WO2022013718A1 - Processo para classificação de amostras biológicas quanto a infecção por agentes virais e usos - Google Patents
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- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/21—Polarisation-affecting properties
Definitions
- the proposed technology presents a process to perform classifications of biological samples for infection by viral agents and also describes the uses of the process.
- the technology is based on a combination of techniques: Variable Angle Spectroscopic Ellipsometry (variable-angle spectroscopic ellipsometry - VASE), Artificial Intelligence and Machine Learning from a Decision Tree model associated with an Extreme Augmentation algorithm. of Gradient (named in English - “Extreme Gradient Boosting”) or random decision trees (“f ⁇ andom Foresf) or the noise elimination technique based on Euclidean distances, called K-Nearest Neighbors (KNN).
- Gradient named in English - “Extreme Gradient Boosting”
- random decision trees f ⁇ andom Foresf
- KNN K-Nearest Neighbors
- the technology is applied to support the diagnosis of infections caused by viral agents, especially for the agents called SARS-CoV-2, Zika and Dengue, and has settings applicable to all stages of the infection's evolution. It provides simultaneous analysis for a plurality of viral agents in multiple detection mode ( Multiplex ) and eliminates the use of markers (" label-free ). It represents a relevant resource for mitigating and controlling pandemics caused by viral etiological agents, especially the current COVID-19 pandemic caused by the coronavirus.
- One of the proposed technology configurations can be used as an alternative to the RT-PCR technique for the detection of viral agents, detecting the presence of virus RNA fragments and cellular material modified by the viral infection in oropharyngeal scraping samples. or in cells cultured and infected in the laboratory, suitable for patients with a few weeks of infection and who do not yet have a high production of antibodies.
- Another configuration of the technology can be used as an alternative to existing serological diagnostic methods, based on antibody reaction, helping to diagnose individuals who have been infected for more than two weeks.
- This form of technology application presents the possibility of detecting infections by the SARS-CoV-2 and Dengue viral agents, providing support for the differential diagnosis of these viral agents. It can also be a viable technology as an alternative to be used for epidemic mapping and public policy purposes.
- “Characterization of layered scattering media using polarized light measurements and neural networks” describes a methodology that measures the depolarization of radiation scattered by a thin tissue layer of skin from a beam of polarized light and indicates the use of an artificial neural network trained to characterization of melanoma from the measures described.
- “Application of neural classification in ellipsometry for robust thin-film characterizations” presents the use of ellipsometry and artificial neural networks to characterize a photoresist. From ellipsometric measurements, a neural network classifies the measured photoresist according to its thickness range. [07] The Scientific article, published in 2018, entitled “Computer-aided diagnosis of glaucoma using fundus images: A reviewW' details the use of ellipsometry applied to the fundus and artificial neural networks for the characterization/diagnosis of glaucoma. Based on ellipsometric measurements, a trained neural network classifies samples measured in eyes, specifically in their fundus, as to the occurrence of glaucoma.
- the present invention differs from the technologies present in the state of the art because it results in the exclusive combination of the following technical characteristics and technical effects: and Machine Learning from a Decision Tree model associated with the Extreme Gradient Boosting algorithm (named in the English language - “Extreme Gradient Boosting') or random decision trees (“f ⁇ andom Foresf) or the noise elimination technique based on in Euclidean distances, called K-Nearest Neighbors (KNN).
- the data applied to the models represent ellipsometric measurements of films prepared from biological samples.
- the technology is applied to support the diagnosis of infections caused by viral agents, especially for the agents called SARS-CoV-2, Zika and Dengue, and has settings applicable to all stages of the infection's evolution. It provides simultaneous analysis for a plurality of viral agents in multiple detection mode (Multiplex) and eliminates the use of label-free markers).
- the proposed technology presents a process to perform classifications of biological samples for infection by viral agents and also describes the uses of the process.
- the technology is based in the combination of techniques: Variable Angle Spectroscopic Ellipsometry (named in English - variable-angle spectroscopic ellipsometry - VASE), Artificial Intelligence and Machine Learning from a Decision Tree model associated with Extreme Gradient Augmentation algorithm (named in English language - “Extreme Gradient Boosing') or random decision trees (“Fiandom Foresf) or the noise elimination technique based on Euclidean distances, called K-Nearest Neighbors (KNN).
- the data applied to the models represent ellipsometric measurements of films prepared from biological samples.
- the technology is applied to support the diagnosis of infections caused by viral agents, especially for the agents called SARS-CoV-2, Zika and Dengue, and has settings applicable to all stages of the infection's evolution. It provides simultaneous analysis for a plurality of viral agents in multiple detection mode (Multiplex) and eliminates the use of label-free markers).
- Multiplex multiple detection mode
- the cells used in the proposed method can be obtained from cell cultures or from smears of cells collected from a patient.
- Patient samples can be obtained by collecting material using nasal or oropharyngeal swab, or both, performed on the patient to obtain a smear of cells.
- the preparation of the lysis film has the following steps: 1) lysis of cells obtained by cultivation or smear, for inactivation of the same and protection of the RNA of the viruses; 2) the solution containing the lysed cells, obtained in step 1, is deposited on a coverslip and left to dry until a film forms.
- the buffer solution used to lyse cells should comprise guanidine isothiocyanate and sodium citrate in RNAse/DNAse free water, with a pH adjusted to close to 4.
- Guanidine is a ribonuclease inhibitor that aids in the preservation of genetic material.
- Samples can be obtained by collecting blood from the patient to obtain serum. To obtain the serum, the patient's blood is centrifuged to separate the serum from the other blood components. Serum contains the antibodies produced by the patient's immune system when infected.
- the description for obtaining training data and test data for the elaboration and verification of the accuracy of the classification model is presented.
- the elaboration of the model comprises the following steps: a) Focus a beam of electromagnetic radiation with well-defined linear polarization in the ultraviolet, visible and infrared spectral regions (from 242 nm to 1689 nm, in unit increments) on the region of the coverslip in which the lysis film or whey film is present for each elipsométricos angles of incidence of 45 °, 50 °, 55 °, 60 °, 65 and 70 0 with respect to the normal line to the film surface deposited on the coverslip , the film is contained in the space between two juxtaposed coverslips; b) Measure the change in polarization of the reflected radiation beam by determining the ratio (p) between the Fresnel coefficients r p r s , according to Expression (1), for each incident wavelength and angle of radiation defined in step "The”: (Expression 1)
- steps “a” and “b” must be applied to multiple regions of the coverslip containing the lysis film or the serum film; d) Label the data obtained in the steps in steps “a”, “b” and “c”” regarding infection by viral agents (the presence of infection by viral agents is known in the training and test data, as samples are chosen infected with the viral agent or, in the case of the cultivation of cells used to generate the lysis film, the cells are intentionally infected); e) The total measurements obtained in steps “a” to “d” are organized to include two columns of data, the first column is made up of all wavelengths measured in duplicate, the second column is made up of the real part the values of p plus the imaginary part of said values; f) A training database is constituted by adding columns with the values of p for each angle of incidence, and each of the regions measured for each coverslip; g) The training database is then submitted to a standard
- KNN K-Nearest Neighbors
- step “h” An extreme gradient increase technique can be used alternatively in step “h”.
- An artificial intelligence algorithm based on random decision trees (“f ⁇ andom Foresf) can be used alternatively in step “h”.
- step “c” The probability generated in step “c” is compared with an arbitrated threshold value (Va), so that if the value of the generated probability is greater than Va the sample is classified as infection by viral agents present; if the value of the generated probability is less than Va, the sample is classified as absent infection by viral agents.
- Va arbitrated threshold value
- the film can be the lysis film formed by cells obtained from culture or smear, lysed with buffer containing ribonuclease inhibitor, deposited on a coverslip with drying at room temperature.
- the film can also be obtained from blood serum, applied to the surface of a coverslip and immediately covered by a second coverslip, enclosing the sample of liquid material between the two coverslips.
- the electromagnetic radiation beam with well-defined linear polarization can be comprised in the ultraviolet spectral regions in the range of 240 nm to 380 nm and the ellipsometric angle is 55 degrees.
- step "a” For the blood serum film, in step "a", the infrared spectral regions above 850 nm (in unit increments) are used.
- steps “a” and “b” can be applied preferably in 13 regions of a rectangular coverslip defined as follows: region (1): center of the coverslip; regions (2), (3), (4) and (5): the four corners of the coverslip; regions (6), (7), (8) and (9): the midpoints of each edge of the coverslip; regions (10), (11), (12) and (13): the points corresponding to 1 ⁇ 4 and 3 ⁇ 4 of each diagonal of the coverslip.
- the numerical value of prediction can be normalized, preferably normalized in a numerical range between 0 and 1.
- the arbitrated threshold value (Va) is preferably 0.5 or 50%.
- the use of the biological sample classification process for infection by viral agents is preferably for classification involving SARS-CoV-2, Zika and/or Dengue viral agents.
- the imaginary part of the values associated with the real part of the p values can be used in a complementary way, also including the depolarization and intensity, in the measurements presented in step "b” .
- Steps “a” and “b” also include the measurement of wavelengths in quadruplicate, according to the steps described below: a) Focus a beam of electromagnetic radiation with well-defined linear polarization in the infrared spectral regions above 850 nm (in unit increments) over a region of the cover slip in the serum of film is present for each elipsométricos angles of incidence of 45 °, 50 °, 55 °, 60 °, 65 and 70 0 with respect to the normal line to the surface of the film, the film being contained in the space between two overlapping coverslips; b) Measure the change in polarization of the reflected radiation beam by determining the ratio (p) between the Fresnel coefficients r p r s , also measure the depolarization, intensity and wavelength
- step “c” The probability generated in step “c” is compared with an arbitrated threshold value (Va), so that if the value of the generated probability is greater than Va, the sample is classified as an infection by SARS-CoV-2 and/or viral agents or Dengue present; if the value of the generated probability is lower than Va, the sample is classified as infection by SARS-CoV-2 viral agents and Dengue absent, allowing the differential identification of the type of infection.
- Va arbitrated threshold value
- the measurements must be applied in 5 to 9 regions of a rectangular coverslip, defined as follows: in the center of the coverslip and on the side where the light falls.
- the process using serum film can be used for the differential diagnosis of Dengue and COVID-19.
- PCR Polymerase Chain Reaction
- Example 2 Process for classifying biological samples for infection by SARS-CoV-2 and Dengue viral agents
- This example presents a possible embodiment of the technology to perform a prediction for Dengue or SARS-CoV-2 infection. It is a differential diagnosis for these two viral agents.
- This embodiment of the invention uses serum samples taken from the patient's blood.
- a patient's blood sample is centrifuged to separate the serum from the rest of the components.
- the serum contains the antibodies produced by the patient's immune system, in huge quantities when the patient was infected, and does not contain remnants of cellular material or the RNA of the virus.
- a 10 pL aliquot of blood serum is applied to the surface of a coverslip and immediately covered by a second coverslip, enclosing the sample of liquid material between the two coverslips.
- Measurement methodology between 5 and 9 regions are used, which include the center of the sample and the left side of it (region where the light falls), not needing to measure the right side of the sample (region where the light comes out). light) nor cover most of the surface of the sample.
- Physical parameters measured and optical configuration the physical parameters measured and used in the analysis with the aid of artificial intelligence use the measurements of two ellipsometric angles y and D to compose the imaginary part (pi) and the real part (p r ) of the ratio between the intensity of reflected light with polarization in the sample plane and out of the sample plane. Depolarization and Intensity measurements were also used at six different angles of incidence (45°, 50°, 55°, 60°, 65° and 70°). The spectral region above 850 nm was used. The Depolarization and Intensity measurements allow the anisotropy of the samples to be considered and require a PSCRA (polarizer-sample-rotary compensator-analyzer) optical configuration.
- PSCRA polarizer-s
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Abstract
O processo combina as técnicas: Elipsometria Espectroscópica de Ângulo Variável ( variabíe-angle spectroscopic ellipsometry), Inteligência Artificial e Aprendizado de Máquina a partir de modelo de Árvores de Decisão associadas com algoritmo de Aumento Extremo de Gradiente (Extreme Gradiení Boosting) ou árvores de decisão randômica (Random Forest), ou a técnica de eliminação de ruído baseada em distâncias euclidianas (K-Nearest Neighbors), A tecnologia aplica-se ao suporte do diagnóstico de infecções causadas por agentes virais, especialmente para os agentes SARS-CoV-2, Zika e Dengue, e possui configurações aplicáveis a todos os estágios da evolução da infecção, Propicia a análise simultânea para uma pluralidade de agentes virais em modo de múltiplas detecções (Multiplex) e prescinde o uso de marcadores. Representa um recurso relevante para ações mitigadoras e de controle de pandemias provocadas por agentes virais, especialmente a atual pandemia de COVID-19.
Description
“PROCESSO PARA CLASSIFICAÇÃO DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS QUANTO A INFECÇÃO POR AGENTES VIRAIS E USOS”
[01] A tecnologia proposta apresenta um processo para realizar classificações de amostras biológicas quanto à infecção por agentes virais e também descreve os usos do processo. A tecnologia baseia-se na combinação das técnicas: Elipsometria Espectroscópica de Ângulo Variável (denominação na língua inglesa - variable-angle spectroscopic ellipsometry - VASE), Inteligência Artificial e Aprendizado de Máquina a partir de modelo de Árvores de Decisão associadas com algoritmo de Aumento Extremo de Gradiente (denominação na língua inglesa - “Extreme Gradient Boosting”) ou árvores de decisão randômica (“ fíandom Foresf) ou a técnica de eliminação de ruído baseada em distâncias euclidianas, chamada K-Nearest Neighbors (KNN). Os dados aplicados aos modelos representam medidas elipsométricas de filmes preparados a partir de amostras biológicas. A tecnologia aplica-se ao suporte do diagnóstico acerca de infecções causadas por agentes virais, especialmente para os agentes denominados SARS-CoV-2, Zika e Dengue, e possui configurações aplicáveis a todos os estágios da evolução da infecção. Propicia a análise simultânea para uma pluralidade de agentes virais em modo de múltiplas detecções ( Multiplex ) e prescinde o uso de marcadores (“ label-free ). Representa um recurso relevante para ações mitigadoras e de controle de pandemias provocadas por agentes etiológicos virais, especialmente a atual pandemia de COVID-19 causada pelo coronavírus.
[02] Uma das configurações da tecnologia proposta pode ser utilizada como alternativa à técnica de RT-PCR para a detecção de agentes virais, detectando a presença de fragmentos de RNA de vírus e de material celular modificado pela infeção virai em amostras de raspado de orofaringe ou em células cultivadas e infectadas em laboratório,
adequada para pacientes com poucas semanas de infeção e que ainda não apresentam uma produção elevada de anticorpos.
[03] Outra configuração da tecnologia pode ser utilizada como uma alternativa aos métodos de diagnostico sorológicos existentes, baseados na reação com anticorpos, auxiliando no diagnóstico de indivíduos que já estão infectados há mais de duas semanas. Esta forma de aplicação da tecnologia apresenta a possibilidade de detectar infeções pelos agentes virais SARS-CoV-2 e Dengue, propiciando suporte ao diagnóstico diferencial destes agentes virais. Também pode ser uma tecnologia viável como alternativa a ser utilizada para fins de mapeamento da epidemia e de políticas públicas.
[04] No estado da técnica encontram-se descritos alguns processos para realizar classificações utilizando-se técnicas de medidas de despolarização da luz e de elipsometria combinadas com Inteligência artificial, como os comentados a seguir.
[05] O Artigo científico, publicado no ano de 2003, intitulado
“Characterization of layered scattering media using polarized light measurements and neural networks” descreve uma metodologia que mede a despolarização da radiação espalhada por uma fina camada tecidual de pele a partir de um feixe de luz polarizada e indica a utilização de uma rede neural artificial treinada para caracterização de melanoma a partir das medidas descritas.
[06] O Artigo científico, publicado no ano de 2009, intitulado
“Application of neural classification in ellipsometry for robust thin-film characterizations” apresenta o uso de elipsometria e redes neurais artificiais para caracterização de um fotoresiste. A partir de medidas elipsométricas uma rede neural classifica o fotoresiste medido quanto ao seu intervalo de espessura.
[07] O Artigo científico, publicado em 2018, intitulado “ Computer- aided diagnosis of glaucoma using fundus images: A revieW’ detalha o uso de elipsometria aplicada ao fundo de olho e redes neurais artificiais para caracterização/diagnóstico de glaucoma. A partir de medidas elipsométricas uma rede neural treinada classifica as amostras medidas em olhos, especificamente em seu fundo, quanto ocorrência de glaucoma.
[08] A presente invenção se difere das tecnologias presentes no estado da técnica porque resulta na combinação exclusiva das seguintes características técnicas e efeitos técnicos: Elipsometria Espectroscópica de Ângulo Variável (denominação na língua inglesa - variable-angle spectroscopic ellipsometry - VASE), Inteligência Artificial e Aprendizado de Máquina a partir de modelo de Árvores de Decisão associadas com algoritmo de Aumento Extremo de Gradiente (denominação na língua inglesa - “ Extreme Gradient Boosting’) ou árvores de decisão randômica (“ fíandom Foresf) ou a técnica de eliminação de ruído baseada em distâncias euclidianas, chamada K-Nearest Neighbors (KNN). Os dados aplicados aos modelos representam medidas elipsométricas de filmes preparados a partir de amostras biológicas. A tecnologia aplica-se ao suporte do diagnóstico acerca de infecções causadas por agentes virais, especialmente para os agentes denominados SARS-CoV-2, Zika e Dengue, e possui configurações aplicáveis a todos os estágios da evolução da infecção. Propicia a análise simultânea para uma pluralidade de agentes virais em modo de múltiplas detecções ( Multiplex ) e prescinde o uso de marcadores label-free).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA
[09] A tecnologia proposta apresenta um processo para realizar classificações de amostras biológicas quanto à infecção por agentes virais e também descreve os usos do processo. A tecnologia baseia-se
na combinação das técnicas: Elipsometria Espectroscópica de Ângulo Variável (denominação na língua inglesa - variable-angle spectroscopic ellipsometry - VASE), Inteligência Artificial e Aprendizado de Máquina a partir de modelo de Árvores de Decisão associadas com algoritmo de Aumento Extremo de Gradiente (denominação na língua inglesa - “ Extreme Gradient Boosíing’) ou árvores de decisão randômica (“ fíandom Foresf) ou a técnica de eliminação de ruído baseada em distâncias euclidianas, chamada K-Nearest Neighbors (KNN). Os dados aplicados aos modelos representam medidas elipsométricas de filmes preparados a partir de amostras biológicas. A tecnologia aplica-se ao suporte do diagnóstico acerca de infecções causadas por agentes virais, especialmente para os agentes denominados SARS-CoV-2, Zika e Dengue, e possui configurações aplicáveis a todos os estágios da evolução da infecção. Propicia a análise simultânea para uma pluralidade de agentes virais em modo de múltiplas detecções ( Multiplex ) e prescinde o uso de marcadores label-free).
[010] Antes de descrever o processo para classificação de amostras biológicas quanto a infecção por agentes virais, é preciso explicar o modo de preparação das amostras e como é feita a elaboração do modelo de classificação.
1 Preparação dos filmes 1.1 Filme de lise
[011] As células utilizadas no método proposto podem ser obtidas de cultivos de células ou de esfregaços de células coletadas de um paciente.
[012] As amostras de pacientes podem ser obtidas por meio de coleta de material utilizando-se Swab nasal ou de orofaringe, ou ambos, realizada no paciente para obter um esfregaço de células.
[013] A preparação do filme de lise apresenta as seguintes etapas: 1) lise das células obtidas por cultivo ou do esfregaço, para inativação das mesmas e proteção do RNA dos vírus; 2) a solução contendo as células lisadas, obtidas na etapa 1 , é depositada sobre uma lamínula e deixada para secar até formar um filme.
[014] A solução tampão usada para lisar as células deve compreender isotiocianato de guanidina e citrato de sódio em água RNAse/DNAse free, com pH ajustado para próximo de 4. A guanidina é um inibidor de ribonuclease que auxilia na preservação do material genético.
[015] As amostras de esfregaço utilizadas nos exemplos do presente relatório descritivo foram coletadas da região nasal e orofaringe através de swabs flexíveis estéreis que, imediatamente após a colheita, foram inseridos em um tubo estéril contendo 1mL da solução tampão de lise, à temperatura ambiente, ficando os swabs imersos por 1 minuto. Em seguida, os swabs foram descartados e as amostras contidas na solução tampão de lise foram analisadas.
[016] Para a preparação do filme de células a partir de cultivo celular, foram plaqueadas 8 x 105 células por lamínula em um volume de 2mL de meio de cultivo celular.
1.2 Filme de soro de sangue
[017] As amostras podem ser obtidas por meio de coleta de sangue do paciente para obtenção de soro. Para obtenção do soro o sangue do paciente é centrifugado para separar o soro dos demais componentes do sangue. O soro contém os anticorpos produzidos pelo sistema imunológico do paciente quando infectado.
[018] Para a preparação do filme de soro, uma alíquota de 10 pL do soro sanguíneo é aplicada na superfície de uma lamínula e imediatamente coberta por uma segunda lamínula, encerrando a amostra de material líquido entre as duas lamínulas.
2. Elaboração do Modelo de Classificação
[019] Apresenta-se a descrição para obtenção dos dados de treino e dados de teste para elaboração e verificação de acurácia do modelo de classificação. A elaboração do modelo compreende as seguintes etapas: a) Incidir um feixe de radiação eletromagnética com polarização linear bem definida nas regiões espectrais do ultravioleta, visível e infravermelho (de 242 nm até 1689 nm, em incrementos unitários) sobre a região da lamínula em que o filme de lise ou o filme de soro está presente, para cada um dos ângulos elipsométricos de incidência de 45°, 50 °, 55 °, 60 °, 65 e 700 com respeito à reta normal à superfície do filme depositado sobre a lamínula, o filme está contido no espaço entre duas lamínulas justapostas; b) Medir a mudança na polarização do feixe de radiação refletido através da determinação da razão (p) entre os coeficientes de Fresnel rp e rs, conforme Expressão (1), para cada comprimento de onda e ângulo incidentes da radiação definidos na etapa “a”:
(Expressão 1)
Sendo (y) os ângulos elipsométricos e (i) o deslocamento de fase devido à mudança de polarização; c) As medidas descritas nas etapas “a” e “b” devem ser aplicadas em múltiplas regiões da lamínula contendo o filme de lise ou o filme de soro; d) Rotular o dado obtido nas etapas nas etapas “a”, “b” e “c”” quanto à infecção por agentes virais (a presença de infecção por agentes virais é conhecida nos dados de treino e de teste, pois são escolhidas amostras infectadas com o agente virai ou, no caso do cultivo de células utilizadas para gerar o filme de lise, efetua-se a infecção intencional das células);
e) O total de medidas obtidas nas etapas “a” a “d” são organizados de forma a incluir duas colunas de dados, a primeira coluna é constituída por todos os comprimentos de onda medidos em duplicata, a segunda coluna é constituída pela parte real dos valores de p acrescida da parte imaginária dos ditos valores; f) Uma base de dados de treinamento é constituída adicionando colunas com os valores de p para cada ângulo de incidência, e cada uma das regiões medidas para cada lamínula; g) A base de dados de treinamento é, então, submetida a um processo de padronização de modo a fazer com que os dados tenham uma média igual a 0 e 1 com desvio padrão igual a 1 ; h) A base de dados de treinamento é processada por um algoritmo de inteligência artificial baseado em árvores de decisão; i) Novos conjuntos de dados, formatados em conformidade com a base de dados de treinamento, são processados e são usados para testes de modo a verificar a acurácia da classificação feita pelo modelo resultante do treinamento.
[020] Pode-se utilizar de forma complementar a parte imaginária dos valores associados à parte real dos valores de p, incluindo-se também a depolarização e a intensidade, nas medidas apresentadas na etapa “b”. Inclui-se também nas etapas “a” e “b” a medição dos comprimentos de onda em quadruplicata, aplicando esta estrutura de dados em “e” e “f”. [021] Pode-se utilizar de forma alternativa uma técnica de eliminação de ruído baseada em distâncias euclidianas, chamada K-Nearest Neighbors (KNN), após a etapa “h”.
[022] Pode-se utilizar de forma alternativa uma técnica de aumento extremo de gradiente na etapa “h”.
[023] Pode-se utilizar de forma alternativa um algoritmo de inteligência artificial baseado em árvores de decisão randômico (“ fíandom Foresf) na etapa “h”.
3. Descrição do Processo de Classificação
[024] O Processo para classificação de amostras biológicas quanto à infecção por agentes virais compreende as seguintes etapas: a) Incidir um feixe de radiação eletromagnética com polarização linear bem definida nas regiões espectrais do ultravioleta, visível e infravermelho (de 242 nm até 1689 nm, em incrementos unitários) sobre uma região da lamínula em que o filme preparado a partir de amostras biológicas está presente, para cada um dos ângulos elipsométricos de incidência de 45°, 50 °, 55 °, 60 °, 65 e 700 com respeito à reta normal à superfície do filme, o filme está contido no espaço entre duas lamínulas justapostas; b) Medir a mudança na polarização do feixe de radiação refletido através da determinação da razão (p) entre os coeficientes de Fresnel rp e rs, conforme Expressão (1), para cada comprimento de onda e ângulo incidentes da radiação definidos na etapa “a”: p = rp/rs=tg(i|j)eiA (Expressão 1 )
Sendo (y) os ângulos elipsométricos e (i) o deslocamento de fase devido à mudança de polarização; c) O total de medidas obtidas nas etapas “a” e “b” é submetido como entrada para modelo de classificação (obtido no item 2 acima descrito, “Elaboração do Modelo de Classificação”) que gera como saída correspondente um valor numérico de predição que corresponde à probabilidade da amostra que gerou o filme apresentar infecção por agentes virais; d) A probabilidade gerada na etapa “c” é comparada com um valor limiar arbitrado (Va), de forma que caso o valor da
probabilidade gerada seja superior a Va a amostra é classificada como infecção por agentes virais presente; caso o valor da probabilidade gerada seja inferior a Va a amostra é classificada como infecção por agentes virais ausente.
[025] Na etapa “a”, o filme pode ser o filme de lise formado por células obtidas de cultura ou esfregaço, lisadas com tampão contendo inibidor de ribonuclease, depositadas em lamínula com secagem à temperatura ambiente.
[026] Na etapa “a”, o filme também pode ser obtido a partir do soro de sangue, aplicado na superfície de uma lamínula e imediatamente coberto por uma segunda lamínula, encerrando a amostra de material líquido entre as duas lamínulas.
[027] Na etapa “a”, para o filme de lise, o feixe de radiação eletromagnética com polarização linear bem definida pode estar compreendido nas regiões espectrais do ultravioleta no intervalo de 240 nm a 380 nm e o ângulo elipsométrico ser 55 graus.
[028] Para o filme de soro de sangue, utilizam-se, preferencialmente, na etapa”a”, as regiões espectrais do infravermelho acima de 850 nm (em incrementos unitários).
[029] As medidas descritas nas etapas “a” e “b” podem ser aplicadas preferencialmente em 13 regiões de uma lamínula retangular assim definidas: região (1): centro da lamínula; regiões (2), (3), (4) e (5): os quatro vértices da lamínula; regiões (6), (7), (8) e (9): os pontos médios de cada aresta da lamínula; regiões (10), (11), (12) e (13): os pontos correspondentes a ¼ e ¾ de cada diagonal da lamínula.
[030] O valor numérico de predição pode estar normalizado, preferencialmente normalizado em um intervalo numérico compreendido entre 0 e 1.
[031] O valor limiar arbitrado (Va) é preferencialmente 0,5 ou 50%.
[032] O uso do processo de classificação de amostras biológicas quanto à infecção por agentes virais é preferencialmente para a classificação envolvendo os agentes virais SARS-CoV-2, Zika e/ou Dengue.
[033] Para o filme de soro de sangue, pode-se utilizar de forma complementar a parte imaginária dos valores associados à parte real dos valores de p, incluindo-se também a depolarização e a intensidade, nas medidas apresentadas na etapa “b”. Inclui-se também nas etapas “a” e “b” a medição dos comprimentos de onda em quadruplicata, conforme as etapas abaixo descritas: a) Incidir um feixe de radiação eletromagnética com polarização linear bem definida nas regiões espectrais do infravermelho acima de 850 nm (em incrementos unitários) sobre uma região da lamínula em que o filme de soro está presente, para cada um dos ângulos elipsométricos de incidência de 45°, 50 °, 55 °, 60 °, 65 e 70 0 com respeito à reta normal à superfície do filme, estando o filme está contido no espaço entre duas lamínulas justapostas; b) Medir a mudança na polarização do feixe de radiação refletido através da determinação da razão (p) entre os coeficientes de Fresnel rp e rs, medir também a depolarização, a intensidade e os comprimentos de onda em quadruplicata, conforme Expressão (1), para cada comprimento de onda e ângulo incidentes da radiação definidos na etapa “a”: p = rp/rs=tg(i|j)eiA (Expressão 1)
Sendo (y) os ângulos elipsométricos e (i) o deslocamento de fase devido à mudança de polarização; c) O total de medidas obtidas nas etapas “a” e “b” é submetido como entrada para modelo de classificação, que gera como saída correspondente um valor numérico de predição que corresponde
à probabilidade da amostra de soro que gerou o filme apresentar a infecção por agentes virais; d) A probabilidade gerada na etapa “c” é comparada com um valor limiar arbitrado (Va), de forma que caso o valor da probabilidade gerada seja superior a Va a amostra é classificada como infecção por agentes virais SARS-CoV-2 e/ou Dengue presente; caso o valor da probabilidade gerada seja inferior a Va a amostra é classificada como infecção por agentes virais SARS- CoV-2 e Dengue ausente, permitindo a identificação diferencial do tipo de infecção.
[034] No processo usando filmes de soro, as medidas devem ser aplicadas em 5 até 9 regiões de uma lamínula retangular, assim definidas: no centro da lamínula e do lado por onde incide a luz.
[035] O processo utilizando filme de soro pode ser usado para o diagnóstico diferencial de Dengue e COVID-19.
[036] A presente invenção pode ser mais bem compreendida através dos exemplos abaixo, não limitantes.
Exemplo 1 - Avaliação da acurácia do modelo elaborado a partir do processo proposto
[037] Apresenta-se a concretização da invenção por meio da implementação dos processos propostos nos itens 1 , 2 e 3 deste relatório descritivo para classificação quanto à infecção de células de esfregaço (realizadas por meio de swab nasal em pacientes humanos) ou cultivos de células (Vero) envolvendo os agentes virais denominados SARS-CoV- 2, Zika e Dengue.
[038] Os filmes obtidos a partir das células geraram medidas elipsométricas que foram submetidas à classificação do modelo. Os resultados gerados foram apresentados em tabelas com conteúdo equivalente a uma matriz de confusão.
[039] A tabela 1 apresenta a identificação dos filmes de células e seus rótulos (que indicam a classificação conhecida dos filmes quanto à infecção das células que os originaram pelos agentes virais analisados para fins de avaliação dos modelos).
Tabela 1 - Identificação dos filmes de células e seus rótulos.
Identificação Rótulo
1 Lysis Buffer Solução de lise
2 Vero Controle Células Vero
3 Vero Controle Lisada Células Vero lisadas
Células Vero lisadas infectadas (SARS-
4 Vero COVID-19 Lisada CoV-2)
5 Vero Dengue Lisada Células Vero lisadas infectadas (Dengue)
6 Vero Zika Lisada Células Vero lisadas infectadas (Zika)
Esfregaço de células não infectado (SARS-
7 Negativo* CoV-2)
Esfregaço de células infectado (SARS-
8 Positivo* CoV-2)
* Realizou-se exame de PCR (do inglês - Polymerase Chain Reaction, termo em português Reação em cadeia da polimerase) previamente nas amostras que geraram o filme de lise para determinar se testaram positivo ou negativo para infecção por SARS-CoV-2.
[040] Adiante serão apresentadas tabelas contendo os resultados de predição dos modelos e a acurácia alcançada para cada teste. O formato de apresentação dos resultados é equivalente a uma matriz de confusão, de forma que, nas tabelas, cada linha exibe um tipo de filme de lise,
conforme identificado e rotulado na tabela 1 , e cada coluna representa as predições realizadas pelo modelo testado com respeito a cada filme analisado.
Tabela 2 - Predições do modelo para o conjunto formado pelos filmes 1 a 6 e acurácia obtida.
Vero Vero
Vero Vero
COVID- Lysis Vero Control
Zika Dengue
19 Buffer Controle e
Lisada Lisada
Lisada Lisada
Vero
COVID-
0,97 0,01 0,01 0 0 0
19
Lisada
Lysis
0,01 0,93 0 0 0 0,05
Buffer
Vero
0 0 0,91 0,02 0,03 0,04
Controle
Vero
Controle 0 0 0 0,9 0,01 0,09
Lisada
Vero
Zika 0,06 0 0,01 0,14 0,71 0,08
Lisada
Vero
Dengue 0 0,04 0,03 0,16 0,04 0,73
Lisada
Acurácia
88 %
Total
Tabela 3 - Predições do modelo para o conjunto formado pelos filmes 3 a 6 e acurácia obtida.
Vero COVID-19 Vero Zika Vero Dengue Lisada Lisada Lisada
Vero COVID-19
0,97 0,02 0,01
Lisada
Vero Zika Lisada 0,07 0,85 0,08
Vero Dengue
0,06 0,08 0,86
Lisada
Acurácia Total 92%
Tabela 3 - Predições do modelo para o conjunto formado pelos filmes 5 a 6 e acurácia obtida.
Vero Zika
Vero Dengue Lisada Lisada
Vero Zika Lisada 0,82 0,18
Vero Dengue
0,18 0,82 Lisada
Acurácia Total 82 %
Tabela 4 - Predições do modelo para o conjunto formado pelos filmes 7 a 8 e acurácia obtida.
Negativo Positivo
Negativo 0,87 0,13
Positivo 0,12 0,88
Acurácia Total 88 %
Exemplo 2 - Processo para classificação de amostras biológicas quanto à infecção por agentes virais SARS-CoV-2 e Dengue
[041] Este exemplo apresenta uma forma possível de concretização da tecnologia para realizar uma predição para infecção por Dengue ou SARS-CoV-2. É um diagnóstico diferencial para estes dois agentes virais.
[042] Esta forma de concretização da invenção utiliza amostras de soro retirado do sangue do paciente. Uma amostra de sangue do paciente é centrifugada para separar o soro do resto dos componentes. O soro contém os anticorpos produzidos pelo sistema imunológico do paciente, em enorme quantidade quando o paciente foi infectado, e não contém restos de material celular nem o RNA do vírus.
[043] Uma alíquota de 10 pL do soro sanguíneo é aplicada na superfície de uma lamínula e imediatamente coberta por uma segunda lamínula, encerrando a amostra de material líquido entre as duas lamínulas.
[044] Metodologia de medidas: utilizam-se entre 5 e 9 regiões, que incluem o centro da amostra e o lado esquerdo da mesma (região por onde incide a luz), não precisando medir o lado direito da amostra (região por onde sai a luz) nem cobrir a maior parte da superfície da amostra. [045] Parâmetros físicos medidos e configuração ótica: os parâmetros físicos medidos e utilizados na análise com auxílio da inteligência artificial utilizam as medidas de dois ângulos elipsométricos y e D para compor a
parte imaginária (pi) e a parte real (pr) da razão entre a intensidade de luz refletida com polarização no plano da amostra e fora do plano da amostra. Também se utilizaram as medidas de Depolarização e Intensidade em seis ângulos de incidência diferentes (45°, 50°, 55°, 60°, 65° e 70°). Utilizou-se a região espectral acima dos 850 nm. As medidas de Depolarização e Intensidade permitem considerar a anisotropia das amostras e exige uma configuração ótica PSCRA (polarizador-amostra- compensador rotativo-analisador).
[046] Análise dos dados: a base de dados de treinamento é processada por um algoritmo de inteligência artificial baseado em árvores de decisão randômica (“ Random Foresf). Aplicou-se também uma técnica de detecção e eliminação de ruído baseada em distâncias euclidianas chamada K-Nearest Neighbors (KNN). A análise é feita de forma diferencial, inferindo se na amostra há anticorpos especificamente contra os vírus causadores de COVID-19 ou da Dengue, ou nenhuma dessas duas opções.
Claims
1. Processo para classificação de amostras biológicas quanto à infecção por agentes virais caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) Incidir um feixe de radiação eletromagnética com polarização linear bem definida nas regiões espectrais do ultravioleta, visível e infravermelho (de 242 nm até 1689 nm, em incrementos unitários) sobre uma região da lamínula em que o filme preparado a partir de amostras biológicas está presente, para cada um dos ângulos elipsométricos de incidência de 45°, 50 °, 55 °, 60 °, 65 e 700 com respeito à reta normal à superfície do filme, estando o filme contido no espaço entre duas lamínulas justapostas; b) Medir a mudança na polarização do feixe de radiação refletido através da determinação da razão (p) entre os coeficientes de Fresnel rp e rs, conforme Expressão (1), para cada comprimento de onda e ângulo incidentes da radiação definidos na etapa “a”: c) O total de medidas obtidas nas etapas “a” e “b” é submetido como entrada para o modelo de classificação, que gera como saída correspondente um valor numérico de predição que corresponde à probabilidade da amostra que gerou o filme apresentar infecção por agentes virais; d) A probabilidade gerada na etapa “c” é comparada com um valor limiar arbitrado (Va), de forma que caso o valor da probabilidade gerada seja superior a Va a amostra é classificada como infecção por agentes virais presente; caso o valor da probabilidade gerada seja inferior a Va a amostra é classificada como infecção por agentes virais ausente.
2. Processo para classificação de amostras biológicas quanto à infecção por agentes virais, de acordo com a reivindicação 1, etapa “a”, caracterizado pelo feixe de radiação eletromagnética com
polarização linear bem definida estar compreendido nas regiões espectrais do ultravioleta, no intervalo de 240 nm a 380 nm, e o ângulo elipsométrico ser 55 graus.
3. Processo para classificação de amostras biológicas quanto à infecção por agentes virais, de acordo com as reivindicações 1, etapa “a”, e 2, caracterizado pelo filme de lise ser formado por células obtidas de cultura ou esfregaço, lisadas com tampão contendo inibidor de ribonuclease, depositadas em lamínula com secagem à temperatura ambiente.
4. Processo para classificação de amostras biológicas quanto à infecção por agentes virais, de acordo com as reivindicações 1, etapas “a” e “b”, 2 e 3, caracterizado pelas medidas serem aplicadas em 13 regiões de uma lamínula retangular, assim definidas: região (1): centro da lamínula; regiões (2), (3), (4) e (5): os quatro vértices da lamínula; regiões (6), (7), (8) e (9): os pontos médios de cada aresta da lamínula; regiões (10), (11), (12) e (13): os pontos correspondentes a ¼ e ¾ de cada diagonal da lamínula.
5. Processo para classificação de amostras biológicas quanto à infecção por agentes virais, de acordo com as reivindicações 1, etapas “c” e “d”, 2, 3 e 4, caracterizado pelo valor numérico de predição estar normalizado, em um intervalo numérico compreendido entre 0 e 1 , e o valor limiar arbitrado (Va) ser 0,5 ou 50%.
6. Uso do processo para classificação de amostras biológicas quanto à infecção por agentes virais definido nas reivindicações 1 a 5, caracterizado por ser para a classificação de células quanto à presença ou não dos agentes virais SARS-CoV-2, Zika e/ou Dengue.
7. Processo para classificação de amostras biológicas quanto à infecção por agentes virais, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender as seguintes etapas:
a) Incidir um feixe de radiação eletromagnética com polarização linear bem definida nas regiões espectrais do infravermelho acima de 850 nm (em incrementos unitários) sobre uma região da lamínula em que o filme de soro está presente, para cada um dos ângulos elipsométricos de incidência de 45°, 50 °, 55 °, 60 °, 65 e 700 com respeito à reta normal à superfície do filme, estando o filme está contido no espaço entre duas lamínulas justapostas; b) Medir a mudança na polarização do feixe de radiação refletido através da determinação da razão (p) entre os coeficientes de Fresnel rp e rs, medir também a depolarização, a intensidade e os comprimentos de onda em quadruplicata, conforme Expressão (1), para cada comprimento de onda e ângulo incidentes da radiação definidos na etapa “a”: p = rp/rs=tg(i|j)eiA (Expressão 1)
Sendo (y) os ângulos elipsométricos e (i) o deslocamento de fase devido à mudança de polarização; c) O total de medidas obtidas nas etapas “a” e “b” é submetido como entrada para modelo de classificação, que gera como saída correspondente um valor numérico de predição que corresponde à probabilidade da amostra de soro que gerou o filme apresentar a infecção por agentes virais; d) A probabilidade gerada na etapa “c” é comparada com um valor limiar arbitrado (Va), de forma que, caso o valor da probabilidade gerada seja superior a Va, a amostra é classificada como infecção por agentes virais SARS-CoV-2 e/ou Dengue presente; caso o valor da probabilidade gerada seja inferior a Va, a amostra é classificada como infecção por agentes virais SARS-CoV-2 e Dengue ausente, permitindo a identificação diferencial do tipo de infecção.
8. Processo para classificação de amostras biológicas quanto à infecção por agentes virais, de acordo com as reivindicações 1 e 7,
caracterizado pelo filme de soro ser obtido a partir do soro de sangue, aplicado na superfície de uma lamínula e imediatamente coberto por uma segunda lamínula, encerrando a amostra de material líquido entre as duas lamínulas.
9. Processo para classificação de amostras biológicas quanto à infecção por agentes virais, de acordo com as reivindicações 1, 7 e 8, caracterizado pelas medidas serem aplicadas em 5 até 9 regiões de uma lamínula retangular, assim definidas: no centro da lamínula e do lado por onde incide a luz.
10. Uso do processo para classificação de amostras biológicas quanto à infecção por agentes virais definido nas reivindicações 1, 7, 8 e 9, caracterizado por ser para o diagnóstico diferencial de Dengue e COVID-19.
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