８に代入して整理すると下記式９が得られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
　式９をＦＲ＝１／Δtの関係を用いて書き換えると下記式１０が得られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
　平均滞在回数ｎは概ねΔｚ／Δｄに比例すると考えられるので、１以下の比例係数βを用いてｎを下記式１１で表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
　式１１を用いて式１０をさらに整理すると下記式１２が得られる。γ＝２β／（１－β）２と置いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
　式１２は理論的な考察に基づいて予測される、粒径分布を正しく計測するためにフレームレートが満たすべき条件である。右辺が拡散定数Ｄに比例しているのは、粒子の動きが速くなるほどその動きに追従するために高いフレームレートが要求されることを意味している。右辺がｚ分解能Δｚに反比例しているのは、ｚ分解能が高くなるほど反射光を検出する上で許容可能な粒子の焦点位置からのずれ量が小さくなるので、より高いフレームレートが必要となることを表している。右辺がｚピッチΔｄに反比例しているのは、ｚピッチを細かくするほどｚ方向への測定速度が低下するので、より高いフレームレートが必要となることを表している。γの値に関しては、理論的な考察のみで予測することは困難であるので、シミュレーションあるいは実験に基づいて決定することが望ましい。
　式１２によると、ΔｚとΔｄを大きくするほど要求されるフレームレートは低くなる。一方で、Δｚを大きくし過ぎるとｚ分解能の範囲内に複数の粒子が存在する確率が高くなり、結果として高い粒子濃度のサンプルの測定が困難になる。ｚ分解能は対象とする粒子濃度範囲を考慮して決定すべきである。また、すでに述べたようにΔｄはΔｚよりも小さくしなければならないという制約がある。Δｚよりも小さい範囲であっても、Δｄを大きくし過ぎると粒子にほぼ焦点が結ばれる確率が低下し、結果として粒径の計測精度が低下する。Δｄは粒径計測精度を考慮して決定すべきである。
　式１２の条件の妥当性を検証するため、発明者らはさらにシミュレーションによる検討を実施した。シミュレーションでは測定領域内にブラウン運動する粒子が１つ存在すると仮定し、測定領域をフレームレートＦＲ、ｚ分解能Δｚ、ｚピッチΔｄで計測した際に得られる粒子からの反射信号波形を１万回繰り返し計算し、得られた波形を所定のアルゴリズムで処理することにより、粒子の検出成功率（粒子が１個検出された回数÷１万）を評価した。シミュレーションはＴ＝３００［Ｋ］、μ＝０．００１［Ｐａ＊ｓ］、測定領域のｚ方向サイズ１ｍｍという条件の元で実施した。
　図３は、シミュレーションにより得られた粒子からの反射信号波形の１例（Δｄ＝０．５μｍ、Δｚ＝約４．７μｍ）である。信号強度は粒子と焦点の位置が一致した際の値で規格化されている。フレームレートが０．１ｆｐｓ～１０ｆｐｓでは、粒子が１つしか存在しないにも関わらず複数の極大ピークが見られる。これは、フレームレートが低いとｚ方向の走査速度が粒子のブラウン運動速度と同等かそれ以下となり、同一粒子からの反射光が複数のｚ位置で検出されるからである。このような波形が得られた場合に極大ピーク１つ１つが異なる粒子に対応する信号であると解釈してデータを解析すると、同一粒子を複数回カウントして粒子数を過大評価してしまう。
　同一粒子を複数回カウントすることを避ける方法としては、例えばある一定回数（第１回数）以上連続したｚ位置で閾値以上の反射信号強度が得られた場合にのみ粒子であると判定し、その後にある一定回数（第２回数）以上連続したｚ位置で閾値以下の反射信号強度が得られた場合に当該粒子の計測を終えたと判定する解析方法が有効となりえる。ここで、第１回数と第２回数は一致していても異なっていてもかまわない。例えば閾値を０．１、第１回数と第２回数を５とすると、検出粒子数は０．１ｆｐｓのとき１個、１ｆｐｓのとき０個、１０ｆｐｓのとき１個、１００ｆｐｓのとき１個となる。この例からフレームレートが不十分であると正しい計測結果が得られないことが分かる。
　図４は、Δｄ＝０．１μｍ、Δｚ＝１２．８７μｍ、ａ＝０．０５μｍ、０．１μｍ、０．２μｍとしたときのフレームレートと検出成功率の関係のシミュレーション結果である。フレームレートが大きくなるほど検出率が１に近づくことが分かる。また、粒径ａによって検出率がほぼ１となるフレームレートは異なる。これは、式４から分かるように粒径が小さくなるほど拡散定数Ｄが大きくなり、ブラウン運動の速度が増すからである。
　図５は、Δｄ＝０．１μｍ、Δｚ＝１２．８７μｍの条件において、検出成功率が０．９以上となる最小のフレームレートをａに対してプロットした結果である。破線は下記式１３を用いてシミュレーション結果をフィッティングしたものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000013
　フィッティングパラメータγは約４．４６となった。シミュレーション結果は式１３を用いて精度良くフィッティングされており、要求フレームレートがＤにほぼ比例（ａに反比例）していることが分かる。
　図６および図７はそれぞれ検出成功率が０．９以上となる最小のフレームレートをΔｚおよびΔｄに対してプロットした結果である。条件はそれぞれ、ａ＝０．１μｍ、Δｚ＝１２．８７μｍおよびａ＝０．１μｍ、Δｄ＝０．１μｍである。破線は図６と同じγの値で式１３を用いて描いた線である。この結果より、要求フレームレートがΔｚとΔｄに反比例していることが分かる。図５，６，７のシミュレーション結果はすべて式１２とほぼ一致しており、以上の検討結果より式１２の妥当性が確認できた。式１２のγの値は解析アルゴリズムや実験（シミュレーション）条件などによって変化するが、検出成功率が０．９を超えるためには殆どの場合γ＞４は必要となる。
　上述のように検出率を１に近づけるためには大きなフレームレートが好ましいが、一方でフレームレートを必要以上に大きくすると、ノイズが増大して粒径の計測精度が低下する。これは、フレームレート増大に伴い、信号の周波数帯域が増大するためである。典型的な検出器の性能を考慮すると、フレームレートは１００ｆｐｓ以下に抑えることが望ましい。これをγの値に換算すると、γの上限はおよそ１００００となる。
＜実施の形態１＞
　図８は、本発明の実施形態１に係るサイズ分布計測装置１００の構成図である。光源１０１から出射されたレーザ光はコリメートレンズ１０２によって平行光に変換され、光学軸が水平方向に対して約２２．５度に設定されたλ／２板１０３によって偏光を４５度直線偏光に調整された後、偏光ビームスプリッタ１０４によって計測光と参照光とに偏光分離される。
　参照光は、λ／２板１０５によって偏光状態を調整された後、参照光ミラー１０６によって反射されて再び偏光ビームスプリッタ１０４へ入射する。計測光は、対物レンズ１０８によってサンプル１１０の計測位置に対して焦点位置が合致するように集光される。ＸＹ軸駆動機構１０７は、計測光の焦点位置をＸＹ平面（サンプル１１０の深さ方向に対して垂直な平面）上で走査する。Ｚ軸駆動機構１０９は、計測光の焦点位置をＺ軸方向（計測光の光軸方向）に沿って走査する。サンプル１１０から反射した反射した反射光は、再び偏光ビームスプリッタ１０４へ入射する。
　反射光と参照光は、偏光ビームスプリッタ１０４によって合波されて合成光となる。合成光は、ピンホール１１１を介して干渉光学系１１２に導かれる。合成光は、偏光ビームスプリッタ１１３によって透過光と反射光に分岐される。
　反射光は、光学軸が水平方向に対して約４５度に設定されたλ／４板１１４を通過した後、集光レンズ１１５によって集光されるとともにウォラストンプリズム１１６によって２分岐されることにより、互いに位相関係が１８０度異なる第１干渉光と第２干渉光が生成される。電流差動型の光検出器１１７は第１および第２干渉光を検出し、それらの強度の差に比例した信号１２２を出力する。
　透過光は、光学軸が水平方向に対して約２２．５度に設定されたλ／２板１１８を透過した後、集光レンズ１１９によって集光されるとともにウォラストンプリズム１２０によって２分岐されることにより、互いに位相関係が１８０度異なる第３干渉光と第４の渉光が生成される。電流差動型の光検出器１２１は第３および第４干渉光を検出し、それらの強度の差に比例した信号１２３を出力する。
　信号処理部１２４は、信号１２２と１２３に基づき、サンプル１１０に含まれる粒子のサイズ分布を算出する。サイズ分布を算出する原理については上述の通りである。算出手順の詳細については後述する。表示部１２５は、信号処理部１２４による算出結果を表示する。
　図９は、サイズ分布計測装置１００がサンプル１１０内に含まれる粒子のサイズ分布を計測する手順の概要を説明する概念図である。以下図９の各ステップについて説明し、次に各ステップの詳細について後述するフローチャートを用いて説明する。
　信号処理部１２４は、計測光の焦点位置をｚ軸方向に沿って走査しながら、サンプル１１０の平面画像（ＸＹ平面における観察画像）を取得する（図９のｓｔｅｐ１）。例えばｚ軸方向に沿ってそれぞれ異なる１００か所の焦点位置において、ＸＹ画像を取得する。ｚ軸方向における焦点位置の走査間隔（ｚピッチ）に関する条件については上述の通りである。
　信号処理部１２４は、隣接するＸＹ画像を相互に比較することにより、ＸＹ画像内に含まれる個々の粒子を特定する（図９のｓｔｅｐ２）。例えば、ＸＹ画像内の部分領域を探索ウインドウとしてセットし、そのなかに含まれる光点を隣接するＸＹ画像間で相互比較することにより、探索ウインドウ内の光点を追跡することができる。例えば図４で説明したように、隣接する３枚のＸＹ画像において反射光強度が判定閾値以上である場合、その位置に粒子が存在すると判定することができる。探索ウインドウのサイズは、概ね１個の粒子が含まれる程度にセットすることが望ましい。
　ＸＹ画像の番号は、ｚ方向における焦点位置と対応している。図１で説明したように焦点位置と粒子位置が合致したとき反射光強度が最大となるので、画像番号と反射光強度との間の対応関係をプロットすると、図９中段に示すような信号波形を得ることができる。信号処理部１２４は、特定した粒子ごとにこの信号波形を取得する。
　信号処理部１２４は、反射光強度と粒子サイズとの間の対応関係をあらかじめ定義した対応関係データを参照することにより、粒子サイズを特定する。具体的には、ｓｔｅｐ２で取得した最大反射光強度を用いて対応関係データを参照することにより、各粒子のサイズを取得する。信号処理部１２４は粒子サイズの分布を算出し、表示部１２５はその算出結果を表示する。例えば図９下段に示すように、粒子サイズの個数分布を出力することができる。
　図１０は、図９で説明した手順の詳細を説明するフローチャートである。サイズ分布計測装置１００は、本フローチャートにしたがって、サンプル１１０内に含まれる粒子のサイズ分布を算出する。以下図１０の各ステップについて説明する。
（図１０：ステップＳ１００１）
　ユーザは、サイズ分布計測装置１００に対して計測条件を入力する。信号処理部１２４はその入力を受け取る。計測条件としては例えば、計測する粒子のサイズ範囲、サンプル１１０内に含まれる粒子数の範囲、最大計測時間、などが考えられる。
（図１０：ステップＳ１００２～Ｓ１００４）
　信号処理部１２４は、ｚ軸方向における焦点位置を走査しながら、各焦点位置におけるＸＹ画像をそれぞれ取得する（Ｓ１００２～Ｓ１００３）。焦点位置の初期値はｚ＝０とする。信号処理部１２４は、ＸＹ画像内において個々の粒子を追跡する際に、ゲイン補正やノイズ処理などの画像鮮明化処理などを適宜実施してもよい（Ｓ１００４）。
（図１０：ステップＳ１００５～Ｓ１００７）
　信号処理部１２４は、ＸＹ画像内の各粒子を特定する。信号処理部１２４は、ｚ軸方向における焦点位置と反射光強度との間の対応関係を表すプロット（図９中段のプロットに対応する）を、特定した粒子ごとに算出する（Ｓ１００５）。この処理はある程度の時間を要するので、予測される残り処理時間を表示するなどしてもよい（Ｓ１００６）。信号処理部１２４は、最大反射光強度を用いて対応関係データを参照することにより、粒子サイズを特定する（Ｓ１００７）。
（図１０：ステップＳ１００８～Ｓ１００９）
　計測終了条件に到達した場合はステップＳ１００９へ進み、到達していない場合はステップＳ１００１へ戻って同様の処理を繰り返す（Ｓ１００８）。ここでいう計測終了条件は、例えばステップＳ１００１において入力した粒子数の範囲や最大計測時間である。信号処理部１２４は、粒子のサイズ分布を算出し、表示部１２５を介して画面表示する（Ｓ１００９）。
　図１１は、サイズ分布計測装置１００の別動作例を説明するフローチャートである。本フローチャートは、ステップＳ１００１の前にステップＳ１１０１を実施する点を除いて図１０と同様である。ステップＳ１１０１においてサイズ分布計測装置１００は、サンプル１１０内の粒子数を概ね把握するための簡易計測を実施する。例えば既定の計測条件を用いて少数のＸＹ画像を取得し、これを用いて粒子数を算出する。例えば明らかに異常な計測結果が得られた場合、実際の粒子数は規定の計測条件からかけ離れていると見積もることができる。これによりオペレータは、ステップＳ１００１においてセットする計測条件として適切なものを概ね予測することができる。ステップＳ１００１以降は図１０と同様である。
　図１２は、同じサイズの粒子を含むサンプル１１０についてサイズ分布計測装置１００がサイズ分布を算出した実験結果を示す図である。図１２上段に示す実験結果は、直径０．２μｍ、０．５μｍ、１．０μｍの３種類の粒子について、粒子濃度を１．５×１０７個／ｍＬとして計測した結果を示す。いずれの粒子サイズにおいても、単一の粒子サイズのみが検出された。図１２下段は、粒子濃度を様々に変えて同様にサイズ分布を算出した結果を示す。いずれの粒子サイズにおいても、粒子濃度が概ね１０７～１０８個／ｍＬの範囲内で、計算値と合致する実験結果が得られた。
　図１３は、異なるサイズの粒子を含むサンプル１１０についてサイズ分布計測装置１００がサイズ分布を算出した実験結果を示す図である。図１３左図は２種類の粒子サイズを混合したサンプル１１０についての実験結果である。図１３右図は３種類の粒子サイズを混合したサンプル１１０についての実験結果である。各粒子サイズの混合比を図１３内に併記した。いずれの実験結果においても、各粒子サイズを正確に区別できていることが分かる。
　図１４は、異なるサイズの粒子を含むサンプル１１０について粒子濃度を様々に変えて同様にサイズ分布を算出した結果を示す図である。図１４左図は２種類の粒子サイズを混合したサンプル１１０についての実験結果である。図１４右図は３種類の粒子サイズを混合したサンプル１１０についての実験結果である。各粒子濃度において、計算値と概ね合致する良好な計測結果が得られている。
＜実施の形態１：まとめ＞
　本実施形態１に係るサイズ分布計測装置１００は、計測光の焦点位置を光軸方向に沿って走査しながら、各焦点位置におけるサンプル１１０のＸＹ画像を取得する。サイズ分布計測装置１００はさらに、ＸＹ画像上の各粒子を個別に特定し、ｚ軸方向の各焦点位置のうち反射光強度が最も大きい位置から得られる反射光強度を用いて粒子サイズを求める。これにより、ｚ軸方向に沿ってブラウン運動する粒子のサイズ分布を正確に求めることができる。
　本実施形態１に係るサイズ分布計測装置１００は、ｚ軸方向において、粒子のブラウン運動速度よりも速く計測光を走査する。これにより、ｚ軸方向における粒子のブラウン運動に追従して、粒子個数を正確にカウントすることができる。
＜実施の形態２＞
　図１５は、本発明の実施形態２に係るサイズ分布計測装置１００の構成図である。実施形態１においては、Ｚ軸駆動機構１０９が計測光の焦点位置をｚ方向において走査することを説明した。図１５においては対物レンズ１０８とＺ軸駆動機構１０９に代えて、焦点可変レンズ１２６を備える。焦点可変レンズ１２６は、ｚ軸方向における焦点位置を変化させることができる。したがって図１５に示す構成例においても、実施形態１と同様の動作を実施することができる。
　図１６は、本実施形態２に係るサイズ分布計測装置１００の変形例を示す図である。図１６においてはＸＹ軸駆動機構１０７とＺ軸駆動機構１０９に代えて、ＸＹＺ軸駆動機構１２７を備える。ＸＹＺ軸駆動機構１２７は、ｘｙｚ軸方向それぞれにおける焦点位置を変化させることができる。したがって図１６に示す構成例においても、実施形態１と同様の動作を実施することができる。
＜実施の形態３＞
　図１７は、本発明の実施形態３に係るサイズ分布計測装置１００の構成図である。本実施形態３に係るサイズ分布計測装置１００は、共焦点顕微鏡として構成されている。レーザ光源１７０１から出射された光は、ピンホール１７０２を通過した後、コリメートレンズ１７０３によって平行光に変換され、光路分離素子１７０４と走査機構１７０５に到達する。走査機構１７０５は、サンプル１１０に対する計測光の焦点位置を走査する。計測光は、投影レンズ１７０６、結像レンズ１７０７、対物レンズ１７０８を介してサンプル１１０に対して照射される。サンプル１１０から反射した反射光は、光路を反対向きに伝搬し、光路分離素子１７０４を介してピンホール１７０９に到達する。ｚ軸方向における計測光の焦点位置がサンプル１１０の計測位置に対して合焦しているとき、反射光も計測器１７１０の計測面上に焦点が合うように、光学系が設計されている。
　本実施形態３に係るサイズ分布計測装置１００も、計測光のｘｙｚ軸方向それぞれにおける焦点位置を変化させることにより、実施形態１～２と同様の動作を実施することができる。ピンホール１７０２と１７０９に代えてスリットを用いてもよい。またレーザ光源１７０１に代えてＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ　Ｅｍｉｔｔｉｎｇ　Ｄｉｏｄｅ）を用いることもできる。
＜実施の形態４＞
　図１８は、粒子径に応じて計測方法を切り替える手順を説明する図である。計測光のスポットサイズが粒子サイズに対して比較的大きい場合、実施形態１～３で説明した反射光強度を用いる方法により、粒子サイズ分布を計測することができる。これに対して粒子サイズがスポットサイズよりも十分大きい場合、反射光強度を用いる方法は望ましくない。計測光を走査しても反射光強度は図９中段のように大きく変化しないからである。そこで粒子サイズが十分大きい場合は、サンプル１１０の観察画像を用いて粒子サイズを計測することが考えられる。粒子サイズが十分大きければ、観察画像上で粒子を識別することができるからである。
　計測方法を切り替える基準としては、例えば粒子サイズとスポットサイズの比（粒子サイズ／スポット径）を用いることができる。反射光強度を用いて粒子サイズを計測した結果、粒子サイズ／スポット径が閾値以下（例えば２以下）であればその計測結果を採用する。閾値以上であれば改めて観察画像を用いて粒子サイズを計測する。同様に観察画像を用いて粒子サイズを計測した結果、粒子サイズ／スポット径が閾値以上であればその計測結果を採用し、閾値以下であれば改めて反射光強度を用いて粒子サイズを計測する。両方法の境界部分においてはいずれの計測方法を用いてもよい。
　信号処理部１２４は、例えば走査型光学顕微鏡と同様の原理により、サンプル１１０の観察画像を取得することができる。サイズ分布計測装置１００は、計測光を走査する光学系を用いているからである。
　図１８において、反射光強度による計測から観察画像による計測へ切り替える閾値は、観察画像による計測から反射光強度による計測へ切り替える閾値と同じであるが、これらの閾値は異なっていてもよい。
＜実施の形態５＞
　以上の実施形態においては、粒子のブラウン運動に追従して粒子サイズ分布を算出する手法を説明した。他方で計測精度の観点からは、粒子のブラウン運動をできる限り抑制することが望ましい。サンプル１１０を収容するサンプル容器の構造によっては、粒子のブラウン運動をある程度抑制することができる。また計測精度の観点からは、サンプル１１０内に気泡が混入しないようにすることが望ましい。サンプル容器の構造によっては気泡混入もある程度抑制することができる。そこで本発明の実施形態５～７では、実施形態１～４において用いるのに適したサンプル容器の構造例について説明する。
　図１９は、本実施形態５に係るサンプル容器１９００の構成図である。図１９（ａ）は上面図、図１９（ｂ）はＢＢ断面図、図１９（ｃ）はＡＡ断面図、図１９（ｄ）は変形例の上面図である。サンプル容器１９００は、サンプル１１０を収容する容器である。サンプル容器１９００は、基材１９０１、気泡収容部１９０２、収容穴１９０４、水平基準マーカ１９０５、基準粒子収容穴１９０６を備える。
　収容穴１９０４は、サンプル１１０を収容する穴であり、基材１９０１を貫通するように形成されている。収容穴１９０４の深さは例えば３００μｍ～１．５ｍｍ程度である。気泡収容部１９０２は、収容穴１９０４の側面から突出した空隙部分であり、収容穴１９０４と連通している。収容穴１９０４に対してサンプル１１０を導入する際に気泡が生じたとしても、その気泡を気泡収容部１９０２（気体放出口）へ逃がすことができる。これにより気泡が収容穴１９０４内のサンプル１１０を測定する際に測定を阻害しないようにすることができる。
　気泡が収容穴１９０４から気泡収容部１９０２へスムーズに移動するためには、収容穴１９０４の内壁は丸みを帯びていることが望ましい。図１９においては収容穴１９０４の側壁に１つの気泡収容部１９０２を配置しているが、気泡収容部１９０２を２つ配置してもよい。例えば穴の中心を挟んで対向する位置にそれぞれ気泡収容部１９０２を配置してもよい。気泡収容部１９０２が多過ぎると却って気泡が移動し難くなる場合もあるので、気泡収容部１９０２は収容穴１９０４ごとに１つまたは２つが望ましい。
　収容穴１９０４の穴直径が２．５～４ｍｍであり、上面図（図１９）における気泡収容部１９０２の形状を矩形とした場合、気泡収容部１９０２の幅を０．５ｍｍ、長さを１．５ｍｍ程度とすることにより、気泡が収容穴１９０４から気泡収容部１９０２へスムーズに移動することが確認できた。
　図１９（ｄ）に示すように、基材１９０１上に複数の収容穴１９０４を配置する場合、各収容穴１９０４と接続されている気泡収容部１９０２の位置や個数は同じでなくともよい。図１９（ｄ）においては、１つの気泡収容部１９０２が接続されている収容穴１９０４と、２つの気泡収容部１９０２が接続されている収容穴１９０４を備えている例を示した。
　水平基準マーカ１９０５は、サンプル容器１９００を水平に設置するときの基準として用いることができる。例えば気泡を含む水を水平基準マーカ１９０５内に収容し、気泡中心が水平基準マーカ１９０５の中心に位置するようにサンプル容器１９００を設置すればよい。
　基準粒子収容穴１９０６は、深さ方向の概ね中央部分に、基準粒子を収容している。基準粒子の位置は、計測光のｚ軸方向における焦点位置の基準として用いることができる。基準粒子を封止する手順については後述する。
　基材１９０１の上面は封止基板１９０８によって封止され、下面は透過性基板１９０９によって封止されている。すなわち収容穴１９０４の上面と底面もこれら基板によって封止されている。計測光は、透過性基板１９０９を介して収容穴１９０４内のサンプル１１０に対して照射される。基板からの界面反射の影響により、収容穴１９０４内の空間のうち各基板の表面に近い部分１９１０は、計測対象から除かれる。したがって実際に計測されるのは領域１９１１である。
　図２０は、基準粒子収容穴１９０６を形成する手順を説明する図である。空の穴に対して封止材（例えば紫外線硬化樹脂）を注入する（１）。封止材が計測基準高さ（例えば穴の深さ方向の中心）まで達すると、封止材の性質に応じて紫外線照射や加熱により封止材を硬化させる（２）。封止材上に基準粒子（例えば直径１μｍのポリビーズ）を投入し（３）、均等に拡散させる（４）。封止材をさらに注入することにより（５）基準粒子を封止材で覆い（６）、同様に硬化させる（７）。封止材が硬化すると、計測基準高さに基準粒子が配置された基準粒子収容穴１９０６が完成する（８）。
＜実施の形態５：まとめ＞
　本実施形態５に係るサンプル容器１９００は、収容穴１９０４と接続された気泡収容部１９０２を備える。これにより、サンプル１１０を収容穴１９０４へ導入する際に気泡が生じたとしても、その気泡を気泡収容部１９０２へ逃がすことができる。これにより、収容穴１９０４に対して測定を実施する際に、気泡が測定を阻害しないようにすることができるので、測定精度が向上する。
＜実施の形態６＞
　図２１は、本発明の実施形態６に係るサンプル容器２１００の構成図である。上段は上面図、下段はＡＡ断面図である。プレート２１０１上に複数のウェル２１０２が配置されており、ウェル２１０２間の間隔（ピッチ）は例えば製品規格によって定められている。ウェル２１０２は、サンプル１１０を収容する収容穴である。ウェル２１０２は、上面から底面に向かって先細り形状に形成されている。
　ウェル２１０２の近傍には流出口２１０３が形成されている。ウェル２１０２の底部と流出口２１０３の底部は、流路２１０４によって接続されている。ウェル２１０２の上面と流出口２１０３の上面は、プレート２１０１の上面と同じ平面上に形成されている。ウェル２１０２に対してサンプル１１０を導入した後、流路２１０４と流出口２１０３を介して、気泡を逃がすことができる。
　プレート２１０１の底面は透過性基板２１０６によって封止され、これによりウェル２１０２の底部も封止される。計測光は、透過性基板２１０６を介してウェル２１０２内のサンプル１１０に対して照射される。ウェル２１０２がサンプル１１０を収容した後、ウェル２１０２の上面をシール２１０５（例えばシーリングテープ）によって覆う。これによりサンプル１１０がウェル２１０２内に封止される。
＜実施の形態６：まとめ＞
　本実施形態６に係るサンプル容器２１００は、ウェル２１０２の導入口がテーパ形状に形成されているので、サンプル１１０をスムーズに導入することができる。これにより、サンプル１１０を導入するときの気泡発生を抑制することができる。またウェル２１０２内に気泡が発生したとしても、流路２１０４と流出口２１０３を介して気泡を逃がすことができる。これらの構造により、ピッチが規定されているウェル２１０２を用いる場合においても、粒子サイズ分布を精度よく算出することができる。
＜実施の形態７＞
　図２２Ａは、本発明の実施形態７に係るサンプル容器２２００の構成を説明する図である。図２２Ａ上段は側断面図、図２２Ａ下段はＣＣ断面図である。サンプル容器２２００は、流路２２０４が形成された部材を透過性基板２２０９によって挟んだ構造を備えている。流路２２０４の深さは実施形態５の収容穴１９０４と同様に例えば３００μｍ～１．５ｍｍ程度である。
　図２２Ｂは、サンプル容器２２００内にサンプル１１０を導入する手順を説明する側断面図である。手順は図２２Ｂの左から右に向かって進行する。適当な部材（例えばビーカーやシャーレ）にサンプル１１０を収容し、流路２１０４の一端を液面に対して接触させる。流路２１０４の深さが適切である場合、毛細管現象によりサンプル１１０が流路２１０４に対して導入される。サンプル１１０を導入した後、サンプル容器２２００を液面から引き上げる。流路２１０４に対して気泡が導入されたとしても、流路２１０４の反対側の端部（気体放出口）からその気泡を逃がすことができる。
　図２３は、本実施形態７に係るサンプル容器２２００の使用方法を説明する側断面図である。サンプル容器２２００は、枠部材２３０１を備える。枠部材２３０１はサンプル容器２２００の一部として構成してもよいし、サンプル容器２２００とは別の部材として構成してもよい。例えばサンプル容器２２００を保持するカセット部材を枠部材２３０１として構成することができる。
　枠部材２３０１は、サンプル容器２２００を取り付ける部材である。サンプル容器２２００内にサンプル１１０を導入した後、サンプル容器２２００を枠部材２３０１に取り付ける。枠部材２３０１は、流路２２０４の一端を覆う壁部２３０２を有する。壁部２３０２は、サンプル容器２２００の取り扱い方に応じて、流路２２０４のいずれか一端を覆うようにしてもよいし、両端を覆うようにしてもよい。図２３（４）は両端を覆う例である。壁部２３０２により、サンプル容器１９００内に収容したサンプル１１０の乾燥を防止することができる。
＜本発明の変形例について＞
　本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施形態は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
　図２４は、反射光強度と粒子サイズとの間の対応関係を記述した対応関係データの例である。この対応関係は、サンプル溶液の光屈折率によって異なる場合もある。そこで図２４に示すように、サンプル溶液の屈折率ごとに対応関係を記述することもできる。ユーザはサイズ分布計測装置１００に対してサンプル溶液の屈折率を指定し、信号処理部１２４はその屈折率に対応する対応関係から粒子サイズを取得する。サンプル溶液の屈折率はサンプル種類に応じて異なるのが一般的であるが、同種サンプルであっても屈折率が異なる場合は、屈折率ごとに対応関係を記述してもよい。
　実施形態１におけるＸＹ軸駆動機構１０７としては、例えば音響光学偏向素子（ＡＯＤ）、ポリゴンミラー、共振動型ガルバノミラー（ＭＥＭＳミラー）などを用いることができる。実施形態２～３におけるＸＹ軸駆動についても同様の構成を用いることができる。実施形態１におけるＺ軸駆動機構１０９としては、例えばサンプル１１０を載置するステージを駆動する機構を用いることができる。
　実施形態２における焦点可変レンズ１２６としては、例えば超音波焦点可変レンズ、液晶焦点可変ミラー、デフォーマブルミラーなどを用いることができる。実施形態３におけるＸＹＺ軸駆動機構１２７が焦点をｚ軸方向に走査する際にも同様の構成を用いることができる。
　信号処理部１２４は、その機能を実装した回路デバイスなどのハードウェアを用いて構成することもできるし、その機能を実装したソフトウェアを演算装置（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ：ＣＰＵなど）が実行することにより構成することもできる。
１００：サイズ分布計測装置
１１０：サンプル
１１２：干渉光学系
１２４：信号処理部
１９００：サンプル容器
２１００：サンプル容器
２２００：サンプル容器
２３００：サンプル容器
２３０１：枠部材
２３０２：壁部

Claims (15)

  1. 　粒子を含む液体のサンプルにおける前記粒子のサイズ分布を計測するサイズ分布計測装置であって、
    　光を出射する光源、
    　前記光の光軸方向に沿って前記光の焦点位置を走査する走査部、
    　前記サンプルから反射された前記光の強度を検出する検出部、
    　前記強度を用いて前記粒子のサイズを算出する演算部、
    　を備え、
    　前記走査部は、前記サンプルのなかで前記粒子が前記光軸方向に移動する過程において前記粒子の前記光軸方向におけるそれぞれ異なる位置から前記光が反射するように前記光の焦点位置を走査し、
    　前記演算部は、前記光軸方向に沿った前記光の焦点位置ごとの前記光の強度のうち最も大きい最大光強度を用いて、前記粒子のサイズを算出する
    　ことを特徴とするサイズ分布計測装置。
  2. 　前記走査部は、前記光軸方向に沿った前記光の焦点位置ごとに、前記光軸方向に対して直交する平面内において前記光の焦点位置を走査し、
    　前記演算部は、前記平面上の所定範囲内の座標領域において、前記粒子が存在するか否かを前記光の強度にしたがって判定することにより、前記平面上における前記粒子の個数を特定する
    　ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
  3. 　前記演算部は、前記座標領域上において、前記光軸方向に沿って前記光の強度を連続してサンプリングし、
    　前記演算部は、前記連続してサンプリングした強度が前記光軸方向に沿って第１回数以上連続して判定閾値以上である場合は前記座標領域上に前記粒子が存在すると判定し、
    　前記演算部は、前記粒子が存在すると判定した場合は、前記連続してサンプリングした強度が前記第１回数以上連続して前記判定閾値以上に到達してから第２回数以上連続して前記判定閾値未満になるまでの間において最も大きい前記光の強度を用いて、前記粒子のサイズを算出する
    　ことを特徴とする請求項２記載のサイズ分布計測装置。
  4. 　前記演算部はさらに、前記最大光強度を用いて前記粒子のサイズを算出するか、それとも前記粒子を撮像することにより取得した画像を用いて前記粒子のサイズを算出するかを切り替える切替ステップを実施し、
    　前記演算部は、前記切替ステップにおいては、前記最大光強度を用いて算出した前記粒子のサイズを前記光のスポット径で除算した値が第１切替閾値以上である場合は前記画像を用いて改めて前記粒子のサイズを算出し、
    　前記演算部は、前記画像を用いて算出した前記粒子のサイズが第２切替閾値以下である場合は前記最大光強度を用いて改めて前記粒子のサイズを算出する
    　ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
  5. 　前記走査部は、前記光軸方向における前記光の走査間隔をΔｄ、前記光軸方向における前記サイズ分布計測装置の分解能をΔｚ、前記粒子の拡散係数をＤ、前記光軸方向における前記光の焦点位置の毎秒走査個数をフレームレートとして定義したとき、（γ×Ｄ）／（Δｚ×Δｄ）（γは定数）以上の前記フレームレートで前記焦点位置を走査する
    　ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
  6. 　前記演算部は、前記サンプルから反射された前記光の強度と前記粒子のサイズとの間の対応関係を記述した対応関係データを用いて、前記粒子のサイズを算出し、
    　前記対応関係データは、前記サンプルの種類ごとに前記対応関係を記述しており、
    　前記演算部は、前記サンプルの種類と前記サンプルから反射された前記光の強度を用いて前記対応関係データを参照することにより、前記粒子のサイズを算出する
    　ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
  7. 　前記サイズ分布計測装置はさらに、前記光源が出射する光を分岐して測定光と参照光を生成する光分岐部を備え、
    　前記サイズ分布計測装置はさらに、前記測定光が前記サンプルから反射することにより生じた信号光を前記参照光と合波することにより互いに位相関係が異なる３つ以上の干渉光を生成する、干渉光学系を備え、
    　前記検出部は、前記干渉光を検出して電気信号として出力する
    　ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
  8. 　前記演算部は、前記粒子のサイズの個数分布を記述したデータを出力する
    　ことを特徴とする請求項１記載のサイズ分布計測装置。
  9. 　粒子を含む液体のサンプルにおける前記粒子のサイズ分布を計測するサイズ分布計測方法であって、
    　前記サンプルに対して光源から光を照射するステップ、
    　前記光の光軸方向に沿って前記光の焦点位置を走査する走査ステップ、
    　前記サンプルから反射された前記光の強度を検出するステップ、
    　前記強度を用いて前記粒子のサイズを算出する算出ステップ、
    　を有し、
    　前記走査ステップにおいては、前記光軸方向における前記光の走査間隔をΔｄ、前記光軸方向における前記サイズ分布計測方法の分解能をΔｚ、前記粒子の拡散係数をＤ、前記光軸方向における前記光の焦点位置の毎秒走査個数をフレームレートとして定義したとき、（γ×Ｄ）／（Δｚ×Δｄ）（γは定数）以上の前記フレームレートで前記焦点位置を走査する
    　ことを特徴とするサイズ分布計測方法。
  10. 　光を照射することによりサイズを計測する粒子を含む液体のサンプルを収容するサンプル容器であって、
    　前記サンプルを収容する収容穴、
    　前記収容穴が収容している前記サンプルに含まれる気体を前記収容穴から逃がす気体放出部、
    　を備え、
    　前記収容穴の底面は光を透過する透過性基板によって封止されている
    　ことを特徴とするサンプル容器。
  11. 　前記気体放出部は、前記収容穴の内壁から前記サンプル容器の基材に対して突出した空隙部によって構成されており、
    　前記収容穴の内壁は、湾曲形状を有しており、
    　前記空隙部は、前記収容穴の内壁に対して１つまたは２つ形成されている
    　ことを特徴とする請求項１０記載のサンプル容器。
  12. 　前記サンプル容器はさらに、前記粒子を封止材によって封止した第２収容穴を備える
    　ことを特徴とする請求項１１記載のサンプル容器。
  13. 　前記サンプル容器はさらに、前記収容穴と前記気体放出部を接続する気体放出流路を備え、
    　前記収容穴に対して前記サンプルを導入する部位は、先細り形状に形成されており、
    　前記収容穴の上面と前記気体放出部の放出面は、前記サンプル容器の同じ側の表面上に形成されており、
    　前記気体放出流路は、
    　　前記収容穴の底部から、前記収容穴の深さ方向に対して直交する方向に沿って延伸する第１部分、
    　　前記第１部分の終端から、前記収容穴の深さ方向に沿って前記気体放出部の放出面まで延伸する第２部分、
    　を備える
    　ことを特徴とする請求項１０記載のサンプル容器。
  14. 　前記収容穴は、前記サンプル容器に対して前記サンプルを導入する流路の一部として構成されており、
    　前記収容穴の上面は光を透過する透過性基板によって封止されており、
    　前記流路は、前記収容穴の深さ方向に対して直交する方向に延伸しており、
    　前記収容穴の深さ方向におけるサイズは、３００μｍ以上１．５ｍｍ以下である
    　ことを特徴とする請求項１１記載のサンプル容器。
  15. 　前記サンプル容器はさらに、前記流路に対して前記サンプルを導入する導入口を覆うことにより封止する枠部材を備える
    　ことを特徴とする請求項１４記載のサンプル容器。
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