WO2022013404A1 - Procede d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges - Google Patents

Procede d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges Download PDF

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Vincent DANI
Louis Casteilla
Alain Pierre Louis DOGLIO
Philippe LETERTRE
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Etablissement Francais du Sang
Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Centre Hospitalier Universitaire de Nice
Universite de Toulouse
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Etablissement Francais du Sang
Universite Toulouse III Paul Sabatier
Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Centre Hospitalier Universitaire de Nice
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Definitions

  • the present invention relates to a process for the in vitro or ex vivo amplification of stem cells of brown or beige adipocytes from human adipose tissue. It also relates to a process for the in vitro or ex vivo amplification of stem cells of brown or beige adipocytes, an extracellular matrix, a composition comprising a mixture of an extracellular matrix and of a stroma-vascular fraction, a kit comprising this composition, a use of the extracellular matrix or of the composition comprising a mixture of the extracellular matrix and the stroma-vascular fraction, stem cells of brown or beige adipocytes and brown or beige adipocytes, obtained according to the method of invention for their use.
  • Cellular therapy consists of a transplant of cells aimed at restoring the functions of a tissue or an organ when they are altered by an accident, a pathology, aging and metabolic disorders. It allows long-term treatment of a patient thanks to an injection of so-called “therapeutic” cells. These cells are obtained, in particular, from multipotent stem cells originating from the patient himself. It has been contemplated to improve a patient's metabolic flexibility and/or stimulate energy expenditure by increasing the mass of brown/tan adipose tissue (BAT) in that patient. This is an innovative track intended to fight against metabolic diseases, such as diabetes, cardiovascular diseases and other metabolic dysfunctions.
  • metabolic diseases such as diabetes, cardiovascular diseases and other metabolic dysfunctions.
  • brown or beige adipose tissue participates in the body's heat dissipation, in the control of redox metabolism and it plays an endocrine and paracrine regulatory role through the secretion of hormones. Restoring the so-called “TAB” function in these patients therefore represents an attractive therapeutic option.
  • brown or beige adipose tissue do not exist in practice, for one main reason which is the virtual absence of a source of brown adipocytes in adult patients, more particularly in patients obese, for ex vivo amplification. Indeed, unlike the white adipose tissue present in abundance and especially in obese patients, brown or beige adipose tissue is particularly rare in adult men and even almost non-existent in obese patients, for whom this virtual non-existence constitutes an aggravating factor, if not a major causative factor, of metabolic disorders, in particular, but not exclusively, linked to overweight.
  • the standard procedure for isolating and amplifying adipocyte precursors from adipose tissue samples involves enzymatic dissociation followed by their two-dimensional (2D) expansion by attachment to plastic culture dishes.
  • This procedure is expensive, long, and requires many manipulations which increase the risk of contamination.
  • it causes destruction of the three-dimensional structure of the tissue, as well as the loss of cell types of interest such as endothelial cells which play an essential role both for the vascularization of the graft and the physiology of the adipocyte.
  • the non-enzymatic dissociation of adipose tissue appears to be a much less expensive, faster alternative method which has undeniable advantages for the manufacture of a product that complies with the standards of therapeutic grade production (reduced exposure to products or contaminants outside).
  • the non-enzymatic dissociation methods presented to date are not satisfactory because several studies report that the number of adipocyte precursors obtained is low compared to enzymatic dissociation.
  • the mature adipocytes, the extracellular matrix as well as the three-dimensional structure of the adipose tissue are always lost at the end of the dissociation process, as well as the endothelial cells, after culture.
  • adipocytes have been proposed for inoculating the precursors of adipocytes therein and thus trying to reconstitute the structure of the adipose tissue as well as possible. These matrices would also be used to orient adipocyte precursors in vitro towards a non-adipose cell type, essentially bone or cartilaginous, before implantation.
  • Decellularized adipose tissue has also been proposed to increase precursor differentiation and better mimic adipose tissue structure. The manufacture of these types of matrices requires many steps involving enzymatic reactions or long chemical treatments. Moreover, decellularized tissue, by definition, loses these endogenous cells.
  • Non-decellularized adipose tissue enriched in adipocyte precursors (previously isolated by enzymatic dissociation) followed by 2D amplification has recently been proposed as a matrix for better bone reconstruction.
  • the time to generate this biological matrix is long, requires three weeks of in vitro culture, and does not allow the amplification of adipocyte precursors. Only the interest for bone repair was highlighted by the authors.
  • Three-dimensional (3D) suspension culture represents an alternative method of choice to the standard 2D method because it essentially allows the structure and intrinsic qualities of the tissue to be preserved. This advantage is important because, for example, the absence of a relevant human model, which best mimics adipose tissue in vitro, is a major limitation during preclinical phase trials, for the discovery of new effective drugs to fight against obesity and associated metabolic diseases such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
  • 3D culture can be carried out in a closed system, which reduces handling and the risk of contamination.
  • a technical problem which the invention proposes to solve is to obtain in vitro or ex vivo a large quantity of stem cells, in particular brown or beige adipocytes, from human white adipose tissue, of grade therapeutic.
  • the solution of the invention to this technical problem has as its first object, a process for the in vitro or ex vivo amplification of stem cells of brown or beige adipocytes of human adipose tissue, comprising the following steps: extraction, on the one hand , of a stroma-vascular fraction of human adipose tissue comprising endothelial cells of the vascular network of human adipose tissue and stem cells of human adipose tissue and, on the other hand, of an extracellular matrix of said human adipose tissue, said extracellular matrix comprising endothelial cells of the vasculature of human adipose tissue, human adipose tissue stem cells and collagen, the extraction of said extracellular matrix comprising a step of mechanical dissociation; mixing said stromal-vascular fraction and said extracellular matrix; and culture of the mixture obtained in the preceding step, in suspension, in a cell proliferation medium.
  • the suspension culture of the stroma-vascular fraction made possible thanks to the presence of the extracellular matrix, allows 3D amplification, giving access to a large number of cells in a native adipose tissue environment and thus limiting manipulations. which increase the risk of contamination.
  • the mechanical dissociation step is a dissociation step which does not involve collagenase;
  • the mechanical dissociation step is a non-enzymatic dissociation step;
  • the extraction of the stroma-vascular fraction and the extracellular matrix comprises the following steps: centrifugation of human adipose tissue to obtain at least two distinct fractions, a fraction A comprising a centrifuged extracellular matrix, and the mechanical stroma-vascular fraction; and mechanical dissociation of fraction A to obtain the extracellular matrix;
  • the method further comprises a step of eliminating the blood cells present in the stroma-vascular fraction;
  • the collagen of the extracellular matrix is structured collagen, which has a fibrillar organization;
  • - the culture of the mixture of said stroma-vascular fraction and of said extracellular matrix comprises the following steps: transfer of said mixture in a sterile manner into a culture bag in suspension comprising the proliferation medium; amplification of said mixture to obtain an amplified mixture comprising cell clusters; - the amplified mixture
  • the invention relates to a process for obtaining in vitro or ex vivo brown or beige adipocytes comprising the following steps: extraction, on the one hand, of a stroma-vascular fraction of a human adipose tissue comprising, endothelial cells of the vascular network of human adipose tissue and stem cells of human adipose tissue and, on the other hand, of an extracellular matrix of said human adipose tissue, said extracellular matrix comprising endothelial cells of the vascular network of adipose tissue human, human adipose tissue stem cells and collagen, the extraction of said extracellular matrix comprising a step of mechanical dissociation; mixing said stromal-vascular fraction and said extracellular matrix; culture of the mixture obtained in the preceding step, in suspension, in a cell proliferation medium; and inducing adipose tissue stem cell differentiation to brown or beige adipocytes.
  • - the differentiation of the adipose tissue stem cells is induced in a differentiation medium;
  • the mechanical dissociation step is a dissociation step which does not involve collagenase;
  • the mechanical dissociation step is a non-enzymatic dissociation step;
  • extraction of the stroma-vascular fraction and the matrix extracellular comprises the following steps: centrifugation of human adipose tissue to obtain at least two distinct fractions, a fraction A comprising a centrifuged extracellular matrix, and the mechanical stroma-vascular fraction; and mechanical dissociation of fraction A to obtain the extracellular matrix;
  • the method further comprises a step of eliminating the blood cells present in the stroma-vascular fraction;
  • the collagen of the extracellular matrix is structured collagen, which has a fibrillar organization;
  • - the culture of the mixture of said mechanical stroma-vascular fraction and of said extracellular matrix comprises the following steps: transfer of said mixture in a sterile manner into a culture bag in suspension comprising the proliferation medium; a
  • the invention relates to an isolated extracellular matrix capable of being obtained according to the method defined above, comprising endothelial cells of the vascular network of human adipose tissue, stem cells of brown or beige adipocytes of adipose tissue human and collagen.
  • the invention relates to a composition comprising a mixture of the extracellular matrix as above and of a stroma-vascular fraction comprising endothelial cells of the vascular network of adipose tissue and stem cells from human adipose tissue.
  • the invention relates to a kit comprising the composition as defined above, a cell proliferation medium and a differentiation medium.
  • the invention relates to the use of the extracellular matrix as defined above or of the composition as defined above for the screening and/or the characterization of pharmacological active agents.
  • the invention relates to brown or beige adipocytes derived from a composition as above, for their use in cell therapy, or for the treatment of metabolic disorders.
  • the invention relates to brown or beige adipocytes derived from a composition as above, for the treatment of obesity.
  • the invention relates to a differentiation medium for the differentiation of stem cells of brown or beige adipocytes into brown or beige adipocytes, comprising a cell growth medium cells supplemented with serum, growth factors, rosiglitazone and SB431542 and, preferably, fetal calf serum, fibroblast growth factors, insulin-like growth factors, endothelial growth factors vascular, ascorbic acid, rosiglitazone, T3, insulin, and SB431542.
  • FIG. 1A schematically represents the necessary and sufficient steps for the extraction of an extracellular matrix and a stroma-vascular fraction (steps 1 to 3), and their coculture (step 4), according to the invention
  • FIG. 1B is a more detailed schematic representation of the method which allows the sequential extraction of extracellular matrices (M1-M4) and cell populations (C1-C3) from the stroma-vascular fraction (steps 1 to 5), and placing them in coculture (step 6), according to the invention;
  • IC is an illustration of products according to the invention, namely the product called ExAdEx-tissue, which is derived from the amplification of the mixture of the stroma-vascular fraction and the extracellular matrix, and the product called ExAdEx- lobules, which arises from the formation of aggregates, in accordance with an additional step of the process according to the invention;
  • FIG. 1D illustrates the steps for obtaining the product ExAdEx-lobules from the product ExAdEx-tissue according to the method of the invention
  • FIG. 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 21, 2J and 2K are graphs which compare, respectively, the quantities expressed, in quantitative PCR, of the following genes listed below in the products ExAdEx-lobules and ExAdeX-tissue: FABP4, PLIN1, Adiponectin, CD31, DPP4, ICAM1, PDGFRa, Inhibin beta A, MSCA1, ILlb (macrophages M1), MRC1 (macrophages M2);
  • FIGS. 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G and 3H are photographs, obtained by confocal imaging, of the ExAdEx-lobule products, highlighting, by immuno-fluorescent labeling, in said products, respectively the collagen I, collagen IV, fibronectin, laminin, elastin, DPP4, ICAM1 and CD31;
  • FIG. 4A, 4B and 4C are representative figures of the presence, respectively, of the hypoxia marker CA9, in human adipocyte stem cells for five different proliferation media tested according to the method of the invention and PLIN1 and UCP1 in the stem cells differentiated, for five different proliferation media enriched in differentiation factors tested according to the method of the invention
  • FIG. 5A, 5B and 5C are optical microscopy images which show, respectively, that the differentiation medium allows differentiation into adipocytes ( Figure 5A), that it is toxic for endothelial cells in the presence of dexamethasone and l IBMX (FIG. 5B), but it is not, when these compounds are removed from said medium (FIG. 5C);
  • FIGS. 6A and 6B are figures which illustrate the expression of PLIN1 and UCP1 in different differentiation media according to the invention.
  • Figures 7A, 7B and 7C present fluorescence microscopy images which make it possible to visualize endothelial cells and different populations of adipose tissue stem cells according to the presence of the marker CD31 (Figure 7A), DPP4 ( Figure 7B) and ICAMI( 7C) in adipose tissue before implementing the method according to the invention (photographs on the left), after 20 days in the proliferation medium (photographs in the center) and after 20 days in the proliferation medium then 20 days in the differentiation medium, except for ICAM1 (photographs on the right, except for ICAM1);
  • FIGS. 8A and 8B show fluorescence microscopy images with labeling, by antibodies coupled to fluorochromes, of the DPP4 and ICAM1 proteins in the stroma-vascular fractions and the extracellular matrix forming the so-called "Endostem” fraction in these figures, before mixing according to the process according to the invention;
  • FIG. 9A shows, by fluorescence microscopy, that the matrix M2 is of the type rich in collagen; collagen stained with PicroSirius Red (light gray) and nucleus staining (white);
  • FIG. 9B shows, by fluorescence microscopy, that the matrix M3 is of the fibrous type; collagen labeled with PicroSirius Red (light gray and white fibers) and labeling of the nuclei (white);
  • FIG. 9D shows, by microscopy, that the matrix M2 is heterogeneous in terms of matrix types: fibrous type and collagen-rich type;
  • FIG. 9E is a microscopy image illustrating the fibrous type of the matrix M3;
  • FIG. 10A is a photograph of the centrifuged adipose tissue of fraction A after mechanical dissociation containing the M4 matrix;
  • FIG. 10B highlights by fluorescence microscopy, in the M4 matrix, mature adipocytes by Oil Red O staining (light gray) and a matrix rich in collagen by labeling of type I collagen (very light gray);
  • FIG. 10C shows, by CD31 immunostaining, the capillary structures formed by CD31+ endothelial cells (white) in the M4 matrix; marking of nuclei (dark grey);
  • FIG. 10D illustrates the presence of the PDGFRa+ adipose tissue stem cell network (light gray dots) in the M4 matrix; marking of nuclei (dark grey);
  • FIG 11 shows, by incorporation of Edu, 5-ethylnyl-2'-deoxyuridine, in the nucleus of proliferating cells, that the endogenous cells, in the extracellular matrix of the invention are maintained in proliferation in the EGM+ medium TM suspended; nuclei (dark gray), proliferating cells (white) matrix autofluorescence (light gray);
  • FIG. 12 shows that exogenous adipose tissue stem cells, placed in coculture with the extracellular matrix of the invention, form structures composed of these adipose tissue stem cells and endogenous cells present in the matrix; image taken after 3 days of co-culture, nuclei (dark grey), collagen (light grey), exogenous stem cells from adipose tissue (light grey/white);
  • FIG. 13A shows the absence of cell proliferation during cell culture of adipose tissue stem cells and endothelial cells in suspension without extracellular matrix, from the stromal vascular fraction; image taken after 10 days of co-culture; nuclei (dark gray), proliferating cell nuclei (very light gray);
  • FIG. 13B demonstrates a capacity for proliferation of the cells of the stroma-vascular fraction, in suspension, with the extracellular matrix of the invention; image taken after 10 days of co-culture; nuclei (dark grey), collagen matrix (light grey), proliferating cell nuclei by Edu labeling (white);
  • FIG. 14A shows the level of expression of the endothelial cell marker CD31 in differentiated cell populations obtained by culture, in suspension, with (right) and without (left) the extracellular matrix of the invention
  • FIG. 14B shows the level of expression of the adipocyte stem cell marker PDGFRa in the differentiated cell populations obtained by culture, in suspension, with (right) and without (left) the extracellular matrix of the invention
  • FIG. 14C shows the level of expression of the marker of mature adipocytes PLIN1 in the differentiated cell populations obtained by culture, in suspension, with (right) and without (left) the extracellular matrix of the invention;
  • FIG. 14D shows the level of expression of the mature adipocyte marker Adiponectin in the differentiated cell populations obtained by culture, in suspension, with (right) and without (left) the extracellular matrix of the invention
  • Figures 15A and 15B are images which demonstrate the activation of the proliferation capacities of the method according to the invention.
  • undissociated adipose tissue shows no proliferating cells.
  • the composition shows cells in proliferation, the nuclei of proliferating cells being shown in white in this figure;
  • FIGS. 16A, 16B, 16C, 16D, 16E and 16F are images in which the proliferating cells, which are contained in the so-called Endostem matrix, are marked, in the absence of the stroma-vascular fraction (figures 16A, 16C, 16E) and with the addition of this stroma-vascular fraction (FIGS. 16B, 16D, 16F) after 20 days of culture in the proliferation medium;
  • FIG. 17A, 17B, 17C, 17D, 17E and 17F illustrate the expression of dipeptidyl peptidase-4 (DPP4), which is concentrated in the isolated stromal vascular fraction, and the expression of ICAM1 and CD31, which is concentrated in the isolated matrix (Figs. 17A, 17C, 17E), and the expression of DPP4, ICAM1 and CD31 in the amplified composition (Figs. 17B, 17D, 17F);
  • DPP4 dipeptidyl peptidase-4
  • FIG. 18 is composed of four photographs which illustrate the proliferation capacity of the cells (EdU positive) which present the DPP4 marker within the extracellular matrix of the adipose tissue in the method according to the invention;
  • - Figure 19 is composed of photographs which illustrate the capacity for differentiation into brown or beige adipocytes of the cell populations presenting the DPP4 marker (three photographs at the top of the figure) or which do not present this DPP4 marker (three photographs at the bottom);
  • - Figures 20A and 20B are graphs which illustrate the capacity for differentiation into brown or beige adipocytes of cell populations, expressing DPP4 or not, obtained by quantitative PCR, in real time of the PLIN1 marker ( Figure 20A) and of the UCP1 marker ( Figure 20B);
  • FIG. 21A and 21B illustrate the presence of type M1 and type M2 macrophages respectively, in the amplified composition according to the invention
  • FIG. 22 comprises a set of photographs which demonstrate the presence of certain proteins in the extracellular matrix according to the invention, and the conservation of a capillary network;
  • FIG. 23 shows the relative expression of human UCP1, on day D0, ie before transplantation of the amplified ExAdeX-tissue product and on day D21, in the ExAdeX-tissue product, after transplantation in mice;
  • - Figure 24 shows three fluorescence microscopy photographs, the left photograph showing the absence of brown/beige adipocytes in the white adipose tissue before the implementation of the method of the invention, the center photograph showing the presence of brown/beige adipocytes, specifically marked in light gray by the expression, in an overweight individual, of the UCP1 protein, ex vivo after the amplification and differentiation process, and the photograph on the right showing the presence of brown/beige adipocytes ex vivo, after the implementation of the invention, in a patient with severe obesity;
  • - figures 25A, 25B and 25C show the viability of adipose tissue stem cells after purification of the stroma-vascular fraction, directly after incubation in an IX lysis buffer, called ACL, comprising ammonium chloride (figure 25A), after 24 h of culture (FIG. 25B) and after 5 days in adherent culture conditions (FIG. 25C);
  • FIGS. 26A, 26B, 26C and 26D present the graphical results of the analysis by flow cytometry of the number of viable and dead cells after different treatment times in an IX lysis buffer, named ACL, comprising ammonium chloride ;
  • FIG. 27A, 27B and 27C show the viability of endothelial cells from adipose tissue after purification of the stromal-vascular fraction, directly after incubation in an IX lysis buffer, named ACL, comprising ammonium chloride (Figure 27A), after 24 h of culture (FIG. 27B) and after 5 days in adherent culture conditions (FIG. 27C);
  • FIG. 28 shows the profile of adipose tissue stem cells, amplified according to the ExAdEx method of the invention, obtained by determination by flow cytometry of cell surface markers;
  • FIGS 29A and 29B show the profiles of ASCs of adipose tissue ex vivo (Figure 29A) and of the amplified product ExAdEx ( Figure 29B) obtained by determination of cell surface markers obtained by flow cytometry;
  • FIGs 30A, 30B and 30C show endothelial cells isolated from human adipose tissue which are cultured in the proliferation medium described in the invention ( Figure 30A), in the differentiation medium described in the invention ( Figure 30B) and in a non-optimized standard differentiation medium that includes DMEM and serum (Figure 30C).
  • FIG. 31 shows a visualization in white, of a functional vascular network of the composition described in the invention after transplantation in nude mice (4 weeks post-transplant);
  • FIG. 32 shows a comparison of the viability and amplification capacities of brown or beige adipocyte stem cells from adipose tissue according to a method not comprising the addition of the stroma-vascular fraction (A) and comprising the purification then the addition of the cells isolated from the infranatant, also named in the invention stromal vascular fraction (B).
  • Adipose tissue is provided to carry out the invention. It is in practice adipose tissue, for example white, from individuals, for example, but not exclusively, from overweight individuals, in particular obese and/or having metabolic disorders such as type 2 diabetes and cardio diseases. -vascular.
  • the first subject of the invention is a process for the in vitro or ex vivo amplification of brown or beige adipocyte stem cells from adipose tissue, for example white, human comprising the following steps: extraction, on the one hand, of a stroma-vascular fraction ( Figure IA, steps 1-2 and Figure IB, steps 1-3 and step 5) called mechanical from a tissue human adipose tissue comprising endothelial cells of the vascular network of human adipose tissue and stem cells of human adipose tissue and, on the other hand, of an extracellular matrix of said human adipose tissue (Figure IA, stage 3 and Figure IB, stage 4) , said extracellular matrix comprising endothelial cells of the vascular network of human adipose tissue, stem cells of human adipose tissue and collagen, the extraction of said extracellular matrix comprising a step of mechanical dissociation ( Figure IA, step 3 and Figure IB, step 4); mixing said strom
  • stroma-vascular fraction is understood to mean the cells present in a sample of human adipose tissue.
  • This stromal-vascular fraction comprises endothelial cells of the vascular network of human adipose tissue and stem cells of human adipose tissue.
  • the stroma-vascular fraction according to the invention also called infranatant, is advantageously derived from steps 2 and 3 described in FIG. 1B, and is rich in DPP4 + cells.
  • extracellular matrix is understood to mean a bioactive matrix, that is to say a matrix which comprises various proteins of adipose tissue (Figure 22) and endogenous cells, comprising in particular endothelial cells (Figure 10C ), adipose tissue stem cells (Figure 10D), adipocytes and macrophages.
  • Figure 11 shows the presence of proliferating cells in the extracellular matrix (Edu marking in white). This extracellular matrix allows cellular amplification in 3D, that is to say the proliferation of cells in three dimensions.
  • the extracellular matrix of the invention is also referred to below as “EndoStem-Matrix” or “EndoStem matrix”.
  • Adipose tissue extracellular matrix proteins include collagen. This collagen is structured. It presents a fibrillar organization. These include type I and type III collagen (see Figures 9A and 9B showing fibrillar collagen fibers labeled with PicroSirius Red and Figure 10B which shows type I collagen labeled with anti-collagen antibody I and observed by confocal microscopy). Adipose tissue extracellular matrix proteins further include fibronectin, elastin, laminin, and type IV collagen ( Figure 22).
  • the extraction of the extracellular matrix comprises a step of non-enzymatic dissociation, in particular the extraction of the extracellular matrix comprises a step of mechanical dissociation.
  • the "mechanical dissociation" of the invention makes it possible to preserve intact the structure of the extracellular matrix while an enzymatic digestion generally involves collagenase which digests it. Mechanical dissociation thus allows the maintenance of the "vasculature”, as shown in Figure 7A, in which appears the vascular network before dissociation in human adipose tissue in the photograph on the left and the vascular network after dissociation and amplification in middle photograph. This mechanical dissociation also allows the maintenance of the microstructure of the extracellular matrix, which consequently presents an organization similar to the organization of adipose tissue in vivo.
  • the extraction of the stroma-vascular fraction and of the extracellular matrix comprises the following steps: centrifugation of human adipose tissue to obtain at least two distinct fractions, a fraction A comprising a centrifuged extracellular matrix, and the stroma-vascular fraction; and mechanical dissociation of fraction A to obtain the extracellular matrix (Figure IA).
  • the human adipose tissue centrifugation step further removes oil, blood and anesthetic liquid contained in the supplied human adipose tissue. This step also makes it possible to eliminate physiological fluid resulting from prior washings of the human adipose tissue supplied.
  • the extraction of the stroma-vascular fraction and of the extracellular matrix comprises the following steps: centrifugation of the human adipose tissue to obtain at least two distinct fractions, a fraction A comprising a centrifuged extracellular matrix and a fraction B comprising endothelial cells of the vascular network of the human adipose tissue and stem cells of the human adipose tissue; mechanical dissociation of fraction A to obtain a fraction A' comprising a dissociated extracellular matrix; centrifugation of fraction A' to obtain at least the extracellular matrix and a fraction B' comprising endothelial cells of the vasculature of human adipose tissue and stem cells of human adipose tissue; and mixing fractions B and B' to obtain the mechanical stroma-vascular fraction (Figure IB).
  • the step of centrifuging the human adipose tissue further removes oil, blood and anesthetic liquid contained in the provided human adipose tissue.
  • This step also makes it possible to eliminate physiological fluid resulting from prior washings of the human adipose tissue supplied. Centrifugation of fraction A′ also makes it possible to eliminate any residues of oil and physiological liquid. This fraction A′ centrifugation step is optional.
  • the method according to the invention further comprises a step of eliminating blood cells.
  • This is an elimination of blood cells of the erythrocyte type, present in the adipose tissue and in the various cell pellets, called mechanical SVF, obtained during the aforementioned steps of the mechanical dissociation process called ExAdEx.
  • This elimination step is carried out during incubation of the adipose tissue and/or cell pellets in an IX lysis buffer comprising ammonium chloride ("Ammonium chloride lysing solution", Becton DickinsonTM - called ACL) diluted in sterilized water, in a buffer:sample ratio varying from 1:1 to 1:10, at a temperature comprised between 4 and 37° C.
  • FIGS. 27A, 27B and 27C illustrate the absence of effect of incubation in the ACL on the viability and the proliferative capacities of the endothelial cells of the adipose tissue contained in the infranatant.
  • the culture of the mixture of the stroma-vascular fraction and of said extracellular matrix comprises the following steps: transfer of said mixture in a sterile manner into a culture bag in suspension comprising proliferation medium; and amplifying said mixture forming cell clumps.
  • the transfer in a “sterile manner”, within the meaning of the invention, is a transfer, preferably, carried out in a closed system.
  • This sterile transfer makes it possible to avoid the presence of contaminants during the cell culture. Mechanical dissociation of cell clusters formed during amplification does not require opening of the system, thus avoiding the exposure of the cellular products to a contamination of the culture by the elements of the environment.
  • the proliferation medium in the suspension culture bag is EGM+TM medium.
  • This proliferation medium includes the basic medium for the proliferation of endothelial cells (EGM) enriched with Epidermal Growth Factor (EGF), Basic Growth Factor (FGF2), Insulin-like Growth Factor, Vascular Endothelial Growth Factor 165, ascorbic acid, heparin and hydrocortisone (EGM+).
  • EGM+ medium also allows the amplification of adipocyte stem cells without altering their capacity for differentiation into adipocytes.
  • the method of the invention allows an amplification of the number of adipose tissue stem cells with an amplification factor greater than 10, advantageously greater than 20, in particular greater than 30, preferably greater than 35.
  • the amplification factor is the ratio between the number of cells obtained after culture of the isolated SVF in the presence of said extracellular matrix and the number of cells before the invention.
  • the method of the invention has an amplification factor of 36 in 8 days.
  • the invention relates to a process for the in vitro or ex vivo amplification of stem cells of brown or beige adipocytes comprising the following steps: in vitro or ex vivo amplification of stem cells from human adipose tissue as defined above -above ; and induction of stem cell differentiation adipose tissue to obtain brown or beige adipocytes.
  • the invention relates to a process for obtaining in vitro or ex vivo brown or beige adipocytes comprising the following steps: in vitro or ex vivo amplification of stem cells from human adipose tissue as defined above -above ; and inducing adipose tissue stem cell differentiation to brown or beige adipocytes.
  • the process for the in vitro or ex vivo amplification of brown or beige adipocytes therefore comprises the following steps: extraction, on the one hand, of a stromal-vascular fraction of a human adipose tissue comprising, endothelial cells of the vascular network of human adipose tissue and stem cells of human adipose tissue and, on the other hand, of an extracellular matrix of said human adipose tissue, said extracellular matrix comprising endothelial cells of the vascular network of human adipose tissue, stem cells of human adipose tissue and collagen; mixing said mechanical stroma-vascular fraction and said extracellular matrix; culture of the mixture obtained in the preceding step, in suspension, in a cell proliferation medium; and inducing adipose tissue stem cell differentiation to brown or beige adipocytes.
  • the process for obtaining in vitro or ex vivo brown or beige adipocytes therefore comprises the following steps: extraction, on the one hand, of a stroma-vascular fraction of a human adipose tissue comprising, endothelial cells of the human adipose tissue vascular network and adipose tissue brown or beige adipocyte stem cells human and, on the other hand, of an extracellular matrix of said human adipose tissue, said extracellular matrix comprising endothelial cells of the vascular network of human adipose tissue, stem cells of brown or beige adipocytes of human adipose tissue and collagen; mixing said mechanical stroma-vascular fraction and said extracellular matrix; culture of the mixture obtained in the preceding step, in suspension, in a cell proliferation medium; and inducing differentiation of brown or beige adipocyte stem cells from adipose tissue to brown or beige adipocytes.
  • the in vitro or ex vivo amplification process for differentiated cells comprising the steps related to the in vitro or ex vivo amplification of adipose tissue stem cells, the details given above for the in vitro or ex vivo amplification process adipose tissue stem cells also apply to the process of in vitro or ex vivo amplification of differentiated cells.
  • the process for obtaining in vitro or ex vivo brown or beige adipocytes comprising the steps related to the in vitro or ex vivo amplification of stem cells of brown or beige adipocytes of adipose tissue, the details given below above for the process for the in vitro or ex vivo amplification of stem cells of brown or beige adipocytes of adipose tissue also apply to the process for obtaining in vitro or ex vivo brown or beige adipocytes.
  • the extraction of the extracellular matrix comprises a step of non-enzymatic dissociation, in particular the extraction of the extracellular matrix comprises a step of mechanical dissociation.
  • the extraction of the stroma-vascular fraction and of the extracellular matrix comprises the following steps: centrifugation of human adipose tissue to obtain at least two distinct fractions, a fraction A comprising a centrifuged extracellular matrix, and the fraction stroma- vascular; and mechanical dissociation of fraction A to obtain the extracellular matrix.
  • the extraction of the stroma-vascular fraction and of the extracellular matrix comprises the following steps: centrifugation of human adipose tissue to obtain at least two distinct fractions, a fraction A comprising a centrifuged extracellular matrix and a fraction B comprising human adipose tissue vasculature endothelial cells and human adipose tissue stem cells; mechanical dissociation of fraction A to obtain a fraction A' comprising a dissociated extracellular matrix; centrifugation of fraction A' to obtain at least the extracellular matrix and a fraction B' comprising endothelial cells of the vascular network of human adipose tissue and stem cells from human adipose tissue; and mixing fractions B and B' to obtain the stroma-vascular fraction.
  • the extracellular matrix collagen includes type I collagen and type III collagen revealed by Picrosirius Red staining (see Figure 9A and Figure 9B).
  • said method also comprises a cell-sorting step aimed at sorting the stem cells expressing the surface marker DPP4, also called CD26.
  • DPP4 also called CD26.
  • a possible variant consists in selecting/sorting the cells expressing CD26/DPP4, mainly before the so-called ExAdEx process, after mixing the stroma-vascular fraction and the extracellular matrix, but before culturing said mixture, in suspension, in the proliferation medium. cellular.
  • the objectives are in particular to enrich the product used in precursor cells of brown or beige adipocytes and, on the other hand, to homogenize and standardize the composition of the cellular product to be amplified.
  • FIG. 20A shows that the DPP4+ and DPP4- populations all have the capacity to differentiate into adipocytes according to the expression of the PLIN1 marker ( Figure 20A). In contrast, only the DPP4+ population differentiates into adipocytes expressing the brown/beige adipocyte marker UCP1 ( Figure 20B).
  • FIG. 19 An illustration in Figure 19 shows by fluorescence imaging of the UCP1 protein that the UCP1 protein is only expressed in adipose tissue stem cells expressing DPP4+ and differentiated in an adipogenic medium.
  • the use of the product which is obtained after culturing the sorted cells, mainly relates to cell therapy applications for obesity and metabolic diseases, however applications in vitro of this type of composition-controlled product are also possible.
  • the methodological modalities of cell sorting are based on the fixing of antibodies specific for DPP4 to identify the cells expressing this protein.
  • a first separation technique consists of using antibodies coupled with fluorochromes, sorting takes place on an automated cell sorting platform (type Aria IIITM, BD) which is a cytometer/high-throughput cell sorter capable of separating least four different cell populations.
  • the other method concerns immuno-magnetic cell sorting, based on the use of antibodies coupled to magnetic beads which allow the retention of the cells of interest in a magnetic field (cliniMACsTM type technology, Miltenyi BiotecTM). These two techniques make it possible to achieve high degrees of homogeneity of the cellular product of interest in the final product (>95%).
  • These techniques are all compatible with sorting carried out under GMP conditions for cell therapy applications, provided that suitable platforms are available (CliniMacsTM automaton for magnetic sorting, GMP sorting cytometer).
  • the culture of the mixture of said stroma-vascular fraction and of said extracellular matrix comprises the following steps: transfer of said mixture in a sterile manner into a culture bag in suspension comprising culture medium; amplifying said mixture forming cell clusters;
  • the product resulting from the amplification of the mixture of the mechanical SVF fraction and the template fraction can be referred to as “ExAdEx-tissue”.
  • the product resulting from the formation of aggregates in an additional step at the end of the process can be called “ExAdEx-lobules”. These products are schematized in Figure IC.
  • the EXADEX-lobules product is a product which can be obtained in an additional step of the process according to the invention.
  • the product is amplified in the EGM+ proliferation medium in culture flasks, as described above. It then constitutes the amplified product ExAdEx-tissue. As shown in FIG.
  • this amplified product is transferred to non-adherent, 6-well, 12-well or 24-well ULA (Ultra-Low Attachment) culture plates in the medium of proliferation, including EGM+, with or without agitation. A formation of aggregates is then observed.
  • These include all the characteristics described in the ExAdEx-tissue product, after 3 to 10 days, under the conditions described. These characteristics are defined by the presence of human adipose tissue stem cells, endothelial cells and components of the extracellular matrix. This product is also characterized by the presence of mature adipocyte cells and macrophages. Among the molecular markers, and as shown in the Figures.
  • ExAdEx-lobules product is also better suited to syringe injection in the context of cell therapy.
  • These ExAdEx-lobule units can be produced from the ExAdEx-tissue product at different amplification times, for example from 10 days of amplification and up to 40 days. These aggregates, once formed, no longer have amplification capacities but have a viability in culture greater than 10 days. Units of ExAdEx-lobules can be maintained in range into white adipocytes or induced to differentiate or differentiate into brown/beige adipocytes.
  • the method according to the invention aims to amplify brown or beige adipocyte stem cells (hASCs), maintained in an active extracellular matrix, in 3D and, then to differentiate them into brown or beige adipocytes while allowing maintain viable cells of the adipose tissue microenvironment, namely endothelial cells (hECs) and macrophages M1 and M2 (Figs. 21A, 21B).
  • hASCs brown or beige adipocyte stem cells
  • hECs endothelial cells
  • M1 and M2 Figs. 21A, 21B
  • culture media have been developed, because the culture medium conventionally used for the proliferation and differentiation of hASCs is toxic for hECs and the culture medium conventionally used for the proliferation of hECs is inhibitor of the differentiation of hASCs.
  • Two culture media were therefore established: a proliferation medium, which allows the proliferation of hASCs and a differentiation medium, which allows the differentiation of amplified hASCs into adipocytes expressing the UCP1 marker.
  • the originality of these two culture media is that they are also compatible with the maintenance of endothelial cells of human adipose tissue.
  • the medium referenced DMEM (DulbeccoTM Modified Eagle Medium), comprising 10% FCS (Fêtai Bovine Serum - Fetal Calf Serum) is the reference medium for the proliferation of hASCs.
  • DMEM DulbeccoTM Modified Eagle Medium
  • FCS Fetal Calf Serum
  • PrepoTechTM product reference: Cat: GS-MacroV
  • PrepoTechTM product reference: Cat: GS-MicroV
  • N°4 EGM+ Marketed by PromocellTM (product reference: Cat: CC-22011 plus C-39216)
  • proliferation medium No. 4 namely EGM+
  • EGM+ did not induce cellular hypoxia, followed by the hypoxia marker CA9, when hASCs are suspended in 3D, as shown in Figure 4A.
  • the composition of the EGM+ proliferation medium is as follows: Endothelium Cell Growth Medium (endothelial cell growth medium) supplemented with: 2% FCS; 5 ng/ml Epidermal Growth Factor (EGF - Epidermal Growth Factor); 10ng/ml Fibroblast Growth factor (FGF2 - Fibroblast growth factor 2); 20ng/ml long R3 Insulin_like Growth Factor-1 (IGF-1 - Insulin-like or analogous growth factor 1); 0.5 ng/ml Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF - Vascular Endothelial Growth Factor) 165; 1 ⁇ g/ml Ascorbic Acid; 22.5 ⁇ g/ml Heparin; 0.2 ⁇ g/ml Hydrocortisone .
  • composition of the non-optimized proliferation medium is therefore advantageously that described above, supplemented with adipocyte differentiation factors, namely: EGM supplemented with: 2% FCS; 5ng/ml EGF; 10ng/ml FGF2; 20 ng/ml long R3 IGF; 0.5 ng/ml VEGF factor 165; 1 ⁇ g/ml ascorbic acid; 22.5 ⁇ g/ml Heparin; 0.2 ⁇ g/ml Hydrocortisone; 2mM Rosiglitazone; 1nM T3; 2.5 ⁇ g/ml Insulin; 0.25 mM Dexamethasone; 500 mM IBMX, a non-specific phosphodiesterase inhibitor.
  • EGM supplemented with: 2% FCS
  • 5ng/ml EGF 10ng/ml FGF2
  • 0.5 ng/ml VEGF factor 165 1 ⁇ g/ml ascorbic acid
  • the aforementioned differentiation medium which is not optimized, is advantageously optimized in the following way.
  • EGF and hydrocortisone to increase the differentiation of hASCs: the two compounds are described in the literature as being able to inhibit the expression of UCP1.
  • the differentiation medium allows differentiation into adipocytes but is toxic for the hECs (Endothelial Cells - Figure 5B).
  • the withdrawal of Dexamethasone and IBMX from the differentiation cocktail after the three first few days helps to maintain the viability of the hECs (Figure 5C).
  • the final composition of the optimized differentiation medium is thus advantageously the following: EGM supplemented with: 0.1% to 5%, preferably 2% FCS; 2 ng/ml to 20 ng/ml, preferably 10 ng/ml FGF2; 10 ng/ml to 30 ng/ml, preferably 20 ng/ml long R3 IGF-1; 0.1 ng/ml to 1 ng/ml, preferably 0.5 ng/ml VEGF 165; 0.5 ⁇ g/ml to 2 ⁇ g/ml, preferably 1 ⁇ g/ml ascorbic acid; 0.5 mM to 4 mM preferably 2 mM Rosiglitazone; 0.5 nM to 10 nM, preferably 1 nM T3; 0.5 ⁇ g/ml to 10 ⁇ g/ml preferably 2.5 ⁇ g/ml Insulin; 0.1 mM to 0.500 mM, preferably 0.25 mM Dexamethasone; 100 mM to 800
  • This differentiation medium is a first differentiation medium, which comprises dexamethasone and the IBMX. These compounds are, however, only present for the first 3 days approximately of differentiation. A second differentiation medium is then used, the composition of which conforms to that of the first differentiation medium mentioned above, but which does not comprise dexamethasone and IBMX.
  • the final composition of this second differentiation medium is therefore for example the following: 0.1% to 5%, preferably 2% FCS; 2 ng/ml to 20 ng/ml, preferably 10 ng/ml FGF2; 10 ng/ml to 30 ng/ml, preferably 20 ng/ml long R3 IGF-1; 0.1 ng/ml to 1 ng/ml, preferably 0.5 ng/ml VEGF 165; 0.5 ⁇ g/ml to 2 ⁇ g/ml, preferably 1 ⁇ g/ml ascorbic acid; 0.5 mM to 4 mM preferably 2 mM Rosiglitazone; 0.5 nM to 10 nM, preferably 1 nM T3; 0.5 pg/ml to 10 pg/ml preferably 2.5 pg/ml Insulin; 1 mM to 10 mM, preferably 5 mM SB431542.
  • the first and/or second differentiation media comprise 5 ⁇ g/ml to 50 ⁇ g/ml, for example 22.5 ⁇ g/ml of heparin and 1 mM to 20 mM, for example 10 mM of Y27632.
  • the hECs are still detectable after 20 days in the composition of the proliferation medium then 20 more days in the composition of the differentiation medium.
  • the ECs are visualized by expression of the CD31 marker.
  • the photo on the left is a photo of the adipose tissue before the implementation of the method according to the invention.
  • the middle photo is a photo of this tissue after 20 days in growth medium.
  • the photo on the right is a photo of this tissue after 20 days in proliferation medium and then 20 days in the differentiation medium.
  • FIG. 7B also shows that the DPP4 cells are still detectable after 20 days in the composition of the proliferation medium then 20 more days in the composition of the differentiation medium. This is also valid for the ICAMI adipocyte precursors still detectable in the amplified tissue after 20 days of co-culture ( Figure 7C).
  • - Y27632 is reported to increase the viability of cells in suspension; - heparin; and - the adipogenic factors can be used at other concentrations.
  • the differentiation of stem cells of brown or beige adipocytes of adipose tissue into brown or beige adipocytes is induced in vivo.
  • Example 4 below indeed demonstrates that the product amplified according to the process of the invention allows a differentiation of the stem cells of brown or beige adipocytes of the adipose tissue into brown or beige adipocytes, after transplantation in nude mice.
  • the invention relates to an isolated extracellular matrix capable of being obtained according to the method defined above, comprising endothelial cells of the vascular network of human adipose tissue, stem cells of brown or beige adipocytes of adipose tissue human and collagen.
  • the extracellular matrix is extracted during the extraction step of the method of the invention, and therefore comprises all the characteristics of the extracellular matrix described above.
  • the collagen is structured collagen, type I and type III collagen ( Figure 9A and Figure 9B).
  • the extracellular matrix also notably comprises fibronectin (FIG. 22).
  • the invention relates to a composition
  • a composition comprising the mixture of the extracellular matrix and the stromal-vascular fraction as defined above, the extracellular matrix comprising endothelial cells of the vascular network of human adipose tissue, stem cells adipose tissue, and collagen, and the stroma-vascular fraction comprising endothelial cells of the vascular network of adipose tissue and stem cells from brown or beige adipose tissue.
  • the composition comprises the extracellular matrix which is extracted during the extraction step of the method of the invention, as well as the stromal-vascular fraction which is extracted during this same extraction step of the method of the invention.
  • the extracellular matrix of the composition therefore comprises all the characteristics of the extracellular matrix described above.
  • the stroma-vascular fraction of the composition therefore includes all the characteristics of the stroma-vascular fraction described above.
  • Collagen is type I collagen and type III collagen.
  • the extracellular matrix further includes fibronectin ( Figure 22).
  • This composition obtained according to the process of the invention, before amplification of the mixture of the stroma-vascular fraction and the extracellular matrix, is a tissue composition. This composition further comprises mature adipocytes.
  • the invention relates to a kit comprising the composition as defined above, the proliferation medium and the differentiation medium.
  • the invention relates to the in vitro use of the extracellular matrix as defined above or the in vitro use of the composition as defined above for the screening and/or characterization of active pharmacological, in particular against obesity and/or associated metabolic diseases such as type 2 diabetes and cardiovascular diseases.
  • the invention also relates to brown or beige adipocytes obtained according to the method defined above, or derived from a composition as defined previously, and intended for use, or for their use, in cell therapy, or for the treatment metabolic disorders.
  • the term “derived” should be understood as meaning that the adipocytes originate from the composition, by differentiation of stem cells from brown or beige adipocytes.
  • the invention thus relates to a composition, obtained according to the methods of the invention, comprising brown or beige adipocytes or the precursors of such adipocytes, and intended for use, or for their use, in cell therapy, or for the treatment of metabolic disorders.
  • This composition is a tissue composition of human adipose tissue and comprises all of the product obtained by the methods of the invention, that is to say the mixture of the stroma-vascular fraction and the extracellular matrix, after proliferation, even after differentiation.
  • Brown or beige adipocytes or the precursors of such adipocytes can be used for the treatment of obesity in overweight or obese individuals.
  • a sample of white adipose tissue is taken from an individual.
  • This sampled tissue is then treated according to the method of the invention, in order to obtain, still in this example, ExAdEx-tissue or even ExAdEx-lobule products as described above.
  • These products in which the stem cells precursors of brown or beige adipocytes have undergone amplification, are then advantageously the subject of a differentiation into brown or beige adipocytes.
  • the products comprising these brown or beige adipocytes are transplanted, for example, into a white adipose tissue or close to such a tissue of the individual.
  • the products comprising brown or beige adipocytes are a tissue composition as defined in the preceding paragraph.
  • not brown or beige adipocytes but stem cells of brown or beige adipocytes, having undergone amplification according to the method of the invention in other words a tissue composition as defined above, are transplanted. above, comprising the mixture of the stroma-vascular fraction and the extracellular matrix after proliferation, and differentiation into mature white or beige adipocytes takes place in the body of the transplanted individual.
  • Figs. IA and IB The mechanical extraction of the stroma-vascular fraction and the extracellular matrix, from a sample of adipose tissue from a human donor, can be carried out according to the following steps (Figs. IA and IB):
  • the syringe is centrifuged at 1600 rcf (relative centrifugal force), 3 min in the collection tube.
  • the oil fraction as well as the blood and anesthetic liquid fraction are eliminated.
  • the pelleted fraction, named Cl is retained.
  • the syringe is connected to another syringe of the male Luer-Lock type connected by a Tulip® type connector in order to carry out the dissociation of the tissue by a emulsification.
  • Tulip® type connector Three types of Tulip® connector, 2.4 mm, 1.4 mm then 1.2 mm, are successively used, over 30 passages.
  • a connector of a brand other than the Tulip® brand can be used.
  • the number of connectors used is between 1 and 5.
  • the number of passes through these connectors is between 10 and 50.
  • Figure IA shows a method making it possible to bring together in step 2 the populations C1 and C2 as well as the matrices M1 and M2.
  • step 3 the population C3 and the matrices M3 and M4 are grouped together. b) Characterization of the cell populations obtained
  • the method described above makes it possible to sequentially extract the stroma-vascular fraction and an extracellular matrix.
  • the cell populations are characterized in particular by fluorescence microscopy, by molecular characterization by quantitative PCR and by flow cytometry.
  • the vascular stroma fraction obtained is characterized by a majority of cells of the DPP4+ type (FIG. 17A) at the level of the gene expression of the DPP4 marker and by observation of the DPP4 protein by microscopy (FIG. 8A).
  • the ICAMI protein is scarcely present (FIG. 17C and FIG. 8B).
  • the amplified product ExAdEx obtained is characterized in particular by the presence of cells of the CD26 + type (FIG. 28).
  • profiles of the stem cells of brown or beige adipocytes of the adipose tissue ex vivo and of the amplified product ExAdEx are obtained by determining, by flow cytometry, the cell surface markers. It is thus demonstrated that the method of the invention allows an increase in the population of cells expressing the CD26 marker from 4% to 51% (FIG. 29A). Cells expressing the CD54 marker are present but not amplified by the method of the invention (FIG. 29B).
  • the matrix obtained during step 2 is of the fibrous type (FIG. 9C).
  • the matrix obtained during step 3 is of the fibrous type and rich in collagen (FIG. 9D).
  • the collagen is revealed by the PicroSirius Red ( Figure 9A) which also makes it possible to visualize a structure of the stick collagen.
  • This matrix contains endogenous cells.
  • the matrix obtained during step 5 and isolated in the collection tube, named here M3, is of the fibrous type ( Figure 9E and Figure 9B).
  • This matrix also contains endogenous cells.
  • the isolated matrix collagen is revealed, in Figure 9B, by PicroSirius Red which stains type I and type III collagen fibers.
  • the red coloration (in shades of gray in FIG. 9B) obtained indicates that the collagen remains organized, namely that the collagen present always has a secondary helix structure and a quaternary triple helix structure. It is not degraded. Indeed, disorganized collagen is stained green by PicroSirius Red.
  • the matrix obtained during step 5 and contained in the syringe, named here M4 is composed of a majority of mature adipocytes and of a type I collagen framework (FIG. 10B).
  • the M4 matrix is also composed of capillary structures formed by CD31+ endothelial cells (Figure 10C) and by a network of PDGFRa+ adipose tissue stem cells ( Figure 10D). d) Purification of the C1/C2 infratant
  • Populations C1 and C2 are previously freed from blood cells by incubating the cell pellets in an IX lysis buffer comprising ammonium chloride, called ACL, diluted in sterilized water, in a buffer:sample ratio, varying from 1:1 to 1:10, at a temperature between 4 and 37°C and during an incubation time varying from 5 minutes to 30 minutes.
  • ACL ammonium chloride
  • a flow cytometry analysis was performed.
  • a total of 1.10 5 human adipose tissue stem cells were incubated, in a saline solution as a control, or at different times, in 10 volumes of the blood cell lysis solution.
  • Figure 25A illustrates direct viability in terms of numbers of viable cells after incubation in the different compositions.
  • Figure 25B illustrates the viability after 24 h of culture and
  • a graphical result of this flow cytometry analysis is presented in Figures 26A, 26B, 26C and 26D and allows the number of viable and dead cells to be visualized after different treatment times in the ACL.
  • a saline solution is taken as a reference.
  • Figure 27B illustrates the viability after 24h of culture and Figure 27C presents the capacity of proliferation after 5 days in adherent culture conditions. It results from these analyzes that an incubation period in the ACL greater than 5 minutes damages the viability and proliferation capacities of the stem cells of the adipose tissue contained in the infranatant. Incubation in ACL also has no effect on the viability or proliferative abilities of human adipose tissue endothelial cells.
  • a method for ex vivo expansion of brown or beige adipocyte stem cells from adipose tissue and differentiation in an adipose tissue-mimicking environment includes the following steps:
  • the final product obtained in example 1 containing the populations C1-C3 as well as the so-called EndoStem-Matrix M1-M4 matrices are cultured in suspension in bags and maintained in the EGM+ proliferation medium with stirring for 24 hours at 37° C. 5% C02, then maintained under the same conditions, preferably with stirring.
  • EGM+ proliferation medium is changed 50% every two days.
  • a mechanical dissociation in a closed system by passage through 2 syringes or two culture bags mounted in a tulip, is carried out on day 5 and day 10.
  • the EGM+ proliferation medium is replaced with the differentiation cocktail I composed of EGM+ enriched with 250 mM Dexamethasone; 500mM IBMX; 1mM Rosiglitazone; 2 mM T3 and 2.5 ⁇ g/ml insulin. 5.
  • the differentiation medium I is replaced with the differentiation medium II composed of EGM+ enriched with 1 mM Rosiglitazone; 2 mM T3 and 2.5 ⁇ g/ml insulin.
  • EndoStem-Matrix extracellular matrices of the invention have been characterized, in particular, by fluorescence microscopy, in the presence of various specific markers. Proliferating cells were thus detected by incorporation, during the DNA replication phase, of fluorescent Edu (5-ethylnyl-2′-deoxyuridine) in the EndoStem-Matrix matrices of the invention, as illustrated in the Figure 11, proving that these are bioactive. Indeed, FIG. 11 shows that the cells endogenous to the matrices are maintained in proliferation during the amplification phase.
  • FIG. 12 demonstrates the presence of exogenous stem cells from adipose tissue placed in co-culture after three days of co-culture with the extracellular matrix of the invention.
  • the extracellular matrix therefore makes it possible to provide support for the proliferation of the stroma-vascular fraction: the stem cells of the added adipose tissue can attach themselves to the EndoStem-Matrix matrix, in suspension.
  • exogenous cells have the ability to attach to the extracellular matrix according to the invention, and demonstrates that the matrix can be used as such and alone for clinical or in vitro applications and, in particular, for screening and/or the characterization of pharmacological actives.
  • Exogenous stem cells can be genetically modified, for example, to express a protein of interest.
  • the exogenous stem cells can moreover be non-adipocyte or specifically adipocyte stem cells. They may be, for example, stem cells of the skin, in particular epithelial stem cells of the skin or induced pluripotent stem cells.
  • the stroma-vascular fraction is amplified by its culture on the EndoStem Matrix of the invention.
  • the extracellular matrix of the invention therefore has the ability to amplify the added adipose tissue stem cells.
  • FIG. 16 makes it possible to highlight the necessity of the co-culture of the stroma-vascular fraction and of the matrix to obtain an amplification of the stem cells of the adipose tissue.
  • Figures 16A, 16C and 16E show a low proportion of proliferating cells in cultured Endostem matrix without the addition of the stroma-vascular fraction.
  • Figures 16B, 16D and 16F show that the co-culture of the stroma-vascular fraction and the extracellular matrix makes it possible to obtain a superior proliferation of the stem cells of the adipose tissue.
  • FIG. 16 makes it possible to highlight the necessity of the co-culture of the stroma-vascular fraction and of the matrix to obtain an amplification of the stem cells of the adipose tissue.
  • Figures 16A, 16C and 16E show a low proportion of proliferating cells in cultured Endostem matrix without the addition of the stroma-vascular fraction.
  • Figures 16B, 16D and 16F show that the co-culture
  • FIG. 32A shows a weak amplification of the cell population in the absence of the addition of the stroma-vascular fraction.
  • FIG. 32B shows an amplification of the cell populations of the stroma-vascular fraction after culturing.
  • the amplification factor is the ratio between the number of cells obtained after culture in the presence of the extracellular matrix and the number of cells obtained in the absence of the extracellular matrix .
  • the M2 and M4 matrices have a strong capacity for amplifying adipose tissue stem cells.
  • Matrix M4 illustrates an extracellular matrix as defined in the invention. The level of expression of different cellular markers
  • FIGS 30A, 30B and 30C illustrate endothelial cells isolated from human adipose tissue after culture in different media.
  • Figure 30A shows the adipose tissue endothelial cells after culture in the proliferation medium of the invention.
  • Figure 30B shows adipose tissue endothelial cells after culture in the differentiation medium of the invention.
  • Figure 30C shows adipose tissue endothelial cells after culture in a standard, non-optimized differentiation medium that includes DMEM and serum.
  • the media described in the invention allow preservation of the endothelial cells during the stages of proliferation and differentiation into brown/beige adipose tissue.
  • the preservation of endothelial cells is of interest, in particular, for transplantation applications of brown/beige adipose tissue, allowing post-transplant vascularization and therefore viability of the transplant product.
  • the native vascular network present in the amplified and optionally differentiated composition obtained by the method of the invention, exhibits post-transplant revascularization capacities in nude mice. Indeed, as shown in white in FIG. 31, 4 weeks after transplantation in nude mice, the composition of the invention exhibits a functional vascular network.
  • an undissociated adipose tissue which can be likened to an explant, remains viable for a short time ex vivo.
  • the matrix isolated by dissociation contains proliferating cells (Figure 15B), unlike an undissociated tissue ( Figure 15A).
  • the figures. 15A and 15B make it possible to compare cell proliferation in the undissociated tissue (Figure 15A) and in the isolated matrix ( Figure 15B).
  • Figure 15A undissociated adipose tissue shows no proliferating cells.
  • the composition shows proliferating cells. Indeed, this figure shows, in white, the nuclei of proliferating cells.
  • DPP4 is a marker for the precursor cells of ICAM1 pre-adipocytes, which have a high capacity for proliferation and which are located in the interstitial reticulum of adipose tissue. These are cells which have the capacity for proliferation in the composition according to the invention. It is important to note that these cells are eliminated following the washings carried out according to the methods of the prior art.
  • DPP4 expression is concentrated in the isolated stroma-vascular fraction. The matrix expresses little.
  • FIG. 17C the expression of ICAM1, is concentrated in the isolated matrix, as well as the cells of the CD31 type in FIG. 17E.
  • the cells that carry the amplification in the composition are the added DPP4 expressing cells.
  • Figure 18 shows that in the co-culture product, the cells expressing the proliferation marker Edu are the cells also expressing the DPP4 marker.
  • the stem cells which carry the power of amplification, are preferentially cells of the DPP4 or CD26+ type.
  • the adipose tissue in vivo contains macrophages and that the amplified composition according to the invention maintains the presence of type M1 macrophages, as shown in Figure 21A and of type M2 as shown in Figure 21B.
  • type M1 macrophages are revealed by the IL-lb marker and, in Figure 21B, type M2 macrophages are revealed by the marker MRC1.
  • the isolated matrix according to the invention comprises extracellular matrix proteins, namely in particular type I collagen, type IV collagen, elastin, fibronectin , laminin. Labeling of CD31 endothelial cells shows that a capillary network is preserved.
  • Figure 19 shows that it is the DPP4 positive cells which are preferentially the precursors of brown/beige adipocytes.
  • an isolated population of stem cells from human adipose tissue expressing DPP4+ and placed in differentiation according to the medium described in the invention shows expression of the UCP1 marker in confocal microscopy.
  • a population of human adipose tissue stem cells not expressing the surface marker DPP4 does not show expression of the marker UCP1 after differentiation.
  • Molecular analyzes confirm these observations and show that the adipocyte differentiation marker PLIN1 is comparable for DPP4 positive populations. and negative ( Figure 20A), in contrast, the brown/beige adipose tissue differentiation marker is observable only in the population differentiated from stem cells expressing the DPP4 marker ( Figure 20B).
  • the amplified – but undifferentiated – ExAdEx-tissue product was injected at the interscapular level, close to the brown adipose tissue of the so-called “Nude” immunodeficiency mouse. Twenty-one days after injection (D21) the ExAdEx-tissue product was sampled. The RNAs were extracted from the constituent cells of the sampled tissue. The level of expression of the brown/beige adipocyte marker UCP1 was compared with that of the product before injection (D0).

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Abstract

La présente invention a pour objet un procédé d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges. Ce procédé comprend les étapes suivantes : extraction, d'une part, d'une fraction stroma-vasculaire d'un tissu adipeux humain comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules souches du tissu adipeux humain brun ou beige, et d'autre part, d'une matrice extracellulaire dudit tissu adipeux humain, ladite matrice extracellulaire comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain, des cellules souches du tissu adipeux humain brun ou beige et du collagène; mélange de ladite fraction stroma-vasculaire et de ladite matrice extracellulaire; et culture du mélange obtenu à l'étape précédente, en suspension, dans un milieu de culture.

Description

PROCEDE D'AMPLIFICATION IN VITRO OU EX VIVO DE CELLULES SOUCHES D'ADIPOCYTES BRUNS OU BEIGES
DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges à partir du tissu adipeux humain. Elle concerne en outre un procédé d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges, une matrice extracellulaire, une composition comprenant un mélange d'une matrice extracellulaire et d'une fraction stroma- vasculaire, un kit comprenant cette composition, une utilisation de la matrice extracellulaire ou de la composition comprenant un mélange de la matrice extracellulaire et de la fraction stroma-vasculaire, des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges et des adipocytes bruns ou beiges, obtenus selon le procédé de l'invention pour leur utilisation.
ART ANTERIEUR
La thérapie cellulaire consiste en une greffe de cellules visant à restaurer les fonctions d'un tissu ou d'un organe lorsqu'elles sont altérées par un accident, une pathologie, le vieillissement et des désordres métaboliques. Elle permet de soigner durablement un patient grâce une injection de cellules dites « thérapeutiques ». Ces cellules sont obtenues, en particulier, à partir de cellules souches multipotentes provenant du patient lui-même. On a envisagé d'améliorer la flexibilité métabolique et/ou de stimuler la dépense énergétique d'un patient en augmentant la masse de tissu adipeux brun/beige (TAB) chez ce patient. Il s'agit là d'une piste innovante destinée à lutter contre les maladies métaboliques, telles que le diabète, les maladies cardiovasculaires et autres dysfonctions métaboliques. En effet, le tissu adipeux brun ou beige participe à la dissipation calorique de l'organisme, au contrôle du métabolisme rédox et il joue un rôle endocrine et paracrine régulateur au travers de la sécrétion d'hormones. Restaurer la fonction dite « TAB » chez ces patients représente donc une option thérapeutique attractive.
Toutefois, les thérapies cellulaires autologues mettant en œuvre les tissus adipeux bruns ou beiges n'existent pas en pratique, et ce, pour une raison principale qui est la quasi absence de source d'adipocytes bruns chez le patient adulte, plus particulièrement chez le patient obèse, pour une amplification ex vivo. En effet, au contraire du tissu adipeux blanc présent en abondance et surtout chez les patients obèses, le tissu adipeux brun ou beige est particulièrement rare chez l'homme adulte et même quasi- inexistant chez les patients obèses, pour lesquels cette quasi-inexistence constitue un facteur aggravant, si ce n'est causal majeur, des dérèglements métaboliques notamment, mais non exclusivement, liés au surpoids.
Dans ce contexte, il existe un besoin de réaliser des cultures d'adipocytes bruns ou beiges autologues et, par suite, de développer des méthodes d'amplification cellulaire permettant l'obtention de quantités importantes d'adipocytes bruns ou beiges de grade thérapeutique pour lutter contre les maladies métaboliques associées à l'obésité, telles que le diabète, les maladies cardiovasculaires et autres dysfonctions métaboliques.
La procédure standard, pour isoler et amplifier les précurseurs d'adipocytes à partir de prélèvements de tissu adipeux, passe par une dissociation enzymatique puis par leur expansion en deux dimensions (2D) par attachement au plastique de boîtes de culture. Cette procédure est coûteuse, longue, et nécessite de nombreuses manipulations qui augmentent les risques de contaminations. De plus, elle entraîne une destruction de la structure tridimensionnelle du tissu, ainsi que la perte de types cellulaires d'intérêts comme les cellules endothéliales qui jouent un rôle essentiel à la fois pour la vascularisation du greffon et la physiologie de 1'adipocyte.
La dissociation non-enzymatique du tissu adipeux apparaît comme une méthode alternative beaucoup moins coûteuse, plus rapide et qui présente des avantages incontestables pour la fabrication d'un produit conforme aux standards d'une production de grade thérapeutique (exposition réduite à des produits ou contaminants extérieurs). En revanche, les procédés de dissociation non-enzymatique présentés à ce jour ne sont pas satisfaisants car plusieurs études rapportent que le nombre de précurseurs d'adipocytes obtenu est faible comparé à la dissociation enzymatique. De plus, les adipocytes matures, la matrice extracellulaire ainsi que la structure tridimensionnelle du tissu adipeux sont toujours perdues à la fin du processus de dissociation, ainsi que les cellules endothéliales, après culture. Il a été proposé différentes matrices synthétiques pour y ensemencer les précurseurs d'adipocytes et ainsi essayer de reconstituer au mieux la structure du tissu adipeux. Ces matrices seraient également utilisées pour orienter in vitro les précurseurs d'adipocytes vers un type cellulaire non adipeux, essentiellement osseux ou cartilagineux, avant implantation. Du tissu adipeux décellularisé a également été proposé pour augmenter la différenciation des précurseurs et mieux mimer la structure du tissu adipeux. La fabrication de ces types de matrices nécessite de nombreuses étapes faisant intervenir des réactions enzymatiques ou de longs traitements chimiques. De plus, le tissu décellularisé, par définition, perd ces cellules endogènes. Le tissu adipeux non décellularisé et enrichi en précurseurs d'adipocytes (préalablement isolés par dissociation enzymatique) suivi d'une amplification en 2D a été proposé récemment comme matrice pour une meilleure reconstruction osseuse. Le temps pour générer cette matrice biologique est long, nécessite trois semaines de culture in vitro, et ne permet pas l'amplification des précurseurs d'adipocytes. Seul l'intérêt pour la réparation osseuse a été mis en avant par les auteurs.
La culture en suspension en trois dimensions (3D) représente une méthode alternative de choix à la méthode standard en 2D car elle permet essentiellement de conserver la structure et les qualités intrinsèques du tissu. Cet avantage est important car, par exemple, l'absence d'un modèle humain pertinent, qui mime au mieux in vitro le tissu adipeux, est une limitation majeure lors des essais de phases précliniques, pour la découverte de nouveaux médicaments efficaces pour lutter contre l'obésité et les maladies métaboliques associées comme le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires. De plus, la culture 3D est réalisable en système clos, ce qui diminue les manipulations et les risques de contamination.
RESUME DE L'INVENTION
Compte tenu de ce qui précède, un problème technique que se propose de résoudre l'invention est d'obtenir in vitro ou ex vivo une grande quantité de cellules souches notamment d'adipocytes bruns ou beiges à partir du tissu adipeux blanc humain, de grade thérapeutique.
La solution de l'invention à ce problème technique a pour premier objet, un procédé d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux humain, comprenant les étapes suivantes : extraction, d'une part, d'une fraction stroma-vasculaire d'un tissu adipeux humain comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules souches du tissu adipeux humain et, d'autre part, d'une matrice extracellulaire dudit tissu adipeux humain, ladite matrice extracellulaire comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain, des cellules souches du tissu adipeux humain et du collagène, l'extraction de ladite matrice extracellulaire comprenant une étape de dissociation mécanique ; mélange de ladite fraction stroma-vasculaire et de ladite matrice extracellulaire ; et culture du mélange obtenu à l'étape précédente, en suspension, dans un milieu de prolifération cellulaire. Ainsi, la culture en suspension de la fraction stroma- vasculaire, rendue possible grâce à la présence de la matrice extracellulaire, permet une amplification en 3D, donnant accès à un grand nombre de cellules dans un environnement du tissu adipeux natif et limitant ainsi les manipulations qui augmentent les risques de contaminations .
Avantageusement, - l'étape de dissociation mécanique est une étape de dissociation qui ne fait pas intervenir de collagénase ; - l'étape de dissociation mécanique est une étape de dissociation non-enzymatique ; - l'extraction de la fraction stroma-vasculaire et de la matrice extracellulaire comprend les étapes suivantes : centrifugation du tissu adipeux humain pour obtenir au moins deux fractions distinctes, une fraction A comprenant une matrice extracellulaire centrifugée, et la fraction stroma-vasculaire mécanique ; et dissociation mécanique de la fraction A pour obtenir la matrice extracellulaire ; - le procédé comporte en outre une étape d'élimination des cellules sanguines présentes dans la fraction stroma- vasculaire ; - le collagène de la matrice extracellulaire est du collagène structuré, qui présente une organisation fibrillaire ; - la culture du mélange de ladite fraction stroma-vasculaire et de ladite matrice extracellulaire comprend les étapes suivantes : transfert dudit mélange de manière stérile dans une poche de culture en suspension comprenant le milieu de prolifération ; amplification dudit mélange pour l'obtention d'un mélange amplifié comprenant des amas cellulaires ; - le mélange amplifié comprenant les amas cellulaires fait l'objet d'une dissociation mécanique pour l'obtention d'agrégats cellulaires ; - le milieu de prolifération comprend un sérum, un facteur de croissance de fibroblastes et un facteur de croissance ressemblant à l'insuline ; et - le procédé comporte en outre une étape de tri-cellulaire visant à trier les cellules souches exprimant le marqueur de surface DPP4.
Selon un second objet, l'invention concerne un procédé d'obtention in vitro ou ex vivo d'adipocytes bruns ou beiges comprenant les étapes suivantes : extraction, d'une part, d'une fraction stroma-vasculaire d'un tissu adipeux humain comprenant, des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules souches du tissu adipeux humain et, d'autre part, d'une matrice extracellulaire dudit tissu adipeux humain, ladite matrice extracellulaire comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain, des cellules souches du tissu adipeux humain et du collagène, l'extraction de ladite matrice extracellulaire comprenant une étape de dissociation mécanique ; mélange de ladite fraction stroma-vasculaire et de ladite matrice extracellulaire ; culture du mélange obtenu à l'étape précédente, en suspension, dans un milieu de prolifération cellulaire ; et induction d'une différenciation des cellules souches du tissu adipeux pour obtenir des adipocytes bruns ou beiges.
Avantageusement, - la différenciation des cellules souches du tissu adipeux est induite dans un milieu de différenciation ; - l'étape de dissociation mécanique est une étape de dissociation qui ne fait pas intervenir de collagénase ; - l'étape de dissociation mécanique est une étape de dissociation non-enzymatique ; - l'extraction de la fraction stroma-vasculaire et de la matrice extracellulaire comprend les étapes suivantes : centrifugation du tissu adipeux humain pour obtenir au moins deux fractions distinctes, une fraction A comprenant une matrice extracellulaire centrifugée, et la fraction stroma-vasculaire mécanique ; et dissociation mécanique de la fraction A pour obtenir la matrice extracellulaire ; - le procédé comporte en outre une étape d'élimination des cellules sanguines présentes dans la fraction stroma- vasculaire ; - le collagène de la matrice extracellulaire est du collagène structuré, qui présente une organisation fibrillaire ; - la culture du mélange de ladite fraction stroma-vasculaire mécanique et de ladite matrice extracellulaire comprend les étapes suivantes : transfert dudit mélange de manière stérile dans une poche de culture en suspension comprenant le milieu de prolifération ; amplification dudit mélange pour l'obtention d'un mélange amplifié comprenant des amas cellulaires ; - le mélange amplifié comprenant les amas cellulaires fait l'objet d'une dissociation mécanique pour l'obtention d'agrégats cellulaires ; et - le milieu de prolifération comprend un sérum, un facteur de croissance de fibroblastes et un facteur de croissance analogue à l'insuline ; et - le milieu de différenciation comprend de la Rosiglitazone et/ou du SB431542 et - le procédé comporte en outre une étape de tri-cellulaire visant à trier les cellules souches exprimant le marqueur de surface DPP4.
Selon un troisième objet, l'invention concerne une matrice extracellulaire isolée susceptible d'être obtenue selon le procédé défini ci-dessus, comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain, des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux humain et du collagène. Selon un quatrième objet, l'invention concerne une composition comprenant un mélange de la matrice extracellulaire telle que ci-dessus et d'une fraction stroma-vasculaire comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux et des cellules souches du tissu adipeux humain.
Selon un cinquième objet, l'invention concerne un kit comprenant la composition telle que définie ci-dessus, un milieu de prolifération cellulaire et un milieu de différenciation .
Selon un sixième objet, l'invention concerne l'utilisation de la matrice extracellulaire telle que définie ci-dessus ou de la composition telle que définie ci-dessus pour le criblage et/ou la caractérisation d'actifs pharmacologiques .
Selon un septième objet, l'invention concerne des adipocytes bruns ou beiges issus d'une composition telle que ci-dessus, pour leur utilisation en thérapie cellulaire, ou pour le traitement de désordres métaboliques.
Selon un huitième objet, l'invention concerne des adipocytes bruns ou beiges issus d'une composition telle que ci-dessus, pour le traitement de l'obésité.
Selon un neuvième objet, l'invention concerne un milieu de différentiation pour la différentiation de cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges en adipocytes bruns ou beiges, comprenant un milieu de croissance de cellules endothéliales supplémenté en sérum, en facteurs de croissance, en rosiglitazone et en SB431542 et, préférentiellement, en sérum fœtal de veau, en facteurs de croissance de fibroblastes, en facteurs de croissance ressemblant à l'insuline, en facteurs de croissance de l'endothélium vasculaire, en acide ascorbique, en rosiglitazone, en T3, en insuline, et en SB431542.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description non limitative qui suit, rédigée au regard des dessins annexés, dans lesquels :
- la figure IA représente schématiquement les étapes nécessaires et suffisantes pour l'extraction d'une matrice extracellulaire et d'une fraction stroma-vasculaire (étapes 1 à 3), et leur mise en coculture (étape 4), selon l'invention ;
- la figure IB est une représentation schématique plus détaillée de la méthode qui permet l'extraction séquentielle de matrices extracellulaires (M1-M4) et de populations de cellules (C1-C3) de fraction stroma- vasculaire (étapes 1 à 5), et de leur mise en coculture (étape 6), selon l'invention ;
- la figure IC est une illustration de produits selon l'invention, à savoir le produit dénommé ExAdEx-tissue, qui est issu de l'amplification du mélange de la fraction stroma-vasculaire et de la matrice extracellulaire, et le produit dénommé ExAdEx-lobules , qui est issu de la formation d'agrégats, conformément à une étape additionnelle du procédé selon l'invention ;
- la figure 1D illustre les étapes d'obtention du produit ExAdEx-lobules à partir du produit ExAdEx-tissue selon le procédé de l'invention ;
- les figures 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 21, 2J et 2K sont des graphes qui comparent, respectivement, les quantités exprimées, en PCR quantitative, des gènes suivants listés ci-après dans les produits ExAdEx-lobules et ExAdeX-tissue : FABP4, PLIN1, Adiponectine, CD31, DPP4, ICAM1, PDGFRa, Inhibine beta A, MSCA1, ILlb (macrophages Ml), MRC1(macrophages M2) ;
- les figures 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G et 3H sont des photographies, obtenues par imagerie confocale, des produits ExAdEx-lobules, mettant en évidence, par marquage immuno-fluorescent, dans lesdits produits, respectivement le collagène I, le collagène IV, la fibronectine, la laminine, l'élastine, DPP4, ICAM1 et CD31 ;
- les figures. 4A, 4B et 4C sont des figures représentatives de la présence, respectivement, du marqueur d'hypoxie CA9, dans les cellules souches adipocytaires humaines pour cinq milieux de prolifération différents testés selon le procédé de l'invention et PLIN1 et UCP1 dans les cellules souches différenciées, pour cinq milieux de prolifération différents enrichis en facteurs de différenciation testés selon le procédé de l'invention } - les figures 5A, 5B et 5C sont des images de microscopie optique qui montrent, respectivement, que le milieu de différentiation permet une différentiation en adipocytes (figure 5A), qu'il est toxique pour les cellules endothéliales en présence de dexaméthasone et de l'IBMX (figure 5B), mais qu'il ne l'est pas, lorsqu'on retire ces composés dudit milieu (figure 5C) ;
- les figures 6A et 6B sont des figures qui illustrent l'expression de PLIN1 et de UCP1 dans différents milieux de différentiation selon l'invention ;
- les figures 7A, 7B et 7C présentent des images de microscopie à fluorescence qui permettent de visualiser les cellules endothéliales et différentes populations de cellules souches du tissu adipeux selon la présence du marqueur CD31 (figure 7A), DPP4 (figure 7B) et ICAMI(figure 7C) dans le tissu adipeux avant la mise en œuvre du procédé selon l'invention (photographies de gauche), après 20 jours dans le milieu de prolifération (photographies du centre) et après 20 jours dans le milieu de prolifération puis 20 jours dans le milieu de différenciation, sauf pour ICAM1 (photographies de droite sauf pour ICAM1) ;
- les figures 8A et 8B présentent des images de microscopie à fluorescence avec marquage, par des anticorps couplés à des fluorochromes, des protéines DPP4 et ICAM1 dans les fractions stroma-vasculaire et la matrice extracellulaire formant la fraction dite « Endostem » sur ces figures, avant mélange selon le procédé selon l'invention ;
- la figure 9A montre, par microscopie à fluorescence, que la matrice M2 est de type riche en collagène ; collagène marqué au PicroSirius Red (gris clair) et marquage des noyaux (blanc) ;
- la figure 9B montre, par microscopie à fluorescence, que la matrice M3 est de type fibreux ; collagène marqué au PicroSirius Red (gris clair et fibres blanches) et marquage des noyaux (blanc) ;
- la figure 9C caractérise, en microscopie, le type fibreux de la matrice Ml ;
- la figure 9D montre, par microscopie, que la matrice M2 est hétérogène en termes de types matricielles : type fibreux et type riche en collagène ;
- la figure 9E est une image de microscopie illustrant le type fibreux de la matrice M3 ;
- la figure 10A est une photographie du tissu adipeux centrifugé de la fraction A après dissociation mécanique contenant la matrice M4 ;
- la figure 10B met en évidence par microscopie en fluorescence, dans la matrice M4, des adipocytes matures par coloration Oil Red O (gris clair) et une matrice riche en collagène par marquage du collagène de type I (gris très clair) ;
- la figure 10C montre, par l'immunomarquage CD31, les structures capillaires formées par des cellules endothéliales CD31+ (blanc) dans la matrice M4 ; marquage des noyaux (gris foncé) ; - la figure 10D illustre la présence du réseau de cellules souches du tissu adipeux PDGFRa+ (points gris clair) dans la matrice M4 ; marquage des noyaux (gris foncé) ;
- la figure 11 montre, par incorporation d'Edu, 5-ethylnyl- 2'-deoxyuridine, dans le noyau des cellules en prolifération, que les cellules endogènes, dans la matrice extracellulaire de l'invention sont maintenues en prolifération dans le milieu EGM+™ en suspension ; noyaux (gris foncé), cellules en prolifération (blanc) auto fluorescence de la matrice (gris clair) ;
- la figure 12 montre que des cellules souches du tissu adipeux exogènes, mises en coculture avec la matrice extracellulaire de l'invention, forment des structures composées de ces cellules souches du tissu adipeux et des cellules endogènes présentent dans la matrice ; image prise après 3 jours de co-culture, noyaux (gris foncé), collagène (gris clair), cellules souches exogènes du tissu adipeux (gris clair/blanc) ;
- la figure 13A montre l'absence de prolifération de cellules lors de la culture cellulaire des cellules souches du tissu adipeux et des cellules endothéliales en suspension sans matrice extracellulaire, issue de la fraction stroma vasculaire ; image prise après 10j de co culture ; noyaux (gris foncé), noyaux de cellules en prolifération (gris très clair) ;
- la figure 13B met en évidence une capacité de prolifération des cellules de la fraction stroma- vasculaire, en suspension, avec la matrice extracellulaire de l'invention ; image prise après 10j de co-culture ; noyaux (gris foncé), matrice collagène (gris clair), noyaux de cellules en prolifération par marquage Edu (blanc) ;
- la figure 14A montre le niveau d'expression du marqueur de cellules endothéliales CD31 dans des populations cellulaires différenciées obtenues par culture, en suspension, avec (droite) et sans (gauche) la matrice extracellulaire de l'invention ;
- la figure 14B montre le niveau d'expression du marqueur de cellules souches adipocytaires PDGFRa dans les populations cellulaires différenciées obtenues par culture, en suspension, avec (droite) et sans (gauche) la matrice extracellulaire de l'invention ;
- la figure 14C montre le niveau d'expression du marqueur d'adipocytes matures PLIN1 dans les populations cellulaires différenciées obtenues par culture, en suspension, avec (droite) et sans (gauche) la matrice extracellulaire de l'invention ;
- la figure 14D montre le niveau d'expression du marqueur d'adipocytes matures Adiponectine dans les populations cellulaires différenciées obtenues par culture, en suspension, avec (droite) et sans (gauche) la matrice extracellulaire de l'invention ;
- les figures 15A et 15B sont des images qui mettent en évidence l'activation des capacités de prolifération du procédé selon l'invention. En figure 15A, un tissu adipeux non dissocié ne montre pas de cellules en prolifération. En figure 15B, la composition montre des cellules en prolifération, les noyaux des cellules en prolifération étant représentés en blanc sur cette figure ;
- les figures 16A, 16B, 16C, 16D, 16E et 16F sont des images dans lesquelles les cellules en prolifération, qui sont contenues dans la matrice dite Endostem, sont marquées, en l'absence de la fraction stroma-vasculaire (figures 16A, 16C, 16E) et avec l'ajout de cette fraction stroma-vasculaire (figures 16B, 16D, 16F) après 20 jours de culture dans le milieu de prolifération ;
- les figures 17A, 17B, 17C, 17D, 17E et 17F illustrent l'expression de la dipeptidyl peptidase-4 (DPP4), qui est concentrée dans la fraction stroma vasculaire isolée, et l'expression de ICAM1 et CD31, qui est concentrée dans la matrice isolée (Figs. 17A, 17C, 17E), et l'expression de DPP4, ICAM1 et CD31 dans la composition amplifiée (Figs. 17B, 17D, 17F) ;
- la figure 18 est composée de quatre photographies qui illustrent la capacité de prolifération des cellules (EdU positives) qui présentent le marqueur DPP4 au sein de la matrice extracellulaire du tissu adipeux dans le procédé selon l'invention ;
- la figure 19 est composée de photographies qui illustrent la capacité de différentiation en adipocytes bruns ou beiges des populations cellulaires présentent le marqueur DPP4 (trois photographies du haut de la figure) ou qui ne présentent pas ce marqueur DPP4 (trois photographies du bas) ; - les figures 20A et 20B sont des graphes qui illustrent la capacité de différentiation en adipocytes bruns ou beiges des populations cellulaires, exprimant DPP4 ou pas, obtenues en PCR quantitative, en temps réel du marqueur PLIN1 (Figure 20A) et du marqueur UCP1 (Figure 20B) ;
- les figures 21A et 21B illustrent la présence de macrophages de type Ml et de type M2 respectivement, dans la composition amplifiée selon l'invention ;
- la figure 22 comprend un ensemble de photographies qui démontrent la présence de certaines protéines dans la matrice extracellulaire selon l'invention, et la conservation d'un réseau capillaire ;
- la figure 23 montre l'expression relative de l'UCPl humain, au jour J0, soit avant transplantation du produit ExAdeX-tissue amplifié et au jour J21, dans le produit ExAdeX-tissue, après transplantation chez la souris ;
- la figure 24 montre trois photographies de microscopie a fluorescence, la photographie de gauche montrant l'absence d'adipocytes bruns/beiges dans le tissu adipeux blanc avant la mise en œuvre du procédé de l'invention, la photographie du centre montrant la présence d'adipocytes bruns/beiges, spécifiquement marqués en gris clair par l'expression, chez un individu en surpoids, de la protéine UCP1, ex vivo après le procédé d'amplification et de différenciation, et la photographie de droite montrant la présence d'adipocytes bruns/beiges ex vivo, après la mise en œuvre de l'invention, chez un patient, avec une obésité sévère ; - les figures 25A, 25B et 25C montrent la viabilité de cellules souches du tissu adipeux après purification de la fraction stroma-vasculaire, directement après incubation dans un tampon de lyse IX, nommé ACL, comprenant du chlorure d'ammonium (figure 25A), après 24h de culture (figure 25B) et après 5 jours en conditions de culture adhérente (figure 25C) ;
- les figure 26A, 26B, 26C et 26D présentent les résultats graphiques de l'analyse par cytométrie en flux du nombre de cellules viables et mortes après différents temps de traitements dans un tampon de lyse IX, nommé ACL, comprenant du chlorure d'ammonium ;
- les figures 27A, 27B et 27C montrent la viabilité de cellules endothéliales du tissu adipeux après purification de la fraction stroma-vasculaire, directement après incubation dans un tampon de lyse IX, nommé ACL, comprenant du chlorure d'ammonium (figure 27A), après 24h de culture (figure 27B) et après 5 jours en conditions de culture adhérente (figure 27C) ;
- la figure 28 présente le profil des cellules souches du tissu adipeux, amplifiées selon le procédé ExAdEx de l'invention, obtenu par détermination par cytométrie en flux des marqueurs de surface cellulaire ;
- les figures 29A et 29B présentent les profils des ASCs du tissu adipeux ex vivo (figure 29A) et du produit amplifié ExAdEx (figure 29B) obtenu par détermination des marqueurs de surface cellulaire obtenu par cytométrie en flux ; - les figures 30A, 30B et 30C montrent des cellules endothéliales isolées du tissu adipeux humain qui sont cultivées dans le milieu de prolifération décrit dans l'invention (figure 30A), dans le milieu de différentiation décrit dans l'invention (figure 30B) et dans un milieu de différentiation standard non optimisé qui comprend du DMEM et du sérum (figure 30C).
- la figure 31 présente une visualisation en blanc, d'un réseau vasculaire fonctionnel de la composition décrite dans l'invention après transplantation chez la souris Nude (4 semaines post greffe) ; et
- la figure 32 présente une comparaison des capacités de viabilité et d'amplification des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux selon un procédé ne comprenant pas l'ajout de la fraction stroma- vasculaire (A) et comprenant la purification puis l'ajout des cellules isolés de l'infranatant, également nommé dans l'invention fraction stroma vasculaire (B).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Le tissu adipeux est fourni pour réaliser l'invention. Il s'agit en pratique de tissu adipeux par exemple blanc provenant d'individus, par exemple, mais non exclusivement, d'individus en surpoids, notamment obèses et/ou présentant des désordres métaboliques tels que le diabète de type 2 et des maladies cardio-vasculaires.
L'invention a pour premier objet, un procédé d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges à partir du tissu adipeux, par exemple blanc, humain comprenant les étapes suivantes : extraction, d'une part, d'une fraction stroma-vasculaire (Figure IA, étapes 1-2 et Figure IB, étapes 1-3 et étape 5) dite mécanique d'un tissu adipeux humain comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules souches du tissu adipeux humain et, d'autre part, d'une matrice extracellulaire dudit tissu adipeux humain (Figure IA, étape 3 et Figure IB, étape 4), ladite matrice extracellulaire comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain, des cellules souches du tissu adipeux humain et du collagène, l'extraction de ladite matrice extracellulaire comprenant une étape de dissociation mécanique (Figure IA, étape 3 et Figure IB, étape 4) ; mélange de ladite fraction stroma-vasculaire et de ladite matrice extracellulaire (Figure IA, étape 4 et Figure IB, étape 6) ; et culture du mélange obtenu à l'étape précédente, en suspension, dans un milieu de culture, à savoir de prolifération cellulaire. Ce procédé est également dénommé, ci-après, « procédé ExAdEx » (pour Ex vivo Adipocytes Expansion).
Au sens de la présente invention, il est entendu par « fraction stroma-vasculaire » les cellules présentes dans un prélèvement de tissu adipeux humain. Cette fraction stroma-vasculaire comprend des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules souches du tissu adipeux humain. La fraction stroma- vasculaire selon l'invention, également nommée infranatant, est avantageusement issue des étapes 2 et 3 décrites sur la figure IB, et est riche en cellules DPP4+. Au sens de l'invention, il est entendu par « matrice extracellulaire » une matrice bioactive, c'est à dire une matrice qui comprend différentes protéines du tissu adipeux (Figure 22) et des cellules endogènes, comprenant notamment des cellules endothéliales (Figure 10C), des cellules souches du tissu adipeux (Figure 10D), des adipocytes et des macrophages. La Figure il montre la présence de cellules en prolifération dans la matrice extracellulaire (marquage Edu en blanc). Cette matrice extracellulaire permet l'amplification cellulaire en 3D, c'est-à-dire la prolifération des cellules en trois dimensions. La matrice extracellulaire de l'invention est également notée ci-après « EndoStem-Matrix » ou « matrice EndoStem ».
Les protéines de la matrice extracellulaire du tissu adipeux comprennent du collagène. Ce collagène est structuré. Il présente une organisation fibrillaire. Il s'agit notamment de collagène de type I et de type III (voir les figures 9A et 9B montrant des fibres de collagène fibrillaire marqué par le PicroSirius Red et la figure 10B qui montre le collagène de type I marqué par un anticorps anti-collagène I et observé par microscopie confocale). Les protéines de la matrice extracellulaire du tissu adipeux comprennent en outre notamment de la fibronectine, de l'élastine, de la laminine et du collagène de type IV (Figure 22).
L'extraction de la matrice extracellulaire comprend une étape de dissociation non-enzymatique, en particulier l'extraction de la matrice extracellulaire comprend une étape de dissociation mécanique. La « dissociation mécanique » de l'invention permet de conserver intacte la structure de la matrice extracellulaire tandis qu'une digestion enzymatique fait généralement intervenir de la collagénase qui la digère. La dissociation mécanique permet ainsi le maintien de la « vasculature », ainsi que cela est montré à la Figure 7A, dans laquelle apparaît le réseau vasculaire avant dissociation dans le tissu adipeux humain dans la photographie de gauche et le réseau vasculaire après dissociation et amplification dans la photographie du milieu. Cette dissociation mécanique permet en outre le maintien de la microstructure de la matrice extracellulaire, qui présente en conséquence une organisation semblable à l'organisation du tissu adipeux in vivo.
L'extraction de la fraction stroma-vasculaire et de la matrice extracellulaire comprend les étapes suivantes : centrifugation du tissu adipeux humain pour obtenir au moins deux fractions distinctes, une fraction A comprenant une matrice extracellulaire centrifugée, et la fraction stroma-vasculaire ; et dissociation mécanique de la fraction A pour obtenir la matrice extracellulaire (Figure IA).
L'étape de centrifugation du tissu adipeux humain permet en outre d'éliminer de l'huile, du sang et du liquide anesthésique contenus dans le tissu adipeux humain fourni. Cette étape permet également d'éliminer du liquide physiologique issu de lavages préalables du tissu adipeux humain fourni.
Dans un mode de réalisation particulier, l'extraction de la fraction stroma-vasculaire et de la matrice extracellulaire comprend les étapes suivantes : centrifugation du tissu adipeux humain pour obtenir au moins deux fractions distinctes, une fraction A comprenant une matrice extracellulaire centrifugée et une fraction B comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules souches du tissu adipeux humain ; dissociation mécanique de la fraction A pour obtenir une fraction A' comprenant une matrice extracellulaire dissociée ; centrifugation de la fraction A' pour obtenir au moins la matrice extracellulaire et une fraction B' comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules souches du tissu adipeux humain; et mélange des fractions B et B' pour obtenir la fraction stroma-vasculaire mécanique (Figure IB).
Dans ce mode de réalisation, l'étape de centrifugation du tissu adipeux humain permet en outre d'éliminer de l'huile, du sang et du liquide anesthésique contenus dans le tissu adipeux humain fourni. Cette étape permet également d'éliminer du liquide physiologique issu de lavages préalables du tissu adipeux humain fourni. La centrifugation de la fraction A' permet en outre d'éliminer d'éventuels résidus d'huile et de liquide physiologique. Cette étape de centrifugation de la fraction A' est optionnelle .
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comporte en outre une étape d'élimination des cellules sanguines. Il s'agit d'une élimination des cellules sanguines de type érythrocytes, présentes dans le tissu adipeux et dans les différents culots cellulaires, nommées SVF mécanique, obtenus lors des étapes précitées du procédé de dissociation mécanique dit ExAdEx. Cette étape d'élimination est réalisée lors d'une incubation du tissu adipeux et/ou des culots cellulaires dans un tampon de lyse IX comprenant du chlorure d'ammonium (« Ammonium chlorure lysing solution », Becton Dickinson™ - nommé ACL) dilué dans de l'eau stérilisée, dans un rapport tampon : échantillon, variant de 1:1 à 1:10, à une température comprise entre 4 et 37°C et durant un temps d'incubation variant de 5 minutes à 30 minutes. Cette étape permet la lyse des érythrocytes. Les figures 25A, 25B et 25C ainsi que les figures 26A, 26B, 26C et 26D présentent l'effet, sur les cellules souches du tissu adipeux, du traitement ACL. Il en résulte qu'une incubation dans l'ACL, sur une période de temps supérieure à 5 minutes, endommage la viabilité et les capacités de prolifération des cellules souches contenues dans l'infranatant. Par ailleurs, les figures 27A, 27B et 27C illustrent l'absence d'effet de l'incubation dans l'ACL sur la viabilité et les capacités de prolifération des cellules endothéliales du tissu adipeux contenues dans l'infranatant.
La culture du mélange de la fraction stroma-vasculaire et de ladite matrice extracellulaire comprend les étapes suivantes : transfert dudit mélange de manière stérile dans une poche de culture en suspension comprenant du milieu de prolifération ; et amplification dudit mélange formant des amas cellulaires.
Le transfert de « manière stérile », au sens de l'invention, est un transfert, de préférence, réalisé en système clos. Ce transfert de manière stérile permet de d'éviter la présence de contaminants lors de la culture cellulaire. La dissociation mécanique des amas cellulaires formés au cours de l'amplification ne nécessite pas d'ouverture du système, évitant ainsi l'exposition des produits cellulaires à une contamination de la culture par les éléments de l'environnement.
Dans un mode de réalisation, le milieu de prolifération, dans la poche de culture en suspension, est un milieu EGM+™. Ce milieu de prolifération comprend le milieu de base pour la prolifération des cellules endothéliales (EGM) enrichi en Epidermal Growth Factor (EGF), Basic Growth Factor (FGF2), Insulin-like Growth Factor, Vascular Endothélial Growth Factor 165, acide ascorbique, héparine et hydrocortisone (EGM+). Le milieu EGM+ permet également l'amplification des cellules souches adipocytaires sans altérer leur capacité de différenciation en adipocytes.
Le procédé de l'invention permet une amplification du nombre de cellules souches du tissu adipeux avec un facteur d'amplification supérieur à 10, avantageusement supérieur à 20, en particulier supérieur à 30, de préférence supérieur à 35. Le facteur d'amplification est le rapport entre le nombre de cellules obtenues après culture de la SVF isolée en présence de ladite matrice extracellulaire et le nombre de cellules avant l'invention. Dans un mode de réalisation particulier décrit dans l'exemple 2, le procédé de l'invention présente un facteur d'amplification de 36 en 8 jours.
Selon un second objet, l'invention concerne un procédé d'amplification in vitro ou ex vivo des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges comprenant les étapes suivantes : amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches du tissu adipeux humain telle que définie ci-dessus ; et induction d'une différenciation des cellules souches du tissu adipeux pour obtenir des adipocytes bruns ou beiges. Autrement dit, selon un second objet, l'invention concerne un procédé d'obtention in vitro ou ex vivo d'adipocytes bruns ou beiges comprenant les étapes suivantes : amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches du tissu adipeux humain telle que définie ci-dessus ; et induction d'une différenciation des cellules souches du tissu adipeux pour obtenir des adipocytes bruns ou beiges.
Plus précisément, le procédé d'amplification in vitro ou ex vivo des adipocytes bruns ou beiges comprend donc les étapes suivantes : extraction, d'une part, d'une fraction stroma-vasculaire d'un tissu adipeux humain comprenant, des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules souches du tissu adipeux humain et, d'autre part, d'une matrice extracellulaire dudit tissu adipeux humain, ladite matrice extracellulaire comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain, des cellules souches du tissu adipeux humain et du collagène ; mélange de ladite fraction stroma-vasculaire mécanique et de ladite matrice extracellulaire ; culture du mélange obtenu à l'étape précédente, en suspension, dans un milieu de prolifération cellulaire ; et induction d'une différenciation des cellules souches du tissu adipeux pour obtenir des adipocytes bruns ou beiges. Autrement dit, le procédé d'obtention in vitro ou ex vivo des adipocytes bruns ou beiges comprend donc les étapes suivantes : extraction, d'une part, d'une fraction stroma-vasculaire d'un tissu adipeux humain comprenant, des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux humain et, d'autre part, d'une matrice extracellulaire dudit tissu adipeux humain, ladite matrice extracellulaire comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain, des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux humain et du collagène ; mélange de ladite fraction stroma-vasculaire mécanique et de ladite matrice extracellulaire ; culture du mélange obtenu à l'étape précédente, en suspension, dans un milieu de prolifération cellulaire ; et induction d'une différenciation des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux pour obtenir des adipocytes bruns ou beiges.
Le procédé d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules différenciées comprenant les étapes liées à l'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches du tissu adipeux, les précisions données ci-dessus pour le procédé d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches du tissu adipeux s'appliquent également pour le procédé d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules différenciées. Autrement dit, le procédé d'obtention in vitro ou ex vivo d'adipocytes bruns ou beiges comprenant les étapes liées à l'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux, les précisions données ci-dessus pour le procédé d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux s'appliquent également pour le procédé d'obtention in vitro ou ex vivo d'adipocytes bruns ou beiges.
En particulier, l'extraction de la matrice extracellulaire comprend une étape de dissociation non-enzymatique, en particulier l'extraction de la matrice extracellulaire comprend une étape de dissociation mécanique. Dans un mode de réalisation, l'extraction de la fraction stroma-vasculaire et de la matrice extracellulaire comprend les étapes suivantes : centrifugation du tissu adipeux humain pour obtenir au moins deux fractions distinctes, une fraction A comprenant une matrice extracellulaire centrifugée, et la fraction stroma- vasculaire ; et dissociation mécanique de la fraction A pour obtenir la matrice extracellulaire.
Dans un autre mode de réalisation, l'extraction de la fraction stroma-vasculaire et de la matrice extracellulaire comprend les étapes suivantes : centrifugation du tissu adipeux humain pour obtenir au moins deux fractions distinctes, une fraction A comprenant une matrice extracellulaire centrifugée et une fraction B comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules souches du tissu adipeux humain ; dissociation mécanique de la fraction A pour obtenir une fraction A' comprenant une matrice extracellulaire dissociée ; centrifugation de la fraction A' pour obtenir au moins la matrice extracellulaire et une fraction B' comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules souches du tissu adipeux humain ; et mélange des fractions B et B' pour obtenir la fraction stroma-vasculaire.
Le collagène de la matrice extracellulaire comprend du collagène de type I et du collagène de type III révélé par coloration au Picrosirius Red (voir Figure 9A et Figure 9B). Dans un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, ledit procédé comporte en outre une étape de tri-cellulaire visant à trier les cellules souches exprimant le marqueur de surface DPP4, aussi appelé CD26. Une variante possible consiste à sélectionner/trier les cellules exprimant CD26/DPP4, principalement avant le procédé dit ExAdEx, après mélange de la fraction stroma- vasculaire et de la matrice extracellulaire, mais avant culture dudit mélange, en suspension, dans le milieu de prolifération cellulaire. Les objectifs sont notamment d'enrichir le produit utilisé en cellules précurseurs d'adipocytes bruns ou beiges et, d'autre part, d'homogénéiser et de standardiser la composition du produit cellulaire à amplifier.
En effet, un tri des cellules souches du tissu adipeux humain trié selon la présence du marqueur de surface CD26 a mis en évidence que les cellules exprimant le marqueur de surface CD26 ont la capacité de se différencier préférentiellement en adipocytes bruns/beiges. La Figure 20A montre que les populations DPP4+ et DPP4- ont toutes la capacité de se différencier en adipocytes selon l'expression du marqueur PLIN1 (Figure 20A). En revanche, seule la population DPP4+ se différencie en adipocytes exprimant le marqueur d'adipocyte brun/beige UCP1 (Figure 20B). Une illustration en Figure 19 montre par imagerie par fluorescence de la protéine UCP1 que la protéine UCP1 n'est exprimée que dans les cellules souches du tissu adipeux exprimant DPP4+ et différenciées dans un milieu adipogénique. L'utilisation du produit, qui est obtenu après culture des cellules triées, concerne principalement les applications de thérapie cellulaire de l'obésité et des maladies métaboliques, toutefois des applications in vitro de ce type de produit à composition contrôlée sont également possibles. Les modalités méthodologiques du tri cellulaire reposent sur la fixation d'anticorps spécifiques de DPP4 pour identifier les cellules exprimant cette protéine. Une première technique de séparation consiste à utiliser des anticorps couplés à des fluorochromes, le tri s'opère sur une plateforme de tri cellulaire automatisée (type Aria III™, BD) qui est un cytomètre/trieur de cellules à haut débit capable de séparer au moins quatre populations cellulaires différentes. L'autre méthode concerne le tri cellulaire immuno-magnétique, basée sur l'utilisation d'anticorps couplés à des billes magnétiques qui permettent la rétention des cellules d'intérêt dans un champs magnétique (technologie type cliniMACs™, Miltenyi Biotec™). Ces deux techniques permettent d'atteindre des degrés élevés d'homogénéité du produit cellulaire d'intérêt dans le produit final (>95%). Ces techniques sont toutes compatibles avec des tris réalisés en condition GMP pour des applications de thérapie cellulaire sous réserve de disposer des plateformes adaptés (Automate CliniMacs™ pour le tri magnétique, Cytomètre trieur GMP).
Dans un mode de réalisation de l'invention, la culture du mélange de ladite fraction stroma-vasculaire et de ladite matrice extracellulaire comprend les étapes suivantes : transfert dudit mélange de manière stérile dans une poche de culture en suspension comprenant du milieu de culture ; amplification dudit mélange formant des amas cellulaires ;
Le produit issu de l'amplification du mélange de la fraction SVF mécanique et de la fraction matrice peut être dénommé « ExAdEx-tissue ». Le produit issu de la formation d'agrégats dans une étape supplémentaire en fin de procédé, peut être dénommé « ExAdEx-lobules ». Ces produits sont schématisés en Figure IC. Le produit EXADEX-lobules est un produit qui peut être obtenu dans une étape additionnelle du procédé selon l'invention. A l'issue de l'étape de mise en co-culture, le produit est mis en amplification dans le milieu de prolifération EGM+ dans des flasques de culture, comme décrit précédemment. Il constitue alors le produit amplifié ExAdEx-tissue. Ainsi que cela est illustré à la Figure 1D, on transfère ce produit amplifié dans des plaques de cultures ULA (Ultra-Low Attachment - Attachement Ultra-Faible), non-adhérentes, de 6 puits, 12 puits ou 24 puits dans le milieu de prolifération, notamment EGM+, avec ou sans agitation. Une formation d'agrégats est alors observée. Ceux-ci comportent l'ensemble des caractéristiques décrites dans le produit ExAdEx-tissue, après 3 à 10 jours, dans les conditions décrites. Ces caractéristiques sont définies par la présence de cellules souches du tissu adipeux humain, les cellules endothéliales et les composants de la matrice extracellulaire. Ce produit est également caractérisé par la présence de cellules adipocytes matures et de macrophages. Parmi les marqueurs moléculaires, et ainsi que cela est montré aux Figures. 2A à 2K, on retrouve les marqueurs CD31, DPP4, ICAM1, PDGFRA, PLN1, ADIPONECTIN, FABP4, IL1B et MRC1. Ces figures montrent une comparaison de l'expression des marqueurs précédemment cités, retrouvé dans le produit ExAdEx-tissue et ExAdEx-lobules de façon comparable. Seul l'expression de MSCA1 est différente entre les deux produits et constitue la signature moléculaire des ExAdEx-lobules en comparaison au produit ExAdEx-tissue. Une caractérisation des protéines présentes dans les ExAdEx-lobules a également été faite par microscopie confocale à fluorescence et montre la présence des principales protéines de la matrice extracellulaire du tissu adipeux, notamment le collagène de type I (Figure 3A) et du collagène de type IV (Figure 3B), mais également de la fibronectine (Figure 3C), de la laminine (Figure 3D), de l'élastine (Figure 3E) et des marqueurs de cellules souches du tissu adipeux DPP4 (Figure 3f), ICAMI (Figure 3G), ainsi que des cellules endothéliales CD31 (Figure 3H). Les unités produites sont de tailles plus homogènes que le produit ExAdEx-tissue et sont adaptées aux standards utilisés par les industries pharmaceutiques dans le cadre de criblage de molécules. Le produit ExAdEx-lobules est aussi mieux adapté à l'injection à la seringue dans le cadre d'une thérapie cellulaire. Ces unités ExAdEx-lobules peuvent être produites à partir du produit ExAdEx-tissue à différents temps d'amplification, par exemple à partir de 10 jours d'amplification et jusqu'à 40 jours. Ces agrégats, une fois formés, ne possèdent plus de capacités d'amplification mais possèdent une viabilité en culture supérieure à 10 jours. Les unités de ExAdEx-lobules peuvent être maintenues dans la gamme de produit en adipocytes blancs ou induit en différenciation ou différenciés en adipocytes bruns/beiges.
En définitive, le procédé selon l'invention a pour objet d'amplifier les cellules souches adipocytaires (hASCs) brunes ou beiges, maintenues dans une matrice extracellulaire active, en 3D et, puis de les différencier en adipocytes bruns ou beiges tout en permettant de maintenir viables des cellules du microenvironnement du tissu adipeux à savoir les cellules endothéliales (hECs) et des macrophages Ml et M2 (Figs. 21A, 21B). A cet effet, des milieux de culture ont été développés, car le milieu de culture utilisé classiquement pour la prolifération et la différenciation des hASCs est toxique pour les hECs et le milieu de culture utilisé classiquement pour la prolifération des hECs est inhibiteur de la différenciation des hASCs. Deux milieux de culture ont donc été établis : un milieu de prolifération, qui permet la prolifération des hASCs et un milieu de différentiation, qui permet la différenciation des hASCs amplifiées en adipocytes exprimant le marqueur UCP1. L'originalité de ces deux milieux de culture est qu'ils sont également compatibles avec le maintien des cellules endothéliales du tissu adipeux humain.
Le milieu référencé DMEM (Dulbecco™ Modified Eagle Medium), comprenant 10% FCS (Fêtai Bovine Sérum - Sérum Fœtal de Veau) est le milieu de référence pour la prolifération des hASCs. Toutefois, ce milieu ne permet pas de maintenir viables les cellules endothéliales. Pour la détermination du milieu de prolifération, cinq milieux, qui sont généralement commercialisés pour la prolifération des cellules endothéliales humaines, ont été testés. Il s'agit des milieux suivants :
N°l: Endo-BM EPC : Commercialisé par la société PrepoTech™ (référence produit : Cat: GS-EPC)
N°2: Endo-BM MacroV Commercialisé par la société
PrepoTech™ (référence produit : Cat: GS-MacroV)
N°3: Endo-BM MicroV Commercialisé par la société
PrepoTech™ (référence produit : Cat: GS-MicroV) N°4: EGM+ Commercialisé par la société Promocell™ (référence produit : Cat: CC-22011 plus C-39216)
N°5 MV2 Commercialisé par la société Promocell™ (référence produit : Cat: CC-39226 plus C-22022B)
En culture en 2D, ces cinq milieux permettent la prolifération des cellules souches du tissu adipeux humain avec la même efficacité que le milieu de référence. Cependant, le milieu de prolifération N°4, à savoir EGM+, a été choisi, car, notamment, contrairement aux autres milieux testés, l'EGM+ n'induit pas d'hypoxie cellulaire, suivie par le marqueur d'hypoxie CA9, lorsque les hASCs sont en suspension en 3D, ainsi que cela est montré à la Figure 4A.
La composition du milieu de prolifération EGM+ est la suivante : Endothélium Cell Growth Medium (milieu de croissance de cellules endothéliales) supplémenté par: 2% FCS ; 5 ng/ml Epidermal Growth Factor (EGF - Facteur de croissance épidermique) ; 10ng/ml Fibroblast Growth factor (FGF2 - Facteur de croissance des fibroblastes 2) ; 20ng/ml long R3 Insulin_like Growth Factor-1 (IGF-1 - Facteur de croissance 1 ressemblant ou analogue à l'insuline) ; 0,5 ng/ml Vascular Endothélial Growth Factor (VEGF - Facteur de Croissance de l'Endothélium Vasculaire) 165 ; 1 pg/ml Acide Ascorbique; 22,5 pg/ml Héparine ; 0,2 pg/ml Hydrocortisone .
Pour la détermination du milieu de différenciation différents milieux ont été testés. Ces milieux ont été enrichis en facteurs adipogéniques puis testés pour la différenciation des hASCs. Les résultats indiquent que : contrairement aux milieux N°1 à 3, l'EGM+, complémenté en facteurs adipogéniques, permet une différenciation adipocytaire, déterminée par l'expression du marqueur adipocytaire PLIN1, ainsi que cela est montré à la Figure 4B. Cependant, l'expression du marqueur UCP1 spécifique des adipocytes brun/beige est très faible, ainsi que cela est montré à la Figure 4C. Ce premier milieu 4 EGM+ de différenciation est donc non optimisé. A noter également que le milieu n°5 est une option à l'EGM+ qui n'a pas été poursuivie plus avant.
La composition du milieu de prolifération non optimisé est donc avantageusement celle décrite ci-dessus, supplémentée en facteurs de différenciation adipocytaire à savoir : EGM supplémenté en : 2% FCS ; 5 ng/ml EGF ; 10ng/ml FGF2 ; 20 ng/ml long R3 IGF ; 0.5 ng/ml VEGF factor 165 ; 1 pg/ml acide ascorbique ; 22,5 pg/ml Héparine ; 0,2 pg/ml Hydrocortisone ; 2 mM Rosiglitazone ; 1 nM T3 ; 2,5 pg/ml Insuline ; 0,25 mM Dexaméthasone ; 500 mM IBMX, un inhibiteur non spécifique des phosphodiestérases.
Le milieu de différentiation précité, non optimisé, est avantageusement optimisé de la manière suivante. Tout d'abord, avec le retrait de l'EGF et de l'hydrocortisone pour augmenter la différenciation des hASCs : les deux composés sont décrits dans la littérature comme pouvant inhiber l'expression de UCP1. Ensuite, avec le retrait de la Dexaméthasone et de l'IBMX pour maintenir la viabilité des hECs : comme le montre la Figure 5A, le milieu de différenciation permet une différenciation en adipocyte mais est toxique pour les hECs (Cellules Endothéliales - Figure 5B). En revanche, le retrait de la Dexaméthasone et de l'IBMX du cocktail de différenciation après les trois premiers jours permet de maintenir la viabilité des hECs (Figure 5C). Ensuite encore, avec l'ajout du composé SB431542 pour compenser le retrait de la Dexaméthasone et de l'IBMX pour la différenciation en adipocytes : l'impact du retrait de la dexaméthasone et de l'IBMX du cocktail de différenciation après les trois premiers jours est une diminution de la différentiation en adipocytes (PLIN1). L'ajout de l'inhibiteur de la voie TGFb, le SB431542, permet de rétablir la différenciation comme le montre la Figure 6A. Le SB431542 est sans conséquence sur la viabilité des hECs. Finalement, l'ajout de SB431542 et le maintien de la Rosiglitazone permet l'expression de UCP1, ainsi que cela est montré à la Figure 6B. De plus, la présence de la Rosiglitazone est particulièrement avantageuse car l'expression est très faible si la Rosiglitazone n'est présente que les trois premiers jours.
La composition finale du milieu de différentiation optimisé est ainsi avantageusement la suivante : EGM supplémenté en : 0,1% à 5%, de préférence 2% FCS ; 2 ng/ml à 20 ng/ml, de préférence 10 ng/ml FGF2 ; 10 ng/ml à 30 ng/ml, de préférence 20ng/ml long R3 IGF-1 ; 0,1 ng/ml à 1 ng/ml, de préférence 0,5 ng/ml VEGF 165 ; 0,5 pg/ml à 2 pg/ml, de préférence 1 pg/ml acide ascorbique ; 0,5 mM à 4 mM de préférence 2 mM Rosiglitazone ; 0,5 nM à 10 nM, de préférence 1 nM T3 ; 0,5 pg/ml à 10 pg/ml de préférence 2,5 pg/ml Insuline ; 0,1 mM à 0,500 mM, de préférence 0,25 mM Dexaméthasone ; 100 mM à 800 mM, de préférence 500 mM de 3-isobutyl-l-methylxanthine (IBMX) ; 1 mM à 10 mM, de préférence 5 mM de SB431542.
Ce milieu de différentiation est un premier milieu de différentiation, qui comporte de la dexaméthasone et de l'IBMX. Ces composés sont cependant présents uniquement les 3 premiers jours environ de la différentiation. On utilise ensuite un second milieu de différentiation dont la composition est conforme à celle précitée du premier milieu de différentiation, mais qui ne comporte pas de dexaméthasone et d'IBMX.
La composition finale de ce second milieu de différentiation est donc par exemple la suivante : 0,1% à 5%, de préférence 2% FCS ; 2 ng/ml à 20 ng/ml, de préférence 10 ng/ml FGF2 ; 10 ng/ml à 30 ng/ml, de préférence 20ng/ml long R3 IGF-1 ; 0,1 ng/ml à 1 ng/ml, de préférence 0,5 ng/ml VEGF 165 ; 0,5 pg/ml à 2 pg/ml, de préférence 1 pg/ml acide ascorbique ; 0.5 mM à 4 mM de préférence 2 mM Rosiglitazone ; 0,5 nM à 10 nM, de préférence 1 nM T3 ; 0.5 pg/ml à 10 pg/ml de préférence 2,5 pg/ml Insuline ; 1 mM à 10 mM, de préférence 5 mM de SB431542.
Par ailleurs, éventuellement, les premier et/ou second milieux de différentiation comprennent 5 pg/ml à 50 pg/ml, par exemple 22,5 pg/ml d'héparine et 1 mM à 20 mM, par exemple 10 mM de Y27632.
Comme le montre la Figure 7A, les hECs sont toujours détectables après 20 jours dans la composition du milieu de prolifération puis 20 jours de plus dans la composition du milieu de différenciation. A cette Figure, les ECs sont visualisées par expression du marqueur CD31. La photo de gauche est une photo du tissu adipeux avant la mise en œuvre du procédé selon l'invention. La photo du centre est une photo de ce tissu après 20 jours dans le milieu de prolifération. La photo de droite est une photo de ce tissu après 20 jours dans le milieu de prolifération puis 20 jours dans le milieu de différentiation. La Figure 7B montre également que les cellules DPP4 sont toujours détectables après 20 jours dans la composition du milieu de prolifération puis 20 jours de plus dans la composition du milieu de différenciation. Ceci est également valable pour les précurseurs d'adipocytes ICAMI toujours détectables dans le tissu amplifié après 20 jours de co culture (Figure 7C).
Les facteurs qui dans le milieu de différenciation peuvent ne pas être nécessaires ou utilisés dans d'autres conditions : - le Y27632 est rapporté comme augmentant la viabilité de cellules en suspension ; - l'héparine ; et - les facteurs adipogéniques peuvent être utilisés à d'autres concentrations.
Selon un exemple de réalisation de l'invention, la différenciation des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux en adipocytes bruns ou beiges est induite in vivo. L'exemple 4 ci-dessous démontre en effet que le produit amplifié selon le procédé de l'invention permet une différenciation des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux en adipocytes bruns ou beiges, après transplantation chez la souris Nude.
Selon un troisième objet, l'invention concerne une matrice extracellulaire isolée susceptible d'être obtenue selon le procédé défini ci-dessus, comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain, des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux humain et du collagène. Autrement dit, la matrice extracellulaire est extraite lors de l'étape d'extraction du procédé de l'invention, et comprend donc toutes les caractéristiques de la matrice extracellulaire décrite ci-dessus.
Le collagène est du collagène structuré, de type I et du collagène de type III (Figure 9A et Figure 9B). La matrice extracellulaire comprend en outre notamment de la fibronectine (Figure 22).
Selon un quatrième objet, l'invention concerne une composition comprenant le mélange de la matrice extracellulaire et de la fraction stroma-vasculaire tel que défini ci-dessus, la matrice extracellulaire comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain, des cellules souches du tissu adipeux, et du collagène, et la fraction stroma-vasculaire comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux et des cellules souches du tissu adipeux brun ou beige.
Autrement dit, la composition comprend la matrice extracellulaire qui est extraite lors de l'étape d'extraction du procédé de l'invention, ainsi que la fraction stroma-vasculaire qui est extraite lors de cette même étape d'extraction du procédé de l'invention. La matrice extracellulaire de la composition comprend donc toutes les caractéristiques de la matrice extracellulaire décrite ci-dessus. Et la fraction stroma-vasculaire de la composition comprend donc toutes les caractéristiques de la fraction stroma-vasculaire décrite ci-dessus.
Le collagène est du collagène de type I et du collagène de type III. La matrice extracellulaire comprend en outre de la fibronectine (Figure 22). Cette composition, obtenue selon le procédé de l'invention, avant amplification du mélange de la fraction stroma-vasculaire et de la matrice extracellulaire, est une composition tissulaire. Cette composition comprend en outre des adipocytes matures.
Selon un cinquième objet, l'invention concerne un kit comprenant la composition telle que définie précédemment, le milieu de prolifération et le milieu de différentiation.
Selon un sixième objet, l'invention concerne l'utilisation in vitro de la matrice extracellulaire telle que définie ci-dessus ou l'utilisation in vitro de la composition telle que définie ci-dessus pour le criblage et/ou la caractérisation d'actifs pharmacologiques, notamment contre l'obésité et/ou les maladies métaboliques associées comme le diabète de type 2 et les maladies cardio vasculaires .
L'invention concerne en outre des adipocytes bruns ou beiges obtenus selon le procédé défini ci-dessus, ou issus d'une composition telle que définie précédemment, et destinés à une utilisation, ou pour leur utilisation, en thérapie cellulaire, ou pour le traitement des désordres métaboliques. Le terme « issu » doit être compris comme signifiant que les adipocytes proviennent de la composition, par différentiation de cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges.
L'invention concerne ainsi une composition, obtenue selon les procédés de l'invention, comprenant des adipocytes bruns ou beiges ou les précurseurs de tels adipocytes, et destinés à une utilisation, ou pour leur utilisation, en thérapie cellulaire, ou pour le traitement des désordres métaboliques. Cette composition est une composition tissulaire du tissu adipeux humain et comprend l'ensemble du produit obtenu par les procédés de l'invention, c'est- à-dire le mélange de la fraction stroma-vasculaire et de la matrice extracellulaire, après prolifération, voire après différentiation.
Les adipocytes bruns ou beiges ou les précurseurs de tels adipocytes, peuvent être utilisés pour le traitement de l'obésité chez des individus en surpoids ou obèses. A cet effet, et dans un exemple, on réalise un prélèvement d'un tissu adipeux blanc chez un individu. Ce tissu prélevé est ensuite traité selon le procédé de l'invention, afin d'obtenir, toujours dans cet exemple, des produits ExAdEx- tissue voire ExAdEx-lobules tels que décrits précédemment. Ces produits, dans lesquels les cellules souches précurseurs d'adipocytes bruns ou beiges ont subi une amplification, font alors avantageusement l'objet d'une différenciation en adipocytes bruns ou beiges. Puis, les produits comportant ces adipocytes bruns ou beiges sont transplantés, par exemple, dans un tissu adipeux blanc ou à proximité d'un tel tissu de l'individu. Il est à noter que les produits comportant les adipocytes bruns ou beiges sont une composition tissulaire telle que définie au paragraphe précédent. Dans un autre mode de réalisation, on transplante non pas des adipocytes bruns ou beiges mais des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges, ayant subi l'amplification selon le procédé de l'invention, autrement dit une composition tissulaire telle que définie ci-dessus, comprenant le mélange de la fraction stroma- vasculaire et de la matrice extracellulaire après prolifération, et la différentiation en adipocytes blancs ou beiges mature s'effectue dans le corps de l'individu transplanté.
EXEMPLES
EXEMPLE 1. EXTRACTION MECANIQUE a) Procédé d'extraction mécanique en vue de la caractérisation des populations cellulaires et matricielles au cours du processus
L'extraction mécanique de la fraction stroma-vasculaires et de la matrice extracellulaire, à partir d'un prélèvement de tissu adipeux chez un donneur humain, peut être réalisée selon les étapes suivantes (Figs. IA et IB) :
1. Prélèvement de tissu adipeux par aspiration dans une seringue stérile de lOcc équipée d'une canule de Coleman 2mm en dépression -20kPa.
2. Afin de séparer les différentes phases, la seringue est centrifugée à 1600 rcf (force centrifuge relative), 3 min dans le tube de collecte. La fraction huile ainsi que la fraction sang et liquide anesthésique sont éliminées. La fraction culotée, nommée Cl, est conservée.
3. Une unité de sérum physiologique est injectée dans la seringue, suivie d'une incubation de 30 min à 37°C en agitation. La seringue est centrifugée à 1600 rcf, 3 min dans le tube de collecte. La fraction de liquide physiologique et la fraction huile sont éliminées. La fraction culotée, nommée C2, est conservée.
4. La seringue est connectée à une autre seringue de type Luer-Lock mâle reliée par un connecteur de type Tulip® afin de procéder à la dissociation du tissu par une émulsification. Trois types de connecteur Tulip®, 2,4 mm, 1,4 mm puis 1,2 mm, sont successivement utilisés, sur 30 passages.
5. Une unité de sérum physiologique est injectée dans la seringue, suivie d'une incubation de 30 min à 37°C en agitation. La seringue est centrifugée à 1600 rcf 3 min dans le tube de collecte. La fraction de liquide physiologique et la fraction huile sont éliminées. La fraction culotée, nommée C3, est conservée.
6. Le contenu de la seringue ainsi que les contenus Cl, C2 et C3 des tubes de collecte préalablement débarrassés des cellules sanguines sont transférés par une connexion stérile dans une poche de culture contenant le milieu de culture EGM+ à 37°C pour la phase d'expansion.
Lors de l'étape 4 ci-dessus de dissociation du tissu, un connecteur d'une autre marque que la marque Tulip® peut être employé. Le nombre de connecteur employé est compris entre 1 et 5. Le nombre de passages à travers ces connecteurs est compris entre 10 et 50.
La Figure IA montre un procédé permettant de rassembler dans l'étape 2 les populations Cl et C2 ainsi que les matrices Ml et M2. Dans l'étape 3 sont regroupées la population C3 et les matrices M3 et M4. b) Caractérisation des populations cellulaires obtenues
Le procédé décrit ci-dessus permet d'extraire séquentiellement la fraction stroma-vasculaire et une matrice extracellulaire. Les populations cellulaires sont caractérisées en particulier par microscopie à fluorescence, par une caractérisation moléculaire par PCR quantitative et par cytométrie en flux. - La fraction stroma vasculaire obtenu est caractérisé par une majorité de cellules de type DPP4+ (Figure 17A) au niveau de l'expression génique du marqueur DPP4 et par observation de la protéine DPP4 par microscopie (Figure 8A). En comparaison, la protéine ICAMI est peu présente (Figure 17C et Figure 8B).
- La matrice extracellulaire obtenu est caractérisé par une majorité de cellules de type ICAM1+ (Figure 17C) et CD31+ (Figure 17E) au niveau de l'expression génique. Ce résultat est confirmé par la présence de cellules exprimant la protéine ICAM1 observé par microscopie (Figure 8B)
- le produit amplifié ExAdEx obtenu est caractérisé en particulier par la présence de cellules de type CD26+ (figure 28). En particulier, des profils des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux ex vivo et du produit amplifié ExAdEx, sont obtenus par détermination, par cytométrie en flux, des marqueurs de surface cellulaire. Il est ainsi démontré que le procédé de l'invention permet une augmentation de la population de cellules exprimant le marqueur CD26 de 4% à 51% (figure 29A). Les cellules exprimant le marqueur CD54 sont présentes mais pas amplifiées par le procédé de l'invention (figure 29B). c) Caractérisation des matrices Ml à M4 obtenues lors des différentes étapes du procédé
- La matrice obtenue lors de l'étape 2, nommée ici Ml est de type fibreux (Figure 9C).
- La matrice obtenue lors de l'étape 3, nommée ici M2 est de type fibreux et riche en collagène (Figure 9D). Le collagène est révélé par le PicroSirius Red (Figure 9A) qui permet, de plus, de visualiser une structure du collagène en bâtonnets. Cette matrice contient des cellules endogènes.
- La matrice obtenue lors de l'étape 5 et isolé dans le tube de collecte, nommée ici M3, est de type fibreux (Figure 9E et Figure 9B). Cette matrice contient également des cellules endogènes. Le collagène de la matrice isolée est révélé, à la Figure 9B, par le PicroSirius Red qui colore les fibres de collagène de type I et de type III. La coloration rouge (en nuance de gris à la Figure 9B) obtenue indique que le collagène reste organisé, à savoir que le collagène présent présente toujours une structure secondaire en hélice et une structure quaternaire en triple hélice. Il n'est pas dégradé. En effet, le collagène désorganisé se colore en vert par le PicroSirius Red.
- La matrice obtenue lors de l'étape 5 et contenue dans la seringue, nommée ici M4, est composée d'une majorité d'adipocytes matures et d'une trame de collagène de type I (Figure 10B). La matrice M4 est également composée de structures capillaires formées par des cellules endothéliales CD31+ (Figure 10C) et par un réseau de cellules souches du tissu adipeux PDGFRa+ (Figure 10D). d) Purification de l'infranatant C1/C2
Les populations Cl et C2 sont préalablement débarrassées des cellules sanguines par une incubation des culots cellulaires dans un tampon de lyse IX comprenant du chlorure d'ammonium, nommé ACL, dilué dans de l'eau stérilisée, dans un rapport tampon : échantillon, variant de 1:1 à 1:10, à une température comprise entre 4 et 37°C et durant un temps d'incubation variant de 5 minutes à 30 minutes. Afin de déterminer l'effet de ce traitement ACL sur les cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux, une analyse en cytométrie en flux a été réalisée. Ainsi, un total de 1.105 cellules souches du tissu adipeux humain ont été incubées, dans une solution saline comme contrôle, ou à différents temps, dans 10 volumes de la solution de lyse des cellules sanguines. La figure 25A illustre la viabilité directe en termes de nombres de cellules viables après incubation dans les différentes compositions. La figure 25B illustre la viabilité après 24h de culture et la figure 25C présente la capacité de prolifération après 5 jours en conditions de culture adhérente (Test Post hoc de Tuckey * < 0,05 ; ** < 0,01 ; *** < 0,001 pour n= 5). Un résultat graphique de cette analyse par cytométrie en flux est présenté sur les figures 26A, 26B, 26C et 26D et permet de visualiser le nombre de cellules viables et mortes après différents temps de traitements dans l'ACL. Une solution saline est prise comme référence. Sur ces figures apparaissent, dans l'encadré gris à gauche, les cellules viables et dans l'encadré à droite, les cellules mortes, identifiées par le marquage à l'Iodure de Propidium. Ce marquage a la propriété de ne pénétrer que les cellules dont la membrane cellulaire est endommagée. Une autre analyse par cytométrie en flux a également été réalisée afin de déterminer l'influence de la purification de l'infranatant sur les cellules endothéliales du tissu adipeux. Ainsi, un total de 1.105 cellules endothéliales du tissu adipeux humain ont été incubées dans une solution saline comme contrôle, ou à différent temps, dans 10 volumes de la solution de lyse des cellules sanguines. La figure 27A illustre la viabilité directe en termes de nombres de cellules viables après incubation dans les différentes compositions. La figure 27B illustre la viabilité après 24h de culture et la figure 27C présente la capacité de prolifération après 5 jours en conditions de culture adhérente. Il résulte de ces analyses qu'une période d'incubation dans l'ACL supérieure à 5 minutes endommage la viabilité et les capacités de prolifération des cellules souches du tissu adipeux contenues dans l'infranatant. L'incubation dans l'ACL n'a, par ailleurs, pas d'effets sur la viabilité ou les capacités de prolifération des cellules endothéliales du tissu adipeux humain.
EXEMPLE 2. EXPANSION CELLULAIRE ET DIFFERENCIATION
Une méthode d'expansion ex vivo de cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux et de différenciation dans un environnement mimant le tissu adipeux comprend les étapes suivantes :
1. Le produit final obtenu à l'exemple 1 contenant les populations C1-C3 ainsi que les matrices dites EndoStem- Matrix M1-M4 sont misent en culture en suspension dans des poches et maintenues dans le milieu de prolifération EGM+ avec une agitation pendant 24h à 37°C 5% C02, puis maintenues dans les mêmes conditions, de préférence, avec agitation.
2. Le milieu de prolifération EGM+ est changé à 50% tous les deux jours.
3. Une dissociation mécanique en système clos, par passage à travers 2 seringues ou deux poches de culture montées en tulipe, est effectuée au jour 5 et jour 10.
4. Au jour 14, le milieu de prolifération EGM+ est remplacé par le cocktail de différenciation I composé de EGM+ enrichi en 250 mM Dexaméthasone ; 500 mM IBMX ; 1 mM Rosiglitazone ; 2 mM T3 et 2,5 pg/ml insuline. 5. Au jour 17, le milieu de différenciation I est remplacé par le milieu de différenciation II composé de EGM+ enrichi en 1 mM Rosiglitazone ; 2 mM T3 et 2,5 pg/ml insuline.
EXEMPLE 3. CARACTERISATION DE LA CAPACITE D'AMPLIFICATION DE LA MATRICE
Les matrices extracellulaires dites EndoStem-Matrix de l'invention ont été caractérisées, notamment, par microscopie à fluorescence, en présence de différents marqueurs spécifiques. Des cellules en prolifération ont ainsi été détectées par incorporation, lors de la phase de réplication de l'ADN, de Edu (5-ethylnyl-2'-deoxyuridine) fluorescent dans les matrices EndoStem-Matrix de l'invention, comme illustré sur la Figure 11, prouvant que celles-ci sont bioactives. En effet, la Figure 11 montre que les cellules endogènes aux matrices sont maintenues en prolifération pendant la phase d'amplification.
Par ailleurs, la Figure 12 met en évidence la présence de cellules souches exogènes du tissu adipeux mises en co culture après trois jours de co-culture avec la matrice extracellulaire de l'invention. La matrice extracellulaire permet donc de fournir un support pour la prolifération de la fraction stroma-vasculaire : les cellules souches du tissu adipeux ajoutées peuvent s'attacher à la matrice EndoStem-Matrix, en suspension. Ceci montre que des cellules exogènes ont la capacité de s'attacher à la matrice extracellulaire selon l'invention, et démontre que la matrice peut être utilisée en tant que telle et seule pour des applications cliniques ou in vitro et, notamment, pour le criblage et/ou la caractérisation d'actifs pharmacologiques. Les cellules souches exogènes peuvent être génétiquement modifiées, par exemple, pour exprimer une protéine d'intérêt. Les cellules souches exogènes peuvent par ailleurs être des cellules souches non- adipocytaires ou spécifiquement adipocytaires. Il peut s'agir, par exemple, de cellules souches de la peau, notamment des cellules souches épithéliales de la peau ou de cellules souches pluripotentes induites.
En référence à la figure 13B, la fraction stroma-vasculaire est amplifiée par sa culture sur l'EndoStem Matrix de l'invention. A l'inverse, en référence à la figure 13A, lorsque la fraction stroma-vasculaire est mise en culture en suspension sans la matrice extracellulaire, des agrégats cellulaires sans prolifération sont observés. La matrice extracellulaire de l'invention a donc la capacité d'amplifier les cellules souches du tissu adipeux ajoutées.
De plus, la figure 16 permet de mettre en évidence la nécessité de la co-culture de la fraction stroma- vasculaire et de la matrice pour obtenir une amplification des cellules souches du tissu adipeux. Les figures 16A, 16C et 16E montrent une proportion faible de cellules en prolifération dans la matrice Endostem cultivée sans l'ajout de la fraction stroma-vasculaire. En comparaison, les Figures 16B, 16D et 16F montrent que la co-culture de la fraction stroma-vasculaire et de la matrice extracellulaire permet d'obtenir une prolifération supérieure des cellules souches du tissu adipeux. De la même manière, afin de comparer la viabilité et les capacités d'amplification des cellules souches du tissu adipeux, des cellules contenues dans une composition sans ajout de la fraction stroma-vasculaire (figure 32A) ou une composition comprenant un mélange de la matrice extracellulaire et des cellules isolées de l'infranatant (figure 32B) sont isolées par digestion mécanique, mises en culture en conditions adhérentes 48h, puis fixées et colorées au cristal violet, permettant ainsi d'observer la densité cellulaire. Les cellules contenues dans le puits cellulaire apparaissent en noir sur la figure 32. La figure 32A montre ainsi une faible amplification de la population cellulaire en absence de l'ajout de la fraction stroma- vasculaire. A l'inverse, la figure 32B montre une amplification des populations cellulaires de la fraction stroma-vasculaire après mise en culture.
La capacité d'amplification cellulaire des différentes matrices Ml à M4 obtenues au cours des étapes de l'exemple
1 a été vérifiée. Ainsi, environ 104 cellules souches du tissu adipeux ont été maintenues en suspension en présence des différentes matrices Ml à M4 en puits Ultra Low Attachment (ULA). Huit jours après, les cellules sont détachées de la matrice par de la trypsine/EDTA puis comptées. Les valeurs obtenues sont montrées dans le tableau 1 suivant :
[Table 1]
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001
Dans le tableau ci-dessus, pour le cas particulier des matrices individuelle Ml à M4, le facteur d'amplification est le rapport entre le nombre de cellules obtenues après culture en présence de la matrice extracellulaire et le nombre de cellules obtenu en absence de la matrice extracellulaire .
Les matrices M2 et M4 ont un fort pouvoir d'amplification des cellules souches du tissu adipeux. Le volume de matrice
M2 obtenu est très faible comparé au volume de la M4 (Figure 10A). La matrice M4 illustre une matrice extracellulaire telle que définie dans l'invention. Le niveau d'expression de différents marqueurs cellulaires
(marqueur de cellules souches du tissu adipeux et de cellules endothéliales CD31) a été analysé après culture en suspension de la fraction stroma-vasculaire sur la matrice extracellulaire de l'invention dans le milieu de prolifération. Cette étude révèle une amplification des cellules souches du tissu adipeux brun/beige DPP4 (Figure 17B), une conservation des cellules souches précurseurs d'adipocytes du tissu adipeux humain ICAMI (Figure 17D) et la conservation d'une population de cellules endothéliales (Figure 17F).
Le niveau d'expression de différents marqueurs cellulaires (marqueur de cellules endothéliales CD31, marqueur de cellules souches adipocytaires PDGFRa, et deux marqueurs d'adipocytes matures PLN1 et Adiponectine) a été analysé après culture en suspension de la fraction stroma- vasculaire sur la matrice extracellulaire de l'invention après l'étape d'amplification et de différenciation du produit ExAdEx-tissue. La Figure 14 montre une comparaison de ces niveaux d'expression avec ceux issus d'une culture en suspension de la fraction stroma-vasculaire sans la matrice extracellulaire de l'invention. Cette étude révèle une amplification des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux (Figure 14A) et des cellules souches du tissu adipeux (Figure 14B). Cette étude permet également de mettre en évidence la meilleure capacité de différenciation induite par la matrice extracellulaire de l'invention (Figures. 14C et 14D). Ainsi, les cellules souches du tissu adipeux amplifiées en 3D sur la matrice extracellulaire de l'invention gardent leur capacité à se différencier en adipocytes.
Le procédé ExAdEx de l'invention permet, en outre, de conserver le réseau vasculaire natif, lors de l'amplification et de la différentiation cellulaire. Les figures 30A, 30B et 30C illustrent les cellules endothéliales isolées du tissu adipeux humain après culture dans différents milieux. La figure 30A montre les cellules endothéliales du tissu adipeux après culture dans le milieu de prolifération de l'invention. La figure 30B montre les cellules endothéliales du tissu adipeux après culture dans le milieu de différentiation de l'invention. Et la figure 30C montre les cellules endothéliales du tissu adipeux après culture dans un milieu de différentiation standard, non optimisé, qui comprend du DMEM et du sérum. Il en résulte que seuls les milieux décrits dans l'invention permettent une conservation des cellules endothéliales lors des étapes de prolifération et de différentiation en tissu adipeux brun/beige. La conservation des cellules endothéliales est d'intérêt, en particulier, pour des applications de transplantation du tissu adipeux brun/beige, permettant une vascularisation post-greffe et donc une viabilité du produit de transplantation. A cet égard, il est également démontré ici que le réseau vasculaire natif, présent dans la composition amplifiée, et éventuellement différentiée, obtenue par le procédé de l'invention, présente des capacités de revascularisation post-greffe chez la souris Nude. En effet, tel que cela apparait en blanc sur la figure 31, 4 semaines après transplantation chez la souris Nude, la composition de l'invention présente un réseau vasculaire fonctionnel.
On notera qu'un tissu adipeux non dissocié, qui peut être assimilé à un expiant, reste viable peu de temps ex vivo. Ainsi que cela est montré notamment à la Figure 15, la matrice isolée par dissociation contient des cellules en prolifération (Figure 15B), au contraire d'un tissu non dissocié (Figure 15A). Les Figures. 15A et 15B permettent de comparer la prolifération cellulaire dans le tissu non dissocié (Figure 15A) et dans la matrice isolée (Figure 15B). En Figure 15A, le tissu adipeux non dissocié ne montre pas de cellules en prolifération. En Figure 15B, la composition montre des cellules en prolifération. En effet, cette figure fait apparaître, en blanc, les noyaux des cellules en prolifération.
On notera que les cellules isolées selon l'invention, par centrifugation du liquide des lavages, sont caractérisées moléculairement par le marqueur DPP4. DPP4 est un marqueur les cellules précurseurs des pré-adipocytes ICAM1, qui ont une grande capacité de prolifération et qui sont localisées dans le réticulum interstitiel du tissu adipeux. Ce sont des cellules qui ont la capacité de prolifération dans la composition selon l'invention. Il est important de noter que ces cellules sont éliminées à la suite des lavages réalisés selon les procédés de l'art antérieur. Ainsi que cela est montré à la Figure 17A, l'expression de DPP4 est concentrée dans la fraction stroma-vasculaire isolée. La matrice en exprime peu. En revanche, et ainsi que cela est montré à la Figure 17C, l'expression de ICAM1, est concentrée dans la matrice isolée, ainsi que les cellules de type CD31 à la Figure 17E. Les cellules qui portent l'amplification dans la composition sont les cellules exprimant DPP4 ajoutées.
En effet, la Figure 18 montre que dans le produit de co culture, les cellules exprimant le marqueur de prolifération Edu sont les cellules exprimant également le marqueur DPP4. Ainsi, les cellules souches, qui portent le pouvoir d'amplification, sont préférentiellement les cellules de type DPP4 ou CD26+. Par ailleurs, on notera que le tissu adipeux in vivo contient des macrophages et que la composition amplifiée selon l'invention maintient la présence de macrophages de type Ml, ainsi que cela est montré à la Figure 21A et de type M2 ainsi que cela est montré à la Figure 21B. A la Figure 21A, les macrophages de type Ml sont révélés par le marqueur IL-lb et, à la Figure 21B, les macrophages de type M2 sont révélés par le marqueur MRC1.
Enfin, et ainsi que cela est montré à la Figure 22, la matrice isolée selon l'invention comprend des protéines de la matrice extracellulaire, à savoir notamment, le collagène de type I, le collagène de type IV, l'élastine, la fibronectine, la laminine. Le marquage des cellules endothéliales CD31 montre qu'un réseau capillaire est conservé.
EXEMPLE 4 - AMPLIFICATION/DIFFERENTIATION EN ADIPOCYTES BRUNS/BEIGES
La Figure 19 montre que ce sont les cellules DPP4 positives qui sont préférentiellement les précurseurs d'adipocytes bruns/beiges. En effet, une population isolée de cellules souches du tissu adipeux humain exprimant DPP4+ et mise en différenciation selon le milieu décrit dans l'invention (Figure 19 ligne du haut), montre une expression du marqueur UCP1 en microscopie confocale. En revanche, une population de cellules souches du tissu adipeux humain n'exprimant pas le marqueur de surface DPP4, ne montre pas d'expression du marqueur UCP1 après différenciation. Des analyses moléculaires confirment ces observations et montrent que le marqueur de différenciation adipocytaire PLIN1 est comparable pour les populations DPP4 positives et négatives (Figure20A), en revanche, le marqueur de différenciation du tissu adipeux brun/beige est observable uniquement dans la population différenciée à partir de cellules souches exprimant le marqueur DPP4 (Figure 20B).
Le produit ExAdEx-tissue amplifié - mais non différencié - a été injecté au niveau interscapulaire, à proximité du tissu adipeux brun de la souris immunodéficience dite « Nude ». Vingt et un jours après injection (J21) le produit ExAdEx-tissue a été prélevé. Les ARN ont été extraits des cellules constitutives du tissu prélevé. Le niveau d'expression du marqueur d'adipocytes bruns/beiges UCP1 a été comparé à celui du produit avant injection (J0). Les niveaux d'expression de UCP1 à J0 et à J21, ont été déterminés par PCR quantitative en temps réel puis ont été normalisés en les rapportant à un gène de référence dont l'expression ne varie pas dans les 2 conditions, à savoir le gène : GUSB humain (beta glucuronidase). Ainsi que cela est montré à la Figure 23, il apparaît que le tissu amplifié transplanté a fait l'objet d'une différentiation cellulaire in vivo en adipocytes bruns/beiges après transplantation. En pratique, et ainsi que cela est montré à la Figure 24, il n'y a pas d'adipocytes bruns/beiges dans le tissu adipeux sous-cutané blanc avant la mise en œuvre du procédé de l'invention (Figure 24, photographie de gauche). La présence d'adipocytes bruns/beiges (spécifiquement marqués par expression de la protéine UCP1) ex vivo après l'invention à partir de tissu adipeux de personne en surpoids (Figure 24, photographie du milieu). La présence d'adipocytes bruns/beiges ex vivo après l'invention à partir de tissu adipeux d'un patient avec une obésité sévère (Figure 24, photographie de droite).

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'obtention in vitro ou ex vivo d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux comprenant les étapes suivantes : extraction, d'une part, d'une fraction stroma- vasculaire d'un tissu adipeux humain comprenant, des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain et des cellules souches du tissu adipeux humain et, d'autre part, d'une matrice extracellulaire dudit tissu adipeux humain, ladite matrice extracellulaire comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain, des cellules souches du tissu adipeux humain et du collagène, l'extraction de ladite matrice extracellulaire comprenant une étape de dissociation mécanique ; mélange de ladite fraction stroma-vasculaire et de ladite matrice extracellulaire ; culture du mélange obtenu à l'étape précédente, en suspension, dans un milieu de prolifération cellulaire des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux; et induction d'une différenciation des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux pour obtenir des adipocytes bruns ou beiges ; dans lequel l'extraction de la fraction stroma-vasculaire et de la matrice extracellulaire comprenant les étapes suivantes : centrifugation du tissu adipeux humain pour obtenir au moins deux fractions distinctes, une fraction A comprenant une matrice extracellulaire centrifugée, et la fraction stroma-vasculaire ; et dissociation mécanique de la fraction A pour obtenir la matrice extracellulaire.
2. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la différenciation des cellules souches du tissu adipeux est induite dans un milieu de différentiation.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape de dissociation mécanique est une étape de dissociation qui ne fait pas intervenir de collagénase.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'étape de dissociation mécanique est une étape de dissociation non-enzymatique.
5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape d'élimination des cellules sanguines présentes dans la fraction stroma-vasculaire.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le collagène de la matrice extracellulaire est du collagène structuré, qui présente une organisation fibrillaire.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la culture du mélange de ladite fraction stroma-vasculaire et de ladite matrice extracellulaire comprend les étapes suivantes : transfert dudit mélange de manière stérile dans une poche de culture en suspension comprenant le milieu de prolifération ; et amplification dudit mélange pour l'obtention d'un mélange amplifié comprenant des amas cellulaires.
8. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le mélange amplifié comprenant les amas cellulaires fait l'objet d'une dissociation mécanique pour l'obtention d'agrégats cellulaires.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend l'ajout, dans le milieu de prolifération, d'un sérum, d'un facteur de croissance de fibroblastes et d'un facteur de croissance ressemblant à l'insuline.
10. Procédé selon l'une des revendications 2 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend l'ajout, dans le milieu de différenciation, de la Rosiglitazone et/ou du SB431542.
11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape de tri-cellulaire visant à trier les cellules souches exprimant le marqueur de surface DPP4.
12. Matrice extracellulaire extraite selon le procédé selon l'une des revendications 1 à 11, comprenant des cellules endothéliales du réseau vasculaire du tissu adipeux humain, des cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges du tissu adipeux humain, et du collagène.
13. Composition comprenant un mélange de la matrice extracellulaire selon la revendication 13 et d'une fraction stroma-vasculaire extraite selon le procédé selon l'une des revendications 1 à 11.
14. Kit comprenant la composition selon la revendication 13, un milieu de prolifération cellulaire comprenant un sérum, un facteur de croissance de fibroblastes et un facteur ressemblant à l'insuline, et un milieu de différentiation comprenant de la rosiglitazone et/ou du SB431542.
15. Utilisation in vitro de la matrice extracellulaire selon la revendication 12 pour le criblage et/ou la caractérisation d'actifs pharmacologiques.
16. Utilisation in vitro de la composition selon la revendication 13 pour le criblage et/ou la caractérisation d'actifs pharmacologiques.
17. Utilisation in vitro du kit selon la revendication 14 pour le criblage et/ou la caractérisation d'actifs pharmacologiques .
18. Produit comprenant des adipocytes bruns ou beiges obtenu selon le procédé selon l'une des revendications 1 à 11, pour leur utilisation en thérapie cellulaire, ou pour le traitement des désordres métaboliques.
19. Produit comprenant des adipocytes bruns ou beiges obtenu selon le procédé selon l'une des revendications 1 à 11, pour le traitement de l'obésité.
20. Milieu de différentiation pour la différentiation de cellules souches d'adipocytes bruns ou beiges en adipocytes bruns ou beiges selon le procédé selon l'une des revendications 2 à 11, comprenant un milieu de croissance de cellules endothéliales supplémenté en sérum, en facteurs de croissance, en rosiglitazone et en SB431542 et, préférentiellement, en sérum fœtal de veau, en facteurs de croissance de fibroblastes, en facteurs de croissance ressemblant à l'insuline, en facteurs de croissance de l'endothélium vasculaire, en acide ascorbique, en rosiglitazone, en T3, en insuline, et en SB431542.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024160980A1 (fr) * 2023-02-02 2024-08-08 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Procédé de préparation d'une construction de tissu adipeux prévascularisé en 3d, ladite construction de tissu adipeux prévascularisé en 3d et ses utilisations

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180216070A1 (en) * 2015-07-10 2018-08-02 Etablissement Francais Du Sang Method for obtaining human brown/beige adipocytes
CN109010920A (zh) * 2018-09-29 2018-12-18 四川新生命干细胞科技股份有限公司 一种含有干细胞、祖细胞和细胞外基质的美容制剂
WO2020144381A1 (fr) * 2019-01-11 2020-07-16 Universite Cote D'azur Procede d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches du tissu adipeux humain

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180216070A1 (en) * 2015-07-10 2018-08-02 Etablissement Francais Du Sang Method for obtaining human brown/beige adipocytes
CN109010920A (zh) * 2018-09-29 2018-12-18 四川新生命干细胞科技股份有限公司 一种含有干细胞、祖细胞和细胞外基质的美容制剂
WO2020144381A1 (fr) * 2019-01-11 2020-07-16 Universite Cote D'azur Procede d'amplification in vitro ou ex vivo de cellules souches du tissu adipeux humain

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHOI J S ET AL: "Human extracellular matrix (ECM) powders for injectable cell delivery and adipose tissue engineering", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 139, no. 1, 1 October 2009 (2009-10-01), pages 2 - 7, XP026519049, ISSN: 0168-3659, [retrieved on 20090528], DOI: 10.1016/J.JCONREL.2009.05.034 *
DAVID MERRICK ET AL: "Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue", SCIENCE, vol. 364, no. 6438, 25 April 2019 (2019-04-25), US, pages eaav2501, XP055679681, ISSN: 0036-8075, DOI: 10.1126/science.aav2501 *
DAVID MERRICK ET AL: "Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue", SCIENCE, vol. 364, no. 6438, 25 April 2019 (2019-04-25), US, pages eaav2501, XP055679684, ISSN: 0036-8075, DOI: 10.1126/science.aav2501 *
MAROESJKA SPIEKMAN ET AL: "The power of fat and its adipose-derived stromal cells: emerging concepts for fibrotic scar treatment : Adipose tissue and ADSC for fibrotic scar treatment", JOURNAL OF TISSUE ENGINEERING AND REGENERATIVE MEDICINE, vol. 11, no. 11, 3 February 2017 (2017-02-03), US, pages 3220 - 3235, XP055638160, ISSN: 1932-6254, DOI: 10.1002/term.2213 *
PABLO BORA ET AL: "Adipose tissue-derived stromal vascular fraction in regenerative medicine: a brief review on biology and translation", STEM CELL RESEARCH & THERAPY, vol. 8, no. 1, 15 June 2017 (2017-06-15), XP055638162, DOI: 10.1186/s13287-017-0598-y *
YAO YAO ET AL: "Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel : A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy", PLASTIC AND RECONSTRUCTIVE SURGERY, vol. 139, no. 4, 1 April 2017 (2017-04-01), US, pages 867 - 879, XP055637126, ISSN: 0032-1052, DOI: 10.1097/PRS.0000000000003214 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024160980A1 (fr) * 2023-02-02 2024-08-08 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Procédé de préparation d'une construction de tissu adipeux prévascularisé en 3d, ladite construction de tissu adipeux prévascularisé en 3d et ses utilisations

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