WO2021100643A1 - 電子伝達体、電子伝達体の製造方法、及び、電子伝達方法 - Google Patents

電子伝達体、電子伝達体の製造方法、及び、電子伝達方法 Download PDF

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征司 児島
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Definitions

  • the present disclosure relates to an electron carrier containing modified cyanobacteria, a method for producing an electron carrier, and a method for electron transfer.
  • Non-Patent Document 1 A bioelectrochemical system (for example, a power generation device) capable of introducing such a phenomenon into, for example, sewage treatment technology and recovering resources from organic wastewater is expected (Patent Document 1).
  • the electrons generated in the cells by photosynthesis can be used as a microbial solar cell (Non-Patent Document 3).
  • Non-Patent Documents 5 and 6 modification of the electrode surface (Non-Patent Documents 5 and 6) or a mediator compound (Non-Patent Document 7) improves the electron transfer efficiency between the cyanobacteria and the electrode.
  • cyanobacteria are also known to produce various useful substances (for example, alcohols, alkanes, fatty acids, etc.) by photosynthesis (Patent Documents 2 and 2).
  • Non-Patent Document 4 Non-Patent Document 4).
  • Non-Patent Document 2 On the other hand, technological development is also underway to send electrons from outside the cell to the microbial cell to activate the metabolism of the microbial cell and improve the efficiency of substance production (for example, Non-Patent Document 2).
  • the present disclosure provides an electron carrier having improved electron transfer efficiency to the outside, a method for producing the electron carrier, and an electron transfer method by including a modified cyanobacteria having improved extracellular electron transfer efficiency. ..
  • the electron transmitter according to one aspect of the present disclosure is: (i) the function of a protein involved in the binding between the outer membrane and the cell wall is suppressed or lost in cyanobacteria, and (ii) the protein permeation of the outer membrane. It comprises at least one modified cyanobacteria in which a sex-enhancing channel protein is expressed, said modified cyanobacteria at least one of supplying electrons to the outside and taking in electrons from the outside. I do.
  • the electron carrier of the present disclosure and the method for manufacturing the electron carrier, it is possible to provide an electron carrier having improved electron transfer efficiency with the outside. Further, according to the electron transfer method of the present disclosure, the efficiency of at least one of the donation of electrons from the electron carrier to the outside and the reception of electrons by the electron carrier from the outside is improved.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the cell surface layer of cyanobacteria.
  • FIG. 2 is a schematic view showing an example of an electron carrier according to the present embodiment.
  • FIG. 3 is a transmission electron microscope observation image of an ultrathin section of the modified cyanobacteria of Example 1.
  • FIG. 4 is an enlarged image of the broken line region A of FIG.
  • FIG. 5 is a transmission electron microscope image of an ultrathin section of the modified cyanobacteria of Example 2.
  • FIG. 6 is an enlarged image of the broken line region B of FIG.
  • FIG. 7 is a transmission electron microscope image of an ultrathin section of the modified cyanobacteria of Comparative Example 1.
  • FIG. 8 is an enlarged view of the broken line region C of FIG. 7.
  • FIG. 10 is an exploded perspective view schematically showing an example of the configuration of the electrochemical measuring device.
  • FIG. 11 is a schematic cross-sectional view taken along the XI-XI cross-sectional line of FIG.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of measuring the current flowing when the culture solution of the modified cyanobacteria of Comparative Example 1 was irradiated with light.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of measuring the current flowing when the culture solution of the modified cyanobacteria of Example 2 was irradiated with light.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of measuring the current flowing when the culture solution of the modified cyanobacteria of Example 3 was irradiated with light.
  • Non-Patent Document 1 if the electrons emitted from the microorganism are received by the external electrode, it can be used as a microbial fuel cell using organic matter as fuel. For example, it can be introduced into a sewage treatment process containing organic matter and used as a power generation device. It is expected (Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 nanoparticles of indium phosphate are adhered to yeast cells, and electrons generated by the photoelectric conversion reaction of the nanoparticles are taken up into the cells to obtain the reducing power used for intracellular metabolism. It has been reported that supplementation can improve the efficiency of shikimic acid production from glucose raw materials.
  • microorganisms does not depend on chemical fuels, and can realize energy production and substance production with low environmental load.
  • photosynthetic microorganisms such as cyanobacteria and algae are expected to be carbon-neutral next-generation material production systems because they can use light as an energy source and carbon dioxide (CO 2) in the air as a raw material. ..
  • Cyanobacteria also called blue-green bacteria or blue-green algae
  • Cyanobacteria are a group of eubacteria that decompose water by photosynthesis to produce oxygen and fix CO 2 in the air with the obtained energy. Cyanobacteria can also fix nitrogen (N 2 ) in the air depending on the species.
  • N 2 nitrogen
  • cyanobacteria grow quickly and have high light utilization efficiency, and in addition, genetic manipulation is easier than other algae species. Therefore, regarding the utilization of cyanobacteria among photosynthetic microorganisms. Active research and development is taking place.
  • cyanobacteria accept the electrons generated in the cells of cyanobacteria during electrolysis of water by photosynthesis at an external electrode by utilizing the property of cyanobacteria to transfer electrons outside the cell, water, cyanobacteria, and a pair of electrodes It can be used as a microbial solar cell with a simple configuration including (Non-Patent Document 3).
  • cyanobacteria have high photosynthetic ability, they cannot obtain sufficient light energy in low light such as at night or in the evening, in rainy weather or in cloudy weather. Therefore, if electrons can be sent into the cell from the outside of the cyanobacteria, the intracellular reducing power that is insufficient at night or in low light can be replenished from the outside, which is expected to lead to improvement in substance production efficiency.
  • Non-Patent Document 5 As means for improving the electron transfer efficiency between cyanobacteria and the external electrode, modification of the electrode surface (Non-Patent Document 5 and Non-Patent Document 6) and a mediator compound (Non-Patent Document 7) have been reported. There is.
  • modified cyanobacteria by partially detaching the outer membrane of cyanobacteria from the cell wall or improving the substance permeability of the outer membrane.
  • the efficiency of electron transfer between cells and external electrodes is improved. More specifically, by removing the outer membrane of cyanobacteria or improving the permeability of substances, the modified cyanobacteria secrete intracellular electron carriers extracellularly, and extracellular electron carriers are secreted into cells.
  • the extracellular electron transfer efficiency of the modified cyanobacteria is improved, so that the electron carrier containing the modified cyanobacteria can efficiently transfer electrons to the outside.
  • the present disclosure provides an electron carrier having improved electron transfer efficiency with the outside, and a method for manufacturing the electron carrier.
  • the present disclosure also provides an electron transfer method that improves the efficiency of at least one of the donation of electrons from the electron carrier to the outside and the reception of electrons from the outside of the electron carrier.
  • the electron transmitter according to one aspect of the present disclosure is: (i) the function of a protein involved in the binding between the outer membrane and the cell wall is suppressed or lost in cyanobacteria, and (ii) the protein permeation of the outer membrane. It comprises at least one modified cyanobacteria in which a sex-enhancing channel protein is expressed, said modified cyanobacteria at least one of supplying electrons to the outside and taking in electrons from the outside. I do.
  • the binding between the cell wall and the outer membrane (for example, the binding amount and the binding force) is partially reduced, so that the outer membrane is easily partially detached from the cell wall. Therefore, the electron generated inside the cell or the substance or molecule having the electron easily leaks to the outside of the outer membrane, that is, to the outside of the cell.
  • the protein permeability of the outer membrane is improved, so that the substance permeability of the outer membrane is improved.
  • the modified cyanobacteria secrete extracellularly generated electrons or substances or molecules having electrons into the cells, and take up extracellular electrons or substances or molecules having electrons into the cells. At least one can be done. Therefore, in the modified cyanobacteria, the extracellular electron transfer efficiency is improved. Therefore, the electron transport chain according to one aspect of the present disclosure has improved electron transfer efficiency with the outside.
  • the outside is a substance or molecule that exists as an individual different from the electron carrier, and is, for example, a redox substance involved in the movement of electrons between substances, or a molecule having a redox reactive group.
  • the modified cyanobacteria may receive light to generate electrons and release the generated electrons to the outside of the outer membrane.
  • the modified cyanobacteria release electrons or substances or molecules with electrons to the outside of the cell when they receive light. Therefore, the electron carrier according to one aspect of the present disclosure can generate electrons inside when irradiated with light, and can supply electrons or substances or molecules having electrons to the outside.
  • the modified cyanobacteria may take in electrons existing outside the outer membrane inside the cell wall and utilize the electrons inside the cell wall. ..
  • the modified cyanobacteria take in electrons or substances or molecules having electrons existing outside the cell into the cell (in the cytoplasm), and for example, energy (ATP: adenosine triphosphate) in the process of flowing through the photosynthetic electron transport chain. ) Is generated. Then, the modified cyanobacteria use this energy to produce organic matter based on carbon dioxide. Therefore, the electron carrier according to one aspect of the present disclosure can take in electrons from the outside to the inside to generate energy and produce an organic substance such as a protein.
  • energy ATP: adenosine triphosphate
  • the proteins involved in the binding between the outer membrane and the cell wall are SLH (Surface Layer Homology) domain-retaining outer membrane protein and It may be at least one of the cell wall-pyruvate modifying enzymes.
  • the modified cyanobacteria for example, (a) an enzyme that catalyzes the reaction of modifying the SLH domain-retaining outer membrane protein that binds to the cell wall and the bound sugar chain on the surface of the cell wall with pyruvate (that is, cell wall-pyruvate modification) At least one function of (enzyme) is suppressed or lost, or (b) expression of at least one of SLH domain-retaining outer membrane protein and cell wall-pyruvate modifying enzyme is suppressed. Therefore, the binding (that is, the binding amount and binding force) between the SLH domain of the SLH domain-retaining outer membrane protein in the outer membrane and the covalently bound sugar chain on the surface of the cell wall is reduced.
  • pyruvate that is, cell wall-pyruvate modification
  • the outer membrane is likely to be detached from the cell wall at the portion where the bond between the outer membrane and the cell wall is weakened.
  • the modified cyanobacteria secretes intracellular electrons or substances or molecules having electrons to the outside of the cell, and takes up extracellular electrons or substances or molecules having electrons into the cells at least one of them. Therefore, the efficiency of extracellular electron transfer is improved. Therefore, the electron transport chain according to one aspect of the present disclosure has improved electron transfer efficiency with the outside.
  • the SLH domain-retaining outer membrane protein is Slr1841 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, NIES970_09470 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: It may be Anacy_3458 consisting of the amino acid sequence represented by 3 or a protein having an amino acid sequence 50% or more identical to that of any of these SLH domain-retaining outer membrane proteins.
  • any SLH domain-retaining outer membrane protein shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 above, or any of these SLH domain-retaining outer membrane proteins and an amino acid sequence The function of proteins that are 50% or more identical is suppressed or lost, or (b) any SLH domain-retaining outer membrane protein set forth in SEQ ID NOs: 1-3 above, or any of these SLH domains.
  • the expression of a protein having an amino acid sequence that is 50% or more identical to that of a retained outer membrane protein is suppressed.
  • the modified cyanobacteria (a) the function of the SLH domain-retaining outer membrane protein in the outer membrane or the protein having the same function as the SLH domain-retaining outer membrane protein is suppressed or lost, or (b) The expression level of the SLH domain-retaining outer membrane protein or the protein having the same function as the SLH domain-retaining outer membrane protein in the outer membrane is reduced.
  • the binding amount and binding force of the binding domain (for example, SLH domain) of the outer membrane to bind to the cell wall are reduced, so that the outer membrane is easily partially detached from the cell wall. Therefore, the electron transport chain according to one aspect of the present disclosure has improved electron transfer efficiency with the outside.
  • the cell wall-pyruvate modifying enzyme is Slr0688 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, Synpcc7942_1529 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 6. It may be Anacy_1623 consisting of the amino acid sequence shown by, or a protein having an amino acid sequence of 50% or more identical to that of any of these cell wall-pyruvate modifying enzymes.
  • the modified cyanobacteria for example, (a) one of the cell wall-pyruvate modifying enzymes shown in SEQ ID NOs: 4 to 6 above or any of these cell wall-pyruvate modifying enzymes and the amino acid sequence are 50%.
  • the functions of the proteins that are the same as described above are suppressed or lost, or (b) any cell wall-pyruvate modifying enzyme shown in SEQ ID NOs: 4 to 6 above or any of these cell walls-pyruvate modification.
  • the expression of proteins having the same amino acid sequence as the enzyme by 50% or more is suppressed.
  • the function of the cell wall-pyruvic acid modifying enzyme or a protein having the same function as the enzyme is suppressed or lost, or (b) the cell wall-pyruvic acid modifying enzyme or the enzyme is used.
  • the expression level of proteins with equivalent functions is reduced. This makes it difficult for the covalently bound sugar chains on the surface of the cell wall to be modified with pyruvic acid, so that the amount and binding force of the sugar chains on the cell wall to bind to the SLH domain of the SLH domain-retaining outer membrane protein in the outer membrane. Is reduced.
  • the covalent sugar chains on the surface of the cell wall are less likely to be modified with pyruvic acid, so that the binding force between the cell wall and the outer membrane is weakened, and the outer membrane is easily partially detached from the cell wall. Become. Therefore, the electron transport chain according to one aspect of the present disclosure has improved electron transfer efficiency with the outside.
  • the gene expressing the protein involved in the binding between the outer membrane and the cell wall may be deleted or inactivated.
  • the modified cyanobacteria of (i) above the expression of the protein involved in the binding between the cell wall and the outer membrane is suppressed, or the function of the protein is suppressed or lost, so that the cell wall and the outer membrane are suppressed. Bonding with (so-called binding amount and binding force) is partially reduced. As a result, the outer membrane is likely to be detached from the cell wall at the portion where the bond between the outer membrane and the cell wall is weakened.
  • intracellular electrons or substances or molecules having electrons are secreted extracellularly, and extracellular electrons or substances or molecules having electrons are taken up into the cells. Since at least one of these can be done, the efficiency of extracellular electron transfer is improved. Therefore, the electron transport chain according to one aspect of the present disclosure has improved electron transfer efficiency with the outside.
  • the genes expressing the protein involved in the binding between the outer membrane and the cell wall are the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein and the cell wall-pyruvate. It may be at least one of the genes encoding the modifying enzyme.
  • the modified cyanobacteria As a result, in the modified cyanobacteria, at least one gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein and the gene encoding the cell wall-pyruvic acid modifying enzyme are deleted or inactivated. Therefore, in the modified cyanobacteria, for example, the expression of at least one of (a) SLH domain-retaining outer membrane protein and cell wall-pyruvic acid modifying enzyme is suppressed, or (b) SLH domain-retaining outer membrane protein and cell wall. -At least one function of pyruvate modifying enzyme is suppressed or lost.
  • the binding that is, the binding amount and binding force
  • the outer membrane is easily detached from the cell wall at the portion where the bond between the outer membrane and the cell wall is weakened, so that the intracellular electron or the substance or molecule having an electron is easily leaked to the outside of the cell. .. Therefore, in the electron carrier according to one aspect of the present disclosure, intracellular electrons or substances or molecules having electrons easily leak out of the cell in the modified cyanobacteria, so that the efficiency of electron transfer to the outside is improved.
  • the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein is slr1841 consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 7, and nies970_09470 consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 8. It may be anacy_3458 consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 9, or a gene whose base sequence is 50% or more identical to any of these genes.
  • the gene encoding any of the SLH domain-bearing outer membrane proteins shown in SEQ ID NOs: 7 to 9 above, or a gene that is 50% or more identical to the base sequence of any of these genes. Is deleted or inactivated. Therefore, in the modified cyanobacteria, the expression of (a) any of the above SLH domain-retaining outer membrane proteins or a protein having a function equivalent to that of any of these proteins is suppressed, or (b) the above. The function of any SLH domain-retaining outer membrane protein or a protein having a function equivalent to that of any of these proteins is suppressed or lost.
  • the binding amount and binding force of the binding domain (for example, SLH domain) for the outer membrane to bind to the cell wall are reduced.
  • the outer membrane is likely to be partially detached from the cell wall, so that the intracellular electron or the substance or molecule having the electron is easily leaked to the outside of the cell.
  • the modified cyanobacteria improve the extracellular electron transfer efficiency, so that the electron carrier according to one aspect of the present disclosure improves the electron transfer efficiency with the outside.
  • the gene encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme is slr0688 consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 10 and synpcc7942_1529 consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 11. , Anacy_1623 consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 12, or a gene whose base sequence is 50% or more identical to any of these genes.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding any cell wall-pyruvic acid modifying enzyme shown in SEQ ID NOs: 10 to 12 above or the gene encoding any of these enzymes is 50% or more identical.
  • the gene is deleted or inactivated. Therefore, in the modified cyanobacteria, (a) expression of any of the above cell wall-pyruvic acid modifying enzymes or a protein having a function equivalent to that of any of these enzymes is suppressed, or (b) any of the above.
  • the function of the cell wall-pyruvic acid modifying enzyme or a protein having a function equivalent to that of any of these enzymes is suppressed or lost.
  • the electron transfer efficiency with the outside is improved.
  • the channel protein for improving the protein permeability of the outer membrane is CppS consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14. It may be CppF consisting of the indicated amino acid sequence, or a protein whose amino acid sequence is 50% or more identical to that of any of these channel proteins.
  • the modified cyanobacteria of (ii) above with CppS (SEQ ID NO: 13) or CppF (SEQ ID NO: 14), which is a channel protein that improves the protein permeability of the outer membrane, or any of these channel proteins. Proteins with equivalent function are expressed. Therefore, in the modified cyanobacteria of (ii) above, the protein permeability of the outer membrane is improved, so that the substance permeability of the outer membrane is improved.
  • the modified cyanobacteria of (ii) described above secrete intracellular electrons or substances or molecules having electrons to the outside of the cell, and take up extracellular electrons or substances or molecules having electrons into the cells. Since at least one of these can be done, the efficiency of extracellular electron transfer is improved. Therefore, the electron transport chain according to one aspect of the present disclosure has improved electron transfer efficiency with the outside.
  • a gene encoding a channel protein that improves protein permeability of the outer membrane may be introduced into the (ii).
  • the modified cyanobacteria of (ii) above a channel protein that improves protein permeability of the outer membrane is expressed. Therefore, in the modified cyanobacteria of (ii) above, the protein permeability of the outer membrane is improved, so that the substance permeability of the outer membrane is improved.
  • the modified cyanobacteria of (ii) described above secrete intracellular electrons or substances or molecules having electrons to the outside of the cell, and take up extracellular electrons or substances or molecules having electrons into the cells. Since at least one of these can be done, the efficiency of extracellular electron transfer is improved. Therefore, the electron transport chain according to one aspect of the present disclosure has improved electron transfer efficiency with the outside.
  • the gene encoding the channel protein that improves the protein permeability of the outer membrane may be a gene derived from chloroplast.
  • the gene encoding the channel protein that improves the protein permeability of the outer membrane is cppS consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 15, cppF consisting of the base acid sequence shown by SEQ ID NO: 16, or any of these. It may be a gene whose base sequence is 50% or more identical to that gene.
  • the gene encoding any of the channel proteins shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 or the base sequence of any of these genes is 50% or more identical.
  • a gene is introduced. Therefore, in the modified cyanobacteria of (ii) above, a protein having a function of improving protein permeability in the outer membrane or a protein having a function equivalent to the protein is expressed. As a result, in the modified cyanobacteria of (ii) above, the protein permeability of the outer membrane is improved, so that the substance permeability of the outer membrane is improved.
  • the modified cyanobacteria of (ii) described above secrete intracellular electrons or substances or molecules having electrons to the outside of the cell, and take up extracellular electrons or substances or molecules having electrons into the cells. Since at least one of these can be done, the efficiency of extracellular electron transfer is improved. Therefore, the electron transport chain according to one aspect of the present disclosure has improved electron transfer efficiency with the outside.
  • the function of a protein involved in the binding between the outer membrane and the cell wall is suppressed or lost in cyanobacteria, and (ii) the above. It comprises the step of producing modified cyanobacteria, which is at least one of which channel proteins are expressed that improve the protein permeability of the outer membrane.
  • the modified cyanobacteria secrete extracellular electrons or substances or molecules having electrons into cells, and take up extracellular electrons or substances or molecules having electrons into cells at least one of them. It can be carried out. As a result, the produced modified cyanobacteria have improved extracellular electron transfer efficiency. Therefore, according to the method for manufacturing an electron carrier according to one aspect of the present disclosure, it is possible to provide an electron carrier with improved electron transfer efficiency with the outside.
  • any of the above electron carriers is used.
  • the electron carrier contains modified cyanobacteria with improved extracellular electron transfer efficiency, it is possible to efficiently donate electrons to the outside (for example, an external electrode) and efficiently receive electrons from the outside. .. Therefore, if an electron carrier is used, the modified cyanobacteria contained in the electron carrier releases the intracellular electron transport chain to the outside of the cell, thereby efficiently supplying electrons to an external electrode, for example, to generate an electric current. Can be done. Further, for example, the modified cyanobacteria contained in the electron carrier can receive electrons instead of light energy from the outside to perform photosynthesis or respiration. As a result, the modified cyanobacteria contained in the electron carrier can also produce useful substances such as proteins inside the cells and secrete them extracellularly.
  • each figure is not necessarily exactly illustrated.
  • substantially the same configuration is designated by the same reference numerals, and duplicate description may be omitted or simplified.
  • the numerical range does not only represent a strict meaning, but also includes measuring a substantially equivalent range, for example, the amount of protein (for example, number or concentration, etc.) or the range thereof.
  • both the bacterial cell and the cell represent one cyanobacterial individual.
  • the identity of the base sequence and the amino acid sequence is calculated by the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) algorithm. Specifically, it is calculated by performing pairwise analysis with the BLAST program available on the website of NCBI (National Center for Biotechnology Information) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). To. Information on cyanobacterial and plant genes and the proteins encoded by these genes is published, for example, in the NCBI database described above and Cyanobase (http://genome.microbedb.jp/cyanobase/). From these databases, the amino acid sequence of the protein of interest and the base sequence of the gene encoding those proteins can be obtained.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • Cyanobacteria also called cyanobacteria or cyanobacteria, collect light energy with chlorophyll and use the obtained energy to cause charge separation of the reaction center chlorophyll, thereby electrolyzing water and generating oxygen while photosynthesizing. It is a group of prokaryotes. Cyanobacteria are rich in diversity, for example, in cell shape, there are unicellular species such as Synechocysis sp. PCC 6803 and multicellular filamentous species such as Anabaena sp. PCC 7120.
  • thermophilic species such as Thermosynechococcus elongatus
  • marine species such as Synechococcus elongatus
  • freshwater species such as Synechocystis.
  • Microcystis aeruginosa a species that has gas vesicles and produces toxins
  • Gloeobacter violaceus which has a protein called phycobilisome that is a focusing antenna on the plasma membrane without thylakoids.
  • phycobilisome a protein called phycobilisome that is a focusing antenna on the plasma membrane without thylakoids.
  • cyanobacteria electrons are generated inside the cell when water is decomposed by photosynthesis and when organic compounds such as sugar synthesized by photosynthesis are catabolized as their own nutrient source.
  • the electrons generated by the decomposition of water flow through the photosynthetic electron transport chain existing on the thylakoid membrane, which is the membrane structure in the cytoplasm, and in the process generate a proton driving force used as a bioenergy source, and finally. It is used in the reaction to reduce NADP + and produce NADPH.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the cell surface layer of cyanobacteria.
  • the cell surface layer of cyanobacteria is composed of a plasma membrane (also referred to as inner membrane 1), peptidoglycan 2, and an outer membrane 5, which is a lipid membrane forming the outermost layer of cells, in this order from the inside.
  • a plasma membrane also referred to as inner membrane 1
  • peptidoglycan 2 and an outer membrane 5, which is a lipid membrane forming the outermost layer of cells, in this order from the inside.
  • a sugar chain 3 composed of glucosamine, mannosamine, etc. is covalently bound to peptidoglycan 2, and pyruvate is covalently bound to these covalently bound sugar chains 3 (Non-Patent Document 9: Jurgens and). Weckesser, 1986, J. Bacteriol., 168: 568-573).
  • the peptidoglycan 2 and the covalently bound sugar chain 3 are collectively referred to as a cell wall 4.
  • the gap between the plasma membrane (that is, the inner membrane 1) and the outer membrane 5 is called periplasm, and is called periplasm, which decomposes proteins or forms a three-dimensional structure, decomposes lipids or nucleic acids, or takes up extracellular nutrients.
  • periplasm which decomposes proteins or forms a three-dimensional structure, decomposes lipids or nucleic acids, or takes up extracellular nutrients.
  • periplasm which decomposes proteins or forms a three-dimensional structure, decomposes lipids or nucleic acids, or takes up extracellular nutrients.
  • enzymes involved in There are various enzymes involved in.
  • the enzyme that catalyzes the pyruvate modification reaction of the covalent sugar chain 3 in peptidoglycan 2 (hereinafter referred to as cell wall-pyruvate modifying enzyme 9) has been identified in the Gram-positive bacterium Bacillus anthracis and is named CsaB.
  • Non-Patent Document 10 Mesnage et al., 2000, EMBO J., 19: 4473-4484.
  • cyanobacteria whose genomic nucleotide sequence is open to the public, many species carry a gene encoding a homologous protein having an amino acid sequence identity of 30% or more with CsaB. Examples include slr0688 held by Synechococcus sp. PCC 6803 or syn7502_03092 held by Synechococcus sp. 7502.
  • Non-Patent Document 11 Kowata et al., 2017).
  • J. Bacteriol., 199: e00371-17 It is known that peptidoglycan-bound sugar chains are pyruvic acid-modified for the binding between the outer membrane protein and the cell wall.
  • Non-Patent Document 12 Kojima et al., 2016, Biosci. Biotech. Biochem., 10 : 1954-1959).
  • a channel protein is a membrane protein that forms a pathway (that is, a channel) for selectively permeating a predetermined substance from the inside to the outside or from the outside to the inside of a lipid membrane (for example, outer membrane 5).
  • the outer membrane of common heterotrophic Gram-negative bacteria such as Escherichia coli and Salmonella, selectively permeates relatively low-molecular-weight nutrients such as sugars and amino acids from the outside to the inside of the outer membrane into cells.
  • Porin for uptake Non-Patent Document 13: Nikaido, 2003, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67 (4): 593-656).
  • Porin does not exist in the outer membrane 5 of cyanobacteria, and instead, a large amount of ion channel proteins (for example, SLH domain-retaining outer membrane protein 6) that selectively permeate only inorganic ions are present in the outer membrane 5.
  • ion channel protein accounts for about 80% of the total protein of the outer membrane 5 (Non-Patent Document 11). Therefore, in cyanobacteria, unless the properties of the outer membrane 5 are significantly modified by using a technique such as gene transfer, a high molecular weight substance such as a protein permeates the outer membrane 5 and is extracellular (that is, the outer membrane 5). It is difficult to spread to (outside).
  • the chloroplasts of plants originated from cyanobacteria that coexisted in the cells of primitive eukaryotic cells about 1.5 to 2 billion years ago, and were transformed into chloroplasts by subsequent evolution (Non-Patent Documents). 14: Ponce-Toledo et al., 2017, Curr. Biol., 27 (3): 386-391).
  • the chloroplasts carried by gray algae, which are the most primitive plants of unicellular algae, have peptidoglycan and retain a surface structure similar to that of cyanobacteria.
  • peptidoglycan does not exist in the chloroplasts of seed plants that have evolved more than unicellular algae.
  • the above-mentioned chloroplast outer membrane protein of Glaucophyte is significantly different from the composition of the outer membrane protein of cyanobacteria.
  • the outer membrane 5 of cyanobacteria contains a large amount of ion channel proteins that allow inorganic substances such as Slr1841 (SLH domain-retaining outer membrane protein 6) to permeate.
  • the ion channel protein accounts for about 80% of the total protein in the outer membrane 5.
  • the outer membrane of the chloroplast of Glaucophyte contains a large amount of channel proteins (hereinafter, also referred to as organic channel proteins 18) that allow organic substances named CppS and CppF to permeate.
  • the organic channel protein 18 accounts for 80% or more of the total protein in the outer membrane of the chloroplast of gray algae (Non-Patent Document 15: Kojima et al., 2016, J. Biol. Chem., 291: 20198-20209. ).
  • CppS and CppF are channel proteins having a channel function that selectively permeates relatively high-molecular-weight organic substances (for example, biomolecules such as proteins), and are used to control the inside of chlorophyll in plant cells and the cytoplasm of plant cells. It is thought to function as a connecting substance transport route.
  • CppS and CppF are widely distributed in gray algae.
  • CppS and CppF-like proteins are present only in bacteria belonging to the phylum Planctomycetes. Cyanobacteria do not carry CppS and CppF and their similar proteins (see Non-Patent Document 15).
  • FIG. 2 is a schematic view showing an example of the electron carrier 30 according to the present embodiment.
  • the electron carrier 30 has a function of supplying electrons to the outside and taking in electrons from the outside.
  • the outside is a substance or molecule that exists as an individual different from the electron carrier 30, and is, for example, a redox substance involved in the movement of electrons between substances, or a molecule having a redox reactive group.
  • supplying electrons means not only supplying electrons but also supplying any substance or molecule having electrons.
  • taking in an electron means not only taking in an electron but also taking in any substance or molecule having an electron.
  • the function of the protein involved in the binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 in cyanobacteria (the parent cyanobacteria described later) is suppressed or lost, and (Ii) Includes modified cyanobacteria 31, which is at least one of which a channel protein (so-called organic channel protein 18) that improves protein permeability of the outer membrane 5 is expressed. Further, the modified cyanobacteria 31 performs at least one of supplying electrons to the outside of the electron carrier 30 and taking in electrons from the outside.
  • the electron carrier 30 may be the modified cyanobacteria 31 of the above (i), the modified cyanobacteria 31 of the above (ii), or the modified cyanobacteria of the above (i) and (ii). It may be 31.
  • the bond between the cell wall 4 and the outer membrane 5 (for example, the amount of binding and the binding force) is partially reduced, so that the outer membrane 5 is partially detached from the cell wall 4. It will be easier. Therefore, the electrons generated inside the cells of the modified cyanobacteria 31 or the substances or molecules having electrons easily leak out of the outer membrane 5, that is, outside the cells. Further, according to the above (ii), in the modified cyanobacteria 31, the protein permeability of the outer membrane 5 is improved, so that the substance permeability of the outer membrane 5 is improved.
  • the modified cyanobacteria 31 secretes intracellularly generated electrons or substances or molecules having electrons to the outside of the cell, and takes up extracellular electrons or substances or molecules having electrons to the inside of the cell. At least one of can be done. As a result, the modified cyanobacteria 31 has improved extracellular electron transfer efficiency. Therefore, the electron transfer body 30 according to the present embodiment improves the electron transfer efficiency with the outside.
  • the electron carrier 30 may contain at least one of the electron transfer substance 33, the electron mediator 35, and the conductive substance 37 in addition to the at least one modified cyanobacteria 31 of the above (i) and (ii). Good.
  • the electron carrier 30 may include a modified cyanobacteria 31, an electron carrier 33, an electron mediator 35, and a conductive substance 37.
  • the extracellular electron transfer efficiency of the modified cyanobacteria 31 can be further improved.
  • the electron transfer substance 33 is a substance responsible for an electron transfer reaction, and is a so-called redox substance including an oxidation type substance that receives electrons and a reduction type substance that gives electrons.
  • the electron transport chain 33 is not particularly limited as long as it is a redox substance involved in the electron transport chain in cells, and for example, non-heme iron such as peptides, proteins, flavins, quinones, heme iron, and iron-sulfur clusters. Alternatively, it may be a copper ion or the like.
  • the electron mediator 35 is a substance that assists or promotes the electron transfer function of the electron transfer substance 33, and is a so-called redox active species.
  • the electron mediator 35 may be, for example, a quinone, a phenothen, a ferricianide, a cytochrome, a viologen, a phenazine, a phenoxazine, a phenothiazine, a ferredoxin, or a derivative thereof.
  • a substance may be appropriately selected depending on the type.
  • the conductive substance 37 is a substance having a property that electrons easily move in the substance, and for example, even if it is selected from one or more materials selected from the group consisting of carbon-based substances, conductive polymers, semiconductors and metals. Good.
  • the carbon-based substance means a substance containing carbon as a constituent component.
  • the carbon-based substance may be carbon powder such as graphite, activated carbon or carbon black, carbon fiber such as graphite felt, carbon wool or carbon woven fabric, carbon nanotubes, carbon plate, carbon paper or carbon disc.
  • the conductive polymer is a general term for polymer compounds having conductivity.
  • the conductive polymer is, for example, a polymer of a single monomer or two or more kinds of monomers whose constituent units are aniline, aminophenol, diaminophenol, pyrrole, thiophene, paraphenylene, fluorene, furan, acetylene or derivatives thereof. There may be. More specifically, the conductive polymer may be, for example, polyaniline, polyaminophenol, polydiaminophenol, polypyrrole, polythiophene, polyfuran, polyacetylene or the like.
  • the conductive substance 37 may be a metal or a metal oxide, and from the viewpoint of further increasing the current production amount, tungsten, tungsten oxide, copper, silver, platinum, gold, niobium, iron, cobalt, titanium and molybdenum. , Molybdenum oxide, tin, tin oxide, nickel, nickel oxide, alloys containing these, or oxides thereof.
  • modified cyanobacteria 31 [3. Modified cyanobacteria] Subsequently, the modified cyanobacteria 31 will be described. In this embodiment, the modified cyanobacteria 31 is included in the electron carrier 30.
  • the modified cyanobacteria 31 for example, receives light to generate electrons and emits the generated electrons to the outside of the outer membrane 5.
  • the modified cyanobacteria 31 releases an electron or a substance or molecule having an electron to the outside of the cell (that is, outside the outer membrane 5). Therefore, when the electron carrier 30 receives light, it generates electrons inside and can supply electrons or substances or molecules having electrons to the outside.
  • the modified cyanobacteria 31 takes in the electrons existing on the outside of the outer membrane 5 into the inside of the cell wall 4 (that is, in the cytoplasm), and utilizes the electrons inside the cell wall 4.
  • the modified cyanobacteria 31 takes in electrons or substances or molecules having electrons existing outside the cell into the cell (in the cytoplasm), and for example, energy (ATP: adenosine) in the process of flowing through the photosynthetic electron transport chain. triphosphate) is generated.
  • the modified cyanobacteria 31 uses this energy to produce an organic substance based on carbon dioxide. Therefore, the electron carrier 30 can take in electrons from the outside to the inside to generate energy and produce an organic substance such as a protein.
  • the function of a protein involved in the binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 (hereinafter, also referred to as a binding-related protein) in the cyanobacteria is suppressed or lost, and
  • At least one of the channel proteins (so-called organic channel proteins 18) that improve the protein permeability of the outer membrane 5 are expressed.
  • the protein involved in the binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 may be, for example, at least one of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the cell wall-pyruvic acid modifying enzyme 9.
  • the modified cyanobacteria 31 have, for example, suppressed or lost the function of at least one protein of SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and cell wall-pyruvic acid modifying enzyme 9.
  • at least one function of (a) SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be suppressed or lost, and (b) SLH binding to cell wall 4 may be suppressed.
  • the modified cyanobacteria 31 for example, (a) an enzyme that catalyzes the reaction of modifying the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 that binds to the cell wall and the bound sugar chain on the surface of the cell wall with pyruvate (that is, the cell wall-pilvin). At least one function of the acid modifying enzyme 9) is suppressed or lost, or (b) the expression of at least one of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 is suppressed. There is.
  • the binding that is, the binding amount and binding force
  • the outer membrane 5 is likely to be detached from the cell wall 4 at the portion where the bond between the outer membrane 5 and the cell wall 4 is weakened.
  • the modified cyanobacteria 31 can secrete the intracellular electron transmitter 33 out of the cell and take up the extracellular electron transmitter 33 into the cell at least one of them.
  • the efficiency of extracellular electron transfer is improved. Therefore, the electron transfer body 30 according to the present embodiment improves the electron transfer efficiency with the outside.
  • the type of cyanobacteria (hereinafter referred to as parent cyanobacteria) before the expression of the channel protein (that is, the organic channel protein 18) that improves the protein permeability of the membrane 5 is not particularly limited, and any type of cyanobacteria can be used. There may be.
  • the parent cyanobacteria may be of the genus Synechococcus, Synechococcus, Anabaena, or Thermosynechococcus, among which Synechococcus sp. PCC 6803, Synechococcus sp. PCC 7942, or Thermosynechococcus elongatus BP-1. May be good.
  • the nucleotide sequences of the genes encoding these binding-related proteins and the positions of the genes on the chromosomal DNA or plasmid can be confirmed in the NCBI database and Cyanobase described above.
  • the protein involved in the binding between the outer membrane and the cell wall whose function is suppressed or lost in the modified cyanobacteria 31 in the present embodiment is that of any parent cyanobacteria as long as it is possessed by the parent cyanobacteria. They may be, and are not limited by the location of the genes encoding them (eg, on chromosomal DNA or plasmids).
  • the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be Slr1841, Slr1908, Slr0042, etc. when the parent cyanobacteria belongs to the genus Synchocystis, or NIES970_09470 or the like when the parent cyanobacteria belongs to the genus Synechococcus.
  • the parent cyanobacteria belongs to the genus Anabaena, it may be Anacy_5815 or Anacy_3458, etc.
  • the parent cyanobacteria belongs to the genus Microcystis it may be A0A0F6U6F8_MICAE, etc.
  • the parent cyanobacteria belongs to the genus Leptolyngbya, it may be A0A1Q8ZE23_9CYAN, etc., if the parent cyanobacteria belongs to the genus Calothrix, it may be A0A1Z4R6U0_9CYAN, and if the parent cyanobacteria belongs to the genus Nostoc, it may be A0A1C0VG86_9NOSO.
  • the parent cyanobacteria belongs to the genus Crocosphaera, it may be B1WRN6_CROS5 or the like, and if the parent cyanobacteria belongs to the genus Pleurocapsa, it may be K9TAE4_9CYAN or the like.
  • the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 is, for example, Slr1841 (SEQ ID NO: 1) of Synechococcus sp. PCC 6803, NIES970_09470 (SEQ ID NO: 2) of Synechococcus sp. NIES-970, or Anabaena cylindrica PCC. It may be Anacy_3458 (SEQ ID NO: 3) of 7122 or the like. Further, it may be a protein having an amino acid sequence of 50% or more identical to these SLH domain-retaining outer membrane proteins 6.
  • any SLH domain-retaining outer membrane protein 6 shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 above, or any of these SLH domain-retaining outer membrane proteins 6 and The function of the protein having the same amino acid sequence of 50% or more may be suppressed or lost, and (b) any SLH domain-retaining outer membrane protein 6 shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 above, or any of these.
  • the expression of a protein having an amino acid sequence that is 50% or more identical to that of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be suppressed.
  • the modified cyanobacteria 31 (a) the function of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 or the protein having the same function as the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 in the outer membrane 5 is suppressed or lost, or , (B) The expression level of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 or the protein having the same function as the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 in the outer membrane 5 is reduced.
  • the binding domain for example, SLH domain 7
  • the electron transfer body 30 improves the electron transfer efficiency with the outside.
  • the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 whose function is suppressed or lost includes, for example, 40% of the amino acid sequence of any of the SLH domain-retaining outer membrane proteins shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 above.
  • the cell wall 4 comprises an amino acid sequence having an identity of preferably 50% or more, more preferably 60% or more, further preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more. It may be a protein or polypeptide having a function of binding to the covalent bond type sugar chain 3.
  • the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be Slr0688 or the like when the parent cyanobacteria belongs to the genus Synchocystis, or may be Syn7502_03092 or Synpcc7942_1529 or the like when the parent cyanobacteria belongs to the genus Synechococcus.
  • the cyanobacteria belongs to the genus Anabaena, it may be ANA_C20348 or Anacy_1623, etc.
  • the parent cyanobacteria belongs to the genus Microcystis, it may be CsaB (NCBI access ID: TRU80220), etc.
  • the parent cyanobacteria belongs to the genus Cyanothese.
  • it may be CsaB (NCBI access ID: WP_107667006.1) or the like
  • the parent cyanobacteria belongs to the genus Spirulina
  • it may be CsaB (NCBI access ID: WP_026079530.1) or the like.
  • CsaB NCBI access ID: WP_096658142.1
  • the parent cyanobacteria is of the genus Nostoc
  • it may be CsaB (NCBI access ID: WP_099068528.1) or the like.
  • the parent cyanobacteria belongs to the genus Crocosphaera, it may be CsaB (NCBI access ID: WP_012361697.1), etc.
  • the parent cyanobacteria belongs to the genus Pleurocapsa it may be CsaB (NCBI access ID: WP_036798735), etc. May be good.
  • the cell wall-pyruvic acid modifying enzyme 9 is, for example, Slr0688 (SEQ ID NO: 4) of Synechococcus sp. PCC 6803, Synpcc 7942_1529 (SEQ ID NO: 5) of Synechococcus sp. PCC 7942, or Anabaena cylindrica PCC 7122. It may be Anacy_1623 (SEQ ID NO: 6) or the like. Further, it may be a protein having an amino acid sequence of 50% or more identical to these cell wall-pyruvic acid modifying enzymes 9.
  • any cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 shown in SEQ ID NOs: 4 to 6 above, or any of these cell walls-pyruvate modifying enzyme 9 and an amino acid sequence The function of the protein is suppressed or lost by 50% or more, or (b) any cell wall shown in SEQ ID NOs: 4 to 6 above-the cell wall of pyruvate modifying enzyme 9 or any of these. -Expression of a protein having an amino acid sequence 50% or more identical to that of pyruvate modifying enzyme 9 is suppressed.
  • the function of (a) cell wall-pyruvic acid modifying enzyme 9 or a protein having a function equivalent to that enzyme is suppressed or lost, or (b) cell wall-pyruvic acid modifying enzyme 9 or The expression level of a protein having the same function as that of the enzyme is reduced.
  • the covalently bound sugar chain 3 on the surface of the cell wall 4 is less likely to be modified with pyruvic acid, so that the sugar chain 3 of the cell wall 4 becomes the SLH domain 7 of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 in the outer membrane 5.
  • the amount of binding and the binding force are reduced.
  • the electron transfer body 30 improves the electron transfer efficiency with the outside.
  • the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 whose function is suppressed or lost includes, for example, 40% or more of the amino acid sequence of any of the cell wall-pyruvate modifying enzymes 9 shown in SEQ ID NOs: 4 to 6 above.
  • Peptidoglycan consisting of an amino acid sequence having an amino acid sequence of preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and having cell wall 4 peptide glycan. It may be a protein or polypeptide having a function of catalyzing a reaction of modifying the covalent sugar chain 3 of 2 with pyruvate.
  • suppressing or losing the function of SLH domain-retaining outer membrane protein 6 means suppressing or losing the ability of the protein to bind to the cell wall 4, and to the outer membrane 5 of the protein.
  • the transport of the protein is suppressed or lost, or the ability of the protein to implant and function in the outer membrane 5 is suppressed or lost.
  • suppressing or losing the function of the cell wall-pyruvic acid modifying enzyme 9 means that the protein suppresses or loses the function of modifying the covalent sugar chain 3 of the cell wall 4 with pyruvic acid.
  • the means for suppressing or losing the function of these proteins is not particularly limited as long as it is a means usually used for suppressing or losing the function of the protein.
  • the means include, for example, deleting or inactivating the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the gene encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9, and inhibiting the transcription of these genes. It may be to inhibit the translation of transcripts of these genes, or to administer an inhibitor that specifically inhibits these proteins.
  • the gene expressing the protein involved in the binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 may be deleted or inactivated.
  • the modified cyanobacteria 31 of (i) above the expression of the protein involved in the binding between the cell wall 4 and the outer membrane 5 is suppressed, or the function of the protein is suppressed or lost, so that the cell wall is suppressed.
  • the bond between 4 and the outer membrane 5 (so-called bond amount and bond force) is partially reduced.
  • the outer membrane 5 is likely to be detached from the cell wall 4 at the portion where the bond between the outer membrane 5 and the cell wall 4 is weakened.
  • intracellular electrons or substances or molecules having electrons are secreted extracellularly, and extracellular electrons or substances or molecules having electrons are intracellularly secreted. Since at least one of uptake can be performed, the efficiency of extracellular electron transfer is improved. Therefore, the electron transfer body 30 according to the present embodiment improves the electron transfer efficiency with the outside.
  • the gene that expresses the protein involved in the binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 is at least one of the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the gene encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9. There may be.
  • the modified cyanobacteria 31 at least one gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the gene encoding the cell wall-pyruvic acid modifying enzyme 9 are deleted or inactivated. Therefore, in the modified cyanobacteria 31, for example, the expression of at least one of (a) SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and cell wall-pyruvic acid modifying enzyme 9 is suppressed, or (b) SLH domain-retaining outer membrane.
  • At least one function of protein 6 and cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 is suppressed or lost. Therefore, the binding (that is, the binding amount and binding force) between the SLH domain 7 of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 in the outer membrane 5 and the covalently bound sugar chain 3 on the surface of the cell wall 4 is reduced.
  • the outer membrane 5 is more likely to be detached from the cell wall 4 at the portion where the bond between the outer membrane 5 and the cell wall 4 is weakened, so that the intracellular electron or the substance or molecule having an electron is extracellular. It becomes easy to leak to. Therefore, in the electron carrier 30 according to the present embodiment, the intracellular electron or the substance or molecule having an electron in the modified cyanobacteria 31 is likely to leak out of the cell, so that the electron transfer efficiency with the outside is improved.
  • SLH domain-retaining outer membrane protein 6 is used to suppress or eliminate at least one function of SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 in cyanobacteria.
  • the encoding gene and the cell wall-the transcription of at least one of the genes encoding the pyruvate modifying enzyme 9 may be suppressed.
  • the gene encoding SLH domain-bearing outer membrane protein 6 may be slr1841, slr1908, slr0042, etc. when the parent cyanobacteria belongs to the genus Syenchocystis, or may be nies970_09470, etc. in the case of the genus Synechococcus.
  • the parent cyanobacteria belongs to the genus Anabaena, it may be anacy_5815 or anacy_3458, etc.
  • the parent cyanobacteria belongs to the genus Microcystis it may be A0A0F6U6F8_MICAE, etc.
  • the parent cyanobacteria belongs to the genus Leptolyngbya, it may be A0A1Q8ZE23_9CYAN, etc., if the parent cyanobacteria belongs to the genus Calothrix, it may be A0A1Z4R6U0_9CYAN, etc., if the parent cyanobacteria belongs to the genus Nostoc, A0A1C0VG86_9NOSO, etc.
  • the parent cyanobacteria belongs to the genus Crocosphaera, it may be B1WRN6_CROS5 or the like, and if the parent cyanobacteria belongs to the genus Pleurocapsa, it may be K9TAE4_9CYAN or the like.
  • the nucleotide sequences of these genes can be obtained from the NCBI database described above or Cyanobase.
  • genes encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 are slr1841 (SEQ ID NO: 7) of Synechococcus sp. PCC 6803, nies970_09470 (SEQ ID NO: 8) of Synechococcus sp. NIES-970, and Anabaena cylindrica PCC. It may be anacy_3458 (SEQ ID NO: 9) of 7122, or a gene whose amino acid sequence is 50% or more identical to these genes.
  • the modified cyanobacteria 31 is 50% or more identical to the gene encoding any of the SLH domain-bearing outer membrane proteins 6 shown in SEQ ID NOs: 7 to 9 above or the base sequence of any of these genes.
  • a gene is deleted or inactivated. Therefore, in the modified cyanobacteria 31, (a) expression of any of the above SLH domain-retaining outer membrane proteins 6 or a protein having a function equivalent to that of any of these proteins is suppressed, or (b) The function of any of the above SLH domain-retaining outer membrane proteins 6 or a protein having a function equivalent to that of any of these proteins is suppressed or lost.
  • the modified cyanobacteria 31 improves the extracellular electron transfer efficiency, so that the electron carrier 30 according to the present embodiment improves the electron transfer efficiency with the outside.
  • the amino acid sequence of a protein is 30% or more the same, it is said that there is a high possibility that it has the same function as the protein. Therefore, if the base sequence of the gene encoding the protein is 30% or more the same, it is considered that there is a high possibility that a protein having the same function as the protein will be expressed. Therefore, the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 whose function is suppressed or lost is, for example, any of the genes encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 shown in SEQ ID NOs: 7 to 9 above.
  • the gene encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be slr0688 or the like when the parent cyanobacteria belongs to the genus Synchocystis, or syn7502_03092 or synpcc7942_1529 or the like when the parent cyanobacteria belongs to the genus Synechococcus. If the parent cyanobacteria belongs to the genus Anabaena, it may be ana_C20348 or anacy_1623, etc., and if the parent cyanobacteria belongs to the genus Microcystis, it may be csaB (NCBI access ID: TRU80220), etc.
  • Cynahothese it may be csaB (NCBI access ID: WP_107667006.1), etc., and if the parent cyanobacteria is Spirulina, it may be csaB (NCBI access ID: WP_026079530.1), etc.
  • the parent cyanobacteria belongs to the genus Calothrix, it may be csaB (NCBI access ID: WP_096658142.1), etc.
  • the parent cyanobacteria belongs to the genus Nostoc it may be csaB (NCBI access ID: WP_099068528.1), etc.
  • the parent cyanobacteria belongs to the genus Crocosphaera, it may be csaB (NCBI access ID: WP_012361697.1), etc., and if the parent cyanobacteria belongs to the genus Pleurocapsa, csaB (NCBI access ID: WP_036798735). And so on.
  • the nucleotide sequences of these genes can be obtained from the NCBI database described above or Cyanobase.
  • the gene encoding the cell wall-pyruvic acid modifying enzyme 9 is slr0688 (SEQ ID NO: 10) of Synechococcus sp. PCC 6803, synpcc7942_1529 (SEQ ID NO: 11) of Synechococcus sp. PCC 7942, or Anabaena cylindrica PCC. It may be anacy_1623 (SEQ ID NO: 12) of 7122. Moreover, it may be a gene whose base sequence is 50% or more identical to these genes.
  • the modified cyanobacteria 31 50% with the base sequence of the gene encoding any cell wall-pyruvic acid modifying enzyme 9 shown in SEQ ID NOs: 10 to 12 above or the gene encoding any of these enzymes. The same gene is deleted or inactivated. Therefore, in the modified cyanobacteria 31, (a) expression of a protein having a function equivalent to that of any of the above cell wall-pyruvic acid modifying enzymes 9 or any of these enzymes is suppressed, or (b) the above. The function of any of the cell walls-pyruvic acid modifying enzyme 9 or a protein having a function equivalent to that of any of these enzymes is suppressed or lost.
  • the covalently bound sugar chain 3 on the surface of the cell wall 4 is less likely to be modified with pyruvic acid, so that the sugar chain 3 of the cell wall 4 becomes the SLH domain 7 of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 in the outer membrane 5.
  • the amount of binding and the binding force are reduced.
  • the amount of the covalently bound sugar chain 3 on the surface of the cell wall 4 modified with pyruvic acid is reduced, so that the binding force between the cell wall 4 and the outer membrane 5 is weakened, and the outer membrane 5 is weakened. Is more likely to partially detach from the cell wall 4.
  • the electron transfer body 30 improves the electron transfer efficiency with the outside.
  • the gene encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 whose function is suppressed or lost is, for example, any of the genes encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 shown in SEQ ID NOs: 10 to 12 above. From a base sequence having 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more identity with the base sequence. It may also be a gene encoding a protein or polypeptide having a function of catalyzing a reaction of modifying the covalent sugar chain 3 of the peptidoglycan 2 of the cell wall 4 with pyruvate.
  • expressing the organic channel protein 18 on the outer membrane 5 of the cyanobacteria means that the gene encoding the organic channel protein 18 is inserted into the chromosomal DNA or plasmid of the cyanobacteria and synthesized through transcription and translation of the gene.
  • the organic channel protein 18 is transported to the outer membrane 5 and expresses a channel function for selectively permeating the gene in the outer membrane 5 of cyanobacteria.
  • the means for inserting and expressing the gene is not particularly limited as long as it is a commonly used means, the base sequence of the promoter for transcription activation, the ribosome binding sequence for translation, and the transport to the outer membrane 5. It is not limited by the type of signal sequence for.
  • the organic channel protein 18 expressed on the outer membrane 5 of cyanobacteria may be an outer membrane channel protein derived from chloroplasts.
  • the organic channel protein 18 may be, for example, CppS (SEQ ID NO: 13) or CppF (SEQ ID NO: 14) of the gray alga Cyanophora paradoxa (hereinafter, also referred to as C. paradoxa).
  • the organic channel protein 18 may be a protein having an amino acid sequence 50% or more identical to that of CppS or CppF.
  • the protein having an amino acid sequence of 50% or more identical to CppS or CppF is not limited to a protein derived from chloroplasts, and may be, for example, a protein similar to CppS or CppF derived from a microorganism such as a bacterium.
  • CppS SEQ ID NO: 13
  • CppF SEQ ID NO: 14
  • a protein having a function equivalent to that of the organic channel protein 18 of the above is expressed. Therefore, in the modified cyanobacteria 31 of the above (ii), the protein permeability of the outer membrane 5 is improved, so that the substance permeability of the outer membrane 5 is improved.
  • the modified cyanobacteria 31 of the above (ii) secretes intracellular electrons or substances or molecules having electrons to the outside of the cell, and extracellular electrons or substances or molecules having electrons to the inside of the cell. Since at least one of uptake can be performed, the efficiency of extracellular electron transfer is improved. Therefore, the electron transfer body 30 according to the present embodiment improves the electron transfer efficiency with the outside.
  • the organic channel protein 18 includes, for example, 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more, and further, with the amino acid sequence of any of the proteins shown in SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 above.
  • the modified cyanobacteria 31 may be introduced with a gene encoding an organic channel protein 18 that improves the protein permeability of the outer membrane 5.
  • the organic channel protein 18 that improves the protein permeability of the outer membrane 5 is expressed. Therefore, in the modified cyanobacteria 31 of the above (ii), the protein permeability of the outer membrane 5 is improved, so that the substance permeability of the outer membrane 5 is improved.
  • the modified cyanobacteria 31 of the above (ii) secretes intracellular electrons or substances or molecules having electrons to the outside of the cell, and extracellular electrons or substances or molecules having electrons to the inside of the cell. Since at least one of uptake can be performed, the efficiency of extracellular electron transfer is improved. Therefore, the electron transfer body 30 according to the present embodiment improves the electron transfer efficiency with the outside.
  • the above gene may be, for example, a gene derived from a chloroplast.
  • the gene encoding the organic channel protein 18 derived from chloroplast may be, for example, cppS (SEQ ID NO: 15) or cppF (SEQ ID NO: 16) of the gray alga Cyanophora paradoxa.
  • the organic channel protein 18 may be a gene having a base sequence of 50% or more identical to any of these genes.
  • the modified cyanobacteria 31 of (ii) above a protein having a function of improving protein permeability in the outer membrane 5 or a protein having a function equivalent to the protein is expressed.
  • the protein permeability of the outer membrane 5 is improved, so that the substance permeability of the outer membrane 5 is improved.
  • the modified cyanobacteria 31 of the above (ii) secretes intracellular electrons or substances or molecules having electrons to the outside of the cell, and extracellular electrons or substances or molecules having electrons to the inside of the cell. Since at least one of uptake can be performed, the efficiency of extracellular electron transfer is improved. Therefore, the electron transfer body 30 according to the present embodiment improves the electron transfer efficiency with the outside.
  • the gene encoding the organic channel protein 18 is not limited to the chloroplast-derived gene.
  • Examples of the gene encoding the organic channel protein 18 include the base sequence of any of the above genes cppS (SEQ ID NO: 15) and cppF (SEQ ID NO: 16) and 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60. % Or more, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and a protein having a function of improving the protein permeability of the outer membrane 5.
  • it may be a gene encoding a polypeptide.
  • the electron transmitter 30 (i) suppresses or loses the function of the protein involved in the binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 in cyanobacteria, and (ii) improves the protein permeability of the outer membrane 5. It comprises the step of producing the modified cyanobacteria 31 which is at least one of the organic channel proteins 18 expressed (hereinafter referred to as the production step of the modified cyanobacteria 31).
  • the steps for producing the modified cyanobacteria 31 are (i) a step of suppressing or losing the function of a protein involved in the binding of the outer membrane 5 to the cell wall 4 in cyanobacteria, and (ii) the protein permeability of the outer membrane 5. Includes at least one step of expressing the improving organic channel protein 18.
  • the protein involved in the binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 may be, for example, at least one of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the cell wall-pyruvic acid modifying enzyme 9.
  • the means for suppressing or losing the function of the protein is not particularly limited, but for example, the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the gene encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 are deleted or deleted. Even by inactivating, inhibiting the transcription of these genes, inhibiting the translation of transcripts of these genes, or administering inhibitors that specifically inhibit these proteins, etc. Good.
  • the means for deleting or inactivating the above gene is, for example, introduction of a mutation for one or more bases on the base sequence of the relevant gene, substitution of the relevant base sequence with another base sequence, or replacement of another base sequence. It may be inserted, or part or all of the base sequence of the relevant gene may be deleted.
  • the means for inhibiting transcription of the gene is, for example, introduction of a mutation into the promoter region of the gene, inactivation of the promoter by substitution with another base sequence or insertion of another base sequence, or CRISPR interferometry (non-).
  • Patent Document 16 Yao et al., ACS Synth. Biol., 2016, 5: 207-212) and the like may be used.
  • the specific method for introducing the mutation or substituting or inserting the base sequence may be, for example, ultraviolet irradiation, site-specific mutation introduction, or homologous recombination method.
  • the means for inhibiting the translation of the transcript of the above gene may be, for example, RNA (ribonucleic acid) interferometry or the like.
  • the modified cyanobacteria 31 may be produced by suppressing or losing the function of the protein involved in the binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 in the cyanobacteria.
  • the binding between the cell wall 4 and the outer membrane 5 that is, the binding amount and the binding force
  • the outer membrane 5 is the cell wall. It becomes easy to partially separate from 4. Therefore, in the modified cyanobacteria 31, intracellular electrons or substances or molecules having electrons are likely to leak out of the cell, so that the extracellular electron transfer efficiency is improved.
  • the organic channel protein 18 that improves the protein permeability of the outer membrane 5 is, for example, a chlorophyll-derived channel protein, and specifically, CppS consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13. , CppF consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14. Further, the organic channel protein 18 may be a protein having an amino acid sequence of 50% or more identical to any of these channel proteins.
  • a gene encoding the organic channel protein 18 that improves the protein permeability of the outer membrane 5 is inserted into the chromosomal DNA or plasmid of cyanobacteria. Then, the organic channel protein 18 synthesized through transcription and translation of the gene is transported to the outer membrane 5 and expresses the channel function in the outer membrane 5 of cyanobacteria.
  • the means for inserting and expressing the gene is not particularly limited as long as it is a commonly used means, and the base sequence of the promoter for transcriptional activation, the ribosome binding sequence for translation, and the outer membrane 5 are provided. It is not limited by the type of signal sequence for transport.
  • the modified cyanobacteria 31 may be produced by expressing the organic channel protein 18 that improves the protein permeability of the outer membrane 5.
  • the protein permeability of the outer membrane 5 is improved, so that the substance permeability of the outer membrane 5 is improved.
  • the modified cyanobacteria 31 secretes intracellular electrons or substances or molecules having electrons to the outside of the cell, and takes up extracellular electrons or substances or molecules having electrons into the cells at least one of them. Therefore, the efficiency of extracellular electron transfer is improved.
  • the modified cyanobacteria 31 produced by the above method secretes intracellular electrons or substances or molecules having electrons to the outside of the cell, and intracellular electrons or substances or molecules having electrons to the cells. Since at least one of the uptake into the cell can be performed, the efficiency of extracellular electron transfer is improved. Therefore, according to the method for manufacturing the electron carrier 30 according to the present embodiment, it is possible to provide the electron carrier 30 with improved electron transfer efficiency to the outside.
  • the electron transfer method according to the present embodiment uses an electron carrier 30 containing any of the above-mentioned modified cyanobacteria 31.
  • the electron transmitter 30 suppresses or loses the function of the protein involved in the binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 in the above-mentioned (i) cyanobacteria, and (ii) improves the protein permeability of the outer membrane 5.
  • the modified cyanobacteria 31, which is at least one of the organic channel proteins 18 to be expressed, are contained, and the modified cyanobacteria 31 (I) supply electrons to the outside and (II) receive electrons from the outside. Do at least one of the uptakes.
  • the electron is an electron or a substance or molecule having an electron.
  • supplying electrons means not only supplying electrons but also supplying any substance or molecule having electrons.
  • taking in an electron means not only taking in an electron but also taking in any substance or molecule having an electron.
  • the electron carrier 30 may be a modified cyanobacteria 31 which is at least one of the above (i) and (ii), and as shown in FIG. 2, in addition to the modified cyanobacteria 31 It may contain at least one of an electron transfer substance 33, an electron mediator 35, and a conductive substance 37.
  • the modified cyanobacteria 31 supplies electrons to the outside, for example, the modified cyanobacteria 31 receives light to generate an electron or a substance or molecule having an electron.
  • the substance or molecule having electrons may be, for example, an electron transport chain 33.
  • the modified cyanobacteria 31 may release the generated electrons or substances or molecules having electrons to the outside of the outer membrane.
  • the modified cyanobacteria 31 may release a part of the electron transport chain 33 involved in the photosynthetic electron transport chain to the outside of the cell (that is, outside the outer membrane 5).
  • the electron transport chain 33 released extracellularly may be incorporated into the cells of another modified cyanobacteria 31 and participate in the generation of a bioenergy source, for example, via a plurality of other modified cyanobacteria 31.
  • the movement of electrons may occur.
  • the released electron transfer material 33 may supply electrons to the electrode by a redox reaction with the outside (for example, an external electrode).
  • the movement of electrons can be confirmed by measuring the current value.
  • an electrode is placed in a cell suspension (so-called culture solution), and an electric potential is applied from the outside, electron transfer between the cell and the electrode occurs with high efficiency. An electric current is generated.
  • the modified cyanobacteria 31 takes in electrons from the outside, for example, the modified cyanobacteria 31 takes in an electron existing outside the outer membrane or a substance or molecule having an electron inside the cell wall 4. Further, the modified cyanobacteria 31 may utilize an electron or a substance or molecule having an electron inside the cell wall 4 (in the cytoplasm). As described in the prior art, cyanobacteria generally have high photosynthetic ability and produce various organic substances in cells. Like cyanobacteria, modified cyanobacteria 31 produce various organic substances intracellularly (intracellular and thylakoids).
  • the modified cyanobacteria 31 takes in an electron or a substance or molecule having an electron (which may be a part of the electron transport chain 33) existing outside the outer membrane 5 into the cell wall 4 and takes in the cell wall. Electrons may be received from the electron transport chain 33 inside the 4 (that is, in the cytoplasm) and used for substance production. Further, the modified cyanobacteria 31 may utilize the electrons taken in from the outside for respiration (catabolism of organic matter). As described above, since the modified cyanobacteria 31 can utilize electric energy instead of light energy, the intracellular reducing power is less likely to be insufficient even in an environment where sunlight irradiation is insufficient. Therefore, the modified cyanobacteria 31 can utilize both light energy and electric energy, so that the efficiency of substance production in the cell is improved.
  • the modified cyanobacteria 31 contained in the electron carrier 30 uses electric energy instead of light energy to stably generate the energy and reducing power required in the cell, catabolize the substance, and the like. , Can produce substances.
  • the electron carrier 30 since the electron carrier 30 according to the present embodiment contains the modified cyanobacteria 31 having improved extracellular electron transfer efficiency, it efficiently donates electrons to the outside (for example, an external electrode) and electrons from the outside. Can be efficiently received. Therefore, for example, when the electron carrier 30 is used, the modified cyanobacteria 31 contained in the electron carrier 30 releases the intracellular electron transfer substance to the outside of the cell, thereby efficiently supplying electrons to, for example, an external electrode. It can generate an electric current.
  • modified cyanobacteria in which the outer membrane of the cyanobacteria is partially detached from the cell wall by (i) suppressing or abolishing the function of the protein related to the binding between the outer membrane and the cell wall in the cyanobacteria. It was prepared (Examples 1 and 2), and (ii) modified cyanobacteria having improved material permeability of the outer membrane were prepared by expressing a channel protein that improves protein permeability in the outer membrane (Example). 3). Whether or not these three types of modified cyanobacteria secrete the intracellular electron transmitter 33 to supply electrons to the outside and to take up electrons from the outside of the cell into the cell at least one of them.
  • the evaluation was performed by quantifying and identifying the proteins secreted extracellularly by these modified cyanobacteria, and measuring the intracellular current value generated by photosynthesis.
  • cyanobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 (hereinafter, simply referred to as "cyanobacteria").
  • Example 1 In Example 1, a modified cyanobacteria in which the expression of the slr1841 gene (SEQ ID NO: 7) encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein was suppressed was produced.
  • a cyanobacterial modified strain in which the expression of the slr1841 gene was suppressed As a gene suppression method, a CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) interferometry was used. In this method, the gene encoding the dCas9 protein (hereinafter referred to as the dCas9 gene) and the slr1841_sgRNA (single-guide Ribonucleic Acid) gene are introduced into the chromosomal DNA of cyanobacteria to introduce the slr1841 gene (SEQ ID NO: 7). Expression can be suppressed.
  • CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat
  • the mechanism of gene expression suppression by this method is as follows.
  • a Cas9 protein lacking nuclease activity and an sgRNA (slr1841__sgRNA) that complementarily binds to the base sequence of the slr1841 gene (SEQ ID NO: 7) form a complex.
  • this complex recognizes the slr1841 gene on the chromosomal DNA of cyanobacteria and specifically binds to the slr1841 gene.
  • this binding becomes steric hindrance, transcription of the slr1841 gene is inhibited.
  • the expression of the cyanobacterial slr1841 gene is suppressed.
  • the above three genes are inserted into the psbA1 gene on the chromosomal DNA in a linked state, they can be amplified as one DNA fragment by the PCR method.
  • the obtained DNA fragment is referred to as "psbA1 :: dCas9 cassette".
  • the psbA1 :: dCas9 cassette was inserted into the pUC19 plasmid to obtain the pUC19-dCas9 plasmid.
  • Transformed cells were selected by growing on BG-11 agar medium containing 20 ⁇ g / mL spectinomycin. In the selected cells, homologous recombination occurs between the psbA1 gene on the chromosomal DNA and the psbA1 upstream fragment region and the psbA1 downstream fragment region on the pUC19-dCas9 plasmid.
  • a Synechocystis dCas9 strain in which a dCas9 cassette was inserted into the psbA1 gene region was obtained.
  • the composition of the BG-11 medium used is as shown in Table 2.
  • sgRNA specifically binds to the target gene by introducing a sequence of about 20 bases complementary to the target sequence into the region called protospacer on the sgRNA gene. To do.
  • the protospacer sequences used in this example are shown in Table 3.
  • the sgRNA gene (excluding the protospacer region) and the kanamycin resistance marker gene are linked and inserted into the slr2030-slr2031 gene on the chromosomal DNA. Therefore, by adding a protospacer sequence (SEQ ID NO: 33) complementary to the slr1841 gene (SEQ ID NO: 7) to the primer used when amplifying the sgRNA gene by the PCR method, an sgRNA that specifically recognizes slr1841 (SEQ ID NO: 33) slr1841_sgRNA) can be easily obtained.
  • amplification by the PCR method using the primers slr2030-Fw (SEQ ID NO: 19) and slr2031-Rv (SEQ ID NO: 22) shown in Table 1 was carried out to obtain ((SEQ ID NO: 19).
  • a DNA fragment (slr2030-2031 :: slr1841_sgRNA) was obtained in which i) slr2030 gene fragment, (ii) slr1841_sgRNA, (iii) kanamycin resistance marker gene, and (iv) slr2031 gene fragment were linked in this order.
  • slr2030-2031 Using the In-Fusion PCR cloning method (registered trademark), slr2030-2031 :: slr1841_sgRNA was inserted into the pUC19 plasmid to obtain the pUC19-slr1841_sgRNA plasmid.
  • the pUC19-slr1841_sgRNA plasmid was introduced into Synechocystis dCas9 strain by the same method as in (1-1) above, and transformed cells were selected on BG-11 agar medium containing 30 ⁇ g / mL kanamycin.
  • a transformant Synechocystis dCas9 slr1841_sgRNA strain (hereinafter, also referred to as slr1841 inhibitory strain) in which slr1841_sgRNA was inserted into the slr2030-slr2031 gene on the chromosomal DNA was obtained.
  • Example 2 a modified cyanobacteria in which the expression of the slr0688 gene encoding the cell wall-pyruvic acid modifying enzyme was suppressed was obtained by the following procedure.
  • In-Fusion PCR was used and DNA fragments (slr2030-2031 :: slr0688_sgRNA) in which (i) slr2030 gene fragment, (ii) slr0688_sgRNA, (iii) canamycin resistance marker gene, and (iv) slr2031 gene fragment were linked in order.
  • Comparative Example 1 a Synechocystis dCas9 strain was obtained by the same procedure as in (1-1) of Example 1.
  • Example 1 Subsequently, the state of the cell surface was observed for each of the strains obtained in Example 1, Example 2, and Comparative Example 1. The details will be described below.
  • Example 3 (3-1) Culturing of strains
  • the cells were shake-cultured for 5 days under the conditions of s and 30 ° C.
  • the slr0688-suppressed strain of Example 2 and the Control strain of Comparative Example 1 were also cultured under the same conditions as in Example 1.
  • the cells in the resin were sliced to a thickness of 70 nm using an ultramicrotome (Ultracut) to prepare ultrathin sections.
  • This ultrathin section was stained with 2% uranium acetate and 1% lead citrate solution to prepare a transmission electron microscope sample of the slr1841 inhibitor strain of Example 1.
  • the same operation was performed for the slr0688-suppressed strain of Example 2 and the Control strain of Comparative Example 1, and samples for a transmission electron microscope were prepared.
  • FIG. 3 is a TEM (Transmission Electron Microscope) image of the slr1841 inhibitory strain of Example 1.
  • FIG. 4 is an enlarged image of the broken line region A of FIG.
  • FIG. 4A is an enlarged TEM image of the broken line region A of FIG. 3
  • FIG. 4B is a diagram depicting an enlarged TEM image of FIG. 4A.
  • the adventitia was partially exfoliated from the cell wall (that is, the adventitia was partially exfoliated) and the adventitia was partially flexed. There was.
  • the outer membrane was partially peeled off as shown in FIGS. 4 (a) and 4 (b).
  • the parts one-dot dashed line areas a1 and a2 in the figure
  • a portion where the outer membrane was greatly bent could be confirmed near the one-dot dashed line region a1.
  • This part is a part where the bond between the outer membrane and the cell wall is weakened, and it is considered that the outer membrane is expanded outward and bent because the culture solution permeated into the periplasm from the outer membrane.
  • FIG. 5 is a TEM image of the slr0688 inhibitory strain of Example 2.
  • FIG. 6 is an enlarged image of the broken line region B of FIG.
  • FIG. 6A is an enlarged TEM image of the broken line region B of FIG. 5
  • FIG. 6B is a diagram depicting an enlarged TEM image of FIG. 6A.
  • FIG. 7 is a TEM image of the Control strain of Comparative Example 1.
  • FIG. 8 is an enlarged image of the broken line region C of FIG. 7.
  • FIG. 8A is an enlarged TEM image of the broken line region C of FIG. 7, and
  • FIG. 8B is a diagram depicting an enlarged TEM image of FIG. 8A.
  • the cell surface layer of the Control strain of Comparative Example 1 was in order, and the inner membrane, the cell wall, the outer membrane, and the S layer were kept laminated in this order. That is, in the Control strain, the portion where the outer membrane was detached from the cell wall, the portion where the outer membrane was detached from the cell wall (that is, peeled off), and the portion where the outer membrane was bent as in Examples 1 and 2 were I could't see it.
  • Example 3 the Synechocystis cppS tetR strain (hereinafter, cppS introduced) in which the chloroplast outer membrane channel protein CppS (SEQ ID NO: 13) retained by the gray alga Cyanophora paradoxa was introduced into the outer membrane of cyanobacteria by the following procedure. Also called a stock).
  • slr2031-Rv SEQ ID NO: 22
  • amplification was performed by PCR to obtain PL22 and KmR.
  • these are inserted into the slr2030-slr2031 gene on the chromosome and are present. Therefore, when amplified by the PCR method using the above four primers, the slr2030 gene fragment is located on the 5'end side of PL22. Is amplified in a linked form, and the slr2031 gene fragment is amplified in a linked form on the 3'terminal side of KmR.
  • amplification is performed by the PCR method using the four primers (SEQ ID NOs: 19, 22, 27, 28) shown in Table 1.
  • a gene cassette (slr2030-2031 :: slr0042-KmR cassette) in which the slr2030 gene fragment, PL22, slr0042 gene, KmR, and slr2031 gene fragment were sequentially linked was obtained from the 5'terminal side.
  • the slr2030-2031 :: slr0042-KmR cassette was inserted into the pUC19 plasmid to obtain the pUC19-slr0042 plasmid.
  • total cDNA was prepared from the gray alga C. paradoxa NIES-547 using the SMART cDNA library synthesis kit (Clontech).
  • amplification was performed by PCR using the primers cppS-Fw (SEQ ID NO: 29) and cppS-Rv (SEQ ID NO: 30) shown in Table 1 to obtain the cppS gene (SEQ ID NO: 13).
  • the cppS gene SEQ ID NO: 13
  • the cppS gene was inserted into the pUC19-slr0042 plasmid to obtain the pUC19-CppS plasmid.
  • the cppS gene is inserted in a form linked to the 3'end side of the outer membrane transfer signal sequence of the slr0042 gene, and the region other than the outer membrane transfer signal sequence of the slr0042 gene is replaced with the coding region of cppS. Is removed with.
  • amplification was performed by the PCR method to obtain a tetR gene and a spectinomycin resistance marker gene (SpcR) as a marker for gene transfer.
  • SpcR spectinomycin resistance marker gene
  • the upstream fragment of the psbA1 gene is linked to the 5'end side of the tetR gene. It is amplified in the form that the downstream fragment of the psbA1 gene is linked to the 3'terminal side of SpcR.
  • amplification by PCR using the primers psbA1-Fw (SEQ ID NO: 17) and psbA1-Rv (SEQ ID NO: 18) shown in Table 1 is used to 5'.
  • a gene cassette (psbA1 :: tetR cassette) in which the upstream fragment of the psbA1 gene, tetR, SpcR, and the downstream fragment of the psbA1 gene were linked in this order was obtained.
  • the psbA1 :: tetR cassette cassette was inserted into the pUC19 plasmid to obtain the pUC19-tetR plasmid.
  • the amount (hereinafter, also referred to as the amount of secreted protein) was measured.
  • the secretory productivity of each of the above strains was evaluated based on the amount of protein in the culture medium.
  • the protein secretory productivity refers to the ability to produce a protein by secreting the protein produced inside the cell extracellularly.
  • Example 1 Culturing of strain The slr1841 inhibitory strain of Example 1 was cultured in the same manner as in (3-1) above. The culture was independently performed 3 times. The strains of Example 2, Example 3 and Comparative Example 1 were also cultured under the same conditions as those of Example 1.
  • the slr1841 inhibitory strain of Example 1 As shown in FIG. 9, the slr1841 inhibitory strain of Example 1, the slr0688 inhibitory strain of Example 2, and the cppS-introduced strain of Example 3 were all culture supernatants as compared with the Control strain of Comparative Example 1.
  • the amount of protein secreted inside (mg / L) was improved about 25 times.
  • Example 1 when the absorbance (730 nm) of the culture solution was measured and the amount of secreted protein (mg protein / g cell dry weight) per 1 g of dry cell weight was calculated, the slr1841 inhibitory strain of Example 1 was calculated. In both the slr0688-suppressed strain of Example 2 and the cppS-introduced strain of Example 3, the amount of secreted protein (mg protein / g cell dry weight) per 1 g of dry cell weight was compared with that of the Control strain of Comparative Example 1. It was improved about 36 times.
  • the amount of secreted protein (mg / L) of the slr0688 inhibitory strain of Example 2 and the gene (cppS) encoding the organic channel protein CppS were expressed on the outer membrane of cyanobacteria. Comparing with the amount of secreted protein (mg / L) of the introduced strain, the slr0688-suppressed strain of Example 2 was slightly higher (about 20 mg / L) than the cppS-introduced strain of Example 3.
  • IAA iodoacetamide
  • cysteine with a final concentration of 60 mM was added and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
  • 400 ng of trypsin was added and allowed to stand overnight at 37 ° C. to fragment the protein into peptide fragments.
  • TFA Trifluoroacetic Acid
  • the sample was dried by a centrifugal evaporator. Then, 3% acetonitrile and 0.1% formic acid were added, and the sample was dissolved using a closed ultrasonic crusher. The peptide concentration was adjusted to 200 ng / ⁇ L.
  • Table 4 shows 10 types of proteins in order from the one with the largest relative quantitative value among the identified proteins.
  • the expression of the cppS gene improved the protein permeability of the outer membrane, and the protein in the periplasm permeated the channel protein CppS to the outside of the outer membrane (that is, outside the cells). It was confirmed that it was easily secreted. Therefore, it was shown that the modified strains of Examples 1 to 3 had improved substance permeability of the outer membrane.
  • FIG. 10 is an exploded perspective view schematically showing an example of the configuration of the electrochemical measuring device 100.
  • FIG. 11 is a schematic cross-sectional view taken along the XI-XI cross-sectional line of FIG.
  • the electrochemical measuring device 100 includes a measuring unit 10 and a light irradiation unit 20.
  • the measuring unit 10 has a reaction tank 12 having a storage unit 11 for accommodating the culture solution 40 of cyanobacteria, and a first electrode installed inside the reaction tank 12 so as to be in contact with the culture solution 40 in the storage unit 11. 13, a second electrode 14 installed inside the reaction vessel 12 so as to be in contact with the culture solution 40 in the accommodating portion 11, a potentiostat 15 for controlling the potential of the first electrode 13, and the inside of the accommodating portion 11.
  • a reference electrode 16 is provided inside the reaction vessel 12 so as to be in contact with the culture solution 40 of the above.
  • the reaction tank 12 has electrical insulation and does not permeate the culture solution 40. Further, the reaction tank 12 is a material that is not corroded or damaged by the culture solution 40, and may be made of, for example, plastic or ceramic.
  • the measuring unit 10 applies, for example, a voltage between the first electrode 13 and the second electrode 14, or causes a current to flow, and measures the current or potential corresponding to the voltage or current.
  • the measuring unit 10 applies a voltage between the first electrode 13 and the second electrode 14 to measure the current.
  • the first electrode 13 is a so-called working electrode, and is an electrode that sensitively undergoes an electrochemical response to a trace amount of a substance in the culture solution 40 on the surface of the electrode.
  • the second electrode 14 is a so-called counter electrode, and is an electrode for setting a potential difference with the working electrode (first electrode 13) or for passing an electric current.
  • the first electrode 13 and the second electrode 14 are made of a conductive substance.
  • the conductive substance may be, for example, a carbon material, a conductive polymer material, a semiconductor, a metal, or the like.
  • the carbon material may be carbon nanotube, Ketjen black, glassy carbon, graphene, fullerene, carbon fiber, carbon fabric, carbon aerogel, or the like.
  • the conductive polymer material polyaniline, polyacetylene, polypyrrole, poly (3,4-ethylenedioxythiophene), poly (p-phenylene vinylene), polythiophene, poly (p-phenylene sulfide) and the like can be used. There may be.
  • the semiconductor may be silicone, germanium, indium tin oxide (ITO: Indium Tin Oxide), titanium oxide, copper oxide, silver oxide or the like.
  • the metal may be gold, platinum, silver, titanium, aluminum, tungsten, copper, iron, palladium or the like.
  • the first electrode 13 is an indium tin oxide (ITO) electrode
  • the second electrode 14 is a platinum electrode.
  • the conductive substance is not particularly limited as long as the conductive substance is not decomposed by its own oxidation reaction.
  • the reference electrode 16 is an electrode that does not react with the substance in the culture solution 40 and maintains a constant potential, and is used by the potentiostat 15 to control the potential difference between the first electrode 13 and the reference electrode 16 to be constant. Will be done.
  • the reference electrode 16 is a silver / silver chloride electrode.
  • the potentiostat 15 applies a voltage between the first electrode 13 and the second electrode 14 to control the potential between the first electrode 13 and the reference electrode 16 to a predetermined value.
  • the light irradiation unit 20 includes a light source 21 and a housing 22 that holds the light source 21.
  • the light source 21 includes, for example, one or more light emitting bodies (for example, an LED (light emission diode)) and a reflecting surface surrounding the light emitting body.
  • the light irradiation unit 20 may be arranged at a predetermined distance from the measurement unit 10 in the Z-axis plus direction.
  • FIG. 11 illustrates a configuration in which the first electrode 13, the second electrode 14, and the reference electrode 16 each have a lead-out electrode below the reaction vessel 12 (that is, in the negative direction of the Z-axis). As long as it can be electrically connected to the stat 15, it may be in a form that does not pop out from the reaction tank 12. Further, the first electrode 13, the second electrode 14 and the reference electrode 16 may each be drawn out to the side surface of the reaction vessel 12.
  • the configuration of the electrochemical measuring device 100 used is as follows.
  • First electrode 13 Indium tin oxide electrode (surface area: 3.14 cm 2 )
  • Second electrode 14 Platinum electrode Reference electrode 16: Silver / silver chloride electrode
  • Light source 21 Light source that emits white light of about 120 ⁇ mol / m 2 / s
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of measuring the current flowing when the culture solution 40 of the Control strain of Comparative Example 1 was irradiated with light.
  • the potentials of the first electrode 13 with respect to the reference electrode 16 are + 0.0V, + 0.1V, + 0.2V, + 0.25V, and +.
  • the measured current values are about + 0.0nA, about + 0.0nA, about + 0.0nA, about + 0.0nA, and about + 1.0nA. Met.
  • FIGS. 13 and 14 are diagram showing the results of measuring the current flowing when the culture solution 40 of the slr0688 inhibitory strain of Example 2 was irradiated with light.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of measuring the current flowing when the culture solution 40 of the cppS-introduced strain of Example 3 was irradiated with light.
  • the potentials of the first electrode 13 with respect to the reference electrode 16 are + 0.0V, + 0.1V, + 0.2V, + 0.25V, and In each case of + 0.3V, the measured current values (maximum after baseline correction) were about + 90nA, about + 250nA, about + 560nA, about + 750nA, and about + 1100nA.
  • the potential of the first electrode 13 with respect to the reference electrode 16 was + 0.0V, + 0.1V, + 0.2V, + 0.25V. And, in each case of + 0.3V, the measured current value (maximum value after baseline correction) is about + 10nA, about + 20nA, about + 70nA, about + 150nA, and about + 260nA. It was.
  • the current flowing in the culture solution 40 (hereinafter referred to as photocurrent) when the culture solution 40 is irradiated with light increases the potential of the first electrode 13 with respect to the reference electrode 16 to + 0.3V.
  • the culture solution 40 of the slr0688-suppressed strain of Example 2 was improved 1000 times as much as the culture solution 40 of the control strain of Comparative Example 1.
  • the photocurrent when the potential of the first electrode 13 with respect to the reference electrode 16 was controlled to be + 0.3 V was the culture solution of the control strain of Comparative Example 1. It improved about 300 times that of 40.
  • the modified cyanobacteria in the present embodiment are extracellular by partially detaching the outer membrane of the cyanobacteria from the cell wall or improving the substance permeability of the outer membrane of the cyanobacteria. It was shown that the electron transfer efficiency was improved about 300 to 1000 times.
  • the modified cyanobacteria modified to facilitate the leakage of intracellular proteins by weakening the bond between the outer membrane of the cyanobacteria and the cell wall, as in Examples 1 and 2. It is considered that the outer membrane is torn and peeled off, which makes it easier for organic substances other than proteins (for example, quinone) to leak out of the cell. Therefore, it is considered that the photocurrent was about 5 times higher than that of the modified cyanobacteria in which the protein permeability of the outer membrane of the cyanobacteria was improved as in Example 3.
  • the protein production efficiency of the modified cyanobacteria is also improved, and the modified cyanobacteria can be used repeatedly even after the protein is recovered, so that the outer membrane can be appropriately detached and peeled off. It is very beneficial in that it is.
  • the useful substance can be produced stably and efficiently by giving electric energy other than sunlight.
  • the electron carrier, the method for manufacturing the electron carrier, and the electron transfer method according to the present disclosure have been described above based on the embodiments, but the present disclosure is not limited to these embodiments. .. As long as the gist of the present disclosure is not deviated, various modifications that can be conceived by those skilled in the art are applied to the embodiment, and other forms constructed by combining some components in the embodiment are also included in the scope of the present disclosure. included.
  • an example in which the binding between the outer membrane and the cell membrane is weakened and the extracellular electron transfer efficiency is improved by suppressing or losing the function of the protein involved in the binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria is not limited to this.
  • the bond between the outer membrane and the cell wall may be weakened, or the outer membrane may be weakened.
  • the outer membrane may be weakened by adding the enzyme or the drug to the culture solution of cyanobacteria.
  • the electron carrier the method for manufacturing the electron carrier, and the electron transfer method of the present disclosure
  • electrons can be efficiently donated to the outside of the electron carrier, so that sludge or sewage can be treated and power generation can be performed. Can be done at the same time.
  • the electron carrier since the electron carrier can efficiently transfer and receive electrons from the outside, the electron carrier can utilize electric energy when the amount of sunlight is insufficient. Therefore, according to the present disclosure, it is possible to efficiently produce useful substances in the fields of food, medicine, or chemistry, soil improvement, wastewater treatment, power generation, and the like.

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Abstract

電子伝達体（３０）は、（ｉ）シアノバクテリアにおいて外膜（５）と細胞壁（４）との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失されている、及び、（ｉｉ）外膜５のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質（１８）が発現されている、の少なくとも１つである改変シアノバクテリア（３１）を含み、改変シアノバクテリア（３１）は、外部に電子を供給すること、及び、外部から電子を取り込むことの少なくとも１つを行う。

Description

電子伝達体、電子伝達体の製造方法、及び、電子伝達方法
　本開示は、改変シアノバクテリアを含む電子伝達体、電子伝達体の製造方法、及び、電子伝達方法に関する。
　微生物細胞が細胞外環境と電子伝達を行う現象を利用する技術開発が近年注目されている。例えば、グラム陰性細菌のShewanelle属又はGeobacter属の細菌は、有機物を細胞内で異化するときに生じる電子を、シトクロムなどの電子伝達機能を持つ生体分子を介して細胞外へ放出することが知られている（非特許文献１）。このような現象を、例えば汚水処理技術に導入して、有機性排水から資源の回収を実現できる生物電気化学システム（例えば、発電装置）が期待されている（特許文献１）。また、光合成により細胞内で生じる電子を微生物太陽電池として利用可能である（非特許文献３）。また、例えば、電極表面の改質（非特許文献５、及び、非特許文献６）、又は、メディエータ化合物（非特許文献７）により、シアノバクテリアと電極との間の電子伝達効率が向上することが報告されている。なお、シアノバクテリアは、細胞外電子伝達の他に、光合成により種々の有用物質（例えば、アルコール類、アルカン類、及び、脂肪酸等）を生産することも知られている（特許文献２、及び、非特許文献４）。
　一方、細胞外から微生物細胞に電子を送り込み、微生物細胞の代謝を活性化して物質生産の効率向上を狙う技術開発も進められている（例えば、非特許文献２）。
特開２０１８－１４２４０８号公報 特許第６３４１６７６号公報
J. A. Gralnick and D. K. Newman, "Extracellular respiration", Molecular Microbiology, Wiley-Blackwell, 2007, Vol.65, pp.1-11 Junling Guo et al., "Light-driven fine chemical production in yeast biohybrids", Science, American Association for the Advancement of Science, 2018, Vol.362, Issue 6416, pp.813-816 Alistair J. McCormick et al., "Photosynthetic biofilms in pure culture harness solar energy in a mediatorless bio-photovoltaic cell (BPV) system", Energy & Environmental Science, Royal Society of Chemistry, 2011, Vol.4, pp.4699-4709 Ducat DC et al., "Engineering cyanobacteria to generate high-value products", Trends in Biotechnology, Elsevier BV, 2011, Vol.29, pp.95-103 Hasan K et al., "Photo-electrochemical communication between cyanobacteria (Leptolyngbia sp.) and osmium redox polymer modified electrodes", Physical Chemistry Chemical Physics, Royal Society of Chemistry, 2014, Vol.16, pp.24676-24680 Jenny Z. Zhang et al., "Photoelectrochemistry of Photosystem II in Vitro vs in Vivo", Journal of American Chemical Society, American Chemical Society, 2018, Vol.140, pp.6-9 Nishio K et al., "Electrochemical detection of circadian redox rhythm in cyanobacterial cells via extracellular electron transfer", Plant and Cell Physiology, Japanese Society of Plant Physiologists, 2015, Vol.56, pp.1053-1058
　しかしながら、上記の従来技術では、シアノバクテリアの細胞外電子伝達効率は低く、細胞外電子伝達効率の向上が望まれている。
　そこで、本開示は、細胞外電子伝達効率が向上した改変シアノバクテリアを含むことにより、外部との電子伝達効率が向上した電子伝達体、電子伝達体の製造方法、及び、電子伝達方法を提供する。
　本開示の一態様に係る電子伝達体は、（ｉ）シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失されている、及び、（ｉｉ）前記外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質が発現されている、の少なくとも１つである改変シアノバクテリアを含み、前記改変シアノバクテリアは、外部に電子を供給すること、及び、外部から電子を取り込むことの少なくとも１つを行う。
　本開示の電子伝達体、及び、電子伝達体の製造方法によれば、外部との電子伝達効率が向上した電子伝達体を提供することができる。また、本開示の電子伝達方法によれば、電子伝達体から外部への電子の供与、及び、外部からの電子伝達体の電子の受容の少なくとも１つの効率が向上する。
図１は、シアノバクテリアの細胞表層を模式的に示した図である。 図２は、本実施の形態に係る電子伝達体の一例を示す模式図である。 図３は、実施例１の改変シアノバクテリアの超薄切片の透過型電子顕微鏡観察像である。 図４は、図３の破線領域Ａの拡大像である。 図５は、実施例２の改変シアノバクテリアの超薄切片の透過型電子顕微鏡像である。 図６は、図５の破線領域Ｂの拡大像である。 図７は、比較例１の改変シアノバクテリアの超薄切片の透過型電子顕微鏡像である。 図８は、図７の破線領域Ｃの拡大図である。 図９は、実施例１、実施例２、実施例３及び比較例１の改変シアノバクテリアの培養液中のタンパク質量（ｎ＝３、エラーバー＝ＳＤ）を示すグラフである。 図１０は、電気化学測定装置の構成の一例を概略的に示す分解斜視図である。 図１１は、図１０のＸＩ－ＸＩ断面線における概略断面図である。 図１２は、比較例１の改変シアノバクテリアの培養液に光を照射した際に流れる電流を測定した結果を示す図である。 図１３は、実施例２の改変シアノバクテリアの培養液に光を照射した際に流れる電流を測定した結果を示す図である。 図１４は、実施例３の改変シアノバクテリアの培養液に光を照射した際に流れる電流を測定した結果を示す図である。
　（本開示の基礎となった知見）
　微生物細胞が細胞外環境と電子伝達を行う現象を利用する技術開発が近年注目されている。例えば、グラム陰性細菌のShewanelle属又はGeobacter属の細菌は、有機物を細胞内で異化するときに生じる電子を、シトクロムなどの電子伝達機能を持つ生体分子を介して細胞外へ放出することが知られている（非特許文献１）。このように、微生物から放出された電子を外部電極で受容すれば、有機物を燃料とした微生物燃料電池として利用でき、例えば有機物を含む汚水処理過程に導入して発電装置として利用するなどの応用が期待されている（特許文献１）。
　一方で、細胞外から微生物細胞に向けて電子を送り込み、細胞の代謝を活性化して物質生産の効率向上を狙う技術開発も進められている。例えば、非特許文献２では、リン化インジウムのナノ粒子を酵母細胞に接着させ、当該ナノ粒子の光電変換反応で発生した電子を細胞内に取り込ませることで細胞内代謝に利用される還元力を補充し、グルコース原料からのシキミ酸生産効率を向上できることが報告されている。
　上記のように、微生物の利用は、化学燃料に依存せず、かつ、環境低負荷なエネルギー生産及び物質生産を実現できる。中でも、シアノバクテリア及び藻類などの光合成微生物は、光をエネルギー源として空気中の二酸化炭素（ＣＯ２）を原料として利用できるため、カーボンニュートラルな次世代の物質生産系として特に期待が持たれている。
　シアノバクテリア（藍色細菌又は藍藻とも呼ばれる）は、真正細菌の一群であり、光合成により水を分解して酸素を産生し、得たエネルギーにより空気中のＣＯ２を固定する。なお、シアノバクテリアは、種によっては、空気中の窒素（Ｎ２）も固定できる。また、シアノバクテリアの特性として、生育が早く光利用効率が高いことが知られており、加えてその他の藻類種と比較して遺伝子操作が容易であるため、光合成微生物の中でもシアノバクテリアの利用に関して活発な研究開発が行われている。
　例えば、シアノバクテリアが細胞外電子伝達を行う性質を利用して、光合成による水の電解時にシアノバクテリアの細胞内で発生する電子を外部電極で受容すれば、水と、シアノバクテリアと、一対の電極とを備える簡単な構成で、微生物太陽電池として利用できる（非特許文献３）。
　また、シアノバクテリアを用いた物質生産の例として、アルコール類、アルカン類、及び、脂肪酸等が報告されている（特許文献２及び非特許文献４）。シアノバクテリアは高い光合成能力を有するものの、例えば、夜間又は夕方、雨天若しくは曇天時などの弱光時に十分な光エネルギーを得ることができない。そのため、シアノバクテリアの細胞外から細胞内に電子を送り込むことができれば、夜間又は弱光時に不足する細胞内の還元力を外部から補充できるため、物質生産効率の向上につながると期待されている。
　なお、シアノバクテリアと外部電極との電子伝達効率を向上させる手段としては、電極表面の改質（非特許文献５及び非特許文献６）、及び、メディエータ化合物（非特許文献７）が報告されている。
　以上のように、シアノバクテリアの細胞外電子伝達を応用する技術開発が期待されているが、その電子伝達効率は未だ低いレベルであり、細胞外電子伝達効率をより高める技術の開発が望まれている。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、シアノバクテリアの外膜を細胞壁から部分的に脱離させる、又は、外膜の物質透過性を向上させることにより、改変シアノバクテリアが細胞と外部電極との間の電子伝達効率が向上することを見出した。より具体的には、シアノバクテリアの外膜の脱離又は物質透過性の向上により、改変シアノバクテリアが細胞内の電子伝達体を細胞外に分泌すること、及び、細胞外の電子伝達体を細胞内に取り込むことの少なくとも１つを行うことができることを見出した。これにより、改変シアノバクテリアの細胞外電子伝達効率が向上するため、改変シアノバクテリアを含む電子伝達体は、外部との電子伝達を効率良く行うことができる。
　そこで、本開示は、外部との電子伝達効率が向上した電子伝達体、及び、電子伝達体の製造方法を提供する。また、本開示は、電子伝達体から外部への電子の供与、及び、電子伝達体の外部からの電子の受容の少なくとも１つの効率が向上する電子伝達方法を提供する。
　（本開示の概要）
　本開示の一態様の概要は、以下の通りである。
　本開示の一態様に係る電子伝達体は、（ｉ）シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失されている、及び、（ｉｉ）前記外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質が発現されている、の少なくとも１つである改変シアノバクテリアを含み、前記改変シアノバクテリアは、外部に電子を供給すること、及び、外部から電子を取り込むことの少なくとも１つを行う。
　上記（ｉ）により、改変シアノバクテリアでは、細胞壁と外膜との結合（例えば、結合量及び結合力）が部分的に低減するため、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなる。そのため、細胞内で生成した電子又は電子を有する物質若しくは分子が外膜の外、つまり、細胞外に漏出しやすくなる。また、上記（ｉｉ）により、改変シアノバクテリアでは、外膜のタンパク質透過性が向上するため、外膜の物質透過性が向上する。これにより、改変シアノバクテリアは、細胞内で生成した電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞外に分泌すること、及び、細胞外の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞内に取り込むこと、の少なくとも１つを行うことができる。そのため、改変シアノバクテリアでは、細胞外電子伝達効率が向上する。したがって、本開示の一態様に係る電子伝達体は、外部との電子伝達効率が向上する。
　なお、外部とは、電子伝達体と別の個体として存在する物質又は分子であり、例えば、物質間の電子の移動に関わる酸化還元物質、又は、酸化還元反応基を有する分子などである。
　例えば、本開示の一態様に係る電子伝達体では、前記改変シアノバクテリアは、光を受けて電子を生成し、生成した前記電子を前記外膜の外に放出してもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアは光を受けると細胞の外に電子又は電子を有する物質若しくは分子を放出する。そのため、本開示の一態様に係る電子伝達体は、光を照射されると内部で電子を生成し、外部に電子又は電子を有する物質若しくは分子を供給することができる。
　例えば、本開示の一態様に係る電子伝達体では、前記改変シアノバクテリアは、前記外膜の外側に存在する電子を前記細胞壁の内側に取り込み、前記細胞壁の内側で前記電子を利用してもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアは、細胞外に存在する電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞内（細胞質内）に取り込んで、例えば、光合成電子伝達系を流れる過程の中でエネルギー（ＡＴＰ：adenosine triphosphate）を生成する。そして、改変シアノバクテリアは、このエネルギーを利用して二酸化炭素を基に有機物を産生する。そのため、本開示の一態様に係る電子伝達体は、外部から内部に電子を取り込んでエネルギーを生成し、タンパク質などの有機物を産生することができる。
　例えば、本開示の一態様に係る電子伝達体では、前記（ｉ）において、前記外膜と前記細胞壁との結合に関与するタンパク質は、ＳＬＨ（Surface Layer Homology）ドメイン保持型外膜タンパク質、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つであってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ａ）細胞壁と結合するＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質及び細胞壁の表面の結合糖鎖をピルビン酸修飾する反応を触媒する酵素（つまり、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素）の少なくとも１つの機能が抑制若しくは喪失されている、又は、（ｂ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つの発現が抑制されている。そのため、外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質のＳＬＨドメインと、細胞壁の表面の共有結合型の糖鎖との結合（つまり、結合量及び結合力）が低減する。その結果、外膜と細胞壁との結合が弱まった部分において外膜が細胞壁から脱離しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリアは、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞外に分泌すること、及び、細胞外の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞内に取り込むことの少なくとも１つを行うことができるため、細胞外電子伝達効率が向上する。したがって、本開示の一態様に係る電子伝達体は、外部との電子伝達効率が向上する。
　例えば、本開示の一態様に係る電子伝達体では、前記ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるSlr1841、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるNIES970_09470、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるAnacy_3458、または、これらのいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ａ）上記の配列番号１～３で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質又はこれらのいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の機能が抑制若しくは喪失されている、又は、（ｂ）上記の配列番号１～３で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質又はこれらのいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の発現が抑制されている。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ａ）外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質若しくはＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制若しくは喪失される、又は、（ｂ）外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質若しくはＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質と同等の機能を有するタンパク質の発現量が低減する。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜の結合ドメイン（例えばＳＬＨドメイン）が細胞壁と結合する結合量及び結合力が低減するため、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなる。したがって、本開示の一態様に係る電子伝達体は、外部との電子伝達効率が向上する。
　例えば、本開示の一態様に係る電子伝達体では、前記細胞壁－ピルビン酸修飾酵素は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるSlr0688、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるSynpcc7942_1529、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるAnacy_1623、又は、これらのいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ａ）上記の配列番号４～６で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素若しくはこれらのいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の機能が抑制又は喪失されている、又は、（ｂ）上記の配列番号４～６で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素若しくはこれらのいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の発現が抑制されている。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ａ）細胞壁－ピルビン酸修飾酵素又は当該酵素と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制若しくは喪失される、又は、（ｂ）細胞壁－ピルビン酸修飾酵素又は当該酵素と同等の機能を有するタンパク質の発現量が低減する。これにより、細胞壁の表面の共有結合型の糖鎖がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁の糖鎖が外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質のＳＬＨドメインと結合する結合量及び結合力が低減する。その結果、改変シアノバクテリアでは、細胞壁の表面の共有結合型の糖鎖がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁と外膜との結合力が弱まり、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなる。したがって、本開示の一態様に係る電子伝達体は、外部との電子伝達効率が向上する。
　例えば、本開示の一態様に係る電子伝達体では、前記（ｉ）において、前記外膜と前記細胞壁との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子が欠失又は不活性化されていてもよい。
　これにより、上記（ｉ）の改変シアノバクテリアでは、細胞壁と外膜との結合に関与するタンパク質の発現が抑制されるため、又は、当該タンパク質の機能が抑制若しくは喪失されるため、細胞壁と外膜との結合（いわゆる、結合量及び結合力）が部分的に低減する。その結果、外膜と細胞壁との結合が弱まった部分において外膜が細胞壁から脱離しやすくなる。これにより、上記（ｉ）の改変シアノバクテリアでは、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞外に分泌すること、及び、細胞外の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞内に取り込むことの少なくとも１つを行うことができるため、細胞外電子伝達効率が向上する。したがって、本開示の一態様に係る電子伝達体は、外部との電子伝達効率が向上する。
　例えば、本開示の一態様に係る電子伝達体では、前記外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子は、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つであってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている。そのため、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ａ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つの発現が抑制される、又は、（ｂ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つの機能が抑制若しくは喪失される。そのため、外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質のＳＬＨドメインと、細胞壁の表面の共有結合型の糖鎖との結合（つまり、結合量及び結合力）が低減する。これにより、改変シアノバクテリアでは、外膜と細胞壁との結合が弱まった部分において外膜が細胞壁から脱離しやすくなるため、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子が細胞外に漏出しやすくなる。したがって、本開示の一態様に係る電子伝達体は、改変シアノバクテリアにおいて細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子が細胞外に漏出しやすくなるため、外部との電子伝達効率が向上する。
　本開示の一態様に係る電子伝達体は、前記ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号７で示される塩基配列からなるslr1841、配列番号８で示される塩基配列からなるnies970_09470、配列番号９で示される塩基配列からなるanacy_3458、又は、これらのいずれかの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、上記の配列番号７～９で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子又はこれらのいずれかの遺伝子の塩基配列と５０％以上同一である遺伝子が欠失又は不活性化される。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ａ）上記のいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質若しくはこれらのいずれかのタンパク質と同等の機能を有するタンパク質の発現が抑制される、又は、（ｂ）上記のいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質若しくはこれらのいずれかのタンパク質と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制若しくは喪失される。そのため、改変シアノバクテリアでは、外膜が細胞壁と結合するための結合ドメイン（例えばＳＬＨドメイン）が細胞壁と結合する結合量及び結合力が低減する。その結果、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなるため、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子が細胞外に漏出しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリアは、細胞外電子伝達効率が向上するため、本開示の一態様に係る電子伝達体は、外部との電子伝達効率が向上する。
　例えば、本開示の一態様に係る電子伝達体では、前記細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子は、配列番号１０で示される塩基配列からなるslr0688、配列番号１１で示される塩基配列からなるsynpcc7942_1529、配列番号１２で示される塩基配列からなるanacy_1623、又は、これらのいずれかの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、上記の配列番号１０～１２で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子又はこれらのいずれかの酵素をコードする遺伝子の塩基配列と５０％以上同一である遺伝子が欠失又は不活性化される。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ａ）上記のいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素若しくはこれらのいずれかの酵素と同等の機能を有するタンパク質の発現が抑制される、又は、（ｂ）上記のいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素若しくはこれらのいずれかの酵素と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制若しくは喪失される。これにより、細胞壁の表面の共有結合型の糖鎖がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁の糖鎖が外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質のＳＬＨドメインと結合する結合量及び結合力が低減する。その結果、改変シアノバクテリアでは、細胞壁の表面の共有結合型の糖鎖がピルビン酸で修飾される量が低減するため、細胞壁と外膜との結合力が弱まり、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリアでは、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子が細胞外に漏出しやすくなるため、細胞外電子伝達効率が向上する。したがって、本開示の一態様に係る電子伝達体では、外部との電子伝達効率が向上する。
　例えば、本開示の一態様に係る電子伝達体では、前記（ｉｉ）において、前記外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質は、配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるCppS、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるCppF、又は、これらのいずれかのチャネルタンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
　これにより、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリアでは、外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質であるCppS（配列番号１３）又はCppF（配列番号１４）、若しくは、これらのいずれかのチャネルタンパク質と同等の機能を有するタンパク質が発現される。そのため、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリアでは、外膜のタンパク質透過性が向上するため、外膜の物質透過性が向上する。その結果、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリアは、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞外に分泌すること、及び、細胞外の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞内に取り込むことの少なくとも１つを行うことができるため、細胞外電子伝達効率が向上する。したがって、本開示の一態様に係る電子伝達体は、外部との電子伝達効率が向上する。
　例えば、本開示の一態様に係る電子伝達体では、前記（ｉｉ）において、前記外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質をコードする遺伝子が導入されていてもよい。
　これにより、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリアでは、外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質が発現される。そのため、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリアでは、外膜のタンパク質透過性が向上するため、外膜の物質透過性が向上する。その結果、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリアは、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞外に分泌すること、及び、細胞外の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞内に取り込むことの少なくとも１つを行うことができるため、細胞外電子伝達効率が向上する。したがって、本開示の一態様に係る電子伝達体は、外部との電子伝達効率が向上する。
　例えば、本開示の一態様に係る電子伝達体では、前記外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質をコードする遺伝子は、葉緑体由来の遺伝子であってもよい。例えば、前記外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１５で示される塩基配列からなるcppS、配列番号１６で示される塩基酸配列からなるcppF、又は、これらのいずれかの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。
　これにより、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリアでは、上記の配列番号１５及び配列番号１６で示されるいずれかのチャネルタンパク質をコードする遺伝子又はこれらのいずれかの遺伝子の塩基配列と５０％以上同一である遺伝子が導入される。そのため、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリアでは、外膜におけるタンパク質透過性を向上させる機能を有するタンパク質又は当該タンパク質と同等の機能を有するタンパク質が発現される。これにより、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリアでは、外膜のタンパク質透過性が向上するため、外膜の物質透過性が向上する。その結果、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリアは、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞外に分泌すること、及び、細胞外の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞内に取り込むことの少なくとも１つを行うことができるため、細胞外電子伝達効率が向上する。したがって、本開示の一態様に係る電子伝達体は、外部との電子伝達効率が向上する。
　また、本開示の一態様に係る電子伝達体の製造方法は、（ｉ）シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失されている、及び、（ｉｉ）前記外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質が発現されている、の少なくとも１つである改変シアノバクテリアを製造するステップを含む。
　これにより、製造された改変シアノバクテリアは、（ｉ）細胞壁と外膜との結合が部分的に弱まるため、外膜が細胞壁から部分的に離脱しやすくなる、及び、（ｉｉ）外膜のタンパク質透過性が向上するため、外膜の物質透過性が向上する、の少なくとも１つである。そのため、改変シアノバクテリアは、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞外に分泌すること、及び、細胞外の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞内に取り込むことの少なくとも１つを行うことができる。その結果、製造された改変シアノバクテリアは、細胞外電子伝達効率が向上する。したがって、本開示の一態様に係る電子伝達体の製造方法によれば、外部との電子伝達効率が向上した電子伝達体を提供することができる。
　また、本開示の一態様に係る電子伝達方法は、上記のいずれかの電子伝達体を用いる。
　これにより、電子伝達体は、細胞外電子伝達効率が向上した改変シアノバクテリアを含むため、外部（例えば、外部電極など）に効率良く電子を供与し、外部から電子を効率良く受容することができる。そのため、電子伝達体を用いれば、電子伝達体に含まれる改変シアノバクテリアが細胞内の電子伝達物質を細胞外に放出することにより、例えば外部電極に効率良く電子を供給して電流を発生させることができる。また、例えば、電子伝達体に含まれる改変シアノバクテリアは、外部から、光エネルギーの代わりに電子を受容して、光合成又は呼吸を行うことができる。これにより、電子伝達体に含まれる改変シアノバクテリアは、細胞内でタンパク質などの有用物質を産生して細胞外に分泌することもできる。
　以下、実施の形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。
　なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的又は具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、材料、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、本開示を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
　また、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化される場合がある。
　また、以下において、数値範囲は、厳密な意味のみを表すのではなく、実質的に同等な範囲、例えば、タンパク質の量（例えば、数又は濃度等）又はその範囲を計測することなどを含む。
　また、本明細書では、菌体と細胞とは、いずれも１つのシアノバクテリアの個体を表している。
　（実施の形態）
　［１．定義］
　本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）アルゴリズムによって計算される。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）のウェブサイトで利用できるBLASTプログラムにてペアワイズ解析を行うことにより算出される。シアノバクテリア及び植物の遺伝子、並びに、これらの遺伝子がコードするタンパク質に関する情報は、例えば上述のNCBIデータベース及びCyanobase（http://genome.microbedb.jp/cyanobase/）において公開されている。これらのデータベースから、目的のタンパク質のアミノ酸配列及びそれらのタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を取得することができる。
　シアノバクテリアは、藍藻又は藍色細菌とも呼ばれ、クロロフィルで光エネルギーを捕集し、得たエネルギーで反応中心クロロフィルの電荷分離を引き起こすことで、水を電解して酸素を発生しながら光合成をおこなう原核生物の一群である。シアノバクテリアは、多様性に富んでおり、例えば、細胞形状ではSynechocystis sp. PCC 6803のような単細胞性の種及びAnabaena sp. PCC 7120のような多細胞が連なった糸状性の種がある。生育環境についても、Thermosynechococcus elongatusのような好熱性の種、Synechococcus elongatusのような海洋性の種、Synechocystisのような淡水性の種がある。また、Microcystis aeruginosaのようにガス小胞を持ち毒素を産生する種、及び、チラコイドを持たずに原形質膜に集光アンテナであるフィコビリソームと呼ばれるタンパク質を有するGloeobacter violaceusのように、独自の特徴をもつ種も多数挙げられる。
　シアノバクテリアにおいて、光合成により水が分解されるときと、光合成により合成した糖などの有機化合物を自らの栄養源として異化するときに、細胞内で電子が発生する。水の分解により発生した電子は、細胞質内の膜構造であるチラコイド膜上に存在する光合成電子伝達鎖を流れ、その過程で生体エネルギー源として利用されるプロトン駆動力を発生させ、最終的にはＮＡＤＰ＋を還元し、ＮＡＤＰＨを生成する反応に使われる。
　一方、有機化合物の異化により有機化合物から発生した電子は、細胞質膜上及びチラコイド膜上に存在する呼吸鎖を流れ、その過程で上述のプロトン駆動力を発生させ、最終的には酸素（Ｏ２）を還元し、水（Ｈ２Ｏ）を生じる反応に使われる。なお、シアノバクテリアにおいて細胞質膜とチラコイド膜とは、連結していることが示されている（非特許文献８：van de Meene et al., 2006, Arch. Microbiol., 184(5):259-270）。
　図１は、シアノバクテリアの細胞表層を模式的に示した図である。図１に示されるように、シアノバクテリアの細胞表層は、内側から順に、原形質膜（内膜１ともいう）、ペプチドグリカン２、及び細胞最外層を形成する脂質膜である外膜５で構成される。ペプチドグリカン２にはグルコサミン及びマンノサミンなどで構成される糖鎖３が共有結合しており、また、これらの共有結合型の糖鎖３にはピルビン酸が結合している（非特許文献９：Jurgens and Weckesser, 1986, J. Bacteriol., 168:568-573）。本明細書では、ペプチドグリカン２と共有結合型の糖鎖３とを含めて細胞壁４と呼ぶ。また、原形質膜（つまり、内膜１）と外膜５との間隙は、ペリプラズムと呼ばれ、タンパク質の分解又は立体構造の形成、脂質又は核酸の分解、若しくは、細胞外の栄養素の取り込み等に関与する様々な酵素が存在する。
　ペプチドグリカン２における共有結合型の糖鎖３のピルビン酸修飾反応を触媒する酵素（以下、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９という）は、グラム陽性菌であるBacillus anthracisにおいて同定され、CsaBと命名されている（非特許文献１０：Mesnage et al., 2000, EMBO J., 19:4473-4484）。ゲノム塩基配列が公開されているシアノバクテリアにおいて、多くの種がCsaBとアミノ酸配列の同一性が３０％以上となる相同タンパク質をコードする遺伝子を保持している。例としては、Synechocystis sp. PCC 6803が保持するslr0688又はSynechococcus sp. 7502が保持するsyn7502_03092などが挙げられる。
　また、シアノバクテリアの細胞壁にはＳＬＨ（Surface layer homologous）ドメイン７を保持するＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６（図中のslr1841）が結合している（非特許文献１１：Kowata et al., 2017, J. Bacteriol., 199:e00371-17）。当該外膜タンパク質と細胞壁の結合には、ペプチドグリカン結合型糖鎖がピルビン酸修飾されていることが知られている（非特許文献１２：Kojima et al., 2016, Biosci. Biotech. Biochem., 10:1954-1959）。
　チャネルタンパク質とは、所定の物質を脂質膜（例えば、外膜５）の内側から外側へ、又は、外側から内側へ選択的に透過させるための経路（すなわちチャネル）を形成する膜タンパク質のことをいう。大腸菌及びサルモネラなどの、一般的な従属栄養性のグラム陰性細菌の外膜には、糖及びアミノ酸などの比較的低分子量の栄養素を外膜の外側から内側に選択的に透過させて細胞内に取り込むための、Porinと呼ばれるチャネルタンパク質が多量に存在する（非特許文献１３：Nikaido, 2003, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67(4):593-656）。一方で、シアノバクテリアの外膜５にはPorinは存在せず、そのかわりに無機イオンのみを選択的に透過させるイオンチャネルタンパク質（例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６）が外膜５に多量に存在する。当該イオンチャネルタンパク質は、外膜５の総タンパク質の約８０％を占めている（非特許文献１１）。そのため、シアノバクテリアにおいては、遺伝子導入などの技術を用いて外膜５の性質を大きく改変しない限り、タンパク質のような高分子量の物質が外膜５を透過して細胞外（つまり、外膜５の外）に拡散することは難しい。
　植物の葉緑体は、約１５～２０億年前に、原始的な真核細胞の細胞内に共生したシアノバクテリアが起源であり、その後の進化により葉緑体へと変化した（非特許文献１４：Ponce-Toledo et al., 2017, Curr. Biol., 27(3):386-391）。最も原始的な植物とされる単細胞藻類である灰色藻が保持する葉緑体は、ペプチドグリカンを有しており、シアノバクテリアとよく似た表層構造を残している。一方で、単細胞藻類よりも進化の進んだ種子植物の葉緑体には、ペプチドグリカンは存在しない。また、シアノバクテリアの外膜タンパク質の多くは、進化の過程で、葉緑体の誕生初期には葉緑体の外膜から失われている。そのため、前述の灰色藻の葉緑体の外膜タンパク質は、シアノバクテリアの外膜タンパク質の構成と大きく異なる。例えば、シアノバクテリアの外膜５には、Slr1841（ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６）などの無機物を透過させるイオンチャネルタンパク質が多量に含まれている。当該イオンチャネルタンパク質は、外膜５の総タンパク質の約８０％を占めている。一方、灰色藻の葉緑体の外膜には、CppS及びCppFと名付けられた有機物を透過させるチャネルタンパク質（以下、有機物チャネルタンパク質１８ともいう）が外膜に多量に含まれている。当該有機物チャネルタンパク質１８は、灰色藻の葉緑体の外膜の総タンパク質の８０％以上を占める（非特許文献１５：Kojima et al., 2016, J. Biol. Chem., 291:20198-20209）。CppS及びCppFは比較的高分子量の有機物（例えば、タンパク質などの生体分子）を選択的に透過させるチャネル機能を有するチャネルタンパク質であり、植物細胞中の葉緑体の内部と植物細胞の細胞質とをつなぐ物質輸送経路として機能していると考えられている。CppS及びCppFは、灰色藻類に広く分布している。一方で、細菌においてはPlanctomycetes門に属する細菌においてのみCppS及びCppFの類似タンパク質が存在している。なお、シアノバクテリアは、CppS及びCppF並びにこれらの類似タンパク質を保持していない（非特許文献１５参照）。
　［２．電子伝達体］
　続いて、本実施の形態に係る電子伝達体について説明する。図２は、本実施の形態に係る電子伝達体３０の一例を示す模式図である。
　電子伝達体３０は、外部に電子を供給し、外部から電子を取り込む機能を有する。外部とは、電子伝達体３０と別の個体として存在する物質又は分子であり、例えば、物質間の電子の移動に関わる酸化還元物質、又は、酸化還元反応基を有する分子などである。
　ここで、電子を供給するとは、電子を供給するだけではなく、電子を有するあらゆる物質又は分子を供給することをいう。また、電子を取り込むとは、電子を取り込むだけでなく、電子を有するあらゆる物質又は分子を取り込むことをいう。
　本実施の形態に係る電子伝達体３０は、（ｉ）シアノバクテリア（後述の親シアノバクテリア）において外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失されている、及び、（ｉｉ）外膜５のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質（いわゆる、有機物チャネルタンパク質１８）が発現されている、の少なくとも１つである改変シアノバクテリア３１を含む。また、上記改変シアノバクテリア３１は、電子伝達体３０の外部に電子を供給すること、及び、外部から電子を取り込むことの少なくとも１つを行う。
　例えば、電子伝達体３０は、上記（ｉ）の改変シアノバクテリア３１であってもよく、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリア３１であってもよく、上記（ｉ）かつ（ｉｉ）の改変シアノバクテリア３１であってもよい。
　上記（ｉ）により、改変シアノバクテリア３１では、細胞壁４と外膜５との結合（例えば、結合量及び結合力）が部分的に低減するため、外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなる。そのため、改変シアノバクテリア３１の細胞内で生成した電子又は電子を有する物質若しくは分子が外膜５の外、つまり、細胞外に漏出しやすくなる。また、上記（ｉｉ）により、改変シアノバクテリア３１では、外膜５のタンパク質透過性が向上するため、外膜５の物質透過性が向上する。これにより、改変シアノバクテリア３１は、細胞内で生成した電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞外に分泌すること、及び、細胞外の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞内に取り込むこと、の少なくとも１つを行うことができる。その結果、改変シアノバクテリア３１は、細胞外電子伝達効率が向上する。したがって、本実施の形態に係る電子伝達体３０は、外部との電子伝達効率が向上する。
　なお、電子伝達体３０は、上記（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくとも１つの改変シアノバクテリア３１に加えて、電子伝達物質３３、電子メディエータ３５、及び、導電性物質３７の少なくとも１つを含んでもよい。
　例えば、図２に示されるように、電子伝達体３０は、改変シアノバクテリア３１と、電子伝達物質３３と、電子メディエータ３５と、導電性物質３７とを含んでもよい。これにより、電子伝達体３０では、改変シアノバクテリア３１の細胞外電子伝達効率がさらに向上され得る。
　ここで、電子伝達物質３３とは、電子伝達反応を担う物質であり、電子を受け取る酸化型と、電子を与える還元型の物質とを含む、いわゆる、酸化還元物質である。電子伝達物質３３は、細胞内の電子伝達系に関与する酸化還元物質であれば特に限定されず、例えば、ペプチド、タンパク質、フラビン類、キノン類、ヘム鉄、鉄硫黄クラスターなどの非ヘム鉄、又は、銅イオンなどであってもよい。
　また、電子メディエータ３５とは、電子伝達物質３３の電子伝達機能を補助する、又は、促進する物質であり、いわゆる酸化還元活性種である。電子メディエータ３５は、例えば、キノン類、フェノセン、フェリシアン化物、シトクロム類、ビオロゲン類、フェナジン類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェレドキシン類及びその誘導体等であってもよいが、電子伝達物質３３の種類に応じて適宜物質を選択してもよい。
　導電性物質３７は、当該物質内を電子が移動しやすい性質を有する物質であり、例えば、炭素系物質、導電性ポリマー、半導体及び金属からなる群より選ばれる一種以上の材料から選択してもよい。ここで、炭素系物質とは、炭素を構成成分とする物質をいう。例えば、炭素系物質は、グラファイト、活性炭素、カーボンブラックなどのカーボンパウダー、グラファイトフェルト、カーボンウール、カーボン織布などのカーボンファイバー、カーボンナノチューブ、カーボンプレート、カーボンペーパー又はカーボンディスクであってもよい。
　また、導電性ポリマーとは、導電性を有する高分子化合物の総称である。導電性ポリマーとしては、例えば、アニリン、アミノフェノール、ジアミノフェノール、ピロール、チオフェン、パラフェニレン、フルオレン、フラン、アセチレン若しくはそれらの誘導体を構成単位とする単一モノマー又は二種以上のモノマーの重合体であってもよい。より具体的には、導電性ポリマーとしては、例えば、ポリアニリン、ポリアミノフェノール、ポリジアミノフェノール、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリフラン、ポリアセチレン等であってもよい。
　また、導電性物質３７は、金属又は金属酸化物であってもよく、電流生産量をより高める観点から、タングステン、酸化タングステン、銅、銀、白金、金、ニオブ、鉄、コバルト、チタン、モリブデン、酸化モリブデン、スズ、酸化スズ、ニッケル、酸化ニッケル、若しくは、これらを含む合金、又は、その酸化物であってもよい。
　なお、これらの構成は、電子伝達体３０の設計に応じて適宜選択されてもよい。
　［３．改変シアノバクテリア］
　続いて、改変シアノバクテリア３１について説明する。本実施の形態では、改変シアノバクテリア３１は、電子伝達体３０に含まれる。
　改変シアノバクテリア３１は、例えば、光を受けて電子を生成し、生成した電子を外膜５の外に放出する。これにより、改変シアノバクテリア３１は、光を受けると細胞の外（つまり、外膜５の外）に電子又は電子を有する物質若しくは分子を放出する。そのため、電子伝達体３０は、光を受けると内部で電子を生成し、外部に電子又は電子を有する物質若しくは分子を供給することができる。
　また、改変シアノバクテリア３１は、例えば、外膜５の外側に存在する電子を細胞壁４の内側（つまり、細胞質内）に取り込み、細胞壁４の内側で電子を利用する。これにより、改変シアノバクテリア３１は、細胞外に存在する電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞内（細胞質内）に取り込んで、例えば、光合成電子伝達系を流れる過程の中でエネルギー（ＡＴＰ：adenosine triphosphate）を生成する。そして、改変シアノバクテリア３１は、このエネルギーを利用して二酸化炭素を基に有機物を産生する。そのため、電子伝達体３０は、外部から内部に電子を取り込んでエネルギーを生成し、タンパク質などの有機物を産生することができる。
　また、当該改変シアノバクテリア３１は、（ｉ）シアノバクテリアにおいて外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質（以下、結合関連タンパク質ともいう）の機能が抑制又は喪失されている、及び、（ｉｉ）外膜５のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質（いわゆる、有機物チャネルタンパク質１８）が発現されている、の少なくとも１つである。
　まず、上記（ｉ）の改変シアノバクテリア３１について説明する。
　上記（ｉ）において、外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質は、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つであってもよい。本実施の形態では、改変シアノバクテリア３１は、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つのタンパク質の機能が抑制又は喪失されている。例えば、改変シアノバクテリア３１では、（ａ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つの機能が抑制又は喪失されてもよく、（ｂ）細胞壁４と結合するＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６の発現、及び、細胞壁４の表面の結合糖鎖のピルビン酸修飾反応を触媒する酵素（つまり、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９）の発現の少なくとも１つが抑制されてもよい。
　これにより、改変シアノバクテリア３１では、例えば、（ａ）細胞壁と結合するＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁の表面の結合糖鎖をピルビン酸修飾する反応を触媒する酵素（つまり、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９）の少なくとも１つの機能が抑制若しくは喪失されている、又は、（ｂ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つの発現が抑制されている。そのため、外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質のＳＬＨドメインと、細胞壁４の表面の共有結合型の糖鎖３との結合（つまり、結合量及び結合力）が低減する。その結果、外膜５と細胞壁４との結合が弱まった部分において外膜５が細胞壁４から脱離しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリア３１は、細胞内の電子伝達物質３３を細胞外に分泌すること、及び、細胞外の電子伝達物質３３を細胞内に取り込むことの少なくとも１つを行うことができるため、細胞外電子伝達効率が向上する。したがって、本実施の形態に係る電子伝達体３０は、外部との電子伝達効率が向上する。
　本実施の形態における改変シアノバクテリア３１の親微生物となる、（ｉ）外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失される前のシアノバクテリア、又は、（ｉｉ）外膜５のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質（つまり、有機物チャネルタンパク質１８）が発現される前のシアノバクテリア（以下、親シアノバクテリアという）の種類は、特に制限されず、あらゆる種類のシアノバクテリアであってもよい。例えば、親シアノバクテリアは、Syenechocystis属、Synechococcus属、Anabaena属、又は、Thermosynechococcus属であってもよく、中でも、Synechocystis sp. PCC 6803、Synechococcus sp. PCC 7942、又は、Thermosynechococcus elongatus BP-1であってもよい。
　これらの親シアノバクテリアにおける（ｉ）外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質、及び、（ｉｉ）外膜５のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質（有機物チャネルタンパク質１８）のアミノ酸配列、それらの結合関連タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列、並びに、当該遺伝子の染色体DNA又はプラスミド上での位置は、上述のNCBIデータベース及びCyanobaseで確認することができる。
　なお、本実施の形態における改変シアノバクテリア３１において機能が抑制又は喪失される外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質は、親シアノバクテリアが保有している限り、いずれの親シアノバクテリアのものであってもよく、それらをコードする遺伝子の存在場所（例えば、染色体DNA上又はプラスミド上）により制限されるものではない。
　例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６は、親シアノバクテリアがSyenchocystis属の場合、Slr1841、Slr1908、又は、Slr0042等であってもよく、親シアノバクテリアがSynechococcus属の場合、NIES970_09470等であってもよく、親シアノバクテリアがAnabaena属の場合、Anacy_5815又はAnacy_3458等であってもよく、親シアノバクテリアがMicrocystis属の場合、A0A0F6U6F8_MICAE等であってもよく、親シアノバクテリアがCyanothese属の場合、A0A3B8XX12_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがLeptolyngbya属の場合、A0A1Q8ZE23_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがCalothrix属の場合、A0A1Z4R6U0_9CYANが挙げられ、親シアノバクテリアがNostoc属の場合、A0A1C0VG86_9NOSO等であってもよく、親シアノバクテリアがCrocosphaera属の場合、B1WRN6_CROS5等であってもよく、親シアノバクテリアがPleurocapsa属の場合、K9TAE4_9CYAN等であってもよい。
　より具体的には、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６は、例えば、Synechocystis sp. PCC 6803のSlr1841（配列番号１）、Synechococcus sp. NIES-970のNIES970_09470（配列番号２）、又は、Anabaena cylindrica PCC 7122 のAnacy_3458（配列番号３）等であってもよい。また、これらのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリア３１では、例えば、（ａ）上記の配列番号１～３で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６又はこれらのいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の機能が抑制若しくは喪失されていてもよく、（ｂ）上記の配列番号１～３で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６又はこれらのいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の発現が抑制されていてもよい。そのため、改変シアノバクテリア３１では、（ａ）外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６若しくはＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制若しくは喪失される、又は、（ｂ）外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６若しくはＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６と同等の機能を有するタンパク質の発現量が低減する。その結果、改変シアノバクテリア３１では、外膜５の結合ドメイン（例えば、ＳＬＨドメイン７）が細胞壁４と結合する結合量及び結合力が低減するため、外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなる。そのため、本実施の形態に係る電子伝達体３０は、外部との電子伝達効率が向上する。
　一般に、タンパク質のアミノ酸配列が３０％以上同一であれば、タンパク質の立体構造の相同性が高いため、当該タンパク質と同等の機能を有する可能性が高いと言われている。そのため、機能が抑制又は喪失されるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６としては、例えば、上記の配列番号１～３で示されるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６のいずれかのアミノ酸配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、細胞壁４の共有結合型の糖鎖３と結合する機能を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。
　また、例えば、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９は、親シアノバクテリアがSyenchocystis属の場合、Slr0688等であってもよく、親シアノバクテリアがSynechococcus属の場合、Syn7502_03092又はSynpcc7942_1529等であってもよく、親シアノバクテリアがAnabaena属の場合、ANA_C20348又はAnacy_1623等であってもよく、親シアノバクテリアがMicrocystis属の場合、CsaB (NCBIのアクセスID：TRU80220)等であってもよく、親シアノバクテリアがCyanothese属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_107667006.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがSpirulina属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_026079530.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがCalothrix属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_096658142.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがNostoc属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_099068528.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがCrocosphaera属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_012361697.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがPleurocapsa属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_036798735）等であってもよい。
　より具体的には、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９は、例えば、Synechocystis sp. PCC 6803のSlr0688（配列番号４）、Synechococcus sp. PCC 7942のSynpcc7942_1529（配列番号５）、又は、Anabaena cylindrica PCC 7122のAnacy_1623（配列番号６）等であってもよい。また、これらの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリア３１では、例えば、（ａ）上記の配列番号４～６で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９若しくはこれらのいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の機能が抑制若しくは喪失されている、又は、（ｂ）上記の配列番号４～６で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９若しくはこれらのいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の発現が抑制されている。そのため、改変シアノバクテリア３１では、（ａ）細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９若しくは当該酵素と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制若しくは喪失される、又は、（ｂ）細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９若しくは当該酵素と同等の機能を有するタンパク質の発現量が低減する。これにより、細胞壁４の表面の共有結合型の糖鎖３がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁４の糖鎖３が外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６のＳＬＨドメイン７と結合する結合量及び結合力が低減する。その結果、改変シアノバクテリア３１では、細胞壁４の表面の共有結合型の糖鎖３がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁４と外膜５との結合力が弱まり、外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなる。そのため、本実施の形態に係る電子伝達体３０は、外部との電子伝達効率が向上する。
　また、上述したとおり、タンパク質のアミノ酸配列が３０％以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有する可能性が高いと言われている。そのため、機能が抑制又は喪失される細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９としては、例えば、上記の配列番号４～６で示される細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９のいずれかのアミノ酸配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、細胞壁４のペプチドグリカン２の共有結合型の糖鎖３をピルビン酸で修飾する反応を触媒する機能を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。
　なお、本明細書において、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６の機能を抑制する又は喪失させるとは、当該タンパク質の細胞壁４との結合能力を抑制する若しくは喪失させること、当該タンパク質の外膜５への輸送を抑制する若しくは喪失させること、又は、当該タンパク質が外膜５に埋め込まれて機能する能力を抑制する若しくは喪失させることである。
　なお、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の機能を抑制する又は喪失するとは、当該タンパク質が細胞壁４の共有結合型の糖鎖３をピルビン酸で修飾する機能を抑制する又は喪失させることである。
　これらのタンパク質の機能を抑制する又は喪失させる手段としては、タンパク質の機能の抑制又は喪失に通常使用される手段であれば特に限定されない。当該手段は、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化させること、これらの遺伝子の転写を阻害すること、これらの遺伝子の転写産物の翻訳を阻害すること、又はこれらのタンパク質を特異的に阻害する阻害剤を投与することなどであってもよい。
　本実施の形態では、上記（ｉ）において、改変シアノバクテリア３１では、外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子が欠失又は不活性化されていてもよい。
　これにより、上記（ｉ）の改変シアノバクテリア３１では、細胞壁４と外膜５との結合に関与するタンパク質の発現が抑制されるため、又は、当該タンパク質の機能が抑制若しくは喪失されるため、細胞壁４と外膜５との結合（いわゆる、結合量及び結合力）が部分的に低減する。その結果、外膜５と細胞壁４との結合が弱まった部分において外膜５が細胞壁４から脱離しやすくなる。これにより、上記（ｉ）の改変シアノバクテリア３１では、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞外に分泌すること、及び、細胞外の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞内に取り込むことの少なくとも１つを行うことができるため、細胞外電子伝達効率が向上する。したがって、本実施の形態に係る電子伝達体３０は、外部との電子伝達効率が向上する。
　外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子は、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子の少なくとも１つであってもよい。改変シアノバクテリア３１では、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子の少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている。そのため、改変シアノバクテリア３１では、例えば、（ａ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つの発現が抑制される、又は、（ｂ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つの機能が抑制若しくは喪失される。そのため、外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６のＳＬＨドメイン７と、細胞壁４の表面の共有結合型の糖鎖３との結合（つまり、結合量及び結合力）が低減する。これにより、改変シアノバクテリア３１では、外膜５と細胞壁４との結合が弱まった部分において外膜５が細胞壁４から脱離しやすくなるため、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子が細胞外に漏出しやすくなる。したがって、本実施の形態に係る電子伝達体３０は、改変シアノバクテリア３１において細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子が細胞外に漏出しやすくなるため、外部との電子伝達効率が向上する。
　本実施の形態では、シアノバクテリアにおけるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つの機能を抑制する又は喪失させるために、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子の少なくとも１つの転写を抑制してもよい。
　例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子は、親シアノバクテリアがSyenchocystis属の場合、slr1841、slr1908、又は、slr0042等であってもよく、Synechococcus属の場合、nies970_09470等であってもよく、親シアノバクテリアがAnabaena属の場合、anacy_5815又はanacy_3458等であってもよく、親シアノバクテリアがMicrocystis属の場合、A0A0F6U6F8_MICAE等であってもよく、親シアノバクテリアがCyanothese属の場合、A0A3B8XX12_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがLeptolyngbya属の場合、A0A1Q8ZE23_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがCalothrix属の場合、A0A1Z4R6U0_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがNostoc属の場合、A0A1C0VG86_9NOSO等であってもよく、親シアノバクテリアがCrocosphaera属の場合、B1WRN6_CROS5等であってもよく、親シアノバクテリアがPleurocapsa属の場合、K9TAE4_9CYAN等であってもよい。これらの遺伝子の塩基配列は、上述したNCBIデータベース又はCyanobaseから入手できる。
　より具体的には、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子は、Synechocystis sp. PCC 6803のslr1841（配列番号７）、Synechococcus sp. NIES-970のnies970_09470（配列番号８）、Anabaena cylindrica PCC 7122 のanacy_3458（配列番号９）、又は、これらの遺伝子とアミノ酸配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリア３１では、上記の配列番号７～９で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子又はこれらのいずれかの遺伝子の塩基配列と５０％以上同一である遺伝子が欠失又は不活性化される。そのため、改変シアノバクテリア３１では、（ａ）上記のいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６若しくはこれらのいずれかのタンパク質と同等の機能を有するタンパク質の発現が抑制される、又は、（ｂ）上記のいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６若しくはこれらのいずれかのタンパク質と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制若しくは喪失される。そのため、改変シアノバクテリア３１では、外膜５が細胞壁４と結合するための結合ドメイン（例えばＳＬＨドメイン７）が細胞壁４と結合する結合量及び結合力が低減する。その結果、外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなるため、細胞内の電子伝達物質３３が細胞外に漏出しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリア３１は、細胞外電子伝達効率が向上するため、本実施の形態に係る電子伝達体３０は、外部との電子伝達効率が向上する。
　上述したように、タンパク質のアミノ酸配列が３０％以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有する可能性が高いと言われている。そのため、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列が３０％以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有するタンパク質が発現される可能性が高いと考えられる。そのため、機能が抑制又は喪失されるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子としては、例えば、上記の配列番号７～９で示されるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子のいずれかの塩基配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつ、細胞壁４の共有結合型の糖鎖３と結合する機能を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
　また、例えば、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子は、親シアノバクテリアがSyenchocystis属の場合、slr0688等であってもよく、親シアノバクテリアがSynechococcus属の場合、syn7502_03092又はsynpcc7942_1529等であってもよく、親シアノバクテリアがAnabaena属の場合、ana_C20348又はanacy_1623等であってもよく、親シアノバクテリアがMicrocystis属の場合、csaB (NCBIのアクセスID：TRU80220)等であってもよく、親シアノバクテリアがCynahothese属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_107667006.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがSpirulina属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_026079530.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがCalothrix属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_096658142.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがNostoc属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_099068528.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがCrocosphaera属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_012361697.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがPleurocapsa属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_036798735）等であってもよい。これらの遺伝子の塩基配列は、上述したNCBIデータベース又はCyanobaseから入手できる。
　より具体的には、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子は、Synechocystis sp. PCC 6803のslr0688（配列番号１０）、Synechococcus sp. PCC 7942のsynpcc7942_1529（配列番号１１）、又は、Anabaena cylindrica PCC 7122 のanacy_1623（配列番号１２）であってもよい。また、これらの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリア３１では、上記の配列番号１０～１２で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子又はこれらのいずれかの酵素をコードする遺伝子の塩基配列と５０％以上同一である遺伝子が欠失又は不活性化される。そのため、改変シアノバクテリア３１では、（ａ）上記のいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９若しくはこれらのいずれかの酵素と同等の機能を有するタンパク質の発現が抑制される、又は、（ｂ）上記のいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９若しくはこれらのいずれかの酵素と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制若しくは喪失される。これにより、細胞壁４の表面の共有結合型の糖鎖３がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁４の糖鎖３が外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６のＳＬＨドメイン７と結合する結合量及び結合力が低減する。その結果、改変シアノバクテリア３１では、細胞壁４の表面の共有結合型の糖鎖３がピルビン酸で修飾される量が低減するため、細胞壁４と外膜５との結合力が弱まり、外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリア３１では、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子が細胞外に漏出しやすくなるため、細胞外電子伝達効率が向上する。したがって、本実施の形態に係る電子伝達体３０は、外部との電子伝達効率が向上する。
　上述したように、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列が３０％以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有するタンパク質が発現される可能性が高いと考えられる。そのため、機能が抑制又は喪失される細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子としては、例えば、上記の配列番号１０～１２で示される細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子のいずれかの塩基配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、細胞壁４のペプチドグリカン２の共有結合型の糖鎖３をピルビン酸で修飾する反応を触媒する機能を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
　続いて、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリア３１について説明する。
　上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリア３１は、外膜５のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質１８が発現されている。
　ここで、有機物チャネルタンパク質１８をシアノバクテリアの外膜５に発現させるとは、有機物チャネルタンパク質１８をコードする遺伝子をシアノバクテリアの染色体DNA又はプラスミドに挿入し、当該遺伝子の転写及び翻訳を経て合成された有機物チャネルタンパク質１８が外膜５に輸送され、シアノバクテリアの外膜５においてタンパク質を選択的に透過させるチャネル機能を発現することである。当該遺伝子の挿入及び発現の手段は、通常使用される手段であれば特に限定されず、転写活性化のためのプロモーターの塩基配列及び翻訳のためのリボソーム結合配列、並びに、外膜５への輸送のためのシグナル配列の種類により制限されるものではない。
　本実施の形態では、シアノバクテリアの外膜５に発現させる有機物チャネルタンパク質１８は、葉緑体由来の外膜チャネルタンパク質であってもよい。当該有機物チャネルタンパク質１８は、例えば、灰色藻Cyanophora paradoxa（以下、C. paradoxaともいう）のCppS（配列番号１３）又はCppF（配列番号１４）などであってもよい。また、有機物チャネルタンパク質１８は、CppS又はCppFとアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。なお、CppS又はCppFとアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質は、葉緑体由来のタンパク質に限られず、例えば、細菌などの微生物由来のCppS又はCppFの類似タンパク質であってもよい。
　これにより、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリア３１では、外膜５のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質１８であるCppS（配列番号１３）又はCppF（配列番号１４）、若しくは、これらのいずれかの有機物チャネルタンパク質１８と同等の機能を有するタンパク質が発現される。そのため、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリア３１は、外膜５のタンパク質透過性が向上するため、外膜５の物質透過性が向上する。その結果、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリア３１は、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞外に分泌すること、及び、細胞外の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞内に取り込むことの少なくとも１つを行うことができるため、細胞外電子伝達効率が向上する。したがって、本実施の形態に係る電子伝達体３０は、外部との電子伝達効率が向上する。
　一般に、タンパク質のアミノ酸配列が３０％以上同一であれば、タンパク質の立体構造の相同性が高いため、当該タンパク質と同等の機能を有する可能性が高いと言われている。そのため、有機物チャネルタンパク質１８としては、例えば、上記の配列番号１３及び配列番号１４で示されるタンパク質のいずれかのアミノ酸配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、外膜５のタンパク質の透過性を向上させる機能を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。
　また、本実施の形態では、上記（ｉｉ）において、改変シアノバクテリア３１は、外膜５のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質１８をコードする遺伝子が導入されていてもよい。これにより、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリア３１では、外膜５のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質１８が発現される。そのため、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリア３１では、外膜５のタンパク質透過性が向上するため、外膜５の物質透過性が向上する。その結果、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリア３１は、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞外に分泌すること、及び、細胞外の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞内に取り込むことの少なくとも１つを行うことができるため、細胞外電子伝達効率が向上する。したがって、本実施の形態に係る電子伝達体３０は、外部との電子伝達効率が向上する。
　上記遺伝子は、例えば、葉緑体由来の遺伝子であってもよい。葉緑体由来の有機物チャネルタンパク質１８をコードする遺伝子は、例えば、灰色藻Cyanophora paradoxaのcppS（配列番号１５）又はcppF（配列番号１６）であってもよい。また、有機物チャネルタンパク質１８は、これらのいずれかの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。これにより、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリア３１では、上記の配列番号１５及び配列番号１６で示されるいずれかの有機物チャネルタンパク質１８をコードする遺伝子又はこれらのいずれかの遺伝子の塩基配列と５０％以上同一である遺伝子が導入される。そのため、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリア３１では、外膜５におけるタンパク質透過性を向上させる機能を有するタンパク質又は当該タンパク質と同等の機能を有するタンパク質が発現される。これにより、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリア３１では、外膜５のタンパク質透過性が向上するため、外膜５の物質透過性が向上する。その結果、上記（ｉｉ）の改変シアノバクテリア３１は、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞外に分泌すること、及び、細胞外の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞内に取り込むことの少なくとも１つを行うことができるため、細胞外電子伝達効率が向上する。したがって、本実施の形態に係る電子伝達体３０は、外部との電子伝達効率が向上する。
　なお、有機物チャネルタンパク質１８をコードする遺伝子としては、葉緑体由来の遺伝子に限られない。有機物チャネルタンパク質１８をコードする遺伝子としては、例えば、上記遺伝子cppS（配列番号１５）及びcppF（配列番号１６）のいずれかの塩基配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、外膜５のタンパク質透過性を向上させる機能を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
　［４．電子伝達体の製造方法］
　続いて、本実施の形態に係る電子伝達体３０の製造方法について説明する。電子伝達体３０は、（ｉ）シアノバクテリアにおいて外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失されている、及び、（ｉｉ）外膜５のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質１８が発現されている、の少なくとも１つである改変シアノバクテリア３１を製造するステップ（以下、改変シアノバクテリア３１の製造ステップという）を含む。
　以下、改変シアノバクテリア３１の製造ステップについて説明する。改変シアノバクテリア３１の製造ステップは、（ｉ）シアノバクテリアにおいて外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質の機能を抑制又は喪失させるステップ、及び、（ｉｉ）外膜５のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質１８を発現させるステップの少なくとも１つを含む。
　上記（ｉ）では、外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質は、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つであってもよい。
　なお、タンパク質の機能を抑制する又は喪失させる手段としては、特に限定されないが、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化させること、これらの遺伝子の転写を阻害すること、これらの遺伝子の転写産物の翻訳を阻害すること、又はこれらのタンパク質を特異的に阻害する阻害剤を投与することなどであってもよい。
　上記遺伝子を欠失又は不活性化させる手段は、例えば、該当遺伝子の塩基配列上の１つ以上の塩基に対する突然変異の導入、該当塩基配列に対する他の塩基配列への置換若しくは他の塩基配列の挿入、又は、該当遺伝子の塩基配列の一部若しくは全部の削除などであってもよい。
　上記遺伝子の転写を阻害する手段は、例えば、該当遺伝子のプロモーター領域に対する変異導入、他の塩基配列への置換若しくは他の塩基配列の挿入による当該プロモーターの不活性化、又は、CRISPR干渉法（非特許文献１６：Yao et al., ACS Synth. Biol., 2016, 5:207-212）等であってもよい。上記の変異導入、又は塩基配列の置換若しくは挿入の具体的な手法は、例えば、紫外線照射、部位特異的変異導入、又は、相同組換え法などであってもよい。
　また、上記遺伝子の転写産物の翻訳を阻害する手段は、例えば、ＲＮＡ（ribonucleic acid）干渉法などであってもよい。
　以上のいずれかの手段を用いることにより、シアノバクテリアにおける外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質の機能を抑制又は喪失させて、改変シアノバクテリア３１を製造してもよい。これにより、上記（ｉ）のステップで製造された改変シアノバクテリア３１は、細胞壁４と外膜５との結合（つまり、結合量及び結合力）が部分的に低減するため、外膜５が細胞壁４から部分的に離脱しやすくなる。そのため、改変シアノバクテリア３１では、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子が細胞外に漏出しやすくなるため、細胞外電子伝達効率が向上する。
　上記（ｉｉ）では、外膜５のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質１８は、例えば、葉緑体由来のチャネルタンパク質であり、具体的には、配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるCppS、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるCppFであってもよい。また、有機物チャネルタンパク質１８は、これらのいずれかのチャネルタンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
　有機物チャネルタンパク質１８を発現させるステップでは、まず、外膜５のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質１８をコードする遺伝子がシアノバクテリアの染色体DNA又はプラスミドに挿入される。そして、当該遺伝子の転写及び翻訳を経て合成された有機物チャネルタンパク質１８は、外膜５に輸送され、シアノバクテリアの外膜５においてチャネル機能を発現する。なお、遺伝子の挿入及び発現の手段は、通常使用される手段であれば特に限定されず、転写活性化のためのプロモーターの塩基配列及び翻訳のためのリボソーム結合配列、並びに、外膜５への輸送のためのシグナル配列の種類により制限されるものではない。
　以上により、外膜５のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質１８を発現させて、改変シアノバクテリア３１を製造してもよい。これにより、上記（ｉｉ）のステップで製造された改変シアノバクテリア３１は、外膜５のタンパク質透過性が向上するため、外膜５の物質透過性が向上する。その結果、改変シアノバクテリア３１は、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞外に分泌すること、及び、細胞外の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞内に取り込むことの少なくとも１つを行うことができるため、細胞外電子伝達効率が向上する。
　以上の手順で、（ｉ）シアノバクテリアにおいて外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失されている、及び、（ｉｉ）外膜５のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質１８が発現されている、の少なくとも１つである改変シアノバクテリア３１を製造してもよい。
　これにより、上記方法により製造された改変シアノバクテリア３１は、細胞内の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞外に分泌すること、及び、細胞外の電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞内に取り込むことの少なくとも１つを行うことができるため、細胞外電子伝達効率が向上する。したがって、本実施の形態に係る電子伝達体３０の製造方法によれば、外部との電子伝達効率が向上した電子伝達体３０を提供することができる。
　［５．電子伝達方法］
　本実施の形態に係る電子伝達方法は、上記のいずれかの改変シアノバクテリア３１を含む電子伝達体３０を用いる。
　電子伝達体３０は、上記の（ｉ）シアノバクテリアにおいて外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失されている、及び（ｉｉ）外膜５のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質１８が発現されている、の少なくとも１つである改変シアノバクテリア３１を含み、当該改変シアノバクテリア３１は、（Ｉ）外部に電子を供給すること、及び、（ＩＩ）外部から電子を取り込むことの少なくとも１つを行う。
　上述したように、本実施の形態では、電子は、電子又は電子を有する物質若しくは分子である。また、電子を供給するとは、電子を供給するだけではなく、電子を有するあらゆる物質又は分子を供給することをいう。また、電子を取り込むとは、電子を取り込むだけでなく、電子を有するあらゆる物質又は分子を取り込むことをいう。
　また、電子伝達体３０は、上記の（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくとも１つである改変シアノバクテリア３１であってもよく、図２に示されるように、当該改変シアノバクテリア３１に加えて、電子伝達物質３３、電子メディエータ３５、及び、導電性物質３７の少なくとも１つを含んでもよい。
　まず、上記の（Ｉ）外部に電子を供給する場合について説明する。改変シアノバクテリア３１が外部に電子を供給するとは、例えば、改変シアノバクテリア３１が光を受けて電子又は電子を有する物質若しくは分子を生成することである。電子を有する物質若しくは分子は、例えば、電子伝達物質３３であってもよい。
　また、改変シアノバクテリア３１は、生成した電子又は電子を有する物質若しくは分子を外膜の外に放出してもよい。例えば、改変シアノバクテリア３１は、光合成電子伝達鎖に関与する電子伝達物質３３の一部を細胞外（つまり、外膜５の外）に放出してもよい。細胞外に放出された電子伝達物質３３は、例えば、他の改変シアノバクテリア３１の細胞内に取り込まれて生体エネルギー源の生成に関与してもよく、他の複数の改変シアノバクテリア３１を介して電子の移動が起こってよい。そして、放出された電子伝達物質３３は、外部（例えば、外部電極）との酸化還元反応より電極に電子を供給してもよい。電子の移動は、電流値を測定することにより確認できる。例えば、改変シアノバクテリア３１を培養し、細胞懸濁液（いわゆる、培養液）中に電極を配置し外部より電位を印加すれば、細胞と電極との間の電子伝達が高効率で起こるため、電流が発生する。
　続いて、上記の（ＩＩ）外部から電子を取り込む場合について説明する。改変シアノバクテリア３１が外部から電子を取り込むとは、例えば、改変シアノバクテリア３１が外膜の外側に存在する電子又は電子を有する物質若しくは分子を細胞壁４の内側に取り込むことである。さらに、改変シアノバクテリア３１は、細胞壁４の内側（細胞質内）で電子又は電子を有する物質若しくは分子を利用してもよい。従来技術で説明したように、一般に、シアノバクテリアは、高い光合成能を有し、細胞内で様々な有機物を産生している。改変シアノバクテリア３１もシアノバクテリアと同様に、細胞内（細胞壁内及びチラコイド内）で様々な有機物を産生する。このとき、改変シアノバクテリア３１は、外膜５の外側に存在する電子又は電子を有する物質若しくは分子（なお、電子伝達物質３３の一部であってもよい）を細胞壁４の内部に取り込み、細胞壁４の内側（つまり、細胞質中）で電子伝達物質３３から電子を受容して、物質産生に利用してもよい。さらに、改変シアノバクテリア３１は、外部から取り込んだ電子を呼吸（有機物の異化）に利用してもよい。このように、改変シアノバクテリア３１は、光エネルギーの代わりに電気エネルギーを利用することができるため、太陽光の照射が不十分な環境においても、細胞内の還元力が不足しにくくなる。そのため、改変シアノバクテリア３１は、光エネルギーと電気エネルギーとの両方を利用することができるため、細胞内での物質生産効率が向上する。
　また、例えば、電子伝達体３０に含まれる改変シアノバクテリア３１は、光エネルギーの代わりに電気エネルギーを利用して、安定的に、細胞内で必要なエネルギー及び還元力の生成、物質の異化、並びに、物質の産生を行うことができる。
　以上より、本実施の形態に係る電子伝達体３０は、細胞外電子伝達効率が向上した改変シアノバクテリア３１を含むため、外部（例えば、外部電極など）に効率良く電子を供与し、外部から電子を効率良く受容することができる。そのため、例えば、電子伝達体３０を用いれば、電子伝達体３０に含まれる改変シアノバクテリア３１が細胞内の電子伝達物質を細胞外に放出することにより、例えば外部電極に効率良く電子を供給して電流を発生させることができる。
　以下、実施例にて本開示の電子伝達体、電子伝達体の製造方法及び電子伝達方法について具体的に説明するが、本開示は以下の実施例のみに何ら限定されるものではない。
　以下の実施例では、シアノバクテリアにおいて（ｉ）外膜と細胞壁との結合に関するタンパク質の機能を抑制又は喪失させることにより、シアノバクテリアの外膜を細胞壁から部分的に脱離させた改変シアノバクテリアを作製し（実施例１及び実施例２）、（ｉｉ）外膜にタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質を発現させることにより、外膜の物質透過性を向上した改変シアノバクテリアを作製した（実施例３）。これらの３種類の改変シアノバクテリアが細胞内の電子伝達物質３３を分泌し、外部に電子を供給すること、及び、細胞外から細胞内に電子を取り込むことの少なくとも１つを行うか否か、つまり、細胞と外部電極との間の細胞外電子伝達効率を向上させるか否かを評価した。評価は、これらの改変シアノバクテリアが細胞外に分泌したタンパク質の定量及び同定、並びに、光合成により発生した細胞内電流値の測定により行った。
　なお、本実施例で使用したシアノバクテリア種は、Synechocystis sp. PCC 6803（以下、単に、「シアノバクテリア」と呼ぶ）である。
　（実施例１）
　実施例１では、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードするslr1841遺伝子（配列番号７）の発現が抑制された改変シアノバクテリアを製造した。
　（１）slr1841遺伝子の発現が抑制されたシアノバクテリア改変株の構築
　遺伝子抑制法として、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）干渉法を用いた。本方法では、dCas9タンパク質をコードする遺伝子（以下、dCas9遺伝子という）と、slr1841_sgRNA（single-guide Ribonucleic Acid）遺伝子とを、シアノバクテリアの染色体DNAに導入することにより、slr1841遺伝子（配列番号７）の発現を抑制することができる。
　本方法による遺伝子発現抑制の仕組みは次の通りである。
　まず、ヌクレアーゼ活性を欠損したCas9タンパク質（dCas9）と、slr1841遺伝子（配列番号７）の塩基配列に相補的に結合するsgRNA（slr1841__sgRNA）とが、複合体を形成する。
　次に、この複合体がシアノバクテリアの染色体DNA上のslr1841遺伝子を認識し、slr1841遺伝子と特異的に結合する。この結合が立体障害となることにより、slr1841遺伝子の転写が阻害される。その結果、シアノバクテリアのslr1841遺伝子の発現が抑制される。
　以下、上記の２つの遺伝子の各々をシアノバクテリアの染色体DNAに導入する方法を具体的に説明する。
　（１－１）dCas9遺伝子の導入
　Synechocystis LY07株（以下、LY07株ともいう）（非特許文献１６参照）の染色体DNAを鋳型として、dCas9遺伝子及びdCas9遺伝子の発現制御のためのオペレーター遺伝子、並びに、遺伝子導入の目印となるスペクチノマイシン耐性マーカー遺伝子を、表１に記載のプライマーpsbA1-Fw（配列番号１７）及びpsbA1-Rv（配列番号１８）を用いてPCR（Polymerase chain reaction）法により増幅した。なお、LY07株では、上記の３つの遺伝子が連結した状態で染色体DNA上のpsbA1遺伝子に挿入されているため、１つのDNA断片としてPCR法により増幅することができる。ここでは、得られたDNA断片を「psbA1::dCas9カセット」と表記する。In-Fusion PCRクローニング法（登録商標）を用いて、psbA1::dCas9カセットをpUC19プラスミドに挿入し、pUC19-dCas9プラスミドを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　得られたpUC19-dCas9プラスミド1 μgとシアノバクテリア培養液（菌体濃度OD730 = 0.5程度）を混合し、自然形質転換によりpUC19-dCas9プラスミドをシアノバクテリアの細胞内に導入した。形質転換された細胞を20 μg/mLのスペクチノマイシンを含むBG-11寒天培地上で生育させることにより、選抜した。選抜された細胞では、染色体DNA上のpsbA1遺伝子と、pUC19-dCas9プラスミド上のpsbA1上流断片領域及びpsbA1下流断片領域との間で相同組み換えが起こっている。これにより、psbA1遺伝子領域にdCas9カセットが挿入されたSynechocystis dCas9株を得た。なお、用いたBG-11培地の組成は表２の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（１－２）slr1841_sgRNA遺伝子の導入
　CRISPR干渉法では、sgRNA遺伝子上のprotospacerと呼ばれる領域に、標的配列と相補的な約20塩基の配列を導入することにより、sgRNAが標的遺伝子に特異的に結合する。本実施例で用いたprotospacer配列は表３に示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　Synechocystis LY07株では、sgRNA遺伝子（protospacer領域を除く）とカナマイシン耐性マーカー遺伝子とが連結した形で、染色体DNA上のslr2030-slr2031遺伝子に挿入されている。従って、当該sgRNA遺伝子をPCR法により増幅する際に用いるプライマーに、slr1841遺伝子（配列番号７）と相補的なprotospacer配列（配列番号３３）を付与することにより、slr1841を特異的に認識するsgRNA (slr1841_sgRNA)を容易に得ることができる。
　まず、LY07株の染色体DNAを鋳型とし、表１に記載のプライマーslr2030-Fw（配列番号１９）及びsgRNA_slr1841-Rv（配列番号２０）のセット、並びに、sgRNA_ slr1841-Fw（配列番号２１）及びslr2031-Rv（配列番号２２）のセットを用いて２つのDNA断片をPCR法により増幅した。
　続いて、上記のDNA断片の混合溶液を鋳型として、表１に記載のプライマーslr2030-Fw（配列番号１９）とslr2031-Rv（配列番号２２）とを用いてPCR法により増幅することにより、（i）slr2030遺伝子断片、（ii）slr1841_sgRNA、（iii）カナマイシン耐性マーカー遺伝子、（iv）slr2031遺伝子断片が順に連結したDNA断片（slr2030-2031:: slr1841_sgRNA）を得た。In-Fusion PCRクローニング法（登録商標）を用いて、slr2030-2031::slr1841_sgRNAをpUC19プラスミドに挿入し、pUC19- slr1841_sgRNAプラスミドを得た。
　上記（１－１）と同様の方法でpUC19-slr1841_sgRNAプラスミドをSynechocystis dCas9株に導入し、形質転換された細胞を30 μg/mLカナマイシンを含むBG-11寒天培地上で選抜した。これにより、染色体DNA上のslr2030-slr2031遺伝子にslr1841_sgRNAが挿入された形質転換体Synechocystis dCas9 slr1841_sgRNA株（以下、slr1841抑制株ともいう）を得た。
　（１－３）slr1841遺伝子の抑制
　上記dCas9遺伝子及びslr1841_sgRNA遺伝子は、アンヒドロテトラサイクリン（aTc）の存在下で発現誘導されるようにプロモーター配列が設計されている。本実施例では、培地中に終濃度1 μg/mL aTc を添加することによりslr1841遺伝子の発現を抑制した。
　（実施例２）
　実施例２では、下記の手順により、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードするslr0688遺伝子の発現が抑制された改変シアノバクテリアを得た。
　（２）slr0688遺伝子の発現が抑制されたシアノバクテリア改変株の構築
　上記（１－２）と同様の手順により、slr0688遺伝子（配列番号１０）と相補的なprotospacer配列（配列番号３４）を含むsgRNA遺伝子をSynechocystis dCas9株に導入し、Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株を得た。なお、表１に記載のプライマーslr2030-Fw（配列番号１９）及びsgRNA_slr0688-Rv（配列番号２３）のセット、並びに、sgRNA_slr0688-Fw（配列番号２４）及びslr2031-Rv（配列番号２２）のセットを用いたことと、（i）slr2030遺伝子断片、（ii）slr0688_sgRNA、（iii）カナマイシン耐性マーカー遺伝子、（iv）slr2031遺伝子断片が順に連結したDNA断片（slr2030-2031::slr0688_sgRNA）をIn-Fusion PCRクローニング法（登録商標）を用いて、pUC19プラスミドに挿入し、pUC19-slr0688_sgRNAプラスミドを得たこと以外は、上記（１－２）と同様の条件で行った。
　さらに、上記（１－３）と同様の手順により、slr0688遺伝子の発現を抑制した。
　（比較例１）
　比較例１では、実施例１の（１－１）と同様の手順により、Synechocystis dCas9株を得た。
　続いて、実施例１、実施例２及び比較例１で得られた菌株について、それぞれ、細胞表層の状態の観察を行った。以下、詳細について説明する。
　（３）菌株の細胞表層の状態の観察
　実施例１で得られた改変シアノバクテリアSynechocystis dCas9 slr1841_sgRNA株（いわゆる、slr1841抑制株）、実施例２で得られた改変シアノバクテリアSynechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株（以下、slr0688抑制株ともいう）、及び、比較例１で得られた改変シアノバクテリアSynechocystis dCas9株（以下、Control株という）のそれぞれの超薄切片を作製し、電子顕微鏡を用いて細胞表層の状態（言い換えると、外膜構造）を観察した。
　（３－１）菌株の培養
　初発菌体濃度OD730 = 0.05となるように、実施例１のslr1841抑制株を、1 μg/mL aTcを含むBG-11培地に接種し、光量100 μmol/m2/s、30°Cの条件下で５日間振盪培養した。なお、実施例２のslr0688抑制株及び比較例１のControl株も実施例１と同様の条件で培養した。
　（３－２）菌株の超薄切片の作製
　上記（３－１）で得られた培養液を、室温にて2,500 g で10分間遠心分離し、実施例１のslr1841抑制株の細胞を回収した。次いで、細胞を-175℃の液体プロパンで急速凍結した後、2%グルタルアルデヒド及び1%タンニン酸を含むエタノール溶液を用いて-80℃で2日間固定した。固定後の細胞をエタノールにより脱水処理し、脱水した細胞を酸化プロピレンに浸透させたあと、樹脂（Quetol-651）溶液中に沈めた。その後60℃で48時間静置し、樹脂を硬化させて、細胞を樹脂で包埋した。樹脂中の細胞を、ウルトラミクロトーム（Ultracut）を用いて70 nmの厚さに薄切し、超薄切片を作成した。この超薄切片を、2%酢酸ウラン及び1%クエン酸鉛溶液を用いて染色して、実施例１のslr1841抑制株の透過型電子顕微鏡の試料を準備した。なお、実施例２のslr0688抑制株及び比較例１のControl株についてもそれぞれ同様の操作を行い、透過型電子顕微鏡の試料を準備した。
　（３－３）電子顕微鏡による観察
　透過型電子顕微鏡（JEOL　JEM-1400Plus）を用いて、加速電圧100 kV下で、上記（３－２）で得られた超薄切片の観察を行った。観察結果を図３～図８に示す。
　まず、実施例１のslr1841抑制株について説明する。図３は、実施例１のslr1841抑制株のＴＥＭ（Transmission Electron Microscope）像である。図４は、図３の破線領域Ａの拡大像である。図４の（ａ）は、図３の破線領域Ａの拡大ＴＥＭ像であり、図４の（ｂ）は、図４の（ａ）の拡大ＴＥＭ像を描写した図である。
　図３に示されるように、実施例１のslr1841抑制株では、外膜が細胞壁から部分的に剥離し（つまり、外膜が部分的に剥がれ落ち）、かつ、外膜が部分的に撓んでいた。
　細胞表層の状態をより詳細に確認するために、破線領域Ａを拡大観察したところ、図４の（ａ）及び図４の（ｂ）に示されるように、外膜が部分的に剥がれ落ちた部分（図中の一点破線領域ａ１及びａ２）を確認できた。また、一点破線領域ａ１の傍に外膜が大きく撓んだ部分を確認できた。この部分は、外膜と細胞壁との結合が弱められた部分であり、培養液が外膜からペリプラズム内に浸透したため、外膜が外側に膨張されて、撓んだと考えられる。
　続いて、実施例２のslr0688抑制株について説明する。図５は、実施例２のslr0688抑制株のＴＥＭ像である。図６は、図５の破線領域Ｂの拡大像である。図６の（ａ）は、図５の破線領域Ｂの拡大ＴＥＭ像であり、図６の（ｂ）は、図６の（ａ）の拡大ＴＥＭ像を描写した図である。
　図５に示されるように、実施例２のslr0688抑制株では、外膜が細胞壁から部分的に剥離し、かつ、外膜が部分的に撓んでいた。また、slr0688抑制株では、外膜が部分的に細胞壁から脱離していることが確認できた。
　細胞表層の状態をより詳細に確認するために、破線領域Ｂを拡大観察したところ、図６の（ａ）及び図６の（ｂ）に示されるように、外膜が大きく撓んだ部分（図中の一点破線領域ｂ１）、及び、外膜が部分的に剥がれ落ちた部分（図中の一点破線領域ｂ２及びｂ３）を確認できた。また、一点破線領域ｂ１、ｂ２及びｂ３それぞれの近傍に外膜が細胞壁から脱離している部分を確認できた。
　続いて、比較例１のControl株について説明する。図７は、比較例１のControl株のＴＥＭ像である。図８は、図７の破線領域Ｃの拡大像である。図８の（ａ）は、図７の破線領域Ｃの拡大ＴＥＭ像であり、図８の（ｂ）は、図８の（ａ）の拡大ＴＥＭ像を描写した図である。
　図７に示されるように、比較例１のControl株の細胞表層は整っており、内膜、細胞壁、外膜、及びＳ層が順に積層された状態を保っていた。つまり、Control株では、実施例１及び２のように外膜が細胞壁から脱離した部分、外膜が細胞壁から剥離した（つまり、剥がれ落ちた）部分、及び、外膜が撓んだ部分は見られなかった。
　（実施例３）
　実施例３では、下記の手順により、灰色藻Cyanophora paradoxaが保持する葉緑体の外膜チャネルタンパク質CppS（配列番号１３）を、シアノバクテリアの外膜に導入したSynechocystis cppS tetR株（以下、cppS導入株ともいう）を得た。
　（４）葉緑体外膜チャネルタンパク質CppSのシアノバクテリア外膜への導入
　（４－１）cppS遺伝子発現カセットの構築
　cppS遺伝子と、cppS遺伝子の発現制御のためのプロモーター領域（PL22）と、シアノバクテリアにおける外膜移行シグナル配列（slr0042-signal）と、遺伝子導入の目印となるカナマイシン耐性マーカー遺伝子（KmR）と、が連結した遺伝子カセットを、以下の手順で作製した。
　まず、シアノバクテリアの染色体DNAを鋳型とし、表１に記載のプライマーslr0042-Fw（配列番号２５）及びslr0042-Rv（配列番号２６）を用いてPCR法により増幅し、slr0042遺伝子を得た。続いて、Synechocystis LY07株（非特許文献１６）の染色体DNAを鋳型として、表１に記載のプライマーslr2030-Fw（配列番号１９）及びPL22-Rv（配列番号２７）のセット並びにKmR-Fw（配列番号２８）及びslr2031-Rv（配列番号２２）のセットを用いてPCR法により増幅し、PL22及びKmRを得た。なお、LY07株では、これらが染色体上のslr2030-slr2031遺伝子中に挿入されて存在しているため、上記の４つのプライマーを用いてPCR法により増幅すると、PL22の5′末端側にslr2030遺伝子断片が連結した形で増幅され、KmRの3′末端側にslr2031遺伝子断片が連結した形で増幅される。次に、上記手順で得られたslr0042遺伝子、PL22、及びKmRの混合溶液を鋳型とし、表１に記載の４つのプライマー（配列番号１９、２２、２７、２８）を用いてPCR法により増幅することにより、5′末端側から、slr2030遺伝子断片、PL22、slr0042遺伝子、KmR、及びslr2031遺伝子断片が順に連結した遺伝子カセット（slr2030-2031::slr0042-KmRカセット）を得た。In-Fusion PCRクローニング法（登録商標）を用いて、slr2030-2031::slr0042-KmRカセットをpUC19プラスミドに挿入し、pUC19-slr0042プラスミドを得た。
　上記手順と並行して、灰色藻C. paradoxa NIES-547よりSMART cDNA ライブラリー合成キット(Clontech) を用いてtotal cDNAを調整した。このcDNAを鋳型に、表１に記載のプライマーcppS-Fw（配列番号２９）及びcppS-Rv（配列番号３０）を用いてPCR法により増幅し、cppS遺伝子（配列番号１３）を得た。In-Fusion PCRクローニング法（登録商標）を用いて、cppS遺伝子（配列番号１３）をpUC19-slr0042プラスミドに挿入し、pUC19-CppSプラスミドを得た。なお、この手順により、cppS遺伝子はslr0042遺伝子の外膜移行シグナル配列の3′末端側に連結した形で挿入され、slr0042遺伝子の外膜移行シグナル配列以外の領域は、cppSのコード領域と入れ替わる形で除去される。
　（４－２）PL22のプロモーター活性制御カセット（tetR）の構築
　上記PL22のプロモーター活性は、TetRリプレッサーを介した制御により、アンヒドロテトラサイクリン（aTc）の存在下でのみ誘導される。従ってPL22の活性制御のためのtetR遺伝子を改変シアノバクテリアに導入する必要がある。
　まず、LY07株の染色体DNAを鋳型とし、表1に記載のプライマーpsbA1-Fw（配列番号１７）及びtetR-Rv（配列番号３１）のセット、並びにtetR-Fw（配列番号３２）及びpsbA1-Rv（配列番号１８）のセットを用いてPCR法により増幅してtetR遺伝子と、遺伝子導入の目印となるスペクチノマイシン耐性マーカー遺伝子（SpcR）を得た。なお、LY07株ではこれらが染色体上のpsbA1遺伝子中に挿入されて存在しているため、上記プライマーを用いてPCR法により増幅すると、tetR遺伝子の5′末端側にpsbA1遺伝子の上流側断片が連結した形で増幅され、SpcRの3′末端側にpsbA1遺伝子の下流側断片が連結した形で増幅される。次に、tetR遺伝子とSpcRの混合溶液を鋳型とし、表1に記載のプライマーpsbA1-Fw（配列番号１７）及びpsbA1-Rv（配列番号１８）を用いてPCR法により増幅することにより、5′末端側から、psbA1遺伝子上流側断片、tetR、SpcR、psbA1遺伝子下流側断片が順に連結した遺伝子カセット（psbA1::tetRカセット）を得た。In-Fusion PCRクローニング法（登録商標）を用いて、psbA1::tetRカセットカセットをpUC19プラスミドに挿入し、pUC19-tetRプラスミドを得た。
　（４－３）cppS遺伝子発現カセットとtetRカセットの導入
　上記手順により得られたpUC19-cppSプラスミド１μgと、シアノバクテリア培養液（菌体濃度OD730 = 0.5程度）とを混合し、自然形質転換によりプラスミドを細胞内に導入した。形質転換された細胞を30 μg/mLのカナマイシンを含むBG-11寒天培地上で生育させることにより、選抜した。選抜された細胞では、染色体上のslr2030-2031遺伝子と、pUC19-cppSプラスミド上のslr2030遺伝子断片領域およびslr2031遺伝子断片領域との間で相同組み換えが起こる。これにより、slr2030-2031遺伝子領域にcppS遺伝子発現カセットが挿入されたSynechocystis cppS株を得た。なお、用いたBG-11培地の組成は表２の通りである。
　次に、pUC19-tetRプラスミド 1 μgとSynechocystis cppS培養液（菌体濃度OD730 = 0.5程度）とを混合し、自然形質転換によりプラスミドを細胞内に導入した。形質転換された細胞を30 μg/mLのカナマイシンおよび20 μg/mLのスペクチノマイシンを含むBG-11寒天培地上で生育させることにより選抜し、Synechocystis cppS tetR株を得た。上記と同様に、同株では染色体DNA上のpsbA1遺伝子にtetRカセットが挿入されている。
　（４－４）cppS遺伝子の発現誘導
　上記Synechocystis cppS tetR 株のcppS遺伝子は、アンヒドロテトラサイクリン（aTc）の存在下で発現誘導される。本実施例では、BG-11培地中に終濃度1 μg/mL aTc を添加して培養することによりcppS遺伝子を発現誘導した。
　（５）タンパク質の分泌生産性試験
　以下の方法により、ペリプラズム（外膜と内膜との間隙）に存在するタンパク質が細胞外に分泌しているか否かを確認した。
　より具体的には、実施例１のslr1841抑制株、実施例２のslr0688抑制株、実施例３のcppS導入株、及び、比較例１のControl株をそれぞれ培養し、細胞外に分泌されたタンパク質量（以下、分泌タンパク質量ともいう）を測定した。培養液中のタンパク質量により、上記の菌株それぞれのタンパク質の分泌生産性を評価した。なお、タンパク質の分泌生産性とは、細胞内で産生されたタンパク質を細胞外に分泌することにより、タンパク質を生産する能力をいう。以下、具体的な方法について説明する。
　（５－１）菌株の培養
　実施例１のslr1841抑制株を上記（３－１）と同様の方法で培養した。培養は、独立して３回行った。なお、実施例２、実施例３及び比較例１の菌株についても実施例１の菌株と同様の条件で培養した。
　（５－２）細胞外に分泌されタンパク質の定量
　上記（５－１）で得られた培養液を、室温にて2,500 gで10分間遠心分離し、培養上清を得た。得られた培養上清を、ポアサイズ0.22 μmのメンブレンフィルターを用いてろ過し、実施例１のslr1841抑制株の細胞を完全に除去した。ろ過後の培養上清に含まれる総タンパク質量をBCA（Bicinchoninic acid）法により定量した。この一連の操作を、独立して培養した３つの培養液のそれぞれについて行い、実施例１のslr1841抑制株の細胞外に分泌されたタンパク質量の平均値及び標準偏差を求めた。なお、実施例２、実施例３及び比較例１の菌株についても、それぞれ、同様の条件で、上記（５－１）で得られた３つの培養液のタンパク質量の定量を行い、３つの培養液中のタンパク質量の平均値及び標準偏差を求めた。
　結果を図９に示す。図９は、実施例１～３及び比較例１の改変シアノバクテリアの培養液中のタンパク質量（ｎ＝３、エラーバー＝ＳＤ）を示すグラフである。
　図９に示されるように、実施例１のslr1841抑制株、実施例２のslr0688抑制株、及び、実施例３のcppS導入株のいずれも、比較例１のControl株と比較して培養上清中に分泌されたタンパク質量（mg/L）が約25倍向上していた。
　データの記載を省略するが、培養液の吸光度(730nm)を測定し、菌体乾燥重量１ｇあたりの分泌タンパク質量（mg protein/g cell dry weight）を算出したところ、実施例１のslr1841抑制株、実施例２のslr0688抑制株及び実施例３のcppS導入株のいずれも、菌体乾燥重量１ｇあたりの分泌タンパク質量（mg protein/g cell dry weight）は、比較例１のControl株と比較して、約36倍向上していた。
　また、図９において、実施例１及び実施例２の「シアノバクテリアの外膜を細胞壁から部分的に脱離させた改変シアノバクテリア」の分泌タンパク質量（mg/L）を比較すると、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子（slr1841）の発現を抑制した実施例１のslr1841抑制株よりも、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子（slr0688）の発現を抑制した実施例２のslr0688抑制株の方が、培養上清中に分泌されたタンパク質量が多かった。これは、外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質（Slr1841）の数よりも細胞壁表面の共有結合型の糖鎖の数の方が多いことが関係していると考えられる。つまり、実施例２のslr0688抑制株の方が、実施例１のslr1841抑制株よりも外膜と細胞壁との結合量及び結合力がより低下したため、分泌されたタンパク質量が実施例１のslr1841抑制株よりも多くなったと考えられる。
　また、図９において、実施例２のslr0688抑制株の分泌タンパク質量（mg/L）と、シアノバクテリアの外膜に有機物チャネルタンパク質CppSをコードする遺伝子（cppS）を発現させた実施例３のcppS導入株の分泌タンパク質量（mg/L）とを比較すると、実施例２のslr0688抑制株の方が実施例３のcppS導入株よりもわずかに（約20mg/L）多かった。
　以上の結果から、外膜と細胞壁との結合に関連するタンパク質の機能を抑制することにより、シアノバクテリアの外膜と細胞壁との結合が部分的に弱められ、外膜が細胞壁から部分的に脱離することが確認できた。また、外膜と細胞壁との結合が弱まることにより、シアノバクテリアの細胞内で産生されたタンパク質が細胞外に分泌されやすくなることも確認できた。したがって、本開示における改変シアノバクテリアによれば、タンパク質の分泌生産性が大きく向上することが示された。
　（５－３）分泌されたタンパク質の同定
　続いて、上記（５－２）で得られた培養上清中に含まれるタンパク質を、LC-MS/MSにより同定した。方法を以下に説明する。
　（５－３－１）試料調製
　培養上清の液量に対して8倍量の冷アセトンを加え、20℃で2時間静置後、20,000 gで15分間遠心分離し、タンパク質の沈殿物を得た。この沈殿物に100 mM Tris pH 8.5、0.5%ドデカン酸ナトリウム（SDoD）を加え、密閉式超音波破砕機によってタンパク質を溶解した。タンパク質濃度1 μg/mLに調整後、終濃度10 mMのジチオスレイトール（DTT）を添加して 50℃で30分間静置した。続いて、終濃度30 mMのヨードアセトアミド（IAA）を添加し、室温（遮光）で30分間静置した。IAA の反応を止めるために、終濃度60 mMのシステインを添加して室温で 10 分間静置した。トリプシン400 ngを添加して37℃で一晩静置し、タンパク質をペプチド断片化した。5% TFA（Trifluoroacetic Acid）を加えた後、室温にて15,000 gで10分間遠心分離し、上清を得た。この作業によりSDoDが除去された。C18スピンカラムを用いて脱塩後、遠心エバポレーターにより試料を乾固した。その後、3%アセトニトリル、0.1% formic acidを加え、密閉式超音波破砕機を用いて試料を溶解した。ペプチド濃度 200 ng/μL になるように調製した。
　（５－３－２）LC-MS/MS分析
　上記（５－３－１）で得られた試料をLC-MS/MS装置（UltiMate 3000 RSLCnano LC System) を用いて以下の条件で解析を実施した。
　試料注入量：200 ng
　カラム：CAPCELL CORE MP 75 μm × 250 mm
　溶媒：A溶媒は0.1%ギ酸水溶液、B溶媒は0.1%ギ酸+80%アセトニトリル
　グラジエントプログラム：試料注入4分後にB溶媒8%、27分後にB溶媒44%、28分後にB溶媒80%、34分後に測定終了
　（５－３－３）データ解析
　得られたデータは以下の条件で解析し、タンパク質及びペプチドの同定ならびに定量値の算出を行った。
　ソフトウェア：Scaffold DIA
　データベース：UniProtKB/Swiss Prot database ( Synechocystis sp. PCC 6803)
　Fragmentation：HCD
　Precursor Tolerance：8 ppm
　Fragment Tolerance：1 0 ppm
　Data Acquisition Type：Overlapping DIA
　Peptide Length：8-70
　Peptide Charge：2-8
　Max Missed Cleavages：1
　Fixed Modification：Carbamidomethylation
　Peptide FDR： 1%以下
　同定されたタンパク質のうち相対定量値が最も大きかったものから順に10種類のタンパク質を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　10種類のタンパク質は、全て、実施例１～実施例３の培養上清のそれぞれに含まれていた。これらのタンパク質の全てにおいて、ペリプラズム（外膜と内膜との間隙を指す）移行シグナルが保持されていた。この結果により、実施例１のslr1841抑制及び実施例２のslr0688抑制株では、外膜と細胞壁との結合が弱まるため、外膜が細胞壁から部分的に脱離することによって、ペリプラズム内のタンパク質が外膜の外（つまり、菌体外）に漏出しやすくなることが確認できた。また、実施例３のcppS導入株では、cppS遺伝子の発現により外膜のタンパク質透過性が向上し、ペリプラズム内のタンパク質がチャネルタンパク質CppSを透過して外膜の外（つまり、菌体外）に分泌されやすくなることが確認できた。したがって、実施例１～３の改変株は、外膜の物質透過性が向上していることが示された。
　（６）改変シアノバクテリアの細胞外電子伝達効率の評価
　実施例２のslr0688抑制株、実施例３のcppS導入株及び比較例１のControl株について、細胞外電子伝達効率の評価を行った。より具体的には、これらの改変株の培養液にそれぞれ光を照射し、光合成による水の分解により発生した細胞内電流を外部電極で検出することにより、細胞外電子伝達効率を評価した。使用した装置及び電流の測定手順を以下に説明する。
　（６－１）電気化学測定装置
　まず、電気化学測定装置１００の構成について図面を参照しながら説明する。図１０は、電気化学測定装置１００の構成の一例を概略的に示す分解斜視図である。図１１は、図１０のＸＩ－ＸＩ断面線における概略断面図である。
　図１０及び図１１に示されるように、電気化学測定装置１００は、測定部１０と、光照射部２０とを備える。測定部１０は、シアノバクテリアの培養液４０を収容するための収容部１１を有する反応槽１２と、収容部１１内の培養液４０に接するように反応槽１２の内部に設置された第一電極１３と、収容部１１内の培養液４０に接するように反応槽１２の内部に設置された第二電極１４と、第一電極１３の電位を制御するためのポテンショスタット１５と、収容部１１内の培養液４０に接するように反応槽１２の内部に設置された参照電極１６と、を備える。
　反応槽１２は、電気的絶縁性を有し、培養液４０を透過しない。また、反応槽１２は、培養液４０によって腐食又は破損が起きない材料であり、例えば、プラスチック又はセラミック等から構成されてもよい。
　測定部１０は、例えば、第一電極１３と第二電極１４との間に電圧を印加し、又は、電流を流し、その電圧又は電流に対応した電流又は電位を測定する。ここでは、測定部１０は、第一電極１３と第二電極１４との間に電圧を印加し、電流を測定する。
　第一電極１３は、いわゆる、作用極であり、電極表面での培養液４０中の微量な物質に敏感に電気化学応答をする電極である。第二電極１４は、いわゆる、対向電極であり、作用極（第一電極１３）との間に電位差を設定する、又は、電流を流すための電極である。
　第一電極１３、及び、第二電極１４は、導電性物質から構成される。導電性物質としては、例えば、炭素材料、導電性ポリマー材料、半導体、又は、金属等であってもよい。例えば、炭素材料としては、カーボンナノチューブ、ケッチェンブラック、グラッシーカーボン、グラフェン、フラーレン、カーボンファイバー、カーボンファブリック、又は、カーボンエアロゲル等であってもよい。また、例えば、導電性ポリマー材料としては、ポリアニリン、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリ（３，４－エチレンジオキシチオフェン）、ポリ（ｐ－フェニレンビニレン）、ポリチオフェン、又は、ポリ（ｐ－フェニレンスルフィド）等であってもよい。また、例えば、半導体としては、シリコーン、ゲルマニウム、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ：Indium Tin Oxide）、酸化チタン、酸化銅、又は、酸化銀等であってもよい。また、例えば、金属としては、金、白金、銀、チタン、アルミニウム、タングステン、銅、鉄、又は、パラジウム等であってもよい。ここでは、第一電極１３は、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）電極であり、第二電極１４は、白金電極である。なお、導電性物質は、導電性物質が自身の酸化反応によって分解されないものであればよく、特に限定されない。
　参照電極１６は、培養液４０中の物質と反応せず、一定電位を維持する電極であり、ポテンショスタット１５で第一電極１３と参照電極１６との間の電位差を一定に制御するために使用される。ここでは、参照電極１６は、銀／塩化銀電極である。
　ポテンショスタット１５は、第一電極１３と第二電極１４との間に電圧を印加し、第一電極１３と参照電極１６との間の電位を所定の値に制御する。
　光照射部２０は、光源２１と、光源２１を保持する筐体２２とを備える。細かな構成の図示は省略するが、光源２１は、例えば、１つ又は２以上の発光体（例えば、ＬＥＤ（light emitting diode）など）と、発光体を囲む反射面とを備えている。なお、光照射部２０は、測定部１０からＺ軸プラス方向に所定の距離離れて配置されてもよい。
　なお、図１１では、第一電極１３、第二電極１４及び参照電極１６は、それぞれ、反応槽１２の下方（つまり、Ｚ軸マイナス方向）に引き出し電極がある構成を例示しているが、ポテンショスタット１５と電気的に接続できれば、反応槽１２から飛び出さない形態であってもよい。また、第一電極１３、第二電極１４及び参照電極１６は、それぞれ反応槽１２の側面に引き出される形態であってもよい。
　（６－２）電流の測定
　比較例１のControl株、実施例２のslr0688抑制株、及び、実施例３のcppS導入株について、以下の手順で、上記の３つの菌株それぞれの電流生成量を測定した。
　使用した電気化学測定装置１００の構成は、以下の通りである。
　第一電極１３：酸化インジウムスズ電極（表面積：3.14cm2）
　第二電極１４：白金電極
　参照電極１６：銀／塩化銀電極
　光源２１：約120 μmol/m2/sの白色光を発する光源
　（６－２－１）培養液の準備
　まず、比較例１のControl株を、初発菌体濃度OD730 = 0.1となるように1 μg/mL aTcを含むBG-11培地に接種し、光量100 μmol/m2/s、30°Cの条件下で３日間振盪培養した。なお、実施例２のslr0688抑制株及び実施例３のcppS導入株についても、それぞれ、同様の条件で培養した。
　（６－２－２）電流の測定
　上記（６－２－１）で得られた比較例１のControl株の培養液４０を、反応槽１２に4mL注入した後、参照電極１６に対する第一電極１３の電位が+0.0Vとなるようにポテンショスタット１５により制御した。そして、光照射部２０から収容部１１内の培養液４０に約120 μmol/m2/sの白色光を一定時間照射し、第一電極１３と第二電極１４との間に流れる電流を測定した。続いて、参照電極１６に対する第一電極１３の電位を+0.1V、+0.2V、+0.25V、及び、+0.3Vの順に変えて、それぞれの電位に制御した場合において、同様に、第一電極１３と第二電極１４との間に流れる電流を測定した。結果を図１２に示す。図１２は、比較例１のControl株の培養液４０に光を照射した際に流れる電流を測定した結果を示す図である。
　図１２に示されるように、比較例１のControl株の培養液４０では、参照電極１６に対する第一電極１３の電位が+0.0V、+0.1V、+0.2V、+0.25V、及び、+0.3Vのそれぞれの場合において、測定された電流値（ベースライン補正後の最大値）は、約+0.0nA、約+0.0nA、約+0.0nA、約+0.0nA、及び、約+1.0nAであった。
　続いて、実施例２のslr0688抑制株及び実施例３のcppS導入株についても、比較例１と同様に、電流値の測定を行った。結果を図１３及び図１４に示す。図１３は、実施例２のslr0688抑制株の培養液４０に光を照射した際に流れる電流を測定した結果を示す図である。図１４は、実施例３のcppS導入株の培養液４０に光を照射した際に流れる電流を測定した結果を示す図である。
　図１３に示されるように、実施例２のslr0688抑制株の培養液４０では、参照電極１６に対する第一電極１３の電位が+0.0V、+0.1V、+0.2V、+0.25V、及び、+0.3Vのそれぞれの場合において、測定された電流値（ベースライン補正後の最大値）は、約+90nA、約+250nA、約+560nA、約+750nA、及び、約+1100nAであった。
　また、図１４に示されるように、実施例３のcppS導入株の培養液４０では、参照電極１６に対する第一電極１３の電位が+0.0V、+0.1V、+0.2V、+0.25V、及び、+0.3Vのそれぞれの場合において、測定された電流値（ベースライン補正後の最大値）は、約+10nA、約+20nA、約+70nA、約+150nA、及び、約+260nAであった。
　図１３及び図１４に示されるように、電流値は電位依存的に上昇した。
　以上より、参照電極１６に対する第一電極１３の電位を+0.3Vに制御した場合に、上記の３株全ての培養液４０の電流値が測定できたため、これらの電流値を表５に抜き出して比較した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示されるように、培養液４０に光が照射されることにより培養液４０において流れる電流（以下、光電流と呼ぶ）は、参照電極１６に対する第一電極１３の電位を+0.3Vになるように制御した場合、実施例２のslr0688抑制株の培養液４０では、比較例１のControl株の培養液４０の1000倍向上した。また、実施例３のcppS導入株の培養液４０では、参照電極１６に対する第一電極１３の電位を+0.3Vになるように制御した場合の光電流は、比較例１のControl株の培養液４０の約300倍向上した。
　以上の結果から、本実施の形態における改変シアノバクテリアは、シアノバクテリアの外膜を細胞壁から部分的に脱離させること、又は、シアノバクテリアの外膜の物質透過性を向上させることにより、細胞外電子伝達効率が約300～1000倍に向上することが示された。
　（７）考察
　以上の結果から、実施例１及び実施例２のように、シアノバクテリアの外膜と細胞壁との結合を弱めて細胞内のタンパク質が漏出しやすくなるように改変した改変シアノバクテリアでは、外膜が破れて剥がれ落ちることにより、タンパク質以外の有機物（例えば、キノンなど）も細胞外に漏出しやすくなったと考えられる。そのため、実施例３のように、シアノバクテリアの外膜のタンパク質透過性を向上した改変シアノバクテリアよりも光電流が約５倍高かったと考えられる。
　したがって、改変シアノバクテリアと外部との電子伝達効率をより向上させるためには、外膜の一部が剥離している状態の方が有機物チャネルタンパク質を発現させるよりも、より効果的であることが分かった。
　なお、本開示の電子伝達体は、改変シアノバクテリアのタンパク質産生効率も向上しており、タンパク質を回収したあとも改変シアノバクテリアを繰り返し使用できるため、適度に外膜を離脱及び剥離させることができている点で非常に有益である。また、上記のタンパク質の同定の結果から、ペリプラズム内のタンパク質をコードする遺伝子を改変することにより、所望のタンパク質を改変シアノバクテリアに分泌させることも可能である。このような有用物質の生産において、本開示の電子伝達体を用いれば、太陽光以外に電気エネルギーを与えることにより、有用物質を安定的に、かつ、効率的に生産することができる。
　以上、本開示に係る電子伝達体、電子伝達体の製造方法、及び、電子伝達方法について、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、これらの実施の形態に限定されるものではない。本開示の主旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を実施の形態に施したものや、実施の形態における一部の構成要素を組み合わせて構築される別の形態も、本開示の範囲に含まれる。
　上記の実施の形態では、シアノバクテリアにおける外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の機能を抑制又は喪失させることにより、外膜と細胞膜との結合を弱めて細胞外電子伝達効率を向上させる例について説明したが、これに限られない。例えば、シアノバクテリアに外力を加えることにより、外膜と細胞壁との結合を弱めてもよく、外膜を脆弱化させてもよい。また、シアノバクテリアの培養液に酵素又は薬剤に添加することにより、外膜を脆弱化させてもよい。
　本開示の電子伝達体、電子伝達体の製造方法、及び、電子伝達方法によれば、電子伝達体の外部に電子を効率良く供与することができるため、汚泥又は汚水などの処理と発電とを同時に行うことができる。また、本開示によれば、外部から電子伝達体が電子を効率良く授受することができるため、電子伝達体は、太陽光の光量が足りない場合に、電気エネルギーを利用することができる。そのため、本開示によれば、食品、医薬、若しくは、化学分野における有用物質の製造、土壌改良、排水処理、又は、発電などを効率良く行うことができる。
　１　内膜
　２　ペプチドグリカン
　３　糖鎖
　４　細胞壁
　５　外膜
　６　ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質
　７　ＳＬＨドメイン
　８、１８　有機物チャネルタンパク質
　９　細胞壁－ピルビン酸修飾酵素
　１０　測定部
　１１　収容部
　１２　反応槽
　１３　第一電極
　１４　第二電極
　１５　ポテンショスタット
　１６　参照電極
　２０　光照射部
　２１　光源
　２２　筐体
　３０　電子伝達体
　３１　改変シアノバクテリア
　３３　電子伝達物質
　３５　電子メディエータ
　３７　導電性物質
　４０　培養液
　１００　電気化学測定装置

Claims (16)

  1. 　（ｉ）シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失されている、及び、（ｉｉ）前記外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質が発現されている、の少なくとも１つである改変シアノバクテリアを含み、
    　前記改変シアノバクテリアは、外部に電子を供給すること、及び、外部から電子を取り込むことの少なくとも１つを行う、
    　電子伝達体。
  2. 　前記改変シアノバクテリアは、
    　光を受けて電子を生成し、
    　生成した前記電子を前記外膜の外に放出する、
    　請求項１に記載の電子伝達体。
  3. 　前記改変シアノバクテリアは、
    　前記外膜の外側に存在する電子を前記細胞壁の内側に取り込み、
    　前記細胞壁の内側で前記電子を利用する、
    　請求項１又は２に記載の電子伝達体。
  4. 　前記（ｉ）において、前記外膜と前記細胞壁との結合に関与するタンパク質は、ＳＬＨ（Surface Layer Homology）ドメイン保持型外膜タンパク質、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つである、
    　請求項１に記載の電子伝達体。
  5. 　前記ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質は、
    　配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるSlr1841、
    　配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるNIES970_09470、
    　配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるAnacy_3458、又は、
    　これらのいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質である、
    　請求項４に記載の電子伝達体。
  6. 　前記細胞壁－ピルビン酸修飾酵素は、
    　配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるSlr0688、
    　配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるSynpcc7942_1529、
    　配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるAnacy_1623、又は、
    　これらのいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質である、
    　請求項４に記載の電子伝達体。
  7. 　前記（ｉ）において、前記外膜と前記細胞壁との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子が欠失又は不活性化されている、
    　請求項１に記載の電子伝達体。
  8. 　前記外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子は、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つである、
    　請求項７に記載の電子伝達体。
  9. 　前記ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子は、
    　配列番号７で示される塩基配列からなるslr1841、
    　配列番号８で示される塩基配列からなるnies970_09470、
    　配列番号９で示される塩基配列からなるanacy_3458、又は、
    　これらのいずれかの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子である、
    　請求項８に記載の電子伝達体。
  10. 　前記細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子は、
    　配列番号１０で示される塩基配列からなるslr0688、
    　配列番号１１で示される塩基配列からなるsynpcc7942_1529、
    　配列番号１２で示される塩基配列からなるanacy_1623、又は、
    　これらのいずれかの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子である、
    　請求項８に記載の電子伝達体。
  11. 　前記（ｉｉ）において、前記外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質は、
    　配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるCppS、
    　配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるCppF、又は、
    　これらのいずれかのチャネルタンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質である、
    　請求項１に記載の電子伝達体。
  12. 　前記（ｉｉ）において、前記外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質をコードする遺伝子が導入されている、
    　請求項１に記載の電子伝達体。
  13. 　前記外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質をコードする遺伝子は、葉緑体由来の遺伝子である、
    　請求項１２に記載の電子伝達体。
  14. 　前記外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質をコードする遺伝子は、
    　配列番号１５で示される塩基配列からなるcppS、
    　配列番号１６で示される塩基酸配列からなるcppF、又は、
    　これらのいずれかの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子である、
    　請求項１２又は１３に記載の電子伝達体。
  15. 　（ｉ）シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失されている、及び、（ｉｉ）前記外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質が発現されている、の少なくとも１つである改変シアノバクテリアを製造するステップを含む、
    　電子伝達体の製造方法。
  16. 　請求項１から１４のいずれか１項に記載の電子伝達体を用いる、
    　電子伝達方法。
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