WO2022013457A1 - Optisches nachweisverfahren - Google Patents

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WO2022013457A1
WO2022013457A1 PCT/EP2021/070185 EP2021070185W WO2022013457A1 WO 2022013457 A1 WO2022013457 A1 WO 2022013457A1 EP 2021070185 W EP2021070185 W EP 2021070185W WO 2022013457 A1 WO2022013457 A1 WO 2022013457A1
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cell
cells
droplet
drops
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Pavel Levkin
Anna Popova
Lei Wenxi
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Aquarray GmbH
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Definitions

  • the invention relates to a method according to claim 1 and a use according to claim 15.
  • the object of the invention is to provide a fast and inexpensive method with which, for example, substances or activities of cells can be examined and detected.
  • the method can be used in the context of personalized medicine, for example to screen anti-cancer drugs and to screen antibiotics. It is particularly useful for screening drug libraries.
  • the invention is characterized, among other things, by its speed; the procedure delivers a result after just a few minutes.
  • the invention can be implemented, for example, in medical diagnostics as a “bedside” or “bench-to-bed” method, that is to say virtually directly at the patient's bed.
  • the procedure can also be carried out as a "point-of-care" procedure
  • the method is characterized by a high sensitivity, in particular compared to test methods in microtiter plates, which use much higher volumes of liquid than the method according to the invention.
  • the method is useful for many applications. Another advantage is that the array can be archived after the procedure has been performed after drying.
  • the method according to the invention is an optical method that allows the detection of a (bio)chemical reaction in a liquid volume of a few nanoliters without having to use molecular markings ("labels"), which are frequently used in particular when examining biological systems. No further detection steps have to be used either.
  • the method can be carried out without fluorescence and luminescence detection.
  • the method is based on the detection of fluorescence, a change in the light transmittance (turbidity) or the color of a droplet that serves as an aqueous reaction space within the scope of the invention.
  • this reaction space may contain cells that carry out the reaction. At least one property of the cells can be examined.
  • some embodiments of the method relate to chemical reactions that take place in the droplets as a reaction space; other embodiments of the method relate to biochemical reactions taking place by means of organisms; in particular reactions that take place in the organisms.
  • the turbidity A can be determined as follows:
  • A -log (l/lo) with I: intensity of the light after exiting a drop of DMA, lo : intensity of light before entering the drop of DMA.
  • the turbidity or color or depth of color of the droplet can be a direct result of a chemical reaction that occurs without an organism involved. In such cases, no biochemical, but a chemical reaction is detected.
  • the method for determining the pH value can be used (cf. FIG. 15 and the associated description).
  • the scanning can be carried out using a simple scanner, in particular a digital camera or a commercially available paper scanner. In one embodiment, the term scanner includes photography here. If the change in turbidity or color of the drop is to be quantified, commercial software can be used for this purpose, such as B. ImageJ.
  • a microarray, droplet microarray (DMA) or array in the sense of the present invention means a solid substrate with a patterned surface layer comprising hydrophilic areas, so-called spots, each of which is surrounded by hydrophobic areas (hydrophobic borders).
  • the surface layer can be in the form of a foil, a film or a coating, for example.
  • the substrate is translucent and solid at room temperature.
  • the solid substrate can be selected from glass or plastic, for example.
  • the solid transparent substrate is glass.
  • the solid substrate suitably has a flat surface, without protrusions, so that scanning can be done more easily, especially with a paper scanner.
  • the substrate should be thin, in particular a maximum of 1 mm high, so that it can be scanned with a paper scanner without any problems.
  • the substrate is formed in a single layer. There are also no channels in the substrate.
  • the array can be shaped in such a way that a pattern of separated homogeneous aqueous liquid microdroplets of a desired size is arranged.
  • a patterned substrate can be provided by the following steps: a) providing a patterned substrate having a solid layer comprising a porous polymeric layer which (i) has superhydrophilic regions with water contact angles (WCAs) of less than 20° ( with desired size and shape) surrounded by (ii) hydrophobic regions with a WCA greater than 130° and a width of 200 pm or less and
  • hydrophilic spots on a superhydrophobic (or hydrophobic) background are produced using photolithographic methods.
  • a fluorinated rough surface modified with nanoparticles can be ablated using UV light irradiation and using a photomask to shade parts of the UV light.
  • the (super)hydrophobic parts can be prepared by modifying a vinyl-bearing micro-nano raw surface using a fluorinated hydrophobic thiol via a thiol-ene or thio-yne reaction. Again, the surface can be irradiated with UV light through a quartz photomask to produce a pattern. The unmodified portions can then be hydrophilized with reactive vinyl groups containing hydrophilic thiols such as mercaptoethanol or other hydrophilic thiols.
  • the invention relates to an optical detection method.
  • the optical detection method in particular for detecting a substance or an activity (e.g. an enzyme or a cell), has the following steps:
  • DMA transparent droplet microarray
  • the DMA used in the process has a plurality of hydrophilic spots on a superhydrophobic base.
  • the DMA should be translucent.
  • the volume of the drops of DMA is 5 nl to 200 nl, in particular 20 nl to 150 nl, preferably approximately 90 nl. In some embodiments of the method, the volume of the drops is less than 100 nl, in particular 90 nl, 80 nl, 70 nl, 60 nl, 50 nl, 40 nl, 30 nl, 20 nl, 10 nl or 5 nl.
  • the spots have diameters of 0.5 mm to 3 mm.
  • performing a reaction includes adding a dye to the plurality of drops.
  • a dye is in particular a substance that changes its color through a chemical reaction. The detection is then based on the color change.
  • the turbidity of the droplets changes as a basis for detection.
  • the method is characterized by the fact that the scanning process does not have to meet any major requirements.
  • the scan can be carried out with a standard document scanner or a camera, in particular with a digital camera.
  • the scanner preferably allows the light intensity to be adjusted and the resolution to be adjusted, in particular up to 6400 dpi.
  • a document scanner shines light on the object to be examined and directs the reflected light (usually by means of mirrors and/or lenses) onto a photosensitive element, creating a digital copy of the entire object. It is therefore much simpler in terms of design than, for example, a spectrophotometer.
  • the detection method serves to detect glucose, hydrogen peroxide or beta-galactosidase activity.
  • chlorophenol red galactoside chlorophenol red galactoside
  • CPRG chlorophenol red galactoside
  • the yellow CPRG is cleaved by beta-galactosidase into galactose and chlorophenol red. In this way, the activity of the beta-galactosidase can be detected or determined.
  • the procedure for detecting glucose can be as follows. A solution of potassium iodide (KI), glucose oxidase and peroxidase (horseradish peroxidase) is placed on the spots of a DMA and dried. A glucose solution is then applied to the DMA spots. After a few minutes of incubation, a color change (yellow/orange) occurs.
  • KI potassium iodide
  • glucose oxidase glucose oxidase
  • peroxidase horseradish peroxidase
  • the method can be used to detect hydrogen peroxide.
  • a solution of potassium iodide (KI) is placed on the spots of a DMA and dried.
  • a hydrogen peroxide solution is then applied to the superhydrophilic spots of the DMA. After a few minutes of incubation, a color change (yellow/orange) occurs, which can be scanned and optionally quantified.
  • the reaction is carried out using a cell.
  • the reaction can result in a change in an optical property of the droplets.
  • the invention relates to an in vitro method for optically determining at least one property of a cell.
  • the method can include at least the following steps:
  • a droplet microarray (DMA) is provided, which has a plurality of droplets with at least one cell.
  • a reaction is carried out in the majority of the droplets of the DMA, which reaction can result in a change in an optical property of the droplets depending on the at least one property of the cell.
  • a scan of the optical properties of the majority of the drops is then carried out, with the scan being able to relate to properties such as color, including color saturation and/or turbidity of the drops.
  • properties such as color, including color saturation and/or turbidity of the drops.
  • Various properties of the cells contained in the droplets can be examined using the method. Possible properties are the viability of the cell or the number of cells, including living or metabolizing cells in a suspension or cell culture liquid. As explained elsewhere, the property can also be determined after the cells have been treated with an active substance, in particular as part of an active substance screening.
  • the method relates to a method for colorimetrically determining the viability of a cell, which has the following steps:
  • DMA droplet microarray
  • performing a reaction includes adding a dye to the plurality of drops, wherein the dye is metabolized by a living cell in a color-changing manner.
  • a dye examples include resazurin (CAS No. 550-82-3; 62758-13-8 (sodium salt)) or WST-8 (CAS No. 193149-74-5).
  • Resazurin WST-8 The viability method with Resazurin and WST-8 is particularly fast and sensitive compared to known microtiter assays. With it, a small number of cells can be detected after a short time.
  • resazurin or WST-8 is added to droplets of DMA that have 40 to 300 cells and metabolize the dyes to produce color changes. These can be scanned using a paper scanner.
  • the cells present in the drops in the method can be eukaryotic cells or prokaryotic cells.
  • the method can be carried out with 2- and 3-dimensional cell cultures.
  • prokaryotic cells in certain embodiments these are selected from the group consisting of Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa and Enterobacter spp, all of which are facultative pathogenic bacteria for humans.
  • Enterococcus faecium Staphylococcus aureus
  • Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae
  • Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii
  • Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
  • Enterobacter spp all of which are facultative pathogenic bacteria for humans.
  • animal-pathogenic or non-pathogenic bacteria can also be examined in the method.
  • the number of cells in a droplet of DMA is measured as a property.
  • the turbidity of a droplet increases with the number of bacterial cells in a droplet (from translucent to turbid). This turbidity can be detected optically, even with the naked eye in some embodiments of the method.
  • the method thus allows the number of cells in a drop to be determined without the bacteria having to be labeled or further detection steps being required.
  • This method is therefore suitable, for example, for screening drug candidates, e.g. B. for antibiotics.
  • the method is particularly suitable as a platform technology for screening methods, i.e. when searching for suitable drug candidates from a large number of possible substances and compounds.
  • the method then additionally has the step of adding a substance to be tested into a drop of the DMA, the substance to be tested being an active substance, for example a drug, in particular the substance to be tested being part of a library of substances to be tested.
  • the method can be used as part of a high-throughput screening.
  • the substance to be tested in the method can be of different nature.
  • the substance to be tested is selected from the group consisting of active substance, small molecule (small molecule), nucleic acid (in particular DNA, RNA, mRNA or siRNA), surface materials, etc.
  • the active ingredient may be a medicament for a human or animal disease, for example cancer.
  • the drug is selected from the group consisting of pazopanib, vorinostat, nilotinib and dasatinib, cytarabine, gemcitabine, etoposide, tamoxifen, tretinoin, dasatinib, pazopanib, nilotinib, gefitinib, bicalutamide, vorinostat, vinblastine, carboplatin, oxalitacin, and alendronate, all of which are well-known anti-cancer drugs.
  • eukaryotic cells such as a human cell line
  • a DMA using resazurin or WST-8, which are metabolized by living cells such that a color change occurs. Scanning the color change can be done with the viewer's eye.
  • the DMA can be scanned, e.g. B. using a commercially available paper scanner, followed by the determination of the color depth.
  • a freely available program such as ImageJ can be used for this purpose.
  • eukaryotic cells are assayed in conjunction with an antibiotic drug such as ciprofloxacin, vancomycin, or others.
  • an antibiotic drug such as ciprofloxacin, vancomycin, or others.
  • 1 to 100 cells can be introduced per drop for this purpose.
  • the turbidity of the drops changes. After drying the DMA, the turbidity can e.g. B. be determined by a digital camera.
  • the invention relates to the use of a DMA in an optical detection method, in particular in an optical biological or medical method, in particular in a method for optically determining at least one property of a cell of the type described here.
  • the use relates to a DMA that allows an optical evaluation, in particular based on the turbidity or the color or color depth of the drops examined on the DMA.
  • the invention relates to a kit for carrying out an optical determination of at least one property of a cell of the type described here.
  • a kit has a carrier for a droplet microarray (or a droplet microarray) of the type described here on.
  • the kit can have at least one substance that can be metabolized by a living cell in a color-changing manner and/or a scanner for scanning an optical property of the plurality of drops of the droplet microarray, for example a document scanner or a camera, in particular a digital camera.
  • the invention relates to the use of said kit, in particular for carrying out the method described here.
  • Figure 1 Schematic representation of the mechanism of the resazurin or WST-8 viability assay and the workflow of the colorimetric method on the drop microarray (DMA) platform
  • DMA drop microarray
  • Figure 2 On-chip colorimetric analysis with a cell gradient using resazurin and WST-8 viability assays compared to calzein AM staining, followed by microscopy and cell quantification.
  • (b) Graph describing the distribution of cell number stained with calzein AM (left) and graph showing the measured depth of color after staining of cells with resazurin (middle) and WST-8 (right).
  • FIG. 3 Comparison of Resazurin and WST-8 colorimetric viability assays performed on a droplet microarray and in a 384-well microtiter plate (a) and (b) The graphs show a comparison of the signal change of WST-8 (a) and Resazurin (b) viability assays , which were developed using 300 cells per well/spot over a period of 5 hours. 300 cells were seeded at 30 microliters per well and incubated at 150 nL per well overnight.
  • the appropriate volume of viability assay reagent was added to each well/spot and the absorbance at 450 nm for WST-8 and at 570/600 nm for resazurin in the 384-well plates and the depth of color on the droplet microarray at 5 hours and 1 hour both in the plates as well as on the array measured.
  • the error bars in the graph represent the standard deviation. 24 and 16 replicates, respectively, were performed for each measurement of the droplet microarray and 384-well plate, respectively.
  • FIG. 4 Comparison of resazurin and WST-8 viability assays and microscopy-based methods (read-out) for estimating a response to a specific drug dose.
  • a table summarizing the IC50 values of doxorubicin obtained using the three read-out methods is shown on the right.
  • Figure 5 Comparison of the performance of resazurin and WST-8 viability assays with microscopy-based readouts in randomized treatment with one drug on a droplet microarray.
  • the graphs show a dose-dependent response of HeLa cells to pazopanib (b), vorinostat (c), nilotinib (d ) and dasatinib (e) and a table summarizing the IC50 values for the named drugs obtained using the three read-out methods.
  • FIG. 6 On-chip colorimetric analysis of spheroids using resazurin and WST-8 viability assays.
  • the graphs show the size distribution of the grown spheroids (middle) and the analysis of the color depth for Resazurin (left) and WST-8 (right) viability assays.
  • the error bars of the graph represent the standard deviations. A total of 24 repetitions were performed for each measurement.
  • Figure 7. Optimization of the imaging process of the whole DMA using food coloring (a) A digital photograph of a 14x14 array of 100 nL droplets containing a serial dilution of food coloring. The length of the scale bar is 2 mm. (b) The scan of 100 nL volume droplets on the DMA containing different dilutions of a food coloring. The length of the scale bar is 0.5 mm. (c) Graphs showing mean gray values (left) and normalized mean gray values (right) after image analysis of scans of the DMA containing a serial dilution of food coloring. Image analysis was performed using ImagJ software, which converts the images into 8-bit images before determining the mean gray values. The error bars represent the standard deviation.
  • Figure 8 Colorimetric analysis of cell gradients performed on an array using resazurin and WST-8 viability assays compared to calzein AM staining with subsequent cell quantification using microscopy
  • Figure 9 Depth of color analysis of the entire droplet microarray containing HeLa cells treated with different concentrations of doxorubicin and stained with WST-8 and resazurin, respectively.
  • FIG. 10 Scans of droplet microarrays containing HeLa cells treated with different concentrations of dasatinib (a), pazopanib (b), nilotinib (c) and vorinostat (d) randomly distributed on the microarray and treated with resazurin and WST- 8 (left) were stained. Tables show the concentrations of each drug in mM/L in random positions corresponding to the scan on the left (right).
  • FIG. 11 Growth of P. aeruginosa PA01 on a DMA support
  • e Fluorescence images of the P. aeruginosa PA01 GFP incubated for 24 hours on the DMA support and in a 96-well plate. 500pm, 1mm and 3mm are the side lengths of the hydrophilic rectangle.
  • aeruginosa PA01 GFP in 96-well plates and on a DMA surface detected by measuring the mean fluorescence intensity per pixel of the cultured bacteria. All fluorescence intensity values were normalized against P. aeruginosa PA01 GFP cultured for 24 hours in 96-well plates. Data are presented as the median ⁇ standard error of three experiments, each with three replicates. P-values ⁇ 0.05 were considered statistically significant (g) bacterial density in 96-well plates and on the DMA surface after incubation for 24 hours. Data are presented as the median ⁇ standard error of three experiments, each with three replicates.
  • Droplet microarray as a screening platform (a) Scheme of the sandwiching method for screening antibiotics (b) Pattern of printed antibiotics on fluorinated glass slides (c) Image of the green fluorescence of the bacteria on DMA with 25 (5 x5) spots treated sequentially with vancomycin (13.5 pmol /l) Ciprofloxacin (40 pmol/l).
  • the DMA slides were placed on black paper (h) Grayscale scan of the yellow line shown in (g) (i.) Scanning electron microscope (SEM) image of the transparent hydrophilic spot on the DMA surface shown in (g) (j) SEM image of the line shown in ( g) shown opaque hydrophilic spots of the DMA surface.
  • SEM Scanning electron microscope
  • FIG. 13 (ae): Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of Ciprofloxacin, Ceftazidime, Tobramycin, Ampicillin and Tetracycline for P. aeruginosa PA01 GFP assayed in 96-well plates and on DMA surfaces (DMA support: read by fluorescence intensity and the intensities were in Optical density (OD) values converted (96-well plates: read by OD measurements). All results were relative to a blank control (0 pM in 96-well plates). Data are presented as the median ⁇ standard deviation of three experiments, each with 10 replicates. (f) Time course experiment of antibacterial activity of polymyxin B on P. aeruginosa PA01 on DMA supports. Data are presented as the median ⁇ standard deviation of three experiments, each with 5 replicates.
  • MIC Minimum Inhibitory Concentration
  • FIG. 15 Result of a pH measurement using cresol red as a pH indicator.
  • Cresol red is a well-known triphenylmethane dye from the sulfonephthalein group.
  • the figure shows the result of a pH measurement on a drop microarray (DMA) in drops with a volume of 150 nL as an example of the method in which the optical property of the drop is the color. Length of scale bar shown: 1 mm.
  • the inventors have developed a simple method for determining a colorimetric viability assay on a droplet microarray (DMA), whereby, for example, a commercially available document scanner or an image acquisition system based on a smartphone camera provided by a smartphone app can be used for the evaluation.
  • the DMA platform consists of an array of hydrophilic spots on a superhydrophobic background and enables the formation of arrays of hundreds of separated, stable droplets with a volume in the nanoliter range, in particular from 5 nL to 200 nL, preferably from 10 nL to 150 nL. These droplets can be used to cultivate living cells. It is also possible to use such a droplet microarray to carry out a so-called high-throughput screening.
  • Resazurin and WST-8 are dyes that can be used to determine cell variability, usually performed in microtiter plates ( Figure 1a).
  • Resazurin is a phenoxazine dye with a dark blue color and absorbance at 600 nm. It is reduced by aerobic respiration of living cells to resorophine, which shows a light pink color and absorbance at 470 nm ( Figure 1a, top).
  • WST-8 is a colorless tetrazole salt, which is reduced by living cells to the bright yellow WST-8 formazan, which absorbs at 450 nm ( Figure 1a).
  • a simple imaging method was developed using food coloring that was printed on a DMA, by means of which high-resolution homogeneous color images of an entire DMA array can be obtained (FIG. 7).
  • a commercially available document scanner can be used, for example with a resolution of 6400 dpi and 80% exposure (Fig 7a, Figure 1a, images of the arrays).
  • An automated algorithm was developed for image analysis and estimation of color changes in the droplets.
  • An embodiment of the method according to the invention is shown in FIG. 1b.
  • a viability dye is added to the DMA, which has cells that have been treated with the molecules of a suitable library (e.g. drugs, small molecules, siRNAs, etc.), using, for example, a commercially available "non-contact low volume dispenser “ is used (Figure 1b step 1). Spreading 100 nL of dye across the array takes approximately one minute.
  • the DMA is incubated in a cell culture incubator for 20 minutes so that the cells can metabolize the viability dye.
  • the DMA is scanned, for example using a commercially available document scanner, which takes about 6 minutes with the necessary resolution.
  • the array scan is analyzed using an automated algorithm, which takes about two minutes per scan. Thus, it is possible to carry out the method according to the invention within only about 30 minutes.
  • both resazurin and WST-8 were used to estimate cell viability, using a gradient of cells with 0, 40, 80, 120, 160, 200, 250 and 300 cells per Spot in 150 nL droplets were applied to the DMA as shown in Figure 2a and incubated overnight. Thereafter, 100 nL of resazurin or WST-8 dye was spread over the entire DMA, incubated in a cell culture incubator for 20 minutes and scanned using a commercial document scanner ( Figure 2a). A control DMA was stained using calzein AM, evaluated microscopically and the number of living cells was determined (FIG. 2a).
  • HepG2 spheroids are incubated on a DMA using the “hanging droplet” method.
  • different numbers of cells between 40 to 300 cells per spot were seeded in blocks of 6x14 spots ( Figure 2a).
  • the DMA was inverted with the cells and incubated on a holder within a Petri dish in a cell culture incubator. After three days of cultivation, HepG2 spheroids of different diameters had formed on the DMA (FIG. 6a).
  • the human cervical adenocarcinoma cell line HeLa CCL2 and the human liver cancer cell line HepG2 were cultured in Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal calf serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin. The cells were cultured in 10 ml cell culture dishes and passaged every 2 to 3 days. 2D cell cultures on DMA
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle Medium
  • FBS fetal calf serum
  • penicillin/streptomycin penicillin/streptomycin
  • DMA plates were purchased from Aquarray GmbH. The DMA south contained 672 rectangular hydrophilic spots in a 14 x 48 array format with hydrophilic spots having a side length of 1 mm. Before culturing cells, the DMA plates were sterilized with 70% ethanol for 5 minutes followed by drying under sterile conditions for 15 minutes. Cells were trypsinized prior to seeding according to the standard protocol, counted and brought to the desired concentration using cell culture medium. The cells were seeded onto the DMA plate using the low volume non-contact dispenser I-DOT-One (Dispendix GmbH) in a volume of 150 nL per spot. Humidity was adjusted to 70% during cell seeding.
  • Staining was performed by dispensing 100 nL of either WST-8 (Kit-8, Dojindo EU GmbH, Germany) or Resazurin (Sigma-Aldrich, Germany) directly into each cell-containing droplet using a low-volume, non-contact dispenser volume non-contact dispensers I-DOT-One l-DOT One (Dispendix GmbH). After adding the reagent, the DMA was placed in the cell culture incubator and incubated for between 20 minutes and 5 hours, depending on the experiment. After incubation, the DMAs were scanned with a commercial paper scanner using the following settings: color: 80%, light 6700 dpi. Scanning the entire array took 6 minutes.
  • cells were distributed with calzein AM by dispensing 50 nL of a solution containing 1.5 pg/mL calzein AM (Thermo Scientific) in Dulbecco's PBS using an l-DOT One dispenser (Dispendix GmbH) has been used. Thereafter, the cells were incubated for 15 minutes in a cell culture incubator before imaging was performed. First, the entire slide was imaged at 2x magnification using a Keyence BZ-9000 microscope (KEYENCE, Osaka, Japan). microscopically. Each spot was then examined at 10X magnification with an Olympus 1X81 automated screening microscope (Olympus, Tokyo, Japan).
  • WST-8 and resazurin viability testing in 384-well plates was performed according to the manufacturer's protocol.
  • the cells were seeded by hand in 30 pL of culture medium and incubated for 24 hours. Viability tests were performed by adding 10 pL of either WST-8 (Kit-8, Dojindo EU GmbH, Germany) or Resazurin (Sigma-Aldrich, Germany). After addition of the reagent, the plates were incubated in a cell culture incubator for 20 minutes to 5 hours depending on the type of experiment.
  • the absorbance at 450 nm was measured in the case of the WST-8 and at 570 and 600 nm for resazurin. For analysis, the absorbance of control medium was subtracted for each well. For resazurin, the absorbance at 570 nm was subtracted from that at 600 nm. drug treatment
  • doxorubicin doxorubicin
  • pazopanib doxorubicin
  • vorinostat nilotinib
  • dasatinib Solutions of these active ingredients with a concentration of 4 mmol/L were prepared in DMSO. Thereafter, stock solutions were prepared in DMSO at concentrations of 7.5 mM and 750 mM. The active ingredients were distributed on sterile and dry DMAs and applied directly to the hydrophilic spots using a sciFLEXARRAYER S11 liquid dispenser (Scienion, Berlin, Germany).
  • HepG2 cells were seeded onto DMAs as described. Immediately after seeding, the DMAs were placed on a 10 cm petri dish with the cells of a holder in an inverted position. The spheroids formed hanging droplets on the DMA within 72 hours before being stained with WST-8 and resazurin.
  • Test solutions consisted of either deionized water (for UV-released compounds and negative controls) or an aqueous 17ß-estradiol (17ß-estradiol) standard at concentrations of 400 ng/L, 200 ng/L, 100 ng /L, 40ng/L, 20ng/L, 10ng/L and 5ng/L. Subsequently, 50 nL of the yeast suspension was added to each spot and the DMA was incubated in a humid atmosphere for 24 h at 30°C.
  • LacZ substrate reaction mix (comprising chlorophenol red galactoside, chlorophenol red galactoside (CPRG)) was added (10 nL per spot) and the color of the droplets was measured after 30 minutes of incubation using a document scanner.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein optisches Nachweisverfahren, aufweisend die folgenden Schritte: - Bereitstellen eines lichtdurchlässigen/transparenten Tropfenmikroarrays (DMA), aufweisend eine Mehrzahl von Tropfen, - Durchführen einer Reaktion in der Mehrzahl von Tropfen, die eine Änderung einer optischen Eigenschaft des Tropfens zur Folge hat, - Scannen einer optischen Eigenschaft der Mehrzahl von Tropfen des Tropfenmikroarrays, insbesondere der Farbe oder Turbidität, und - Schließen auf die in den Tropfen abgelaufenen Reaktion..

Description

OPTISCHES NACHWEISVERFAHREN
Die Erfindung betrifft ein Verfahren nach Anspruch 1 sowie eine Verwendung nach Anspruch 15.
Beschreibung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein schnelles und kostengünstiges Verfahren bereitzustellen, mit dem beispielsweise Stoffe oder Aktivitäten von Zellen untersucht und nachgewiesen werden können.
Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst, die sich durch diverse Vorteile auszeichnet.
Das Auslesen der Ergebnisse stellt technisch keine hohen Anforderungen. Daher benötigt man bei der Durchführung des Verfahrens keine teuren Gerätschaften, insbesondere keine teure Scantechnik. Das Verfahren kommt ohne Spektrophotometer oder Mikroskope aus.
Das Verfahren kann im Rahmen der personalisierten Medizin verwendet werden, beispielsweise zum Screenen von Wirkstoffen gegen Krebs und zum Screenen von Antibiotika. Es eignet sich insbesondere zum Screenen vor Wirkstoffbibliotheken.
Die Erfindung zeichnet sich unter anderem durch seine Geschwindigkeit aus; nach nur wenigen Minuten liefert das Verfahren ein Ergebnis.
Durch die Simplizität und Schnelligkeit der Durchführung kann die Erfindung beispielsweise in der medizinischen Diagnostik als „bed-side''oder „bench-to-bed“ Verfahren, also quasi direkt am Patientenbett durchgeführt werden. Das Verfahren kann auch als „point-of-care“-Verfahren durchgeführt werden
Darüber hinaus zeichnet sich das Verfahren durch eine hohe Sensitivität aus, insbesondere gegenüber Testverfahren in Mikrotiterplatten, die viel höhere Flüssigkeitsvolumina verwenden als das erfindungsgemäße Verfahren.
Weiterhin ist das Verfahren für viele Applikationen nützlich. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass der Array nach der Durchführung des Verfahrens nach dem Trocknen archiviert werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein optisches Verfahren, das den Nachweis einer (bio)chemischen Reaktionen in einem Flüssigkeitsvolumen von wenigen Nanolitern erlaubt, ohne dass molekulare Markierungen („label“), die insbesondere bei der Untersuchung biologischer Systeme häufig benutzt werden, verwendet werden müssen. Es müssen auch keine weiteren Detektionsschritte verwendet werden. Das Verfahren kann ohne Fluoreszenz- und Lumineszenz-Detektion durchgeführt werden.
Das Verfahren basiert auf dem Nachweis der Fluoreszenz, einer Änderung der Lichtdurchlässigkeit (Turbidität) oder der Farbe eines Tropfens, der im Rahmen der Erfindung als wässriger Reaktionsraum dient. Dieser Reaktionsraum kann in einigen Ausführungsformen Zellen enthalten, die die Reaktion durchführen. Mindestens eine Eigenschaft der Zellen kann untersucht werden.
Somit betreffen einige Ausführungsformen des Verfahrens chemische Reaktionen, die in den Tropfen als Reaktionsraum ablaufen; andere Ausführungsformen des Verfahrens betreffen biochemische Reaktionen, die mittels Organismen ablaufen; insbesondere Reaktionen, die in den Organismen ablaufen.
Die T urbidität A kann wie folgt bestimmt werden:
A = -log (l/lo) mit I: Intensität des Lichts nach dem Austritt aus einem Tropfen des DMA, lo: Intensität des Lichts vor dem Eintritt in den Tropfen des DMA.
Der Ablauf einer (bio)chemischen Reaktion ändert die T urbidität oder Farbe bzw. Farbtiefe des Tropfens und dies optische Änderung wird qualitativ oder quantitativ beobachtet, die auf die abgelaufenen (bio)chemische Reaktion zurückgeht. Aus der Änderung der Turbidität oder Farbe des Tropfens kann ein Schluss z. B. überdas Vorhandensein eines Stoffes, die Aktivität eines Enzyms oder über mindestens eine Eigenschaft einer Zelle gezogen werden.
Die Turbidität oder Farbe bzw. Farbtiefe des Tropfens kann eine direkte Folge einer chemischen Reaktion sein, die ohne einen beteiligten Organismus abläuft. In solchen Fällen wird also keine biochemische, sondern eine chemische Reaktion nachgewiesen. Beispielsweise kann das Verfahren zur Bestimmung des pH-Wertes verwendet werden (vgl. Figur 15 und die dazugehörige Beschreibung). Das Scannen kann mittels eines einfachen Scanners, insbesondere einer Digitalkamera oder einem handelsüblichen Papierscanner durchgeführt werden. Der Begriff des Scanners umfasst hier in einer Ausführungsform das Fotografieren. Sofern die Änderung der Turbidität oder Farbe des Tropfens quantifiziert werden soll, kann hierzu eine handelsübliche Software verwendet werden, wie z. B. ImageJ.
Unter einem Microarray, Tropfenmikroarray (droplet microarray, DMA) oder Array im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man ein festes Substrat mit einer gemusterten Oberflächenschicht, die hydrophile Bereiche, so genannte Spots, umfasst, die jeweils von hydrophoben Bereichen (hydrophobe Grenzen) umschlossen sind. Die Oberflächenschicht kann hierbei beispielsweise in Form einer Folie, eines Films oder einer Beschichtung vorliegen. Das Substrat ist lichtdurchlässig und am bei Raumtemperatur fest. Das feste Substrat kann beispielsweise ausgewählt sein aus Glas, oder Kunststoff. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das feste transparente Substrat Glas. Das feste Substrat hat zweckmäßiger Weise eine flache Oberfläche, ohne Vorsprünge, so dass das Scannen einfacher erfolgen kann, insbesondere mittels eines Papierscanners. Zudem sollte das Substrat dünn sein, insbesondere maximal 1 mm hoch, so dass es mit einem Papierscanners problemlos gescannt werden kann.
In einer Ausführungsform ist das Substrat einschichtig ausgeformt. Es finden sich auch keine Kanäle in dem Substrat.
Die Herstellung derartiger Arrays ist beispielsweise beschrieben in EP 2 684601 A, EP 2952 267 A2 und EP 3 205 394 A1. Derartige Arrays sind erhältlich von der Aquarray GmbH, Eggenstein-Leopoldshafen, Deutschland.
Die hier zitierten Dokumente werden durch Verweis vollumfänglich in die Offenbarung aufgenommen (incorporated by reference in their entirety).
Der Array kann in bestimmten Ausführungsformen so ausgeformt sein, dass ein Muster separierter homogener wässriger Flüssigkeitsmikrotropfen einer gewünschten Größe angeordnet ist. Es kann ein gemustertes Substrat durch folgende Schritte bereitgestellt werden: a) Bereitstellen eines gemusterten Substrates mit einer festen Schicht, die eine poröse Polymerschicht aufweist, welche (i) superhydrophile Bereiche aufweist mit Wasserkontaktwinkeln (water contact angles, WCAs) von weniger als 20° (mit gewünschten Größe und Form), umgeben von (ii) hydrophoben Bereichen mit einem WCA von größer als 130° und einer Breite von 200 pm oder weniger und
(b) Applikation der wässrigen Flüssigkeit auf eine Mehrzahl der hydrophilen Bereiche.
Hydrophile Spots auf einem superhydrophoben (oder hydrophoben) Hintergrund werden insbesondere unter Verwendung von Photolithographieverfahren hergestellt. Beispielsweise kann eine fluorierte, raue, mit Nanopartikeln modifizierte Oberfläche unter Verwendung von UV-Licht-Bestrahlung und unter Verwendung einer Fotomaske abgetragen werden, um Teile des UV-Lichts abzuschatten. Alternativ können die (super)hydrophoben Teile durch Modifizieren einer Vinyl-tragenden Mikro-Nanorohoberfläche unter Verwendung eines fluorierten hydrophoben Thiols über eine Thiol-En- oder Thio-In-Reaktion hergestellt werden. Wieder kann die Oberfläche mit UV-Licht durch eine Quarzphotomaske bestrahlt werden, um ein Muster herzustellen. Die unmodifizierten Teile können dann mit reaktiven Vinylgruppen mit hydrophilen Thiolen wie Mercaptoethanol oder anderen hydrophilen Thiolen hydrophilisiert werden.
Ein Nachteil derartiger Arrays besteht darin, dass die superhydrophoben Bereiche das Licht stark streuen.
Die Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt ein optisches Nachweisverfahren.
Das optische Nachweisverfahren, insbesondere zum Nachweis eines Stoffes oder einer Aktivität (z. B. eines Enzyms oder einer Zelle) weist die folgenden Schritte auf:
- Bereitstellen eines lichtdurchlässigen, also transparenten Tropfenmikroarrays (DMA) aufweisend eine Mehrzahl von Tropfen, die als Reaktionsraum für das Nachweisverfahren dienen,
- Durchführen einer Reaktion in der Mehrzahl von Tropfen, die eine Änderung einer optischen Eigenschaft des Tropfens zur Folge hat bzw. haben kann (für negative Kontrollen wird beispielsweise keine Änderung der optischen Eigenschaft erwartet),
- Scannen einer optischen Eigenschaft der Mehrzahl von Tropfen des Tropfenmikroarrays insbesondere der Farbe oder Turbidität, und
- Schließen auf die in den Tropfen abgelaufene Reaktion. Hierbei wird z. B. auf die Anwesenheit eines Stoffes bzw. dessen Konzentration oder auf die Aktivität, etwa eines Enzyms geschlossen. Die optische Bestimmung des Verfahrens kann auf unterschiedliche Weis erfolgen. Sie kann kolorimetrisch erfolgen oder die Ermittlung der Turbidität (Trübheit) der Tropfen zum Gegenstand haben.
Der im Verfahren verwendete DMA weist eine Mehrzahl von hydrophilen Spots auf einem superhydrophoben Grund auf. Für das Verfahren sollte der DMA lichtdurchlässig sein. Weiterhin ist es von Vorteil, wenn der DMA, flach ausgeformt ist, also eine Höhe von z. B. 1 mm hat und keine hervortretenden Strukturen aufweist, so dass der gesamte Array plan und somit leicht scannbar ist
Bei dem Verfahren beträgt das Volumen der Tropfen des DMA 5 nl bis 200 nl, insbesondere 20 nl bis 150 nl, bevorzugt ungefähr 90 nl. In einigen Ausführungsformen des Verfahrens ist das Volumen der Tropfen geringer als 100 nl, insbesondere 90 nl ,80 nl, 70 nl, 60 nl, 50 nl, 40 nl, 30 nl, 20 nl, 10 nl oder 5 nl.
Die Spots haben in einigen Ausführungsformen der Erfindung Durchmesser von 0,5 mm bis 3 mm.
Das Durchführen einer Reaktion umfasst in einigen Ausführungsformend das Hinzufügen eines Farbstoffes in die Mehrzahl von Tropfen. Ein Farbstoff ist insbesondere ein Stoff, der seine Farbe durch eine chemische Reaktion verändert. Der Nachweis beruht dann auf der Farbveränderung.
In anderen Ausführungsformen des Verfahrens ändert sich die T urbidität der T ropfen als Basis für den Nachweis.
Das Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass der Scanvorgang keine großen Anforderungen erfüllen muss. Der Scan kann mit einem handelsüblichen Dokumentenscanner oder einer Kamera, insbesondere mit einer Digitalkamera erfolgen. Der Scanner ermöglicht bevorzugter Weise die Einstellung der Lichtintensität und der Einstellung der Auslösung, insbesondere bis zu 6400 dpi. Ein Dokumentenscanner wirft Licht auf das zu untersuchende Objekt und lenkt das reflektierte Licht (für gewöhnlich mittels Spiegeln und/oder Linsen) auf ein photosensitives Element, wodurch eine digitale Kopie des gesamten Objektes erstellt wird. Damit ist es konstruktiv viel einfacher als beispielsweise ein Spektrophotometer.
In dem Verfahren kann jede Reaktion verwendet werden, deren Ablauf in einem wässrigen Medium zu einer Veränderung der Farbe, einschließlich der Farbintensität und/oder der Turbidität führt. In einigen Ausführungsformen dient das Nachweisverfahren dem Nachweis von Glucose, von Wasserstoffperoxid oder der beta-Galaktosidase-Aktivität.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens basiert auf Chlorophenol-Rot-Galaktosid (chlorophenol red galactoside, CPRG). Das gelbe CPRG wird durch beta-Galaktosidase in Galaktose und Chlorophenol Rot gespalten. Dadurch kann die Aktivität der beta-Galaktosidase nachgewiesen bzw. bestimmt werden.
Zum Nachweis von Glukose kann im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wie folgt vorgegangen werden. Eine Lösung von Kaliumiodid (Kl), Glucoseoxidase und Peroxidase (horseradish peroxidase) wird auf die Spots eines DMA gegeben und getrocknet. Danach wird eine Glucoselösung auf die Spots des DMA gegeben. Nach einigen Minuten der Inkubation kommt es zu einer Farbänderung (gelb/orange).
Das Verfahren kann in einer Ausführungsform zum Nachweis von Wasserstoffperoxid verwendet werden. Eine Lösung von Kaliumiodid (Kl) wird auf die Spots eines DMA gegeben und getrocknet. Danach wird eine Wasserstoffperoxidlösung auf die superhydrophilen Spots des DMA gegeben. Nach einigen Minuten der Inkubation kommt es zu einer Farbänderung (gelb/orange), die gescannt und optional quantifiziert werden kann.
In einigen Ausführungsformen des Verfahrens wird die Reaktion mittels einer Zelle durchgeführt. Die Reaktion kann dann in Abhängigkeit mindestens einer Eigenschaft der Zelle eine Änderung einer optischen Eigenschaft der Tropfen zur Folge haben.
Die Erfindung betrifft in einer Ausgestaltung ein in vitro Verfahren zur optischen Bestimmung mindestens einer Eigenschaft einer Zelle. Das Verfahren kann mindestens die folgenden Schritte aufweisen:
Zunächst wird ein Tropfen-Microarray (Droplet Microarray, DMA) bereitgestellt, der eine Mehrzahl von Tropfen mit mindestens einer Zelle aufweist.
In der Mehrzahl der Tropfen des DMA wird einer Reaktion durchgeführt, die in Abhängigkeit der mindestens einen Eigenschaft der Zelle eine Änderung einer optischen Eigenschaft der Tropfen zur Folge haben kann.
Nachfolgend wird ein Scan der optischen Eigenschaften der Mehrzahl der Tropfen durchgeführt, wobei der Scan Eigenschaften wie Farbe, einschließlich Farbsättigung und/oder Trübheit der Tropfen betreffen kann. Auf der Grundlage der durch den Scan gewonnen Informationen über die Mehrzahl der Tropfen bzw. die in den Tropen enthaltenen Zellen wird auf (von den gescannten optischen Eigenschaften) auf die Eigenschaft der Zelle geschlossen.
Mittels des Verfahrens können verschiedene Eigenschaften der in den Tropfen enthaltenen Zellen untersucht werden. Mögliche Eigenschaft sind die Viabilität der Zelle oder die Anzahl von Zellen, auch von lebenden bzw. metabolisierenden Zellen in einer Suspension oder Zellkulturflüssigkeit. Wie an anderer Stelle erläutert, kann die Eigenschaft auch nach einer Behandlung der Zellen mit einem Wirkstoff, insbesondere im Rahmen eines Wirkstoffscreenings, ermittelt werden.
In einer Ausführungsform betrifft das Verfahren ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung der Viabilität einer Zelle, das die folgenden Schritte aufweist:
- Bereitstellen eines Tropfen Microarrays (DMA), aufweisend eine Mehrzahl von Tropfen mit mindestens einer Zelle,
- Hinzufügen eines Farbstoffes in dem Tropfen des DMA, wobei der Farbstoff von einer lebenden Zelle in farbändernder Weise metabolisiert wird,
- Inkubieren des Farbstoffes mit der mindestens einen Zelle und
- Scannen der Farbe und/oder Farbsättigung der Mehrzahl von Tropfen und
- Schließen auf die Viabilität der Zelle auf der Grundlage der mittels des Scans erhaltenen Werte.
Bei dem Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung der Viabilität einer Zelle umfasst das Durchführen einer Reaktion in einer Ausführungsform das Hinzufügen eines Farbstoffes in die Mehrzahl von Tropfen, wobei der Farbstoff von einer lebenden Zelle in farbändernder Weise metabolisiert wird. Beispiele für einen derartigen Farbstoff ist Resazurin (CAS Nr. 550-82-3 ; 62758-13-8 (Natriumsalz)) oder WST-8 (CAS Nr. 193149-74-5).
Figure imgf000009_0001
Resazurin WST-8 Das Viabilitäts-Verfahren mit Resazurin und WST-8 ist besonders schnell und sensitiv verglichen mit bekannten Mikrotiterassays. Mit ihm kann eine geringe Anzahl von Zellen nach kurzer Zeit nachgewiesen werden.
In einigen Ausführungsformen des Verfahrens werden Resazurin oder WST-8 zu Tropfen des DMA gegeben, die 40 bis 300 Zellen aufweisen und die Farbstoffe metabolisieren, so dass Farbänderungen erfolgen. Diese können mittels eines Papierscanners gescannt werden.
Die in dem Verfahren in den Tropfen vorhandenen Zellen können eukaryontische Zellen oder prokaryontische Zelle sein. Das Verfahren ist mit 2- und 3-dimensionellen Zellkulturen durchführbar.
Im Falle von prokaryontischen Zellen sind diese in bestimmten Ausführungsformen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und Enterobacter spp, welche alle für Menschen fakultativ-pathogene Bakterien darstellen. Es können aber auch tierpathogene oder nichtpathogene Bakterien in dem Verfahren untersucht werden.
In bestimmten Ausführungsformen des Verfahrens wird die Anzahl der Zellen in einem T ropfen des DMA als Eigenschaft gemessen. Die Turbidität eines Tropfens steigt mit der Anzahl von Bakterienzelle in einem Tropfen (von lichtdurchlässig bis trüb). Diese Turbidität kann optisch erfasst werden, in einigen Ausführungsformen des Verfahrens sogar mit dem bloßen Auge.
Das Verfahren erlaubt somit die Bestimmung der Zellzahl in einem Tropfen, ohne dass die Bakterien markiert werden müssten oder dass weitere Nachweisschritte erforderlich wären. Daher eignet sich dieser Verfahren beispielsweise zum Screenen von Wirkstoffkandidaten, z. B. für Antibiotika.
Das Verfahren eignet sich insbesondere als Plattformtechnologie für Screeningverfahren, also bei der Suche nach geeigneten Wirkstoffkandidaten aus einer Vielzahl von möglichen Stoffen und Verbindungen. Das Verfahren weist dann zusätzlich den Schritt der Hinzugabe eines zu testenden Stoffes in einen Tropfen des DMA auf, wobei der zu testende Stoff ein Wirkstoff, beispielsweise ein Medikament ist, insbesondere wobei der zu testende Stoff Teil einer Bibliothek von zu testenden Stoffen ist. Somit kann das Verfahren im Rahmen eines Hochdurchsatz-Screenings verwendet werden. Der in dem Verfahren zu testende Stoff kann unterschiedlicher Natur sein. In einigen Ausführungsformen des Verfahrens ist der zu testende Stoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wirkstoff, kleines Molekül (small molecule), Nukleinsäure (insbesondere DNA, RNA, mRNA oder siRNA), Oberflächenmaterialien etc.
Der Wirkstoff kann ein Medikament gegen eine Krankheit beim Menschen oder beim Tier sein, beispielsweise gegen Krebs. In einigen Ausführungsformen des Verfahrens ist das Medikament ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pazopanib, Vorinostat, Nilotinib und Dasatinib, Cytarabine, Gemcitabine, Etoposide, Tamoxifen, Tretinoin, Dasatinib, Pazopanib, Nilotinib, Gefitinib, Bicalutamide, Vorinostat, Vinblastine, Carboplatin, Oxalitacin, und Alendronate, die alle als Krebsmedikamente bekannt sind.
In bestimmten Ausführungsformen werden eurkaryonte Zellen, beispielsweise eine menschliche Zelllinie, in den Tropfen eines DMA untersucht, wobei Resazurin oder WST-8 eingesetzt werden, welche durch lebende Zellen derart metabolisiert werden, dass es zu einer Farbänderung kommt. Das Scannen der Farbänderung kann mit dem Auge des Betrachters durchgeführt werden. Insbesondere zur Quantifizierung der Farbänderung kann der DMA gescannt werden, z. B. mittels eines handelsüblichen Papierscanners, gefolgt von der Bestimmung der Farbtiefe. Hierzu kann ein frei erhältliches Programm wie ImageJ verwendet werden.
In bestimmten Ausführungsformen werden eurkaryonte Zellen zusammen mit einem Antibiotikum als Wirkstoff untersucht, beispielsweise mit Ciprofloxacin, Vancomycin, oder anderen. In einigen Ausführungsformen können hierzu pro Tropfen 1 bis 100 Zellen eingebracht werden. In Abhängigkeit von der Wirksamkeit des Antibiotikums ändert sich die Turbidität der Tropfen. Nach dem Trocknen des DMA kann die Turbidität z. B. mittels einer Digitalkamera bestimmt werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung eines DMA in einem optischen Nachweisverfahren, insbesondere in einem optischen biologischen oder medizinischen Verfahren, insbesondere in einem Verfahren zur optischen Bestimmung mindestens einer Eigenschaft einer Zelle der hier beschriebenen Art.
In einer Ausführungsform betrifft die Verwendung einen DMA, der eine optische Auswertung erlaubt, insbesondere auf Basis der T urbidität oder der Farbe bzw. Farbtiefe der auf dem DMA untersuchten Tropfen. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit zur Durchführung eines zur optischen Bestimmung mindestens einer Eigenschaft einer Zelle der hier beschriebenen Art. Ein derartiger Kit weist in einer Ausführungsform einen Träger für einen Tropfen-Microarray (oder einen Tropfen-Microarray) der hier beschriebenen Art auf. Zusätzlich kann der Kit mindestens einen Stoff aufweisen, der von einer lebenden Zelle in farbändernder Weise metabolisierbar ist und/oder einen Scanner zum Scannen einer optischen Eigenschaft der Mehrzahl von Tropfen des Tropfenmikroarrays, beispielsweise einen Dokumentenscanner oder einee Kamera, insbesondere eine Digitalkamera.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung des genannten Kits, insbesondere zur Durchführung des hier beschriebenen Verfahrens.
Figuren
Figur 1. Schematische Darstellung des Mechanismus des Resazurin beziehungsweise WST- 8 Viabilitätsassays und des Workflows des kolorimetrischen Verfahrens auf der Tropfenmikroarray (DMA) Plattform (a) Beispiele von Arrays repräsentiert durch einen 3x3 Array von 250 nL Tröpfchen innerhalb hydrophiler Rechtecke mit einer Seitenlänge von 1 mm umgeben von einem superhydrophopen Hintergrund. Maßstableiste: 0,5 mm. (b) Der Workflow des kolorimetrischen Verfahrens auf der DMA Plattform.
Figur 2. Kolorimetrische Analyse auf dem Chip mit einem Zellgradienten unter Verwendung von Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays im Vergleich zu Calzein AM Färbung, gefolgt von Mikroskopie- und Zellquantifikation. (a) Mikroskopisches Bild des Tropfenmikroarrays mit einem Gradienten von Zellen gefärbt mit Calzein AM (oben); Scans von Tropfenmikroarrays enthaltend einen Gradienten von Zellen gefärbt mit Resazurin (Mitte) und WST-8 (unten) (b) Graph beschreibend die Verteilung der Zellzahl, die mit Calzein AM (links) gefärbt wurde und Graphen, die die gemessene Farbtiefe nach der Färbung der Zellen mit Resazurin (Mitte) und WST-8 (rechts) zeigen.
Figur 3. Vergleich der Resazurin und WST-8 kolorimetrischen Viabilitätsassays durchgeführt auf einem Tropfenmikroarray und in einer Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen (a) und (b) Die Graphen zeigen einen Vergleich der Signaländerung von WST-8 (a) und Resazurin (b) Viabilitätsassays, die entwickelt wurden unter Verwendung von 300 Zellen pro Vertiefung/Spot über eine Zeitdauer von 5 Stunden. 300 Zellen wurden in 30 Mikroliter pro Vertiefung ausgesät und in 150 nL pro Vertiefung über Nacht inkubiert. Es wurde das entsprechende Volumen der Viabilitätsassay Reagenz in jede Vertiefung/Spot hinzugegeben und die Absorption bei 450 nm für WST-8 und bei 570/600 nm für Resazurin in einer Platte mit 384 Vertiefungen und die Farbtiefe auf einem Tropfenmikroarray zu den folgenden Zeitpunkten gemessen: 15, 30, 45 Minuten, 1, 2, 3, 4 und 5 Stunden. Fehlerbalken im Graphen stehen für
Standardabweichungen. 48 beziehungsweise 32 Wiederholungen wurden für jede Messung des Tropfenmikroarrays und der Platte mit 384 Vertiefungen durchgeführt (c) und (d) Die Graphen zeigen den Vergleich der Signaländerung von WST-8 (c) und Resazurin (d) Viabilitätsassays, die für die folgenden Zellgradienten entwickelt wurden: 1, 10, 25, 50, 100, 250, 500. Verschiedene Anzahl von Zellen wurden in 30 pL pro Vertiefung ausgesät und in 150 nL pro Spot über Nacht inkubiert. Das entsprechende Volumen des Viabilitätsassay Reagenz wurde in jede Vertiefung/Spot hinzugegeben und die Absorption bei 450 nm für WST- 8 und bei 570/600 nm für Resazurin in den Platten mit 384 Vertiefungen und die Farbtiefe auf dem Tropfenmikroarray nach 5 Stunden und 1 Stunde sowohl in den Platten als auch auf dem Array gemessen. Die Fehlerbalken im Graph repräsentieren die Standardabweichung. 24 beziehungsweise 16 Wiederholungen wurden für jede Messung des Tropfenmikroarrays beziehungsweise der Platte mit 384 Vertiefungen durchgeführt.
Figur 4. Vergleich von auf Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays bzw Mikroskopie basierendem Verfahren (read-out) für die Abschätzung einer Antwort auf eine bestimmte Medikamentendosis. (a) Scans von Tropfenmikroarrays enthaltend HeLa Zellen behandelt mit verschiedenen Konzentrationen von Doxorubicin gefärbt mit Resazurin und WST-8. (b) Der Graph zeigt den Vergleich der Dosisantwort von HeLa Zellen auf Doxorubicin erhalten unter Verwendung von drei verschiedenen Read-out Verfahren, nämlich Mikroskopie, Resazurin und WST-8 (links). Eine Tabelle, die die IC50 Werte von Doxorubicin zusammenfasst, welche unter Verwendung der drei Read-Out Verfahren erhalten wurde, ist rechts gezeigt.
Figur 5. Vergleich der Leistung von Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays mit Mikroskopie basierten Read-outs bei randomisierter Behandlung mit einem Medikament auf einem Tropfenmikroarray. (a) Scans von Tropfenmikroarrays enthaltend HeLa Zellen behandelt mit drei verschiedenen Konzentrationen von Pazopanib in zufällig ausgewählten Stellen gefärbt mit Resazurin und WST-8 (links).
Eine Tabelle, die die Konzentrationen von Pazopanib in mM in zufälligen Stellen zeigt entsprechend den Scans auf der linken Seite (rechts) (b-e) Die Graphen zeigen eine dosisabhängige Antwort von HeLa Zellen auf Pazopanib (b), Vorinostat (c), Nilotinib (d) und Dasatinib (e) und eine Tabelle, die die IC50 Werte für die genannten Medikamente zusammenfasst, welche unter Verwendung der drei Read-out Verfahren erhalten wurde.
Figur 6. Mittels Chip durchgeführte kolorimetrischer Analyse von Sphäroiden unter Verwendung von Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays. (a) Scans und mikroskopische Bilder von Tröpfchen enthaltend Sphäroide, die von unterschiedlichen Zellzahlen kultiviert wurden. Verschiedene Anzahlen von HepG2 Zellen wurden in 200 nL pro Spot ausgesät und in einer invertierten „hanging droplet“ Position für 72 Stunden kultiviert. Das entsprechende Volumen von Resazurin (oben) und WST-8 (unten) Viabilitätsassay Reagenz wurden jedem Spot zugegeben und die Farbtiefe wurde nach 40 Minuten Inkubation gemessen (b) Die Graphen zeigen die Größenverteilung der gewachsenen Sphäroide (Mitte) und die Analyse der Farbtiefe für Resazurin (links) und WST-8 (rechts) Viabilitätsassays. Die Fehlerbalken des Graphen repräsentieren die Standardabweichungen. Im Ganzen wurden 24 Wederholungen für jede Messung durchgeführt. Figur 7. Optimierung des Bildgebungsprozesses des gesamten DMA unter Verwendung von Lebensmittelfarbe (a) Eine digitale Fotografie eines 14x14 Arrays von Tröpfchen von 100 nL enthaltend eine serielle Verdünnung von Lebensmittelfarbe. Die Länge der Maßstabsleiste beträgt 2 mm. (b) Der Scan von Tröpfchen mit 100 nL Volumen auf dem DMA enthaltend verschiedene Verdünnungen einer Lebensmittelfarbe. Die Länge der Maßstabsleiste beträgt 0,5 mm. (c) Graphen zeigend die mittleren Grauwerte (links) und normalisierte mittlere Grauwerte (rechts) nach der Bildanalyse von Scans der DMA enthaltend eine serielle Verdünnung der Lebensmittelfarbe. Die Bildanalyse wurde mittels ImagJ Software durchgeführt, welche die Bilder in 8 Bit Bilder umwandelt, bevor die mittleren Grauwerte ermittelt werden. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung.
Figur 8. Auf einem Array durchgeführte kolorimetrische Analyse von Zellgradienten unter Verwendung von Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays verglichen mit Calzein AM Färbung mit nachfolgender Zellquantifiation mittels Mikroskopie (a) Eine Tabelle, die die Verteilung der Zellzahlen über den gesamten Tropfenmikroarray zeigt (b) Analyse der Farbtiefe über den gesamten Tropfenmikroarray mit einem Zellgrandienten unter Färbung mit Resazurin.
(c) Analyse der Farbtiefe des gesamten Tropfenmikroarrays enthaltend einen Zellgradienten mittels Färbung mit Kit-8.
Figure 9. Analyse der Farbtiefe des gesamten Tropfenmikroarrays enthaltend HeLa Zellen, die mit verschiedenen Konzentrationen von Doxorubicin behandelt wurden und mit WST-8 beziehungsweise Resazurin gefärbt wurden.
Figure 10. Scans von Tropfenmikroarrays enthaltend HeLa Zellen, welche mit verschiedenen Konzentrationen von Dasatinib (a), Pazopanib (b), Nilotinib (c) und Vorinostat (d) behandelt wurden, welche auf dem Mikroarray zufällig verteilt sind und mit Resazurin beziehungsweise WST-8 (links) gefärbt wurden. Tabellen zeigen die Konzentrationen der jeweiligen Medikamente in mM/L in zufälligen Positionen, welche denen des auf der linken Seite befindlichen Scans entsprechen (rechts).
Figur 11. Wachstum von P. aeruginosa PA01 auf einem DMA Träger (a) Schema des Aussäens von Bakterien auf einem DMA. (b) Fotografie von Wassertropfen auf dem hydrophoben Rand (links) und einem hydrophilen Rechteck (rechts) der DMA Oberfläche mit dem entsprechenden statistischen Kontaktwinkel des Wassers (c) Digitales Bild des DMA, nachdem sich Tropfen des BM2 Mediums gebildet haben (d) Verteilung des Tropfenvolumens auf dem DMA Träger (e) Fluoreszenzbilder des P. aeruginosa PA01 GFP, für 24 Stunden auf dem DMA Träger und auf einer Platte mit 96 Vertiefungen inkubiert. 500 pm, 1 mm und 3 mm sind die Seitenlängen des hydrophilen Rechtecks (f) Wachstum von P. aeruginosa PA01 GFP in Platten mit 96 Vertiefungen und auf einer DMA Oberfläche detektiert durch Messung der mittleren Fluoreszenzintensität per Pixel der kultivierten Bakterien. Alle Fluoreszenzintensitätswerte wurden gegen P. aeruginosa PA01 GFP normalisiert, welches für 24 Stunden in Platten mit 96 Vertiefungen kultiviert wurde. Die Daten werden als Median ± Standardabweichung von drei Experimenten mit jeweils drei Wiederholungen gezeigt. P- values <0.05 wurden als statistisch signifikant angesehen (g) Bakteriendichte in Platten mit 96 Vertiefungen und auf der DMA Oberfläche nach einer Inkubation für 24 Stunden. Die Daten sind als Median ± Standardabweichung dreier Experimente mit jeweils drei Wiederholungen gezeigt.
Figur 12. Tropfenmikroarray als Screeningplattform (a) Schema des Sandwiching Verfahrens zum Screenen von Antibiotika (b) Muster gedruckter Antibiotika auf fluorierten Glasträgern (c) Bild der Grünfluoreszenz der Bakterien auf DMA mit 25 (5 x5) Spots behandelt nacheinander mit Vancomycin (13.5 pmol/l) Ciprofloxacin (40 pmol/l). (d) Scan der Fluoreszenzintensität über die in c) gezeigte gelbe Linie (e) Bild roter Fluoreszenz der aktiven Bakterien auf einem DMA mit 25 (5 x 5) Spots nacheinander behandelt mit Vancomycin (13,5 mM) oder Ciprofloxacin (40 pM) und gefärbt mit CTC (Ditolyl-tetrazoliumchlorid) unter Verwendung der Sandwiching Methode (f) Scan der Fluoreszenzintensität über die in (e) gezeigte gelbe Linie (g) Digitales Bild der DMA Oberfläche der Bakterien auf dem DMA mit 25 (5 x 5) Spots nacheinander behandelt mit Vancomycin (13,5 pM) oder Ciprofloxacin (40 pM). Die DMA Träger wurden auf schwarzes Papier gelegt (h) Graustufenscan der in (g) gezeigten gelben Linie (i.) Rasterelektronenmikroskop (SEM) Bild des transparenten hydrophilen Spots auf der in (g) gezeigten DMA Oberfläche (j) SEM Bild des in (g) gezeigten Licht undurchlässigen hydrophilen Spots der DMA Oberfläche.
Figur 13. (a-e): Minimale Inhibitionskonzentration (MIC) von Ciprofloxacin, Ceftazidime, Tobramycin, Ampicillin und Tetracycline für P. aeruginosa PA01 GFP getestet in Platten mit 96 Vertiefungen und auf DMA Oberflächen (DMA Träger: ausgelesen durch Fluoreszenzintensität und die Intensitäten wurden in Werte optischer Dichte (OD) konvertiert; Platten mit 96 Vertiefungen: Auslesen durch OD Messungen). Alle Ergebnisse wurden bezogen auf eine Leere Kontrolle (0 pM in Platten mit 96 Vertiefungen (96-well plates)). Die Daten werden als Median ± Standardabweichung dreier Experimente mit jeweils 10 Wiederholungen dargestellt (f) Zeitverlaufexperiment der antibakteriellen Aktivität von Polymyxin B auf P. aeruginosa PA01 auf DMA Trägern. Die Daten werden als Median ± Standardabweichung dreier Experimente mit jeweils 5 Wiederholungen dargestellt.
Figur 14. Screeningergebnisse der antibiotischen Wirksamkeit P. aeruginosa 49 auf einer DMA Oberfläche und einer Platte mit 96 Vertiefungen. Es wurden zwei Konzentrationen der Antibiotika getestet. Der MIC Wert der Antibiotika wurde der EUCAST Datenbank entnommen. In der Platte mit 96 Vertiefungen wurden die Antibiotika in die bakterielle Suspension transferiert (100 mM pro Vertiefung). Auf der DMA Oberfläche wurden die Antibiotika mittels der Sandwiching Methode in die Tröpfchen der bakteriellen Suspension übertragen. Ursprüngliche bakterielle Dichte: Oϋboo = 0,001. Die Bakterien wurden für 24 Stunden bei 37 °C mit Antibiotika inkubiert. Die antibiotische Aktivität wurde mittels visueller Prüfung der Transparenz der Vertiefungen oder Tropfen evaluiert, wobei Lichtundurchlässigkeit lebende Bakterien anzeigt. Es wurden drei Experimente mit 10 Wiederholungen (10 Vertiefungen und 10 Spots) für jede Konzentration eines Antibiotikums durchgeführt. Das Antibiotikum wurde als wirksam angesehen, wenn > 8 Vertiefungen oder Spots transparent waren. S: sensitiv; NS: nicht sensitiv.
Figur 15. Ergebnis einer pH-Messung unter Verwendung von Kresolrot als pH-lndikator. Kresolrot ist ein bekannter T riphenylmethanfarbstoff aus der Gruppe der Sulfonphthaleine. Die Figur zeigt das Ergebnis einer pH-Messung auf einem Tropfenmikroarray (DMA) in Tropfen mit einem Volumen von 150 nL als Beispiel für das Verfahren, bei dem die optische Eigenschaft des Tropfens die Farbe ist. Länge der gezeigten Maßstabsleiste: 1 mm.
Beispiele
Kolorimetrische Assays auf dem DMA
Die Erfinder haben ein einfaches Verfahren für die Bestimmung eines kolorimetrischen Viabilitätsassays auf einem Tropfenmikroarray (Droplet Microarray, DMA) entwickelt, wobei beispielsweise ein handelsüblicher Dokumentenscanner oder ein mittels einer Smartphone App zur Verfügung gestellten, auf einer Smartphone Kamera beruhenden Bilderfassung zur Auswertung verwendet werden kann. Die DMA Plattform besteht aus einem Array von hydrophilen Spots auf einem superhydrophoben Hintergrund und ermöglicht die Bildung von Arrays von hunderten von separierten, stabilen Tröpfchen mit einem Volumen im Nanoliterbereich, insbesondere von 5 nL bis 200 nL, bevorzugt von 10 nL bis 150 nL. Diese Tröpfchen können zur Kultivierung von lebenden Zellen verwendet werden. Es ist auch möglich, einen derartigen Tropfenmikroarrays zur Durchführung eines sogenannten Hochdurchsatz (High Throughput)-Screenings zu verwenden.
Im Stand der Technik ist beschrieben, dass eine DMA mittels Mikroskopie ausgewertet wird. Dabei erlaubt die Mikroskopie es, detaillierte Informationen über den Status der kultivierten Zellen und verschiedener Zellprozesse zu erfahren. Nachteilig ist jedoch, dass die Anwendung der Mikroskopie in High Throughput Screenings zu langwierigen Laborprotokollen mit großen Datenmengen und komplexer Bildanalyse führt, die ein teures automatisiertes Screeningmikroskop nötig macht, welches nicht in jedem Labor zur Verfügung steht.
Sofern eine detaillierte mikroskopische Analyse der einzelnen Zellen nicht nötig ist hat es sich als ausreichend erwiesen, bei einigen Screeningapplikationen lediglich eine Schätzung der Zellviabilität vorzunehmen.
Resazurin und WST-8 sind Farbstoffe, mittels derer die Vaibilität von Zellen bestimmt werden kann, was für gewöhnlich in Mikrotiterplatten durchgeführt wird (Figur 1a). Resazurin ist ein Phenoxazinfarbstoff mit einer dunkelblauen Farbe und einer Absorption bei 600 nm. Er wird durch aerobe Respiration von lebenden Zellen zu Resorophin reduziert, das eine hellrosane Farbe und Absorption bei 470 nm zeigt (Figur 1a, oben). WST-8 ist ein farbloses Tetrazolsalz, welches durch lebende Zellen zu dem hellgelben WST-8 Formazan reduziert wird, welches bei 450 nm absorbiert (Figur 1a).
In einem ersten Schritt wurde mittels Lebensmittelfarbe, die auf ein DMA gedruckt wurde, ein einfaches bildgebendes Verfahren entwickelt, mittels dessen hochauflösende homogene Farbbilder eines gesamten DMA Arrays erhalten werden können (Figur 7). Im Rahmen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann ein handelsüblicher Dokumentenscanner beispielsweise mit einer Auflösung von 6400 dpi und 80% Belichtung verwendet werden (Figur 7a, Figur 1a, Bilder der Arrays). Für die Bildanalyse und Schätzung der Farbänderungen in den Tröpfchen wurde ein automatisierter Algorithmus entwickelt. Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in Figur 1b gezeigt.
In einem ersten Schritt wird ein Viabilitätsfarbstoff auf den DMA gegeben, welcher Zellen aufweist, die mit den Molekülen einer geeigneten Bibliothek behandelt worden sind (beispielsweise Medikamente, kleine Moleküle, siRNAs, etc.), wobei beispielsweise ein handelsüblicher „non-contact Low Volume Dispenser“ verwendet wird (Figur 1b Schritt 1). Das Verteilen von 100 nL Farbstoff über den ganzen Array dauert ungefähr eine Minute. In einem zweiten Schritt wird der DMA in einem Zellkulturinkubator für 20 Minuten inkubiert, sodass die Zellen den Viabilitätsfarbstoff metabolisieren können. In einem dritten Schritt wird der DMA gescannt, beispielsweise mittels eines handelsüblichen Dokumentenscanners, was mit der nötigen Auflösung ungefähr 6 Minuten dauert. In einem vierten Schritt erfolgt die Analyse des Arrayscans mittels eines automatisierten Algorithmus, welcher ungefähr zwei Minuten pro Scan in Anspruch nimmt. Somit ist es möglich, das erfindungsgemäße Verfahren innerhalb von nur ungefähr 30 Minuten durchzuführen.
Um zu zeigen, dass das Verfahren unter Verwendung verschiedener Viabilitätsfarbstoffe funktioniert, wurden sowohl Resazurin als auch WST-8 zur Abschätzung der Zellviabilität verwendet, wobei ein Gradient von Zellen mit 0, 40, 80, 120, 160, 200, 250 und 300 Zellen pro Spot in 150 nL T röpfchen auf dem DMA, wie in Figur 2a gezeigt, aufgebracht wurden und über Nacht inkubiert wurden. Danach wurden 100 nL Resazurin oder WST-8 Farbstoff über den gesamten DMA verteilt, in einem Zellkulturinkubator für 20 Minuten inkubiert und unter Verwendung eines handelsüblichen Dokumentenscanners gescannt (Figur 2a). Ein Kontroll DMA wurde mittels Calzein AM gefärbt, mikroskopisch ausgewertet und die Anzahl lebender Zellen bestimmt (Figur 2a). Die Scans wurden mittels eines Algorithmus ausgewertet, welcher jeder Probe eine Zahl zugewiesen hat, die als Farbtiefe für jeden Spot bezeichnet wird. Wie in Figur 2b gezeigt wurde ein Gradient der Farbtiefe sowohl für Resazurin als auch für WST-8 Viabilitätsfarbstoff erhalten (Figur 2b, Mitte und rechts), was dem Gradienten der berechneten Calzein positiven Zellen entspricht (Figur 2b, links). Der Low Volume Dispenser, welcher für das Aussäen der Zellen verwendet wurde, zählt die Zellen nicht, sodass eine Verteilung der Zellzahl pro Spot erhalten wurde (Figur 2b, links). Dies zeigt sich in der Verteilung der Daten für jede Zellzahl des Gradienten, welche sich sowohl für die kolorimetrischen Assays als auch für die Quantifizierung lebender Zellen zeigt (Figur 2b). Die Ergebnisse zeigen, dass Resazurin und WST-8 Viablilitätsfarbstoffe für eine leichte und schnelle Abschätzung von Zellzahlen pro Spot eines DMA verwendet werden können, wobei ähnliche Ergebnisse erhalten werden wie unter Verwendung eines Mikroskops. Vergleich mit Platten mit 384 Vertiefungen
Als nächstes wurde die Sensitivität und die Inkubationszeit für Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays auf einem DMA mit einer Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen verglichen. Zunächst wurde untersucht, wieviel Zeit nötig ist, um ein Signal von 300 Zellen auf DMA beziehungsweise Mikroplatten zu erhalten. Wie in den Figuren 3a und b gezeigt, war auf einem DMA ein Signal von beiden Farbstoffen bereits nach 5 Minuten Inkubation detektierbar und nach 50 Minuten gesättigt. Demgegenüber dauerte es ungefähr eine Stunde, bis auf einer Platte mit 384 Vertiefungen ein detektierbares Signal vorhanden war, welches selbst nach 5 Stunden der Inkubation nicht gesättigt war (Figur 3a und b). Zweitens wurde untersucht, wie groß die minimale Anzahl von Zellen ist, die auf einem DMA beziehungsweise einer Plattform mit 384 Vertiefungen unter Verwendung von Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays detektierbar ist. Dazu wurde ein Zellgradient von Zellen von 100 bis 300 pro Spot/Vertiefung aufgetragen und für 1 Stunde und 5 Stunden auf DMA beziehungsweise Platten inkubiert. Wie in den Figuren 3c und d gezeigt, kann das Signal von beiden Viabilitätsfarbstoffen auf dem DMA bereits bei 10 Zellen pro Spot detektiert werden, wobei auf der Platte mit 384 Vertiefungen die Detektion erst mit 25 beziehungsweise 100 Zellen für WST-8 beziehungsweise Resazurin möglich war (Figuren 3c und d). Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl Resazurin als auch WST-8 Viabilitätsassays schneller und sensitiver auf DMA sind als auf Mikroplatten und bereits 10 Zellen nach nur 20 Minuten der Inkubation nachweisbar sind.
Behandlung mit Wirkstoffen wie Medikamenten
Um zu zeigen, dass etablierte Resazurin beziehungsweise WST-8 kolorimetrische Viabilitätsassays verwendet werden können, um Zellviabilität nach der Behandlung mit einem Medikament abzuschätzen, wurden HeLa Zellen mit verschiedenen Konzentrationen des Antikrebsmedikamentes Doxorubicin behandelt (Figur 4). Dazu wurden, wie in Figur 4a gezeigt, verschiedene Konzentrationen von Doxorubicin in hydrophile Spots eines DMAvorgedruckt. Dann wurden HeLa Zellen auf die vorbedruckte DMA gebracht und für 24 Stunden inkubiert. Sowohl Resazurin als auch WST-8 kolorimetrische Viabilitätsassays wurden gemäß dem etablierten Protokoll durchgeführt (Figur 4a und 9, vormals S3). Die mit kolorimetrischen Methoden erhaltenen Ergebnisse wurden mit denen verglichen, die unter Verwendung einer Färbung erhalten wurde, gefolgt von Mikroskopie, also der normalerweise in Laboratorien zur Abschätzung der Toxizität eines Medikamentes verwendeten Verfahren. Wie in Figur 4b gezeigt, war die mittels aller drei Methoden gemessene Dosisantwort der HeLa Zellen mit IC50 Werten vergleichbar, nämlich 0.5±0.03, 0.7±0.04 und 0.4±0.2 für Mikroskopie, Resazurin beziehungsweise WST-8. Diese Ergebnisse zeigen, dass etablierte kolorimetrische Viabilitätsassays als Verfahren für Wirkstofftoxizität Screening Anwendungen auf einem DMA verwendbar sind. Im nächsten Schritt wurde geprüft, ob etablierte kolorimetrische Assays als Verfahren in Wirkstoffscreenings verwendet werden können, bei denen verschiedene Konzentrationen der zu prüfenden Verbindungen in zufälligerweise auf dem Array vorgedruckt sind um mögliche Einflüsse der Positionen zu vermeiden, wobei nur 4 Wiederholungen pro Konzentration verwendet werden, wie dies allgemeinhin in dem im Stand der T echnik verwendeten Screening Experimenten der Fall ist. Es wurden verschiedene Konzentrationen der Antikrebswirkstoffe Pazopanib, Vorinostat, Nilotinib und Dasatinib auf ein DMA vorgedruckt, wie in den Figuren 5a und 10 gezeigt. Nachfolgend wurden HeLa Zellen auf die vorgedruckten Arrays aufgebracht und für 24 Stunden inkubiert. Die Dosisantwort und IC50 Werte, die unter Verwendung kolorimetrischer Assays für jeden Wirkstoff erhalten wurden, wurden mit Mikroskopie basierten Auswertungsverfahren verglichen. Wie in Figur 5 gezeigt sind die erhaltenen Dosisantwortkurven und die IC50 Werte für alle vier getesteten Wirkstoffe vergleichbar. Dies beweist, dass kolorimetrische Viabilitätsassays in Hochdurchsatzscreening Verfahren verwendet werden können.
3D-Zellkultur
Da das vorliegende Verfahren nicht nur für adhärente Zellen, sondern auch für suspensive Zellen verwendet werden soll, wurden bekannte Protokolle zur Abschätzung der Größe von Sphäroiden getestet, die auf dem DMA gebildet sind. HepG2 Sphäroide werden dazu als „hanging droplet“ Methode auf einem DMA inkubiert. Um einen Gradienten der Sphäroide mit unterschiedlichen Größen auf dem Array zu erreichen, wurden verschiedene Anzahlen von Zellen zwischen 40 bis 300 Zellen pro Spot in Blöcken von 6x14 Spots ausgesät (Figur 2a). Danach wurde der DMA mit den Zellen invertiert und auf einer Halterung innerhalb einer Petrischale in einem Zellkulturinkubator inkubiert. Nach drei Tagen der Kultivierung hatten sich HepG2 Sphäroide verschiedener Durchmesser auf der DMA gebildet (Figur 6a). Dann wurden Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays gemäß dem etablierten Protokoll mit ansteigender Inkubationszeit mit Reagenzien von 20 bis 60 Minuten durchgeführt (Figur 6). Wie in den Figuren 6a und b gezeigt, wurde die unterschiedliche Größe der Sphäroid Durchmesser durch die Farbänderung von Resazurin und WST-8 abgebildet. Dieses Ergebnis zeigt, dass Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays für Screenings von 3D Zellkulturen verwendet werden können.
Zellkultur
Die humane zervikale Adenokarzinomzelllinie HeLa CCL2 und die humane Leberkrebszelllinie HepG2 wurde in Dulbecco modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin kultiviert. Die Zellen wurden in 10 ml Zellkulturschalen kultiviert und alle 2 bis 3 Tage passagiert. 2D Zellkulturen auf DMA
DMA Platten wurden von der Aquarray GmbH erworben. Die DMA Südes enthielten 672 rechteckige hydrophile Spots im Arrayformat von 14 x 48 mit hydrophilen Spots mit einer Seitenlänge von 1 mm. Vor der Kultivierung von Zellen wurden die DMA Platten mit 70% Ethanol für 5 Minuten sterilisiert gefolgt von einer Trocknung unter sterilen Bedingungen für 15 Minuten. Die Zellen wurden vor dem Aussäen entsprechend dem Standardprotokoll trypsinisiert, gezählt und unter Verwendung von Zellkulturmedium auf die gewünschte Konzentration gebracht. Die Zellen wurden auf die DMA Platte unter Verwendung des low volume non-contact Dispensers I-DOT-One (Dispendix GmbH) in einem Volumen von 150 nL pro Spot ausgesät. Während des Aussäens der Zellen wurde die Feuchtigkeit auf 70 % eingestellt. Die Zellen wurden mittels 8 parallelen Kanälen auf einen DMA ausgesät unter Verwendung von Luftdruck von 150 La, wobei das Verteilen der Zellen auf 672 Spots 44 Sekunden dauerte. Sofort nach dem Aufträgen der Zellen wurde der DMA in eine 10 cm Petrischale mit 2 mL Dulbecco’s PBS gesetzt und fecht gehalten. Die Petrischale wurde in einen Standardzellkulturinkubator verbracht und die Zellen wurden für 24 Stunden auf dem DMA Slide mit oder ohne zugegebene Verbindungen inkubiert, bevor sie gefärbt wurden.
Resazurin und WST-8 Viabilitätsassay auf dem DMA
Die Färbung wurde durchgeführt durch Verteilung von 100 nL von entweder WST-8 (Kit-8, Dojindo EU GmbH, Deutschland) oder Resazurin (Sigma-Aldrich, Deutschland) direkt in jedes Zellen enthaltende Tröpfchen unter Verwendung eines kontaktlosen Dispensers mit kleinem Volumen, low volume non-contact Dispensers I-DOT-One l-DOT One (Dispendix GmbH). Nach der Zugabe des Reagenzes wurde das DMA in den Zellkulturinkubator gelegt und je nach Experiment zwischen 20 Minuten und 5 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die DMAs mit einem handelsüblichen Papierscanner gescannt, wobei die folgenden Einstellungen verwendet wurden: Farbe: 80%, Licht 6700 dpi. Das Scannen des gesamten Arrays benötigte 6 Minuten.
Mikroskopie
Zur Schätzung der Anzahl von Zellzahlen pro Spot wurden die Zellen mit Calzein AM durch Dispension von 50 nL einer Lösung mit 1,5 pg/mL Calzein AM (Thermo Scientific) in Dulbecco’s PBS verteilt, wobei ein l-DOT One dispenser (Dispendix GmbH) verwendet wurde. Danach wurden die Zellen für 15 Minuten in einem Zellkulturinkubator inkubiert, bevor die Bildgebung durchgeführt wurde. Zunächst wurde das gesamte Slide mit zweifacher Vergrößerung mit einem Keyence BZ-9000 Mikroskop (KEYENCE, Osaka, Japan) mikroskopiert. Dann wurde jeder Spot mit zehnfacher Vergrößerung mit einem automatisierten Screeningmikroskop Olympus 1X81 Mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) untersucht.
Zur Schätzung der Zellzahl pro Spot nach der Behandlung mit einem Medikament wurden die Zellen mit Hoechst 33342 (Thermo Scientific) gefärbt durch Verteilen von 50 nL der Lösung enthalten 4 pg/mL von Hoechst in Dulbecco’s PBS mit einer l-DOT One (Dispendix GmbH). Danach wurden die Zellen für 15 Minuten in einem Zellkulturinkubator inkubiert. Das Bild jedes Spots wurde mittels zehnfacher Vergrößerung mit einem automatisierten Screeningmikroskop Olympus 1X81 microscope (Olympus, Tokyo, Japan) erhalten.
Bildanalyse
Die Analyse gescannter Bilder von DMAs, die mit WST-8 oder Resazurin gefärbt wurden, wurde wie folgt durchgeführt. Für jedes Bild wurde die Anzahl der Zeilen und Spalten festgelegt sowie die linke obere Ecke und die untere rechte Ecke und die horizontale und vertikale Position aller Vertiefungen. Die mittlere Position aller Vertiefungen wurde geschätzt und ein Rechteck von 41 x 41 Pixeln, die sich um die zentrale Position befindet, wurde extrahiert. Die Intensität der Farbkanäle wurde kalkuliert und auf [0,1] normalisiert (für violette Vertiefungen wurde das Verhältnis von R-Kanal zu R+G-Kanal berechnet, für grau-gelbe Bilder wurde der blaue Kanal invertiert). Die Intensitäten wurden innerhalb des betrachteten Rechtecks gemittelt, um eine Intensitätsgröße zu erhalten.
Mikroskopische Bilder wurden unter Verwendung der ImageJ Software analysiert. Zunächst wurde das Bild in ein 8 Bit Bild konvertiert, dann wurde der Threshold per Hand angepasst. Ein „Watershed” Algorithmus wurde verwendet, um Zellen voneinander zu trennen. Dann wurde die „Analyze particle“ Funktion verwendet, um die Anzahl der pro Spot gefärbten Zellen zu zählen. Die „Batch Macro“ Funktion von ImageJ wurde verwendet, um alle 672 Bilder automatisch zu analysieren.
Resazurin und WST-8 Viabilitätstest in Platten mit 384 Vertiefungen
WST-8 und Resazurin Viabilitätstests auf Platten mit 384 Vertiefungen wurden gemäß Herstellerprotokoll durchgeführt. Die Zellen wurden per Hand in 30 pL Kulturmedium aussät und für 24 Stunden inkubiert. Viabilitätstests wurden durch Zugabe von 10 pL von entweder WST-8 (Kit-8, Dojindo EU GmbH, Deutschland) oder Resazurin (Sigma-Aldrich, Deutschland) durchgeführt. Nach der Zugabe des Reagenzes wurden die Platten in einem Zellkulturinkubator für 20 Minuten bis 5 Stunden inkubiert, abhängig von der Art des Experimentes. Die Absorption bei 450 nm wurde im Fall des WST-8 und bei 570 und 600 nm für Resazurin gemessen. Für die Analyse wurde die Absorption von Kontrollmedium für jede Vertiefung abgezogen. Für Resazurin wurde die Absorption bei 570 nm von der bei 600 nm abgezogen. Wirkstoffbehandlung
Die folgenden Wirkstoffe wurden verwendet: Doxorubicin, Pazopanib, Vorinostat, Nilotinib und Dasatinib. Lösungen dieser Wirkstoffe mit einer Konzentratioin von 4 mmol/L wurden in DMSO hergestellt. Danach wurden Vorratslösungen in DMSO hergestellt mit Konzentration von 7,5 mM and 750 mM. Die Wirkstoffe wurden auf sterile und trockene DMAs verteilt und direkt in die hydrophilen Spots mit einem sciFLEXARRAYER S11 Flüssigkeitsdispenser (Scienion, Berlin, Deutschland) aufgetragen. Verteilt für Endkonzentrationen von 0.05 mM - 1 nL, für 0.1 mM - 2 nL, für 0.5 mM - 10 nL, für 1 mM - 20 nL der 7.5 mM Vorratslösung. Für Endkonzentrationen von 5 mM - 1 nL, 10 mM - 2 nL, 25 mM - 5 nL, 50 mM - 10 nL der 750 mM Vorratslösung. 10 nL Konzentration wurden als Kontrolle verwendet. Nach der Verteilung wurden DMA Südes mit vorgedruckten Wirkstoffen unter Vakuum für 2 Stunden getrocknet und am nächsten Tag für Zellexperimente verwendet.
3D Sphäroidkulturen auf DMA
HepG2 Zellen wurden wie beschrieben auf DMAs ausgesät. Direkt nach dem Aussäen wurden die DMAs mit den Zellen einerHalterung in umgekehrter Position auf eine 10 cm Petrischale gesetzt. Die Sphäroide bildeten innerhalb von 72 Stunden sogenannte „hanging droplets“ auf dem DMA bevor sie mit WST-8 und Resazurin gefärbt wurden.
Hefe Östrogen Assay (Yeast Estrogen Assay, YES)
100 nL Probenvolumens wurden auf jeden Spot eines DMA mit runden Spots (Durchmesser d = 900 pm) gegeben. Die Probelösungen bestanden entweder aus entionisiertem Wasser (für UV-freigegebene (UV-released) Verbindungen und negative Kontrollen) oder aus einem wässrigen 17ß-Estradiol (17ß-Östradiol) Standard mit Konzentrationen von 400 ng/L, 200 ng/L, 100 ng/L, 40 ng/L, 20 ng/L, 10 ng/L und 5 ng/L. Nachfolgend wurden 50 nL der Hefesuspension zu jedem Spot gegeben und der DMA wurde in einer feuchten Atmosphäre für 24 h bei 30 °C inkubiert. Das LacZ-Substrat Reaktionsgemisch (aufweisend Chlorophenol- Rot-Galaktosid, Chlorophenol Red Galactoside (CPRG)) wurde hinzugegeben (10 nL pro Spot) und die Farbe der Tropfen wurde nach 30 Minuten Inkubations mittels eines Dokumentenscanners gemessen.

Claims

Ansprüche
1. Optisches Nachweisverfahren, insbesondere zum Nachweis eines Stoffes oder einer Aktivität, aufweisend die folgenden Schritte:
- Bereitstellen eines lichtdurchlässigen/transparenten Tropfenmikroarrays (DMA), aufweisend eine Mehrzahl von Tropfen,
- Durchführen einer Reaktion in der Mehrzahl von Tropfen zur Änderung einer optischen Eigenschaft des Tropfens,
- Scannen einer optischen Eigenschaft der Mehrzahl von T ropfen des T ropfenmikroarrays und
- Schließen auf die in den Tropfen abgelaufene« Reaktion.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die optische Eigenschaft des Tropfens die Farbe, Fluoreszenz oder die Turbidität ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Tropfenmikroarrays (DMA) eine Mehrzahl von hydrophilen Spots auf einem superhydrophoben Grund aufweist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, wobei das Volumen der Tropfen 5 nl bis 200 nl beträgt, insbesondere 20 nl bis 150 nl, bevorzugt ungefähr 100 nl.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, wobei das Durchführen einer Reaktion das Hinzufügen eines Farbstoffes in die Mehrzahl von Tropfen umfasst.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, wobei das Scannen mit einem Scanner, einem Dokumentenscanner oder einer Kamera, insbesondere mit einer Digitalkamera erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, wobei die Reaktion mittels einer Zelle durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Reaktion in Abhängigkeit mindestens einer Eigenschaft der Zelle eine Änderung einer optischen Eigenschaft der T ropfen zur Folge haben kann.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Farbstoff von einer lebenden Zelle in farbändernder Weise metabolisiert wird, insbesondere wobei der Farbstoff Resazurin oder WST-8 ist.
10. Verfahren nach Anspruch 7 bis 9, wobei die mindestens eine Zelle eine eukaryontische Zelle oder eine prokaryontische Zelle ist, insbesondere eine Säugertierzelle, eine Hefe oder ein Bakterium.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die prokaryontische Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und Enterobacter spp.
12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, weiterhin aufweisend den Schritt der Hinzugabe eines zu testenden Stoffes in einen Tropfen des DMA, wobei der zu testende Stoff ein Wirkstoff, beispielsweise ein Medikament ist, insbesondere wobei der zu testende Stoff Teil einer Bibliothek von zu testenden Stoffen ist.
13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der zu testende Stoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wrkstoff, Medikament, kleines Molekül (small molecule) und Nukleinsäure, insbesondere DNA, RNA, mRNA oder siRNA.
14. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Medikament ein Medikament gegen Krebs ist, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pazopanib, Vorinostat, Nilotinib und Dasatinib, Cytarabine, Gemcitabine, Etoposide, Tamoxifen, Tretinoin, Dasatinib, Pazopanib, Nilotinib, Gefitinib, Bicalutamide, Vorinostat, Vinblastine, Carboplatin, Oxalitacin, und Alendronate.
15. Verwendung eines Tropfenmikroarrays (DMA) in einem biologischen oder medizinischen Verfahren, insbesondere in einem Verfahren zur optischen Bestimmung mindestens einer Eigenschaft einer Zelle, insbesondere in einem Verfahren nach Anspruch 1 bis 14.
16. Kit, aufweisend
- einen lichtdurchlässigen/transparenten Tropfenmikroarrays (DMA) zur Aufnahme eine Mehrzahl von Tropfen, und
- einen Scanner zum Scannen einer optischen Eigenschaft der Mehrzahl von Tropfen des Tro pf e n m i kroa rray s .
17. Kit nach Anspruch 16, wobei der Scanner ein Dokumentenscanner oder eine Kamera ist.
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