WO2020153723A1 - Fab i 저해제를 포함하는 주사제용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Fab i 저해제를 포함하는 주사제용 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an injectable composition containing a compound that inhibits Fab I or a salt thereof, and a method for manufacturing the same.
  • Bacterial infection is a disease that has plagued centuries for as long as the history of civilization. In order to overcome the threat from these bacteria, civilization has made ceaseless efforts, which has led to the rapid development of medicine and medicine.
  • the development of a modern concept antibiotic began with penicillin, first discovered in 1928 by Alexander Fleming. Since then, the development of antibiotics for treating infectious diseases caused by bacteria has made rapid progress.
  • the resistance of the bacteria itself to antibiotics began to be known, causing restrictions on the use of antibiotics.
  • MRSA Metal-Resistant Staphylococcus Aureus
  • MRSA is a staphylococcus aureus resistant to methicillin, a penicillin-based antibiotic. It is not simply resistant to methicillin, but is a pathogen that can be treated with extremely limited antibiotics because it has strong resistance to most antibiotics. More than 700,000 people die worldwide each year from MRSA infections, and the mortality rate is expected to increase steadily every year, exceeding 10 million in 2050. The reason this strain is attracting attention is not only because it is resistant to existing antibiotics, but also because it is the most frequently occurring causative agent among pathogens that cause infection in hospitals and can be fatal to patients with weak immunity or the elderly.
  • the present invention is a Fab I inhibitor 1-(3-amino-2-methylbenzyl)-4-(2-thiophen-2-yl-ethoxy)-1H-pyridin-2-one And it provides a composition for an injection comprising a salt thereof as an active ingredient.
  • composition for intravenous injection comprising a.
  • the content of 1-(3-amino-2-methylbenzyl)-4-(2-thiophen-2-yl-ethoxy)-1H-pyridin-2-one or a salt thereof is 0.1 to 10 Weight percent
  • the content of the polymer compound is 5 to 40% by weight
  • the content of the solubilizing agent may be 10 to 30% by weight.
  • the polymer compound is dextrin (dextrin), polydextrin (polydextrin), cyclodextrin (cyclodextrin), poloxamer (poloxamer), dextran (dextran), pectin (pectin) and pectin derivatives, alginate, Starch, hydroxypropyl methylcellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxylethyl cellulose, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose ( sodium carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose acetate succinate, hydroxylethylmethyl cellulose, guar gum, locust bean gum, tragacanta ( tragacantha, carrageenan, acacia gum, arabicgum, gellangum, xanthan gum, gelatin, casein, polyvinyl alcohol ), polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl acetaldiethyl aminoacetate,
  • the solubilizing agent is propylene glycol (propylene glycol), polyethylene glycol (polyethylene glycol), dipropylene glycol (dipropyleneglycol), diethylene glycol (diethylene glycol), diethylene glycol Monoethyl ether (diethylene glycol monoethyl ether), glycerol (glycerol), tween 80 (tween 80), may include one or more selected from the group consisting of cremophor (cremophor) and transcutol (transcutol).
  • the composition may be provided as an injection in the form of a liquid, emulsion or lyophilized powder.
  • 4-benzyloxy-1H-pyridone (4-benzyloxy-1H-pyridone) in dimethylformamide, 2-methyl-3-nitro-benzylchloride (2-methyl- 3-nitro-benzylchloride), potassium t-butoxide (Potassium tert-butoxide) is added to mix and react under heating;
  • It provides a method for preparing a composition for an injection containing the compound.
  • the step of adding an acidic material may be further included.
  • the acidic material is hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, tartaric acid, formic acid, citric acid, acetic acid, trichloroacetic acid, trifluoroacetic acid, gluconic acid, benzoic acid, lactic acid, oxalic acid, Fumaric acid, malonic acid, maleic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid and one or more selected from the group consisting of EDTA.
  • the polymer compound and 1-(3-amino-2-methylbenzyl)-4-(2-thiophen-2-yl-ethoxy)-1H-pyridin-2-one or a salt thereof in a solvent To dissolve by adding;
  • the polymer dispersion may be prepared by a method further comprising micronizing the produced solid after vacuum drying.
  • the solvent is a polymer compound and a lipid-based surfactant and 1-(3-amino-2-methylbenzyl)-4-(2-thiophen-2-yl-ethoxy)-1H-pyridine-2 -Dissolving on or a salt thereof;
  • the liposome preparation may be prepared by a method including centrifugation and vacuum drying followed by homogenization.
  • the lipid-based surfactant may include soybean oil.
  • the composition may be prepared in the form of a solid dispersion, a liposome preparation, or a combination thereof.
  • the composition may be used for the treatment of bacterial infections.
  • composition for injection containing the Fab I inhibitor of the present invention or a salt thereof can be effectively applied to infection of bacteria resistant to antibiotics.
  • the present invention can improve the solubility of FabI inhibitors or salts of which the solubility is remarkably low, and improve intravenous storage stability, thereby enabling intravenous administration, and thus can initiate a therapeutic effect more quickly.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a method for producing a cyclodextrin inclusion compound.
  • 5 is a graph showing the antibacterial effect according to the T/MIC value.
  • the term “pharmaceutical composition” may be used interchangeably with “pharmaceutical composition” and “pharmaceutically acceptable composition”, and is a composition capable of relatively non-toxic and harmless effect on the subject to be administered.
  • any side effect resulting from the composition does not decrease the efficacy of the drug, does not cause serious irritation to the subject to which the compound is administered, means any organic or inorganic compound formulation that does not impair the biological activity and properties of the compound Can.
  • the term'administered subject' refers to all animals, including humans, which can be used interchangeably with'administered subjects' and'administered organisms', and which may or may cause infection of bacterial or resistant strains. do.
  • the term'bacterial infection' may be used interchangeably as'bacterial-related disease' and refers to a disease or disorder caused by bacterial infection.
  • the disease or disease may include, for example, urinary tract, respiratory or skin tissue infection, sepsis, and the like, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a composition for an injection comprising a Fab I inhibitor.
  • the present invention is a selective inhibitor for Fab I 1-(3-amino-2-methylbenzyl)-4-(2-thiophen-2-yl-ethoxy)-1H-pyridin-2-one, its Salts or combinations thereof.
  • 1-(3-amino-2-methylbenzyl)-4-(2-thiophen-2-yl-ethoxy)-1H-pyridin-2-one (1-(3-amino-2-methyl-benzyl)
  • the structure of -4-(2-thiophen-2-yl-ethoxy)-1H-pyridin-2-on) is as shown in Chemical Formula 1.
  • the Fab I selective inhibitor such as the structure of Formula 1, is an existing antibiotic, beta-lactam (penicillin, cephalosporin, etc.), glycopeptide (Glycopeptides: vancomycin, etc.), tetracyclines (Tetracyclines), amino Glycosides (Aminoglycosides), Glycylclines (Glycylclines), Macrolides (Macrolides), Chromamphenicol (Chloramphenicol), quinolone (quinolone), sulfonamides (Sulfonamides) and oxazoline (oxazoline) and Is a compound with a completely different mechanism of action, and is a substance that exhibits an antibiotic effect by inhibiting the action of the enzyme Fab I, which is essential for bacterial protein synthesis.
  • Fatty acid plays an essential role in maintaining life phenomena as a main component of cell membranes as well as an energy source for life. Therefore, these fatty acid biosynthesis processes in cells are essential biochemical processes in all living cells, and the genes involved therein are a kind of essential genes essential for humans from bacteria.
  • Fab I is the last step of the four enzymes involved in the bacterial fatty acid biosynthesis process. It is the last step of the enoyl-ACP reductase, and the corresponding acyl ACP through 1,4 reduction reaction of enoyl-ACP (enoyl-ACP). It has been reported to play a role in the conversion to (acyl-ACP) (Payne et al., Drug Discovery Today 6, 2001, 537-544).
  • Fab I is the most important protein in the synthesis of fatty acids and is involved in the reaction that determines the rate in the overall synthesis process. However, in the case of mammals such as humans, unlike bacteria, a large amount of enzyme called fatty acid synthase is used for the synthesis of fatty acids.
  • the compound of Formula 1 may be provided in the form of an amorphous form, a crystalline form, or a mixture thereof.
  • reaction After dissolving the obtained dried product in an organic solvent, reaction is performed by adding iron chloride hexahydrate, activated carbon, and hydrazine monohydrate, followed by cooling and filtration, and then drying and pulverizing the final precipitate obtained to prepare a compound of Formula 1 Can.
  • reaction is performed by adding iron chloride hexahydrate, activated carbon, and hydrazine monohydrate, followed by cooling and filtration, and then drying and pulverizing the final precipitate obtained to prepare a compound of Formula 1 Can.
  • it provides a method for preparing a composition for intravenous injection containing the compound of Formula 1 as Fab I inhibitor.
  • the pharmaceutically acceptable salt of Formula 1 may be contained in the composition for injection.
  • the pharmaceutically acceptable salt may be an acid addition salt formed using an acid.
  • acids include hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, tartaric acid, and formic acid ( formic acid, citric acid, acetic acid, trichloroacetic acid, trifluoroacetic acid, gluconic acid, benzoic acid, lactic acid ), oxalic acid, fumaric acid, malonic acid, maleic acid, methane sulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid (p-toluenesulfonic acid), naphthalenesulfonic acid, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), and the like, but are not limited thereto.
  • the present invention may be formulated in a solid or liquid form capable of intravenous administration.
  • the present invention can be provided in the form of an emulsion or liquid by significantly increasing the water solubility of the FabI inhibitor (Chemical Formula 1 compound) through a combination of a solubilizer, cosurfactant, and lipid. .
  • solubilizer, co-surfactant and lipid are used as non-toxic pharmaceutically acceptable substances, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, dipropylene glycol ( dipropyleneglycol), diethylene glycol, diethylene glycol monoethyl ether, glycerol, tween 80, cremophor, transcutol It may include, but is not limited thereto, and the composition of the present invention may be prepared in the form of a liquid or emulsion capable of intravenous administration through an appropriate combination.
  • the solubilizing agent may contain 10 to 30% by weight based on the total weight of the composition, for example 10% by weight or more, also 15% by weight or more, and also 20% by weight or more, for example 30% by weight or less, and also 25% by weight
  • the composition may be included below, and an intravenous composition may include, for example, an injection.
  • composition of the present invention can be nano-particled to increase the surface area or to improve the solubility by incorporating a porous polymer material.
  • nanoparticles are dissolved and mixed in a compound of Formula 1 in an appropriate solvent, and then rapidly reduced in temperature to produce a solid, pulverized with a grinder, and then obtained by a supercritical extractor. It can contain.
  • the polymer material may be a water-soluble polymer compound, for example, dextrin, polydextrin, cyclodextrin, dextran, dextran, pectin and pectin derivatives , Alginate, starch, hydroxypropyl methylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose (sodium carboxymethyl cellulose), hydroxypropyl methylcellulose acetate succinate, hydroxylethylmethyl cellulose, guar gum, locust bean gum, tragacanta (tragacantha), carrageenan, acacia gum, arabicgum, gellangum, xanthan gum, gelatin, casein, polyvinyl alcohol alcohol), polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl acetaldiethyl aminoacetate, poly(butyl methacrylate, (2-dimethylaminoethyl)me
  • the composition of the present invention can be prepared in a solid form of a lyophilized powder, thereby further improving solubility and storage stability.
  • the composition may be manufactured and manufactured in a form including nanoparticles, hydrophilic polymer compounds, or a combination thereof.
  • composition Formula 1 compound based on the total weight of the composition Formula 1 compound, a salt thereof or a combination thereof, for example, 0.1 to 10% by weight, for example 0.2 to 2% by weight, for example, 0.1% by weight or more, and also 0.2 It may contain more than or equal to 0.5% by weight, more than or equal to 0.5% by weight, for example less than or equal to 10% by weight, less than or equal to 8% by weight, and less than or equal to 5% by weight, and also less than or equal to 2% by weight.
  • the composition in powder form can be dissolved in water for injection prior to application to a subject.
  • Water for injection may include, for example, glucose, xylitol, D-mannitol, fructose, saline, dextran 40, dextran 70, amino acids, Ringer's solution, lactic acid-Linger's solution for injection, etc., but is not limited to the above. Does not.
  • the present invention can be used for the treatment of gram-positive bacteria (gram-positive bacteria) infectious diseases such as MRSA (methicillin resistant staphylococcus aureus) or various infectious diseases thereof.
  • Gram-positive bacteria are, for example, Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) and Staphylococcus epi Demi discharge Staphylococcus (Staphylococcus), such as (Staphylococcus epidermidis); Streptococcus pneumonia , Streptococcus pyrogenes , group C/F/G Streptococci and viridans group Streptococci ) and it may include the same streptococcus (Streptococcus).
  • Purification may be performed as necessary to remove the related substances generated in the synthesis process.
  • For the purification operation after dissolving 2 kg of the raw material synthesized in 30 L of dichloromethane, adding purified water to separate the layers, taking the organic layer and stirring with 0.7 kg of sodium sulfate, additionally adding 0.7 kg of activated carbon and stirring for 1 hour, It can be filtered and concentrated under reduced pressure to remove dichloromethane. Further, 10 L of ethyl acetate was added to dissolve, concentrated, and recrystallized by adding 20 L of hexane, and then dried at 40°C. The purification operation can be repeated as necessary.
  • the first centrifugation was performed to remove the insoluble material that may remain as a second using a 0.22um filtration filter. After diluting it with methanol, the solubility was quantified by HPLC analysis. The results are shown in FIG. 1. As shown in Figure 1, it can be seen that the compound of Formula 1 is affected by solubility depending on the pH of the aqueous solution. Specifically, at pH 1.2, a solubility of about 1 mg/ml is shown, but at pH 3, it is 6 ug/ml and at pH 7, 2.5 ug/ml, which tends to decrease rapidly with increasing pH.
  • solubility in the pH range of 4 to 8 which is an appropriate pH range for intravenous administration, shows a very low value of 2 to 5.0 ug/mL, and thus a study to increase the solubility as a FabI inhibitor is required.
  • an approved excipient and a solvent that can be used for future process studies were selected as shown in Table 1, and a small amount of the compound of Formula 1 was added and dissolved until it was no longer dissolved, and the addition operation was repeated. After stirring at room temperature for filtration, the concentration of the compound of Formula 1 was determined by HPLC analysis dissolved in the filtrate.
  • the organic solvent showed solubility of about 60 mg/mL in methylene chloride, and solubility of more than 20 mg/mL in PEG300, Tween 20 and Labrasol.
  • Excipients showing solubility of 10 mg/mL or more were Tween 80 and Solutol HS 15, and showed solubility of about 8.5 mg/mL in soybean oil in the Lipid family.
  • Tween 20, Tween 80, Solutol HS 15, Soybean oil and PEG 300 can be used as injections. Therefore, in the future, selected excipients were used for the study, and injection formulation studies were conducted through a combination of these.
  • Polymer dispersions were prepared to improve solubility using PEG 20,000 (PEG20K) and poloxamer 407 (P407), which are compatible with Formula 1 compounds.
  • PEG20K PEG 20
  • P407 poloxamer 407
  • each polymer compound was dissolved in methylene chloride (DCM), and dissolved by adding a compound of Formula 1 to it, followed by vacuum drying, and pulverized and then pulverized the resulting solid.
  • DCM methylene chloride
  • Table 3 The composition of the prepared composition is shown in Table 3.
  • the compound of Formula 1 As shown in Table 3, as the content of the polymer compound in the polymer dispersion increases, the compound of Formula 1 generally dissolves well. In particular, when the content ratio of PEG2000 or poloxamer 407 to the compound of Formula 1 is 20:1, the maximum solubility (maximal solubility) was measured to be about 12 mg/mL (12,000 ug/mL) and 15 mg (15,000 ug/ml), respectively. As shown in Table 3, the concentration of the actually prepared injection preparation was prepared at 10 mg/mL lower than the maximum solubility at a content ratio of 20:1 for each material. The concentration of this formulation is 10 mg/mL, which is approximately 4,000 times the water solubility of the compound of Formula 1 compared to the value of 2.5 ug/mL.
  • the molecular weight of Formula 1 is 340.45, and the hydrophile-lipophile balance (HLB) value is determined by multiplying the total molecular weight ratio of hydrophilic functional group molecules by 5 to the total molecular weight.
  • the HLB value of the compound of Formula 1 thus calculated is 5.4.
  • the HLB values of PEG 20,000 and poloxamer 407 are approximately 19 and 20. Therefore, the HLB value of each composition is calculated as the total sum of HLB values multiplied by the weight fraction of each material. Table 3 shows the results. As the content of the compound of Formula 1 increased, the HLB value decreased, and the hydrophobic properties of the polymer dispersion increased, so that dissolution did not easily occur.
  • a microemulsion or liposome is prepared, the drug is enclosed in the particle, and the It was intended to prevent the occurrence of precipitation due to hydrophobic bonding.
  • the compound of Formula 1 was first dissolved in methylene chloride and the solubilizer was gradually added. When the added solubilizer was not sufficiently dissolved, additional methylene chloride was added to make a light yellow liquid. The amount of methylene chloride used for dissolution is about 15 mL. The solution thus prepared was removed by insoluble material through centrifugation, and methylene chloride was removed by vacuum drying. Secondary distilled water was added to the vacuum-dried material and homogenized to prepare liposomes.
  • FIG. 2 shows a photograph of the properties of the liposome preparation of Example 5 and the properties of the preparation diluted 20 times with water for injection (0.9% NaCl solution).
  • the properties of the prepared composition was easily diluted in water for injection (0.9% NaCl solution) with an opaque suspension, and it was confirmed that it can be easily injected (injection) with a 22G needle.
  • Table 4 when the content of the soybean oil (soybean oil) with respect to the total weight of the composition decreases, it was confirmed that the compound of Formula 1 precipitates when left at room temperature for 24 hours.
  • poloxamer and Tween 80 when adding poloxamer and Tween 80 to the formulation, it was found that physical stability was improved when precipitation was not caused when left at room temperature for 24 hours.
  • Example 5 the concentration of the compound of Formula 1 was prepared at 20 mg/mL, and this concentration is an amount corresponding to 8,000 times the water solubility of the compound of Formula 1 at 2.5 ug/mL.
  • Example 2 Since the compound of Formula 1 has a low solubility in water, phosphoric acid was used in Example 2, but the condition of low pH below pH 2 may cause unexpected side effects such as phlebitis when injected into the body. , Designed the same composition as Examples 3 to 5. It was found that microemulsion was easily generated when phosphoric acid was removed. In the case of Example 5, as described above, the compound of Formula 1 is contained in a concentration of 20 mg/mL, and since the precipitate of the undissolved Formula 1 compound is not observed, all of the compounds were determined to be dissolved.
  • the formulation containing acid had a high turbidity upon dilution, but when removing the acid, a suspension formulation with a slightly blue color was produced, and when the acid was not used as a whole, the turbidity was low.
  • Example 5 when the content of tween 80 and poloxamer 407 was increased, it was confirmed that the size of the produced particles was reduced and unencapsulated Formula 1 compound was not observed. Did.
  • the average particle diameter of the particles may be adjusted to 5 ⁇ m or less in order to improve suitability.
  • Example 5 observed changes in long-term and accelerated conditions, and Table 5 shows the conditions and results.
  • the compound of Formula 1 was encapsulated using (2-Hydroxypropyl)- ⁇ -cyclodextrin, HP-beta-cyclodextrin (2-hydroxypropyl)-beta-cyclodextrin.
  • the specific composition is as shown in Table 6, and the manufacturing method is shown in schematic diagram in FIG. 4.
  • the compound of Formula 1 was incubated with HP-beta-cyclodextrin and mixed with a solution in which a solubilizer was dissolved, stirred until a clear solution was obtained, and finally adjusted to pH 3.0, and then injected water (0.9% NaCl solution) and filtered.
  • the concentration of the compound of Formula 1 in the finally prepared formulation was 4 mg/mL, and it was judged that all of them were dissolved because no precipitate was observed. This is a value improved by approximately 1,600 times compared to the water solubility of the compound of Formula 1 at a concentration of 4 mg/mL 2.5 ug/mL.
  • Example 6 observed changes in long-term and accelerated conditions, Table 7 shows the results of long-term storage, and Table 8 shows the results of accelerated storage.
  • Example 6 When a low molecular weight substance in the composition contains a large amount of ethanol, PEG 300, and propylene glycol, etc., there is a risk of side effects such as phlebitis caused later when directly administered due to an increase in osmotic pressure and low pH 3.0.
  • the composition was prepared by excluding the use of a molecular weight solubilizer and bringing the pH close to neutral.
  • Hydroxypropyl betacyclodextrin (HP-beta-cyclodextrin) was dissolved by stirring at room temperature with distilled water for injection, then heated to 60° C. to add the compound of Formula 1, followed by stirring and inclusion.
  • the liquid injection was sterilized through 0.22 um filter paper.
  • the filtered injection solution was filled into a glass vial, cooled at -80°C, and then lyophilized to produce a product.
  • Table 9 shows the specific composition.
  • the highest solubility of the compound of Formula 1 in 16% HP-beta-cyclodextrin is 3 mg/mL, which is an improvement in solubility of about 1200 times compared to 2.5 ug/mL of the water solubility of the compound of Formula 1.
  • the pH is close to neutral, which may reduce the risk of hemolysis and phlebitis caused by osmotic pressure and pH when administered intravenously.
  • Example 9 After diluting Example 9 with physiological saline 50 times and 100 times for intravenous administration (IV infusion), the change in content was observed to evaluate the physical stability according to the storage time at room temperature, that is, precipitation. The results are shown in Tables 11 and 12.
  • Example 9 As shown in Tables 11 to 13, after diluting Example 9 50 times and 100 times at room temperature for 4 hours, and after standing for 1 week, the measured content was maintained in a uniform concentration in the upper, middle, and lower layers. It shows that it does not reprecipitate after dilution and is physically stable.
  • composition according to Example 9 was placed in a glass vial and sealed to perform a stability test up to 24 weeks under accelerated conditions (40 degrees/75% humidity), and the results are shown in Table 14.
  • Example 9 As shown in Table 14, no significant changes in content and related substances were observed until 6 months of acceleration. In view of this, it was found that the lyophilized powder according to Example 9 was very physically and chemically stable.
  • the sensitivity to the drug was evaluated by treating the compound of Formula 1 with a Staphylococcus aureus phenotype isolated from each patient.
  • the most important result from in vitro testing for antibiotic development is the MIC 90 (the minimum inhibitory concentration that can inhibit the growth of an individual of 90% of the total bacterial strain).
  • the results in Table 15 are currently commercially available for about 100 mesacillin susceptible strains and 100 socially problematic MRSA strains at Dr. Apelbaum's laboratory at Hershey Hospital, which is recognized for its authority in the field of anti-infection worldwide. This is the result of performing the MIC 90 test using the representative drug in control as a control drug.
  • the MIC 90 value is 0.25 ug/mL regardless of the MRSA, which is a susceptible strain and a non-susceptible strain, which is two to ten times superior to the control drug. It can be seen that the result In particular, among these strains, vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (VISA) strains resistant to vancomycin and vancomycin-resistant Staphylococcus aureus (VRSA) strains (vancomycin MIC> 64 ug/mL), which are super bacteria.
  • VISA vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus
  • VRSA vancomycin-resistant Staphylococcus aureus
  • the compound of Formula 1 is bacterial compared to the conventional drugs vancomycin, teicoplanin, linezolid, amoxicillin-clavulanate, daptomycin, etc. It can be confirmed that it can be used as an effective therapeutic agent for diseases or disorders caused by infection. Specifically, but not limited to, it can be usefully used as a therapeutic agent for bacterial infections related to diseases including urinary tract, respiratory tract, skin tissue infection, sepsis, and the like.
  • pharmacokinetic/pharmacodynamic experiments were conducted using a mouse infection model. To this end, experiments were conducted on Staphylococcus aureus ATCC 29213 (MSSA, standard strain) and 13B-382 (MRSA, clinical strain). As the medium, Mueller-Hinton medium or Cation-adjusted Mueller-Hinton medium was used. Formula 1 compound was used for the sensitivity test (minimum inhibitory concentration (MIC)).
  • the femur was separated, placed in physiological saline, and finely cut with a homogenizer (Kinematica AG/Polytron®). After 10-fold dilution, it was smeared on Muller Hinton II broth medium and cultured at 37°C for 24 hours, and the number of viable cells was counted. The result was expressed as log 10 CFU/thigh, and the limit for measuring the viable cell count in the laboratory was 1 x 10 2 CFU/thigh.
  • T/MIC was evaluated as an index for judging the effectiveness of antibiotics in combination with antimicrobial action and pharmacokinetic results according to the antimicrobial dose and usage.
  • the T/MIC value represents the ratio of the administration interval to the time showing a concentration above the MIC value in the blood.
  • the results are shown in FIG. 5. As shown in FIG. 5, it can be seen that as the T/MIC value increases, the bactericidal effect rapidly increases. When the T/MIC value was approximately 20% or more, 99.9% or more of bacteria were eradicated. In addition, it can be seen that when the AUC 0-24h /MIC and C max /MIC values are increased, the effect of eradication of bacteria such as MRSA is rapidly increased.
  • the compound of Formula 1 can confirm that the MIC value for Staphylococcus aureus ATCC 29213 and 13B-382 is 0.25 ug/mL regardless of the strain, and this value is oxacillin (0.25 and 16 ug/mL) and vancomycin (vancomycin). , 0.5 and 1 ug/mL).
  • the present invention can be effectively applied to the treatment of bacterial infections having multi-drug resistance.

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Abstract

본 발명은 Fab I 저해제를 포함하는 정맥투여용 약제학적 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 항생제에 내성이 있는 세균의 감염 등에 효과적으로 적용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 용해도 및 용출률을 향상시킴으로써 치료 효과를 더욱 신속하게 개시할 수 있으며, 생체 이용률을 향상시킬 수 있다. 또한, 입자 크기를 조절함으로써 제제에 대한 혼합 및 용량의 균일성을 향상시킬 수 있다.

Description

FAB I 저해제를 포함하는 주사제용 조성물 및 그 제조방법
본 발명은 Fab I를 저해하는 화합물 또는 그의 염을 함유하고 있는 주사제용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 출원은 2019.01.21자로 출원된 한국특허출원 제 2019-0007288 호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
박테리아에 의한 감염증은 인류의 역사만큼이나 오랫동안 인류를 괴롭혀 온 질병으로 흑사병 등과 같이 인류 역사에 큰 영향을 미쳤다. 이러한 세균으로부터의 위협을 극복하기 위하여 인류는 부단한 노력을 하였고 이로 인하여 의술과 의약의 비약적인 발전을 가져왔다. 근대적인 개념의 항생제의 개발은 1928년 알렉산더 플레밍(Alexander Fleming)이 처음 발견한 페니실린(penicillin)으로부터 시작되었다. 이후, 박테리아에 의한 감염증을 치료하기 위한 항생제 개발은 비약적인 발전을 이루었다. 그러나 세균 자체의 항생제에 대한 내성이 알려지기 시작하였고 항생제의 사용에 제약을 야기시켰다.
이후, 새로운 항생제의 개발과 그에 대한 내성세균의 지속적인 출현이 되풀이되면서 새로운 항생제의 개발은 박테리아 감염증 치료에 반드시 필요한 과제가 되었다. 또한, 연구전략 역시 내성균을 극복하기 위한 것으로 바뀌고 있다. 기존에 확립된 박테리아 저해 작용기전을 이용하여 약효가 보다 우수한 새로운 항생제를 개발하면 이미 발현되어 있는 내성을 극복할 수 없기 때문에 새로운 작용기전을 갖는 항생제의 개발에 관심이 집중되고 있다. 또한, 전 세계적으로 Bayer, Bristol-Myers Squibb, Merck, Glaxo Smithkline, Astrazenca 등의 거대 제약사들이 지금까지의 항생제와는 전혀 다른 작용 기작으로 내성을 극복할 수 있는 새로운 개념의 항생제를 개발하기 위하여 많은 노력을 기울이고 있다. 이러한 내성균주 중에 가장 치료가 어려운 것 중 하나가 MRSA (Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus)이다. MRSA는 페니실린계 항생제인 메티실린(methicillin) 에 내성을 보이는 포도상구균인데 단순히 메티실린에만 내성을 보이는 것이 아니고, 대부분의 항생제에 강한 내성을 가지고 있어 극히 제한된 항생제로만 치료가 가능한 병원균이다. MRSA 감염 발생으로 인하여 전 세계적으로 매년 70만명 이상이 사망하고 있으며, 사망률은 매년 꾸준하게 증가하여 2050년에는 1,000만명 이상을 상회할 것으로 예측되고 있다. 이 균주가 주목을 받고 있는 이유는 기존의 항생제에 내성을 가지고 있다는 이유뿐만 아니라 병원 내 감염을 유발하는 병원균 중 가장 빈번히 나타나는 원인균이면서 면역력이 약한 환자나 노약자에게는 치명적일 수 있다는 점 때문이다. 최근에는 healthcare-acquired MRSA 감염뿐만 아니라 community-acquired MRSA 감염이 크게 증가하고 있어 일상생활에서도 MRSA에 쉽게 노출이 되고 있다. 치료에는 반코마이신(vancomycin)이 사용되고 있으나 이에 대한 내성 균주도 이미 보고되어 있다. 그 밖에 치료제로 리네졸리드(Linezolid), 답토마이신(Daptomycin)등이 있으나 치료목적의 항생제 선택이 매우 제한적이다.
따라서 항생제에 내성이 있는 세균감염에 사용할 수 있는 새로운 항생제의 개발이 절실하다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 Fab I 저해제인 1-(3-아미노-2-메틸벤질)-4-(2-티오펜-2-일-에톡시)-1H-피리딘-2-온 및 이의 염을 유효성분으로 포함하는 주사제용 조성물을 제공한다.
또한, 상기 주사제용 조성물의 제조방법 제공한다.
본 발명은,
1-(3-아미노-2-메틸벤질)-4-(2-티오펜-2-일-에톡시)-1H-피리딘-2-온 또는 이의 염과 함께,
고분자 화합물, 가용화제 또는 이들의 혼합물
을 포함하는 정맥투여 주사제용 조성물을 제공한다.
일구현예에 따르면, 1-(3-아미노-2-메틸벤질)-4-(2-티오펜-2-일-에톡시)-1H-피리딘-2-온 또는 이의 염의 함량은 0.1 내지 10중량%이고,
상기 고분자 화합물의 함량은 5 내지 40중량%이고,
상기 가용화제의 함량은 10 내지 30중량%일 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 고분자 화합물은 덱스트린(dextrin), 폴리덱스트린(polydextrin), 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 폴록사머(poloxamer), 덱스트란(dextran), 펙틴(pectin) 및 펙틴 유도체, 알긴산염, 전분, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose), 히드록시프로필 셀룰로오스(hydroxypropyl cellulose), 히드록시메틸 셀룰로오스(hydroxymethyl cellulose), 히드록시에틸 셀룰로오스(hydroxylethyl cellulose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨(sodium carboxymethyl cellulose), 히드록시프로필메틸셀룰로오스 아세테이트 숙시네이트(hydroxypropyl methylcellulose acetate succinate), 히드록시에틸메틸셀룰로오스(hydroxylethylmethyl cellulose), 구아검(guar gum), 로커스트 콩 검(locust bean gum), 트라가칸타(tragacantha), 카라기난(carrageenan), 아카시아검(acacia gum), 아라비아검(arabicgum), 젤란검(gellangum), 잔탄검(xanthan gum), 젤라틴(gelatin), 카제인(casein), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리비닐 아세탈디에틸 아미노아세테이트(polyvinyl acetaldiethyl aminoacetate), 폴리(부틸 메타크릴레이트,(2-디메틸아미노에틸)메타크릴레이트, 메틸메타크릴레이트) 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide) 및 카보머(carbomer)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 가용화제는 프로필렌글라이콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글라이콜(polyethylene glycol), 디프로필렌글라이콜(dipropyleneglycol), 디에틸렌글라이콜(diethylene glycol), 디에틸렌글리콜모노에틸에테르(diethylene glycol monoethyl ether), 글리세롤(glycerol), 트윈 80(tween 80), 크레모포어(cremophor) 및 트란스큐톨(transcutol)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 조성물은 액제, 에멀젼 또는 동결건조분말 형태의 주사제로 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 디메틸포름아미드(dimethylformamide)에 4-벤질옥시-1H-피리돈(4-benzyloxy-1H-pyridone ), 2-메틸-3-니트로-벤질클로라이드(2-methyl-3-nitro-benzylchloride), 칼륨 t-부톡사이드(Potassium tert-butoxide) 투입하여 가온 하에서 혼합 및 반응시키는 단계;
상기 혼합물을 반응시킨 후 정제수를 추가하고 가온 하에서 건조시키는 단계;
상기 건조물을 유기용매에 녹이고 정제수를 추가하여 층 분리시키는 단계;
유기층을 회수하고 여과 및 농축시켜 농축물을 제조하는 단계;
상기 농축물을 재농축시켜 헥산을 추가하여 중간 침전물을 제조하는 단계;
상기 수득된 침전물을 용해, 냉각, 여과 및 건조하여 수득하는 단계;
상기 수득된 건조물을 유기용매에 용해한 후 염화철 육수화물, 활성탄 및 하이드라진 일수화물을 첨가하여 반응시킨 후 냉각 및 여과시켜 수득된 최종 침전물을 건조 후 분쇄하는 단계를 포함하는 방법으로 상기 1-(3-아미노-2-메틸벤질)-4-(2-티오펜-2-일-에톡시)-1H-피리딘-2-온 또는 이의 염의 화합물을 제조하고,
상기 화합물을 포함하는 주사제용 조성물의 제조방법을 제공한다.
일구현예에 따르면, 산성 물질을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 산성 물질은 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 타르타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 옥살산, 푸마르산, 말론산, 말레인산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌설폰산 및 EDTA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 용매에 고분자 화합물과 1-(3-아미노-2-메틸벤질)-4-(2-티오펜-2-일-에톡시)-1H-피리딘-2-온 또는 이의 염을 첨가하여 용해시키는 단계; 및
진공 건조시킨 후 생성된 고체를 미분화하는 단계를 더 포함하는 방법으로 고분자 분산체를 제조할 수 있다.
일구현예에 따르면, 용매에 고분자 화합물 및 지질계 계면활성제와 1-(3-아미노-2-메틸벤질)-4-(2-티오펜-2-일-에톡시)-1H-피리딘-2-온 또는 이의 염을 용해시키는 단계;
가용화제를 점진적으로 투입시키는 단계; 및
원심분리 및 진공 건조한 후 균질화시키는 단계를 포함하는 방법으로 리포좀 제제를 제조할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 지질계 계면활성제는 대두유를 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 조성물은 고체 분산체, 리포좀 제제 또는 이들 조합의 형태로 제조될 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 조성물은 박테리아 감염증의 치료용도로 사용될 수 있다.
기타 본 발명의 구현 예들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.
본 발명의 Fab I 저해제 또는 그의 염을 포함하는 주사제용 조성물은 항생제에 내성이 있는 세균의 감염 등에 효과적으로 적용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 용해도가 현저히 낮은 FabI 저해제 또는 그의 염의 용해도를 개선시키고, 보관 안정성을 향상시킴으로써 정맥투여가 가능하도록 하여 치료 효과를 더욱 신속하게 개시할 수 있다.
도 1은 pH에 따른 화학식 1 화합물의 용해도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 리포좀 제제의 성상 및 주사용수에 희석 후의 관찰 사진이다.
도 3은 실시예 3 내지 5에 따른 리포좀 제제의 현미경 관찰 사진이다.
도 4는 사이클로덱스트린 포접화합물 제조방법을 나타내는 개략도이다.
도 5는 T/MIC 값에 따른 항균 효과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예를 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명의 구현 예에 따른 주사제용 조성물에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
본 명세서에 사용되는 용어, "약제학적 조성물"은 "약학적 조성물" 및 "약학적으로 허용가능한 조성물"과 혼용하여 기재할 수 있고, 투여 대상에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 할 수 있는 조성물로서, 상기 조성물로부터 기인하는 부작용이 약물의 효능을 저하시키지 않고, 화합물이 투여되는 대상에 심각한 자극을 유발하지 않고, 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 임의의 유기 또는 무기 화합물 제형을 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 '투여 대상'이란, '투여 개체' 및 '투여 유기체'와 혼용하여 기재할 수 있고, 박테리아 또는 내성 균주의 감염이 유발되었거나, 유발될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.
또한, '박테리아 감염증'이란, '박테리아 관련 질병'으로 혼용하여 기재할 수 있고, 박테리아 감염에 의하여 발생하는 병 또는 질환을 의미한다. 상기 병 또는 질환으로는 예를 들어 요로, 호흡 또는 피부 조직 감염, 패혈증 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 Fab I 저해제를 포함하는 주사제용 조성물을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 Fab I에 대한 선택적 저해제로서 1-(3-아미노-2-메틸벤질)-4-(2-티오펜-2-일-에톡시)-1H-피리딘-2-온, 이의 염 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 1-(3-아미노-2-메틸벤질)-4-(2-티오펜-2-일-에톡시)-1H-피리딘-2-온(1-(3-amino-2-methyl-benzyl)-4-(2-thiophen-2-yl-ethoxy)-1H-pyridin-2-on)의 구조는 하기 화학식 1과 같다.
Figure PCTKR2020001033-appb-img-000001
상기 화학식 1의 구조와 같은 Fab I 선택적 저해제는 기존의 항생제인 베타락탐(beta-lactam: 페니실린, 세팔로스포린 등)계, 글리코펩타이드계 (Glycopeptides: 반코마이신 등), 테트라사이클린류 (Tetracyclines), 아미노글리코사이드류 (Aminoglycosides), 글리실사이클린류 (Glycylclines), 마크로라이드류 (Macrolides), 크로람페니콜 (Chloramphenicol), 퀴놀론(quinolone)계, 설폰아마이드류 (Sulfonamides) 및 옥사졸린(oxazoline)계와는 작용기전이 완전히 다른 화합물로서, 박테리아의 단백질 합성에 필수적인 효소 Fab I 작용을 억제함으로써 항생 효력을 나타내는 물질이다.
지방산(fatty acid)은 생명체에 에너지원으로서뿐만 아니라 세포막의 주성분으로 생명현상의 유지에 필수적인 역할을 한다. 따라서 세포내의 이들 지방산 생합성 과정은 모든 살아있는 세포에서는 필수적으로 존재하는 생화학적 과정이며, 이에 관여하는 유전자는 세균에서부터 사람에게 필수적으로 존재하는 일종의 필수 유전자이다.
Fab I는 박테리아 지방산 생합성 과정에 관여하는 4개의 효소 중 마지막 단계의 에노일 ACP 리덕타제(enoyl-ACP reductase)로서 에노일 ACP(enoyl-ACP)를 1,4 환원반응을 통하여 그에 해당하는 아실 ACP(acyl-ACP)로 전환하는 역할을 한다고 보고되어 있다(Payne et al., Drug Discovery Today 6, 2001, 537-544). Fab I는 지방산 합성에 있어서 가장 중요한 단백질이고, 전체 합성과정에 있어서의 속도를 결정하는 반응에 관여한다. 그러나 사람과 같은 포유류의 경우 박테리아와 달리, 이와 같은 지방산의 합성에 지방산합성효소(fatty acid synthase)라는 거대한 한 덩어리의 효소가 사용되고 있다. 더불어 그 구조는 박테리아의 지방산 합성경로에 있는 단백질들과 완전히 다르다. 따라서 선택적인 Fab I 저해제는 독성이 거의 없고, 지금까지는 그 어떤 항생제도 표적으로 삼지 않았던 새로운 표적단백질이라는 점에서 이 표적단백질에 작용하는 약물의 개발은 약제 내성, 그 중에서도 다중약제 내성을 지닌 박테리아의 치료 성공률을 향상시킬 수 있다.
일구현예에 따르면, 화학식 1 화합물은 비결정형, 결정형 또는 이들의 혼합물 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면,
디메틸포름아미드(dimethylformamide)에 4-벤질옥시-1H-피리돈(4-benzyloxy-1H-pyridone), 2-메틸-3-니트로-벤질클로라이드(2-methyl-3-nitrobenzoyl chloride) 및 칼륨 t-부톡사이드(potassium tert-butoxide)를 투입하여 가온 하에서 혼합 및 반응시키는 단계;
상기 혼합물을 반응시킨 후 정제수를 추가하고 가온 하에서 건조시키는 단계;
상기 건조물을 유기용매에 녹이고 정제수를 추가하여 층 분리시키는 단계;
유기층을 회수하고 여과 및 농축시켜 농축물을 제조하는 단계;
상기 농축물을 재농축시켜 헥산을 추가하여 중간 침전물을 제조하는 단계;
상기 수득된 침전물을 용해, 냉각, 여과 및 건조하여 수득하는 단계;
상기 수득된 건조물을 유기용매에 용해한 후 염화철 육수화물, 활성탄 및 하이드라진 일수화물을 첨가하여 반응시킨 후 냉각 및 여과시켜 수득된 최종 침전물을 건조 후 분쇄하는 단계를 포함하는 방법으로 화학식 1 화합물을 제조할 수 있다. 또한, 상기와 같은 화학식 1 화합물을 Fab I 저해제로서 포함하는 정맥투여 주사제용 조성물의 제조방법을 제공한다.
일구현예에 따르면, 화학식 1의 약학적으로 허용 가능한 염은 주사제용 조성물 내에 함유될 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 산을 이용하여 형성되는 산 부가염일 수 있다. 산의 예로는 염산(hydrochloric acid), 황산(sulfuric acid), 질산(nitric acid), 인산(phosphoric acid), 브롬화수소산(hydrobromic acid), 요오드화수소산(hydriodic acid), 타르타르산(tartaric acid), 포름산(formic acid), 시트르산(citric acid), 아세트산(acetic acid), 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid), 글루콘산(gluconic acid), 벤조산(benzoic acid), 락트산(lactic acid), 옥살산(oxalic acid), 푸마르산(fumaric acid), 말론산(malonic acid), 말레인산(maleic acid), 메탄설폰산(methane sulfonic acid), 벤젠설폰산(benzenesulfonic acid]), p-톨루엔설폰산(p-toluenesulfonic acid), 나프탈렌설폰산(naphthalenesulfonicacid), EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일구현예에 따르면, 본 발명은 정맥 투여가 가능한 고체 또는 액체 형태로 제형화될 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 화학식 1 화합물 또는 이의 염을 가용화제, 공계면활성제 및 지질의 조합을 통해 FabI 저해제(화학식 1 화합물)의 수용해도를 현저하게 증가시킴으로써 에멀젼 또는 액체의 형태로 제공할 수 있다. 상기 가용화제, 공계면활성제 및 지질은 무독성의 약학적으로 허용되는 물질로 사용하며, 예를 들면, 프로필렌글라이콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글라이콜(polyethylene glycol), 디프로필렌글라이콜(dipropyleneglycol), 디에틸렌글라이콜(diethylene glycol), 디에틸렌글리콜모노에틸에테르(diethylene glycol monoethyl ether), 글리세롤(glycerol), 트윈 80(tween 80), 크레모포어(cremophor), 트란스큐톨(transcutol) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적절한 조합을 통하여 본 발명의 조성물을 정맥 투여가 가능한 액제 또는 에멀젼의 형태로 제조할 수 있다. 가용화제는 조성물 총 중량에 대하여 10 내지 30중량% 포함할 수 있으며, 예를 들면 10중량% 이상, 또한 15중량% 이상, 또한 20중량% 이상, 예를 들면 30중량% 이하, 또한 25중량% 이하 포함할 수 있고, 정맥 투여가 가능한 조성물로는 예를 들면 주사제를 포함할 수 있다.
또한, 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물을 나노 입자화시켜 표면적을 증가시키거나 다공의 형태를 갖는 고분자 물질에 포접시켜 용해도를 향상시킬 수 있다.
일구현예에 따르면, 나노 입자화는 화학식 1 화합물을 적절한 용매에 용해 및 혼합시킨 후, 온도를 급격하게 저하시켜 고형물을 생성하고, 분쇄기로 분쇄시킨 뒤, 초임계 추출기로 생성물을 수득하는 방법을 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 고분자 물질은 수용성 고분자 화합물을 사용할 수 있고, 예를 들면 덱스트린(dextrin), 폴리덱스트린(polydextrin), 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 덱스트란(dextran), 펙틴(pectin) 및 펙틴 유도체, 알긴산염, 전분, 히드록시프로필메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose), 히드록시프로필셀룰로오스(hydroxypropylcellulose), 히드록시메틸셀룰로오스(hydroxymethylcellulose), 히드록시에틸셀룰로오스(hydroxylethylcellulose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨(sodium carboxymethyl cellulose), 히드록시프로필메틸셀룰로오스 아세테이트 숙시네이트(hydroxypropyl methylcellulose acetate succinate), 히드록시에틸메틸셀룰로오스(hydroxylethylmethyl cellulose), 구아검(guar gum), 로커스트 콩 검(locust bean gum), 트라가칸타(tragacantha), 카라기난(carrageenan), 아카시아검(acacia gum), 아라비아검(arabicgum), 젤란검(gellangum), 잔탄검(xanthan gum), 젤라틴(gelatin), 카제인(casein), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리비닐 아세탈디에틸 아미노아세테이트(polyvinyl acetaldiethyl aminoacetate), 폴리(부틸 메타크릴레이트,(2-디메틸아미노에틸)메타크릴레이트, 메틸메타크릴레이트) 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide), 카보머(carbomer) 등을 포함할 수 있고, 단독 또는 2종 이상의 조합을 통해 사용할 수 있으며, 조성물 총 중량에 대하여 5 내지 40중량%, 예를 들면 10 내지 20% 중량, 예를 들면 5중량% 이상, 또한 10중량% 이상, 예를 들면 40중량% 이하, 또한 35중량% 이하, 또한 30중량% 이하, 또한 25중량% 이하, 또한 20중량% 이하의 함량으로 포함될 수 있다.
일구현예에 따르면 본 발명의 조성물은 동결건조분말의 고체 형태로 제조될 수 있으므로 용해도 및 보관 안정성을 더욱 향상시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 나노입자, 친수성 고분자 화합물 또는 이들의 조합을 포함하는 형태로 제조되어 제품화될 수 있다.
일구현예에 따르면, 조성물 총 중량에 대하여 화학식 1 화합물, 이의 염 또는 이들의 조합을 예를 들면 0.1 내지 10중량%, 예를 들면 0.2 내지 2 중량%, 예를 들면 0.1중량% 이상, 또한 0.2중량% 이상, 또한 0.5중량% 이상, 예를 들면 10중량% 이하, 또한 8중량% 이하, 또한 5중량% 이하, 또한 2중량% 이하 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 분말 형태의 조성물은 투여 대상에게 적용하기 전에 주사용수에 용해시킬 수 있다. 주사용수로는 예를 들면, 글루코스, 자일리톨, D-만니톨, 프룩토스, 생리식염수, 덱스트란 40, 덱스트란 70, 아미노산, 링거액, 락트산-링거액 주사용수 등을 포함할 수 있으나, 상기한 바에 한정되지는 않는다.
일구현예에 따르면, 본 발명은 MRSA(methicillin resistant staphylococcus aureus)와 같은 그람양성 세균(gram-positive bacteria)성의 감염 질환 또는 이의 다양한 감염 질환의 치료를 위해 사용할 수 있다. 그람양성 세균(gram-positive bacteria)은 예를 들어, 스타필로코쿠스아우레우스( Staphylococcus aureus) 및 스타필로코쿠스에피데미디스( Staphylococcus epidermidis) 와 같은 스타필로코쿠스( Staphylococcus); 스트렙토코쿠스뉴모니아( Streptococcus pneumonia), 스트렙토코쿠스피로제네스( Streptococcus pyrogenes), C, F 및 G 군의 스트렙토코쿠스(group C/F/G Streptococci) 및 비리단군의 스트렙토코쿠스(viridans group Streptococci)와 같은 스트렙토코쿠스( Streptococcus)를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시 예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
제조예 1: 화학식 1 화합물 제조
화학식 1 화합물을 제조하기 위하여, 4-벤질옥시-1H-피리돈(4-benzyloxy-1H-pyridon) 0.9mol을 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF) 10L에 투입 후 교반하면서 칼륨 터트-부톡사이드(potassium tert-butoxide) 0.9mol을 첨가하여 준 다음 55℃로 가온하면서 30분간 가열 및 혼합하여 준다. 2-메틸-3-니트로벤질클로라이드(2-methyl-3-nitrobenzyl chloride) 0.9mol을 천천히 첨가하고 추가적으로 2시간 동안 혼합하면서 반응을 시킨다. 반응 완료 후 정제수 4L 를 넣어준 후 이를 회전증발건조기(Rotary evaporator, Rotavapor ㄾ R-220, 뷰키코리아)를 이용하여 60℃로 가온하면서 건조를 실시하였다. 14L의 디메칠클로라이드(dimethyl chloride)를 추가하여 건조물을 용해한 후 7L 증류수를 추가하여 층분리한다. 상층액을 취하여 마그네슘설페이트 및 활성탄을 각각 0.7kg씩 추가하여 1시간 동안 교반 후 이를 셀라이트로 여과 후 회전증발건조기를 사용하여 건조하였다(수득률: 60%).
수득된 건조물 약 2kg을 에탄올에 용해한 후 염화철 육수화물 100g 및 활성탄 600g 및 하이드라진 일수화물 10kg 첨가하여 반응시킨 용액을 냉각하고, 여과시켜 하얀색의 침전물을 수득 및 이를 진공오븐에서 40℃에서 overnight 건조시켜 화학식 1 화합물인, 피리딘 치환체 1-(3-아미노-2-메틸벤질)-4-(2-티오펜-2-일-에톡시)-1H-피리딘-2-온을 제조하였다. 수득률은 85%이다.
합성 과정에서 생성된 유연물질을 제거하기 위하여 필요에 따라 정제 작업을 실시할 수 있다. 정제 작업은 디클로로메탄(dichloromethane) 30L에 합성된 원료물질 2kg을 용해한 후 정제수를 추가하여 층분리시키고, 유기층을 취하여 황산나트륨 0.7kg을 넣어 교반하고, 추가적으로 활성탄 0.7kg을 넣고 1시간 동안 교반한 다음, 여과시키고, 감압농축하여 디클로로메탄를 제거하는 과정으로 진행될 수 있다. 또한, 에틸아세테이트를 10L 첨가하여 용해 후, 농축시키고, 헥산 20L을 첨가하여 재결정시킨 후, 이를 40℃에서 건조시킨다. 정제 작업은 필요에 따라 반복할 수 있다.
실험예 1: 용해도 평가
실험예 1-1: pH에 따른 수용해도 평가
화학식 1 화합물 (1-(3-아미노-2-메틸벤질)-4-(2-티오펜-2-일-에톡시)-1H-피리딘-2-온)에 대하여 pH 변화에 따른 용해도를 측정하였다. 이를 위하여 pH 1.2 에서 7.0까지 pH 값을 달리한 수용액에 화학식 1 화합물을 과량으로 투입하여 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
교반을 완료한 후 1차 원심분리 후 2차로 0.22um 여과필터를 이용하여 잔류할 수 있는 불용성 물질을 제거하였다. 이를 유기용매 메탄올로 희석 후 HPLC 분석을 실시하여 용해도를 정량하였다. 그 결과 값은 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 화학식 1 화합물은 수용액의 pH에 따라 용해도에 영향을 받는 것을 확인할 수 있다. 구체적으로, pH1.2 에서는 약 1mg/ml의 용해도를 나타내지만, pH3에서는 6ug/ml, pH7에서는 2.5ug/ml로, pH가 증가함에 따라 용해도가 급격하게 감소하는 경향을 나타낸다. 일반적으로 정맥 투여에 적절한 pH 범위인 pH4 내지 8에서의 용해도는 2 내지 5.0ug/mL로 매우 낮은 값을 보이므로, FabI 저해제로서의 용해도를 높이기 위한 연구가 필요하다.
실험예 1-2: HPLC 분석
의약용 첨가제로서 허가된 부형제 및 향후 공정 연구를 위하여 사용할 수 있는 용매를 표 1과 같이 선택하여 화학식 1 화합물을 소량 첨가 후 용해시키면서 더 이상 용해되지 않을 때까지 첨가 작업을 반복하였고, 마지막으로 한 시간 동안 실온에서 교반 후 여과하여 여과액에 용해된 HPLC 분석을 통하여 화학식 1 화합물의 농도를 결정하였다.
검액 및 표준액 20μL씩, 다음 조건으로 대한민국약전 일반시험법 액체크로마토그래프법(HPLC)에 따라 시험하여 각각의 용액의 주성분 피크면적을 측정하였다.
조작조건 및 계산
[조작조건]
검출기: 자외부흡광광도계 (측정파장 286 nm)
칼럼: Aegispak C18-L (4.6mm x 250 mm, 5um) 컬럼
칼럼온도: 25 ℃
이동상: 아세토나이트릴:물 = 3:2
유량: 1.0 mL/분
[계산]
Figure PCTKR2020001033-appb-img-000002
A T: 검액 중 주성분의 피크면적
A S: 표준액 중 주성분의 피크면적
D T: 검액 희석배수
D S: 표준액 희석배수
P: 주성분 표준품의 순도 (%)
결과 값은 표 1에 나타내었다.
Figure PCTKR2020001033-appb-img-000003
표 1에 나타난 바와 같이 유기용매로서는 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)에서 약 60mg/mL의 용해도를 보였으며, PEG300, Tween 20 및 Labrasol에서 20mg/mL 이상의 용해도를 보였다. 10mg/mL 이상의 용해도를 보이는 부형제로서는 Tween 80 및 Solutol HS 15 였으며, Lipid 계열 중에 soybean oil에서 약 8.5mg/mL 용해도를 보였다. 선택된 약물 중에 Tween 20, Tween 80, Solutol HS 15, Soybean oil 및 PEG 300이 주사제로서 사용될 수 있다. 따라서, 향후 선택된 부형제들을 연구에 사용하였으며, 특히 이들의 조합을 통하여 주사제 제제 연구를 진행하였다.
실험예 2: 부형제 적합성 평가
표 2와 같이 의약용으로 허가된 부형제와 화학식 1 화합물을 혼합하여 유기용매 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)에 용해시킨 후 이를 진공 건조하여 첨가된 유기 용매를 휘발시켰다. 이 결과물을 60℃에 보관하면서 화학식 1 화합물의 안정성(stability)을 측정하였다. 유연물질 측정은 식품의약품 안전처의 유연물질 평가 가이드라인에 따라 평가하였으며, 그 결과는 표 2에 나타내었다.
Figure PCTKR2020001033-appb-img-000004
표 2에서 보는 바와 같이 soybean oil, olive oil, Tween 80, PEG 20000, PVA, PVA 2,000, poloxamer 407, 베타-하이드록시프로필 사이클로덱스트린(beta-hydroxypropyl cyclodextrin) 및 글리세린(glycerin) 등의 부형제에서 상대적으로 화학식 1 화합물이 안정함을 확인하였다. PVA 계열은 일반적으로 안약제제에 사용되는 부형제이므로, 용해도(solubility) 및 적합성(compatibility)을 종합적으로 고려할 때 향후 제제 연구는 soybean oil, Tween 20, Tween 80, poloxamers 및 PEG 20,000 등의 부형제를 사용하여 수행할 수 있다.
실시예 1: 고분자 분산체 제조
화학식 1 화합물과 적합성(compatibility)이 있는 PEG 20,000(PEG20K) 및 poloxamer 407(P407)을 이용하여 용해도를 향상시키고자 고분자 분산체를 제조하였다. 이를 위해서 메틸렌클로라이드(DCM)에 각각의 고분자 화합물을 용해하였고, 이에 화학식 1 화합물을 첨가하여 용해시킨 후, 진공 건조를 진행하였으며, 생성된 고체를 분쇄시킨 뒤, 미분화하였다. 제조된 조성물의 조성은 표 3과 같다.
Figure PCTKR2020001033-appb-img-000005
표 3에 나타난 바와 같이, 고분자 분산체 내에 고분자 화합물의 함량이 증가할수록 전체적으로 화학식 1 화합물은 잘 용해되었으며, 특히 PEG2000 또는 폴록사머 407 대 화학식 1 화합물의 함량비가 20:1인 경우, 최대용해도 (maximal solubility) 는 각각 약 12mg/mL(12,000ug/mL) 및 15mg(15,000ug/ml)으로 측정되었다. 표 3에서 보여주고 있는 바와 같이 실제 제조된 주사제 조제물의 농도는 각각의 물질의 함량비 20:1에서 최대용해도 (maximal solubility)보다 낮은 10mg/mL로 제조되었다. 이 조제물의 농도 10mg/mL는 화학식 1 화합물 수용해도 2.5ug/mL의 값과 비교할 때 대략 4,000배에 해당하는 양이다.
그러나, 정맥(IV infusion) 주사를 위하여 50 내지 100배 희석하였을 때 10 내지 30분 이내에 침전이 발생되었다. 또한, 폴록사머 407(poloxamer 407)과 결합된 화학식 1 화합물을 주사용수에 용해시켰 때의 침전 속도가, PEG 20,000를 사용하였을 때에 비하여 감소하였다. 이는 용액 내에 존재하는 FabI 저해제(화학식 1 화합물)의 소수성 특성으로 인하여 응집(aggregation)이 일어나 결정화가 발생되기 때문이다. 폴록사머가 PEG 20,000에 비해서 보다 소수성이 강하기 때문에 화학식 1 화합물과 소수성(hydrophobic) 결합을 할 수 있으므로 침전이 더디게 일어나는 것으로 사료된다. 화학식 1의 분자량은 340.45 이며, 친수성-소수성 밸런스(hydrophile-lipophile balance, HLB) 값은 전체 분자량 대비 친수성 기능기 분자들의 총 분자량 비에 5를 곱하여 결정한다. 이렇게 계산된 화학식 1 화합물의 HLB 값은 5.4이다. PEG 20,000 및 poloxamer 407의 HLB 값은 대략 19 및 20 정도이다. 따라서, 각각의 조성물의 HLB 값은 각 물질의 무게분율 곱하기 HLB 값의 총 합으로 계산된다. 그 결과 값은 표 3에서 보여주고 있다. 화학식 1 화합물의 함량이 증가함에 따라 HLB 값은 낮아졌고, 고분자 분산체의 소수성 성질이 증가하면서 용해가 용이하게 일어나지 않았으며, 초음파를 가하여 용해하였을 때 약간 푸른빛이 도는 나노입자가 형성되었으나, 대략 30분 이내에 화학식 1 화합물의 침전이 관찰되었다. 결과적으로, 고분자 분산체를 적용한 경우 화학식 1 화합물의 결정형 구조를 무정형(amorphous)으로 변경하여 전체적으로 용해도를 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 2 내지 5: 리포좀(liposome) 제제 제조
고분자 분산체에 보다 소수성 특성이 강한 물질을 첨가하여 화학식 1 화합물의 소수성 결합을 차단하기 위하여, 마이크로에멀젼(microemulsion) 또는 리포좀(liposome)을 제조하고, 이 입자 안에 약물을 봉입하고 화학식 1 화합물 분자의 소수결합으로 인한 침전 발생을 방지하고자 하였다.
난용성의 화학식 1 화합물의 용해도를 향상시키기 위해서 상기에서 언급된 고분자 분산체 제조 기술과 리포좀(liposome) 제조기술을 병용하여 제제 연구를 수행하였다. 이를 위해서 고분자 분산체에서 침전속도가 늦었던 폴록사머 407(poloxamer 407)를 선택하였다. 다음, 리피드(lipid) 계열 계면활성제(surfactant)로는 대두유(soybean oil)를 사용하였다. 실험예 1-2의 용해도 평가에서 대두유는 1mL 당 화학식 1 화합물을 8.5mg 용해하였고, 실험예 2의 적합성 평가에서 대두유는 화학식 1 화합물의 안정성에 상대적으로 영향을 많이 미치지 않았다. 또한 추가적으로, 낮은 임계미셀농도(critical micelle concentration, CMC)를 가지는 레시틴(lecithin)을 사용하여 용액 내에서 생성된 마이크로에멀젼(microemulsion)의 안정성을 조절하고자 하였다. 구체적으로, 먼저 화학식 1 화합물을 메틸렌클로라이드에 용해시키고 가용화제를 점진적으로 투입시켰다. 첨가된 가용화제가 충분하게 용해되지 않을 때 추가적으로 메틸렌클로라이드를 넣어 미황색의 액체가 되도록 하였다. 용해에 사용된 메틸렌클로라이드의 용량은 대략 15mL 정도이다. 이렇게 제조된 용액은 원심분리를 통해 불용성 물질을 제거하였고, 진공 건조를 실시하여 메틸렌클로라이드를 제거하여 주었다. 진공 건조시킨 물질에 2차 증류수를 넣고 균질화(homogenizing)하여 리포좀(liposome)을 제조하였다.
리포좀 제제(실시예 2 내지 5)의 구체적인 조성은 표 4에서 보여주고 있다. 도 2는 실시예 5의 리포좀 제제의 성상 및 이를 주사용수(0.9% NaCl용액)로 20배 희석시킨 제제의 성상을 관찰한 사진을 나타내었다.
Figure PCTKR2020001033-appb-img-000006
도 2에 나타난 바와 같이, 제조된 조성물의 성상은 불투명한 현탁액으로 주사용수(0.9% NaCl용액)에 용이하게 희석되었으며, 22G 주사바늘로 용이하게 주입(injection) 할 수 있음을 확인하였다. 또한, 표 4에서 보는 바와 같이 조성물 총 중량에 대한 대두유(soybean oil)의 함량이 감소하는 경우 화학식 1 화합물은 실온에서 24시간 방치하였을 때 침전이 발생됨을 확인하였다. 그러나, 제제 내에 폴록사머 및 Tween 80을 첨가하였을 때 실온에서 24시간 방치하였을 때 침전은 발생하지 않음을 볼 때 물리적 안정성이 향상됨을 알 수 있었다.
실시예 5는 화학식 1 화합물의 농도가 20mg/mL로 제조되었으며, 이 농도는 화학식 1 화합물의 수용해도 2.5ug/mL 대비 8,000배에 해당되는 양이다.
화학식 1 화합물이 물에서의 용해도가 낮은 관계로, 실시예 2에서는 인산(phosphoric acid)을 사용하였으나, pH 2이하의 낮은 pH의 조건은 체내에 주사 시 정맥염 등과 같은 예기치 못한 부작용의 발현 가능성이 있으므로, 실시예 3 내지 5와 같은 조성을 설계하였다. 인산을 제거하였을 때 마이크로에멀젼(microemulsion)이 용이하게 생성됨을 알 수 있었다. 실시예 5의 경우 상기한 바와 같이 화학식 1 화합물을 20mg/mL의 농도로 포함하며, 미용해된 화학식 1 화합물의 침전물이 관찰되지 않으므로 모두 용해된 것으로 판단하였다.
육안으로 관찰하였을 때 산이 들어간 제제의 경우 희석 시 탁도가 높았으나, 산을 제거하는 경우 약간 푸른빛을 보이는 현탁 제제가 만들어졌으며, 전체적으로 산을 사용하지 않은 경우 탁도가 낮게 나타났다.
한편, 대두유의 함량이 증가함에 따라 화학식 1의 침전이 지연되는 대신, 생성된 마이크로에멀젼의 입도가 증가하는 경향이 나타나는 것을 확인하였다. 실시예 5에서 tween 80 및 폴록사머 407의 함량을 증가시키는 경우, 생성된 입자의 크기가 감소하고 봉입되지 않은 화학식 1 화합물이 관찰되지 않음을 확인하였으며, 이를 현미경으로 관찰한 사진을 도 3에 나타내었다.
주사제로 적용시키는 경우, 적합성을 향상시키기 위하여 입자의 평균 입경을 5um 이하로 조절할 수 있다.
실험예 3: 리포좀 제제 안정성 평가
리포좀 제제의 안정성을 평가하기 위하여 실시예 5를 장기 및 가속 조건에서 변화를 관찰하였고, 표 5에 그 조건 및 결과를 나타내었다.
Figure PCTKR2020001033-appb-img-000007
표 5에 나타난 바와 같이, 장기 및 가속에서 3개월 동안 물리, 화학적으로 유의적인 변화가 관찰되지 않았다.
실시예 6: 사이클로 덱스트린 복합체 형성(cyclodextrin complexation)
조성물의 용해도를 더욱 향상시키고자, (2-하이드록시프로필)-베타-사이클로덱스트린((2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin, HP-beta-cyclodextrin)을 이용하여 화학식 1 화합물을 포접시켰다. 구체적인 조성은 표 6과 같고, 제조방법은 도 4에 개략도로 나타내었다.
Figure PCTKR2020001033-appb-img-000008
도 4를 참고하면, 먼저 화학식 1 화합물을 HP-beta-cyclodextrin에 포접시키고 이를 가용화제가 용해되어 있는 용액에 혼합시켜 투명한 액이 될 때까지 교반시켰으며, 최종적으로 pH3.0으로 조절한 후 주사용수(0.9% NaCl용액)로 희석하고, 필터시켰다. 최종적으로 제조된 제제의 화학식 1 화합물 농도는 4mg/mL이며, 침전물이 관찰되지 않는 것으로 보아 모두 용해된 것으로 판단하였다. 이는 4mg/mL 농도의 화학식 1 화합물의 수용해도인 2.5ug/mL에 비하여 대략 1,600배가 향상된 값이다.
실험예 4: 사이클로덱스트린 제제 안정성 평가
사이클로덱스트린 제제의 안정성을 평가하기 위하여, 실시예 6을 장기 및 가속 조건에서 변화를 관찰하였고, 표 7에 장기보관에 따른 결과를, 표 8에 가속보관에 따른 결과를 나타내었다.
Figure PCTKR2020001033-appb-img-000009
Figure PCTKR2020001033-appb-img-000010
표 7에 나타난 바와 같이, 장기 조건에서 성상, 함량, 유연물질 및 pH는 물리, 화학적으로 안정성 시험 기간 동안 유의적인 변화가 관찰되지 않았다. 그러나, 표 8에서 보여주고 있는 바와 같이 성상 및 함량은 유의적인 변화가 관찰되지 않았으나, 유연물질에서 미지의 개개유연물질이 가속 조건에서 1달 경과되었을 때 기준인 0.2% 상회하는 약 0.6%로 증가되었을 뿐만 아니라, pH는 3.25 에서 3.05로 감소되었다. 이는 실시예 6에 의해서 제조된 조성물이 물리화학적으로 불안정함을 보여주고 있는 것이다.
실시예 7 내지 11: 사이클로덱스트린 제제에서 화학식 1 화합물 농도 선정
실시예 6 조성물 내 저분자량 물질 에탄올, PEG 300, 프로필렌글리콜(propylene glycol) 등이 다량 함유되는 경우, 삼투압 증가 및 낮은 pH 3.0으로 인하여 직접 투여 시 추후 정맥염 발생 등과 같은 부작용 발생의 위험성이 있으므로, 저분자량 가용화제를 사용을 배제하고, pH를 중성에 가깝게 하여 조성물을 제조하였다.
하이드록시프로필 베타사이클로덱스트린(HP-beta-cyclodextrin)을 주사용 증류수로 상온에서 교반하여 녹인 후, 60℃로 가온시켜 화학식 1 화합물을 첨가하여 교반 후 포접하였다. 액제 상태의 주사제를 0.22um 여과지를 통하여 멸균 여과시켰다. 여과된 주사액을 유리바이알에 충진 후 -80℃에서 냉각시킨 후, 동결건조하여 제품화하였다. 구체적인 조성은 표 9에 나타내었다.
Figure PCTKR2020001033-appb-img-000011
표 9에 나타난 바와 같이, 16% HP-beta-cyclodextrin에서 화학식 1 화합물의 최고 용해도는 3mg/mL로, 이는 화학식 1 화합물의 수용해도 2.5ug/mL 대비 약 1200배 용해도가 개선된 것이다. 생리식염수에 희석하였을 때 pH는 중성에 가까워 추후 정맥 투여 시, 삼투압 및 pH로 인한 용혈 및 정맥염 등의 발생 위험을 줄일 수 있다.
실험예 6: 베타사이클로덱스트린 포접화합물 안정성 평가
실시예 9에 따른 동결건조 분말을 생리식염수에 희석시킨 후, 보관 조건을 달리하여 72시간 보관한 뒤, 침전 유무를 관찰하였다. 그 결과는 표 10 에 나타내었다.
Figure PCTKR2020001033-appb-img-000012
표 10에 나타난 바와 같이, 보관 조건에 관계없이 화학식 1 화합물의 농도가 일정하게 유지됨을 알 수 있다. 이는 희석 후에도 침전 발생 없이 물리적으로 안정함을 보여주고 있는 것이다.
또한, 정맥 투여(IV infusion)를 위하여 실시예 9를 생리식염수로 50배 및 100배 희석시킨 후, 실온에서 보관 시간에 따라 물리적인 안정성, 즉, 침전 여부를 평가하기 위해서 함량 변화를 관찰하였다. 그 결과는 표 11 및 12에 나타내었다.
Figure PCTKR2020001033-appb-img-000013
Figure PCTKR2020001033-appb-img-000014
또한, 실시예 9를 50배 희석시킨 조성물을 일주일 동안 방치시킨 후, 화학식 1 화합물의 함량을 측정하여 그 결과를 표 13에 나타내었다.
Figure PCTKR2020001033-appb-img-000015
표 11 내지 13에 나타난 바와 같이, 실시예 9를 50배 및 100배 희석 후 실온에서 4시간, 그리고 1주일 동안 방치 후 측정된 함량은 상층, 중층, 하층에서 농도가 균일하게 유지가 되었으며, 이는 희석 후에 재 석출이 발생되지 않고 물리적으로 안정함을 보여주고 있는 것이다.
또한, 실시예 9에 따른 조성물을 유리 바이알에 넣고 밀봉하여 가속조건 (40도/75% 습도)에서 24주까지 안정성 시험을 진행하였으며 그 결과는 표 14에 나타내었다.
Figure PCTKR2020001033-appb-img-000016
표 14에 나타난 바와 같이, 가속 6개월까지 함량 및 유연물질에 있어 유의적인 변화가 관찰되지 않았다. 이를 볼 때 실시예 9에 따른 동결건조 분말은 물리화학적으로 매우 안정함을 알 수 있었다.
실험예 7: MRSA 균주 억제 평가
화학식 1 화합물의 항생제 내성 균주에 대한 억제 효과를 확인하기 위하여, 각각의 환자에서 분리된 황색포도상구균 표현형(phenotype)에 화학식 1 화합물을 처리하여 약물에 대한 감수성을 평가하였다. 항생제 개발을 위한 시험관 시험에서 가장 중요한 결과 값은 MIC 90(전체 박테리아 strain의 90%의 개체의 성장을 억제할 수 있는 최소 억제 농도)라 할 수 있다. 표 15의 결과는 세계적으로 항감염 분야에서 그 권위를 인정받고 있는 미국 허쉬 병원의 아펠바움 박사 실험실에서 메체실린 감수성 균주 약 100종과 현재 사회적으로 문제가 되고 있는 MRSA 균주 100종을 대상으로 현재 시판 중인 대표적인 약제를 대조 약물로 하여 MIC 90 시험을 수행한 결과이다.
Figure PCTKR2020001033-appb-img-000017
표 15에 나타난 바와 같이, 화학식 1 화합물을 처리한 경우, 감수성 균주와 비 감수성 균주인 MRSA에 상관없이 MIC 90 값이 0.25ug/mL임을 확인할 수 있으며, 이는 대조 약물에 비하여 두 배에서 수십 배 우수한 결과임을 알 수 있다. 특히, 이들 균주 중에는 반코마이신(vancomycin)에 내성을 보이는 vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus(VISA)주, 슈퍼 박테리아인 vancomycin-resistant Staphylococcus aureus(VRSA)균주(vancomycin MIC > 64 ug/mL)가 포함되어 있다. 이러한 결과를 볼 때, 종래의 약물인 반코마이신, 테이코플라닌(teicoplanin), 리네졸리드(linezolid), 아목시실린-클라브란네이트(amoxicillin-clavulanate), 답토마이신(daptomycin) 등에 비하여 화학식 1 화합물은 박테리아의 감염에 의해 발생하는 질병 또는 질환의 효과적인 치료제로서 이용될 수 있음을 확인할 수 있다. 구체적으로, 이에 한정되는 것은 아니지만 요로, 호흡기, 피부조직 감염, 패혈증 등을 포함하는 질환과 관련하는 박테리아의 감염증에 대한 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 8: 마우스(mouse) 약동학 및 약역학 분석
화학식 1 화합물에 대하여, 생쥐감염모델을 이용한 약동학/약역학 실험을 진행하였다. 이를 위하여 Staphylococcus aureus ATCC 29213(MSSA, 표준주) 및 13B-382(MRSA, 임상주)를 대상으로 실험을 진행하였다. 배지는 Mueller-Hinton 배지 혹은 Cation-adjusted Mueller-Hinton 배지를 사용하였다. 감수성 검사(최소억제농도: minimum inhibitory concentration (MIC))에는 화학식 1 화합물을 사용하였다.
무균(Specific pathogen free, SPF) 상태의 암컷, 6주령(23 내지 27g)의 ICR mice(오리엔트바이오, 가평, 한국)를 사용하고 동물보호법 및 실험동물에 관한 법률에 의거한 동물실험윤리위원회의 허가를 얻어 그 규정과 절차를 준수하여 실시하였다. 호중구 감소(<100/mm 3) 유도를 위하여 사이클로포스파미드(cyclophosphamide, Bexter, Frankfurt,Germany)를 피하 주사하였다. 실험 전 실험 균주를 Muller Hinton II broth 배지에 24 시간 동안 37℃에서 배양하고 농도를 10 8CFU/mL 맞추었다. 그 후 생리식염수로 희석하여 0.1m을 생쥐의 대퇴부에 접종하였고 (접종량 1.0 x 10 5 CFU/mL), 2시간 경과 후 화학식 1 화합물 경구투여를 시작하였다. 약물 투여는 7.5mg 내지 240mg/kg/일의 용량으로 3, 6, 12 및 24시간마다 투여하였다.
약물 투여 24시간 경과 후, 이산화탄소 가스로 안락사시킨 후 대퇴부를 분리하여 생리식염수에 넣고 균질기(homogenizer, Kinematica AG/ Polytron®)으로 잘게 절단하였다. 이를 10배 희석 후 Muller Hinton II broth 배지에 도말 후 24 시간 동안 37℃에서 배양하고 생균수를 세어 기록하였다. 결과는 log 10CFU/thigh로 표기하였고, 실험실의 생균수 측정 한계는 1 x 10 2CFU/thigh이었다.
항균제 용량 및 용법에 따른 항균 작용과 약동학 결과와 결합하여 항생제의 효과를 판단하기 위한 지표로 T/MIC를 평가하였다. T/MIC 값은 혈중 내에 MIC 값 이상의 농도를 보이는 시간 대비 투여 간격의 비를 나타낸다. 그 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, T/MIC 값이 증가함에 따라서 세균 박멸 효과는 급격하게 증가함을 알 수 있다. 대략 T/MIC 값이 20% 이상일 때 세균이 99.9% 이상 박멸되었다. 또한 AUC 0-24h/MIC및 C max/MIC 값이 증가할 때 MRSA와 같은 세균 박멸 효과도 급격하게 증가함을 확인할 수 있다.
또한, 화학식 1 화합물은 Staphylococcus aureus ATCC 29213 및 13B-382에 대한 MIC 값은 균주에 상관없이 0.25ug/mL임을 확인할 수 있으며, 이 값은 옥사실린(oxacillin, 0.25 및 16ug/mL) 및 반코마이신(vancomycin, 0.5 및 1ug/mL)에 비하여 낮은 값이다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 다중약제 내성을 가지는 박테리아 감염증의 치료에 효과적으로 적용할 수 있음을 확인할 수 있다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 또한, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

1-(3-아미노-2-메틸벤질)-4-(2-티오펜-2-일-에톡시)-1H-피리딘-2-온 또는 이의 염; 및
고분자 화합물, 가용화제 또는 이들의 혼합물
을 포함하는 주사제용 조성물.
제1항에 있어서 상기 조성물 총 중량에 대하여,
상기 1-(3-아미노-2-메틸벤질)-4-(2-티오펜-2-일-에톡시)-1H-피리딘-2-온 또는 이의 염의 함량이 0.1 내지 10중량%이고,
상기 고분자 화합물의 함량이 5 내지 40중량%이고,
상기 가용화제의 함량이 10 내지 30중량%인 것인, 주사제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 고분자 화합물이 덱스트린(dextrin), 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 폴록사머(poloxamer), 덱스트란(dextran), 펙틴(pectin), 펙틴 유도체, 알긴산염, 전분, 히드록시프로필메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose), 히드록시프로필셀룰로오스(hydroxypropylcellulose), 히드록시메틸셀룰로오스(hydroxymethylcellulose), 히드록시에틸셀룰로오스(hydroxylethylcellulose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨(sodium carboxymethyl cellulose), 히드록시프로필메틸셀룰로오스 아세테이트 숙시네이트(hydroxypropyl methylcellulose acetate succinate), 히드록시에틸메틸셀룰로오스(hydroxylethylmethyl cellulose), 구아검(guar gum), 로커스트 콩 검(locust bean gum), 트라가칸타(tragacantha), 카라기난(carrageenan), 아카시아검(acacia gum), 아라비아검(arabicgum), 젤란검(gellangum), 잔탄검(xanthan gum), 젤라틴(gelatin), 카제인(casein), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리비닐 아세탈디에틸 아미노아세테이트(polyvinyl acetaldiethyl aminoacetate), 폴리(부틸 메타크릴레이트,(2-디메틸아미노에틸)메타크릴레이트, 메틸메타크릴레이트) 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide) 및 카보머(carbomer)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인, 주사제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 가용화제가 프로필렌글라이콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글라이콜(polyethylene glycol), 디프로필렌글라이콜(dipropyleneglycol), 디에틸렌글라이콜(diethylene glycol), 디에틸렌글리콜모노에틸에테르(diethylene glycol monoethyl ether), 글리세롤(glycerol), 트윈 80(tween 80), 크레모포어(cremophor) 및 트란스큐톨(transcutol)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인, 주사제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물이 액제, 에멀젼 또는 동결건조분말 형태인 것인, 주사제용 조성물.
1-(3-아미노-2-메틸벤질)-4-(2-티오펜-2-일-에톡시)-1H-피리딘-2-온 또는 이의 염의 화합물을 포함하는 조성물을 제조함에 있어서,
디메틸포름아미드에 4-벤질옥시-1H-피리돈, 2-메틸-3-니트로-벤질클로라이드, 칼륨 t-부톡사이드를 투입하여 가온 하에서 혼합 및 반응시키는 단계;
상기 혼합물을 반응시킨 후 정제수를 추가하고 가온 하에 건조시키는 단계;
상기 건조물을 유기용매에 녹이고 정제수를 추가하여 층 분리시키는 단계;
유기층을 회수하고 여과 및 농축시켜 농축물을 제조하는 단계;
상기 농축물을 재농축시켜 헥산을 추가하여 중간 침전물을 제조하는 단계;
상기 수득된 침전물을 용해, 냉각, 여과 및 건조하여 수득하는 단계;
상기 수득된 건조물을 유기용매에 용해한 후 염화철 육수화물, 활성탄 및 하이드라진 일수화물을 첨가하여 반응시킨 후 냉각 및 여과시켜 수득된 최종 침전물을 건조 후 분쇄시키는 단계를 포함하는 방법으로 상기 화합물을 제조하는 주사제용 조성물의 제조방법.
제6항에 있어서,
산성 물질을 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인, 주사제용 조성물의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 산성 물질이 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 타르타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 옥살산, 푸마르산, 말론산, 말레인산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌설폰산 및 EDTA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인, 주사제용 조성물의 제조방법.
제6항에 있어서,
1) 용매에 고분자 화합물과 1-(3-아미노-2-메틸벤질)-4-(2-티오펜-2-일-에톡시)-1H-피리딘-2-온 또는 이의 염을 첨가하여 용해시키는 단계; 및
2) 상기 1)의 용액을 진공 건조시킨 후 생성된 고체를 미분화하는 단계를 더 포함하는 것인, 주사제용 조성물의 제조방법.
제6항에 있어서,
1) 용매에 고분자 화합물 및 지질계 계면활성제와, 1-(3-아미노-2-메틸벤질)-4-(2-티오펜-2-일-에톡시)-1H-피리딘-2-온 또는 이의 염을 용해시키는 단계;
2) 상기 1)의 용액에 가용화제를 점진적으로 투입시키는 단계; 및
3) 상기 3)의 용액을 원심분리 및 진공 건조한 후 균질화시키는 단계를 더 포함하는 것인, 주사제용 조성물의 제조방법.
제10항에 있어서,
상기 지질계 계면활성제가 대두유를 포함하는 것인, 주사제용 조성물의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 조성물이 고체 분산체, 리포좀 제제 또는 이들 조합의 형태로 제조되는 것인, 주사제용 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 조성물이 박테리아 감염증의 치료용인 것인, 주사제용 조성물.
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