WO2019059709A2 - Ｈｐ1404 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Ｈｐ1404 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to novel antimicrobial peptides derived from Hp1404 peptides and their uses.
  • Bacterial infections are one of the most common and deadly causes of human disease, and unfortunately the abuse of antibiotics has caused antibiotic resistance in bacteria. In fact, the rate at which bacteria respond to new antibiotics is much faster than the rate at which new antibiotic analogs are developed.
  • bacterial species such as Enterococcus faecalis , Mycobacterium tuberculosis , and Pseudomonas aeruginosa , which can pose a life threat, are all known antibiotics Which has been developed to resist.
  • Antibiotic tolerance is a phenomenon distinct from resistance to antibiotics, which was first discovered in the 1970s by Pneumococcus sp. And provided important clues to the mechanism of action of penicillin. Resistant species stop growing but do not die in the presence of the usual concentration of antibiotics. Resistance occurs when antibiotics inhibit the cell wall synthetase because autolytic enzymes such as autolysin do not activate. This suggests that penicillin activates the endogenous hydrolytic enzyme By killing bacteria, bacteria also inhibit their activity, resulting in the survival of antibiotics.
  • antibiotic resistance In terms of mechanism of action, antibiotic resistance consists of two major pathways: the first is the phenotypic resistance that occurs when the growth rate is reduced in all bacteria, the second is the genetic resistance due to mutations in certain bacteria to be.
  • the underlying phenomenon is the down regulation of autolysin activity, which is transient in the case of external resistance to external stimuli and leads to changes in pathways regulating cell hemolysis In the case of genetic resistance in which the mutation has occurred, it is permanent.
  • the most simple genetic resistance is the loss of autolyzine enzyme, which has not been clinically found to have resistance due to deficiency of the suicide enzyme due to various reasons. By controlling the activity of lysine.
  • Bacteria can synthesize peptides and small organic molecules to kill neighboring bacteria. These bacteriocins are structurally classified into three classes. The first is lantibiotics, the second is nonlantibiotics, and the third is secreted by signal peptides. Animals, including insects, also produce naturally occurring peptide antibiotics, which are structurally divided into three groups. The first is the cysteine-rich ⁇ -sheet peptide, the second is the ⁇ -helical amphipathic molecule, and the third is the proline-rich peptide. These antimicrobial peptides are known to play an important role in host defense and innate immune system. These antimicrobial peptides have various structures depending on the amino acid sequence. Of these structures, Hp1404, an antimicrobial peptide found in scorpion, It forms an alpha helical structure.
  • Korean Patent No. 1006321 discloses a peptide having an antibiotic activity extracted from a venomous stripped jellyfish, and a gene encoding the same
  • Korean Patent No. 1440112 discloses a peptide having antibiotic activity extracted from a coprisin antibiotic peptide Quot; as an antibacterial and anti-inflammatory agent has been disclosed, but there is no description of a novel antimicrobial peptide derived from the Hp1404 peptide of the present invention and its use.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned needs, and the inventors of the present invention have found that a novel synthetic peptide having enhanced antimicrobial activity from previously reported antimicrobial peptides is prepared by using the Hp1404 antimicrobial peptide having amphiphilic nature as a template, Hp1404-T1c, Hp1404-T1d and Hp1404-T1e peptides (SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 7) of the synthesized peptide analogs were synthesized by using the parent peptide Hp1404
  • the present inventors completed the present invention by confirming that they exhibit excellent antimicrobial activity against Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and resistant bacteria, and exhibit low cytotoxicity against mouse erythrocytes and human normal cell line (HaCaT).
  • the present invention also provides an antibiotic comprising the above-mentioned antimicrobial peptide as an active ingredient.
  • the present invention also provides a cosmetic composition for antimicrobial use containing the above-mentioned antibacterial peptide as an active ingredient.
  • the present invention also provides an antimicrobial food additive containing the above-mentioned antimicrobial peptide as an active ingredient.
  • the present invention also provides an antimicrobial feed additive containing the above-mentioned antimicrobial peptide as an active ingredient.
  • the present invention also provides an antibiotic pesticide containing the above-mentioned antimicrobial peptide as an active ingredient.
  • the present invention also provides a quasi-drug composition for antimicrobial use containing the above-mentioned antimicrobial peptide as an active ingredient.
  • the present invention also provides an antimicrobial method in an individual comprising administering a pharmaceutically effective amount of said antimicrobial peptide to a subject.
  • novel antimicrobial peptides (Hp1404-T1c, Hp1404-T1d and Hp1404-T1e) of the present invention have excellent antimicrobial activity and low cytotoxicity simultaneously, they are effective for antibiotics, cosmetic compositions, food additives, feed additives, May be useful as an ingredient.
  • Figure 1 shows the formation of secondary structures on various solvents of Hp1404-T1, Hp1404-T1a, Hp1404-T1b, Hp1404-T1c, Hp1404-T1d and Hp1404-T1e (experimental group), which are antimicrobial peptides Hp1404
  • ⁇ was 10 mM sodium phosphate solution and ⁇ was 30 mM sodium dodecyl sulfate solution. And? Denotes 50% trifluoroethanol solution.
  • FIG. 2 shows the results of evaluating the stability of the antimicrobial peptide against trypsin enzyme, and confirming the amount of the remaining peptide by reacting for 2 hours.
  • Fig. 3 shows the result of confirming the biofilm formation inhibitory effect of the standard strains Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa with the SYTO9 dye.
  • Fig. 4 shows the result of analyzing the binding force and binding structure with LPS (lipopolysaccharide), an endotoxin of Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa ).
  • LPS lipopolysaccharide
  • P. aeruginosa an endotoxin of Pseudomonas aeruginosa
  • Figures 5 and 6 show the effect of the Hp1404 peptide and the new peptides Hp1404-T1c, Hp1404-T1d and Hp1404-T1e on S. aureus and Pseudomonas aeruginosa membranes, .
  • FIG. 7 shows the binding capacity of Hp1404 peptide and Hp1404-T1c, Hp1404-T1d, and Hp1404-T1e to the DNA as the internal substance of the bacteria.
  • peptides / DNA ratios of lane 1 to 8 were DNA 1: 1, 1.5: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1.
  • Buforin 2 An antimicrobial peptide that binds to DNA and exhibits antimicrobial activity.
  • Fig. 8 shows a comparison between Hp1404-T1e and Hp1404 peptides, which showed the most excellent effect on the in vivo activity of the antimicrobial peptide.
  • Ciprofloxacin An antibiotic used as a remedy for Pseudomonas aeruginosa.
  • the ninth amino acid is glycine (G) or lysine (K)
  • Hp1404 which is a parent peptide having the amino acid sequence of known known sequence No. 1, is an antimicrobial peptide isolated from Asian forest scorpion (scorpion Heterometris petersii ) and can be produced by a conventional peptide synthesis method known in the art. Specifically, It is not limited. As a method for the above-described synthesis, it is preferable to synthesize the peptide according to a conventional chemical synthesis method of peptides (WH Freeman and Co., Proteins; structures and molecular principles, 1983).
  • a solution-phase peptide solid phase peptide synthesis fractional condensation and F-moc or T-BOC chemistry, and most preferably synthesized by a liquid phase peptide synthesis method.
  • a solution-phase peptide solid phase peptide synthesis fractional condensation and F-moc or T-BOC chemistry, and most preferably synthesized by a liquid phase peptide synthesis method.
  • the antimicrobial peptide of the present invention must satisfy the above i), ii), iii), iv) and v) conditions.
  • the i) condition is that the first and the 14th amino acid glycine (G) and glutamic acid (E), which are the fourth and eighth amino acids, in the parent peptide of SEQ ID NO: 1, (Lysine, K).
  • the condition is that the seventh amino acid Tryptophan (W) in the parent peptide of SEQ ID NO: 1 is replaced by leucine (L), and leucine is an amino acid having a nonpolar aliphatic R group.
  • the conditions should be such that the ninth amino acid in the parent peptide of SEQ ID NO: 1 is either glycine (G) or the lysine (K), a basic amino acid in which glycine has a positive charge.
  • the v) condition is that the 12th amino acid in the parent peptide of SEQ ID NO: 1 is either serine (S) or that the serine is replaced by a basic amino acid lysine (K) with a positive charge.
  • the ninth and twelfth amino acids are not only glycine (G) and serine (S), respectively, but also the ninth and twelfth amino acids are lysine (K) S), the ninth and 12th amino acids may all be lysine (K).
  • the antimicrobial peptide of the present invention preferably has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 7, wherein the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 deletes the first and the 14th amino acid from the parent peptide Hp1404, (K), and the seventh amino acid was substituted with leucine (L), and the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 was designated as Hp1404-T1c from the parent peptide Hp1404 1d and 14th amino acids were deleted, the fourth, eighth and ninth amino acids were substituted with lysine (K), and the seventh amino acid was replaced with leucine (L), and designated as Hp1404-T1d,
  • the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 deletes the 1st and 14th amino acids from the parent peptide Hp1404, and the 4th, 8th, 9th and 12th An antimicrobial peptide in which the amino acid was replaced with lysine (K
  • the antimicrobial peptide is most preferably a peptide consisting of one amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 7, but is not limited thereto.
  • the substitution may be performed to increase or maintain the antimicrobial activity against Gram-negative bacteria and Gram-positive bacteria by lowering the cytotoxicity using the increase / decrease of the electrode.
  • the antimicrobial peptide of the present invention is preferably, but not limited to, an antimicrobial activity against Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria, or antibiotic-resistant bacteria.
  • the Gram-negative bacteria are preferably all Gram-negative bacteria known in the art as Gram-negative bacteria including Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Leptospira, and Rickettsia And more preferably at least one selected from the group consisting of Pseudomonas sp. And Escherichia sp., More preferably Pseudomonas aeruginosa .
  • the present invention is not limited thereto.
  • the Gram-positive bacteria are Gram-positive bacteria including Staphylococcus, Listeria, Corynebacterium, Lactobacillus and Bacillus, which are known in the art It is preferable that all Gram-positive bacteria are present, more preferably Staphylococcus or Listeria, more particularly Staphylococcus aureus , It does not.
  • the antibiotic-resistant microorganism is one or more selected from the group consisting of Pseudomonas aeruginosa , Escherichia coli , and Staphylococcus aureus having antibiotic resistance. Do not.
  • the antibiotics include, but are not limited to, aminoglycosides (aminoglycosides, gentamycin, neomycin, etc.), penicillins (ampicillin, etc.), sulfonamides, beta-lactams (beta-lactam, amoxicillin / Pyruvic acid, phosphomycin, linamomycin, methicillin, quinolone, streptomycin, tetramycin, trimesprimin, vancomycin and the like), chloramphenicol, erythromycin, Family antibiotics.
  • the antimicrobial peptide of the present invention may have low cytotoxicity against mouse and human-derived cells, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides an antibiotic containing the above-mentioned antimicrobial peptide as an active ingredient.
  • the antimicrobial peptide is preferably a peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 7 as described above.
  • Hp1404-T1c SEQ ID NO: 5
  • Hp1404-T1d SEQ ID NO: 6
  • Hp1404-T1e SEQ ID NO: 7
  • the peptide of the present invention can be administered parenterally at the time of clinical administration and can be used in the form of a general pharmaceutical preparation.
  • Parenteral administration may mean administration through an administration route other than oral, such as rectal, intravenous, peritoneal, muscular, arterial, transdermal, nasal, inhalation, ocular and subcutaneous.
  • the antimicrobial peptide of the present invention may further contain one or more active ingredients showing the same or similar functions.
  • the antimicrobial peptide of the present invention can be administered in various formulations of actual parenteral formulations.
  • the antimicrobial peptide is prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, .
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous agents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used as the suspending agent.
  • As a suppository base witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, Liu ling, glycerogelatin and the like can be used.
  • the antimicrobial peptide of the present invention can be used in combination with various carriers that are accepted as medicines such as physiological saline or an organic solvent, and can be used in combination with carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, Antioxidants such as ascorbic acid or glutathione, chelating agents, low molecular weight proteins or other stabilizers can be used as pharmaceuticals.
  • the effective dose of the antimicrobial peptide of the present invention is 0.1 to 2 mg / kg, preferably 0.5 to 1 mg / kg, and can be administered once to three times a day.
  • the present invention also provides a cosmetic composition for antimicrobial use containing the above-mentioned antibacterial peptide as an active ingredient.
  • the antimicrobial peptide is preferably a peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 7 as described above. Since the peptide exhibits a strong antimicrobial activity and exhibits low cytotoxicity against human-derived cells, the antimicrobial peptide of the present invention can be usefully used as an effective ingredient of a cosmetic composition.
  • the cosmetic composition of the present invention includes components commonly used in cosmetic compositions in addition to the above-mentioned antimicrobial peptides, and includes customary adjuvants such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and fragrances, and carriers.
  • the peptide of the present invention may be added to the cosmetic composition usually contained in an amount of 0.1 to 50% by weight, preferably 1 to 10% by weight.
  • the cosmetic composition of the present invention can be prepared into any of the formulations conventionally produced in the art and can be used in the form of solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, , Oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, but is not limited thereto. More specifically, it can be manufactured in the form of a flexible lotion (skin), a nutritional lotion (milk lotion), a nutritional cream, a massage cream, an essence, an eye cream, a cleansing cream, a cleansing foam, a cleansing water, a pack, a spray or a powder .
  • the formulation of the present invention is a paste, a cream or a gel, an animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tragacantha, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide .
  • lactose When the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component.
  • a spray in particular, / Propane or dimethyl ether.
  • a solvent, a dissolving agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, and examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, , 3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan fatty acid esters.
  • the formulation of the present invention is a suspension
  • a carrier such as water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tragacantha, etc.
  • a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester
  • the carrier component is selected from aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters.
  • the present invention also provides an antimicrobial food additive containing the above-mentioned antimicrobial peptide as an active ingredient.
  • the antimicrobial peptide is preferably a peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 5 to 7, wherein the peptide exhibits a strong antimicrobial activity while exhibiting low cytotoxicity against human-derived cells
  • the antimicrobial peptide of the present invention can be usefully used as an effective ingredient of a food additive.
  • the peptide of the present invention When the peptide of the present invention is used as a food additive, the peptide may be added as it is or may be used together with other food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined depending on the purpose of use thereof.
  • the peptide of the present invention is added in an amount of 15 parts by weight or less, preferably 10 parts by weight or less, based on the raw material.
  • the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of stability, the active ingredient may be used in an amount in the above range.
  • foods to which the above substances can be added include dairy products such as meat, sausage, bread, chocolate, candy, snack, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, drinks, tea, Alcoholic beverages, and vitamin complexes, and includes foods in a conventional sense.
  • the present invention also provides an antimicrobial feed additive comprising the above-mentioned antimicrobial peptide as an active ingredient.
  • the antimicrobial peptide is preferably a peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 7 as described above. Since the peptide exhibits a strong antimicrobial activity and exhibits low cytotoxicity against human-derived cells, the antibiotic peptide of the present invention can be usefully used as an effective ingredient of a feed additive.
  • the feed composition of the present invention has the effect of replacing existing antibiotics and inhibiting the growth of harmful food pathogenic bacteria to improve the health condition of the animal, improve the weight gain and meat quality of the livestock, increase the milk yield and immunity.
  • the feed composition of the present invention can be produced in the form of a fermented feed, a compound feed, a pellet form, a silage reed, or the like.
  • the fermented feed can be prepared by fermenting an organic material by adding various microorganism groups or enzymes other than the peptide of the present invention, and the compound feed can be prepared by mixing various kinds of general feed and the peptide of the present invention.
  • the pellet-shaped feed can be produced by applying heat and pressure to the compound feed or the like in a pelletizer, and the silage can be produced by fermenting a chrysanthemum feed as a microorganism.
  • the wet fermented feed is collected and transported organic substances such as food wastes, and the mixture is mixed at a certain ratio with sterilization process and a certain amount of water for controlling moisture, and fermented for 24 hours or more at a temperature suitable for fermentation so that the moisture content is about 70% And the like.
  • the fermented dried feed can be prepared by adjusting the wet fermented feed so that the moisture content is 30% to 40%.
  • the present invention also provides a preservative composition containing the above-mentioned antimicrobial peptide as an active ingredient, a pesticide for antimicrobial use, and a quasi-drug composition for antimicrobial use.
  • the antimicrobial peptide is preferably a peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 7 as described above. Since the peptide exhibits strong antimicrobial activity and exhibits low cytotoxicity against human-derived cells, the antimicrobial peptide of the present invention can be effectively used as an effective ingredient of a bio-pesticide for antibiosis, a preservative composition, and a quasi-drug composition.
  • the preservative composition includes a cosmetic preservative or a pharmaceutical preservative.
  • Preservatives, cosmetic preservatives, and pharmaceutical preservatives of foods mentioned above are additives used to prevent deterioration, decay, discoloration and chemical change of medicines, including antiseptics and antioxidants, which inhibit the growth of microorganisms such as bacteria, fungi and yeast, And functional antibiotics such as inhibiting the growth of microorganisms or sterilizing microorganisms in pharmaceuticals.
  • Ideal conditions for such preservative compositions should be non-toxic and effective in trace amounts.
  • the peptide of the present invention may be added as it is or may be used in combination with other quasi-drugs or quasi-drugs, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the amount of the active ingredient to be mixed can be appropriately determined depending on the purpose of use.
  • the quasi-drug composition of the present invention may be a disinfectant cleaner, a shower foam, a gagrin, a wet tissue, a detergent soap, a hand wash, a humidifier filler, a mask, an ointment agent, a patch or a filter filler.
  • the present invention also provides an antimicrobial method in an individual comprising the step of administering to said individual a pharmaceutically effective amount of said antimicrobial peptide.
  • the subject may be, but is not limited to, mammals other than humans.
  • the inventors of the present invention have synthesized an amino acid sequence of Hp1404 which is the maternal peptide described in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 according to Merrifield, RB., J. Am. Chem. Soc., 85, 2149, The first and 14th amino acid residues in the sequence were deleted. Then, the fourth amino acid residue was substituted with lysine (K), the seventh amino acid residue was replaced with leucine (L), and the eighth, ninth and 12th amino acid residues were replaced with lysine (K) Table 1).
  • the peptide of which the carboxyl terminal of the peptide designed in the present invention is in the form of NH 2 was used as a starting material for Rink Amide MBHA-Resin, and the peptide having an OH-type carboxyl terminal was Fmoc ( 9-fluorenylmethoxycarbonyl) -amino acid-Wang Resin was used as a starting material.
  • the extension of the peptide chain by coupling of Fmoc-amino acid was performed by DCC (N-hydroxybenzo trizole (HOBt) -dicyclo-hexycarbodiimide) method. After the Fmoc-amino acid of the amino terminal of each peptide was coupled, the Fmoc group was removed with NMP (20% piperidine / N-methyl pyrolidone) solution, washed several times with NMP and DCM (dichoromethane) .
  • NMP N-hydroxybenzo trizole
  • the synthetic peptide was hydrolyzed with 6N hydrochloric acid at 110 ° C, and the residue was concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in 0.02N hydrochloric acid and the amino acid composition was measured with an amino acid analyzer (Hitachi 8500 A). To confirm the purity and molecular weight of the peptide, Respectively.
  • the peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 was synthesized with a purity of 95% or more and its molecular weight was confirmed to have the same molecular weight as the expected molecular weight.
  • sequence, molecular weight and retention time of the peptides synthesized in the present invention Peptide name Amino acid sequence SEQ ID NO: Retention time Molecular Weight Hp1404 GILGKLWEGVKSIF-NH 2 One 36.251 1545.7 Hp1404-T1 ILGKLWEGVKSI-NH 2 2 23.176 1342.2 Hp1404-T1a ILKKLWEGVKSI-NH 2 3 20.756 1413.5 Hp1404-T1b ILKKLLEGVKSI-NH 2 4 20.875 1340.2 Hp1404-T1c ILKKLLKGVKSI-NH 2 5 17.643 1338.0 Hp1404-T1d ILKKLLKKVKSI-NH 2 6 17.741 1409.8 Hp1404-T1e ILKKLLKKVKKI-NH 2 7 16.002 1451.0 Amino acid number One 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Hp1404 G I L G K L W E G V K
  • MIC Minimal Inhibitory Concentration
  • the strains described in the following Table 2 were purchased and cultured in the mid-log phase in a medium having a composition suitable for each strain.
  • the cells were diluted to a concentration of 2 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ l, Were prepared on a titration plate (Nunc, USA).
  • Hp1404-T1, Hp1404-T1a, Hp1404-T1b, Hp1404-T1c, Hp1404-T1d or Hp1404-T1e peptides synthesized in Example 1 were serially diluted 1/2 times in each well , followeded by incubation at 37 ° C for 18 hours, and the absorbance was measured at a wavelength of 600 nm using a microtiter plate reader (Merck Elisa reader, Germany) to determine the MIC value for each strain.
  • the maternal peptide, Hp1404 was used as a control.
  • Hp1404-T1c, Hp1404-T1d, and Hp1404-T1e peptides exhibited similar or excellent antimicrobial activity against Staphylococcus aureus and Pseudomonas erucinosa, as compared with the parent peptide Hp1404 Respectively.
  • the present inventors measured the biofilm inhibition concentration of peptides in which the cells were not cleaved.
  • microbes in which the biofilm is well formed among the strains described in Table 2 were cultured in each medium to the mid-log phase, and then diluted to a cell concentration of 5 x 10 4 cells / Plate (SPL) was inoculated. Then, Hp1404, Hp1404-T1c, Hp1404-T1d, or Hp1s404-T1e peptide synthesized in Example 1 was diluted with 10 mM of sodium phosphate (pH 7.2) And then cultured at 37 ° C for 24 hours.
  • SPL sodium phosphate
  • the supernatant was completely removed, fixed with 100% methanol for 15 minutes, stained with crystal violet staining solution for 1 hour, washed 3 times, dissolved with 95% ethanol, and absorbance at a wavelength of 595 nm using a microtiter plate reader And the minimum inhibitory concentration of biofilm for each strain was determined.
  • Hp1404-T1c, Hp1404-T1d, and Hp1404-T1e peptides exhibited similar or strong biofilm inhibitory activities in all strains as compared with the control group Hp1404 as shown in Table 4 below.
  • RBCs (Balb / c, 6 weeks old, female) were diluted with PBS (pH 7.0) to a concentration of 8%, and Hp1404, Hp1404-T1, Hp1404-T1a, Hp1404-T1b, Hp1404-T1c, Hp1404 -T1d or Hp1404-T1e peptide at a concentration of 6.25, 12.5, 25.0, 50.0, 100.0 and 200.0 ⁇ M / well, respectively, and reacted at 37 ° C for 1 hour. Then, the amount of hemoglobin contained in the supernatant obtained by centrifugation at 1,000 x g was measured by measuring the absorbance at a wavelength of 414 nm.
  • the absorbance of the supernatant was measured after treatment with 1% Triton X-100 (Sigma, USA) at 37 ° C for 1 hour, and the absorbance value was measured using a red blood cell hemolytic activity 100 %, Hemolysis of each peptide was calculated using the following equation (1).
  • absorbance A represents the absorbance of the reaction solution treated with each peptide measured at a wavelength of 414 nm
  • absorbance B represents the absorbance of the reaction solution treated with PBS measured at a wavelength of 414 nm
  • the absorbance of the reaction solution treated with 1% Triton X-100 measured at a wavelength of 414 nm is shown.
  • Hp1404 peptide as a maternal peptide showed 100% hemolytic action on rat erythrocytes when treated with 200 ⁇ M concentration, whereas Hp1404-T1, Hp1404-T1a, Hp1404-T1b , Hp1404-T1c, Hp1404-T1d, and Hp1404-T1e peptides did not exhibit destructive ability against erythrocytes even at a concentration of 200 ⁇ M. Thus, it was confirmed that the antimicrobial peptide of the present invention had reduced cytotoxicity compared to the parent peptide.
  • Hemolytic activity of antimicrobial peptides % Erythropoietin activity (peptide concentration, ⁇ M) 200 100 50 25 12.5 6.25 Hp1404 100 92.64 55.41 11.01 2.16 0.01 Hp1404-T1 0.53 0 0 0 0 0 Hp1404-T1a 0.55 0 0 0 0 Hp1404-T1b 1.05 0 0 0 0.19 0.07 Hp1404-T1c 0.65 0 0 0 0 0 Hp1404-T1d 0.08 0 0 0 0 Hp1404-T1e 0.55 0.15 0 0.41 0.28 0.10
  • cytotoxicity was measured using a human keratinocyte line (HaCaT cell line, Dr. NE Fusenig, Heidelberg, Germany).
  • HaCaT cells cultured in DMEM medium containing 10% FBS Fetal Bovine Serum
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • Hp1404, Hp1404-T1, Hp1404-T1a , Hp1404-T1b, Hp1404-T1c, Hp1404-T1d or Hp1404-T1e peptides were treated at a concentration of 6.25, 12.5, 25.0, 50.0, 100.0 or 200.0 ⁇ M / well respectively and reacted in a 5% CO 2 incubator for 24 hours .
  • HaCaT cells showed cell viability of 0% when 200 ⁇ M of maternal Hp1404 peptide was treated, confirming that Hp1404 peptide exhibits very high cytotoxicity.
  • Hp1404-T1a, Hp1404-T1b, Hp1404-T1c and Hp1404-T1d peptides showed 30.67%, 31.95%, 39.87% and 18.35% cell viability at a concentration of 200 ⁇ M, respectively.
  • the Hp1404-T1 and Hp1404-T1e peptides showed 100% cell viability at a concentration of 200 ⁇ M, indicating that they showed almost no cytotoxicity compared to the parent Hp1404 peptide.
  • Cytotoxicity analysis of antimicrobial peptide % Cell viability (peptide concentration, mu M) 200 100 50 25 12.5 6.25 Hp1404 0 0.11 30.48 100 100 Hp1404-T1 100 100 100 100 100 100 Hp1404-T1a 30.67 100 100 100 100 100 Hp1404-T1b 31.95 80.86 100 100 100 Hp1404-T1c 39.87 48.56 51.28 100 100 100 Hp1404-T1d 18.35 34.56 33.09 38.90 53.93 100 Hp1404-T1e 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
  • the peptide prepared by the method of Example 1 was used to measure the circular dichroism method to determine whether the secondary structure, the? -Helical structure, was induced.
  • Hp1404, Hp1404-, and Hp1404 were added to a solution of 10 mM sodium phosphate (pH 7.4), 50% trifluoroethanol, or 30 mM sodium dodecyl sulfate (SDS)
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • a jasco 810 spectrophotometer was fixed at 25 ⁇ ⁇ to measure the original color scheme spectrum.
  • the ⁇ -helical structure calculation formula for the original color scheme spectrum is as follows.
  • the antimicrobial peptide of the present invention forms an a-helical structure in the SDS and TFE solution similar to the microbial bacterial membrane (Fig. 1).
  • RP-HPLC reverse-phase HPLC
  • the inhibition of biofilm formation was visually observed with a fluorescence microscope using the peptide prepared by the method of Example 1 above.
  • Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa were selected as standard strains, and the respective peptides were treated with bacteria at a concentration of 1 x or 2 x MBIC (Minimum Biofilm Inhibitory Concentration), and cultured for 24 hours Respectively.
  • the degree of biofilm formation was then observed with a SYTO TM 9 staining reagent (green) for 30 minutes followed by microscopic observation.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the LPS used in the present invention was isolated from Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa ). 0 to 100 ⁇ g / ml of lipid polysaccharide was diluted in 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.2) and reacted with each peptide at 1 ⁇ and 2 ⁇ MIC concentrations, and 2 ⁇ 10 5 CFU / ml Of bacteria. Absorbance was measured at 600 nm to confirm the binding force with the peptide. In addition, 0.1% lipid polysaccharide and 40 ⁇ M peptide were reacted in an incubator and secondary structure was measured by CD spectroscopy.
  • each antimicrobial peptide binds to the LPS at a concentration of 50 ⁇ g / ml at the concentration of 2 ⁇ MIC and does not act on the bacteria.
  • Hp1404-T1e, Hp1404-T1d, Hp1404-T1c, Hp1404 And it was confirmed that LPS binds well and does not act on bacteria. Further, the binding structure of LPS and peptide was confirmed through a circular dichroism polarizer, and it was found that ⁇ -helical structure was formed (FIG. 4).
  • Example 10 Action mechanism for bacterial outer membrane and inner membrane
  • NPN N-Phenyl-1-naphthylamine fluorescent dye was used to confirm whether each antimicrobial peptide acts on the outer membrane of the standard strain Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa ). NPN accumulates in the bacterial membrane and does not fluoresce, but when the cell membrane is damaged and the hydrophobic part is exposed, it shows fluorescent light. After culture for each strain in TSB with NB medium, OD 600 value in 5mM HEPES buffer solution is prepared such that 0.2.
  • the cells were incubated with a 1 ⁇ , 2 ⁇ , or 4 ⁇ concentration of the peptide with the lowest inhibitory concentration and 0.1% Triton X-100 Respectively.
  • DiSC 3 -5 (3,3'-Dipropylthiadicarbocyanine Iodide) was used to confirm whether it acts on the bacterial inner membrane. DiSC 3 -5 is accumulated in the cell membrane, but when the cell membrane is damaged, it is released and fluorescence appears. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa were cultured in NB medium and then washed in 5 mM HEPES buffer containing 20 mM glucose. Then, 5 mM HEPES buffer containing 20 mM glucose and 0.1 M potassium chloride was added to OD 600 Prepare it to have a value of 0.05.
  • Hp1404-T1c, Hp1404-T1d, and Hp1404 which showed antimicrobial activity similar to the parent peptide and showed no cytotoxicity even at high concentration, to confirm whether the peptide prepared by the method of Example 1 acts on the bacterial membrane -T1e peptides were analyzed by flow cytometry.
  • the minimum inhibitory concentration (MIC) of the maternal Hp1404 peptide or the Hp1404-T1c, Hp1404-T1d and Hp1404-T1e peptides was 2-fold treated with Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa, Lt; 0 > C. Then, the supernatant was removed using a centrifuge (10,000 rpm), and then stained with Propidium iodide (PI) at a concentration of 10 ⁇ g / ml for 30 minutes at 4 ° C.
  • PI Propidium iodide
  • Hp1404 peptide, Hp1404-1c, Hp1404-T1d and Hp1404-T1e peptides showed damage to the bacterial membrane, while fluorescence signals shifted to the right, while Hp1404-T1d and Hp1404-T1e peptides did not damage the bacterial membrane (Fig. 6).
  • the novel peptide of the present invention can deduce that the mechanism of action of the parent peptide and the bacterial membrane is different.
  • plasmid DNA plasmid DNA
  • pRSETB plasmid DNA
  • the reaction was carried out at 37 ° C for 10 minutes. Respectively. Buforin 2, an antimicrobial peptide that binds to bacterial DNA and exhibits antibacterial activity, was used as a positive control.
  • Hp1404 and Hp1404-T1c peptides did not bind to DNA at all, and Hp1404-T1d and Hp1404-T1e showed binding to DNA (FIG. 7).
  • Hp1404 a maternal peptide that acts on a bacterial membrane due to the substitution or deletion of some amino acid residues
  • Hp1404-T1d and Hp1404-T1e peptides bind to DNA as an internal substance of bacteria, resulting in antibacterial activity .
  • Hp1404-T1e which has the highest antimicrobial activity among the peptides prepared by the method of Example 1, was measured.
  • 1034 strains of Pseudomonas aeruginosa strains were selected and tested by washing the strains three times with PBS buffer. Ciprofloxacin antibiotics were used as controls.
  • BALB / c mice (6 weeks old) were shaved thoroughly and scarred to a certain size. 2 x 10 < 5 > CFU / ml of Pseudomonas aeruginosa strain 1034 (20 ml) was intracutaneously injected into the wound area.
  • peptides and antibiotics were prepared at concentrations of 0.1 mg / ml and 0.2 mg / ml, respectively, and injected into the blood and observed daily. Skin tissues were sampled on each day and plated on NB solid medium. The cultured medium was incubated in an incubator for 18 hours, and the number of grown colonies was counted and expressed as%.
  • mice infected with the bacteria only remained almost unchanged in wound area until day 7, and the number of colonies showed up to 60% in the tissues sampled on the fifth day.
  • mice treated with Hp1404-T1e after bacterial infection showed wound healing effects depending on the peptide treatment concentration.
  • the number of colonies identified in the sampled tissues was 40% (0.1 mg / ml treatment condition) and 20 % (0.2 mg / ml treatment condition), and it was found that it was considerably reduced as compared with a mouse infected with only bacteria.
  • mice treated with ciprofloxacin after bacterial infection did not recover any wound, and the number of colonies was also found to be higher than that of peptide treatment (Fig. 8). From the above results, it was found that the Hp1404-T1e peptide exhibits an antimicrobial effect superior to the antibiotic even in vivo.
  • tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.
  • the capsules were filled in gelatin capsules according to the conventional preparation method of capsules.
  • Each component was added to purified water in accordance with the usual liquid preparation method and dissolved, and the lemon flavor was added in an appropriate amount. Then, the above components were mixed, and purified water was added thereto. The whole was adjusted to 100 ml with purified water, And sterilized to prepare a liquid preparation.
  • the peptide of the present invention was dissolved in an appropriate volume of injectable sodium chloride BP.
  • the pH of the resulting solution was adjusted to pH 7.6 using diluted hydrochloric acid BP, and the volume was adjusted using main sodium chloride BP and mixed thoroughly.
  • the solution was filled in 5 ml type I ampoule made of transparent glass, sealed in the upper lattice of the air by dissolving the glass, and sterilized with a high pressure steam sterilizer at 120 ⁇ for 15 minutes or longer to prepare an injection solution.
  • the softening longevity water for antimicrobial use containing the peptide of the present invention may be formulated as described in Table 7 below and may be manufactured according to a conventional manufacturing method in the field of cosmetics.
  • Softening longevity composition ingredient Content (% by weight)
  • the peptide of the present invention 0.1 to 30 1,3-butylene glycol 3.0 glycerin 5.0 Polyoxyethylene (60) Hardened castor oil 0.2 ethanol 8.0 Citric acid 0.02 Sodium citrate 0.06 antiseptic a very small amount Spices a very small amount Purified water To 100
  • the antifungal nutritional lotion containing the peptide of the present invention can be prepared as described in Table 8 below and can be produced according to a conventional manufacturing method in the field of cosmetics.
  • Nutritional Lotion Composition ingredient Content (% by weight)
  • the peptide of the present invention 0.1 to 30 Squalane 10.0 Polyoxyethylene sorbitan monooleate 2.0 Nursery oil 0.1 to 30 1,3-butylene glycol 8.0 glycerin 5.0 Polyoxyethylene (60) Hardened castor oil 0.2 ethanol 8.0 Citric acid 0.02 Sodium citrate 0.06 antiseptic a very small amount Spices a very small amount Purified water To 100
  • an antimicrobial essence containing the peptide of the present invention may be formulated as described in Table 9 below and may be produced according to a conventional method for manufacturing in the field of cosmetics.
  • the peptide of the present invention 0.1 to 30 Sitosterol 1.7
  • the polyglyceryl 2-oleate 1.5 Ceramide 0.7 Setares-4 1.2 cholesterol 1.5 Dicetyl phosphate 0.4
  • Concentrated glycerin 5.0 Carboxyvinyl polymer 0.2 Xanthan gum 0.2 antiseptic a very small amount Spices a very small amount Purified water To 100
  • an antimicrobial cleanser cleaning foam
  • it may be formulated as described in Table 10 below and may be manufactured according to a conventional manufacturing method in the field of cosmetics.
  • composition of cleanser ingredient Content (% by weight)
  • the peptide of the present invention 0.1 to 30 Sodium N-acylglutamate 20.0 glycerin 10.0 PEG-400 15.0 Propylene glycol 10.0 POE (15) oleyl alcohol ether 3.0 Laurin derivative 2.0 Methyl paraben 0.2 EDTA-4Na 0.03 Spices 0.2 Purified water To 100
  • an antimicrobial nutrition cream containing the peptide of the present invention is prepared according to a conventional method in the field of cosmetics as shown in Table 11 below.
  • Nutritional cream composition ingredient Content (% by weight)
  • the peptide of the present invention 0.1 to 30 vaseline 7.0
  • antimicrobial massage cream containing the peptide of the present invention it is prepared according to the conventional manufacturing method in the field of cosmetics as shown in Table 12 below.
  • composition of massage cream ingredient Content (% by weight)
  • the peptide of the present invention 0.1 to 30 Propylene glycol 6.0 glycerin 4.0 Triethanolamine 0.5 Wax 2.0 Tocophenylacetate 0.1 Polysorbate 60 3.0 Sorbitan sesquioleate 2.5 Cetearyl alcohol 2.0 Liquid paraffin 30.0 Xanthan gum 0.5 Spices, preservatives a very small amount Purified water To 100
  • the preparation is carried out according to a conventional method in the field of cosmetics as shown in Table 13 below.
  • the peptide of the present invention 0.1 to 30 Propylene glycol 2.0 glycerin 4.0 Polyvinyl alcohol 10.0 ethanol 7.0 Paiji-40 Hydrogenated Castor Oil 0.8 Triethanolamine 0.3 Spices, preservatives a very small amount Purified water To 100

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Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Hp1404 펩타이드에서 i) 1번째 및 14번째 아미노산이 결실되고, ii) 4번째 및 8번째 아미노산이 리신(lysine, K)으로 치환되고, iii) 7번째 아미노산이 루신(Leucine, L)으로 치환되고, iv) 9번째 아미노산이 글리신(Glycine, G)이거나 또는 리신(K)으로 치환되고, v) 12번째 아미노산이 세린(Serine, S)이거나 또는 리신(K)으로 치환된 항균 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

Ｈｐ1404 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도
본 발명은 Hp1404 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
세균 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중 하나인데, 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 세균의 항생제 저항성(resistance)이 야기되었다. 실제로, 세균이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제의 유사체가 개발되는 속도보다 훨씬 더 빨리 일어난다. 예를 들면, 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다.
항생제 내성(tolerance)은 항생제에 대한 저항성(resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스(Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다. 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재하에서는 성장을 멈추지만 죽지는 않는다. 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신(autolysin) 등과 같은 세균의 자가분해(autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데, 이러한 사실은 페니실린이 내인성 가수분해 효소(endogenous hydrolytic enzyme)를 활성화시킴으로써 세균을 죽이며 세균은 또한 이들의 활성을 억제해서 항생제 치료시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.
세균이 여러 가지 항생제에 대해 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 이는 내성 세균을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다. 아울러, 내성이 생기는 것은 항생제에 대한 저항성이 생기게 되는 선행조건이라고 간주되는데 이것은 항생제 치료에도 불구하고 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재 하에서도 계속 성장하게 된다. 실제로 모든 저항성을 보이는 세균들은 내성도 가지고 있는 것으로 알려져 있으므로, 이러한 항생제 저항성을 가지는 세균을 죽일 수 있는 신규한 항생제의 개발이 필요하다.
작용 기작의 측면에서 항생제 내성은 크게 두가지 경로로 이루어지는데, 첫 번째는 모든 세균에 있어서 성장속도가 감소할 때 일어나는 외형적(phenotypic) 내성이며, 두 번째는 특정 세균에서 일어나는 돌연변이에 의한 유전적인 내성이다. 두 가지 경우 모두 기본적인 현상은 오토라이신 활성의 하부조절(down regulation)이 일어난다는 것인데, 이러한 하부조절은 외부자극에 대한 외형적인 내성일 경우에는 일시적이며, 세포 용혈을 조절하는 경로의 변화를 야기하는 돌연변이가 일어난 유전적인 내성의 경우에는 영구적이다. 가장 간단한 유전적인 내성의 경우는 오토라이신 효소에 결손이 일어나는 것인데, 확실하지 않은 여러 가지 이유로 인해서 이러한 자살 효소의 결손에 의해 내성을 가지는 균주가 임상적으로 발견된 적은 없으며, 오히려 임상적인 내성은 오토라이신의 활성을 조절함으로써 이루어진다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 항생제에 저항성을 나타내는 세균들과 싸우기 위해서는 새로운 항생제의 개발이 필요하며, 아울러 오토라이신 활성과는 독립적으로 작용하는 새로운 항생제의 개발이 필요하다.
한편, 세균은 펩타이드나 작은 유기물 분자들을 합성해서 이웃하는 세균을 죽일 수 있는데, 이러한 박테리오신(bacteriocin)들은 구조적으로 세 부류로 분류된다. 첫 번째는 란티바이오틱스(lantibiotics)이며, 두 번째는 비란티바이오틱스(nonlantibiotics)이고, 세 번째는 신호 펩타이드(signal peptide)에 의해 분비되는 것들이다. 곤충을 포함하는 동물들 역시 자연적으로 생성되는 펩타이드 항생제를 생산하는데, 상기 펩타이드 항생제는 구조적으로 세 개의 그룹으로 나누어진다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한(cysteine-rich) β-쉬트(sheet) 펩타이드이고, 두 번째는 α-나선형(helical)의 양친화성 분자이며, 세 번째는 프롤린이 풍부한(proline-rich) 펩타이드이다. 이들 항균 펩타이드들은 숙주방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있는데, 이러한 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 가지며, 이들 구조 중 전갈(scorpion)에서 발견된 항균 펩타이드인 Hp1404는 양친화성 알파 나선형 구조를 형성한다.
한편, 한국등록특허 제1006321호에는 '줄무늬감탕벌 독액으로부터 추출한 항생제 활성을 갖는 펩타이드와 이를 코딩하는 유전자'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1440112호에는 '애기뿔 소똥구리로부터 분리된 coprisin 항생 펩타이드의 항균, 항염제로서의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 Hp1404 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 기존에 보고된 항균 펩타이드로부터 항균활성이 증진된 신규한 합성 펩타이드를 제조하기 위하여 양친화성을 갖는 Hp1404 항균 펩타이드를 주형으로 하여, 6종의 Hp1404 유사체(서열번호 2 내지 서열번호 7)를 합성하였고, 상기 합성된 펩타이드 유사체 중, Hp1404-T1c, Hp1404-T1d 및 Hp1404-T1e 펩타이드(서열번호 5 내지 서열번호 7)가 모체 펩타이드인 Hp1404에 비해 그람 양성균 및 그람 음성균 및 내성균에 대한 항균 활성이 우수하며, 쥐 적혈구 및 인간 정상 세포주(HaCaT)에 대하여 낮은 세포독성을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 i) 1번째 및 14번째 아미노산이 결실되고, ii) 4번째 및 8번째 아미노산이 리신(lysine, K)으로 치환되고, iii) 7번째 아미노산이 루신(Leucine, L)으로 치환되고, iv) 9번째 아미노산이 글리신(Glycine, G)이거나 또는 리신(lysine, K)으로 치환되고, v) 12번째 아미노산이 세린(Serine, S)이거나 또는 리신(lysine, K)으로 치환된 항균 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 식품 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 사료 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 생물 농약을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 의약외품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 항균 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 항균 방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 항균 펩타이드(Hp1404-T1c, Hp1404-T1d 및 Hp1404-T1e)는 우수한 항균 활성와 동시에 낮은 세포 독성을 가지고 있으므로, 항생제, 화장료 조성물, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 생물 농약 및 의약외품 등의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 항균 펩타이드인 Hp1404(대조군) 및 Hp1404 유사체 신규 펩타이드인 Hp1404-T1, Hp1404-T1a, Hp1404-T1b, Hp1404-T1c, Hp1404-T1d 및 Hp1404-T1e(실험군)의 다양한 용매 상에서 2차 구조 형성 여부를 확인한 결과로, ○은 10mM 인산 나트륨 용액, □은 30mM 황산 도데실 나트륨 용액. 및 △은 50% 트리플루오로에탄올 용액을 의미한다.
도 2는 항균 펩타이드의 트립신 효소에 대한 안정성을 평가한 것으로 2시간동안 반응시켜 남은 펩타이드의 양을 확인한 결과이다.
도 3은 표준균주 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 생물막(biofilm) 형성 억제 효과를 SYTO9 염색약으로 확인한 결과이다.
도 4는 슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa)의 내독소인 LPS(lipopolysaccharide)와의 결합력과 결합구조를 분석한 결과이다.
도 5와 6은 대조군인 Hp1404 펩타이드와 신규 펩타이드 Hp1404-T1c, Hp1404-T1d 및 Hp1404-T1e의 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) 및 슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa) 막에 대한 작용 여부를 확인한 결과이다.
도 7은 대조군인 Hp1404 펩타이드 및 신규 펩타이드인 Hp1404-T1c, Hp1404-T1d 및 Hp1404-T1e의 박테리아 내부 물질인 DNA에 대한 결합능을 확인한 결과로, lane 1번부터 8번까지 펩타이드/DNA 비율은 각각 DNA 단독, 0.25:1, 0.5:1, 1:1, 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1 이다. Buforin 2: DNA에 결합하여 항균 활성을 나타내는 항균 펩타이드.
도 8은 항균 펩타이드의 생체 내의 활성에 관한 실험으로 가장 뛰어난 효과를 보였던 Hp1404-T1e와 대조군인 Hp1404 펩타이드를 비교한 결과로, 슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa)에 감염된 마우스 피부에 항균활성을 나타내는 정도를 비교한 결과이다. 시프로플록사신(Ciprofloxacin): 슈도모나스 에루지노사의 치료제로 쓰이는 항생제.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
서열번호 1의 아미노산 서열에서
i) 1번째 및 14번째 아미노산이 결실되고,
ii) 4번째 및 8번째 아미노산이 리신(lysine, K)으로 치환되고,
iii) 7번째 아미노산이 루신(Leucine, L)으로 치환되고,
iv) 9번째 아미노산이 글리신(Glycine, G)이거나 또는 리신(lysine, K)으로 치환되고,
v) 12번째 아미노산이 세린(Serine, S)이거나 또는 리신(lysine, K)으로 치환된 항균 펩타이드를 제공한다.
기존의 알려진 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 모체 펩타이드인 Hp1404는 아시안 포레스트 전갈(scorpion Heterometrus petersii)에서 분리된 항균 펩타이드로 당업계에 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법에 의해 제조가 가능하며, 제조 방법에 특별히 한정되지 않는다. 상기 합성을 위한 방법으로 당업계의 통상적인 펩타이드의 화학적 합성 방법(W. H. Freeman and Co., Proteins; structures and molecular principles, 1983)으로 합성하는 것이 바람직하며, 구체적으로는 액상 펩타이드 합성법(solution-phase peptide synthesis), 고상 펩타이드 합성법(solid-phase peptide synthesis), 단편 응축법 및 F-moc 또는 T-BOC 화학법으로 합성하는 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로는 액상 펩타이드 합성법으로 합성하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항균 펩타이드는 상기 i), ii), iii), iv) 및 v) 조건을 만족해야 하는데, 구체적으로 i) 조건은 서열번호 1의 모체 펩타이드에서 1번째 및 14번째 아미노산인 글리신(Glycine, G)과 페닐알라닌(Phenylalanine, F)이 모두 결실되어야 하는 것이며, ii) 조건은 서열번호 1의 모체 펩타이드에서 4번째 및 8번째 아미노산인 글리신(G)과 글루탐산(Glutamic acid, E)이 양전하를 갖는 염기성의 아미노산인 리신(lysine, K)으로 치환되어야 한다.
다음으로, iii) 조건은 서열번호 1의 모체 펩타이드에서 7번째 아미노산인 트립토판(Tryptophan, W)이 루신(Leucine, L)으로 치환되는 것으로, 루신은 비극성의 지방족 R기를 가진 아미노산이다.
다음으로, iv) 조건은 서열번호 1의 모체 펩타이드에서 9번째 아미노산이 글리신(Glycine, G) 그대로이거나 또는 글리신이 양전하를 갖는 염기성의 아미노산인 리신(lysine, K)으로 치환되어야 한다.
마지막으로, v) 조건은 서열번호 1의 모체 펩타이드에서 12번째 아미노산이 세린(Serine, S) 그대로이거나 또는 세린이 양전하를 갖는 염기성의 아미노산인 리신(lysine, K)으로 치환되어야 한다.
따라서, iv) 및 v) 조건을 만족하는 경우는 9번째 및 12번째 아미노산이 각각 글리신(G)과 세린(S)인 경우뿐만 아니라, 9번째 및 12번째 아미노산이 각각 리신(K)과 세린(S)인 경우, 9번째 및 12번째 아미노산이 모두 리신(K)인 경우를 포함할 수 있다.
본 발명의 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 5 내지 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있는데, 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 모체 펩타이드인 Hp1404로부터 1번째 및 14번째 아미노산이 결실되고, 4번째 및 8번째 아미노산이 리신(K)으로 치환되고, 7번째 아미노산이 루신(L)으로 치환된 항균 펩타이드로 Hp1404-T1c로 명명하였고, 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 모체 펩타이드인 Hp1404로부터 1번째 및 14번째 아미노산이 결실되고, 4번째, 8번째 및 9번째 아미노산이 리신(K)으로 치환되고, 7번째 아미노산이 루신(L)으로 치환된 항균 펩타이드로 Hp1404-T1d로 명명하였고, 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 모체 펩타이드인 Hp1404로부터 1번째 및 14번째 아미노산이 결실되고, 4번째, 8번째, 9번째 및 12번째 아미노산이 리신(K)으로 치환되고, 7번째 아미노산이 루신(L)으로 치환된 항균 펩타이드로 Hp1404-T1e로 명명하였다.
상기 항균 펩타이드는 서열번호 5 내지 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 치환은 전극의 증/감을 이용하여 세포독성을 낮추며, 그람 음성균 및 그람 양성균에 대하여 항균활성을 증가 또는 유지하기 위해 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 항균 펩타이드는 그람 음성균, 그람 양성균 또는 항생제 내성균에 대해 항균 활성을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 그람 음성균은 슈도모나스 속(Pseudomonas), 대장균 속(Escherichia), 살모넬라 속(Salmonella), 렙토스피라 속(Leptospira), 리케치아 속(Rickettsia)을 포함하는 그람 음성균으로 당업계에 공지된 모든 그람 음성균인 것이 바람직하며, 구체적으로 슈도모나스 속(Pseudomonas) 또는 대장균 속(Escherichia)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 그람 양성균은 스타필로코커스 속(Staphylococcus), 리스테리아 속(Listeria), 코리네박테리움 속(Corynebacterium), 락토바실러스 속(Lactobacillus) 및 바실러스 속(Bacillus)을 포함하는 그람 양성균으로 당업계에 공지된 모든 그람 양성균인 것이 바람직하며, 구체적으로 스타필로코커스 속(Staphylococcus) 또는 리스테리아 속(Listeria) 인 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항생제 내성균은 항생제 내성을 갖는 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 대장균(Escherichia coli) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항생제는 이에 제한되지는 않으나, 아미노글리코사이드 계열(아미노글리코사이드, 겐타마이신, 네오마이신 등), 페니실린 계열(앰피실린 등), 술폰아미드 계열, 베타-락탐 계열(베타-락탐, 아목시실린/클라불란산 등), 클로람페니콜 계열, 에리트로마이신 계열, 플로르페니콜 계열, 포스포마이신 계열, 카나마이신 계열, 린코마이신 계열, 메티실린 계열, 퀴놀론 계열, 스트렙토마이신 계열, 테트라사이클린 계열, 트리메소프림 계열 및 반코마이신 계열의 항생제를 포함한다.
본 발명의 상기 항균 펩타이드는 쥐 및 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 가진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제를 제공한다. 상기 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 5 내지 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 전술한 바와 같다.
본 발명의 Hp1404 항균 펩타이드로부터 유래된 유사체 항균 펩타이드인 Hp1404-T1c(서열번호 5), Hp1404-T1d(서열번호 6), 및 Hp1404-T1e(서열번호 7) 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서, 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로, 본 발명의 항균 펩타이드는 항균용 항생제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 항균 펩타이드를 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
즉, 본 발명의 항균 펩타이드는 실제의 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 항균 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 항균 펩타이드의 유효용량은 0.1 내지 2mg/kg이고, 바람직하게는 0.5 내지는 1mg/kg 이며, 하루 1 회 내지 3 회 투여될 수 있다.
본 발명의 항생제에서 본 발명의 신규한 펩타이드의 총 유효량은 볼루스(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 신규한 펩타이드의 항생제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 5 내지 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 전술한 바와 같다. 상기 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서, 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로, 본 발명의 항균 펩타이드는 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 항균 펩타이드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함되며, 예켠대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 펩타이드는 0.1 내지 50 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸타, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸타 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 식품 첨가제를 제공한다.
상기 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 5 내지 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로, 상기 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서, 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로, 본 발명의 항균 펩타이드는 식품 첨가제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드를 식품 첨가물로 사용하는 경우, 상기 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 펩타이드는 원료에 대하여 15 중량부이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 사료 첨가제를 제공한다.
상기 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 5 내지 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 전술한 바와 같다. 상기 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서, 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로, 본 발명의 항생 펩타이드는 사료 첨가제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 기존의 항생제를 대체하고 유해한 식품 병원성균의 생장을 억제하여 동물체의 건강상태를 양호하게 하고, 가축의 증체량과 육질을 개선시키며, 산유량 및 면역력을 증가시키는 효과가 있다. 본 발명의 사료 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있다.
상기 발효사료는 본 발명의 펩타이드 이외의 여러 가지 미생물군 또는 효소들을 첨가함으로서 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 펩타이드를 혼합하여 제조할 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 배합사료 등을 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 미생물로 발효시킴으로써 제조할 수 있다. 습식발효사료는 음식물 쓰레기 등과 같은 유기물을 수집 및 운반하여 살균과정과 수분조절을 위한 부형제를 일정비율로 혼합한 후, 발효에 적당한 온도에서 24시간 이상 발효하여, 수분함량이 약 70%로 포함되도록 조절하여 제조할 수 있다. 발효건조사료는 습식발효사료를 건조과정을 추가로 거쳐 수분함량이 30% 내지 40% 정도 함유되도록 조절하여 제조할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 방부 조성물, 항균용 생물 농약, 및 항균용 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 5 내지 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로서 전술한 바와 같다. 상기 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서, 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로, 본 발명의 항균 펩타이드는 항균용 생물 농약, 방부 조성물 및 의약외품 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
상기 방부 조성물에는 화장품 보존제 또는 의약품 보존제 등이 있다. 상기 식품의 방부제, 화장품 보존제 및 의약품 보존제는 의약품의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제가 이에 포함되며 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품 및 의약품에서 부패미생물의 발육저지 또는 살균작용을 하는 등의 기능성 항생제도 포함된다. 이러한 방부 조성물의 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다.
본 발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 본 발명의 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제, 패치, 또는 필터 충진제일 수 있다.
본 발명은 또한, 약학적으로 유효한 양의 상기 항균 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 항균 방법을 제공한다. 상기 개체는 인간을 제외한 포유류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 펩타이드의 합성 및 분리정제
본 발명자들은 메리필드(Merrifield)의 액상 펩타이드 합성법(Merrifield, RB., J.Am. Chem. Soc., 85, 2149, 196)에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재된 모체 펩타이드인 Hp1404의 아미노산 서열에서 1번째와 14번째의 아미노산 잔기를 결실시켰다. 이후 4번째 아미노산 잔기를 리신(Lysine, K)으로, 7번째 아미노산 잔기를 루신(Leucine, L)으로, 8번째와 9번째 그리고 12번째 아미노산 잔기를 리신(K)으로 순차적으로 치환하여 합성하였다(표 1).
구체적으로, 본 발명에서 설계한 펩타이드의 카르복실 말단이 NH2 형태인 펩타이드는 링크 아미드 MBHA-레진(Rink Amide MBHA-Resin)을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실 말단이 OH 형태의 펩타이드는 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-아미노산-Wang Resin을 출발물질로 사용하였다.
Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬(chain)의 연장은 DCC(N-hydroxybenzo trizole(HOBt)-dicyclo-hexycarbodiimide)법에 의해 실시하였다. 각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링시킨 후, NMP(20% piperidine/N-methyl pyrolidone) 용액으로 Fmoc기를 제거하고, NMP 및 DCM(dichoromethane)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 TFA(trifluoroacetic acid), 페놀(phenol), 씨이오아니졸(thioanisole), H2O 및 트리이소프로필실레인(triisopropylsilane)을 각각 85:5:5:2.5:2.5(v/v)의 비율로 혼합한 용액을 가하고 2~3시간 동안 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 후, 디에틸에테르(diethylether)로 펩타이드를 침전하여 이를 수득하였다. 상기 수득한 크루드(crude) 펩타이드는 0.05% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도구배(acetonitrile gradient)에서 정제형 역상(reverse phase, RP)-HPLC 컬럼(Delta Pak, C18300Å,15,19.0mm×30 cm, Waters, USA)을 이용하여 정제하였다. 합성 펩타이드를 6N 염산으로 110℃에서 가수분해한 후 잔사를 감압 농축하고, 0.02N 염산에 녹여서 아미노산 분석기(Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정한 후, 펩타이드의 순도 및 분자량을 확인하기 위하여 MALDI 질량 분석법을 수행하였다.
그 결과, 하기 표 1에서 나타난 바와 같이, 서열번호 1 내지 서열번호 7의 아미노산 서열로 기재되는 펩타이드를 95% 이상의 순도로 합성하였고, 이의 분자량은 예상한 분자량과 동일한 분자량을 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명에서 합성한 펩타이드의 서열, 분자량 및 보유시간
펩타이드 명칭 아미노산 서열 서열번호 보유시간 분자량
Hp1404 GILGKLWEGVKSIF-NH2 1 36.251 1545.7
Hp1404-T1 ILGKLWEGVKSI-NH2 2 23.176 1342.2
Hp1404-T1a ILKKLWEGVKSI-NH2 3 20.756 1413.5
Hp1404-T1b ILKKLLEGVKSI-NH2 4 20.875 1340.2
Hp1404-T1c ILKKLLKGVKSI-NH2 5 17.643 1338.0
Hp1404-T1d ILKKLLKKVKSI-NH2 6 17.741 1409.8
Hp1404-T1e ILKKLLKKVKKI-NH2 7 16.002 1451.0
아미노산 번호 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Hp1404 G I L G K L W E G V K S I F
Hp1404-T1 - - - - - - - - - - - -
Hp1404-T1a - - K - - - - - - - - -
Hp1404-T1b - - K - - L - - - - - -
Hp1404-T1c - - K - - L K - - - - -
Hp1404-T1d - - K - - L K K - - - -
Hp1404-T1e - - K - - L K K - - K -
[공백 : 아미노산 결실, - : 아미노산 치환 없음]
실시예 2. 항균 활성 측정
본 발명자들은 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드들의 항균 활성을 비교하기 위하여, 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농도인 생육 최소저해농도(Minimal Inhibitory Concentration, MIC) 값을 측정하였다.
구체적으로, 하기 표 2에 기재된 균주를 구입하여, 각 균주에 적합한 조성의 배지에서 중간-로그 상(mid-log phase)까지 배양한 다음, 2×104 세포/100㎕의 농도로 희석하여 마이크로 적정 플레이트(Nunc, USA)에 준비하였다. 그런 다음, 상기 실시예 1에서 합성한 Hp1404-T1, Hp1404-T1a, Hp1404-T1b, Hp1404-T1c, Hp1404-T1d 또는 Hp1404-T1e 펩타이드를 각 웰에 1/2배씩 계열 희석(serial dilution)하여 첨가한 후 37℃에서 18시간 동안 배양하였고, 마이크로 적정 플레이트 판독기(Merck Elisa reader, 독일)를 이용하여 600nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 각 균주에 대한 MIC 값을 결정하였다. 모체 펩타이드인 Hp1404를 대조군으로 사용하였다.
Figure PCTKR2018011241-appb-T000001
그 결과, 하기 표 3에서 나타난 바와 같이 Hp1404-T1c, Hp1404-T1d, 및 Hp1404-T1e 펩타이드는 대조군인 모체 펩타이드 Hp1404에 비해 스타필로코커스 아우레우스와 슈도모나스 에루지노사에 대해 유사하거나 우수한 항균활성을 나타내는 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2018011241-appb-T000002
실시예 3. 항생물막 활성 측정
본 발명자들은 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드들의 항균 활성을 비교하기 위하여, 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 생물막 억제 농도값을 측정하였다.
구체적으로, 상기 표 2에 기재된 균주 중 생물막이 잘 형성되는 균을 각 배지에서 중간-로그 상(mid-log phase)까지 배양한 다음, 5×104 세포/100㎕의 균체 농도로 희석하여 마이크로 플레이트(SPL)에 접종하였다. 그런 다음, 상기 실시예 1에서 합성한 Hp1404, Hp1404-T1c, Hp1404-T1d 또는 Hp1s404-T1e 펩타이드를 각 웰에 1/10배씩 10mM 인산 나트륨 용액(sodium phosphate, pH 7.2)으로 희석하여 10㎕ 첨가한 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 상층액을 완벽히 제거한 후 100% 메탄올로 15분간 고정시키고 크리스탈 바이올렛 염색용액으로 1시간 염색시킨 후, 3번 세척한 뒤 95% 에탄올로 용해하여 마이크로 적정 플레이드 판독기를 이용하여 595nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 각 균주에 대한 생물막 최소억제 농도값을 확인하였다.
그 결과, 하기 표 4에 개시된 바와 같이 Hp1404-T1c, Hp1404-T1d 및 Hp1404-T1e 펩타이드에서는 대조군인 Hp1404에 비해 균주 모두에서 비슷하거나 강한 생물막 저해활성을 나타내는 것을 확인하였다.
그람 음성균, 그람 양성균 및 항생제 내성균에 대한 항균 펩타이드의 항생물막 활성
생물막 최소억제농도 (μM)
Hp1404 Hp1404-T1c Hp1404-T1d Hp1404-T1e
S. 아우레우스 (ATCC 25923) 3.13 12.5 6.25 12.5
P. 에루지노사 (ATCC 27853) 25 25 12.5 12.5
P. 에루지노사 434 25 50 12.5 12.5
P. 에루지노사 559 50 25 12.5 12.5
P. 에루지노사 778 25 25 12.5 6.25
P. 에루지노사 1034 25 25 12.5 6.25
P. 에루지노사 1162 25 12.5 6.25 6.25
P. 에루지노사 3543 6.25 >50 >50 50
P. 에루지노사 3399 12.5 25 25 12.5
P. 에루지노사 4007 25 >50 50 12.5
실시예 4. 용혈 활성 측정
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드들의 세포독성을 비교하기 위하여, 합성한 펩타이드들의 적혈구 용혈 활성을 측정하였다.
구체적으로, 쥐(Balb/c, 6주령, 암컷) 적혈구를 8%의 농도가 되도록 PBS(pH 7.0)로 희석하고, Hp1404, Hp1404-T1, Hp1404-T1a, Hp1404-T1b, Hp1404-T1c, Hp1404-T1d 또는 Hp1404-T1e 펩타이드를 각각 6.25, 12.5, 25.0, 50.0, 100.0 및 200.0μM/웰의 농도로 처리하여, 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 그런 다음, 1,000xg로 원심 분리하여 수득한 상등액 속에 포함된 헤모글로빈 량을 414㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 확인하였다. 세포 파괴 정도의 기준이 되는 대조군으로, 1% 트리톤 X-100(sigma, USA)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 반응한 후 수득한 상등액의 흡광도를 측정하였고, 상기 흡광도 값을 적혈구 용혈활성 100%로 하여, 하기 수학식 1을 사용하여 각 펩타이드의 용혈활성(hemolysis)을 계산하였다.
[수학식 1]
적혈구 파괴능(%) = (흡광도 A-흡광도 B)/(흡광도 C-흡광도 B) X 100
(상기 식에 있어서, 흡광도 A는 414㎚ 파장에서 측정한 각 펩타이드를 처리한 반응 용액의 흡광도를 나타내며; 흡광도 B는 414㎚ 파장에서 측정한 PBS를 처리한 반응 용액의 흡광도를 나타내며; 흡광도 C는 414㎚ 파장에서 측정한 1% 트리톤 X-100를 처리한 반응 용액의 흡광도를 나타낸다.)
그 결과, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 모체 펩타이드인 Hp1404 펩타이드는 200μM 농도를 처리하였을 때 쥐 적혈구에 대하여 100%의 용혈작용이 유발되는 것을 확인한 것에 비해, Hp1404-T1, Hp1404-T1a, Hp1404-T1b, Hp1404-T1c, Hp1404-T1d 및 Hp1404-T1e 펩타이드는 200μM 농도에서도 적혈구에 대한 파괴능을 나타내지 않는 것을 확인하여, 본 발명의 항균 펩타이드가 모체 펩타이드에 비해 세포독성이 감소한 것을 확인하였다.
항균 펩타이드의 용혈활성
% 적혈구 파괴능 (펩타이드 농도, μM)
200 100 50 25 12.5 6.25
Hp1404 100 92.64 55.41 11.01 2.16 0.01
Hp1404-T1 0.53 0 0 0 0 0
Hp1404-T1a 0.55 0 0 0 0 0
Hp1404-T1b 1.05 0 0 0 0.19 0.07
Hp1404-T1c 0.65 0 0 0 0 0
Hp1404-T1d 0.08 0 0 0 0 0
Hp1404-T1e 0.55 0.15 0 0.41 0.28 0.10
실시예 5. 정상 세포주에서 세포독성 확인
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드들의 정상 세포주에서의 세포독성을 확인하기 위해, 사람의 각질 형성 세포주(HaCaT cell line, Dr. NE. Fusenig, Heidelberg, Germany)을 이용하여 독성을 측정하였다.
구체적으로, 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 함유된 DMEM 배지에서 배양된 HaCaT 세포를 2×105 세포/웰로 마이크로 적정 플레이트에 분주하고 24시간 배양한 후, Hp1404, Hp1404-T1, Hp1404-T1a, Hp1404-T1b, Hp1404-T1c, Hp1404-T1d 또는 Hp1404-T1e 펩타이드를 각각 6.25, 12.5, 25.0, 50.0, 100.0 또는 200.0μM/웰의 농도로 처리하여, 24시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 반응시켰다. 24시간 후, 인산 완충액 생리식염수(phosphate buffered saline; PBS)에 0.5mg/㎖ MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)를 녹인 반응 용액 100㎕를 각 웰에 넣고 4시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 상층액을 제거하고, 200㎕의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 넣어 형성된 MTT 크리스탈을 녹인 후, 560nm에서 파장을 확인하여 세포 생존능을 확인하였다.
그 결과, 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 200μM의 모체 Hp1404 펩타이드를 처리했을 때, HaCaT 세포는 0%의 세포 생존력을 나타내어 Hp1404 펩타이드가 매우 높은 세포 독성을 나타내는 것을 확인하였다. 이에 반해, Hp1404-T1a, Hp1404-T1b, Hp1404-T1c 및 Hp1404-T1d 펩타이드는 200μM의 농도에서 각각 30.67%, 31.95%, 39.87% 및 18.35%의 세포 생존력을 나타내어 낮은 세포 독성을 가지는 것을 확인하였고, 특히 Hp1404-T1와 Hp1404-T1e 펩타이드는 200μM 농도에서 100%의 세포 생존력을 나타내어, 모체 Hp1404 펩타이드에 비해 세포 독성을 거의 보이지 않는 것을 확인하였다.
항균 펩타이드의 세포독성 분석
% 세포 생존력 (펩타이드 농도, μM)
200 100 50 25 12.5 6.25
Hp1404 0 0.11 30.48 100 100 100
Hp1404-T1 100 100 100 100 100 100
Hp1404-T1a 30.67 100 100 100 100 100
Hp1404-T1b 31.95 80.86 100 100 100 100
Hp1404-T1c 39.87 48.56 51.28 100 100 100
Hp1404-T1d 18.35 34.56 33.09 38.90 53.93 100
Hp1404-T1e 100 100 100 100 100 100
실시예 6. 원이색법 스펙트럼 측정
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드를 이용하여 2차 구조인 α-나선형 구조를 유도하는지 확인하고자 원이색법(circular dichroism) 방법을 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 10mM 인산나트륨(sodium phosphate, pH 7.4), 50% 트리플루오로에탄올(2,2,2-trifluoroethanol, TFE) 또는 30mM 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액에 Hp1404, Hp1404-T1, Hp1404-T1a, Hp1404-T1b, Hp1404-T1c, Hp1404-T1d 또는 Hp1404-T1e 펩타이드를 40μM로 첨가하여 0.1cm 길이(path-length)의 셀에 가한 후, jasco 810 분광광도계(spectrophotometer)에 온도를 25℃로 고정하여 원이색법 스펙트럼을 측정하였다. 상기 원이색법 스펙트럼을 위한 α-나선형 구조 계산식은 하기 수학식 2를 사용하였다.
[수학식 2]
Figure PCTKR2018011241-appb-I000001
그 결과, 10mM 인산나트륨 용액에 펩타이드를 첨가하였을 때에는 구조를 형성하지 않은 반면, 50% TFE 용액과 30mM SDS 용액에 펩타이드를 첨가하였을 때에는 정도의 차이를 보이지만 모든 펩타이드에서 2차 구조인 α-나선형 구조를 형성하는 것을 확인하였다. 이의 결과를 통해, 본 발명의 항균 펩타이드는 미생물인 박테리아 막과 유사한 SDS와 TFE 용액 상에서 α-나선형 구조를 형성하는 것을 확인하였다(도 1).
실시예 7. 트립신 효소에 대한 안정성 확인
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드를 이용하여 효소에 대한 안정성을 가지는지 알아보기 위해 RP-HPLC(reverse-phase HPLC)를 수행하였다. 20㎍의 펩타이드를 20nM 농도의 트립신 100㎕와 함께 37℃에서 1시간 또는 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 RP-HPLC에 반응물 20㎕를 주입하여 남아있는 펩타이드 양을 확인하였다.
그 결과, 1시간 반응 후 모체 펩타이드인 Hp1404는 60%, 유사체 펩타이드인 Hp1404-T1c, Hp1404-T1d 및 Hp1404-T1e는 80% 이상의 펩타이드가 유지됨을 알 수 있었고, 2시간 경과 후 유사체 펩타이드는 여전히 80%를 유지하지만 모체 펩타이드의 경우 45%까지 떨어짐을 확인할 수 있었다. 이로서 모체 펩타이드보다 유사체 펩타이드들이 트립신 효소에 보다 안정성을 가짐을 알 수 있었다(도 2).
실시예 8. 생균염색을 통한 항생물막 확인
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드를 이용하여 형광 현미경으로 생물막(biofilm) 생성 억제를 시각적으로 관찰하였다. 표준균주 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)를 선별하여 각각의 펩타이드를 1× 또는 2× MBIC(Minimum Biofilm Inhibitory Concentration) 농도로 박테리아에 처리한 후 24시간 배양하였다. 그 후 생물막 형성 정도를 SYTOTM 9 염색시약(녹색)으로 30분 염색한 후 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 1× MBIC 농도의 펩타이드를 처리한 균주는 0.5× MBIC 농도의 펩타이드를 처리한 균주와의 비교시 생물막 형성이 현저히 억제되는 것이 시각적으로 관찰되었다. 이의 결과를 통해, 본 발명의 항균 펩타이드가 생물막 형성 억제에 강한 효과를 보인다는 것을 확인할 수 있었다(도 3).
실시예 9. 지질다당류(LPS)와 펩타이드의 결합력 측정
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드를 이용하여 그람 음성균의 세포벽 구성성분인 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)와의 결합여부를 알아보았다. 본 발명에서 사용한 LPS는 슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa)에서 분리되었다. 0 ~ 100㎍/㎖의 지질다당류를 10mM 인산화나트륨 완충용액(Sodium phosphate buffer, pH7.2)에 희석하여 1×, 2× MIC 농도의 각 펩타이드와 반응시켜 준비하고, 2 x 105 CFU/㎖의 박테리아와 배양하였다. 600nm에서 흡광도를 측정하여 펩타이드와 결합력을 확인하였다. 추가적으로 0.1% 지질다당류와 40μM 펩타이드를 배양기에서 반응시켜 원이색성 편광기(CD spectroscopy)로 이차구조를 측정하였다.
그 결과, 2× MIC 농도에서는 50㎍/㎖ 농도의 LPS에 각 항균 펩타이드들이 결합하여 박테리아에 작용을 못하는 것으로 확인되었고, 1× MIC 농도에서는 Hp1404-T1e, Hp1404-T1d, Hp1404-T1c, Hp1404 순으로 LPS와 잘 결합해 박테리아에 작용하지 못하는 것으로 확인되었다. 더 나아가, 원이색성 편광기를 통해 LPS와 펩타이드의 결합구조를 확인한 결과 α-나선형(helical) 구조를 형성함을 알 수 있다(도 4).
실시예 10. 박테리아 외막과 내막에 대한 작용기작
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드를 이용하여 박테리아 외막과 내막에 대한 작용여부를 알아보았다. NPN(N-Phenyl-1-naphthylamine) 형광염료를 이용하여 표준균주 슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa)의 외막에 각 항균 펩타이드가 작용하는지 확인하였다. NPN은 박테리아 막에 축적되어 형광을 나타내지 않지만 세포막이 손상되어 소수성 부분이 드러나게 되면 형광 빛을 나타낸다. 각 균주를 TSB와 NB 배지에서 배양한 후, 5mM HEPES 완충용액에서 OD600 값이 0.2가 되도록 준비하였다. 95% 에탄올에 녹인 10μM의 NPN과 세균을 검은색 96-웰 플레이트에 넣어 반응시킨 후, 최소억제농도의 1×, 2× 또는 4× 농도의 펩타이드와 0.1% Triton X-100을 넣어 형광을 측정하였다.
그 결과, Hp1404는 처리 농도 의존적으로 형광값이 증가함을 알 수 있었고, 유사체 펩타이드는 형광값의 변화가 Hp1404보다 크지 않음을 알 수 있었다. 이를 통해 유사체 펩타이드는 외막에 작용하는 정도가 모체 펩타이드보다 낮음을 알 수 있었다(도 5A).
또한, 박테리아 내막에 작용하는지 확인하기 위하여 DiSC3-5(3,3'-Dipropylthiadicarbocyanine Iodide)를 이용하여 실험하였다. DiSC3-5는 세포막에 축적되어 있다가 세포막이 손상되면 방출되어 형광이 나타난다. 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) 및 슈도모나스 에루지노사를 NB 배지에 배양한 후 20mM 글루코스가 들어간 5mM HEPES 완충용액에 세척한 후 20mM 글루코스와 0.1M 염화칼륨이 들어간 5mM HEPES 완충용액에 OD600 값이 0.05가 되도록 준비한다. 1μM의 DiSC3-5와 1시간 반응시켜 안정화 상태로 만든 후 최소억제농도의 1×, 2×, 4× 농도의 펩타이드를 넣어 형광을 측정하였다. 그결과, 펩타이드 농도 의존적으로 DiSC3-5의 형광이 증가함을 알 수 있다. 이를 통해 펩타이드가 박테리아 내막에 영향을 준다는 것을 확인하였다(도 5B).
실시예 11. 유세포분석기(Flow cytometry) 측정
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드가 박테리아 막에 작용하는지 여부를 확인하기 위하여, 모체 펩타이드와 유사한 항균활성을 보이며, 고농도에서도 세포 독성을 나타내지 않는 것으로 확인된 Hp1404-T1c, Hp1404-T1d 및 Hp1404-T1e 펩타이드를 유세포분석기(Flow cytometry)를 이용하여 분석하였다.
구체적으로, 모체 Hp1404 펩타이드 또는 Hp1404-T1c, Hp1404-T1d 및 Hp1404-T1e 펩타이드의 최소억제농도(MIC)의 2배 값을 스타필로코커스 아우레우스와 슈도모나스 에루지노사에 처리한 후 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 그 후, 원심분리기(10,000rpm)를 이용해 상층액을 제거한 다음 10㎍/㎖ 농도의 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide, PI)로 4℃에서 30분간 염색하였다. 그런 다음, 결합하지 않은 프로피디움 요오드화물을 원심분리기를 이용해 제거하고 생리식염수(PBS) 1㎖를 첨가하여 세포의 뭉침 현상을 제거한 후, Bechman 유세포분석기를 이용하여 박테리아 막에 대한 펩타이드의 영향을 확인하였다.
그 결과, Hp1404 펩타이드는 박테리아 막에 손상을 주어 형광시그널이 오른쪽으로 이동된 반면, Hp1404-1c, Hp1404-T1d 및 Hp1404-T1e 펩타이드는 형광시그널이 이동되지 않아 박테리아 막에 손상을 주지 않았음을 확인할 수 있었다(도 6). 이의 결과를 통해, 본 발명의 신규 펩타이드는 대조군인 모체 펩타이드와 박테리아 막에 작용하는 기작이 다름을 유추할 수 있었다.
실시예 12. 항균 펩타이드와 DNA의 결합 유무 분석
본 발명의 합성 펩타이드가 항균활성을 나타내는 기작이 무엇인지 구체적으로 확인하기 위하여, Hp1404, Hp1404-1c, Hp1404-T1d 및 Hp1404-T1e 합성 펩타이드가 박테리아 내부 물질인 DNA와 결합하는지 여부를 전기영동을 통해 확인하였다.
구체적으로, 260ng의 플라스미드 DNA(pRSETB)를 펩타이드와 비율별(lane 1번부터 8번까지 펩타이드/DNA 비율은 각각 DNA 단독, 0.25:1, 0.5:1, 1:1, 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1로 실시)로 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 1% 아가로스 겔에 전기영동을 수행하여 브로민화 에티듐(Ethidium bromide, EtBr)으로 염색하고 UV로 확인하였다. 박테리아의 DNA에 결합하여 항균활성을 나타내는 항균 펩타이드인 Buforin 2를 양성 대조군으로 사용하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 Hp1404와 Hp1404-T1c 펩타이드는 DNA와 어떠한 결합도 하지 않았으며 Hp1404-T1d와 Hp1404-T1e는 DNA와 결합하는 결과를 보여주었다(도 7). 상기 결과를 통해, Hp1404-T1d와 Hp1404-T1e 펩타이드가 일부 아미노산 잔기의 치환 또는 결실로 인해, 박테리아 막에 작용하여 항균활성을 나타내는 모체 펩타이드인 Hp1404와는 달리, 박테리아 내부 물질인 DNA와 결합하여 항균활성을 나타내는 것임을 확인할 수 있었다.
실시예 13. 항균 펩타이드의 생체 내 활성 측정
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드 중 항균활성이 가장 뛰어난 Hp1404-T1e를 이용하여 생체 내 항균활성을 측정하였다. 슈도모나스 에루지노사 균주 중 1034 균주를 선택하여 실험하였는데, PBS 버퍼를 이용하여 균주를 3번 세척하여 준비하였다. 시프로플록사신(Ciprofloxacin) 항생제를 대조군으로 사용하였다. BALB/c 마우스(6주령)를 깨끗이 면도하고 일정한 크기의 상처를 만들었다. 상처부위의 피내(intracutaneous)로 2 x 105 CFU/㎖의 슈도모나스 에루지노사 1034 균주 20 ㎖를 주입하였다. 박테리아 감염 후, 펩타이드와 항생제를 각각 0.1㎎/㎖과 0.2㎎/㎖의 농도로 준비한 후 피내에 주입하고 매일 관찰하였다. 각 날짜에 피부조직을 샘플링하여 NB 고체배지에 도말하였다. 도말한 배지는 배양기에서 18시간 배양시키고, 자라난 콜로니 수를 세어 측정하여 %로 나타내었다.
그 결과, 박테리아만 감염시킨 마우스는 7일째까지 상처부위가 아물지 않고거의 비슷하게 유지되었으며, 콜로니 수는 5일째에 샘플링한 조직에서 60%까지 나타났다. 그에 반해 박테리아 감염 후 Hp1404-T1e를 처리한 마우스는 펩타이드 처리 농도 의존적으로 상처 치유 효과가 확인되었고, 5일째에 샘플링한 조직에서 확인된 콜로니 수는 각각 40%(0.1㎎/㎖ 처리 조건)와 20%(0.2㎎/㎖ 처리 조건)로 확인되어, 박테리아만 감염시킨 마우스와 비교하여 상당히 감소되어 있음을 알 수 있었다. 또한 박테리아 감염 후 시프로플록사신을 처리한 마우스는 상처가 전혀 회복되지 않았으며, 콜로니 수 또한 펩타이드 처리 조건보다 많은 것을 확인하였다(도 8). 상기 결과를 통해, Hp1404-T1e 펩타이드는 생체 내에서도 항생제보다 뛰어난 항균효과를 나타냄을 알 수 있었다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 예시한다.
<제조예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1> 산제의 제조
본 발명의 펩타이드 20㎎
유당 20㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
본 발명의 펩타이드 10㎎
옥수수전분 100㎎
유당 100㎎
스테아린산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
본 발명의 펩타이드 10㎎
결정성 셀룰로오스 3㎎
락토오스 14.8㎎
스테아린산 마그네슘 0.2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 액제의 제조
본 발명의 펩타이드 20㎎
이성화당 10g
만니톨 5g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
<1-5> 주사제의 제조
본 발명의 펩타이드 10㎍/㎖
묽은 염산 BP pH 7.6로 될 때까지
주이용 염화나트륨 BP 최대 1㎖
적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 본 발명의 펩타이드를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 7.6로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15분 이상 고압증기멸균기로 살균하여 주사액제를 제조하였다.
<제조예 2> 화장품의 제조
<2-1> 유연화장수(스킨)
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 유연화장수를 제조하기 위해 하기 표 7에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
유연화장수 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
1,3-부틸렌글리콜 3.0
글리세린 5.0
폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유 0.2
에탄올 8.0
구연산 0.02
구연산나트륨 0.06
방부제 미량
향료 미량
정제수 To 100
<2-2> 영양화장수(로션)
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 영양화장수를 제조하기 위해 하기 표 8에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
영양화장수 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
스쿠알란 10.0
모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄 2.0
유창목오일 0.1~30
1,3-부틸렌글리콜 8.0
글리세린 5.0
폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유 0.2
에탄올 8.0
구연산 0.02
구연산나트륨 0.06
방부제 미량
향료 미량
정제수 To 100
<2-3> 에센스
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 에센스를 제조하기 위해 하기 표 9에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
에센스 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
시토스테롤 1.7
플리글리세릴2-올레이트 1.5
세라마이드 0.7
세테아레스-4 1.2
콜레스테롤 1.5
디세틸포스페이트 0.4
농글리세린 5.0
카르복시비닐폴리머 0.2
산탄검 0.2
방부제 미량
향료 미량
정제수 To 100
<2-4> 세안제(클렌징폼)
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 세안제(클렌징폼)를 제조하기 위해 하기 표 10에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
세안제 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
N-아실글루타민산나트륨 20.0
글리세린 10.0
PEG-400 15.0
프로필렌글리콜 10.0
POE(15) 올레일알코올에테르 3.0
라우린유도체 2.0
메틸파라벤 0.2
EDTA-4Na 0.03
향료 0.2
정제수 To 100
<2-5> 영양크림
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 영양크림을 제조하기 위해 하기 표 11에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조한다.
영양크림 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
바셀린 7.0
유동파라핀 10.0
밀납 2.0
폴리솔베이트60 2.5
솔비탄세스퀴올레이트 1.5
스쿠알란 3.0
프로필렌글리콜 6.0
글리세린 4.0
트리에탄올아민 0.5
산탄검 0.5
토코페닐아세테이트 0.1
향료, 방부제 미량
정제수 To 100
<2-6> 마사지크림
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 마사지크림을 제조하기 위해 하기 표 12에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조한다.
마사지크림 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
프로필렌글리콜 6.0
글리세린 4.0
트리에탄올아민 0.5
밀납 2.0
토코페닐아세테이트 0.1
폴리솔베이트60 3.0
솔비탄세스퀴올레이트 2.5
세테아릴알코올 2.0
유동파라핀 30.0
산탄검 0.5
향료, 방부제 미량
정제수 To 100
<2-7> 팩
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 팩을 제조하기 위해 하기 표 13에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조한다.
팩 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
프로필렌글리콜 2.0
글리세린 4.0
폴리비닐알코올 10.0
에탄올 7.0
파이지-40 히드로게비이티드캐스터오일 0.8
트리에탄올아민 0.3
향료, 방부제 미량
정제수 To 100
이상의 본 발명은 상기에 기술된 실시예 및 제조예에 의해 한정되지 않고, 통상의 기술자들에 의해 다양한 변형 및 변경을 가져올 수 있으며, 그외의 색조 화장품을 포함하는 다양한 용도의 화장품에 적용될 수 있는 것이고, 그 효능에 따라 인체에 얇게 도포하여 바를 수 있는 약제 즉, 연고로 제조에 이용될 수 있고, 이는 첨부된 청구항에서 정의되는 본 발명의 취지와 범위에 포함된다.

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서
    i) 1번째 및 14번째 아미노산이 결실되고,
    ii) 4번째 및 8번째 아미노산이 리신(lysine, K)으로 치환되고,
    iii) 7번째 아미노산이 루신(Leucine, L)으로 치환되고,
    iv) 9번째 아미노산이 글리신(Glycine, G)이거나 또는 리신(lysine, K)으로 치환되고,
    v) 12번째 아미노산이 세린(Serine, S)이거나 또는 리신(lysine, K)으로 치환된 항균 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항균 펩타이드는 서열번호 5 내지 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항균 펩타이드는 그람 음성균, 그람 양성균 또는 항생제 내성균에 대해 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 그람 음성균은 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)인 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  5. 제3항에 있어서, 상기 그람 양성균은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)인 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  6. 제3항에 있어서, 상기 항생제 내성균은 항생제 내성을 갖는 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)인 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항균 펩타이드는 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  8. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제.
  9. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물.
  10. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 식품 첨가제.
  11. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 사료 첨가제.
  12. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 생물 농약.
  13. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 의약외품 조성물.
  14. 약학적으로 유효한 양의 제1항의 항균 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 항균 방법.
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