WO2022014681A1 - 運動ニューロン疾患（ｍｎｄ）の治療に有効な多能性幹細胞 - Google Patents

運動ニューロン疾患（ｍｎｄ）の治療に有効な多能性幹細胞 Download PDF

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康二 阿部
徹 山下
真理 出澤
良祐 串田
裕美子 岩瀬
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Tohoku University NUC
Okayama University NUC
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    • A61K35/02—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution from inanimate materials
    • A61K35/04—Tars; Bitumens; Mineral oils; Ammonium bituminosulfonate

Definitions

  • the present invention relates to a cell preparation for regenerative medicine. More specifically, the invention relates to cell formulations that are effective for the treatment, prevention, alleviation and / or delay of onset of motor neuron disease (MND) in a subject, including pluripotent stem cells.
  • MND motor neuron disease
  • ALS Amyotrophic lateral sclerosis
  • SOD1 Cu / Zn superoxide dismutase
  • TDP-43 TAR DNA-binding protein 43
  • Non-Patent Documents 4 and 5 [ 4, 5]
  • hexanucleotide repeated extension of the C9orf72 gene [Non-Patent Documents 6 and 7] [6, 7] have a genetic type associated with the mutation.
  • Non-Patent Documents 8 and 9 [8, 9].
  • the therapeutic effects of these treatments are still very limited and new therapeutic strategies for ALS are needed.
  • Muse (Multilineage-diffrentiating stress ending) cells are endogenous pluripotent-like stem cells that can be recovered as stage-specific embryonic antigen (SSEA) -3 positive cells, which are pluripotent stem cell surface markers. These are usually localized in the connective tissues of bone marrow, peripheral blood and organs and are non-neoplastic [Non-Patent Documents 10-13] [10-13]. Muse cells are venous because they express sphingosine-1-phosphate receptors (S1PR2) that recognize damaged tissue and recognize sphingosine-1-phosphate (S1P) produced by damaged cells / apoptotic cells. It selectively accumulates at the site of injury by injection.
  • S1PR2 sphingosine-1-phosphate receptors
  • S1P sphingosine-1-phosphate
  • Muse cells After homing to the site of injury, Muse cells can replace damaged / apoptotic cells by spontaneous differentiation into damaged / apoptotic cell types and contribute to tissue repair, including stroke, acute myocardial infarction, epidermal vesicular disease, chronic renal disease, etc. And animal models of liver cirrhosis have been reported [Non-Patent Documents 14-18] [14-18]. In addition to tissue remodeling, Muse cells have multifaceted effects such as angiogenesis, immunomodulation, nutrition, anti-apoptosis, and anti-fibrosis [Non-Patent Documents 18 and 19] [18, 19].
  • Non-Patent Document 20 Muse cells can target injured tissue, the number of cells required for treatment is an order of magnitude less than the number of mesenchymal stem cells (MSCs) [Non-Patent Document 21] [21]. For these properties, we investigated the possible therapeutic potential of Muse cells for ALS animal models.
  • the present invention provides a novel medical application using pluripotent stem cells (for example, Muse cells) in regenerative medicine. More specifically, the invention is a cellular formulation and / or pharmaceutical composition effective for treating, preventing, alleviating and / or delaying the onset of motor neuron disease (MND) in a subject, including Muse cells. It provides objects, as well as methods of using them to treat subjects with the above disorders.
  • pluripotent stem cells for example, Muse cells
  • MND motor neuron disease
  • the present invention is as follows.
  • Treat, prevent, alleviate and / or treat motor neuron disease (MND) in a subject including SSEA-3 positive pluripotent stem cells isolated from living mesenchymal tissue or cultured mesenchymal cells. Or a cell preparation to delay the onset.
  • MND motor neuron disease
  • the cell preparation according to the above [1] which comprises a cell fraction in which SSEA-3 positive pluripotent stem cells are concentrated by external stress stimulation.
  • pluripotent stem cells are CD117 negative, CD146 negative, NG2 negative, CD34 negative, vWF negative, and CD271 negative.
  • Pluripotent stem cells are CD34 negative, CD117 negative, CD146 negative, CD271 negative, NG2 negative, vWF negative, Sox10 negative, Snai1 negative, Slug negative, Tyrp1 negative, and Dct negative.
  • the pluripotent stem cell is a pluripotent stem cell having all of the following properties: (I) Low or no telomerase activity; (Ii) Has the ability to differentiate into cells of any of the three germ layers; (Iii) show no neoplastic growth; and (iv) have self-renewal ability.
  • MND is amyotrophic lateral sclerosis (ALS), primary lateral sclerosis (PLS), spinal muscular atrophy (SMA), progressive muscular atrophy (PMA), or spinal and bulbar muscularis.
  • SBMA atrophy
  • Muse cells by administering Muse cells directly to an injured site or from a vein or the like to a subject suffering from motor neuron disease (MND), the Muse cells constitute normal tissue around the injured site.
  • Motor neurons (MNDs) can be repaired by a tissue regeneration mechanism that differentiates into cells.
  • A The distribution of GFP-labeled Muse cells in the spinal cord 7 days after intravenous (iv) or intrathecal (it) injection is shown.
  • the dotted box on the panel indicates the high magnification of each panel. Notably, i. v. Only injection delivered a large number of GFP-labeled Muse cells to the pia mater and the lower white matter of both the cervical and lumbar spinal cords.
  • B The number of GFP-labeled Muse cells is i. t. From injection i. v. It was expensive later.
  • C Shows the distribution of nano-lantern-labeled human MSC and Muse cells in spinal cord, brain, muscle, lung, and leg bone 7 days after intravenous administration.
  • Group C was compared with groups A and D ($$: p ⁇ 0.01 group D vs. C group, repeated measures ANOVA, factor: group).
  • Body weight The graph shows changes in body weight [g] per group (B, C, and D) measured once a week over the entire dosing period. Each point represents the mean ⁇ SEM of all animals in each group and each week.
  • Group C was compared with groups B and D ($$: p ⁇ 0.01 group D vs. C group, repeated measures ANOVA, factor: group).
  • Hanging wire The graph shows the course of wire suspension time [seconds] per group (A, C, and D) measured after 1 week and every 2 weeks throughout the treatment period. Each point represents the mean ⁇ SEM of all animals in each group and each week.
  • Group C was compared with groups A and D (&; p ⁇ 0.05 group C vs. A group, $$: p ⁇ 0.01 group D vs. C group, repeated measures ANOVA, factor: group).
  • Hanging wire The graph shows the passage of time [seconds] from wire to fall per group (B, C, and D) measured at week 1 and is measured every 2 weeks over the entire treatment period. .. Each point represents the mean ⁇ SEM of all animals in each group and each week.
  • Group C was compared with groups B and D ($$: p ⁇ 0.01 group D vs. C group, repeated measures ANOVA, factor: group).
  • Rotorrod The graph represents the time [seconds] to average fall of each group at test 1, 2, 3, and baseline inspection and at week 12.
  • Group C was compared with group D, and groups A to B were compared with group C (##: p ⁇ 0.01, t-test). The data are displayed as a bar graph of mean ⁇ standard error for all animals in each group.
  • Clasping The graph represents the mean classification score [n] for each group at baseline and at week 12. Group C was compared with group D, and groups A to B were compared with group C (##: p ⁇ 0.01, t-test). The data are displayed as a bar graph of mean ⁇ standard error for all animals in each group.
  • the present invention is a cell containing SSEA-3 positive pluripotent stem cells (eg, Muse cells) for treating, preventing, alleviating and / or delaying the onset of motor neuron disease (MND) in a subject.
  • SSEA-3 positive pluripotent stem cells eg, Muse cells
  • the present invention relates to a preparation and a pharmaceutical composition, and a method for treating MND using the cell preparation and the like.
  • a detailed description of the present invention will be described.
  • Ang1 Angiopoietin-1 ANOVA: ANOVA BW: Body weight BRET: Bioluminescence resonance EGF: Energy transfer of epidermal growth factor; FACS: Fluorescence-activated cell fractionation GFAP: Glia fibrous acidic protein GFP: Green fluorescent protein HBSS: Hanks equilibrium salt solution HE: Hematoxillin and eosin HGF: Hepatocyte growth factor Iba1: Ionized calcium binding adapter molecule 1 IGF-1: Insulin-like growth factor 1 i. t. : Intramedullary cavity i. v.
  • Intravenous MAP2 Microtubule-associated protein 2 MSC: Mesenchymal stem cells NMJ: Neuromuscular junction NeuN: Neuron nucleus PGE2: Prostaglandin E2 SOD1: Superoxide dismutase S1P: Sphingosine-1-phosphate S1PR2: Sphingosine-1-phosphate receptor 2 TDP-43: TAR DNA binding protein 43 Tg: Transgenic VAChT: Vesicular acetylcholine transporter VEGF: Vascular endothelial growth factor WT: Wild type
  • the present invention uses a cell preparation or a pharmaceutical composition containing SSEA-3 positive pluripotent stem cells (Muse cells) for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and primary lateral sclerosis (PLS). ), Spinal muscular atrophy (SMA), progressive muscular atrophy (PMA), or motor neuron disease such as spinal and bulbar muscular atrophy (SBMA) (hereinafter, may be simply abbreviated as "MND”). It can be used for treatment, prevention, mitigation and / or delay of its onset.
  • the present invention uses a cell preparation or pharmaceutical composition containing SSEA-3 positive pluripotent stem cells (Muse cells) to TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration (FTLD) in nerve cells.
  • FTLD frontotemporal lobar degeneration
  • motor neuron disease refers to a neurological disorder that selectively destroys motor neurons.
  • motor neuron disease also referred to as motor neuron degenerative disease
  • ICD-10 International Structural Classification of Disease and Reserved Health Products
  • WHO World Health Organization
  • MND typically amyotrophic lateral sclerosis (including familial amyotrophic lateral sclerosis), primary muscular sclerosis, and spinal muscular atrophy (distal spinal muscular atrophy).
  • Muscle atrophy familial spinal muscular atrophy, including scapulohumeral spinal muscular atrophy), progressive muscular atrophy (juvenile progressive muscular atrophy, pediatric progressive muscular atrophy, infant progressive (Spinal muscular atrophy, progressive spinal muscular atrophy, etc.), spinal muscular atrophy, Weldnig-Hoffmann disease, diffuse atrophic palsy, motor neuron disease, pseudosphere palsy, sphere palsy, juvenile unilateral upper limb muscle atrophy , Progressive bulbar palsy, traumatic bulbar palsy, cervical spondylotic muscular atrophy.
  • MND is a neurological disorder that selectively destroys motor neurons, which can degenerate and lead to death.
  • Motor neurons including primary (upper) and secondary (lower) motor neurons
  • Primary motor neurons originate from the cerebral cortex, send fibers through the brainstem and spinal cord, and are involved in the control of secondary motor neurons.
  • Secondary motor neurons are located in the brainstem and spinal cord and send fibers to muscles.
  • Secondary motor neuron disease is a disease that involves degeneration of secondary motor neurons. When a secondary motor neuron degenerates, it usually cuts off the activating muscle fibers and ceases to contract, causing muscle weakness and hyporeflexia. Loss of either type of neuron leads to weakness, and muscular atrophy (muscle wasting) and painless weakness are clinical features of MND.
  • ALS Amyotrophic lateral sclerosis
  • SOD1 Cu / Zn superoxide dismutase 1 enzyme
  • TDP-43 abnormal accumulation of phosphorylated or ubiquitinated TDP-43 in nerve cells is involved in the onset of ALS, and abnormalities in the gene encoding TDP-43 and the mechanism of TDP-43 degradation are known. Abnormalities have been reported and are found in some familial ALS (with mutations in the ALS10, TARDBP gene) and in about 90% of sporadic ALS. In the present specification, an ALS mouse model overexpressing TDP-43 was prepared, and the therapeutic efficacy of the cell preparation of the present invention was examined (see Example 2).
  • PLS Primary lateral sclerosis
  • FTLD frontotemporal lobar degeneration
  • SMA Spinal muscular atrophy
  • Type I severe type (also known as Weldnig-Hoffmann disease)
  • type II intermediate type (also known as Dubowitz disease)
  • type III mild type (also known as Kugelberg-Welander disease), which develops in childhood, in adulthood It is classified as type IV that develops.
  • PMA Progressive muscular atrophy
  • SBMA Spinal and bulbar muscular atrophy
  • FTLD Frontotemporal lobar degeneration
  • FTLD-TDP accumulation of TDP-43
  • FTLD-TAU accumulation of TAU
  • FTLD-FUS accumulation of FUS
  • FTLD-others accumulation of other proteins
  • FTLD-TDP accounts for about 45% of FTLD and is classified into types A to D based on histopathological characteristics.
  • Pluripotent stem cells The pluripotent stem cell used in the cell preparation of the present invention is a cell that Izuzawa, one of the present inventors, discovered its existence in a human body and named it "Muse (Multipleage-differentiation stress ending) cell".
  • Is. Muse cells are obtained from skin tissues such as bone marrow fluid, adipose tissue (Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., Nov 20, 2013 (Epub) (published on Jan 17, 2014)) and dermal connective tissue. It can also be scattered in the connective tissue of each organ.
  • these cells are cells having the properties of both pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells, and are, for example, the respective cell surface markers "SSEA-3 (Stage-specific embryonic antigen-3)" and " Identified as a double positive for "CD105". Therefore, a Muse cell or a cell population containing a Muse cell can be separated from a living tissue using these antigen markers as an index, for example. Details such as Muse cell separation methods, identification methods, and characteristics are disclosed in International Publication No. WO2011 / 007900. Also, as reported by Wakao et al. (S. Wakao, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.
  • Muse cells can be simply purified and used using SSEA-3 as an antigen marker. ..
  • SSEA-3 as an antigen marker, which can be used in a cell preparation (including a pharmaceutical composition) for treating a motor neuron disease, a living mesophyll tissue or a cultured mesenchymal tissue.
  • a cell population containing pluripotent stem cells (Muse cells) or Muse cells isolated from the cells may be simply referred to as "SSEA-3 positive cells”.
  • the “non-Muse cell” refers to a cell contained in a living mesenchymal tissue or a cultured mesenchymal tissue, and is a cell other than the “SSEA-3 positive cell”.
  • a Muse cell or a cell population containing a Muse cell is a living tissue (eg, using an antibody against the cell surface marker SSEA-3 alone, or with both antibodies against SSEA-3 and CD105, respectively). , Can be separated from the mesenchymal tissue).
  • the "living body” means a living body of a mammal. In the present invention, the living body does not include a fertilized egg or an embryo in the developmental stage before the blastogenic stage, but includes an embryo in the developmental stage after the blastogenic stage including a foetation or a blastoblast.
  • Mammals include, but are not limited to, primates such as humans and monkeys, rodents such as mice, rats, rabbits and guinea pigs, cats, dogs, sheep, pigs, cows, horses, donkeys, goats, ferrets and the like. Be done.
  • the Muse cells used in the cell preparation of the present invention are clearly distinguished from embryonic stem cells (ES cells) and iPS cells in that they are directly separated from living tissues with markers.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells embryonic stem cells
  • the "mesophageal tissue” refers to tissues existing in various organs such as bone, synovium, fat, blood, bone marrow, skeletal muscle, dermatitis, ligament, tendon, dental pulp, umbilical cord, and cord blood.
  • Muse cells can be obtained from bone marrow, skin and adipose tissue. For example, it is preferable to collect mesenchymal tissue of a living body, separate Muse cells from this tissue, and utilize it. In addition, Muse cells may be separated from cultured mesenchymal cells such as fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells by using the above-mentioned separation means. In the cell preparation of the present invention, the Muse cell used may be autologous or allogeneic to the recipient receiving the cell transplant.
  • Muse cells or cell populations containing Muse cells can be separated from living tissues using, for example, SSEA-3 positive and double positive of SSEA-3 and CD105 as indicators, but human adult skin. Is known to include various types of stem cells and progenitor cells. However, Muse cells are not the same as these cells.
  • Such stem cells and progenitor cells include skin-derived progenitor cells (SKP), neural ridge stem cells (NCSC), melanoblasts (MB), perivascular cells (PC), endothelial progenitor cells (EP), and adipose-derived stem cells (ADSC). ).
  • SSEA-3 positive and double positive of SSEA-3 and CD105 as indicators, but human adult skin.
  • Such stem cells and progenitor cells include skin-derived progenitor cells (SKP), neural ridge stem cells (NCSC), melanoblasts (MB), perivascular cells (PC), endothelial progenitor cells (EP), and adipose-derived stem cells (ADSC).
  • Muse cells include CD34 (marker of EP and ADSC), CD117 (c-kit) (marker of MB), CD146 (marker of PC and ADSC), CD271 (marker of NCFR), NG2 (PC marker), vWF factor (Fonville brand factor) (EP marker), Sox10 (NCSC marker), Sai1 (SKP marker), Slug (SKP marker), Typ1 (MB marker), and At least one of 11 markers selected from the group consisting of Dct (MB marker), for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 The non-expression of 11 or 11 markers can be used as an index for separation.
  • the non-expression of CD117 and CD146 can be separated as an index, and further, the non-expression of CD117, CD146, NG2, CD34, vWF and CD271 can be separated as an index, and further, the above-mentioned The non-expression of 11 markers can be separated as an index.
  • the Muse cells having the above characteristics used in the cell preparation of the present invention are as follows: (I) Low or no telomerase activity; (Ii) Has the ability to differentiate into cells of any of the three germ layers; It may have at least one property selected from the group consisting of (iii) no neoplastic growth; and (iv) self-renewal ability.
  • the Muse cells used in the cell preparation of the present invention have all the above-mentioned properties.
  • "low or no telomerase activity” means that, for example, when telomerase activity is detected using TRAPEZE XL telomerase detection kit (Millipore), it is low or cannot be detected.
  • telomerase activity means, for example, telomerase having the same level of telomerase activity as somatic human fibroblasts, or telomerase of 1/5 or less, preferably 1/10 or less of that of Hela cells. It means having activity.
  • Muse cells have the ability to differentiate into three germ layers (endoderm lineage, mesodermal lineage, and ectodermal lineage) in vitro and in vivo, and are, for example, induced and cultured in vitro. Can differentiate into hepatocytes, nerve cells, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, bone cells, fat cells and the like. It may also show the ability to differentiate into three germ layers when transplanted in vivo into the testis.
  • Muse cells proliferate at a growth rate of about 1.3 days in suspension culture, but grow from one cell in suspension culture to form embryo-like cell clusters and stop growing in about 14 days. However, when these embryo-like cell masses are brought into the adhesive culture, cell proliferation is started again, and the cells proliferated from the cell mass spread. Furthermore, when transplanted into the testis, it has the property of not becoming cancerous for at least half a year.
  • Muse cells have a self-renewal (self-renewal) ability.
  • self-renewal means that the differentiation of cells contained in embryo-like cell mass obtained by culturing from one Muse cell in suspension culture to trigermoid cells can be confirmed at the same time. By bringing the cells of the embryo-like cell mass into the suspension culture again with one cell, the next generation embryo-like cell mass is formed, and from there, the embryos in the three germ layer differentiation and suspension culture are again formed. It means that an adenomorphic cell mass can be confirmed. Self-renewal may be repeated one or more cycles.
  • the cell fraction containing Muse cells used in the cell preparation of the present invention gives an external stress stimulus to the mesenchymal tissue or cultured mesenchymal cells of a living body, and cells other than cells resistant to the external stress.
  • Cells enriched with SSEA-3 positive and CD105 positive pluripotent stem cells having at least one, preferably all of the following properties, obtained by methods involving killing cells and recovering surviving cells: It may be a fraction.
  • Iii Low or no telomerase activity;
  • Iv Has the ability to differentiate into three germ layers;
  • V) show no neoplastic growth; and (vi) have self-renewal ability.
  • the above external stresses are protease treatment, culture at low oxygen concentration, culture under low phosphoric acid condition, culture at low serum concentration, culture under low nutritional condition, culture under heat shock exposure, low temperature. Culturing in, freezing treatment, culturing in the presence of harmful substances, culturing in the presence of active oxygen, culturing under mechanical stimulation, culturing under shaking treatment, culturing under pressure treatment or physical impact. It may be any or a combination of two or more.
  • the treatment time with the protease is preferably 0.5 to 36 hours in total in order to give external stress to the cells.
  • the protease concentration may be any concentration used when peeling off the cells adhered to the culture vessel, breaking up the cell mass into a single cell, or recovering a single cell from the tissue.
  • the protease is preferably serine protease, aspartic protease, cysteine protease, metal protease, glutamate protease or N-terminal threonine protease. Further, it is preferable that the protease is trypsin, collagenase or dispase.
  • the cell preparation of the present invention is not limited to the Muse cells obtained in (1) above, or a cell population containing Muse cells in a physiological saline solution or an appropriate buffer solution (for example, phosphorus). Obtained by suspending in acid buffered saline). In this case, if the number of Muse cells separated from autologous or allogeneic tissues is small, the cells may be cultured before cell transplantation and proliferated until a predetermined cell concentration is obtained. As already reported (Pamphlet of International Publication No. WO2011 / 007900), Muse cells do not become tumors, so even if cells recovered from living tissues are contained in an undifferentiated state, they may become cancerous. Is low and safe.
  • the culture of the recovered Muse cells is not particularly limited, but can be carried out in a normal growth medium (for example, ⁇ -minimum essential medium ( ⁇ -MEM) containing 10% calf serum). More specifically, with reference to the above-mentioned International Publication No. WO2011 / 007900, in the culture and proliferation of Muse cells, a medium, additives (for example, antibiotics, serum) and the like are appropriately selected, and Muse cells having a predetermined concentration are selected. A solution containing the above can be prepared.
  • a normal growth medium for example, ⁇ -minimum essential medium ( ⁇ -MEM) containing 10% calf serum.
  • the cell preparation of the present invention When administering the cell preparation of the present invention to a human subject, it is effective to collect about several ml of bone marrow fluid from human intestinal bone and, for example, cultivate bone marrow mesenchymal stem cells as adherent cells from the bone marrow fluid.
  • Muse cells After increasing the therapeutic amount of Muse cells until they reach a cell volume that can be separated, Muse cells can be separated using the antigen marker of SSEA-3 as an index, and autologous or allogeneic Muse cells can be prepared as a cell preparation.
  • the cells are cultured and expanded until an effective therapeutic amount is reached, and then autologous or allogeneic Muse cells can be prepared as a cell preparation. can.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • serum albumin etc.
  • antibiotics etc. are contained in the cell preparations to prevent bacterial contamination and proliferation. May be.
  • other pharmaceutically acceptable ingredients eg, carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, etc.
  • the cell preparation may contain cells or components other than Muse cells contained in mesenchymal stem cells. Those skilled in the art can add these factors and agents to the cell preparation at appropriate concentrations.
  • Muse cells can also be used as a pharmaceutical composition containing various additives.
  • the number of Muse cells contained in the cell preparation or pharmaceutical composition prepared above is such that the desired effect in motor neuron disease (eg, increase in muscle strength, suppression of progression of muscle atrophy, etc.) can be obtained. It can be appropriately adjusted in consideration of gender, age, weight, condition of affected area, condition of cells to be used, and the like.
  • the target individuals include, but are not limited to, mammals such as humans.
  • the cell preparation of the present invention may be administered once, but may be administered multiple times (for example, 2 to 10 times or more) at appropriate intervals (for example, 1 day) until the desired therapeutic effect is obtained.
  • the administration may be in the early, middle or late stage of onset as long as the therapeutic effect can be obtained.
  • the therapeutically effective amount depends on the condition of the subject, but for example, 1 ⁇ 10 3 cells to 1 ⁇ 10 11 cells, preferably 1 ⁇ 10 4 cells to 1 ⁇ 10 10 cells per individual, and further. Preferred examples thereof include 1 ⁇ 10 5 cells to 1 ⁇ 10 9 cells.
  • the cell preparation of the present invention is not particularly limited, but may be administered directly to the brain (brain stem, cerebral cortex) or spinal cord, or may be administered intravenously. Further, from Examples and the like, it is particularly preferable to administer intravenously.
  • Human-derived Muse cells can be used for the cell preparations and pharmaceutical compositions of the present invention, but for subjects to which the subject is heterologous to the cells (eg, mice, rats), the heterologous cells are used.
  • immunosuppressive agents such as cyclosporin
  • an immunosuppressive agent may or may not be used in combination.
  • the cell preparation and the pharmaceutical composition of the present invention are administered to a patient, it is particularly preferable not to use an immunosuppressant in combination.
  • the cell formulations and pharmaceutical compositions of the invention can treat, prevent, alleviate and / or delay the onset of motor neuron disease (MND). More specifically, according to the present invention, it is possible to recover the muscle strength of the trunk and limbs caused by the motor neuron disease, or to suppress the progression of muscular atrophy.
  • treatment means suppressing or completely eliminating various symptoms caused by MND.
  • alleviation means alleviation of various symptoms caused by MND and suppression of progression, and preferably means alleviation of symptoms to the extent that they do not interfere with daily life. The term “alleviation” may also include the meaning of "delayed symptoms”.
  • the cells of the present invention are obtained by measuring the motor ability of a mouse using an ALS model mutant SOD1 (G93A) Tg mouse or TDP-43 Tg mouse.
  • the effectiveness of the formulation or pharmaceutical composition can be evaluated.
  • the evaluation method may be, but is not limited to, a commonly used method such as a hanging wire test, a rotor rod, a clasping, a grip strength test, and a beam balance test.
  • mice carrying the G93A human SOD1 mutation were obtained from Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) [2] and were obtained from Tg males and C57BL. It was maintained as a hemi-joint by mating 6J females. Three animals in each group were used in the comparative experiment of intravenous (iv) injection and intrathecal (it.) Injection, and two animals were used in the exvivo imaging using nano-lantern. , Medium, MSC and Muse cells were used.
  • GFP-labeled MSCs are prepared by labeling human bone marrow-MSCs (Lonza, Basel, Switzerland) with lentivirus GFP as previously reported [22]. did.
  • GFP-labeled Muse cells as SSEA-3 positive cells were isolated from GFP-MSCs by fluorescence activated cell selection (FACS). The GFP-MSC and Muse cells were frozen in a Beissel freezing container (Nihon Freezer, Tokyo, Japan) and kept in liquid nitrogen until use.
  • Nano-lantern labels with bioluminescence resonance energy transfer (BRET) potency are bright photoproteins that can be detected even in a small number of transplanted cells [25].
  • Human bone marrow-MSCs (Lonza) were labeled with nano-lanterns [25] as previously reported [25].
  • Nano-lantern-labeled Muse cells were isolated from nano-lantern-labeled MSCs as SSEA-3 positive cells by FACS. i. v.
  • HBSS injection medium
  • mice were euthanized when they were unable to stand up within 15 seconds of falling to one side and recorded as the time of death. Each animal was injected intraperitoneally with pentobarbital (20 mg / kg) for deep anesthesia and sampling as previously reported [26].
  • the primary antibodies used were goat anti-GFP antibody (1: 500, Abcam, Cambridge, UK); rabbit anti-GFP antibody (1: 500, MBL, Woburn, USA); rabbit anti-Iba1 antibody (1: 500, Osaka, Japan).
  • Mouse anti- ⁇ III tubulin (Tuji1) antibody (1: 100, Santa Cruz Biotechnology); Rabbit anti-glial fibrous acid protein (GFAP) antibody (1: 500, Dako, Glostrup, Denmark); Anti-NeuN antibody (1: 100, Millipore, MA, USA); goat anti-vesicular acetylcholine transporter (VAChT) antibody (1: 200, Thermo Scientific).
  • the secondary antibody used was either Alexa 488 or 546 conjugated anti-goat, rabbit or mouse IgG (1: 500, Alexa Fluor TM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
  • ⁇ -Bungarotoxin conjugated with Alexa 594 (1: 500, Millipore) was also used to detect the acetylcholine receptor.
  • NMJs neuromuscular junctions
  • Nano-lantern-labeled cells were used to investigate later in vivo kinetics of MSCs and Muse cells.
  • MSC group on day 7, a strong signal was detected in the lungs and a trace signal was detected in the femur, but no signal was detected in other organs including the brain, cervical cord and lumbar spinal cord.
  • Muse group signals were detected in the cervical and lumbar spinal cords (Fig. 1c, upper right), as well as in the lungs, while not in the brain (Fig. 1c, middle). The femoral signal was higher in the Muse group than in the MSC group.
  • Immunohistological analysis confirmed the presence of nano-lantern-Muse cells in the pulmonary vascular lumen and bone marrow (Fig. 1d). This signal was consistently below the detection limit for all organs examined in the vehicle group (Fig. 1c).
  • the average survival time was not significantly different between the 3 groups (medium; 144.4 ⁇ 8.0 days, MSC; 143.9 ⁇ 6.9 days, Muse cells; 142.6 ⁇ 6.7 days).
  • there was no statistical difference in body weight between the three groups over the entire period (Fig. 2a).
  • the rotarod test showed reduction in the Muse group on days 67 and 70, and statistical significance in the medium group (Fig. 2b).
  • the hanging wire scores on days 84, 112, and 133, as well as the muscle strength of the lower extremities on days 126 and 140 were also significantly improved only in the Muse cell group compared to the vehicle group (FIGS. 2c, d). ).
  • GFP-positive cells could not be detected in the medium group (Fig. 2e), but a small number of GFP-positive cells were observed in the MSC group (Fig. 2f).
  • Muse cell population GFP-positive cells were found in the spinal cord soft membrane (Fig. 2 g, solid line box), lower white matter, and anterior horn (Fig. 2 g, dotted box, 2h), and 85.7% (201) of these cells. (180 of the GFP-positive cells) co-expressed the astrocyte marker GFAP located in both the soft membrane (FIG. 2i) and the anterior horn (FIG. 2j). The remaining GFP-positive cells (14.3%) were microglia marker Iba-1 (Fig.
  • the number of survival motor neurons in the anterior horn was significantly lower in the media, MSC and Muse groups when compared to the wild-type (WT) group (WT, FIGS. 3a, b, * p ⁇ 0.05).
  • WT wild-type
  • FIGS. 3a, b, * p ⁇ 0.05 The number of survival motor neurons in the anterior horn was significantly lower in the media, MSC and Muse groups when compared to the wild-type (WT) group.
  • WT wild-type
  • FIGS. 3a, b, * p ⁇ 0.05 The number of survival motor neurons in the anterior horn was significantly lower in the media, MSC and Muse groups when compared to the wild-type (WT, FIGS. 3a, b, * p ⁇ 0.05.
  • the Muse group had a larger number of motor neurons than the medium group and was statistically significant (FIGS. 3a, b, # p ⁇ 0.05). No statistical significance was found between the vehicle group and the MSC group (FIGS. 3
  • ALS model mice i.e. in that Muse cells are delivered to the spinal cord, which is an important therapeutic target.
  • the injection is i. t. It was superior to injection (Table 1, FIGS. 1a, b).
  • i. v. The administration is easy to access, less invasive, and less burdensome to the patient. t. It has superior advantages over administration. This allows repeated administration of Muse cells to ALS patients.
  • Muse cells expressing sphingosine-1-phosphate receptor 2 (S1PR2) are specific for the site of injury by sensing sphingosine-1-phosphate (S1P) produced by the injured cells. It has been shown that it can be homing to [18].
  • Muse cells are i. v.
  • the spinal cord of ALS mice can be reached by injection.
  • Nano-lantern imaging showed a strong signal of Muse cells in the femur rather than the MSC (Fig. 1c). Bone marrow abnormalities have been reported in ALS [32]. Therefore, Muse cells selectively and actively accumulated in the femoral bone marrow and spinal cord in a lesion-dependent manner, in contrast to passive confinement in pulmonary capillaries. Another interesting point is i. v. The injected Muse cells migrated to the pia mater, lower white matter, and abdominal horn (FIGS. 2 g-j), suggesting that Muse cells home to the spinal cord via the pia mater perforated artery. On the other hand, i. t. The injected Muse cells were rarely detected in the spinal cord (FIGS. 1a, 1b). These results suggest that Muse cell homing factors are endocrine into the circulatory system rather than paracrine primarily into the spinal subarachnoid space [32-35].
  • ALS In the animal disease model, i. v.
  • the injected Muse cells spontaneously differentiated into tissue-constituting cells after homing specifically to the injured tissue; that is, in the stroke model, they differentiated into neurons and oligodendrocytes [16].
  • ALS In contrast to stroke, ALS is chronic and progressive, and its pathology is quite different from stroke.
  • the injected Muse cells differentiated predominantly into the astroglial lineage rather than the neuronal lineage in the spinal cord of ALS mice. Reactive astrocytes are important therapeutic targets for ALS [36].
  • Muse cells include hepatocyte growth factor (HGF), intravascular growth factor (VEGF), insulin-like growth factor 1 (IGF-1), epidermal growth factor (EGF), prostaglandin E2 (PGE2) and angio. It produces various neurotrophic factors such as poietin-1 (Ang1) [17-19]. Therefore, they may provide beneficial factors for motor neurons and astrocytes and prevent myofiber atrophy in the ALS model.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • VEGF intravascular growth factor
  • IGF-1 insulin-like growth factor 1
  • EGF epidermal growth factor
  • PGE2 prostaglandin E2
  • angio angiogenesis
  • Muse cells can be a promising cell resource for the treatment of ALS patients.
  • ALS Amyotrophic lateral sclerosis
  • TAR human transgenic response
  • TDP-43 DNA-binding protein 43 kDa
  • Muse cells were isolated and identified according to the method described in WO2011 / 007900. More specifically, Muse cells were obtained by expanded concentration culture of mesenchymal stem cells under stress conditions. Animals were dosed with 5 ml / kg of 2 ⁇ 10 6 viable cells / ml working fluid.
  • Animal management 5-1 Animals were housed in individual ventilation cages using standard rodent bedding supplied by the breeding facility Rettenmaier. Up to 5 animals in the same group were housed in one cage. Room temperature was maintained at about 21 ° C. and relative humidity was maintained at 40-70%. Animals were bred with a constant light-dark cycle (12 hours / 12 hours). Animals were given free access to dry pelletized standard rodent feed (altromin) and regular tap water.
  • the identified animals were numbered consecutively by the classical ear punch method. Each cage was identified by a color card indicating test number, gender, individual registration number (IRN), date of birth, genotyping date, and dosing group allocation.
  • IRN individual registration number
  • each animal was determined by a polymerase chain reaction specific for the transgenic construct. Prior to the start of the test, each mouse was genotyped using DNA isolated from ear tissue collected from ear punches for animal identification.
  • mice were allowed access to food pellets and water at the bottom of the cage when animals showed severe motor dysfunction and could no longer reach food / water bottles. We also used a drinking bottle with a long cap.
  • a reflection test and a modified Irwin test including hanging wires were performed once for all animals. Coordination hanging wires were evaluated biweekly during the test (6 times in total), rotor rods twice (at baseline and at the end of the test), and clasping behavior twice (at baseline and at the end of the test).
  • 6-3 As a behavioral baseline test, a reflex test and a modified Irwin test including hanging wires were performed once on all animals. Coordination hanging wires were evaluated biweekly during the test (6 times in total), rotor rods twice (at baseline and at the end of the test), and clasping behavior twice (at baseline and at the end of the test). The test was conducted at random.
  • the hanging wire test is a test for evaluating neuromuscular abnormalities in exercise intensity, and is performed during the test period (starting from the second week of administration) and as part of the Irwin test (as behavior at baseline). Conducted every other week.
  • This test used a wire cage lid with duct tape around it to prevent the mouse from coming off the edge. The animal was placed on top of the cage lid. The lid was lightly shaken three times to force the mouse to grip the wire and then turned upside down. The lid was held at a height of about 55-60 cm above the soft underlay, which was high enough to prevent the mouse from jumping down, but not high enough to harm it if it fell. The incubation time until the fall was quantified. A cutoff time of 300 seconds was used. Normal mice may hang upside down for several minutes.
  • Rotarod test The rotarod test was conducted twice at the start of the test (at baseline) and at the end of the test. In this test, motor coordination is evaluated by placing the animal on a rotating rod (4 lane rotor rod; Ugo Basile) traveling at a constant speed or acceleration speed. If the mouse loses balance and falls to the underlying platform, Red automatically stops and records fall latency measurements as well as fall speed.
  • a rotating rod (4 lane rotor rod; Ugo Basile
  • mice Prior to the first test session, the mice were acclimatized to the test system so that they could stay on the rod at a constant speed of 2 rpm for about 1 minute. During the test, one animal was exposed to the device three times for the test for 180 seconds. The initial speed increased from 2 rpm to 20 rpm with an acceleration time of 180 seconds. If the mouse fell, the session ended and the Ugo Basile Program stopped the timer.
  • PB phosphate buffer
  • the entire spinal column (n 8 per group) was fixed by immersing it in freshly prepared 4% paraformaldehyde in PB (pH 7.4) for 24 hours at 4 ° C. The next day, an incision was made from the fixed spinal column of the spinal cord and transferred to a 15% sucrose-PBS solution overnight for cryoprotection. Then, the tissue block was cut into 8 pieces, placed on a cryomold as a tissue array, and embedded in OCT medium. The samples were then snap-frozen in dry ice-cooled liquid isopentane and stored in an ultra-deep freezer (set to ⁇ 80 ° C. target temperature) until sectioning.
  • Experiment II-MBP Iba1, MAP-2
  • myelin basic protein (MBP) ionized calcium-associated adapter molecule 1 (Iba1) and microtubule-associated protein 2 (MAP-2) were added to five fragments (L2, L4, L6, L8 and L10) per mouse brain.
  • MBP myelin basic protein
  • Iba1 ionized calcium-associated adapter molecule 1
  • MAP-2 microtubule-associated protein 2
  • ⁇ Immune response area Percentage of ROI covered by objects above the threshold (eg, cell body cells); this is the most comprehensive parameter indicating whether there is an overall difference in immune response. be.
  • ⁇ Object density [number of objects / mm 2 ]: The number of objects that exceed the threshold standardized for the size of the target area. This is particularly useful for detecting changes in the density of immunoreactive objects.
  • ⁇ Object strength [a. u. ]: Average brightness of pixels of immunoreactive objects above the threshold; this indicates whether there is a difference in the cellular expression level of the target protein.
  • ⁇ Object size [ ⁇ m 2 ]: Size of immunoreactive object above threshold; this is particularly useful for detecting changes in the size of immunoreactive object.
  • ⁇ ROI strength [a. u. ]: Average brightness of pixels within the ROI; this indicates whether there is an overall difference in immunofluorescent signals.
  • ⁇ GFP average object size [ ⁇ m 2 ], average object strength [a. u. ], Object density [n / mm 2 ], Immune active region [%]
  • Iba1 Average object size [ ⁇ m 2 ], average object strength [a. u. ], Object density [n / mm 2 ], Immune active region [%]
  • hTDP-43 average object size [ ⁇ m 2 ], average object strength [a. u. ], Object density [n / mm 2 ], Immune active region [%]
  • MBP Average ROI [a. u.
  • TDP-43 levels determined by Western blot were quantified and statistically evaluated in the spinal cord and hippocampus.
  • TDP-43 / ⁇ -tubulin isotype III showed a significant increase in group C compared to group D.
  • Groups A to B showed no significant difference compared to Group C (Fig. 20).
  • Arai, T. et al. TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Biochem Biophys Res Commun 351, 602-611, doi: 10.1016 / j.bbrc .2006.10.093 (2006).
  • Alpha1-syntrophin-deficient skeletal muscle exhibits hypertrophy and aberrant formation of neuromuscular junctions during regeneration. J Cell Biol 158, 1097-1107, doi: 10.1083 / jcb.200204076 (2002).
  • Nagano, I. et al. Therapeutic benefit of intrathecal injection of insulin-like growth factor-1 in a mouse model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Neurol Sci 235, 61-68, doi: 10.1016 / j.jns. 2005.04 .011 (2005).
  • Glial cell line-derived neurotrophic factor protein prevents motor neuron loss of transgenic model mice for amyotrophic lateral sclerosis.
  • Bossolasco P. et al. Metalloproteinase alterations in the bone marrow of ALS patients.

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Abstract

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、進行性運動ニューロン喪失を特徴とする致死的な神経変性疾患である。Ｍｕｓｅ細胞は、種々の組織に分布する内因性の修復性多能性様幹細胞である。これらは、損傷細胞によって産生されたスフィンゴシン－１－リン酸を感知することによって、静脈注射後に損傷部位に選択的に定着し、ホーミング後に組織保護及び組織構成細胞への自然分化を含む多面的効果を発揮することができる。ＡＬＳモデル　Ｇ９３Ａ－Ｔｇマウスでは、静脈内注射により、主に軟膜で及び下部白質において、ヒトＭｕｓｅ細胞は首尾よく腰髄にホーミングし、グリア様形態及びＧＦＡＰ発現を示したが、ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）ではそのようなホーミング及び分化は認められず、むしろ主に肺に分布した。Ｍｕｓｅ群は、ロータロッド、ハンギングワイヤ及び下肢の筋力のスコアを有意に改善し、運動ニューロン数を回復させ、下肢筋肉の脱神経及び筋線維萎縮を媒体群よりも有意に軽減させた。さらに、ＡＬＳモデル　ＴＤＰ－４３　Ｔｇマウスにおける運動機能におけるＭｕｓｅ細胞の効果を評価した。その結果、Ｍｕｓｅ群は、媒体群よりもハンギングワイヤ試験のスコアを有意に改善した。これらの結果は、Ｍｕｓｅ細胞が損傷部位依存的にホーミングし、運動ニューロン死に対して脊髄を保護し、Ｍｕｓｅ細胞がＡＬＳ患者の治療のために有用であることを示している。

Description

運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）の治療に有効な多能性幹細胞
　本発明は、再生医療のための細胞製剤に関する。より具体的には、本発明は、多能性幹細胞を含む、対象における運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）の治療、予防、軽減及び／又は発症の遅延のために有効な細胞製剤に関する。
　筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、進行性運動ニューロン喪失を特徴とする破壊的な神経変性疾患である。ＡＬＳ患者の約１０％は、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）［非特許文献１～３］［１～３］、ＴＡＲ　ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）［非特許文献４及び５］［４、５］、及びＣ９ｏｒｆ７２遺伝子のヘキサヌクレオチド反復伸長［非特許文献６及び７］［６、７］における突然変異に関連する遺伝型を有する。経口薬リルゾールに加えて、フリーラジカルスカベンジャーエダラボンが新しい抗ＡＬＳ薬として最近承認された［非特許文献８及び９］［８、９］。しかしながら、これらの治療の治療効果は依然として非常に限られており、ＡＬＳに対する新しい治療戦略が必要である。
　Ｍｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｓｔｒｅｓｓ　ｅｎｄｕｒｉｎｇ）細胞は、多能性幹細胞表面マーカーであるステージ特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）－３陽性細胞として回収可能な内因性の多能性様幹細胞である。これらは通常、骨髄、末梢血、臓器の結合組織に局在しており、非腫瘍性である［非特許文献１０～１３］［１０～１３］。Ｍｕｓｅ細胞は、損傷した組織を認識し、損傷した細胞／アポトーシス細胞によって産生されるスフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）を認識するスフィンゴシン－１－リン酸受容体（Ｓ１ＰＲ２）を発現するため、静脈注射によって損傷部位に選択的に蓄積する。損傷部位にホーミングした後、Ｍｕｓｅ細胞は損傷／アポトーシス細胞型への自然分化によって損傷／アポトーシス細胞を置換し、組織修復に寄与することが、脳卒中、急性心筋梗塞、表皮水疱症、慢性腎疾患、及び肝硬変の動物モデルで報告されている［非特許文献１４～１８］［１４～１８］。組織修復作用に加えて、Ｍｕｓｅ細胞には血管新生、免疫調節、栄養、抗アポトーシス、抗線維化などの多面的作用を有する［非特許文献１８及び１９］［１８、１９］。別の重要な特殊性は、同種Ｍｕｓｅ細胞は静脈内投与後に宿主の免疫拒絶反応を免れ、免疫抑制治療を行わなくても分化細胞として宿主組織内で６カ月以上生存することである［非特許文献１８］［１８］。これは、胎盤における免疫寛容を媒介する組織適合性抗原であるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－Ｇの発現によって部分的に説明される［非特許文献１８］［１８］。これらの特性に基づき、静脈内投与された同種異系Ｍｕｓｅ細胞は、医薬品規制当局の承認を得て、急性心筋梗塞、脳卒中、脊髄損傷、表皮水疱症、及び新生児脳性麻痺の臨床試験に適用されているが、いずれもＨＬＡ適合又は長期免疫抑制治療は行われていない［非特許文献２０］［２０］。Ｍｕｓｅ細胞は損傷組織を標的とすることができるため、治療に必要な細胞数は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の細胞数よりも一桁少ない［非特許文献２１］［２１］。これらの特性について、本発明者らはＡＬＳ動物モデルに対するＭｕｓｅ細胞の可能な治療可能性を調べた。
Aoki, M. et al. Nat Genet 5, 323-324, doi:10.1038/ng1293-323 (1993). Gurney, M. E. et al. Science 264, 1772-1775, doi:10.1126/science.8209258 (1994). Rosen, D. R. et al. Nature 362, 59-62, doi:10.1038/362059a0 (1993). Arai, T. et al. Biochem Biophys Res Commun 351, 602-611, doi:10.1016/j.bbrc.2006.10.093 (2006). Kabashi, E. et al. Nat Genet 40, 572-574, doi:10.1038/ng.132 (2008). DeJesus-Hernandez, M. et al. Neuron 72, 245-256, doi:10.1016/j.neuron.2011.09.011 (2011). Renton, A. E. et al. Neuron 72, 257-268, doi:10.1016/j.neuron.2011.09.010 (2011). Abe, K. et al. Amyotroph Lat Scl Fr 18, 40-48, doi:10.1080/21678421.2017.1361441 (2017). Writing, G. & Edaravone, A. L. S. S. G. Lancet Neurol 16, 505-512, doi:10.1016/S1474-4422(17)30115-1 (2017). Kuroda, Y. et al. Proc Natl Acad Sci USA 107, 8639-8643, doi:10.1073/pnas.0911647107 (2010). Kuroda, Y. et al. Nat Protoc 8, 1391-1415, doi:10.1038/nprot.2013.076 (2013). Tanaka, T. et al. Circ J 82, 561-571, doi:10.1253/circj.CJ-17-0552 (2018). Wakao, S. et al. Proc Natl Acad Sci USA 108, 9875-9880, doi:10.1073/pnas.1100816108 (2011). Fujita, Y. et al. J Invest Dermatol, doi:10.1016/j.jid.2020.05.092 (2020). Iseki, M. et al. Cell Transplant 26, 821-840, doi:10.3727/096368916X693662 (2017). Uchida, H. et al. Stroke 48, 428-435, doi:10.1161/STROKEAHA.116.014950 (2017). Uchida, N. et al. J Am Soc Nephrol 28, 2946-2960, doi:10.1681/ASN.2016070775 (2017). Yamada, Y. et al. Circ Res 122, 1069-1083, doi:10.1161/CIRCRESAHA.117.311648 (2018). Yabuki, H., Wakao, S., Kushida, Y., Dezawa, M. & Okada, Y. Cell Transplant 27, 979-993, doi:10.1177/0963689718761657 (2018). Dezawa, M. Adv. Exp. Med. Biol. 1103, 305-307, doi:10.1007/978-4-431-56847-6 17 (2018). Noda, T., Nishigaki, K. & Minatoguchi, S. Circ J, doi:10.1253/circj.CJ-20-0307 (2020).
　本発明は、再生医療における多能性幹細胞（例えば、Ｍｕｓｅ細胞）による新規な医療用途を提供する。より具体的には、本発明は、Ｍｕｓｅ細胞を含む、対象における運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）を治療し、予防し、軽減し及び／又は発症を遅延させるのに有効な細胞製剤及び／又は医薬組成物、ならびにこれらを用いて上記の疾患を有する対象を治療する方法を提供する。
　本発明者らは、変異ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）トランスジェニックマウスモデルを用いて、静脈（全身）投与されたＭｕｓｅ細胞が損傷した脊髄に集積し、下肢筋肉の除神経と筋線維萎縮が軽減されたことから、ＡＬＳの治療及び予防を可能にすることを見出した。また、本発明者らは、ユビキチン化タンパク質（例えば、ＴＤＰ－４３）を過剰発現するＡＬＳマウスモデルに、Ｍｕｓｅ細胞を注入又は投与することにより、Ｍｕｓｅ細胞が、病変部位に局所的に蓄積し、病変部位において組織構成細胞に分化し、ＡＬＳを修復し得ることを見出した。これらの知見に基づいて、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
　［１］生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む、対象における運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）を治療し、予防し、軽減し及び／又は発症を遅延させるための細胞製剤。
　［２］外部ストレス刺激によりＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分を含む、上記［１］に記載の細胞製剤。
　［３］多能性幹細胞がＣＤ１０５陽性である、上記［１］又は［２］記載の細胞製剤。
　［４］多能性幹細胞がＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性である、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の細胞製剤。
　［５］多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性、及びＣＤ２７１陰性である、上記［１］～［４］のいずれか１つに記載の細胞製剤。
　［６］多能性幹細胞が、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性、及びＤｃｔ陰性である、上記［１］～［５］のいずれか１つに記載の細胞製剤。
　［７］多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、上記［１］～［６］のいずれか１つに記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれかの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
　［８］ＭＮＤが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、又は球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）である、上記［１］～［７］のいずれか１つに記載の細胞製剤。
　［９］多能性幹細胞が脊髄内に生着する能力を有する、上記［１］～［８］のいずれか１つに記載の細胞製剤。
　本発明は、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）を患っている対象に対し、Ｍｕｓｅ細胞を損傷部位に直接、又は静脈等から投与することにより、Ｍｕｓｅ細胞が損傷部位において該部位周辺の正常組織を構成する細胞に分化するという組織再生メカニズムによって、運動ニューロン（ＭＮＤ）を修復することができる。
（ａ）静脈内（ｉ．ｖ．）注射又は髄腔内（ｉ．ｔ．）注射の７日後の脊髄におけるＧＦＰ標識されたＭｕｓｅ細胞の分布を示す。パネルの点線のボックスは、各パネルの高倍率を示す。注目すべきことに、ｉ．ｖ．注射のみが、多数のＧＦＰ標識されたＭｕｓｅ細胞を軟膜、及び頸髄と腰髄の両方の下部白質に送達した。（ｂ）ＧＦＰ標識されたＭｕｓｅ細胞の数は、ｉ．ｔ．注射よりｉ．ｖ．後に高かった。（ｃ）静脈内投与後の７日でのナノ・ランタン標識されたヒトＭＳＣ及びＭｕｓｅ細胞の脊髄、脳、筋肉、肺、及び脚骨における分布を示す。注目すべきことに、Ｍｕｓｅ細胞のみが脊髄において検出された。（ｄ）ナノ・ランタン標識されたＭｕｓｅ細胞は、肺血管内腔（左パネル、矢印）及び骨髄（右パネル、矢印）に認められた。スケールバー：（ａ）１００μｍ、（ａ、囲み図）２０μｍ；２ｍｍ（ｃ、脊髄）、１ｃｍ（ｃ、その他）、及び（ｄ）２０μｍ。 （ａ～ｄ）（ａ）体重、（ｂ）ロータロッド試験、（ｃ）ハンギングワイヤ試験、及び（ｄ）下肢の筋力について、媒体（ｎ＝１０）、ＭＳＣ（ｎ＝９）、及びＭｕｓｅ細胞（ｎ＝９）で処置されたＧ９３Ａ　Ｔｇマウスの臨床分析を示す。媒体と比較して、Ｍｕｓｅ細胞によるｉ．ｖ．処置は、ロータロッド試験、ハンギングワイヤ試験、及び下肢の筋力において有意な改善を示した（＊ｐ＜０．０５、対媒体）。（ｅ）媒体で処理されたＧ９３Ａ　Ｔｇマウスの腰髄にＧＦＰ陽性細胞はなかった。（ｆ）いくつかのＧＦＰ陽性細胞はＭＳＣ群の軟膜においてのみ認められた。（ｇ）Ｍｕｓｅ細胞群の軟膜から腹角にかけてより多くのＧＦＰ陽性細胞が検出された。（ｇ）の枠内は、それぞれｉ（実線のボックス）とｊ（点線のボックス）で拡大される。Ｍｕｓｅ細胞による処理は、アストログリア（矢印）に典型的な形態を示す、軟膜（ｉ、矢印）及び前角（ｊ、矢印）に明らかなＧＦＰ陽性細胞（ｈ）及びＧＦＰ／ＧＦＡＰ二重陽性細胞を示したが、ＧＦＰ＋ミクログリアマーカーＩｂａ－１（ｋ）、Ｔｕｊ１（ｌ）などのニューロンマーカー、又はＮｅｕＮ（ｍ）の二重陽性は示さなかった。スケールバー：（ｅ）１００μｍ及び（ｈ）５０μｍ。 （ａ－ｂ）腰髄におけるニッスル染色された運動ニューロンの数は、Ｇ９３Ａ　Ｔｇマウスにおいて大幅な減少（＊ｐ＜０．０５、対野生型＝ＷＴ）を示し、Ｍｕｓｅ細胞のｉ．ｖ．処理により有意な改善（＃ｐ＜０．０５、対媒体）を示した。（ｃ‐ｄ）神経筋接合部（ＮＭＪ）染色は、Ｇ９３Ａ　Ｔｇマウスの前脛骨筋における脱神経と、Ｍｕｓｅ細胞群における回復を示した（ＶＡＣｈＴ陽性運動終末；緑色、ＢＴＸで染色したアセチルコリン受容体；赤色、矢頭、＊ｐ＜０．０５、対ＷＴ、＃ｐ＜０．０５、対媒体）。（ｅ‐ｆ）Ｇ９３Ａ　Ｔｇマウスの前脛骨筋におけるＨＥ染色された神経原性筋線維萎縮、及びＭｕｓｅ細胞処理による有意な改善を示す（＊ｐ＜０．０５、対媒体、＃ｐ＜０．０５、対ＭＳＣ）。スケールバー：（ａ）５００μｍ、（Ｃ）５０μｍ、及び（ｄ）５０μｍ。 切片レベルを示す。切片化プロトコールに従って得られたほぼ中矢状面レベルである。Ｐａｘｉｎｏｓ　＆　Ｆｒａｎｋｌｉｎ、「Ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｂｒａｉｎ　Ａｔｌａｓ」（第２版）から引用し、定位座標を示す。 脊髄の組織アレイにおける切片レベルを示す。脊髄切片の図は、Ａｌｌｅｎ　Ｂｒａｉｎ　Ａｔｌａｓ（ｈｔｔｐ：／／ｍｏｕｓｅｓｐｉｎａｌ．ｂｒａｉｎ－ｍａｐ．ｏｒｇ／ｍａｇｅｓｅｒｉｅｓ／ｓｈｏｗｒｅｆ．ｈｔｍｌ）から引用した。 体重：グラフは、投与期間全体にわたって週１回測定した群（Ａ、Ｃ、Ｄ）あたりの体重［ｇ］の推移を示す。各点は、各群及び各週の全動物の平均値±標準誤差を表す。Ｃ群をＡ群及びＤ群と比較した（＄＄：ｐ＜０．０１群Ｄ対Ｃ群、反復測定ＡＮＯＶＡ、因子：群）。 体重：グラフは、投与期間全体にわたって週１回測定した群（Ｂ、Ｃ、及びＤ）あたりの体重［ｇ］の推移を示す。各点は、各群及び各週の全動物の平均値±ＳＥＭを表す。Ｃ群をＢ群及びＤ群（＄＄：ｐ＜０．０１群Ｄ対Ｃ群、反復測定ＡＮＯＶＡ、因子：群）と比較した。 ハンギングワイヤ：グラフは、治療期間全体にわたって１週間後及びさらに２週間ごとに測定した群（Ａ、Ｃ、及びＤ）あたりのワイヤ吊り下げ時間［秒］の経過を示す。各点は、各群及び各週の全動物の平均値±ＳＥＭを表す。Ｃ群をＡ群及びＤ群と比較した（＆；ｐ＜０．０５群Ｃ対Ａ群、＄＄：ｐ＜０．０１群Ｄ対Ｃ群、反復測定ＡＮＯＶＡ、因子：群）。 ハンギングワイヤ：グラフは、１週目に測定した群（Ｂ、Ｃ、及びＤ）あたりのワイヤから落ちるまでの時間［秒］の経過を示し、治療期間全体にわたって２週間ごとに測定したものである。各点は、各群及び各週の全動物の平均値±ＳＥＭを表す。Ｃ群をＢ群及びＤ群と比較した（＄＄：ｐ＜０．０１群Ｄ対Ｃ群、反復測定ＡＮＯＶＡ、因子：群）。 ロータロッド：グラフは、試験１、２、３、及びベースライン検査時及び１２週目の各群の平均的な落下までの時間［秒］を表す。Ｃ群をＤ群と比較し、Ａ～Ｂ群をＣ群と比較した（＃＃：ｐ＜０．０１、ｔ検定）。データは、各群の全動物の平均値±標準誤差の棒グラフとして表示する。 クラスピング：グラフは、ベースライン検査時及び１２週目の各群の平均クラスピングスコア［ｎ］を表す。Ｃ群をＤ群と比較し、Ａ～Ｂ群をＣ群と比較した（＃＃：ｐ＜０．０１、ｔ検定）。データは、各群の全動物の平均値±標準誤差の棒グラフとして表示する。 ｈＴＤＰ－４３：グラフは、マウスあたり１つの脊髄組織アレイのＲＯＩ内で測定された免疫蛍光シグナルの平均値（群あたりｎ＝８）を示す。各値は平均±ＳＥＭを表す。＊：ｐ＜０．０５、対Ｃ群（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）；＃：ｐ＜０．０５、＃＃：ｐ＜０．０１、対Ｄ群（ｔ検定）；＄＄：ｐ＜０．０１、対Ｃ群（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定後、２元配置ＡＮＯＶＡ；因子：群）；％％：ｐ＜０．０１、対Ｄ群（２元配置ＡＮＯＶＡ；因子：群）。 ＧＦＡＰ：グラフは、マウスあたり１つの脊髄組織アレイのＲＯＩ内で測定された免疫蛍光シグナルの平均（１群あたりｎ＝８）を示す。各値は平均±ＳＥＭを表す。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、対Ｃ群（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）；＃：ｐ＜０．０５、＃＃：ｐ＜０．０１、対Ｄ群（ｔ検定）；＄＄：ｐ＜０．０１、対Ｃ群（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定後、２元配置ＡＮＯＶＡ；因子：群）；％：ｐ＜０．０５、％％：ｐ＜０．０１、対Ｄ群（２元配置ＡＮＯＶＡ；因子：群）。 ＭＡＰ２：グラフは、マウスあたり１つの脊髄組織アレイのＲＯＩ内で測定された免疫蛍光シグナルの平均値（１群あたりｎ＝８）を示す。各値は平均±ＳＥＭを表す。＄：ｐ＜０．０５、対Ｃ群（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定後、２元配置ＡＮＯＶＡ；因子：群）；％：ｐ＜０．０５、％％：ｐ＜０．０１、対Ｄ群（２元配置ＡＮＯＶＡ；因子：群）。 Ｉｂａ１：グラフは、マウスあたり１つの脊髄組織アレイのＲＯＩ内で測定された免疫蛍光シグナルの平均値（１群あたりｎ＝８）を示す。各値は平均±ＳＥＭを表す。＃：ｐ＜０．０５、＃＃：ｐ＜０．０１、対Ｄ群（ｔ検定）；＄：ｐ＜０．０５、対Ｃ群（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定後、２元配置ＡＮＯＶＡ；因子：群）；％：ｐ＜０．０５、％％：ｐ＜０．０１、対Ｄ群（２元配置ＡＮＯＶＡ；因子：群）。 ｈＴＤＰ－４３：グラフは、マウスあたり５つの脳切片のＲＯＩ内で測定された免疫蛍光シグナルの平均値（１群あたりｎ＝８）を示す。各値は平均±ＳＥＭを表す。＃＃：ｐ＜０．０１、対Ｄ群（ｔ検定）。 ＧＦＡＰ：グラフは、マウスあたり５つの脳切片のＲＯＩ内で測定された免疫蛍光シグナルの平均値（１群あたりｎ＝８）を示す。各値は平均±ＳＥＭを表す。＃＃：ｐ＜０．０１、対Ｄ群（ｔ検定）。 Ｉｂａ１：グラフは、マウスあたり５つの脳切片のＲＯＩ内で測定された免疫蛍光シグナルの平均値（１群あたりｎ＝８）を示す。各値は平均±ＳＥＭを表す。＃：ｐ＜０．０５、＃＃：ｐ＜０．０１、対Ｄ群（ｔ検定）。 ＮｅｕＮ：グラフは、マウスあたり５つの脳切片のＲＯＩ内で測定された免疫蛍光シグナルの平均値（１群あたりｎ＝８）を示す。各値は平均±ＳＥＭを表す。＃：ｐ＜０．０５、＃＃：ｐ＜０．０１、対Ｄ群（ｔ検定）。 ウエスタンブロット：グラフは、全動物（海馬：１群あたりｎ＝１５、脊髄：１群あたりｎ＝７）のＴＤＰ－４３シグナル（ＡＵ）又は算出された比（ＴＤＰ－４３がチューブリンアイソタイプＩＩＩに対して標準化された）の平均値を示す。各値は平均±ＳＥＭを表す。＄：ｐ＜０．０５、対Ｃ群（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定後、２元配置ＡＮＯＶＡ；因子：群）；％：ｐ＜０．０５、％％：ｐ＜０．０１、対Ｄ群（２元配置ＡＮＯＶＡ；因子：群）。＃＃：ｐ＜０．０１、対Ｄ群（ｔ検定）。
　本発明は、ＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞（例えば、Ｍｕｓｅ細胞）を含有する、対象における運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）を治療し、予防し、軽減し及び／又は発症を遅延させるための細胞製剤及び医薬組成物、並びに該細胞製剤等を用いたＭＮＤを治療するための方法に関する。以下、本発明の詳細な説明を説明する。
　本明細書において、使用される略語について、下記の通り詳述する。なお、当該技術分野において、一般的に使用される略語については、慣習に従うものとする。
使用される略語
　Ａｎｇ１：アンジオポイエチン－１
　ＡＮＯＶＡ：分散分析
　ＢＷ：体重
　ＢＲＥＴ：生物発光共鳴
　ＥＧＦ：上皮細胞増殖因子のエネルギー移動；
　ＦＡＣＳ：蛍光活性化細胞分別
　ＧＦＡＰ：グリア線維性酸性タンパク質
　ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質
　ＨＢＳＳ：ハンクス平衡塩類溶液
　ＨＥ：ヘマトキシリン及びエオシン
　ＨＧＦ：肝細胞増殖因子
　Ｉｂａ１：イオン化カルシウム結合アダプター分子１
　ＩＧＦ－１：インスリン様増殖因子１
　ｉ．ｔ．：髄腔内
　ｉ．ｖ．：静脈内
　ＭＡＰ２：微小管関連タンパク質２
　ＭＳＣ：間葉系幹細胞
　ＮＭＪ：神経筋接合部
　ＮｅｕＮ：ニューロン核
　ＰＧＥ２：プロスタグランジンＥ２
　ＳＯＤ１：スーパーオキシドジスムターゼ
　Ｓ１Ｐ：スフィンゴシン－１－リン酸
　Ｓ１ＰＲ２：スフィンゴシン－１－リン酸受容体２
　ＴＤＰ－４３：ＴＡＲ　ＤＮＡ結合タンパク質４３
　Ｔｇ：トランスジェニック
　ＶＡＣｈＴ：小胞アセチルコリントランスポーター
　ＶＥＧＦ：血管内皮増殖因子
　ＷＴ：野生型
１．適用疾患
　本発明は、ＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む細胞製剤又は医薬組成物を用いて、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、又は球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）などの運動ニューロン疾患（以下、単に「ＭＮＤ」と略することがある）の治療、予防、軽減及び／又はその発症の遅延に使用することができる。
　さらに、本発明は、ＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む細胞製剤又は医薬組成物を用いて、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）のうち、神経細胞内にＴＤＰ－４３が蓄積するＦＴＬＤ－ＴＤＰの治療、予防、軽減、及び／又は、その発症の遅延にも使用することができる。
　本明細書で使用される場合、用語「運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）」とは、運動ニューロンを選択的に破壊する神経学的障害を指す。一般的には、運動ニューロン疾患（運動神経変性疾患ともいう）は、世界保健機構（ＷＨＯ）の「疾病及び関連保健問題の国際統計分類：ＩＣＤ－１０（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｒｏｂｌｅｍｓ　第１０版）」の診断基準に基づくと、第ＶＩ章（Ｇ）「神経系の疾患（Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ）」のうちの［Ｇ１２：脊髄性筋萎縮症及び関連症候群（ｓｐｉｎａｌ　ｍｕｓｃｕｌａｒ　ａｔｒｏｐｈｙ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）］に分類され、好ましくは［Ｇ１２．２：運動ニューロン疾患（ｍｏｔｏｒ　ｎｅｕｒｏｎ　ｄｉｓｅａｓｅ）］に分類されるものである。ＭＮＤの例としては、典型的には、筋萎縮性側索硬化症（家族性筋萎縮性側索硬化症を含む）、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症（遠位型脊髄性筋萎縮症、家族性脊髄性筋萎縮症、肩甲腓骨型脊髄性筋萎縮症を含む）、進行性筋萎縮症（若年性進行性筋萎縮症、小児性進行性筋萎縮症、乳幼児進行性球麻痺、脊髄進行性筋萎縮症など）、球脊髄性筋萎縮症、ウェルドニッヒ・ホフマン病、びまん性萎縮性麻痺、運動ニューロン疾患、仮性球麻痺、球麻痺、若年性一側性上肢筋萎縮症、進行性球麻痺、外傷性球麻痺、頚椎症性筋萎縮症が挙げられる。
　ＭＮＤは、運動ニューロンを選択的に破壊する神経学的障害であり、運動ニューロンが変性し、死に至ることがある。運動ニューロン（一次（上位）運動ニューロン及び二次（下位）運動ニューロンを含む）は、随意筋に作用し、それらを刺激して収縮させる。一次運動ニューロンは大脳皮質に由来し、脳幹及び脊髄を通じて線維を送り、二次運動ニューロンの制御に関与する。二次運動ニューロンは脳幹及び脊髄に位置しており、筋肉に線維を送る。二次運動ニューロン疾患は、二次運動ニューロンの変性を含む疾患である。二次運動ニューロンが変性する場合、それが通常、活性化する筋線維が切断され、収縮しなくなり、筋脱力及び反射低下の原因となる。いずれかの型のニューロンの喪失は脱力を招き、筋萎縮症（筋消耗症）及び無痛性脱力がＭＮＤの臨床特徴である。
　「筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）」は、脊髄、脳幹、及び大脳皮質における運動ニューロンの選択的で進行性の喪失により特徴付けられる致死的な運動ニューロン疾患である。それは、典型的に、進行性の筋脱力及び神経筋呼吸不全を招く。ＡＬＳの約１０％が、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ１酵素（ＳＯＤ１）をコードする遺伝子中の点突然変異に関連付けられる。本明細書では、変異ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）トランスジェニックマウスモデルを用いて、本願発明の細胞製剤の治療有効性を検討した（実施例１参照）。他方、ＡＬＳ発症には、リン酸化あるいはユビキチン化されたＴＤＰ－４３の神経細胞内の異常蓄積が関与することが知られており、ＴＤＰ－４３をコードする遺伝子の異常やＴＤＰ－４３分解機構の異常が報告され、家族性ＡＬＳの一部（ＡＬＳ１０、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子の変異を伴う）と孤発性ＡＬＳの約９０％に認められている。本明細書では、ＴＤＰ－４３を過剰発現させたＡＬＳマウスモデルを作製し、本願発明の細胞製剤の治療有効性を検討した（実施例２参照）。
　「原発性側索硬化症（ＰＬＳ）」は、一次（上位）運動ニューロンのみが選択的、進行性に障害され、二次（下位）運動ニューロンは保たれる原因不明の疾患である。ＰＬＳは、一次運動ニューロン障害が前面に出たＡＬＳとの鑑別が困難な場合があり、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）と関連付けられることもある。
　「脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）」は、脊髄の運動神経細胞（脊髄前角細胞）の病変によって起こる神経原性の筋萎縮症である。体幹や四肢の筋力低下、筋萎縮を進行性に示す。小児期に発症するＩ型：重症型（別名：ウェルドニッヒ・ホフマン病）、ＩＩ型：中間型（別名：デュボビッツ病）、ＩＩＩ型：軽症型（別名：クーゲルベルグ・ウェランダー病）、成人期に発症するＩＶ型に分類される。
　「進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）」は、四肢や躯幹の骨格筋が進行性に脱力、萎縮を起す疾患であり、筋肉自体に原因のあるものとして、筋ジストロフィー及び萎縮性筋緊張症がある。筋ジストロフィーは骨格筋の壊死・再生を主な病態とする遺伝子変異に基づく疾患と定義されている。
　「球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）」は、脳の一部である脳幹や脊髄に存在する、筋肉を動かすための神経（二次運動ニューロン）が徐々に減少することによっておこる神経疾患であり、成人男性にのみ発症する。球脊髄性筋萎縮症の原因は、性別を決めるＸ染色体にある「アンドロゲン受容体遺伝子」の異常であることが分かっている。
　「前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）」は、大脳の前頭葉と側頭葉を中心とする神経細胞の変性・脱落により神経変性を来たし、人格変化や行動異常、失語症、認知機能障害、運動障害などが緩徐に進行することを特徴とする神経変性疾患である。ＦＴＬＤにおいては、神経細胞内にタンパク質封入体の蓄積が認められ、封入タンパク質の種類によりＦＴＬＤ－ＴＤＰ（ＴＤＰ－４３が蓄積）、ＦＴＬＤ－ＴＡＵ（ＴＡＵが蓄積）、ＦＴＬＤ－ＦＵＳ（ＦＵＳが蓄積）、ＦＴＬＤ－ｏｔｈｅｒｓ（他のタンパク質が蓄積）等に分類される。ＦＴＬＤ－ＴＤＰはＦＴＬＤの約４５％を占め、病理組織学的な特徴からタイプＡ～Ｄに分類されている。
２．細胞製剤
（１）多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）
　本発明の細胞製剤に使用される多能性幹細胞は、本発明者らの一人である出澤が、ヒト生体内にその存在を見出し、「Ｍｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｓｔｒｅｓｓ　ｅｎｄｕｒｉｎｇ）細胞」と命名した細胞である。Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄液、脂肪組織（Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., Nov 20, 2013 (Epub) (published on Jan 17,2014)）や真皮結合組織等の皮膚組織から得ることができ、各臓器の結合組織にも散在する。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞であり、例えば、それぞれの細胞表面マーカーである「ＳＳＥＡ－３（Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ－３）」と「ＣＤ１０５」のダブル陽性として同定される。したがって、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、これらの抗原マーカーを指標として生体組織から分離することができる。Ｍｕｓｅ細胞の分離法、同定法、及び特徴などの詳細は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に開示されている。また、Ｗａｋａｏら（S. Wakao, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 108, p.9875-9880 (2011)）によって報告されているように、骨髄、皮膚などから間葉系細胞を培養し、それをＭｕｓｅ細胞の母集団として用いる場合、ＳＳＥＡ－３陽性細胞の全てがＣＤ１０５陽性細胞であることが分かっている。したがって、本発明における細胞製剤においては、生体の間葉系組織又は培養間葉系幹細胞からＭｕｓｅ細胞を分離する場合は、単にＳＳＥＡ－３を抗原マーカーとしてＭｕｓｅ細胞を精製し、使用することができる。なお、本明細書においては、運動ニューロン疾患を治療するための細胞製剤（医薬組成物を含む）において使用され得る、ＳＳＥＡ－３を抗原マーカーとして、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から分離された多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を単に「ＳＳＥＡ－３陽性細胞」と記載することがある。また、本明細書においては、「非Ｍｕｓｅ細胞」とは、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織に含まれる細胞であって、「ＳＳＥＡ－３陽性細胞」以外の細胞を指す。
　簡単には、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、細胞表面マーカーであるＳＳＥＡ－３に対する抗体を単独で用いて、又はＳＳＥＡ－３及びＣＤ１０５に対するそれぞれの抗体を両方用いて、生体組織（例えば、間葉系組織）から分離することができる。ここで、「生体」とは、哺乳動物の生体をいう。本発明において、生体には、受精卵や胞胚期より発生段階が前の胚は含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物には、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、生体の組織から直接マーカーを持って分離される点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）やｉＰＳ細胞と明確に区別される。また、「間葉系組織」とは、骨、滑膜、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、歯髄、臍帯、臍帯血などの組織及び各種臓器に存在する組織をいう。例えば、Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄や皮膚、脂肪組織から得ることができる。例えば、生体の間葉系組織を採取し、この組織からＭｕｓｅ細胞を分離し、利用することが好ましい。また、上記分離手段を用いて、線維芽細胞や骨髄間葉系幹細胞などの培養間葉系細胞からＭｕｓｅ細胞を分離してもよい。なお、本発明の細胞製剤においては、使用されるＭｕｓｅ細胞は、細胞移植を受けるレシピエントに対して自家であってもよく、又は他家であってもよい。
　上記のように、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ－３陽性、及びＳＳＥＡ－３とＣＤ１０５の二重陽性を指標にして生体組織から分離することができるが、ヒト成人皮膚には、種々のタイプの幹細胞及び前駆細胞を含むことが知られている。しかしながら、Ｍｕｓｅ細胞は、これらの細胞と同じではない。このような幹細胞及び前駆細胞には、皮膚由来前駆細胞（ＳＫＰ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）、メラノブラスト（ＭＢ）、血管周囲細胞（ＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が挙げられる。これらの細胞に固有のマーカーの「非発現」を指標として、Ｍｕｓｅ細胞を分離することができる。より具体的には、Ｍｕｓｅ細胞は、ＣＤ３４（ＥＰ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ）（ＭＢのマーカー）、ＣＤ１４６（ＰＣ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）（ＮＣＳＣのマーカー）、ＮＧ２（ＰＣのマーカー）、ｖＷＦ因子（フォンビルブランド因子）（ＥＰのマーカー）、Ｓｏｘ１０（ＮＣＳＣのマーカー）、Ｓｎａｉ１（ＳＫＰのマーカー）、Ｓｌｕｇ（ＳＫＰのマーカー）、Ｔｙｒｐ１（ＭＢのマーカー）、及びＤｃｔ（ＭＢのマーカー）からなる群から選択される１１個のマーカーのうち少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。例えば、限定されないが、ＣＤ１１７及びＣＤ１４６の非発現を指標に分離することができ、さらに、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ及びＣＤ２７１の非発現を指標に分離することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。
　また、本発明の細胞製剤に使用される上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、以下：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有してもよい。本発明の一局面では、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、上記性質を全て有する。ここで、上記（ｉ）について、「テロメラーゼ活性が低いか又は無い」とは、例えば、ＴＲＡＰＥＺＥ　ＸＬ　ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に、低いか又は検出できないことをいう。テロメラーゼ活性が「低い」とは、例えば、体細胞であるヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、又はＨｅｌａ細胞に比べて１／５以下、好ましくは１／１０以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。上記（ｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、三胚葉（内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系）に分化する能力を有し、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで誘導培養することにより、肝細胞、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、脂肪細胞等に分化し得る。また、ｉｎ　ｖｉｖｏで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を示す場合がある。さらに、静注により生体に移植することで損傷を受けた臓器（心臓、皮膚、脊髄、肝、筋肉等）に遊走及び生着し、組織に応じた細胞に分化する能力を有する。上記（ｉｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、浮遊培養では増殖速度約１．３日で増殖するが、浮遊培養では１細胞から増殖し、胚様体様細胞塊を作り１４日間程度で増殖が止まる、という性質を有するが、これらの胚様体様細胞塊を接着培養に持っていくと、再び細胞増殖が開始され、細胞塊から増殖した細胞が広がっていく。さらに精巣に移植した場合、少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。また、上記（ｉｖ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、セルフリニューアル（自己複製）能を有する。ここで、「セルフリニューアル」とは、１個のＭｕｓｅ細胞から浮遊培養で培養することにより得られる胚様体様細胞塊に含まれる細胞から３胚葉性の細胞への分化が確認できると同時に、胚様体様細胞塊の細胞を再び１細胞で浮遊培養に持っていくことにより、次の世代の胚様体様細胞塊を形成させ、そこから再び３胚葉性の分化と浮遊培養での胚様体様細胞塊が確認できることをいう。セルフリニューアルは１回又は複数回のサイクルを繰り返せばよい。
　また、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞を含む細胞画分は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に外的ストレス刺激を与え、該外的ストレスに耐性の細胞以外の細胞を死滅させ、生き残った細胞を回収することを含む方法によって得られる、以下の性質の少なくとも１つ、好ましくは全てを有する、ＳＳＥＡ－３陽性及びＣＤ１０５陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分であってもよい。
（ｉ）ＳＳＥＡ－３陽性；
（ｉｉ）ＣＤ１０５陽性；
（ｉｉｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｖ）三胚葉に分化する能力を持つ；
（ｖ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｖｉ）セルフリニューアル能を持つ。
　上記外的ストレスは、プロテアーゼ処理、低酸素濃度での培養、低リン酸条件下での培養、低血清濃度での培養、低栄養条件での培養、熱ショックへの曝露下での培養、低温での培養、凍結処理、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養、振とう処理下での培養、圧力処理下での培養又は物理的衝撃のいずれか又は複数の組み合わせであってもよい。例えば、上記プロテアーゼによる処理時間は、細胞に外的ストレスを与えるために合計０．５～３６時間行うことが好ましい。また、プロテアーゼ濃度は、培養容器に接着した細胞を剥がすとき、細胞塊を単一細胞にばらばらにするとき、又は組織から単一細胞を回収するときに用いられる濃度であればよい。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ又はＮ末端スレオニンプロテアーゼであることが好ましい。さらに、前記プロテアーゼがトリプシン、コラゲナーゼ又はジスパーゼであることが好ましい。
（２）細胞製剤の調製及び使用
　本発明の細胞製剤は、限定されないが、上記（１）で得られたＭｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を生理食塩水や適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁させることによって得られる。この場合、自家又は他家の組織から分離したＭｕｓｅ細胞数が少ない場合には、細胞移植前に細胞を培養して、所定の細胞濃度が得られるまで増殖させてもよい。なお、すでに報告されているように（国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレット）、Ｍｕｓｅ細胞は、腫瘍化しないため、生体組織から回収した細胞が未分化のまま含まれていても癌化の可能性が低く安全である。また、回収したＭｕｓｅ細胞の培養は、特に限定されないが、通常の増殖培地（例えば、１０％仔牛血清を含むα－最少必須培地（α－ＭＥＭ））において行うことができる。より詳しくは、上記国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレットを参照して、Ｍｕｓｅ細胞の培養及び増殖において、適宜、培地、添加物（例えば、抗生物質、血清）等を選択し、所定濃度のＭｕｓｅ細胞を含む溶液を調製することができる。ヒト対象に本発明の細胞製剤を投与する場合には、ヒトの腸骨から数ｍｌ程度の骨髄液を採取し、例えば、骨髄液からの接着細胞として骨髄間葉系幹細胞を培養して有効な治療量のＭｕｓｅ細胞を分離できる細胞量に達するまで増やした後、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ－３の抗原マーカーを指標として分離し、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。あるいは、例えば、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ－３の抗原マーカーを指標として分離後、有効な治療量に達するまで細胞を培養して増やした後、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。
　また、Ｍｕｓｅ細胞の細胞製剤への使用においては、該細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等を細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）や間葉系幹細胞に含まれるＭｕｓｅ細胞以外の細胞又は成分を細胞製剤に含有させてもよい。当業者は、これら因子及び薬剤を適切な濃度で細胞製剤に添加することができる。このように、Ｍｕｓｅ細胞は、各種添加物を含む医薬組成物として使用することも可能である。
　上記で調製される細胞製剤又は医薬組成物中に含有するＭｕｓｅ細胞数は、運動ニューロン疾患における所望の効果（例えば、筋力の増加、筋萎縮の進行の抑制など）が得られるように、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、適宜、調整することができる。なお、対象とする個体はヒトなどの哺乳動物を含むがこれに限定されない。また、本発明の細胞製剤は、単回投与でもよいが、所望の治療効果が得られるまで、複数回（例えば、２～１０回、又は、それ以上）、適宜、間隔（例えば、１日に２回、１日に１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、６カ月に１回など）をおいて投与されてもよい。投与の時期は、治療効果が得られる限り、発症初期、中期、後期のいずれでもよい。
　治療上有効量としては、対象の状態にもよるが、例えば、一個体あたり一回につき１×１０３細胞～１×１０１１細胞、好ましくは１×１０４細胞～１×１０１０細胞、さらに好ましくは１×１０５細胞～１×１０９細胞などが挙げられる。また、本発明の細胞製剤は、特に限定されないが、脳（脳幹、大脳皮質）又は脊髄に直接に投与されてもよく、また、静脈内に投与されてもよい。また、実施例等から、特に、静脈内投与することも好ましい態様となる。
　本発明の細胞製剤及び医薬組成物には、ヒト由来のＭｕｓｅ細胞を使用し得るが、投与される対象が該細胞と異種の関係にある対象（例えば、マウス、ラット）には、異種細胞の生体内で拒絶反応を抑制するために、異種細胞の投与前又は同時に免疫抑制剤（シクロスポリンなど）が投与し得る。なお、本発明によれば、本発明の細胞製剤及び医薬組成物を運動ニューロン疾患の治療等に適用する場合において、このような免疫抑制剤を併用してもよく又は併用しなくてもよい。また、本発明の細胞製剤及び医薬組成物を患者に投与する場合、特に、免疫抑制剤を併用しないことも好ましい態様となる。
３．Ｍｕｓｅ細胞による治療効果
　本発明の実施形態では、本発明の細胞製剤及び医薬組成物は、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）の治療し、予防し、軽減し及び／又は発症を遅延させることができる。より具体的には、本発明により、運動ニューロン疾患に起因する体幹や四肢の筋力を回復し、又は筋萎縮の進行を抑制することができる。ここで、「治療」とは、ＭＮＤに起因する各種の症状を抑制すること又は完全に消失させることをいう。また、「軽減」とは、ＭＮＤに起因する各種の症状の緩和及び進行の抑制を意味し、好ましくは、日常生活に差し支えない程度にまでに症状を緩和することを意味する。この「軽減」なる用語には、「症状の遅延」の意味も含み得る。
　本明細書では、以下の実施例に示されるように、ＡＬＳモデル　変異ＳОＤ１（Ｇ９３Ａ）Ｔｇマウス、又は、ＴＤＰ－４３　Ｔｇマウスを用いて、マウスの運動能力を測定することにより、本発明の細胞製剤又は医薬組成物の有効性を評価することができる。評価法には、限定されないが、ハンギングワイヤ試験、ロータロッド、クラスピング、グリップストレングス試験、ビームバランス試験など、一般に使用される方法が採用され得る。
　以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
　本研究の動物実験は全て岡山大学動物実験委員会（ＯＫＵ－２０１９２８９）の承認を受け、岡山大学動物実験指針に準拠して実施した。
材料及び方法
動物及び実験群
　Ｇ９３ＡヒトＳＯＤ１変異（Ｇ１Ｈ／＋）を有するトランスジェニック（Ｔｇ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）［２］から入手し、Ｔｇ雄とＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌を交配することによりヘミ接合体として維持した。静脈内（ｉ．ｖ．）注射と髄腔内（ｉ．ｔ．）注射の比較実験では、各群３匹を使用し、ナノ・ランタンを用いたエクスビボイメージングでは、２匹の動物を使用し、媒体、ＭＳＣ及びＭｕｓｅ細胞を使用した。静脈内注射による処置効果の評価には、媒体群で１０匹（雄５匹及び雌５匹）、ＭＳＣ群で９匹（雄４匹及び雌５匹）、Ｍｕｓｅ細胞群で９匹（雄５匹及び雌４匹）を用いた。
ＧＦＰ標識されたＭＳＣ及びＭｕｓｅ細胞の調製
　ＧＦＰ標識されたＭＳＣは、以前に報告されているように［２２］、ヒト骨髄－ＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をレンチウイルスＧＦＰで標識することによって調製した。報告されるように［１０、１１］、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によりＧＦＰ－ＭＳＣからＳＳＥＡ－３陽性細胞としてＧＦＰ標識されたＭｕｓｅ細胞を単離した。上記ＧＦＰ－ＭＳＣ及びＭｕｓｅ細胞を、Ｂｅｉｓｓｅｌ凍結コンテナ（Ｎｉｈｏｎ　Ｆｒｅｅｚｅｒ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）中で凍結し、使用するまで液体窒素中に保持した。
注射経路のためのインビボ比較細胞移植
　２５０μｌのＨａｎｋ平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、ｐＨ７．４）中の上記ＧＦＰ標識されたＭｕｓｅ細胞（２．０×１０５個）を、以前に報告されるように［２３、２４］、ｉ．ｖ．用の尾静脈、又は髄腔内注射用の大槽に注入した。７日目に、全ての動物を屠殺した。
ナノ・ランタンを用いたエクスビボ動態
　生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）効力を有するナノ・ランタン標識は、少数の移植細胞でさえも検出が可能な明るい発光タンパク質である［２５］。ヒト骨髄－ＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ）を、以前に報告されるように［２５］、ナノ・ランタンで標識した［２５］。ナノ・ランタン標識されたＭｕｓｅ細胞をＦＡＣＳによりＳＳＥＡ－３陽性細胞としてナノ・ランタン標識されたＭＳＣから単離した。ｉ．ｖ．注射のエクスビボ動態のために、媒体（ＨＢＳＳ）、ナノ・ランタン標識されたＭＳＣ及びＭｕｓｅ細胞（１．０×１０５細胞／２５０μｌ）を１４週齢で静脈内注射した。７日後、動物を深麻酔下で屠殺し、以前に報告されるように分析した［２６］。
治療効果の評価
　溶媒、ＧＦＰ－ＭＳＣ及びＧＦＰ－Ｍｕｓｅ細胞（両方とも５．０×１０４細胞／２５０μｌ）を各動物の尾静脈に１分間にわたって注射した。本発明者ら及び他のグループは、Ｇ９３Ａ　Ｔｇマウスが約５６日齢で早期発症を示すことが報告されている［２７］ことを確認したため、本発明者らは５６日齢で細胞投与を開始し、同数の細胞を用いて１１９日目（計１０回の注射）まで週１回投与（計１０回の注射）を継続することを決定した。免疫抑制剤であるシクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ／日、Ｎｏｖａｒｔｉｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）もまた、媒体、ＭＳＣ、又はＭｕｓｅ細胞群での投与直後に、屠殺まで隔日に全ての動物に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与された。生存を毎日チェックし、体重（ＢＷ）とロータロッドスコアを５６日齢から週２回測定した。本発明者らの以前の方法［２４、２８］に従って、ロータロッド試験及び車輪走行活動を行った。ハンギングワイヤ試験は、以前に報告されるように、週１回、筋力及び協調運動の測定として評価された［２９］。精密ばねスケール（Ｏｏｂａ　Ｋｅｉｋｉ　Ｃｏ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて、下肢の筋力を週１回測定した。
免疫組織学的分析
　マウスが片側に倒れてから１５秒以内に立ち上がれない状態になった時点で安楽死させ、死亡時点として記録した。各動物にペントバルビタール（２０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して深麻酔し、既報のようにサンプリングを行った［２６］。使用した一次抗体は、ヤギ抗ＧＦＰ抗体（１：５００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）；ウサギ抗ＧＦＰ抗体（１：５００、ＭＢＬ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＵＳＡ）；ウサギ抗Ｉｂａ１抗体（１：５００、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）；マウス鵜抗βＩＩＩチューブリン（Ｔｕｊ１）抗体（１：１００、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ウサギ抗グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体（１：５００、Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）；抗ＮｅｕＮ抗体（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）；ヤギ抗小胞アセチルコリントランスポーター（ＶＡＣｈＴ）抗体（１：２００、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｃｔｉｆｉｃ）であった。使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ　４８８又は５４６でコンジュゲートした抗ヤギ、ウサギ又はマウスＩｇＧ（１：５００、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）のいずれかであった。Ａｌｅｘａ　５９４（１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でコンジュゲートしたα－ブンガロトキシンもまた、アセチルコリン受容体を検出するために使用された。
　細胞型マーカー／ＧＦＰ二重標識に関して、軟膜から前角までの５～６領域を無作為に選択し、分析した。Ｌ４～５のニッスル染色された運動ニューロンを各腰髄からの５つの横断切片を用いてカウントした［３０］。中心管から脊髄を横切る側線下の両前角に明瞭な核小体を有する２０μｍを超える細胞を運動ニューロンとしてカウントした［３１］。除神経のために、各マウスからの約１００個の神経筋接合部（ＮＭＪ）を分析した。筋線維の大きさについて、１匹のマウスあたり３つのヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）染色された前脛骨筋切片から約１８０個の筋線維を処置条件に盲検化された研究者によって分析した。
統計解析
　研究者は、データ収集と分析の間、実験群に対して盲検化された。本研究の所見を裏付けるデータは、合理的な要請があれば、担当者から入手することができる。データは、ＳＰＳＳバージョン２２．０．０．０（ＩＢＭ　Ｃｏｒｐ．、Ａｒｍｏｎｋ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）で分析し、平均値±ＳＤで表した。治療効果は、非反復測定の分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びＤｕｎｎｅｔｔ’ｔ検定によって評価された。免疫組織学的データをＫｒｕｓｋａｌｌ－Ｗａｌｌｉｓを用いて分析し、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を伴うＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ検定を行った。すべての統計解析において、有意性はｐ＜０．０５であるとみなした。
結果
　投与経路を決定するために、ＧＦＰ－Ｍｕｓｅ細胞のホーミングを７日目にＧ９３Ａマウス脊髄の免疫組織学的分析によりｉ．ｖ．注射とｉ．ｔ．注射で比較した。予備研究は、ＧＦＰ－Ｍｕｓｅ細胞数がｉ．ｔ．注射群では頸部、胸部及び腰髄で一貫して低く又は無視することができたが、一方、ｉ．ｖ．注射群ではｉ．ｔ．注射群と比較して頚部及び腰髄で高く、ＧＦＰ－Ｍｕｓｅ細胞は主に軟膜及び下部白質に位置することが示された。ＧＦＰ－Ｍｕｓｅ細胞は、ｉ．ｖ．注射によっても胸髄ではほとんど検出されなかった（表１、図１ａ、ｂ）。したがって、以下の実験では、ｉ．ｖ．注射を投与経路として選択した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ｉ．ｖ．後のＭＳＣ及びＭｕｓｅ細胞のインビボ動態を調べるために、ナノ・ランタン標識細胞を用いた。ＭＳＣ群では、７日目では、肺で強いシグナルが検出され、大腿骨で微量シグナルが検出されたが、脳、頸髄及び腰髄を含む他の器官ではシグナルが検出されなかった。Ｍｕｓｅ群では、シグナルは、頸髄及び腰髄（図１ｃ、右上段）、ならびに肺において検出され、一方、脳では検出されなかった（図１ｃ、中段）。大腿骨のシグナルはＭＳＣ群よりＭｕｓｅ群において高かった。免疫組織学的分析により、肺血管内腔及び骨髄にナノ・ランタン－Ｍｕｓｅ細胞が存在することが確認された（図１ｄ）。このシグナルは、媒体群で検査したすべての器官で一貫して検出限界以下であった（図１ｃ）。
　平均生存時間は３群で有意差を示さなかった（媒体；１４４．４±８．０日、ＭＳＣ；１４３．９±６．９日、Ｍｕｓｅ細胞；１４２．６±６．７日）。また、体重は、３群で全期間にわたって統計学的な差は認められなかった（図２ａ）。対照的に、ロータロッド試験は、６７日目及び７０日目にＭｕｓｅ群で軽減が認められ、媒体群で統計的有意性が認められた（図２ｂ）。さらに、８４、１１２、及び１３３日目のハンギングワイヤスコア、ならびに１２６日目及び１４０日目の下肢の筋力もまた、媒体群と比較してＭｕｓｅ細胞群においてのみ有意に改善した（図２ｃ、ｄ）。
　腰髄では、ＧＦＰ陽性細胞は媒体群では検出することができなかったが（図２ｅ）、ＭＳＣ群では少数のＧＦＰ陽性細胞が観察された（図２ｆ）。Ｍｕｓｅ細胞群では、ＧＦＰ陽性細胞が、脊髄軟膜（図２ｇ、実線の囲み）、下部白質、前角（図２ｇ、点線の囲み、２ｈ）に認められ、これらの細胞の８５．７％（２０１個のＧＦＰ陽性細胞のうち１８０個）が軟膜（図２ｉ）と前角（図２ｊ）の両方に位置する星状細胞マーカーＧＦＡＰを共発現した。残りのＧＦＰ陽性細胞（１４．３％）は、ミクログリアマーカーＩｂａ－１（図２ｋ、０／１２０ＧＦＰ陽性細胞）、ニューロンマーカーＴｕｊ１（図２ｌ、０／９７ＧＦＰ陽性細胞）及びＮｅｕＮ（図２ｍ、０／１０９ＧＦＰ陽性細胞）に対していずれの陽性も示さなかったことから、ｉ．ｖ．注射されたＭｕｓｅ細胞の大部分は、腰髄にホーミングした後、主に星状細胞系統の細胞に自然分化したことが示唆された。
　野生型（ＷＴ）群と比較した場合、前角の生存運動ニューロンの数は、媒体、ＭＳＣ及びＭｕｓｅ群で有意に低かった（ＷＴ、図３ａ、ｂ、＊ｐ＜０．０５）。しかしながら、Ｍｕｓｅ群は媒体群と比較して運動ニューロン数が多く、統計的に有意であった（図３ａ、ｂ、＃ｐ＜０．０５）。媒体群とＭＳＣ群の間に統計的有意性は認められなかった（図３ａ、ｂ）。
　前脛骨筋では、神経支配されたシナプスの数は、ＷＴと比較して、媒体、ＭＳＣ及びＭｕｓｅ細胞群で有意に減少し（図３ｃ、ｄ、＊ｐ＜０．０５）、Ｍｕｓｅ細胞群では媒体群と比較して統計的有意に回復した（図３ｃ、ｄ、＃ｐ＜０．０５）。筋線維サイズ分析は、媒体群及びＭＳＣ群において重度の神経原性筋線維萎縮を示し、これは、媒体群（＊ｐ＜０．０５）とＭＳＣ群（＃ｐ＜０．０５）の両方において統計的有意性でＭｕｓｅ細胞群において改善された（図３ｅ、ｆ）。
考察
　本研究は、ＡＬＳモデルＧ９３Ａ　Ｔｇマウスにおいて、Ｍｕｓｅ細胞の多重静脈内投与がロータロッド、ハンギングワイヤ及び下肢の筋力を改善することを示した最初の報告である。ｉ．ｖ．注射したＭｕｓｅ細胞は、腰髄、肺及び骨にホーミングした（図１ｃ、ｄ）。腰髄では、ＧＦＰ陽性Ｍｕｓｅ細胞は、主にアストログリアマーカーＧＦＡＰを発現し、末期にグリア様形態を示した（１５４日齢、図２ｇ～ｊ）。さらに、腰髄における生存運動ニューロンの数は、媒体群に比べて統計的有意に多かった（図３ａ、ｂ）。これは、下肢筋肉の除神経と筋線維萎縮の両方の軽減をもたらした可能性がある（図３ｃ～ｆ）。
　ＡＬＳモデルマウスでは、Ｍｕｓｅ細胞を重要な治療標的である脊髄に送達させる点で、ｉ．ｖ．注射はｉ．ｔ．注射よりも優れていた（表１、図１ａ、ｂ）。ｉ．ｖ．投与は、アクセスが容易であり、侵襲性が低く、さらに患者への負担が少ないため、ｉ．ｔ．投与よりも優れた利点がある。これにより、ＡＬＳ患者へのＭｕｓｅ細胞の反復投与を可能にする。最近の研究は、スフィンゴシン－１－リン酸受容体２（Ｓ１ＰＲ２）を発現するＭｕｓｅ細胞が、損傷細胞によって産生されたスフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）を感知することにより、損傷部位に特異的にホーミングすることができることを示した［１８］。Ｓ１Ｐは、細胞膜の構成成分の一つであるスフィンゴシンのリン酸化によって産生されるため、すべての臓器に共通する一般的な損傷シグナルである。したがって、Ｍｕｓｅ細胞はｉ．ｖ．注射によりＡＬＳマウスの脊髄に到達することができる。
　ナノ・ランタンイメージングは、ＭＳＣよりもむしろ、大腿骨においてＭｕｓｅ細胞の強いシグナルを示した（図１ｃ）。ＡＬＳでは骨髄異常が報告されている［３２］。したがって、Ｍｕｓｅ細胞は、病変依存的に大腿骨骨髄及び脊髄に選択的かつ能動的に蓄積し、肺毛細血管における受動的な閉じ込めとは対照的であった。別の興味深い点は、ｉ．ｖ．注射されたＭｕｓｅ細胞が脊髄軟膜、下部白質、腹角に移動したことであり（図２ｇ～ｊ）、軟膜穿孔動脈を介してＭｕｓｅ細胞が脊髄にホーミングすることを示唆している。一方、ｉ．ｔ．注射されたＭｕｓｅ細胞は、脊髄ではほとんど検出されなかった（図１ａ、ｂ）。これらの結果から、Ｍｕｓｅ細胞のホーミング因子は、主に脊髄くも膜下腔に傍分泌されるのではなく、循環系に内分泌されることが示唆された［３２～３５］。
　動物疾患モデルでは、ｉ．ｖ．注射されたＭｕｓｅ細胞は、損傷組織に特異的にホーミングした後、組織構成細胞に自然分化した；すなわち、脳卒中モデルでは神経細胞と乏突起膠細胞に分化した［１６］。脳卒中とは対照的に、ＡＬＳは慢性かつ進行性であり、病態は脳卒中とは全く異なる。ｉ．ｖ．注射されたＭｕｓｅ細胞は、ＡＬＳマウスの脊髄においてニューロン系列ではなく、主にアストログリア系列に分化した。反応性星状細胞はＡＬＳの重要な治療標的である［３６］。Ｍｕｓｅ細胞は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内細胞増殖長因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及びアンジオポイエチン－１（Ａｎｇ１）［１７～１９］などの種々の神経栄養因子を産生する。したがって、これらは運動ニューロン及び星状細胞に有益な因子を供給し、ＡＬＳモデルにおける筋線維萎縮を予防する可能性がある。さらに、急性心筋梗塞、脳卒中、脊髄損傷、表皮水疱症、及び新生児脳性麻痺の臨床試験は、現在、ＨＬＡ適合性を必要とせず、長期免疫抑制薬を用いないで、ドナーＭｕｓｅ細胞の点滴によって全て行われている。急性心筋梗塞の臨床試験では、安全性と著明な心機能回復が報告されている［２１］。
　全体として、本研究は、Ｍｕｓｅ細胞の全身投与がＡＬＳマウスモデルに対して有意な臨床的利益を示し、ｉ．ｖ．注射したＭｕｓｅ細胞が脊髄に優先的に移動し、アストログリアを供給し、運動ニューロン生存を支持して、筋線維萎縮を抑制したことを初めて成功へと導いた。Ｍｕｓｅ細胞は、ＡＬＳ患者の治療のための有望な細胞資源となり得る。
１．研究目的
　本研究の目的は、ＴＤＰ－４３　Ｔｇマウスの運動機能に対するＭｕｓｅ細胞の効果を評価することである。
２．試験システム及びその妥当性
　筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、脳と脊髄の運動ニューロンの変性を特徴とする神経変性疾患である。ヒトトランスアクティブ応答（ＴＡＲ）ＤＮＡ結合タンパク質４３ｋＤａ（ＴＤＰ－４３）と呼ばれるユビキチン化タンパク質がＡＬＳの病因において中心的役割を果たすという証拠がある。ＴＤＰ－４３　Ｔｇマウスは、ＴＤＰ－４３産生及び細胞内沈着を研究するための適切なモデルである。ＡＬＳの臨床的特徴を模倣したこのモデルは、ＡＬＳに対する薬物の効果を試験するのに有用である。提案された研究では、ヒト野生型ＴＤＰ－４３（ｈＴＤＰ－４３）を過剰発現し、ニューロンマウスＴｈｙ－１プロモーターの制御下にあるマウスを使用する。ホモ接合マウスでは、ヒトＴＤＰ－４３タンパク質は、非トランスジェニック同腹仔における内因性タンパク質よりも３．８倍高い。
３．ヒトＭｕｓｅ細胞の調製
　ＷＯ２０１１／００７９００に記載されている方法に従って、ヒトＭｕｓｅ細胞の単離及び同定を行った。より具体的には、ストレス条件下での間葉系幹細胞の拡大濃縮培養によって、Ｍｕｓｅ細胞を得た。動物には、２×１０６生存細胞／ｍｌ作用液の５ｍｌ／ｋｇを投与した。
４．媒体
　ハンクス平衡塩類溶液、カルシウム不含、マグネシウム不含、フェノールレッド不含（ＨＢＳＳ；Ｇｉｂｃｏ　１４１７５－０４６）を媒体として使用した。
５．動物の管理
５－１．飼育設備
　Ｒｅｔｔｅｎｍａｉｅｒから供給された標準的なげっ歯類用床敷を用いて、個別換気ケージに動物を収容した。同群の最大５匹を１ケージに収容した。室温を約２１℃に維持し、相対湿度を４０～７０％に維持した。動物は一定の明暗周期（１２時間／１２時間）で飼育した。動物には、乾燥したペレット状の標準げっ歯類用飼料（アルトロミン）と、通常の水道水を自由に摂取させた。
５－２．環境エンリッチメント
　最初の処置の開始時から、マウスイグルー及びＦＡＳＴ　Ｔｒａｃ（ＰＬＥＸＸ由来）を環境エンリッチメントとして用いて、全ての動物を飼育した。
５－３．識別
　動物には古典的なイヤーパンチ法により連続的に番号を付けた。各ケージは、試験番号、性別、個体登録番号（ＩＲＮ）、生年月日、遺伝子型決定日、投与群割り付けを示すカラーカードで識別した。
　各動物の遺伝子型は、トランスジェニック構築物に特異的なポリメラーゼ連鎖反応により決定した。各マウスは、試験開始前に、動物の同定のためにイヤーパンチ採取した耳組織から単離したＤＮＡを用いて遺伝子型決定を行った。
５－４．群割り当て
　健康状態が明らかに良好な動物のみを対象とした。全ての動物を（全群及びコホートの平均体重及び性別が十分に分布していることを考慮して）全投与群の動物からなるコホートに無作為に割り付けた。最初のコホートの動物数は、同年齢及び均一な取扱いを確保するために制限した。
５－５．健康状態及びケージ側観察
　試験に割り付ける前に、各個体の健康状態を評価した。試験期間中、ケージ外側からの特筆すべき観察結果を記録し、その後の処置（安楽死など）を決定した。
　全ての動物の体重を週１回記録した。動物が重い運動機能不全症状を示し、もはや食物／水ボトルに到達することができなくなった場合、マウスがケージの底部にある食餌ペレットと水にアクセスすることができるようにした。また、キャップが長い飲用ボトルも使用した。
５－６．早期死亡動物の取扱い
　早期に死亡した動物（ＩＲＮ　５９２１）を剖検した。死亡率は、これ以外の安楽処置動物、又は早期に死亡した動物がいなかったため評価しなかった。
６．材料及び方法
　１５匹ずつ３群に分けた４５匹のホモ接合ＴＤＰ－４３　Ｔｇマウス、及び８週齢の１５匹の非トランスジェニック同腹仔群を本研究に用いた。動物には、Ｍｕｓｅ細胞又は媒体のいずれかを静脈内（ｉ．ｖ．）投与により２回投与した。
　ベースライン試験として、反射試験及びハンギングワイヤを含む改変Ｉｒｗｉｎ試験を全ての動物に１回実施した。運動協調性ハンギングワイヤを試験期間中（計６回）、ロータロッドを２回（ベースライン時及び試験終了時）、クラスピング行動を２回（ベースライン時及び試験終了時）隔週で評価した。
　試験終了時、ペントバルビタールの腹腔内注射により全動物を安楽死させた。生理食塩水による経心臓潅流後、脳を取り出し、左右の半脳に分離した。左半脳を海馬及びそれ以外の部分に分け、タンパク質発現解析のためにドライアイス上で凍結し、右半脳を４％ＰＦＡ中で後固定し、免疫組織学的評価のために凍結保存した。また、脊髄を採取し、ｎ＝７をドライアイス上で凍結し、残りのｎ＝８の脊髄を固定し、免疫組織学的評価のために処理した。
６－１．動物
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
６－２．処置
　本研究では、１５匹ずつ３群に分けた４５匹のホモ接合ＴＤＰ－４３　Ｔｇマウスと、８週齢の１５匹の非トランスジェニック同腹仔群を非疾患対照として用いた。１２週間の試験では、各動物に、Ｍｕｓｅ細胞と媒体、媒体とＭｕｓｅ細胞、又は媒体と媒体のいずれかをそれぞれ１週目及び８週目に２回静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。すなわち、Ｍｕｓｅ細胞は第１週（Ａ群）又は第８週（Ｂ群）のいずれかで１回のみ投与された。以下の群を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
６－３．行動
　ベースライン試験として、反射試験及びハンギングワイヤを含む改変Ｉｒｗｉｎ試験を全ての動物に１回実施した。運動協調性ハンギングワイヤを試験期間中（計６回）、ロータロッドを２回（ベースライン時及び試験終了時）、クラスピング行動を２回（ベースライン時及び試験終了時）隔週で評価した。試験は無作為に実施した。
（１）ハンギングワイヤ試験
　ハンギングワイヤ試験は、運動強度の神経筋異常を評価する試験であり、試験期間中（投与２週目から開始する）及びＩｒｗｉｎ試験の一環として（ベースライン時の行動として）隔週に実施した。この試験では、マウスがエッジから外れるのを防ぐために、ダクトテープを周囲に配置したワイヤケージ蓋を使用した。動物をケージ蓋の上部に置いた。蓋を３回軽く振り、マウスに強制的にワイヤを握らせた後、上下反転させた。蓋は、マウスが飛び降りるのを防ぐのに十分な高さであるが、落ちた場合に危害を与えるほどの高さではない、柔らかい下敷きの上方約５５～６０ｃｍの高さに保持した。落下までの潜伏時間を定量化した。３００秒のカットオフ時間を使用した。正常なマウスは数分間、逆さまの状態でぶら下がることがある。
（２）ロータロッド試験
　試験開始時（ベースライン時）及び試験終了時にロータロッド試験を２回実施した。この試験では、動物を一定速度又は加速速度で走行する回転ロッド（４レーンのロータロッド；Ｕｇｏ　Ｂａｓｉｌｅ）上に置くことによって運動協調性を評価する。マウスがバランスを失い、下にあるプラットフォームに落下した場合、赤は自動的に停止し、落下速度と同様に落下潜時の測定値を記録した。
　最初の試験セッションに先立ち、マウスを試験システムに慣らし、約１分間、２ｒｐｍの一定速度でロッド上に留まることができるようにした。試験中、１匹の動物を１８０秒間、試験のために装置に３回曝露した。初期速度は１８０秒の加速時間で２ｒｐｍから２０ｒｐｍに増加した。マウスが落下した場合、セッションは終了し、Ｕｇｏ　Ｂａｓｉｌｅ　Ｐｒｏｇｒａｍはタイマーを停止した。
（３）クラスピング試験
　クラスピング行動は試験開始時（ベースライン）及び試験終了時に２回評価した。
　４点：マウスを尾で懸垂させたときに、外側正中線から離れる方向に後肢が完全に伸長する状態になりこれを２秒間保持できる。数秒間、２～３回懸垂したとき、マウスは懸垂中に少なくとも２回、両後肢で動きを示す。
　３点：尾懸垂時に、外側正中線に向かっての脚伸長が屈折するか若しくは部分的に屈折する状態、又は後肢が震える状態。
　２点：３０ｃｍ（１２インチ）の歩行中に少なくとも２回、つま先が下方に曲がるか、又は足のいずれかの部分をケージの底部／テーブルに沿って引きずっている状態。
　１点：硬質麻痺又は最小限の関節の動きであり、足が前進運動に使用されていない。
　０点：マウスは、片側に倒れて、（１５～）３０秒以内に起き上がることができない。
６－４．組織のサンプリング及び処理
　試験終了時、全動物をペントバルビタール注射（６００ｍｇ／ｋｇ）で安楽死させ、半脳及び脊髄を採取した。
（１）潅流
　マウスを経心臓的に０．９％生理食塩水で潅流した。この目的のために、０．９％生理食塩水ボトルに接続した２３ゲージ針を左心室に挿入した。右心室をハサミで開放した。溶液ボトルを圧力計制御空気圧縮機に接続することにより、潅流溶液上に１００～１２０ｍｍ　Ｈｇの一定圧力を維持した。灌流は、肝臓が青白くなり、血液の代わりに灌流液のみが右心室から出るまで継続した。
（２）脳サンプリング
　潅流後、頭蓋骨を開き、その後、脳を慎重に除去し、冷却した表面上で片側を切断した。右半脳を、室温で２時間、新しく調製した４％パラホルムアルデヒド／ＰＢ（ｐＨ＝７．４）に浸漬することにより固定した。左半脳をさらに海馬とそれ以外の部分に分けた。全ての部品を秤量し、ドライアイス上でスナップ凍結し、－８０℃で保存した。
　（３）脊髄サンプリング
免疫組織学的検査（群あたりｎ＝８）
　免疫組織学的分析のために、脊柱を動物から切開し、後に浸漬固定を容易にするために筋肉組織の多くを除去した。頸部、胸部及び腰部を含む脊柱全体を、新たに調製した４％パラホルムアルデヒド／ＰＢを含む１５ｍｌのチューブに、固定のために直立位置で移した。脊柱を４℃で２４時間固定した。
タンパク質発現解析（群あたりｎ＝７）
　ウエスタンブロット法によるタンパク質発現解析のために、脊柱を動物から切開し、脊髄を除去し、秤量し、ドライアイス上で凍結し、－８０℃で保存した。
６－５．免疫組織学的分析
（１）組織の調製
　右半脳（群あたりｎ＝１５）を室温で２時間、リン酸緩衝液（ＰＢ；ｐＨ７．４）中に新しく調製した４％パラホルムアルデヒド中に浸漬することにより固定した。次に、凍結保護のために、試料を１５％ショ糖－ＰＢＳ溶液に一晩かけて移した。その後、組織ブロックを必要に応じてトリミングし、クライオモールドに移し、ＯＣＴ培地に包埋し、次に、ドライアイス冷却液体イソペンタン中でスナップ凍結し、切片化するまで超深冷凍庫（－８０℃目標温度に設定）に保存した。
　全脊柱（群あたりｎ＝８）を４℃で２４時間、ＰＢ（ｐＨ７．４）中に新しく調製した４％パラホルムアルデヒド中に浸漬することにより固定した。翌日、脊髄を固定した脊柱から切開し、凍結保護のために１５％ショ糖－ＰＢＳ溶液に一晩かけて移した。その後、組織ブロックを８片に切断し、組織アレイとしてクライオモールドに配置し、ＯＣＴ培地に包埋した。次に、試料をドライアイス冷却液体イソペンタン中でスナップ凍結し、切片化するまで超深冷凍庫（－８０℃目標温度に設定）に保存した。
　（２）切片化
右半脳（群あたりｎ＝８）
　１２の中外側レベルからの５つの凍結切片（合計６０切片）を、Ｌｅｉｃａクライオトーム上で１０μｍ厚で矢状に切断した。次の２３切片をレベルごとに廃棄した。Ｐａｘｉｎｏｓ　ａｎｄ　Ｆｒａｎｋｌｉｎ（「Ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｂｒａｉｎ　ｉｎ　Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ　Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ」（第２版）２００１年）に従って切片化レベルを選択した。切片の採取は、標的領域を通した系統的なランダムサンプリングを確実にするために、正中線から外側約０．２ｍｍのレベルで開始し、半球を通して行った（図４）。ディープフリーザー（目標温度設定－２０℃）に切片を保管した。
脊髄組織アレイ（群あたりｎ＝８）
　脊髄組織アレイからの５つの凍結切片をＬｅｉｃａクライオトーム上で１０μｍ厚で切断した。次の１５切片を廃棄した。この回収スキームを５レベル（計３０切片）で繰り返した。その結果、頸部、胸部、腰部、仙骨の各部位から切片を採取し、脊髄を通して系統的に無作為にサンプリングすることができた（図５）。ディープフリーザー（目標温度設定－２０℃）に切片を保管した。
（３）免疫組織学的検査
実験Ｉ－ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、及びｈＴＤＰ－４３
　実験Ｉでは、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ニューロン核（ＮｅｕＮ）及びｈＴＤＰ－４３をマウス脳（Ｌ２、Ｌ４、Ｌ６、Ｌ８及びＬ１０の１切片；合計ｎ＝１６０切片）あたり５切片の均一系統的ランダムセット、及び脊髄組織アレイのレベル３の１切片（合計ｎ＝３２切片）で評価した。
実験ＩＩ－ＭＢＰ、Ｉｂａ１、ＭＡＰ－２
　実験ＩＩでは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ１）及び微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ－２）をマウス脳あたり５つの断片（Ｌ２、Ｌ４、Ｌ６、Ｌ８及びＬ１０の１断片；合計ｎ＝１６０断片）の均一系統的無作為セット、及び脊髄組織アレイのレベル３の１断片（合計ｎ＝３２断片）で評価した。
（４）イメージング
　免疫蛍光染色切片の全スライドスキャンをＺｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｃａｍ　５０６モノ及び日立３ＣＣＤ　ＨＶ－Ｆ２０２ＳＣＬカメラ及びＺｅｉｓｓ　ＺＥＮ　２．３ソフトウェアを備えた、高開口レンズを有するＺｅｉｓｓ自動顕微鏡ＡｘｉｏＳｃａｎ　Ｚ１上に記録した。
　実験Ｉ及びＩＩの免疫蛍光標識組織切片を定量的画像解析により分析した。画像解析はＩｍａｇｅ　Ｐｒｏ　１０（Ｍｅｄｉａ　Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）で行った。最初に、画像上の対象領域（ＲＯＩ）を描くことにより、標的領域（右半脳：皮質及び脳幹；脊髄：頸髄、胸髄及び腰髄の左右腹角）を同定した。追加のＲＯＩは、シワ、気泡、又は測定を妨げる他のアーチファクトを除外する。その後、以下のシグナルを、同定された区域内で定量的に評価した。
　●ＧＦＡＰ、
　●Ｉｂａ１、
　●ｈＴＤＰ－４３、
　●ＭＢＰ、
　●ＭＡＰ２、
　●ＮｅｕＮ
　定量化には、Ｅｄｇｅ　Ｐｌｕｓフィルタリングを使用してバックグラウンド補正を行った。次に、ＧＦＡＰ、Ｉｂａ１、ｈＴＤＰ－４３、及びＮｅｕＮの場合と同様に、さらなる形態学的フィルタリング（サイズ、形状）を用いて、適切な閾値化によって、免疫反応性物体を検出した。
　次に、読み出しとして、異なる物体の特徴をそれらの間で定量化した。
　●免疫反応領域［％］：閾値以上の物体（例えば、細胞体細胞）によってカバーされるＲＯＩのパーセンテージ；これは、免疫反応性に全体的な差があるかどうかを示す最も包括的なパラメータである。
　●物体密度［物体の数／ｍｍ２］：標的領域の大きさに規格化された閾値を超える物体の数。これは、免疫反応性物体の密度の変化を検出するのに特に有効である。
　●物体強度［ａ．ｕ．］：閾値を超える免疫反応性物体の画素の平均輝度；これは標的タンパク質の細胞発現レベルに差があるかどうかを示す。
　●物体の大きさ［μｍ２］：閾値以上の免疫反応性物体の大きさ；これは免疫反応性物体の大きさの変化を検出するのに特に役立つ。
　●ＲＯＩ強度［ａ．ｕ．］：ＲＯＩ内の画素の平均輝度；これは、免疫蛍光シグナルに全体的な差があるかどうかを示す。
　標的物体のパラメータがテスト回で定義されると、定量的画像解析は自動的に実行され、結果はオペレータに依存せず、完全に再現可能である。
　調査したＲＯＩの領域サイズに加えて、それぞれの読み出し（脳及び脊髄領域）について以下のデータを提供した。
　●ＧＦＡＰ：平均物体サイズ［μｍ２］、平均物体強度［ａ．ｕ．］、物体密度［ｎ／ｍｍ２］、免疫活性領域［％］
　●Ｉｂａ１：平均物体サイズ［μｍ２］、平均物体強度［ａ．ｕ．］、物体密度［ｎ／ｍｍ２］、免疫活性領域［％］
　●ｈＴＤＰ－４３：平均物体サイズ［μｍ２］、平均物体強度［ａ．ｕ．］、物体密度［ｎ／ｍｍ２］、免疫活性領域［％］
　●ＭＢＰ：ＲＯＩの平均値［ａ．ｕ．］、免疫反応領域［％］
　●ＭＡＰ２：ＲＯＩの平均値［ａ．ｕ．］、免疫反応領域［％］
　●ＮｅｕＮ：平均物体サイズ［μｍ２］、平均物体強度［ａ．ｕ．］、物体密度［ｎ／ｍｍ２］、免疫活性領域［％］
６－６．タンパク質発現解析
（１）試料調製
　凍結された固定されていない組織試料（群あたり１５匹の全動物の海馬及び群あたり７匹の脊髄）を重量あたり５容量のＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ－４０又は０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、２％ＳＤＳ、１μＭのＮａＦ、０．２ｍＭデオキシコール酸ナトリウム、８０μＭグリセロリン酸１×プロテアーゼ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１×ホスファターゼ阻害剤）中でホモジナイズした。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイにより測定した。ホモジネートをさらに使用するまで－８０℃で保存した。
（２）ウエスタンブロット法
　各試料の等量のタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動；例えば、Ａｎｙ　ｋＤ（商標）Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）プレキャストタンパク質ゲル、ＢｉｏＲａｄ）を介して分子量によって分離した。各ゲル上の予め染色されたタンパク質マーカーは、タンパク質の正しい分離を可視化し、後にウエスタンブロットフィルム上で正しいタンパク質バンドサイズを確認した。その後、タンパク質をニトロセルロース膜上に移し、１×ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）中の５％非脂肪乾燥ミルクでブロックし、ヒト－ＴＤＰ－４３抗体（１：１０００、Ａｂｎｏｖａ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｈ０００２３４３５－Ｍ０１）及びβ－チューブリンアイソタイプＩＩＩ（１：５０００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ、Ｔ８６６０）を用いて特異的抗体とインキュベートした。一次抗体、ＥＣＬ（増強化学ルミネセンス）及びＣ－ｄｉｇｉｔブロットスキャナー（Ｌｉｃｏｒ）の種に対して生じたＨＰＲ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）結合二次抗体を所望のタンパク質バンドの可視化及び半定量化のために使用した。
７．結果
７－１．体重
　全実験期間にわたって群を比較することにより統計解析を行い、体重に対するＭｕｓｅ細胞の影響を評価した。反復測定ＡＮＯＶＡを行い、群間因子の有意水準を評価した。結果を図６及び７に示した。
（１）Ｄ群とＣ群、及びＣ群とＡ群の比較
　１～１２週目でＣ群はＤ群と比較して有意差を示し、Ａ群はＣ群と比較して有意差を示さなかった。
（２）Ｄ群とＣ群、及びＣ群とＢ群の比較
　１～７週目、及び８～１２週目で、Ｃ群はＤ群と比較して有意差を示し、Ｂ群は各期間においてＣ群と比較して有意差を示さなかった。
７－２．ハンギングワイヤ試験
　ハンギングワイヤ試験におけるＭｕｓｅ細胞の効果を評価するために、全実験期間にわたって群を比較することにより統計解析を行った。反復測定ＡＮＯＶＡを行い、群間因子の有意水準を評価した。結果を図８及び９に示した。
（１）Ｄ群とＣ群、及びＣ群とＡ群の比較
　０～１２週目でＣ群はＤ群と比較して有意差が認められ、Ａ群はＣ群と比較して有意差が認められた。
（２）Ｄ群とＣ群、及びＣ群とＢ群の比較
　０～６週目、及び第８～１２週目で、Ｃ群はＤ群と比較して有意差を示し、Ｂ群は各期間においてＣ群と比較して有意差を示さなかった。
７－３．ロータロッド
　結果を図１０に示した。試験１～３及びベースライン時及び１２週目の平均値では、Ｃ群はＤ群と比較して有意な低下を示し、Ａ及びＢ群はＣ群と比較して有意差を示さなかった。
７－４．クラスピング
　結果を図１１に示した。ベースライン時及び１２週目に、Ｃ群はＤ群と比較して有意な低下を示し、Ａ及びＢ群はＣ群と比較して有意差を示さなかった。
７－５．脊髄組織における免疫蛍光の評価
　免疫蛍光シグナルを脊髄（頸部、胸部及び腰部）で定量し、統計学的に評価した。
７－５－１．ｈＴＤＰ－４３
　結果を図１２に示した。
（１）Ｄ群とＣ群の比較
　頸部及び胸部の平均物体強度、物体密度、免疫反応領域、全腰部の読み出しにおいて、Ｃ群はＤ群と比較して有意な増加を示し、２元配置ＡＮＯＶＡの結果、因子：群間に有意差を示した。
（２）Ｃ群とＡ～Ｂ群の比較
　Ａ群は、胸部及び腰部の平均物体強度、免疫反応領域において、Ｃ群と比較して有意な減少を示したが、２元配置ＡＮＯＶＡの結果、平均物体強度、物体密度、免疫反応領域において、因子：群間に有意差が認められたことから、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定を実施したところ、Ａ～Ｂ群はＣ群と比較して有意差が認められた。
７－５－２．ＧＦＡＰ
　結果を図１３に示した。
（１）Ｄ群とＣ群の比較
　頸部の平均物体サイズ、物体密度及び免疫反応領域、ならびに胸部及び腰部の平均物体強度、物体密度及び免疫反応領域において、Ｃ群はＤ群と比較して有意な増加を示した。２元配置ＡＮＯＶＡの結果として、全ての読み出しにおいて、因子：群は有意差を示した。
（２）Ｃ群とＡ～Ｂ群の比較
　頸部の平均物体サイズにおいて、Ａ～Ｂ群はＣ群と比較して有意な減少を示したが、２元配置ＡＮＯＶＡの結果として、平均物体サイズにおいて、因子：群は有意差を示した。したがって、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定を行ったところ、Ａ～Ｂ群はＣ群と比較して有意差を示した。
７－５－３．ＭＡＰ２
　結果を図１４に示した。
（１）Ｄ群とＣ群の比較
　胸部の免疫反応領域において、Ｃ群はＤ群と比較して有意な増加を示した。２元配置ＡＮＯＶＡの結果として、平均ＲＯＩ強度及び免疫反応領域において、因子：群は有意差を示した。
（２）Ｃ群とＡ～Ｂ群の比較
　全ての読み出しにおいて、Ａ～Ｂ群はＣ群と比較して有意差を示さなかったが、２元配置ＡＮＯＶＡの結果として、ＲＯＩ強度の平均値と免疫反応領域において、因子：群は有意差を示した。したがって、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定を行ったところ、平均ＲＯＩ強度において、Ａ～Ｂ群はＣ群と比較して有意差を示し、免疫反応領域おいて、Ａ群はＣ群と比較して有意差を示した。
７－５－４．Ｉｂａ－１
　結果を図１５に示した。
（１）Ｄ群とＣ群の比較
　頸部の平均物体サイズ、胸部の物体密度、並びに腰部の物体密度及び免疫反応領域において、Ｃ群はＤ群と比較して有意な増加を示した。２元配置ＡＮＯＶＡの結果として、全ての読み出しにおいて、因子：群は有意差を示した。
（２）Ｃ群とＡ～Ｂ群の比較
　全ての読み出しにおいて、Ａ～Ｂ群はＣ群と比較して有意差を示さなかった。２元配置ＡＮＯＶＡの結果として、平均物体強度において、因子：群は有意差を示した。したがって、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定を行ったところ、Ａ群はＣ群と比較して有意差を示した。
７－５－５．ＮｅｕＮ
　頚部の物体密度において、Ｃ群はＤ群と比較して有意な増加を示した。２元配置ＡＮＯＶＡの結果として、物体密度において、因子：群は有意差を示した。Ａ群及びＢ群は、これらの変化において何ら有意な影響を示さなかった（データを示さず）。
７－５－６．ＭＢＰ
　全ての読み出しにおいて、Ｃ群はＤ群と比較して有意差を示さなかった。２元配置ＡＮＯＶＡの結果として、因子：群は有意差を示さなかった（データを示さず）。
７－６．脳組織における免疫蛍光の評価
　免疫蛍光シグナルを脳（大脳皮質及び脳幹）において定量化し、統計学的に評価した。
７－６－１．ｈＴＤＰ－４３
　結果を図１６に示した。脳幹及び皮質の全ての読み取りにおいて、Ｃ群はＤ群と比較して有意な増加を示した。Ａ～Ｂ群はＣ群と比較して有意差を示さなかった。
７－６－２．ＧＦＡＰ
　結果を図１７に示した。脳幹の物体密度及び免疫反応領域、ならびに大脳皮質の全ての読み取りにおいて、Ｃ群はＤ群と比較して有意な増加を示した。Ａ～Ｂ群はＣ群と比較して有意差を示さなかった。
７－６－３．ＭＡＰ２
　脳幹及び皮質の全ての読み取りにおいて、Ｃ群はＤ群と比較して有意差を示さなかった（データを示さず）。
７－６－４．Ｉｂａ－１
　結果を図１８に示した。脳幹の全ての読み取り、及び皮質の平均物体強度において、Ｃ群はＤ群と比較して有意な増加を示した。Ａ～Ｂ群はＣ群と比較して有意差を示さなかった。
７－６－５．ＮｅｕＮ
　結果を図１９に示した。脳幹の平均物体サイズにおいて、Ｃ群はＤ群と比較して有意な減少を示し、皮質の物体密度において、Ｃ群はＤ群と比較して有意な増加を示した。全ての読み取りにおいて、Ａ～Ｂ群はＣ群と比較して有意差を示さなかった。
７－６－６．ＭＢＰ
　脳幹及び皮質の全ての読み取りにおいて、Ｃ群はＤ群と比較して有意差を示さなかった（データを示さず）。
７－７．ウエスタンブロット分析
　ウエスタンブロットにより決定したＴＤＰ－４３レベルを脊髄及び海馬において定量し、統計学的に評価した。脊髄及び海馬において、ＴＤＰ－４３／β－チューブリンアイソタイプＩＩＩについて、Ｃ群はＤ群と比較して有意な増加を示した。Ａ～Ｂ群はＣ群と比較して有意差を示さなかった（図２０）。
考察
　本研究は、ＡＬＳモデル　ｈＴＤＰ－４３　Ｔｇマウスにおいて、Ｍｕｓｅ細胞の８週齢時の単回静脈内投与が、ハンギングワイヤ試験の成績を改善することを示した最初の報告である。免疫組織学的評価を行ったところ、脊髄において、ｈＴＤＰ－４３　Ｔｇマウスで上昇したｈＴＤＰ－４３の陽性反応が低下したことから、Ｍｕｓｅ細胞の投与により脊髄の神経細胞の細胞質におけるｈＴＤＰ－４３の凝集が抑制されて、運動機能が改善した可能性が考えられる。
免疫組織学的分析
　６－５（１）で調製した右半脳のうち、上述の免疫組織学的分析に用いなかった７例の脳から、（２）と同様に凍結切片を作製する。また、脊髄組織アレイ（群あたりｎ＝８）の残存サンプルを用いて、同様に凍結切片を作製する。作製した切片を用いて、ユビキチン（細胞質内でのＴＤＰ－４３タンパク質蓄積の指標）、トランスロケータータンパク質（神経変性疾患における神経炎症の指標）及びコリンアセチルトランスフェラーゼ（一次及び二次運動ニューロンのマーカー）について、上述の方法と同様に蛍光免疫染色による評価を行う。
　脳及び脊髄においてこれらのタンパク質の発現状態を免疫染色により評価することで、Ｍｕｓｅ細胞のＡＬＳモデル　ｈＴＤＰ－４３　Ｔｇマウスの病態に対する改善作用の特徴（細胞質内におけるＴＤＰ－４３タンパク質蓄積に対する抑制作用、神経炎症抑制作用及び運動神経に対する保護作用等）をさらに明らかにすることができる。
タンパク質発現解析
　６－４（２）で調製した左半脳のうち、上述のウエスタンブロット法によるタンパク質発現解析で使用しなかった海馬以外の部分（１５例）を用い、核分画と細胞質分画を分離し、それぞれの分画において、ヒト－ＴＤＰ－４３抗体を用いてウエスタンブロットを行う。ＴＤＰ－４３による神経変性は、核分画から細胞質分画へＴＤＰ－４３が移行することにより惹起されることから、それぞれの分画におけるＴＤＰ－４３の分布に対するＭｕｓｅ細胞投与の影響を調べることにより、Ｍｕｓｅ細胞のＡＬＳモデル　ｈＴＤＰ－４３　Ｔｇマウスの病態に対する改善作用の特徴をさらに明らかにすることができる。
　上述の全ての参考文献及び対応する出願の全ての開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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Claims (9)

  1. 　生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む、対象における運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）を治療し、予防し、軽減し及び／又は発症を遅延させるための細胞製剤。
  2. 　外部ストレス刺激によりＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分を含む、請求項１に記載の細胞製剤。
  3. 　多能性幹細胞がＣＤ１０５陽性である、請求項１又は２記載の細胞製剤。
  4. 　多能性幹細胞がＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性である、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  5. 　多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性、及びＣＤ２７１陰性である、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  6. 　多能性幹細胞が、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性、及びＤｃｔ陰性である、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  7. 　多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞製剤：
    （ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
    （ｉｉ）三胚葉のいずれかの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
    （ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
    （ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
  8. 　ＭＮＤが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、又は球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）である、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  9. 　多能性幹細胞が脊髄内に生着する能力を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞製剤。
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