WO2020197227A1 - 간세포암 진단용 바이오마커 세레브론 및 이에 특이적인 신규한 단일클론항체 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to the use of Cerebron as a biomarker for diagnosis of hepatocellular carcinoma and to a novel monoclonal antibody specific to Cerebron (CRBN), and in more detail, by using CRBN as a biomarker for diagnosis of hepatocellular carcinoma, diagnosis of hepatocellular carcinoma Or a composition for predicting the prognosis, a kit, a method for providing information for diagnosing or predicting the prognosis of hepatocellular carcinoma, two novel monoclonal antibodies that specifically bind to CRBN, and a hybridoma cell producing the same .
  • Hepatocellular carcinoma is a primary liver cancer that occurs in the liver.According to the 2014 national cancer registration statistics, it ranks 6th among all cancers, but the 5-year survival rate is only 32.8%, making it a very high mortality rate. In particular, in Asian countries, including Korea, where the hepatitis virus carrier rate is high, the incidence is high, and it is one of the cancers with a poor prognosis, which is the second or third place compared to cancer incidence, and prevention and early detection are important.
  • AMPK adenosine monophosphate-activated protein kinase
  • AMPK is a heterotrimeric protein complex composed of three subunits of ⁇ , ⁇ , and ⁇ , and plays an important role in regulating sugar, lipid, and cholesterol metabolism.
  • cereblon known as a substrate receptor for cullin-ring ubiquitin lipase (CRL)
  • CBL cullin-ring ubiquitin lipase
  • the CRBN protein is found in a variety of tissues including the brain, placenta, retina, skeletal muscle, liver, kidney, pancreas, spleen, testis, prostate, and small intestine. According to conventional studies on CRBN, it is possible to predict the response to immunomodulatory drugs in multiple myeloma and leukemia through CRBN levels, and high CRBN levels increase the effectiveness of immunomodulatory drugs and have been found to be associated with patient survival. lost. CRBN has been shown to be the only protein that inhibits the activity of endogenous AMPK, and it is expected to develop biomarkers for other tumors using this.
  • Korean Patent Application Publication No. 10-2014-0024914 discloses a method for the treatment of cancer and inflammatory diseases using cerebron (CRBN) as a predictor, but CRBN-DDB1 and/or CRBN E3 ubiquitin-ligase It only presents a treatment method using a compound that directly binds to the complex and prevents CRBN from functioning properly, but there is no mention of monoclonal antibodies that specifically bind to CRBN.
  • cerebron cerebron
  • the present inventors investigated the expression of CRBN protein in the tissues of hepatocellular carcinoma patients, analyzed the recurrence and survival of hepatocellular carcinoma after surgery in the patient to be studied, to determine the possibility of CRBN as a biomarker for early diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma. Evaluation and verification were conducted, and the present invention was completed by producing two novel monoclonal antibodies that specifically bind to CRBN and demonstrating the possibility of diagnosing hepatocellular carcinoma and predicting prognosis thereof.
  • an object of the present invention is to provide a composition and kit for diagnosing hepatocellular carcinoma or predicting prognosis using CRBN.
  • Another object of the present invention is to provide a method of providing information for diagnosing hepatocellular carcinoma or predicting prognosis using CRBN.
  • Another object of the present invention is to provide a monoclonal antibody specifically binding to CRBN and hybridoma cells producing the same.
  • the present invention provides a composition for diagnosing hepatocellular carcinoma or predicting prognosis, including an agent measuring the level of the mRNA of the CRBN gene or the protein expressed therefrom.
  • the agent for measuring the mRNA level of the gene may include a primer pair, a probe or an antisense nucleotide specifically binding to the gene.
  • the agent for measuring the level of the protein may include an antibody or aptamer specific for the protein.
  • the antibody is from the group consisting of a monoclonal antibody produced by a hybridoma cell of accession number KCTC18596P and a monoclonal antibody produced by a hybridoma cell line of accession number KCTC18598P. It may contain one or more selected monoclonal antibodies.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing hepatocellular carcinoma or predicting prognosis comprising the above-described composition.
  • the kit may be an RT-PCR kit, a competitive RT-PCR kit, a real-time RT-PCR kit, a DNA chip kit, or a protein chip kit.
  • the present invention also provides a method of providing information for diagnosis of hepatocellular carcinoma comprising the following steps:
  • the method for providing information for diagnosing hepatocellular carcinoma includes the (c) mRNA measured in the biological sample of step (a) or the level of the protein expressed therefrom is a normal individual or the (a) If it is higher than that measured in the biological sample isolated from the biological sample of the individual in step ), it may further include determining as hepatocellular carcinoma.
  • the present invention also provides a method for providing information for predicting the prognosis of hepatocellular carcinoma comprising the following steps:
  • the method for providing information for predicting the prognosis of hepatocellular carcinoma is (c) mRNA of the CRBN gene measured in a biological sample isolated from the hepatocellular carcinoma tissue of step (a) or expression therefrom. If the level of the protein to be obtained is two or more times higher than that measured in a biological sample isolated from surrounding normal tissue, determining that the protein has a poor prognosis may be further included.
  • the method of providing information for predicting the prognosis of hepatocellular carcinoma further includes the following steps:
  • step (d-1) The level of the CRBN gene mRNA or protein expressed therefrom measured in the biological sample isolated from the hepatocellular carcinoma tissue in step (a) is twice that measured in the biological sample isolated from the surrounding normal tissue. If the abnormality is high, classifying the CRBN high-expression patient group, and if less than two times, classifying the CRBN low-expression patient group;
  • the present invention provides a hybridoma cell of accession number KCTC18596P and a monoclonal antibody that specifically binds to cerebron (CRBN) produced thereby.
  • the monoclonal antibody may specifically bind to a region of cerebron including one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 and 6.
  • the present invention also provides hybridoma cells of accession number KCTC18598P and monoclonal antibodies that specifically bind to cerebron (CRBN), produced thereby.
  • the monoclonal antibody may specifically bind to a region of cerebron including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the CRBN-specific monoclonal antibody of the present invention has significantly improved diagnostic sensitivity and specificity compared to the conventional CRBN polyclonal antibody, and is effective in early diagnosis of hepatocellular carcinoma and predicting the prognosis after surgery.
  • the difference in the expression level of the CRBN protein shows not only the early diagnosis of hepatocellular carcinoma patients, but also the predictive power of microvascular invasion, which is an important factor in predicting the prognosis of hepatocellular carcinoma. It is expected to be used as a diagnostic marker.
  • FIG. 1 is a photograph confirming the expression level of CRBN protein in tumor cell tissues of hepatocellular carcinoma and normal cell tissues around the same by immunohistochemistry.
  • FIG 3 is a graph showing a comparison of the cumulative tumor recurrence rate (left) and patient survival rate (right) of the CRBN high-expression group (lower graph line) and the low-expression group (upper graph line).
  • FIG. 4 is a graph showing the comparison of the cumulative tumor recurrence rate (left) and patient survival rate (right) according to the presence or absence of microvascular invasion (upper graph line; patient group without microvascular infiltration, lower graph line; patient group with microvascular infiltration) ).
  • Figure 5 (A) is a Western blot analysis comparing the expression level of CRBN according to the cell line
  • Figure 3 (B) shows the results of the Western blot analysis comparing the expression level of MMP-9 and MMP-2 according to the cell line.
  • FIG. 9 is a diagram showing an antigenic peptide sequence suitable for production of a monoclonal antibody among human CRBN protein sequences, and is a diagram showing homology with the sequence of a mouse.
  • hepatocellular carcinoma is a cancer with a very high mortality rate
  • prevention and early detection are very important, and development of a biomarker capable of reliably early diagnosis is required.
  • the present inventors evaluated and verified the possibility of CRBN as a biomarker for early diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma, and also produced two novel monoclonal antibodies that specifically bind to CRBN to diagnose and prognose hepatocellular carcinoma.
  • a solution to the above-described problem was sought by proving predictability.
  • a first aspect of the present invention relates to a composition for diagnosing hepatocellular carcinoma or predicting prognosis, and a kit comprising the same, comprising an agent measuring the level of the mRNA of the CRBN gene or a protein expressed therefrom.
  • CRBN in the present invention refers to "Cerebron”.
  • CRBN (cereblon) protein is a substrate receptor for cullin-ring ubiquitin ligase (CRL) and is known to cause mild mental retardation when mutations in the cerebron gene appear.
  • CTL cullin-ring ubiquitin ligase
  • CRBN is known as a protein that directly binds to AMPK and inhibits the activation of AMPK, and it has been reported that it can treat metabolic diseases by activating AMPK by inhibiting the expression of CRBN.
  • the type of the CRBN protein is not particularly limited, but may preferably be a human CRBN protein.
  • the CRBN protein is encoded by the CRBN gene, and the CRBN protein and the gene encoding it include all types of CRBN protein and CRBN gene that can occur in an individual to be diagnosed, respectively.
  • the term "CRBN protein” in the present invention may include a known non-mutated form consisting of 442 amino acids or a mutated form of a CRBN protein in which a specific amino acid substitution, insertion, deletion, etc. has occurred, and the non-mutated or It may also contain a portion of the mutated CRBN protein.
  • the term "CRBN gene” includes a base sequence encoding all of the above-described CRBN proteins.
  • CRBN protein of the present invention may be a human cerebron protein represented by the amino acid sequence of Human CRBN (442 aa) of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the term "agent for measuring the expression level of the mRNA of CRBN or its protein” means a molecule that can be used to confirm the expression level of the CRBN gene or the protein encoded by these genes of the present invention, preferably May be a primer pair, a probe or antisense nucleotide that specifically binds to the CRBN gene, or an antibody or aptamer specific for the protein encoded by the CRBN gene.
  • an antibody is a term known in the art and refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to the marker of the present invention, and such an antibody clones each gene into an expression vector according to a conventional method to obtain a protein encoded by the marker gene.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and any polyclonal antibody, monoclonal antibody, or any one having antigen-binding properties is also included in the antibody of the present invention, and all immunoglobulin antibodies are included. Furthermore, the antibody of the present invention also includes special antibodies such as humanized antibodies.
  • the antibody against the protein encoded by the biomarker gene of the present invention may be any antibody that can be prepared by a method known in the art.
  • an antibody used for detection of a cancer diagnostic marker of the present invention may include a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains as well as functional fragments of antibody molecules.
  • the functional fragment of the antibody molecule means a fragment having at least an antigen-binding function, and may be Fab, F(ab'), F(ab') 2 , Fv, etc., but is not particularly limited thereto.
  • the kit is one selected from the group consisting of a monoclonal antibody produced by a hybridoma cell of accession number KCTC18596P and a monoclonal antibody produced by a hybridoma cell line of accession number KCTC18598P. It includes the above monoclonal antibodies, and the description of these antibodies will be described in more detail in the fourth aspect of the present invention.
  • the term "aptamer” refers to a single-stranded oligonucleotide, and refers to a nucleic acid molecule having binding activity to a predetermined target molecule.
  • the aptamer may have various three-dimensional structures according to its base sequence, and may have high affinity for a specific substance such as an antigen-antibody reaction.
  • the aptamer can inhibit the activity of a given target molecule by binding to a given target molecule.
  • the aptamer of the present invention may be RNA, DNA, a modified nucleic acid, or a mixture thereof, and the form thereof may be linear or cyclic, but is not limited thereto.
  • the aptamer having binding activity to CRBN can be easily prepared by a person of ordinary skill in the art by referring to each nucleotide sequence according to a known method.
  • the term "primer” is a nucleic acid sequence having a short free 3'hydroxyl group, which can form a complementary template and a base pair, and is a starting point for copying the template. It refers to a short nucleic acid sequence that functions as a branch.
  • PCR amplification is performed using the sense and antisense primers of the marker polynucleotide of the present invention to predict the diagnosis or prognosis of hepatocellular carcinoma through the degree of production of a desired product.
  • the PCR conditions, the length of the sense and antisense primers can be modified based on those known in the art.
  • the term "probe” refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a short number of bases to several hundreds of bases capable of specific binding to mRNA, and is labeled You can check the presence or absence of a specific mRNA.
  • the probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, or the like.
  • hybridization is performed using a probe complementary to the CRBN polynucleotide of the present invention, and the prognosis of hepatocellular carcinoma can be predicted through the degree of hybridization. Selection of suitable probes and conditions for hybridization can be modified based on those known in the art.
  • the primer or probe of the present invention can be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support method or other well known method.
  • Such nucleic acid sequences can also be modified using a number of means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, encapsulation, substitution of one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkers (e.g., methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoro Amidates, carbamates, etc.) or to charged linkers (eg phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
  • uncharged linkers e.g., methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoro Amidates, carbamates, etc.
  • charged linkers eg phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.
  • the kit of the present invention can be used to predict the diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma by checking the mRNA expression level of the CRBN gene or the expression level of the protein encoded by these genes.
  • the kit for measuring the mRNA expression level of the CRBN gene may be a kit including essential elements necessary for performing RT-PCR.
  • RT-PCR kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerase and reverse transcriptases, DNase, RNase inhibitors, DEPC-water, in addition to each primer pair specific for the marker gene. DEPC-water), sterilized water, and the like.
  • the kit of the present invention may be a kit for detecting CRBN including essential elements necessary for performing a DNA chip.
  • the DNA chip kit includes a substrate to which cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached as a probe, and the substrate may include a cDNA corresponding to a quantitative control gene or a fragment thereof.
  • the kit for measuring the expression level of a protein encoded by CRBN in the present invention is a substrate, a suitable buffer solution, 2 labeled with a color developing enzyme or a fluorescent substance for immunological detection of an antibody. Secondary antibodies and chromogenic substrates, and the like.
  • the substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96-well plate synthesized with polyvinyl resin, a 96-well plate synthesized with polystyrene resin, and a slide glass made of glass, and the coloring enzyme is peroxidase, alkaline force. Fatase (alkaline phosphatase) can be used, FITC, RITC, etc.
  • ABTS 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
  • OPD o-phenylenediamine
  • TMB tetramethyl benzidine
  • the kit of the present invention may include a monoclonal antibody produced by a hybridoma cell of accession number KCTC18596P and/or a monoclonal antibody produced by a hybridoma cell line of accession number KCTC18598P provided in the present invention.
  • the kit of the present invention may further comprise a composition, solution or device having one or more other components suitable for the assay method.
  • a second aspect of the present invention relates to a method of providing information for diagnosis of hepatocellular carcinoma comprising the following steps:
  • the method for providing information for diagnosis of hepatocellular carcinoma of the present invention comprises: (c) a normal individual whose level of mRNA or protein expressed therefrom is measured in the biological sample of step (a) or the biological sample of the individual of step (a). If it is higher than that measured in the biological sample isolated from, it may further include determining as hepatocellular carcinoma.
  • the term "measurement of mRNA expression level” is a process of determining the presence and expression level of the CRBN gene in a biological sample, and can be determined by measuring the amount of mRNA. Analysis methods for this include RT-PCR, competitive RT-PCR, Real-time RT-PCR, RNase protection method, and northern blotting. Alternatively, there may be a DNA chip (DNA chip technology), but is not limited thereto.
  • protein expression level measurement is a process of determining the presence and expression level of a protein expressed in the CRBN gene in a biological sample, and an antibody that specifically binds to the protein expressed in the gene is Can be used to determine the amount of protein. Analysis methods for this include western blotting, ELISA (enzyme linked immunosorbentassay), radioimmunoassay (RIA), radial immunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, and rocket immunity. Rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, immunofluorescence, immunochromatography, FACS analysis ( fluorescenceactivated cell sorter analysis) or protein chip technology, but is not limited thereto.
  • biological sample refers to tissues, cells, whole blood, phlegm, serum, plasma, saliva, brain, skin, lymph nodes, spinal cord, cell culture supernatant, saliva, urine, ruptured eukaryotic cells and bacterial expression systems, etc. However, it is not limited thereto. These biological samples can be reacted with the monoclonal antibody of the present invention with or without manipulation to predict the presence of CRBN protein or the diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma.
  • the term "individual" of the present invention may mean all animals including humans who have developed or are likely to develop hepatocellular carcinoma.
  • the animals may be mammals such as cattle, horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, dogs, cats, etc. in need of treatment for symptoms similar to humans, but are not limited thereto.
  • abnormal individual of the present invention means an individual who has not developed hepatocellular carcinoma or is not suspected of developing hepatocellular carcinoma.
  • the expression level of the CRBN gene can be measured at the mRNA level or the protein level, and the isolation of the mRNA or protein from the biological sample can be performed using a known process.
  • I can.
  • the analysis method for measuring the mRNA level and the analysis method for measuring the protein level are as described above.
  • the method for providing information for the diagnosis of hepatocellular carcinoma of the present invention is a monoclonal antibody produced by hybridoma cells of accession number KCTC18596P and/or a monoclonal antibody produced by hybridoma cell line of accession number KCTC18598P provided in the present invention. This can be done using antibodies.
  • the present invention uses the monoclonal antibody to react with the CRBN protein of an isolated biological sample of an individual suspected of hepatocellular carcinoma or an individual who wants to check the prognosis after hepatocellular carcinoma surgery. It provides a method for providing information for diagnosing or predicting prognosis of hepatocellular carcinoma, comprising the step of detecting through.
  • the method of providing information for diagnosing or predicting the prognosis of hepatocellular carcinoma of the present invention is to react the CRBN-specific monoclonal antibody of the present invention with an isolated biological sample of an individual suspected of hepatocellular carcinoma or a patient with hepatocellular carcinoma, and form an antigen-antibody complex.
  • By detecting the CRBN protein it is possible to provide information for diagnosing hepatocellular carcinoma or predicting prognosis. Since CRBN is overexpressed in hepatocellular carcinoma, hepatocellular carcinoma can be diagnosed by comparing the expression level with a control such as normal cells or surrounding normal tissues, and the prognosis after surgery can be predicted, but is not limited thereto.
  • the term "antigen-antibody complex” refers to a combination of a CRBN protein antigen in a sample and a monoclonal antibody according to the present invention that recognizes it, and the formation of such an antigen-antibody complex is performed by a colormetric method, and Any method selected from the group consisting of an electrochemical method, a fluorescence method, a luminometry, a particle counting method, a visual assessment, and a scintillation counting method Can be detected. However, it is not necessarily limited to these, and various applications and applications are possible.
  • markers can be used to detect the antigen-antibody complex.
  • Specific examples may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent substances, ligands, luminescent substances, microparticles, and radioactive isotopes, but are not necessarily limited thereto.
  • Enzymes used as detection markers include acetylcholinesterase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, horseradish peroxidase, ⁇ -latamase, and the like, and fluorescent substances include fluorescein.
  • Phosphorus, Eu 3+ , Eu 3+ chelate or cryptate, etc. as a ligand, a biotin derivative, etc., as a luminescent material, an acridinium ester, an isoluminol derivative, etc., and a colloid as a microparticle Contains gold, colored latex, and the like, and radioactive isotopes include 57 Co, 3 H, 125 I, 125 I-Bonton Hunter's reagent and the like.
  • the antigen-antibody complex can be detected using an enzyme immunosorbent assay (ELISA).
  • Enzyme immunosorbent involves direct ELISA using a labeled antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, and an indirect ELISA using a labeled secondary antibody that recognizes the capture antibody in a complex of antibodies that recognize an antigen attached to a solid support.
  • ELISA direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes an antigen in a complex of an antibody and an antigen attached to a solid support, after reacting with another antibody that recognizes an antigen in a complex of an antibody and an antigen attached to a solid support It includes various ELISA methods, such as indirect sandwich ELISA using a labeled secondary antibody that recognizes this antibody.
  • the monoclonal antibody of the present invention specifically recognizes CRBN using the antigen-antibody reaction, and at this time, it was confirmed that it has superior detection ability compared to the commercially available CRBN polyclonal antibody. By doing so, it was demonstrated that the antibody of the present invention can be usefully used for diagnosis or prognosis of hepatocellular carcinoma.
  • a third aspect of the present invention relates to a method of providing information for predicting the prognosis of hepatocellular carcinoma comprising the following steps:
  • the method for providing information for predicting the prognosis of hepatocellular carcinoma of the present invention includes (c) the mRNA of the CRBN gene measured in a biological sample isolated from the hepatocellular carcinoma tissue in step (a) or the level of the protein expressed therefrom. It may further include determining that it has a poor prognosis if it is twice or more higher than that measured in the biological sample isolated from.
  • the level of the mRNA of the CRBN gene or the protein expressed therefrom measured in a biological sample isolated from the hepatocellular carcinoma tissue in step (a) is determined from surrounding normal tissues. If it is more than twice as high as measured in the isolated biological sample, it can be classified as a high-expressing CRBN group, and if it is less than two-fold, it can be classified as a low-expressing CRBN group.
  • the level of additional hepatocellular carcinoma biomarkers from biological samples isolated from patients in the high-expression group The accuracy of prognosis prediction can be improved by checking.
  • the method of providing information for predicting the prognosis of hepatocellular carcinoma of the present invention may specifically further include the following steps:
  • step (d-1) The level of the CRBN gene mRNA or protein expressed therefrom measured in the biological sample isolated from the hepatocellular carcinoma tissue in step (a) is twice that measured in the biological sample isolated from the surrounding normal tissue. If the abnormality is high, classifying the CRBN high-expression patient group, and if less than two times, classifying the CRBN low-expression patient group;
  • the expression level of the CRBN gene can be measured at the mRNA level or the protein level, and the isolation of the mRNA or protein from the biological sample is performed using a known process. can do.
  • the analysis method for measuring the mRNA level and the analysis method for measuring the protein level are as described in the method for providing information for diagnosis of hepatocellular carcinoma.
  • the mRNA of the CRBN gene measured from a sample of a hepatocellular carcinoma patient whose prognosis is known, or the amount of expression of the protein expressed therefrom, and the mRNA of the CRBN gene measured from a sample of a patient who wants to know the prognosis, or expressed therefrom It can be used to predict the prognosis of HCC patients by comparing the expression level of the protein and determining whether the expression level is increased or decreased. That is, as a result of comparing the expression levels, if the sample of the patient who wants to know the prognosis shows the expression level or expression pattern similar to that of the patient's known good prognosis, it can be predicted that it will have a good prognosis. If the expression level or expression pattern is similar to that of a known patient sample, it can be predicted that it will have a poor prognosis.
  • the prognosis of a patient with hepatocellular carcinoma can be accurately predicted, and an appropriate treatment plan can be established according to the predicted prognosis. For example, for patients judged to have a good prognosis, it may be decided to pursue standard treatment or less invasive treatment options, and for patients judged to have a poor prognosis, use for patients with advanced stage hepatocellular carcinoma. You may decide to pursue a treatment that is either very aggressive or experimental.
  • the term “good prognosis” does not progress to stage II, microvascular invasion does not occur, the cumulative tumor recurrence rate after surgery is low, or the survival rate after surgery is high. Can mean that.
  • the term “poor prognosis” may mean that stage II progresses, microvascular infiltration occurs, a cumulative tumor recurrence rate after surgery is high, or a survival rate after surgery is low.
  • the term "hepatocellular carcinoma patient with known prognosis” refers to a patient whose disease progression has been revealed among patients diagnosed with hepatocellular carcinoma.
  • a patient or surgery confirmed to have a poor prognosis due to recurrence after undergoing a surgical operation due to hepatocellular carcinoma Patients who survive without recurrence after undergoing surgery or who have been cured and confirmed to have a good prognosis.
  • patients who want to know the prognosis by obtaining and comparing the expression level or expression pattern of the mRNA of the CRBN gene or the protein expressed therefrom from samples collected from patients with known prognosis and samples from patients who want to know the prognosis.
  • the prognosis can be accurately predicted.
  • the progression from "poor prognosis" to "stage II” is according to the AJCC classification, one of the staging systems of hepatocellular carcinoma, which is universally used, and AJCC classification Is known to be effective in distinguishing the prognosis of surgical patients (Ueno S et al., Hepatol Res 2002;24:395-403.)
  • AJCC classification one of the staging systems of hepatocellular carcinoma, which is universally used
  • AJCC classification Is known to be effective in distinguishing the prognosis of surgical patients Ueno S et al., Hepatol Res 2002;24:395-403.
  • the information provision method for predicting the prognosis of hepatocyte box of the present invention patients predicted with poor prognosis In addition to AJCC classification, UICC/AJCC, Okuda weapon, CLIP (Cancer of the Liver Italian Program) weapon, French weapon, CUPI (Chinese University Prognostic Index), JIS (Japan Integrated Staging
  • AFP refers to alpha-fetoprotein
  • blood (or serum) AFP measurement among tumor marker tests is the most commonly used diagnostic test for hepatocellular carcinoma.
  • hepatocellular carcinoma has a clear limitation in predicting prognosis of Dail biomarkers due to the characteristics of patients with oncological diversity and cirrhosis.
  • the present inventors confirmed that by detecting CRBN alone and CRBN and AFP in combination, the accuracy of diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma can be improved (Table 3). Accordingly, by detecting CRBN alone and a combination of CRBN and AFP, hepatocellular carcinoma We proposed a method to diagnose HCC patients early and accurately and to predict the prognosis of HCC patients more accurately and in detail after surgery.
  • the fourth aspect of the present invention relates to a monoclonal antibody that specifically binds to CRBN, and is produced by a monoclonal antibody produced by hybridoma cells of accession number KCTC18596P and/or hybridoma cells of accession number KCTC18598P. It provides a monoclonal antibody that specifically binds to Cerebron (CRBN).
  • the term "monoclonal antibody” refers to an antibody molecule of a single molecular composition obtained from substantially the same antibody population, and such monoclonal antibody exhibits a single binding specificity and affinity for a specific epitope.
  • immunoglobulins have a heavy and light chain and each heavy and light chain comprises a constant region and a variable region (the region is also known as a domain).
  • the variable regions of the light and heavy chains include three multivariable regions and four structural regions (framework regions, FRs) called complementarity-determining regions (hereinafter referred to as "CDR").
  • the CDRs mainly play a role in binding to the epitope of the antigen.
  • the CDRs of each chain typically start from the N-terminus and are sequentially referred to as CDR1, CDR2, and CDR3, and are also identified by the chain in which a particular CDR is located.
  • the monoclonal antibody may be in the form of a chimeric antibody or a humanized antibody with reduced immunogenicity for application to the human body.
  • chimeric antibody refers to an antibody obtained by recombining the variable region of a mouse antibody and the constant region of a human antibody by DNA recombination technology, and the immune response of the chimeric antibody is Compared to that, it is greatly improved, so it can be used clinically.
  • the term "humanized antibody” refers to an antibody in which all or a part of the CDR sequence of a mouse monoclonal antibody is grafted onto a human antibody.
  • the CDR of a mouse monoclonal antibody is derived from a human antibody.
  • the humanized variable region may be prepared by recombination with the FR of and may be prepared by recombining it with the constant region of a desirable human antibody, but is not limited thereto.
  • the affinity of the humanized antibody is lowered, so the affinity can be improved by replacing the FR amino acid residue, which may affect the three-dimensional structure of the CDR, with an amino acid of the mouse antibody.
  • the term "monoclonal antibody specifically binding to the CRBN (cereblon) protein” refers to an antibody capable of inhibiting the biological activity of the CRBN protein by binding to the CRBN protein.
  • the anti-CRBN antibody and Can can be used interchangeably.
  • the form of the monoclonal antibody of the present invention may include both whole antibodies and antibody fragments, and may be modified into chimeric antibodies or humanized antibodies.
  • the CRBN protein is known to inhibit phosphorylation (activation) of AMPK by directly binding to the ⁇ subunit of the AMPK trimer, which is an intracellular energy sensor.
  • the present inventors have found that the expression of CRBN is remarkably increased in hepatocellular carcinoma patients and prepared a monoclonal antibody capable of specifically detecting this.
  • the monoclonal antibody of the present invention specifically binds to the site of CRBN Pep2: C-DMEEFHGRTLHD (SEQ ID NO: 3), and/or Pep5: C-DRIKKQLREWDENLKD (SEQ ID NO: 6) to specifically detect the expression level of CRBN
  • Pep2 C-DMEEFHGRTLHD (SEQ ID NO: 3)
  • Pep5 C-DRIKKQLREWDENLKD (SEQ ID NO: 6) to specifically detect the expression level of CRBN
  • it since it has high sensitivity and specificity in diagnosing hepatocellular carcinoma or predicting prognosis after surgery, it can be usefully used for diagnosing and predicting hepatocellular carcinoma.
  • the CRBN amino acid Pep2 C-DMEEFHGRTLHD (63-74 aa) (SEQ ID NO: 3)
  • Pep4 C-GRQRFKVLELRTQSD (161-175aa) (SEQ ID NO: 5) site
  • Pep5 C-DRIKKQLREWDENLKD (255 ⁇ 270aa) (SEQ ID NO: 6)
  • a monoclonal antibody specifically binding to the CRBN of the present invention was prepared by using a fusion protein containing the site as an antigen protein (Example 1).
  • the monoclonal antibody provided in the present invention not only specifically binds to CRBN, but also has a remarkably strong binding force compared to the commercially available CRBN polyclonal antibody. It was confirmed that the monoclonal antibody of the present invention was significantly overexpressed in hepatocellular carcinoma cells than in surrounding normal tissues, and decreased the activities of cancer metastasis-related MMP-2 and MMP-9 in liver cancer cell lines in which CRBN expression was suppressed, while CRBN overexpression It was confirmed that the activity of MMP-9 was increased in a CRBN protein-dependent manner in liver cancer cell lines.
  • the CRBN expression level it was classified into a high-expression group and a low-expression group, and as a result of follow-up investigation of clinical indicators, it was confirmed that the progression of the HCC stage, the survival rate following HCC surgery, and the tumor recurrence rate can be predicted at a meaningful level.
  • the present invention provides a method for preparing the monoclonal antibody described above.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be easily prepared by known monoclonal antibody manufacturing techniques.
  • a method of preparing a monoclonal antibody can be performed by preparing a hybridoma using B lymphocytes obtained from an immunized animal (Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495), or phage display (phage display). display) technology, but is not limited thereto.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be obtained from hybridoma cells produced by a cell fusion method known in the art.
  • Hybridoma cells that secrete monoclonal antibodies are produced by fusing immune cells from an immunologically suitable host animal such as a mouse injected with an antigenic protein and a cancer cell line. The fusion of these two cells is fused through a method using polyethyleneglycol known in the art, and the antibody-producing cells are proliferated by a standard culture method. After subcloning by limited dilution is performed to obtain a homogeneous cell population, hybridoma cells capable of producing antigen-specific antibodies are cultured in large quantities in vitro or in vivo.
  • Myeloma cells used for cell fusion include mouse-derived p3/x63-Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP-2/0, F0, P3x63 Ag8, V653, S194, rat-derived R210, etc.
  • Various cell lines can be used.
  • the cell line used in a specific example of the present invention is myeloma cells SP-2/0.
  • the above-mentioned hybridoma produced monoclonal antibody can be used without purification, and also various conventional methods such as dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, size exclusion chromatography, affinity chromatography It can be used after being purified with high purity using the same.
  • monoclonals are selected by enzyme immunosorbent method (ELISA).
  • the monoclonal antibody of the present invention can be prepared by a phage display method known in the art.
  • An antibody library using phage display technology is a method of expressing an antibody on the surface of phage by obtaining an antibody gene from B lymphocytes immediately without making hybridomas.
  • phage display technology many existing difficulties associated with producing monoclonal antibodies by B-cell immortalization can be overcome.
  • phage display technology includes: 1) inserting a random sequence of oligonucleotides into a gene site corresponding to the N-terminus of a coat protein pIII (or pIV) of the phage; 2) expressing a fusion protein of a portion of the native envelope protein and a polypeptide encoded by the random sequence oligonucleotide; 3) treating a receptor material capable of binding to the polypeptide encoded by the oligonucleotide; 4) eluting the peptide-phage particles bound to the receptor using a low pH or binding competitive molecule; 5) amplifying the phage eluted by panning in the host cell; 6) repeating the method to obtain the desired amount; And 7) determining the sequence of an active peptide from the DNA sequences of the phage clones selected by panning.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be prepared from hybridoma cells.
  • Polynucleotides encoding monoclonal antibodies or phage display clones derived from hybridomas of the present invention can be easily isolated and sequenced using conventional procedures.
  • oligonucleotide primers designed to specifically amplify the heavy and light chain coding regions from hybridoma or phage template DNA can be used.
  • the polynucleotide Once the polynucleotide is isolated, it can be put into an expression vector, and then the expression vector can be introduced into a suitable host cell to produce a desired monoclonal antibody from a transformed host cell (ie, a transformant).
  • the method for producing the monoclonal antibody of the present invention may be a method for producing a monoclonal antibody, including a step of amplifying an expression vector containing a polynucleotide encoding the monoclonal antibody, but is not limited thereto.
  • the synthesized peptide was conjugated to Keyhole limpet hemocyanin (KLH) and Bandeiraea simplicifolia agglutinin (BSA) using SMCC (Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate) and then subjected to ELISA screening.
  • KLH Keyhole limpet hemocyanin
  • BSA Bandeiraea simplicifolia agglutinin
  • SMCC Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate
  • the recombinant CRBN antigen proteins PEP2, PEP4 and PEP5 (each 30 ⁇ g/ ⁇ l) prepared in Example 1 were mixed and phosphate buffered saline (PBS).
  • Emulsions were prepared by diluting in 150 ⁇ l and mixing with an equal volume of complete Freund's adjuvant (Sigma). The emulsion was injected into the abdominal cavity of BALB/C (female, 8 weeks old) mice 4 times at 3 weeks intervals, 200 ⁇ l each.
  • BALB/C female, 8 weeks old mice 4 times at 3 weeks intervals, 200 ⁇ l each.
  • the spleen was excised and used for cell fusion 3 days after administration of the recombinant CRBN protein purified by tail vein.
  • myeloma cells were prepared for cell fusion.
  • SP2/O cells which are myeloma cells, were cultured, and the cell density was set to 2.5 ⁇ 5 ⁇ 10 4 /ml. SP2/O cells were diluted by 1/3 and prepared 24 hours before cell fusion.
  • Cell fusion was performed as follows according to a general method using polyethylene glycol (Ed Harlow, David Lane: Antibodis, A laboratory manual. Cold Springs Harbor press, 1988 P139-244).
  • the immunized mouse was anesthetized with ether and spleen cells located on the left side of the body were It was extracted. Splenocytes from the extracted spleen were isolated using a cell strainer (Falcon, USA), and diluted to a concentration of 1 ⁇ 10 8 cells/ml. 1 ⁇ 10 7 cells/ml of myeloma cells and 1 ml of PEG1500 (Sigma, USA) were mixed and fused.
  • the cells were diluted in 200 ml of HAT (Sigma, USA) medium and then dispensed into 96-well microplates by 100 ⁇ l, and cultured in a 37° C. incubator supplied with 5% carbon dioxide.
  • HAT Sigma, USA
  • fusion cells that react specifically to CRBN were selected and screened using an enzyme immunological method to confirm whether or not antibodies were produced.
  • the medium was exchanged on days 8 to 9, and cultured in cDMEM2 until well grown from 96 wells to 24 wells.
  • the supernatant of the well changed color was collected and filled with cDMEM2, followed by ELISA test.
  • wells were selected and transferred to 24 wells for culture. After culturing in 24 wells, ELISA test was again performed. Specifically, the concentration of the fused cells in 24 wells was checked, and the fused cells were diluted in 15 ml of the culture solution so that 0.5 cells/well in a 96 well plate. The fusion cell dilution solution was dispensed 150 ⁇ l per well.
  • a well containing one cell was checked by microscopic examination.
  • the supernatant of the well in which the cells were grown to some extent was harvested and confirmed by ELISA and Western blot, followed by primary screening.
  • the fusion cells selected based on the first screening were transferred to 24 wells, cultured, centrifuged, and the supernatant was harvested and confirmed by ELISA and Western blot, followed by secondary screening.
  • the fused cells selected based on the third screening were transferred to a 75T/C culture flask and cultured, and the absorbance was checked by ELISA to select only fused cells with an absorbance greater than 1.
  • the finally selected fusion cells were named 1D3 and 4E11, respectively, and were deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Gene Bank (KCTC) as of August 30, 2017 (accession numbers: KCTC18596P (4E11), KCTC18598P (1D3)).
  • Example 2 In order to produce monoclonal antibodies against CRBN from the final hybridoma cells selected in Example 2 ("1D3" and "4E11"), Pristane in the abdominal cavity of 7 to 8 weeks old female Balb/C mice (pristane) 500 ⁇ l was injected. The fused cells cultured in a 75T/C culture flask were collected and centrifuged, and then the supernatant was removed, put into phosphate buffer, and pipetted. 7 to 10 days after administration of Pristane, the fused cells [1D3 and 4E11] selected in Example 2 were injected into the peritoneal cavity of the mouse with 8 ⁇ 10 5 to 4 ⁇ 10 7 respectively.
  • Protein G Fast Flow Bed stored in the stock solution (20% ethanol) was filled into the column in an appropriate amount, and 20% ethanol was poured down, and then washed with 5 Bed Volum of binding buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0).
  • the ascites solution was diluted in an appropriate amount with phosphate buffer and then loaded onto the Protein G column.
  • 3 Bed Volum's binding buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0) 0.5 ml of fractions were eluted with 3 Bed Volum's elution buffer (0.1 M glycine buffer, pH 3.0-2.5). Each fraction was neutralized with 35 ⁇ l of neutralization buffer (1 M Tris-HCl, pH 9.0).
  • the hybridoma cells (1D3 and 4E11) of the present invention all had a binding reaction with the peptide derived from Cerebron, and in particular, it was found that the 4E11 clone showed a cross-reaction with PEP2 and PEP5.
  • ELISA was performed to determine the isotype of the monoclonal antibody prepared in Example 3. Specifically, purified antibodies against each isotype of mice fished from rabbits were diluted to 10 ⁇ g/ml in carbonate buffer (pH 9.4) and then used in Maxisorp ELISA plates (Nunc, USA). 100 ⁇ l was added to each well, and reacted at 4° C. for 16 hours to coat the antibody. Each well coated with each isotype antibody was treated with a blocking buffer solution containing 1% BSA (PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA, 3% heat inactive horse serum) at 37°C for 1 hour. The reaction was blocked.
  • BSA PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA, 3% heat inactive horse serum
  • TMB 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine
  • substrate solution 100 ⁇ l of TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) (Sigma, USA) substrate solution was added to each well, reacted in the dark for 30 minutes to develop color, and then treated with 2N H 2 SO 4 The enzyme reaction was stopped. After the reaction, the absorbance was measured at 450 nm using an ELISA reader (Perkinelmer Victor X3). The results are shown in [Table 2].
  • Hepatocellular carcinoma tissue and surrounding normal liver tissue were cut into 5 ⁇ m using a microtome in a frozen state and then in a phosphate buffer (1 M Na 2 HPO 4 77.4 ml, 1 mM Na 2 HPO 4 22.6 ml, distilled water 900 ml) for 30 minutes at room temperature. ) was fixed to the slide with 4% paraformaldehyde. The fixed tissue was permeated in 0.5% Triton X-100 (Merck, Darmstadt, Germany) for 5 minutes and 2% NGS (normal goat serum) and 2% NGS (normal goat serum) and PBS (phosphate-buffered saline) for 1 hour at room temperature. goat serum) and incubated with a solution to block (blocking).
  • Triton X-100 Merck, Darmstadt, Germany
  • a primary antibody E-cadherin, 1:500, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA and N-cadherin, 1:500, Abcam
  • the primary antibody was detected with fluorescein isothiocyanate (FITC) or CY3 (cyanin) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), and the secondary antibody, anti-rabbit, 1:500 , Invitrogen) or anti-mouse (anti-mouse, 1:2000, Invitrogen) at room temperature for about 1 hour.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • CY3 cyanin
  • anti-rabbit 1:500
  • Invitrogen Invitrogen
  • anti-mouse anti-mouse, 1:2000, Invitrogen
  • Total protein was cultured and extracted by dissolving in Pro-Prep protein extraction solution (iNtRON Biotechnology, Boca Raton, FL, USA) at -20°C for 30 minutes. The lysate was centrifuged at 4° C. for 5 minutes at 20,217 x g. Protein concentration was measured using the Standard Bradford Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
  • the extracted 60 ⁇ g of protein was subjected to electrophoresis with 10% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel) at room temperature and at 80 to 120 V, and the separated protein was subjected to PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane at 4°C at 260 mA at 90 After moving for a minute, it was fixed for 1 hour at room temperature with 5% skim milk. A primary antibody was added to the fixed cell membrane, followed by incubation at 4° C. overnight.
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • polyclonal CRBN antibody (Sigma) was diluted 1:1000 in 5% skim milk, and actin (anti-rabbit) as a control was diluted 1:5000 in 5% skim milk. After incubation at 4° C. overnight, washing was repeated three times for 20 minutes with 1X TBST (Nacl 8.766 g/ Tris-base 1.211 g/ Tween20 500 ⁇ l).
  • anti-mouse was diluted 1:2000 in 5% skim milk, incubated for 2 hours at room temperature, and washed three times for 20 minutes with 1X TBST, and the protein band was electrogenerated chemiluminescent (ECL). Visualization was performed using reagents (Millipore, Billerica, MA, USA). The density of the appropriate band was analyzed by measuring the reflectance density of a Bio-Rad GS-670 imaging densitometer.
  • the medical records were reviewed retrospectively for 40 patients. Age, sex, operation name, preoperative ICG value, presence of hepatitis B surface antibody, and preoperative AFP and PIVKA were investigated. Based on histologic examination after surgery, liver cirrhosis, size and number of hepatocellular carcinoma, microvascular invasion, and stage were investigated. The disease-free period, recurrence, survival period and survival were investigated after surgery.
  • the clinical indicators according to the expression level of the CRBN protein were compared with the recurrence and survival after surgery.
  • a Chi-Square test was used, and continuous variables were compared with Student's t-test.
  • the recurrence rate and survival rate were determined by the Kaplan-Meier method. Compared with the log-rank test. Statistical significance was determined when the p-value was less than 0.05.
  • AFP a diagnostic marker for hepatocellular carcinoma
  • Chang Liver(HeLa derivative) cell line (Sigma-Aldrich): a normal hepatocyte-like cell line derived from HeLa
  • HepG2 cell line (Korean Cell Line Bank): obtained from hepatoblastoma of a 15-year-old male, the most representative cell line for studying human liver models
  • Hepa1c1c7 cell line (CRL-2026): mouse-derived liver cancer cell line
  • MMP-2 and MMP-9 72 kDa and 95 kDa can be simultaneously confirmed on a gel, so it is easy to check whether MMP-2 and MMP-9 are activated.
  • collagenase buffer [50 mM Tris, 5 mM CaCl 2 , 1% Triton X-100] was added and placed in a shaker at 37°C to react. After 24 hours, the gel was washed once with 2.5% Triton X-100 solution, and stained with Coomassie Blue solution [1% Coomassie brilliant blue R250, 30% methanol, 10% acetic acid] for 2 hours. , The gel was observed by decolorizing twice for 30 minutes with a decolorization solution [30% methanol, 10% acetic acid].
  • CRBN KD-HCC primary hepatocellular carcinoma cell line

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Abstract

본 발명은 간세포암 진단용 바이오마커로서의 세레브론의 용도 및 세레브론 (Cereblon, CRBN)에 특이적인 신규한 단일클론항체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CRBN을 간세포암 진단용 바이오마커로 하여, 간세포암를 진단하거나 또는 예후를 예측하기 위한 조성물, 키트, 간세포암의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법, CRBN에 특이적으로 결합하는 2종의 신규한 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포에 관한 것이다. CRBN 단백질의 발현량 차이는 간세포암 환자의 조기 진단뿐만 아니라, 종래 간세포암 예후 예측에 중요한 인자인 미세혈관 침윤 여부보다 더욱 뛰어난 예측력을 나타내어 간세포암 진단 및 간 절제 수술 후 예후를 평가하기 위한 진단 마커로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

간세포암 진단용 바이오마커 세레브론 및 이에 특이적인 신규한 단일클론항체
본 발명은 간세포암 진단용 바이오마커로서의 세레브론의 용도 및 세레브론 (Cereblon, CRBN)에 특이적인 신규한 단일클론항체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CRBN을 간세포암 진단용 바이오마커로 하여, 간세포암를 진단하거나 또는 예후를 예측하기 위한 조성물, 키트, 간세포암의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법, CRBN에 특이적으로 결합하는 2종의 신규한 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포에 관한 것이다.
간세포암은 간에서 발생하는 원발성 간암으로 2014년 국가 암 등록 통계에 따르면 전체 암 중 발생률이 6위에 해당되나 5년 생존율은 32.8%에 불과하여 발생빈도 대비 사망률이 매우 높은 암이다. 특히 간염 바이러스 보균율이 높은 우리나라를 포함한 아시아권에서는 발생 빈도가 높을 뿐만 아니라, 암 발생대비 2~3위의 사망률을 나타낼 정도로 예후가 불량한 암 중의 하나로 예방과 조기 발견이 중요하다.
현재까지 간세포암의 절제 후 예후 판정에는 종양 크기 및 개수, 미세혈관침윤(microvascular invasion), FDG-PET CT 소견 및 종양표시자(AFP, PIVKA-II [DCP]) 등을 참조하였으나, 조기 간세포암에서는 이와 같은 종양 특성을 나타내는 인자들이 대부분 낮게 나와서 변별력이 떨어지는 심각한 한계점이 있었다.
국내에 진단 마커 개발을 위하여 유전체학, 단백체학, 대사체학과 같은 오믹스를 기반으로 하는 연구가 진행 중이며, BT/IT 등을 응용한 진단 바이오칩 분야는 차세대 성장동력 사업의 일부로 추진 중이나, 아직 국내에서 개발된 바이오마커를 이용한 제품은 그리 많지 않은 실정이다. 매우 다양한 임상 경과를 보이는 간세포암에 있어 신뢰성 있는 예후 예측은 매우 중요한 역할을 할 것이다.
최근 여러 연구에서 세포 내 에너지 센서인 AMPK(adenosine monophosphate-activated protein kinase)의 활성 제어를 통한 항암 효과를 확인한 바 있다. AMPK 는 α, β, γ 세 개의 소단위체로 이루어진 이종삼합 단백질 복합체(heterotrimeric protein complex)로 당, 지질, 콜레스테롤 대사조절에 중요한 역할을 담당한다. 최근 CRL(cullin-ring ubiquitin lipase)의 기질 수용체로 알려진 세레브론(cereblon, CRBN)이 AMPK 삼합체의 α 소단위체와 직접적으로 결합하여 AMPK 의 활성을 억제할 수 있다는 것이 확인되었다.
CRBN 단백질은 뇌, 태반, 망막, 골격근, 간, 신장, 췌장, 비장, 고환, 전립선, 소장 등을 포함하는 다양한 조직에서 발견된다. 종래 CRBN에 대한 연구에 따르면 CRBN 수치를 통해 다발성 골수종과 백혈병에서 면역조절 약물들(immunomodulatory drugs)에 대한 반응을 예측할 수 있으며, 높은 CRBN 수치는 면역조절 약물들의 효과를 높이고 환자 생존과 연관이 있다고 밝혀졌다. CRBN 은 내생적 AMPK의 활성을 억제하는 유일한 단백질로 밝혀져 있으며, 이를 활용하여 다른 종양에 대한 바이오마커 개발이 기대되고 있다.
한편, 대한민국 공개특허 제10-2014-0024914호에는 예측인자로 세레브론 (CRBN)을 사용하는 암 및 염증성 질환의 치료를 위한 방법을 개시하고 있으나, CRBN-DDB1 및/또는 CRBN E3 유비퀴틴-리가아제 복합체에 직접적으로 결합하여 CRBN이 제대로 기능하지 못하도록하는 (malfunction) 화합물을 이용한 치료방법만을 제시하고 있을 뿐, CRBN에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 대해서는 언급한 바가 없다.
이에 본 발명자들은, 간세포암 환자의 조직에서 CRBN 단백질의 발현을 조사하여, 연구 대상 환자에서 수술 후 간세포암의 재발과 생존을 분석하여 간세포암 조기 진단과 예후 예측을 위한 바이오마커로서 CRBN의 가능성을 평가 및 검증하였으며, 또한 CRBN에 특이적으로 결합하는 신규한 2종의 단일클론항체를 제조하여 이의 간세포암 진단 및 예후 예측 가능성을 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 CRBN을 이용한 간세포암 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 CRBN을 이용한 간세포암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CRBN에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간세포암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 항체는 수탁번호 KCTC18596P의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체 및 수탁번호 KCTC18598P의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 단일클론항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단일클론항체를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 조성물을 포함하는 간세포암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 간세포암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 측정된 수준을 정상 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 간세포암 진단을 위한 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 측정된 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 정상 개체 또는 상기 (a) 단계의 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 것보다 높은 경우, 간세포암으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 간세포암의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 간세포암 환자의 간세포암 조직과 이의 주변 정상 조직으로부터 분리된 생물학적 시료에서 각각 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 각 시료에서 측정된 수준을 비교하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 간세포암의 예후 예측을 위한 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계의 간세포암 조직으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 주변 정상 조직으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 것보다 2배 이상 높은 경우 불량한 예후를 가지는 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 간세포암의 예후 예측을 위한 정보제공방법은 다음의 단계를 추가로 포함한다:
(d-1) 상기 (a) 단계의 간세포암 조직으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 주변 정상 조직으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 것보다 2배 이상 높은 경우 CRBN 고발현 환자군으로 분류하고, 2배 미만인 경우 CRBN 저발현 환자군으로 분류하는 단계;
(d-2) 고발현군 환자 및 저발현군 환자로부터 분리된 혈액에서 각각 AFP(α-fetoprotein) 수치를 측정하는 단계; 및
(d-3) 고발현군 환자로부터 분리된 혈액에서 측정된 AFP 수치가 저발현군 환자로부터 분리된 혈액에서 측정된 수치보다 높은 경우 고발현군 환자군 환자가 불량한 예후를 가지는 것으로 판단하는 단계.
추가로, 본 발명은 수탁번호 KCTC18596P의 하이브리도마 세포 및 이에 의해 생산되는, 세레브론 (CRBN)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단일클론항체는 서열번호 3 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 세레브론의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명은 또한, 수탁번호 KCTC18598P의 하이브리도마 세포 및 이에 의해 생산되는, 세레브론(CRBN)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단일클론항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 세레브론의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 CRBN 특이적 단일클론항체는 종래 CRBN 다중클론항체에 비해 진단적 민감도와 특이도가 현저히 향상된 것으로서, 간세포암의 조기 진단 및 수술 후 예후를 예측하는데 효과적이다. 또한, CRBN 단백질의 발현량 차이는 간세포암 환자의 조기 진단 뿐만 아니라, 종래 간세포암 예후 예측에 중요한 인자인 미세혈관 침윤 여부보다 더욱 뛰어난 예측력을 나타내어 간세포암 진단 및 간 절제 수술 후 예후를 평가하기 위한 진단 마커로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 간세포암의 종양 세포 조직과 이의 주변부의 정상세포 조직에서 CRBN 단백질의 발현 정도를 면역조직화학법으로 확인한 사진이다.
도 2는 간세포암 조직(T)과 주변부 정상 조직(N)에서 CRBN 발현량을 웨스턴블랏으로 확인한 결과이다.
도 3은 CRBN 고발현군(아래쪽 그래프선)과 저발현군(위쪽 그래프선)의 누적 종양 재발율(좌) 및 환자 생존율(우)를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 미세혈관 침윤 여부에 따른 누적 종양 재발율(좌) 및 환자 생존율(우)를 비교하여 나타낸 그래프이다(위쪽 그래프선; 미세혈관 침윤이 나타나지 않은 환자군, 아래쪽 그래프선; 미세혈관 침윤이 나타난 환자군).
도 5의 (A)는 세포주에 따른 CRBN 발현 정도를 비교한 웨스턴 블랏 분석, 도 3의 (B)는 세포주에 따른 MMP-9, MMP-2 발현 정도를 비교한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 siRNA를 이용하여 CRBN 유전자 발현을 억제시킨 HepG2 세포주에서 CRBN, MMP-9 및 MMP-2의 발현량을 비교한 결과이다(Scam; 대조군, #1; siRNA 처리군).
도 7은 HA-CRBN(pCDNA3)을 이용하여 CRBN을 활성화시킨 인체 유래 간세포암 일차 배양 세포주에서 MMP-9와 MMP-2의 발현량을 비교한 결과이다(110621; 대조군, HA-CRBN; CRBN 발현 활성화)
도 8은 WT 및 CRBN 넉다운 일차간세포암 세포주 (CRBN KD-HCC)를 이식한 Nude 마우스에서 종양 부피를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 인간 CRBN 단백질 서열 중 단일클론항체 생산에 적합한 항원 펩타이드 서열을 나타낸 것으로, 마우스의 서열과 상동성을 나타낸 도면이다.
상술한 바와 같이, 간세포암은 사망률이 매우 높은 암으로, 예방과 조기 발견이 매우 중요하여 이를 신뢰성 있게 조기에 진단할 수 있는 바이오마커의 개발이 필요한 실정이다. 이에 본 발명자들은 간세포암 조기 진단과 예후 예측을 위한 바이오마커로서 CRBN의 가능성을 평가 및 검증하였으며, 또한 CRBN에 특이적으로 결합하는 신규한 2종의 단일클론항체를 제조하여 이의 간세포암 진단 및 예후 예측 가능성을 입증함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간세포암 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 용어 "CRBN"은 "세레브론"을 지칭한다. 본 발명에서 용어, "CRBN(cereblon) 단백질"은 CRL(cullin-ring ubiquitin ligase)의 기질 수용체로서 세레브론 유전자에 변이가 나타나면 경증 정신지체가 나타난다고 알려져 있다. 또한 CRBN은 AMPK와 직접적으로 결합하여 AMPK의 활성화를 억제하는 단백질로 알려져 있으며, CRBN의 발현을 억제함으로써 AMPK를 활성화시킴으로써 대사질환을 치료할 수 있다는 점이 보고된 바 있다. 상기 CRBN 단백질은 그 종류가 특별히 제한되지는 않으나, 바람직하게는 인간 CRBN 단백질일 수 있다.
CRBN 단백질은 CRBN 유전자에 의해 코딩되며, CRBN 단백질 및 이를 코딩하는 유전자는 진단하고자 하는 개체에서 발생할 수 있는 모든 형태의 CRBN 단백질 및 CRBN 유전자를 각각 포함한다. 구체적으로, 본 발명에서 용어 "CRBN 단백질"은 공지된 442개의 아미노산으로 이루어진 비변이 형태 또는 특정 아미노산의 치환, 삽입, 결실 등이 발생한 변이된 형태의 CRBN 단백질을 포함할 수 있고, 상기 비변이 또는 변이된 CRBN 단백 질의 일부분을 포함할 수도 있다. 또한, 용어 "CRBN 유전자"는 상기 모든 형태의 CRBN 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함한다.
CRBN에 대한 정보는 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession Number가 BC_067811 (Gene ID: 51185)인 CRBN 단백질의 정보일 수 있다. 본 발명의 CRBN 단백질은 하기 서열번호 1의 Human CRBN(442 aa)의 아미노산 서열로 표시되는 인간 세레브론 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[서열번호 1]
MAGEGDQQDA AHNMGNHLPL LPAESEEEDE MEVEDQDSKE AKKPNIINFD TSLPTSHTYL
GADMEEFHGR TLHDDDSCQV IPVLPQVMMI LIPGQTLPLQ LFHPQEVSMV RNLIQKDRTF
AVLAYSNVQE REAQFGTTAE IYAYREEQDF GIEIVKVKAI GRQRFKVLEL RTQSDGIQQA
KVQILPECVL PSTMSAVQLE SLNKCQIFPS KPVSREDQCS YKWWQKYQKR KFHCANLTSW
PRWLYSLYDA ETLMDRIKKQ LREWDENLKD DSLPSNPIDF SYRVAACLPI DDVLRIQLLK
IGSAIQRLRC ELDIMNKCTS LCCKQCQETE ITTKNEIFSL SLCGPMAAYV NPHGYVHETL
TVYKACNLNL IGRPSTEHSW FPGYAWTVAQ CKICASHIGW KFTATKKDMS PQKFWGLTRS
ALLPTIPDTE DEISPDKVIL CL
본 발명에서 용어, "CRBN의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 제제"란 본 발명의 CRBN 유전자 또는 이들 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현수준을 확인하기 위하여 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 CRBN 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드이거나, 또는 CRBN 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머일 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 이러한 본 발명의 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있는 모든 항체가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 키트는 수탁번호 KCTC18596P의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체 및 수탁번호 KCTC18598P의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 단일클론항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단일클론항체를 포함하며, 이들 항체에 대한 설명은 하기 본 발명의 제4 측면에서 보다 상세히 기술하기로 한다.
본 발명에서 용어, "앱타머"란 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.
본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상일 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 상기 CRBN에 결합 활성을 갖는 앱타머는 각각의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 카피를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 본 발명 마커 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 정도를 통해 간세포암의 진단 또는 예후를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브(probe)"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 CRBN 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 간세포암의 예후를 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명의 키트는 CRBN 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 확인함으로써 간세포암의 진단 및 예후를 예측하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, CRBN 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 CRBN을 검출하기 위한 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 CRBN에 의해 코딩된 단백질의 발현수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있으며, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 키트는 본 발명에서 제공되는 수탁번호 KCTC18596P의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체 및/또는 수탁번호 KCTC18598P의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 단일클론항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 분석방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 추가로 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명의 제2 측면은 다음의 단계를 포함하는 간세포암 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 측정된 수준을 정상 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계.
본 발명의 간세포암 진단을 위한 정보제공방법은, (c) 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 측정된 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 정상 개체 또는 상기 (a) 단계의 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 것보다 높은 경우, 간세포암으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어, "mRNA 발현수준 측정"이란 생물학적 시료에서 CRBN 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 DNA 칩(DNA chip technology) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어, "단백질 발현수준 측정"이란 생물학적 시료에서 CRBN 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자에서 발현된 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbentassay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "생물학적 시료"란, 조직, 세포, 전혈, 담, 혈청, 혈장, 타액, 뇌, 피부, 림프절, 척수, 세포 배양 상등액, 타액, 뇨, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 단일클론항체와 반응시켜 CRBN 단백질의 존재 또는 간세포암의 진단 및 예후를 예측할 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"란, 간세포암이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "정상 개체"란, 간세포암이 발병하지 않았거나, 발병이 의심되지 않는 개체를 의미한다.
본 발명의 간세포암의 진단을 위한 정보제공방법에 있어서, 상기 CRBN 유전자의 발현수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다. mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법 및 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 간세포암의 진단을 위한 정보제공방법은 본 발명에서 제공되는 수탁번호 KCTC18596P의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체 및/또는 수탁번호 KCTC18598P의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 단일클론항체를 이용하여 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 구현예로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 이용하여 간세포암이 의심되는 개체 또는 간세포암 수술 후 예후를 확인하고자 하는 개체의 분리된 생물학적 시료의 CRBN 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 간세포암의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 간세포암의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법은 본 발명의 CRBN에 특이적인 단일클론항체를 간세포암이 의심되는 개체 또는 간세포암 환자의 분리된 생물학적 시료와 반응시키고 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 CRBN 단백질을 검출할 수 있으며, 이를 통해 간세포암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보를 제공할 수 있다. CRBN는 간세포암에서 과발현되어 있으므로, 정상 세포 또는 주변 정상 조직과 같은 대조군과 발현량을 비교하여 간세포암을 진단할 수 있으며, 수술 후 예후를 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "항원-항체 복합체"란 시료 중의 CRBN 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.
검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu3+, Eu3+　킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는　57Co,　3H,　125I,　125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.
바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 단일클론항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 항원-항체 반응을 이용하여 본 발명의 단일클론항체가 CRBN을 특이적으로 인지함을 확인하였으며, 이때 상업적으로 판매되는 CRBN 다클론항체에 비하여 뛰어난 검출 능력이 있음을 확인함으로써, 본 발명의 항체는 간세포암의 진단 또는 예후 예측에 유용하게 사용할 수 있음을 입증하였다.
본 발명의 제3 측면은 다음의 단계를 포함하는 간세포암의 예후 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것이다:
(a) 간세포암 환자의 간세포암 조직과 이의 주변 정상 조직으로부터 분리된 생물학적 시료에서 각각 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 각 시료에서 측정된 수준을 비교하는 단계.
본 발명의 간세포암의 예후 예측을 위한 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계의 간세포암 조직으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 주변 정상 조직으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 것보다 2배 이상 높은 경우 불량한 예후를 가지는 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 간세포암의 예후 예측을 위한 정보제공방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 간세포암 조직으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 주변 정상 조직으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 것보다 2배 이상 높은 경우 CRBN 고발현군, 2배 미만인 경우 CRBN 저발현군으로 분류할 수 있으며, 고발현군의 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 추가의 간세포암 바이오마커의 수준을 확인함으로써 예후 예측의 정확도를 높일 수 있다.
이를 위해, 본 발명의 간세포암의 예후 예측을 위한 정보제공방법은 구체적으로 다음의 단계를 추가로 포함할 수 있다:
(d-1) 상기 (a) 단계의 간세포암 조직으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 주변 정상 조직으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 것보다 2배 이상 높은 경우 CRBN 고발현 환자군으로 분류하고, 2배 미만인 경우 CRBN 저발현 환자군으로 분류하는 단계;
(d-2) 고발현군 환자 및 저발현군 환자로부터 분리된 혈액에서 각각 AFP(α-fetoprotein) 수치를 측정하는 단계; 및
(d-3) 고발현군 환자로부터 분리된 혈액에서 측정된 AFP 수치가 저발현군 환자로부터 분리된 혈액에서 측정된 수치보다 높은 경우 고발현군 환자군 환자가 불량한 예후를 가지는 것으로 판단하는 단계.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 다수의 간세포암 환자로부터 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 발현 수준 및/또는 발현 패턴을 측정하고, 측정된 값을 이들 환자의 예후와 함께 데이터베이스화한 후, 예후를 알고자 하는 환자의 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준 및/또는 발현 패턴을 상기 데이터베이스에 입력하여 예후를 예측할 수 있다. 이 경우, 발현 수준 또는 발현 패턴을 비교하기 위한 공지의 알고리즘, 통계분석 프로그램 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 데이터베이스는 간세포암 환자를 병리학적 병기, 치료받은 치료법 등으로 더욱 세분화될 수 있다.
본 발명의 간세포암의 예후 예측을 위한 정보제공방법에 있어서, 상기 CRBN 유전자의 발현 수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다. mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법 및 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법은 상기 간세포암 진단을 위한 정보제공방법에서 설명한 바와 같다.
상기 분석방법들을 통하여, 예후가 알려진 간세포암 환자의 시료로부터 측정한 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현된 단백질의 발현량과 예후를 알고자 하는 환자의 시료로부터 측정한 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현된 단백질의 발현량을 비교할 수 있고, 발현량의 증감 여부를 판단하여 간세포암 환자의 예후를 예측하는데 활용할 수 있다. 즉, 발현량을 비교한 결과, 예후를 알고자 하는 환자의 샘플이 양호한 예후로 알려진 환자의 시료와 비슷한 발현량 또는 발현 패턴을 나타내었다면, 이는 양호한 예후를 가질 것이라고 예측할 수 있고, 반대로 불량한 예후로 알려진 환자의 시료와 비슷한 발현량 또는 발현 패턴을 나타내었다면, 이는 불량한 예후를 가질 것이라고 예측할 수 있다.
따라서, 본 발명의 간세포암의 예후 예측을 위한 정보제공방법에 의하면 간세포암 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있고, 예측된 예후에 따라 적절한 치료계획을 세울 수 있는 이점을 얻을 수 있다. 예컨대, 양호한 예후를 가질 것이라고 판단된 환자에 대해서는 표준 치료 또는 덜 침범적인 치료(invasive treatment) 옵션을 추구하도록 결정할 수 있고, 불량한 예후를 가질 것이라고 판단된 환자에 대해서는 상위 단계의 병기 간세포암 환자에게 사용하는 치료방법 또는 매우 공격적이거나 실험적인 치료를 추구하도록 결정할 수 있다.
본 발명의 간세포암의 예후 예측을 위한 정보제공방법에 있어서, 용어 "양호한 예후"는 병기 II로 진행되지 않거나, 미세혈관 침윤이 일어나지 않거나, 수술 후 누적 종양 재발율이 낮거나, 수술 후 생존율이 높은 것을 의미할 수 있다. 이와 대조적으로, 용어 "불량한 예후는" 병기 II로 진행되거나, 미세혈관 침윤이 일어나거나, 수술 후 누적 종양 재발율이 높거나, 수술 후 생존율이 낮은 것을 의미할 수 있다. 용어 "예후가 알려진 간세포암 환자"는 간세포암 진단을 받은 환자 중에서 병의 진행 경과가 밝혀진 환자를 의미하며, 예컨대 간세포암으로 인한 외과 수술을 받은 후 재발하여 불량한 예후를 가진 것으로 확정된 환자 또는 외과 수술을 받은 후 재발하지 않고 생존하거나 완치되어 양호한 예후를 가진 것으로 확정된 환자 등이다. 이들 예후가 알려진 환자로부터 채취한 시료와 예후를 알고자 하는 환자로부터 채취한 시료에서 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 발현 수준 또는 발현 패턴을 수득하고, 비교함으로써 예후를 알고자 하는 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있다.
본 발명의 간세포암의 예후 예측을 위한 정보제공방법에 있어서, "불량한 예후"에서 나타나는 "병기 II"로의 진행은 세계적으로 통용되고 있는 간세포암의 병기체계 중 하나인 AJCC 분류에 따른 것으로, AJCC 분류는 수술 환자의 예후 구분에 효율적인 것으로 알려져 있다 (Ueno S et al., Hepatol Res 2002;24:395-403.) 본 발명의 간세포함의 예후 예측을 위한 정보제공방법에 따라 불량한 예후로 예측된 환자는 AJCC 분류 이외에도 UICC/AJCC, Okuda 병기, CLIP (Cancer of the Liver Italian Program) 병기, French 병기, CUPI (Chinese University Prognostic Index), JIS (Japan Integrated Staging) 및 BCLC (Barcelona-Clinic Liver Cancer) 병기 분류에 따라 상위 단계의 병기로의 진행을 의미할 수 있다.
본 발명의 간세포암의 예후 예측을 위한 정보제공방법에 있어서, "AFP"는 알파태아단백질을 지칭하며, 종양표지자검사 중 혈액 (또는 혈청) AFP 측정은 가장 일반적으로 사용되고 있는 간세포암종 진단검사이다. 그러나, 간세포암은 종양학적 다양성과 간경변이 동반되는 환자 특성으로 인해 다일 바이오마커가 가지는 예후 예측 능력에는 분명한 한계가 있다고 알려져 있다.
본 발명자들은 CRBN 단독 및 CRBN와 AFP를 복합적으로 검출함으로써, 간세포암 진단 및 예후 예측의 정확도를 높일 수 있음을 확인하였으며 (표 3), 이에 따라 CRBN 단독 및 CRBN과 AFP의 조합을 검출함으로써 간세포암을 조기에 빠르고 정확하게 진단하고, 수술 후 간세포암 환자의 예후를 보다 정확하고 세밀하게 예측할 수 있는 방법을 제안하였다.
본 발명의 제4 측면은 CRBN에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 관한 것으로, 수탁번호 KCTC18596P의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체 및/또는 수탁번호 KCTC18598P의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는, 세레브론(CRBN)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
본 발명에서 용어 "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region, FR)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
한편, 상기 단일클론항체는 인체에 적용하기 위해 면역원성을 감소시킨 키메라성 항체 또는 인간화 항체의 형태일 수 있다.
본 발명에서 용어, "키메라성 항체(chimeric antibody)"는 DNA 재조합 기술에 의하여 마우스 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역을 재조합시킨 형태의 항체이며, 상기 키메라성 항체의 면역반응은 마우스 항체에 비하여 크게 개선되므로, 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "인간화 항체(humanized antibody)"는 마우스 단일클론항체의 CDR 서열의 전부 또는 일부를 인간 항체에 이식시킨 형태의 항체를 의미하며, 그 예로 마우스 단일클론항체의 CDR를 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변영역을 제조하고 이를 바람직한 인간 항체의 불변영역과 재조합시켜 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 마우스 유래의 CDR만을 이식하는 경우 인간화 항체의 친화도가 떨어지므로 CDR의 3차원 구조에 영향을 줄 것으로 생각될 수 있는 FR 아미노산 잔기를 마우스 항체의 아미노산으로 치환시켜 친화도를 증진시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "CRBN(cereblon) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체"는 CRBN 단백질에 결합하여 CRBN 단백질의 생물학적 활성을 억제할 수 있는 항체를 의미하며, 본 발명에서 항-CRBN 항체와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 단일클론항체의 형태는 상기에서 설명한 바와 같이, 전체 항체 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있으며, 키메라성 항체 또는 인간화 항체로 변형시킬 수 있다.
CRBN 단백질은 세포 내 에너지 센서인 AMPK 삼합체 중 α 소단위와 직접적으로 결합함으로써 AMPK의 인산화(활성화)를 억제하는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 간세포암 환자에서 CRBN의 발현이 현저히 증가하는 점을 발견하고 이를 특이적으로 검출할 수 있는 단일클론항체를 제조하였다. 본 발명의 단일클론항체는 CRBN의 Pep2: C-DMEEFHGRTLHD (서열번호 3), 및/또는 Pep5 : C-DRIKKQLREWDENLKD (서열번호 6)부위에 특이적으로 결합하여, CRBN의 발현량을 특이적으로 검출할 수 있으며, 특히 간세포암의 진단 또는 수술 후 예후 예측에 있어 높은 민감도 및 특이도를 가지므로 간세포암의 진단 및 예후 예측에 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 CRBN 아미노산 Pep2: C-DMEEFHGRTLHD (63~74 aa) (서열번호 3), Pep4: C-GRQRFKVLELRTQSD (161~175aa) (서열번호 5) 부위 또는 Pep5: C-DRIKKQLREWDENLKD (255~270aa) (서열번호 6) 부위를 포함하는 융합 단백질을 항원 단백질로 이용하여 본 발명의 CRBN에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제작하였다 (실시예 1).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 제공되는 단일클론항체는 CRBN에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, 상업적으로 판매되는 CRBN 다클론항체에 비하여 현저히 강한 결합력을 가짐을 확인하였다. 본 발명의 단일클론항체는 주변 정상 조직보다 간세포암 세포에서 현저하게 과발현되는 것을 확인하였으며, CRBN 발현이 억제된 간암 세포주에서 암 전이 관련 MMP-2 및 MMP-9 의 활성을 감소시키는 반면, CRBN 과발현 간암 세포주에서 MMP-9 의 활성을 CRBN 단백질 의존적으로 증가시키는 것을 확인하였다. 나아가 CRBN 발현량에 따라 고발현군과 저발현군으로 분류하고 임상적 지표를 추적 조사한 결과 간세포암 병기의 진행 여부, 간세포암 수술에 따른 생존율, 종양 재발률을 유의미한 수준으로 예측할 수 있다는 점을 확인하였다.
본 발명의 제4 측면과 관련하여, 본 발명은 전술한 단일클론항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 단일클론항체는 공지의 단일클론항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론항체를 제조하는 방법은 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행될 수 있거나(Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495), 파아지 디스플레이(phage display) 기술을 이용함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의　단일클론항체는 당해 기술분야에서 공지된 세포융합방법에 의해 생성된　하이브리도마　세포로부터 얻을 수 있다. 일반적으로　단일클론항체를 분비하는　하이브리도마　세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 면역세포와 암 세포주를 융합함으로써 만들어진다. 이러한 두 가지 세포의 융합은 당업계에서 공지되어 있는 폴리에틸렌클리콜(polyethyleneglycol)을 이용하는 방법을 통해 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution)에 의한 서브 클로닝을 실시하여 균일한 세포 집단을 수득하고 난 후, 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는　하이브리도마　세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다.
세포 융합에 사용되는　골수종　세포로는 마우스 유래의 p3/x63-Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP-2/0, F0, P3x63 Ag8, V653, S194, 랫트 유래의 R210 등 다양한 세포주를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에서 사용된 세포주는　골수종 세포 SP-2/0이다.
상기의　하이브리도마　세포가 생산하는　단일클론항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며, 또한 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다.
CRBN 단백질을 선택적으로 인식하는 단일클론을 선별하기 위하여 통상 사용되는 다양한 방법, 예를 들면, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역흡착법(ELISA), 면역형광법(Immunofluorescence), 웨스턴 블랏팅(Western blotting) 및 유세포 분석법 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 효소면역흡착법(ELISA)에 의해 단일클론을 선별한다.
본 발명의　단일클론항체는 당해 기술분야에서 공지된 파아지 디스플레이 방법에 의해 제조될 수 있다. 파아지 디스플레이 기술을 이용한 항체 라이브러리는 하이브리도마를 제작하지 않고 바로 B 림프구로부터 항체 유전자를 얻어 파아지 표면에 항체를 발현시키는 방법이다. 파아지 디스플레이 기술을 이용하면 B-세포 불멸화(immortalization)에 의해 단일클론항체를 생성하는데 관련된 기존의 많은 어려움이 극복될 수 있다. 일반적으로 파아지 디스플레이 기술은 1) 파아지의 외피 단백질(coat protein) pⅢ (또는 pIV) N-말단에 해당하는 유전자 부위에 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)를 삽입하는 단계; 2) 천연형의 외피 단백질 일부와 상기 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 3) 상기 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드와 결합할 수 있는 수용체 물질을 처리하는 단계; 4) 수용체에 결합된 펩티드-파아지 입자들을 낮은 pH나 결합 경쟁력 있는 분자를 이용하여 용출시키는 단계; 5) 패닝(panning)에 의하여 용출된 파아지를 숙주 세포 내에서 증폭시키는 단계; 6) 원하는 양을 얻기 위해 상기 방법을 반복하는 단계; 및 7) 패닝에 의해 선별된 파지 클론들의 DNA 서열로부터 활성이 있는 펩티드의 서열을 결정하는 단계로 구성된다.
바람직하게 본 발명의 단일클론항체는 하이브리도마 세포로부터 제조할 수 있다.
본 발명의 하이브리도마 유래의 단일클론항체 또는 파아지 디스플레이 클론을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. 그 예로, 하이브리도마 또는 파아지 주형 DNA로부터 당해 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용할 수 있다. 일단 상기 폴리뉴클레오티드가 단리되면, 이를 발현 벡터 내로 넣을 수 있고, 그 후 상기 발현 벡터를 적당한 숙주세포에 도입하여, 형질전환된 숙주세포(즉, 형질전환체)로부터 원하는 단일클론항체을 생산할 수 있다. 따라서 본 발명의 상기 단일클론항체의 제조 방법은 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 증폭시키는 단계를 포함하는, 단일클론항체의 제조방법일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
세레브론(CRBN) 항원 생산
1-1. CRBN 서열 중 항원결정 펩타이드 선정
서열번호 1로 표시되는 인간 CRBN 단백질 서열 중 단일클론항체 생산에 적합한 항원 펩타이드 서열을 선정하기 위해 각 서열의 친수성 및 소수성 측정을 하였다.
그 결과 서열번호 3(PEP2), 서열번호 5(PEP4) 또는 서열번호 6(PEP5)으로 표시되는 펩타이드 서열에 대한 단일클론항체 제작 가능성이 높은 것으로 나타났다.
[서열번호 2]
Prediction 1: C-EDEMEVEDQDSKEAK (28-42aa, 16mer)
[서열번호 3]
Prediction 2: C-DMEEFHGRTLHD (63-74aa, 13mer)
[서열번호 4]
Prediction 3: C-EIYAYREEQDFGIE (140-153aa, 15mer)
[서열번호 5]
Prediction 4: C-GRQRFKVLELRTQSD (161-175aa, 16mer)
[서열번호 6]
Prediction 5: C-DRIKKQLREWDENLKD (255-270aa, 17mer)
1-2. 항원 생산
합성된 펩타이드는 SMCC(Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)를 이용하여 KLH(Keyhole limpet hemocyanin)와 BSA(Bandeiraea　simplicifolia　agglutinin)에 접합(conjugation)시킨 후 ELISA 스크리닝하였다.
[실시예 2]
하이브리도마 세포의 제작
2-1. 단일클론항체 생산 세포주 제작을 위한 마우스의 면역
하이브리도마　세포의 제조에 필요한 면역화된 마우스를 얻기 위하여, 상기실시예 1에서 제조된 재조합 CRBN 항원 단백질 PEP2, PEP4 및 PEP5(각각 30㎍/㎕)를 혼합하여 인산염 완충액(phosphate buffered saline; PBS) 150㎕에 희석하고 동일한 부피의 프로인트 완전 아주반트(complete Freund's adjuvant, Sigma)와 혼합하여 에멀젼을 제조하였다. 상기 에멀젼은 3주 간격으로 4차례 BALB/C(암컷, 8 주령) 마우스의 복강에 200㎕씩 주사하였다. 4번째 면역 후 한 달 후 꼬리 정맥으로 정제된 재조합 CRBN 단백질을 투여한 3일 후에 비장을 적출하여 세포융합에 사용하였다.　
2-2. 세포 융합
먼저, 세포융합을 위해　골수종　세포(myeloma　cell)를 준비하였다.　골수종　세포인 SP2/O 세포를 배양하고, 세포밀도를 2.5 ~ 5 Х 104 /㎖로 하였다. 세포융합 24시간 전에 SP2/O 세포를 1/3로 희석하여 준비하였다.
세포융합은 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 일반적인 방법(Ed Harlow, David Lane: Antibodis, A laboratory manual. Cold Springs Harbor press, 1988 P139-244)에 따라 다음과 같이 실시하였다.
상기 실시예 2-1에서 면역화된 마우스의 혈청에서 ELISA 법으로 항체의 역가를 확인하여 항체 생성력이 있음을 확인한 후, 면역화된 마우스를 에테르로 마취시키고 몸통의 좌측에 위치한 비장세포(spleen cell)를 적출하였다. 적출한 비장에서 비장세포들(splenocytes)을 세포 스트레이너 (cell strainer) (Falcon, 미국)를 이용하여 분리하고, 1 Х 108 세포/㎖의 농도로 희석하였다. 1 Х 107 세포/㎖의　골수종(myeloma) 세포와 1㎖의 PEG1500(Sigma, 미국)을 혼합하여 융합시켰다. 융합이 완료된 세포를 200㎖의 HAT(Sigma, 미국) 배지에 희석시킨 후 96 웰 마이크로플레이트에 100 ㎕씩 분주하고, 5% 탄산가스가 공급되는 37 ℃ 배양기에서 배양하였다.
2-3. 단일클론항체를 생산하는　하이브리도마　세포의 선별 및 클로닝
상기 실시예 2-2에서 제조한 융합세포군 중에서 CRBN에만 특이적으로 반응하는 융합세포들을 선별하고 항체의 생성여부를 확인하기 위하여, 효소면역방법을 이용하여 스크리닝하였다.
세포융합 후 8 ~ 9일째에 배지를 교환하고, 96 웰에서부터 24 웰까지 잘 자랄 때까지 cDMEM2에서 배양하였다. 배지를 교환한 후 5 ~ 7일째에 색이 변한 웰의 상층액을 거두고 cDMEM2로 채운 후 ELISA 시험을 수행하였다. ELISA 시험 후 웰을 선택하여 24 웰로 옮겨 배양하였다. 24 웰에서 배양한 후 다시 ELISA 시험을 수행하였다. 구체적으로는, 24 웰의 융합세포 농도를 확인하고, 96 웰 플레이트에 0.5 세포/웰이 되도록 15㎖의 배양액에 융합세포를 희석하였다. 융합세포 희석액을 각 웰당 150㎕씩 분주하였다. 현미경으로 검경하여 1개의 세포가 들어있는 웰을 체크하였다. 세포가 어느 정도 자란 웰의 상층액을 거두어 ELISA 및 웨스턴 블랏으로 확인하여 1차 스크리닝을 수행하였다. 1차 스크리닝을 토대로 선택된 융합세포를 24 웰로 옮겨 배양하고 원심분리한 후 상층액을 거두어 ELISA 및 웨스턴 블랏으로 확인하여 2차 스크리닝을 수행하였다. 24 웰에서 키운 융합세포의 450 nm 흡광도(O.D 값)를 ELISA로 확인하고, 흡광도가 1이 넘는 융합세포만 선택하여 25T/C 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 원심분리한 후 상층액을 거두어 ELISA 및 웨스턴 블랏으로 확인하여 3차 스크리닝을 수행하였다. 3차 스크리닝을 토대로 선택된 융합세포를 다시 75T/C 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 ELISA로 흡광도를 확인하여 흡광도가 1이 넘는 융합세포만 선택하였다. 최종적으로 선택한 융합세포를 각각 1D3 및 4E11로 명명하였으며, 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 각각 2017년 08월 30일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC18596P (4E11), KCTC18598P(1D3)).
[실시예 3]
CRBN에 대한 단일클론항체의 생산 및 정제
3-1. CRBN에 대한　단일클론항체의 생산
상기 실시예 2에서 선택한 최종 하이브리도마　세포("1D3" 및 "4E11")로부터 CRBN에 대한　단일클론항체를 생산하기 위하여, 7 ~ 8 주령의 암컷 Balb/C 마우스 복강(abdominal cavity)에 프리스탄(pristane) 500㎕를 주사하였다. 75T/C 배양 플라스크에서 배양한 융합세포를 수거하여 원심분리한 다음, 상층액을 제거하고 인산염 완충액에 넣고 피펫팅하였다. 프리스탄 투여 7 ~ 10일 후 상기 실시예 2에서 선택한 융합세포[1D3 및 4E11]를 각각 8Х105　~ 4Х107으로 마우스의 복강 내에 주사하였다. 5 ~ 7일 후에 마우스의 복강에 복수(ascites)가 가득찼을 때 18G 주사 바늘을 이용하여 복수를 뽑았다. 복수를 4℃에서 하룻밤 두었다가 다음날 원심분리하여 노란 지방층을 포함한 덩어리 물질을 제거하고 상층액만을 분리하였다. 분리한 상층액은 분주하여 -20℃에 보관하였다.
3-2. CRBN에 대한　단일클론항체의 정제
저장액(20% 에탄올)에 저장되어 있는 Protein G Fast Flow Bed를 적당량 컬럼에 채우고 20% 에탄올을 흘려 내린 후, 5 Bed Volum의 결합 완충액(20 mM sodium phosphate, pH 7.0)으로 세척하였다. 복수액을 인산염 완충액으로 적당량 희석시킨 후 Protein G 컬럼에 로딩하였다. 3 Bed Volum의 결합 완충액(20 mM sodium phosphate, pH 7.0)으로 결합한 후, 3 Bed Volum의 용출 완충액(0.1 M glycine buffer, pH 3.0~2.5)으로 0.5㎖씩 분획을 용출하였다. 각 분획을 35㎕의 중화 완충액(1 M Tris-HCl, pH 9.0)으로 중화시켰다. 70% 에탄올로 냉장온도에서 하룻밤 정치시킨 후, 다시 저장액(20% 에탄올)에서 다음 번 사용시까지 냉장 보관하였다. 각 분획의 순도를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 수행하였으며, Ammersharm GE 컬럼으로 탈염(desalting)하였다.
그 결과 1130㎍의 복수액으로부터 1938㎍의 CRBN에 대한　단일클론항체가 Protein G 컬럼을 이용하여 정제되었고, GE 컬럼을 이용하여 염이 제거된 CRBN에 대한　단일클론항체는 1309㎍ 이었다. 회수율은 11.7% 이었다.
[실시예 4]
하이브리도마　세포(1D3 및 4E11)의 CRBN 항원에 대한 결합 특이성 실험 - ELISA
본 발명의　하이브리도마　세포 (1D3 및 4E11)의 CRBN 항원 (PEP2, PEP4 및 PEP5)에 대한 결합 특이성을 확인하기 위하여, ELISA 실험을 통해 확인하였다.
본 발명의　하이브리도마　세포 (1D3 및 4E11)의 CRBN 항원(PEP2, PEP4 및 PEP5)에 대한 결합 특이성을 ELISA를 통해 확인한 결과는 하기 [표 1]에 나타내었다.
PEP2 PEP4 PEP5 대조군
1D3 1.511 0.062 0.229 0.068
4E11 1.270 0.091 0.827 0.079
따라서, 본 발명의　하이브리도마　세포(1D3 및 4E11)는 모두 세레브론 유래 펩타이드와 결합반응을 한다는 점을 확인하였으며, 특히 4E11 클론은 PEP2 및 PEP5와 교차반응을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
[실시예 5]
이소타이핑(isotyping)에　의한　단일클론항체의 선별
상기 실시예 3에서 제조한 단일클론항체의 이소타입(isotype) 결정을 위해 ELISA를 실시하였다. 구체적으로, 토끼에서 생선 된 각각의 쥐(mice)의 이소타입에 대한 정제된 항체가 탄산염 완충액(carbonate buffer, pH 9.4)로 10 ㎍/㎖ 농도로 희석한 다음 Maxisorp ELISA 플레이트(Nunc, 미국)의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 16시간 반응시켜 항체를 코팅하였다. 각각의 이소타입 항체가 코팅된 각 웰에 1% BSA가 포함된 블러킹 완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA, 3% 열 비활성 말 혈청)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이적 반응을 차단하였다. 각 웰에　단일클론항체　생성　하이브리도마　세포배양액을 50 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 1 시간 반응한 다음, 세척완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 0.05% BSA)으로 3회 세척하였다. 세척 후 1:1000배 희석한 HRP(Horseradish peroxidase)-축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체 (1:2000; Sigma, 미국)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 다음 세척 완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 TMB(3,3',5,5' - tetramethylbenzidine) (Sigma, 미국) 기질용액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 후, 2N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 반응 후 ELISA 리더(Perkinelmer Victor X3)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 [표 2]에 나타내었다.
하기 [표 2]에 나타난 바와 같이, 이소타입을 분석한 결과, 중쇄(heavy chain)의 서브클래스에 따라 분류할 수 있었으며, 4종류의 하이브리도마 세포에서 생산된 단일클론항체는 모두 IgG1/Kappa 서브클래스 이소타입이라는 것을 확인할 수 있었다.
1D3 4E11
IgG1 2.792 2.412
IgG2a 0.269 0.164
IgG2b 0.064 0.051
IgG3 0.080 0.058
IgA 0.090 0.065
IgM 0.226 0.107
Kappa 2.555 0.606
Lambda 0.082 0.068
[실시예 6]
CRBN 발현 확인을 위한 면역조직화학법(immunohistochemistry)
서울아산병원의 임상시험심사위원회의 승인을 받아 2009년 9월부터 2011년 12월까지 서울아산병원 외과에서 간세포암으로 수술을 받았던 환자 중 AJCC(The American Joint Committee on Cancer) 7판 병기 I과 II 에 해당하는 40명의 환자를 대상으로 서울아산병원 Bio-Resource Center 에 보관되어 있는 수술 후 간 조직 중 간세포암 조직과 주변 정상 간 조직을 각각 40건씩 이전 받아 실험에 사용하였다.
간세포암 조직과 주변 정상 간 조직을 동결 상태에서 마이크로톰을 이용하여 5 μm로 자른 후 실온에서 30분 동안 인산 완충액(1 M Na2HPO4 77.4 ml, 1 mM Na2HPO4 22.6 ml, 증류수 900 ml)에 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 슬라이드에 고정하였다. 고정된 조직을 0.5% Triton X-100(Merck, Darmstadt, Germany)에 5분 동안 투과시키고 실온에서 1시간 동안 2% NGS(normal goat serum)와 PBS(phosphate-buffered saline)에 2% NGS(normal goat serum)를 더한 용액과 배양하여 블로킹(blocking)하였다. 그 후 4℃에서 하룻밤 동안 1차 항체 (E-cadherin, 1:500,　Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA and N-cadherin, 1:500, Abcam)와 배양시켰다. 1차 항체는 플루오레세인이소티오시안산염(FITC, fluorescein isothiocyanate) 또는 CY3(cyanin)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 검출하였고, 2차 항체인 항-토끼(anti-rabbit, 1:500, Invitrogen) 또는 항-마우스(anti-mouse, 1:2000, Invitrogen)와 실온에서 약 1시간 동안 결합시켰다. 형광현미경(fluorescence microscope, Leica, Heidelberg, Germany)을 사용하여 정상군과 간세포암군에서 CRBN 발현량을 비교하였으며, 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 간세포암 조직과 주변의 정상 조직의 냉동 절편에 실시예 3에서 생산한 CRBN 단일클론항체를 사용하여 면역조직화학법으로 확인한 결과, 정상 간 조직에 비해 간세포암 조직에서 CRBN 단백질 발현이 2배 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 7]
CRBN 발현 정량화를 위한 웨스턴 블랏(Western blot)
총 단백질은 30분 동안 -20℃에서 Pro-Prep protein extraction solution (iNtRON Biotechnology, Boca Raton, FL, USA)에 용해하여 배양 추출하였다. 용해물은 4℃에서 5분 동안 20,217 x g로 원심분리하였다. 단백질 농도는 Standard Bradford Assay(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 추출한 60 μg의 단백질은 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)로 실온, 80 ~ 120 V 조건에서 전기 영동을 하였고, 분리된 단백질을 PVDF (polyvinylidene fluoride) 막으로 4℃ 260 mA에서 90분 동안 이동시킨 후 5% 탈지유(skim milk)로 실온에서 1시간 동안 고정시켰다. 상기 고정시킨 세포막에 1차 항체를 추가하여 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 1차 항체는 다클론 CRBN 항체(ployclonal CRBN antibody, Sigma)를 5% 탈지유에 1:1000으로 희석하였고, 대조군으로서 액틴(Actin, anti-rabbit)은 5% 탈지유에 1:5000으로 희석하여 사용하였으며, 4℃에서 하룻밤 동안 배양시킨 후 1X TBST(Nacl 8.766 g/ Tris-base 1.211 g/ Tween20 500㎕)로 20분 간 세 번 반복 세척하였다. 2차 항체로서 항-마우스(anti-mouse)를 5% 탈지유에 1:2000으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양시킨 후 1X TBST로 20분간 세 번 반복 세척하였고, 단백질 밴드를 ECL(electrogenerated chemiluminescent) 시약(Millipore, Billerica, MA, USA)을 사용해 시각화 하였다. 적절한 밴드의 밀도는 Bio-Rad GS-670 imaging densitometer의 반사율 농도측정으로 분석하였다.
그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 주변 정상 간 조직(N)에 비해 간세포암 조직(T)에서 CRBN 발현량이 더 높은 것으로 나타났다.
웨스턴 블랏 분석에서 CRBN이 주변 간 조직에 비해 간세포암 조직에서 2배 이상으로 높게 측정되었을 때 CRBN 발현의 컷오프 값(cut-off value)으로 정의하고, CRBN 고발현 환자군과 저발현 환자군으로 분류하였다.
[실시예 8]
임상자료 수집 및 유의미성 분석
연구 대상 환자 40명에 대하여 의무기록을 후향적으로 조사하였다. 수술 당시 환자의 나이, 성별, 수술명, 수술 전 ICG 값, B형 간염표면항체 유무, 수술 전 AFP와 PIVKA을 조사하였다. 수술 후 조직 검사를 바탕으로 간경화 여부, 간세포암의 크기와 개수, 미세혈관 침윤 여부, 병기를 조사하였다. 수술 후 무병기간, 재발여부, 생존 기간 및 생존 여부를 조사하였다.
먼저, CRBN 단백질의 발현 정도에 따른 임상 지표와 수술 후 재발 및 생존 여부를 비교하였다. 범주형 변수에 대해서는 카이-스퀘어 검정(Chi-Square test)을 사용하였고, 연속형 변수는 스튜던트 t-검정(Student's t-test)으로 비교하였다. 재발률과 생존율은 카플란-마이어 법(Kaplan-Meier method)으로 구하였고. 로그순위법(Log-rank test)으로 비교하였다. p-value 0.05이하일 때 통계적 유의성이 있다고 판정하였다.
연구 대상 환자들의 임상 및 병리학적 특성은 하기 [표 3]에 정리하였다. 상기 실시예 7의 웨스턴 블랏 분석에서 주변 조직보다 간세포암에서 2배 이상의 CRBN이 발현된 환자(CRBN 고발현군)는 19명(47.5%)이었고, CRBN이 2배 미만으로 발현된 환자(CRBN 저발현군)는 21명(52.5%)으로 비슷하게 나타났다.
CRBN 발현량에 따른 임상병리학적 특징
CRBN 고발현 N=19 (47.5%) CRBN 저발현 N=21 (52.5%) p-value
환자의 평균 연령, y, 범위 56.3 ± 5.7 53.1 ± 7.5 0.25
성별(남/여) 16/3 15/6 0.94
간 경변증 발생수, n (%) 15 (78.9) 20 (95.2) 0.120
HBsAg (+), n (%) 19 (100) 20 (95.2) 0.335
수술 전 ICG-R15, %, 평균 15.3 ± 6.2 16.4 ± 5.4 0.692
수술명, n (%) 0.755
Right hepatectomy 2 (10.5) 1 (4.8)
Left hepatectomy 1 (5.3) 2 (9.5)
Right anterior sectionectomy 5 (26.3) 4 (19)
Right posterior sectionectomy 4 (21.1) 8 (38.1)
Left lateral sectionectomy 1 (5.3) 1 (5.3)
Left medial sectionectomy 0 (0) 1 (4.8)
Partial hepatectomy 6 (31.6) 4 (19)
종양 마커(수술 전)
AFP, 평균 ng/mL 929.9 ± 1595.8 198.1 ± 370.8 0.001
PIVKA II, 평균 mAU/mL 1988.9 ± 4676.2 649.8 ± 1510.7 0.052
평균 종양 크기, cm 4.3 ± 2.3 3.6 ± 1.6 0.278
평균 종양의 수, n 1 (100) 1 (100)
AJCC 병기, n (%) 0.005
I기 13 (68.4) 21 (100)
II기 6 (31.6) 0 (0)
미세혈관 침윤(+), n (%) 6 (31.6) 0 (0) 0.005
BCLC 병기, n (%) 0.087
0기 0 (0) 3 (14.3)
A기 19 (100) 18 (85.7)
종양 재발 횟수, n (%) 14 (73.7) 10 (47.6) 0.093
HCC-관련 사망자 수, n (%) 10 (52.6) 4 (19) 0.026
CRBN 고발현군과 저발현군 환자를 비교했을 때, 성별 및 수술 당시 나이, 간경화 정도, B 형 간염 표면항체, ICG-R15 값은 두 군 사이에 통계학적 차이는 없었다(p > 0.05). 수술 후 조직 검사에서 발견된 종양의 크기는 두 군 간에 차이가 없었으나(p = 0.278), CRBN의 발현이 높은 환자군에서 병기II에 해당하는 환자들이 유의한 수준으로 더 많이 나타났다(p = 0.005). 간세포암 진단 마커인 AFP는 CRBN이 높게 발현된 환자에서 현저히 높게 측정되었으며(고발현군 929.9±1595.8 ng/mL; 저발현군 198.1±370.8 ng/mL, p = 0.001), PIVKA-II의 경우 CRBN 고발현 환자군에서 높게 측정되었으나 통계학적 차이를 보이지는 않았다(고발현군 1988.9±4676.2 mAU/mL; 저발현군 649.8±1510.7 mAU/mL, p = 0.052). CRBN이 낮게 발현된 환자군에서는 조직학적으로 간세포암의 미세혈관 침윤(microvascular invasion)이 발견되지 않았으나, CRBN이 높게 발현된 환자군의 31.6%에서 발견되었다(p = 0.005).
이로부터 간세포암 환자의 CRBN 발현 정도는 간세포암 진단 마커 AFP 발현량, AJCC 병기 II기로 진행되는지 여부, 미세혈관 침윤 여부 및 생존 여부와 유의미한 관계가 있다는 것을 알 수 있었다.
또한, AJCC 7판 병기 I과 II에 따라 분류한 환자들의 임상병리학적 특성을 비교하여 하기 [표 4]에 정리하였다.
간세포암암 진단 마커인 AFP와 PIVKA-II 모두 병기 II 환자에서 현저히 높은 수준으로 측정되었으며(p = 0.000), 병기 I 환자에서는 CRBN 저발현 환자(61.8%)가 더 많았으나, 병기 II 환자는 모두 CRBN 단백질 고발현군인 것으로 나타났다(p = 0.005).
I 기 N=34 (85%) II 기 N=6 (15%) p-value
환자의 평균 연령, y, 범위 55.7 ± 6.6 49.8 ± 5.8 0.466
성별 (남/여) 25/9 6/0 0.152
간 경변증, n (%) 29 (85.3) 6 (100) 0.315
HBsAg (+), n (%) 33 (97.1) 6 (100) 0.671
평균 ICG R15, %, 범위 15.8 ± 5.5 16.3 ± 7.6 0.354
수술명, n (%) 0.215
Right hepatectomy 1 (2.9) 2 (33.3)
Left hepatectomy 2 (5.9) 1 (16.7)
Right anterior sectionectomy 8 (23.5) 1 (16.7)
Right posterior sectionectomy 11 (32.4) 1 (16.7)
Left lateral sectionectomy 2 (5.9) 0 (0)
Left medial sectionectomy 1 (2.9) 0 (0)
Partial hepatectomy 9 (26.5) 1 (16.7)
종양 마커(수술 전)
AFP, 평균 ng/ml 264.4 ± 539.8 2140 ± 2296.7 0.000
PIVKA II, 평균 mAU/mL 687.9 ± 1512.3 4674 ± 7754.1 0.000
평균 종양 크기, cm 3.7 ± 1.5 4.9 ± 3.6 0.004
평균 종양의 수, n 1 (100) 1 (100)
CRBN 발현, n (%) 0.005
고발현 13 (38.2) 6 (100)
저발현 21 (61.8) 0 (0)
BCLC 병기, n (%) 0.449
0기 3 (8.8) 0 (0)
A기 31 (91.2) 6 (100)
종양 재발 횟수, n (%) 19 (55.9) 5 (88.3) 0.206
HCC-관련 사망자 수, n (%) 11 (32.4) 3 (50) 0.403
[실시예 9]
CRBN 발현량에 따른 예후 예측 가능성 분석
상기 실시예 7에서 분류한 CRBN 고발현군과 CRBN 저발현군을 대상으로 간세포암 수술 후 누적 종양 재발율과 생존율을 비교하였다.
그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, CRBN 고발현군에서 저발현군에 비해 누적 종양 재발률이 유의하게 높았고(도 3의 (A), p = 0.017), 환자생존율이 유의하게 낮았다(도 3의 (B), p = 0.025).
CRBN 단백질의 발현량 차이가 수술 후 간세포암 예후를 예측하는데 얼마나 효율적인지 확인하기 위하여, 간세포암 병기의 진행 여부를 결정하는 미세혈관 침윤 여부에 따라 간세포암 수술 후 누적 종양 재발율과 생존율을 비교하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 미세혈관 침윤 여부에 따라 누적 종양 재발율(p = 0.114)과 환자 생존율(p = 0.334) 모두 유의미한 차이를 보이지 않았다.
이로부터 환자의 수술 후 예후를 예측하는 데 있어서 CRBN 단백질의 발현량은 병기 I, II기의 단일 간세포암을 가진 환자들에게서 전통적으로 가장 중요한 예후 인자인 미세혈관 침윤보다 더 우수한 예측력을 가진다는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 10]
기존 구축된 세포주를 이용한 CRBN 단백질 발현 검증
10-1. 세포주별 CRBN 발현량과 MMP-2, MMP-9 활성 비교
서로 다른 간 세포에서 CRBN 발현량을 비교하기 위하여, 상기 실시예 6의 방법으로 3개의 세포주에 대한 웨스턴 블랏 분석을 하였으며, 실험 대상 세포주는 아래와 같다.
i) Chang Liver(HeLa derivative) cell line(Sigma-Aldrich): HeLa에서 유래한 정상 간세포 유사 세포주
ii) HepG2 cell line(Korean Cell Line Bank): 15세 남성의 간모세포종(hepatoblastoma)에서 얻어졌으며, 인간 간 모델을 연구하는데 가장 대표적인 세포주
iii) Hepa1c1c7 cell line(CRL-2026): 마우스 유래 간암 세포주
그 결과 도 5의 (A)에 나타난 바와 같이, 사람의 정상 간세포주인 Chang Liver, 사람의 간모세포종 세포주인 HepG2, 마우스 간암 세포주인 Hepa1c1c7에서 각각 CRBN의 발현을 확인할 수 있었고, 정상 세포인 Chang Liver에서 보다 종양 세포인 HepG2와 Hepa1c1c7에서 CRBN 발현량이 증가하였다. 이로부터 정상 간세포보다 간암 세포에서 CRBN 발현량이 증가한다는 것을 알 수 있었고, 이는 CRBN 단백질의 발현이 세포의 암화 과정 또는 암화 진행 후 발현이 증가되었을 것으로 생각된다.
또한, 이들 세포주의 종양 특성을 확인하기 위하여 각 세포주에서 암 전이 관련 단백질인 MMP-2와 MMP-9의 활성 분석을 수행하였다. 그 결과 도 5의 (B)에 나타난 바와 같이, CRBN 단백질 발현량이 높았던 간세포암 세포주 (HepG2, Hepa1c1c7)에서 암전이 관련 단백인 MMP-9의 활성이 증가한 것을 알 수 있었다.
10-2. CRBN 발현량 변화에 따른 MMP-2, MMP-9 활성 변화
CRBN의 발현량과 암 전이 단백질의 활성의 변화를 확인하기 위하여, CRBN 단백질 발현을 억제 또는 과발현 시킨 후 MMP-2 및 MMP-9의 활성을 확인하였다.
구체적으로 siRNA CRBN(251, 제놀루션) 또는 Ha-CRBN(pCDNA 3, 제놀루션)을 이용하여, 각각 인간 간암 세포주(HepG2)와 인체 유래 간세포암 일차 배양 세포에 형질전환(transfection)시킨 후 24시간 뒤에 웨스턴 블랏 분석을 통해 CRBN 단백질의 발현량 변화를 조사하였다. 젤라틴 자이모그라피(Gelatin zymography)는 젤라틴을 함유한 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel) 상에서 전기영동하면 조직에 포함된 단백 분해효소에 의해 겔 내의 젤라틴이 분해되어 겔의 염색 후에는 투명한 띠로 남게 되는 현상을 이용한 기법으로, MMP-2 및 MMP-9의 경우 72 kDa와 95 kDa를 동시에 겔 상에서 확인할 수 있기 때문에 MMP-2 및 MMP-9의 활성화 여부를 쉽게 확인할 수 있다. 1% 젤라틴(Sigma, USA)이 포함된 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔(8×10 cm)을 만들고, 대조군과 함께 시료 10 ㎕에 3× 로딩 버퍼[pH 6.8, 62 mM Tris-HCl, 2% SDS, 10% glycerol, 0.05% bromphenol blue] 5 ㎕를 혼합한 시료 15 ㎕를 겔에 적재하고 Vertical Electrophoresis Unit(Hoefer, USA)에서 100 V로 4시간 동안 전기영동 하였다. 겔을 2.5% Triton X-100 용액으로 30분간 2회 세척한 뒤, 콜라게나제 버퍼[50 mM Tris, 5 mM CaCl2, 1% Triton X-100]를 넣고 37℃ 진탕기에 두고 반응시켰다. 24시간 후, 겔을 2.5% Triton X-100 용액으로 1회 세척한 뒤, 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 용액[1% Coomassie brilliant blue R250, 30% methanol, 10% acetic acid]으로 2시간 염색하고, 탈색용액[30% methanol, 10% acetic acid]으로 30분간 2회 탈색시켜 겔을 관찰하였다.
그 결과, 인간의 간모세포종 세포주인 HepG2에 siRNA CRBN을 처리하여 CRBN의 발현을 저해하였을 때(도 6의 (A)), 암전이 효소인 MMP-2 및 MMP-9의 활성이 감소하였다(도 6의 (B)). 이는 간암세포주에서 CRBN 단백질이 간세포암 전이 관련 단백질인 MMP-2 및 MMP-9의 활성을 조절한다는 것을 의미한다.
반대로, 인체 유래 간세포암으로부터 분리한 일차 배양 세포에 HA-CRBN(pCDNA 3)을 도입하여 CRBN 단백을 과발현시킨 경우(도 7의 (A)), CRBN 발현량의 증가에 따라 MMP-9의 활성이 증가되는 것을 확인하였다. 한편, MMP-2는 CRBN 과발현 여부와 관련 없이 유의성 있는 증가를 확인할 수 없었다(도 7의 (B)).
이러한 결과를 종합해 볼 때, 정상 혹은 간암세포주 및 일차배양 암세포 생체 외(in vitro) 실험에서 정상 간세포에 비하여, 간암세포에서 CRBN 단백질이 발현이 유의성 있게 증가하였고, 이렇게 증가한 CRBN 단백질이 암전이 관련 MMP-9의 활성 조절에 관여한다는 것을 알 수 있다.
[실시예 11]
CRBN 넉다운 (Knock down) 일차간세포암 세포주를 이용한 종양 성장의 확인
생체 내 (in vivo)에서 CRBN 발현에 따른 종양 성장의 변화를 확인하기 위해, shRNA CRBN(251, 제놀루션)을 이용하여, CRBN이 넉다운된, 일차 간세포암 세포주 (CRBN KD-HCC)를 확립하였고, 이러한 간세포암 세포주를 Nude 마우스에 이식한 후 CRBN WT-HCC를 이식한 마우스와 비교 관찰하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, CRBN KD-HCC를 이식한 마우스에서의 종양 부피가 CRBN WT-HCC를 이식한 마우스에서의 종양 부피보다 유의적으로 감소된 것을 확인하였으며, 이러한 결과를 통해 CRBN의 발현이 종양 성장에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다.
본 발명을 지원한 국가연구개발사업은 하기와 같다.
(1) [이 발명을 지원한 국가연구개발사업]
[과제고유번호] 2018R1D1A1A02049905
[부처명] 한국연구재단
[연구관리 전문기관] 한국연구재단
[연구사업명] 이공분야기초연구사업
[연구과제명] 다발성 골수종에서 면역조절 치료제의 cereblon 의존적 항암기전 연구
[기여율]1/2
[주관기관] 울산대학교 산학협력단
[연구기간] 2018.05.01 ~ 2021.04.30
(2) [이 발명을 지원한 국가연구개발사업]
[과제고유번호] NCCR-HA16C0014010019
[부처명] 보건복지부
[연구관리 전문기관] 국립암센터
[연구사업명] 암정복추진연구개발사업
[연구과제명] 다발성 골수종 치료시 세르브론 단백발현에 따른 치료제 선별기준 연구
[기여율]1/2
[주관기관] 울산대학교 산학협력단
[연구기간] 2016.05.01 ~ 2019.04.30
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC18596P
수탁일자 : 20170830
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC18598P
수탁일자 : 20170830
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Claims (18)

  1. CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간세포암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는, 간세포암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함하는, 간세포암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체는 수탁번호 KCTC18596P의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체 및 수탁번호 KCTC18598P의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 단일클론항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단일클론항체를 포함하는, 간세포암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 간세포암 진단 또는 예후 예측용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인, 간세포암 진단 또는 예후 예측용 키트.
  7. (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 측정된 수준을 정상 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계;를 포함하는 간세포암 진단을 위한 정보제공방법.
  8. 제7항에 있어서, (c) 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 측정된 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 정상 개체 또는 상기 (a) 단계의 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 것보다 높은 경우, 간세포암으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 간세포암 진단을 위한 정보제공방법.
  9. (a) 간세포암 환자의 간세포암 조직과 이의 주변 정상 조직으로부터 분리된 생물학적 시료에서 각각 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 각 시료에서 측정된 수준을 비교하는 단계;를 포함하는 간세포암의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  10. 제9항에 있어서, (c) 상기 (a) 단계의 간세포암 조직으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 주변 정상 조직으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 것보다 2배 이상 높은 경우 불량한 예후를 가지는 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 간세포암의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  11. 제10항에 있어서, (d-1) 상기 (a) 단계의 간세포암 조직으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 CRBN 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준이 주변 정상 조직으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 것보다 2배 이상 높은 경우 CRBN 고발현 환자군으로 분류하고, 2배 미만인 경우 CRBN 저발현 환자군으로 분류하는 단계;
    (d-2) 고발현군 환자 및 저발현군 환자로부터 분리된 혈액에서 각각 AFP(α-fetoprotein) 수치를 측정하는 단계; 및
    (d-3) 고발현군 환자로부터 분리된 혈액에서 측정된 AFP 수치가 저발현군 환자로부터 분리된 혈액에서 측정된 수치보다 높은 경우 고발현군 환자군 환자가 불량한 예후를 가지는 것으로 판단하는 단계;를 추가로 포함하는, 간세포암의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  12. 제10항 또는 11항에 있어서, 상기 불량한 예후는 병기 II로의 진행, 미세혈관의 침윤, 누적 종양 재발율 증가 및 생존율 감소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 나타내는 것을 의미하는, 간세포암의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  13. 수탁번호 KCTC18596P의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는, 세레브론 (CRBN)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 3 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 세레브론의 영역에 특이적으로 결합하는, 단일클론항체.
  15. 수탁번호 KCTC18598P의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는, 세레브론(CRBN)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 세레브론의 영역에 특이적으로 결합하는, 단일클론항체.
  17. 제13항의 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC18596P의 하이브리도마 세포.
  18. 제15항의 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC18598P의 하이브리도마 세포.
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