WO2021029698A1 - 엑세나타이드 유사체 및 이의 용도 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to glycosylated exenatide analogs and uses thereof.
  • the present invention relates to exenatide dimer analogs and uses thereof.
  • Glycosylation a process by which sugars are attached to proteins expressed in vivo, is a reaction that occurs in the Golgi apparatus, an organelle in cells, and glycoproteins formed by glycosylation are related to intercellular bonding, tissue development, immune response, and hormone action. It is known to be involved in various biological phenomena. Studies on the structure of sugar began in 1880, and studies on sugar and glycosylation have been actively conducted until now. Recently, research on drug development using glycosylation technology is in progress.
  • Exenatide is a functional analog of GLP-1 (Glucagon-like Peptide-1) isolated from the salivary glands of Heloderma suspectum in the southeastern United States, and is used as a peptide treatment for type 2 diabetes. . Recently, the development of persistent functional analogs with improved stability in the body of GLP-1 analogs including exenatide has been actively made.
  • GLP-1 Glucagon-like Peptide-1
  • Exenatide whose scientific name is'Exendin-4', is a biologically active peptide composed of 39 amino acids. It is present in humans, but has 53% amino acid similarity to GLP-1 and is resistant to degrading enzymes such as DPP-4 (Dipetidyl peptidase-4). It is stable and has a relatively long half-life in the body compared to GLP-1.
  • Exenatide is administered twice a day, before breakfast and dinner. Because exenatide is excreted by the kidneys, it is not recommended for use in patients with severe renal impairment or end-stage renal disease.
  • Exenatide excretion is not dependent on liver function and therefore does not interact with drugs metabolized to the liver.
  • exenatide can interact with other drugs related to absorption because it affects gastric motility.
  • exenatide has been reported to have side effects such as a decrease in drug efficacy due to an immune response in the body. Therefore, the development of a peptide drug using the glycosylation process occurring in the body is expected to show improved stability in the body and improved immunogenicity.
  • Exenatide is an agonist of GLP-1R (glucagon-like peptide-1 receptor) and is used as a peptide treatment for type 2 diabetes. Recently, exenatide and other side effects such as hypoglycemia and stability in the body of GLP-1 analogs The development of this improved, sustained-acting analog is actively underway.
  • GLP-1R glucagon-like peptide-1 receptor
  • GLP-1R and GCGR glucagon receptor bind to GLP-1 and glucagon in the body, respectively, and play an important role in maintaining homeostasis in the body by regulating blood sugar. It is known that GLP-1R is activated in the cerebral cortex and intestines to inhibit appetite and at the same time reduce intestinal motility to play an important role in weight loss.
  • GCGR is known to contribute to weight loss by decomposing accumulated fat through increased activity of HSL and ATGL, which are lipolytic enzymes in white adipose tissue, and heat energy generation in brown adipose tissue (REFERENCE), type 2 diabetes.
  • HSL and ATGL lipolytic enzymes in white adipose tissue
  • REFERENCE brown adipose tissue
  • Glycosylation a process by which sugars are attached to proteins expressed in vivo, is a reaction that occurs in the Golgi apparatus, an organelle in cells, and glycoproteins formed by glycosylation are related to intercellular bonding, tissue development, immune response, and hormone action. It is known to be involved in various biological phenomena. Studies on the structure of sugar began in 1880, and studies on sugar and glycosylation have been actively conducted until now. Recently, research on drug development using glycosylation technology is in progress.
  • Exenatide is a functional analog of GLP-1 (Glucagon-like Peptide-1) isolated from the salivary glands of Heloderma suspectum in the southeastern United States, and is used as a peptide treatment for type 2 diabetes. . Recently, the development of persistent functional analogs with improved stability in the body of GLP-1 analogs including exenatide has been actively made.
  • GLP-1 Glucagon-like Peptide-1
  • Exenatide whose scientific name is'Exendin-4', is a biologically active peptide composed of 39 amino acids. It is present in humans, but has 53% amino acid similarity to GLP-1 and is resistant to degrading enzymes such as DPP-4 (Dipetidyl peptidase-4). It is stable and has a relatively long half-life in the body compared to GLP-1.
  • Exenatide is administered twice a day, before breakfast and dinner. Because exenatide is excreted by the kidneys, it is not recommended for use in patients with severe renal impairment or end-stage renal disease.
  • Exenatide excretion is not dependent on liver function and therefore does not interact with drugs metabolized to the liver.
  • exenatide can interact with other drugs related to absorption because it affects gastric motility.
  • exenatide has been reported to have side effects such as a decrease in drug efficacy due to an immune response in the body. Therefore, the development of a peptide drug using the glycosylation process occurring in the body is expected to show improved stability in the body and improved immunogenicity.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for improving, preventing or treating diabetes comprising a glycosylated exenatide analog.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for improving, preventing or treating obesity comprising a glycosylated exenatide analog.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for improving or alleviating diabetes comprising a glycosylated exenatide analog.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for improving or alleviating obesity comprising a glycosylated exenatide analog.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for suppressing appetite comprising a glycosylated exenatide analog.
  • Another object of the present invention is to provide a method for improving, preventing or treating diabetes by administering a glycosylated exenatide analog to a subject in need thereof in an amount effective for improving, preventing or treating diabetes.
  • Another object of the present invention is to provide a method for improving, preventing or treating obesity by administering a glycosylated exenatide analog to a subject in need thereof in an effective amount for improving, preventing or treating obesity.
  • Another object of the present invention is to provide a use of a glycosylated exenatide analogue to improve, prevent or treat diabetes.
  • Another object of the present invention is to provide a use of a glycosylated exenatide analog to improve, prevent or treat obesity.
  • Another object of the present invention is to provide a use of a glycosylated exenatide analog to suppress appetite.
  • the present inventors developed an exenatide dimer analog with improved blood sugar control ability and in vivo stability based on Exenatide, a GLP-1R agonist, by applying multiple antigenic peptides (MAP). And development of candidates for treatment of obesity.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for improving, preventing or treating diabetes comprising an exenatide dimer analog.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for improving, preventing or treating obesity comprising an exenatide dimer analog.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for improving or alleviating diabetes comprising an exenatide dimer analog.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for improving or alleviating obesity comprising an exenatide dimer analog.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for suppressing appetite comprising an exenatide dimer analog.
  • Another object of the present invention is to provide a method for improving, preventing or treating diabetes by administering an exenatide dimeric analogue to a subject in need thereof in an effective amount for improving, preventing or treating diabetes.
  • Another object of the present invention is to provide a method for improving, preventing or treating obesity by administering an exenatide dimer analog in an amount effective to improve, prevent or treat obesity to a subject in need thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a use of an exenatide dimer analogue to improve, prevent or treat diabetes.
  • Another object of the present invention is to provide a use of exenatide dimer analogs to improve, prevent or treat obesity.
  • Another object of the present invention is to provide an appetite suppression use of an exenatide dimer analog.
  • the present invention relates to glycosylated exenatide analogs and uses thereof.
  • An example of the present invention relates to a glycosylated exenatide analog.
  • exenatide is a GLP-1 receptor agonist, and as an analog (GLP-1 metrics) that mimics GLP-1 that is rapidly degraded by dipeptidyl peptidase-IV (DPP-IV), DPP-IV It is a drug that shows the effect of GLP-1, which is not rapidly degraded by, and promotes glucose-dependent insulin secretion, suppresses glucagon secretion, gastric excretion and appetite, and exhibits beta-cell protective effects.
  • GLP-1 metrics GLP-1 metrics
  • DPP-IV dipeptidyl peptidase-IV
  • exenatide is an exenatide analog containing at least 80%, 90%, 95% or more of sequence homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or exenatide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Include.
  • the exenatide may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, for example, may be formed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the exenatide analog may be one in which some amino acids in the amino acid sequence of exenatide are deleted and fatty acids are conjugated.
  • deletions are 1 to 15, 1 to 14, 1 to 13, 1 to 12, 1 to 11, 1 to 10, 1 to 9, 4 to 15 of the amino acid sequence of exenatide.
  • Dogs, 4 to 14, 4 to 13, 4 to 12, 4 to 11, 4 to 10, 4 to 9, 7 to 15, 7 to 14, 7 to 13, 7 to 12 , 7 to 11, 7 to 10, for example, 7 to 9 amino acids may be deleted.
  • the deletion may be the deletion of the N-terminal or C-terminal amino acid of the amino acid sequence of exenatide, for example, the deletion of the C-terminal amino acid of the amino acid sequence of exenatide. have.
  • the deletion is 1 to 15, 1 to 14, 1 to 13, 1 to 12, 1 to 11, 1 amino acid at the C-terminal of the amino acid sequence of exenatide To 10, 1 to 9, 4 to 15, 4 to 14, 4 to 13, 4 to 12, 4 to 11, 4 to 10, 4 to 9, 7 to 15, 7 to 14 Dogs, 7 to 13, 7 to 12, 7 to 11, 7 to 10, for example, 7 to 9 may be deleted.
  • the fatty acid in the exenatide analogue of the present invention may be conjugated to various positions of the exenatide in which some amino acids in the amino acid sequence have been deleted.
  • the fatty acid includes various saturated fatty acids and unsaturated fatty acids known in the art.
  • the fatty acid may be a fatty acid having a carbon number of C 3 to C 36 , for example, propionic acid, butyric acid, valeric acid, and caproic acid.
  • the fatty acid may be conjugated to the C-terminus Lys residue, N-terminus or C-terminus of the amino acid sequence of exenatide in which some amino acids are deleted, for example, C- It may be conjugated to the end.
  • the conjugation of exenatide and fatty acid from which some amino acids of the amino acid sequence are deleted includes both direct and/or indirect bonding.
  • the direct bond is a functional group such as a carboxyl group in a fatty acid and a functional group of an amino acid-deleted exenatide (e.g., -NH 2 ) reacts to form a covalent bond.
  • a functional group such as a carboxyl group in a fatty acid and a functional group of an amino acid-deleted exenatide (e.g., -NH 2 ) reacts to form a covalent bond.
  • a functional group such as a carboxyl group in a fatty acid and a functional group of an amino acid-deleted exenatide (e.g., -NH 2 ) reacts to form a covalent bond.
  • -NH 2 amino acid-deleted exenatide
  • the indirect bond may form a deleted exenatide-fatty acid conjugation by mediating a compound commonly used as a linker in the art.
  • the linker used in the present invention may be any compound used as a linker in the art, and a suitable linker may be selected according to the kind of functional group in the deleted exenatide.
  • the linker is N-succinimidylio Doacetate (N-succinimidyl iodoacetate), N-hydroxysuccinimidyl bromoacetate (N-Hydroxysuccinimidyl Bromoacetate), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide) ester), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester, N-maleimidobutyryloxysuccinamide ester (N-Maleimidobutyryloxysuccinamide ester) and Lys. , But is not limited thereto.
  • the amino acid-deleted exenatide is additionally linked to a linker at its C-terminus, and the fatty acid is conjugated to a linker bonded to the C-terminus.
  • Lys is bonded as a linker to the C-terminus of exenatide from which an amino acid has been deleted, and a fatty acid can be conjugated to this Lys.
  • the -NH 2 functional group of the additional Lys and the carboxyl group of the fatty acid may react to form a conjugate.
  • the glycosylated exenatide analog may be a saccharide bound to at least one or more amino acids of the exenatide analog, and the saccharide bound amino acid may be substituted with another amino acid and then a saccharide bound.
  • the binding of the saccharide may be made at one or more positions selected from the group consisting of positions 17, 24 and 28 of exenatide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but limited thereto. It does not become.
  • the 17th amino acid Glu of exenatide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with Cys
  • the 28th amino acid Asn of exenatide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be one or more selected from the group consisting of Cys substitution, but is not limited thereto.
  • sugars are 1 to 11 sugars, 2 to 11 sugars, 3 to 11 sugars, 4 to 11 sugars, 5 to 11 sugars, 6 to 11 sugars, 7 to 11 sugars, 8 to 11 sugars, 9 to 11 sugars , 10 to 11 sugars, for example, may be 11 sugars, specifically bromoacetyl glycan of the following structural formula 1 and/or 11NC-Asn-Fmoc of the following structural formula 2, but It is not limited.
  • AGM-212 consists of a sequence from 1 to 32 of the sequence of exenatide consisting of SEQ ID NO: 1, and capric acid is bound to the side chain at the C-terminus of the sequence The resulting lysine is conjugated and is specified by the sequence of Ex4(1-32)K-cap.
  • AGM-212(E17C-11 sugar) refers to the sequence of Ex4(1-32)-cap, where glutamic acid (Glutamic acid, Glu, E) at No. 17 is substituted with Cys, and the substituted amino acid is 11 It is a sequence to which sugars having a sugar structure are bound.
  • AGM-212(N28C-11 sugar) refers to the sequence of Ex4(1-32)-cap, in which asparagine at position 28 (Asparagine, Asn, N) is substituted with Cys, and the substituted amino acid is 11 It is a sequence to which sugars having a sugar structure are bound.
  • AGM-212(N28-11 sugar) is a sequence in which a sugar having a structure of 11 sugars is bound to asparagine at position 28 in the sequence of Ex4(1-32)-cap.
  • AGM-212(E24-11 sugar) is in the sequence of Ex4(1-32)-cap, glutamic acid at position 24 is substituted with this Cys, and a sugar having a structure of 11 sugars is bound to the substituted amino acid. Is the order
  • AGM-212 (E17C-11 sugar & E24C-11 sugar) is in the sequence of Ex4(1-32)-cap, by replacing glutamic acid at No. 17 with Cys and glutamic acid at No. 24, respectively, It is a sequence in which a sugar having a structure of 11 sugars is bound to a substituted amino acid.
  • AGM-212 (E17C-11 sugar & N28C-11 sugar) is in the sequence of Ex4(1-32)-cap, by substituting Cys for glutamic acid at No. 17 and asparagine at No. 28, respectively, It is a sequence in which a sugar having a structure of 11 sugars is bonded to the substituted amino acid of.
  • Another example of the present invention relates to a pharmaceutical composition for improving, preventing or treating diabetes, comprising a glycosylated exenatide analog.
  • Another example of the present invention relates to a pharmaceutical composition for improving, preventing or treating obesity comprising a glycosylated exenatide analog.
  • glycosylated exenatide analogue in the pharmaceutical composition of the present invention is the same as described above, and the description thereof is omitted.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in the formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystals Sex cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, but are not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., a talc, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, kaolin, kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, a talct, a talct, a talct, a stea, stevia, glycerin, glycerin, glycerin, g
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, route of administration, excretion rate and response sensitivity of the patient, Usually, the skilled practitioner can readily determine and prescribe the dosage effective for the desired treatment or prophylaxis.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.001-10000 mg/kg.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person having ordinary knowledge in the art. Or it can be made by incorporating it into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or a stabilizer.
  • the term "including as an active ingredient” means including an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the following exetanide analogs.
  • the upper limit of quantity included in the composition of the present invention can be selected and implemented within an appropriate range by a person skilled in the art.
  • Another example of the present invention relates to a food composition for improving or alleviating diabetes comprising a glycosylated exenatide analog.
  • Another example of the present invention relates to a food composition for improving or alleviating obesity comprising a glycosylated exenatide analog.
  • Another example of the present invention relates to an appetite suppressing food composition comprising a glycosylated exenatide analog.
  • glycosylated exenatide analogue is the same as described above, and the description thereof is omitted.
  • composition of the present invention is a food composition
  • it may be prepared in the form of powder, granules, tablets, capsules or beverages.
  • various foods such as candy, beverages, gum, tea, vitamin complexes, or health supplement foods.
  • the food composition of the present invention may include ingredients commonly added during food production as an active ingredient, and includes, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, flavoring agents, and flavoring agents.
  • Examples of the aforementioned carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides, and the like; And polysaccharides, for example, common sugars such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • sweetening agents natural flavoring agents [taumatin, stevia extract (eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.]) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • citric acid liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, cephalic extract, jujube extract, licorice extract, etc. may be additionally included in addition to the compounds of the present invention. .
  • Another object of the present invention is to provide a method for improving, preventing or treating diabetes by administering an exenatide analogue to a subject in need thereof in an amount effective for improving, preventing or treating diabetes.
  • Another object of the present invention is to provide a method for improving, preventing or treating obesity by administering an exenatide analogue to a subject in need thereof in an effective amount for improving, preventing or treating obesity.
  • Another object of the present invention is to provide a use of exenatide analogues to improve, prevent or treat diabetes.
  • Another object of the present invention is to provide a use of exenatide analogues to improve, prevent or treat obesity.
  • Another object of the present invention is to provide the use of an exenatide analogue to suppress appetite.
  • the present invention relates to exenatide dimer analogs and uses thereof.
  • An example of the present invention relates to an exenatide dimer analog.
  • the exenatide dimer analog is a first body consisting of an exenatide analog in which 1 to 15 amino acids of the exenatide amino acid sequence are deleted, and fatty acids are conjugated; And a second body consisting of an exenatide analog in which 1 to 15 amino acids of the exenatide amino acid sequence are deleted and fatty acids are conjugated, or glucagon; including, the first body and the second body May be combined to form a dimeric analog.
  • exenatide is a GLP-1 receptor agonist, as an analog (GLP-1 metrics) mimicking GLP-1 that is rapidly degraded by dipeptidyl peptidase-IV (DPP-IV). It is a drug that shows the effect of GLP-1, which is not rapidly degraded by, and promotes glucose-dependent insulin secretion, suppresses glucagon secretion, gastric excretion and appetite, and exhibits beta-cell protective effects.
  • exenatide is an exenatide analog containing at least 80%, 90%, 95% or more of sequence homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or exenatide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Include.
  • the exenatide may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, for example, may be formed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • glucagon includes glucacon comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or glucacon analogues showing at least 80%, 90% or more, 95% or more of sequence homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 .
  • glucagon may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, may be formed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the bond between the first body and the second body may be a disulfide bond, but is not limited thereto.
  • the first body and the second body are bonded to each other by adding a Lys residue to the C-terminus of the first body, and a second body made of glucagon to the side chain thereof, or a disulfide bond. It may be, but is not limited thereto.
  • the exenatide analog may be one in which some amino acids in the amino acid sequence of exenatide are deleted and fatty acids are conjugated.
  • deletions are 1 to 15, 1 to 14, 1 to 13, 1 to 12, 1 to 11, 1 to 10, 1 to 9, 4 to 15 of the amino acid sequence of exenatide.
  • Dogs, 4 to 14, 4 to 13, 4 to 12, 4 to 11, 4 to 10, 4 to 9, 7 to 15, 7 to 14, 7 to 13, 7 to 12 , 7 to 11, 7 to 10, for example, 7 to 9 amino acids may be deleted.
  • the deletion may be the deletion of the N-terminal or C-terminal amino acid of the amino acid sequence of exenatide, for example, the deletion of the C-terminal amino acid of the amino acid sequence of exenatide. have.
  • the deletion is 1 to 15, 1 to 14, 1 to 13, 1 to 12, 1 to 11, 1 amino acid at the C-terminal of the amino acid sequence of exenatide To 10, 1 to 9, 4 to 15, 4 to 14, 4 to 13, 4 to 12, 4 to 11, 4 to 10, 4 to 9, 7 to 15, 7 to 14 Dogs, 7 to 13, 7 to 12, 7 to 11, 7 to 10, for example, 7 to 9 may be deleted.
  • the fatty acid in the exenatide analogue of the present invention may be conjugated to various positions of the exenatide in which some amino acids in the amino acid sequence have been deleted.
  • the fatty acid includes various saturated fatty acids and unsaturated fatty acids known in the art.
  • the fatty acid may be a fatty acid having a carbon number of C 3 to C 36 , for example, propionic acid, butyric acid, valeric acid, and caproic acid.
  • the fatty acid may be conjugated to the C-terminus Lys residue, N-terminus or C-terminus of the amino acid sequence of exenatide in which some amino acids are deleted, for example, C- It may be conjugated to the end.
  • the conjugation of exenatide and fatty acid from which some amino acids of the amino acid sequence are deleted includes both direct and/or indirect bonds.
  • the direct bond is a functional group such as a carboxyl group in a fatty acid and a functional group of an amino acid-deleted exenatide (e.g., -NH 2 ) reacts to form a covalent bond.
  • a functional group such as a carboxyl group in a fatty acid and a functional group of an amino acid-deleted exenatide (e.g., -NH 2 ) reacts to form a covalent bond.
  • a functional group such as a carboxyl group in a fatty acid and a functional group of an amino acid-deleted exenatide (e.g., -NH 2 ) reacts to form a covalent bond.
  • -NH 2 amino acid-deleted exenatide
  • the indirect bond may form a deleted exenatide-fatty acid conjugation by mediating a compound commonly used as a linker in the art.
  • the linker used in the present invention may be any compound used as a linker in the art, and a suitable linker may be selected according to the kind of functional group in the deleted exenatide.
  • the linker is N-succinimidylio Doacetate (N-succinimidyl iodoacetate), N-hydroxysuccinimidyl bromoacetate (N-Hydroxysuccinimidyl Bromoacetate), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide) ester), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester, N-maleimidobutyryloxysuccinamide ester (N-Maleimidobutyryloxysuccinamide ester) and Lys. , But is not limited thereto.
  • the amino acid-deleted exenatide is additionally linked to a linker at its C-terminus, and the fatty acid is conjugated to a linker bonded to the C-terminus.
  • Lys is bonded as a linker to the C-terminus of exenatide from which an amino acid has been deleted, and a fatty acid can be conjugated to this Lys.
  • the -NH 2 functional group of the additional Lys and the carboxyl group of the fatty acid may react to form a conjugate.
  • the exenatide dimer analog may be a first body, a second body, or a saccharide bound to one amino acid of each of them.
  • the exenatide dimer analog may be a first, a second, or one of which one amino acid is substituted with another amino acid, and a saccharide is bonded to the substituted amino acid.
  • the binding of the saccharide may be made at one or more positions selected from the group consisting of positions 17, 24 and 28 of exenatide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but limited thereto. It does not become.
  • the 17th amino acid Glu of exenatide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with Cys
  • the 28th amino acid Asn of exenatide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be one or more selected from the group consisting of Cys substitution, but is not limited thereto.
  • the binding of the saccharide may be made at one or more positions selected from the group consisting of the 16th and 24th positions of the glucagon consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the 16th amino acid Ser of glucagon consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with Cys or Asn
  • the 24th amino acid Gln of glucagon consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is Cys Or, it may be one or more selected from the group consisting of substitution with Asn, but is not limited thereto.
  • sugars are 1 to 11 sugars, 2 to 11 sugars, 3 to 11 sugars, 4 to 11 sugars, 5 to 11 sugars, 6 to 11 sugars, 7 to 11 sugars, 8 to 11 sugars, 9 to 11 sugars , 10 to 11 sugars, for example, may be 11 sugars, specifically bromoacetyl glycan of the following structural formula 1 and/or 11NC-Asn-Fmoc of the following structural formula 2, but It is not limited.
  • AGM-212 consists of a sequence from 1 to 32 of the sequence of exenatide consisting of SEQ ID NO: 1, and capric acid is bound to the side chain at the C-terminus of the sequence The resulting lysine is conjugated and is specified by the sequence of Ex4(1-32)K-cap.
  • AGM-212-1 refers to the sequence of AGM-212, wherein two sequences in which glutamic acid (Glu, E) at No. 17 is substituted with Cys form a dimer through disulfide bonds, and glutamic acid at No. 24 of each sequence This is a sequence in which 11 sugars are attached to an amino acid by being substituted with Cys.
  • AGM-212-2 refers to the sequence of AGM-212, wherein two sequences in which glutamic acid at No. 17 is substituted with Cys form a dimer through disulfide bonds, and Aspargine at No. 28 of each sequence is substituted with Cys. It is a sequence to which 11 sugars are bound.
  • AGM-212-3 is a sequence in which Lys is added to the C-terminus in the sequence of AGM-212, and glucagon is bound to the side chain thereof.
  • AGM-212-4 is a sequence in which 11 sugars are bound to 28 Asparagine in the sequence of AGM-212, Lys is added to the C-terminus, and glucagon is bound to its side chain.
  • AGM-212-5" is in the sequence of AGM-212, 11 sugars are bound to 28 Asparagine, Lys is added to the C-terminus, and glucagon is bound to its side chain, and in the sequence of glucagon 16 Serine (Ser, S) of 1 was replaced with 11NC-Asn, and 11 sugars were bound.
  • AGM-212-6 is in the sequence of AGM-212, 11 sugars are bound to 28 Asparagine, Lys is added to the C-terminus, and glucagon is bound to its side chain, and 24 in the sequence of glucagon Glutamine (Gln, Q) of 1 was substituted with 11NC-Asn, and 11 sugars were bound.
  • AGM-212-7 is in the sequence of AGM-212, by substituting Cys for Glutamic acid (Glu, E) at No. 17 and Cys for Glutamic acid at No. 24 to the sequence to which 11 sugars are bound.
  • 11 sugars are attached by substituting Cys for Serine (Ser, S) at No. 16, and a sequence in which Glutamine (Gln, Q) at No. 24 is substituted with Cys, and a dimer through a disulfide bond.
  • AGM-212-8 is a sequence to which 11 sugars are bound by replacing Glutamic acid (Glu, E) at No. 17 with Cys and Cys for Glutamic acid at No. 24 in the sequence of AGM-212, In the constituent sequence of glucagon, 11 sugars are attached by substituting Cys for Glutamine (Gln, Q) at No. 24, and a sequence in which Serine at No. 16 is substituted with Cys, and a dimer through disulfide bonds.
  • disulfide bond in the present name may mean that after E17 of two AGM-212 is substituted with C17, each of C17-C17 forms a disulfide bond with each other, but is not limited thereto.
  • Another example of the present invention relates to a pharmaceutical composition for improving, preventing or treating diabetes comprising an exenatide dimeric analog.
  • Another example of the present invention relates to a pharmaceutical composition for improving, preventing or treating obesity comprising an exenatide dimer analog.
  • exenatide dimer analog in the pharmaceutical composition of the present invention is the same as described above, and the description thereof is omitted.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in the formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystals Sex cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, but are not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., a talc, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, kaolin, kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, a talct, a talct, a talct, a stea, stevia, glycerin, glycerin, glycerin, g
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, route of administration, excretion rate and response sensitivity of the patient, Usually, the skilled practitioner can readily determine and prescribe the dosage effective for the desired treatment or prophylaxis.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.001-10000 mg/kg.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person having ordinary knowledge in the art. Or it can be made by incorporating it into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or a stabilizer.
  • the term "including as an active ingredient” means including an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the following exetanide analogs.
  • the upper limit of quantity included in the composition of the present invention can be selected and implemented within an appropriate range by a person skilled in the art.
  • Another example of the present invention relates to a food composition for improving or alleviating diabetes comprising an exenatide dimer analog.
  • Another example of the present invention relates to a food composition for improving or alleviating obesity comprising an exenatide dimer analog.
  • Another example of the present invention relates to an appetite suppressing food composition comprising an exenatide dimer analog.
  • exenatide dimer analogue in the food composition of the present invention is the same as described above, and the description thereof is omitted.
  • composition of the present invention is a food composition
  • it may be prepared in the form of powder, granules, tablets, capsules or beverages.
  • various foods such as candy, beverages, gum, tea, vitamin complexes, or health supplement foods.
  • the food composition of the present invention may include ingredients commonly added during food production as an active ingredient, and includes, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, flavoring agents, and flavoring agents.
  • Examples of the aforementioned carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides, and the like; And polysaccharides, for example, common sugars such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • sweetening agents natural flavoring agents [taumatin, stevia extract (eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.]) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • citric acid liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, cephalic extract, jujube extract, licorice extract, etc. may be additionally included in addition to the compounds of the present invention. .
  • Another object of the present invention is to provide a method for improving, preventing or treating diabetes by administering an exenatide analogue to a subject in need thereof in an amount effective for improving, preventing or treating diabetes.
  • Another object of the present invention is to provide a method for improving, preventing or treating obesity by administering an exenatide analogue to a subject in need thereof in an effective amount for improving, preventing or treating obesity.
  • Another object of the present invention is to provide a use of exenatide analogues to improve, prevent or treat diabetes.
  • Another object of the present invention is to provide a use of exenatide analogues to improve, prevent or treat obesity.
  • Another object of the present invention is to provide the use of an exenatide analogue to suppress appetite.
  • diabetes refers to a chronic disease characterized by a relative or absolute lack of insulin causing glucose-intolerance.
  • diabetes includes all types of diabetes, for example type 1 diabetes, type 2 diabetes and inherited diabetes.
  • Type 1 diabetes is insulin dependent diabetes, which is mainly caused by the destruction of ⁇ -cells.
  • Type 2 diabetes is insulin-independent diabetes, which is caused by insufficient insulin secretion after a meal or by insulin resistance.
  • the term "obesity” refers to a state in which adipose tissue is accumulated excessively in the body to the extent that it causes abnormal health.
  • appetite suppression means that the desire to eat food is suppressed.
  • the present invention relates to an exenatide analog glycosylated to a specific moiety and a use thereof, and the present invention provides a novel diabetes treatment material showing improved stability in the body compared to the conventional exenatide and its analog.
  • the present invention relates to an exenatide dimer analog and its use, and the present invention provides a novel diabetes treatment material showing improved stability in the body compared to the conventional exenatide and its analog.
  • Example 1 is a result of analyzing the insulin secretion ability of glycosylated AGM-212 analogs (Examples 1,2 and 4) according to an embodiment of the present invention through rat insulin ELISA in rat islets.
  • Example 2 is a result of analysis of the insulin secretion ability of glycosylated AGM-212 analogs (Examples 5 and 6) according to an embodiment of the present invention through rat insulin ELISA in rat islets.
  • FIG. 3 is a result of analyzing the degree of glucose tolerance in a type 2 diabetic mouse animal model by subcutaneously administering a glycosylated AGM-212 analog according to an embodiment of the present invention through a blood glucose meter.
  • FIG. 4 is a result of analyzing a pharmacokinetic evaluation test in a wild-type mouse animal model by subcutaneously administering a glycosylated AGM-212 analog according to an embodiment of the present invention.
  • 5 is an immunogenicity test result of a glycosylated AGM-212 analog according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a result of analyzing the insulin secretion ability of the analog according to an embodiment of the present invention through rat insulin ELISA in rat islets.
  • 7A is a result of analyzing the antidiabetic efficacy in a type 2 diabetic mouse animal model by subcutaneously administering analogs including AGM-212-1 and AGM-212-2 according to an embodiment of the present invention through a blood glucose meter. .
  • 7B is a result of analyzing the antidiabetic efficacy in a type 2 diabetic mouse animal model by subcutaneously administering analogs including AGM-212-1 and AGM-212-2 according to an embodiment of the present invention through a blood glucose meter. .
  • Figure 8a is a subcutaneous administration of analogs including AGM-212-3, AGM-212-4, AGM-212-5 and AGM-212-6 according to an embodiment of the present invention in a type 2 diabetes disease mouse animal model. This is the result of analyzing the anti-diabetic efficacy through a blood glucose meter.
  • 8B is a subcutaneous administration of analogs including AGM-212-3, AGM-212-4, AGM-212-5 and AGM-212-6 according to an embodiment of the present invention in a mouse animal model of type 2 diabetes mellitus. This is the result of analyzing the anti-diabetic efficacy through a blood glucose meter.
  • 9A is a result of analyzing a pharmacokinetic evaluation test in a wild-type mouse animal model by subcutaneously administering an analog according to an embodiment of the present invention.
  • 9B is a result of analyzing a pharmacokinetic evaluation test in a wild-type mouse animal model by subcutaneously administering an analog according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10a is a diet control ability test results of the analog according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10b is a diet control ability test results of the analog according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10c is a diet control ability test results of the analog according to an embodiment of the present invention.
  • 11A is a test result of improving glucose tolerance of an analog according to an embodiment of the present invention.
  • 11B is a test result of improving glucose tolerance of an analog according to an embodiment of the present invention.
  • 12A is a result of a test for improving insulin resistance of an analog according to an embodiment of the present invention.
  • 12B is a result of a test for improving insulin resistance of an analog according to an embodiment of the present invention.
  • 13A is a test result of fat accumulation in the liver of an analog according to an embodiment of the present invention.
  • 13B is a test result of fat accumulation in the liver of an analog according to an embodiment of the present invention.
  • 14A is a test result of a thermal energy enhancing effect of an analog according to an embodiment of the present invention.
  • 14B is a test result of the thermal energy enhancing effect of the analog according to an embodiment of the present invention.
  • 15A is a test result of a factor related to heat energy generation of an analog according to an embodiment of the present invention.
  • 15B is a test result of a factor related to heat energy generation of an analog according to an embodiment of the present invention.
  • 16A is a result of a fat resolution test result of an analog according to an embodiment of the present invention.
  • 16B is a result of a fat resolution test result of an analog according to an embodiment of the present invention.
  • 16C is a result of a fat resolution test result of an analog according to an embodiment of the present invention.
  • 16D is a result of a fat resolution test result of an analog according to an embodiment of the present invention.
  • 16E is a fat resolution test result of an analog according to an embodiment of the present invention.
  • 17A is a result of a test result of the ability to decompose fat and generate heat energy in muscle cells of an analog according to an embodiment of the present invention.
  • 17B is a test result of the ability to resolve fat and generate heat energy in muscle cells of the analog according to an embodiment of the present invention.
  • 17C is a test result of the ability to decompose fat and generate heat energy in muscle cells of the analog according to an embodiment of the present invention.
  • 1 to 15 amino acids of the exenatide amino acid sequence are deleted, a glycosylated exenatide analogue to which fatty acids are conjugated, or 1 to 15 amino acids of the exenatide amino acid sequence are deleted, , A first body consisting of an exenatide analog to which fatty acids are conjugated; And a second body consisting of an exenatide analog in which 1 to 15 amino acids of the exenatide amino acid sequence are deleted and fatty acids are conjugated, or glucagon; including, the first body and the second body Is bound to form a dimeric analog, exenatide dimer analog.
  • Fmoc-Lys(dde) trityl was added to trityl resin by adding Fmoc-Lys(dde)-OH and DMF.
  • the resin was prepared.
  • Fmoc-Ser(tBu)-Lys by adding DMF containing 20% piperidine and Fmoc-Ser(tBu)-OH and HOBt(hydroxyl-benzo triazole) to Fmoc-Lys(dde) trityl resin (dde) Trityl resin was prepared.
  • Fmoc-Ser(tBu)-Lys(dde) trityl resin in the same manner as described above, and sequentially Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(trt)-OH , Fmoc-Lys(boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu- OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gl
  • Formula 3 was prepared by adding capric acid and DMF containing HOBt and DIC to Formula 2.
  • Chemical Formula 5 was prepared by adding Bromoacetyl glycan (11 suar), NaOH, and phosphate buffer, which constitutes the structure of 11 sugars to Chemical Formula 4.
  • Chemical Formula 10 was prepared by adding Bromoacetyl glycan (11 suar), NaOH, and a phosphate buffer, which constitutes an 11 sugar structure to Chemical Formula 9.
  • Formula 12 was prepared by adding Bromoacetyl glycan (11 suar), NaOH, and phosphate buffer, which constitutes the structure of 11 sugars to Formula 11.
  • the Luciferase assay system is a method that can determine the degree of activity of a receptor by measuring the binding ability of a ligand to a specific receptor in a cell.
  • AGM-212 showed an activity against GLP-1R equivalent to Ex4, and AGM-212 analogs to which 11 sugars were bound were found to have somewhat reduced activity than Ex4 or AGM-212. Although the activity of each analogue was reduced due to glycosylation, it was found that it still had an nM level of binding ability.
  • SD rats (Damul Science) 8-week-old pancreas were extracted, and islets were isolated.
  • the isolated islets were treated with each analog in 28 mM glucose at different concentrations (10 nM, 100 nM), and then the amount of insulin secreted using a rat insulin ELISA kit was measured, and the results are shown in Figs. It is shown in Table 3 to 4.
  • AGM-212 (N28-11 sugar) exhibited a half-life similar to AGM-212, in the case of AGM-212 (N28C-11 sugar), an enhanced half-life was observed than Ex4. , AGM-212 (N28-11 sugar) showed a somewhat reduced level. It can be seen that this result does not appear to affect the half-life in the body when glycosylated.
  • glycosylated analog may have solubility enhanced by the binding of sugars
  • a solubility test for the glycosylated AGM-212 analog was performed.
  • the solubility of AGM-212 (N28C-11 sugar) and AGM-212 (E17C-11 sugar & N28C-11 sugar) at 10 mg/ml, respectively, in H 2 O and PBS (phosphate buffered saline) was performed using HPLC. Then, the results are shown in Table 6.
  • Ex4 has a solubility of 10 mg/ml in all solvents.
  • AGM-212 it was found that it has a somewhat reduced solubility in H 2 O, and about 0.5 times or more compared to Ex4 in PBS. Solubility was shown.
  • the glycosylated analog it shows an improved solubility than AGM-212 in all solvents, and when comparing the solubility of the analogs in which one and two sugars are bound, 11 sugars have more enhanced solubility due to the increase in the number of sugars bound.
  • Fmoc-Lys(dde) trityl resin was prepared by adding Fmoc-Lys(dde)-OH and DMF to trityl resin.
  • Fmoc-Ser(tBu)-Lys by adding DMF containing 20% piperidine and Fmoc-Ser(tBu)-OH and HOBt(hydroxyl-benzo triazole) to Fmoc-Lys(dde) trityl resin (dde) Trityl resin was prepared.
  • Fmoc-Ser(tBu)-Lys(dde) trityl resin in the same manner as described above, and sequentially Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(trt)-OH , Fmoc-Lys(boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Cys(trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu- OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, F
  • Formula 3 was prepared by adding capric acid and DMF containing HOBt and DIC to Formula 2.
  • Chemical Formula 5 was prepared by adding Bromoacetyl glycan (11 suar), NaOH, and Phosphate buffer, which constitutes an 11 sugar structure to Chemical Formula 4.
  • Fmoc-Lys-OH and DMF were added to tritiresin to prepare Fmoc-Lys trityl resin.
  • Fmoc-Cys(Acm)-OH of No. 17 was substituted with Fmoc-Glu(tBu)-OH to prepare Chemical Formula 6.
  • Fmoc-Thr(tBu)-OH and DMF were added to tritiresin to prepare Fmoc-Thr(tBu) trityl resin.
  • Fmoc-Asn(trt)-Thr by adding DMF containing 20% piperidine and Fmoc-Asn(trt)-OH and HOBt(hydroxyl-benzo triazole) to Fmoc-Thr(tBu) trityl resin (tBu) Trityl resin was prepared.
  • Fmoc-Asn(trt)-Thr(tBu) trityl resin in the same manner as described above, and sequentially Fmoc-Met-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Gln(trt )-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Gln(trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc -Arg(pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(trt)-OH, Fmoc-Ser
  • Example 3 after preparation by substituting 11NC-Asn-Fmoc for Asn 28 of the constituent sequence of Formula 6, the material of Formula 8 was replaced with DMF and HOBt (hydroxyl-benzo triazole) containing 20% piperidine. was added to prepare AGM-212-4 of Table 1 bound to the side chain of Lys 34 of Chemical Formula 6.
  • Chemical Formula 10 was prepared by adding Bromoacetyl glycan (11 suar), NaOH, and Phosphate buffer constituting the structure of 11 sugars to Chemical Formula 9.
  • Chemical Formula 12 was prepared by adding Bromoacetyl glycan (11 suar), NaOH, and Phosphate buffer, which constitutes an 11 sugar structure to Chemical Formula 11.
  • the Luciferase assay system is a method that can determine the degree of activity of a receptor by measuring the binding ability of a ligand to a specific receptor in a cell.
  • AGM-212-1 and AGM-212-2 confirmed the EC50 level of about 6 times or more enhanced than Ex4. This result shows that the glycosylated exenatide homolog composed of disulfide bonds has higher activity against the GLP-1 receptor than Ex4 and AGM-212.
  • AGM-212-3 a 10-fold decrease in EC50 levels was observed, and AGM-212-4, AGM-212-5, and AGM-212-6 decreased by 4-5 times compared to AGM-212-3. It was possible to observe the activity.
  • glucagon and exenatide analogs bind to each other by disulfide bonds, and thus their activity against GLP-1 receptors is somewhat reduced. I can see Sikkim. However, it can be seen that all analogues show a high nM level of avidity to the GLP-1 receptor, which has a selective and specific agonist function.
  • AGM-212 showed the same activity against GLP-1R as Ex4, and the AGM-212 analogs to which 11 sugars were bound were confirmed to have a somewhat reduced activity than Ex4 or AGM-212. 11 Although the activity of each analogue was reduced due to sugar, it was found that they still have nM level of binding ability.
  • glycosylated exenatide homolog showed a concentration-dependently enhanced insulin secretion ability compared to exenatide and AGM-212.
  • each analogue was administered subcutaneously at 20 nmole/kg, and after 0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24, 44, 48 hours elapsed, blood was collected from the tail vein of the mouse to obtain blood sugar. The level was measured, and the results are shown in FIGS. 7A to 8B.
  • AGM-212-2 exhibited an enhanced degree of lowering of blood sugar than Ex4 and AGM-212. Comparing the activity results with AGM-212-1, it was found that the glycosylation of Cys 24 of AGM-212-1 showed a reduced antidiabetic effect.
  • AGM-212-3, AGM-212-4, and AGM-212-5 all showed significant anti-diabetic efficacy, but slightly reduced efficacy than AGM-212.
  • AGM-212-4, AGM-212-5, and AGM-212-6 are structures in which sugars are bound to constituent residues of glucagon among the constituent sequences of AGM-212-3, and in antidiabetic efficacy, large activity due to each residue It was confirmed that there was no difference.
  • AGM-212-7 and AGM-212-8 it was confirmed that glucagon and AGM-212 glycosylated at different residues were composed of disulfide bonds, and had antidiabetic properties similar to Ex4.
  • Example 3 The analogs prepared in Example 3 were evaluated for weight loss and diet control ability in an animal model of obesity disease.
  • an animal model of obesity disease was constructed by inducing the intake of a high fat diet containing more than 60% fat to simultaneously retain obesity and hyperglycemia symptoms.
  • AGM-212-3 and AGM-212-4 were administered subcutaneously once a day at 50 nmole/kg for 9 weeks to 16-week-old obese mice. The results are shown in FIGS. 10A to 10C and Table 11.
  • mice with obesity disease at week 7 of the experiment were fasted for 16 hours, each analogue was administered subcutaneously at 10 nmole/kg, and glucose (1.5 g/kg) was administered intraperitoneally after 30 minutes.
  • glucose 1.5 g/kg
  • blood glucose was measured using a blood glucose meter (acu-check, Roche, Germany) using blood extracted from the tail vein of the mouse at 0, 15, 30, 45, 60, 90, and 120 minutes, and the result was It is shown in FIGS. 11A to 11B and Table 12.
  • Increased fat accumulation in the body due to obesity increases fat toxicity to beta cells of the pancreatic islet that produces insulin, thereby reducing insulin production and inhibiting insulin consumption in liver and muscle, tissues that absorb and store the increased blood sugar after eating. Therefore, it is reported as the main cause of the increase in insulin resistance, which is the main cause of hyperglycemia symptoms by inducing hyperinsulinemia and decreased insulin function.
  • Insulin resistance experiment was conducted in a period corresponding to 8 weeks to confirm the insulin sensitivity according to long-term administration of the drug, and after the long-term administration experiment was completed.
  • Mouse blood was collected and the insulin concentration in the blood was analyzed through mouse insulin ELISA to determine whether or not insulin resistance was improved.
  • each analogue was administered subcutaneously at a concentration of 1 nmol/kg, and after 30 minutes, insulin (1 unit/kg) was administered intraperitoneally. After 0, 15, 30, 60, 90, 120 minutes elapsed, blood was collected from the tail of the mouse, and the blood glucose was measured with a blood glucose meter (acc-check, Roche, Germany) to analyze the sensitivity to insulin, and the result It is shown in Figures 12a to 12b and Tables 13 and 14.
  • the incidence of overweight and obesity caused by ingestion of a high fat diet is known to increase the incidence of non-alcoholic fatty liver disease, a metabolic disease, by increasing fat accumulation in the liver, metabolic tissue, and lipid synthesis in hepatocytes.
  • non-alcoholic fatty liver disease a metabolic disease
  • the amount of lipids in liver tissue was analyzed through Oil red O staining, a lipid identification staining method.
  • liver tissue was degraded to confirm the amount of triglyceride, which is a form of lipid storage in cells.
  • mice livers were removed, separated by lobes, some were fixed in 4% formaldehyde, and then a paraffin block was prepared and sliced. After dyeing by treatment with Oil red O, a dyeing reagent, it was observed through a microscope. To measure the amount of triglyceride in liver tissue, the separated liver tissue was digested with a 70 um cell strainer, and then the supernatant containing triglyceride obtained by centrifugation at 14,000 rpm was diluted at a certain ratio and analyzed using Triglyceride ELISA. The results are shown in FIGS. 13A to 13B.
  • the blood glucose control hormone insulin and the diet control hormone leptin are higher than normal due to tissue resistance to each hormone when type 2 diabetes and obesity occur. These symptoms are called hyperinsulinemia and hyperleptinemia, respectively, and metabolic disease diagnosis It is used as a mark of.
  • mice blood was collected after the experiment and ELISA corresponding to each factor to be confirmed The amount of metabolic factors involved in blood was analyzed through the test, and the results are shown in Table 13.
  • AGM-212-3 was administered subcutaneously to 16-week-old obese mice (Diet induced obese C57BL/6) once a day for 5 weeks, followed by heat energy generation, exercise, respiration coefficient, and rectal temperature. was measured.
  • mice that have been administered for a long time for 5 weeks are reared for 24 hours in a metabolic cage connected to an energy metabolism analyzer, an indirect calorimetry system, and the amount of oxygen consumed through respiration and the amount of carbon dioxide released are measured at 1 hour intervals.
  • the Respiratory quotient an index that can confirm the amount of heat energy generated and the preference of nutrients consumed in the body, was analyzed.
  • the mouse was taken out of the metabolic feedlot, and a thermal probe was inserted through the anus to measure the rectal temperature, and the results are shown in FIGS. 14A to 14B.
  • the brown adipose tissue of the mouse was isolated after a 5-week long-term administration experiment, followed by Western blotting and quantitative real-time polymerase. Chain reaction, qRT-PCR) was used to analyze the expression levels of UCP1, PRDM16, and CIDEA, which are the main factors of the mechanism of heat energy generation.
  • the brown adipose tissue fixed in 4% paraformaldehyde was treated with an antibody having specific affinity to UCP1 to observe the expression level of UCP1 in brown adipose tissue, and the results are shown in FIGS. 15A to 15B.
  • AGM-212-3 activates glucagon receptors in brown adipose tissue, thereby increasing the generation of a signaling pathway that regulates the expression of factors involved in the generation of thermal energy.
  • FIGS. 16A to 16E it was confirmed through Western blot that protein kinase A, an important factor for the transduction of adipose decomposition signal, and HSL, a lipolytic enzyme, were significantly increased in the testicular white adipose tissue of the test group mice. I did.
  • Skeletal muscle is the main cause of the basal metabolic rate, and it is reported that it plays an important role in weight control by increasing the generation of heat energy through the same mechanism as brown fat.
  • the degree of phosphorylation of AMPK which is a major signal transducer of the C2C12 cell heat energy generation signal transduction pathway through Western blot, decreases compared to the control when the fatty acid palmitic acid (0.75 mM) is treated.
  • the degree of phosphorylation of AMPK significantly increased in a concentration-dependent manner when the analogs were treated at different concentrations (10nM, 20nM, 50nM, 100nM).
  • FAS lipid synthesis signal transduction factor
  • AGM-212-3 like brown fat, increases the generation of heat energy in skeletal muscle, can inhibit lipid synthesis, and has a valuable weight loss ability.
  • the present invention relates to glycosylated exenatide analogs and uses thereof, and to exenatide dimer analogs and uses thereof.

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Abstract

본 발명은 특정 잔기에 당쇄화된 엑세나타이드 유사체 및 이의 용도에 관한것으로, 본 발명은 종래의 엑세나타이드 및 이의 유사체에 비해 향상된 체내 안정성을 보이는 신규 당뇨 치료 물질을 제공한다. 본 발명은 엑세나타이드 이량 유사체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명은 종래의 엑세나타이드 및 이의 유사체에 비해 매우 향상된 체내 안정성을 보이는 신규 당뇨 및 비만 치료 물질을 제공한다.

Description

엑세나타이드 유사체 및 이의 용도
본 특허출원은 2019년 08월 13일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2019-0098911호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 특허출원은 2020년 08월 12일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2020-0101087호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 특허출원은 2020년 08월 12일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2020-0101088호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 당쇄화 엑세나타이드 유사체 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 엑세나타이드 이량 유사체 및 이의 용도에 관한 것이다.
생체 내에서 발현되는 단백질에 당이 붙는 과정인 당쇄화 (glycosylation)는 세포 내 소기관인 골지체에서 일어나는 반응으로, 당쇄화로 인해 형성된 당단백질은 세포간 결합, 조직의 발달, 면역 반응, 호르몬 작용 등의 다양한 생체현상에 관여하는 것으로 알려져 있다. 1880년도에 당의 구조 연구가 시작되어 현재까지 당 및 당쇄화 연구는 활발히 진행되고 있으며, 최근 당쇄화 기술을 활용한 약물개발 연구가 진행되고 있는 실정이다.
엑세나타이드 (Exenatide)는 미국 남서부에 서식하는 왕도마뱀 (Heloderma suspectum)의 침샘으로부터 분리된 GLP-1 (Glucagon-like Peptide-1)의 기능적 유사체 (analog)로서 제2형 당뇨병 펩타이드 치료제로 사용되고 있다. 최근 엑세나타이드를 비롯한 GLP-1 유사체의 체내 안정성이 개선된 지속적 작용성의 유사체 개발이 활발히 이루어지고 있다.
학술명 'Exendin-4'인 엑세나타이드는 39개 아미노산으로 구성된 생리활성 펩타이드로서 사람 생체 내에 존재하나 GLP-1과 53% 아미노산이 유사하며 DPP-4(Dipetidyl peptidase-4)와 같은 분해효소에 안정하여 GLP-1에 비해 체내 반감기가 비교적 길다.
엑세나타이드는 하루 두 번, 아침과 저녁 식사 이전에 투여한다. 엑세나타이드는 신장으로 배설되므로 심각한 신장 기능의 손상이나 말기 신질환을 가진 환자에게 사용은 추천되지 않는다.
엑세나타이드의 배설은 간기능에 의존적이지 않으므로 간으로 대사되는 약물과 상호작용을 가지지 않는다. 반면 엑세나타이드는 위장관 운동성 (gastric motility)에 영향을 주기 때문에 흡수와 관련하여 다른 약물과 상호작용을 일으킬 수 있다.
또한, 엑세나타이드 펩타이드의 합성 과정에서 과량의 시약과 재료의 비용이 많이 드는 단점이 있다. 또한 반응 단계수가 많고 각 단계별로 중간체를 유리해야하고 또한 이성질체가 생길 가능성이 있어 정제하기도 쉽지 않다.
GLP-1 유사체를 이용한 신규 당뇨병 신규 치료제는 활발히 연구되고 있으나, 대부분의 경우 약효 지속 효과 개선을 위한 제형 개발에 중점을 두고 있으며, 효능 및 안정성을 개선한 획기적인 엑세나타이드 유사체 및 모사체의 개발은 거의 없다.
한편, 엑세나티이드는 체내 면역반응으로 인한 약물 효능 저하 등의 부작용이 보고되고 있는 실정이다. 따라서, 체내에서 일어나는 당쇄화 과정을 이용한 펩타이드 약물의 개발은 증진된 체내 안정성 및 개선된 면역원성 (immunogenicity)을 나타낼 것으로 기대된다.
엑세나타이드는 GLP-1R (glucagon-like peptide-1 receptor)의 효현제(agonist)로 제2형 당뇨병 펩타이드 치료제로 사용되고 있으며, 최근 엑세나타이드를 비롯한 GLP-1 유사체의 체내 안정성과 저혈당 등의 부작용이 개선된 지속적 작용성의 유사체 개발이 활발히 이루어지고 있다.
GLP-1R 및 GCGR(glucagon receptor)은 각각 체내의 GLP-1, 글루카곤과 결합하여 혈당 조절을 통해 체내 항상성 유지에 중요한 작용을 한다. GLP-1R은 대뇌 피질 및 장에서 활성화되어 식욕을 저해하는 동시에 장 운동성을 감소시켜 체중 감소에 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 GCGR은 백색 지방 조직에서 지방 분해 효소인 HSL, ATGL 활성 증가, 갈색 지방 조직에서의 열에너지 발생 증가를 통해 축적된 지방을 분해하여 체중 감소에 기여하는 것으로 알려져 있으며 (REFERENCE), 제2형 당뇨병, 비만을 가진 환자를 대상으로 한 대사 기능 연구에서 글루카곤과 GLP-1을 동시에 투여하였을 시 글루카곤의 고혈당 위험성이 GLP-1의 인슐린 분비 증진에 의해 방지되어 혈당수준이 안정화되고, 열에너지 발생이 증가됨을 확인하였다.
상기 결과들은 GCGR과 GLP-1R을 동시에 표적하는 이중 표적 효현제 (Dual agonist)가 기존의 GLP-1 표적 효현제 대비 혈당 수준 조절 및 증진된 체중 감소 효과를 보유할 것이라는 점을 시사하며, 이중 표현 효현제가 새로운 제2형 당뇨병, 비만의 두 종류의 대사 질환의 동시적인 치료를 위한 새로운 약물 후보 물질이 될 수 있을 것으로 예상된다.
생체 내에서 발현되는 단백질에 당이 붙는 과정인 당쇄화 (glycosylation)는 세포 내 소기관인 골지체에서 일어나는 반응으로, 당쇄화로 인해 형성된 당단백질은 세포간 결합, 조직의 발달, 면역 반응, 호르몬 작용 등의 다양한 생체현상에 관여하는 것으로 알려져 있다. 1880년도에 당의 구조 연구가 시작되어 현재까지 당 및 당쇄화 연구는 활발히 진행되고 있으며, 최근 당쇄화 기술을 활용한 약물개발 연구가 진행되고 있는 실정이다.
엑세나타이드 (Exenatide)는 미국 남서부에 서식하는 왕도마뱀 (Heloderma suspectum)의 침샘으로부터 분리된 GLP-1 (Glucagon-like Peptide-1)의 기능적 유사체(analog)로서 제2형 당뇨병 펩타이드 치료제로 사용되고 있다. 최근 엑세나타이드를 비롯한 GLP-1 유사체의 체내 안정성이 개선된 지속적 작용성의 유사체 개발이 활발히 이루어지고 있다.
학술명 'Exendin-4'인 엑세나타이드는 39개 아미노산으로 구성된 생리활성 펩타이드로서 사람 생체 내에 존재하나 GLP-1과 53% 아미노산이 유사하며 DPP-4(Dipetidyl peptidase-4)와 같은 분해효소에 안정하여 GLP-1에 비해 체내 반감기가 비교적 길다.
엑세나타이드는 하루 두 번, 아침과 저녁 식사 이전에 투여한다. 엑세나타이드는 신장으로 배설되므로 심각한 신장 기능의 손상이나 말기 신질환을 가진 환자에게 사용은 추천되지 않는다.
엑세나타이드의 배설은 간기능에 의존적이지 않으므로 간으로 대사되는 약물과 상호작용을 가지지 않는다. 반면 엑세나타이드는 위장관 운동성 (gastric motility)에 영향을 주기 때문에 흡수와 관련하여 다른 약물과 상호작용을 일으킬 수 있다.
또한, 엑세나타이드 펩타이드의 합성 과정에서 과량의 시약과 재료의 비용이 많이 드는 단점이 있다. 또한 반응 단계수가 많고 각 단계별로 중간체를 유리해야하고 또한 이성질체가 생길 가능성이 있어 정제하기도 쉽지 않다.
GLP-1 유사체를 이용한 신규 당뇨병 신규 치료제는 활발히 연구되고 있으나, 대부분의 경우 약효 지속 효과 개선을 위한 제형 개발에 중점을 두고 있으며, 효능 및 안정성을 개선한 획기적인 엑세나타이드 유사체 및 모사체의 개발은 거의 없다.
한편, 엑세나티이드는 체내 면역반응으로 인한 약물 효능 저하 등의 부작용이 보고되고 있는 실정이다. 따라서, 체내에서 일어나는 당쇄화 과정을 이용한 펩타이드 약물의 개발은 증진된 체내 안정성 및 개선된 면역원성 (immunogenicity)을 나타낼 것으로 기대된다.
본 발명에서는 당쇄화 기술을 접목한 엑세나타이드 유사체를 개발하여, 약물의 효능 및 체내 안정성이 증진된 신규 당뇨 치료 후보물질의 개발을 하고자 한다.
본 발명의 목적은 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 포함하는 당뇨 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 포함하는 비만 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 포함하는 당뇨 개선 또는 완화용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 포함하는 비만 개선 또는 완화용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 포함하는 식욕 억제용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 당뇨의 개선, 예방 또는 치료 유효량으로 이를 필요로 하는 대상에 투여하여 당뇨의 개선, 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 비만의 개선, 예방 또는 치료 유효량으로 이를 필요로 하는 대상에 투여하여 비만의 개선, 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 당쇄화 엑세나타이드 유사체의 당뇨 개선, 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 당쇄화 엑세나타이드 유사체의 비만 개선, 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 당쇄화 엑세나타이드 유사체의 식욕 억제 용도를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 다량 항원성 펩타이드 (Multiple antigenic peptide, MAP)를 적용하여 GLP-1R 효현제인 엑세나타이드를 기반으로 개발된 혈당 조절능 및 생체 내 안정성이 개선된 엑세나타이드 이량 유사체를 개발하여 신규 당뇨 및 비만 치료 후보물질의 개발을 하고자 한다.
본 발명의 목적은 엑세나타이드 이량 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 엑세나타이드 이량 유사체를 포함하는 당뇨 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 이량 유사체를 포함하는 비만 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 이량 유사체를 포함하는 당뇨 개선 또는 완화용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 이량 유사체를 포함하는 비만 개선 또는 완화용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 이량 유사체를 포함하는 식욕 억제용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 이량 유사체를 당뇨의 개선, 예방 또는 치료 유효량으로 이를 필요로 하는 대상에 투여하여 당뇨의 개선, 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 이량 유사체를 비만의 개선, 예방 또는 치료 유효량으로 이를 필요로 하는 대상에 투여하여 비만의 개선, 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 이량 유사체의 당뇨 개선, 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 이량 유사체의 비만 개선, 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 이량 유사체의 식욕 억제 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 당쇄화 엑세나타이드 (exenatide) 유사체 및 이의 용도에 관한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 당쇄화 엑세나타이드 유사체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 엑세나타이드는 GLP-1 수용체 항진제로, 디펩티딜 펩티데이즈-IV(DPP-IV)에 의해 빠르게 분해되는 GLP-1을 모방한 유사체 (GLP-1 metrics)로서, DPP-IV에 의해 빠르게 분해되지 않으면서 당-의존적 인슐린 분비를 촉진하고 글루카곤 분비, 위 배출 및 식욕을 억제하며, 베타세포 보호효과를 보이는 GLP-1의 효과를 나타내는 약물이다.
본 발명에 있어서 엑세나타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 엑세나타이드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열 상동성 최소 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상을 나타내는 엑세나타이드 유사체를 포함한다.
본 발명의 일 예에 있어서, 엑세나타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 엑세나타이드 유사체는 엑세나타이드의 아미노산 서열의 일부 아미노산이 결실되고 지방산이 접합 (conjugation)된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 결실은 엑세나타이드의 아미노산 서열의 1 내지 15개, 1 내지 14개, 1 내지 13개, 1 내지 12개, 1 내지 11개, 1 내지 10, 1 내지 9개, 4 내지 15개, 4 내지 14개, 4 내지 13개, 4 내지 12개, 4 내지 11개, 4 내지 10, 4 내지 9개, 7 내지 15개, 7 내지 14개, 7 내지 13개, 7 내지 12개, 7 내지 11개, 7 내지 10, 예를 들어, 7 내지 9개의 아미노산이 결실된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 결실은 엑세나타이드의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단의 아미노산이 결실된 것일 수 있으며, 예를 들어, 엑세나타이드의 아미노산 서열의 C-말단의 아미노산이 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 결실은 엑세나타이드의 아미노산 서열의 C-말단의 아미노산이 1 내지 15개, 1 내지 14개, 1 내지 13개, 1 내지 12개, 1 내지 11개, 1 내지 10, 1 내지 9개, 4 내지 15개, 4 내지 14개, 4 내지 13개, 4 내지 12개, 4 내지 11개, 4 내지 10, 4 내지 9개, 7 내지 15개, 7 내지 14개, 7 내지 13개, 7 내지 12개, 7 내지 11개, 7 내지 10, 예를 들어, 7 내지 9개 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 엑세나타이드 유사체에서의 지방산은 아미노산 서열의 일부 아미노산이 결실된 엑세나타이드의 다양한 위치에 접합된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 지방산은 당업계에 공지된 다양한 포화 지방산 및 불포화 지방산을 포함한다.
본 발명에 있어서 지방산은 C3 내지 C36의 탄소수를 갖는 지방산인 것일 수 있으며, 예를 들어, 프로피온산 (propionic acid), 부티르산 (butyric acid), 발레르산 (valeric acid), 카프로산 (caproic acid), 에난트산 (enanthic acid), 카프릴릭산 (caprylic acid), 펠라르곤산 (pelargonic acid), 카프릭산 (capric acid), 언데실산 (undecylic acid), 라우르산 (lauric acid), 트리데실산 (tridecylic acid), 미리스트산 (myristic acid), 펜타데실산 (pentadecylic acid), 팔미트산 (palmitic acid), 마르가르산 (margaric acid), 스테아르산 (stearic acid), 논아데실산 (nonadecylic acid), 아라키트산 (arachidic acid), 헤네이코실산 (heneicosylic acid), 베헨산 (behenic acid), 트리코실(tricosylic acid), 리그노세르산 (lignoceric acid), 펜타코실산 (pentacosylic acid), 세로트산 (cerotic acid), 헵타코실산 (heptacosylic acid), 몬탄산 (montanic acid), 논아코실산 (nonacosylic acid), 멜리스산 (melissic acid), 헤나트리아콘틸산 (henatriacontylic acid), 라세로산 (lacceroic acid), 사일산 (psyllic acid), 게드산 (geddic acid), 세로플라스트산 (ceroplastic acid) 및 헥사트리아콘틸산 (hexatriacontylic acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 지방산은 일부 아미노산이 결실된 엑세나타이드의 아미노산 서열의 C-말단의 Lys 잔기, N-말단 또는 C-말단에 접합된 것일 수 있으며, 예를 들어, C-말단에 접합된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 아미노산 서열의 일부 아미노산이 결실된 엑세나타이드 및 지방산의 접합은 직접 결합 및/또는 간접 결합을 모두 포함한다.
본 발명에 있어서 직접 결합은 지방산에 있는 카복실기와 같은 작용기와 아미노산이 결실된 엑세나타이드의 작용기 (예를 들어, -NH2)가 반응하여 공유결합을 형성함으로써 결실된 엑세나타이드-지방산 접합을 형성할 수 있다.
본 발명에 있어서 간접 결합은 당업계에서 링커로 통상적으로 이용되는 화합물이 중개하여 결실된 엑세나타이드-지방산 접합을 형성할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 링커는 당업계에서 링커로 이용되는 어떠한 화합물도 가능하며, 결실된 엑세나타이드에 있는 작용기 종류에 따라 적합한 링커를 선택할 수 있으며, 예를 들어, 링커는 N-숙시니미딜 요오도아세테이드 (N-succinimidyl iodoacetate), N-히드록시숙시니미딜 브로모아세테이트(N-Hydroxysuccinimidyl Bromoacetate), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), m-말레이미도벤조일-N-히드록시설포숙신이미드 에스테르 (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester), N-말레이미도부티릴옥시숙신아미드 에스테르 (N-Maleimidobutyryloxysuccinamide ester) 및 Lys을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 아미노산이 결실된 엑세나타이드는 그의 C-말단에 링커를 추가적으로 결합되며, 상기 지방산은 상기 C-말단에 결합된 링커에 접합되어 있다. 예를 들어, 아미노산이 결실된 엑세나타이드의 C-말단에 링커로서 Lys이 결합되고 이 Lys에 지방산이 접합될 수 있다. 이 경우, 상기 추가적인 Lys의 -NH2 작용기와 지방산의 카복실기가 반응하여 컨쥬게이트를 형성할 수 있다.
본 발명에 있어서 당쇄화 엑세나타이드 유사체는 엑세나타이드 유사체의 적어도 하나 이상의 아미노산에 당류가 결합된 것일 수 있으며, 당류가 결합된 아미노산은 다른 일 아미노산으로 치환된 후 당류가 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 당류의 결합은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 엑세나타이드의 17, 24 및 28번째 위치로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 위치에서 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 치환은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 엑세나타이드의 17번째 아미노산 Glu이 Cys로 치환, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 엑세나타이드의 24번째 아미노산 Glu이 Cys로 치환, 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 엑세나타이드의 28번째 아미노산 Asn이 Cys로 치환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 당류는 1 내지 11당, 2 내지 11당, 3 내지 11당, 4 내지 11당, 5 내지 11당, 6 내지 11당, 7 내지 11당, 8 내지 11당, 9 내지 11당, 10 내지 11당, 예를 들어, 11당인 것일 수 있으며, 구체적으로는 하기 구조식 1의 브로모아세틸 글리칸 (Bromoacetyl glycan) 및/또는 하기 구조식 2의 11NC-Asn-Fmoc인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[구조식 1]
Figure PCTKR2020010751-appb-I000001
[구조식 2]
Figure PCTKR2020010751-appb-I000002
본 명세서에서 용어 "AGM-212"는 서열번호 1로 이루어진 엑세나타이드의 서열의 1번부터 32번까지의 서열로 이루어지며, 상기 서열 C-말단에 카프릭 산 (capric acid)이 측쇄에 결합된 라이신 (lysine)을 접합한 것으로, Ex4(1-32)K-cap의 서열로 명시한다.
본 명세서에서 용어 "AGM-212(E17C-11 sugar)"는 Ex4(1-32)-cap의 서열에서, 17번의 글루탐산 (Glutamic acid, Glu, E)이 Cys로 치환되고, 치환된 아미노산에 11 당의 구조를 갖는 당이 결합된 서열이다.
본 명세서에서 용어 "AGM-212(N28C-11 sugar)"는 Ex4(1-32)-cap의 서열에서, 28번의 아스파라진 (Asparagine, Asn, N)이 Cys로 치환되고, 치환된 아미노산에 11 당의 구조를 갖는 당이 결합된 서열이다.
본 명세서에서 용어 "AGM-212(N28-11 sugar)"는 Ex4(1-32)-cap의 서열에서, 28번의 아스파라진에 11 당의 구조를 갖는 당이 결합된 서열이다.
본 명세서에서 용어 "AGM-212(E24-11 sugar)"는 Ex4(1-32)-cap의 서열에서, 24번의 글루탐산이 이 Cys로 치환되고, 치환된 아미노산에 11 당의 구조를 갖는 당이 결합된 서열이다.
본 명세서에서 용어 "AGM-212(E17C-11 sugar & E24C-11 sugar)"는 Ex4(1-32)-cap의 서열에서, 17번의 글루탐산을 Cys로 치환하고 24번의 글루탐산을 치환하여, 각각의 치환된 아미노산에 11 당의 구조를 갖는 당이 결합된 서열이다.
본 명세서에서 용어 "AGM-212(E17C-11 sugar & N28C-11 sugar)"는 Ex4(1-32)-cap의 서열에서, 17번의 글루탐산을 Cys로 치환하고 28번의 아스파라진을 치환하여, 각각의 치환된 아미노산에 11 당의 구조를 갖는 당이 결합된 서열이다.
본 발명의 다른 일 예는 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 포함하는 당뇨 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 포함하는 비만 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물에 있어서 당쇄화 엑세나타이드 유사체에 관한 기재는 상술한 바와 동일하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10000 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 하기의 엑세타나이드 유사체의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 포함하는 당뇨 개선 또는 완화용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 포함하는 비만 개선 또는 완화용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 포함하는 식욕 억제용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서 당쇄화 엑세나타이드 유사체에 관한 기재는 상술한 바와 동일하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물인 경우에는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등의 형태로 제조될 수 있다. 예컨대 캔디류의 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 또는 건강보조 식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다.
상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 화합물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 유사체를 당뇨의 개선, 예방 또는 치료 유효량으로 이를 필요로 하는 대상에 투여하여 당뇨의 개선, 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 유사체를 비만의 개선, 예방 또는 치료 유효량으로 이를 필요로 하는 대상에 투여하여 비만의 개선, 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 유사체의 당뇨 개선, 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 유사체의 비만 개선, 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 유사체의 식욕 억제 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 엑세나타이드 (exenatide) 이량 유사체 및 이의 용도에 관한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 엑세나타이드 이량 유사체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 엑세나타이드 이량 유사체는 엑세나타이드 (exenatide) 아미노산 서열의 1 내지 15개의 아미노산이 결실되고, 지방산이 접합 (conjugation)된 엑세나타이드 유사체로 이루어진 제1체; 및 엑세나타이드 (exenatide) 아미노산 서열의 1 내지 15개의 아미노산이 결실되고 지방산이 접합 (conjugation)된 엑세나타이드 유사체, 또는 글루카곤으로 이루어진 제2체;를 포함하고, 상기 제1체 및 제2체는 결합되어 이량 유사체를 형성하고 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 엑세나타이드는 GLP-1 수용체 항진제로, 디펩티딜 펩티데이즈-IV (DPP-IV)에 의해 빠르게 분해되는 GLP-1을 모방한 유사체 (GLP-1 metrics)로서, DPP-IV에 의해 빠르게 분해되지 않으면서 당-의존적 인슐린 분비를 촉진하고 글루카곤 분비, 위 배출 및 식욕을 억제하며, 베타세포 보호효과를 보이는 GLP-1의 효과를 나타내는 약물이다.
본 발명에 있어서 엑세나타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 엑세나타이드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열 상동성 최소 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상을 나타내는 엑세나타이드 유사체를 포함한다.
본 발명의 일 예에 있어서, 엑세나타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 글루카곤은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 글루카콘 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열 상동성 최소 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상을 나타내는 글루카콘 유사체를 포함한다.
본 발명의 일 예에 있어서, 글루카곤은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 제2체가 엑세나타이드 유사체인 경우, 상기 제1체 및 제2체의 결합은 이황화결합인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 제2체가 글루카곤인 경우, 상기 제1체 및 제2체의 결합은 제1체의 C-말단에 Lys 잔기를 첨가하고 이의 측쇄에 글루카곤으로 이루어진 제2체가 결합, 또는 이황화결합된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 엑세나타이드 유사체는 엑세나타이드의 아미노산 서열의 일부 아미노산이 결실되고 지방산이 접합 (conjugation)된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 결실은 엑세나타이드의 아미노산 서열의 1 내지 15개, 1 내지 14개, 1 내지 13개, 1 내지 12개, 1 내지 11개, 1 내지 10, 1 내지 9개, 4 내지 15개, 4 내지 14개, 4 내지 13개, 4 내지 12개, 4 내지 11개, 4 내지 10, 4 내지 9개, 7 내지 15개, 7 내지 14개, 7 내지 13개, 7 내지 12개, 7 내지 11개, 7 내지 10, 예를 들어, 7 내지 9개의 아미노산이 결실된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 결실은 엑세나타이드의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단의 아미노산이 결실된 것일 수 있으며, 예를 들어, 엑세나타이드의 아미노산 서열의 C-말단의 아미노산이 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 결실은 엑세나타이드의 아미노산 서열의 C-말단의 아미노산이 1 내지 15개, 1 내지 14개, 1 내지 13개, 1 내지 12개, 1 내지 11개, 1 내지 10, 1 내지 9개, 4 내지 15개, 4 내지 14개, 4 내지 13개, 4 내지 12개, 4 내지 11개, 4 내지 10, 4 내지 9개, 7 내지 15개, 7 내지 14개, 7 내지 13개, 7 내지 12개, 7 내지 11개, 7 내지 10, 예를 들어, 7 내지 9개 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 엑세나타이드 유사체에서의 지방산은 아미노산 서열의 일부 아미노산이 결실된 엑세나타이드의 다양한 위치에 접합된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 지방산은 당업계에 공지된 다양한 포화 지방산 및 불포화 지방산을 포함한다.
본 발명에 있어서 지방산은 C3 내지 C36의 탄소수를 갖는 지방산인 것일 수 있으며, 예를 들어, 프로피온산(propionic acid), 부티르산(butyric acid), 발레르산(valeric acid), 카프로산(caproic acid), 에난트산(enanthic acid), 카프릴릭산(caprylic acid), 펠라르곤산(pelargonic acid), 카프릭산(capric acid), 언데실산(undecylic acid), 라우르산(lauric acid), 트리데실산(tridecylic acid), 미리스트산(myristic acid), 펜타데실산(pentadecylic acid), 팔미트산(palmitic acid), 마르가르산(margaric acid), 스테아르산(stearic acid), 논아데실산(nonadecylic acid), 아라키트산(arachidic acid), 헤네이코실산(heneicosylic acid), 베헨산(behenic acid), 트리코실(tricosylic acid), 리그노세르산(lignoceric acid), 펜타코실산(pentacosylic acid), 세로트산(cerotic acid), 헵타코실산(heptacosylic acid), 몬탄산(montanic acid), 논아코실산(nonacosylic acid), 멜리스산(melissic acid), 헤나트리아콘틸산(henatriacontylic acid), 라세로산(lacceroic acid), 사일산(psyllic acid), 게드산(geddic acid), 세로플라스트산(ceroplastic acid) 및 헥사트리아콘틸산(hexatriacontylic acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 지방산은 일부 아미노산이 결실된 엑세나타이드의 아미노산 서열의 C-말단의 Lys 잔기, N-말단 또는 C-말단에 접합된 것일 수 있으며, 예를 들어, C-말단에 접합된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 아미노산 서열의 일부 아미노산이 결실된 엑세나타이드 및 지방산의 접합은 직접 결합 및/또는 간접 결합을 모두 포함한다.
본 발명에 있어서 직접 결합은 지방산에 있는 카복실기와 같은 작용기와 아미노산이 결실된 엑세나타이드의 작용기 (예를 들어, -NH2)가 반응하여 공유결합을 형성함으로써 결실된 엑세나타이드-지방산 접합을 형성할 수 있다.
본 발명에 있어서 간접 결합은 당업계에서 링커로 통상적으로 이용되는 화합물이 중개하여 결실된 엑세나타이드-지방산 접합을 형성할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 링커는 당업계에서 링커로 이용되는 어떠한 화합물도 가능하며, 결실된 엑세나타이드에 있는 작용기 종류에 따라 적합한 링커를 선택할 수 있으며, 예를 들어, 링커는 N-숙시니미딜 요오도아세테이드 (N-succinimidyl iodoacetate), N-히드록시숙시니미딜 브로모아세테이트(N-Hydroxysuccinimidyl Bromoacetate), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), m-말레이미도벤조일-N-히드록시설포숙신이미드 에스테르 (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester), N-말레이미도부티릴옥시숙신아미드 에스테르 (N-Maleimidobutyryloxysuccinamide ester) 및 Lys을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 아미노산이 결실된 엑세나타이드는 그의 C-말단에 링커를 추가적으로 결합되며, 상기 지방산은 상기 C-말단에 결합된 링커에 접합되어 있다. 예를 들어, 아미노산이 결실된 엑세나타이드의 C-말단에 링커로서 Lys이 결합되고 이 Lys에 지방산이 접합될 수 있다. 이 경우, 상기 추가적인 Lys의 -NH2 작용기와 지방산의 카복실기가 반응하여 컨쥬게이트를 형성할 수 있다.
본 발명에 있어서 엑세나타이드 이량 유사체는 제1체, 제2체 또는 이들 각각의 일 아미노산에 당류가 결합된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 엑세나타이드 이량 유사체는 제1체, 제2체 또는 이들 각각의 일 아미노산이 다른 일 아미노산으로 치환되고, 치환된 아미노산에 당류가 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 당류의 결합은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 엑세나타이드의 17, 24 및 28번째 위치로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 위치에서 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 치환은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 엑세나타이드의 17번째 아미노산 Glu이 Cys로 치환, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 엑세나타이드의 24번째 아미노산 Glu이 Cys로 치환, 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 엑세나타이드의 28번째 아미노산 Asn이 Cys로 치환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 당류의 결합은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 글루카곤의 16 및 24번째 위치로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 위치에서 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 치환은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 글루카곤의 16번째 아미노산 Ser이 Cys또는 Asn로 치환, 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 글루카곤의 24번째 아미노산 Gln이 Cys 또는 Asn로 치환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 당류는 1 내지 11당, 2 내지 11당, 3 내지 11당, 4 내지 11당, 5 내지 11당, 6 내지 11당, 7 내지 11당, 8 내지 11당, 9 내지 11당, 10 내지 11당, 예를 들어, 11당인 것일 수 있으며, 구체적으로는 하기 구조식 1의 브로모아세틸 글리칸 (Bromoacetyl glycan) 및/또는 하기 구조식 2의 11NC-Asn-Fmoc인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[구조식 1]
Figure PCTKR2020010751-appb-I000003
[구조식 2]
Figure PCTKR2020010751-appb-I000004
본 명세서에서 용어 “AGM-212”는 서열번호 1로 이루어진 엑세나타이드의 서열의 1번부터 32번까지의 서열로 이루어지며, 상기 서열 C-말단에 카프릭 산 (capric acid)이 측쇄에 결합된 라이신 (lysine)을 접합한 것으로, Ex4(1-32)K-cap의 서열로 명시한다.
본 명세서에서 용어 "AGM-212-1"는 AGM-212의 서열에서, 17번의 글루탐산 (Glu, E)이 Cys로 치환된 서열 2개가 이황화결합을 통해 이량체를 이루고, 각 서열의 24번 글루탐산이 Cys로 치환되어 아미노산에 11 당이 결합된 서열이다.
본 명세서에서 용어 "AGM-212-2"는 AGM-212의 서열에서, 17번의 글루탐산이 Cys로 치환된 서열 2개가 이황화결합을 통해 이량체를 이루고, 각 서열의 28번 Aspargine이 Cys로 치환되어 11 당이 결합된 서열이다.
본 명세서에서 용어 "AGM-212-3"는 AGM-212의 서열에서, C-말단에 Lys을 첨가하고, 이의 측쇄에 글루카곤 (Glucagon)이 결합된 서열이다.
본 명세서에서 용어 "AGM-212-4"는 AGM-212의 서열에서, 28번의 Asparagine에 11 당이 결합되며, C-말단에 Lys을 첨가하고 이의 측쇄에 글루카곤이 결합된 서열이다.
본 명세서에서 용어 "AGM-212-5"는 AGM-212의 서열에서, 28번의 Asparagine에 11 당이 결합되며, C-말단에 Lys을 첨가하고 이의 측쇄에 글루카곤이 결합되며, 글루카곤의 서열에서 16번의 Serine (Ser, S)이 11NC-Asn으로 치환하여 11 당이 결합된 서열이다.
본 명세서에서 용어 "AGM-212-6"는 AGM-212의 서열에서, 28번의 Asparagine에 11 당이 결합되며, C-말단에 Lys을 첨가하고 이의 측쇄에 글루카곤이 결합되며, 글루카곤의 서열에서 24번의 Glutamine (Gln, Q)가 11NC-Asn으로 치환하여 11 당이 결합된 서열이다.
본 명세서에서 용어 "AGM-212-7"는 AGM-212의 서열에서, 17번의 Glutamic acid(Glu, E)을 Cys로 치환하고, 24번의 Glutamic acid을 Cys로 치환하여 11 당이 결합된 서열과, 글루카곤의 서열에서 16번의 Serine(Ser, S)을 Cys로 치환하여 11 당이 결합되고, 24번의 Glutamine(Gln, Q)을 Cys로 치환한 서열과 이황화결합을 통해 이량체로 구성된 물질이다.
본 명세서에서 용어 "AGM-212-8"는 AGM-212의 서열에서 17번의 Glutamic acid(Glu, E)을 Cys로 치환하고, 24번의 Glutamic acid을 Cys로 치환하여 11 당이 결합된 서열과, 글루카곤의 구성 서열에서 24번의 Glutamine(Gln, Q)을 Cys로 치환하여 11 당이 결합되고, 16번의 Serine을 Cys로 치환한 서열과 이황화결합을 통해 이량체로 구성된 물질이다.
본 명에서의 용어 "이황화결합"은 두 개의 AGM-212의 E17이 C17로 치환된 후, 각각의 C17-C17이 서로 이황화결합을 이루는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 예는 엑세나타이드 이량 유사체를 포함하는 당뇨 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 엑세나타이드 이량 유사체를 포함하는 비만 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물에 있어서 엑세나타이드 이량 유사체에 관한 기재는 상술한 바와 동일하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10000 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 하기의 엑세타나이드 유사체의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 엑세나타이드 이량 유사체를 포함하는 당뇨 개선 또는 완화용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 엑세나타이드 이량 유사체를 포함하는 비만 개선 또는 완화용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 엑세나타이드 이량 유사체를 포함하는 식욕 억제용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서 엑세나타이드 이량 유사체에 관한 기재는 상술한 바와 동일하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물인 경우에는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등의 형태로 제조될 수 있다. 예컨대 캔디류의 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 또는 건강보조 식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다.
상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 화합물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 유사체를 당뇨의 개선, 예방 또는 치료 유효량으로 이를 필요로 하는 대상에 투여하여 당뇨의 개선, 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 유사체를 비만의 개선, 예방 또는 치료 유효량으로 이를 필요로 하는 대상에 투여하여 비만의 개선, 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 유사체의 당뇨 개선, 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 유사체의 비만 개선, 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑세나타이드 유사체의 식욕 억제 용도를 제공하는 것이다.
본 명세서에서 용어 "당뇨"는 포도당-비관용(intolerance)을 초래하는 인슐린의 상대적 또는 절대적 부족으로 특징되는 만성질환을 의미한다. 용어 당뇨는 모든 종류의 당뇨병을 포함하며, 예를 들어, 제1형 당뇨, 제2형 당뇨 및 유전성 당뇨를 포함한다. 제1형 당뇨는 인슐린 의존성 당뇨병으로서, β-세포의 파괴에 의해 주로 초래된다. 제2형 당뇨는 인슐린 비의존성 당뇨병으로서, 식사 후 불충분한 인슐린 분비에 의해 초래되거나 또는 인슐린 내성에 의해 초래된다.
본 명세서에서 용어 "비만"은 건강에 이상을 초래할 정도로 지방 조직이 체내에 과잉으로 축적된 상태를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "식욕 억제"는 음식을 섭취하고자 하는 욕구가 억제되는 것을 의미한다.
본 발명은 특정 잔기에 당쇄화된 엑세나타이드 유사체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명은 종래의 엑세나타이드 및 이의 유사체에 비해 향상된 체내 안정성을 보이는 신규 당뇨 치료 물질을 제공한다.
본 발명은 엑세나타이드 이량 유사체 및 이의 용도에 관한것으로, 본 발명은 종래의 엑세나타이드 및 이의 유사체에 비해 향상된 체내 안정성을 보이는 신규 당뇨 치료 물질을 제공한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 당쇄화 AGM-212 유사체(실시예 1,2 및 4)의 인슐린 분비능을 rat islets에서 rat insulin ELISA를 통해 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 당쇄화 AGM-212 유사체(실시예 5 및 6)의 인슐린 분비능을 rat islets에서 rat insulin ELISA를 통해 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 당쇄화 AGM-212 유사체를 피하 투여하여 2형 당뇨 질병 마우스 동물 모델에서의 당부하 정도를 혈당측정기를 통해 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 당쇄화 AGM-212 유사체를 피하 투여하여 야생형 마우스 동물 모델에서의 약동력학 평가 시험을 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 당쇄화 AGM-212 유사체의 면역원성 시험 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 인슐린 분비능을 rat islets에서 rat insulin ELISA를 통해 분석한 결과이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 AGM-212-1 및 AGM-212-2를 포함한 유사체들을 피하 투여하여 2형 당뇨 질병 마우스 동물 모델에서의 항당뇨 효능을 혈당측정기를 통해 분석한 결과이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 AGM-212-1 및 AGM-212-2를 포함한 유사체들을 피하 투여하여 2형 당뇨 질병 마우스 동물 모델에서의 항당뇨 효능을 혈당측정기를 통해 분석한 결과이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 AGM-212-3, AGM-212-4, AGM-212-5 및 AGM-212-6을 포함한 유사체들을 피하 투여하여 2형 당뇨 질병 마우스 동물 모델에서의 항당뇨 효능을 혈당측정기를 통해 분석한 결과이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 AGM-212-3, AGM-212-4, AGM-212-5 및 AGM-212-6을 포함한 유사체들을 피하 투여하여 2형 당뇨 질병 마우스 동물 모델에서의 항당뇨 효능을 혈당측정기를 통해 분석한 결과이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체를 피하 투여하여 야생형 마우스 동물 모델에서의 약동력학 평가 시험을 분석한 결과이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체를 피하 투여하여 야생형 마우스 동물 모델에서의 약동력학 평가 시험을 분석한 결과이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 식이조절능 시험 결과이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 식이조절능 시험 결과이다.
도 10c는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 식이조절능 시험 결과이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 당내성 개선 시험 결과이다.
도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 당내성 개선 시험 결과이다.
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 인슐린 내성 개선 시험 결과이다.
도 12b는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 인슐린 내성 개선 시험 결과이다.
도 13a는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 간 내 지방 축적량 시험 결과이다.
도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 간 내 지방 축적량 시험 결과이다.
도 14a는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 열에너지 증진효과 시험 결과이다.
도 14b는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 열에너지 증진효과 시험 결과이다.
도 15a는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 열에너지 발생 관련 인자 시험 결과이다.
도 15b는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 열에너지 발생 관련 인자 시험 결과이다.
도 16a는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 지방 분해능 시험 결과이다.
도 16b는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 지방 분해능 시험 결과이다.
도 16c는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 지방 분해능 시험 결과이다.
도 16d는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 지방 분해능 시험 결과이다.
도 16e는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 지방 분해능 시험 결과이다.
도 17a는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 근육세포 내 지방 분해능 및 열에너지 발생 효과 시험 결과이다.
도 17b는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 근육세포 내 지방 분해능 및 열에너지 발생 효과 시험 결과이다.
도 17c는 본 발명의 일 실시예에 따른 유사체의 근육세포 내 지방 분해능 및 열에너지 발생 효과 시험 결과이다.
엑세나타이드 (exenatide) 아미노산 서열의 1 내지 15개의 아미노산이 결실되고, 지방산이 접합 (conjugation)된 당쇄화 엑세나타이드 유사체, 또는 엑세나타이드 (exenatide) 아미노산 서열의 1 내지 15개의 아미노산이 결실되고, 지방산이 접합 (conjugation)된 엑세나타이드 유사체로 이루어진 제1체; 및 엑세나타이드 (exenatide) 아미노산 서열의 1 내지 15개의 아미노산이 결실되고 지방산이 접합 (conjugation)된 엑세나타이드 유사체, 또는 글루카곤으로 이루어진 제2체;를 포함하고, 상기 제1체 및 제2체는 결합되어 이량 유사체를 형성하고 있는 것인, 엑세나타이드 이량 유사체.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
I. 당쇄화된 엑세나타이드 유사체
실시예 1. AGM-212(E17C-11 sugar)의 제조
1-1. 화학식 1
AGM-212의 구성 서열인 Ex4(1-32)K-cap을 제조하기 위해, 트리틸 레진(trityl resin)에 Fmoc-Lys(dde)-OH 및 DMF를 첨가하여 Fmoc-Lys(dde) 트리틸 레진을 제조하였다. Fmoc-Lys(dde) 트리틸 레진에 20% 피페리딘(piperidine)이 포함된 DMF 및 Fmoc-Ser(tBu)-OH 및 HOBt(hydroxyl-benzo triazole)를 첨가하여 Fmoc-Ser(tBu)-Lys(dde) 트리틸 레진을 제조하였다. Fmoc-Ser(tBu)-Lys(dde) 트리틸 레진에 상기 제작 방법을 동일하게 하여 순차적으로 Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(trt)-OH, Fmoc-Lys(boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(trt)-OH, Fmoc-Lys(boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Le)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-GlutBu()-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(trt)-OH을 첨가하여 아래의 화학식 1을 제조하였다.
[화학식 1]
Fmoc-His(trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lyc(Boc)-Gln(trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Cys(tBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Lys(dde)-트리틸 레진
1-2. 화학식 2
화학식 1에 2% NH2NH2·H2O를 포함하는 DMF를 첨가하고 dde를 제거하여 화학식 2을 제조하였다.
[화학식 2]
Fmoc-His(trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lyc(Boc)-Gln(trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Cys(trt)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Lys-트리틸 레진
1-3. 화학식 3
화학식 2에 카프릭산, 및 HOBt 및 DIC를 포함하는 DMF를 첨가하여 화학식 3을 제조하였다.
[화학식 3]
Fmoc-His(trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lyc(Boc)-Gln(trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Cys(trt)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Lys(capric acid)-트리틸 레진
1-4. 화학식 4
화학식 3의 보호기를 절단 한 후, 정제하여 화학식 4를 제조하였다.
[화학식 4]
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lyc-Gln-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Lys(capric acid)-OH
1-5. 화학식 5
화학식 4에 11 당의 구조를 이루는 Bromoacetyl glycan (11 suar) 및 NaOH, 인산 완충액 (Phosphate buffer)을 첨가하여, 화학식 5을 제조하였다.
[화학식 5]
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lyc-Gln-Met-Glu-Glu-Cys(11 sugar)-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Lys(capric acid)-OH
실시예 2. AGM-212(N28C-11 sugar)의 제조
실시예 1의 제조 과정에서 28번째 아미노산인 Fmoc-Asn(tBu)-OH를 Fmoc-Cys(trt)-OH로 대체하여 동일한 방법으로 화학식 6을 제조하였다.
[화학식 6]
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lyc-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Cys(11 sugar)-Gly-Gly-Pro-Ser-Lys(capric acid)-OH
실시예 3. AGM-212(N28-11 sugar)의 제조
실시예 1의 제조 과정에서 28번째 아미노산인 Fmoc-Asn(tBu)-OH를 도면 2의 11NC-Asn-Fmoc으로 대체하여 동일한 방법으로 화학식 7을 제조하였다.
[화학식 7]
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lyc-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn(11 sugar)-Gly-Gly-Pro-Ser-Lys(capric acid)-OH
명명 서열
Ex4 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS
AGM-212 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSK-capric acid
AGM-212(E17C-11 sugar) HGEGTFTSDL SKQMEEC(11 sugar)AVR LFIEWLKNGG PSK-capric acid
AGM-212(E24C-11 sugar) HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIC(11 sugar)WLKNGG PSK-capric acid
AGM-212(N28C-11 sugar) HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKC(11 sugar)GG PSK-capric acid
AGM-212(N28-11 sugar) HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKN(11 sugar)GG PSK-capric acid
AGM-212(E17C-11 sugar & E24C-11 sugar HGEGTFTSDL SKQMEEC(11 sugar)AVR LFIC(11 sugar)WLKNGG PSK-capric acid
AGM-212(E17C-11 sugar & N28C-11 sugar HGEGTFTSDL SKQMEEC(11 sugar)AVR LFICWLC (11sugar)NGG PSK-capric acid
실시예 4. AGM-212(E24C-11 sugar)의 제조
실시예 1의 제조 과정에서 24번째 아미노산인 Fmoc-Glu(tBu)-OH를 Fmoc-Cys(trt)-OH로 대체하여 동일한 방법으로 화학식 8을 제조하였다.
[화학식 8]
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lyc-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Cys(11 sugar)-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Lys(capric acid)-OH
실시예 5. AGM-212(E17C-11 sugar & E24C-11 sugar)의 제조
5-1. 화학식 9
실시예 1의 제조 과정에서 24번째 아미노산인 Fmoc-Glu(tBu)-OH를 Fmoc-Cys(trt)-OH로 대체하여 화학식 9을 제조하였다.
[화학식 9]
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lyc-Gln-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Cys-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Lys(capric acid)-OH
5-2. 화학식 11
화학식 9에 11 당의 구조를 이루는 Bromoacetyl glycan (11 suar) 및 NaOH, 인산 완충액을 첨가하여, 화학식 10을 제조하였다.
[화학식 10]
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lyc-Gln-Met-Glu-Glu-Cys(11 sugar)-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Cys(11 sugar)-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Lys(capric acid)-OH
실시예 6. AGM-212(E17C-11 sugar & N28C-11 sugar)의 제조
6-1. 화학식 11
실시예 1의 제조 과정에서 28번째 아미노산인 Fmoc-Asn(tBu)-OH를 Fmoc-Cys(trt)-OH로 대체하여 화학식 11을 제조하였다.
[화학식 11]
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lyc-Gln-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Cys-Gly-Gly-Pro-Ser-Lys(capric acid)-OH
6-2. 화학식 12
화학식 11에 11 당의 구조를 이루는 Bromoacetyl glycan (11 suar) 및 NaOH, 인산 완충액을 첨가하여, 화학식 12을 제조하였다.
[화학식 12]
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lyc-Gln-Met-Glu-Glu-Cys(11 sugar)-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Cys(11 sugar)-Gly-Gly-Pro-Ser-Lys(capric acid)-OH
실험예 1. 유사체의 GLP-1 수용체 결합력 확인
실시예 1 내지 실시예 6에서 제조한 유사체의 GLP-1 수용체에 대한 결합력을 알아보기 위해, luciferase assay system을 사용하였다. Luciferase assay system은 세포의 특정 수용체에 대한 리간드의 결합력을 측정하여 수용체의 활성 정도를 확인할 수 있는 방법이다.
구체적으로, 섬유아세포주인 CV-1 (1 x 104 cells/ml, 한국세포주은행)을 96well white cell culture plate에 24시간 배양 후, human GLP-1R(pcDNA3.1_hGLP-1R), cAMP response element (CRE, pcDNA3.1_hCRE)를 첨가하여 형질전환(transfection)하였다. 24시간 배양 후, serum이 없는 배지로 교체하여, 16시간 배양 후, 각 유사체를 6시간 동안 처리하였다. 활성화된 GLP-1R에 의해 reporter gene인 luciferase의 발현 정도를 luminometer를 이용하여 정량하여, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
목록 EC50 (nM) Emax (fold induction over basal)
Ex4 12 ± 0.12 10.6 ± 1.5
AGM-212 11 ± 0.21 10.4 ± 1.4
AGM-212(E17C-11 sugar) 18.4 ± 0.4 10.1 ± 1.2
AGM-212(N28C-11 sugar) 35.6 ± 0.8 10.2 ± 1.3
AGM-212(N28-11 sugar) 58.5 ± 0.7 10.3 ± 1.4
AGM-212(E24C-11 sugar) 73.6± 0.4 10.1 ± 1.4
AGM-212(E17C-11 sugar & E24C-11 sugar) 80 ± 0.4 9.7 ± 1.2
AGM-212(E17C-11 sugar & N28C-11 sugar) 40 ± 0.5 9.8 ± 1.3
표 2에서 확인할 수 있듯이, AGM-212는 Ex4와 동등한 GLP-1R에 대한 활성을 보이며, 11 sugar가 결합된 AGM-212 유사체들은 Ex4 또는 AGM-212보다 다소 감소된 활성을 발견하였다. 당쇄화로 인해 각 유사체들의 활성이 감소되지만 여전히 nM 수준의 결합력을 가짐을 알 수 있었다.
실험예 2. 유사체의 인슐린 분비능 확인
실시예 1 내지 실시예 6에서 제조한 유사체의 인슐린 분비능을 확인하기 위해, rat islets에 대한 유사체의 당 의존성 인슐린 분비능을 확인하였다.
구체적으로, SD rat (다물사이언스) 8주령의 pancreas를 추출하여, islets을 분리하였다. 분리된 islets을 28 mM glucose에서의 각 유사체를 농도별(10 nM, 100 nM)로 처리 한 후, rat insulin ELISA kit를 이용해 분비된 인슐린 양을 측정하여, 그 결과를 도 1 내지 도 2 및 표 3 내지 표 4에 나타내었다.
목록 Insulin secretion from rat islets (pg/ml)
10 nM 100 nM
Control 4018.30 ± 536.4 4018.30 ± 536.4
Ex4 5379.62 ± 1120 6038.49 ± 656.60
AGM-212 5740.38 ± 111.7 6725.28 ± 988.68
AGM-212(E17C-11 sugar) 7895.09 ± 2457.36 9523.02 ± 2852.08
AGM-212(N28C-11 sugar) 5879.25 ± 2162.26 8168.68 ± 2623.02
AGM-212(N28-11 sugar) 5676.60 ± 1180.76 8128.68 ± 732.45
목록 Insulin secretion from rat islets (pg/ml)
10 nM 100 nM
Control 5018.30 ± 536.4 5020.30 ± 536.4
Ex4 7803.40 ± 2216.2 9928.68 ± 1638.11
AGM-212 10978.11 ± 268.68 15476.60 ± 5468.30
AGM-212(E17C-11 sugar & E24C-11 sugar) 6763.40 ± 32.83 14650.94 ± 3305.28
AGM-212(E17C-11 sugar & N28C-11 sugar ) 11250.94 ± 624.53 22183.40 ± 830.19
도 1 내지 도 2 및 표 3 내지 표 4에서 확인할 수 있듯이, 11 sugar가 결합된 유사체 모두 농도 의존적으로 인슐린 분비를 증진시키며, 또한 Ex4 및 AGM-212보다 증진된 인슐린 분비능을 확인하였다.
실험예 3. 유사체의 당부하 효과 확인
실시예 1 내지 실시예 4에서 제조한 유사체의 당 부하 효과를 확인하기 위해, 2형 당뇨 질병 마우스 모델인 C57BKS/J dbdb mice (5-7주령, 중앙실험동물)를 16시간 절식 후, 각 유사체들을 10 nmole/kg으로 피하투여하고, 30분 후, 포도당(1.5 g/kg)을 복강으로 투여하였다. 120분 동안, 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120분에서의 마우스 꼬리 미정맥에서 추출한 혈액을 이용하여 혈당측정기(acu-check, Roche, Germany)로 혈당을 측정하여, 그 결과를 도 3a 내지 도 3b에 나타내었다.
도 3a 내지 도 3b에서 확인할 수 있듯이, 모든 AGM-212 유사체가 Ex4 및 AGM-212 동등한 당부하 효능을 보였다. 이 결과는, 당쇄화된 AGM-212 유사체들이 Ex4의 생물학적인 활성을 가지고 있음을 의미한다.
실험예 4. 유사체의 약동력학 시험
실시예 2내지 실시예 3에서 제조한 유사체의 약동력학(pharmacokinetics) 시험을 실시하였다. 야생형 C57BL/6J mice(male, 5-6주령, n=5)을 이용, 각 유사체들을 50 nmole/kg으로 피하 투여 후, 각 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 10, 12, 14, 24시간에 혈액을 추출하였다. 추출한 혈액의 혈장을 분리하여 Exendin-4 EIA를 이용하여 정량 분석을 진행하였다. 결과 분석은 winnolin 프로그램을 이용하여 Pharmacokinetics parameter를 결정하여, 그 결과를 도 4 및 표 5에 나타내었다.
Parameter Ex4 AGM-212 AGM-212(N28C-11 sugar) AGM-212(N28-11 sugar)
t1/2 (h) 0.56 ± 0.03 3.68 ± 0.35 2.3 ± 0.16 3.33 ± 0.74
Tmax (h) 0.5 4 4 5 ± 1
Cmax (ng/mL) 107.38 ± 12.48 750.67 ± 107.7 856.9 ± 103.4 762.9 ± 197.05
AUC (ng h/mL) 171.5 ± 7.15 6698.8 ± 621 4913.1 ± 380.5 5584.9 ± 968.5
Vd (mL/kg) 1004 .9 ± 81.51 334.8 ± 38.35 416.7 ± 62.5 256.9 ± 37.8
Cl (mL/h/kg) 1236.9 ± 52.4 63.36 ± 5.93 123.3 ± 10.3 57.7 ± 8.98
도 4 및 표 5에서 확인할 수 있듯이, AGM-212(N28-11 sugar)가 AGM-212와 유사한 반감기를 나타내었으며, AGM-212(N28C-11 sugar)의 경우, Ex4보다는 증진된 반감기가 관찰되었으나, AGM-212(N28-11 sugar)보다는 다소 감소된 수준을 보임을 확인하였다. 이 결과는 당쇄화가 되었을 때, 체내 반감기에는 영향을 주지 않는 것으로 보임을 알 수 있다.
실험예 5. 유사체의 면역원성 시험
당쇄화 AGM-212 유사체에 대한 면역원성 시험을 하기 위해, 야생형 C57BL/6J mice(male, 6주령, 을 이용, 각 Ex4와 AGM-212(N28C-11 sugar)를 1 mg/kg으로 Freund's complete adjuvant(sigma)를 첨가하여 일주일에 한번씩 총 세 번을 피하 투여하였다. 혈액을 추출하여, antidrug antibody assay kit를 이용하여 생성된 항체를 정량 분석하여, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 확인할 수 있듯이, Ex4를 투여한 군에서는 Ex4에 대한 lgG의 항체가 약 10 pg/ml이 형성된 반면에, 당쇄화 AGM-212 유사체를 투여한 군에서는 형성된 항체가 검출되지 않음을 확인하였다. 이 결과는 당쇄화 AGM-212 유사체가 당쇄화로 인해 이의 면역원성이 개선되었음을 의미한다.
실험예 6. 유사체의 용해도 시험
당쇄화된 유사체는 당의 결합으로 증진된 용해도(solubility)를 가질 수 있기 때문에, 당쇄화 AGM-212 유사체에 대한 용해도 시험을 수행하였다. AGM-212(N28C-11 sugar) 및 AGM-212(E17C-11 sugar & N28C-11 sugar)를 각각 10 mg/ml로 H2O 및 PBS(phosphate buffered saline)에서의 용해도를 HPLC를 이용하여 진행하여, 그 결과를 표 6에 나타내었다.
용매 명명 용해도
H2O Ex4 >10 mg/ml
AGM-212 <2.5 mg/ml
AGM-212(N28C-11 sugar) <6.1 mg/ml
AGM-212(E17C-11 sugar & N28C-11 sugar) <8.3 mg/ml
PBS Ex4 >10 mg/ml
AGM-212 <5.4 mg/ml
AGM-212(N28C-11 sugar) <7.8 mg/ml
AGM-212(E17C-11 sugar & N28C-11 sugar) <9.5 mg/ml
표 6에서 확인할 수 있듯이, Ex4는 모든 용매에서 10 mg/ml의 용해도를 갖는데, AGM-212의 경우, H2O에서는 다소 감소된 용해도를 갖음을 알 수 있었고, PBS에서는 Ex4 대비 약 0.5배 이상의 용해도를 나타내었다. 당쇄화 유사체의 경우, 모든 용매에서 AGM-212보다는 증진된 용해도를 보이며, 11 sugar가 하나 및 두개로 결합된 유사체의 용해도를 비교할 때, 결합된 당의 수의 증가로 인해, 보다 증진된 용해도를 가짐을 발견하였다.
II. 엑세나타이드 이량 유사체
실시예 1. AGM-212-1의 제조
1-1. 화학식 1
트리틸 레진(trityl resin)에 Fmoc-Lys(dde)-OH 및 DMF를 첨가하여 Fmoc-Lys(dde) 트리틸 레진을 제조하였다. Fmoc-Lys(dde) 트리틸 레진에 20% 피페리딘(piperidine)이 포함된 DMF 및 Fmoc-Ser(tBu)-OH 및 HOBt(hydroxyl-benzo triazole)를 첨가하여 Fmoc-Ser(tBu)-Lys(dde) 트리틸 레진을 제조하였다. Fmoc-Ser(tBu)-Lys(dde) 트리틸 레진에 상기 제작 방법을 동일하게 하여 순차적으로 Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(trt)-OH, Fmoc-Lys(boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Cys(trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gln(trt)-OH, Fmoc-Lys(boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Le)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(trt)-OH을 첨가하여 아래의 화학식 1을 제조하였다.
[화학식 1]
Fmoc-His(trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lyc(Boc)-Gln(trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Cys(Acm)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Cys(trt)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(dde)-트리틸 레진
1-2. 화학식 2
화학식 1에 2% NH2NH2·H2O를 포함하는 DMF를 첨가하고 dde를 제거하여 화학식 2을 제조하였다.
[화학식 2]
Fmoc-His(trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lyc(Boc)-Gln(trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Cys(Acm)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Cys(trt)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys-트리틸 레진
1-3. 화학식 3
화학식 2에 capric acid 및 HOBt 및 DIC를 포함하는 DMF를 첨가하여 화학식 3를 제조하였다.
[화학식 3]
Fmoc-His(trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lyc(Boc)-Gln(trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Cys(Acm)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Cys(trt)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(capric acid)-트리틸 레진
1-4. 화학식 4
화학식 3의 보호기를 절단 한 후, 정제하여 화학식 4를 제조하였다.
[화학식 4]
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lyc-Gln-Met-Glu-Glu-Cys(Acm)-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Cys-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys(capric acid)-OH
1-5. 화학식 5
화학식 4에 11 당의 구조를 이루는 Bromoacetyl glycan (11 suar) 및 NaOH, Phosphate buffer를 첨가하여, 화학식 5을 제조하였다.
[화학식 5]
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lyc-Gln-Met-Glu-Glu-Cys(Acm)-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Cys(11 sugar)-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys(capric acid)-OH
1-6. AGM-212-1
화학식 5에 Silver acetate, 및, iodine, 50% 아세트산을 첨가하여 표 1의 AGM-212-1을 제조하였다.
실시예 2. AGM-212-2의 제조
실시예 1의 제조 과정에서 28번째 아미노산인 Fmoc-Asn(tBu)-OH를 Fmoc-Cys(trt)-OH로 대체하여 동일한 방법으로 표 1의 AGM-212-2를 제조하였다.
실시예 3. AGM-212-3의 제조
3-1. 화학식 6
트리틸레진에 Fmoc-Lys-OH 및 DMF를 첨가하여 Fmoc-Lys 트리틸 레진을 제조하였다. 상기 실시예 1의 제조과정에서 17번의 Fmoc-Cys(Acm)-OH을 Fmoc-Glu(tBu)-OH로 치환하는 것만 달리하여 화학식 6을 제조하였다.
[화학식 6]
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lyc-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys(capric acid)-Lys-OH
3-2. 화학식 7
글루카곤을 제조하기 위해 트리틸레진에 Fmoc-Thr(tBu)-OH 및 DMF를 첨가하여 Fmoc-Thr(tBu) 트리틸 레진을 제조하였다. Fmoc-Thr(tBu) 트리틸 레진에 20% 피페리딘(piperidine)이 포함된 DMF 및 Fmoc-Asn(trt)-OH 및 HOBt(hydroxyl-benzo triazole)를 첨가하여 Fmoc-Asn(trt)-Thr(tBu) 트리틸 레진을 제조하였다. Fmoc-Asn(trt)-Thr(tBu) 트리틸 레진에 상기 제작 방법을 동일하게 하여 순차적으로 Fmoc-Met-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Gln(trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Gln(trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmor-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmor-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln(trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-His(trt)-OH을 첨가하여 아래의 화학식 7을 제조하였다.
[화학식 7]
Fmoc-His(trt)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(trt)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(tBu)-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ala-Gln(trt)-Asp(tBu)-Phe-Val-Gln(trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(trt)-Thr(tBu)-트리틸 레진
3-3. 화학식 8
화학식 7의 보호기를 절단하고 정제하여 화학식 8을 제조하였다.
[화학식 8]
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH
3-4. AGM-212-3
상기 화학식 6과 화학식 8에 20% 피페리딘(piperidine)이 포함된 DMF 및 HOBt(hydroxyl-benzo triazole)를 첨가하여 화학식 8의 34번 Lys의 측쇄에 화학식 8의 30번 Thr이 결합된 표 1의 AGM-212-3을 제조하였다.
실시예 4. AGM-212-4의 제조
실시예 3에서 화학식 6의 구성 서열 중 28번의 Asn을 11NC-Asn-Fmoc으로 치환하여 제조 후, 화학식 8의 물질을 20% 피페리딘(piperidine)이 포함된 DMF 및 HOBt(hydroxyl-benzo triazole)를 첨가하여 화학식 6의 34번 Lys의 측쇄에 결합된 표 1의 AGM-212-4를 제조하였다.
실시예 5. AGM-212-5의 제조
상기 실시예 4의 제조 과정에서 화학식 6의 구성 서열 중 16번 Ser을 11NC-Asn-Fmoc으로 치환하여 동일한 제조 방법으로 표 1의 AGM-212-5를 제조하였다.
실시예 6. AGM-212-6의 제조
실시예 4의 제조 과정에서 화학식 6의 구성 서열 중 24번 Gln을 11NC-Asn-Fmoc으로 치환하여 동일한 제조 방법으로 표 1의 AGM-212-6을 제조하였다.
실시예 7. AGM-212-7의 제조
7-1. 화학식 9
실시예 5의 제작 과정 중 16번의 Ser을 Cys(Acm)으로 치환하고, 24번의 Glutamine을 Cys로 치환하여 화학식 10을 제조하였다.
[화학식 9]
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys(Acm)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH
7-1. 화학식 10
화학식 9에 11 당의 구조를 이루는 Bromoacetyl glycan (11 suar) 및 NaOH, Phosphate buffer를 첨가하여, 화학식 10을 제조하였다.
[화학식 10]
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys(Acm)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys(11 sugar)-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH
7-2. AGM-212-7
화학식 5와 화학식 10에 Silver acetate, 및, iodine, 50% 아세트산을 첨가하여 표 1의 AGM-212-7을 제조하였다.
실시예 8. AGM-212-8의 제조
8-1. 화학식 11
실시예 5의 제작 과정 중 16번의 Ser을 Cys로 치환하고, 24번의 Gln을 Cys(Acm)으로 치환하여 화학식 11을 제조하였다.
[화학식 11]
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys(Acm)-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH
8-2. 화학식 12
화학식 11에 11 당의 구조를 이루는 Bromoacetyl glycan (11 suar) 및 NaOH, Phosphate buffer를 첨가하여, 화학식 12를 제조하였다.
[화학식 12]
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys(11 sugar)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys(Acm)-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH
8-3. AGM-212-8
화학식 6과 화학식 12에 Silver acetate, 및, iodine, 50% 아세트산을 첨가하여 표 7의 AGM-212-8을 제조하였다.
명명 서열목록
Ex4 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS
Glucagon HSQGTFTSDY SKYLDSRRAQ DFVQWLMNT
AGM-212 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSK-capric acid
AGM-212-1 AGM-212(E17C & E24C-11 sugar) -S-S - AGM-212(E17C & E24C-11 sugar)
AGM-212-2 AGM-212(E17C & N28C-11 sugar) -S-S - AGM-212(E17C & N28C-11 sugar)
AGM-212-3 AGM-212 - Lys(s.c) - 글루카곤
AGM-212-4 AGM-212(N28-11 sugar) -Lys(s.c) - 글루카곤
AGM-212-5 AGM-212(N28-11 sugar) -Lys(s.c) - 글루카곤(S16N-11 sugar)
AGM-212-6 AGM-212(N28-11 sugar) -Lys(s.c) - 글루카곤(Q24N-11 sugar)
AGM-212-7 AGM-212(E17C & E24C-11 sugar)-S-S - 글루카곤(S16C-11 sugar & Q24C)
AGM-212-8 AGM-212(E17C & E24C-11 sugar) -S-S - 글루카곤(S16C & Q24C-11 sugar)
실험예 1. 유사체의 GLP-1 수용체 결합력 확인
실시예 1 내지 6에서 제조한 유사체의 GLP-1 수용체에 대한 결합력을 알아보기 위해, luciferase assay system을 사용하였다. Luciferase assay system은 세포의 특정 수용체에 대한 리간드의 결합력을 측정하여 수용체의 활성 정도를 확인할 수 있는 방법이다.
구체적으로, 섬유아세포주인 CV-1(1 x 104 cells/ml, 한국세포주은행)을 96well white cell culture plate에 24시간 배양 후, human GLP-1R(pcDNA3.1_hGLP-1R), cAMP response element (CRE, pcDNA3.1_hCRE)를 첨가하여 형질전환(transfection)한다. 24시간 배양 후, serum이 없는 배지로 교체하여, 16시간 배양 후, 각 유사체를 6시간 동안 처리한다. 활성화된 GLP-1R에 의해 reporter gene인 luciferase의 발현 정도를 luminometer를 이용하여 정량하여, 그 결과를 표 8에 나타내었다.
명명 EC50 (nM) Emax (fold induction over basal)
Ex4 0.8 ± 0.12 10.6 ± 1.5
AGM-212 0.91 ± 0.21 10.4 ± 1.4
AGM-212-1 0.13 ± 0.4 10.1 ± 1.2
AGM-212-2 0.11 ± 0.8 10.2 ± 1.3
AGM-212-3 8 ± 0.7 10.1 ± 1.4
AGM-212-4 32 ± 1.7 10.2 ± 1.2
AGM-212-5 25 ± 1.2 10.4 ± 1.1
AGM-212-6 34 ± 1.5 7.2 ± 1.3
AGM-212-7 16 ± 1.5 10.2 ± 1.3
AGM-212-8 25 ± 1.5 10.3 ± 1.5
표 8에서 확인할 수 있듯이, AGM-212-1 및 AGM-212-2가 Ex4보다 약 6배이상 증진된 EC50 수준을 확인하였다. 이 결과는, 이황화결합으로 구성된 당쇄화된 엑세나타이드 동종 유사체가 GLP-1 수용체에 대해 기존의 Ex4보다 또한 AGM-212보다도 높은 활성을 가짐을 알 수 있다. AGM-212-3의 경우, 10배 정도 감소된 EC50 수준이 관찰되었으며, AGM-212-4, AGM-212-5 및 AGM-212-6은 AGM-212-3에 비해 4~5배 정도 감소된 활성을 관찰할 수 있었다. 이 결과는, 글루카곤과 엑세나타이드 유사체가 이황화결합으로 결합하여, GLP-1 수용체에 대해 활성이 다소 감소됨을 알 수 있으며, 이들 이종 유사체 구성 중 글루카곤의 당쇄화는 GLP-1 수용체의 활성을 감소시킴을 알 수 있다. 하지만 모든 유사체가 GLP-1 수용체에 대해 nM 수준의 높은 결합력을 보이며, 이것은 선택적이고 특이적인 효현제의 기능을 갖음을 알 수 있다.
그 결과, AGM-212는 Ex4와 동등한 GLP-1R에 대한 활성을 보이며, 11 당이 결합된 AGM-212 유사체들은 Ex4 또는 AGM-212보다 다소 감소된 활성을 확인하였다. 11 sugar로 인해 각 유사체들의 활성이 감소되지만 여전히 nM 수준의 결합력을 갖음을 알 수 있었다.
실험예 2. 유사체의 인슐린 분비능 확인
실시예 1 내지 실시예 2에서 제조한 유사체의 인슐린 분비능을 확인하기 위해, rat islets에 대한 유사체의 당 의존성 인슐린 분비능을 확인하였다. SD rat (다물사이언스) 8주령의 pancreas를 추출하여, islets을 분리하였다. 분리된 islets을 28 mM glucose에서의 각 유사체를 농도별(10 nM, 100 nM)로 처리 한 후, rat insulin ELISA kit를 이용해 분비된 인슐린 양을 측정하여, 그 결과를 도 6 및 표 9에 나타내었다.
목록 Insulin secretion from rat islets (pg/ml)
10 nM 100 nM
Control 5018.30 ± 534.4 5020.30 ± 533.4
Ex4 7803.40 ± 2216.2 9928.68 ± 1638.11
AGM-212 10978.11 ± 268.7 15476.60 ± 5468.3
AGM-212-1 14506.04 ± 3493.9 20080 ± 8384.9
AGM-212-2 14446.79 ± 654.34 24954.72 ± 2741.89
도 6 및 표 9에서 확인할 수 있듯이, 당쇄화 엑세나타이드 동종 유사체가 엑세나타이드 및 AGM-212에 비해 농도 의존적으로 증진된 인슐린 분비능을 보이고 있음을 확인하였다.
실험예 3. 유사체의 항당뇨 효과 확인
실시예 1 내지 실시예 6에서 제조한 유사체의 항당뇨 효과를 확인하기 위하여, 2형 당뇨 질병 마우스 모델인 C57BKS/J dbdb mice(5-7주령, 중앙실험동물)에서 혈당 강하 효과를 확인하였다.
구체적으로, 각 유사체들을 20 nmole/kg으로 피하 투여하고, 0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24, 44, 48시간 경과 후, 마우스의 꼬리 미정맥 혈액을 채취하여 혈당 수준을 측정하여, 그 결과를 도 7a 내지 도 8b에 나타내었다.
도 7a 내지 도 7b에서 확인할 수 있듯이, AGM-212-2가 Ex4 및 AGM-212보다 증진된 혈당 강하 정도를 나타냄을 확인하였다. AGM-212-1과의 활성 결과를 비교해보면, AGM-212-1의 24번 Cys의 당쇄화가 감소된 항당뇨 효능을 나타냄을 알 수 있었다.
도 8a 내지 도 8b에서 확인할 수 있듯이, AGM-212-3, AGM-212-4, AGM-212-5 모두 유의미한 항당뇨 효능을 보였으나, AGM-212보다는 다소 감소된 효능을 보임을 확인하였다. AGM-212-4, AGM-212-5, AGM-212-6은 AGM-212-3의 구성 서열 중 글루카곤의 구성 잔기에 당이 결합된 구조인데, 항당뇨 효능에 있어서는 각 잔기로 인한 큰 활성 차이는 나타나지 않음을 확인하였다. AGM-212-7, AGM-212-8은 각각 서로 다른 잔기에 당쇄화된 글루카곤과 AGM-212가 이황화결합으로 구성된 형태로, Ex4와 유사한 항당뇨능을 가짐을 확인하였다.
실험예 4. 유사체의 약동력학 (pharmacokinetics) 시험
실시예 1내지 실시예 8에서 제조한 유사체의 약동력학 시험을 실시하였다. 야생형 C57BL/6J mice(male, 5-6주령, n=5)을 이용, 각 유사체들을 50 nmole/kg으로 피하 투여 후, 각 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 10, 12, 14 및 24 시간에 혈액을 추출하였다. 추출한 혈액의 혈장을 분리하여 Exendin-4 EIA를 이용하여 정량 분석을 진행하였다. 결과 분석은 winnolin 프로그램을 이용하여 Pharmacokinetics parameter를 결정하여, 그 결과를 도 9a 내지 도 9b에 나타내었다.
Parameter Ex4 AGM-212 AGM-212-2 AGM-212-3 AGM-212-4 AGM-212-5 AGM-212-6 AGM-212-7 AGM-212-8
t1/2 (h) 0.56 ± 0.03 3.68 ± 0.35 4.85 ± 0.278 4.86 ± 0.3 4.77 ± 0.33 3.72 ± 0.06 4.69 ± 0.18 5.82 ± 0.1 5.84 ± 0.23
Tmax (h) 0.5 4 2 1 ± 0.4 1.5 ± 0.28 2.5 ± 0.5 1.13 ± 0.32 1.75 ± 0.75 1
Cmax (ng/mL) 107.38 ± 12.48 750.67 ± 107.7 605.15 ± 19.03 1219.06± 66.12 1190.2 ± 84.8 1250 ± 83.3 1333.3 715.6 ± 81.1 675.1 ± 65.4
AUC (ng h/mL) 171.5 ± 7.15 6698.8 ± 621 4414.9 ± 226.38 7647.23± 548.3 8365.12± 271.5 7229.2 ± 741.3 9684.1 ± 294.1 4608.4 ± 383.02 4658.1 ± 130.77
Vd (mL/kg) 1004 .9 ± 81.51 334.8 ± 38.35 993 ± 54.15 440.3 ± 55.9 783.6 ± 93.4 453.3 ± 54.5 403.5 ± 12.9 822.2 ± 61.7 805.5 ± 43.9
Cl (mL/h/kg) 1236.9 ± 52.4 63.36 ± 5.93 133.9 ± 7.19 62.1 ± 4.22 55.5 ± 1.67 84.2 ± 8.9 59.73 ± 2 97.8 ± 7.15 95.4 ± 2.01
도 9a 내지 도 9b 및 표 10에서 확인할 수 있듯이, 모든 유사체가 Ex4보다 현저히 증진된 반감기를 나타냈으며, 구체적으로 AGM-212-1, AGM-212-2, AGM-212-3, AGM-212-4, AGM-212-5, AGM-212-6, AGM-212-7, AGM-212-8 모두 AGM-212보다 약 1~1.5배 이상 증진된 반감기 수준을 보임을 확인하였다. 이 결과는, 엑세나타이드 이량유사체가 이황화결합과 같은 특정 결합을 통해 생체 내 안정성이 크게 증진됨을 나타낸다.
실험예 5. 유사체의 비만 질병 동물 모델에서의 체중 및 식이 조절능 확인
실시예 3에서 제조한 유사체의 비만 질병 동물 모델에서의 체중 감소 및 식이 조절능 시험 평가를 하였다. C57BL/6 마우스를 대상으로 비만과 고혈당 증세를 동시에 보유하도록 60% 이상 지방이 함유된 고지방 식이 섭취를 유도한 비만 질병 동물 모델을 제작하였다. 16주령의 비만 질병 마우스를 대상으로 9주간 AGM-212-3 및 AGM-212-4를 50 nmole/kg으로 일일 1회 피하 투여하였다. 그 결과를 도 10a 내지 도 10c 및 표 11에 나타내었다.
군 체중 변화량 (%)
Vehicle 17.17 ± 0.56
Ex4 -2.63 ± 1.06
AGM-212 11.71 ± 2.40
Glucagon -8.67 ± 1.76
AGM-212 + 글루카곤 -12.36 ± 2.11
AGM-212-3 -21.95 ± 1.83
AGM-212-4 -20.04 ± 2.21
도 10a 내지 도 10c 및 표 11에서 확인할 수 있듯이, 3주차부터 각 유사체를 투여한 군의 체중이 유의미하게 감소됨을 확인하였고, 5주차부터 AGM-212 또는 AGM-212와 글루카곤의 동시 투여군과 대비하여 유의미한 차이를 보임을 확인하였다. 실험이 종료된 9주차에서 AGM-212-3 및 AGM-212-4를 투여한 군의 식이 섭취량도 유의미하게 감소됨을 확인하였다.
실험예 6. 유사체의 비만 질병 동물 모델에서의 당내성 개선효과 확인
실시예 5의 실험 과정 중 7주에 해당하는 기간에 AGM-212-3으로 인한 당내성 개선 효과를 확인하였다. 구체적으로, 실험 7주차의 비만 질병 동 마우스를 16시간 절식한 후, 각 유사체들을 10 nmole/kg으로 피하투여하고, 30분 후, 포도당(1.5 g/kg)을 복강으로 투여하였다. 120분 동안, 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120분에서의 마우스 꼬리 미정맥에서 추출한 혈액을 이용하여 혈당측정기(acu-check, Roche, Germany)로 혈당을 측정하여, 그 결과를 도 11a 내지 도 11b 및 표 12에 나타내었다.
군 Blood glucose (Area under curve)
Vehicle 43957.5 ± 2483.8
Ex4 17795.0 ± 2137.4
AGM-212 45846.2 ± 5538.1
Glucagon 29029.5 ± 1784.5
AGM-212 + 글루카곤 23687.5 ± 3393.1
AGM-212-3 19545 ± 623.1
AGM-212-4 20936.2 ± 837.3
도 11a 내지 도 11b 및 표 12에서 확인할 수 있듯이, 각 유사체를 투여한 마우스 군의 혈당이 감소되었고, 대조군 대비 각 혈당 측정 시간대에서 유의한 혈당 감소를 보였다. 상기 결과는 유사체의 장기간 투여에 따른 비만 질병 마우스의 당 내성이 개선되었음을 시사한다.
실험예 7. 유사체의 비만 질병 동물 모델에서의 인슐린 내성 개선효과 확인
비만에 의한 체내 지방 축적량 증가는 인슐린을 생산하는 췌장 islet의 베타 세포에 대한 지방 독성을 증가시켜 인슐린 생산량을 감소시키고, 식후 증가한 혈당에 대해 이를 흡수, 저장하는 조직인 간, 근육에서의 인슐린 소비를 저해하여 고 인슐린 혈증과 인슐린의 기능 감소를 유도해 고혈당 증세를 유발하는 주 원인인 인슐린 저항성 증가의 주 원인으로 보고되어 있다.
실험예 5의 9주 비만 질병 마우스를 사용한 장기 투여 실험 8주에 해당하는 기간에 인슐린 내성 실험을 진행하여 약물의 장기 투여에 따른 인슐린에 대한 민감성 (insulin sensitivity)을 확인하였으며, 장기 투여 실험 종료 후 마우스 혈액을 채취하여 mouse insulin ELISA를 통해 혈중 인슐린 농도를 분석하여 인슐린 저항성 (insulin resistance)의 개선 여부를 확인하였다.
구체적으로, 장기 투여 실험 8주차의 비만 질병 마우스를 6시간 절식한 후, 각 유사체들을 1 nmol/kg의 농도로 피하 투여하고, 30분 경과 후, 인슐린 (1 unit/kg)을 복강 투여하였다. 0, 15, 30, 60, 90, 120 분 경과 후 마우스의 꼬리에서 혈액을 채취, 이를 혈당 측정기 (acc-check, Roche, Germany)로 혈당을 측정하여 인슐린에 대한 민감성을 분석하여, 그 결과를 도 12a 내지 12b 및 표 13, 표 14에 나타내었다.
군 Blood glucose (Area under curve)
Vehicle 21231.2 ± 293.4
Ex4 11847.0 ± 582.7
AGM-212 23749.5 ± 387.6
Glucagon 13102.5 ± 638.8
AGM-212 + 글루카곤 15222.0 ± 263.6
AGM-212-3 13288.5 ± 409.1
AGM-212-4 13966.2 ± 504.1
군 Insulin (ng/ml) Leptin (pg/ml) Triglyceride (nmol/ul) Cholesterol(ug/ul)
Vehicle 241.72 ± 56.27 669.92 ± 30.47 56.25 ± 2.11 205.92 ± 7.19
Ex4 67.52 ± 12.33 341.41 ± 43.10 48.64 ± 1.94 156.17 ± 8.56
AGM-212 44.77 ± 12.21 212.52 ± 23.92 40.51 ± 1.28 134.28 ± 5.06
Glucagon 86.08 ± 21.43 463.09 ± 44.22 43.01 ± 1.38 161.43 ± 7.55
AGM-212 + 글루카곤 44.46 ± 9.17 175.21 ± 40.57 34.51 ± 0.85 111.23 ± 1.62
AGM-212-3 26.90 ± 6.86 95.81 ± 10.10 31.76 ± 1.81 92.83 ± 3.00
도 12a 내지 12b 및 표 13에서 확인할 수 있듯이, 각 유사체를 투여한 실험군의 혈당이 복강 투여한 인슐린에 대해 높은 민감성으로 보이며 혈당이 빠르게 감소됨을 확인하였다.
또한, 표 14에서 확인할 수 있듯이, 실험 종료 후 유사체를 투여한 마우스 군의 혈중 인슐린 농도가 유의하게 감소하였음을 확인하였다.
상기 결과들을 통해 AGM-212-3 및 AGM-212-4의 장기간 투여에 인슐린 민감성, 고인슐린 혈증이 개선되어 비만 질병 마우스의 인슐린 기능의 회복을 유도하였음을 시사한다.
실험예 8. 유사체의 비만 질병 동물 모델에서의 간내 지방 축적량 변화 확인
고지방 식이 섭취에 의한 과체중, 비만의 발생은 대사 조직인 간 내 지방 축적 및 간세포 내 지질 합성 등을 증가시켜 대사 질환인 비알코올성 지방간 (non-alcoholic fatty liver disease)의 발병률을 증가시키는 원인으로 알려져 있다. AGM-212-3의 장기 투여에 따른 비만 질병 마우스의 체중 감소가 연관된 대사 질환인 지방간의 증세 완화에 영향을 주는지 확인하기 위해, 지질 확인 염색법인 Oil red O staining을 통해 간 조직 내 지질 량을 분석하였으며, 또한 간 조직을 분해하여 세포 내 지질 저장 형태인 Triglyceride의 양을 확인하였다.
구체적으로, 실험예 5의 9주 장기 투여 실험 종료 후 마우스 간을 적출하여 각 엽 (lobe) 별로 구분해 일부는 4% formaldehyde에 넣어 고정시킨 뒤, 파라핀 블록을 제조하여 슬라이스 한 후 만들어진 슬라이드에 지질 확인 염색 시약인 Oil red O를 처리하여 염색 시킨 후, 이를 현미경을 통해 관찰하였다. 간 조직 내 triglyceride 량의 측정은 분리한 간 조직을 70 um cell strainer를 이용해 분해한 후, 14,000 rpm에서 원심 분리해 얻어진 triglyceride를 포함한 상층액을 일정 비율로 희석한 후 Triglyceride ELISA를 이용해 분석하여, 그 결과를 도 13a 내지 도 13b에 나타내었다.
군 Hepatic triglyceride (mg/g)
Vehicle 39.38 ± 4.08
AGM-212 7.50 ± 1.01
AGM-212-3 3.58 ± 0.12
도 13a 내지 도 13b 및 표 15에서 확인할 수 있듯이, AGM-212-3을 투여한 마우스의 간 내 Oil red O 로 염색된 지질 범위가 감소하였음을 확인할 수 있으며, 간 조직 내 triglyceride 량 또한 유의하게 감소함을 확인하였다.
상기 결과는 AGM-212-3의 장기간 투여에 따른 체중 감소가 비만 질병 마우스에의 고지방 식이 섭취에 따른 지방간 발생 위험을 감소시키는 효능을 보유하고 있음을 시사한다.
실험예 9. 유사체의 비만 질병 동물 모델에서의 혈중 대사 관여 인자량 변화 확인
혈당 조절 호르몬 인슐린, 식이 조절 호르몬 렙틴의 혈중 농도는 제2형 당뇨병, 비만 발생 시 각 호르몬에 대한 조직에서의 저항성으로 인해 정상치보다 높아지며 이러한 증상을 각각 고인슐린 혈증, 고렙틴 혈증 이라 하며 대사질환 진단의 표지로써 사용된다. 콜레스테롤, 트리글리세라이드 와 같은 지질의 혈중 농도의 증가, 즉 고지혈증은 과체중, 비만의 대표적인 증상으로 비만도를 측정하는 대표적인 표지이다.
실험예 5에서의 AGM-212-3의 장기 투여에 의해 인슐린, 렙틴 저항성 및 비만도와 같은 대사 이상 증세 개선이 유도되었는지 확인하기 위해 실험 종료 후 마우스 혈액을 채취하여 확인하고자 하는 각 인자에 해당하는 ELISA 검사를 통해 혈중 대사 관여 인자량을 분석하여, 그 결과를 표 13에 나타내었다.
표 14에서 확인할 수 있듯이, AGM-212-3을 투여한 마우스 군의 혈중 인슐린, 렙틴 농도가 유의하게 감소하였으며, 콜레스테롤, Triglyceride의 지질 농도 또한 유의하게 감소하였다.
상기 결과는 AGM-212-3의 투여에 따른 비만 질병 마우스의 고지방식이 섭취에 의해 발생하는 대사 호르몬에 대한 저항성 및 고지혈증의 개선이 유도되었음을 시사한다.
실험예 10. 유사체의 비만 질병 동물 모델에서의 열에너지 발생 증진 효과 확인
글루카곤과 글루카곤 리셉터의 갈색 지방 조직에서의 상호작용에 의해 유도되는 열에너지 발생 증가는 단백질인 Uncoupling protein 1 (UCP-1)의 미토콘드리아에서의 발현을 증가시켜 지방산을 산화하여 발생한 Acetyl CoA 의 산화, 환원 과정 중에 발생하는 수소를 산화적 인산화, 즉 호흡에의 사용을 막고 UCP1을 통과하도록 하여, 이 때 발생한 에너지를 열로써 방출되도록 함으로써 체내 축적된 지방의 소비를 증가시켜 체중 감소에 주요하게 작용하는 것으로 보고되었다.
AGM-212-3의 열에너지 발생 증진 효과를 확인하기 위해 16주령 비만 질병 마우스 (Diet induced obese C57BL/6)를 대상으로 5주간 일일 1회 피하 투여한 후 열에너지 발생량, 운동량, 호흡 계수, 직장 내 온도를 측정하였다.
구체적으로, 5주간 장기 투여한 마우스를 에너지 대사 분석 기기인 indirect calorimetry system 와 연결된 대사 사육장 (Metabolic cage)에서 24시간 동안 사육하면서, 호흡을 통해 소비되는 산소량, 방출되는 이산화탄소량을 1시간 간격으로 측정하여 열에너지 발생량과 체내 소비되는 영양소 선호도를 확인할 수 있는 지표인 호흡 계수 (Respiratory quotient)를 분석하였다. 24시간 후 마우스는 대사 사육장에서 꺼내어 thermal probe를 항문을 통해 삽입하여 직장 온도를 측정하여, 그 결과를 도 14a 내지 도 14b에 나타내었다.
군 Energy expenditure (kcal/day/kg0.75)
Dark Light
Vehicle 161.76 ± 3.49 145.56 ± 2.58
AGM-212 189.30 ± 3.53 158.01 ± 3.43
AGM-212-3 201.78 ± 3.33 175.39 ± 3.20
도 14a 내지 도 14b 및 표 16에서 확인할 수 있듯이, 12시간 간격으로 측정한 낮, 밤 시간대에서 AGM-212-3을 투여한 마우스 군의 열에너지 소비량, 직장 내 온도가 유의하게 증가됨을 확인하였다. 반면, 운동량은 대조군과 비교하여 운동 패턴의 변화는 있으나 전체 운동량에서는 유의한 변화가 일어나지 않았음을 확인하였다. 또한, 호흡 계수는 낮, 밤 시간대에서 모두 0.7에 근사하게 유의한 감소를 보였다.
상기 결과는 비만 질병 마우스의 운동량과 무관하게 유사체에 따른 글루카곤 활성의 장기적인 유지에 의해 지방을 소비하는 열에너지 발생이 증가되었으며 체중 감소에 주요하게 작용하였음을 시사한다.
실험예 11. 유사체의 비만 질병 동물 모델에서의 열에너지 발생 관여 인자량 변화 확인
실험예 10에서의 AGM-212-3의 열에너지 발생 증진 기작을 검증하기 위해 5주 장기 투여 실험 후 마우스 갈색 지방 조직을 분리하여 웨스턴 블랏 (Western blotting)과 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (Quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)을 통해 열에너지 발생 기작의 주요 인자인 UCP1, PRDM16, CIDEA 의 발현량을 분석하였다. 또한, 4% paraformaldehyde에 고정된 갈색 지방 조직을 대상으로 UCP1에 특이적 affinity를 가지는 항체를 처리해 갈색 지방 조직 내 UCP1 발현량을 관찰하여, 그 결과를 도 15a 내지 도 15b에 나타내었다.
군 UCP-1/β-actin expression ratio
(arbitrary units)
Vehicle 1.00 ± 0.02
AGM-212 0.93 ± 0.15
AGM-212-3 1.37 ± 0.01
군 mRNA expression (fold.)
UCP-1 PRDM16 CIDEA
Vehicle 1.02 ± 0.10 1.06 ± 0.05 1.00 ± 0.08
AGM-212 3.47 ± 1.69 1.01 ± 0.23 1.73 ± 0.31
AGM-212-3 6.03 ± 1.24 5.81 ± 1.12 5.63 ± 1.58
도 15a 내지 도 15b 및 표 17, 표 18에서 확인할 수 있듯이, 유사체를 투여한 군의 갈색 지방 조직 내 UCP1 단백질 발현량, UCP-1, PRDM16, CIDEA mRNA 발현량 모두 대조군과 비교하여 유의하게 증가되었음을 확인하였다. 또한, immunohistochemistry (IHC) 이미지에서도 갈색 지방 조직 내 UCP1 량이 대조군과 대비하여 증가됨을 확인하였다.
상기 결과는 AGM-212-3이 갈색 지방 조직에서의 글루카곤 수용체를 활성화 시켜 열에너지 발생 관여 인자들의 발현을 조절하는 신호 전달 경로의 발생을 증가시켰음을 시사한다.
실험예 12. 유사체의 지방 분해능 확인
AGM-212-3의 장기 투여에 따른 지방 조직의 감소 및 조직 내 지질 합성/분해 기작의 주요 인자들의 발현량 변화를 확인하기 위해, 상기 실시예 11의 장기 투여 실험 종료 후 고환부, 서혜부 백색지방 조직과 피하 갈색 지방 조직을 분리하여 각 조직 별 크기를 측정한 뒤, 웨스턴 블랏, qRT-PCR을 통해 각 대사 인자들의 발현량 변화를 분석하여, 그 결과를 도 16a 내지 도 16e에 나타내었다.
도 16a 내지 도 16e에서 확인할 수 있듯이, 실험군 마우스의 고환부 백색 지방 조직에서 지방 분해 신호 전달에 중요한 인자인 Protein kinase A와 지질 분해 효소인 HSL의 단백질 발현이 유의하게 증가하였음을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.
또한, 지질 분해 효소인 ATGL, HSL과 지방 분해 작용의 주요 인자인 Perilipin의 mRNA 발현량이 유의하게 증가하였고, 지질 합성 및 세포 내 지방산 흡수에 관여하는 CD36, PPARr, C/EBPa, FABP4의 mRNA 발현량은 유의하게 감소함을 qRT-PCR을 통해 확인하였다.
더불어, 실험군 마우스의 서혜부 백색 지방 조직 내 지질 합성 신호 전달의 주요인자인 FAS의 단백질 발현량과 SCD, ACACA1의 mRNA 발현량은 감소한 반면, 지방산의 베타 산화 (Beta-oxidation) 신호 전달의 주요 인자인 ACSL1의 단백질 발현량, 그리고 CPT1a, CPT2, CACT, PGC-1a의 단백질, mRNA 발현량이 유의하게 증가하였음을 Western blot, qRT-PCR을 통해 확인하였다.
실험예 13. 유사체의 근육세포 내 지방 분해능 및 열에너지 발생 효과 확인
골격근은 기초 대사율의 주 원인이 되는 기관으로 갈색 지방과 동일한 기작을 통해 열에너지 발생을 증가시켜 체중 조절에 중요한 역할을 담당하는 것으로 보고되어 있다.
이에, AGM-212-3의 근육에서의 열에너지 발생을 증가시킬 수 있는지의 기능 검증을 위해, 근원세포주인 C2C12를 대상으로, 지질 합성, 분해, 지방산 수송 신호 전달과 연관된 대사인자들의 발현량 변화를 웨스턴 블랏, qRT-PCR을 통해 분석하여, 그 결과를 도 17a 내지 도 17c에 나타내었다.
도 17a 내지 도 17c에서 확인할 수 있듯이, 웨스턴 블랏을 통해 C2C12 세포 내 열에너지 발생 신호 전달 경로의 주요 신호 전달자인 AMPK의 인산화 정도가 지방산인 palmitic acid (0.75mM) 를 처리한 경우 대조군과 비교하여 감소하는 경향을 보이나, 유사체의 농도 별 처리 (10nM, 20nM, 50nM, 100nM) 시 농도 의존적으로 AMPK의 인산화 정도가 유의하게 증가하였다.
또한, qRT-PCR을 통해, C2C12 세포 내 지방산 대사 및 미토콘드리아 기질 내 지방산 수송 관여 인자 (ACSL1, CPT1a, CPT2, CACT)와 지방산의 베타 산화 신호 전달 인자 (Acox1, PGC-1a, FoxA2)의 mRNA 발현량이 처리한 접합체의 농도 의존적으로 유의하게 증가한 반면, 지질 합성 신호 전달 인자 (FAS, SREBP-1c)의 mRNA 발현량은 접합체의 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다.
상기 결과는 AGM-212-3이 갈색 지방과 마찬가지로 골격근에서도 열에너지 발생을 증가시키며 지질 합성을 저해할 수 있으며 유요한 체중 감소능을 보유하고 있음을 시사한다.
본 발명은 당쇄화 엑세나타이드 유사체 및 이의 용도, 및 엑세나타이드 이량 유사체 및 이의 용도에 관한 것이다.

Claims (33)

  1. 엑세나타이드 (exenatide) 아미노산 서열의 1 내지 15개의 아미노산이 결실되고, 지방산이 접합 (conjugation)된 당쇄화 엑세나타이드 유사체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 엑세나타이드 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 당쇄화 엑세나타이드 유사체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 결실은 엑세나타이드의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단의 아미노산이 결실된 것인, 당쇄화 엑세나타이드 유사체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 지방산은 엑세나타이드의 Lys 잔기, N-말단 또는 C-말단에 접합된 것인, 당쇄화 엑세나타이드 유사체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 지방산은 링커를 통하여 Lys 잔기, N-말단 또는 C-말단에 접합된 것인, 당쇄화 엑세나타이드 유사체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 지방산은 C3 내지 C36의 탄소수를 갖는 지방산인 것인, 당쇄화 엑세나타이드 유사체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 지방산은 프로피온산 (propionic acid), 부티르산 (butyric acid), 발레르산 (valeric acid), 카프로산 (caproic acid), 에난트산 (enanthic acid), 카프릴릭산 (caprylic acid), 펠라르곤산 (pelargonic acid), 카프릭산 (capric acid), 언데실산 (undecylic acid), 라우르산 (lauric acid), 트리데실산 (tridecylic acid), 미리스트산 (myristic acid), 펜타데실산 (pentadecylic acid), 팔미트산 (palmitic acid), 마르가르산 (margaric acid), 스테아르산 (stearic acid), 논아데실산 (nonadecylic acid), 아라키트산 (arachidic acid), 헤네이코실산 (heneicosylic acid), 베헨산 (behenic acid), 트리코실(tricosylic acid), 리그노세르산 (lignoceric acid), 펜타코실산 (pentacosylic acid), 세로트산 (cerotic acid), 헵타코실산 (heptacosylic acid), 몬탄산 (montanic acid), 논아코실산 (nonacosylic acid), 멜리스산 (melissic acid), 헤나트리아콘틸산 (henatriacontylic acid), 라세로산 (lacceroic acid), 사일산 (psyllic acid), 게드산 (geddic acid), 세로플라스트산 (ceroplastic acid) 및 헥사트리아콘틸산 (hexatriacontylic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 당쇄화 엑세나타이드 유사체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 당쇄화 엑세나타이드 유사체는 엑세나타이드 유사체의 일 아미노산이 치환되어 당류가 결합된 것인, 당쇄화 엑세나타이드 유사체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 당류는 1 내지 11당으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 당쇄화 엑세나타이드 유사체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 당쇄화 엑세나타이드 유사체는 엑세나타이드 유사체의 적어도 하나 이상의 아미노산에 당류가 결합된 것인, 당쇄화 엑세나타이드 유사체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 적어도 하나 이상의 아미노산은 다른 일 아미노산으로 치환된 것인, 당쇄화 엑세나타이드 유사체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 포함하는 당뇨 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 포함하는 비만 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 포함하는 당뇨 개선 또는 완화용 식품 조성물.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 포함하는 비만 개선 또는 완화용 식품 조성물.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 당쇄화 엑세나타이드 유사체를 포함하는 식욕 억제용 식품 조성물.
  17. 엑세나타이드 (exenatide) 아미노산 서열의 1 내지 15개의 아미노산이 결실되고, 지방산이 접합 (conjugation)된 엑세나타이드 유사체로 이루어진 제1체; 및
    엑세나타이드 (exenatide) 아미노산 서열의 1 내지 15개의 아미노산이 결실되고 지방산이 접합 (conjugation)된 엑세나타이드 유사체, 또는 글루카곤으로 이루어진 제2체;를 포함하고,
    상기 제1체 및 제2체는 결합되어 이량 유사체를 형성하고 있는 것인, 엑세나타이드 이량 유사체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 엑세나타이드의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 엑세나타이드 이량 유사체.
  19. 제17항에 있어서, 상기 글루카곤의 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 엑세나타이드 이량 유사체.
  20. 제17항에 있어서, 상기 제2체가 엑세나타이드 유사체인 경우, 상기 1체 및 제2체의 결합은 이황화결합된 것인, 엑세나타이드 이량 유사체.
  21. 제17항에 있어서, 상기 제2체가 글루카곤인 경우, 상기 제1체 및 제2체의 결합은 체1체의 C-말단에 Lys 잔기를 첨가하고 이의 측쇄에 글루카곤으로 이루어진 제2체가 결합, 또는 이황화결합된 것인, 엑세나타이드 이량 유사체.
  22. 제17항에 있어서, 상기 결실은 엑세나타이드의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단의 아미노산이 결실된 것인, 엑세나타이드 이량 유사체.
  23. 제17항에 있어서, 상기 지방산은 엑세나타이드의 Lys 잔기, N-말단 또는 C-말단에 접합된 것인, 엑세나타이드 이량 유사체.
  24. 제19항에 있어서, 상기 지방산은 링커를 통하여 Lys 잔기, N-말단 또는 C-말단에 접합된 것인, 엑세나타이드 이량 유사체.
  25. 제17항에 있어서, 상기 지방산은 프로피온산(propionic acid), 부티르산(butyric acid), 발레르산(valeric acid), 카프로산(caproic acid), 에난트산(enanthic acid), 카프릴릭산(caprylic acid), 펠라르곤산(pelargonic acid), 카프릭산(capric acid), 언데실산(undecylic acid), 라우르산(lauric acid), 트리데실산(tridecylic acid), 미리스트산(myristic acid), 펜타데실산(pentadecylic acid), 팔미트산(palmitic acid), 마르가르산(margaric acid), 스테아르산(stearic acid), 논아데실산(nonadecylic acid), 아라키트산(arachidic acid), 헤네이코실산(heneicosylic acid), 베헨산(behenic acid), 트리코실(tricosylic acid), 리그노세르산(lignoceric acid), 펜타코실산(pentacosylic acid), 세로트산(cerotic acid), 헵타코실산(heptacosylic acid), 몬탄산(montanic acid), 논아코실산(nonacosylic acid), 멜리스산(melissic acid), 헤나트리아콘틸산(henatriacontylic acid), 라세로산(lacceroic acid), 사일산(psyllic acid), 게드산(geddic acid), 세로플라스트산(ceroplastic acid) 및 헥사트리아콘틸산(hexatriacontylic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 엑세나타이드 이량 유사체.
  26. 제17항에 있어서, 상기 엑세나타이드 이량 유사체는 제1체, 제2체 또는 이들 각각의 일 아미노산에 당류가 결합된 것인, 엑세나타이드 이량 유사체.
  27. 제26항에 있어서, 상기 당류는 1 내지 11당으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 엑세나타이드 유사체.
  28. 제26항에 있어서, 상기 엑세나타이드 이량 유사체는 제1체, 제2체 또는 이들 각각의 일 아미노산이 다른 일 아미노산으로 치환되고, 치환된 아미노산에 당류가 결합된 것인, 엑세나타이드 유사체.
  29. 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항의 엑세나타이드 이량 유사체를 포함하는 당뇨 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  30. 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항의 엑세나타이드 이량 유사체를 포함하는 비만 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  31. 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항의 엑세나타이드 이량 유사체를 포함하는 당뇨 개선 또는 완화용 식품 조성물.
  32. 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항의 엑세나타이드 이량 유사체를 포함하는 비만 개선 또는 완화용 식품 조성물.
  33. 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항의 엑세나타이드 이량 유사체를 포함하는 식욕 억제용 식품 조성물.
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