WO2021259199A1

WO2021259199A1 - 抗cd73抗体及其用途

Info

Publication number: WO2021259199A1
Application number: PCT/CN2021/101233
Authority: WO
Inventors: 荆华; 沈浩然; 唐蓉; 刘军建
Original assignee: Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
Current assignee: Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
Priority date: 2020-06-22
Filing date: 2021-06-21
Publication date: 2021-12-30
Anticipated expiration: 2022-12-22
Also published as: CN115734972A; US20230312741A1; AU2021297856A9; AU2021297856A1; EP4169948A4; EP4169948A1; JP2023532234A

Abstract

涉及特异性结合CD73的新型抗体或其抗原结合片段以及含有所述抗体或其抗原结合片段的组合物。还涉及编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述核酸或载体的宿主细胞、包含所述抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物和药物组合物。此外，还涉及这些抗体或其抗原结合片段在疾病的免疫治疗、预防和/或诊断上的应用。

Description

抗CD73抗体及其用途

技术领域

本发明总体上涉及免疫学和抗体工程领域。具体而言，本发明涉及特异性结合CD73的新型抗体或其抗原结合片段以及含有所述抗体或其抗原结合片段的组合物。此外，本发明涉及编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述核酸或载体的宿主细胞、包含所述抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物和药物组合物。此外，本发明涉及这些抗体或其抗原结合片段在疾病的免疫治疗、预防和/或诊断上的应用。

背景技术

CD73(分化簇73)，也称为胞外-5’-核苷酸酶(胞外-5’-NT)，是一种70-kDa的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白。CD73在ATP转化为腺苷的过程中起着极其重要的作用，与CD39联合能使ATP去磷酸化为腺苷，CD39主要使ATP转化为ADP和AMP，而CD73则使AMP去磷酸为腺苷。

CD73在乳腺癌，肺癌等不同肿瘤细胞中均具有高表达，并且CD73的高表达与较差的预后成正相关。在HER2/ErbB2单克隆抗体trastuzumab治疗的乳腺癌病人中，CD73的高表达与较短的无病生存期成正相关。另外，CD73在肿瘤组织中的内皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞和髓系细胞中也有表达。细胞膜表面的CD73分子可以被磷脂酶切割进入细胞间质和血液。细胞间质和血液中的CD73同样具有5’-核苷酸酶的活性。ATP及其代谢物AMP和腺苷在细胞代谢、信号传导和免疫稳态中具有重要的作用，其中腺苷具有免疫抑制活性。细胞外腺苷在癌性组织中积累并构成肿瘤免疫逃逸的重要机制。已经表明腺苷可调节许多癌症的增殖和迁移，并通过调节抗肿瘤T细胞而具有免疫抑制作用(Zhang等人，Cancer Res 2010；70：6407-11)。因此，需要有效的抗CD73分子抗体，以高效地抑制细胞表面和可溶性的CD73分子的酶活性功能，从而阻断AMP转化为腺苷，解除腺苷积累造成的T细胞增殖抑制和活性抑制，从而达到改变肿瘤微环境，激活肿瘤免疫反应，抑制肿瘤生长的目的。

现有技术中已经开发出一些抗CD73分子抗体，但同时也存在各自的缺陷，如专利US20180194858A1中公开的抗CD73分子抗体，其在高抗体浓度下出现了较差的对可溶性CD73酶活性的抑制作用(勾状效应)；专利WO2018013611A1和专利WO2016055609A1中的抗CD73分子抗体不能完全阻断CD73的酶活性。因此，仍然有必要开发出一些更优的具有不同抗体序列的抗CD73分子抗体，本发明满足了这些要求。

发明内容

本发明提供了一种新的结合CD73分子的抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，本发明的抗CD73抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含

(i)表B所列任一抗体的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)，或

(ii)相对于(i)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列，或

(iii)与表B所列任一抗体的VH序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，且包含所述序列的相应CDR的序列。

在一些实施方案中，本发明的抗CD73抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含：

(i)表B所列任一抗体的VL中所含的三个互补决定区域(CDR)；或

(ii)相对于(i)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列；或

(iii)与表B所列任一抗体的VL序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，且包含所述序列的相应CDR的序列。

在一些实施方案中，本发明的抗CD73抗体或其抗原结合片段包含重链可变区VH和/或轻链可变区VL，其中

(a)所述VH包含

(i)表B所列任一抗体的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)，或

(iii)与表B所列任一抗体的VH序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，且包含所述序列的相应CDR的序列；

(iv)表A或表D所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的组合；

和/或

(b)所述VL包含：

(i)表B所列任一抗体的VL中所含的三个互补决定区域(CDR)；或

(iii)与表B所列任一抗体的VL序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，且包含所述序列的相应CDR的序列；或

(iv)表A或表D所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的组合。

在一些实施方案中，本发明提供了结合CD73分子(优选人CD73蛋白质)的抗CD73抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区VH和/或轻链可变区VL，其中，

1)所述VH包含SEQ ID NO：55所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：91所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

2)所述VH包含SEQ ID NO：56所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：92所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

3)所述VH包含SEQ ID NO：57所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：92所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

4)所述VH包含SEQ ID NO：58所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：92所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

5)所述VH包含SEQ ID NO：59所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：93所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

6)所述VH包含SEQ ID NO：60所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：93所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

7)所述VH包含SEQ ID NO：61所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：93所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

8)所述VH包含SEQ ID NO：62所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：93所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

9)所述VH包含SEQ ID NO：63所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：93所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

10)所述VH包含SEQ ID NO：64所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：93所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

11)所述VH包含SEQ ID NO：65所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：94所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

12)所述VH包含SEQ ID NO：66所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：94所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

13)所述VH包含SEQ ID NO：67所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：94所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

14)所述VH包含SEQ ID NO：68所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：95所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

15)所述VH包含SEQ ID NO：69所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：96所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

16)所述VH包含SEQ ID NO：70所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：97所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

17)所述VH包含SEQ ID NO：71所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：97所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

18)所述VH包含SEQ ID NO：72所示的VH中所含的三个互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含SEQ ID NO：97所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些实施方案中，本发明提供了抗CD73抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区VH和/或轻链可变区VL，其中，

(i)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：1-15、132-133或136-149中任一项所示的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：16-30、134或135中任一项所示的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：31-37或150-156中任一项所示的氨基酸序列；

和/或

(ii)其中所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：38-43中任一项所示的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：44-48中任一项所示的氨基酸序列；LCDR3包含SEQ ID NO：49-54中任一项所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了抗CD73抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区VH和/或轻链可变区VL，其中

1)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：1或136所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：31或150所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

2)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：1或136所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：32或151所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

3)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：2 或137所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：32或151所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

4)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：3或138所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：32或151所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

5)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：4或139所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：33或152所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

6)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：4或139所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：33或152所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

7)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：5或139所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：33或152所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

8)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：6或140所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：33或152所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

9)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：7或141所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：33或152所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

10)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：8或142所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：33或152所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

11)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：9或143所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：34或153所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

12)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：10或144所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：34或153所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

13)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：11或145所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：35或154所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

14)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：9或143所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：36或155所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

15)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：12或146所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：36或155所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

16)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：13或147所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：37或156所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

17)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：14或148所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：37或156所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；

18)所述VH包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：15或149所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO：37或156所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述VL包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；或

(a)重链可变区VH

(i)包含与SEQ ID NO：55-72中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，且包含所述序列的相应CDR序列；或者

(ii)包含SEQ ID NO：55-72中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：55-72中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中；

和/或

(b)轻链可变区VL

(i)包含与SEQ ID NO：91-97中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，且包含所述序列的相应CDR序列；

(ii)包含SEQ ID NO：91-97中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：91-97中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。

在一些实施方案中，本发明提供了抗CD73抗体或其抗原结合片段，其包含

1)包含与SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：91所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；

2)包含与SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；

3)包含与SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；

4)包含与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；

5)包含与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；

6)包含与SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；

7)包含与SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；

8)包含与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；

9)包含与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；

10)包含与SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；

11)包含与SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：94所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；

12)包含与SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：94所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；

13)包含与SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：94所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；

14)包含与SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：95所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；

15)包含与SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：96所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；

16)包含与SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：97所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；

17)包含与SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：97所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；或

18)包含与SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含与SEQ ID NO：97所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL；

在一些实施方案中，本发明提供了结合CD73的抗体或其抗原结合片段，其包含

1)包含SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：91所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；

2)包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；

3)包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；

4)包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；

5)包含SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；

6)包含SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；

7)包含SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；

8)包含SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；

9)包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；

10)包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；

11)包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：94所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；

12)包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：94所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；

13)包含SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：94所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；

14)包含SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：95所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；

15)包含SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：96所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；

16)包含SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：97所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；

17)包含SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：97所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；或

18)包含SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列的重链可变区VH，和包含SEQ ID NO：97所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；

在一些实施方案中，本发明提供了抗CD73抗体或其抗原结合片段，其包含重链和/或轻链，其中

(a)重链

(i)包含与SEQ ID NO：106-123中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且包含所述序列相应CDR序列的氨基酸序列或由其组成；

(ii)包含SEQ ID NO：106-123中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：106-123中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在重链的CDR区中，更优选地，所述氨基酸改变不发生在重链可变区中；

和/或

(b)轻链

(i)包含与SEQ ID NO：124-130中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且包含所述序列相应CDR序列的氨基酸序列或由其组成；

(ii)包含SEQ ID NO：124-130中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：124-130中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在轻链的CDR区中，更优选地，所述氨基酸改变不发生在轻链可变区中。

1)包含与SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：124所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；

2)包含与SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：125所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；

3)包含与SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：125所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；

4)包含与SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：125所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；

5)包含与SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；

6)包含与SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；

7)包含与SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；

8)包含与SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；

9)包含与SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；

10)包含与SEQ ID NO：115所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；

11)包含与SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：127所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；

12)包含与SEQ ID NO：117所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：127所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；

13)包含与SEQ ID NO：118所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：127所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；

14)包含与SEQ ID NO：119所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：128所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；

15)包含与SEQ ID NO：120所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；

16)包含与SEQ ID NO：121所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：130所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；

17)包含与SEQ ID NO：122所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：130所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；或

18)包含与SEQ ID NO：123所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO：130所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链；

1)包含SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：124所示的氨基酸序列的轻链；

2)包含SEQ ID NO：107所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：125所示的氨基酸序列的轻链；

3)包含SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：125所示的氨基酸序列的轻链；

4)包含SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：125所示的氨基酸序列的轻链；

5)包含SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列的轻链；

6)包含SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列的轻链；

7)包含SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列的轻链；

8)包含SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列的轻链；

9)包含SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列的轻链；

10)包含SEQ ID NO：115所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列的轻链；

11)包含SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：127所示的氨基酸序列的轻链；

12)包含SEQ ID NO：117所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：127所示的氨基酸序列的轻链；

13)包含SEQ ID NO：118所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：127所示的氨基酸序列的轻链；

14)包含SEQ ID NO：119所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：128所示的氨基酸序列的轻链；

15)包含SEQ ID NO：120所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列的轻链；

16)包含SEQ ID NO：121所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：130所示的氨基酸序列的轻链；

17)包含SEQ ID NO：122所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：130所示的氨基酸序列的轻链；或

18)包含SEQ ID NO：123所示的氨基酸序列的重链，和包含SEQ ID NO：130所示的氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，本发明的抗CD73抗体是IgG1形式的抗体、IgG2形式的抗体、IgG3形式的抗体或IgG4形式的抗体；优选地，抗CD73抗体是IgG4形式的抗体。

在一些实施方案中，抗CD73抗体是单克隆抗体。

在一些实施方案中，抗CD73抗体或其抗原结合片段包含框架序列，其中框架序列的至少一部分是人共有框架序列。

在一些实施方案中，本申请涉及与本申请公开的示例性抗体竞争结合CD73，或者拮抗、阻断本申请公开的示例性抗体与CD73结合的抗体。

在一些实施方案中，抗CD73抗体是嵌合抗体，在优选实施方案中，抗CD73抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD73抗体是人抗体。本发明的抗CD73抗体还涵盖其抗体片段，优选地选自以下的抗体片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、，F(ab’) ₂、Fv、单链抗体(例如scFv)、单结构域抗体、双抗体(dAb)或线性抗体。

在一些实施方案中，本发明提供了编码本发明抗CD73抗体或其抗原结合片段的分离的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。

在一些实施方案中，本发明提供了制备本发明抗CD73抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达编码本发明所述的核酸的条件下培养本发明所述的宿主细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了由上述方法制备的抗CD73抗体及其抗原结合片段。

在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明抗CD73抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物和药物组合物和药物组合。

在一些实施方案中，本发明还提供了利用本发明抗CD73抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、药物组合物或药物组合在制备用于预防和/或治疗CD73相关疾病或病症(例如肿瘤)的药物中的应用。

在一些实施方案中，本发明还提供了预防和/或治疗CD73相关疾病或病症(例如肿瘤)的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明结合CD73的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、药物组合物或药物组合。

在一些实施方案中，本发明所述的药物组合包含上述的抗CD73抗体或其抗原结合片段及抗PD1抗体，所述抗PD1抗体优选为信迪利单抗。

在一些实施方案中，本发明还提供了抗CD73抗体或其抗原结合片段在制备用于逆转CD73对T细胞增殖抑制的药物中的用途。在一些实施方案中，其中所述T细胞是CD4+T细胞，CD8+T细胞。

在一些实施方案中，本发明还提供了抗CD73抗体或其抗原结合片段在制备激活T细胞活性的药物中的用途。

在一些实施方案中，本发明还提供了CD73与抗体结合的表位，其包含SEQ ID NO：131所示的第159-170位氨基酸的片段，优选地，所示表位包含SEQ ID NO：131所示的第159、161、162、163、170位氨基酸。

本发明还涉及检测样品中CD73分子的方法，所述方法包括(a)使本发明所述的抗体或其抗原结合片段与样品接触；以及(b)检测样品中是否形成抗体或其抗原结合片段与CD73分子的复合物。

本发明抗CD73抗体或其抗原结合片段具有如下优点：

1)以高亲和力结合人或食蟹猴CD73；

2)完全阻断细胞表面上膜结合的CD73的酶活性；

3)以高亲和力结合表达于CHO-S细胞表面的人CD73；

4)阻断可溶性的CD73的酶活性；

5)逆转AMP-腺苷对CD4+T细胞增殖的抑制；

6)逆转AMP-腺苷对CD8+T细胞增殖的抑制；

7)逆转AMP-腺苷对T细胞活性的抑制；

8)优异的抗肿瘤作用及安全性。

附图说明

结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。

图1.CD73分子在细胞表面的表达；

图2.抗CD73抗体分子对Calu-6细胞表面CD73酶活抑制；

图3.抗CD73抗体分子对NCI-H292细胞表面CD73酶活抑制；

图4.本发明抗体对可溶性CD73酶活性的抑制作用；

图5.抗CD73抗体与表达于CHO-S细胞表面的人CD73结合；

图6.抗CD73抗体分子促进CD4+T细胞增殖活性；

图7.CD73在CD8+T细胞中表达的流式细胞检测结果；

图8.抗CD73抗体分子促进CD8+T细胞增殖活性；

图9.抗CD73抗体对人T细胞的激活作用；

图10.抗CD73抗体和抗PD-1抗体联用对T细胞的激活

图11.ADI37505和ADI37506在MDA-MB-231荷瘤NOG小鼠模型中的肿瘤抑制活性；

图12.小鼠体重变化；

图13.ADI37505和抗PD-1抗体在A375荷瘤人源化小鼠模型中肿瘤抑制率

图14.各组小鼠体重变化

图15.流式细胞技术检测抗CD73抗体和过表达全长人CD73、CD73N端结构域及C端结构域的GS-CHO细胞结合情况；

图16.流式细胞技术检测抗CD73抗体和过表达CD73N端突变体的GS-CHO细胞结合情况。

具体实施方式

I.定义

在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。

为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。

术语“和/或”意指当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项。

术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其它要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组合的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。

术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、完整抗体或其显示出所需的抗原结合活性的抗体片段。完整抗体通常将包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下可包括较少的链，例如骆驼中天然存在的抗体可仅包含重链。

术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指一种抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。

术语“抗体片段”包括上述提及的抗体的任意部分，优选的是它们的抗原结合片段或其可变区。

术语“抗原结合片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。抗原结合片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’) ₂；双抗体(diabodies，dAb)；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体(单域抗体)；双价或双特异性抗体的抗原结合片段；骆驼科抗体；和表现出所需的结合抗原(例如CD73)能力的其它片段。

术语“抗原”是指引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生或特异性免疫细胞的活化，或两者兼有。技术人员将理解，任何大分子，包括基本上所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。

如本文所用，术语“表位”指抗原(例如，CD73)中与抗体分子特异性相互作用的部分。

如本文所用，术语“单克隆抗体”指具有单一分子组成的抗体分子的制备物(即，它们由同一种免疫细胞产生，这些免疫细胞都是单个亲本细胞的克隆，因此这些分子都是相同的)。单克隆抗体或其抗原结合片段可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术例如CDR嫁接、或此类或其它本领域已知的技术的组合来产生。

如本文所用，术语“结合”和“特异性结合”意指抗体的结合作用对抗原是选择性的，并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别开。抗体与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、表面等离子共振法(SPR)或生物膜层光学干涉技术(ForteBio)或本领域已知的其它常规结合测定法测定。作为本发明的实施例，指抗体或其抗原结合片段在体外测定法中，优选地在采用纯化的野生型抗原的生物膜层光学干涉测量中与抗原表位结合。在某些实施方案中，在抗体或其抗原结合片段优选地识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中其靶抗原时，将抗体或其抗原结合片段称作特异性结合抗原。

取决于其重链恒定区的氨基酸序列，将抗体以“类”划分：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。对应于不同抗体类的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。可以在全部五个抗体类中找到的轻链恒定区(CL)称作κ和λ。在全长轻链和重链内，通常可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，且重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。参见例如Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.编辑，第二版，Raven Press，N.Y.(1989))(其为所有目的以其整体在此引作参考)。每一轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中，人IgG重链Fc区通常从Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5 ^thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区(参见，例如，Kindt等Kuby Immunology，6 ^th ed.，W.H.Freeman and Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构域分别筛选互补VL或VH结构域的文库来分离结合所述抗原的抗体，参见，例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)。

可变区通常由三个高变区及相连的相对保守的四个构架区(FR)组成，所述高变区也被称为互补决定区或CDR。通常通过构架区定位(align)来自每对的两条链的CDR，所述CDR可结合特异性表位。两条轻链和重链可变区从N-末端到C-末端通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。

“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”(在本文中与超变区“HVR”可以互换使用)，是抗体可变结构域中在序列上高度可变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR从N-端开始顺序编号，通常称作CDR1、CDR2和CDR3。位于抗体重链可变结构域内的CDR也称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR则称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，可以采用本领域公知的多种方案确定其CDR序列，例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342：877-883，Al-Lazikani等人，“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”，Journal of Molecular Biology，273，927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes of Health(1987))，AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(国际免疫遗传学信息系统，万维网imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义(North等，“A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations”，Journal of Molecular Biology，406，228-256(2011))。

例如，使用Kabat和Chothia等编号的CDR区域的不同定义范围。

CDR也可以基于与参考CDR序列具有相同的Kabat编号位置而确定。

除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。

除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5 ^th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))的编号位置。

在一个实施方案中，本发明抗体的HCDR1通过AbM规则确定边界，HCDR3通过IMGT规则确定边界，HCDR2和LCDR1-3通过Kabat规则确定边界，例如下文表A所示。在一个实施方案中，本发明抗体的CDR1通过Kabat规则确定边界，例如下文表D所示。

然而，应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。

具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat，Chothia，AbM、Contact和North方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。

术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如NK细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型免疫球蛋白使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。Ravetch和 Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或美国专利No.6,737,056中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括PBMC和NK细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等人，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。本文实施例中提供了用于评估ADCC活性的一种例示性测定法。

术语“功能性Fc区”指这样的Fc区，其拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变域)联合，而且可以使用多种测定法来评估，例如本文所公开的那些。

本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗肿瘤(例如癌症)中有效的任何物质，包括化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂。

本文使用的术语“免疫调节剂”指抑制或调节免疫应答的天然或合成活性剂或者药物。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。

术语“有效量”指本发明的抗体或其片段或缀合物或组合物这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。针对治疗或预防的目的，可以将“有效量”区分为“治疗有效量”和“预防有效量”。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素而容易地确定：诸如哺乳动物的物种、大小、年龄和一般健康、涉及的具体疾病、疾病的程度或严重性、个体患者的应答、施用的具体抗体、施用模式、施用制剂的生物利用率特征、选择的给药方案、和任何伴随疗法的使用。

在一个实施方式中，相比较于对照，有效量的本发明CD73抗体优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率，肿瘤体积等)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％和仍更优选地至少约80％或90％。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换地使用且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括最初原代转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。

如本文所用，术语“多特异性”抗体指具有至少两个不同抗原结合位点的抗体，所述至少两个不同抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。多特异性抗体是对至少两个不同抗原表位具有结合特异性的抗体。在一个实施方案中，本文提供了这样的双特异性抗体，其具有针对第一抗原和第二抗原的结合特异性。

术语“效应子功能”指随免疫球蛋白同种型变动的归因于免疫球蛋白Fc区的那些生物学活性。免疫球蛋白效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。

术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子、白介素(IL)，诸如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)和γ-干扰素。如本文中使用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体，及其药剂学可接受的衍生物和盐。

术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)将恒定区或其部分改变、替换或交换，从而抗原结合位点与不同的或改变的类别、效应子功能和/或物种的恒定区或赋予嵌合抗体新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物)等连接；或(b)将可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，小鼠抗体可以通过将其恒定区更换为来自人免疫球蛋白的恒定区进行修饰。由于更换为人类恒定区，该嵌合抗体可以保留其在识别抗原方面的特异性，同时如与原始小鼠抗体相比，具有在人类中降低的抗原性。

术语“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于下述抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

术语“人源化”抗体是指包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR(例如，6个CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。

术语“免疫缀合物”是与一个或多个其它物质(包括但不限于细胞毒性剂或标记)缀合的抗体。

本文所使用的术语“标记”是指被直接或间接缀合或融合至试剂(诸如多核苷酸探针或抗体)并且促进其所缀合或融合的试剂的检测的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶促标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即，物理连接)至探针或抗体来直接标记探针或抗体以及通过与直接标记的另一种试剂反应来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体进行的一级抗体的检测和具有生物素的DNA探针的末端标记，使得其可以用荧光标记的链霉抗生素蛋白来检测。

术语“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。

术语“分离的”抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。

“分离的编码抗CD73抗体或其抗原结合片段的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码抗体重链或轻链(或其抗原结合片段)，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。

如下进行序列之间序列同一性的计算。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。

可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法(在http：//www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http：//www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。

还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法，((1989)CABIOS，4：11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。

额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其它家族成员序列或相关序列。

术语“药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、载体或稳定剂等。

术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

术语“药物组合”是指非固定组合产品或固定组合产品，包括但不限于药盒、药物组合物。术语“非固定组合”意指活性成分(例如，(i)抗CD73抗体或其片段、以及(ii)其他治疗剂)以分开的实体被同时、无特定时间限制或以相同或不同的时间间隔、依次地施用于患者，其中这类施用在患者体内提供预防或治疗有效水平的两种或更多种活性剂。在一些实施方案中，药物组合中使用的抗CD73抗体或其片段和其他治疗剂以不超过它们单独使用时的水平施用。术语“固定组合”意指两种或更多种活性剂以单个实体的形式被同时施用于患者。优选对两种或更多种活性剂的剂量和/或时间间隔进行选择，从而使各部分的联合使用能够在治疗疾病或病症时产生大于单独使用任何一种成分所能达到的效果。各成分可以各自呈单独的制剂形式，其制剂形式可以相同也可以不同。

术语“组合疗法”或“联合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗如本公开所述的癌症或感染。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，例如以具有固定比例的活性成分的单一胶囊。或者，这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如片剂、胶囊、粉末和液体)中的共同施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。此外，这种施用还包括以大致相同的时间或在不同的时间以顺序的方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。

用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。

用于本文时，“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。

术语“抗感染活性剂”包括在施用浓度和给药间隔下特异性抑制或消除微生物生长但对宿主不致命的任何分子，所述微生物诸如病毒、细菌、真菌或原生动物，例如寄生虫。用于本文时，术语抗感染活性剂包括抗生素、抗菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗原生动物剂。在一个具体方面中，抗感染活性剂在施用浓度和给药间隔对宿主是无毒的。

抗细菌的抗感染活性剂或抗菌剂可广泛的分类为杀菌的(即，直接杀死)或抑菌的(即，阻止分裂)。抗菌的抗感染活性剂可进一步再分类为窄谱抗菌剂(即，仅影响小类细菌亚型，例如，革兰氏阴性等)或广谱抗菌剂(即，影响广泛种类)。

术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。

术语“受试者/患者样品”指从患者或受试者得到的组织或细胞样品集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织(例如来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品)；血液或任何血液组分；体液(诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液)；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、细针吸出物、支气管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手术标本、循环中的肿瘤细胞、血清、血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。

II.抗体

除非另外说明，术语“分化簇73”、“胞外-5’-核苷酸酶”、“胞外-5’-NT”和“CD73”当用于本文中时是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然CD73，除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工的CD73以及由细胞内加工产生的任何形式的CD73或其任何片段。该术语还包括天然存在的CD73的变体，例如，剪接变体或等位变体。在一些实施方案中，所述CD73为人或食蟹猴CD73。

本文所用的术语“抗CD73抗体”、抗CD73、“CD73抗体”或“抗CD73的抗体”是指这样的抗体，所述抗体或其抗原结合片段能够以足够的亲合力结合CD73蛋白。所述抗体可以用作靶向CD73中的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，如例如通过放射性免疫测定(RIA)或生物膜层光学干涉测定法(例如Fortebio亲和测量)或MSD(Meso Scale Discovery)测定法测量的那样，抗CD73抗体与非CD73蛋白结合的程度低于所述抗体与CD73结合的约10％。

在一些实施方案中，本发明的抗CD73抗体或其抗原结合片段以足够的亲和力结合CD73(例如人或食蟹猴CD73)，例如，以以下平衡解离常数(K _D)与CD73结合，所述K _D≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10 ^-8M以下，例如10 ^-8M至10 ^-13M，例如10 ^-9M至10 ^-13M)。在一些实施方案中，CD73为人或食蟹猴CD73。在一些实施方案中，抗体结合亲和力是使用生物光干涉测量测定的。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段结合细胞表面表达的CD73并抑制CD73酶活功能。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段结合可溶性的CD73分子并抑制CD73酶活功能。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以逆转腺苷积累造成的CD4+T细胞增殖抑制。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以完全逆转腺苷积累造成的CD4+T细胞增殖抑制。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以逆转腺苷积累造成的CD8+T细胞增殖抑制。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以完全逆转腺苷积累造成的CD8+T细胞增殖抑制。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以逆转腺苷积累造成的T细胞活性抑制。

在一些实施方案中，本发明的结合CD73的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中所述VH和VL包含选自表A或表D所示的6个CDR的组合。

在优选的实施方案中，本发明提供的结合CD73的抗体或其抗原结合片段所包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的组合如表A或表D所示。

在本发明的一个实施方案中，本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换，优选地保守置换。

在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。

在一些实施方案中，置换为保守性置换。保守置换是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸置换，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸置换，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸置换，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸置换。示例性的置换如下表所示：

原始残基	示例性置换	优选的保守氨基酸置换
Ala(A)	Val、Leu、Ile	Val
Arg(R)	Lys、Gln、Asn	Lys
Asn(N)	Gln、His、Asp、Lys、Arg	Gln
Asp(D)	Glu、Asn	Glu
Cys(C)	Ser、Ala	Ser
Gln(Q)	Asn、Glu	Asn
Glu(E)	Asp、Gln	Asp
Gly(G)	Ala	Ala
His(H)	Asn、Gln、Lys、Arg	Arg
Ile(I)	Leu、Val、Met、Ala、Phe、正亮氨酸	Leu
Leu(L)	正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala、Phe	Ile
Lys(K)	Arg、Gln、Asn	Arg
Met(M)	Leu、Phe、Ile	Leu
Phe(F)	Trp、Leu、Val、Ile、Ala、Tyr	Tyr

Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Val、Ser	Ser
Trp(W)	Tyr、Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp、Phe、Thr、Ser	Phe
Val(V)	Ile、Leu、Met、Phe、Ala、正亮氨酸	Leu

在某些实施方案中，置换发生在抗体的CDR区。通常，获得的变体相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体。

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体经改变以增加或降低抗体经糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点而方便地实现。当抗体包含Fc区时，可以改变附着于其的糖类。在一些应用中，除去不想要的糖基化位点的修饰可以是有用的，例如除去岩藻糖模块以提高抗体依赖性细胞介导的细胞毒性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等(2002)JBC277：26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖苷化修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。

在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体。Fc区变体可包括在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。关于Fc变体的实例参见美国专利号7,332,581，美国专利号6,737,056，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312和Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)，美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164：4178-4184(2000)，美国专利号7,371,826，Duncan&Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。

在某些实施方案中，本发明所提供抗体的Fc区具有S228、F234和/或L235位点突变，优选突变为S228P、F234A和/或L235A。

在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代MAb”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基置换。可以如，例如美国专利号7,521,541中所述地生成半胱氨酸改造的抗体。

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其它非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二烷、聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。

III.本发明的核酸以及包含其的载体和宿主细胞

在一方面，本发明提供了编码以上任何抗CD73抗体或其抗原结合片段的核酸。示例性的编码抗体重链可变区的核酸序列包括与选自SEQ ID NO：73-90中任一项的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸序列，或者包括选自SEQ ID NO：73-90中任一项的核酸序列。示例性的编码抗体轻链可变区的核酸序列包括与选自SEQ ID NO：98-105中任一项的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸序列，或者包括选自SEQ ID NO：98-105中任一项的核酸序列。本发明还涵盖与上述核酸在严格性条件下杂交的核酸或与上述核酸相比具有一个或多个置换(例如保守性置换)、缺失或插入的核酸。

在一个实施方案中，本发明提供了包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。在一个实施方案中，载体是pV120载体。

一旦已经制备了用于表达的表达载体或DNA序列，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其它常规技术。在原生质体融合的情况下，将细胞在培养基中培育并且筛选适宜的活性。用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法，根据使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞变动或优化。

另外，可以通过引入允许选择已转染的宿主细胞的一个或多个标记物，选出已经稳定将DNA掺入至其染色体中的细胞。标记物可以例如向营养缺陷型宿主提供原养型、杀生物抗性(例如，抗生素)或重金属(如铜)抗性等。可选择标记基因可以与待表达的DNA序列直接连接或通过共转化引入相同的细胞中。也可能需要额外元件以便最佳合成mRNA。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。

在一个实施方案中，本发明提供了包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或HEK293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。

IV.本发明的抗体分子的生产和纯化

在一个实施方案中，本发明提供制备抗CD73抗体或其片段(优选抗原结合片段)的方法，其中所述方法包括在适于表达编码所述抗体或其片段(优选抗原结合片段)的核酸的条件下培养所述宿主细胞，以及任选地分离所述抗体或其片段。在某个实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞回收抗CD73抗体或其片段。

在一个实施方案中，提供了制备结合CD73的抗体的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体(例如任意一条多肽链和/或多条多肽链)的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。

为了重组产生结合CD73的抗体，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体，例如任意一条多肽链和/或多条多肽链)的核酸，并将其插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。

如本文所述制备的抗体分子可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗体分子的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。

V.测定法

可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的结合CD73的抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹等来进行。可使用本领域已知方法来测定对CD73的结合，本文中公开了例示性方法。在一些实施方案中，使用生物膜层光学干涉测定法或MSD测定法。

可以理解的是，能够使用本发明的免疫缀合物替换或补充结合CD73的抗体来进行任何上述测定法。

可以理解的是，能够使用结合CD73的抗体和别的活性剂来进行任何上述测定法。

VI.免疫缀合物

在一些实施方案中，本发明提供了免疫缀合物，其包含本文中提供的任何抗CD73抗体和其它物质。在一些实施方案中，其它物质例如治疗剂，如细胞毒性剂或化疗剂。细胞毒性剂包括任何对细胞有害的药剂。适合于形成免疫缀合物的细胞毒性剂的例子是本领域中已知的。

在一些实施方案中，所述免疫缀合物用于预防或治疗肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤为癌症。

VII.药物组合物

在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何抗CD73抗体或其抗原结合片段或其免疫缀合物的组合物，优选地组合物为药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料。在一个实施方案中，组合物(例如，药物组合物)包含本发明的抗CD73抗体或其抗原结合片段或其免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂(例如化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂)的组合。

在一些实施方案中，所述组合物用于预防或治疗癌症。在一个实施方案中，所述癌症为乳腺癌，肺癌。

本发明还包括包含抗CD73抗体或其免疫缀合物的组合物(包括药物组合物)和包含编码抗CD73抗体的多核苷酸的组合物(包括药物组合物)。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种抗CD73抗体或其抗原结合片段或一种或多种编码一种或多种抗CD73抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。这些组合物还可以包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂。关于药用辅料的使用例如请参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”，第五版，R.C.Rowe，P.J.Seskey和S.C.Owen，PharmaceuticalPress，London，Chicago。

本发明的药物组合物还可以包含一种或多种其它活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地影响彼此活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它抗癌活性成分，例如化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等。所述活性成分以对于目的应用有效的量合适地组合存在。

VIII药物组合

本发明提供了前述本发明的药物组合，其包含上述抗CD73抗体或其抗原结合片段及抗PD1抗体，进一步的所述抗PD1抗体为信迪利单抗。

本发明提供了前述本发明的药物组合在制备用于治疗癌症或肿瘤的药物中的用途。

本发明所述癌症或肿瘤包括乳腺癌、肺癌和黑色素瘤。

本发明的药物组合可以同时、分开或依次组合使用。

本发明提供了预防或治疗癌症的方法，其包括向有需要的个体施用有效量的本发明的药物组合。所述有效量包括预防有效量和治疗有效量。

IX应用

本发明一方面提供了预防和/或治疗CD73相关疾病或病症(例如癌症)的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的抗CD73的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物或药物组合物或药物组合。

受试者可以是哺乳动物，例如，灵长类，优选地，高级灵长类，例如，人类在一个实施方案中，受试者患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的风险。在某些实施方案中，受试者接受或已经接受过其它治疗，例如化疗治疗和/或放射疗法。

在一些实施方案中，本文所述的癌症例如为人乳腺癌、肺癌。

在其它方面，本发明提供抗CD73抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物、药物组合物或药物组合在生产或制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗本文提及的CD73相关疾病或病症。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段或免疫缀合物或组合物或药物组合或产品会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。

X.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文中提供的任何抗CD73抗体或其抗原结合片段可以用于检测CD73在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测，示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法、PCR-技术(例如，RT-PCR)。在某些实施方案中，生物样品是血、血清或生物来源的其它液体样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。在一些实施方案中，生物样品来自过度增生性或癌性病灶。

在一个实施方案中，提供检测CD73是否在生物样品中存在的方法。在某些实施方案中，CD73是人CD73。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗CD73抗体在允许抗体与CD73结合的条件下接触，并检测是否形成抗CD73抗体和CD73的复合物。该方法可以是体外或体内方法。

在一些实施方案中，提供了一种治疗CD73相关疾病或病症(例如癌症或肿瘤)的方法，所述方法包括：向受试者施用治疗有效量的抗CD73抗体。在另一个实施方案中，所述方法还包括向受试者施用一种或多种其它疗法。

1)ADI-34071

重链(SEQ ID NO：106)

轻链(SEQ ID NO：124)

2)ADI-34074

重链(SEQ ID NO：107)

轻链(SEQ ID NO：125)

3)ADI-37496

重链(SEQ ID NO：108)

轻链(SEQ ID NO：125)

4)ADI-37497

重链(SEQ ID NO：109)

轻链(SEQ ID NO：125)

5)ADI-34086

重链(SEQ ID NO：110)

轻链(SEQ ID NO：126)

6)ADI-37503

重链(SEQ ID NO：111)

轻链(SEQ ID NO：126)

7)ADI-37504

重链(SEQ ID NO：112)

轻链(SEQ ID NO：126)

8)ADI-37505

重链(SEQ ID NO：113)

轻链(SEQ ID NO：126)

9)ADI-37506

重链(SEQ ID NO：114)

轻链(SEQ ID NO：126)

10)ADI-37507

重链(SEQ ID NO：115)

轻链(SEQ ID NO：126)

11)ADI-34095

重链(SEQ ID NO：116)

轻链(SEQ ID NO：127)

12)ADI-37513

重链(SEQ ID NO：117)

轻链(SEQ ID NO：127)

13)ADI-37522

重链(SEQ ID NO：118)

轻链(SEQ ID NO：127)

14)ADI-34101

重链(SEQ ID NO：119)

轻链(SEQ ID NO：128)

15)ADI-37532

重链(SEQ ID NO：120)

轻链(SEQ ID NO：129)

16)ADI-34104

重链(SEQ ID NO：121)

轻链(SEQ ID NO：130)

17)ADI-37542

重链(SEQ ID NO：122)

轻链(SEQ ID NO：130)

18)ADI-37543

重链(SEQ ID NO：123)

轻链(SEQ ID NO：130)

CD73蛋白野生型序列(SEQ ID NO：131)

实施例

实施例1.本发明抗CD73抗体的获得、表达和纯化

1. 基于酵母的抗体展示文库获得亲本抗体：

采用Adimab公司的基于酵母的抗体展示文库，按照现有的方法(WO2009036379；WO 2010105256；W02012009568)进行扩增，其中每个库的多样性达到1×10 ⁹。简言之，前两轮的筛选使用Miltenyi公司的MACS系统进行磁性激活细胞分选。首先，将文库的酵母细胞(～1×10 ¹⁰细胞/文库)分别在FACS洗涤缓冲液中(磷酸盐缓冲液，含有0.1％牛血清蛋白)室温孵育15分钟，缓冲液中含有100nM生物素标记的人CD73抗原(R&D Systems，5795-EN)。使用50ml预冷的FACS洗涤缓冲液洗一次，再用40ml相同洗涤缓冲液重悬细胞，并加入500μl链霉素微珠(Miltenyi LS)于4℃孵育15分钟。室温，1000rpm离心5min弃去上清后用5ml FACS洗涤缓冲液重悬细胞，将细胞溶液加到Miltenyi LS柱中。加样完成后，用FACS洗涤缓冲液洗柱3次，每次3ml。从磁性区域取下Miltenyi LS柱，用5ml生长培养基洗脱，收集洗脱的酵母细胞并在37℃过夜生长。

使用流式细胞仪进行下一轮的分选：将经过MACS系统筛选获得的大约1×10 ⁸的酵母细胞用FACS缓冲液洗三次，与含有低浓度生物素(100 ^-1nM)标记的人CD73抗原在室温下培养。弃去培养液，细胞用FACS洗涤缓冲液洗两次之后，将细胞与LC-FITC(FITC标记山羊抗人免疫球蛋白F(ab’)kappa链抗体，Southern Biotech)(1∶100稀释)混合，并与SA-633(链霉亲和素-633，Molecular Probes)(1∶500稀释)或SA-PE(链霉亲和素-藻红蛋白，Sigma)(1∶50稀释)试剂混合，4℃下培养15分钟。用预冷的FACS洗涤缓冲液冲液两次，并重悬于0.4ml缓冲液中，将细胞转移到带滤器的分离管中。使用FACSARIA(BD Biosciences)分选细胞。

将通过筛选获得的表达抗CD73抗体的酵母细胞在30℃下震荡诱导48小时以表达抗CD73的抗体。诱导结束之后，室温1300rpm离心10min去除酵母细胞，收获上清液。使用Protein A对上清液中的抗CD73抗体进行纯化，pH2.0醋酸溶液洗脱，收获抗CD73抗体，经检测，抗体纯度＞95％。

本次筛选共获得6株抗人CD73的抗体，分别命名为：ADI-34086，ADI-34101，ADI-34071，ADI-34095，ADI-34104和AD-34074。所述抗体的特性参见下文表1。

2.抗人CD73抗体的亲和力成熟：

为了获得更高亲和力的抗人CD73抗体，我们通过以下方法对抗体ADI-34086，ADI-34101，ADI-34071，ADI-34095，ADI-34104和AD-34074进行了优化。

VHmut筛选

该方法通过采用常规的错配PCR方法向抗体重链区域引入突变。具体而言，在PCR过程中，通过使用1uM高突变的碱基类似物dPTP和8-oxo-dGTP，将碱基错配概率提高至约0.01bp。

获得的错配PCR的产物通过同源重组的方法构建入含有重链恒定区的载体中。通过在包括CD73抗原滴度、未标记抗原竞争以及使用母抗体竞争的筛选压力下，我们获得了库容量为1×10 ⁷的次级库。通过FACS方法进行了3轮成功筛选。

CDRH1/CDRH2筛选

把VHmut方法获得的子代抗体的重链CDR3基因构建入1×10 ⁸多样性的CDRH1/CDRH2基因库中，并对其进行了3轮筛选。第一轮使用MACS方法，而第二、三轮使用FACS方法，对抗体抗原结合物进行亲和力加压，从而筛选出最高亲和力的抗体。

经过以上亲和力成熟过程，我们获得了相对于亲本抗体，亲和力提高的12株抗人CD73单克隆抗体，分别命名为：ADI-37503，ADI-37504，ADI-37505，ADI-37506，ADI-37507，ADI-37532，ADI-37513，ADI-37522，ADI-37497，ADI-37496，ADI-37542和ADI-37543。

由此，本发明示例的18个抗体的CDR区、轻链可变区和重链可变区、轻链和重链的氨基酸序列以及相应序列编号在本申请的表A、B、D以及序列表中列出。本发明示例的抗体是IgG4形式。

3.在CHO-S细胞中表达并且纯化本发明的抗体：

根据制造商的说明书，使用

试剂盒(Invitrogen)产生表达抗体的CHO-S细胞系。首先将抗体分子重链和轻链的DNA序列插入到同一个pCHO1.0质粒中，其中重链在轻链的上游。之后采用化学转染法或电转染法将构建的pCHO1.0质粒转入CHO-S细胞系，转染48小时之后利用ForteBio检测抗体产量以判断转染效率。转染后的细胞经过两轮加压筛选得到高表达抗体的细胞池(pool)。之后扩增细胞池，大量表达抗体，并收集细胞上清用ProteinA纯化上清液，使抗体的纯度＞95％。

4.在293HEK细胞中表达并且纯化本发明的抗体：

对于293HEK细胞中抗体的瞬时表达，使用载体pV120。首先将抗体的重链和轻链克隆到单独的pV120载体中。使用化学转染的方法将带有抗体分子重链和轻链的pV120载体转入293HEK细胞中。采用的化学转染试剂为聚乙烯亚胺PEI(购自Polysciences)，按照生产产商提供的方案瞬时转染培养的293HEK。首先准备质粒DNA和转染试剂，将F17培养基(Gibco)(体积为转染体积的1/5)各一半加入50ml离心管中，一份加入已过滤的质粒(130μg/100ml)，另一半加入已过滤的PEI(1g/L，Polysciences)(质量比(质粒∶PEI)＝1∶3)，混匀5min，将二者轻柔混匀20次，静置15-30min。将DNA/PEI混合物轻柔倒入293HEK细胞并混匀，在37℃，8％CO ₂的条件下培养细胞7天，每48小时流加新鲜培养基。7天后或者连续培养至细胞活力≤60％时，室温13000rpm离心20min。取上清液，用ProteinA纯化上清液，使抗体的纯度＞95％。

按照相同的方法，分别在293HEK细胞中表达并且纯化实施例中使用的下述各个对照抗体：

对照抗体Oleclumab(Omab)，其序列如美国专利US 9938356B2中公开的抗体“MEDI9447”的序列所示。

对照抗体BMS 4-2，其序列如WO2016/081748A2中公开的抗体“CD73.4-2”的序列所示。

对照抗体Surface，其序列如WO2018/237157A1中公开的抗体“373.A”的序列所示。

对照抗体CPI-006，其序列如WO2017/100670A1中公开的抗体“CPX-006”的序列所示。

对照抗体Imab hu101-28，其序列如2018/137598A1中公开的抗体“hu101-28”的序列所示。

对照抗体Innate 6E1，其序列如WO2016/131950A1中公开的抗体“6E1”的序列所示。

实施例2.本发明抗CD73抗体的亲和力测定

采用生物膜层光学干涉(ForteBio)测定法测定本发明上述18个抗CD73抗体结合人CD73的平衡解离常数(K _D)。

对亲和力优化前6个抗体的双价亲和力测定，本申请采用ForteBio亲和力测定法，所述方法按照现有的方法(Estep，P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs，2013.5(2)：p.270-8)进行。简言之，传感器在分析缓冲液中线下平衡30分钟，然后线上检测60秒建立基线，在线加载如上所述获得的经纯化的抗体至AHQ传感器(ForteBio)上进行ForteBio亲和测量。再将具有加载的抗体的传感器暴露于100nM的人或食蟹猴抗原中作用5分钟，之后将传感器转移至分析缓冲液解离5分钟用于解离速率测量。使用1∶1结合模型进行动力学的分析。

基于

发光法，测量亲和力优化前6个抗体对表达于Calu-6肿瘤细胞表面的人CD73的酶活性的抑制能力，通过比较不同抗体对AMP降解的抑制曲线来测定其酶活性抑制能力。具体实验过程为：(1)接种Calu-6细胞至96孔平底板中并过夜培养。(2)次日使用进行3倍梯度稀释的候选抗体溶液(浓度范围为0-10000ng/ml)与Calu-6细胞进行混合，于37℃，5％CO ₂培养箱孵育30分钟。(3)配制AMP溶液(Sigma，01930)，并将其加入到已与抗体孵育的细胞中，AMP溶液终浓度为2mM，将混合物放入培养箱37℃，5％CO ₂孵育3小时。(4)配制ATP溶液(Sigma，A6419)然后将其与细胞培养上清、CellTiter-Glo底物(Promega，G7572)一起混合，ATP溶液终浓度为200μM，室温振荡孵育10分钟后使用多功能酶标仪(Molecular Divices，SpectraMax i3)读取荧光度值(1000ms)。拟合曲线计算IC50值。

在如以上测定法所述进行的实验中，6个亲和力优化前抗体的亲和力和酶活性如下表1所示。

表1：亲和力优化前的六个抗体特性总结

由于存在CD73二聚化，因此针对亲和力优化后的12个抗体，采用ForteBio亲和力测定法测定了其单价(scfv)的亲和力，具体方法如下：传感器在分析缓冲液中线下平衡30分钟，然后线上检测60秒建立基线，在线加载人或食蟹猴CD73抗原蛋白至AHQ传感器(ForteBio)上进行ForteBio亲和测量。再将具有加载的抗原的传感器暴露于100nM亲和力成熟所获得的抗体的scfv片段中作用5分钟，之后将传感器转移至分析缓冲液解离5分钟用于解离速率测量。使用1∶1结合模型进行动力学的分析。

12个亲和力优化之后抗体的亲和力如下表2所示。

表2：通过生物膜层光学干涉技术测量亲和力优化后本发明抗体的亲和力

可见，本发明上述12个示例抗体与人和食蟹猴CD73均显示极高的亲和力。

实施例3.本发明抗CD73抗体在细胞水平抑制CD73的酶活性

CD73分子在多种肿瘤细胞表面表达。本研究通过流式细胞技术检测了CD73分子在NCI-H292和Calu-6肿瘤细胞表面的表达情况，结果如图1所示，CD73分子在Calu-6肿瘤细胞表面表达高于NCI-H292细胞。

1.亲和力优化的抗CD73抗体抑制细胞膜CD73的酶活性

基于

发光法，测量本发明上述12个亲和力优化后示例抗体对表达于Calu-6肿瘤细胞表面的人CD73的酶活性的抑制能力，其中采用Omab作为阳性对照，不相关IgG作为阴性对照。通过比较不同抗体对AMP降解的抑制曲线来测定其酶活性抑制能力。具体实验过程为：(1)接种Calu-6细胞至96孔平底板中并过夜培养。(2)次日使用通过3倍梯度稀释的，浓度范围为0-10000ng/mL的候选抗体溶液与Calu-6细胞进行混合，于37℃，5％CO ₂培养箱孵育30分钟。(3)配制AMP溶液(Sigma，01930)，并将其加入到已与抗体孵育的细胞中，AMP溶液终浓度为2mM，将混合物放入培养箱37℃，5％CO ₂孵育3小时。(4)配制ATP溶液(Sigma，A6419)然后将其与细胞培养上清、CellTiter-Glo底物(Promega，G7572)一起混合，ATP溶液终浓度为200μM，室温振荡孵育10分钟后使用多功能酶标仪(Molecular Divices，SpectraMax i3)读取荧光度值(1000ms)。结果如图2所示。

下文表3总结了本发明亲和力优化的12个示例性抗CD73抗体抑制细胞膜结合CD73的酶活性的IC50，其中采用Omab作为阳性对照。

表3：抗CD73抗体分子抑制细胞膜上CD73的酶活性的IC50值

由上面的实验结果可以得出如下结论：(1)亲和力成熟后的抗CD73抗体均可以有效抑制细胞表面的CD73酶活性。(2)亲和力成熟后的子代抗体ADI-37503，ADI-37504，ADI-37506，ADI-37505，ADI-37507，ADI-37532，ADI-37513，ADI-37522，ADI-37497，ADI-37496抑制细胞表面CD73酶活性的能力均强于对照抗体Oleclumab。

在低表达CD73的NCI-H292中，利用

发光法测量本发明的抗CD73抗体ADI-37505和ADI-37506和对照抗体对NCI-H292细胞表面的人CD73的酶活性的抑制能力，其中采用Omab作为阳性对照，不相关hIgG4作为阴性对照。通过比较不同抗体对AMP降解的抑制曲线来测定其酶活性抑制能力。具体实验过程为：(1)接种NCI-H292细胞至96孔平底板中并过夜培养。(2)次日使用3倍梯度稀释的，浓度范围为0-50mM的候选抗体溶液与NCI-H292细胞进行混合，于37℃，5％CO ₂培养箱孵育30分钟。(3)配制AMP溶液(Sigma，01930)，并将其加入到已与抗体孵育的细胞中，AMP溶液终浓度为2mM，将混合物放入培养箱37℃，5％CO ₂孵育7小时。(4)配制ATP溶液(Sigma，A6419)然后将其与细胞培养上清、CellTiter-Glo底物(Promega，G7572)一起混合，ATP溶液终浓度为200μM，室温振荡孵育10分钟后使用多功能酶标仪(Molecular Divices，SpectraMax i3)读取荧光度值(1000ms)。结果如图3所示。

由上面的实验结果可以得出如下结论：(1)ADI-37505和ADI-37506抗体均可以抑制NIC-H292细胞表面的CD73酶活性。(2)ADI-37505和ADI-37506抑制CD73酶活性的IC50分别为1.47nM和1.27nM，低于对照抗体Medimmune Omab。(3)Medimmune Omab在高浓度也未达到最大酶活性抑制率，而ADI-37505和ADI-37506在高浓度均可完全抑制CD73酶活性。因此ADI-37505和ADI-37506对细胞水平CD73酶活性的抑制能力均高于对照抗体。

2.亲和力优化的抗CD73抗体对可溶性CD73的酶活性抑制

细胞膜表面的CD73分子在磷脂酶的作用下脱离细胞膜，进入细胞间质和血液，成为具有酶活性功能的可溶性CD73分子。基于

发光法测量本发明的示例抗体对溶液中的人CD73的酶活性抑制能力。通过比较不同抗体对AMP降解的抑制曲线来测定其酶活性抑制能力。具体实验过程为：(1)无血清EMEM培养基(ATCC，30-2003)37℃预热，作为本实验中的稀释介质；(2)在一块96孔圆底板中加入50ul CD73蛋白(ACRO，CD3-H52H7)，浓度为2nM；(3)在另一块96孔板中以EMEM稀释抗体溶液，抗体最高终浓度为200nM，3倍逐级稀释(12个梯度)；(4)分别取(3)中的抗体梯度溶液50ul加入到(2)中96孔圆底板各孔中，吹打混匀；37℃培养箱孵育30分钟；(5)在EMEM培养基中加入ATP(Sigma，A6419)和AMP(Sigma，01930)母液，使之浓度为ATP＝600uM，AMP＝2mM，取50ul上述溶液加入到(4)中96孔圆底板各孔中，吹打混匀；(6)37℃培养箱中孵育1小时。(7)在96孔不透明白色培养板中，加入50ul Cell-Titer Glo(Promega，G7572)底物，分别加入50ul(6)中的各个溶液，混匀后室温孵育5分钟，i3多功能酶标仪(Molecular Divices，SpectraMax i3)读取荧光度值(1000ms)。

结果如图4所示：本发明抗CD73抗体可以高效抑制可溶性CD73的酶活性，从而抑制AMP转化为腺苷，ADI-37505和ADI-37506分子在1小时的酶活性抑制IC50分别为0.07184nM和0.08974nM，并且抑制效果具有剂量依赖性。而Medimmune Omab抗体在高浓度时表现出了较差的抑制效果，出现了钩状效应。

实施例4.本发明抗CD73抗体与CHO-S细胞上过表达的人CD73的结合

基于流式细胞术测定法测量本发明的抗体与过表达于CHO-S细胞表面的人CD73的结合能力。通过比较不同抗体与表达于CHO-S细胞表面的人CD73的结合曲线来测定其结合能力。具体实验过程为：(1)按照常规方法复苏并传代进而获得状态良好的CHO-S细胞。(2)使用3倍梯度稀释的，浓度范围为0-400nM的候选抗体与上述CHO-S细胞于4℃孵育30分钟。PBS清洗三次后，使用PE标记的羊抗人IgG的荧光二抗(Southern biotech，2040-09)与之4℃孵育30分钟。PBS再次清洗三次后，使用100ul PBS重悬CHO-S细胞。(3)使用流式细胞仪(BD，Celesta)测定PE荧光通道中位荧光度值。(4)比较其EC50及曲线峰值，结果如图5所示。

由上面的实验结果可以得出如下结论：ADI-37505和ADI-37506抗体与表达于CHO-S细胞表面的人CD73的结合能力相当，其EC50优于Medimmune Omab。

实施例5.本发明抗CD73抗体逆转CD73对T细胞增殖的抑制和抗CD73抗体体外激活T细胞

1. 本发明抗CD73抗体逆转CD73对CD4+T细胞增殖的抑制

CD73抗体分子可以抑制CD73酶活性，阻断AMP转换为具有免疫抑制功能的腺苷，从而逆转腺苷积累造成的T细胞增殖抑制。基于这一原理，本研究在CD4+T细胞培养体系中加入IL-2和CD3/CD28 dynabeads促进T细胞增殖，进一步加入AMP抑制T细胞增殖。在此体系中，可以评价不同CD73抗体分子促进T细胞增殖的活性。具体实验过程为：(1)复苏PBMC细胞并培养过夜，次日使用CD4+T细胞富集试剂盒(stem cell，19052)按照制造商的说明分离纯化获得CD4+T细胞。(2)使用cell-trace far red活细胞染色试剂盒(Thermo，C34564)按照制造商的说明对CD4+T细胞进行标记。(3)将20ng/ml的IL-2(R&D，202-IL-500)和珠∶细胞＝1∶5 CD3/CD28 dynabeads(Gibco，11131D)与标记好的CD4+T细胞进行混匀，再将其转移到96孔圆底板中静置培养1小时。(4)分别将0-20nM梯度稀释的候选抗体分子加入到细胞中，混合孵育30分钟。(5)配制AMP溶液(Sigma，01930)加入到CD4+T细胞中，终浓度为300uM，混匀后放入培养箱培养3天。(6)流式细胞术(BD，Celesta)检测增殖细胞比例。(7)绘制细胞增殖曲线，比较其EC50及曲线峰值。

结果如图6所示：ADI-370503，ADI-37505，ADI-37506，ADI-37513，ADI-37497和ADI-37542均可逆转AMP/腺苷对CD4+T细胞增殖的抑制，其中ADI-37503，ADI-37505和ADI-37506的平台高于对照抗体Omab，EC50也远远低于对照抗体Omab，表明ADI-37503，ADI-37505和ADI-37506活性优于对照抗体Omab。

2. 本发明CD73抗体逆转CD73对CD8+T细胞增殖的抑制

利用本发明的抗体ADI-37505检测CD73分子在CD8+T细胞表面的表达情况。具体实验过程为：(1)按照常规方法复苏人外周血单核细胞。(2)使用20nM的ADI-37505抗体和CD3(Biolegend)、CD8(Biolegend)抗体与外周血单核细胞于4℃孵育30分钟。PBS清洗三次后，使用PE标记的羊抗人IgG的荧光二抗(Southern biotech)与之4℃孵育30分钟。PBS再清洗三次后，使用100ul PBS重悬人外周血单核细胞。(3)使用流式细胞仪(BD)检测。结果如图7所示，在所检测人外周血单核细胞CD8+T细胞群体，49.5％的CD8+T细胞表面表达CD73分子。

CD73抗体可以抑制CD73酶活性，阻断AMP转换为具有免疫抑制功能的腺苷，从而逆转腺苷积累造成的T细胞增殖抑制。基于这一原理，本研究在CD8+T细胞(5×10 ⁴/well)培养体系中加入20ng/ml IL-2和1×10 ⁴CD3/CD28 dynabeads：cells促进CD8+T细胞增殖，进一步加入1000μM AMP抑制T细胞增殖。在此体系中，可以评价不同CD73抗体分子促进T细胞增殖的活性。具体实验过程为：(1)按照常规方法复苏PBMC细胞并过夜培养，次日使用CD8+T细胞富集试剂盒(stem cell，19053)按照制造商的说明分离纯化获得CD8+T细胞。(2)使用cell-trace far red活细胞染色试剂盒(Thermo)按照制造商的说明对CD8+T细胞进行标记。(3)将20ng/ml的IL-2(R&D，202-IL-500)和磁珠∶细胞＝1∶5 CD3/CD28 dynabeads(Gibco，11131D)与标记好的CD8+T细胞进行混匀，再将其转移到96孔圆底板中静置培养1小时。(4)分别将0-100nM梯度稀释的候选抗体分子加入到细胞中，混合孵育30分钟。(5)配制AMP溶液(Sigma，01930)加入到CD8+T细胞中，终浓度为1000μM，混匀后放入培养箱培养3天。(6)流式细胞术(BD，Celesta)检测增殖细胞比例。(7)绘制细胞增殖曲线，比较各个抗体的EC50及曲线峰值。

结果如图8所示。本发明抗体ADI-37505、ADI-37506及对照抗体Medimmune Omab均可逆转AMP/腺苷对CD8+T细胞增殖的抑制。本发明抗体促进CD8+T细胞增殖的EC50低于对照抗体Omab，并且ADI-37505、ADI-37506处理组细胞最大增殖比例高于对照抗体Omab。因此，ADI-37505、ADI-37506抗体促进CD8+T细胞增殖活性优于对照抗体Omab，其中阳性对照为CD3/CD28+IL2，阴性对照为CD3/CD28+IL2+AMP。

3. 本发明抗CD73抗体对T细胞的激活作用

检测了本发明抗体ADI-37505、ADI-37506对人T细胞的体外激活作用，详细实验过程如下：按照常规方法复苏成熟树突状细胞(moDC，Allcells)，将其与另一供者来源的外周血单核细胞进行混合(moDC∶PBMC＝1∶10)；随即加入不同梯度浓度抗CD73抗体(浓度如图9所示)，再向培养体系中加入终浓度为2000μM的AMP(Sigma，01930)，混合细胞培养4天后，使用细胞因子检测试剂盒TNF-α(Cisbio，62HTNFAPEG)、IFN-γ(Cisbio，62HIFNGPEG)和IL-2(Cisbio，62HIL02PEG)测定细胞培养上清中细胞因子的分泌量，根据细胞因子表达量评估T细胞激活程度。

结果如图9所示，成熟的DC细胞与PBMC细胞共同孵育，能够使T细胞活化，分泌TNF-α(图9a)，IFN-γ，(图9b)，和IL-2(图9c)细胞因子。当体系中加入AMP，在CD73的作用下，生成的腺苷抑制T细胞的活性。本发明抗体ADI-37505和ADI-37506在不同浓度下均能够解除腺苷的抑制作用，使T细胞活化，分泌细胞因子。对照抗体Medimmune Omab不同浓度激活T细胞的效果均差于本发明抗体。

实施例6.本发明抗CD73抗体和抗PD-1抗体联用对抗原特异性T细胞的激活作用

本发明使用抗原特异性T细胞召回的方法评估ADI-37505与抗PD-1抗体(信迪利，信达)联用对人记忆T细胞的激活作用，详细实验过程如下：按照常规方法复苏感染过腮腺炎或接种过腮腺炎疫苗的供者来源的外周血单核细胞；随即加入不同浓度(起始浓度10nM，三倍梯度稀释)的抗CD73抗体和终浓度为10nM的抗PD-1抗体信迪利，再向培养体系中加入终浓度为1000μM的AMP(Sigma，01930)和2μg/Ml的Mumps(NOVUS，NBP2-62509)，混匀后培养5天，使用细胞因子检测试剂盒IFN-γ(Cisbio，62HIFNGPEG)测定细胞培养上清中细胞因子的分泌量，根据细胞因子表达量评估T细胞激活程度。

结果如图10所示，PBMC与Mumps共同孵育，能够使T细胞活化，分泌IFN-γ细胞因子。当体系中加入AMP，在CD73的作用下，生成的腺苷抑制T细胞的活性。本发明抗体ADI-37505在不同浓度下均能够解除腺苷对T细胞激活的抑制作用，使T细胞活化，分泌细胞因子；与抗PD-1抗体联用，可进一步增强T细胞活化。

实施例7.本发明抗CD73抗体的抗肿瘤活性

本实验采用MDA-MB-231细胞(ATCC，HTB-26)接种NOG小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)测定本发明的抗CD73抗体的抗肿瘤作用。

细胞：

按照常规方法，复苏外周血单核细胞，计数，离心收集细胞，用PBS将细胞稀释至1×10 ⁷个/ml，每只小鼠静脉接种0.2ml PBMC悬液，即2×10 ⁶个细胞/只小鼠。

将MDA-MB-231细胞进行常规传代培养。接种外周血单核细胞5天后，胰酶消化并离心收集MDA-MB-231细胞，以PBS+Matrigel(CORNING，356231)(1∶1)分散细胞至浓度为2.5×10 ⁷个/ml，每只小鼠皮下接种0.2ml MDA-MB-231细胞悬液(即5×10 ⁶/只小鼠)至NOG小鼠右侧腹部区域中。

给药：

肿瘤细胞接种第1天后随机分组(每组7只小鼠)，分别在接种后第1、8、12、15、19天给药(所采用的抗体、阳性对照抗体、阴性对照抗体以及给药浓度参见表4)，每周2次监测小鼠瘤体积与体重。监测至29天后结束。接种后第29天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：

TGI％＝100％(h-IgG对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积)/(h-IgG对照组肿瘤体积-h-IgG对照组初始肿瘤体积)。

肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W ²/2。采用电子天平测定体重。在整个研究期间，当小鼠体重下降＞20％时，对小鼠实施安乐死。

统计结果与分析：

肿瘤抑制率结果如图11和表4所示：在第29天统计肿瘤大小，并计算出肿瘤抑制率。与h-IgG对比，对照抗体Medimmune Omab、ADI-37505和ADI-37506的肿瘤抑制率分别为45％、76％和46％。ADI-37505抗体的肿瘤抑制效果明显优于对照抗体。同时对小鼠体重进行检测，结果如图12所示，在给药的小鼠组中，均没有发现体重明显减轻的现象。

表4.接种第29天肿瘤抑制率

实施例8.本发明抗CD73抗体与抗PD-1抗体联用在A375荷瘤人源化小鼠模型体内的抗肿瘤药效

根据常规方法，复苏外周血单个核细胞，计数，离心收集细胞，用PBS将细胞稀释至1×10 ⁷个/ml，每只小鼠静脉接种0.2ml PBMC悬液，既2×10 ⁶/只小鼠。

将A375人恶性黑色素瘤细胞(ATCC，CRL-1619 ^TM)进行常规传代培养。接种外周血单个核细胞5天后，胰酶消化并离心收集A375细胞，以PBS分散细胞至3×10 ⁷个/ml，每只小鼠皮下接种0.2ml A375细胞悬液(即6×10 ⁶/只小鼠)至NOG小鼠右侧腹部区域中。

给药：

黑色素肿瘤细胞接种第1天后随机分组(每组8只小鼠)，分别在接种后第1、4、8、11天给药(所采用的抗体、阳性对照抗体、阴性对照抗体以及给药浓度参见表5)，每周2次监测小鼠瘤体积与体重。监测至25天后结束。接种后第25天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：

TGI％＝100％×(hIgG对照组肿瘤体积治疗组肿瘤体积)/(h-IgG对照组肿瘤体积-h-IgG对照组初始肿瘤体积)。

统计结果与分析：

肿瘤抑制率结果如图13和表5所示：在第25天统计肿瘤大小，并计算出肿瘤抑制率。与h-IgG对比，10mg/kg Omab对照抗体没有显示对A375的抗肿瘤药效；ADI-37505治疗组的肿瘤抑制率为33％；信迪利的肿瘤抑制率为15％；ADI-37505和PD-1抗体(信迪利)联合用药的肿瘤抑制率为61％，明显优于单药。同时对小鼠体重进行检测，结果如图14所示，在给药的小鼠组中，体重无明显变化。

表5.接种后第25天肿瘤抑制率

实施例9.本发明抗CD73抗体与人CD73分子结合位点研究

与对照抗体相比，本发明CD73抗体表现出了较好的体外功能，推测本发明CD73抗体与CD73分子可能具有独特的结合位点。Fortebio结果显示本发明CD73抗体(ADI-37505和ADI-37506)，Innate 6E1，BMS 4-2，Surface和Omab结合CD73分子同一bin，而CPI-006和Imab hu101-28分别结合不同的bin(表5)。本研究进一步检测了不同CD73抗体与过表达CD73 N端(27到317位氨基酸)及CD73 C端(337到549位氨基酸)的CHO-S细胞的结合情况。

基于流式细胞术测定法测量本发明示例抗体与表达于GS-CHO细胞表面的人CD73N端或C端结构域的结合能力。具体实验过程为：(1)构建表达CD73 N端(27到317位氨基酸)及CD73 C端(337到549位氨基酸)的pLVX-IRES-puro-human-CD质粒(苏州泓迅生物科技股份有限公司)，瞬时转染GS CHO细胞；(2)48h后，使用不同浓度的ADI-37505、ADI-37506、对照抗体与瞬时转染的细胞于4℃孵育30分钟。(3)PBS(Gibco，10010-023)清洗三次后，使用PE标记的羊抗人二抗(SouthernBiotech，2040-09)与之4℃孵育30分钟。PBS再次清洗三次后，使用100ul PBS重悬细胞。(4)使用流式细胞仪(BD，Celesta)测定PE通道平均荧光度值。以抗体浓度的Log ₁₀对数为横坐标，以PE通道平均荧光度值为纵坐标作图，比较其EC50及曲线峰值。

结果如图15所示，本发明CD73抗体(ADI-37505和ADI-37506)，Innate 6E1，BMS 4-2，Surface，Omab和CPI-006与CD73分子的N端结合，而Imab hu101-28与CD73分子的C端结合。

根据这一结果，本研究构建了25个CD73分子N端突变体(表6)，进一步确认哪些氨基酸突变可以影响CD73抗体与CD73分子的结合。具体实验过程为：(1)构建了如表6所示CD73分子N末端特定位点氨基酸突变的pLVX-IRES-puro-human-CD质粒，瞬时转染GS-CHO细胞；(2)48h后，使用不同浓度的候选抗体与瞬时转染的细胞于4℃孵育30分钟。(3)PBS(Gibco，10010-023)清洗三次后，使用PE标记的羊抗人二抗(SouthernBiotech，2040-09)4℃孵育30分钟。PBS再次清洗三次后，使用100μl PBS重悬细胞。(4)使用流式细胞仪测定PE通道平均荧光度值。以抗体浓度的Log ₁₀对数为横坐标，以PE通道平均荧光度值为纵坐标作图，比较其EC50及曲线峰值。

表6.CD73分子N端突变体

	CD73突变体
1	K145A/K147A
2	S152A/Q153A
3	Y161A/K162A/V170A
4	K179A/E180A
5	F183A/L184A/N186A
6	E194A/E196A
7	Q201A/E203A
8	K206A/N211A
9	E224A/K227A
10	K232A/R234A
11	K291A/E293A
12	E296A/R297A
13	K136A/Y161A/K162A/V170A
14	V163K
15	V170K
16	L159A/Y161A/K162A/V170A
17	L159E
18	L210F
19	L157A/S155A/L159A
20	L157A/S155A/L159A/Q153A

21	R109A/K136A
22	R109A/K136A/E134A
23	F65A/H103A
24	H103A/W327A
25	F265A/H304A

检测结果如图16所示：具有V163K、V170K和L159A/Y161A/K162A/V170A突变的CD73分子与本发明抗体ADI-37505和ADI-37506具有减弱的结合能力，而其他22个突变体与本发明抗体正常结合，因此推测ADI-37505和ADI-37506与CD73的结合表位位于CD73分子的第159、161、162、163、170位氨基酸。

如表7所示，Innate 6E1，BMS 4-2，Surface，Omab，CPI-006分别与对应的CD73分子的突变体具有减弱的结合能力，而这些突变体与本发明CD73抗体分子正常结合，因此推测本发明CD73抗体与CD73的结合表位与Innate 6E1，BMS 4-2，Surface，Omab和CPI-006不完全相同。

表7.本发明抗体及对照抗体与人CD73分子结合差异分析

Claims

一种抗CD73抗体或其抗原结合片段，其包含

(i)如SEQ ID NO：55所示的重链可变区的3个互补决定区HCDR，以及如SEQ ID NO：91所示的轻链可变区的3个互补决定区LCDR，或者

(ii)如SEQ ID NO：56、57或58所示的重链可变区的3个互补决定区HCDR，以及如SEQ ID NO：92所示的轻链可变区的3个互补决定区LCDR，或者

(iii)如SEQ ID NO：59-64中任一项所示的重链可变区的3个互补决定区HCDR，以及如SEQ ID NO：93所示的轻链可变区的3个互补决定区LCDR，或者

(iv)如SEQ ID NO：65、66或67所示的重链可变区的3个互补决定区HCDR，以及如SEQ ID NO：94所示的轻链可变区的3个互补决定区LCDR，或者

(v)如SEQ ID NO：68所示的重链可变区的3个互补决定区HCDR，以及如SEQ ID NO：95所示的轻链可变区的3个互补决定区LCDR，或者

(vi)如SEQ ID NO：69所示的重链可变区的3个互补决定区HCDR，以及如SEQ ID NO：96所示的轻链可变区的3个互补决定区LCDR，或者

(vii)如SEQ ID NO：70、71或72所示的重链可变区的3个互补决定区HCDR，以及如SEQ ID NO：97所示的轻链可变区的3个互补决定区LCDR。
一种抗CD73抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区的3个互补决定区HCDR，以及轻链可变区的3个互补决定区LCDR，其中HCDR1包含SEQ ID NO：1-15、132-133或136-149中任一项所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，HCDR2包含SEQ ID NO：16-30、134或135中任一项所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，HCDR3包含SEQ ID NO：31-37或150-156中任一项所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，LCDR1包含SEQ ID NO：38-43中任一项所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，LCDR2包含SEQ ID NO：44-48中任一项所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，LCDR3包含SEQ ID NO：49-54中任一项所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
一种抗CD73抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，其中

所述重链可变区包含：

(i)表B所列任一抗体的VH中所含的三个互补决定区域(HCDR)；或

(ii)表A或表D所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的组合；

和/或

所述轻链可变区包含：

(i)表B所列任一抗体的VL中所含的三个互补决定区域(LCDR)；

(ii)表A或表D所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的组合。
权利要求1-3中任一项所述的抗CD73抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区VH和/或轻链可变区VL，其中，

(a)重链可变区VH

(i)包含与SEQ ID NO：55-72中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或者

(ii)包含SEQ ID NO：55-72中任一项所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：55-72中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换、插入或缺失，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中；

和/或

(b)轻链可变区VL

(i)包含与SEQ ID NO：91-97中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii)包含与SEQ ID NO：91-97中任一项所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：91-97中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换、插入或缺失，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
权利要求1-4中任一项所述的抗CD73抗体或其抗原结合片段，其包含

(i)包含与SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区或由所述氨基酸序列组成，和/或包含与SEQ ID NO：91所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区或由所述氨基酸序列组成，或者

(ii)包含与SEQ ID NO：56、57或58所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区或由所述氨基酸序列组成，和/或包含与SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区或由所述氨基酸序列组成，或者

(iii)如SEQ ID NO：59-64中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区或由所述氨基酸序列组成，和/或包含与SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区或由所述氨基酸序列组成，或者

(iv)如SEQ ID NO：65、66或67所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区或由所述氨基酸序列组成，和/或包含与SEQ ID NO：94所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区或由所述氨基酸序列组成，或者

(iv)如SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区或由所述氨基酸序列组成，和/或包含与SEQ ID NO：95所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区或由所述氨基酸序列组成，或者

(iv)如SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区或由所述氨基酸序列组成，和/或包含与SEQ ID NO：96所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区或由所述氨基酸序列组成，或者

(iv)如SEQ ID NO：70、71或72所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区或由所述氨基酸序列组成，和/或包含与SEQ ID NO：97所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区或由所述氨基酸序列组成。
权利要求1-5中任一项所述的分离的抗CD73抗体或其抗原结合片段，其包含重链和/或轻链，其中，

(a)重链

(i)包含与SEQ ID NO：106-123中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且包含所述序列相应CDR序列的氨基酸序列；

(ii)包含SEQ ID NO：106-123中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：106-123中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在重链的CDR区中，更优选地，所述氨基酸改变不发生在重链可变区中；

和/或

(b)轻链

(i)包含与SEQ ID NO：124-130中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且包含所述序列相应CDR序列的氨基酸序列；

(ii)包含SEQ ID NO：124-130中任一项所示的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：124-130中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在轻链的CDR区中，更优选地，所述氨基酸改变不发生在轻链可变区中。
权利要求1-6中任一项所述的抗CD73抗体或其抗原结合片段，其包含：

(i)包含与SEQ ID NO：106所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链或由所述氨基酸序列组成，和/或包含与SEQ ID NO：124所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链或由所述氨基酸序列组成，或者

(ii)包含与SEQ ID NO：107-109中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链或由所述氨基酸序列组成，和/或包含与SEQ ID NO：125所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链或由所述氨基酸序列组成，或者

(iii)包含与SEQ ID NO：110-115中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链或由所述氨基酸序列组成，和/或包含与SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链或由所述氨基酸序列组成，或者

(iv)包含与SEQ ID NO：116-118所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链或由所述氨基酸序列组成，和/或包含与SEQ ID NO：127所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链或由所述氨基酸序列组成

(v)包含与SEQ ID NO：119所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链或由所述氨基酸序列组成，和/或包含与SEQ ID NO：128所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链或由所述氨基酸序列组成，或者

(vi)包含与SEQ ID NO：120所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链或由所述氨基酸序列组成，和/或包含与SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链或由所述氨基酸序列组成，或者

(vii)包含与SEQ ID NO：121-123中任一项所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链或由所述氨基酸序列组成，和/或包含与SEQ ID NO：130所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链或由所述氨基酸序列组成。
权利要求1至7中任一项的抗CD73抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源化抗体或人抗体。
权利要求1至8中任一项的抗CD73抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)或(Fab’)2、单结构域抗体、双抗体(dAb)、骆驼科抗体(重链抗体)或线性抗体。
权利要求1至9中任一项的抗CD73抗体或其抗原结合片段，其包含框架序列，其中框架序列的至少一部分是人共有框架序列。
抗CD73抗体或其抗原结合片段，其与权利要求1至10中任一项所述的抗体竞争结合CD73，或者拮抗、阻断权利要求1至10中任一项所述的抗体与CD73结合。
权利要求1至10中任一项的抗CD73抗体或其抗原结合片段，其具有以下一个或多个特性：

(1)以高亲和力结合CD73(例如人CD73)，例如，以以下平衡解离常数(KD)与CD73结合，所述KD小于大约100nM；

(2)阻断可溶性的CD73的酶活性；

(3)逆转AMP-腺苷对CD4+T细胞增殖的抑制；

(4)逆转AMP-腺苷对CD8+T细胞增殖的抑制；

(5)逆转AMP-腺苷对T细胞活性的抑制。
一种核酸，其编码权利要求1至12中任一项的抗CD73抗体或其抗原结合片段。
包含权利要求13的核酸的载体，优选地所述载体是表达载体。
包含权利要求14的载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞；更优选所述宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞，优选CHO细胞和293细胞。
制备抗CD73抗体或其抗原结合片段的方法，包括在适于表达编码权利要求1至12中任一项的抗CD73抗体或其抗原结合片段的核酸的条件下培养权利要求15的宿主细胞，任选地分离所述抗体或其抗原结合片段，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗CD73抗体或其抗原结合片段。
由权利要求16所述的方法制备的抗CD73抗体或其抗原结合片段。
药物组合物，其包含权利要求1至12和17中任一项的抗CD73抗体或其抗原结合片段，以及任选地药用载体。
免疫缀合物，其包含根据权利要求1至12和17中任一项的抗CD73抗体或其抗原结合片段。
药物组合，其包含权利要求1-12和17中任一项所述的抗CD73抗体或其抗原结合片段与抗PD1抗体，优选所述抗PD1抗体为信迪利单抗。
权利要求1-12和17中任一项所述的抗CD73抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗癌症或者肿瘤的药物中的用途。
权利要求20的药物组合在制备用于治疗癌症或者肿瘤的药物中的用途。
权利要求21-22的用途，其中所述癌症或者肿瘤是乳腺癌，肺癌，黑色素瘤。
权利要求1-12和17中任一项所述的抗CD73抗体或其抗原结合片段或权利要求20的药物组合在制备用于逆转CD73对T细胞增殖抑制的药物中的用途。
权利要求24所述的用途，其中所述T细胞是CD4+T细胞，CD8+T细胞。
权利要求1-12和17中任一项所述的抗CD73抗体或其抗原结合片段或权利要求20的药物组合在制备激活T细胞活性的药物中的用途。
CD73与抗体结合的表位，其包含SEQ ID NO：131所示的第159-170位氨基酸的片段，优选地，所示表位包含SEQ ID NO：131所示的第159、161、162、163、170位氨基酸。
预防和/或治疗CD73相关疾病或病症例如癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据权利要求1-12和17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求18所述的药物组合物或根据权利要求19所述的免疫缀合物或根据权利要求20所述的药物组合。
检测样品中CD73的方法，所述方法包括

(a)将样品与根据权利要求1-12和17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；以及

(b)检测抗体或其抗原结合片段与CD73间的复合物的形成；任选地，抗体是被可检测地标记的。