WO2021221471A1 - 3차원 배양된 줄기세포로부터 세포외 소포체를 제조하는 방법 - Google Patents

3차원 배양된 줄기세포로부터 세포외 소포체를 제조하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2021221471A1
WO2021221471A1 PCT/KR2021/005408 KR2021005408W WO2021221471A1 WO 2021221471 A1 WO2021221471 A1 WO 2021221471A1 KR 2021005408 W KR2021005408 W KR 2021005408W WO 2021221471 A1 WO2021221471 A1 WO 2021221471A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
present
cell
disease
exosomes
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2021/005408
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
조쌍구
김세희
임경민
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University Industry Cooperation Corporation of Konkuk University
Original Assignee
University Industry Cooperation Corporation of Konkuk University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=78373742&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2021221471(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by University Industry Cooperation Corporation of Konkuk University filed Critical University Industry Cooperation Corporation of Konkuk University
Priority to AU2021264368A priority Critical patent/AU2021264368B2/en
Priority to CN202180031909.1A priority patent/CN115485366B/zh
Priority to JP2022565884A priority patent/JP7513305B2/ja
Priority to EP21795735.6A priority patent/EP4144836A4/en
Priority to US17/997,340 priority patent/US20230220348A1/en
Publication of WO2021221471A1 publication Critical patent/WO2021221471A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2527/00—Culture process characterised by the use of mechanical forces, e.g. strain, vibration

Definitions

  • the present invention relates to a method for obtaining stem cell-derived extracellular vesicles in high yield through three-dimensional culture of stem cells.
  • the extracellular ER is an endoplasmic reticulum with a lipid bilayer structure of various sizes secreted from various eukaryotic cells such as insects, plants, and microorganisms as well as humans and animals. do. Exosomes contain specific molecules, such as proteins, nucleic acids, lipids, and carbohydrates, contained in cells, and serve as information transfer by stably protecting these molecules with a lipid bilayer and delivering them to other cells after secretion.
  • exosomes are obtained in a manner that is isolated from a cell culture medium.
  • stem cell culture two-dimensional culture is performed.
  • a large amount of cells must be cultured, resulting in an increase in cost.
  • separating the exosomes from a large amount of cell culture medium in which a large number of cells are cultured requires considerable labor. Centrifugation and tangential flow filtration (TFF) are mainly used for separation and purification of exosomes, but in the case of centrifugation, the applicable capacity is limited, so it is not suitable for separating exosomes from a large amount of cell culture medium.
  • TFF tangential flow filtration
  • TFF has the advantage of being suitable for mass processing compared to centrifugation, but there are many problems to be solved, such as shear stress and loss of exosomes that occur during the T filtration process.
  • shear stress and loss of exosomes that occur during the T filtration process.
  • the development of an efficient extraction method capable of obtaining a large amount of exosomes with a small number of cells and a small amount of culture medium is required.
  • the present inventors have developed an efficient method for obtaining stem cell-derived extracellular vesicles, specifically mesenchymal stem cell-derived exosomes, which contain various beneficial components and are composed of a lipid bilayer and function as a stable drug delivery system by themselves. For this purpose, research efforts were made diligently. As a result, when three-dimensional culturing of stem cell aggregates provides a physical, biological, and spatial environment similar to in vivo conditions, and at the same time, when TGF- ⁇ (Transforming growth factor beta) superfamily cytokine is added, the By discovering that not only the yield but also the intrinsic immunomodulatory effect of stem cells, such as the therapeutic effect on inflammatory diseases, is remarkably improved, the present invention has been completed.
  • TGF- ⁇ Transforming growth factor beta
  • an object of the present invention is to provide a method for preparing a stem cell-derived extracellular vesicle.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating inflammatory or autoimmune diseases comprising the stem cell-derived extracellular vesicles prepared by the above method as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for producing a stem cell-derived extracellular vesicle (extracellular vesicle) comprising the steps of:
  • the present inventors have developed an efficient method for obtaining stem cell-derived extracellular vesicles, specifically mesenchymal stem cell-derived exosomes, which contain various beneficial components and are composed of a lipid bilayer and function as a stable drug delivery system by themselves. For this purpose, research efforts were made diligently. As a result, when three-dimensional culturing of stem cell aggregates provides a physical, biological, and spatial environment similar to in vivo conditions, and at the same time, when TGF- ⁇ (Transforming growth factor beta) superfamily cytokine is added, the It was found that not only the yield but also the intrinsic immunomodulatory effect of stem cells, such as the therapeutic effect on inflammatory diseases, was also remarkably improved.
  • TGF- ⁇ Transforming growth factor beta
  • extracellular vesicle refers to a vesicle having a lipid bi-membrane structure with a diameter in the range of 30-1,000 nm that is secreted into the extracellular environment through the fusion of polycystic bodies and plasma membranes in various cells.
  • the extracellular vesicles prepared by the method of the present invention have an average diameter of 30 - 150 nm, more specifically, have an average diameter of 50 - 120 nm. Extracellular vesicles having a microdiameter in this range are called exosomes.
  • stem cell is an undifferentiated cell before differentiation into each cell constituting the tissue, and has the ability to differentiate into a specific cell under a specific differentiation stimulus (environment).
  • cells are collectively referred to as Stem cells, unlike differentiated cells in which cell division is stopped, can produce the same cells as themselves by cell division (self-renewal), and when a differentiation stimulus is applied, they can be differentiated into various cells depending on the nature of the stimulus. , it is characterized by the flexibility of differentiation (plasticity).
  • the stem cells used in the present invention may be used without limitation as long as they have the characteristics of stem cells, that is, undifferentiated, indefinitely proliferated, and have the ability to differentiate into specific cells, so long as they are capable of inducing differentiation into a tissue to be regenerated.
  • the stem cells used in the present invention are mesenchymal stem cells.
  • meenchymal stem cells refers to stem cells having multipotency capable of differentiation into adipocytes, osteocytes, chondrocytes, muscle cells, nerve cells, and cardiomyocytes. Mesenchymal stem cells can be identified through their vortex shape and the expression levels of the basic cell surface markers CD73(+), CD105(+), CD34(-), and CD45(-). It also has a control function.
  • step (a) is performed by suspension culture of stem cells in a multi-well culture vessel.
  • the term “suspension culture” refers to culturing the cells to be cultured in a floating state in a culture medium without fixing them to a substrate or the like. Accordingly, the term “floating culture” is used in the same sense as “3-dimensional culture”. Stem cells, which are adhesion-dependent, cause cell aggregation during suspension culture, and cells floating alone without being included in such aggregation cause apoptosis and die. do. According to the present invention, a cell aggregate having a size according to the size of the well is formed by suspending stem cells in multiple wells having a plurality of wells. Accordingly, the present invention can obtain a large amount of standardized stem cell aggregates having the same size and shape.
  • cell aggregate refers to a cell having a three-dimensional structure formed by self-aggregation of cells cultured in an environment such as a floating culture that allows three-dimensional growth rather than a monolayer. means agglomerated mass.
  • the cell aggregate produced as a result of the three-dimensional culture provides an environment similar to the in vivo tissue from which stem cells are derived, and may be spherical or non-spherical depending on the size and number of self-assembled cells.
  • a spherical cell aggregate is called a spheroid, but the spheroid need not be geometrically perfectly spherical.
  • cell culture herein in, in vitro, including the essential element in the growth and proliferation of cells, such as sugar, amino acids, and various nutrients, minerals refers to a mixture for cell growth and proliferation.
  • Components that may be additionally included in the cell culture medium are, for example, glycerin, L-alanine, L-arginine hydrochloride, L-cysteine hydrochloride-monohydrate, L-glutamine, L-histidine hydrochloride-monohydrate, L- Lysine hydrochloride, L-methionine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-valine, L-asparagine-monohydrate, L-aspartic acid, L-cystine 2HCl, L-glutamic acid, L-isoleucine, L -Leucine, L-phenylalanine, L-tryptophan, L-tyrosine disodium salt dihydrate, i-inositol, thiamine hydrochloride, niacinamide, pyridoxine hydrochloride, biotin, D-pantothenate calcium, folic acid, riboflavin, vitamin B
  • the medium for cell culture according to the present invention may be artificially prepared and used, or commercially available ones may be purchased and used.
  • Examples of commercially available culture media include IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), ⁇ -MEM (Alpha Modification of Eagle's Medium), F12 (Nutrient Mixture F-12) and DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture) F-12), but is not limited thereto.
  • the multi-well culture vessel has a size of 300-500 ⁇ m per well. More specifically, it has a size of 350-450, and most specifically has a size of about 400 ⁇ m.
  • the suspension culture is 300 per well in the multi-well culture vessel. - It is made by dispensing 500 cells. More specifically, 350 - 450 cells, most specifically about 400 cells, are dispensed.
  • the TGF- ⁇ used in the present invention is TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2 or TGF- ⁇ 3, more specifically TGF- ⁇ 3.
  • step (b) is performed by orbital shaking culture of the cell aggregate in a suspended state.
  • the rotation shake culture is performed at a rotation speed of 50 - 70 rpm. More specifically, it is performed at a rotation speed of 53 - 67 rpm, more specifically 55 - 65 rpm, and most specifically 57 - 63 rpm.
  • the method of the present invention further comprises the step of separating the extracellular vesicles from the culture medium obtained in step (b) through a plurality of centrifugation.
  • the present invention provides a stem cell-derived extracellular vesicles prepared by the method of the present invention described above.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating inflammatory or autoimmune diseases comprising the stem cell-derived extracellular vesicles prepared by the method of the present invention as an active ingredient.
  • prevention refers to inhibiting the occurrence of a disease or disease in a subject who has never been diagnosed with a disease or disease, but is likely to have the disease or disease.
  • the term “treatment” refers to (a) inhibiting the development of a disease, disorder or condition; (b) alleviation of the disease, condition or condition; or (c) eliminating the disease, condition or symptom.
  • the composition of the present invention serves to inhibit, eliminate, or alleviate symptoms of various inflammatory or autoimmune diseases caused by excessive or unwanted immune responses by efficiently inhibiting T cell-mediated immune activity. Accordingly, the composition of the present invention may be a composition for treating these diseases by itself, or may be administered together with other pharmacological ingredients having a therapeutic effect on inflammatory or autoimmune diseases and applied as a therapeutic adjuvant for the above diseases. Accordingly, as used herein, the term “treatment” or “therapeutic agent” includes the meaning of “therapeutic adjuvant” or “therapeutic adjuvant”.
  • the term “administration” refers to directly administering a therapeutically effective amount of the composition of the present invention to a subject so that the same amount is formed in the body of the subject, and has the same meaning as “transplantation” or “injection”.
  • the term “therapeutically effective amount” refers to the content of the composition contained in an amount sufficient to provide a therapeutic or prophylactic effect to an individual to whom the composition of the present invention is to be administered, and includes a “prophylactically effective amount”. it means
  • the term “subject” includes, without limitation, humans, mice, rats, guinea pigs, dogs, cats, horses, cattle, pigs, monkeys, chimpanzees, baboons or rhesus monkeys. Specifically, the subject of the present invention is a human.
  • the autoimmune disease or inflammatory disease to be prevented or treated with the composition of the present invention is, for example, rheumatoid arthritis, reactive arthritis, type 1 diabetes, type 2 diabetes mellitus, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, Idiopathic fibroalveolitis, polymyositis, dermatomyositis, localized scleroderma, systemic scleroderma, colitis, inflammatory bowel disease, Sjorgen's syndrome, Raynaud's phenomenon, Bechet's disease, Kawasaki disease (Kawasaki's disease), primary biliary sclerosis, primary sclerosing cholangitis, ulcerative colitis (ulcerative olitis), graft-versus-host disease (GVHD) and Crohn's disease (GVHD) Crohn's disease), but is not limited thereto.
  • rheumatoid arthritis reactive arthritis
  • type 1 diabetes type 2 diabetes mellitus
  • the pharmaceutical composition of the present invention when prepared as a pharmaceutical composition, includes a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used in formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like, in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., a talc, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, a talct, a talct, a talct, a talct, a sorbitol, mannitol, mannitol
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and specifically may be administered orally, intravenously, subcutaneously or intraperitoneally.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is variously prescribed depending on factors such as formulation method, administration method, age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity of the patient. can be A preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is within the range of 0.001-100 mg/kg for adults.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, syrup, or emulsion in oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or stabilizer.
  • the present invention provides a method for preventing or treating inflammation or autoimmune disease, comprising administering to a subject a composition comprising the stem cell-derived extracellular vesicles of the present invention as an active ingredient. .
  • peroxyredoxin-4 Peroxiredoxin-4
  • Thioredoxin reductase 1 Thioredoxin reductase 1
  • prostaglandin G / H synthase 2 prostaglandin G / H synthase 2
  • the extracellular vesicles isolated from the mesenchymal stem cells cultured by the method of the present invention show a clear difference in protein expression profile compared to the exosomes obtained by the conventional method.
  • the three proteins are significantly higher expressed than the mesenchymal stem cell-derived exosomes to which only the three-dimensional culture was applied without two-dimensional culture or TGF- ⁇ 3 treatment, and by the method of the present invention It can be seen that the composition itself of the obtained exosome also has a novel composition that did not exist in the prior art.
  • the term “high expression” refers to a mesenchymal stem cell-derived exosome obtained by a conventional method, not by the method of the present invention, so that the content, secretion or expression level of a specific protein in the exosome can be measured significantly. It means increased, specifically, it means that the content, secretion amount or expression amount increased by 40% or more, more specifically it means an increase of 60% or more, more specifically it means an increase of 80% or more, and most specifically means an increase of more than 100%.
  • the extracellular vesicles are HSP90- ⁇ (heat shock protein 90- ⁇ ), neprilysin, T-complex protein 1 (TCP1) subunit- ⁇ , filamine-A (Filamin-A), 40S ribosomal protein S3, myosin-9, transaldolase, Fascin, thioredoxin reductase 1, RUVBL 2 (RuvB-like 2) at least one protein selected from the group consisting of additionally high expression.
  • the extracellular vesicles are coronin-1A (Coronin-1A), prolyl 4-hydroxylase subunit ⁇ -2 (Prolyl 4-hydroxylase subunit ⁇ -2) and purine nucleos positive for at least one protein selected from the group consisting of purine nucleoside phosphorylase.
  • the three proteins are proteins that are not detected in mesenchymal stem cell-derived exosomes to which only three-dimensional culture is applied without two-dimensional culture or TGF- ⁇ 3 treatment, and the exosomes obtained by the method of the present invention are not at all It can be seen that it has a new protein expression profile.
  • the present invention provides a method for producing an extracellular vesicle from a three-dimensional cultured stem cells.
  • the method of the present invention can obtain stem cell-derived extracellular vesicles in high yield by orbital shaking culture of stem cell aggregates in the presence of TGF- ⁇ It can be usefully used in the process of mass-producing exosomes that can be made on an industrial scale.
  • the exosome obtained by the method of the present invention has significantly improved immunomodulatory function compared to the exosome produced by the conventional method, and can be applied as an excellent therapeutic composition for various inflammatory or autoimmune diseases.
  • FIG. 1 is a diagram showing a three-dimensional culturing process of mesenchymal stem cells according to the method of the present invention, showing the embryonic body formation (Fig. 1a) and 3D culture using a rotary stirrer (Fig. 1b), respectively.
  • 2 is a diagram showing the yield of exosomes according to each culture condition.
  • Figure 3 is a diagram showing the change in PDI value by TGF- ⁇ treatment, it shows that a single peak (one peak) appears in the 3D shaking culture conditions treated with TGF- ⁇ .
  • FIG. 4 is a diagram showing the effect of TGF- ⁇ on T cell proliferation.
  • Figure 5a is a diagram showing the results of examining the size of the exosomes through dynamic light scattering (DLS) analysis.
  • Figure 5b is the result of observing the shape and structure of the exosomes with a transmission electron microscope (TEM).
  • Figure 5c shows the results of Western blotting analysis to confirm the expression of CD9, CD63, Flotillin-1 and Alix.
  • Figure 5d shows the results of performing the immunophenotyping of the surface of the exosomes through flow cytometry.
  • FIG. 6 shows the results of examining the wound healing ability in skin epithelial cells (Keratinocyte, HaCaT) by the exosomes of the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram showing a protein that is specifically changed in a T-3D-EV sample, which is an exosome obtained by the method of the present invention, among four clusters derived through clustering analysis.
  • FIG. 9 is a diagram showing the biological functions of the derived three clusters of proteins and their immune-related characteristics.
  • 11 is a gene set enrichment analysis result, showing the enriched gene set, normalized enrichment score (NES) and p-value, respectively.
  • FIG. 12 is a diagram showing the gene group enriched in the present invention.
  • FIG. 13 and 14 show a protein expressed only in the exosome obtained by the method of the present invention (FIG. 14) and a protein (FIG. 13) that increased or decreased two-fold or more compared to the 3D culture group in the exosome obtained by the method of the present invention. Each picture is listed.
  • 15 is a diagram showing the expression pattern of the inflammation-related protein in the exosome obtained by the method of the present invention.
  • Example 1 Three-dimensional cell culture of mesenchymal stem cells
  • AggreWell TM 400 (STEMCELL Technologies; #34425) containing about 7000 400 ⁇ m-sized microwells per well was treated with F127 solution, and about 400 umbilical cord-derived mesenchymal stem cells per well (Seoul National University Hospital) , Konkuk University Bioethics Committee Approval No.: 001355-201705-BR-181) was seeded to produce uniform spheroids in the range of 120-200 ⁇ m in diameter. After seeding the spheroids in a culture medium containing TGF- ⁇ 3 in a non-adsorption culture dish, shaking culture was performed at 60 rpm and 37° C. with an orbital shaker (INFORS HT Celtron; #69455) for 3 days. . After 3 days, exosomes were isolated from the obtained culture medium.
  • PBMCs were isolated using ficoll from blood (Konkuk University Hospital, Konkuk University Bioethics Committee Approval No.: 7001355-201705-BR-181), and after 5 days of culture, CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester, Invitrogen; #C34554) was stained with PBMCs and the proliferation of PBMCs was confirmed through flow cytometry. After inducing an inflammatory environment accompanied by proliferation of T cells by treatment with PHA (Phytohaemaglutinin, Sigma; #L1668), the PBMC inhibitory effect of the mesenchymal stem cells itself was set as a positive control.
  • PHA Physicalhaemaglutinin
  • the size of the exosomes was investigated through dynamic light scattering (DLS) analysis using a Nano Zetasizer (Malvern Instruments, Malvern, UK), and the number of EVs was measured using a nanoparticle tracking analyzer NS300 (Nanosight, Amesbery, UK). and measured.
  • the shape and structure of the exosomes were analyzed using a transmission electron microscope (TEM, JEM-1010, Nippon Denshi, Tokyo, Japan) at 80 kV, and as a result of the observation, the shape of the exosomes was cup or spherical (Fig. 5b).
  • Exosomes were attached to the grid (Formvar/Carbon 300 Mesh, Copper_FCF300-CU 50/pk), and negative staining was performed using 1% phosphotungstic acid hydrate (sigma, P4006).
  • CD9 ab263023, abcam
  • CD63 ab134045, abcam
  • Flotillin-1 Flotillin-1
  • Alix a2171, CST
  • the fluorescence intensity generated from the labeled antibody was measured using a flow cytometer (Beckman Coulter, CytoFlex Flow Cytometry Analyzer). As a result, it was confirmed that the fluorescence expression levels of CD9, CD63, and CD81 were more than 96% in the exosomes. Judging that the isolated exosomes expressed 96-98% of the exosome-positive markers, it can be confirmed that the homogeneous exosomes were isolated.
  • HaCaT skin epithelial cells
  • HaCaT cells were inoculated in a culture dish and grown to 90%, and then a long wound was made using the tip of 1000 ⁇ l.
  • a cell culture medium Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose, D6429, sigma
  • exosomes (1E+10 particles/ml)
  • Proteins stained from each gel were prepared and extracted with peptides through in-gel digestion. Specifically, for protein destaining, 50 mM ammonium bicarbonate and 50% acetonitrile were used and a 100% acetonitrile solution was used, and then 50 mM dithiothreitol was used. After reducing the disulfide bond at 37° C. and performing an alkylation reaction under light blocking conditions using 55 mM iodoacetamide, a dehydration process is performed using 100% acetonitrile solution. did. Peptides were prepared using a LysS/trypsin mixed protease dissolved in 50 mM ammonium bicarbonate.
  • the extracted peptide was dissolved in 0.1% formic acid and mass spectrometry combined with liquid chromatography (LC) was performed.
  • LC liquid chromatography
  • Q-Exactive Plus (Thermo, USA) was used, and for liquid chromatography, UltiMateTM 3000 RSLCnano System (Thermo, USA) was used.
  • 5 ⁇ l of peptide sample was injected and linked with NanoLC at a flow rate of 250 ⁇ l/min. Analysis was performed with an ion trap mass spectrometer.
  • LC is separated for a total of 200 minutes, including 150 minutes gradient of solution A (5% dimethyl sulfoxide, 0.1% formic acid) and solution B (95% acetonitrile, 0.1% formic acid, 5% dimethylsulfoxide).
  • the analytical column used was a fused silica capillary column with an inner diameter of 75 ⁇ m, an outer diameter of 360 ⁇ m, and a length of 50 cm filled with C18 (2 ⁇ m, 100 ⁇ ) to separate the peptide mixture.
  • the isolated peptide was injected with a mass spectrometer to obtain spectral data.
  • Orbitrap MS analysis was performed using the Higher energy collision dissociation (HCD) method, 27% energy level (HCD), after one survey scan (resolution 70,000) with ion trap MS for the range of 350 to 1800 m/z. Twenty MS/MS (resolution 17,500) analyzes were performed using trap MS. The detection of overlapping peptide ions was minimized through the dynamic exclusion option of 20 seconds. The auto gain control target setting of the ion trap was 3E06 for Full MS and 1E5 for FT MS/MS. Qualitative analysis and label-free quantitative analysis were performed on the obtained RAW file using MaxQuant (version 1.6.10.43, https://www.maxquant.org/), a database analysis software based on Andromeda algorithm.
  • Cysteine carbamidomethylation was treated as a fixed modification to cysteine, and oxidation to methionine was performed as a variable modification.
  • the protein sequence database uses the human SwissProt database published in October 2019, and the MaxLFQ algorithm was used for label-free quantification to derive protein quantification values.
  • a heat map, clustering analysis, and principal component analysis were performed on the identified proteome using Perseus (http://www.perseus-framework.org). ClueGO, ShinyGO v0.60, and GSEA programs were used to confirm the characteristics of each cluster protein.
  • the protein body was quantified through the label-free quantification method for the change in the protein expression pattern according to each sample, and groups of proteins were classified into four clusters according to the pattern change between the samples. Among the four clusters, proteins that change specifically in the T-3D-EV sample, which are exosomes obtained by the method of the present invention, were selected and shown in FIG. 7 .
  • T-3D-EV proteins in the group (3D-EV) and 2D culture group (2D-EV) in which only 3D shaking culture was applied without TGF- ⁇ 3 treatment
  • Expression patterns were comparatively analyzed.
  • the protein group that specifically changes in T-3D-EV has features such as glycolytic process, wound healing inflammatory response-related connective tissue replacement, platelet formation, pentose phosphate pathway, and oxidation point. and a clear difference was observed from other comparison groups.
  • FIG. 9 another comparative analysis of biological characteristics also observed immune-related characteristics in T-3D.
  • Gene set enrichment analysis was performed using the GSEA module.
  • An enrichment score assigns a prespecified class of genes when the genes included in that set are significantly differentially expressed in a phenotype-consistent manner.
  • Normalized enrichment scores were calculated by adjusting enrichment scores for the number of genes in the gene set. Nominal p-values are determined by substituting the sensitivity and resistance markers and recalculating the normalized enrichment score to produce a null distribution.
  • 11 shows the results of gene set enrichment analysis in this analysis, in which the enriched gene set, normalized enrichment score (NES) and p-value are presented, the higher the NES and the lower the p-value, the more likely the finding is significant. Big.
  • the gene groups enriched in this analysis are shown in FIG. 12 .
  • Pairwise comparison between samples was performed to find a protein group that was significantly changed in the group to which TGFb was added.
  • the observed proteins increased or decreased more than 2 times in T-3D-EV compared to 3D-EV, and Benjamini-rochberg FDR was selected under two criteria of 0.05 or less.
  • ROS as a free radical, induces changes in structure and activity by attacking proteins and DNA, which are macromolecular substances in cells, and thereby is involved in DNA repair, cell cycle regulation, and cell growth/death.
  • the thioredoxin system is a representative intracellular defense system that operates to relieve stress induced by ROS, etc., and functions as a ROS scavenger to restore proteins oxidized by free radicals to a reversible oxidation-reduction reaction. It is widely involved in the defense system, acting not only as a cell survival inducer, but also as an anti-apoptotic, anti-inflammatory, and immuno-regulatory factor to control the cell's defense system.
  • the expression of COX-2 in T-3D-EV was also high (FIG. 15).
  • the inflammatory response is one of the defense responses of biological tissues against external physical and chemical stimuli or bacterial infection, and is a mechanism to repair or regenerate damaged tissues.
  • inflammatory cells such as macrophages become inflammatory cells such as nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2), tumor necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ ), and interleukin-1 ⁇ (IL-1 ⁇ ).
  • NO nitric oxide
  • PGE2 prostaglandin E2
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • IL-1 ⁇ interleukin-1 ⁇
  • COX cyclooxygenase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)

Abstract

본 발명은 3차원 배양된 줄기세포로부터 세포외 소포체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법은 TGF-β 존재 하에서 줄기세포 응집체를 회전 진탕 배양(orbital shaking culture)함으로써 줄기세포 유래 세포외 소포체를 높은 수율로 수득할 수 있어, 세포 치료제를 대체하는 약리성분으로 활용될 수 있는 엑소좀을 산업적 규모로 대량 생산하는 공정에 유용하게 이용될 수 있다. 아울러, 본 발명의 방법으로 수득된 엑소좀은 종래 방법으로 생산된 엑소좀에 비하여 면역조절 기능 또한 현저히 개선되어, 다양한 염증 또는 자가면역질환에 대한 우수한 치료 조성물로도 적용될 수 있다.

Description

3차원 배양된 줄기세포로부터 세포외 소포체를 제조하는 방법
본 발명은 줄기세포의 3차원 배양을 통해 줄기세포 유래 세포외 소포체를 고수율로 수득하는 방법에 관한 것이다.
세포외 소포체는 인간과 동물은 물론, 곤충, 식물, 미생물 등 다양한 진핵 세포에서 분비되는 다양한 크기의 지질 이중막 구조의 소포체로서, 이 중 나노수준의 입경을 가지는 미세 소포체를 엑소좀(exosome)이라 한다. 엑소좀은 세포가 함유하는 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물 등 특정 분자들을 포함하면서, 지질 이중층으로 이들 분자들을 안정적으로 보호하고 분비 후 다른 세포로 이들을 전달하는 정보 전달 역할을 한다.
한편 줄기세포를 이용한 재생의학 또는 면역질환 치료에 있어서, 살아있는 줄기세포를 병변부에 직접 이식하는 세포 치료법을 대체하는, 줄기세포로부터 유래된 세포외 소포체를 이용한 치료법이 전임상 시험에서 효능을 보이고 있으며, 몇몇 질병치료에 있어 임상 단계에 진입한 사례도 보고되고 있다. 줄기세포에서 분비되는 엑소좀은 줄기세포가 가지고 있는 항염증 활성 및 재생(self-renewal) 활성과 관련된 핵심 인자를 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 세포를 이용하지 않아 치료적 유효량의 세포 확보 및 유지 등의 문제가 있는 기존 세포 치료제의 단점을 극복할 수 있는 새로운 접근으로서 각광받고 있다. 그러나, 일반적으로 유핵세포가 분비하는 엑소좀 개수는 세포 당 1000개 정도에 불과하다. 따라서 엑소좀을 이용한 치료제 기술에서 세포로부터 분리된 엑소좀의 수율을 향상시키는 것은 매우 중요한 문제이다.
일반적으로 엑소좀은 세포 배양액으로부터 분리되는 방식으로 수득한다. 일반적인 줄기세포 배양 시 2차원 배양을 하는데, 이 경우 다량의 엑소좀을 얻기 위해서는 많은 양의 세포를 배양해야 하기 때문에 결과적으로 비용의 증가를 가져온다. 또한 다수의 세포를 배양한 대량의 세포배양액에서 엑소좀을 분리하는 것은 상당한 노동을 필요로 한다. 엑소좀의 분리 및 정제에는 원심분리 및 TFF(tangential flow filtration)를 주로 사용하는데, 원심분리의 경우 적용할 수 있는 용량이 한정되어 있어 대량의 세포 배양액에서 엑소좀을 분리하는 데에 적합하지 않으며, TFF는 원심분리에 비하여 대량 공정에 적합하다는 장점이 있지만, T여과 공정 도중 발생하는 전단 스트레스(shear stress) 및 엑소좀의 손실 등 해결해야 할 문제점들이 많다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 적은 수의 세포 및 소량의 배양액으로 다량의 엑소좀을 수득할 수 있는 효율적인 추출 방법의 개발이 요구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 다양한 유익 성분을 함유하면서도 지질 이중막으로 구성되어 그 자체로 안정적인 약물 전달 시스템으로도 기능하는 줄기세포 유래 세포외 소포체, 구체적으로는 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀의 효율적인 수득 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 줄기세포 응집체를 3차원 배양함으로써 인 비보 조건과 유사한 물리적, 생물학적, 공간적 환경을 제공하면서 동시에 TGF-β(Transforming growth factor beta) 초가계(superfamily) 사이토카인을 첨가할 경우, 엑소좀의 수율 뿐 아니라 염증성 질환 등에 대한 치료 효과와 같은 줄기세포고유의 면역조절 효과 또한 현저하게 향상됨을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 줄기세포 유래 세포외 소포체(extracellular vesicle)의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 줄기세포 유래 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체(extracellular vesicle)의 제조 방법을 제공한다:
(a) 대상체로부터 분리된 줄기세포를 배양하여 세포 응집체(cell aggregate)를 형성하는 단계; 및
(b) 상기 세포 응집체를 TGF-β(Transforming growth factor beta)를 포함하는 배양액에서 3차원 배양하는 단계.
본 발명자들은 다양한 유익 성분을 함유하면서도 지질 이중막으로 구성되어 그 자체로 안정적인 약물 전달 시스템으로도 기능하는 줄기세포 유래 세포외 소포체, 구체적으로는 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀의 효율적인 수득 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 줄기세포 응집체를 3차원 배양함으로써 인 비보 조건과 유사한 물리적, 생물학적, 공간적 환경을 제공하면서 동시에 TGF-β(Transforming growth factor beta) 초가계(superfamily) 사이토카인을 첨가할 경우, 엑소좀의 수율 뿐 아니라 염증성 질환 등에 대한 치료 효과와 같은 줄기세포고유의 면역조절 효과 또한 현저하게 향상됨을 발견하였다.
본 명세서에서 용어 "세포밖 소포체(extracellular vesicle)"는 다양한 세포에서 다낭체와 원형질막의 융합을 통해 세포 밖 환경으로 분비되는 30-1,000 nm 범위 직경의 지질 이중막 구조의 소낭을 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법으로 제조되는 세포외 소포체는 30 - 150 nm의 평균 직경을 가지며, 보다 구체적으로는 50 - 120 nm의 평균 직경을 가진다. 이러한 범위의 미세 직경을 가지는 세포외 소포체를 엑소좀(exosome)이라 한다.
본 명세서에서, 용어“줄기세포(stem cell)”는 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포로서, 특정 분화 자극(환경) 하에서 특정 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지는 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있고, 분화 자극이 가해지면 자극의 성격에 따라 다양한 세포로 분화될 수 있는, 분화의 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
본 발명에서 이용되는 줄기세포는 줄기세포의 특성, 즉 미분화, 무한정 증식 및 특정세포로의 분화능을 가져 재생하고자 하는 조직으로 분화 유도가 가능한 세포라면 제한 없이 이용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 줄기세포는 중간엽 줄기세포이다.
본 명세서에서 용어“중간엽 줄기세포”는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포로의 분화가 가능한 다분화능(multipotency)을 가진 줄기세포를 의미한다. 중간엽 줄기세포는 소용돌이 모양의 형태와 기본적인 세포표면 표식자 CD73(+), CD105(+), CD34(-), CD45(-)의 발현 정도를 통하여 식별될 수 있으며, 다분화능과 함께 면역 반응을 조절하는 기능도 가진다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 다중 웰(multi-well) 배양 용기에서 줄기세포를 부유 배양(suspension culture)함으로써 수행된다.
본 명세서에서 용어“부유배양(suspension culture)”은 배양대상 세포를 기질(substrate) 등에 고정시키지 않은 채로 배양액 내에서 부유(floating)하는 상태로 배양하는 것을 말한다. 이에, 용어“부유배양”은“3차원 배양(3-dimensional culture)”과 동일한 의미로 사용된다. 부착(adhesion) 의존성인 줄기세포는 부유배양 시에 세포 응집을 일으키며, 이러한 응집에 포함되지 못하고 홀로 부유하는 세포는 세포사(apoptosis)를 유발하여 사멸하게 되므로 세포는 그 부착 특성에 맞는 환경이 조성되어야 한다. 본 발명에 따르면, 복수의 웰을 가지는 다중 웰에서 줄기세포를 부유배양 함으로써 웰 크기에 따른 크기의 세포 응집체가 형성된다. 이에, 본 발명은 동일한 크기와 모양을 가지는 규격화된 줄기세포 응집체를 대량으로 수득할 수 있다.
본 명세서에서 용어“세포 응집체(aggregate)”는 단일층(monolayer)이 아닌 3차원적인 성장이 허용된 부유 배양 등의 환경에서 배양된 세포가 자가 조립(self aggregation)을 하면서 형성된 3차원 구조의 세포 응집 덩어리를 의미한다. 3차원 배양의 결과로 만들어진 세포 응집체는 줄기세포가 유래한 생체 내 조직과 유사한 환경을 제공하며, 크기 및 자가 조립된 세포의 수에 따라 구형(sphere)일 수도 있고 구형 이외의 형태일 수도 있다. 구형의 세포 응집체는 스페로이드(spheroid)라고 불리우나, 스페로이드는 기하학적으로 완전한 구형일 필요는 없다.
본 명세서에서 용어“세포 배양액”는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 무기질 등과 같이 세포의 성장 및 증식에 필수적인 요소를 포함하는, 인 비트로에서 세포 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다.
세포 배양용 배지에 추가적으로 포함될 수 있는 성분은 예를 들어 글리세린, L-알라닌, L-아르기닌 하이드로클로라이드, L-시스테인 하이드로클로라이드-모노하이드레이트, L-글루타민, L-히스티딘 하이드로클로라이드-모노하이드레이트, L-리신 하이드로클로라이드, L-메티오닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-발린, L-아스파라긴-모노하이드레이트, L-아스파르트산, L-시스틴 2HCl, L-글루탐산, L-이소류신, L-류신, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-티로신 디소듐염 디하이드레이트, i-이노시톨, 티아민 하이드로클로라이드, 나이아신아미드, 피리독신 하이드로클로라이드, 바이오틴, D-판토텐산칼슘, 엽산, 리보플라빈, 비타민 B12, 염화나트륨(NaCl), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 염화칼륨(KCl), 염화칼슘(CaCl2), 인산수소나트륨 모노하이드레이트(NaH2PO4-H2O), 황산동 펜타하이드레이트(CuSO4-5H2O), 황산제이철 헵타하이드레이트(FeSO4-7H2O), 염화마그네슘(무수), 황산마그네슘(MgSO4), 인산수소이나트륨(Na2HPO4), 황산아연 헵타하이드레이트(ZnSO4-7H2O), D-글루코즈(덱스트로즈), 소듐 피루베이트, 히포크산틴 Na, 리놀렌산, 리포산, 푸트레신 2HCl 및 티미딘을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 세포 배양용 배지는 인위적으로 제조하여 사용하거나, 혹은 상업적으로 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있다. 상업적으로 시판되고 있는 배양용 배지의 예는 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), α-MEM(Alpha Modification of Eagle's Medium), F12(Nutrient Mixture F-12) 및 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 다중 웰(multi-well) 배양 용기는 웰 당 300 - 500μm의 크기를 가진다. 보다 구체적으로는 350-450의 크기를 가지며, 가장 구체적으로는 약 400μm의 크기를 가진다
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 부유배양은 상기 다중 웰(multi-well) 배양 용기 내 웰 당 300 - 500개의 세포를 분주함으로써 이루어진다. 보다 구체적으로는 350 - 450개, 가장 구체적으로는 약 400개의 세포를 분주한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 TGF-β는 TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3이며, 보다 구체적으로는 TGF-β3이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)는 상기 세포 응집체를 부유 상태에서 회전 진탕 배양(orbital shaking culture) 함으로써 수행된다.
보다 구체적으로는, 상기 회전 진탕 배양은 50 - 70 rpm의 회전속도로 수행된다. 보다 구체적으로는 53 - 67 rpm, 보다 구체적으로는 55 - 65 rpm, 가장 구체적으로는 57 - 63 rpm의 회전속도로 수행된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 단계 (b)에서 수득한 배양액으로부터 복수 회의 원심분리를 통해 세포외 소포체를 분리하는 단계를 추가적으로 포함한다.
종래 방법으로 배양된 줄기세포로부터 원심분리를 통해 세포외 소포체를 수득할 경우 원심분리의 용량 한계로 인해 충분한 양의 세포외 소포체를 확보하기 어려웠으나, 본 발명의 방법으로 배양된 줄기세포는 세포 당 세포외 소포체의 분비량이 현저하게 증가됨으로써 원심분리 만으로도 치료적 유효량의 세포외 소포체를 용이하게 수득할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 방법으로 제조된 줄기세포 유래 세포외 소포체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 방법으로 제조된 줄기세포 유래 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 이용되는 줄기세포 유래 세포외 소포체에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 T 세포 매개 면역활성을 효율적으로 억제함으로써 과도하거나 원치 않는 면역반응을 원인으로 하는 다양한 염증 또는 자가면역 질환의 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 염증 또는 자가면역 질환에 대한 치료효과를 가지는 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 용어“투여”본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말하며, “이식”또는“주입”과 동일한 의미를 가진다.
본 발명에서 용어“치료적 유효량”은 본 발명의 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 용어“대상체”는 제한 없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 자가면역질환 또는 염증성 질환은 예를 들어 류마티스 관절염, 반응성 관절염, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창, 다발성경화증, 특발성섬유성폐포염, 다발성근염, 피부근염, 국한피부경화증, 전신피부경화증, 대장염, 염증성 장질환, 조르젠신드롬(Sjorgen's syndrome), 레이노현상(Raynaud's phenomenon), 베쳇병(Bechet's disease), 가와사키병(Kawasaki's disease), 원발성담즙성경화증(primary biliary sclerosis), 원발성경화성담관염(primary sclerosing cholangitis), 궤양성대장염(ulcerative olitis), 이식편대숙주병(Graft-versus-host disease, GVHD) 및 크론병(Crohn's disease)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 구체적으로는 경구, 정맥, 피하 또는 복강 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 줄기세포 유래 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 염증 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 퍼옥시레독신-4 (Peroxiredoxin-4), 티오레독신 환원효소 1(Thioredoxin reductase 1) 및 프로스타글란딘 G/H 신타아제 2(prostaglandin G/H synthase 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 고발현하는 줄기세포 유래 세포외 소포체(extracellular vesicle)를 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 방법으로 배양된 중간엽 줄기세포에서 분리한 세포외 소포체, 예를 들어 엑소좀은 종래의 방법으로 수득한 엑소좀과 비교하여 단백질 발현 프로파일에 있어서도 명확한 차이를 보인다. 하기 실시예에서 보는 바와 같이, 상기 3가지 단백질은 2차원 배양 또는 TGF-β3 처리 없이 3차원 배양만 적용한 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀에 비해 유의하게 고발현되는 단백질로서, 본 발명의 방법에 의해 수득된 엑소좀의 조성 자체도 종래에 존재하지 않던 신규한 조성을 가짐을 알 수 있다.
본 명세서에서 용어“고발현”은 본 발명의 방법에 의하지 않고 종래 방법에 의해 수득한 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀과 비교하여 특정 단백질 등의 엑소좀 내 함량, 분비량 또는 발현량이 측정 가능할 정도로 유의하게 증가한 것을 의미하며, 구체적으로는 함량, 분비량 또는 발현량이 40% 이상 증가한 것을 의미하고, 보다 구체적으로는 60% 이상 증가한 것을 의미하며, 보다 더 구체적으로는 80% 이상 증가한 것을 의미하고, 가장 구체적으로는 100% 이상 증가한 것을 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포외 소포체는 HSP90-β(heat shock protein 90-β), 네프릴리신(Neprilysin), T-복합체 단백질 1(TCP1) 서브유닛-α, 필라민-A(Filamin-A), 40S 리보좀 단백질 S3, 미오신-9, 트랜스알돌라제, 패신(Fascin), 티오레독신 환원효소 1, RUVBL 2(RuvB-like 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 추가적으로 고발현한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포외 소포체는 코로닌-1A(Coronin-1A), 프롤일 4-하이드록실레이즈 서브유닛 α-2(Prolyl 4-hydroxylase subunit α-2) 및 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라아제(purine nucleoside phosphorylase)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질에 대해 양성이다. 본 발명에 따르면, 상기 3가지 단백질은 2차원 배양 또는 TGF-β3 처리 없이 3차원 배양만 적용한 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀에서는 검출되지 않는 단백질로서, 본 발명의 방법에 의해 수득된 엑소좀은 전혀 새로운 단백질 발현 프로파일을 가짐을 알 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 3차원 배양된 줄기세포로부터 세포외 소포체를 제조하는 방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 방법은 TGF-β 존재 하에서 줄기세포 응집체를 회전 진탕 배양(orbital shaking culture)함으로써 줄기세포 유래 세포외 소포체를 높은 수율로 수득할 수 있어, 세포 치료제를 대체하는 약리성분으로 활용될 수 있는 엑소좀을 산업적 규모로 대량 생산하는 공정에 유용하게 이용될 수 있다.
(c) 아울러, 본 발명의 방법으로 수득된 엑소좀은 종래 방법으로 생산된 엑소좀에 비하여 면역조절 기능 또한 현저히 개선되어, 다양한 염증 또는 자가면역질환에 대한 우수한 치료 조성물로도 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 방법에 따른 중간엽 줄기세포 3차원 배양과정을 나타낸 그림으로, 배아체 형성(도 1a) 및 회전 교반기를 이용한 3D 배양(도 1b) 과정을 각각 보여준다.
도 2는 각 배양조건에 따른 엑소좀 수율을 나타낸 그림이다.
도 3은 TGF-β 처리에 의한 PDI 값의 변화를 나타내는 그림으로, TGF-β를 처리한 3D 진탕 배양 조건에서는 단일 피크(one peak)가 나타남을 보여준다.
도 4는 TGF-β가 T 세포 증식에 미치는 영향을 보여주는 그림이다. 각각PHA를 이용하여 PBMC의 증식을 유발한 뒤 음성 대조군(무처리군), 양성 대조군(MSC 처리군), 3D 진탕 배양 조건 만을 적용한 엑소좀(3D-EV), 3D 진탕 배양 조건 하에서 TGF-β3를 배양액에 첨가하여 얻어진 엑소좀(T-3D-EV)의 T 세포 억제효과를 확인하였다(도 4a). 그 결과, TGF-β를 처리한 3D 진탕 배양 조건을 통해 수득한 엑소좀(T-3D-EV)이 가장 현저한 T 세포 억제효과를 가지는 것으로 확인되어(도 4b 및 4c), 본 발명의 방법으로 인해 수득된 엑소좀은 수율 뿐 아니라 기능도 강화되었음을 보여준다.
도 5a는 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS) 분석을 통해 엑소좀의 크기를 조사한 결과를 보여주는 그림이다. 도 5b는 엑소좀의 형태 및 구조를 투과전자현미경(TEM)으로 관찰한 결과이다. 도 5c는 CD9, CD63, Flotillin-1 및 Alix의 발현을 확인하기 위한 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 나타낸다. 도 5d는 유세포 분석을 통해 엑소좀 표면의 면역 표현형 분석을 수행한 결과를 보여준다.
도 6은 본 발명의 엑소좀에 의한 피부상피세포(Keratinocyte, HaCaT)에서의 상처 치유 능력을 조사한 결과를 나타낸다.
도 7은 클러스터링 분석을 통해 도출된 4개의 클러스터 중 본 발명의 방법으로 수득한 엑소좀인 T-3D-EV 시료에서 특이적으로 변화하는 단백질을 보여주는 그림이다.
도 8은 본 발명의 엑소좀에서 특징적인 발현 양상을 보이는 단백질들의 생물학적 특징을 비교 분석한 결과를 보여준다.
도 9는 도출된 세 개 클러스터의 단백질들의 생물학적 기능 및 이의 면역관련 특징을 보여주는 그림이다.
도 10은 주성분 분석(Principal component analysis)을 통해 각 그룹 간의 분리 정도를 Discrimination index를 사용하여 나타낸 결과를 보여준다.
도 11은 유전자 세트 농축 분석 결과로, 농축된 유전자 세트, 표준화된 농축 점수(NES) 및 p-값을 각각 보여준다.
도 12는 본 발명에서 농축된 유전자 그룹을 도시한 그림이다.
도 13 및 14는 본 발명의 방법으로 수득한 엑소좀에서 3D 배양군에 비해 2배 이상 증가 또는 감소한 단백질(도 13) 및 본 발명의 방법으로 수득한 엑소좀에서만 발현된 단백질(도 14)를 각각 나열한 그림이다.
도 15는 본 발명의 방법으로 수득한 엑소좀에서 염증 관련 단백질의 발현 양상을 보여주는 그림이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 중간엽 줄기세포의 3차원 세포 배양
줄기세포의 3차원 세포배양을 위해 웰당 400μm 크기의 마이크로웰 약 7000개를 포함하는 AggreWellTM400(STEMCELL Technologies; #34425)에 F127 용액을 처리하고 웰당 약 400개의 탯줄유래 중간엽 줄기세포(서울대병원, 건국대학교 생명윤리위원회 승인번호:001355-201705-BR-181)를 씨딩하여 120~200μm 직경 범위의 균일한 스페로이드(spheroid)를 생산하였다. 비-흡착 배양 접시에 TGF-β3가 포함된 배양액에 스페로이드를 씨딩한 후 3일간 회전 진탕기(orbital shaker, INFORS HT Celtron; #69455)로 60 rpm, 37℃로 진탕 배양(shaking culture)하였다. 3일 후 얻어진 배양액에서 엑소좀을 분리하였다.
실시예 2: 엑소좀 분리 및 정량
배양액을 300g로 10분간 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하고, 2000g로 10분간 원심분리 후 상등액을 새로운 튜브로 옮긴 다음 다시 10,000g로 30분간 원심분리하여 다시 상등액을 187,000g로 2시간 동안 원십분리하여 펠렛에서 엑소좀을 수득하였다. 배양액에서 엑소좀을 분리한 후 NTA 장비(NS300, NANOSIGHT System)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 NTA(nanoparticle tracking analysis)를 수행함으로써 엑소좀의 수 및 피크(peak)를 확인하였다. 그 결과, 진탕(shaking, 60 rpm) 없이 3D 배양만 적용한 경우 일반적인 2D 배양 환경과 수율에 큰 차이가 없어, 3차원 배양 자체에 의한 효과는 유의하지 않은 것으로 나타났다. 아울러, 진탕(60 rpm) 없이 3D 배양에서 TGF-β3만 첨가하거나, TGF-β3 없이 3D 진탕 배양 조건만을 적용한 경우에 비하여, 3D, 진탕(60 rpm) 및 TGF-β3를 모두 적용한 군에서 현저한 수율 증가를 확인할 수 있었다(도 2). 아울러, TGF-β를 처리한 3D 진탕 배양 조건에서는 단일 피크(one peak)가 나타남으로써 균질의 엑소좀이 생산되는 것으로 확인되었다(도 3).
실시예 3: PBMC 증식 어세이
실시예 2의 방법으로 수득한 엑소좀에 대해 종래에 보고된 방법에 따라(Hsu, P.J., et al. J. Vis. Exp. (106), e53265, doi:10.3791/53265(2015)) PBMC 증식 어세이를 수행함으로써 TGF-β를 처리한 배양액에서 얻어진 엑소좀이 대조군(일반 세포배양액)에 비해 T 세포 억제 효과가 있는지를 확인하였다. 혈액(건국대학교병원, 건국대학교 생명윤리위원회 승인번호:7001355-201705-BR-181)에서 피콜(ficoll)을 이용하여 PBMC를 분리한 다음 배양 5일 뒤 CFSE(Carboxyfluorescein succinimidyl ester, Invitrogen; #C34554)로 PBMC를 염색하고 유세포 분석을 통해 PBMC의 증식을 확인하였다. PHA(Phytohaemaglutinin, Sigma; #L1668)를 처리하여 T 세포의 증식이 수반되는 염증환경을 유도한 뒤 중간엽 줄기세포 자체의 PBMC 억제 효과를 양성 대조군으로 설정한 후 일반 세포배양액에서 얻어진 엑소좀(EV); 3D 진탕 배양 조건 만을 적용한 엑소좀(3D-EV)와, 3D 진탕 배양 조건 하에서 TGF-β3를 배양액에 첨가하여 얻어진 엑소좀(T-3D-EV)의 PBMC 억제 효과를 확인하였다(도 4a). 그 결과, TGF-β를 처리한 3D 진탕 배양 조건을 통해 수득한 본 발명의 엑소좀이 43.1%에 달하던 MSC 처리군의 증식성 T 세포를 9.6%까지 감소시켜 양성 대조군에 비해서도 80%에 가까운 현저한 감소율을 보이면서 가장 우수한 T 세포 억제효과를 나타냈다(도 4b 및 4c). 이에, 본 발명의 방법을 통해 수득된 엑소좀은 수율 뿐 아니라 기능도 크게 강화되었음을 알 수 있었다.　
실시예 4: 각 엑소좀의 특성 분석
엑소좀의 크기는 Nano Zetasizer(Malvern Instruments, Malvern, UK)를 이용한 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS) 분석을 통해 조사하였으며, EV의 수는 나노입자 추적 분석기 NS300(Nanosight, Amesbery, UK)을 이용하여 측정하였다. 엑소좀의 형태 및 구조는 80kV에서 투과전자현미경(TEM, JEM-1010, Nippon Denshi, Tokyo, Japan)을 이용하여 분석하였으며, 관찰 결과 엑소좀의 형태는 컵 또는 구형이었다(도 5b).
Grid(Formvar/Carbon 300 Mesh, Copper_FCF300-CU 50/pk) 위에 엑소좀을 부착하고, 1% 포스포텅스텐산 수화물(sigma, P4006)를 이용하여 음성염색을 실시하였다. 엑소좀-관련 양성 마커를 확인하기 위해, 면역블롯팅으로 CD9(ab263023, abcam), CD63(ab134045, abcam), Flotillin-1(#18634, CST), Alix(#2171, CST) 단백질의 발현을 조사하였다. 웨스턴 블롯팅 결과 엑소좀의 양성 마커는 발현이 되었고, 엑소좀 음성 마커인 GM130(#12480, CST) 단백질 발현은 관찰되지 않았다.
유세포 분석을 통해 엑소좀 표면의 면역 표현형 분석을 수행하였다. 먼저, 엑소좀의 크기는 유세포분석기를 이용하여 분석할 수 없는 크기이기 때문에 엑소좀의 양성마커인 CD9 항체가 결합되어 있는 2.7um Dynabead(10620D, invitrogen, Exosome-Human CD9 Flow Detection Reagent (from cell culture))를 엑소좀에 붙여 크기를 키워준 후 CD9-BV421(BD Bioscience, 743047), CD63-PE(BD Bioscience, 556020), CD81-APC(macs miltenyi biotec, M130-119-787) 항체로 표지하였다. 후에 유세포 분석기(Beckman Coulter, CytoFlex Flow Cytometry Analyzer)를 이용하여 표지된 항체에서 생성되는 형광강도를 측정하였다. 그 결과, 엑소좀에서 CD9, CD63, CD81의 형광 발현량이 96% 이상 발현되는 것을 확인하였다. 분리된 엑소좀이 엑소좀 양성마커가 96~98% 발현되는 것으로 미루어보아 균질한 엑소좀이 분리되었음을 확인할 수 있다.
실시예 5: 각 엑소좀의 상처 치유능 분석(Wound healing Assay)
엑소좀의 피부상피세포(Keratinocyte, HaCaT)에서의 치유 능력을 평가하기 위해, HaCaT 세포를 배양접시에 접종하고 90%까지 키운 후 1000㎕ 팁 끝을 이용하여 길게 상처를 냈다. 이후 엑소좀(1E+10 particles/ml)이 포함된 세포 배양배지(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-high glucose, D6429, sigma)로 교체 후, 일정한 시간마다 상처부위를 촬영하여 상처가 치유되는 능력을 분석하였다.
그 결과, 엑소좀을 처리한 군에서 모두 음성대조군보다 빠르게 상처부위가 닫히는 것을 확인하였으며, 3D 진탕 배양만 적용한 군(3D-EV) 보다 TGF-β3 및 3D 진탕 배양을 모두 적용한 군(T-3D-EV)에서 더욱 빠르게 상처부위가 닫히는 것을 확인하였다(도 6).
실시예 6: 엑소좀 발현 단백질의 분석
단백질 추출 및 정량 분석
각 겔에서 염색된 단백질들은 in-gel digestion 방법을 통해 펩타이드를 제조하고 추출하였다. 상세하게는, 단백질의 탈염색을 위해 50 mM 이탄산암모늄와 50% 아세토나이트릴이 구성된 용액과 100% 아세토나이트릴 용액을 이용하여 수행한 후, 50 mM의 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 이용하여 37℃에서 이황화 결합(disulfide bond)을 환원시키고, 55 mM의 요오드아세트아미드 (iodoacetamide)를 이용하여 빛 차단 조건에서 알킬화 반응을 수행한 후, 100% 아세토나이트릴 용액을 이용하여 탈수화 과정을 수행하였다. 50 mM 이탄산암모늄에 녹여져 있는 LysS/트립신 혼합 프로테아제를 사용하여 펩타이드를 제조하였다. 추출된 펩타이드는 0.1% 포름산으로 녹여 액체크로마토그래피(Liquid chromatography, LC)와 결합된 질량분석을 수행하였다. 질량분석 장비는 장비는 Q-Exactive Plus (Thermo, USA)을, 액체크로마토그래피는 UltiMate™ 3000 RSLCnano System (Thermo, USA)를 사용하였으며 펩타이드 시료는 5μl씩 주입하여 250μl/min의 유속으로 NanoLC와 연동된 이온 트랩 질량 분석기(Ion trap mass spectrometer)로 분석을 수행하였다. LC는 용액 A(5% 디메틸설폭시화물, 0.1% 포름산)와 용액 B(95% 아세토니트릴, 0.1% 포름산, 5% 디메틸설폭시화물)의 농도 구배 150분을 포함하여 총 200분 동안 분리하며 사용하는 분석 컬럼은 C18(2μm, 100 Å)을 충진한 내직경 75μm, 외직경 360μm, 길이 50cm의 융합 실리카 모세관 컬럼을 사용하여 펩타이드 혼합체를 분리하였다. 분리된 펩타이드는 질량분석기로 주입하여 스펙트럼 데이터를 획득하였다. 오비트랩(Orbitrap) MS 분석은 350~1800 m/z 범위에 대해 이온 트랩 MS로 1번의 서베이 스캔(survey scan, 해상도 70,000) 후에 HCD(Higher energy collision dissociation, 27% energy level) 방식을 이용하여 오비트랩 MS를 이용, 20번의MS/MS(해상도 17,500) 분석을 수행하였다. 20초의 dynamic exclusion option을 통해 중복된 펩타이드 이온 검출을 최소화하였다. 이온 트랩의 Auto gain control target setting은 Full MS에 대해서는 3E06를, FT MS/MS에 대해서는 1E5을 사용하였다. 획득한 RAW 파일을 Andromeda 알고리즘 기반의 데이터 베이스 분석 소프트웨어인 MaxQuant (version 1.6.10.43, https://www.maxquant.org/)를 이용하여 정성 분석 및 비표지 정량 분석을 수행하였다. 시스테인(Cysteine)에는 시스테인 카바미도메틸화를 고정값(Fixed modification)으로 처리하고, 메티오닌(Methionine)에 산화를 변동값(Variable modification)으로 하여 수행하였다. 단백질 서열 데이터베이스는 2019년 10월 발표된 인간 SwissProt database를 사용하며 비표지 정량을 위해서 MaxLFQ 알고리즘을 사용하여 단백질 정량값을 도출하였다. 동정된 단백체들을 Perseus (http://www.perseus-framework.org)를 이용하여 히트 맵(heat map) 및 클러스터링 분석과 주성분 분석을 수행하였다. 각 클러스터의 단백질의 특징을 확인하기위해ClueGO, ShinyGO v0.60, GSEA 프로그램을 사용하였다.
정량분석을 수행하여 얻은 데이터에서 각 시료에 따라 단백질 발현 패턴의 변화를 비표지 정량법을 통하여 단백질체를 정량하고, 시료 간의 패턴 변화에 따라 단백질들의 군을 4개의 클러스터(cluster)로 분류하였다. 4개의 클러스터 중 본 발명의 방법으로 수득한 엑소좀인 T-3D-EV 시료에서 특이적으로 변화하는 단백질들을 선별하여 이를 도 7에 도시하였다.
단백질의 생물학적 특징 비교 분석
본 실험은 T-3D-EV에서 특이적인 특징을 가지는 단백질을 발굴하기 위해 비교군으로서 TGF-β3 처리 없이 3D 진탕 배양만 적용한 군(3D-EV) 및 2D 배양 군(2D-EV)에서의 단백질 발현 양상을 비교분석하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, T-3D-EV에서 특이적으로 변화하는 단백질 그룹은 해당(glycolytic) 과정, 상처 치유 염증 반응 관련 연결 조직 대체, 혈소판 형성, 오탄당 인산 경로, 산화 지점 등의 특징이 확인되었고, 다른 비교군과 확연한 차이가 관찰되었다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 또 다른 생물학적 특징 비교 분석 역시 T-3D에서 면역관련 특징이 관찰되었다.
주성분 분석
주성분 분석(Principal component analysis)은 각 시료 그룹 간 얼마나 명확히 분리가 되었는지를 Discrimination index를 사용하여 나타낸다. 도 10에 나타낸 데이터는 시료 처리 방법에 따라 3회 반복 질량분석한 결과로서 제1 주성분 값의 기여율은 60.2% 였고, 제2 주성분 값의 기여율은 28.9%였다. 그 결과 시료 처리 방법에 따라 관찰된 단백질들의 정성 및 정량적 특징 간에 큰 패턴의 차이를 확인하였다. 또한 3D-EV 또는 T-3D-EV 간의 패턴 거리에 비해 이들과 2D-EV 간의 거리가 더 먼 것으로 보아 2D 방법과 3D 방법 간의 차이로 단백질의 변화가 관찰되는 것으로 추측할 수 있다.
유전자 세트 농축 분석
유전자 세트 농축 분석은 GSEA 모듈을 이용하여 수행하였다. 농축 점수(Enrichment score)는 해당 세트에 포함된 유전자가 표현형에서 일치하는 방식으로 유의하게 차별적으로 발현될 때 유전자의 예비 특정화된 클래스를 부여한다. 표준화된 농축 점수는 농축 점수를 유전자 세트 내의 유전자의 수에 대해 조정함으로써 계산하였다. 명목상 p-값은 감수성 및 내성 표지를 치환하고 귀무(null) 분포를 생성하기 위해 표준화된 농축 점수를 재계산함으로써 결정된다. 도 11은 본 분석에서의 유전자 세트 농축 분석 결과로, 농축된 유전자 세트, 표준화된 농축 점수 (NES) 및 p-값이 제시되었으며, NES가 높고 p-값이 낮을수록, 발견이 유의할 가능성이 더 크다. 본 분석에서 농축된 유전자 그룹은 도 12에 도시하였다.
T-3D-EV 특이적 단백질의 동정
TGFb를 첨가한 그룹에서 유의미하게 변화되는 단백질 그룹을 찾기 위해 시료 간의 쌍 비교를 수행하였다. 관찰된 단백질들은 3D-EV 대비 T-3D-EV에서 2배 이상 증가 또는 감소하고, Benjamini-hochberg FDR이 0.05이하라는 2가지 기준 하에 선별하였다. 또한 T-3D 시료에만 발견된 단백질들도 포함하였다. 선별된 단백질은 도 13 및 도 14에 나타내었다.
EV내 존재하는 단백질 분석시 도 15에서 보는 바와 같이 항산화 단백질 및 염증관련 인자들이 발현되고 있는 것을 확인할 수 있다.
세포의 스트레스반응 중 대표적인 것이 ROS 생성 및 이로 인한 세포 산화환원 조절 네트워크 활성화이다. ROS는 자유 라디칼로서 세포 내 고분자 물질인 단백질과 DNA를 공격하여 구조 및 활성의 변화를 유도하며, 이로써 DNA 수리, 세포주기 조절 및 세포의 성장/사멸에 관여한다.
포유동물에는 6가지 유형의 퍼옥시레독신이 존재하는데, 이들은 각종 세포 및 조직에 널리 분포되어 조직에서 발생하는 H2O2를 제거하는데 주요한 항산화 단백질로 작용한다. 티오레독신 시스템은 이렇게 ROS 등에 의하여 유발된 스트레스를 해소하기 위하여 작동되는 대표적인 세포 내 방어체계로서 활성산소에 의해 산화된 단백질을 가역적 산화-환원 반응으로 복구시키는 ROS 스캐빈저로서의 기능과 함께 다양한 세포 방어 시스템에 광범위하게 관여하는데, 세포의 생존유도인자로서 뿐 아니라, 항사멸(anti-apoptotic), 항염증(anti-inflammatory) 및 면역조절(immuno-regulatory)인자로서도 작용하여 세포의 방어체계를 관장하는 핵심단백질로 알려져 있다. 이러한 항산화제 단백질인 퍼옥시레독신-4 (Peroxiredoxin-4)와 티오레독신 환원효소(Thioredoxin reductase)가 본 발명의 방법으로 수득한 엑소좀인 T-3D-EV에서 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다(도 15).
또한 T-3D-EV에서 COX-2의 발현도 높은 것으로 나타났다(도 15). 일반적으로 염증 반응은 외부로부터 물리적, 화학적 자극이나 세균 감염에 대한 생체조직의 방어 반응의 하나이며, 손상된 조직을 수복하거나 재생하려는 기전이다. 체내에서 염증 반응이 일어나면 대식세포와 같은 염증 세포들은 일산화질소(NO), 프로스타글란딘E2(PGE2), 종양괴사인자(tumor necrosis factor-α, TNF-α), 인터루킨-1β (IL-1β)등 염증매개 물질을 분비한다. PGE2의 합성은 포스포리파아제 A2에 의해 막 인지질(membrane phospholipid)로부터 아라키돈산이 만들어지는 것으로 시작된다. 아라키돈산은 효소작용에 의해 프로스타글란딘 G2가 되고 다시 불안정한 대사산물인 프로스타글란딘 H2가 되는데, 이 두 과정은 COX(cyclooxygenase)에 의해 촉진된다. COX는 두 종류 이상의 아형 효소(isoenzyme)가 존재하는데 이들 중 COX-1은 지속적으로 발현하여 혈소판 응집, 위점막 보호, 신기능 조절 등의 생리적 기능을 담당하고, COX-2는 염증 등의 자극에 의해 발현되며 COX-2에 의해 생성된프로스타글란딘이 염증반응과 세포증식에 관여한다고 알려져 있다. 따라서, COX-2가 T-3D-EV에서 높게 발현되는 것은 본 발명의 엑소좀을 면역관련 세포에 처리했을 때 염증 반응 조절에 관여하기 때문인 것으로 판단된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (16)

  1. 다음의 단계를 포함하는 줄기세포 유래 세포외 소포체(extracellular vesicle)의 제조 방법:
    (a) 대상체로부터 분리된 줄기세포를 배양하여 세포 응집체(cell aggregate)를 형성하는 단계; 및
    (b) 상기 세포 응집체를 TGF-β(Transforming growth factor beta)를 포함하는 배양액에서 3차원 배양하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 다중 웰(multi-well) 배양 용기에서 줄기세포를 부유 배양(suspension culture)함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 다중 웰(multi-well) 배양 용기는 웰 당 300 - 500μm의 크기를 가지는 마이크로웰 플레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 부유배양은 상기 다중 웰(multi-well) 배양 용기 내 웰 당 300 - 500개의 세포를 분주함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 TGF-β는 TGF-β3인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 세포 응집체를 부유 상태에서 회전 진탕 배양(orbital shaking culture) 함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 회전 진탕 배양은 50 - 70 rpm의 회전속도로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (b)에서 수득한 배양액으로부터 복수 회의 원심분리를 통해 세포외 소포체를 분리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 세포외 소포체는 30 - 150 nm의 평균 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 줄기세포 유래 세포외 소포체.
  12. 제 11 항의 줄기세포 유래 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 자가면역질환 또는 염증성 질환은 류마티스 관절염, 반응성 관절염, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창, 다발성경화증, 특발성섬유성폐포염, 다발성근염, 피부근염, 국한피부경화증, 전신피부경화증, 대장염, 염증성 장질환, 조르젠신드롬(Sjorgen's syndrome), 레이노현상(Raynaud's phenomenon), 베쳇병(Bechet's disease), 가와사키병(Kawasaki's disease), 원발성담즙성경화증(primary biliary sclerosis), 원발성경화성담관염(primary sclerosing cholangitis), 궤양성대장염(ulcerative olitis), 이식편대숙주병(Graft-versus-host disease, GVHD) 또는 크론병(Crohn's disease)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 퍼옥시레독신-4 (Peroxiredoxin-4), 티오레독신 환원효소 1(Thioredoxin reductase 1) 및 프로스타글란딘 G/H 신타아제 2(prostaglandin G/H synthase 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 고발현하는 줄기세포 유래 세포외 소포체(extracellular vesicle).
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 세포외 소포체는 HSP90-β(heat shock protein 90-β), 네프릴리신(Neprilysin), T-복합체 단백질 1(TCP1) 서브유닛-α, 필라민-A(Filamin-A), 40S 리보좀 단백질 S3, 미오신-9, 트랜스알돌라제, 패신(Fascin), 티오레독신 환원효소 1, RUVBL 2(RuvB-like 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 추가적으로 고발현하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 유래 세포외 소포체.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 세포외 소포체는 코로닌-1A(Coronin-1A), 프롤일 4-하이드록실레이즈 서브유닛 α-2(Prolyl 4-hydroxylase subunit α-2) 및 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라아제(purine nucleoside phosphorylase)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질에 대해 양성인 것을 특징으로 하는 줄기세포 유래 세포외 소포체.
PCT/KR2021/005408 2020-04-28 2021-04-28 3차원 배양된 줄기세포로부터 세포외 소포체를 제조하는 방법 Ceased WO2021221471A1 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2021264368A AU2021264368B2 (en) 2020-04-28 2021-04-28 Method for producing extracellular vesicles from three-dimensionally cultured stem cells
CN202180031909.1A CN115485366B (zh) 2020-04-28 2021-04-28 由三维培养的干细胞生产细胞外囊泡的方法
JP2022565884A JP7513305B2 (ja) 2020-04-28 2021-04-28 ３次元培養された幹細胞から細胞外小胞体を製造する方法
EP21795735.6A EP4144836A4 (en) 2020-04-28 2021-04-28 METHOD FOR PRODUCING EXTRACELLULAR VESICLES FROM THREE-DIMENSIONALLY CULTIVATED STEM CELLS
US17/997,340 US20230220348A1 (en) 2020-04-28 2021-04-28 Method for producing extracellular vesicles from three-dimensionally cultured stem cells

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2020-0051640 2020-04-28
KR1020200051640A KR102319735B1 (ko) 2020-04-28 2020-04-28 3차원 배양된 줄기세포로부터 세포외 소포체를 제조하는 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021221471A1 true WO2021221471A1 (ko) 2021-11-04

Family

ID=78373742

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/005408 Ceased WO2021221471A1 (ko) 2020-04-28 2021-04-28 3차원 배양된 줄기세포로부터 세포외 소포체를 제조하는 방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230220348A1 (ko)
EP (1) EP4144836A4 (ko)
JP (1) JP7513305B2 (ko)
KR (1) KR102319735B1 (ko)
CN (1) CN115485366B (ko)
AU (1) AU2021264368B2 (ko)
WO (1) WO2021221471A1 (ko)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114306732A (zh) * 2021-12-28 2022-04-12 孙烨 一种促软骨修复水凝胶材料及其制备方法和应用
CN115154484A (zh) * 2022-08-09 2022-10-11 中晶生物技术股份有限公司 三维培养间充质干细胞外泌体在制备皮肤损伤修复与再生的药物或制剂中的应用
WO2023224798A1 (en) * 2022-05-17 2023-11-23 Corning Incorporated Methods and systems for production of extracellular vesicles
US12213995B2 (en) 2019-07-18 2025-02-04 Direct Biologics, Llc Preparations comprising mesenchymal stem cells and cannabinoids and methods of their use
EP4512903A3 (en) * 2021-12-03 2025-07-02 China Medical University Production of exosomes and uses thereof
US12453743B2 (en) 2018-05-30 2025-10-28 Direct Biologics, Llc Mesenchymal stem cell (MSC) growth factor and extracellular vesicle preparation in frozen or powdered form and methods of use
US12502407B2 (en) 2024-04-25 2025-12-23 Direct Biologics, Llc Treatment of fistula with bone marrow mesenchymal stem cell derived extracellular vesicles
US12570980B2 (en) 2020-04-22 2026-03-10 Direct Biologics, Llc Methods and compositions for treating inflammatory conditions associated with infectious disease
US12569517B2 (en) 2019-02-07 2026-03-10 Direct Biologics, Llc Method for treating osteoarthritis with mesenchymal stem cell exosomes

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102424333B1 (ko) * 2020-12-14 2022-07-22 조선대학교산학협력단 펩타이드를 이용하는 줄기세포 유래 고순도 세포외 소포체의 대량 생산 방법
CN114672456B (zh) * 2022-03-01 2024-10-29 上海交通大学医学院附属第九人民医院 利用超声刺激提高脂肪干细胞分泌胞外囊泡效率的方法及应用
KR20230147009A (ko) * 2022-04-12 2023-10-20 (주)인엑소플랫 화학적으로 유도된 유도 만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 세포외 소포체 및 이의 용도
KR102633660B1 (ko) * 2022-05-04 2024-02-05 (주)에스엔이바이오 효능이 증진된 줄기세포 유래 세포외소포를 포함하는 상처 치료용 조성물
KR20240025133A (ko) * 2022-08-17 2024-02-27 포항공과대학교 산학협력단 줄기세포 유래 인슐린 분비 세포 응집체를 담지한 생분해성 다공성 마이크로웰을 포함하는 세포이식체 내지 이의 용도
CN116574676B (zh) * 2023-05-15 2024-03-05 南开大学 一种细胞外囊泡/工程化细胞外囊泡及其制备方法和应用
BE1032721B1 (fr) 2024-02-19 2026-02-02 Revatis S A Procédé de préparation d'une composition de vésicules extracellulaires, composition de vésicules extracellulaires et son utilisation
CN118165925B (zh) * 2024-03-12 2026-03-24 西北工业大学 一种凝集态干细胞凋亡囊泡的制备方法
CN119157909B (zh) * 2024-11-22 2025-03-04 温州医科大学附属第二医院（温州医科大学附属育英儿童医院） 人诱导多能干细胞来源的外泌体用于制备治疗川崎病的药物的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150079046A1 (en) * 2012-04-03 2015-03-19 Reneuron Limited Stem cell microparticles
KR20190080723A (ko) * 2017-12-28 2019-07-08 황인후 Emt-met 가소성이 유도된 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 방법
KR20200040818A (ko) * 2017-08-15 2020-04-20 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 정제된 중간엽 줄기 세포 엑소좀 및 그의 용도

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101706642B1 (ko) 2015-02-04 2017-02-17 주식회사 엑소스템텍 연골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 포함하는 연골세포 분화 유도 또는 연골조직 재생용 조성물
US20170121685A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-04 Tigenix S.A.U. Mesenchymal stem cell-derived exosomes and their uses
EP3922253A1 (en) * 2016-01-15 2021-12-15 Orbsen Therapeutics Limited Sdc-2 exosome compositions and methods of isolation and use
JP7588806B2 (ja) * 2017-04-20 2024-11-25 国立大学法人東北大学 振盪浮遊培養を用いた間葉系幹細胞の未分化性維持方法
WO2019175773A1 (en) * 2018-03-12 2019-09-19 Universidade Do Porto Compositions for use in the treatment of musculoskeletal conditions and methods for producing the same leveraging the synergistic activity of two different types of mesenchymal stromal/stem cells

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150079046A1 (en) * 2012-04-03 2015-03-19 Reneuron Limited Stem cell microparticles
KR20200040818A (ko) * 2017-08-15 2020-04-20 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 정제된 중간엽 줄기 세포 엑소좀 및 그의 용도
KR20190080723A (ko) * 2017-12-28 2019-07-08 황인후 Emt-met 가소성이 유도된 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 방법

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Remington's Pharmaceutical Sciences", 1995
HARTING MATTHEW T., SRIVASTAVA AMIT K., ZHAORIGETU SIQIN, BAIR HENRY, PRABHAKARA KARTHIK S., TOLEDANO FURMAN NAAMA E., VYKOUKAL JO: "Inflammation-Stimulated Mesenchymal Stromal Cell-Derived Extracellular Vesicles Attenuate Inflammation : Stimulated EVs Attenuate Inflammation", STEM CELLS, vol. 36, no. 1, 1 January 2018 (2018-01-01), pages 79 - 90, XP055862538, ISSN: 1066-5099, DOI: 10.1002/stem.2730 *
HSU, P.J. ET AL., J. VIS. EXP., no. 106, 2015, pages e53265
JOO HYEON SU, JU HUN SUH, HYEON JI LEE, EUN SONG BANG, JUNG MIN LEE: "Current Knowledge and Future Perspectives on Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes as a New Therapeutic Agent", INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES, vol. 21, no. 3, 22 January 2020 (2020-01-22), XP055862542, DOI: 10.3390/ijms21030727 *
See also references of EP4144836A4
STELLA COSENZA, MAXIME RUIZ, KARINE TOUPET, CHRISTIAN JORGENSEN, DANIèLE NOëL: "Mesenchymal stem cells derived exosomes and microparticles protect cartilage and bone from degradation in osteoarthritis", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 7, no. 1, 1 December 2017 (2017-12-01), XP055703164, DOI: 10.1038/s41598-017-15376-8 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12453743B2 (en) 2018-05-30 2025-10-28 Direct Biologics, Llc Mesenchymal stem cell (MSC) growth factor and extracellular vesicle preparation in frozen or powdered form and methods of use
US12569517B2 (en) 2019-02-07 2026-03-10 Direct Biologics, Llc Method for treating osteoarthritis with mesenchymal stem cell exosomes
US12213995B2 (en) 2019-07-18 2025-02-04 Direct Biologics, Llc Preparations comprising mesenchymal stem cells and cannabinoids and methods of their use
US12570980B2 (en) 2020-04-22 2026-03-10 Direct Biologics, Llc Methods and compositions for treating inflammatory conditions associated with infectious disease
US12590310B2 (en) 2020-04-22 2026-03-31 Direct Biologics, Llc Methods and compositions for treating inflammatory conditions associated with infectious disease
EP4512903A3 (en) * 2021-12-03 2025-07-02 China Medical University Production of exosomes and uses thereof
CN114306732A (zh) * 2021-12-28 2022-04-12 孙烨 一种促软骨修复水凝胶材料及其制备方法和应用
WO2023224798A1 (en) * 2022-05-17 2023-11-23 Corning Incorporated Methods and systems for production of extracellular vesicles
CN115154484A (zh) * 2022-08-09 2022-10-11 中晶生物技术股份有限公司 三维培养间充质干细胞外泌体在制备皮肤损伤修复与再生的药物或制剂中的应用
US12502407B2 (en) 2024-04-25 2025-12-23 Direct Biologics, Llc Treatment of fistula with bone marrow mesenchymal stem cell derived extracellular vesicles

Also Published As

Publication number Publication date
US20230220348A1 (en) 2023-07-13
EP4144836A1 (en) 2023-03-08
AU2021264368A1 (en) 2022-12-01
CN115485366A (zh) 2022-12-16
KR102319735B1 (ko) 2021-11-01
EP4144836A4 (en) 2024-03-27
JP7513305B2 (ja) 2024-07-09
CN115485366B (zh) 2026-03-13
JP2023523995A (ja) 2023-06-08
AU2021264368B2 (en) 2024-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021221471A1 (ko) 3차원 배양된 줄기세포로부터 세포외 소포체를 제조하는 방법
US12195724B2 (en) Methods of producing T cell populations enriched for stable regulatory T-cells
Hopkins et al. Hormone secretion by cells dissociated from rat anterior pituitaries
US8592209B2 (en) Methods of preparing and characterizing mesenchymal stem cell aggregates and uses thereof
Chang et al. Isolation of mesenchymal stem cells with neurogenic potential from the mesoderm of the amniotic membrane
AU764499B2 (en) Use of collagenase in the preparation of neural stem cell cultures
CA2148715A1 (en) Pluripotential quiescent stem cell population
US20210171914A1 (en) Human brown adipose derived stem cells and uses
EP1385936A4 (en) METHOD OF ISOLATING STEM CELLS BY IMMUNA-MARKING WITH THE HLA / MHC GENE PRODUCT MARKER
CN1221660C (zh) 人骨髓和脐带血间充质干细胞体外分离扩增和向神经细胞定向诱导的方法
Noble et al. Neuraminidase‐releasable surface sialic acid of cultured astroblasts exposed to ethanol
WO2020122405A1 (ko) 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
AU2023302146A1 (en) Cryopreserved intermediate and potency assay for same
KR20220068148A (ko) 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 분리된 엑소좀의 제조방법 및 이의 용도
KR20230019157A (ko) 유도 조절 t 세포, 이의 제조 방법, 및 용도
AU2024266790B2 (en) Strain of pediococcus acidilactici with function of treating ulcerative colitis and application thereof
WO2020017676A1 (ko) Fresh-트레이서 기반 분리된 세포의 유전자 프로파일의 응용
CN118406585A (zh) 一种粪便罗斯拜瑞氏菌及其应用
WO2023090928A1 (ko) 인간 타액선 상피성 줄기세포 또는 전구세포 유래 단일클론세포 분리, 유지, 증식 및 분화 방법 및 타액선 질환 치료용 세포외소포체 생산 방법
CN119432635A (zh) 菌株、培养物及其应用
KR20230073997A (ko) 인간 타액선 상피성 줄기세포 또는 전구세포 유래 단일클론세포 분리, 유지, 증식 및 분화 방법 및 타액선 질환 치료용 세포외소포체 생산 방법
EP4661885A1 (en) Potency assay and manufacturing method
CN117683708A (zh) 用于治疗免疫相关性肾病的药物
WO2025192960A1 (ko) 중간엽 줄기세포의 신속 층분리 배양 방법
FR2796280A1 (fr) Nouvelle utilisation du vasoactive intestinal peptide (vip), de ses agonistes et de ses antagonistes pour moduler le developpement/initiation d'une reponse immune specifique

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21795735

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022565884

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021264368

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20210428

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021795735

Country of ref document: EP

Effective date: 20221128