WO2022045637A1 - 항종양 세균 균주, 및 이를 이용한 조성물 및 방법 - Google Patents

항종양 세균 균주, 및 이를 이용한 조성물 및 방법 Download PDF

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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase

Definitions

  • the present disclosure relates to anti-tumor bacterial strains, and compositions and methods using the same, and more particularly, to Enterococcus faecium spp. bacterial strains exhibiting anti-tumor activity, and preventing or treating tumors using the same It relates to a composition and method for
  • the present disclosure relates to an anti-tumor bacterial strain, and a composition and method using the same, and more particularly, to an Enterococcus faecalis microorganism having anticancer activity, a composition comprising the same, and cancer prevention or treatment using the same it's about
  • gut bacteria can be used to prevent or treat various diseases and disorders.
  • WO2016/196605 discloses that modulating the level of one or more commensal microbes in a subject enhances an immune response by a subject, inhibits the growth or spread of cancer, and/or evades immunity by cancer Disclosed is a method of treating or preventing cancer in a subject by inhibiting and/or enhancing the efficacy of a therapeutic agent.
  • WO2017/085520 discloses a composition for use in a method of treating or preventing cancer, comprising a bacterial strain of Enterococcus gallinarum species.
  • WO2017/085518 discloses a composition for use in a method of treating or preventing a disease or condition mediated by the IL-17 or Th17 pathway, including a bacterial strain of Enterococcus faecium spp. there is.
  • Enterococcus faecalis is found in the gastrointestinal tract of humans and other mammals. Enterococcus faecalis is a Gram-positive, cocci bacterium. Enterococcus faecalis can be grown at a temperature of 10 to 45 °C.
  • Korean Patent Publication No. 10-2020-0054589 discloses Enterococcus faecalis KACC 92220P having the effect of lowering the lactose content.
  • Korean Patent No. 10-2053730 discloses an Enterococcus faecalis AMI-1001 strain having antioxidant, anti-inflammatory or antibacterial activity.
  • a first object of the present disclosure is to provide a bacterial strain of Enterococcus faecium species having antitumor activity characterized in lactate-producing ability compared to microbial growth.
  • a second object of the present disclosure is to provide a composition for preventing or treating a tumor comprising a bacterial strain of the Enterococcus faecium species as an active ingredient.
  • a third object of the present disclosure is to provide a method for preventing or treating a tumor in a subject, comprising administering to the subject the bacterial strain of Enterococcus faecium species or the composition.
  • a fourth object of the present disclosure is to provide an Enterococcus faecalis LMT19-32 (Accession No. KCTC 14306BP) microorganism or a culture or extract thereof having anti-tumor activity.
  • a fifth object of the present disclosure is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the Enterococcus faecalis LMT19-32 microorganism or a culture or extract thereof as an active ingredient.
  • a sixth object of the present disclosure is to provide a food composition for preventing or improving cancer containing the Enterococcus faecalis LMT19-32 microorganism or a culture or extract thereof as an active ingredient.
  • a seventh object of the present disclosure is to provide a method for preventing or treating cancer in a subject, comprising administering to the subject an amount of the Enterococcus faecalis LMT19-32 microorganism or a culture or extract thereof effective to treat cancer do.
  • a first aspect of the present disclosure is
  • i) belongs to the species Enterococcus faecium ,
  • lactate/OD 600 a lactate-producing ability of 3 g/L or more compared to the growth of microorganisms during culturing for 48 hours;
  • a second aspect of the present disclosure relates to a composition for preventing or treating a tumor, comprising the bacterial strain of Enterococcus faecium species as an active ingredient.
  • a third aspect of the present disclosure relates to a method for preventing or treating a tumor in a subject, comprising administering the bacterial strain of Enterococcus faecium species, or the composition, to the subject in need thereof. it's about
  • a fourth aspect of the present disclosure relates to an Enterococcus faecalis LMT19-32 (Accession No. KCTC 14306BP) microorganism or a culture or extract thereof having anti-tumor activity.
  • a fifth aspect of the present disclosure relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the Enterococcus faecalis LMT19-32 microorganism or a culture or extract thereof as an active ingredient.
  • a sixth aspect of the present disclosure relates to a food composition for preventing or improving cancer containing the Enterococcus faecalis LMT19-32 microorganism or a culture or extract thereof as an active ingredient.
  • a seventh aspect of the present disclosure relates to a method for preventing or treating cancer in a subject, comprising administering to the subject an amount of the Enterococcus faecalis LMT19-32 microorganism or a culture or extract thereof effective to treat the cancer will be.
  • the bacterial strain according to the present disclosure increases the number of tumor-infiltrating T cells, CD8 T cells, and IFN ⁇ + CD8 T cells and thus exhibits excellent tumor suppressive activity, and thus can be effectively used for preventing or treating tumors.
  • Enterococcus faecalis LMT19-32 (Accession No. KCTC 14306BP) microorganism having anti-tumor activity according to the present disclosure or a culture or extract thereof, it can be used to prevent or treat cancer .
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer according to the present disclosure, it can be used to prevent or treat cancer.
  • the food composition for preventing or ameliorating cancer according to the present disclosure, it is possible to prevent or ameliorate cancer.
  • cancer in another aspect, according to the method for preventing or treating cancer in an individual according to the present disclosure, cancer can be effectively prevented or treated.
  • 1 is an optical micrograph of the Enterococcus faecium LMT17-62 strain and KCTC13225 strain, which is a type strain, according to an aspect of the present disclosure.
  • Figure 2a is a graph showing the tumor growth inhibition rate (%) of Enterococcus faecium strains selected from a mouse tumor induction model.
  • Figure 2b is a graph showing the change in tumor size over time in the Enterococcus faecium LMT17-62 strain administered group.
  • 2c is a graph showing changes in the number of tumor-infiltrating total T cells, CD8 T cells, and interferon gamma-positive CD8 T cells in the Enterococcus faecium LMT17-62 strain administered group.
  • Figure 3a is a growth (OD 600 ) curve of the selected Enterococcus faecium strain.
  • Figure 3b is a graph showing the amount of lactate production according to the culture time of the selected Enterococcus faecium strain.
  • Figure 3c is a graph showing the lactate production amount (g / L) compared to the growth (OD 600 ) of Enterococcus faecium strains selected after culture for 24 hours and 48 hours.
  • 4 is a graph showing the number of viable cells of Enterococcus faecium strains selected when cultured at pH 2.5.
  • 5 is a graph showing the number of live cells of Enterococcus faecium strains selected when cultured in a bile salt-containing medium.
  • 6 is a graph showing the number of viable cells of a selected anti-tumor-positive Enterococcus faecium strain attached to intestinal epithelial cells.
  • FIG. 7 shows representative optical micrographs of the selected Enterococcus faecalis LMT19-32 strain and KCTC3206 strain, which is a type strain.
  • 8A and 8B are diagrams showing the results of measuring the tumor size after administration of the Enterococcus faecalis LMT19-32 strain to mice having tumors.
  • 9a, 9b, and 9c show the results of analyzing the T cells, CD8 T cells and IFN ⁇ + CD8 T cells infiltrating the tumor after the Enterococcus faecalis LMT19-32 strain was administered to the tumor-bearing mice.
  • the present disclosure is based on the discovery of the fact that a bacterial strain of Enterococcus faecium, which is characterized by lactate-producing ability compared to microbial growth, exhibits excellent antitumor activity.
  • tumor and cancer are used interchangeably and encompass, eg, solid and liquid, eg, diffuse or circulating tumors. This includes precancerous as well as malignant cancers and tumors. It also includes primary malignant cells or tumors and secondary malignant cells or tumors (eg, metastatic tumors).
  • anti-tumor and “anti-cancer” are denoted by a variety of means, including, but not limited to, for example, a reduction in tumor size, a reduction in the number of tumor cells, a reduction in tumor cell proliferation, or a reduction in tumor cell survival. possible biological effects.
  • One aspect of the present disclosure is
  • i) belongs to the species Enterococcus faecium ,
  • lactate/OD 600 a lactate-producing ability of 3 g/L or more compared to the growth of microorganisms during culturing for 48 hours;
  • the bacterial strain may have a lactate-producing ability (lactate/OD 600 ) of greater than 2.5 g/L compared to the growth of microorganisms when cultured for 24 hours.
  • the bacterial strain may exhibit a tumor growth inhibition rate of 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more. In certain instances, the bacterial strain may be one that exhibits tumor growth inhibition of 10% to 40%, 15% to 40%, 20% to 40%, 25% to 40%, 30% to 40%, 35% to 40%. there is.
  • the bacterial strain may be one having iv) beta-galactosidase activity.
  • the bacterial strain may be one having a degradability of v) D-sorbitol.
  • the bacterial strain may be one having vi) D-tagatose degradability.
  • the bacterial strain may be one having vii) methyl-aD-mannopyranoside degradability.
  • the bacterial strain comprises the three characteristics of i) to iii), the four characteristics of i) to iv), i) to v), i) to iv), i) to vi) or i) to vii ), six properties of i) to vi) or i) to vii), or seven properties of i) to vii) may be satisfied.
  • the bacterial strain may be, but is not limited to, one or more of those shown in Table 1 below.
  • a second aspect of the present disclosure relates to a composition for preventing or treating a tumor, comprising the bacterial strain as an active ingredient.
  • the terms “treat”, “treating” or “treatment” include, for example, healing of wounded or damaged tissue, or altering, altering, enhancing, ameliorating, ameliorating and/or modifying an existing or recognized disease, disorder or condition. or alleviation or reduction (including partial reduction, significant reduction, near complete reduction and complete reduction), resolution or prevention (temporary or permanent) of a disease, disorder or condition, such as to achieve the desired therapeutic outcome, by beautifying it means.
  • prevention means delaying the onset of a disease, disorder or condition. Prevention may be considered complete if the onset of the disease, disorder or condition is delayed for a predetermined period.
  • the bacterial strain included in the composition may exist as a live cell or a dead cell, and may exist in a dried or lyophilized form.
  • the bacterial strain may be used in any form, including cultured or isolated strains, as long as it maintains antitumor activity, all of which fall within the scope of the present invention.
  • culture refers to a cultured strain, its metabolites, extra nutrients, etc. obtained by culturing the strain for a certain period in a medium capable of supplying nutrients so that the bacterial strain of the present disclosure can grow and survive in vitro. It means a composition comprising.
  • the composition may be for oral or parenteral administration.
  • Parenteral administration includes, but is not limited to, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, rectal administration, intratumoral administration, and the like.
  • the composition may be for oral administration.
  • the composition may be a pharmaceutical composition, and in this case, it may be formulated by further including a pharmaceutically acceptable carrier or additive in addition to the active ingredient.
  • the carrier or additive may include an excipient, a disintegrant, a sweetener, a binder, a coating agent, a swelling agent, a lubricant, a lubricant, a flavoring agent, a coloring agent, a diluent, a dispersing agent, a surfactant, an antioxidant, a buffer, a bacteriostatic agent, and the like.
  • the composition may be formulated as an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, powders, capsules, granules or tablets.
  • the composition may be a food or food additive composition, and in this case, it may include a pharmaceutically acceptable diluent or carrier.
  • the diluent may be water, medium or a buffer such as PBS.
  • the carrier may be a conventional excipient, disintegrant, binder, lubricant, thickener or filler.
  • the food may be a health functional food.
  • the food may be beverages, confectionery, diet bar, chocolate, pizza, ramen, other noodles, gum, ice cream, and the like.
  • composition When the composition is for oral administration, it may be coated with a coating agent to increase acid resistance, heat resistance, bile resistance, survival rate, intestinal fixability, etc. of the bacterial strain.
  • Available coating agents include enteric coating agents; gelatin, polysaccharides, gums and the like; water-soluble polymers, hyaluronic acid, porous particles and proteins; casein, and coating agent, edible oil and fat, Extracellular Polymeric Substance of Lactobacillus plantarum, and alginic acid; silk fibroin, etc., but are not particularly limited thereto, and may be single coated or multi-coated, for example double, triple or quadruple coated.
  • the tumor may be a solid tumor.
  • solid cancer include breast cancer, lung cancer, head or neck cancer, colorectal cancer, esophageal cancer, laryngeal cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, bone cancer, skin cancer, skin or intraocular melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, perianal cancer, Colon cancer, breast cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, small intestine cancer, endocrine adenocarcinoma, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer , lymphocyte lymphoma, bladder cancer, kidney or ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma, and pituitary adenoma.
  • the dosage varies according to the patient's weight, age, sex, health status, diet, administration time, administration method, administration period or interval, excretion rate, constitutional specificity, the nature of the preparation, the severity of the disease, etc. and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the active ingredient bacterial strain may be administered at 1 ⁇ 10 6 CFU or more, 1 ⁇ 10 7 CFU or more, 1 ⁇ 10 8 CFU or more, 1 ⁇ 10 9 CFU or more.
  • the bacterial strain may be administered at 1 ⁇ 10 15 CFU or less, 1 ⁇ 10 14 CFU or less, 1 ⁇ 10 13 CFU or less, and 1 ⁇ 10 12 CFU or less.
  • a bacterial strain 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 15 CFU, 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 14 CFU, 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 13 CFU, 1 ⁇ 10 9 to 1 ⁇ 10 12 CFU , 1 ⁇ 10 10 to 1 ⁇ 10 12 CFU, 1 ⁇ 10 11 to 1 ⁇ 10 12 CFU.
  • the active ingredient, the bacterial strain may be administered once to several times a day.
  • the composition may be for use in combination with one or more other therapeutic agents, for example, an anticancer agent, an antiviral agent, a cytokine, or an immune agent.
  • an anticancer agent for example, an anticancer agent, an antiviral agent, a cytokine, or an immune agent.
  • combination refers to any form of two or more different therapeutic agents such that a second therapeutic agent is administered while the previously administered therapeutic agent is still effective in the body.
  • two therapeutic agents are simultaneously effective in a subject, which may include a synergistic effect of the two therapeutic agents.
  • the different therapeutic agents may be administered simultaneously or sequentially as a single agent or as separate agents.
  • the anticancer agent may be a chemotherapeutic agent.
  • chemotherapeutic agents include alkylating agents, nitrosourases, antimetabolites, anticancer drugs, plant-derived alkaloids, topoisomerase inhibitors, hormonal drugs, hormone antagonists, leukopenia (neutropenia) therapeutic drugs, thrombocytopenia. It includes therapeutic drugs, antiemetics, aromatase inhibitors, P-glycoprotein inhibitors, platinum complex derivatives, other immunotherapeutic drugs and other anticancer drugs.
  • Exemplary cytotoxic agents that may be co-administered may be anti-microtubule agents, topoisomerase inhibitors, antimetabolites, mitotic inhibitors, alkylating agents, anthracyclines, vinca alkaloids, intercalating agents, signal transduction pathways. agents that promote apoptosis, proteosome inhibitors, and radiation (local or systemic irradiation).
  • additional therapeutic agents include, but are not limited to, peptides, polypeptides, proteins, fusion proteins, nucleic acid molecules, small molecules, mimetic agents, synthetic drugs, inorganic molecules, and organic molecules.
  • the anti-cancer agent may be an immuno-cancer agent.
  • immuno-cancer agent refers to a compound, composition or treatment that indirectly or directly enhances, stimulates or increases the body's immune response to cancer cells and/or reduces the side effects of other anticancer therapies.
  • immuno-oncology agents include cytokines, cancer vaccines, monoclonal antibodies, non-cytokine adjuvants, immune cells (T cells, NK cells, dendritic cells, B cells, etc.), immune checkpoint inhibitors, and the like.
  • the immuno-oncology agent is an immune checkpoint inhibitor. Immune checkpoint inhibitors include peptides, antibodies, nucleic acid molecules and small molecules.
  • an immune checkpoint inhibitor may be administered to enhance the proliferative, migratory, persistence and/or cytotoxic activity of CD8+ T cells in a subject, and particularly tumor invasiveness of CD8+ T cells in a subject.
  • checkpoint inhibitors are activated T lymphocytes, such as cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4 (CTLA4) and programmed cell death 1 (PD-1), or the killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) family.
  • CTL4 cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4
  • PD-1 programmed cell death 1
  • KIR killer cell immunoglobulin-like receptor
  • antagonists that block immunosuppressive receptors expressed by NK cells such as various members of It is a blocking antagonist.
  • an immune checkpoint inhibitor is an antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the checkpoint inhibitor is an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, an anti-PD-L2 antibody, an anti-CTLA-4 antibody, an anti-TIM-3 antibody, an anti-LAG3 antibody, an anti-IDO1 antibody.
  • immune checkpoint inhibitors include Ipilimumab (Yervoy®, BMS/Ono), Tremelimumab (AstraZeneca), atezolizumab (Tecentric®, Roche), and nivolumab (nivolumab) (Opdivo®, BMS/Ono), Pembrolizumab (Keytruda®, MSD), Avelumab (Bavencio®, Pfizer/Merck Germany), Durvalumab ( Imfinzi®, AstraZeneca/MedImmune), and antigen-binding fragments thereof may be at least one selected from, but not limited to.
  • the immuno-oncology agent is a solution, suspension, powder, granule, tablet, capsule, pill, extract, emulsion, syrup, aerosol, etc. oral dosage form, sterile injection solution, according to a conventional method for each purpose of use. It can be formulated and used in various forms, such as parenteral formulations such as injections of The immunotherapy may be administered orally or parenterally via various routes including intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, intramuscular, spinal, spinal, or rectal administration or injection.
  • the dosage may vary depending on the patient's weight, age, sex, health status, diet, administration time, administration method, administration period or interval, excretion rate, constitutional specificity, properties of the preparation, severity of disease, etc. It may be appropriately selected by a person skilled in the art. For example, it may be in the range of about 0.1 to 10,000 mg/kg, but is not limited thereto, and may be administered in divided doses from once to several times a day.
  • a third aspect of the present disclosure relates to a method for preventing or treating a tumor in a subject, comprising administering the bacterial strain, or the composition, to the subject in need thereof.
  • administration refers to a step of providing an active ingredient or a composition comprising the same to a subject.
  • the active ingredient or a composition comprising the same may be administered through various appropriate routes.
  • the subject to be administered can include, without limitation, humans or animals, such as humans, pigs, dogs, cats, cattle, horses, mice, and the like.
  • Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis LMT19-32
  • a first aspect provides an Enterococcus faecalis LMT19-32 (Accession No. KCTC 14306BP) microorganism or a culture or extract thereof having anti-tumor activity.
  • the microorganism or its culture or extract may inhibit tumor growth.
  • the microorganism or its culture or extract may increase the level of immune cells in the tumor.
  • the microorganism or a culture or extract thereof may increase the level of CD8 T cells, for example CD8 T cells expressing IFN ⁇ , in a tumor.
  • the microorganism or its culture or extract can increase the infiltration of immune cells into the tumor.
  • the immune cells may be CD8 T cells, CD4 T cells, NK cells, B cells, dendritic cells, macrophages, and neutrophils.
  • the microorganism or its culture or extract may activate immune cells.
  • the activation may be such that the microorganism or its culture or extract promotes the production, secretion or production and secretion of cytokines or enzymes having anti-tumor activity.
  • the cytokine or enzyme may be one or more of interferon gamma and granzyme B.
  • the microorganism is excellent in bile resistance and intestinal fixability. The microorganism was isolated from human feces.
  • the bile acid resistance is 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more when cultured for 2 hours at 37°C in MRS medium containing 0.3% bile acid. % or more, 75 to 90%, 75 to 95%, 80 to 90%, 80% to 95%, 85% to 90%, or 90 to 95%.
  • the microorganism or a culture or extract thereof may promote infiltration of CD8 T cells into a tumor.
  • the promotion is 5% or more, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% of the number of CD8 T cells to the number of T cells in the tumor, compared to the case in which the microorganism or the culture or extract thereof is not present.
  • the microorganism or a culture or extract thereof may promote the production, secretion or production and secretion of one or more of interferon gamma and granzyme B of tumor-infiltrating CD8 T cells.
  • the promotion increases the percentage of interferon-gamma-producing cells among CD8 T cells by 5% or more, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25%, compared to the case in which the microorganism or its culture or extract is not present.
  • the promotion increases the percentage of granzyme B-producing cells among CD8 T cells by 5% or more, 10% or more, 15% or more, 20% or more, compared to the case in which the microorganism or its culture or extract is not present.
  • the microorganism or its culture or extract may inhibit the growth of tumors by CD8 T cells.
  • the inhibition is 5% or more, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more of the size of the tumor compared to the case in which the microorganism or its culture or extract is not present. , 45% or more, 50% or more, 55% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 100% or more, 5% to 100%, 10% to 100%, 20% to 100%, 30% to 100%, 40% to 100%, 50% to 100%, 60% to 100%, 70% to 100%, 80% to 100%, or 90% to 100% % may be reduced.
  • a second aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the above-mentioned microorganism or a culture or extract thereof as an active ingredient.
  • the cancer may be a solid cancer.
  • the cancer may be a solid cancer existing in a tissue other than a tissue directly contacted when the microorganism is orally administered.
  • the tissues in direct contact include the oral cavity, esophagus, stomach, duodenum, small intestine, large intestine and colon.
  • tissues other than the tissues in direct contact are breast, lung, head, neck, liver, pancreas, bone, fallopian tube, long arch, vagina, vulva, thyroid gland, parathyroid gland, adrenal gland, soft tissue, urethra, penis, prostate, bladder , kidney, ureter, or CNS.
  • the cancer may be metastatic cancer.
  • the cancer may be, for example, but not limited to, a cancer listed in "I. Enterococcus faecium".
  • the composition may be for inhibiting the growth of cancer.
  • the composition may be for administration together with an immune checkpoint inhibitor.
  • the immune checkpoint inhibitor may be for administration before, simultaneously with, or after administration of the above-described microorganism or a culture or extract thereof.
  • the immune checkpoint inhibitor may be, for example, but not limited to, those listed in "I. Enterococcus faecium”.
  • the composition may be for administration together with a chemotherapeutic agent.
  • the chemotherapeutic agent may be for administration before, simultaneously with, or after administration of the microorganism or its culture or extract.
  • the chemotherapeutic agent may be, for example, but not limited to, those listed in "I. Enterococcus faecium”.
  • the composition may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier may be a stabilizer, excipient, diluent, or adjuvant.
  • the carrier may be, for example, any and all aqueous and non-aqueous solutions, sterile solutions, solvents, buffers, such as phosphate buffered saline (PBS) solutions, water, suspensions suitable for pharmaceutical administration, particularly suitable for oral administration.
  • PBS phosphate buffered saline
  • emulsions for example oil/water emulsions, various types of wetting agents, liposomes, dispersion media and coating agents.
  • PBS phosphate buffered saline
  • emulsions for example oil/water emulsions, various types of wetting agents, liposomes, dispersion media and coating agents.
  • the use of such media and agents in pharmaceutical compositions is well known in the art, and compositions comprising such carriers may be formulated by well known conventional methods.
  • the composition may include the microorganism or its culture or extract in a “therapeutically effective amount”.
  • therapeuticically effective amount means an amount sufficient to exhibit a therapeutic effect when administered to an individual in need of treatment when administered once or twice or more.
  • treatment means treating a cancer disease or medical condition of cancer in a subject, eg, a mammal, including a human, including: alleviation of a cancer disease or medical condition of cancer; inhibiting a cancer disease or medical symptom of cancer, ie, slowing or arresting the progression of the disease or medical symptom in a subject; or alleviating a cancer disease or a medical symptom of cancer in a subject.
  • the "effective amount” can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the "effective amount" may be 0.01 to 50% by weight, or 0.1 to 20% by weight, based on the weight of the composition.
  • the composition may be administered at 1x10 6 CFU/g or more, 1x10 7 CFU/g or more, 1x10 8 CFU/g or more, 1x10 9 CFU/g or more, based on the weight of the composition.
  • the bacterial strain may be administered at 1x10 15 CFU/g or less, 1x10 14 CFU/g or less, 1x10 13 CFU/g or less, and 1x10 12 CFU/g or less.
  • the composition may be administered orally. Accordingly, the composition may be formulated in various forms such as tablets, capsules, liquid preparations, for example, aqueous solutions, dry syrups, or suspensions.
  • excipients such as lactose and corn starch and lubricants such as magnesium stearate may be usually added.
  • capsules for oral administration lactose and/or dry corn starch may be used as diluents.
  • the active ingredient may be combined with emulsifying and/or suspending agents. If desired, certain sweetening and/or flavoring agents may be added.
  • the composition may be a formulation that allows the microorganism or its culture or extract to be stabilized in acidity such as gastric juice.
  • the composition may be a capsule containing the microorganism or its culture or extract therein, or a tablet in which the microorganism or its culture or extract is coated with a film.
  • a third aspect provides a food composition for preventing or ameliorating cancer containing the above-mentioned microorganism or a culture or extract thereof as an active ingredient.
  • the composition may include a food pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier may be a stabilizer, excipient, diluent, or adjuvant.
  • the carrier may be, for example, any and all aqueous and non-aqueous solutions, sterile solutions, solvents, buffers, such as phosphate buffered saline (PBS) solutions, water, suspensions suitable for pharmaceutical administration, particularly suitable for oral administration.
  • PBS phosphate buffered saline
  • emulsions for example oil/water emulsions, various types of wetting agents, liposomes, dispersion media and coating agents.
  • PBS phosphate buffered saline
  • emulsions for example oil/water emulsions, various types of wetting agents, liposomes, dispersion media and coating agents.
  • the use of such media and agents in pharmaceutical compositions is well known in the art, and compositions comprising such carriers may be formulated by well known conventional methods.
  • the food product may be a dairy product, soy product, vegetable and fruit product, or a food additive.
  • the dairy product may be fermented milk, butter, cheese, or milk powder.
  • the food may be a health functional food.
  • the health functional food may be a health functional food for preventing or improving cancer.
  • the food may also be beverages, confectionery, diet bar, chocolate, pizza, ramen, other noodles, gum, and ice cream.
  • the food may include ingredients commonly added during food production, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavoring agents.
  • Carbohydrates used in food preparation include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; and polysaccharides such as conventional sugars such as dextrin, cyclodextrin, and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, erythritol. It is also possible to use natural flavoring agents and synthetic flavoring agents such as saccharin and aspartame as flavoring agents.
  • the natural flavoring agent may be a stevia extract such as thaumatin, rebaudioside A, and glycyrrhizin.
  • a health functional food means that when ingested, it brings a specific effect on health.
  • the microorganism may be 0.01 to 50% by weight, or 0.1 to 20% by weight based on the weight of the composition.
  • the composition may be administered at 1x10 6 CFU/g or more, 1x10 7 CFU/g or more, 1x10 8 CFU/g or more, 1x10 9 CFU/g or more, based on the weight of the composition.
  • the bacterial strain may be administered at 1x10 15 CFU/g or less, 1x10 14 CFU/g or less, 1x10 13 CFU/g or less, and 1x10 12 CFU/g or less.
  • a fourth aspect provides a method for preventing or treating cancer in a subject, comprising administering to the subject an amount of the microorganism or a culture or extract thereof effective to treat the cancer.
  • the subject may be a mammal.
  • the mammal may be a human or a mammal other than a human.
  • the administration may be oral administration.
  • the “amount effective to treat cancer” refers to an amount effective to prevent or treat cancer.
  • the “amount effective to treat cancer” may be 0.01 mg to 200 mg per kg body weight of the microorganism or a culture or extract thereof, or 0.1 mg to 400 mg per kg body weight of the microorganism or a culture or extract thereof.
  • the “amount effective to treat cancer” may be administered in an amount of 1x10 6 CFU or more, 1x10 7 CFU or more, 1x10 8 CFU or more, 1x10 9 CFU or more per subject.
  • the bacterial strain may be administered at 1x10 15 CFU or less, 1x10 14 CFU or less, 1x10 13 CFU or less, and 1x10 12 CFU or less.
  • the bacterial strain can be administered at 1x10 6 CFU to 1x10 15 CFU, 1x10 7 CFU to 1x10 14 CFU, 1x10 8 CFU to 1x10 13 CFU, 1x10 9 CFU to 1x10 12 CFU, 1x10 10 CFU to 1x10 12 CFU.
  • the active ingredient, a bacterial strain may be administered in divided doses from two to several times a day.
  • the method may comprise administering in conjunction with an immune checkpoint inhibitor.
  • the immune checkpoint inhibitor may be administered before, simultaneously with, or after the administration of the above-described microorganism or a culture or extract thereof.
  • the immune checkpoint inhibitor can be, for example, “I. Enterococcus faecium”, but is not limited thereto.
  • the method may also comprise administering in combination with a chemotherapeutic agent.
  • the chemotherapeutic agent may be administered before, simultaneously with, or after administration of the above-described microorganism or a culture or extract thereof.
  • the chemotherapeutic agent may be, for example, but not limited to, those listed in "I. Enterococcus faecium”.
  • Enterococcus faecalis LMT19-32 (Accession No. KCTC 14306BP) microorganism with anti-tumor activity.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the microorganism of item 1 or a culture or extract thereof as an active ingredient.
  • composition according to item 2 wherein the cancer is a solid cancer.
  • composition according to item 2 for administration with an immune checkpoint inhibitor.
  • composition of item 4 wherein the immune checkpoint inhibitor is a CTLA4 inhibitor, a PD-1 inhibitor, or a PD-L1 inhibitor.
  • a food composition for preventing or ameliorating cancer containing the microorganism of item 1 or a culture or extract thereof as an active ingredient.
  • the selected strains were named LMT17-62, LMT17-74, LMT15-24, LMT17-25, LMT15-4, LMT17-43, LMT17-40 and LMT2-17, respectively.
  • the selected 8 strains were cultured in MRS plate medium (Difco, USA) and the colony morphology was observed.
  • the colony form of the selected strain is shown in Table 2 below.
  • Morphological characteristics of the selected strain LMT17-62 KCTC13225 form circle circle size 0.5 mm 0.5 mm color cream color cream color Opacity opacity opacity bump convex convex surface lubricity lubricity aerobic growth + + anaerobic growth + +
  • FIG. 1 is an optical micrograph of Enterococcus faecium LMT17-62 strain and KCTC13225 strain, which is a type strain, among 8 selected strains. As shown in FIG. 1 , the Enterococcus faecium LMT17-62 strain was confirmed to have a spherical shape typical of the Enterococcus genus.
  • the 16S rRNA gene was amplified and sequenced using universal bacterial primers (27F (SEQ ID NO: 1) and 1492R (SEQ ID NO: 2)) (Macrogen).
  • the 16S rDNA sequence of the isolated strain is shown in SEQ ID NOs: 3 to 10 (SEQ ID NO: 3: 16S rDNA sequence of LMT17-62; SEQ ID NO: 4: 16S rDNA sequence of LMT17-74; SEQ ID NO: 5: 16S of LMT15-24 rDNA sequence; SEQ ID NO: 6: 16S rDNA sequence of LMT17-25; SEQ ID NO: 7: 16S rDNA sequence of LMT15-4; SEQ ID NO: 8: 16S rDNA sequence of LMT17-40; SEQ ID NO: 9: 16S rDNA sequence of LMT2-17 and SEQ ID NO: 10: 16S rDNA sequence of LMT17-43).
  • NCBI blast http://www.nc
  • the isolated strains were deposited with the Korean Collection for Type Cultures (KCTC) at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology on August 26, 2020, and each Enterococcus faecium LMT17-62 (Accession No.: KCTC 14284BP) ), Enterococcus faecium LMT17-74 (Accession Number: KCTC 14285BP), Enterococcus faecium LMT15-24 (Accession Number: KCTC 14289BP), Enterococcus faecium ( Enterococcus faecium ) LMT17- 25 (Accession number: KCTC 14288BP), Enterococcus faecium LMT15-4 (Accession number: KCTC 14290BP), Enterococcus faecium LMT17-43 (Accession number: KCTC 14286BP), Enterococcus faecium Um ( Enterococcus faec
  • Example 2 Evaluation of antitumor efficacy of selected Enterococcus faecium strains
  • C57BL/6 mice male, 20-22 g used in the mouse tumor induction model were purchased from Orient Bio, and were acclimatized to the environment for 1 week before the start of the experiment.
  • 2.5 ⁇ 10 5 MC38 cells derived from colorectal cancer of C57BL/6 mice were injected into the subcutaneous tissue of the back of the mouse, and groups were separated based on the tumor size (50-70 mm 3 ) one week after the tumor injection.
  • the Enterococcus faecium strain was orally administered at 1.0 ⁇ 10 9 CFU per mouse using a sonde once every two days.
  • anti-PD1 antibody (clone number: RMP1-14) was intraperitoneally administered at 10 mg per kg of mouse weight twice a week.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Tumor size was measured up to 21 days after injection of the MC38 tumor cell line into mice, and then, the mice were sacrificed using carbon dioxide to extract tumors and immune organs, and tumor-infiltrating immune cells were analyzed.
  • the size of the tumor was measured twice a week from 7 days after injection of the tumor cell line.
  • the long axis and the short axis of the tumor were measured using a vernier caliper, and the tumor size was calculated according to the following equation.
  • Tumor size (long axis ⁇ (short axis) 2 )/2
  • Tumor growth inhibition rate (%) was calculated according to the following equation.
  • Tumor growth inhibition (%) (1 - Vt/Vc) ⁇ 100
  • Vc mean tumor size in the negative control group at the time of tumor size assessment
  • Vt Mean tumor size in the experimental group at the time of tumor size evaluation.
  • FIG. 2b shows the tumor size up to 21 days after the end of the experiment after the injection of the tumor cell line in the Enterococcus faecium LMT17-62 strain administered group. As shown in FIG. 2b , it was confirmed that the Enterococcus faecium LMT17-62 administration group and the positive control anti-PD1 antibody administration group were statistically significantly inhibited in tumor growth compared to the negative control group.
  • CD8 T cells which are tumor-infiltrating immune cells, are important indicators of anti-tumor responses, and interferon gamma secreted by CD8 T cells is a functional cytokine that exhibits immune cell activity.
  • tumors were extracted and analyzed after the end of the animal experiment. The extracted tumors were separated into single cells using RPMI1640 medium containing 50 ⁇ g/ml Liberase and 40 ⁇ g/ml DNase I and a cell strainer.
  • the isolated cells were stimulated with 50 ng/ml PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) and 500 ng/ml ionomycin in RPMI1640 medium containing 10% Fetal bovine serum for 4 hours. After stimulation, cells were stained with the antibodies in Table 3 for immune cell analysis and interferon gamma generation confirmation, and analyzed using CANTO II flow cytometry equipment.
  • PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate
  • ionomycin in RPMI1640 medium containing 10% Fetal bovine serum
  • Figure 2c shows the total number of tumor-infiltrating T cells, the number of CD8 T cells and interferon gamma producing CD8 T cells.
  • Tumor-infiltrating T cells and CD8 T cells were significantly increased in the LMT17-62 strain treated group compared to the PBS treated group.
  • interferon gamma a CD8 T cell activator
  • Example 3 Analysis of physiological activity characteristics of anti-tumor-positive Enterococcus faecium strains
  • the colonies of the anti-tumor-positive and anti-tumor-negative strains were cultured in MRS liquid medium for 24 hours, and then the initial OD 600 (optical density) value for each strain coincided with 50 Inoculated into ml or 250 ml erlenmeyer flask. Thereafter, for the measurement of the growth curve of the strain, the OD 600 value of the strain was measured every hour using a spectrophotometer Ultrospec 7000 (biochrom, UK). The results are shown in Figure 3a.
  • the LMT17-62 strain having anti-tumor efficacy stopped growing after 8 hours after culture, but the anti-tumor-negative LMT2-17 strain continued to grow.
  • the amount of lactate, a metabolite of the strain present in the culture medium was confirmed using a biochemical analyzer YSI2900 (Xylem, USA).
  • the enzyme activity was evaluated using the Rapid ID 32A kit (BioMetrieux, France), and the results are shown in Table 4 below.
  • the Enterococcus faecium strain group (LMT17-62, LMT17-74, LMT15-24, LMT17-25) with anti-tumor efficacy was beta -Galactosidase ( ⁇ -galactosidase) had enzyme activity.
  • anti-tumor strains No.1, No.2, No.3, No.4, and No.5 are LMT17-62, LMT17-74, LMT15-24, LMT17-25, and LMT15-4, in that order. , respectively, and control strains No.1, No.2, and No.3 represent LMT17-43, LMT17-40, and LMT2-17, respectively, in that order.
  • anti-tumor strains No.1, No.2, No.3, No.4, and No.5 are LMT17-62, LMT17-74, LMT15-24, LMT17-25, and LMT15-4 in that order. , respectively, and control strains No.1, No.2, and No.3 represent LMT17-43, LMT17-40, and LMT2-17, respectively, in that order.
  • the antitumor-positive Enterococcus faecium strain was shown to have rather low acid resistance, so it may be preferable to use a capsule or a coating agent during formulation.
  • the selected anti-tumor-positive Enterococcus faecium strain is It can be a basis for confirming that it can sufficiently survive in the intestine of animals.
  • a human epithelial colorectal adenocarcinoma cell Caco-2 cell line (KCLB 30037.1) purchased from the Korea Cell Line Bank was used.
  • Caco-2 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco, USA) containing 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco, USA) at 5% CO 2 , 37°C conditions at 7 ⁇ 10 4 cells/100. It was aliquoted so as to become ⁇ l and cultured to form a cell monolayer in a 96-well plate (Corning, USA).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the selected antitumor-positive Enterococcus faecium strain cultured in MRS liquid medium was washed with phosphate buffered saline (PBS) and then suspended in DMEM medium without antibiotic added, and Caco- The amount of Enterococcus faecium strain was added to 2 cells so that 1 ⁇ 10 7 CFU was added, and incubated for 2 hours at 5% CO 2 , 37° C. conditions.
  • the cells were washed 5 times with PBS, and the adhered cells were removed with 100 ⁇ l of 0.1% Triton x-100 and then plated on MRS solid medium. After culturing at 37° C. for 24 hours, the number of colonies on the plate medium was counted to investigate the intestinal fixability of the Enterococcus faecium strain.
  • FIG. 6 shows the number of selected antitumor-positive Enterococcus faecium strains attached to intestinal epithelial cells.
  • LMT17-62 exhibited an intestinal fixation force of 0.31%, LMT17-74 1.55%, LMT15-24 0.46%, and LMT17-25 0.48% against intestinal epithelial cells (Caco-2). confirmed to have.
  • Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis LMT19-32
  • Example 1 Isolation and identification of Enterococcus faecalis LMT19-32 strain
  • Enterococcus faecalis strains were isolated from adult fecal samples.
  • the sample was smeared on MRS medium (Difco Co., USA) and cultured anaerobically at 30°C.
  • MRS medium Denssion Resistive Staline medium
  • the sample was taken aseptically, diluted with 180 ml of 0.85% NaCl solution, and the fecal stock solution was homogenized with a stomacher for 5 minutes.
  • a fecal sample was prepared by serially diluting the homogenized sample in a tube containing 9 ml of a sterile 0.85% NaCl solution.
  • the sample was spread on MRS plate medium (Difco, USA) and cultured at 37°C for 2-3 days.
  • the selected Enterococcus faecalis strain was cultured in MRS plate medium (Difco, USA) and the colony shape was observed.
  • the colony forms in the MRS plate medium of the selected Enterococcus faecalis strain and the Enterococcus faecalis type strain KCTC3206 are shown in Table 6 below.
  • LMT19-32 KCTC3206 form circle circle size 0.8mm 0.8mm color cream color cream color transparency opacity opacity bump convex convex surface lubricity lubricity aerobic growth + + anaerobic growth + +
  • FIG. 7 shows representative optical micrographs of the selected Enterococcus faecalis LMT19-32 strain and KCTC3206 strain, which is a type strain. As shown in FIG. 7 , the LMT19-32 strain was similar to a typical Enterococcus genus as a cocci.
  • the 16S rRNA gene of the isolated LMT19-32 strain was amplified, and the nucleotide sequence of the amplified 16S rRNA gene was analyzed.
  • the amplification was performed using the LMT19-32 strain genomic DNA as a template and PCR using the oligonucleotide of SEQ ID NO: 11 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 12 (Macrogen Co., Ltd.) as a primer set.
  • the nucleotide sequence of 16S rDNA of the isolated LMT19-32 strain is shown in SEQ ID NO: 13.
  • the nucleotide sequence of the identified 16S rDNA was compared with the nucleotide sequence of the known 16S rDNA using NCBI blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  • the 16S rDNA of LMT19-32 had 100% sequence identity with Enterococcus faecalis species.
  • LMT19-32 was the same as that of Enterococcus faecalis.
  • the LMT19-32 strain was identified as a new strain belonging to a new Enterococcus faecalis species.
  • LMT19-32 lactic acid bacteria as " Enterococcus faecalis LMT19-32" (Accession No.: KCTC14306BP), and it was transferred to the Korea Cell Line Bank (Korean Collection for Type Cultures, KCTC) at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology 2020 Deposited on September 9, 2017.
  • Example 2 Characterization of physiological activity of Enterococcus faecalis LMT19-32 strain
  • the sugar metabolism characteristics of the selected LMT19-32 strain were confirmed by using the API 50 CHL kit (BioMetrieux, France) according to the supplier's experimental method.
  • Table 7 shows the sugar fermentation characteristics of the identified LMT19-32 strain.
  • the Enterococcus faecalis LMT19-32 strain was shown to have somewhat low acid resistance, so it may be preferable to use a capsule or a coating agent during formulation.
  • a human epithelial colorectal adenocarcinoma cell Caco-2 cell line (KCLB 30037.1) purchased from the Korea Cell Line Bank was used.
  • Caco-2 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco, USA) containing 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco, USA) under 5% CO 2 , 37°C conditions at 7 x 10 4 cells/100 ⁇ l. , and cultured to form a cell monolayer in a 96-well plate (Corning, USA).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the LMT19-32 strain cultured in MRS liquid medium was washed with PBS and then suspended in DMEM medium without antibiotic added, and the amount of LMT19-32 strain was 1x10 7 CFU in Caco-2 cells constituting the cell monolayer. It was added as much as possible, and incubated for 2 hours at 5% CO 2 , 37° C. conditions.
  • the cells were washed 5 times with PBS, and the adhered cells were removed with 100 ⁇ l of 0.1% Triton X-100, and then plated on MRS solid medium. After culturing at 37° C. for 24 hours, the number of colonies on the plate medium was counted to investigate the intestinal fixability of the LMT19-32 strain.
  • Table 10 is a view showing the number of Enterococcus faecalis LMT19-32 strain adhered to intestinal epithelial cells. As shown in Table 10, it was confirmed that the novel Enterococcus faecalis LMT19-32 strain of the present invention and the comparative strain Enterococcus faecalis KCTC3206 both had anchoring power to Caco-2, which is about 1% of intestinal epithelial cells.
  • Example 3 Evaluation of anti-tumor efficacy of Enterococcus faecalis LMT19-32 strain 1. Induction of tumor model in mice and administration of Enterococcus faecalis LMT19-32 strain
  • C57BL/6 mice male, 20-22 g used in the mouse tumor induction model were purchased from Orient Bio, and were acclimatized to the environment for one week before the start of the experiment.
  • 2.5 x 10 5 MC38 cells derived from colorectal cancer of C57BL/6 mice were injected into the subcutaneous tissue of the back of the mouse, and groups were separated based on the tumor size (50-70 mm 3 ) one week after the tumor injection.
  • the Enterococcus faecalis LMT19-32 strain was orally administered with 1 x 10 9 CFU strain per mouse using a sonde once every two days, and as a positive control, an anti-PD1 antibody (clone number: RMP1- 14, Manufacturer: Bioxcell, Product name: InvivoMAb anti-mouse PD-1) was administered intraperitoneally at an intraperitoneal dose of 10 mg per kg of mouse weight twice a week.
  • PBS was orally administered.
  • the experimental group consisted of 3 groups of 10 animals in each group, as shown in Table 11.
  • Tumor size was measured up to 21 days after injection of the MC38 tumor cell line into mice, and then, the mice were sacrificed using carbon dioxide to extract the tumor, and tumor-infiltrating immune cell analysis was performed.
  • the analysis results are shown in Figures 9a, 9b and 9c.
  • 9A, 9B and 9C show tumor-infiltrating T cells, CD8 T cells and CD8 T cells expressing IFN ⁇ , that is, IFN ⁇ + CD8 T cells, after administration of Enterococcus faecalis LMT19-32 strain to tumor-bearing mice. shows the results of the analysis.
  • the MC38 tumor cell line is mouse colon adenocarcinoma cells induced by subcutaneous injection of dimethylhydrazine into C57BL/6 mice.
  • the mouse tumor induction model used in this Example is one in which MC38 tumor cells are transplanted into the subcutaneous tissue
  • the effect of the orally administered strain is not directly in contact with the tissue, for example, cancer growth inhibition of the subcutaneous tissue.
  • FIGS. 8a and 8b are diagrams showing the results of measuring the tumor size after administration of the Enterococcus faecalis LMT19-32 strain to tumor-bearing mice.
  • the dosing was performed according to section 1. Specifically, the size of the tumor was measured twice a week from 7 days after injection of the tumor cell line to 21 days. In order to accurately measure the size of the tumor, the long axis and the short axis of the tumor were measured using a vernier caliper, and the tumor size was calculated using the formula of 'long axis x (short axis) 2 /2'.
  • the control group was administered with PBS as a negative control
  • aPD1 was administered with an anti-PD1 antibody as a positive control
  • LMT19-32 was administered with LMT19-32 as an experimental group.
  • 8A graph shows the tumor size according to the number of days after cell injection
  • FIG. 8B shows the tumor size on the 21st day after cell injection.
  • the horizontal axis represents days after tumor cell administration as days of measuring tumor size.
  • the bars indicate the tumor size for each individual on the 21st day after cell injection.
  • a statistically significant tumor growth inhibition was observed in the LMT19-32 strain alone administration group.
  • CD8 T cells which are tumor-infiltrating immune cells, are important markers of anticancer responses, and interferon gamma and granzyme B, which are secreted by CD8 T cells, are functional cytokines that show the activation ability of immune cells.
  • 9a, 9b and 9c show the results of analyzing the CD8 T cells infiltrating the tumors and cytokine secretion by them after administration of the Enterococcus faecalis LMT19-32 strain to tumor-bearing mice. Dosing was performed according to section 1. The tumor was excised 21 days after administration.
  • the extracted tumors were separated into single cells using RPMI1640 medium containing 50 ug/ml Liberase and 40 ug/ml DNase I and a cell strainer.
  • the isolated cells were stimulated with 50 ng/ml PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) and 500 ng/ml Ionomycin in RPMI1640 medium containing 10% FBS for 4 hours.
  • PMA and ionomycin substances are substances that signal stimulation to activate T cells, and act as the mechanism of activation of T cells by an actual antigen, creating an environment in which an immune response occurs.
  • Ionomycin increases PKC (protein kinase C), and in the case of PMA, it synergizes to target CD4 T cells and CD8 T cells by phosphorylating PKC. .
  • the cells were stained with the antibodies of Table 12 for immune cell analysis and interferon gamma generation confirmation, and analyzed using CANTO II flow cytometry equipment.
  • 9A, 9B, and 9C show the total number of tumor-infiltrating T cells, the number of CD8 T cells in the tumor-infiltrating T cells, and the number of IFN ⁇ expressing cells in the CD8 T cells, respectively.
  • the number of tumor-infiltrating T cells and the number of CD8 T cells were significantly increased in the LMT19-32 administration group compared to the PBS treatment group.
  • the number of CD8 T cells producing interferon gamma, an activator was also significantly increased in the LMT19-32 treatment group compared to the PBS control group.

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Abstract

항암 활성을 갖는 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 미생물 또는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 미생물 또는, 그를 포함하는 조성물 및 그를 이용한 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

Description

항종양 세균 균주, 및 이를 이용한 조성물 및 방법
본 개시는 항종양 세균 균주, 및 이를 이용한 조성물 및 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항종양 활성을 나타내는 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 종의 세균 균주, 및 이를 이용하여 종양을 예방하거나 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
또한, 본 개시는 항종양 세균 균주, 및 이를 이용한 조성물 및 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항암 활성을 갖는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 미생물, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 암 예방 또는 치료에 관한 것이다.
장내 세균(gut bacteria)을 다양한 질병이나 장애를 예방하거나 치료하는데 사용할 수 있음이 알려져 있다.
국제공개 제WO2016/196605호는 대상에서 하나 이상의 공생 미생물(commensal microbes)의 수준을 조절하여 대상에 의한 면역 반응을 향상시키고/거나, 암의 성장 또는 확산을 억제하고/거나, 암에 의한 면역 회피를 억제하고/거나, 치료제의 효능을 향상시킴으로써, 대상에서 암을 치료하거나 예방하는 방법을 개시하고 있다. 이 문헌은 공생 미생물로서 Adlercreutzia, Oscillopira, Mollicutes, Butyrivibrio, Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Bifidobacterium, Rikenella, Alistipes, Marinilabilia, Anaerostipes, Escherichia, Lactobacillus　속을 예로 들고 있으며, 특히 비피도박테리움(Bifidobacterium)　속의 세균과 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 병용하여 암을 치료하는 방법을 개시하고 있다.
국제공개 제WO2017/085520호는 엔테로코커스 갈리나룸(Enterococcus gallinarum)　종의 세균 균주를 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 조성물을 개시하고 있다.
국제공개 제WO2017/085518호는 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)　종의 세균 균주를 포함하는 IL-17 또는 Th17 경로에 의해 매개되는 질환이나 이상을 치료하거나 예방하는 방법에 사용하기 위한 조성물을 개시하고 있다.
지금까지 엔테로코커스 패시움 종에 있어서 항종양 활성과 미생물 성장 대비 특정 대사체(metabolite) 생성능의 연관성에 대해서는 알려진 바 없었다.
또한, 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)는 사람 및 다른 포유동물의 위장관에서 발견된다. 엔테로코커스 패칼리스는 그람-양성, 구균 박테리아이다. 엔테로코커스 패칼리스는 온도 10 내지 45℃에서 성장할 수 있다.
한국특허 공개 10-2020-0054589는 유당 함량을 낮출 수 있는 효과를 가진 엔테로코커스 패칼리스 KACC 92220P를 개시한다. 또한, 한국특허 10-2053730은 항산화, 항염 또는 항균 활성을 갖는 엔테로코커스 패칼리스 AMI-1001 균주를 개시한다.
그러나, 상기한 선행기술에 의하더라도 항암 활성을 갖는 엔테로코커스 패칼리스에 대한 요구가 있다.
본 개시의 제1 목적은 미생물 성장 대비 락테이트(lactate) 생성능에 특징이 있는 항종양 활성을 갖는 엔테로코커스 패시움 종의 세균 균주를 제공하는 것이다.
본 개시의 제2 목적은 유효성분으로 상기 엔테로코커스 패시움 종의 세균 균주를 포함하는 종양을 예방하거나 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 개시의 제3 목적은 상기 엔테로코커스 패시움 종의 세균 균주 또는 상기 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 종양을 예방하거나 치료하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 개시의 제4 목적은 항 종양 활성을 가진 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) LMT19-32 (수탁번호 KCTC 14306BP) 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물을 제공한다.
본 개시의 제5 목적은 유효성분으로서 상기 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물을 함유하는 암을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 개시의 제6 목적은 유효성분으로서 상기 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물을 함유하는 암을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물을 제공한다.
본 개시의 제7 목적은 암을 치료하기에 유효한 양의 상기 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시의 제1 측면은
i) 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 종에 속하고,
ii) 48 시간 배양 시 미생물 성장 대비 락테이트 생성능(lactate/OD600)이 3 g/L 이상이고;
iii) 항종양 활성을 나타내는,
세균 균주에 관한 것이다.
본 개시의 제2 측면은 유효성분으로 상기 엔테로코커스 패시움 종의 세균 균주를 포함하는, 종양을 예방하거나 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 개시의 제3 측면은 상기 엔테로코커스 패시움 종의 세균 균주, 또는 상기 조성물을 종양의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 종양을 예방하거나 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 개시의 제4 측면은 항 종양 활성을 가진 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) LMT19-32 (수탁번호 KCTC 14306BP) 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물에 관한 것이다.
본 개시의 제5 측면은 유효성분으로서 상기 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물을 함유하는 암을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 개시의 제6 측면은 유효성분으로서 상기 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물을 함유하는 암을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물에 관한 것이다.
본 개시의 제7 측면은 암을 치료하기에 유효한 양의 상기 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 암을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 개시에 따른 세균 균주는 종양 침윤 T 세포, CD8 T 세포, 및 IFNγ+ CD8 T 세포 수를 증가시키고 이에 따라 우수한 종양 억제 활성을 나타내는바, 종양을 예방하거나 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시에 따른 항 종양 활성을 가진 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) LMT19-32 (수탁번호 KCTC 14306BP) 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물에 의하면, 암을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시에 따른 암을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물에 의하면, 암을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시에 따른 암을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물에 의하면, 암을 예방 또는 개선할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시에 따른 개체의 암을 예방 또는 치료하는 방법에 의하면, 암을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 본 개시의 일 태양에 따른 엔테로코커스 패시움 LMT17-62 균주와 타입 균주인 KCTC13225 균주의 광학현미경 사진이다.
도 2a는 마우스 종양 유도 모델에서 선발된 엔테로코커스 패시움 균주의 종양 성장 억제율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 엔테로코커스 패시움 LMT17-62 균주 투여군에서 시간에 따른 종양 크기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2c는 엔테로코커스 패시움 LMT17-62 균주 투여군에서 종양 침윤 전체 T 세포, CD8 T 세포 및 인터페론 감마 양성 CD8 T 세포 수의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 선발된 엔테로코커스 패시움 균주의 성장(OD600) 곡선이다.
도 3b는 선발된 엔테로코커스 패시움 균주의 배양 시간에 따른 락테이트 생성 량을 나타낸 그래프이다.
도 3c는 24시간 및 48시간 배양 후 선발된 엔테로코커스 패시움 균주의 성장(OD600) 대비 락테이트 생성 량(g/L)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 pH 2.5에서 배양 시 선발된 엔테로코커스 패시움 균주의 생균 수를 나타낸 그래프이다.
도 5는 담즙염 함유 배지에서 배양 시 선발된 엔테로코커스 패시움 균주의 생균 수를 나타낸 그래프이다.
도 6은 장내 상피세포에 부착된 선발된 항종양 양성 엔테로코커스 패시움 균주의 생균 수를 나타낸 그래프이다.
도 7은 선발된 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주와 타입 균주인 KCTC3206 균주의 대표적 광학현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 8a, 및 8b는 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주를 종양을 가진 마우스에 투여한 후 종양 크기를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9a, 9b, 및 9c는 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주를 종양을 가진 마우스에 투여한 후 종양에 침윤된 T 세포, CD8 T 세포 및 IFNγ+ CD8 T 세포를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
I. 엔테로코커스 패시움 ( Enterococcus faecium )
본 개시는 미생물 성장 대비 락테이트 생성능에 특징이 있는 엔테로코커스 패시움 종의 세균 균주가 우수한 항종양 활성을 나타내는 사실을 발견한 것에 기초한 것이다.
용어 "종양" 및 "암"은 호환 가능하게 사용되며, 예를 들어 고형 및 액상, 예를 들어 미만성 또는 순환 종양을 포괄한다. 이는 전암성 뿐만 아니라 악성 암 및 종양을 포함한다. 이는 또한, 원발성 악성 세포 또는 종양 및 속발성 악성 세포 또는 종양(예를 들어, 전이 종양)을 포함한다.
용어 "항종양" 및 "항암"은 예를 들어 종양 크기의 감소, 종양 세포의 수의 감소, 종양 세포 증식의 감소, 또는 종양 세포 생존의 감소를 포함하나 이에 제한되지 않는, 다양한 수단에 의해 나타낼 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다.
본 개시의 일 측면은
i) 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 종에 속하고,
ii) 48 시간 배양 시 미생물 성장 대비 락테이트 생성능(lactate/OD600)이 3 g/L 이상이고;
iii) 항종양 활성을 나타내는,
세균 균주에 관한 것이다.
일 태양에서, 세균 균주는 24 시간 배양 시 미생물 성장 대비 락테이트 생성능(lactate/OD600)이 2.5 g/L 초과인 것일 수 있다.
일 태양에서, 세균 균주는 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상의 종양 성장 억제율(tumor growth inhibition rate)을 나타내는 것일 수 있다. 특정 예에서, 세균 균주는 10% 내지 40%, 15% 내지 40%, 20% 내지 40%, 25% 내지 40%, 30% 내지 40%, 35% 내지 40%의 종양 성장 억제율을 나타내는 것일 수 있다.
일 태양에서, 세균 균주는 iv) 베타-갈락토시데이제(β-galactosidase) 활성을 갖는 것일 수 있다.
일 태양에서, 세균 균주는 v) D-소르비톨(D-sorbitol) 분해능을 갖는 것일 수 있다.
일 태양에서, 세균 균주는 vi) D-타가토스(D-tagatose) 분해능을 갖는 것일 수 있다.
일 태양에서, 세균 균주는 vii) 메틸-aD-만노피라노시드(Methyl-aD-mannopyranoside) 분해능을 갖는 것일 수 있다.
일 태양에서, 세균 균주는 상기 i) 내지 iii)의 세 가지 특성, i) 내지 iv)의 네 가지 특성, i) 내지 v), i) 내지 iv), i) 내지 vi) 또는 i) 내지 vii)의 다섯 가지 특성, 또는 i) 내지 vi) 또는 i) 내지 vii)의 여섯 가지 특성, 또는 i) 내지 vii)의 일곱 가지 특성을 만족시키는 것일 수 있다.
구체예에서, 세균 균주는 아래 표 1에 나타낸 것들 중 하나 이상의 것일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
명칭 수탁번호 특성
락테이트/
OD600(g/L)		 β-갈락토시데이제 D-소르비톨 D-타가토스 메틸-aD-만노피라노시드
LMT17-62 KCTC 14284BP >3 + + + +
LMT17-74 KCTC 14285BP >3 + + + +
LMT15-24 KCTC 14289BP >3 + + + -
LMT17-25 KCTC 14288BP >3 + - - -
LMT15-4 KCTC 14290BP >3 - - - -
본 개시의 제2 측면은 유효성분으로 상기 세균 균주를 포함하는, 종양을 예방하거나 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다. 용어 "치료하다", "치료하는 것" 또는 "치료"는 예컨대 상처를 입거나 손상된 조직의 치유, 또는 기존의 것이거나 인지된 질환, 장애 또는 이상을 변경, 변화, 강화, 개선, 개량 및/또는 미화하는 것에 의해, 원하는 치료상의 결과를 달성하도록 하는, 질환, 장애 또는 이상의 경감 또는 감소(일부 감소, 상당한 감소, 거의 완전한 감소 및 완전한 감소 포함), 해결 또는　예방(일시적이거나 영구적인 것)을 의미한다.
용어 "예방"은 질병, 장애 또는 질환의 발병의 지연을 의미한다. 질병, 장애 또는 질환의 발병이 예정된 기간 동안 지연된 경우 예방은 완전한 것으로 간주될 수 있다.
일 태양에서, 상기 조성물에 포함되는 세균 균주는 생균체 또는 사균체로서 존재할 수 있으며, 건조 또는 동결건조된 형태로 존재할 수도 있다.
일 태양에서, 세균 균주는 배양물이나 분리된 균주 등을 비롯하여 항종양 활성을 유지하는 한 어떠한 형태로도 사용될 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것이다. 용어 "배양물"은 본 개시의 세균 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정 기간 배양하여 얻는, 배양된 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 조성물을 의미한다.
일 태양에서, 상기 조성물은　경구　또는 비경구로 투여하기 위한 것일 수 있다. 비경구　투여는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여, 종양 내 투여 등을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 특정 예에서, 상기 조성물은 경구로 투여하기 위한 것일 수 있다.
상기 조성물은 약제학적 조성물일 수 있으며, 이 경우 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 추가로 포함하여 제제화될 수 있다. 상기 담체 또는 첨가제는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 코팅제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 발색제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 항산화제, 완충액, 정균제 등을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환제, 산제, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 조성물은 식품 또는 식품 첨가제 조성물일 수 있으며, 이 경우 식품학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다. 상기 희석제는 물, 배지 또는 PBS와 같은 완충액일 수 있다. 상기 담체는 통상적인 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 증점제 또는 충진제일 수 있다. 상기 식품은 건강기능성 식품일 수 있다. 상기 식품은 음료류, 과자류, 다이어트바, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류 등일 수 있다.
상기 조성물이 경구 투여용인 경우, 세균 균주의 내산성, 내열성, 내담즙성, 생존율, 장내 정착성 등을 높이기 위하여 코팅제로 코팅할 수 있는바, 사용 가능한 코팅제는 장용　코팅제; 젤라틴, 다당류, 검류 등; 수용성 폴리머, 히알루론산, 다공성 입자 및 단백질; 카제인, 및 코팅제, 식용유지, 락토바실러스 플란타룸의 Extracellular Polymeric Substance, 및 알긴산; 실크 피브로인 등을 포함하지만 이들로 특별히 제한되는 것은 아니며, 단일 코팅 또는 다중 코팅, 예를 들어 이중, 삼중 또는 사중 코팅될 수 있다.
일 태양에서, 종양은 고형암(solid tumor)일 수 있다. 고형암의 비제한적인 예들은 유방암, 폐암, 두부 또는 경부암, 대장암, 식도암, 후두암, 위암, 간암, 췌장암, 골암, 피부암, 피부 또는 안구내　흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 및 뇌하수체 선종을 포함할 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 태양에서, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 투여 기간 또는 간격, 배설율, 체질 특이성, 제제의 성질, 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 유효성분인 세균 균주를 1×106 CFU 이상, 1×107 CFU 이상, 1×108 CFU 이상, 1×109 CFU 이상으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 세균 균주를 1×1015 CFU 이하, 1×1014 CFU 이하, 1×1013 CFU 이하, 1×1012 CFU 이하로 투여할 수 있다. 예를 들어, 세균 균주를 1×106 ~ 1×1015 CFU, 1×107 ~ 1×1014 CFU, 1×108 ~ 1×1013 CFU, 1×109 ~ 1×1012 CFU, 1×1010 ~ 1×1012 CFU, 1×1011 ~ 1×1012 CFU로 투여할 수 있다. 예를 들어, 유효 성분인 세균 균주를 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
일 태양에서, 상기 조성물은 하나 이상의 다른 치료제, 예를 들어 항암제, 항바이러스제, 사이토카인 또는　면역작용제와 병용하기 위한 것일 수 있다.
용어 "병용"은 사전에 투여된 치료제가 체내에서 여전히 유효한 동안 제2 치료제가 투여되도록 하는 2종 이상의 상이한 치료제의 임의의 형태를 가리킨다. 예를 들어, 2종의 치료제는 대상에서 동시에 유효하며, 이는 2종의 치료제의 상승 효과를 포함할 수 있다. 상이한 치료제는 단일의 제제 또는 별개의 제제로 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
구체예에서, 항암제는 화학치료제일 수 있다. 화학치료제의 비제한적인 예는 알킬화제, 나이트로소우레아제, 항대사물질,　항암　항생제, 식물-기원 알칼로이드, 토포아이소머라제 저해제, 호르몬 약물, 호르몬 길항제, 백혈구감소증(호중구감소증) 치료 약물, 혈소판감소증 치료 약물, 항구토제, 아로마타제 저해제, P-당단백질 저해제, 백금 착물 유도체, 다른　면역치료 약물 및 다른　항암　약물을 포함한다. 병용 투여될 수 있는 예시적인 세포독성제는 항미세소관 작용제, 토포아이소머라제 저해제, 항대사물질, 유사분열 저해제, 알킬화제, 안트라사이클린, 빈카 알카로이드, 인터칼레이팅제, 신호 전달 경로를 방해할 수 있는 작용제, 아포토시스를 촉진하는 작용제, 프로테오좀 저해제 및 방사선(국소 또는 전신 조사)을 포함한다. 추가적인 치료제의 비제한적인 예는 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 융합 단백질, 핵산 분자, 소분자, 모방 작용제, 합성 약물, 무기 분자 및 유기 분자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
구체예에서, 항암제는 면역항암제일 수 있다. 용어 "면역항암제"는 암세포에 대한 신체의 면역 반응을 간접적으로 또는 직접적으로 증강, 자극 또는 증가시키고/거나 다른 항암 요법의 부작용을 감소시키는 화합물, 조성물 또는 치료를 의미한다. 면역항암제의 비제한적인 예는 사이토카인, 암 백신, 단일클론 항체, 비사이토카인 보조제, 면역 세포(T 세포, NK 세포, 수지상 세포, B 세포 등), 면역관문 억제제 등을 포함한다. 구체예에서, 면역항암제는 면역관문 억제제이다. 면역관문 억제제는 펩티드, 항체, 핵산 분자 및 소형 분자를 포함한다. 예를 들어, 면역관문 억제제는 대상에서 CD8+ T 세포의 증식성, 이동성, 지속성 및/또는 세포독성 활성, 및 특히 대상의 CD8+ T 세포의 종양 침윤성을 증강시키기 위해 투여될 수 있다. 전형적으로, 면역관문 억제제는 활성화된 T 림프구, 예를 들어 세포독성 T 림프구-연관 단백질 4(CTLA4) 및 프로그램된 세포사멸 1(PD-1), 또는 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR) 패밀리의 다양한 구성원과 같은, NK 세포에 의해 발현되는 면역억제성 수용체를 차단하는 길항제이거나, 이들 수용체의 주요 리간드, 예를 들어 PD-1 리간드 CD274(PD-L1 또는 B7-H1로 가장 잘 알려짐)를 차단하는 길항제이다. 예를 들어, 면역관문 억제제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 구체적으로, 면역관문 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM-3 항체, 항-LAG3 항체, 항-IDO1 항체, 항-TIGIT 항체, 항-B7H3 항체, 항-B7H4 항체, 항-BTLA 항체, 및 항-B7H6 항체, 및 이의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 면역관문　억제제는 이필리무맙(Ipilimumab)(여보이®, BMS/오노), 트레멜리무맙(Tremelimumab)(아스트라제네카), 아테졸리주맙(atezolizumab)(티쎈트릭®, 로슈), 니볼루맙(nivolumab)(옵디보®, BMS/오노), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)(키트루다®, MSD), 아벨루맙(Avelumab)(바벤시오®, 화이자/독일머크), 더발루맙(Durvalumab)(임핀지®, 아스트라제네카/메드이뮨), 및 이의 항원-결합 단편 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 태양에서, 면역항암제는 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 엑스제, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등의 비경구 제형과 같이 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 면역항암제는 경구 투여되거나,　정맥　내, 복강 내, 피하, 피내, 근육 내, 척추, 척추강 또는 직장 내 국소 투여 또는 주입 등을 포함한 다양한 경로를 통해 비경구 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 투여 기간 또는 간격, 배설율, 체질 특이성, 제제의 성질, 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 약 0.1 내지 10,000 ㎎/㎏의 범위일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.
본 개시의 제3 측면은 상기 세균 균주, 또는 상기 조성물을 종양의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 종양을 예방하거나 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
용어 "투여" 또는 "투여하는 것"은 유효성분 또는 이를 포함하는 조성물을 대상에게 제공하는 단계를 의미한다. 유효성분 또는 이를 포함하는 조성물은 다양한 적절한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
투여되는 대상은 인간이나 동물, 예를 들어 인간, 돼지, 개, 고양이, 소, 말, 쥐 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
II. 엔테로코커스 패칼리스( Enterococcus faecalis ) LMT19-32
제1 측면은 항 종양 활성을 가진 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) LMT19-32 (수탁번호 KCTC 14306BP) 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물을 제공한다.
상기 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물은, 종양 성장을 억제할 수 있다. 상기 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물은 종양 내 면역세포의 수준을 증가시킬 수 있다. 상기 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물은 종양 내 CD8 T 세포, 예를 들면 IFNγ를 발현하는 CD8 T 세포의 수준을 증가시킬 수 있다. 상기 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물은 면역세포의 종양 내로의 침윤을 증가시킬 수 있다. 상기 면역세포는 CD8 T 세포, CD4 T 세포, NK 세포, B 세포, 수지상 세포, 대식세포, 및 호중구일 수 있다. 상기 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물은 면역세포를 활성화시킬 수 있다. 상기 활성화는 상기 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물이 항 종양 활성을 갖는 사이토카인 또는 효소의 생산, 분비 또는 생산 및 분비를 촉진하도록 하는 것일 수 있다. 상기 사이토카인 또는 효소는 인터페론 감마 및 그랜자임 B 중 하나 이상일 수 있다. 상기 미생물은 내담즙성, 및 장내 정착성이 우수하다. 상기 미생물은 사람 분변으로부터 분리되었다.
상기 내담즙산성은 0.3% 담즙산 함유 MRS 배지에서 37℃에서 2시간 배양한 경우 생존율이 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 75 내지 90%, 75 내지 95%, 80 내지 90%, 80% 내지 95%, 85% 내지 90%, 또는 90 내지 95%일 수 있다.
상기 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물은 CD8 T 세포의 종양으로 침윤을 촉진할 수 있다. 상기 촉진은 상기 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물이 존재하지 않는 경우에 비하여, 종양 내 T 세포 수에 대한 CD8 T 세포 수의 백분율을 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 5% 내지 100%, 10% 내지 100%, 20% 내지 100%, 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 또는 90% 내지 100% 증가시키는 것일 수 있다.
상기 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물은 종양 침윤 CD8 T 세포의 인터페론 감마 및 그랜자임 B 중 하나 이상의 생산, 분비 또는 생산 및 분비를 촉진할 수 있다. 상기 촉진은 상기 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물이 존재하지 않는 경우에 비하여, CD8 T 세포 중 인터페론 감마를 생산하는 세포의 백분율을 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 5% 내지 100%, 10% 내지 100%, 20% 내지 100%, 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 또는 90% 내지 100% 증가시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 촉진은 상기 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물이 존재하지 않는 경우에 비하여, CD8 T 세포 중 그랜자임 B를 생산하는 세포의 백분율을 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 5% 내지 100%, 10% 내지 100%, 20% 내지 100%, 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 또는 90% 내지 100% 증가시키는 것일 수 있다.
상기 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물은 CD8 T 세포에 의한 종양의 성장을 억제할 수 있다. 상기 억제는 상기 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물이 존재하지 않는 경우에 비하여, 종양의 크기를 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 5% 내지 100%, 10% 내지 100%, 20% 내지 100%, 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 또는 90% 내지 100% 감소시키는 것일 수 있다.
제2 측면은 유효성분으로서 상기한 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물을 함유하는 암을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 약제학적 조성물에 있어서, 상기 암은 고형암일 수 있다. 상기 암은 상기 미생물이 경구 투여되었을 때 직접적으로 접촉하는 조직이 아닌 다른 조직에 존재하는 고형암일 수 있다. 상기 직접적으로 접촉하는 조직은 구강, 식도, 위, 십이지장, 소장, 대장 및 결장을 포함한다. 또한, 상기 직접적으로 접촉하는 조직이 아닌 다른 조직은 유방, 폐, 두부, 경부, 간, 췌장, 골, 나팔관, 장궁, 질, 음문, 갑상선, 부갑상선, 부신, 연조직, 요도, 음경, 전립선, 방광, 신장, 수뇨관, 또는 CNS일 수 있다. 상기 암은 전이암일 수 있다. 상기 암은 예를 들어 "I. 엔테로코커스 패시움"에 열거된 암일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
상기 약제학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은 암의 성장을 억제하기 위한 것일 수 있다.
상기 약제학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은 면역 체크포인트 억제제와 함께 투여하기 위한 것일 수 있다. 상기 면역 체크포인트 억제제는 상기한 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물의 투여 전, 동시 또는 투여 후에 투여하기 위한 것일 수 있다.
상기 면역 체크포인트 억제제는 예를 들어 "I. 엔테로코커스 패시움"에 열거된 것들일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
상기 약제학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은 화학치료제와 함께 투여하기 위한 것일 수 있다. 상기 화학치료제는 상기한 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물의 투여 전, 동시 또는 투여 후에 투여하기 위한 것일 수 있다.
상기 화학치료제는 예를 들어 "I. 엔테로코커스 패시움"에 열거된 것들일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
상기 약제학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 안정화제, 부형제, 희석제, 또는 보조제일 수 있다. 상기 담체는 예를 들면, 약제학적 투여에 적합한, 특히 경구 투여에 적합한 임의의 및 모든 수성 및 비수성 용액, 멸균 용액, 용매, 완충제, 예를 들어, 인산염 완충 식염수(PBS) 용액, 물, 현탁액, 에멀션, 예를 들어 오일/물 에멀션, 다양한 유형의 습윤제, 리포솜, 분산매 및 코팅제일 수 있다. 약제학적 조성물에서 이러한 매질 및 작용제의 용도는 당해 분야에 잘 알려져 있고, 이러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 통상적인 방법에 의해 제형화될 수 있다.
상기 조성물은 상기 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물을 "치료학적 유효량"으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "치료학적 유효량"은 1회 또는 2 회 이상의 투여시 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 치료 효과를 나타내기에 충분한 양을 의미한다. 용어 "치료"는 개체, 예를 들면 사람을 포함한 포유류에서 암 질환 또는 암 의학적 증상을 치료함을 의미하고, 이는 다음을 포함한다: 암 질환 또는 암의 의학적 증상의 완화; 암 질환 또는 암의 의학적 증상의 억제, 즉, 개체에서 질환 또는 의학적 증상의 진행을 늦춤 또는 정지; 또는 개체에서 암 질환 또는 암의 의학적 증상을 경감. 상기 "유효량"은 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 상기 "유효량"은 조성물 중량에 대하여 0.01 내지 50 중량 %, 또는 0.1 내지 20 중량 %일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 조성물 중량 기준으로 1x106 CFU/g 이상, 1x107 CFU/g 이상, 1x108 CFU/g 이상, 1x109 CFU/g 이상으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 세균 균주를 1x1015 CFU/g 이하, 1x1014 CFU/g 이하 1x1013 CFU/g 이하, 1x1012 CFU/g 이하로 투여할 수 있다. 예를 들어, 1x106 CFU/g 내지 1x1015 CFU/g, 1x107 CFU/g 내지 1x1014 CFU/g, 1x108 CFU/g 내지 1x1013 CFU/g, 1x109 CFU/g 내지 1x1012 CFU/g, 1x1010 CFU/g 내지 1x1012 CFU/g의 세균 균주를 포함할 수 있다.
상기 조성물은 경구 투여될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 정제, 캡슐제, 액체 제제 예를 들면, 수성액제, 건조 시럽제 또는 현탁제 등의 다양한 형태로 제제화될 수 있다. 경구용 정제의 경우 락토즈, 옥수수 전분 등의 부형제 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제가 통상 가해질 수 있다. 경구투여용 캡슐제의 경우, 락토즈 및/또는 건조 옥수수 전분이 희석제로서 사용될 수 있다. 경구용 수성 현탁제가 필요할 경우, 활성성분을 유화제 및/또는 현탁화제와 결합시킬 수 있다. 필요할 경우, 특정 감미제 및/또는 향미제를 가할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 상기 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물이 위액과 같은 산성에서 안정화될 수 있도록 하는 제형일 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 상기 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물이 내부에 포함되어 있는 캡슐제 또는 상기 미생물 또는 그 배양물 또는 추출물이 피막으로 코팅된 정제일 수 있다.
제3 측면은 유효성분으로서 상기한 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물을 함유하는 암을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 식품학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 안정화제, 부형제, 희석제, 또는 보조제일 수 있다. 상기 담체는 예를 들면, 약제학적 투여에 적합한, 특히 경구 투여에 적합한 임의의 및 모든 수성 및 비수성 용액, 멸균 용액, 용매, 완충제, 예를 들어, 인산염 완충 식염수(PBS) 용액, 물, 현탁액, 에멀션, 예를 들어 오일/물 에멀션, 다양한 유형의 습윤제, 리포솜, 분산매 및 코팅제일 수 있다. 약제학적 조성물에서 이러한 매질 및 작용제의 용도는 당해 분야에 잘 알려져 있고, 이러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 통상적인 방법에 의해 제형화될 수 있다.
상기 식품은 유제품, 콩 제품, 채소 및 과실 제품, 또는 식품 첨가제일 수 있다. 상기 유제품은 발효유, 버터, 치즈, 또는 분유일 수 있다. 상기 식품은 건강기능식품일 수 있다. 상기 건강기능식품은 암 예방 또는 개선용 건강기능식품일 수 있다. 상기 식품은 또한 음료류, 과자류, 다이어트바, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류일 수 있다.
상기 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다.
식품제조에 사용되는 탄수화물은 모노사카리드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카리드, 예를 들어 말토스, 수크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카리드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알콜일 수 있다. 또한 향미제로서 천연 향미제 및 사카린 및 아스파르탐과 같은 합성 향미제를 사용할 수 있다. 천연 향미제는 타우마틴, 레바우디오시드 A, 및 글리시르히진과 같은 스테비아 추출물일 수 있다. 건강기능식품은 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미한다.
상기 조성물에 있어서, 상기 미생물은 조성물 중량에 대하여 0.01 내지 50 중량 %, 또는 0.1 내지 20 중량 %일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 조성물 중량 기준으로 1x106 CFU/g 이상, 1x107 CFU/g 이상, 1x108 CFU/g 이상, 1x109 CFU/g 이상으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 세균 균주를 1x1015 CFU/g 이하, 1x1014 CFU/g 이하 1x1013 CFU/g 이하, 1x1012 CFU/g 이하로 투여할 수 있다. 예를 들어, 1x106 CFU/g 내지 1x1015 CFU/g, 1x107 CFU/g 내지 1x1014 CFU/g, 1x108 CFU/g 내지 1x1013 CFU/g, 1x109 CFU/g 내지 1x1012 CFU/g, 1x1010 CFU/g 내지 1x1012 CFU/g의 세균 균주를 포함할 수 있다.
제4 측면은 암을 치료하기에 유효한 양의 상기한 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 또는 사람을 제외한 포유동물일 수 있다. 상기 투여는 경구 투여하는 것일 수 있다.
상기 "암을 치료하기에 유효한 양"은 암의 예방 또는 치료하기에 유효한 양을 나타낸다. 상기 "암을 치료하기에 유효한 양"은 체중 kg 당 0.01 mg 내지 200 mg 상기한 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물, 또는 체중 kg 당 0.1 mg 내지 400 mg 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물일 수 있다. 또한, 상기 "암을 치료하기에 유효한 양"은 개체 당 1x106 CFU 이상, 1x107 CFU 이상, 1x108 CFU 이상, 1x109 CFU 이상으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 세균 균주를 1x1015 CFU 이하, 1x1014 CFU 이하 1x1013 CFU 이하, 1x1012 CFU 이하로 투여 할 수 있다. 예를 들어, 세균 균주를 1x106 CFU 내지 1x1015 CFU, 1x107 CFU 내지 1x1014 CFU, 1x108 CFU 내지 1x1013 CFU, 1x109 CFU 내지 1x1012 CFU, 1x1010 CFU 내지 1x1012 CFU로 투여할 수 있다. 예를 들어, 유효 성분인 세균 균주를 하루 2회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
상기 방법은 면역 체크포인트 억제제와 함께 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 면역 체크포인트 억제제는 상기한 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물의 투여 전, 동시 또는 투여 후에 투여하는 것일 수 있다.
상기 면역 체크포인트 억제제는예를 들어 “I. 엔테로코커스 패시움”에 열거된 것들일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
상기 방법은 또한 화학치료제와 함께 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 화학치료제는 상기한 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물의 투여 전, 동시 또는 투여 후에 투여하는 것일 수 있다.
상기 화학치료제는 예를 들어 "I. 엔테로코커스 패시움"에 열거된 것들일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
다음은 항 종양 활성을 가진 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) LMT19-32 미생물의 일부 바람직한 태양을 나타내지만, 이로 제한되는 것은 아니다:
1. 항 종양 활성을 가진 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) LMT19-32 (수탁번호 KCTC 14306BP) 미생물.
2. 유효성분으로서 항목 1의 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물을 함유하는 암을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물.
3. 항목 2에 있어서, 상기 암은 고형암인 것인 조성물.
4. 항목 2에 있어서, 면역 체크포인트 억제제와 함께 투여하기 위한 것인 조성물.
5. 항목 4에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제는 CTLA4 억제제, PD-1 억제제, 또는 PD-L1 억제제인 것인 조성물.
6. 유효성분으로서 항목 1의 미생물 또는 그의 배양물 또는 추출물을 함유하는 암을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물.
이하, 본 개시를 실시예를 들어 구체적으로 설명하나, 이는 본 개시의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 개시의 범위를 어떤 식으로든지 제한하는 것은 아니다.
실시예
I. 엔테로코커스 패시움( Enterococcus faecium )
실시예 1: 균주의 분리 및 동정
1. 균주의 분리
엔테로코커스 패시움 균주의 분리를 위하여 영유아 분변, 성인 분변 및 식품 샘플 등을 사용하였다. 이 샘플로부터 엔테로코커스 패시움 균주 분리를 위해 MRS 배지(De Man,　Rogosa　and　Sharpe broth, Difco Co., USA)에 도말하여 30℃에서 혐기 배양하였다. 무균적으로 샘플을 취하여 0.85% NaCl 용액 180 ㎖로 희석하고, 스토마커(stomacher)로 5분간 균질화한 후 0.85% NaCl 용액 9 ㎖이 담긴 튜브를 멸균하여 준비하고 준비된 튜브에 단계적으로 희석하여 샘플을 준비하였다. 이 후 MRS 평판 배지에 도말하여 30℃에서 2~3일간 배양하였고, 나타난 콜로니들을 형태 및 색깔 별로 구별하여 다시 순수 분리하여 총 8종의 균주를 선발하였다. 선발된 균주를 각각 LMT17-62, LMT17-74, LMT15-24, LMT17-25, LMT15-4, LMT17-43, LMT17-40 및 LMT2-17로 명명하였다.
2. 선발된 균주의 동정
1) 형태학적 특성 분석
선발된 8종의 균주를 MRS 평판 배지(Difco, USA)에서 배양하고 콜로니의 형태를 관찰하였다. 선발된 균주의 콜로니 형태는 하기 표 2에 나타내었다.
선발된 균주의 형태학적 특성
LMT17-62 KCTC13225
형태 원형 원형
크기 0.5 ㎜ 0.5 ㎜
색 크림색 크림색
불투명도 불투명 불투명
융기 볼록 볼록
표면 매끄러움 매끄러움
호기적 생장 + +
혐기적 생장 + +
도 1은 선발된 8종의 균주 중 엔테로코커스 패시움 LMT17-62 균주와 타입 균주인 KCTC13225 균주의 광학현미경 사진이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 엔테로코커스 패시움 LMT17-62 균주는 구형의 전형적인 엔테로코커스 속의 성상을 갖는 것으로 확인되었다.
2) 16S rDNA 분석
분리된 균주의 16S rDNA를 분석하기 위하여, universal bacterial primer(27F(서열번호 1)와 1492R(서열번호 2))를 이용하여 16S rRNA 유전자를 증폭하여 서열분석하였다(㈜마크로젠). 분리된 균주의 16S rDNA 서열은 서열번호 3 내지 10에 나타내었다(서열번호 3: LMT17-62의 16S rDNA 서열; 서열번호 4: LMT17-74의 16S rDNA 서열; 서열번호 5: LMT15-24의 16S rDNA 서열; 서열번호 6: LMT17-25의 16S rDNA 서열; 서열번호 7: LMT15-4의 16S rDNA 서열; 서열번호 8: LMT17-40의 16S rDNA 서열; 서열번호 9: LMT2-17의 16S rDNA 서열; 및, 서열번호 10: LMT17-43의 16S rDNA 서열). 그 결과는 NCBI blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 사용하여 해석하였으며, 이에 따라 분리된 균주들은 엔테로코커스 패시움 종에 속하는 것으로 판명되었다.
분리된 균주들은 한국생명공학연구원 소재 한국세포주은행(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2020년 8월 26일자로 기탁하였고, 각각 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) LMT17-62(수탁번호: KCTC 14284BP), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) LMT17-74(수탁번호: KCTC 14285BP), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) LMT15-24(수탁번호: KCTC 14289BP), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) LMT17-25(수탁번호: KCTC 14288BP), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) LMT15-4(수탁번호: KCTC 14290BP), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) LMT17-43(수탁번호: KCTC 14286BP), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) LMT17-40(수탁번호: KCTC 14287BP), 및 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) LMT2-17(수탁번호: KCTC 14291BP)로 최종 명명되었다.
실시예 2: 선발된 엔테로코커스 패시움 균주의 항종양 효능 평가
1. 마우스의 종양 모델 유도 및 엔테로코커스 패시움 균주의 투여
마우스 종양 유도 모델에 사용된 C57BL/6 마우스(수컷, 20~22 g)는 ㈜오리엔트바이오에서 구입하였으며, 실험 시작 전 1 주간 환경에 적응시켰다. 마우스 등 피하 조직에 C57BL/6 마우스의 대장암에서 유래한 MC38 세포 2.5×105 개를 주입하였고, 종양 주입 1 주일 후에 종양 크기(50~70 ㎣)를 바탕으로 군 분리를 하였다. 군 분리 이후 2주간 엔테로코커스 패시움 균주를 이틀에 한번 존데를 이용하여 마우스당 1.0×109 CFU를 경구 투여하였다. 양성 대조군에서는 항 PD1 항체(클론번호: RMP1-14)를 주 2 회 마우스 무게 1 ㎏당 10 ㎎을 복강 투여하였다. 음성 대조군으로는 PBS(phosphate buffered saline)를 경구 투여하였다.
마우스에 MC38 종양 세포주 투입 후 21일까지 종양 크기를 측정하고, 이후 이산화탄소를 이용하여 마우스를 희생하여 종양 및 면역 장기를 적출하여 종양 침윤 면역세포 분석을 수행하였다.
2. 엔테로코커스 패시움 균주 투여에 따른 항종양 효능 평가
엔테로코커스 패시움 균주에 의한 종양 억제 효능을 알아보고자 선발한 미생물 균주 8 종에 대하여 종양 억제 실험을 실시하였다.
종양의 크기는 종양 세포주 주입 7 일 후부터 주 2 회씩 측정하였다. 정확한 종양의 크기를 측정하기 위하여 버니어 캘리퍼스를 이용하여 종양의 장축과 단축을 측정하여 아래 식에 따라 종양 크기를 계산하였다.
종양 크기 = (장축 × (단축)2)/2
아래 식에 따라 종양 성장 억제율(Tumor growth inhibition rate(%))을 계산하였다.
종양 성장 억제율(%) = (1 - Vt/Vc) × 100
Vc: 종양 크기 평가 시 음성 대조군에서의 평균 종양 크기;
Vt: 종양 크기 평가 시 실험군에서의 평균 종양 크기.
그 결과를 도 2a에 나타내었다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 엔테로코커스 패시움 LMT17-62, LMT17-74, LMT15-24, LMT17-25, 및 LMT15-4 균주가 각각 39%, 31%, 25%, 22%, 및 15%의 종양 성장 억제율을 나타내었다. 반면, 엔테로코커스 패시움 LMT17-40, LMT2-17, 및 LMT17-43 균주는 종양 성장 억제율이 각각 1%, -3% 및 -5% 이하로 항종양 효능을 나타내지 않았다. 따라서 동일 종(species)이라 하더라도 균주(strain)에 따라 항종양 효능에 차이가 있음을 확인하였다.
도 2b에 엔테로코커스 패시움 LMT17-62 균주 투여군에서 종양 세포주 주입 후 실험을 종료하는 21일까지의 종양 크기를 나타내었다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, 엔테로코커스 패시움 LMT17-62 투여군과 양성 대조군 항 PD1 항체 투여군에서 음성 대조군 대비 통계학적으로 유의하게 종양 성장이 억제됨을 확인하였다.
3. 종양 침윤 면역 세포 분석 및 면역 세포의 기능성 평가
종양 침윤 면역 세포인 CD8 T 세포는 중요한 항종양 반응의 지표이며, CD8 T 세포가 분비하는 인터페론 감마는 면역 세포의 활성을 나타내는 기능성 사이토카인이다. 엔테로코커스 패시움의 항종양 효능이 상기 요소들의 증가로 인한 것인지 확인하기 위해 동물 실험 종료 후 종양을 적출하여 분석하였다. 적출한 종양은 50 ㎍/㎖ Liberase와 40 ㎍/㎖ DNaseⅠ이 포함된 RPMI1640 배지와 cell strainer를 이용하여 단일 세포로 분리하였다. 분리한 세포는 10% Fetal bovine serum이 포함된 RPMI1640 배지에서 50 ng/㎖ PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)와 500 ng/㎖ Ionomycin으로 4시간 동안 자극하였다. 자극 후 면역세포 분석 및 인터페론 감마 생성 확인을 위해 표 3의 항체들로 세포를 염색하고 CANTO Ⅱ 유세포 분석 장비를 이용하여 분석하였다.
유세포 분석을 위한 항체 리스트
설명 표적 색
표면 마커 CD45 PE-Cy7
TCRβ APC-Cy7
CD4 PerCP-Cy5.5
CD8 Pacific blue
PD1 APC
세포내 염색 IFN-γ FITC
도 2c는 종양 침윤 전체 T 세포의 수와, CD8 T 세포의 수 및 인터페론 감마 생성 CD8 T 세포를 나타낸 것이다. PBS 처리군 대비 LMT17-62 균주 처리 군에서 유의미하게 종양 침윤 T 세포 및 CD8 T 세포가 증가하였다. 또한, CD8 T 세포 활성 인자인 인터페론 감마 생성도 PBS 대조군 대비 LMT17-62 균주 처리군에서 유의미하게 증가한 것을 확인하였다.
실시예 3: 항종양 양성 엔테로코커스 패시움 균주의 생리 활성 특성 분석
1. 항종양 양성 엔테로코커스 패시움 균주의 성장 곡선 및 대사체 생산 능력 평가
선발된 엔테로코커스 패시움 균주의 성장 패턴을 알아보기 위하여, 항종양 양성 균주와 항종양 음성 균주의 집락을 MRS 액체 배지에서 24시간 배양한 후 균주 마다 초기 OD600(optical density) 값이 일치하게 50 ㎖ 또는 250 ㎖ erlenmeyer flask에 접종하였다. 이후 균주의 성장곡선 측정을 위하여 매시간 마다 균주의 OD600 값을 분광 광도계 Ultrospec 7000(biochrom, UK)를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 3a에 나타내었다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, 항종양 효능을 가진 LMT17-62 균주는 배양 후 8시간 이후부터 성장이 멈추었으나, 항종양 음성 LMT2-17 균주는 계속하여 성장을 지속하였다. 배양액에 존재하는 균주의 대사물질인 락테이트의 양은 생화학 분석기 YSI2900(Xylem, USA)를 이용하여 확인하였다.
그 결과를 도 3b에 나타내었다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 항종양 효능을 가진 LMT17-62 균주와 항종양 음성 LMT2-17 균주 모두에서 배양을 지속할수록 대사물질 락테이트 생성이 증가하였다. 도 3c에 OD600 당 대사물질 락테이트 생산 능력을 나타내었다. 도 3c에 나타낸 바와 같이, 항종양 효능을 가진 엔테로코커스 패시움 균주 그룹(LMT17-62, LMT17-74, LMT15-24, LMT15-4, LMT17-25)이 항종양 음성 엔테로코커스 패시움 균주 그룹(LMT17-43, LMT17-40, LMT2-17) 대비 높은 OD600 당 락테이트 생산 능력을 보였다. 이는 균주 배양을 24시간에서 48시간으로 지속할수록 더욱 두드러졌다. 즉, 48시간 배양 시, 항종양 음성 균주들은 3 g/L에 미치지 못하는 OD600 당 락테이트 생성을 나타낸 반면, 항종양 양성 균주들은 일관되게 3 g/L 이상의 OD600 당 락테이트 생성을 나타내었으며, OD600 당 락테이트 생성능이 높을수록 높은 항종양 활성을 갖는 경향을 보여주었다.
2. 항종양 양성 엔테로코커스 패시움 균주의 효소 활성 평가
선발된 엔테로코커스 패시움 균주의 생화학적 특성을 조사하기 위하여 Rapid ID 32A kit(BioMetrieux, France)를 사용하여 효소 활성을 평가하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 항종양 음성 균주 그룹(LMT17-43, LMT17-40, LMT2-17)과 달리 항종양 효능을 가진 엔테로코커스 패시움 균주 그룹(LMT17-62, LMT17-74, LMT15-24, LMT17-25)은 베타-갈락토시데이제(β-galactosidase) 효소 활성을 가지고 있었다.
번호 효소 항종양 균주 대조균주
No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.1 No.2 No.3
1 유레이에이제 - - - - - - - -
2 아르기닌
디히드롤레이제		 + + + + + + + +
3 알파-갈락토시데이제 - - - - - + + +
4 베타갈락토시데이제 + + + + - - - -
5 베타갈락토시데이제
6-포스페이트		 - - - - - - - -
6 알파-글루코시데이제 - - - - - - - -
7 베타글루코시데이제 - - - - - - - -
8 알파-아라비노시데이제 - - - - - - - -
9 베타글루코로니데이제 - - - - - - - -
10 N-아세틸-베타
글루코사미니데이제		 - - - - - - - -
11 만노스 발효 + + + + + + + +
12 라피노스 발효 + - - - - + + +
13 글루탐산
디카복실레이제		 - - - - - - - -
14 알파-푸코시데이제 - - - - - - - -
15 질산염 환원 - - - - - - - -
16 인돌 생산 + + + + + + + +
17 알칼린 포스파타제 - - - - - - - -
18 아르기닌 아릴아미데이제 + + + + + + + +
19 프롤린 아릴아미데이제 - - - - - - - -
20 류실 글리신
아릴아미데이제		 - - - - - - - -
21 페닐알라닌
아릴아미데이제		 + + + + + + + +
22 류신 아릴아미데이제 - + + + + + + +
23 피로글루탐산
아릴아미데이제		 + + + + + + + +
24 티로신 아릴아미데이제 + + + + + + + +
25 알라닌 아릴아미데이제 - - - - - - - -
26 글리신 아릴아미데이제 - + + + + + + +
27 히스티딘 아릴아미데이제 - + + + + + + +
28 글루타밀
글루탐산
아릴아미데이제		 - - - - - - - -
29 세린 아릴아미데이제 - + + + + + + +
표 4에서, 항종양 균주 No.1, No.2, No.3,No.4, 및 No.5는 순서대로 LMT17-62, LMT17-74, LMT15-24, LMT17-25, 및 LMT15-4를 각각 나타내고, 대조 균주 No.1, No.2, 및 No.3은 순서대로 LMT17-43, LMT17-40, 및 LMT2-17을 각각 나타낸다.
3. 항종양 양성 엔테로코커스 패시움 균주의 당 발효 특성
선발된 엔테로코커스 패시움 균주의 당 대사 특성을 분석하기 위하여 API 50 CHL kit(BioMetrieux, France)를 이용하여 공급 회사의 실험방법에 따라 평가를 수행하였다. 표 5에 그 결과를 나타내었다. 항종양 효능을 가진 엔테로코커스 패시움 균주 그룹(LMT17-62, LMT17-74, LMT15-24)은 D-소르비톨(D-sorbitol)과 D-타가토스(D-tagatose) 당 발효 특성을 가지고 있었다. 또한, 항종양 효능을 가진 엔테로코커스 패시움 균주(LMT17-62, LMT17-74)의 경우 메틸-aD-만노피라노시드(Methyl-aD-mannopyranoside) 당 발효 특성을 가지고 있었다.

번호
탄수화물		 항종양 균주 대조균주
No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.1 No.2 No.3
1 글리세롤 - + - - - - - -
2 에리트리톨 - - - - - - - -
3 D-아라비노스 - - - - - - - -
4 L-아라비노스 + + + + + + + +
5 D-리보스 + + + + + + + +
6 D-자일로스 - - - - - - - -
7 L-자일로스 - - - - - - - -
8 D-아도니톨 - - - - - - - -
9 메틸-bD-
자일로피라노시드		 - - - - - - - -
10 D-갈락토스 + + + + + + + +
11 D-글루코스 + + + + + + + +
12 D-프럭토스 + + + + + + + +
13 D-만노스 + + + + + + + +
14 L-소르보스 - - - - - - - -
15 L-람노스 - - - + - - + -
16 둘시톨 + - - - - - - -
17 이노시톨 - - - - - - - -
18 D-만니톨 + + + + + + + +
19 D-소르비톨 + + + - - - - -
20 메틸-aD-
만노피라노시드		 + + - - - - - -
21 메틸-aD-
글루코피라노시드		 - - - - - - - -
22 N-아세틸글루코사민 + + + + + + + +
23 아미그달린 + + + + - + + +
24 아르부틴 + + + + + + + +
25 에스쿨린 + + + + + + + +
26 살리신 + + + + + + + +
27 D-셀로비오스 + + + + + + + +
28 D-말토스 + + + + + + + +
29 D-락토스 + + + + + + + +
30 D-멜리비오스 + + + - + + + +
31 D-사카로스 + + + + + + + +
32 D-트레할로스 + + + + + + + +
33 이눌린 - - - - - - - -
34 D-멜레지토스 - + - - - - - -
35 D-라피노스 + - + - - + + +
36 아미돈 - - - - - - - -
37 글리코겐 - - - - - - - -
38 자일리톨 - - - - - - - -
39 겐티오비오스 + + + + + + + +
40 D-투라노스 - - - - - - - -
41 D-릭소스 - - - - - - - -
42 D-타가토스 + + + - - - - -
43 D-푸코스 - - - - - - - -
44 L-푸코스 - - - - - - - -
45 D-아라비톨 - - - - - - - -
46 L-아라비톨 - - - - - - - -
47 포타슘글루코네이트 + + + + - - + -
48 포타슘
2-케토글루코네이트		 - - - - - - - -
49 포타슘
5-케토글루코네이트		 - - - - - - - -
표 5에서, 항종양 균주 No.1, No.2, No.3,No.4, 및 No.5는 순서대로 LMT17-62, LMT17-74, LMT15-24, LMT17-25, 및 LMT15-4를 각각 나타내고, 대조 균주 No.1, No.2, 및 No.3은 순서대로 LMT17-43, LMT17-40, 및 LMT2-17을 각각 나타낸다.
4. 항종양 양성 엔테로코커스 패시움 균주의 안정성 평가
(1) 내산성 조사
엔테로코커스 패시움 균주들의 내산성을 평가하기 위하여 다음의 방법으로 실험을 실시하였다. 선발된 균주를 멸균된 MRS 액체 배지에 접종 후 37℃에서 16시간 배양하였다. 그 다음 HCl로 pH 2.5로 조정하여 멸균한 MRS 액체 배지에 접종한 후 2시간 동안 37℃에서 배양한 후, 생균수를 확인하였다. 접종 전의 생균 수와 접종 후 2시간째의 생균 수를 MRS 평판 배지에 도말한 다음 배양하여 집락 수를 비교하여 계수하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 항종양 양성 엔테로코커스 패시움 균주는 다소 낮은 내산성을 갖는 것으로 나타난바, 제형화 시 캡슐제나 코팅제 등을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
(2) 내담즙성 조사
엔테로코커스 패시움 균주들의 내담즙성을 조사하기 위해 다음의 방법으로 실험을 실시하였다. 선발된 균주를 멸균된 MRS 액체 배지에 접종 후 37℃에서 16시간 배양하였다. 장관 내 담즙염 농도가 0.1% 내외임을 감안하여 0.3%의 담즙염(bile salts)(Sigma, USA)이 함유된 MRS 액체 배지에 균체만을 108~109 CFU/㎖이 되도록 접종한 후 2시간 동안 37℃에서 배양한 후, 생균수를 확인하였다. 균주 접종 전의 생균 수와 접종 후 2시간 째의 생균 수를 MRS 평판 배지에 도말한 다음 배양하여 집락 수를 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 항종양 양성 엔테로코커스 패시움 균주들은 장내 실제 농도와 유사한 0.1% 보다 더 높은 0.3%에서도 적정 균 수를 유지하였기 때문에, 선발된 항종양 양성 엔테로코커스 패시움 균주는 인체나 동물의 장 내에서도 충분히 생존할 수 있음을 확인할 수 있는 근거가 될 수 있다.
(3) 장내 정착성 조사
항종양 양성 엔테로코커스 패시움 균주의 장내 세포 정착력을 평가하기 위하여 한국세포주은행에서 구입한 사람 직장 상피세포인 선암종 세포(human epithelial colorectal adenocarcinoma cell) Caco-2 세포주(KCLB 30037.1)를 사용하였다. Caco-2 세포는 10% 소 태아 혈청(FBS)(Gibco, USA)이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM; Gibco, USA) 배양액에서 5% CO2, 37℃ 조건으로 7×104 cell/100 ㎕가 되도록 분주하여 96-well plate(Corning, USA)에 세포 단일 층을 형성하도록 배양하였다.
한편, MRS 액체 배지에서 배양된 선발 항종양 양성 엔테로코커스 패시움 균주를 인산 완충 염수(Phosphate Buffered Saline:PBS)로 세척한 다음 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지에 현탁하고, 세포 단일층을 구성한 Caco-2 세포에 엔테로코커스 패시움 균주의 양이 1×107 CFU가 되도록 첨가하고, 5% CO2, 37℃ 조건에서 2시간 동안 배양하였다. Caco-2 세포에 부착하지 못한 세포를 제거하기 위해 PBS로 5번 세척하고, 100 ㎕의 0.1% 트리톤 x-100으로 부착된 세포를 떼어낸 다음 이를 MRS 고체 배지에 도말하였다. 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 평판 배지 위의 집락 수를 계수하여 엔테로코커스 패시움 균주의 장내 정착성을 조사하였다.
도 6에 장내 상피세포에 부착된 선발된 항종양 양성 엔테로코커스 패시움 균주의 수를 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 장 상피 세포(Caco-2)에 대해 LMT17-62는 0.31%, LMT17-74는 1.55%, LMT15-24는 0.46%, 및 LMT17-25는 0.48%의 장내 정착력을 가짐을 확인하였다.
II. 엔테로코커스 패칼리스( Enterococcus faecalis ) LMT19-32
실시예 1: 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주의 분리 및 동정
1. 엔테로코커스 패칼리스 ( Enterococcus faecalis ) 균주의 분리
성인 분변 시료로부터 엔테로코커스 패칼리스 균주를 분리하였다. 먼저, 시료를 MRS 배지 (Difco Co., USA)에 도말하여 30℃에서 혐기 배양하였다. 시료의 전처리 방법은 무균적으로 시료를 취하여 0.85% NaCl 용액 180 ㎖로 희석하고, 스토마처(stomacher)로 5분간 분변 원액을 균질화하였다. 균질화된 시료를 멸균된 0.85% NaCl 용액 9 ml가 담긴 튜브에 단계적으로 희석하여 분변 시료를 준비하였다. 시료를 MRS 평판 배지(Difco, USA)에 도말하여 37℃에서 2 내지 3 일간 배양하였고 나타난 콜로니들을 형태 및 색깔 별로 구별하여 다시 순수 분리하였다.
2. 엔테로코커스 패칼리스 균주의 동정
(1) 형태학적 특성 분석
선발된 엔테로코커스 패칼리스 균주를 MRS 평판 배지(Difco, USA)에서 배양하고 콜로니의 형태를 관찰하였다. 선발한 엔테로코커스 패칼리스 균주 및 엔테로코커스 패칼리스 타입 균주인 KCTC3206의 MRS 평판 배지에서 콜로니 형태는 하기 표 6에 나타내었다.
LMT19-32 KCTC3206
형태 원형 원형
크기 0.8mm 0.8mm
색 크림색 크림색
투명도 불투명 불투명
융기 볼록 볼록
표면 매끄러움 매끄러움
호기적 생장 + +
혐기적 생장 + +
도 7은 선발된 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주와 타입 균주인 KCTC3206 균주의 대표적 광학현미경 사진을 나타낸 것이다. 도 7에 나타낸 바와 같이, LMT19-32 균주는 구균으로서 전형적인 엔테로코커스 속의 성상과 유사하였다.
(2) 16S rDNA 분석
분리된 LMT19-32 균주의 16S rRNA 유전자를 증폭하고, 증폭된 16S rRNA 유전자의 뉴클레오티드 서열을 분석하였다. 상기 증폭은 LMT19-32 균주 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드와 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드((주)마크로젠)를 프라이머 세트로 한 PCR을 수행하여 이루어졌다. 분리된 LMT19-32 균주의 16S rDNA의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 13에 나타내었다. 확인된 16S rDNA의 뉴클레오티드 서열을 NCBI blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 사용하여 공지된 16S rDNA의 뉴클레오티드 서열과 비교하였다. 그 결과, LMT19-32의 16S rDNA는 엔테로코커스 패칼리스 종과 서열 동일성이 100%이었다. 또한, 계통수 분석 결과, LMT19-32은 엔테로코커스 패칼리스 종과 같았다. 그 결과, LMT19-32 균주는 새로운 엔테로코커스 패칼리스 종에 속하는 새로운 균주로 확인되었다.
본 발명자들은 LMT19-32 유산균을 "엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) LMT19-32" (기탁번호: KCTC14306BP)로 명명하고 이를 한국생명공학연구원 소재 한국세포주은행 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2020년 9월 9일자로 기탁하였다.
실시예 2: 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주의 생리 활성 특성 분석
1. 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주의 당 발효 특성
선발된 LMT19-32 균주의 당 대사 특성을 API 50 CHL kit (BioMetrieux, France)를 공급회사의 실험 방법에 따라 사용하여 확인하였다. 표 7은 확인된 LMT19-32 균주의 당 발효 특성을 나타낸 것이다.
번호 탄수화물 LMT19-32
24시간 48시간
1 글리세롤 + +
2 에리트리톨 - -
3 D-아라비노스 - -
4 L-아라비노스 - -
5 D-리보스 + +
6 D-자일로스 - -
7 L-자일로스 - -
8 D-아도니톨 - -
9 메틸-bD-자일로피라노시드 - -
10 D-갈락토스 + +
11 D-글루코스 + +
12 D-프럭토스 + +
13 D-만노스 + +
14 L-소르보스 - -
15 L-람노스 - -
16 둘시톨 - -
17 이노시톨 - +
18 마니톨 + +
19 D-소르비톨 + +
20 메틸 αD-만노피라노시드 - -
21 메틸 αD-글루코피라노시드 - -
22 N-아세틸글루코사민 + +
23 아미그달린 + +
24 아르부틴 + +
25 에스쿨린 + +
26 살리신 + +
27 D-셀로비오스 + +
28 D-말토스 + +
29 D-락토스 + +
30 D-멜리비오스 - -
31 D-사카로스 + +
32 D-트레할로스 + +
33 이눌린 - -
34 D-멜레지토스 + +
35 D-라피노스 - -
36 아미돈 - -
37 글리코겐 - -
38 자일리톨 - -
39 겐티오비오스 + +
40 D-투라노스 - -
41 D-릭소스(lyxose) - -
42 D-타가토스 + +
43 D-푸코스 - -
44 L-푸코스 - -
45 D-아라비톨 - -
46 L-아라비톨 - -
47 포타슘 글루코네이트 + +
48 포타슘 2-케토글루코네이트 - -
49 포타슘 5-케토글루코네이트 - -
2. 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주의 안정성 평가
엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주의 내산성을 평가하기 위하여 다음의 방법으로 실험을 실시하였다. LMT19-32 균주를 멸균된 MRS 액체 배지에 접종 후 37℃에서 16시간 배양하였다. 그 다음 HCl로 pH 2.5로 조정하여 멸균한 MRS 액체 배지에 상기 균주 1%를 접종하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 균주 접종 직후와 2시간 배양후의 시료를 회수하여 MRS 액체 배지에 희석하고 MRS 평판 배지에 도말한 다음 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 평판 배지위의 집락 수를 계수하여 균수를 측정하였다.
표 8에 나타낸 바와 같이, 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주는 다소 낮은 내산성을 갖는 것으로 나타난바, 제형화 시 캡슐제나 코팅제 등을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
LMT19-32 KCTC3206
MRS (pH 6.8)(세포수/평판) 3.1x109 1.8x109
MRS (pH 2.5) (세포수/평판) 3.0x101 8.5x104
생존율 (%) 0.000001 0.004670
(2) 내담즙성 조사
담즙산이 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주의 성장에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다음의 방법으로 실험을 실시하였다. 선발된 균주를 멸균된 MRS 액체 배지에 접종 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 장관 내 담즙산 염 농도가 0.1% 내외임을 감안하여, 0.3%의 담즙산염 (bile salts) (Sigma, USA)이 함유된 MRS 액체 배지에 상기 균주를 1%를 접종하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 균주 접종 직후와 2시간 배양후의 시료를 회수하여 MRS 액체 배지에 희석하고 MRS 평판 배지에 도말한 다음 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 평판 배지 위의 집락 수를 계수하여 생존 균주 세포 수를 측정하였다. 대조군으로서 0.3%의 담즙염산이 함유되지 않은 MRS 액체 배지에서 동일하게 배양을 진행하고 생존 균주 세포 수를 측정하였다. 표 9는 내담즙산염을 측정한 결과이다. 표 9에 나타낸 바와 같이, LMT19-32 균주는 장내 실제 농도와 유사한 0.1% 보다 더 높은 0.3%에서 93%의 생존율을 유지하였기 때문에 LMT19-32 균주는 인체나 동물의 장 내에서도 충분히 생존할 수 있는 근거가 될 수 있다.
LMT19-32 KCTC3206
대조군(세포수/평판) 3.1x109 1.8x109
0.3% 담즙산염(세포수/평판) 2.9x109 1.4x109
생존율 (%) 93.0 80.2
(3) 장내 정착성 조사
엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주의 장내 세포 정착력 정도를 평가하기 위하여 한국세포주은행에서 구입한 사람 직장 상피세포인 선암종 세포 (human epithelial colorectal adenocarcinoma cell) Caco-2 세포주 (KCLB 30037.1)를 사용하였다. Caco-2 세포는 10% 소 태아 혈청 (FBS) (Gibco, USA)이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco, USA)에서 5% CO2, 37℃ 조건으로 7 x 104 cell/100㎕가 되도록 분주하여 96-웰 플레이트 (Corning, USA)에 세포 단일층을 형성하도록 배양하였다.
한편, MRS 액체 배지에서 배양된 LMT19-32 균주를 PBS로 세척한 다음 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지에 현탁하고, 세포 단일층을 구성한 Caco-2 세포에 LMT19-32 균주의 양이 1x107 CFU가 되도록 첨가하고, 5% CO2, 37℃ 조건에서 2시간 동안 배양하였다. Caco-2 세포에 부착하지 못한 세포를 제거하기 위해 PBS로 5번 세척하고, 100 ㎕의 0.1% 트리톤 X-100으로 부착된 세포를 떼어낸 다음 이를 MRS 고체 배지에 도말하였다. 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 평판 배지 위의 집락수를 계수하여 LMT19-32 균주의 장내 정착성을 조사하였다.
표 10은 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주의 장내 상피세포에 부착한 수를 나타낸 도면이다. 표 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신규한 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주와 비교 균주 엔테로코커스 패칼리스 KCTC3206 모두 약 1%의 장 상피 세포인 Caco-2에 정착력이 있음을 확인하였다.
LMT19-32 KCTC3206
처리 균주 수 (107 CFU) 1.4 1.5
부착된 균주 수 (104 CFU) 10.4 19.4
부착률 (%) 0.75 1.26
실시예 3: 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주의 항 종양 효능 평가 1. 마우스의 종양 모델 유도 및 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주의 투여
마우스 종양 유도 모델에 사용된 C57BL/6 마우스 (수컷, 20~22 g)는 ㈜오리엔트바이오에서 구입하였으며, 실험 시작 전 1 주간 환경에 적응시켰다. 마우스 등 피하 조직에 C57BL/6 마우스의 대장암에서 유래한 MC38 세포 2.5 x 105 개를 주입하였고, 종양 주입 1 주일 후에 종양 크기 (50~70 mm3)를 바탕으로 군을 분리하였다. 군 분리 이후 2주간 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주를 이틀에 한번 존데를 이용하여 마우스 당 1 x 109 CFU 균주 함유 PBS를 경구투여하였으며, 양성 대조군으로는 항-PD1 항체 (클론번호: RMP1-14, 제조사: Bioxcell, 제품명: InvivoMAb anti-mouse PD-1)를 주 2 회 마우스 무게 1 kg당 10 mg을 복강투여하였다. 음성 대조군으로는 PBS를 경구 투여하였다. 실험군 구성은 각 군당 10 마리씩 총 3 군으로 표 11과 같이 구성하였다.
그룹 1 PBS 대조군
그룹 2 항-PD1 항체 처리군
그룹 3 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 처리군
마우스에 MC38 종양 세포주 투입 후 21일까지 종양 크기를 측정하고, 이후 이산화탄소를 이용하여 마우스를 희생하여 종양을 적출하여 종양 침윤 면역세포 분석을 수행하였다. 분석 결과는 도 9a, 9b 및 9c에 기재되어 있다. 도 9a, 9b 및 9c는 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주를 종양을 가진 마우스에 투여한 후 종양에 침윤된 T 세포, CD8 T 세포 및 IFNγ를 발현하는 CD8 T 세포, 즉, IFNγ+ CD8 T 세포를 분석한 결과를 나타낸 것이다. MC38 종양 세포주는 C57BL/6 마우스에 디메틸히드라진을 피하 주사하여 유도된 마우스 직장 아데노카시노마 세포 (mouse colon adenocarcinoma cell)이다. 본 실시예에 사용된 마우스 종양 유도 모델은 MC38 종양 세포가 피하 조직에 이식된 것이므로, 경구 투여한 균주의 효과가 균주가 직접적으로 접촉하는 조직이 아닌 다른 조직, 예를 들면 피하조직의 암성장 억제를 나타낼 수 있다는 것을 나타내는 것으로서, 균의 영향이 균주가 직접적으로 접촉하는 조직인, 위장관 또는 장과 연관된 암뿐만 아니라 다양한 고형암종에서도 작용할 수 있다는 것을 나타낸다.
2. 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주 투여에 따른 항 종양 효능 평가
도 8a 및 8b는 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주를 종양을 가진 마우스에 투여한 후 종양 크기를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 상기 투여는 섹션 1에 따라 수행되었다. 구체적으로, 종양의 크기는 종양 세포주 주입 7 일 후부터 21일까지 주 2 회씩 측정하였다. 정확한 종양의 크기를 측정하기 위하여 버니어 캘리퍼스를 이용하여 종양의 장축과 단축을 측정하여 '장축 x (단축)2/2'의 공식으로 종양 크기를 계산하였다. 도 8a 및 8b에서, 대조군은 음성 대조군으로서 PBS를 투여한 것이고, aPD1은 양성 대조군으로서 항-PD1 항체를 투여한 것이고, LMT19-32은 실험군으로써 LMT19-32을 투여한 것이다. 도 8a 그래프는 세포 주입 후 경과일 수에 따른 종양 크기를 나타낸 것이고, 도 8b는 세포 주입 후 21일째의 종양 크기를 나타낸 것이다. 도 8a에서, 가로축은 종양 크기를 측정한 일로서 종양세포 투여 후 경과 일을 나타낸다. 도 8b에서, 막대는 세포 주입 후 21일째의 각 개체별 종양 크기를 모두 표기한 것이다. 도 8a 및 8b에 나타낸 바와 같이, LMT19-32 균주 단독 투여군에서 통계학적으로 유의한 종양성장 저해 (tumor growth inhibition)가 관찰되었다.
3. 종양 침윤 면역 세포 분석 및 면역 세포의 기능성 평가
종양 침윤 면역 세포인 CD8 T 세포는 중요한 항암 반응의 지표이며, CD8 T 세포가 분비하는 인터페론 감마(Interferon gamma)와 그랜자임 B(Granzyme B)는 면역 세포의 활성능을 나타내는 기능성 사이토카인이다. 도 9a, 9b 및 9c는 엔테로코커스 패칼리스 LMT19-32 균주를 종양을 가진 마우스에 투여한 후 종양에 침윤된 CD8 T 세포 및 그에 의한 사이토카인 분비를 분석한 결과를 나타낸 것이다. 투여는 섹션 1에 따라 수행되었다. 투여 21일 후 종양을 적출하였다. 적출한 종양은 50 ug/ml Liberase와 40 ug/ml DNase I이 포함된 RPMI1640 배지와 세포 스트레이너(cell strainer)를 이용하여 단일 세포로 분리하였다. T 세포의 인터페론 감마 생성 양상을 관찰하기 위해서, 분리한 세포는 10% FBS가 포함된 RPMI1640 배지에서 50 ng/ml PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)와 500 ng/ml Ionomycin으로 4시간 동안 자극하였다. PMA, 및 ionomycin 물질은 T 세포가 활성화되도록 신호적 자극을 주는 물질로 실제 항원에 의한 T 세포의 활성 기작과 같은 역할을 하여 면역반응이 일어나는 것 같은 환경을 만들어 준다. Ionomycin은 Ca2+ ionophore로서 PKC(protein kinase C)를 증가시켜주고, PMA의 경우는 PKC를 인산화(phosphorylation) 시킴으로써 CD4 T 세포와 CD8 T 세포를 타깃할 수 있도록 상승작용(synergize) 하는 역할을 한다. 자극 후 면역세포 분석 및 인터페론 감마 생성 확인을 위해 표 12의 항체들로 세포를 염색하고 CANTO II 유세포 분석 장비를 이용하여 분석하였다.
설명 표적 색
표면 마커 CD45 PE-Cy7
TCRβ APC-Cy7
CD4 PerCP-Cy5.5
CD8 퍼시픽 블루(Pacific blue)
세포내 염색 IFNγ FITC
Granzyme B APC
도 9a, 9b, 및 9c는 각각 종양 침윤된 전체 T 세포의 수, 종양 침윤 T 세포 중 CD8 T 세포의 수 및 CD8 T 세포 중 IFNγ 발현 세포의 수를 나타낸 것이다. 도 9에 나타낸 바와 같이, PBS 처리군 대비 LMT19-32 투여군에서 유의미하게 종양 침윤 T 세포의 수와 CD8 T 세포의 수가 증가하였다. 또한, 활성 인자인 인터페론 감마를 생성하는 CD8 T 세포의 수에서도 PBS 대조군 대비 LMT19-32 처리군에서 유의미하게 증가하였다.
Figure PCTKR2021010525-appb-I000001
Figure PCTKR2021010525-appb-I000002
Figure PCTKR2021010525-appb-I000003
Figure PCTKR2021010525-appb-I000004
Figure PCTKR2021010525-appb-I000005
Figure PCTKR2021010525-appb-I000006
Figure PCTKR2021010525-appb-I000007
Figure PCTKR2021010525-appb-I000008
Figure PCTKR2021010525-appb-I000009

Claims (21)

  1. i) 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 종에 속하고;
    ii) 48 시간 배양 시 미생물 성장 대비 락테이트 생성능(lactate/OD600)이 3 g/L 이상이고;
    iii) 항종양 활성을 나타내는,
    세균 균주.
  2. 제1항에 있어서, 24 시간 배양 시 미생물 성장 대비 락테이트 생성능(lactate/OD600)이 2.5 g/L 초과인 세균 균주.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 10% 이상의 종양 성장 억제율을 나타내는 세균 균주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 20% 이상의 종양 성장 억제율을 나타내는 세균 균주.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, iv) 베타-갈락토시데이제(β-galactosidase) 활성을 갖는 세균 균주.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, v) D-소르비톨(D-sorbitol) 분해능을 갖는 세균 균주.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, vi) D-타가토스(D-tagatose) 분해능을 갖는 세균 균주.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, vii) 메틸-aD-만노피라노시드(Methyl-aD-mannopyranoside) 분해능을 갖는 세균 균주.
  9. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 것인 세균 균주:
    수탁번호 KCTC 14284BP로 기탁되어 있는 LMT17-62;
    수탁번호 KCTC14285BP로 기탁되어 있는 LMT17-74;
    수탁번호 KCTC 14289BP로 기탁되어 있는 LMT15-24;
    수탁번호 KCTC 14288BP로 기탁되어 있는 LMT17-25; 및,
    수탁번호 KCTC 14290BP로 기탁되어 있는 LMT15-4.
  10. 유효성분으로 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 세균 균주를 포함하는, 종양을 예방하거나 치료하기 위한 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 경구로 투여하기 위한 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 세균 균주는 생균 또는 사균인 것인 조성물.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 고형 암(solid tumor)인 것인 조성물.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세균 균주를 1×106 CFU 이상으로 포함하는 조성물.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 다른 치료제와 병용하기 위한 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 치료제는 면역항암제인 것인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 면역항암제는 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)인 것인 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 면역관문 억제제는 PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 면역관문 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA4 항체, 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택되는 하나 이상의 것인 조성물.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 다른 치료제와 동시에 또는 순차적으로 투여하기 위한 조성물.
  21. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 세균 균주, 또는 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 종양의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 종양을 예방하거나 치료하기 위한 방법.
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