WO2021209080A2 - Péptido para el tratamiento del síndrome de la tormenta de citocinas - Google Patents

Péptido para el tratamiento del síndrome de la tormenta de citocinas Download PDF

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Gillian Martinez Donato
Gerardo Enrique Guillen Nieto
Mabel HERNÁNDEZ CEDEÑO
Lilia María ORTEGA GONZÁLEZ
Hugo NODARSE CUNI
Cruz Matilde Lopez Abad
Hilda Elisa Garay Perez
Raimundo UBIETA GÓMEZ
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Definitions

  • the present invention relates to the branch of biomedicine and the pharmaceutical industry, in particular with a pharmaceutical composition for the treatment and prevention of cytokine storm syndrome.
  • Said composition comprises the peptide identified as SEQ ID NO: 1, and can be used in the treatment of acute respiratory distress syndrome, macrophage activation syndrome, respiratory sepsis, dengue, hepatic encephalopathy and pericarditis, among others. diseases.
  • the epithelial barrier is also altered, and it exacerbates an inflammatory response with secretion of pro-inflammatory IL, such as TNFa, IL-1b, and IL-6, and other mediators of inflammation, with the successive activation of neutrophils, monocytes, macrophages, and the trafficking of these molecules and cells towards the alveolar spaces, increasing the initial involvement.
  • pro-inflammatory IL such as TNFa, IL-1b, and IL-6
  • IL-6 pro-inflammatory IL-6
  • the development of this hyperinflammation occurs in other diseases such as respiratory sepsis, macrophage activation syndrome, and sepsis in adults and neonates.
  • the present invention solves the problem raised above, by providing a pharmaceutical composition for the treatment and prevention of cytokine storm syndrome that comprises a concentration of 1.8-3.6 mg / mL of the peptide identified as SEQ ID NO: 1 and a sucrose concentration between 20-30 mg / mL, which surprisingly, synergistically increases the biological activity of said peptide, in addition to being a determining factor for the induction of regulatory T cells, which control the magnitude of the inflammation.
  • the composition of the invention is capable of reducing the hyperinflammation that characterizes the subgroup of patients with Covid-19 who transition to a severe stage, characterized by respiratory distress, as occurs in respiratory sepsis, macrophage activation syndrome, and neonatal sepsis and adult.
  • Administration of the peptide identified as SEQ ID NO: 1 reduces the level of pro-inflammatory cytokines in patients with Covid-19 disease, without causing immunosuppression or serious adverse effects or those associated with the peptide therapy.
  • the peptide identified as SEQ ID NO: 1 is derived from a region of the HSP60 protein, comprised between amino acids 83 to 109.
  • HSP60 is highly immunogenic, both in healthy individuals and in patients with autoimmune diseases. However, the level of antibodies and T cells that this protein can induce is higher in patients with autoimmune diseases (de Jong et al ⁇ 2009). Arthritis Rheum. 7 (60): 1966-1976). This protein has a great capacity to stimulate the pro-inflammatory reactivity of the innate immune system. HSP60 has also been found to induce the expression of IL-12 and IL-15 genes, cytokines involved in the induction of a Th1 phenotype.
  • HSP60 acts as a danger signal for the innate immune system (Habich et al ⁇ 2005). J.lmmunol. 3 (174): 1298-1305). On the other hand, peptides derived from HSP60 can also constitute a danger signal (Quintana and Cohén (2011). Trends Immunol. 2 (32): 89-95).
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 contains several overlapping T-cell epitopes. It increases the frequency of Treg cells with CD4 + CD25 high Foxp3 + phenotype in ex vivo assays with peripheral blood mononuclear cells from rheumatoid arthritis patients. However, this is not the case with cells from healthy donors (Barbera et al (2016). Cell Stress. Chaperones 4 (21): 735-744).
  • the peptide identified as SEQ ID NO: 1 is obtained by chemical synthesis. Through experiments such as those described in the present invention, those immunological mechanisms induced by the peptide that they participate in the control of hyperinflammation. The pharmaceutical composition was well tolerated and with a high safety profile, with no evidence of immunosuppression. No serious adverse events were identified in any patient.
  • cytokine storm syndrome is understood to be the increase in pro-inflammatory cytokines, where concentrations that exceed normal levels are reached.
  • pro-inflammatory cytokines are IL-6, TNFa, IL-1, IL-17, among others. It also refers to the increase in other cytokines, such as IL-10, IL-8, and IL-5.
  • biomarkers of inflammation such as C-reactive protein, fibrinogen, D-dimer, liver transaminases, lactate dehydrogenase and ferritin.
  • the increase in these molecules associated with the cytokine storm occurs in patients affected by inflammatory pathologies such as: acute respiratory distress, macrophage activation syndrome, respiratory sepsis, dengue, hepatic encephalopathy and pericarditis. From the clinical point of view, sustained fever, weakness, fatigue and nausea can be evidenced in patients.
  • the invention discloses the use of a pharmaceutical composition comprising the peptide identified as SEQ ID NO: 1 in the manufacture of a medicament for the treatment and prevention of cytokine storm syndrome.
  • treatment with a composition comprising said peptide allows the withdrawal of mechanical ventilation in patients with Covid-19, from the improvement of interstitial pneumonia, the reduction of reactants of the acute phase of inflammation among 24 and 48 hours, and the reduction of biomarkers of inflammation.
  • the rapid decrease in C-reactive protein, in just 24 hours, is an unexpected finding.
  • Previously, in patients with rheumatoid arthritis who were treated with this peptide it was not possible to demonstrate a significant decrease in C-reactive protein (Prada, et al (2016). J Clin Triáis 1 (8): 1-11).
  • the present invention demonstrates the ability of the peptide identified as SEQ ID NO: 1, administered intravenously, to reduce respiratory distress, hyperinflammation, the reactants of the acute phase of inflammation, and the level of pro-inflammatory cytokines in the patients with Covid-19. Surprisingly, these results were reproduced in patients with respiratory sepsis who presented with the respiratory distress syndrome.
  • the pharmaceutical composition comprising the peptide identified as SEQ ID NO: 1 is used in the manufacture of a drug for the treatment and prevention of cytokine storm syndrome that manifests as acute respiratory distress syndrome, macrophage activation syndrome, respiratory sepsis in adults or neonates, systemic inflammatory response syndrome, venous or arterial thromboembolism, acute elevation of ferritin levels, severe pericarditis, acute elevation of liver transaminases causing hepatic encephalopathy or disease associated with therapies with T cells that possess chimeric antigen receptor.
  • cytokine storm syndrome that manifests as acute respiratory distress syndrome, macrophage activation syndrome, respiratory sepsis in adults or neonates, systemic inflammatory response syndrome, venous or arterial thromboembolism, acute elevation of ferritin levels, severe pericarditis, acute elevation of liver transaminases causing hepatic encephalopathy or disease associated with therapies with T cells that possess chimeric antigen receptor.
  • the cytokine storm syndrome that underlies the systemic inflammatory response syndrome, which occurs in patients after burns or severe trauma or in acute inflammatory diseases.
  • the drug is administered intravenously.
  • the medicament is used for the treatment and prevention of cytokine storm syndrome caused by an infectious disease.
  • said infectious disease is Covid-19 or dengue.
  • the object of the present invention is a method for the treatment or prevention of cytokine storm syndrome that comprises the administration of a pharmaceutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising the peptide identified as SEQ ID NO: 1, to an individual who does so. needs to.
  • the cytokine storm syndrome manifests as acute respiratory distress syndrome, macrophage activation syndrome, respiratory sepsis in adults or neonates, systemic inflammatory response syndrome, venous or arterial thromboembolism, acute elevation of levels.
  • the cytokine storm that is treated or prevented by the method of the invention is caused by an infectious disease.
  • the method of the invention is useful for the treatment of the infectious disease Covid-19 or dengue.
  • the composition in said method is administered intravenously.
  • composition comprising the peptide identified as SEQ ID NO: 1 to patients in need thereof reduces the events associated with respiratory distress. This distress causes patients to need:
  • composition of the invention is useful for the treatment of patients affected with the infectious disease Covid-19, when said patients have a need for oxygen therapy of no less than 6 L / min plus one of the following conditions:
  • composition of the invention is also useful for the treatment of patients with Covid-19 who enter a serious state without the need for oxygen therapy, but who present an increase in the initial value of ferritin from 500 ng / ml or value absolute ferritin greater than or equal to 2000 ng / ml, with progressive radiological signs of multifocal interstitial pneumonia.
  • FIG. 1A Frequency of T cells quantified by flow cytometry expressing the CD4 + Foxp3 + phenotype, isolated from the spleen of BALB / c mice, after being inoculated with the pharmaceutical composition of the peptide identified as SEQ ID NO: 1, where sucrose was added at a concentration 10 mg / mL. (10), 30 mg / mL (30) and 80 mg / mL (80). The Kruskal-Wallis and Dunn statistical tests were used for data analysis. Different letters indicate statistically significant differences (P ⁇ 0.05).
  • FIG. 1B Frequency of T cells quantified by flow cytometry expressing the CD4 + Foxp3 + phenotype, isolated from the spleen of BALB / c mice, after being inoculated with the pharmaceutical composition of the peptide identified as SEQ ID NO: 1, where sucrose was added at a concentration of 20 mg / mL. (20), 30 mg / mL (30) and 40 mg / mL (40). The Kruskal-Wallis and Dunn statistical tests were used for data analysis. Different letters indicate statistically significant differences (P ⁇ 0.05).
  • the pharmaceutical composition was administered intravenously, once every 12 hours. In eight of the ten patients, 1 mg of the peptide was administered per patient in each application. Patients with code 5 and 6 received 2 mg every 12 hours, as they had cancer among the comorbidities. The characteristics of the patients, as well as the days of VAM APRV and administration of the peptide are reflected in Table 1.
  • HT arterial hypertension.
  • VAM APRV Mechanical Artificial Ventilation / Airway Pressure Release Ventilation.
  • the ten patients with Covid-19 disease who were treated with the peptide had risk factors that predispose to a serious or critical state of the same. Only one patient had no comorbidities, but his advanced age (80 years) was a risk factor. In particular, the patient identified with no. 5 presented a deep vein thrombosis. However, the clinical evolution of the ten, once they were administered the peptide, was favorable. At the time of extubation, the acute respiratory distress syndrome is considered to have ended. These results demonstrate that the peptide treatment was effective for the acute respiratory distress syndrome that these patients develop.
  • Example 3 Decrease in C-reactive protein in patients with Covid-19 disease treated with the pharmaceutical composition comprising the peptide identified as SEQ ID NO: 1.
  • C-reactive protein is one of the most used markers for inflammatory processes, it is considered one of the reactants of the acute phase of inflammation.
  • the pharmaceutical composition comprising the peptide identified as SEQ ID NO: 1 was administered intravenously. Eight of the ten patients affected with Covid-19, whose treatment is described in Example 1, received 1 mg of the peptide every 12 hours. Patients with code 5 and 6 who had cancer between comorbidities received 2 mg of the peptide every 12 hours. Unexpectedly, treatment with the peptide of SEQ ID NO: 1 decreased the levels of C-reactive protein, markedly, in the treated patients. These results are shown in Table 3.
  • the decrease in C-reactive protein during the treatment of these patients is a direct indication that the peptide of SEQ ID NO: 1 reduces inflammation in them, and is in correspondence with the disappearance of the acute respiratory distress syndrome, as well as with the clinical and radiological improvement of the patients.
  • Example 4 Decrease in pro-inflammatory cytokines in patients with Covid-19 disease treated with the pharmaceutical composition comprising the peptide identified as SEQ ID NO: 1.
  • the levels of the pro-inflammatory cytokines IL-6, IL-17, IL-1, IFNy and TNFa were determined in patients with Covid-19 disease treated with the composition comprising the peptide identified as SEQ ID NO: 1.
  • the patients were in critical condition.
  • the treatment of these patients was set forth in Example 1.
  • These cytokines were quantified in the sera of the patients identified with the numbers 1, 2, 3, 4, 7 and 8, which appear in Table 1, Example 1.
  • the virus under strict biosecurity measures. The quantification was carried out just before applying the first dose of the peptide, and at 48, 72 and 96 hours after starting the treatment with it.
  • cytokine determinations were carried out using an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) specific for each one, following the manufacturer's recommendations (Quantikine® R&D Systems, USA). Briefly, 50 pL of the specified diluent for each cytokine was added to the wells, followed by 200 pL of the standard curve, sample or control. The plate was incubated for 2 h at room temperature, and then the contents of each well were discarded. Then three washes were performed with the 1X wash solution, 200 pL of the conjugated antibody was added to each well, and incubated for 1 hr at room temperature. The wash was repeated and 200 pL of the substrate solution was added to each well.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the plate was incubated for 20 min at room temperature protected from light, 50 pL of the stop solution was added to each well, and the optical density was determined at 450 nm in a microplate reader (Thermo Scientific Multiskan Go, Finland) . A second reading was made at 570 nm, and the values obtained were subtracted from the 450 nm reading, to correct the optical imperfections on the plate. The determination of the concentration of each cytokine was carried out in triplicate. The results obtained for IL-6 are shown in Table 4.
  • IL-6 cytokine levels (pg / mL) found in patients treated with the peptide. As can be seen in the table, there was a decrease in the levels of the cytokine IL-6, since the critically ill patients received the peptide of SEQ ID NO: 1. This is a cytokine that increases markedly in inflammatory processes . It has been described that patients with Covid-19 disease who transition to a severe stage have elevated this cytokine, in contrast to patients who present mild symptoms of the disease. Similarly, a decrease in IL-17, IL-1, IFNy and TNFa was found in these patients. These results confirm that treatment with the peptide reduces hyperinflammation, and cytokine storm, developed by patients with Covid-19 disease who are transitioning to a severe stage.
  • Example 5 Treatment of a patient with Covid-19 disease who presented high concentrations of ferritin without respiratory distress with the pharmaceutical composition comprising the peptide identified as SEQ ID NO: 1.
  • the patient treated was 66 years old, female, with a history of type 2 diabetes mellitus, exogenous obesity, grade 4 fatty liver disease. He was admitted, for a diagnosis of COVID-19, presented a digestive picture due to dyspepsia, nausea, occasional diarrhea , for which prokinetics and anti-emetics were indicated. In addition, he presented high concentrations of ferritin, above 1500 ng / mL, and presented an increase in the erythrocyte sedimentation rate with a fall in hemoglobin. Due to this clinical picture, the specialists indicated treatment with the pharmaceutical composition that comprises the peptide identified as SEQ ID NO: 1, at a dose of 1 mg, every 12 hours.
  • the ferritin values were reduced to a concentration of 350 ng / mL.
  • Treatment with the pharmaceutical composition comprising the peptide identified as SEQ ID NO: 1 continued for a further 72 hours.
  • the ferritin concentration normalized, and the patient did not present any symptoms.
  • Example 6 Treatment of a patient with pericarditis of viral etiology with the pharmaceutical composition comprising the peptide identified as SEQ ID NO: 1.
  • the treated patient was 48 years old, confirmed with Covid-19, and admitted to the Holgu ⁇ n Military Hospital. After two days of admission, the patient presented a fever of 38C and two diarrheal stools, and was diagnosed with pericarditis secondary to myocarditis, of viral etiology (Covid-19), without hemodynamic repercussions. The patient did not present respiratory distress.
  • Treatment was started with the pharmaceutical composition comprising the peptide identified as SEQ ID NO: 1, at a dose of 1 mg every 12 hours.
  • the electrocardiogram showed improvement, and at 96 hours of treatment the patient was asymptomatic, with significant clinical improvement.
  • Example 7 Treatment of a patient with Covid-19 hepatic encephalopathy with the pharmaceutical composition comprising the peptide identified as SEQ ID NO: 1.
  • the patient was suspended all the hepatotoxic medications, changes were made to the diet, the gradual replacement of sodium was continued, and the treatment with the pharmaceutical composition that comprises the peptide identified as SEQ ID NO: 1 was started, at a rate of 1 mg every 12 hours, intravenously.
  • the patient was transferred to the intensive care unit, and the pharmaceutical composition comprising the peptide identified as SEQ ID NO: 1 was administered, at a rate of 1 mg every 12 hours, intravenously.
  • the administration of said composition had the objective of modulating the immune response, and thus controlling the cytokine storm, which, according to the clinical picture and laboratory parameters, was triggered in this patient.
  • After 48 hours of treatment a noticeable improvement was observed in the patient, since abdominal pain, arterial hypotension and distal coldness disappeared.
  • the patient began taking food by mouth.
  • clinical and radiological improvement continued, from which the frequency of administration of the pharmaceutical composition comprising the peptide was reduced to 1 mg every 24 hours.
  • the patient was clinically and radiologically asymptomatic. Dengue virus infection was confirmed, as IgM was positive in the serological test. All laboratory parameters were normalized, and the patient was discharged. These results confirmed those outlined in the previous examples, it is confirmed that the pharmaceutical composition that comprises the peptide identified as SEQ ID NO: 1 controls the cytokine storm, which can be linked to the hemophagocytic syndrome that can be associated with various pathologies, such as the case of patients with dengue who transition to a severe stage of the disease.
  • Example 9 Effects of the sucrose concentration on the pharmacological potentiation of the peptide of SEQ ID NO: 1 for the reduction of inflammation.
  • composition For the preparation of the composition, 1.8mg / mL - 3.5mg / mL of the peptide identified as SEQ ID NO: 1 were used and it was dissolved in sodium acetate buffer, pH 4; to which sucrose sugar was added in different concentrations, as described later.
  • mice of the BALB / c line were randomly separated into three groups of 10 each.
  • the mice separated by group were inoculated intravenously, as follows:
  • -Group 1 pharmaceutical composition of the peptide identified as SEQ ID NO: 1, where sucrose was added at a concentration of 10 mg / mL.
  • -Group 2 pharmaceutical composition of the peptide identified as SEQ ID NO: 1, where sucrose was added at a concentration of 30 mg / mL.
  • -Group 3 pharmaceutical composition of the peptide identified as SEQ ID NO:
  • mice received a second dose under identical conditions.
  • the 10 animals per group were sacrificed on day 8 after receiving the first inoculation.
  • the spleen cells of the mice were preincubated with Mab 2.4G2 (eBiosciences, USA), to block non-specific binding to FC receptors.
  • the cells were labeled in PBS containing three percent calf serum and saturating amounts of the following mAbs (eBiosciences, USA): APC-Cy7-anti-CD4 conjugate (clone RM4-5) and APC-anti-CD25 conjugate ( PC61).
  • the Foxp3 transcriptional factor was evaluated through the use of an anti-Foxp3 mAb conjugated to PE (FJK-16s; eBioscience, USA), following the manufacturers' recommendations.
  • An isotype-irrelevant mAb (rat PE-Cy5 IgG2a; eBioscience, USA) was used as a control.
  • the region corresponding to lymphocytes was framed according to their distribution characteristics in the Flow cytometric histograms on an LSR-II TM cytometer. The analyzes were carried out using the FlowJo® program (Tree Star).
  • mice inoculated with the formulation containing the peptide identified as SEQ ID NO: 1 and sucrose at a concentration of 30 mg / mL significantly increased the percentage of regulatory T cells, which shows a synergistic effect between those components of the composition.
  • sucrose at this concentration is decisive to induce the frequency of regulatory T cells, we carried out an experiment under conditions very similar to the previous one, but narrowing the concentration range of said sugar.
  • mice were randomly separated into three groups of 10 mice each.
  • the mice separated by group were inoculated intravenously, as follows:
  • Group 1 pharmaceutical composition of the peptide identified as SEQ ID NO: 1, where sucrose was added at a concentration of 20 mg / mL.
  • sucrose was added at a concentration of 30 mg / mL.
  • mice treated with these sucrose concentrations between 20-40 mg / mL showed a significant increase in the percentage of regulatory T cells compared to the groups treated with 10-80 mg / mL in the previous experiment, observing a synergistic effect between the components of the composition, demonstrating a greater effect in the groups of mice treated with the pharmaceutical composition of the peptide identified as SEQ ID NO: 1, where sucrose was added in concentrations of 20 and 30 mg / mL ( Figure 1 B) .
  • sucrose in concentrations in the range of 20-30 mg / mL is a determining factor for the induction of regulatory T cells, which control the magnitude of inflammation, as well as that this formulation applied intravenously, it has the capacity to control pathologies characterized by hyperinflammation.

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Abstract

Composición farmacéutica que comprende el péptido tipo APL identificado como SEQ ID NO:1, como inhibidor de un estado de hiperinflamación caracterizado por un aumento de citocinas o interleucinas y moléculas inflamatorias, que aumentan su concentración hasta alcanzar el estado definido como "tormenta de citocinas". Las concentraciones de sacarosa en dicha composición aumentan la actividad biológica del péptido, facilitando su aplicación por vía endovenosa. Dicho péptido en una composición farmacéutica es útil para la fabricación de un medicamento para tratar las enfermedades relacionadas con la hiperinflamación, tales como la Covid-19, el dengue, el síndrome de activación de macrófagos, la sepsis respiratoria y las asociadas a las terapias con células T, que poseen receptor de antígeno quimérico, y el síndrome de distrés respiratorio agudo. También revela un método para el tratamiento de dichas enfermedades, administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición.

Description

PÉPTIDO PARA EL TRATAMIENTO DEL SÍNDROME DE LA TORMENTA DE
CITOCINAS
Campo de la técnica La presente invención se relaciona con la rama de la biomedicina y la industria farmacéutica, en particular con una composición farmacéutica para el tratamiento y la prevención del síndrome de la tormenta de citocinas. Dicha composición comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , y puede ser empleada en el tratamiento del síndrome de distrés respiratorio agudo, el síndrome de activación de macrófagos, la sepsis respiratoria, el dengue, la encefalopatía hepática y la pericarditis, entre otras enfermedades.
Estado de la técnica anterior
Dentro de los individuos infectados con el virus SARS-CoV-2 que desarrollan la enfermedad infecciosa Covid-19, se ha descrito un subgrupo de pacientes en los que se genera un estado de hiperinflamación. En estos pacientes se describe una “tormenta de citocinas”, en particular de interleucinas (IL), caracterizada por un aumento de la IL-2, IL-17, IL-6, TNFa, entre otras. Este estado de hiperinflamación conduce a la muerte de los pacientes (Mehta, et al. (2020). The Lancet, 395: 1033- 1034). Por otro lado, en un estudio retrospectivo, en el que se incluyeron 150 casos confirmados con Covid-19 en Wuhan, China, se demostró un aumento significativo de la concentración de la ferritina en los pacientes que no sobrevivieron (1297,6 ng/ml), en comparación con los niveles de esta proteína en los pacientes que sobrevivieron a la enfermedad (614 ng/ml) (Rúan et al. (2020). Intensive Care Med; https://doi.Org/10.1007/s00134-020-05991 -x).
Se conoce que los pacientes en estado grave y crítico afectados por la Covid-19 desarrollan el síndrome de distrés respiratorio agudo. Este se caracteriza por la presencia de eventos inflamatorios en el alveolo pulmonar, que se expanden por la circulación sistémica del organismo. En el curso de este síndrome se produce una afectación endotelial pulmonar, con incremento de la permeabilidad vascular, y del tráfico de células y macromoléculas al espacio alveolar, donde inactivan el surfactante pulmonar, estableciendo las típicas membranas hialinas (Janz y Ware (2014). Clin Chest Med; 35: 685-96). La barrera epitelial también se altera, y se exacerba en esta una respuesta inflamatoria con secreción de IL proinflamatorias, como TNFa, IL-1 b, e IL-6, y de otros mediadores de la inflamación, con la sucesiva activación de neutrófilos, monocitos, macrófagos, y el tráfico de estas moléculas y células hacia los espacios alveolares, incrementando la afectación inicial. El desarrollo de esta hiperinflamación se presenta en otras enfermedades como la sepsis respiratoria, el síndrome de activación de macrófagos, y la sepsis en adultos y neonatos.
Hasta la fecha, no existe una terapia eficaz para los pacientes con la enfermedad Covid-19. Se están utilizando terapias aprobadas para el tratamiento de otras enfermedades, como la administración de anticuerpos monoclonales contra la IL-1 (Anakinra), la IL-6 (Tocilizumab), y los inhibidores de la proteína Janus quinasa. Sin embargo, estos fármacos no han sido eficaces, y además son inmunosupresores, por lo que el uso de estas terapias para tratar la Covid-19 puede conllevar a un empeoramiento del estado general del paciente, ya que se ha comprobado la persistencia viral durante el transcurso de la enfermedad, y aun después de la recuperación clínica del paciente. Tampoco existe una cura efectiva y segura para la sepsis respiratoria, el síndrome de activación de macrófagos, la sepsis neonatal, así como para el distrés respiratorio.
Por tanto, es de gran interés la obtención de fármacos que sean eficaces para el tratamiento de la hiperinflamación y la “tormenta de citocinas” que caracteriza estas patologías.
Explicación de la invención
La presente invención resuelve el problema antes planteado, al proveer una composición farmacéutica para el tratamiento y la prevención del síndrome de la tormenta de citocinas que comprende una concentración de 1 ,8 - 3,6 mg/mL del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 y una concentración de sacarosa entre 20- 30 mg/mL, lo que sorprendentemente, aumenta de forma sinérgica la actividad biológica de dicho péptido, además de resultar un factor determinante para la inducción de las células T reguladoras, las cuales controlan la magnitud de la inflamación. La composición de la invención es capaz de reducir la hiperinflamación que caracteriza el subgrupo de pacientes con la Covid-19 que transitan a un estadio grave, caracterizado por un distrés respiratorio, como sucede en la sepsis respiratoria, el síndrome de activación de macrófagos, y la sepsis neonatal y del adulto. La administración del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 reduce el nivel de citocinas proinflamatorias en los pacientes con la enfermedad Covid-19, sin causar inmunosupresión ni efectos adversos serios o asociados a la terapia con el péptido.
El péptido identificado como SEQ ID NO: 1 se deriva de una región de la proteína HSP60, comprendida entre los aminoácidos del 83 al 109. La HSP60 es muy inmunogénica, tanto en individuos sanos como en pacientes con enfermedades autoinmunes. Sin embargo, el nivel de anticuerpos y células T que esta proteína puede inducir es mayor en los pacientes con enfermedades autoinmunes (de Jong etal { 2009). Arthritis Rheum. 7 (60): 1966-1976). Esta proteína tiene gran capacidad para estimular la reactividad proinflamatoria del sistema inmunitario innato. También se ha encontrado que la HSP60 induce la expresión de los genes de la IL-12 y la IL- 15, citocinas involucradas en la inducción de un fenotipo Th1. Estos hechos sugieren que la HSP60 actúa como una señal de peligro para el sistema inmunitario innato (Habich et al { 2005). J.lmmunol. 3 (174): 1298-1305). Por otra parte, péptidos derivados de la HSP60 también pueden constituir una señal de peligro (Quintana y Cohén (2011). Trends Immunol. 2 (32): 89-95).
El péptido de SEQ ID NO: 1 contiene varios epitopos superpuestos de células T. El mismo incrementa la frecuencia de las células Treg con fenotipo CD4+CD25highFoxp3+ en ensayos ex vivo con células mononucleares de sangre periférica de pacientes con artritis reumatoide. Sin embargo, no ocurre así con células de donantes sanos (Barbera et al (2016). Cell Stress. Chaperones 4 (21): 735-744).
En las solicitudes internacionales de patente No. PCT/CU2005/000008 y PCT/CU2009/000009 se reivindica el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 y su uso para el tratamiento de la artritis reumatoide, y de la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa y la diabetes mellitus tipo I, respectivamente. Todas estas patologías son no trasmisibles. Además, la solicitud de patente WO2019/129315 describe una composición farmacéutica muy estable que contiene el péptido de SEQ ID NO: 1 , su administración causa la disminución de anticuerpos contra péptidos citrulinados y de otros parámetros muy asociados a la citrulinación de proteínas.
El péptido identificado como SEQ ID NO: 1 se obtiene por síntesis química. Mediante experimentos como los que se describen en la presente invención, se pueden evaluar aquellos mecanismos inmunológicos que induce el péptido que participan en el control de la hiperinflamación. La composición farmacéutica fue bien tolerada y con un alto perfil de seguridad, sin evidenciarse signos de inmunosupresión. No se identificaron eventos adversos graves en ningún paciente.
A los efectos de la invención se entiende por síndrome de la tormenta de citocinas al aumento de citocinas proinflamatorias, donde se alcanzan concentraciones que rebasan los niveles normales. Estas citocinas proinflamatorias son IL-6, TNFa, IL-1 , IL-17, entre otras. También se refiere al aumento de otras citocinas, como la IL-10, IL-8 e IL-5. Además, comprende el aumento de biomarcadores de inflamación, como la proteína C reactiva, el fibrinógeno, el Dímero-D, las transaminasas hepáticas, la lactato deshidrogenasa y la ferritina. El aumento de estas moléculas asociadas a la tormenta de citocinas ocurre en pacientes afectados de patologías inflamatorias como: distrés respiratorio agudo, el síndrome de activación de macrófagos, la sepsis respiratoria, el dengue, la encefalopatía hepática y la pericarditis. Desde el punto de vista clínico, puede evidenciarse en los pacientes fiebre sostenida, decaimiento, fatiga y náuseas.
En otro aspecto, la invención revela el uso de una composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y la prevención del síndrome de la tormenta de citocinas. Sorprendentemente, el tratamiento con una composición que comprende dicho péptido permite la retirada de la ventilación mecánica de los pacientes con la Covid-19, a partir de la mejoría de la neumonía intersticial, la disminución de los reactantes de la fase aguda de la inflamación entre las 24 y 48 horas, y la reducción de los biomarcadores de la inflamación. La disminución rápida de la proteína C reactiva, en tan solo 24 horas, es un hallazgo inesperado. Anteriormente, en pacientes con artritis reumatoide que se trataron con este péptido, no se logró demostrar una disminución significativa de la proteína C reactiva (Prada, et al (2018). J Clin Triáis 1 (8): 1-11).
En la presente invención se demuestra la capacidad del péptido identificado como SEQ ID NO: 1, administrado por vía intravenosa, de reducir el distrés respiratorio, la hiperinflamación, los reactantes de la fase aguda de la inflamación, y el nivel de citocinas proinflamatorias en los pacientes con la Covid-19. Sorprendentemente, estos resultados se reprodujeron en pacientes con sepsis respiratoria que presentaron el síndrome de distrés respiratorio. En una realización particular, la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 se utiliza en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y la prevención del síndrome de la tormenta de citocinas que se manifiesta como síndrome de distrés respiratorio agudo, síndrome de activación de macrófagos, sepsis respiratoria en adultos o neonatos, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, tromboembolismo venoso o arterial, elevación aguda de los niveles de ferritina, pericarditis severa, elevación aguda de las transaminasas hepáticas que causan encefalopatía hepática o enfermedad asociada a las terapias con células T que poseen receptor de antígeno quimérico. Dentro de las patologías que se tratan con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 está el síndrome de la tormenta de citocinas que subyace en el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, que se produce en los pacientes tras las quemaduras o traumatismos severos o en enfermedades inflamatorias agudas. En una materialización de la invención, el medicamento se administra por vía intravenosa.
En una realización de la invención, el medicamento se emplea para el tratamiento y la prevención del síndrome de la tormenta de citocinas causado por una enfermedad infecciosa. En una realización particular, dicha enfermedad infecciosa es la Covid-19 o el dengue. Es objeto de la presente invención un método para el tratamiento o prevención del síndrome de la tormenta de citocinas que comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , a un individuo que lo necesita. En una realización particular, el síndrome de la tormenta de citocinas se manifiesta como síndrome de distrés respiratorio agudo, síndrome de activación de macrófagos, sepsis respiratoria en adultos o neonatos, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, tromboembolismo venoso o arterial, elevación aguda de los niveles de ferritina, pericarditis severa, elevación aguda de las transaminasas hepáticas que causan encefalopatía hepática o enfermedad asociada a las terapias con células T que poseen receptor de antígeno quimérico. En una realización, la tormenta de citocinas que se trata o se previene con el método de la invención es causada por una enfermedad infecciosa. En una realización preferida el método de la invención es útil para el tratamiento de la enfermedad infecciosa Covid-19 o dengue. En una materialización de la invención, en dicho método la composición se administra por vía intravenosa.
La administración de la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 a pacientes que lo necesitan disminuye los eventos asociados con un distrés respiratorio. Este distrés provoca que los pacientes tengan necesidad de:
• Oxigenoterapia para mantener saturación de oxígeno (S02) por encima del 93%
• Saturación de oxígeno mayor a 3 puntos porcentuales o disminución en la presión parcial de oxígeno arterial (Pa02) mayor al 10%, con fracción de oxígeno inspirada (Fi02) estable en las últimas 24 horas
• Aumento de Fi02 con el fin de mantener un S02 estable o nueva necesidad de ventilación mecánica en las últimas 24 horas
• Aumento del número y/o extensión de las áreas pulmonares de consolidación Además, la administración de la composición de la invención es útil para el tratamiento de pacientes afectados con la enfermedad infecciosa Covid-19, cuando dichos pacientes tienen necesidad de oxigenoterapia no menor de 6 L/min más una de las siguientes condiciones:
Sibilancia o habla entrecortada
Frecuencia respiratoria mayor de 22 respiraciones/min con oxigenoterapia a L/min
Pa02: Menor de 65 mm Hg Empeoramiento de la imagen radiológica Fiebre mayor o igual a 39QC
Reducción de los valores iniciales de hemoglobina, plaquetas ó leucocitos hemoglobina <9,2 gm/dl, leucocitos <5000/mm3, plaquetas<110,000/mm
Disminución de la eritrosedimentación en discordancia con la proteína C eactiva que aumenta o no se modifica
Aumento del valor inicial de los triglicéridos por encima de 3 mmol/L Aumento del valor inicial de la ferritina a partir de 500 ng/ml o valor absoluto de ferritina mayor o igual a 2000 ng/ml
Transaminasa aspartato-aminotransferasa mayor o igual a 30 Ul/L Aumento del dímero D Fibrinógeno menor de 2,5 g/L • Aparición de manifestaciones neurológicas
La composición de la invención también es útil para el tratamiento de los pacientes con la Covid-19 que entran en un estado grave sin necesidad de oxigenoterapia, pero que presentan un aumento del valor inicial de la ferritina a partir de 500 ng/ml o valor absoluto de ferritina mayor o igual a 2000 ng/ml, con signos radiológicos progresivos de neumonía intersticial multifocal.
También es útil para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por un estado de hiperinflamación aguda como el que desarrollan la sepsis respiratoria en el adulto o en los neonatos; y para las enfermedades que desarrollan el síndrome de distrés respiratorio, así como para dicho síndrome provocado por causas mecánicas y físicas.
Breve descripción de las figuras
Figura 1A. Frecuencia de células T cuantificados por citometría de flujo que expresan el fenotipo CD4+ Foxp3+ , aisladas del bazo de ratones BALB/c, después ser inoculados con la composición farmacéutica del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , donde la sacarosa se adicionó a una concentración de 10 mg/mL. (10 ), de 30 mg/mL (30) y 80 mg/mL (80) . Para el análisis de los datos se emplearon las pruebas estadísticas Kruskal-Wallis y Dunn. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (P<0.05).
Figura 1B. Frecuencia de células T cuantificados por citometría de flujo que expresan el fenotipo CD4+ Foxp3+ , aisladas del bazo de ratones BALB/c, después ser inoculados con la composición farmacéutica del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , donde la sacarosa se adicionó a una concentración de 20 mg/mL. (20 ), 30 mg/mL (30) y 40 mg/mL (40) . Para el análisis de los datos se emplearon las pruebas estadísticas Kruskal-Wallis y Dunn. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (P<0.05).
Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización Ejemplo 1. Tratamiento de pacientes con la enfermedad Covid-19 con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1.
Se ejemplifica con diez pacientes ingresados en la Unidad de Cuidados Intensivos del Hospital Militar Luis Díaz Soto, afectados con la enfermedad infecciosa Covid- 19. Estos pacientes recibían atención médica según el protocolo establecido por el Ministerio de Salud Pública de Cuba para el tratamiento de esta enfermedad. Los pacientes desarrollaron el síndrome de distrés respiratorio agudo, y el mismo día que lo presentaron fueron sometidos a ventilación artificial mecánica/ventilación con liberación de presión en la vía aérea (VAM APRV). Después de recibir el consentimiento informado del representante legal del paciente, según lo establecido por la autoridad regulatoria cubana y el Comité de Ética y Revisión de dicho hospital, los pacientes recibieron la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1. Dicho péptido se obtuvo por síntesis química, por un método bien conocido en este campo de la técnica La composición farmacéutica fue administrada por vía intravenosa, una vez cada 12 horas. En ocho de los diez pacientes, se administró 1 mg del péptido por paciente en cada aplicación. Los pacientes con el código 5 y 6 recibieron 2 mg cada 12 horas, ya que tenían cáncer entre las comorbilidades. Las características de los pacientes, así como los días de VAM APRV y de administración del péptido se reflejan en la Tabla 1.
Tabla 1. Características de los pacientes tratados con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1.
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HTA: hipertensión arterial. VAM APRV: Ventilación artificial mecánica/ventilación con liberación de presión en la vía aérea. Como se aprecia en la tabla, los diez pacientes con la enfermedad Covid-19 que se trataron con el péptido tenían factores de riesgo que predisponen a un estado de gravedad o crítico de la misma. Un solo paciente no presentaba comorbilidades, pero su avanzada edad (80 años) constituye un factor de riesgo. En particular, la paciente identificada con el no. 5 presentó una trombosis venosa profunda. Sin embargo, la evolución clínica de los diez, una vez que se les administró el péptido, fue favorable. En el momento en que se procede a la extubación se considera que finaliza el síndrome de distrés respiratorio agudo. Estos resultados demuestran que el tratamiento con el péptido fue efectivo para el síndrome de distrés respiratorio agudo que desarrollan estos pacientes. La desaparición de dicho síndrome en los pacientes coincidió con la mejoría clínica y radiológica de los mismos. La paciente que presentó la trombosis venosa profunda evolucionó de forma favorable también. Estos pacientes no presentaron ningún síntoma de inmunosupresión. Antes de la terapia presentaban linfopenia, signo característico de los pacientes con Covid-19. Producto del tratamiento con el péptido los niveles de linfocitos circulantes se recuperaron paulatinamente hasta la normalidad.
La literatura especializada refiere que el 85%-90% de los pacientes con síndrome de distrés respiratorio agudo no sobreviven. En Cuba, dentro de los pacientes confirmados con SAR-COV-2 que transitaron hacia un estadio crítico o grave, hubo una tasa de letalidad de 68,6% en los individuos que no fueron tratados con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1. En contraste, la tasa de letalidad fue de 13,0% en los pacientes críticos o graves, confirmados con SAR-COV-2, que se trataron con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1. Ejemplo 2. Administración de la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 para prevenir el establecimiento del síndrome de distrés respiratorio.
Los pacientes en estado grave y críticos afectados de la Covid-19 desarrollan el síndrome de distrés respiratorio, que puede ocasionar la muerte. De forma sorprendente, la administración de la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 previno el desarrollo de un síndrome de distrés respiratorio agudo. El péptido se administró en una etapa temprana, luego de los primeros signos de alarma (indicadores radiológicos progresivos de neumonía intersticial multifocal, ferritina elevada (2 veces por encima del valor normal), oximetría de pulso inferior a 94 de saturación de oxígeno). La administración de dicho péptido previno, por tanto, la necesidad de ventilación artificial. De esta forma, se evitó la probable evolución a una sepsis nosocomial.
Se ejemplifica con un paciente de 42 años, del sexo femenino, afectado con la enfermedad Covid-19, ingresado en la sala de terapia intermedia del Hospital del Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kouri”. Este paciente recibía atención médica, según el protocolo establecido por el Ministerio de Salud Pública de Cuba para el tratamiento de esta enfermedad, pero presentó un cuadro de disnea repentino, con fiebre de 39 QC y una concentración de ferritina de 700 ng/mL. Con el consentimiento informado, se le realizó la administración de la composición farmacéutica que contiene el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , por vía intravenosa, en una dosis de 1 mg, cada 12 horas. Al cabo de las 2 horas, el cuadro de disnea desapareció y la temperatura corporal disminuyó. El paciente no desarrolló el síndrome de distrés respiratorio agudo, y en el transcurso de 72 horas la concentración de ferritina disminuyó por debajo de 500 ng/mL.
Además, se trataron otros tres pacientes en estado grave, cuyas edades y comorbilidades se presentan en la Tabla 2. Estos pacientes estaban ingresados en la sala de terapia intermedia del Hospital Militar Central Luis Díaz Soto.
Tabla 2. Edad y comorbilidades de los pacientes graves tratados con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1.
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HTA: hipertensión arterial
Estos pacientes también presentaron los primeros signos de alarma, como: fiebre sostenida por encima de 38 QC, disnea con necesidad oxigenoterapia por máscara o tenedor nasal, para mantener una saturación de oxígeno por encima de 93. Presentaron, además, polipnea mayor de 25 ventilaciones por minuto y necesitaron oxigenoterapia por máscara o tenedor nasal, para mantener una saturación de oxígeno por encima de 93.
La administración de la composición farmacéutica que contiene el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , se realizó por vía intravenosa, en una dosis de 1 mg, cada 24 horas. Al cabo de las 2 horas de tratamiento, el cuadro de disnea desapareció, y la temperatura corporal disminuyó. Los pacientes no desarrollaron el síndrome de distrés respiratorio agudo, y en el transcurso de 72 horas la concentración de ferritina disminuyó por debajo de 200 ng/mL. Estos resultados demuestran que, el tratamiento de los pacientes con la enfermedad Covid-19 con la composición farmacéutica que contiene el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , antes de que desarrollen el síndrome de distrés respiratorio agudo, evita el uso de la ventilación mecánica para estos pacientes.
Ejemplo 3. Disminución de la proteína C reactiva en los pacientes con la enfermedad Covid-19 tratados con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1.
La proteína C reactiva constituye uno de los marcadores más utilizados para los procesos inflamatorios, es considerada uno de los reactantes de la fase aguda de la inflamación. La composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 se administró por vía intravenosa. Ocho de los diez pacientes afectados con la Covid-19, cuyo tratamiento se describe en el Ejemplo 1 , recibieron 1 mg del péptido cada 12 horas. Los pacientes con el código 5 y 6 que tenían entre las comorbilidades cáncer recibieron 2 mg del péptido cada 12 horas. Inesperadamente, el tratamiento con el péptido de SEQ ID NO: 1 disminuyó los niveles de proteína C reactiva, de forma marcada, en los pacientes tratados. Estos resultados se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Concentración de proteína C reactiva (mg/mL) en los pacientes tratados con el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 .
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No se rea izó la determinación.
La disminución de proteína C reactiva durante el tratamiento de estos pacientes es un indicativo directo de que el péptido de SEQ ID NO: 1 disminuye la inflamación en los mismos, y está en correspondencia con la desaparición del síndrome de distrés respiratorio agudo, así como con la mejoría clínica y radiológica de los pacientes.
Los resultados obtenidos en este estudio son sorprendentes. Durante la realización de un ensayo clínico, en pacientes con artritis reumatoide tratados con el mismo péptido, no se encontró disminución de dicho reactante de la fase aguda de la inflamación.
Ejemplo 4. Disminución de citocinas proinflamatorias en pacientes con la enfermedad Covid-19 tratados con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1.
En este estudio se determinaron los niveles de las citocinas proinflamatorias IL-6, IL- 17, IL-1 , IFNy y TNFa en pacientes con la enfermedad Covid-19 tratados con la composición que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1. Los pacientes se encontraban en estado crítico. El tratamiento de estos pacientes se enunció en el Ejemplo 1 . Dichas citocinas se cuantificaron en los sueros de los pacientes identificados con los números 1 , 2, 3, 4, 7 y 8, que aparecen en la Tabla 1 , Ejemplo 1. Para la determinación de las citocinas en las muestras de suero se inactivó el virus, bajo estrictas medidas de bioseguridad. La cuantificación se realizó justo antes de aplicar la primera dosis del péptido, y a las 48, 72 y 96 horas después de iniciado el tratamiento con el mismo.
Todas las determinaciones de citocinas se realizaron mediante un inmunoensayo tipo ELISA (del inglés enzyme-linked immunosorbent assay) específico para cada una, siguiendo las recomendaciones del fabricante (Quantikine® R&D Systems, EEUU). Brevemente, se añadieron 50 pL del diluente especificado para cada citocina en los pocilios, y a continuación 200 pL de la curva patrón, la muestra o el control. Se incubó la placa durante 2 h a temperatura ambiente, y después se desechó el contenido de cada pocilio. Luego se realizaron tres lavados con la solución de lavado 1X, se añadieron 200 pL del anticuerpo conjugado a cada pocilio, y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Se repitió el lavado y se añadieron 200 pL de la solución sustrato a cada pocilio. Se incubó la placa durante 20 min a temperatura ambiente protegida de la luz, se añadieron 50 pL de la solución de parada a cada pocilio, y se determinó la densidad óptica a 450 nm en un lector de microplacas (Thermo Scientific Multiskan Go, Finlandia). Se realizó una segunda lectura a 570 nm, y se sustrajeron los valores obtenidos a la lectura de 450 nm, para corregir las imperfecciones ópticas en la placa. La determinación de la concentración de cada citocina se realizó por triplicado. Los resultados obtenidos para IL-6 se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4. Niveles de la citocina IL-6 (pg/mL) encontrados en los pacientes tratados con el péptido.
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Como se aprecia en la tabla, hubo una disminución de los niveles de la citocina IL-6, a partir de que los pacientes en estado crítico recibieron el péptido de SEQ ID NO: 1. Esta es una citocina que aumenta marcadamente en los procesos inflamatorios. Se ha descrito que los pacientes con la enfermedad Covid-19 que transitan hacia un estadio grave tienen elevada esta citocina, en contraste con los pacientes que presentan síntomas leves de la enfermedad. De igual forma, se encontró en estos pacientes una disminución de IL-17, IL-1 , IFNy y TNFa. Estos resultados confirman que el tratamiento con el péptido disminuye la hiperinflamación, y la tormenta de citocinas, que desarrollan los pacientes con la enfermedad Covid-19 que transitan a un estadio grave.
Ejemplo 5. Tratamiento de paciente con la enfermedad Covid-19 que presentó altas concentraciones de ferritina sin distrés respiratorio con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1.
El paciente tratado tenía 66 años, era del sexo femenino, con antecedentes de diabetes mellitus tipo 2, obesidad exógena, hepatopatía grasa grado 4. Se ingresó, por diagnóstico de COVID-19, presentó un cuadro digestivo dado por dispepsias, nauseas, diarreas ocasionales, por lo que se le indicó procinéticos y anti-eméticos. Además, presentó altas concentraciones de ferritina, por encima de 1500 ng/mL, y presentó elevación de la velocidad de sedimentación globular con caída de la hemoglobina. Por este cuadro clínico los especialistas le indicaron tratamiento con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , a una dosis de 1 mg, cada 12 horas.
Sorprendentemente, al cabo de 96 horas de tratamiento los valores de ferritina se redujeron a una concentración de 350 ng/mL. El tratamiento con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 continúo durante 72 horas más. Al completar el tratamiento, la concentración de ferritina se normalizó, y el paciente no presentaba ninguna sintomatología.
Estos resultados indican que el tratamiento con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , es capaz de reducir la concentración de ferritina, cuando esta aumenta debido a una infección viral. Ejemplo 6. Tratamiento de paciente con pericarditis de etiología viral con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1. El paciente tratado tenía 48 años de edad, fue confirmado con Covid-19, e ingresado en el Hospital Militar de Holguín. Al cabo de dos días de ingreso, el paciente presentó fiebre de 38 QC y dos deposiciones diarreicas, y se le diagnostica pericarditis secundaria a miocarditis, de etiología viral (Covid-19), sin repercusión hemodinámica. El paciente no presentó distrés respiratorio. Se inició el tratamiento con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , a una dosis de 1 mg cada 12 horas.
Sorprendentemente, al cabo de 24 horas de tratamiento el electrocardiograma presentó mejoría, y a las 96 horas de tratamiento el paciente se encontraba asintomático, con mejoría clínica significativa. Estos resultados confirmaron que la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO:1 disminuye la inflamación que tiene lugar en patologías como la pericarditis secundaria a miocarditis, sin repercusión hemodinámica, de etiología viral.
Ejemplo 7. Tratamiento de paciente con encefalopatía hepática por Covid-19 con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1.
Paciente del sexo femenino, 55 años de edad, raza blanca, con antecedentes patológicos de hipertensión arterial. Dicha paciente ingresó en el hospital Luis Díaz Soto, en sala de aislamiento, servicio de medicina interna, al ser positiva al coronavirus que provoca la enfermedad Covid-19. Por ello, se le comenzó el tratamiento para dicha enfermedad, según el protocolo establecido en el país. Durante el ingreso estuvo asintomática hasta el décimo día. Dicho día presentó episodios de ansiedad o nerviosismo, asociado a cifras tensionales elevadas (160/90 mm Hg). Fue valorada por especialistas en psiquiatría, y se le realizaron exámenes de laboratorio complementarios. El paciente no presentó distrés respiratorio. El psiquiatra realizó el diagnostico de síndrome ansioso, con elementos de un síndrome psicopático.
El paciente empeoró su cuadro clínico al día 11 , presentó vómitos, cifras tensionales elevadas, tendencia a la taquicardia, sin relajación de esfínteres, por lo que se traslada para la unidad de cuidados intensivos. La hemogasometría evidenció la existencia de hiponatremia grave (concentración de Na 105 mmol/L). La Tomografía Axial Computarizada no presentó alteraciones craneoencefálicas, y los exámenes complementarios indicaron las enzimas hepáticas marcadamente elevadas, así como una leucocitosis. A partir de estos resultados el paciente fue diagnosticado con un cuadro clínico correspondiente a una encefalopatía hepática.
Al paciente se le suspendieron todos los medicamentos hepatotóxicos, se le realizaron los cambios en la dieta, se continuó la reposición paulatina del sodio, y se inició el tratamiento con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO:1 , a razón de 1 mg cada 12 horas, por vía endovenosa.
Se le realizó un seguimiento clínico diario con los exámenes complementarios de laboratorio. Sorprendentemente, después de 72 horas de tratamiento con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , la evolución fue favorable, con el descenso de las enzimas hepáticas, descenso progresivo de la creatina quinasa y de los azoados en sangre, así como la normalización de la concentración del sodio. A las 96 horas de tratamiento, el cuadro correspondiente a una encefalopatía hepática se revirtió completamente, el tratamiento con la composición farmacéutica que comprende el péptido se mantuvo por tres días más. Estos resultados confirmaron que la administración de la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 disminuye la inflamación que tiene lugar en patologías como la encefalopatía hepática. Ejemplo 8. Tratamiento de paciente con dengue con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1.
Paciente del sexo femenino, de 19 años, que acudió al hospital Luis Díaz Soto, por presentar fiebre de 38,5 QC, por más de 72 horas, y cefalea intensa holocraneal. Además, presentaba dolor retroocular asociado a discreta inyección conjuntival. A partir de dichos síntomas, se decide su ingreso hospitalario por sospecha de dengue.
Al examen físico de dicha paciente, se constató hipertermia de 39,9 QC, tensión arterial de 90/60 mm Hg, taquicardia y discreta frialdad distal. A la inspección de la piel, el médico detectó petequias en la región de los antebrazos y el abdomen, con prueba de lazo positiva. Se trató terapéuticamente con soporte de volumen a 30 mL/Kg de peso corporal, por 24 horas.
Al cabo de las 24 horas de ingreso, el paciente comenzó con dolor abdominal y vómitos. Los exámenes complementarios indicaron leucopenia (2,9 x 109 leucocitos totales), eritrosedimentación de 95 mm/h, proteína C reactiva 150 mg/mL, Lactato Deshidrogenasa 918 U/L, Transaminasa Glutámico Oxalacética 93 Ul/L, Transaminasa Glutámico Pirúvica 58 Ul/L. El ultrasonido abdominal indicó presencia de líquido libre en los cuatro ángulos, de moderada intensidad. La vesícula presentó paredes engrosadas y edema perivesicular, sin litiasis. Se le aplicaron al paciente medidas terapéuticas de sostén, que incluyeron soluciones cristaloides a razón de 35 - 45 mL/Kg de peso, para 24 horas.
La tórpida evolución del paciente y la escasa respuesta a las medidas terapéuticas basadas en la reposición de líquidos, hizo sospechar al equipo médico que el paciente desarrolló el síndrome de activación de macrófagos, secundario a la infección por el virus que causa el dengue. Esto se comprobó por los valores de los parámetros de laboratorio asociados a dicho síndrome, ferritina: 1893 mg/L; fibrinógeno: 2,31 g/L; proteína C reactiva: 150 mg/mL; eritrosedimentación: 53 mm/h.
A partir de estos resultados, se trasladó el paciente a la unidad de cuidados intensivos, y se le administró la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO:1 , a razón de 1 mg cada 12 horas, por vía endovenosa. La administración de dicha composición tuvo el objetivo de modular la respuesta inmunológica, y controlar así la tormenta de citocinas, que según el cuadro clínico y los parámetros de laboratorio se desencadenó en este paciente. Al cabo de las 48 horas de tratamiento, se observó una mejoría ostensible en el paciente, ya que desaparecieron el dolor abdominal, la hipotensión arterial y la frialdad distal. El paciente inició la ingestión de alimentos por vía oral. Al cabo de las 72 horas, continuó la mejoría clínica y radiológica, a partir de lo cual se redujo la frecuencia de administración de la composición farmacéutica que comprende el péptido a 1 mg cada 24 horas.
Al cabo del séptimo día de tratamiento, el paciente se encontraba asintomático, desde el punto de vista clínico y radiológico. Se confirmó la infección por el virus dengue, al resultar IgM positivo en la prueba serológica. Todos los parámetros de laboratorio se normalizaron, y se decidió el egreso del paciente. Estos resultados confirmaron los esbozados en los ejemplos anteriores, se confirma que la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO:1 controla la tormenta de citocinas, que puede estar vinculada al síndrome hemofagocítico que puede estar asociado a diversas patologías, como es el caso de pacientes con dengue que transitan a un estadio grave de la enfermedad. Ejemplo 9. Efectos de la concentración de la sacarosa en la potenciación farmacológica del péptido de SEQ ID NO:1 para la reducción de la inflamación.
Con el objetivo de usar el péptido identificado como SEQ ID NO:1 , como inductor de mecanismos moleculares que producen la reducción de la hiperinflamación en pacientes con COVID-19 y otras patologías, estudiamos la influencia del azúcar sacarosa en la composición, en un rango de concentraciones, para seleccionar la concentración óptima de este azúcar, asociada a la inducción de células T reguladoras, cuando la formulación es aplicada por vía intravenosa.
Para la preparación de la composición se utilizaron de 1 ,8mg/mL - 3,5mg/mL del péptido identificado como SEQ ID NO:1 y se disolvió en tampón acetato de sodio, pH 4; a lo que se le adicionó el azúcar sacarosa en diferentes concentraciones, como se describe posteriormente.
Ratones machos de la línea BALB/c se separaron aleatoriamente en tres grupos de 10 cada uno. Los ratones separados por grupo, fueron inoculados por vía intravenosa, de la siguiente forma:
-Grupo 1 : composición farmacéutica del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , donde la sacarosa se adicionó a una concentración de 10 mg/mL. -Grupo 2: composición farmacéutica del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , donde la sacarosa se adicionó a una concentración de 30 mg/mL. -Grupo 3: composición farmacéutica del péptido identificado como SEQ ID
NO: 1 , donde la sacarosa se adicionó a una concentración de 80 mg/mL. Cuatro días después, los ratones recibieron una segunda dosis en idénticas condiciones. Los 10 animales por grupo se sacrificaron el día 8 después de recibir la primera inoculación. Las células del bazo de los ratones se preincubaron con el AcM 2.4G2 ( eBiosciences , EUA), para bloquear las uniones no específicas a los receptores FC. Seguidamente, las células se marcaron en PBS conteniendo tres porcentaje de suero de ternero y cantidades saturantes de los siguientes AcM ( eBiosciences , EUA): APC-Cy7-conjugado anti-CD4 (clon RM4-5) y APC-conjugado anti-CD25 (PC61). El factor transcripcional Foxp3 se evaluó a través del uso de un AcM anti-Foxp3 conjugado a PE (FJK-16s; eBioscience, EUA), siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. Un AcM con isotipo irrelevante (PE-Cy5 lgG2a de rata; eBioscience, EUA) se utilizó como control. La región correspondiente a los linfocitos se enmarcó de acuerdo a las características de distribución de estos en los histogramas de citometría de flujo en un citómetro LSR-II™. Los análisis se efectuaron empleando el programa FlowJo® (Tree Star).
Como se aprecia en esta Figura 1A los ratones inoculados con la formulación conteniendo el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 y la sacarosa a una concentración de 30 mg/mL, aumentaron de forma significativa el porcentaje de las células T reguladoras, lo que demuestra un efecto sinérgico entre esos componentes de la composición. Con el objetivo de precisar si la sacarosa a esta concentración es determinante para inducir la frecuencia de las células T reguladoras, realizamos un experimento en condiciones muy similares al anterior, pero estrechando el rango de concentración de dicho azúcar.
Los ratones se separaron aleatoriamente en tres grupos de 10 ratones cada uno. Los ratones separados por grupo, fueron inoculados por vía intravenosa, de la siguiente forma:
- Grupo 1 : composición farmacéutica del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , donde la sacarosa se adicionó a una concentración de 20 mg/mL.
- Grupo 2: composición farmacéutica del péptido identificado como SEQ ID
NO: 1 , donde la sacarosa se adicionó a una concentración de 30 mg/mL.
- Grupo 3: composición farmacéutica del péptido identificado como SEQ ID
NO: 1 , donde la sacarosa se adicionó a una concentración de 40 mg/mL. Sorprendentemente, los ratones tratados con estas concentraciones de sacarosa entre los 20-40 mg/mL mostraron un aumento significativo del porcentaje de las células T reguladoras respecto a los grupos tratados con 10-80 mg/mL del experimento anterior, observándose un efecto sinérgico entre los componentes de la composición, demostrando un mayor efecto en los grupos de ratones tratados con la composición farmacéutica del péptido identificado como SEQ ID NO:1 , donde la sacarosa se adicionó en las concentraciones de 20 y 30 mg/mL (Figura 1 B).
Estos resultados nos permiten concluir que la adición de sacarosa en concentraciones en el rango de 20-30 mg/mL, es un factor determinante para la inducción de las células T reguladoras, las cuales controlan la magnitud de la inflamación, así como que esta formulación aplicada por vía intravenosa tiene capacidad para controlar las patologías caracterizadas por la hiperinflamación.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Composición farmacéutica para el tratamiento y la prevención del síndrome de la tormenta de citocinas que comprende el péptido identificado como SEQ ID No. 1 y un excipiente farmacéuticamente aceptable
2. Composición farmacéutica de la reivindicación 1 caracterizada porque comprende el péptido identificado como SEQ ID NO:1 en un rango de concentraciones entre 1 ,8 mg/mL - 3,6 mg/mL y sacarosa en una de concentración entre 20-30 mg/mL.
3. La composición de la reivindicación 1 caracterizada porque se aplica por la vía endovenosa.
4. Uso de una composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID No. 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y la prevención del síndrome de la tormenta de citocinas.
5. El uso de la reivindicación 4 donde el síndrome de la tormenta de citocinas se manifiesta como síndrome de distrés respiratorio agudo, síndrome de activación de macrófagos, sepsis respiratoria en adultos o neonatos, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, tromboembolismo venoso o arterial, elevación aguda de los niveles de ferritina, pericarditis severa, elevación aguda de las transaminasas hepáticas que causan encefalopatía hepática o enfermedad asociada a las terapias con células T que poseen receptor de antígeno quimérico.
6. El uso de la reivindicación 4 donde la composición se administra por vía intravenosa.
7. El uso de la reivindicación 4 donde el síndrome de la tormenta de citocinas es causado por una enfermedad infecciosa.
8. El uso de la reivindicación 7 donde la enfermedad infecciosa es la Covid-19 o el dengue.
9. Método para el tratamiento o prevención del síndrome de la tormenta de citocinas que comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID No. 1.
10. El método de la reivindicación 9 donde el síndrome de la tormenta de citocinas se manifiesta como síndrome de distrés respiratorio agudo, síndrome de activación de macrófagos, sepsis respiratoria en adultos o neonatos, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, tromboembolismo venoso o arterial, elevación aguda de los niveles de ferritina, pericarditis severa, elevación aguda de las transaminasas hepáticas que causan encefalopatía hepática o enfermedad asociada a las terapias con células T que poseen receptor de antígeno quimérico.
11. El método de la reivindicación 9 donde la composición se administra por vía intravenosa.
12. El método de la reivindicación 9 donde el síndrome de la tormenta de citocinas es causado por una enfermedad infecciosa.
13. El método de la reivindicación 12 donde la enfermedad infecciosa es la Covid- 19 o el dengue.
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