WO2021215624A1 - 신규의 2-아릴티아졸 유도체 또는 이의 염, 이의 제조방법, 및 이를 함유하는 약학 조성물 - Google Patents

신규의 2-아릴티아졸 유도체 또는 이의 염, 이의 제조방법, 및 이를 함유하는 약학 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a novel 2-arylthiazole derivative or salt thereof, a method for preparing the same, and a pharmaceutical composition containing the same. More particularly, the present invention relates to certain carboxamide moieties, such as substituted aminoalkyl-carboxamide moieties, N-containing heterocyclicalkyl-carboxamide moieties, or N-containing heterocyclic moieties.
  • the 2-arylthiazole derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention has an excellent ability to induce autophagy.
  • Autophagy also referred to as autophagocytosis, is a natural regulatory mechanism that disassembles unnecessary or dysfunctional cellular components. Autophagy enables the orderly degradation and recycling of cellular components. In this process, the target cytoplasmic component is separated from the rest of the cell in a double-membrane vesicle known as an autophagosome. The autophagosome then fuses with the lysosome, and the contents are degraded and recycled.
  • Three forms of autophagy are generally mentioned: macroautophagy, microautophagy, and chaperone-mediated autophagy (CMA).
  • CMA chaperone-mediated autophagy
  • In disease autophagy has been observed to increase survival as an adaptive response to stress, whereas in other cases it has been shown to increase cell death and morbidity. In extreme cases of starvation, destruction of cellular components promotes cell survival by maintaining cellular energy levels.
  • a substance capable of effectively inducing autophagy may be usefully used for the prevention and treatment of various diseases related to autophagy, for example, degenerative brain disease, liver disease, metabolic disease, sepsis, etc. It is expected.
  • the inventors have identified certain carboxamide moieties, for example, substituted aminoalkyl-carboxamide moieties, N-containing heterocyclicalkyl-carboxamide moieties, or N-containing heterocyclic-carboxamide moieties. It has been found that a novel 2-arylthiazole derivative having thiazole or a pharmaceutically acceptable salt thereof has a remarkably excellent autophagy-inducing activity, and thus is useful for the treatment and prevention of various diseases related to autophagy.
  • an object of the present invention is to provide the 2-arylthiazole derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a method for preparing the same, a pharmaceutical composition comprising the same, and uses thereof.
  • a pharmaceutical composition comprising the 2-arylthiazole derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • a method of treating an autophagy-associated disease comprising administering the 2-arylthiazole derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the 2-arylthiazole derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of an autophagy-associated disease.
  • Certain carboxes such as compounds according to the invention, i.e. a substituted aminoalkyl-carboxamide moiety, an N-containing heterocyclicalkyl-carboxamide moiety, or an N-containing heterocyclic-carboxamide moiety
  • a novel 2-arylthiazole derivative having an amide moiety or a pharmaceutically acceptable salt thereof has remarkably excellent autophagy-inducing activity. Therefore, the compound according to the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be usefully applied to the treatment and prevention of various diseases associated with autophagy, including degenerative brain disease, liver disease, metabolic disease, sepsis, and the like.
  • 1 shows the results of analyzing the autophagy flux of a compound according to the present invention in N2a cells.
  • 1A is an imaging result of the entire cell by the mosaic technique, and arrows indicate autophagy.
  • 1B is an electron microscope imaging result of N2a cells treated with the compound of Example 29, black arrows indicate autophagosomes, and white arrows indicate autolysosomes.
  • Figure 2 is a summary of the liver function improvement activity evaluation method by oral administration in the liver injury model of Test Example 4.
  • Figure 3 is a summary of the liver function improvement activity evaluation method by oral administration in the liver injury model of Test Example 5.
  • FIG. 4 shows the results obtained by performing hematoxylin & eosin (H&E) staining and Masson's Trichrome staining on the tissue sample obtained in Test Example 5.
  • Scale bar left solid black line 100 ⁇ m, right black solid line 100 ⁇ m.
  • alkyl refers to an aliphatic hydrocarbon radical, and includes both straight-chain or branched hydrocarbon radicals.
  • C 1-6 alkyl is an aliphatic hydrocarbon group having from 1 to 6 carbon atoms, methyl, ethyl, propyl, n - butyl, n - pentyl, n - hexyl, isopropyl, isobutyl, sec - butyl, tert - butyl, neopentyl, isopentyl, and the like.
  • 'hydroxy' is defined as -OH
  • 'alkoxy' refers to a radical in which the hydrogen atom of the hydroxy group is replaced with alkyl, unless otherwise defined.
  • C 1-6 alkoxy is methoxy, ethoxy, propoxy, n -butoxy, n -pentyloxy, isopropoxy, isobutoxy, sec -butoxy, tert -butoxy, neopentyloxy , isopentyloxy, and the like.
  • alkylamino refers to amino substituted with mono- or di-alkyl.
  • C 1-6 alkylamino includes amino substituted with mono- or di-C 1-6 alkyl.
  • the present invention provides a compound or a salt thereof having excellent autophagy inducing ability, that is, a compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • R 1 is hydrogen; C 1 -C 4 alkyl group; or a C 1 -C 4 alkyl group substituted with mono or di-C 1 -C 5 alkylamino;
  • R 2 is a C 1 to C 4 alkyl group
  • A is a group selected from the group consisting of groups of formulas 1a to 1d,
  • n 1, 2, or 3;
  • R 3 and R 4 are, independently of each other, hydrogen; C 1 -C 4 alkyl; or together with the nitrogen atom to which they are attached form piperidine, morpholine, or pyrrolidine (wherein the piperidine, morpholine, or pyrrolidine is optionally substituted with C 1 -C 4 alkyl);
  • R 5 and R 6 are C 1 -C 4 alkyl; or ring together to form cyclopentane, cyclohexane or tetrahydro-pyran,
  • Cy is a nitrogen-containing heterocyclic group selected from the group consisting of homopiperazinyl, piperidinyl, morpholinyl, and pyrrolidinyl, wherein the nitrogen-containing heterocyclic group is optionally C 1 to C 4 alkyl or benzyl is replaced by ).
  • R 1 is hydrogen; isobutyl group; Alternatively, it may be a diethylaminoethyl group, and R 2 may be a methyl group.
  • A is a group selected from the group consisting of the groups of formulas 1a to 1d.
  • A may be a group of Formula 1a or a group of Formula 1b.
  • A is a group of formula (1a) or a group of formula (1b)
  • the compounds of the present invention have structures of the following formulas (11a and 11b).
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , and R 6 are the same as defined above.
  • R 3 and R 4 together with the nitrogen atom to which they are attached may form piperidine, morpholine, or pyrrolidine. More preferably, the piperidine, morpholine, or pyrrolidine may be substituted with C 1 -C 4 alkyl.
  • the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be one or more selected from the group consisting of the following compounds.
  • the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be one or more selected from the group consisting of the following compounds.
  • the compound of Formula 1 may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt, for example, in the form of an acid addition salt.
  • the acid addition salt can be obtained from conventional inorganic or organic acids, for example, hydrochloride, bromate, iodate, nitrate, sulfate, hydrogen sulfate, phosphate, acetate, lactate, citrate, tartrate, succinate, maleate, malonate, oxalate, fumarate, gluconate, saccharate, benzoate, methanesulfonate, ethanesulfonate, benzenesulfonate, p-toluenesulfonate, pamoate, and the like. it is not
  • the acid addition salt may be obtained by reacting the compound of Formula 1 with an inorganic acid or an organic acid in a common solvent, for example, water, alcohol, tetrahydrofuran, acetone, or a mixed solution thereof.
  • the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention may be in the form of an anhydride, a hydrate, or a solvate.
  • the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention may be in the form of an amorphous or crystalline form, and they may also be in the form of a hydrate or a solvate.
  • the hydrate or solvate may contain water or an organic solvent in a stoichiometric or non-stoichiometric amount with respect to the compound of Formula 1.
  • the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof may have a substituent including an asymmetric carbon.
  • the compound of Formula 1 or a salt thereof is an optical isomer or racemic (RS) such as (R) or (S). ) may exist.
  • the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof includes all optical isomers or racemics (RS) such as (R) or (S).
  • the present invention also includes a method for preparing the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be prepared by acylating the compound of Formula 2 using an N-containing compound to prepare the compound of Formula 1, as shown in Scheme 1 below. or acylating the compound of Formula 3 using an N-containing compound to prepare a compound of Formula 4; and performing an alkylation reaction of the compound of Formula 4 with R 1 X of Formula 5 to prepare the compound of Formula 1.
  • the present invention provides a compound of formula 2 NH 2 -(CH 2 ) n -NR 3 R 4 , NH 2 -CH 2 -CR 5 R 6 -NR 3 R 4 , Cy, and NH 2 -Cy
  • R 1 , R 2 , and A are the same as defined above.
  • the present invention provides a compound of formula 3 with NH 2 -(CH 2 ) n -NR 3 R 4 , NH 2 -CH 2 -CR 5 R 6 -NR 3 R 4 , Cy, and NH 2 -Cy
  • R 1 , R 2 , and A are the same as defined above, and X is halogen.
  • the compound of Formula 2, the compound of Formula 3, and the N-containing compound ie, NH 2 -(CH 2 ) n -NR 3 R 4 , NH 2 -CH 2 -CR 5 R 6 -NR 3 R 4 , Cy , or NH 2 -Cy
  • the N-containing compound ie, NH 2 -(CH 2 ) n -NR 3 R 4 , NH 2 -CH 2 -CR 5 R 6 -NR 3 R 4 , Cy , or NH 2 -Cy
  • the acylation reaction is an acylating agent 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide [1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDC], dicyclohexylcarbodiimide [dicyclohexylcarbodiimide, DCC], 1,1'-carbonyldiimidazole (1,1'-carbonyldiimidazole, CDI], N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline (N-ethoxycarbonyl-2- ethoxy-1,2-dihydroquinoline, EEDQ], etc.
  • the acylation reaction can also be carried out using thionyl chloride, oxalyl chloride or phosphorus chloride with the compound of Formula 2 and Formula 3 It can be carried out by reacting with a compound to prepare an acyl chloride and then reacting with an N-containing compound
  • the acylation reaction can be carried out in a common organic solvent such as dichloromethane and dimethylformamide.
  • the alkylation reaction may be performed in the presence of a base of an alkali metal such as sodium hydroxide or sodium carbonate.
  • the molar ratio of the compound of Formula 4 and R 1 X of Formula 5 may be in the range of 1:1 to 1:5, preferably about 1:1.
  • the alkylation reaction may be performed in water, a C 1 to C 4 alcohol, acetone, tetrahydrofuran, toluene, or a mixed solvent thereof.
  • the 2-arylthiazole derivative according to the present invention that is, the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, has excellent autophagy-inducing ability, so that autophagy including degenerative brain disease, liver disease, metabolic disease, sepsis, etc. It can be usefully applied to the treatment and prevention of various diseases associated with predation.
  • the present invention includes a pharmaceutical composition for induction of autophagy comprising a therapeutically effective amount of the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a degenerative brain disease selected from the group consisting of Huntington's disease, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, prion disease, multiple sclerosis, and Lou Gehrig's disease; liver disease selected from the group consisting of liver fibrosis, cirrhosis, hepatitis, and fatty liver; a metabolic disease selected from the group consisting of diabetes, hyperlipidemia, obesity, and inflammation; Or it may be a pharmaceutical composition for preventing or treating sepsis.
  • a degenerative brain disease selected from the group consisting of Huntington's disease, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, prion disease, multiple sclerosis, and Lou Gehrig's disease
  • liver disease selected from the group consisting of liver fibrosis, cirrhosis, hepatitis, and fatty liver
  • a metabolic disease selected from the group consisting of diabetes, hyperlipidemia, obesity, and inflammation
  • it may be a pharmaceutical composition for preventing or treating sepsis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include pharmaceutically acceptable carriers such as excipients, disintegrants, sweeteners, lubricants or flavoring agents commonly used, and tablets, capsules, powders, granules and suspensions according to conventional methods.
  • oral preparations such as preparations, emulsions or syrups; Alternatively, it may be formulated as a preparation for parenteral administration such as an external solution, an external suspension, an external emulsion, a gel (ointment, etc.), an inhalant, a spray, an injection, and the like.
  • the formulation may be formulated in a variety of forms, for example, single-dose or multiple-dose dosage forms.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include excipients such as lactose and corn starch, lubricants such as magnesium stearate, emulsifiers, suspending agents, stabilizers, and isotonic agents. If desired, sweetening and/or flavoring agents may be added.
  • excipients such as lactose and corn starch
  • lubricants such as magnesium stearate, emulsifiers, suspending agents, stabilizers, and isotonic agents.
  • sweetening and/or flavoring agents may be added.
  • composition of the present invention may be administered orally, or parenterally, including inhalation, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intracerbroventricular injection, rectal and topical administration.
  • the composition of the present invention may be formulated in various forms such as tablets, capsules, aqueous solutions or suspensions.
  • carriers such as lactose and corn starch and lubricants such as magnesium stearate may be usually added.
  • capsules for oral administration lactose and/or dried corn starch may be used as diluents. If an aqueous suspension for oral use is required, the active ingredient may be combined with an emulsifying and/or suspending agent.
  • compositions according to the present invention may be in the form of an aqueous solution containing a pharmaceutically acceptable carrier, such as saline having a pH of 7.4.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as saline having a pH of 7.4. The solution can be introduced into the patient's intramuscular bloodstream by local bolus injection.
  • the 2-arylthiazole derivative that is, the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, is administered to the patient in an amount of about 0.0001 mg/kg to about 100 mg/kg per day, preferably about 0.001 to 100 mg/kg per day. It may be administered in an effective amount.
  • the administration may be administered once a day or in divided doses via oral or parenteral routes. Of course, the dosage may be changed according to the patient's age, condition, weight, sensitivity, disease severity, administration route, administration period, and the like.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof in an amount of 0.001 to 99% by weight, preferably 0.01 to 60% by weight.
  • the present invention also includes a method of inducing autophagy in a mammal, comprising administering to the mammal a therapeutically effective amount of the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention relates to a degenerative brain disease selected from the group consisting of Huntington's disease, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, prion disease, multiple sclerosis, and Lou Gehrig's disease; liver disease selected from the group consisting of liver fibrosis, cirrhosis, hepatitis, and fatty liver; a metabolic disease selected from the group consisting of diabetes, hyperlipidemia, obesity, and inflammation; or a method for preventing or treating sepsis.
  • a degenerative brain disease selected from the group consisting of Huntington's disease, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, prion disease, multiple sclerosis, and Lou Gehrig's disease
  • liver disease selected from the group consisting of liver fibrosis, cirrhosis, hepatitis, and
  • the present invention also provides the use of a compound of formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in the manufacture of a medicament for inducing autophagy in a mammal.
  • the present invention relates to a degenerative brain disease selected from the group consisting of Huntington's disease, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, prion disease, multiple sclerosis, and Lou Gehrig's disease; liver disease selected from the group consisting of liver fibrosis, cirrhosis, hepatitis, and fatty liver; a metabolic disease selected from the group consisting of diabetes, hyperlipidemia, obesity, and inflammation; or the use of the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of sepsis.
  • the title compound was prepared in the same manner as in Example 1, except that 2-(diisopropylamino)ethylamine was used instead of 2-(diethylamino)ethylamine (yield: 55.5%).
  • the title compound was prepared in the same manner as in Example 1, except that 2-(dimethylamino)ethylamine was used instead of 2-(diethylamino)ethylamine (yield: 90.6%).
  • the title compound was prepared in the same manner as in Example 1, except that 4-amino-1-methylpiperidine was used instead of 2-(diethylamino)ethylamine (yield: 62.4%).
  • the title compound was prepared in the same manner as in Example 1, except that 1-(2-aminoethyl)pyrrolidine was used instead of 2-(diethylamino)ethylamine (yield: 59.5%).
  • the title compound was prepared in the same manner as in Example 1, except that 1-(2-aminoethyl)piperidine was used instead of 2-(diethylamino)ethylamine (yield: 72.7%).
  • the title compound was prepared in the same manner as in Example 1, except that 1-(aminomethyl)-N,N-dimethylcyclopentylamine was used instead of 2-(diethylamino)ethylamine (yield: 72.9%). .
  • the title compound was prepared in the same manner as in Example 1, except that 1-(aminomethyl)-N,N-dimethylcyclohexylamine was used instead of 2-(diethylamino)ethylamine (yield: 58.3%). .
  • the title compound was prepared in the same manner as in Example 1, except that 4-aminomorpholine was used instead of 2-(diethylamino)ethylamine (yield: 59.9%).
  • N-(2-(diisopropylamino)ethyl)-2-(3-cyano-4-hydroxyphenyl)-4-methylthiazole-5-carboxamide hydrochloride prepared in Example 18 (3.17 g ) was added to a solution of sodium hydroxide (1.26 g) dissolved in purified water (8 ml) and tetrahydrofuran (35 ml), and then 2-diethylaminoethyl chloride hydrochloride (1.30 g) was added thereto, and at about 70° C. for 4 hours. stirred. The reaction mixture was cooled to room temperature, and then the aqueous layer was separated and removed.
  • Example 28 N-((4-(dimethylamino)tetrahydro-2H-pyran-4-yl)methyl)-2-(3-cyano-4-hydroxyphenyl)-4-methylthiazole prepared in Example 28 Except for using 5-carboxamide hydrochloride, the title compound was prepared in the same manner as in Example 23 (yield: 74.0%).
  • the autophagy-inducing activity of the compounds of the present invention was measured in Hela cells (Korea Cell Line Bank) using an autophagy detection kit (DAPGreen Autophagy detection (Dojindo, D676-10)) according to the manufacturer's instructions. Specifically, 8 X 10 4 Hela cells per well were seeded into each well of a 96-well plate using FluroBrite DMEM containing 10% fetal bovine serum (FBS), and cultured overnight at 37° C. in a CO 2 incubator. was stabilized.
  • FBS FluroBrite DMEM containing 10% fetal bovine serum
  • DAPGreen (Cat.D676-10, Dojindo) solution (0.1 mM in DMSO) was diluted 1/1000 in medium (FluroBrite DMEM containing 10% FBS) to obtain a medium containing 0.1 ⁇ M DAPGreen (DAPGreen/FBS-containing medium).
  • DAPGreen/FBS-containing medium a medium containing 0.1 ⁇ M DAPGreen (DAPGreen/FBS-containing medium).
  • FluroBrite DMEM 100ul of the DAPGreen/FBS-containing medium obtained above was put into each well, and incubated in a CO 2 incubator for 30 minutes. Fluorescence (EX: 450 nm / EM: 535 nm) was measured at the start of the DAPGreen treatment and 30 minutes after the treatment, respectively, and the difference value was set as the baseline uptake value of the cells.
  • the relative fluorescence value is 1 when exhibiting an autophagy-inducing ability equivalent to that of the positive control material, and when the test substance prepared in Example shows excellent autophagy-inducing ability, the relative fluorescence value is greater than 1, If the test substance prepared in the example is low and shows autophagy inducing ability, the relative fluorescence value is less than 1.
  • the compound according to the present invention when cultured for 4 hours after treatment with the test substance, the compound according to the present invention exhibits an autophagy-inducing activity equal to or greater than that of the positive control, rapamycin, and 2-( It can be seen that, compared to 3-cyano-4-isobutoxyphenyl)-4-methylthiazole-5-carboxylic acid, it exhibits significantly superior autophagy-inducing activity. Therefore, the compound according to the present invention exhibits remarkably excellent autophagy-inducing activity, and thus can be usefully applied to the treatment and prevention of various diseases related to autophagy, including degenerative brain disease, liver disease, metabolic disease, sepsis, and the like.
  • CYTO-TM ID auto grip detection kit CYTO-ID TM Autophagy Detection Kit , ENZ-51031-K200, Enzo Life Sciences, Inc.
  • ALP autophagy lysosomal pathway activation by the compound of the present invention was verified.
  • Neurons primary mouse cortical neuron cells
  • 20 U/ml papain Worthington Biochemical Corporation, LK003176
  • DNase I Worthington Biochemical Corporation, LK003170
  • the compounds of Examples 10 and 29 significantly increase autophagy vesicle formation, despite the 1/2 concentration compared to the positive control rapamycin. Therefore, the compound according to the present invention exhibits remarkably excellent autophagy-inducing activity, and thus can be usefully applied to the treatment and prevention of various diseases related to autophagy, including degenerative brain disease, liver disease, metabolic disease, sepsis, and the like.
  • N2a cells (ATCC, CCL-131, mouse neuroblastoma cell line) (3 X 10 4 cells) and medium (5% heat-inactivated fetal bovine serum, FBS; Gibco, 16000-044) and DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco, 11995-065) supplemented with 50 ⁇ g/ml penicillin-streptomycin (Gibco, 15140-122) was added to each well of a 6-well plate, and incubated at 37° C., CO 2 Incubated overnight. The compound of Example 29 (5uM), and rapamycin (10uM) were treated, respectively, and cultured at 37° C., CO 2 in an incubator for 24 hours.
  • the compound of Example 29 significantly increased the formation of autophagy vesicles, particularly the formation of autolysosomes, despite the 1/2 concentration compared to the positive control drug rapamycin. can be checked Therefore, the compound according to the present invention exhibits remarkably excellent autophagy-inducing activity, and thus can be usefully applied to the treatment and prevention of various diseases related to autophagy, including degenerative brain disease, liver disease, metabolic disease, sepsis, and the like.
  • Test Example 4 Evaluation of liver function improvement activity by oral administration in a liver injury model (1)
  • DMN Dimethylnitrosamine-induced liver damage
  • 7-week-old male SD rats (Orient Bio, Korea) were acclimatized to the laboratory environment at room temperature for 7 days, then general symptoms were observed, and only healthy animals were used for the experiment.
  • DMN was dissolved in purified water and administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg for 3 consecutive days per week (3 times/week, 4 weeks).
  • ALT Alanine Transaminase
  • AST Aspartate Transaminase
  • the collected blood is injected into a vacuum collection tube containing a clot activator, left at room temperature for about 20 minutes to coagulate, and then centrifuged for 10 minutes to obtain serum, and then blood biochemical tests are performed. did.
  • a summary of the experimental method is shown in FIG. 2 . Measurement results were compared between groups through parametric multiple comparison or non-parametric multiple comparison using SPSS, and when P ⁇ 0.05, it was judged to be statistically significant.
  • Test Example 5 Evaluation of liver function improvement activity by oral administration in a liver injury model (2)
  • DMN Dimethylnitrosamine-induced liver damage
  • DMN was dissolved in purified water and administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg for 3 consecutive days per week (3 times/week, 4 weeks). After the end of the 4th week of induction of liver damage, blood was collected, and the level of the liver (ALT: Alanine Transaminase and AST: Aspartate Transaminase) was checked with serum to confirm the degree of induction, and then the compound of the present invention was administered for 4 weeks from the 1st day after the end of the induction in the 4th week. did.
  • the compound according to the present invention was dissolved in purified water and administered orally using an oral sonde for a total of 4 weeks once a day at a dose of 25 mg/kg.
  • Blood collection was performed on Day 0 (one day after the end of administration of the inducer in Week 4) and on Days 7, 14, 21 and 28 after administration of the test substance.
  • the collected blood was injected into a vacuum collection vessel containing a clot activator, left at room temperature for about 20 minutes to coagulate, and then centrifuged for 10 minutes to obtain serum, followed by blood biochemical testing.
  • an autopsy was performed 24 hours later to prepare a tissue sample after liver extraction and fixation. Hematoxylin & eosin (H&E) staining was performed after making slides from tissue samples to confirm liver tissue damage and inflammatory cell infiltration in the liver tissue under a microscope.
  • H&E Hematoxylin & eosin
  • the compound of the present invention has an activity to effectively treat liver fibrosis.
  • the normal group, the DMN administration group for 4 weeks, and the compound of the present invention (compounds of Examples 23 and 26) and DMN were mixed with DMN.
  • the results obtained by performing hematoxylin & eosin (H&E) staining and Masson's Trichrome staining are shown in FIG.
  • the degree of liver tissue damage and inflammatory cell infiltration in the liver tissue were measured from the results of FIG. 4
  • the results of measuring the degree of collagen fiber deposition in the liver tissue from the results of FIG. 4 are shown in Table 8 below.
  • liver tissue damage and inflammatory cell infiltration in the liver tissue were 259.14 to 319.14 cells/1000 cells and 90.00 to 101.43 cells/, respectively.
  • mm 2 It can be confirmed that about 43 to 54% and 46 to 52% of the DMN administration group was relieved.
  • attrition tricolor staining FIG.
  • the collagen fiber deposition in the liver tissue was increased by about 12 times compared to the normal group by DMN administration for 4 weeks.
  • collagen fiber deposition in the liver tissue of the group administered with the compound of the present invention (compounds of Examples 23 and 26) and DMN was 10.75-12.44%/mm 2 , which was reduced by about 57 to 63% compared to the DMN-administered group. Therefore, it can be confirmed that the compounds of the present invention (compounds of Examples 23 and 26) have an activity of effectively treating liver fibrosis.
  • Test Example 6 Analysis of inhibitory activity on neuronal cell death by beta-amyloid
  • the inhibitory activity of the compound of the present invention on neuronal cell death by beta-amyloid known as a major toxic substance for degenerative brain disease, was isolated from N2a cells (ATCC, CCL-131, mouse neuroblastoma cell line) in the same manner as in Test Example 2. Neurons were analyzed in primary mouse cortical neuron cells. As a medium for culturing N2a cells and neurons, the medium used in Test Example 3 and Test Example 2, respectively, was used. Specifically, N2a cells (3 X 10 4 cells) and neurons (8 X 10 4 cells) were placed in each well of a 96-well plate together with a medium, and cultured overnight at 37° C., CO 2 in an incubator.
  • Example 10 and the compound of Example 29 were treated at concentrations of 5 uM and 500 nM, respectively, and 20 uM of beta amyloid after 30 minutes was treated, and then incubated at 37° C., CO 2 in an incubator for 72 hours.
  • 10 ⁇ l of CCK-8 reagent (Enzo Life Science, ALX-850-039-KI02) was treated and incubated in an incubator at 37° C., CO 2 for 2 hours.
  • Three wells were tested for each group, and absorbance was measured at 450 nm.
  • the absorbance value of the untreated control was taken as 100% cell viability, and cell viability was calculated from each absorbance value.
  • Table 9 the control group represents a group treated with only 20 uM of beta-amyloid.
  • Example 10 test substance Cell viability (%) (N2a cells) control 44.68
  • Example 10 (5uM) 68.86
  • Example 29 (5 uM) 68.45 test substance Cell viability (%) (neurons) control 45.10
  • Example 10 500 nM
  • 52.16 Example 29 (500 nM) 53.33
  • Test Example 7 Analysis of inhibitory activity on mitochondrial damage by rotenone
  • the inhibitory activity of the compound of the present invention on mitochondrial damage caused by rotenone which is known as a major toxic substance for degenerative brain disease, was analyzed in N2a cells (ATCC, CCL-131, mouse neuroblastoma cell line), a mouse neuronal cell line.
  • N2a cells (3 X 10 4 cells) and medium (5% heat-inactivated fetal bovine serum, FBS; Gibco, 16000-044) and 50 ⁇ g/ml penicillin-streptomycin ( Gibco, 15140-122) supplemented DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco, 11995-065) medium was placed in each well of an XF24-well culture plate, respectively, and cultured overnight at 37° C., CO 2 in an incubator.
  • FBS heat-inactivated fetal bovine serum
  • FBS heat-inactivated fetal bovine serum
  • penicillin-streptomycin Gibco, 15140-122
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco, 11995-065
  • the compound of Example 10 restores mitochondrial damage caused by rotenone treatment to a statistically significant level. Therefore, the compound of the present invention can be usefully used for the prevention and treatment of various degenerative brain diseases associated with mitochondrial damage.

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Abstract

본 발명은 특정 카르복스아미드 모이어티, 예를 들어 치환된 아미노알킬-카르복스아미드 모이어티, N-함유 헤테로사이클릭알킬-카르복스아미드 모이어티, 또는 N-함유 헤테로사이클릭-카르복스아미드 모이어티를 갖는 신규의 2-아릴티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 제조방법, 및 이를 함유하는 약학 조성물을 제공한다.

Description

신규의 2-아릴티아졸 유도체 또는 이의 염, 이의 제조방법, 및 이를 함유하는 약학 조성물
본 발명은 신규의 2-아릴티아졸 유도체 또는 이의 염, 이의 제조방법, 및 이를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 특정 카르복스아미드 모이어티, 예를 들어 치환된 아미노알킬-카르복스아미드 모이어티, N-함유 헤테로사이클릭알킬-카르복스아미드 모이어티, 또는 N-함유 헤테로사이클릭-카르복스아미드 모이어티를 갖는 신규의 2-아릴티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 2-아릴티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 우수한 자가포식 유도능을 갖는다.
자가포식(autophagy)은 오토파고사이토시스(autophagocytosis)로도 지칭되며, 불필요하거나 불완전하게 기능하는(dysfunctional) 세포 구성성분을 분해하는(disassembles) 자연적인 조절 메커니즘이다. 자가포식은 세포 구성성분의 면밀한(orderly) 분해 및 재활용을 가능하게 한다. 이 과정에서, 표적 세포질 구성성분은 오토파고좀(autophagosome)으로 알려져 있는 이중-막 소낭(double-membraned vesicle) 내에서 세포내의 나머지 성분들로부터 분리된다. 오토파고좀은 이후 라이소좀과 융합하고, 내용물들은 분해되어 재활용된다. 세가지 형태의 자가포식이 일반적으로 언급된다: 거대자가포식(macroautophagy), 미세자가포식(microautophagy), 및 샤페론-매개 자가포식(chaperone-mediated autophagy, CMA). 질병에 있어서, 자가포식은 스트레스에 대한 적응 반응으로서 생존(survival)을 증가시키는 것으로 관찰되어 왔으나, 반면에 다른 경우에는 세포 사멸과 이환율(morbidity)을 증가시키는 것으로 나타났다. 극단적인 기아의 경우, 세포 구성성분의 파괴는 세포 에너지 수준을 유지함으로써 세포 생존을 촉진한다.
한편, 자가포식이 저하될 경우, 변성 단백질(misfolded protein)의 축적 등에 의해 다양한 질환이 발생하게 된다. 예를 들어, 자가포식을 유도할 경우, 헌팅턴병 (Huntington's disease; HD), 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 프리온병/인간 광우병(Prion disease), 다발성 경화증, 근위축성 측삭경화증(루게릭병) 등의 퇴행성 뇌질환을 치료할 수 있다는 것이 알려진 바 있다(대한민국 특허등록 제10-1731908호 등). 또한, 자가포식을 유도할 경우, 간섬유화증, 간경변증, 간염, 지방간 등의 간질환을 치료할 수 있다는 것이 알려진 바 있다(대한민국 특허공개 제10-2017-0022790호 등). 또한, 자가포식을 유도할 경우, 당뇨병, 고지혈증, 비만, 염증 등의 대사성 질환을 치료할 수 있다는 것이 알려진 바 있다(대한민국 특허공개 제10-2018-0007307호). 이외에도, 자가포식을 유도할 경우, 패혈증(sepsis)과 관련된 과도한 면역 반응을 억제할 수 있다는 것이 알려져 있다(대한민국 특허공개 제10-2012-0131401호 등).
따라서, 자가포식을 효과적으로 유도할 수 있는 물질은 자가포식과 관련된 다양한 질환, 예를 들어, 퇴행성 뇌질환, 간질환, 대사성 질환, 패혈증 등을 비롯한 다양한 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명자들은 특정 카르복스아미드 모이어티, 예를 들어 치환된 아미노알킬-카르복스아미드 모이어티, N-함유 헤테로사이클릭알킬-카르복스아미드 모이어티, 또는 N-함유 헤테로사이클릭-카르복스아미드 모이어티를 갖는 신규의 2-아릴티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 현저하게 우수한 자가포식 유도활성을 가짐으로써, 자가포식과 연관된 다양한 질환의 치료 및 예방에 유용하다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 상기 2-아릴티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 제조방법, 이를 포함하는 약학 조성물, 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 신규의 2-아릴티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 2-아릴티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, 상기 2-아릴티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, 상기 2-아릴티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 것을 포함하는 자가포식-연관 질환의 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, 자가포식-연관 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서의 사용을 위한 상기 2-아릴티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도가 제공된다.
본 발명에 따른 화합물 즉, 치환된 아미노알킬-카르복스아미드 모이어티, N-함유 헤테로사이클릭알킬-카르복스아미드 모이어티, 또는 N-함유 헤테로사이클릭-카르복스아미드 모이어티 등의 특정 카르복스아미드 모이어티를 갖는 신규의 2-아릴티아졸 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 현저하게 우수한 자가포식 유도활성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 퇴행성 뇌질환, 간질환, 대사성 질환, 패혈증 등을 포함하는 자가포식과 연관된 다양한 질환의 치료 및 예방에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 N2a 세포에서 본 발명에 따른 화합물의 자가포식 플럭스(Autophagy Flux)를 분석한 결과를 나타낸다. 도 1a는 모자이크 기법에 의한 세포 전체의 이미징 결과이며, 화살표는 오토파지를 나타낸다. 도 1b는 실시예 29의 화합물을 처리한 N2a 세포의 전자현미경 이미징 결과이며, 흑색 화살표는 오토파고솜(Autophagosome)을 나타내고, 백색 화살표는 오토라이소솜(Autolysosome)을 나타낸다.
도 2는 시험예 4의 간 손상 모델에서 경구 투여에 의한 간 기능 개선 활성 평가 방법을 요약한 것이다.
도 3은 시험예 5의 간 손상 모델에서 경구 투여에 의한 간 기능 개선 활성 평가 방법을 요약한 것이다.
도 4는 시험예 5에서 얻어진 조직 표본에 대하여 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색 및 마손 삼색(Masson's Trichrome) 염색을 시행하여 얻어진 결과를 나타낸다. 스케일 바: 좌측 검정실선 100 μm, 우측 검정실선 100 μm.
본 명세서에서, 용어 "알킬"은 지방족 탄화수소 라디칼을 의미하며, 직쇄상 또는 분지상의 탄화수소 라디칼을 모두 포함한다. 예를 들어 C1-6 알킬은 1 내지 6개의 탄소원자를 갖는 지방족 탄화수소로서, 메틸, 에틸, 프로필, n-뷰틸, n-펜틸, n-헥실, 아이소프로필, 아이소뷰틸, sec-뷰틸, tert-뷰틸, 네오펜틸, 아이소펜틸 등을 모두 포함한다.
또한, 용어 '하이드록시'는 -OH로서 정의되고, 용어 '알콕시'는 별도로 정의되지 않는 한 하이드록시 기의 수소 원자가 알킬로 치환된 라디칼을 의미한다. 예를 들어, C1-6 알콕시는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, n-뷰톡시, n-펜틸옥시, 아이소프로폭시, 아이소뷰톡시, sec-뷰톡시, tert-뷰톡시, 네오펜틸옥시, 아이소펜틸옥시 등을 모두 포함한다.
또한, 용어 '아미노'는 -NH2로서 정의되고, 용어 "알킬아미노"는 모노- 혹은 다이-알킬로 치환된 아미노를 의미한다. 예를 들어, C1-6 알킬아미노는 모노- 혹은 다이-C1-6 알킬로 치환된 아미노를 포함한다.
본 발명은 우수한 자가포식 유도능을 갖는 화합물 또는 이의 염, 즉 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
<화학식 1>
Figure PCTKR2021000578-appb-I000001
식 중,
R1은 수소; C1∼C4 알킬기; 또는 모노 혹은 디-C1∼C5 알킬아미노로 치환된 C1∼C4 알킬기이고,
R2는 C1∼C4 알킬기이고,
A는 하기 화학식 1a 내지 1d의 기로 이루어진 군으로부터 선택된 기이며,
<화학식 1a>
Figure PCTKR2021000578-appb-I000002
<화학식 1b>
Figure PCTKR2021000578-appb-I000003
<화학식 1c>
Figure PCTKR2021000578-appb-I000004
<화학식 1d>
Figure PCTKR2021000578-appb-I000005
상기 화학식 1a 내지 1d에서,
*는 화학식 1의 화합물에 결합되는 위치를 나타내고,
n은 1, 2, 또는 3이고,
R3 및 R4는, 서로 독립적으로, 수소; C1∼C4 알킬; 또는 이들이 결합되는 질소원자와 함께 피페리딘, 모르폴린, 또는 피롤리딘을 형성하고(상기 피페리딘, 모르폴린, 또는 피롤리딘은 C1∼C4 알킬로 선택적으로 치환된다),
R5 및 R6는 C1∼C4 알킬; 또는 함께 고리를 이루어 시클로펜탄, 시클로헥산 또는 테트라히드로-피란을 형성하고,
Cy는 호모피페라진일, 피페리딘일, 모르폴린일, 및 피롤리딘일로 이루어진 군으로부터 선택된 질소-함유 헤테로시클릭 기(상기 질소-함유 헤테로시클릭 기는 C1∼C4 알킬 또는 벤질로 선택적으로 치환된다)이다.
본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, 바람직하게는, R1은 수소; 아이소뷰틸기; 또는 디에틸아미노에틸기일 수 있으며, R2는 메틸기일 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서, A는 화학식 1a 내지 1d의 기로 이루어진 군으로부터 선택된 기이다. 본 발명의 일 구현예에서, A는 화학식 1a의 기 또는 화학식 1b의 기일 수 있다. A는 화학식 1a의 기 또는 화학식 1b의 기인 본 발명의 화합물은 하기 화학식 11a 및 11b의 구조를 갖는다.
<화학식 11a>
Figure PCTKR2021000578-appb-I000006
<화학식 11b>
Figure PCTKR2021000578-appb-I000007
상기 화학식 11a 및 11b의 화합물에 있어서, R1, R2, R3, R4 , R5, 및 R6은 상기에서 정의한 바와 동일하다.
상기 화학식 11a 및 11b의 화합물에 있어서, 바람직하게는 R3 및 R4가 이들이 결합되는 질소원자와 함께 피페리딘, 모르폴린, 또는 피롤리딘을 형성할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 피페리딘, 모르폴린, 또는 피롤리딘이 C1∼C4 알킬로 치환될 수 있다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있다.
N-(2-(디에틸아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(2-(디아이소프로필아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(2-(디메틸아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(3-(디에틸아미노)프로필)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(4-메틸호모피페라지노)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(4-(1-메틸)피페리딘일)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(2-(4-모르폴리노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(2-(1-피롤리디노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(2-(1-피페리디노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-((4-(디메틸아미노)테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-((1-(디메틸아미노)시클로펜틸)메틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-((1-(디메틸아미노)시클로헥실)메틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(3-(1-벤질)피롤리딘일)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(2-(2-(1-메틸)피롤리디노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-((S)-2-(1-에틸)피롤리디노메틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(4-모르폴린아미노)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(1-피페리딘아미노)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(2-(디아이소프로필아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(2-(디에틸아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(2-(디메틸아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(2-(4-모르폴리노)에틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-((S)-2-(1-에틸)피롤리디노메틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(2-(디아이소프로필아미노)에틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(2-(디에틸아미노)에틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(2-(디메틸아미노)에틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(2-(4-모르폴리노)에틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-((S)-2-(1-에틸)피롤리디노메틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-((4-(디메틸아미노)테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염; 및
N-((4-(디메틸아미노)테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염.
특히 바람직하게는, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있다.
N-(2-(디아이소프로필아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-((4-(디메틸아미노)테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(2-(디아이소프로필아미노)에틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-(2-(4-모르폴리노)에틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
N-((4-(디메틸아미노)테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염; 및
N-((4-(디메틸아미노)테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염.
상기 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태일 수 있으며, 예를 들어 산부가염의 형태일 수 있다. 상기 산부가염은 통상의 무기산 또는 유기산으로부터 얻어질 수 있으며, 예를 들어 염산염, 브롬산염, 요오드산염, 질산염, 황산염, 황산수소염, 인산염, 아세트산염, 젖산염, 구연산염, 타르타르산염, 숙신산염, 말레산염, 말론산염, 옥살산염, 푸마르산염, 글루콘산염, 사카린산염, 벤조산염, 메탄설폰산염, 에탄설폰산염, 벤젠설폰산염, p-톨루엔설폰산염, 파모산염(pamoate) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 산부가염은 통상의 용매, 예를 들어 물, 알코올, 테트라히드로퓨란, 아세톤, 또는 이들의 혼합용액 중에서 상기 화학식 1의 화합물을 무기산 또는 유기산과 반응시킴으로써 얻어질 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 무수물, 수화물, 또는 용매화물 형태일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 무정형 또는 결정형의 형태일 수 있으며, 이들은 또한 수화물 또는 용매화물의 형태일 수 있다. 상기 수화물 또는 용매화물은 화학식 1의 화합물에 대하여 물 또는 유기용매를 화학양론적 혹은 비화학양론적 양으로 포함할 수 있다.
화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 비대칭 탄소를 포함하는 치환기를 가질 수 있으며, 이 경우 화학식 1의 화합물 또는 그의 염은 (R) 또는 (S) 등의 광학 이성질체 또는 라세믹체(RS)로 존재할 수 있다. 따라서, 달리 표기하지 않는 한, 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 (R) 또는 (S) 등의 광학 이성질체 또는 라세믹체(RS)를 모두 포함한다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조방법을 포함한다. 예를 들어, 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은, 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 화학식 2의 화합물을 N-함유 화합물을 사용하여 아실화하여 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계를 수행하거나, 혹은 화학식 3의 화합물을 N-함유 화합물을 사용하여 아실화하여 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계; 및 상기 화학식 4의 화합물을 화학식 5의 R1X와 알킬화 반응을 수행하여 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계를 수행함으로써 제조될 수 있다.
<반응식 1>
Figure PCTKR2021000578-appb-I000008
상기 반응식 1에서, R1, R2, 및 A는 상기에서 정의한 바와 동일하고, X는 할로겐이다.
일 구현예에서, 본 발명은 화학식 2의 화합물을 NH2-(CH2)n-NR3R4, NH2-CH2-CR5R6-NR3R4, Cy, 및 NH2-Cy로 이루어진 군으로부터 선택된 N-함유 화합물(식 중, n, R3, R4, R5, 및 R6은 상기에서 정의한 바와 동일하며, Cy는 호모피페라진, 피페리딘, 모르폴린, 및 피롤리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 질소-함유 헤테로사이클이고(상기 질소-함유 헤테로사이클은 C1∼C4 알킬 또는 벤질로 선택적으로 치환된다), NH2-Cy는 호모피페라진일아민, 피페리딘일아민, 모르폴린일아민, 및 피롤리딘일아민로 이루어진 군으로부터 선택된 질소-함유 헤테로시클릭아민(상기 질소-함유 헤테로시클릭아민은 C1∼C4 알킬 또는 벤질로 선택적으로 치환된다)이다)을 사용하여 아실화하는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다:
<화학식 1>
Figure PCTKR2021000578-appb-I000009
<화학식 2>
Figure PCTKR2021000578-appb-I000010
식 중, R1, R2, 및 A는 상기에서 정의한 바와 동일하다.
다른 구현예에서, 본 발명은 화학식 3의 화합물을 NH2-(CH2)n-NR3R4, NH2-CH2-CR5R6-NR3R4, Cy, 및 NH2-Cy로 이루어진 군으로부터 선택된 N-함유 화합물(식 중, n, R3, R4, R5, 및 R6은 상기에서 정의한 바와 동일하며, Cy는 호모피페라진, 피페리딘, 모르폴린, 및 피롤리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 질소-함유 헤테로사이클이고(상기 질소-함유 헤테로사이클은 C1∼C4 알킬 또는 벤질로 선택적으로 치환된다), NH2-Cy는 호모피페라진일아민, 피페리딘일아민, 모르폴린일아민, 및 피롤리딘일아민로 이루어진 군으로부터 선택된 질소-함유 헤테로시클릭아민(상기 질소-함유 헤테로시클릭아민은 C1∼C4 알킬 또는 벤질로 선택적으로 치환된다)이다)을 사용하여 아실화하여 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계; 및 상기 화학식 4의 화합물을 화학식 5의 화합물과 알킬화 반응을 수행하여 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다:
<화학식 1>
Figure PCTKR2021000578-appb-I000011
<화학식 3>
Figure PCTKR2021000578-appb-I000012
<화학식 4>
Figure PCTKR2021000578-appb-I000013
<화학식 5>
R1X
식 중, R1, R2, 및 A는 상기에서 정의한 바와 동일하고, X는 할로겐이다.
상기 화학식 2의 화합물, 화학식 3의 화합물, 및 N-함유 화합물(즉, NH2-(CH2)n-NR3R4, NH2-CH2-CR5R6-NR3R4, Cy, 또는 NH2-Cy)은 공지 화합물로서 상업적으로 구입 가능하다. 상기 아실화 반응은 아실화제인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDC], 디시클로헥실카르보디이미드[dicyclohexylcarbodiimide, DCC], 1,1'-카르보닐디이미다졸(1,1'-carbonyldiimidazole, CDI], N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디히드로퀴놀린(N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline, EEDQ] 등의 아실화제를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 아실화 반응은 또한 티오닐 클로라이드, 옥살릴 클로라이드 또는 포스포러스 클로라이드 등을 상기 화학식 2의 화합물 및 화학식 3의 화합물과 반응시켜 아실 클로라이드를 제조한 후, N-함유 화합물과 반응시킴으로써, 수행될 수 있다. 상기 아실화 반응은 디클로로메탄, 디메틸포름아미드 등의 통상의 유기 용매 중에서 수행될 수 있다.
상기 알킬화 반응은 수산화나트륨 또는 탄산나트륨 등의 알칼리금속의 염기 존재하에서 수행될 수 있다. 상기 화학식 4의 화합물과 상기 화학식 5의 R1X의 몰비는 1 : 1 내지 1 : 5의 범위일 수 있으며, 바람직하게는 약 1 : 1의 비율일 수 있다. 상기 알킬화 반응은 물, C1∼C4 알코올, 아세톤, 테트라히드로퓨란, 톨루엔 또는 이들의 혼합용매 중에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 2-아릴티아졸 유도체 즉, 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 우수한 자가포식 유도능을 가짐으로써, 퇴행성 뇌질환, 간질환, 대사성 질환, 패혈증 등을 포함하는 자가포식과 연관된 다양한 질환의 치료 및 예방에 유용하게 적용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 자가포식의 유도를 위한 약학 조성물을 포함한다.
상기 자가포식의 유도를 통하여 예방, 개선, 또는 치료될 수 있는 다양한 질환을 제한 없이 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 프리온병, 다발성 경화증, 및 루게릭병으로 이루어진 군으로부터 선택된 퇴행성 뇌질환; 간섬유화증, 간경변증, 간염, 및 지방간으로 이루어진 군으로부터 선택된 간질환; 당뇨병, 고지혈증, 비만, 및 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 대사성 질환; 또는 패혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제 또는 향미제 등의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 정제, 캅셀제, 산제, 과립제 및 현탁제, 유제 또는 시럽제와 같은 경구용 제제; 또는 외용 액제, 외용 현탁제, 외용 에멀젼, 겔제(연고제 등), 흡입제, 분무제, 주사제 등의 비경구 투여용 제제로 제제화될 수 있다. 상기 제제는 다양한 형태, 예를 들어 단회 투여형 또는 수회 투여형 투여 형태(dosage form)로 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 락토즈, 옥수수전분 등의 부형제, 마그네슘 스테아레이트등의 활택제, 유화제, 현탁화제, 안정화제, 및 등장화제 등을 포함할 수 있다. 필요할 경우, 감미제 및/또는 향미제를 가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 투여하거나, 흡입, 정맥내, 복강내, 피하, 뇌혈관(intracerbroventricular) 주사, 직장 및 국소 투여를 포함한 비경구로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 정제, 캅셀제, 수성액제 또는 현탁제 등의 다양한 형태로 제제화될 수 있다. 경구용 정제의 경우 락토즈, 옥수수 전분 등의 담체 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제가 통상 가해질 수 있다. 경구투여용 캅셀제의 경우, 락토즈 및/또는 건조 옥수수 전분이 희석제로서 사용될 수 있다. 경구용 수성현탁제가 필요할 경우, 활성성분을 유화제 및/또는 현탁화제와 결합시킬 수 있다. 필요할 경우, 특정 감미제 및/또는 향미제를 가할 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여의 경우, 활성성분의 멸균 용액이 통상 제조되며, 용액의 pH를 적합하게 조절하고 완충시켜야 한다. 정맥내 투여의 경우, 용질의 총 농도는 제제에 등장성이 부여되도록 조절되어야 한다. 본 발명에 따른 조성물은 pH가 7.4인 염수와 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태일 수 있다. 상기 용액은 국소 주사 (local bolus injection)로 환자의 근육내 혈류에 도입될 수 있다.
상기 2-아릴티아졸 유도체 즉, 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 환자에게 약 0.0001 mg/kg 내지 약 100mg/kg per day, 바람직하게는 약 0.001 내지 100 mg/kg per day의 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 1일 1회 또는 분할하여 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여될 수 있다. 물론, 상기 용량은 환자의 나이, 상태, 체중, 감수성, 질병의 정도, 투여경로, 투여기간 등에 따라 변경될 수 있다. 투여 방법에 따라, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 0.001 내지 99 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 60 중량%의 범위로 함유할 수 있다.
본 발명은 또한 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 자가포식을 유도하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 프리온병, 다발성 경화증, 및 루게릭병으로 이루어진 군으로부터 선택된 퇴행성 뇌질환; 간섬유화증, 간경변증, 간염, 및 지방간으로 이루어진 군으로부터 선택된 간질환; 당뇨병, 고지혈증, 비만, 및 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 대사성 질환; 또는 패혈증의 예방 또는 치료방법을 포함한다.
본 발명은 또한 포유동물에서 자가포식 유도를 위한 약제의 제조에 있어서의 사용을 위한 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 프리온병, 다발성 경화증, 및 루게릭병으로 이루어진 군으로부터 선택된 퇴행성 뇌질환; 간섬유화증, 간경변증, 간염, 및 지방간으로 이루어진 군으로부터 선택된 간질환; 당뇨병, 고지혈증, 비만, 및 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 대사성 질환; 또는 패혈증의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 사용을 위한 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하는 것이며, 본 발명이 이들에 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예들에서 제조된 화합물들의 분석은 다음과 같이 수행하였다: 핵자기 공명 (NMR) 스펙트럼 분석은 브루커 (Bruker) 400 MHz 분광계 상에서 수행하였고, 화학이동(chemical shift)은 ppm으로 분석하였으며, 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔 (Merck, 70-230 mesh) 상에서 수행하였다. 특별한 언급이 없으면, 모든 출발 물질은 시판되고 있는 것을 구입한 것이며, 추가 정제 없이 사용한 것이다. 모든 반응 및 크로마토그래피 분획은 250nm 실리카 겔 평판 상에서 박층 크로마토그래피(TLC)로 분석하였으며, 자외선 또는 요오드 (I2) 염색으로 시각화하였다. 생성물 및 중간체는 플래시 크로마토그래피 또는 역상 HPLC로 정제하였다.
실시예 1: N-(2-(디에틸아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000014
2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복실산(9.49 g), 디클로로메탄(100 ml), 및 디메틸포름아미드(0.25 ml)의 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 티오닐 클로라이드(4.28 g)를 상기 혼합물에 가하고, 3시간 동안 환류 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 다음, 감압 농축하였다. 얻어진 농축액에 디클로로메탄(90 ml)을 가하고, 0∼10℃로 냉각한 다음, K2CO3(5.30 g)을 가하고, 20분 동안 교반하였다. 상기 혼합물에 2-(디에틸아미노)에틸아민(3.49 g)를 가하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 정제수(100 ml)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조한 후, 진공 농축하여 N-(2-(디에틸아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드를 얻었다. 상기 화합물을 메탄올(70 ml) 및 디클로로포름(7 ml)의 혼합용매로 용해한 후, 1N 염산 에테르 용액(25 ml)을 가하고, 40℃로 가열한 다음, 감압 농축하였다. 얻어진 농축물에 아세톤(70 ml)을 가하고, 1시간 동안 교반한 후, 여과하였다. 얻어진 고체를 아세톤(10 ml)으로 세척한 다음, 50∼55℃에서 건조하여 표제 화합물 6.50 g을 제조하였다(수율: 66.3%).
TLC Rf = 0.24 in 10% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, MeOH-d4) δ 8.26 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.22 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.33 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.03 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.78 (t, 2H, J = 6.4 Hz), 3.42 (t, 2H, J = 6.4 Hz), 3.40 ~ 3.32 (m, 4H), 2.74 (s, 3H), 2.25 ~ 2.15 (m, 1H), 1.40 (t, 6H, J = 7.2 Hz), 1.12 (d, 6H, J = 6.8 Hz)
실시예 2: N-(2-(디아이소프로필아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000015
2-(디에틸아미노)에틸아민 대신 2-(디아이소프로필아미노)에틸아민을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 55.5%).
TLC Rf = 0.29 in 10% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, MeOH-d4) δ 8.23 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.20 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.30 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.01 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.90 ~ 3.82 (m, 2H), 3.75 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 3.38 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 2.72 (s, 3H), 2.25 ~ 2.15 (m, 1H), 1.46 (d, 12H, J = 6.8 Hz), 1.12 (d, 6H, J = 6.8 Hz)
실시예 3: N-(2-(디메틸아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000016
2-(디에틸아미노)에틸아민 대신 2-(디메틸아미노)에틸아민을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 90.6%).
TLC Rf = 0.34 in 10% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, MeOH-d4) δ 8.26 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.22 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.34 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 4.03 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.77 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.42 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.02 (s, 6H), 2.74 (s, 3H), 2.25 ~ 2.15 (m, 1H), 1.12 (d, 6H, J = 6.8 Hz)
실시예 4: N-(3-(디에틸아미노)프로필)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000017
2-(디에틸아미노)에틸아민 대신 3-(디에틸아미노)프로필아민을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 44.4%).
TLC Rf = 0.17 in 10% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, MeOH-d4) δ 8.27 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.22 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.35 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.03 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.51 (t, 2H, J = 6.4 Hz), 3.34 ~ 3.22 (m, 6H), 2.73 (s, 3H), 2.25 ~ 2.15 (m, 1H), 2.15 ~ 2.05 (m, 2H), 1.37 (t, 6H, J = 7.2 Hz), 1.12 (d, 6H, J = 6.4 Hz)
실시예 5: N-(4-메틸호모피페라지노)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000018
2-(디에틸아미노)에틸아민 대신 N-메틸호모피페라진을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 45.3%).
TLC Rf = 0.39 in 10% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, MeOH-d4) δ 8.23 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.20 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.33 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.32 ~ 4.18 (m, 1H), 4.02 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.90 ~ 3.60 (m, 5H), 3.45 ~ 3.35 (m, 2H), 3.00 (s, 3H), 2.52 (s, 3H), 2.35 ~ 2.25 (m, 2H), 2.25 ~ 2.15 (m, 1H), 1.12 (d, 6H, J = 6.8 Hz)
실시예 6: N-(4-(1-메틸)피페리딘일)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000019
2-(디에틸아미노)에틸아민 대신 4-아미노-1-메틸피페리딘을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 62.4%).
TLC Rf = 0.29 in 10% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, MeOH-d4) δ 8.24 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.20 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.33 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.20 ~ 4.10 (m, 1H), 4.02 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.65 ~ 3.55 (m, 2H), 3.25 ~ 3.15 (m, 2H), 2.97 (s, 3H), 2.68 (s, 3H), 2.35 ~ 2.25 (m, 2H), 2.25 ~ 2.15 (m, 1H), 2.05 ~ 1.90 (m, 2H), 1.12 (d, 6H, J = 6.8 Hz)
실시예 7: N-(2-(4-모르폴리노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000020
2-(디에틸아미노)에틸아민 대신 4-(2-아미노에틸)모르폴린을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 64.9%).
TLC Rf = 0.61 in 10% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, MeOH-d4) δ 8.26 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.22 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 9.2 Hz), 7.34 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 4.12 (dd, 2H, J = 3.2, 12.8 Hz), 4.03 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.92 ~ 3.85 (m, 2H), 3.85 ~ 3.78 (m, 2H), 3.73 (d, 2H, J = 12.8 Hz), 3.44 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.30 ~ 3.20 (m, 2H), 2.74 (s, 3H), 2.25 ~ 2.15 (m, 1H), 1.12 (d, 6H, J = 6.8 Hz)
실시예 8: N-(2-(1-피롤리디노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000021
2-(디에틸아미노)에틸아민 대신 1-(2-아미노에틸)피롤리딘을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 59.5%).
TLC Rf = 0.14 in 10% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, MeOH-d4) δ 8.26 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.22 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 9.2 Hz), 7.35 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.03 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.88 ~ 3.80 (m, 2H), 3.77 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.48 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.25 ~ 3.15 (m, 2H), 2.75 (s, 3H), 2.25 ~ 2.15 (m, 3H), 2.15 ~ 2.05 (m, 2H), 1.12 (d, 6H, J = 6.8 Hz)
실시예 9: N-(2-(1-피페리디노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000022
2-(디에틸아미노)에틸아민 대신 1-(2-아미노에틸)피페리딘을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 72.7%).
TLC Rf = 0.33 in 10% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, MeOH-d4) δ 8.25 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.21 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.33 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.03 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.77 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.73 (d, 2H, J = 11.6 Hz), 3.37 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.10 ~ 3.00 (m, 2H), 2.73 (s, 3H), 2.25 ~ 2.15 (m, 1H), 2.05 ~ 1.95 (m, 2H), 1.93 ~ 1.83 (m, 3H), 1.62 ~ 1.53 (m, 1H), 1.12 (d, 6H, J = 6.8 Hz)
실시예 10: N-((4-(디메틸아미노)테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000023
2-(디에틸아미노)에틸아민 대신 4-(아미노메틸)-N,N-디메틸테트라히드로-2H-피란-4-아민을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 67.9%).
TLC Rf = 0.44 in 10% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 10.31 (t, 1H, J = 4.8 Hz), 8.67 (t, 1H, J = 6.4 Hz), 8.26 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.20 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.40 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.02 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.95 ~ 3.85 (m, 2H), 3.83 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.65 ~ 3.55 (m, 2H), 2.80 (s, 3H), 2.79 (s, 3H), 2.64 (s, 3H), 2.15 ~ 2.05 (m, 1H), 1.95 ~ 1.85 (m, 4H), 1.03 (d, 6H, J = 6.4 Hz)
실시예 11: N-((1-(디메틸아미노)시클로펜틸)메틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000024
2-(디에틸아미노)에틸아민 대신 1-(아미노메틸)-N,N-디메틸시클로펜틸아민을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 72.9%).
TLC Rf = 0.34 in 10% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 10.73 (t, 1H, J = 4.8 Hz), 8.73 (t, 1H, J = 6.4 Hz), 8.26 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.20 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.40 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.02 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.61 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 2.81 (s, 3H), 2.80 (s, 3H), 2.64 (s, 3H), 2.15 ~ 2.05 (m, 1H), 2.00 ~ 1.90 (m, 4H), 1.80 ~ 1.70 (m, 4H), 1.02 (d, 6H, J = 6.8 Hz)
실시예 12: N-((1-(디메틸아미노)시클로헥실)메틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000025
2-(디에틸아미노)에틸아민 대신 1-(아미노메틸)-N,N-디메틸시클로헥실아민을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 58.3%).
TLC Rf = 0.31 in 10% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9.90 (s, 1H), 8.56 (t, 1H, J = 6.0 Hz), 8.26 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.20 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.40 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.02 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.74 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 2.81 (s, 3H), 2.79 (s, 3H), 2.64 (s, 3H), 2.15 ~ 2.05 (m, 1H), 1.95 ~ 1.88 (m, 2H), 1.75 ~ 1.52 (m, 7H), 1.22 ~ 1.13 (m, 1H), 1.02 (d, 6H, J = 6.8 Hz)
실시예 13: N-(3-(1-벤질)피롤리딘일)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000026
2-(디에틸아미노)에틸아민 대신 1-벤질-3-아미노피롤리딘을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 43.4%).
TLC Rf = 0.41 in 10% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 11.20 (s, 1H), 8.73 (dd, 1H, J = 6.4, 26 Hz), 8.25 ~ 8.15 (m, 2H), 7.65 ~7.60 (m, 2H), 7.50 ~ 7.40 (m, 4H), 4.73 ~ 4.45 (m, 1H), 4.42 (dd, 2H, J = 6.0, 14 Hz), 4.02 (dd, 2H, J = 2.8, 6.4 Hz), 3.60 ~ 3.40 (m, 2H), 3.40 ~ 3.30 (m, 1H), 3.22 ~ 3.10 (m, 1H), 2.62 (d, 3H, J = 4.0 Hz), 2.15 ~ 2.05 (m, 1H), 1.02 (dd, 6H, J = 1.6, 6.8 Hz)
실시예 14: N-(2-(2-(1-메틸)피롤리디노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000027
2-(디에틸아미노)에틸아민 대신 2-(2-아미노에틸)-1-메틸-피롤리딘을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 85.3%).
TLC Rf = 0.14 in 10% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, D2O) δ 7.58 (dd, 1H, J = 2.4, 8.8 Hz), 7.51 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.88 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 3.72 (d, 2H, J = 6.8 Hz), 3.68 ~ 3.60 (m, 1H), 3.37 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 3.32 ~ 3.25 (m, 1H), 3.27 (s, 2H), 3.15 ~ 3.05 (m, 1H), 2.87 (s, 3H), 2.35 ~ 2.25 (m, 1H), 2.25 ~ 2.15 (m, 1H), 2.15 ~ 1.92 (m, 3H), 1.85 ~ 1.70 (m, 2H), 0.92 (d, 6H, J = 6.8 Hz)
실시예 15: N-((S)-2-(1-에틸)피롤리디노메틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000028
2-(디에틸아미노)에틸아민 대신 (S)-2-(아미노메틸)-1-에틸-피롤리딘을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 63.6%).
TLC Rf = 0.24 in 10% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 10.39 (s, 1H), 8.74 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 8.25 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 8.19 (dd, 1H, J = 2.0 Hz, 9.2 Hz), 7.40 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 4.01 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.75 ~ 3.52 (m, 4H), 3.45 ~ 3.35 (m, 1H), 3.13 ~ 3.03 (m, 2H), 2.65 (s, 3H), 2.20 ~ 1.80 (m, 5H), 1.29 (t, 3H, J = 7.2 Hz), 1.02 (d, 6H, J = 6.8 Hz)
실시예 16: N-(4-모르폴린아미노)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000029
2-(디에틸아미노)에틸아민 대신 4-아미노모르폴린을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 59.9%).
TLC Rf = 0.69 in 10% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9.10 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.30 ~ 8.20 (m, 1H), 7.35 ~ 7.40 (m, 1H), 4.01 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.85 ~ 3.65 (m, 4H), 2.95 ~ 2.70 (m, 4H), 2.67 (s, 3H), 2.15 ~ 2.05 (m, 1H), 1.29 (t, 3H, J = 7.2 Hz), 1.03 (d, 6H, J = 6.8 Hz)
실시예 17: N-(1-피페리딘아미노)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000030
2-(디에틸아미노)에틸아민 대신 1-아미노피페리딘을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 45.8%).
TLC Rf = 0.39 in 10% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9.01 (s, 1H), 8.28 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.23 (dd, 1H, J = 2.0, 8.8 Hz), 7.38 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.01 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.25 ~ 3.20 (m, 1H), 3.05 ~ 2.95 (m, 2H), 2.72 (s, 3H), 2.70 ~ 2.65 (m, 1H), 2.15 ~ 2.05 (m, 1H), 1.82 ~ 1.65 (m, 6H), 1.03 (d, 6H, J = 6.4 Hz)
실시예 18: N-(2-(디아이소프로필아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000031
2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복실산(3.00 g), 히드록시벤조트리아졸(1.71 g), 디시클로헥실카르보디이미드(2.62 g) 및 디메틸포름아미드(30 ml)의 혼합물을 10분 동안 교반하였다. N-메틸모르폴린(1.28 g) 및 2-(디아이소프로필아미노)에틸아민(1.83 g)를 가하고, 50℃로 승온하여 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0∼5℃로 냉각한 다음 생성된 고체를 여과하여 제거하였다. 여과액을 감압농축한 다음, 얻어진 오일상의 농축물을 0.5N 염산용액(60 ml) 및 정제수(60 ml)로 용해하고, 에틸 아세테이트(60 ml x 2회)로 세척하였다. 수층을 수산화나트륨(1.2 g)으로 pH 7∼8로 조절한 다음, 디클로로메탄(60 ml x 2회)으로 추출하였다. 얻어진 추출물을 합하여 무수 황산나트륨 상에서 건조한 후, 진공 농축하여 N-(2-(디아이소프로필아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드를 얻었다. 상기 화합물을 메탄올(10 ml)로 용해한 후, 1N 염산 에테르 용액(20 ml)을 가하고, 40℃로 가열한 다음, 아세톤(30 ml)을 가하고, 1시간 동안 교반한 후, 여과하였다. 얻어진 고체를 아세톤(10 ml)으로 세척한 다음, 50∼55℃에서 건조하여 표제 화합물 4.17 g을 제조하였다(수율: 85.5%).
TLC Rf = 0.20 in 20% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, MeOH-d4) δ 8.18 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.09 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.11 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 3.90 ~ 3.82 (m, 2H), 3.74 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 3.38 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 2.73 (s, 3H), 1.46 (d, 12H, J = 6.8 Hz)
실시예 19: N-(2-(디에틸아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000032
2-(디아이소프로필아미노)에틸아민 대신 2-(디에틸아미노)에틸아민을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 18과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 40.0%).
TLC Rf = 0.39 in 40% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 11.99 (s, 1H), 10.40 (s, 1H), 8.61 (t, 1H, J = 6.0 Hz), 8.13 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.95 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.23 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 3.64 (q, 2H, J = 6.4 Hz), 3.22 (q, 2H, J = 6.4 Hz), 3.20 ~ 3.12 (m, 4H), 2.64 (s, 3H), 1.25 (t, 6H, J = 7.2 Hz)
실시예 20: N-(2-(디메틸아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000033
2-(디아이소프로필아미노)에틸아민 대신 2-(디메틸아미노)에틸아민을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 18과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 83.7%).
TLC Rf = 0.18 in 40% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 11.97 (s, 1H), 10.19 (s, 1H), 8.52 (t, 1H, J = 6.0 Hz), 8.13 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.05 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.22 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 3.62 (q, 2H, J = 6.0 Hz), 3.25 (q, 2H, J = 6.0 Hz), 2.83 (s, 3H), 2.82 (s, 3H), 2.64 (s, 3H)
실시예 21: N-(2-(4-모르폴리노)에틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000034
2-(디아이소프로필아미노)에틸아민 대신 4-(2-아미노에틸)모르폴린을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 18과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 73.2%).
TLC Rf = 0.67 in 20% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 12.03 (s, 1H), 11.24 (s, 1H), 8.64 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 8.13 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.05 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.24 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.00 ~ 3.80 (m, 4H), 3.68 (q, 2H, J = 6.0 Hz), 3.58 ~ 3.48 (m, 2H), 3.45 ~ 3.35 (m, 2H), 3.25 ~ 3.15 (m, 2H), 2.64 (s, 3H)
실시예 22: N-((S)-2-(1-에틸)피롤리디노메틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000035
2-(디아이소프로필아미노)에틸아민 대신 (S)-2-(아미노메틸)-1-에틸-피롤리딘을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 18과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 23.5%).
TLC Rf = 0.47 in 40% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 11.96 (s, 1H), 10.43 (s, 1H), 8.71 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 8.14 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.06 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.21 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 3.75 ~ 3.52 (m, 4H), 3.45 ~ 3.35 (m, 1H), 3.13 ~ 3.03 (m, 2H), 2.64 (s, 3H), 2.20 ~ 2.10 (m, 1H), 2.05 ~ 1.80 (m, 3H), 1.29 (t, 3H, J = 7.2 Hz)
실시예 23: N-(2-(디아이소프로필아미노)에틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000036
실시예 18에서 제조한 N-(2-(디아이소프로필아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염(3.17 g)을 수산화나트륨(1.26 g)을 정제수(8ml) 및 테트라히드로퓨란(35 ml)에 용해한 용액에 가한 다음, 2-디에틸아미노에틸 클로라이드 염산염(1.30 g)을 가하고, 약 70℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 다음, 수층을 층분리하여 제거하였다. 유기층을 감압 농축한 후, 디클로로메탄(50 ml)을 가하여 용해한 다음, 층분리된 수층을 제거하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조한 후, 진공 농축한 다음 디이소프로필 에테르(50 ml)를 가하여 결정화하였다. 생성된 결정을 여과한 다음, 50∼55℃에서 건조하여 N-(2-(디아이소프로필아미노)에틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드를 얻었다. 상기 화합물을 메탄올(5 ml)로 용해한 후, 1N 염산 에테르 용액(15 ml)을 가하고, 40℃로 가열한 다음, 아세톤(30 ml)을 가하고, 1시간 동안 교반한 후, 여과하였다. 얻어진 고체를 아세톤(10 ml)으로 세척한 다음, 50∼55℃에서 건조하여 표제 화합물 2.50 g을 제조하였다(수율: 60.0%).
TLC Rf = 0.33 in 20% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, MeOH-d4) δ 8.34 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.30 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.43 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.65 (t, 2H, J = 4.8 Hz), 3.90 ~ 3.80 (m, 2H), 3.80 ~ 3.70 (m, 4H), 3.52 ~ 3.43 (m, 4H), 3.38 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 2.73 (s, 3H), 1.50 ~ 1.46 (m, 18H)
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 10.90 (s, 1H), 10.14 (s, 1H), 8.77 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 8.30 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.24 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.44 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 4.67 (t, 2H, J = 4.4 Hz), 3.70 ~ 3.60 (m, 6H), 3.30 ~ 3.15 (m, 6H), 2.68 (s, 3H), 1.40 ~ 1.40 (m, 18H)
실시예 24: N-(2-(디에틸아미노)에틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000037
실시예 19에서 제조한 N-(2-(디에틸아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 23과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 46.3%).
TLC Rf = 0.30 in 20% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 10.54 (s, 1H), 10.31 (s, 1H), 8.65 (t, 1H, J = 5.2 Hz), 8.30 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.25 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.44 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.64 (s, 2H), 3.70 ~ 3.60 (m, 4H), 3.40 ~ 3.15 (m, 10H), 1.35 ~ 1.20 (m, 12H)
실시예 25: N-(2-(디메틸아미노)에틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000038
실시예 20에서 제조한 N-(2-(디메틸아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 23과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 55.5%).
TLC Rf = 0.25 in 20% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 10.80 (s, 1H), 10.45 (s, 1H), 8.89 (t, 1H, J = 5.2 Hz), 8.30 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.25 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.44 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.66 (t, 2H, J = 4.8 Hz), 3.65 ~ 3.55 (m, 4H), 3.30 ~ 3.20 (m, 6H), 2.83 (s, 3H), 2.82 (s, 3H), 2.66 (s, 3H), 1.35 ~ 1.28 (m, 6H)
실시예 26: N-(2-(4-모르폴리노)에틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000039
실시예 21에서 제조한 N-(2-(4-모르폴리노)에틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 23과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 52.1%).
TLC Rf = 0.40 in 20% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 11.24 (s, 1H), 10.86 (s, 1H), 8.70 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 8.30 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.24 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.44 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.66 (t, 2H, J = 4.8 Hz), 4.05 ~ 3.95 (m, 2H), 3.90 ~ 3.80 (m, 4H), 3.75 ~ 3.65 (m, 2H), 3.65 ~ 3.60 (m, 2H), 3.60 ~ 3.50 (m, 2H), 3.45 ~ 3.25 (m, 6H), 3.20 ~ 3.10 (m, 2H), 2.66 (s, 3H), 1.30 (t, 6H, J = 7.2Hz)
실시예 27: N-((S)-2-(1-에틸)피롤리디노메틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000040
실시예 22에서 제조한 N-((S)-2-(1-에틸)피롤리디노메틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 23과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 28.8%).
TLC Rf = 0.08 in 20% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 10.70 (s, 1H), 10.66 (s, 1H), 8.80 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 8.31 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.25 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz), 7.45 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.65 (t, 2H, J = 4.4 Hz), 3.80 ~ 3.50 (m, 6H), 3.45 ~ 3.35 (m, 5H), 3.15 ~ 3.05 (m, 2H), 2.67 (s, 3H), 2.20 ~ 2.10 (m, 1H), 2.05 ~ 1.80 (m, 3H), 1.35 ~ 1.25 (m, 9H)
실시예 28: N-((4-(디메틸아미노)테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000041
2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복실산(5.00 g), 히드록시벤조트리아졸(2.86 g), 디시클로헥실카르보디이미드(4.36 g) 및 디메틸포름아미드(45 ml)의 혼합물을 10분 동안 교반하였다. N-메틸모르폴린(2.14 g) 및 4-(아미노메틸)-N,N-디메틸테트라히드로-2H-피란-4-아민(3.50 g)를 가하고, 50℃로 승온하여 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0∼5℃로 냉각한 다음, 생성된 고체를 여과하여 제거하였다. 여과액을 감압농축하여 N-((4-(디메틸아미노)테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드를 얻었다. 상기 화합물을 2N 염산용액(25 ml) 및 정제수(100 ml)로 용해하고, 에틸 아세테이트(100 ml)로 세척한 후, 여과하였다. 얻어진 여과액을 1시간 교반하였다. 생성된 고체를 여과하고, 차가운 정제수(10ml)로 세척한 다음, 아세톤(50ml)을 가하여 30분 교반하였다. 고체를 여과하고, 아세톤(20 ml)으로 세척한 다음, 50∼55℃에서 건조하여 표제 화합물 7.10 g을 제조하였다(수율: 84.6%).
TLC Rf = 0.48 in 20% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 11.98 (s, 1H), 10.48 (s, 1H), 8.67 (t, 1H, J = 6.4 Hz), 8.15 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.06 (dd, 1H, J = 6.4 Hz, 8.8 Hz), 7.21 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 3.92 ~ 3.85 (m, 2H), 3.83 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.68 ~ 3.58 (m, 2H), 2.79 (s, 6H), 2.63 (s, 3H), 2.00 ~ 1.88 (m, 4H)
실시예 29: N-((4-(디메틸아미노)테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염의 제조
Figure PCTKR2021000578-appb-I000042
실시예 28에서 제조한 N-((4-(디메틸아미노)테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 23과 동일한 방법으로 표제 화합물을 제조하였다(수율: 74.0%).
TLC Rf = 0.38 in 20% MeOH in Chloroform
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 10.45 ~ 10.35 (m, 2H), 8.72 (t, 1H, J = 6.4 Hz), 8.33 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 8.27 (dd, 1H, J = 6.4 Hz, 8.8 Hz), 7.45 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.64 (t, 2H, J = 4.4 Hz), 3.98 ~ 3.85 (m, 2H), 3.84 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.70 ~ 3.60 (m, 4H), 3.35 ~ 3.25 (m, 4H), 2.80 (d, 6H, J = 4.8Hz), 2.65 (s, 3H), 1.95 ~ 1.88 (m, 4H), 1.30 (t, 6H, J = 7.2 Hz)
시험예 1: 자가포식(autophagy) 유도 활성
본 발명의 화합물의 자가포식 유도 활성을 Hela 세포(한국세포주은행)에서 자가포식 검출 키트(DAPGreen Autophagy detection (Dojindo, D676-10))를 사용하여 제조자 지침에 따라 측정하였다. 구체적으로, 10% 우태혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함된 FluroBrite DMEM을 이용하여 웰당 8 X 104 개의 Hela 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 시딩하고, 37℃, CO2 인큐베이터에서 밤새 배양하여 안정화시켰다. DAPGreen (Cat.D676-10, Dojindo) 용액(0.1 mM in DMSO)을 배지(10% FBS를 함유하는 FluroBrite DMEM)에 1/1000 희석하여 0.1 μM DAPGreen이 들어간 배지(DAPGreen/FBS-함유 배지)를 제조하였다. 단층 세포(Monolayer cell)가 부착된 각 웰의 상층액을 모두 제거한 후, FluroBrite DMEM로 세척하였다. 상기에서 얻어진 DAPGreen/FBS-함유 배지를 웰당 100ul씩 넣고, 30분간 CO2 인큐베이터에서 배양하였다. DAPGreen의 처리 시작 시점과 30분 후 시점에 각각 형광(EX: 450 nm / EM: 535 nm)을 측정하여 차이 값을 세포의 기저 흡수값(baseline uptake value of the cells)으로 설정하였다.
상기 기저 흡수값 측정과 마찬가지로, 단층 세포(Monolayer cell)가 부착된 각 웰의 상층액을 모두 제거하고, FluroBrite DMEM로 세척하였다. 실시예 화합물들, 대조물질(2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복실산), 및 양성 대조물질(라파미이신)을 각각 DMSO에 용해시켜 500, 1000 nM 농도로 DAPGreen/FBS-함유 배지(100ul)에 희석하여 처리하였다. 각 농도별로 3개의 웰씩 시험하였으며(n=3), 37℃에서 4시간 배양 후에 EX:450nm, EM:535nm에서 형광값을 측정하였다. 각 웰의 형광값을 상기 기저 흡수값으로 빼준 후, DMSO 처치군의 평균 흡수(uptake) 값을 기준으로 보정(normalization)하였다.
양성 대조물질(라파마이신: 1000 nM과 500nM) 처리시의 형광값을 기준으로, 시험물질(1000 nM과 500 nM) 및 대조물질(2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복실산: 1000 nM과 500 nM) 처리시의 상대 형광값을 계산한 결과는 하기 표 1과 같다. 표 1에서, 양성 대조물질과 동등한 정도의 자가포식 유도능을 나타내는 경우 상대 형광값은 1이며, 실시예에서 제조한 시험물질이 우수한 자가포식 유도능을 나타내는 경우 상대 형광값은 1보다 크고, 실시예에서 제조한 시험물질이 낮은 경우 자가포식 유도능을 나타내는 경우 상대 형광값은 1보다 작다.
상대 형광값 (4시간 동안 배양)
시험물질 / 농도 1000nM 500nM
실시예 1 0.951 1.022
실시예 2 0.929 0.902
실시예 3 0.963 0.918
실시예 4 0.941 0.975
실시예 5 0.713 0.766
실시예 6 0.841 1.069
실시예 7 0.873 1.035
실시예 8 0.813 0.965
실시예 9 0.949 0.994
실시예 10 1.242 0.976
실시예 11 0.921 0.991
실시예 12 1.001 0.752
실시예 13 0.836 0.854
실시예 14 1.079 0.925
실시예 15 0.924 0.847
실시예 16 1.177 1.663
실시예 17 1.046 1.674
실시예 18 0.731 0.838
실시예 19 1.229 0.869
실시예 20 1.240 0.758
실시예 21 0.916 2.286
실시예 22 1.064 2.018
실시예 23 0.878 0.958
실시예 24 1.167 0.969
실시예 25 1.076 1.415
실시예 26 1.343 1.718
실시예 27 1.004 1.370
실시예 28 1.715 2.133
실시예 29 1.306 1.896
2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복실산 0.590 0.697
라파마이신 1.000 1.000
상기 표 1의 결과로부터, 시험물질 처리 후 4시간 동안 배양하였을 때, 본 발명에 따른 화합물은 양성 대조물질인 라파마이신과 동등 이상의 자가포식 유도 활성을 나타내며, 카르복실산 모이어티를 갖는 2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복실산에 비해 현저히 우수한 자가포식 유도활성을 나타냄을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물은 현저히 우수한 자가포식 유도 활성을 나타냄으로써, 퇴행성 뇌질환, 간질환, 대사성 질환, 패혈증 등을 포함하는 자가포식과 연관된 다양한 질환의 치료 및 예방에 유용하게 적용될 수 있다.
시험예 2: 자가포식 베지클(Autophagic Vesicle) 형성 분석
CYTO-IDTM 오토파지 검출 키트(CYTO-IDTM Autophagy Detection Kit, ENZ-51031-K200, Enzo Life Sciences, Inc.)를 사용하여, 신경세포에서 자가포식 베지클(Autophagic Vesicle) 형성 정도를 측정하여, 본 발명의 화합물에 의한 ALP (autophagy lysosomal pathway) 활성화를 검증하였다. 신경세포(primary mouse cortical neuron cells)는 마우스로부터 효소 소화(enzymatical digest) 방법을 이용하여 분리하였으며, 구체적으로는 16 day embryonic C57BL6 마우스의 피층(cortice) 조직을 20 U/ml 파파인(Worthington Biochemical Corporation, LK003176) 및 0.005% DNase I(Worthington Biochemical Corporation, LK003170)를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 분리하였다.
신경세포(primary mouse cortical neuron cells)(8 X 104 cells) 및 배지(2 mM L-글루타민(Gibco, 25030-081), N2 supplement(Gibco, 17502-048), B27 supplement(Gibco, 17504-044), 및 50 μg/ml 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, 15140-122)을 함유하는 신경세포배양용 배지)를 96 웰 플레이트의 각 웰에 넣고, 37℃, CO2 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 실시예 10의 화합물(5uM), 실시예 29의 화합물(5uM), 및 라파마이신(10uM)을 각각 처리하고, 24시간 동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 1xAssay Buffer(Enzo Life Science, ENZ-51031-K200)로 각 웰을 세척한 후, 0.2μl Cyto-ID autophagy dye와 0.1μl의 Hoechst 33342을 처리하고, 30분간 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 1xAssay Buffer(Enzo Life Science, ENZ-51031-K200)로 각 웰을 세척한 후, 형광측정기를 이용하여 Cyto-ID (EX:480nm, EM:530nm) 및 Hoechst 33342(EX:340nm, EM:480nm)의 형광값을 각각 측정하였다. 각 그룹별로 3개의 웰씩 실험하였고, 각 웰의 Cyto-ID 형광값을 Hoechst 33342 형광값으로 나누어 보정(normalization)한 다음, 미처리 대조군(untreated control)을 1로 하여 상대 강도(Relative Intensity)를 계산하였다. 그 결과는 하기 표 2와 같다.
Cyto-ID 형광값 (상대 강도)
시험물질 상대 강도
실시예 10 (5uM) 1.813
실시예 29 (5uM) 2.171
라파마이신 (10uM) 1.668
상기 표 2의 결과로부터, 실시예 10 및 29의 화합물은 양성 대조물질인 라파마이신에 비하여 1/2 농도임에도 불구하고, 자가포식 베지클 형성을 유의성있게 증가시킴을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물은 현저히 우수한 자가포식 유도 활성을 나타냄으로써, 퇴행성 뇌질환, 간질환, 대사성 질환, 패혈증 등을 포함하는 자가포식과 연관된 다양한 질환의 치료 및 예방에 유용하게 적용될 수 있다.
시험예 3: 자가포식 플럭스(Autophagy Flux) 분석
N2a 세포(ATCC, CCL-131, mouse neuroblastoma cell line)(3 X 104 cells) 및 배지(5% 열-불활성시킨 우태아혈청(heat-inactivated fetal bovine serum, FBS; Gibco, 16000-044) 및 50 μg/ml 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, 15140-122)으로 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco,11995-065) 배지)를 6 웰 플레이트의 각 웰에 넣고, 37℃, CO2 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 실시예 29의 화합물(5uM), 및 라파마이신(10uM)을 각각 처리하고, 24시간 동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 각 그룹별로 3개 웰씩 전자현미경 블록으로 제작하고, 플랫-포매 방법(flat-embedding method)으로 전고정, 후고정, 탈수, 치환, 포매를 수행하였다. 70 nm 두께의 초박절편을 제작하여 중금속 염색(uranyl acetate, lead citrate)을 한 후 세포전체를 이미징하는 모자이크 이미징 기법으로 촬영하였다. 전자현미경 이미징 결과는 도 1과 같다. 또한, 처리 군 별로 세포당 오토파지의 전체(자가포식 베지클), 오토파고솜(Autophagosome), 오토라이소솜(Autolysosome)의 수를 측정하여 얻어진 결과는 하기 표 3과 같다. 하기 표 3에서 대조군은 미처리 대조군(untreated control)을 의미한다.
세포당 오토파지 수
시험물질 자가포식 베지클 오토파고솜 오토라이소솜
대조군 8.3개 4.6개 4.7개
실시예 29 (5uM) 22.3개 6.9개 14.9개
라파마이신 (10uM) 13.3개 4.1개 7.6개
상기 표 3의 결과로부터, 실시예 29의 화합물은 양성 대조약물인 라파마이신에 비하여 1/2 농도임에도 불구하고 자가포식 베지클의 형성, 특히 오토라이소솜(Autolysosome)의 형성을 유의성 있게 증가시킴을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물은 현저히 우수한 자가포식 유도 활성을 나타냄으로써, 퇴행성 뇌질환, 간질환, 대사성 질환, 패혈증 등을 포함하는 자가포식과 연관된 다양한 질환의 치료 및 예방에 유용하게 적용될 수 있다.
시험예 4: 간 손상 모델에서 경구 투여에 의한 간 기능 개선 활성 평가 (1)
DMN(Dimethylnitrosamine)으로 유발한 간 손상 수컷 SD 랫드에 본 발명에 따른 화합물을 3주 반복 경구 투여하여, 간 기능 개선 활성을 평가하였다. 구체적으로, 7주령의 수컷 SD 랫드(㈜오리엔트바이오, 대한민국)를 실온에서 7일간 실험실 환경에 적응시킨 후 일반증상을 관찰하여 건강한 동물만을 실험에 사용하였다. 랫드를 정상 대조군, DMN 투여군 및 본 발명에 따른 화합물(실시예 2 및 23의 화합물)에 DMN을 투여한 그룹으로 총 4그룹으로 나누었다(n=5). DMN은 정제수에 용해시켜 10 mg/kg의 용량으로 주당 3일간 연속(3회/주, 4주간) 복강 투여하였다. 간 손상 유발 1주차 유발 종료 3일 후에 채혈을 실시하고 혈청으로 간 수치(ALT : Alanine Transaminase 및 AST : Aspartate Transaminase)를 확인하여 유발정도를 확인한 다음 본 발명의 화합물들을 1주차 유발 4일 후부터 DMN 투여기간 동안 3주간 투여하였다. 본 발명에 따른 화합물들은 정제수에 녹여 25 mg/kg 용량으로 1일 1회 총 3주간, 경구용 존데를 사용하여 경구투여하였다. 채혈은 Day 0 (1 주차 유발물질 투여 종료 3일 후)와 시험물질 투여 후 Day 7, 14 및 21에 실시하였다. 채혈한 혈액은 혈액응고촉진제(clot activator)가 들어있는 진공채혈관(vacutainer tube)에 주입하고 약 20 분간 상온에 방치하여 응고시킨 후, 10 분간 원심 분리하여 혈청을 얻은 후 혈액생화학적 검사를 실시하였다. 상기 실험방법을 요약하면 도 2와 같다. 측정결과는 SPSS를 사용하여 모수적인 다중비교 또는 비모수적안 다중비교를 통하여 군간 비교하고, P < 0.05인 경우 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
상기와 같이 혈액생화학적 검사를 실시하여 얻어진 혈청 ALT 및 AST 값을 측정한 결과는 하기 표 4 및 표 5와 같다.
그 룹 ALT 값 (단위 U/L; 평균)
0 주 1 주 2 주 3 주
정상 대조군 45.64 54.04 53.68 55.00
DMN 투여군 72.58 107.52 124.82 156.26
실시예 2 + DMN 투여군 70.76 93.68 107.06 117.02
실시예23 + DMN 투여군 67.64 94.40 97.64 101.04
그 룹 AST 값 (단위 U/L; 평균)
0 주 1 주 2 주 3 주
정상 대조군 109.64 142.88 137.60 142.74
DMN 투여군 140.16 207.10 250.84 301.04
실시예 2 + DMN 투여군 138.50 180.72 218.90 231.54
실시예 23 + DMN 투여군 145.10 208.56 221.58 203.44
상기 표 4 및 표 5의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, DMN 투여군은 혈청 ALT 값 및 AST 값이 3주 후 각각 약 3배 및 약 2배 증가되었다. 그러나 본 발명의 화합물들과 DMN을 동시에 투여한 군들은, 3주 후 ALT 수치는 101.04 및 117.02로 DMN 투여군 보다 35% 및 25% 감소하였으며, AST 수치는 203.44 및 231.54로 DMN 투여군 보다 32% 및 23% 감소하였다. 따라서 본 발명의 화합물들은 간 섬유화를 효과적으로 억제하는 활성을 가짐을 확인할 수 있다.
시험예 5: 간 손상 모델에서 경구 투여에 의한 간 기능 개선 활성 평가 (2)
DMN(Dimethylnitrosamine)으로 유발한 간 손상 수컷 SD 랫드에 본 발명에 따른 화합물을 4주 반복 경구 투여하여, 간 기능 개선 활성을 평가하였다. 구체적으로, 7주령의 수컷 SD 랫드(㈜오리엔트바이오, 대한민국)를 실온에서 7일간 실험실 환경에 적응시킨 후 일반증상을 관찰하여 건강한 동물만을 실험에 사용하였다. 랫드를 정상 대조군, DMN 투여군 및 본 발명에 따른 화합물(실시예 23, 26, 및 29의 화합물)에 DMN을 투여한 그룹으로 총 5그룹으로 나누었다(n=10). DMN은 정제수에 용해시켜 10 mg/kg의 용량으로 주당 3일간 연속(3회/주, 4주간) 복강 투여하였다. 간 손상 유발 4주차 유발 종료 후에 채혈을 실시하고 혈청으로 간 수치(ALT : Alanine Transaminase 및 AST : Aspartate Transaminase)를 확인하여 유발정도를 확인한 다음 본 발명의 화합물을 4주차 유발종료 1일 후부터 4주간 투여하였다. 본 발명에 따른 화합물은 정제수에 녹여 25 mg/kg 용량으로 1일 1회 총 4주간, 경구용 존데를 사용하여 경구투여하였다. 채혈은 Day 0 (4 주차 유발물질 투여 종료 1일 후)와 시험물질 투여 후 Day 7, 14, 21 및 28에 실시하였다. 채혈한 혈액은 혈액응고촉진제(clot activator)가 들어있는 진공채혈관에 주입하고 약 20 분간 상온에 방치하여 응고시킨 후, 10 분간 원심 분리하여 혈청을 얻은 후 혈액생화학적 검사를 실시하였다. 또한, 마지막 투여 시점에서 24시간 후 부검하여 간 적출 및 고정 후 조직 표본을 제작하였다. 조직 표본으로 슬라이드 제작 후 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색을 시행하여 현미경하에서 간조직 손상 및 간조직내 염증세포 침윤을 확인하였다. 또한 마손 삼색(Masson's Trichrome) 염색을 시행하여 현미경으로 간조직내 콜라겐섬유 침착을 확인하였다. 상기 실험방법을 요약하면 도 3과 같다. 측정결과는 SPSS를 사용하여 모수적인 다중비교 또는 비모수적인 다중비교를 통하여 군간 비교하고, P < 0.05인 경우 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
상기와 같이 혈액생화학적 검사를 실시하여 얻어진 혈청 ALT 및 AST 값을 측정한 결과는 하기 표 6 및 표 7와 같다.
그 룹 주간 ALT 값 (단위 U/L; 평균)
0 주 1 주 2 주 3 주 4 주
정상 대조군 50.90 51.15 50.09 48.38 48.79
DMN 투여군 254.33 111.02 64.26 63.65 65.60
실시예23 + DMN 투여군 198.30 104.22 65.66 60.95 52.93
실시예26 + DMN 투여군 199.51 134.97 70.09 62.81 59.12
실시예29 + DMN 투여군 219.29 99.31 66.57 53.03 52.97
그 룹 주간 AST 값 (단위 U/L; 평균)
0 주 1 주 2 주 3 주 4 주
정상 대조군 103.83 99.78 93.96 117.32 117.91
DMN 투여군 339.76 182.01 132.13 143.45 158.68
실시예23 + DMN 투여군 395.34 169.11 140.57 128.30 125.15
실시예26 + DMN 투여군 322.72 153.48 145.71 138.76 114.45
실시예29 + DMN 투여군 376.67 164.60 143.87 127.65 123.33
상기 표 6 및 표 7의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, DMN 투여군은 혈청 ALT 값 및 AST 값이 4주 후 각각 약 4-5배 및 약 3-4배 증가되었다. 그러나 본 발명의 화합물과 DMN을 동시에 투여한 군들은, 4주후의 ALT 값은 52.93 ∼ 59.12로 DMN 투여군 보다 9.9 ∼ 19% 감소하였으며, 4주후 AST 값은 114.45 ∼ 125.59로 DMN 투여군 보다 21 ∼ 28% 감소하였으며, 특히 실시예 26의 화합물은 4주차에 정상대조군의 AST 수치를 나타내었다. 따라서 본 발명의 화합물은 간 섬유화를 효과적으로 치료하는 활성을 가짐을 확인할 수 있다.또한, 상기한 바와 같이 정상군, 4주간 DMN 투여군 및 본 발명의 화합물(실시예 23 및 26의 화합물)과 DMN을 동시에 투여한 군을 부검하여 간 조직표본을 제작한 후 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색 및 마손 삼색(Masson's Trichrome) 염색을 시행하여 얻어진 결과는 도 4와 같다. 또한, 도 4의 결과로부터 간조직내 간조직 손상 정도 및 간조직내 염증세포 침윤 정도를 측정하였으며, 또한 도 4의 결과로부터 간조직내 콜라겐섬유 침착 정도를 측정한 결과는 하기 표 8과 같다.
그 룹 Degenerative hepatocyte numbers Inflammatory cell numbers Collagen fiber occupied regions
cells/1000 cells cells/mm2 %/mm2
정상 대조군 33.14±3.23 40.29±6.71 2.37±0.37
DMN 투여군 559.88±44.30 188.50±9.90 28.68±1.83
실시예 23 + DMN 투여군 319.14±44.66 101.43±16.53 12.44±2.03
실시예 26 + DMN 투여군 259.14±42.56 90.00±20.67 10.75±2.17
H&E 염색(도 4) 및 표 8의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 4주간의 DMN 투여로 간조직내 간조직 손상 및 간조직내 염증세포 침윤이 정상군에 비해 약 17배 및 약 5배 증가하여 정상군에 비해 간장해가 유발되었다. 그러나 본 발명의 화합물(실시예 23 및 26의 화합물)과 DMN을 동시에 투여한 군의 간조직내 간조직 손상 및 간조직내 염증세포 침윤은 각각 259.14 ∼ 319.14 cells/1000 cells 및 90.00 ∼ 101.43 cells/mm2으로 DMN 투여군 보다 약 43 ∼ 54% 및 46 ∼ 52% 완화된 것을 확인할 수 있다. 또한, 마손 삼색 염색(도 4) 및 표 8의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 4주간의 DMN 투여로 간조직내 콜라겐섬유 침착이 정상군에 비해 약 12배 증가하였다. 그러나, 본 발명의 화합물(실시예 23 및 26의 화합물)과 DMN을 동시에 투여한 군의 간조직내 콜라겐섬유 침착은 10.75 ∼ 12.44 %/mm2로 DMN 투여군 보다 약 57 ∼ 63% 감소하였다. 따라서 본 발명의 화합물(실시예 23 및 26의 화합물)은 간섬유화를 효과적으로 치료하는 활성을 가짐을 확인할 수 있다.
시험예 6: 베타 아밀로이드에 의한 신경세포사멸에 대한 억제 활성 분석
퇴행성 뇌질환의 주요 독성물질로 알려진 베타 아밀로이드에 의한 신경세포 사멸에 대한 본 발명의 화합물의 억제 활성을 N2a 세포(ATCC, CCL-131, mouse neuroblastoma cell line)와 시험예 2와 동일한 방법으로 분리한 신경세포(primary mouse cortical neuron cells)에서 분석하였다. N2a 세포 및 신경세포 배양을 위한 배지로는 각각 시험예 3 및 시험예 2에서 사용된 배지를 사용하였다. 구체적으로, N2a 세포(3 X 104 cells) 및 신경세포(8 X 104 cells)를 각각 배지와 함께 96 웰 플레이트의 각 웰에 넣고, 37℃, CO2 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 실시예 10의 화합물과 실시예 29의 화합물을 각각 5uM 및 500nM의 농도로 처리하고, 30분 후에 20uM의 베타 아밀로이드를 처리한 다음, 72시간 동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 10 μl의 CCK-8 시약(Enzo Life Science, ALX-850-039-KI02)을 처리하여 2시간 동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 각 그룹별로 3개 웰씩 시험하였으며, 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 미처리 대조군(untreated control)의 흡광도값을 100% 세포 생존율로 하여, 각각의 흡광도값으로부터 세포 생존율을 계산하였다. 그 결과는 하기 표 9와 같다. 표 9에서, 대조군은 20uM의 베타 아밀로이드만을 처리한 군을 나타낸다.
시험물질 세포 생존율(%) (N2a 세포)
대조군 44.68
실시예 10 (5uM) 68.86
실시예 29 (5uM) 68.45
시험물질 세포 생존율(%) (신경세포)
대조군 45.10
실시예 10 (500nM) 52.16
실시예 29 (500nM) 53.33
상기 표 9의 결과로부터, 실시예 10의 화합물 및 실시예 29의 화합물 모두 베타 아밀로이드 처리에 의한 세포 독성을 유의성 있게 억제함을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물은 베타 아밀로이드와 연관된 다양한 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.
시험예 7: 로테논에 의한 미토콘드리아 손상에 대한 억제 활성 분석
퇴행성 뇌질환의 주요 독성물질로 알려진 로테논(Rotenone)에 의한 미토콘드리아 손상에 대한 본 발명의 화합물의 억제 활성을 마우스 신경 세포주인 N2a 세포(ATCC, CCL-131, mouse neuroblastoma cell line)에서 분석하였다. 구체적으로, N2a 세포(3 X 104 cells) 및 배지(5% 열-불활성시킨 우태아혈청(heat-inactivated fetal bovine serum, FBS; Gibco, 16000-044) 및 50 μg/ml 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, 15140-122)으로 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco,11995-065) 배지를 각각 XF24-웰 배양 플레이트의 각 웰에 넣고, 37℃, CO2 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 실시예 10의 화합물(5uM)을 처리하고, 30분 후에 10uM의 로테논을 처리한 다음, 24시간 동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. XF Cell Mito Stress Test Kit(Seahorse Bioscience, 103015-100)로 제조사 지침에 따라 처리한 후, 미토콘드리아 호흡량을 XF24 Extracellular Flux Analyzer(Seahorse Bioscience)를 이용하여 측정하였다. 각 그룹별로 4개 웰씩 실험하였고, 기초 호흡량(basal Respiration), ATP 생산(ATP production), 최대 호흡량(Maximal Respiration), Spare capacity의 호흡량을 측정였다. 미토콘드리아 호흡량은 단백질 정량 값으로 나누어 보정(normalization)한 다음, 미처리 대조군(untreated control)의 기초 호흡량을 100%로 하고, 나머지 값을 나타내었다. 그 결과는 하기 표 10과 같다. 표 10에서, 대조군은 10uM의 로테논만을 처리한 군을 나타낸다.
시험물질 미토콘드리아 호흡량(%)
Basal ATP production Maximal Spare
Control 100 65.32 112.21 19.59
로테논(Rotenone) 34.76 20.33 47.67 17.00
실시예 10 + 로테논 51.69 31.65 62.28 16.33
상기 표 10의 결과로부터, 실시예 10의 화합물은 로테논 처리에 의한 미토콘드리아 손상을 통계적으로 유의성 있는 수준으로 회복함을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 미토콘드리아 손상과 연관된 다양한 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    <화학식 1>
    Figure PCTKR2021000578-appb-I000043
    식 중,
    R1은 수소; C1∼C4 알킬기; 또는 모노 혹은 디-C1∼C5 알킬아미노로 치환된 C1∼C4 알킬기이고,
    R2는 C1∼C4 알킬기이고,
    A는 하기 화학식 1a 내지 1d의 기로 이루어진 군으로부터 선택된 기이며,
    <화학식 1a>
    Figure PCTKR2021000578-appb-I000044
    <화학식 1b>
    Figure PCTKR2021000578-appb-I000045
    <화학식 1c>
    Figure PCTKR2021000578-appb-I000046
    <화학식 1d>
    Figure PCTKR2021000578-appb-I000047
    상기 화학식 1a 내지 1d에서,
    *는 화학식 1의 화합물에 결합되는 위치를 나타내고,
    n은 1, 2, 또는 3이고,
    R3 및 R4는, 서로 독립적으로, 수소; C1∼C4 알킬; 또는 이들이 결합되는 질소원자와 함께 피페리딘, 모르폴린, 또는 피롤리딘을 형성하고(상기 피페리딘, 모르폴린, 또는 피롤리딘은 C1∼C4 알킬로 선택적으로 치환된다),
    R5 및 R6는 C1∼C4 알킬; 또는 함께 고리를 이루어 시클로펜탄, 시클로헥산 또는 테트라히드로-피란을 형성하고,
    Cy는 호모피페라진일, 피페리딘일, 모르폴린일, 및 피롤리딘일로 이루어진 군으로부터 선택된 질소-함유 헤테로시클릭 기(상기 질소-함유 헤테로시클릭 기는 C1∼C4 알킬 또는 벤질로 선택적으로 치환된다)이다.
  2. 제1항에 있어서, R1이 수소; 아이소뷰틸기; 또는 디에틸아미노에틸기인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  3. 제1항에 있어서, R2가 메틸기인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  4. 제1항에 있어서, A가 화학식 1a의 기 또는 화학식 1b의 기인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  5. 제4항에 있어서, R3 및 R4가 이들이 결합되는 질소원자와 함께 피페리딘, 모르폴린, 또는 피롤리딘을 형성하는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  6. 제5항에 있어서, 상기 피페리딘, 모르폴린, 또는 피롤리딘이 C1∼C4 알킬로 치환되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  7. 제1항에 있어서,
    N-(2-(디에틸아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(2-(디아이소프로필아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(2-(디메틸아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(3-(디에틸아미노)프로필)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(4-메틸호모피페라지노)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(4-(1-메틸)피페리딘일)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(2-(4-모르폴리노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(2-(1-피롤리디노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(2-(1-피페리디노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-((4-(디메틸아미노)테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-((1-(디메틸아미노)시클로펜틸)메틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-((1-(디메틸아미노)시클로헥실)메틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(3-(1-벤질)피롤리딘일)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(2-(2-(1-메틸)피롤리디노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-((S)-2-(1-에틸)피롤리디노메틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(4-모르폴린아미노)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(1-피페리딘아미노)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(2-(디아이소프로필아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(2-(디에틸아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(2-(디메틸아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(2-(4-모르폴리노)에틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-((S)-2-(1-에틸)피롤리디노메틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(2-(디아이소프로필아미노)에틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(2-(디에틸아미노)에틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(2-(디메틸아미노)에틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(2-(4-모르폴리노)에틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-((S)-2-(1-에틸)피롤리디노메틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-((4-(디메틸아미노)테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염; 및
    N-((4-(디메틸아미노)테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  8. 제1항에 있어서,
    N-(2-(디아이소프로필아미노)에틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-((4-(디메틸아미노)테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸)-2-(3-시아노-4-아이소뷰톡시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(2-(디아이소프로필아미노)에틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-(2-(4-모르폴리노)에틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염;
    N-((4-(디메틸아미노)테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸)-2-(3-시아노-4-히드록시페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염; 및
    N-((4-(디메틸아미노)테트라히드로-2H-피란-4-일)메틸)-2-(4-(2-디에틸아미노)에톡시-3-시아노페닐)-4-메틸티아졸-5-카르복스아미드 염산염
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  9. 화학식 2의 화합물을 NH2-(CH2)n-NR3R4, NH2-CH2-CR5R6-NR3R4, Cy, 및 NH2-Cy로 이루어진 군으로부터 선택된 N-함유 화합물(식 중, n, R3, R4, R5, 및 R6은 제1항에서 정의한 바와 동일하며, Cy는 호모피페라진, 피페리딘, 모르폴린, 및 피롤리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 질소-함유 헤테로사이클이고(상기 질소-함유 헤테로사이클은 C1∼C4 알킬 또는 벤질로 선택적으로 치환된다), NH2-Cy는 호모피페라진일아민, 피페리딘일아민, 모르폴린일아민, 및 피롤리딘일아민로 이루어진 군으로부터 선택된 질소-함유 헤테로시클릭아민(상기 질소-함유 헤테로시클릭아민은 C1∼C4 알킬 또는 벤질로 선택적으로 치환된다)이다)을 사용하여 아실화하는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법:
    <화학식 1>
    Figure PCTKR2021000578-appb-I000048
    <화학식 2>
    Figure PCTKR2021000578-appb-I000049
    식 중, R1, R2, 및 A는 제1항에서 정의한 바와 동일하다.
  10. 화학식 3의 화합물을 NH2-(CH2)n-NR3R4, NH2-CH2-CR5R6-NR3R4, Cy, 및 NH2-Cy로 이루어진 군으로부터 선택된 N-함유 화합물(식 중, n, R3, R4, R5, 및 R6은 제1항에서 정의한 바와 동일하며, Cy는 호모피페라진, 피페리딘, 모르폴린, 및 피롤리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 질소-함유 헤테로사이클이고(상기 질소-함유 헤테로사이클은 C1∼C4 알킬 또는 벤질로 선택적으로 치환된다), NH2-Cy는 호모피페라진일아민, 피페리딘일아민, 모르폴린일아민, 및 피롤리딘일아민로 이루어진 군으로부터 선택된 질소-함유 헤테로시클릭아민(상기 질소-함유 헤테로시클릭아민은 C1∼C4 알킬 또는 벤질로 선택적으로 치환된다)이다)을 사용하여 아실화하여 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계; 및
    상기 화학식 4의 화합물을 화학식 5의 화합물과 알킬화 반응을 수행하여 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법:
    <화학식 1>
    Figure PCTKR2021000578-appb-I000050
    <화학식 3>
    Figure PCTKR2021000578-appb-I000051
    <화학식 4>
    Figure PCTKR2021000578-appb-I000052
    <화학식 5>
    R1X
    식 중, R1, R2, 및 A는 제1항에서 정의한 바와 동일하고, X는 할로겐이다.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 자가포식의 유도를 위한 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 프리온병, 다발성 경화증, 및 루게릭병으로 이루어진 군으로부터 선택된 퇴행성 뇌질환; 간섬유화증, 간경변증, 간염, 및 지방간으로 이루어진 군으로부터 선택된 간질환; 당뇨병, 고지혈증, 비만, 및 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 대사성 질환; 또는 패혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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