WO2022059794A1 - Ｉｌ－２変異体タンパク質及びこれを含む医薬 - Google Patents

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伸幸 田中
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    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)

Definitions

  • IL-2 is known to stimulate a variety of immune cells, including monocytes, NK cells and T cells. IL-2 is used in hospitals to stimulate cell-mediated immune responses and is FDA-approved as standard treatment in patients with metastatic melanoma or metastatic renal cancer (eg, Ardes Roykin (also known as Proleukin). Registered trademark))).
  • the T cell repertoire involved in the cellular adaptive immune response includes CD8 + memory T cells, CD8 + effector T cells and regulatory T cells (Treg). These Tregs play an important role in the adaptive immune program by reducing the activity of effector T cells and memory T cells.
  • Tregs play an important role in the adaptive immune program by reducing the activity of effector T cells and memory T cells.
  • IL-2 can also activate a Treg subset of T cells, which in turn can act to suppress CD8 + T cells or tolerate other T cells. Therefore, IL-2 is involved in both the activation and attenuation of adaptive immune responses.
  • Treg cells are characterized by the expression of CD4 and the transcription factor FoxP3, which in turn activates the expression of CD25, the ⁇ subunit of the IL-2 receptor complex (CD4 + CD25 + cells).
  • CD25 is constitutively expressed in Treg cells. Due to the association of CD25 with the signaling components of the IL-2 receptor complex ( ⁇ subunit CD122 and ⁇ subunit CD132), the medium-affinity IL-2 receptor complex becomes a high-affinity IL-2 receptor complex. Is converted to. IL-2 activation of Treg cells occurs through signaling pathways relayed by the high affinity IL-2 receptor complex.
  • High levels of CD25 expression are characteristic of activated T cells, and these cells become sensitive to IL-2 via the high affinity IL-2 receptor complex.
  • Theoretical evidence that blockade of CD25 inhibits IL-2-mediated signaling in activated T cells and exhibits immunosuppressive effects has led to the development of therapies based on blockade of CD25.
  • Anti-CD25 antibodies such as daclizumab (Roche) (also known as Zenapax®) and basiliximab (Novartis) (also known as Simulect®) have been approved by the FDA for the prevention of acute organ rejection after kidney transplantation. .. Due to the dual role of IL-2, there is still a need to provide more effective IL-2 mediated therapy in the art.
  • Immune cells involved in the cell-mediated immune response include NK cells having an NK1.1 + phenotype. NK cells play an important role in the adaptive immune program. However, it has been observed that IL-2 can also activate a Treg subset of T cells, which in turn can act to suppress CD8 + T cells or tolerate other T cells. Therefore, IL-2 is involved in both the activation and attenuation of adaptive immune responses.
  • High levels of CD25 expression are characteristic of activated T cells, and these cells become sensitive to IL-2 via the high affinity IL-2 receptor complex.
  • Theoretical evidence that blockade of CD25 inhibits IL-2-mediated signaling in activated T cells and exhibits immunosuppressive effects has led to the development of therapies based on blockade of CD25.
  • Anti-CD25 antibodies such as daclizumab (Roche) (also known as Zenapax®) and basiliximab (Novartis) (also known as Simulect®) have been approved by the FDA for the prevention of acute organ rejection after kidney transplantation. .. Due to the dual role of IL-2, there is still a need to provide more effective IL-2 mediated therapy in the art.
  • An object of the present invention is to provide an IL-2 mutant in which the binding property to IL-2 receptor ⁇ is attenuated while maintaining the binding property to IL-2 receptor ⁇ and ⁇ .
  • IL-2 receptor ⁇ and ⁇ were obtained by substituting all the amino acids at positions 35, 38, 42 (or 43) and 45 of mature IL-2 with A. It was found that the binding property to IL-2 receptor ⁇ is attenuated while maintaining the binding property to IL-2 receptor ⁇ .
  • the present invention is based on such novel findings. Accordingly, the present invention provides the following sections: Item 1. All amino acids at positions 35, 38, 42 or 43, and 45 have at least 95% sequence identity with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. An IL-2 variant protein having an amino acid sequence of A.
  • Item 2 The IL-2 mutant protein according to Item 1, which is a fusion protein with albumin and / or immunoglobulin.
  • Item 3 The IL-2 mutant protein according to Item 2, wherein the immunoglobulin portion is the Fc portion of the antibody.
  • Item 4 Albumin-IL-2, IL-2-albumin, albumin-IL-2-immunoglobin, immunoglobulin-IL-2-albumin, albumin-immunoglobulin-IL-2-albumin or albumin-IL-2-immunoglobulin- Item 2.
  • IL-2 receptor has the ability to activate TPA-Mat cells expressing IL-2 receptors ⁇ and ⁇ , and is compared with the IL-2 mutant protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Item 6. The IL-2 mutant protein according to any one of Items 1 to 4, wherein the binding property to body ⁇ is suppressed.
  • Item 6 A drug comprising the IL-2 mutant protein according to any one of Items 1 to 5.
  • Item 7. The medicine according to Item 6 for preventing or treating cancer.
  • Item 8 A method for preventing or treating cancer, which comprises administering an effective amount of the IL-2 mutant protein according to any one of Items 1 to 5 to a subject in need thereof.
  • Item 9 Use of the IL-2 mutant protein according to any one of Items 1 to 5 for producing a preventive or therapeutic agent for cancer.
  • the present invention it is possible to provide an IL-2 mutant in which the binding property to IL-2 receptor ⁇ and ⁇ is attenuated while maintaining the binding property to IL-2 receptor ⁇ and ⁇ . Therefore, by using the IL-2 mutant of the present invention, the effectiveness of IL-2 therapy can be enhanced by suppressing the proliferation of Treg (CD4 + CD25 +) while retaining the ability to proliferate CD8 + T cells and NK1.1 + cells. Can be enhanced.
  • FIG. 1 is a mature human IL-2 amino acid sequence (SEQ ID NO: 1).
  • FIG. 2 is a mature stable mutant human IL-2 amino acid sequence (SEQ ID NO: 2).
  • FIG. 3 shows the mature stable IL-2 receptor alpha subunit (CD25) unbound human IL-2 amino acid sequence (MK-6 (SEQ ID NO: 3), MK-15 (SEQ ID NO: 4) and mature stable variant. Human IL-2 amino acid sequence MK-4 (SEQ ID NO: 5))).
  • FIG. 4 is a mature human albumin amino acid sequence (SEQ ID NO: 6).
  • FIG. 5 shows the mature human albumin-MK-6-IL-2 amino acid sequence (HSA-3xG4S-MK-6) (SEQ ID NO: 7) and the mature human albumin-MK-15-IL-2 amino acid sequence (HSA-3xG4S-).
  • MK-15 SEQ ID NO: 8
  • mature human albumin-3x EAAAK
  • EAAAK mature human albumin-3x
  • EAAAK mature human albumin-2 amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 9 and mature human albumin- 3x (EAAAK) -MK-15-IL-2 amino acid sequence
  • HSA-3x (EAAAK) -MK-6) SEQ ID NO: 10
  • FIG. 10 shows the mature human albumin-MK-6-IL-2 amino acid sequence (HSA-3xG4S-MK-6) (SEQ ID NO: 7) and the mature human albumin-MK-15-IL-2 amino acid sequence (HSA-3xG4S-).
  • MK-15 SEQ ID NO: 8
  • mature human albumin-3x
  • FIG. 6 shows the amino acid sequence of the mouse albumin protein (SEQ ID NO: 11), the amino acid sequence of the mature MK-6 mouse albumin fusion protein (SEQ ID NO: 12), the amino acid sequence of the mature MK-14 mouse albumin fusion protein (SEQ ID NO: 13) and Amino acid sequence of mature MK-15 mouse albumin fusion protein (SEQ ID NO: 14).
  • FIG. 7A shows a human anti-CSPG4-scFv amino acid sequence (SEQ ID NO: 15), a mature human albumin-CSPG4-scFv-MK-6-IL-2-amino acid sequence (HSA-CSPG4-scFv-MK-6) (SEQ ID NO: 16).
  • FIG. 7B is a mature human albumin-CSPG4-scFv-MK-15-IL-2-amino acid sequence (HSA-CSPG4-scFv-MK-15) (SEQ ID NO: 18).
  • FIG. 8 is a linker amino acid sequence (SEQ ID NOs: 21 and 25) linking mature MK-6 and albumin.
  • FIG. 9 (top) is a schematic binding diagram of the IL-2 / IL-2 receptor ⁇ complex.
  • FIG. 9 (bottom) is a schematic three-dimensional structure diagram relating to the binding between the IL-2 / IL-2 receptor ⁇ complex and IL-2.
  • FIG. 10 shows IL-2 receptor ⁇ -binding on cells.
  • FIG. 11 shows IL-2 receptor ⁇ -binding on cells.
  • FIG. 12 shows human CSPG4 binding on cells.
  • FIG. 13 shows IL-2-dependent cell proliferation of mouse and human lymphocytes by IL-2, MK-14 and MK-6.
  • FIG. 14 shows IL-2-dependent cell proliferation of mouse and human lymphocytes by MK-4, MK-6, MK-14 and MK-15.
  • FIG. 15 shows IL-2-dependent cell proliferation of mouse and human lymphocytes by MK-6, HSA-3xG4S-MK-6 and HSA-3x (EAAAK) -MK-6.
  • FIG. 16 shows IL-2-dependent cell proliferation of mouse and human lymphocytes by MK-6, HSA-CSPG4-scFv-3xG4S-MK-6 and HSA-CSPG4-scFv-3xG4S-MK-14.
  • FIG. 17 shows IL-2-dependent Treg cell proliferation.
  • FIG. 18 shows the effect on peripheral immune system cell count in mice (BALB / c) treated with IL-2 (MK-6-IL-2 or MK-14-IL-2).
  • FIG. 19 shows the body weight, liver, and spleen of mice (BALB / c) intravenously administered with IL-2 (MK-6-IL-2 or MK-14-IL-2) once daily for 4 consecutive days. Shows the effect on weight.
  • FIG. 20 shows the effect of IL-2 (MK-6-IL-2 or MK-14-IL-2) on cancer-bearing mice (BALB / c) subcutaneously transplanted with CT26 colorectal cancer cells.
  • FIG. 21 shows mice subcutaneously transplanted with CT26 colorectal cancer cells (BALB / c) and IL-2 (MK-6-IL-2 or MK-14-IL-2) in the abdominal cavity twice a day for 5 consecutive days.
  • FIG. 22 shows the effect of IL-2 (MK-6-IL-2 or MK-14-IL-2) on cancer-bearing mice (C57BL / 6) subcutaneously transplanted with B16F10 malignant melanoma.
  • FACS analysis of intratumoral lymphocytes (TIL) by IL-2 monotherapy in B16F10 malignant melanoma-bearing model mice is shown.
  • FIG. 24 shows the antitumor effect of albumin-fused IL-2 (MSA-IL-2) monotherapy in CT26 colorectal cancer-bearing model mice.
  • 25 shows changes in IL-2 blood concentration after intraperitoneal administration of mature MK-6-IL-2 and mature MK-6-IL-2-mouse albumin and intratumoral IL in CT26 colorectal cancer-bearing model mice. The quantification of -2 is shown.
  • protein (protein) and “peptide” are used in the sense of including oligopeptides and polypeptides. Further, in the present specification, “protein” and “peptide” are used to include both proteins modified by sugar chains and the like and unmodified proteins, unless otherwise specified. This also applies to proteins that are not specified to be proteins.
  • IL-2 variant protein The present invention has at least 95% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and is at positions 35, 38, 42 or Provided is an IL-2 mutant protein having an amino acid sequence in which the amino acids at positions 43 and 45 are all A. Therefore, the present invention has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; at least 95% sequence identity with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and the amino acids at positions 35, 38, 42 and 45. Amino acid sequence in which is all A; or an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and in which the amino acids at positions 35, 38, 43 and 45 are all A.
  • an IL-2 variant protein having.
  • the IL-2 variant protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is not limited to the IL-2 variant protein whose amino acid sequence consists only of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. It also includes an IL-2 variant protein whose amino acid sequence includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 as a part thereof.
  • amino acids having at least 95% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and in which the amino acids at positions 35, 38, 42 or 43 and 45 are all A.
  • An IL-2 variant protein having a sequence has an amino acid sequence having at least 95% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and has positions 35, 38, 42 or 43 and 45.
  • the amino acid sequence is all A, but also the amino acid sequence has at least 95% sequence identity with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence at position 35 , 38, 42 or 43 and 45 are all A amino acid sequences including an IL-2 variant protein as a part thereof.
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of the mature stable mutant human IL-2.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 corresponds to a sequence in which K at position 35, R at position 38, K at position 43 and Y at position 45 are all replaced with A in SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 corresponds to a sequence in which K at position 35, R at position 38, F at position 42 and Y at position 45 are all replaced with A in SEQ ID NO: 2.
  • IL-2 / IL-2 receptor binding and MK-6-IL-2 (described in Examples below) and IL-2 receptor which are one typical embodiment of the present invention. The outline of the binding is shown in FIG. Specifically, FIG.
  • FIG. 9 (top) is a schematic binding diagram of the IL-2 / IL-2 receptor ⁇ complex.
  • Mature human IL-2 (and mature modified human IL-2) binds to the high affinity IL-2 receptor ⁇ complex.
  • mature MK-6-IL-2 does not bind to the ⁇ subunit but to the intermediate affinity IL-2 receptor consisting of ⁇ .
  • FIG. 9 (bottom) is a schematic three-dimensional structure diagram relating to the binding between the IL-2 / IL-2 receptor ⁇ complex and IL-2.
  • the three-dimensional structural schematic diagram of each protein in FIG. 9 (bottom) was created using publicly known data (2ERJ) of a protein structure data bank (PDB: Protein Data Bank).
  • IL-2 receptor ⁇ is widely expressed in vascular endothelial cells, Treg cells, activated T cells, and the like. Mature human IL-2 (and mature modified human IL-2) binds to cells that express IL-2 receptor ⁇ alone. This causes the following multiple adverse events. The first is vascular leakage syndrome (VLS), which is sometimes fatal because it binds to vascular endothelial cells that express IL-2 receptor ⁇ alone, which enhances vascular permeability. Causes edema and multiple organ failure. The second adverse event is the activation of Tregs. Since Treg suppresses antitumor immunity, it induces cancer growth and metastasis / infiltration.
  • VLS vascular leakage syndrome
  • Treg suppresses antitumor immunity, it induces cancer growth and metastasis / infiltration.
  • IL-2R Three subunits of the IL-2 receptor (IL-2R) have been identified: ⁇ (CD25), ⁇ (CD122) and ⁇ c (CD132).
  • IL-2R ⁇ is a low-affinity receptor alone
  • IL-2R ⁇ and ⁇ c heterodimers are intermediate-affinity receptors
  • ⁇ is a high-affinity receptor, but only the latter two have signal transduction.
  • the tyrosine kinases JAK1 and JAK3 associate with IL-2R ⁇ and ⁇ c, respectively, and mainly activate STAT5.
  • activation of PI3K, Akt and MAPK systems occurs.
  • IL-2 acts on T cell proliferation.
  • One of its effects is the proliferation and activation of antigen-stimulated CD8 + T cells.
  • IL-2 controls antigen-dependent proliferation over all stages of naive effector memory differentiation. At least some of the CD8 + T cells are called cytotoxic T cells or killer T cells and are known to kill tumor cells that present cancer-related antigens. Furthermore, NK cells express an intermediate affinity IL-2 receptor consisting of ⁇ , and are proliferated and activated by IL-2 stimulation to exhibit cytotoxic activity including antitumor activity. On the other hand, IL-2 is required for the differentiation of both endogenous Tregs (nTregs) formed in the thymus and inducible Tregs (iTregs) formed in the periphery.
  • nTregs endogenous Tregs
  • iTregs inducible Tregs
  • Treg cells are constitutively high in IL2R ⁇ , a high-affinity IL-2 receptor composed of IL2 receptor ⁇ -subunit (CD25), IL2 receptor ⁇ -subunit (CD122), and IL2RG-subunit (CD132). Characterized by expression at levels, Treg cell proliferation has been shown to be IL-2 dependent.
  • antitumor immunity it is known that antitumor immunity does not function effectively due to immunosuppression by Treg cells, and activation of antitumor activity is not induced, resulting in tumor growth and metastatic infiltration.
  • Non-Patent Document 1 a dozen or more amino acids among the amino acids constituting IL-2 are present in the appendix of the binding portion between IL-2 and IL-2 receptor ⁇ . ..
  • the present inventors have made numerous studies to reduce the binding property between IL-2 and IL-2 receptor ⁇ , and have conceived to mutate one of these dozens of amino acids.
  • the IL-2 mutant protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 becomes IL-2 receptor ⁇ while maintaining the binding property to IL-2 receptor ⁇ and ⁇ .
  • the attenuated binding property is that the K at the 35th position, the R at the 38th position, the F at the 42nd position or the K at the 43rd position and the Y at the 45th position are all replaced with A, which are in contact with the IL-2 receptor ⁇ . It is probable that it was done. Therefore, the IL-2 variant protein of the present invention is sequenced so as to conserve all A at positions 35, 38, and 45, and conserve A at position 43 or have A at position 42. One or several from the amino acid sequence represented by No.
  • the IL-2 variant protein may have an amino acid sequence obtained by adding, deleting and / or substituting the amino acids of.
  • the IL-2 variant protein preferably has at least 95% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, preferably at least 97% sequence. It is more preferred to have identity, more preferably at least 99% sequence identity.
  • a at positions 35, 38, and 45 are all preserved, and A is preserved at position 43 or A at position 42.
  • amino acid sequence obtained by adding, deleting and / or substituting an amino acid from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • amino acids from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 are preserved while preserving all A at positions 35, 38, 43 and 45.
  • amino acid sequence obtained by adding, deleting and / or substituting the amino acid sequence in which the two amino acids between positions 81 and 84 are deleted and DTK is added in SEQ ID NO: 3, P in position 82 in SEQ ID NO: 3 is used.
  • Examples thereof include an amino acid sequence, an amino acid sequence in which at least two of these modifications are combined, and the like.
  • the IL-2 mutant protein is at positions 35, 38 and 45 from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • It may be a fusion protein to which another amino acid sequence is fused, optionally via a linker.
  • all A at positions 35, 38 and 45 from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 are preserved.
  • the portion consisting of the amino acid sequence to which one or several amino acids are added, deleted and / or substituted so that A is conserved at the 43rd position or A is held at the 42nd position is simply IL-2.
  • IL-2 it may also be referred to as a variant protein portion.
  • the IL-2 variant protein contains all A at positions 35, 38 and 45 from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the immunoglobulin moiety may be (a) an Fc moiety of an antibody and (b) an antibody that encloses a variable region (Fab moiety) for an antigen against an antigen molecule presented in a tumor cell or tumor cell environment.
  • the term "immunoglobulin moiety” is not limited to those having an Fc moiety and a Fab moiety, but any fragment (eg, Fab partial fragment, single chain variable region fragment) within the range of antigen binding. (ScFv), variable region fragment of heavy chain antibody (variable domain of heavy chain of healthy chain antibody (VHH), etc.).
  • the antibody having a variable region include anti-EGFR antibody Cetuximab, anti-Her2 antibody Trastuzumab, anti-CD20 antibody Rituximab and the like.
  • fusion proteins examples include albumin-IL-2, IL-2-albumin, albumin-IL-2-immunoglobulin, immunoglobulin-IL-2-albumin, albumin-immunoglobulin-IL-2-albumin, and albumin.
  • albumin examples include albumin (HSA) or a fragment or variant of albumin.
  • HSA albumin
  • domain III of human serum albumin has been shown to be highly bound to FCGRT (FcRn), and this domain alone or in combination with other domains with long or modified half-life. It is possible to make variants containing (eg, Albumin Flex Technology, Novozymes).
  • the protein to be fused to the IL-2 mutant protein moiety include those derived from mammals such as humans. Further, the protein to be fused to the IL-2 mutant protein portion may be a humanized protein or the like.
  • FIG. 5 an example of a mature human albumin-MK-6-IL-2 amino acid sequence (FIG. 5, SEQ ID NOs: 7-10), a mature MK-6-IL-2-mouse albumin-amino acid sequence. Examples (FIG.
  • FIGS. 5 and 6 SEQ ID NOs: 12-14 are shown in FIGS. 5 and 6, respectively.
  • the mature mouse albumin amino acid sequence (SEQ ID NO: 11) that constructs these fusion proteins is shown in FIG.
  • the IL-2 mutant protein moiety and other proteins may be linked via a linker.
  • the linker amino acid sequence may be either a so-called rigid linker or a flexible linker, and examples thereof include those described in Non-Patent Document 2, and specific examples thereof include those described in the following table: More specifically, in a preferred embodiment, the linker amino acid sequence includes, for example, one or several amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 23 or 27 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 or 27 in FIG.
  • Examples include sequences.
  • the repeating sequence of GGGGS or GGGGS (for example, GGGGGS GGGGGS GGGGS) has flexible properties and retains the properties of each of the fused proteins. It is useful because it can be used.
  • EAAAK or its repeating sequence can reliably maintain (separate) the distance between two protein domains, and is therefore unique to each protein functional domain. It is useful because it can be fused while retaining its function.
  • the IL-2 mutant protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 includes those modified by saccharification, acetylation and the like. In the present invention, those modified with sugar or the like are preferable. Further, in order to facilitate purification in the purification process described later, the mutant of the present invention is genetically engineered with a purification tag (for example, a polyhistine tag, Strep-tag®, etc.) at the N-terminal or C-terminal of the mutant. Also known as a secretory signal sequence (also known as a signal peptide or pre-sequence) as an N-terminal extension of the fusion protein to guide the fusion protein to the secretory pathway of the host cell.
  • a purification tag for example, a polyhistine tag, Strep-tag®, etc.
  • secretory signal sequence also known as a signal peptide or pre-sequence
  • the DNA sequence encoding the signal peptide is typically attached to the 5'terminus of the DNA sequence encoding the fusion protein in the correct reading frame.
  • the signal peptide is usually associated with the protein. It may be a related peptide, or it may be a gene-derived or artificial secretory sequence encoding another secreted protein.
  • the IL-2 mutant protein of the present invention has the ability to activate cells expressing IL-2 receptors ⁇ and ⁇ , and from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. It is preferable because the binding property to IL-2 receptor ⁇ is suppressed as compared with the IL-2 mutant protein.
  • a method for producing such a mutant strain a method known per se (for example, the method described in Japanese Patent No. 6640834) is appropriately used to construct, for example, a gene cassette in which the above mutation is added to the IL-2 gene.
  • the expression cassette is connected to a suitable vector suitable for the host to be adopted.
  • the vector must be capable of containing the DNA sequence encoding the fusion protein to be expressed.
  • Suitable host cells can be readily transformed among eukaryotic and prokaryotic cells in culture medium. Contains cells that can exhibit rapid proliferation. Specifically, preferred host cells are E. coli.
  • Prokaryotic cells such as colli, Bacillus subtillus, as well as animal cells and yeast strains, such as S. cerevisiae. Includes eukaryotic cells such as cerevisiae. Mammalian cells, in particular Expi293F, ExpiCHO, HEK, ExJ558, NSO, SP2-O, or CHO, are generally preferred. Other suitable hosts include insect cells such as, for example, Sf9 cells. Stable transformed or transfected cell lines can then be selected. Furthermore, a transcriptional translation system in vitro can also be adopted as an expression system. Further, the mutant of the present invention may be produced using a cell-free protein synthesis system. Further, the obtained mutant of the present invention may be purified by an appropriate method known per se (filtration, centrifugation, chromatography, etc.).
  • the invention provides a pharmaceutical containing the IL-2 mutant protein. Due to the effects of the IL-2 mutant protein described above, the present invention presents the invention to a receptor consisting of IL-2 receptor ⁇ and ⁇ , which is a modified IL-2 drug whose binding to IL-2 receptor ⁇ is attenuated. It is possible to provide a modified drug for IL-2, which increases the amount of IL-2.
  • the pharmaceuticals of the present invention can be used, for example, to prevent and / or treat cancer.
  • the target cancer includes, for example, solid cancer such as kidney cancer, melanoma, non-small cell lung cancer, colon cancer, hepatocellular carcinoma, head and neck cancer, non-Hodgkin's lymphoma, and blood such as acute myeloid leukemia.
  • solid cancer such as kidney cancer, melanoma, non-small cell lung cancer, colon cancer, hepatocellular carcinoma, head and neck cancer, non-Hodgkin's lymphoma, and blood such as acute myeloid leukemia.
  • system tumors include system tumors.
  • IL-2 mutant protein itself, which is the active ingredient of the present invention, is used as a pharmaceutical
  • various pharmaceutically acceptable carriers for example, isotonic agents, chelating agents, stabilizers, pH
  • It may be used as a pharmaceutical composition in combination with a regulator, a preservative, an antioxidant, a solubilizing agent, a thickening agent, etc.).
  • tonicity agent examples include saccharides such as glucose, trehalose, lactose, fructose, mannitol, xylitol and sorbitol, polyhydric alcohols such as glycerin, polyethylene glycol and propylene glycol, sodium chloride, potassium chloride and calcium chloride.
  • saccharides such as glucose, trehalose, lactose, fructose, mannitol, xylitol and sorbitol
  • polyhydric alcohols such as glycerin, polyethylene glycol and propylene glycol
  • sodium chloride potassium chloride and calcium chloride
  • examples include inorganic salts.
  • the chelating agent examples include edetates such as disodium edetate, disodium calcium edetate, trisodium edetate, tetrasodium edetate, calcium edetate, ethylenediaminetetraacetic acid salt, nitrilotriacetic acid or a salt thereof, and hexametallin. Examples thereof include acid soda and citric acid.
  • the stabilizer examples include sodium bisulfite and the like.
  • Examples of the pH adjuster include acids such as hydrochloric acid, carbonic acid, acetic acid and citric acid, and further include alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide, alkali metal carbonates such as sodium carbonate or hydrogen carbonate. Examples thereof include salts, alkali metal acetates such as sodium acetate, alkali metal citrates such as sodium citrate, and bases such as tromethamol.
  • preservatives include paraoxybenzoic acid esters such as sorbic acid, potassium sorbate, methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, and butyl paraoxybenzoate, chlorhexidine gluconate, benzalkonium chloride, and chloride.
  • examples thereof include quaternary ammonium salts such as benzethonium and cetylpyridinium chloride, alkylpolyaminoethylglycine, chlorobutanol, polyquad, polyhexamethylenebiguanide, chlorhexidine and the like.
  • antioxidant examples include sodium hydrogen sulfite, dry sodium sulfite, sodium pyrosulfite, concentrated mixed tocopherol and the like.
  • solubilizing agent examples include sodium benzoate, glycerin, D-sorbitol, glucose, propylene glycol, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, macrogol, D-mannitol and the like.
  • thickening agent examples include polyethylene glycol, methyl cellulose, ethyl cellulose, carmellose sodium, xanthan gum, chondroitin sodium sulfate, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropylmethyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol and the like.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition may further contain a compound which is said to have a preventive or therapeutic action on a target disease of the said drug, in addition to the IL-2 mutant protein.
  • a compound which is said to have a preventive or therapeutic action on a target disease of the said drug in addition to the IL-2 mutant protein.
  • examples of the compound known to have an antitumor effect include Cetuximab, Trastuzumab, Rituximab and the like.
  • immune checkpoint inhibitors such as Nivolumab, Pembrolizumab, and Ipilimumab are preferable.
  • the content of the IL-2 mutant protein in the composition is not particularly limited, and for example, 90% by mass or more, 70% by mass or more, 50% by mass or more, 30% by mass or more, 10 by mass. It can be appropriately set from conditions such as mass% or more, 5% by mass or more, and 1% by mass or more.
  • the form of the preparation is not particularly limited, and for example, oral administration agents such as tablets, rounds, capsules, powders, granules and syrups; injections (intravenous injection, intramuscular injection, local injection, etc.), gargling agents, drip agents. , Various formulations such as external preparations (ointments, creams, patches, inhalants), parenteral administrations such as suppositories, and the like can be mentioned. Among the above-mentioned pharmaceutical forms, for example, oral administration agents (tablets, pills, capsules, powders, granules, syrups, etc.), external preparations (inhalants, ointments, creams, patches, etc.) and the like are preferable. Can be mentioned.
  • the dose of the IL-2 mutant protein varies depending on the route of administration, the age, body weight, symptoms, etc. of the patient and cannot be unconditionally defined, but the daily dose for an adult is usually about 5000 mg or less, preferably about.
  • the amount may be 1000 mg or less.
  • the lower limit of the dose of the IL-2 mutant protein is not particularly limited, and the daily dose for an adult can be appropriately set in the range of usually 0.1 mg or more, preferably 0.5 mg or more. When administered once a day, this amount may be contained in one pharmaceutical product, and when administered three times a day, one third amount may be contained in one pharmaceutical product.
  • the drug of the present invention is administered to a patient such as a mammal.
  • mammals include humans, monkeys, mice, rats, rabbits, cats, dogs, pigs, cows, horses, sheep and the like, and humans are preferable.
  • the invention prevents cancer, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the IL-2 mutant protein according to any one of Items 1-5. Or provide a method of treatment.
  • Example 1 Construction of IL-2 receptor ⁇ (IL-2R ⁇ ) binding plasmid The plasmid (pcDNA4-IL-2) encoding human IL-2 encoding the mutant protein of the present invention is a Jurkat cell (# TKG 0209 Tohoku) based on the sequence information described in NCBI Reference Sequence: NM_000586.3. Amplified by the PCR method using cDNA (PrimeScript (trade) II 1st strand cDNA Synthesis Kit, Takara Bio Co., Ltd. # 6210A) derived from mRNA derived from mRNA derived from Medical Cell Resource Center, Institute of Aging Medicine, University (Purchased from Medical Cell Resource Center) as a template.
  • cDNA PrimarymeScript (trade) II 1st strand cDNA Synthesis Kit, Takara Bio Co., Ltd. # 6210A
  • the human IL-2 mutant MK-14 is a PCR method using synthetic primers for the human IL-2 gene contained in the plasmid above (PrimeSTAR TM Max DNA Polymerase, Takara Bio Co., Ltd. # R045A). ) Introduced a new mutation, and a plasmid (PCDNA4-MK-14) encoding the structure was constructed.
  • MK-6 and MK-15 encoding the mutant proteins of the present invention are those in which a new mutation is introduced by the PCR method using MK-14 as a template, and a plasmid encoding a structure (pcDNA4-MK-6). And cDNA4-MK-15) were constructed.
  • MK-4 was also introduced with a new mutation by the PCR method using MK-14 as a template, and a plasmid encoding the structure (pcDNA4-MK-4) was constructed.
  • Production of IL-2 mutant protein The IL-2 mutant protein used in the following examples was prepared as follows using the plasmid obtained by the above method: The polyhistidine-tagged IL-2 variant protein transforms the plasmid encoding the structure into NEB Table chemical competent E. coli cells (NEB® # C3040H) and colonies on Amp-selected agar plates. The transformants were used to inoculate LB cultures. After overnight growth, pelletized E.
  • coli cells were used for a large plasmid preparation (NucleoBond® Xtra Maxi EF® Mahalai Nagel # 740424).
  • Expression per IL-2 variant protein construct is human embryo-derived kidney (HEK) cells in 250 ml suspension culture grown in Expi293® expression medium (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd., # A1435101).
  • Expi293F® Thermo Fisher Scientific Co., Ltd., # A14527
  • Expi293 cells were grown in a disposable sterile disposable Erlenmeyer flask flat bottom 1000 mL vent filter Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. at 37 ° C., 8% CO 2 and 80% humidity.
  • the shaking speed was 125 rpm in the Waken Be Tech Co., Ltd. remote shake.
  • 11.25 ml of transfection medium (Opti-MEM® I (1x) + GlutaMAX®-I reduced serum medium, Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. (registered trademark) # 51985-026) 250 ⁇ g of DNA in Medium and 11.83 ml of Transfection 675 ⁇ l ExpiFectamine® 293 Reagent (ExpiFectamine TM 293 Transfection Kit, Life technologies® # A14525), manufacturer's instructions. Used according to.
  • the liquid obtained by purification centrifugation and filtration through a 0.22 ⁇ m filter was prepared using NPI-20 buffer (50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 20 mM imidazole) using an AKTA go chromatography system (GE-Healthcare). It was poured into a 5 ml HisTrap HP column (GE-Healthcare # 17524802, USA) equilibrated at pH 8.0) at a low flow rate, and then the low affinity binding impurities were eluted with NPI-20 buffer.
  • NPI-20 buffer 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 20 mM imidazole
  • AKTA go chromatography system GE-Healthcare
  • the bound fusion protein elutes with 100% NPI-250 buffer (50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) and the main peak uses the peak detection option of Unicorn® software. Collected. Purified using 1 ⁇ D-PBS (-) (Gibco®), Prepacked Disposable PD-10 Colors (GE-Healthcare # 17085101, USA). Each fraction of 1 ml was collected and analyzed by reducing SDS-PAGE using SuperCep TM Ace 10-20% 13well® gel (Fuji-Film Wako # 191-15031).
  • the sample was mixed with a 3 x SDS (sodium dodecyl sulfate) sample buffer supplemented with 10 x reducing agent. The mixture was heated at 95 ° C. for 5 minutes before filling on SDS-PAGE. Proteins were visualized using QC Colloidal Coomasie staining (BIO-RAD # 1610803) according to the manufacturer's instructions. For protein cleavage by protease, TEV protease (Applied Biological Materials Co., Ltd. # E027) was used. Protein quantification was measured using the Protein Assay BCA Kit (Nacalai Tesque, Inc. # 06385-00) according to the manufacturer's instructions.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • 293T cells were obtained from RIKEN Cell Bank (RCB2202).
  • the human and mouse IL-2 receptor ⁇ expression 293T (293Ta) is a lentiviral vector constructed using human and mouse IL-2 receptor ⁇ chain genes (NCBI Reference Sequence: NM_000417.2 and NM_0083367.3) as cassettes, respectively. It was established as a cell that stably expresses IL-2 receptor ⁇ in 293T using pSIN-EF-RfA2-1-humanIL-2Ra and pSIN-EF-RfA2-1mouseIL-2Ra).
  • NanoLuc TM luciferase sequence was fused with human stable M-type.
  • 4-IL-2 MK-4, pcDNA4-MK-4-NLuc, equivalent to comparative example
  • mature stable mutant human MK-6-IL-2 MK-6, pcDNA4-MK-6-NLuc
  • Mature stable mutant human IL-2 MK-14, pcDNA4-MK-14-NLuc, IL-2 positive control
  • mature stable mutant human MK-15-IL-2 MK-15, pcDNA4-MK-15
  • FIG. 10 shows mouse and human IL-2 receptor sigma binding.
  • MK-6 and MK-15 did not show binding to the IL-2 receptor ⁇ in mice.
  • MK-4 has high mouse IL-2 receptor ⁇ binding.
  • MK-6 and MK-15 did not show binding to human IL-2 receptor ⁇ .
  • MSA-CSPG4-scFv-MK-14 or MSA-CSPG4-scFv-MK-6 was used as the IL-2 sample to be assayed.
  • plasmid construction and IL- are the same as in Example 1 except that the DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 or 19 is used.
  • 2 Obtained by producing a mutant protein.
  • the binding property to human and mouse IL-2 receptor ⁇ -expressing 293T cells was also examined as a numerical value of the amount ratio (293Ta / 293T). The results are shown in FIG. As shown in FIG.
  • MSA-CSPG4-scFv-MK-14 bound to human and mouse IL-2 receptor ⁇
  • MSA-CSPG4-scFv-MK-6 was similar to MK-6 in human and mouse. It can be seen that it does not bind to IL-2 receptor ⁇ .
  • binding to human CSPG4 on cells was measured. Specifically, CT26 cells were purchased from the Medical Cell Resources Center, Institute of Aging Medicine, Tohoku University.
  • CT26 / CSPG4 Human CSPG4-expressing CT26 cells (CT26 / CSPG4) are Lentiviral vectors (LT3G-hCSPG4-myc-His, Johannes A plasmid in which the human CSPG4 gene cDNA was inserted into pmiRE18_LT3GEPIR_Ren713 distributed from Pathology (IMP) was established as CT26 cells inducibly expressing human CSPG4 in the presence of doxicycline.
  • CT26 and CT26 / CSPG4 were 24 wel cell cells.
  • Mature stable mutant human MK-6-IL-2 (MK-6, cDNA4) fused to a plate (Techno Plastic Products AG # 92424) and then fused with a NanoLuc TM luciferase sequence (Promega Corporation, USA).
  • -MK-6-NLuc mature stable mutant MSA-CSPG4-scFv-MK-6
  • pcDNA4-MSA-CSPG4-scFv-MK-6-NLuc mature stable mutant MSA-CSPG4-scFv-MK-6
  • MK-6 fused albumin and CSPG-scFv contains albumin and CSPG-scFv. It bound to CSPG4 in the same manner as the fused MK-14. From this result, it can be seen that MK-6 to which the antibody-like molecule is bound binds to the target antigen (human CSPG4) expressed on cancer cells.
  • Example 2 IL-2-Dependent Cell Proliferation
  • Example 2-1 IL-2-Dependent Cell Proliferation
  • CTLL-2 cells RIKEN cell bank RCB0637
  • mouse T cell line CTLL-2 cells RIKEN cell bank RCB0637
  • the cells proliferate in an IL-2 dependent manner, they are used in rapid and sensitive bioassays for IL-2 detection.
  • CTLL-2 cells added with 1 nM human IL-2 (BioLegend # 589106), 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol (Gibco®), 10% fetal bovine serum (Fetal Bovine Serum (FBS), Hyclone) PRMI- It was grown at 1640 (FujiFilm-Wako # 1890202), penicillin 100 units / ml, streptomycin 100 units / ml 37 ° C. 5% CO 2 at 37 ° C., 10% CO 2 and 97% humidity.
  • CTLL-2 is a factor-dependent cell lineage that requires IL-2 for growth.
  • CTLL-2 cells 5% FBS, 5 ⁇ 10 -5 M 2-mercaptoethanol, 50 ⁇ g / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin, and 3 -Washed twice with high glucose DMEM supplemented with 4.0 mM L-glutamine.
  • IL-2 samples to be assayed were titrated with RPMI with 10% FBS in 96-well cell culture plate (Techno Plastic Products AG # 92097). Washed CTLL-2 cells were added (final assay volume 100 ⁇ l, 3000 cells / hole) and plates were incubated for approximately 72 hours at 37 ° C. and 10% CO 2 .
  • TPA-Mat cells which are IL-2-dependent T cell lines (distributed by Dr. Toshikazu Takeshita, Shinshu University. J Cell Physiol., 136: 319-25, 1988. ) was used. These cells are medium supplemented with human IL-2 (1 nM human IL-2 (BioLegend # 589106)), 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone) added PRMI-1640 (FujiFilm-Wako # 18902025), penicillin 100 units. In / ml, streptomycin 100 units / ml), the cells were grown at 37 ° C.
  • KHYG-1 cells which are IL-2 dependent NK cell lines (distributed by Dr. Toshikazu Takeshita, Shinshu University, express only human IL-2 receptor ⁇ chain and not ⁇ chain) and TPA-Mat ⁇ KO cells (distributed by Dr. Toshikazu Takeshita, Shinshu University, expressing only the human IL-2 receptor ⁇ chain and not the ⁇ chain) were used.
  • the IL-2 samples to be assayed include MK-4-IL-2 (MK-4), MK-6-IL-2 (MK-6), MK-14-IL-2 (MK-14), and MK-15.
  • -IL-2 (MK-15), HSA-CSPG4-scFv-MK-14 or HSA-CSPG4-scFv-MK-6 was used.
  • plasmid construction and IL- are the same as in Example 1 except that the DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 or 16 is used.
  • IL-2 samples Obtained by producing a mutant protein.
  • These IL-2 samples were titrated with RPMI1640 with 10% FBS in 96-well cell culture plate (Techno Plastic Products AG #) and adjusted as each sample of elevated concentration. Washed TPA-Mat, or TPA-Mat ⁇ KO cells or KHYG-1 cells were added (final assay volume 100 ⁇ l, 3000 cells / hole) and plates were incubated for approximately 72 hours at 37 ° C. and 10% CO 2 . For the cells in each hole, the number of cells was quantitatively measured using CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay Kit (Promega # G7570), and the Emax of each IL-2 (including mutants) was 100. % And expressed as a relative value.
  • IL-2-dependent proliferation is a numerical value relating to biological activity and refers to a measure of biological activity in a cell-based quantitative in vitro assay.
  • MK-6-IL was compared with the 50% effect concentration (EC50) of MK-14-IL-2 and IL-2 (BioLegend # 589106).
  • EC50 50% effect concentration
  • TPA-Mat the results were similar to those of CTLL-2.
  • MK-6 exerted the same maximum proliferative effect as IL-2 and MK-14-IL-2 on mouse and human T cell lines. Furthermore, as shown in FIG. 14, MK-15 showed proliferative activity against CTLL-2 and TPA-Mat, similar to MK-6. Furthermore, MK-6 and MK-15 exerted proliferative activity against TPA-Mat ⁇ KO cells or KHYG-1 cells. MK-6 and MK-15 are human IL-2 receptors because they showed the same proliferative activity as MK-14 against these cells expressing only the IL-2 receptor ⁇ chain and not the ⁇ chain. It can be seen that it has the ability to exert the same level of proliferative activity as IL-2 on ⁇ chain expressing cells.
  • Example 2-2 CTLL-2 was used in the same manner as in Example 2-1 except that MK-6-IL-2, HSA-3xG4S-MK-6 or HSA-3x (EAAAK) -MK-6 was used as the IL-2 sample.
  • the proliferation test was performed.
  • HSA-3xG4S-MK-6 or HSA-3x (EAAAK) -MK-6 are obtained by changing the linker sequence of MK-6-IL-2 to 3xG4S or 3x (EAAAK), respectively, and sequence the amino acid sequence. Shown in number 7 or 9.
  • These IL-2 samples were also obtained by performing plasmid construction and IL-2 mutant protein production in the same manner as in Example 1 except that the DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 9 was used.
  • MK-6-IL-2, HSA-3xG4S-MK-6 and HSA-3x (EAAAK) -MK-6 all have the same proliferation activity. showed that.
  • TPA-Mat TPA-Mat ⁇ KO cells or KHYG-1 cells
  • the results were similar to those of CTLL-2.
  • MK-6-IL-2 fused with albumin is equivalent to MK-6-IL-2 for mouse and human T cell lines regardless of whether a flexible linker or a rigid linker is used. Exhibited a proliferative effect.
  • Example 2-3 IL-2 dependent as in Example 2-1 except that MK-6-IL-2, HSA-CSPG4-scFv-MK-6 and HSA-CSPG4-scFv-MK-14 are used as IL-2 samples.
  • a sex growth test was performed. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 16, HSA-CSPG4-scFv-MK-14 showed high proliferative activity against CTLL-2 and TPA-Mat. On the other hand, HSA-CSPG4-scFv-MK-6 showed the same proliferative activity as MK-6-IL-2.
  • HSA-CSPG4-scFv-MK-6 exhibited the same proliferative activity as HSA-CSPG4-scFv-MK-14 and MK-6-IL-2 against TPA-Mat ⁇ KO cells or KHYG-1 cells. Since the three cells showed equivalent proliferative activity against these cells expressing only the IL-2 receptor ⁇ chain and not the ⁇ chain, HSA and CSPG4 and MK-6 were ligated via the G4S linker. However, it can be seen that it has the ability to exert the same degree of proliferative activity on human IL-2 receptor ⁇ chain expressing cells.
  • Example 3 IL-2 Dependent Treg Cell Proliferation Treg cells (CD4 + CD25 + ) are obtained from the spleen of BALB / c mice (8 weeks old, Nippon SLC Co., Ltd.) from the spleen of CD4 + CD25 + Regulatory T cell Isolation Kit (8 weeks old). Prepared using Miltenyi Biotec # 130-091-041) according to the manufacturer's instructions.
  • Treg cells were then washed twice with 1xD-PBS (-) (Gibco®) and then resuspended in 1xD-PBS (-) and CFSE (5,6-carboxyfluorescein dialectate succinidil ester, Staining with BioLegend # 423801) at room temperature and in the dark for 15 minutes.
  • CFSE 1,6-carboxyfluorescein dialectate succinidil ester, Staining with BioLegend # 423801
  • IL-2 BioLegend # 589106
  • MK-14-IL-2 induced cell division and proliferation for more than 70% Treg at a concentration of 1 nM, but by MK-6. Since the cell division-promoting effect of Treg did not change at all with no addition (0 pM), the proliferative activity for Treg was deficient.
  • CD8 + T cells CD3 + CD4 --CD8 + :
  • Treg cells CD3 + CD4 + CD25 + FoxP3 +
  • NK CD3 --CD49b + NKp46 +
  • the antibodies used were CD3 ⁇ : 145-2C11, BioLegend Co., Ltd., CD4: RM4-4, BioLegend Co., Ltd., CD8a: 53-6.7, BioLegend Co., Ltd., CD25 (IL-2R ⁇ ): PC61, BioLegend. NKp46: 29A1.4, BioLegend Co., Ltd., FoxP3; FJK-16s, DB Biosciences Co., Ltd.
  • Example 5 Side effects of IL-2 in vivo administration IL-2 (MK-6-IL-2 or MK-14-IL-2) to mice (BALB / c, 8 weeks old, Nippon SLC Co., Ltd.) It was administered to the body and its in vivo effect was examined. Specifically, each IL-2 was intravenously administered once a day in an amount of 2.5 ⁇ g, 25 ⁇ g, and 250 ⁇ g for 4 consecutive days. On the 5th day, the mice were euthanized, weighed, and the weight gain ratio compared with that before administration was calculated. In addition, the liver and spleen were removed and their weights were measured.
  • IL-2 MK-6-IL-2 or MK-14-IL-2
  • Example 6 Antitumor effect of IL-2 monotherapy in CT26 colorectal cancer-bearing model mice IL-2 (MK-14-IL-2 or) for cancer-bearing mice (BALB / c) subcutaneously transplanted with CT26 colorectal cancer cells
  • MK-6-IL-2 The effect of MK-6-IL-2 was measured.
  • 5x10 5 CT26 cells purchased from the Medical Cell Resource Center, Institute of Aging Medicine, Tohoku University
  • mice (BALB /) allogeneic to the cells were suspended. It was subcutaneously transplanted to the back of c).
  • the tumor diameter (minor diameter a and major diameter bmm) was measured.
  • the tumors increased similarly in the group treated with 1 ⁇ D-PBS (-) and MK-14-IL-2, but in the group treated with MK-6-IL-2, MK-14- Tumor growth was significantly suppressed compared to the IL-2 group.
  • Example 7 FACS analysis of intratumoral T cells treated with IL-2 monotherapy in CT26 colorectal cancer model mice.
  • 5x10 5 CT26 cells purchased from the Medical Cell Resource Center, Institute of Aging Medicine, Tohoku University
  • a 26G needle and 1mL syringe were used.
  • BALB / c mice (8 weeks old, Japan SLC Co., Ltd.) were subcutaneously transplanted into the back.
  • D-PBS -
  • IL-2 MK-14-IL-2 or MK-6-IL-2
  • TIL intratumoral lymphocytes
  • Treg cells CD4 + CD25 + FoxP3 +
  • CD8 + T cells CD8 + T cells
  • PD-1 + CD8 + T cells CD4 + T cells
  • NK cells CD3 - CD49b + NKp46 +
  • the CD8 / Treg ratio is shown as a relative value obtained by dividing the number of CD8 + T cells by the number of Treg cells.
  • the antibodies used were CD3 ⁇ : 145-2C11, BioLegend Co., Ltd., CD4: RM4-4, BioLegend Co., Ltd., CD8a: 53-6.7, BioLegend Co., Ltd., CD25 (IL-2R ⁇ ): PC61, BioLegend.
  • the Treg (%) in the CD4 + T cell group was significantly lower than that in the group to which MK-14-IL-2 was administered. (Fig. 21d).
  • the CD8 / Treg ratio was significantly increased as compared with the PBS-administered group.
  • Example 8 Antitumor effect of IL-2 monotherapy in B16F10 malignant melanoma model mouse IL-2 (MK-6-IL-2) for cancer-bearing mouse (C57BL / 6) subcutaneously transplanted with B16F10 malignant melanoma Alternatively, the effect of MK-14-IL-2) was measured. Specifically, 5x10 5 B16-F10 cells (purchased from the Medical Cell Resources Center, Institute of Aging Medicine, Tohoku University) were suspended in 100 ⁇ L of 1xD-PBS (-), and a 26 G needle and 1 mL syringe were placed. It was subcutaneously transplanted to the back of C57 / BL6 mice (8 weeks old, Nippon SLC Co., Ltd.).
  • Intraperitoneal administration of 1 ⁇ D-PBS (-), MK-14-IL-2 (5 ⁇ g) or MK-6-IL-2 (100 ⁇ g) twice daily for 5 consecutive days for tumors of uniform size growth. Then, the tumor diameter (minor diameter a and major diameter bmm) was measured over time using a caliper. The tumor volume (V) was calculated using the approximate formula of major axis ⁇ major axis ⁇ minor axis ⁇ 2 (V axb 2/2 ) mm 3 . The results of measuring the tumor system are shown in FIG. As shown in FIG. 22, MK-6 had a significantly smaller tumor volume than 1 ⁇ D-PBS ( ⁇ ) on the 7th day after the start of IL-2 administration.
  • Example 9 FACS analysis of intratumoral lymphocytes by IL-2 monotherapy in B16F10 malignant melanoma-bearing cancer model mice
  • FACS analysis of intratumoral T cells by IL-2 monotherapy in B16F10 malignant melanoma-bearing cancer model mice went. Specifically, 5x10 5 B16F10 cells (purchased from the Medical Cell Resources Center, Institute of Aging Medicine, Tohoku University) were suspended in 100 ⁇ L of 1xD-PBS (-) and used with a 26G needle and 1mL syringe. , C57 / BL6 mice (8 weeks old, Nippon SLC Co., Ltd.) were subcutaneously transplanted into the back.
  • TIL intratumoral lymphocytes
  • Dissociation buffer 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone) added PRMI-1640 (FujiFilm-Wako # 1890202) / penicillin 100 units / ml / Streptomycin 100 units / ml, DNaseI (Sigma-Aldrich # DN25-100MG, 50 ⁇ g / mL added) was immersed and shaken at 37 ° C. for 30 minutes at 122 rpm (Titec BR-53FP). Cell suspension was passed through a 70 ⁇ m strainer (BD Falcon).
  • TIL blood line cells
  • CD8 + T cells CD4 + T cells, Treg cells (CD4 + CD25 + FoxP3 + ), IFN ⁇ + CD8 + T cells (activated CD8 + T cells) NK cells (CD3 - CD49b + NKp46 + ), IFN ⁇ + NK cells
  • the number of cells of (activated NK cells), PD-1 + CD8 + T cells and PD-1 + Treg cells (activated Treg cells) was quantified.
  • the antibodies used were CD3 ⁇ : 145-2C11, BioLegend Co., Ltd., CD4: RM4-4, BioLegend Co., Ltd., CD8a: 53-6.7, BioLegend Co., Ltd., CD25 (IL-2R ⁇ ): PC61, BioLegend.
  • NKp46 29A1.4, BioLegend Co., Ltd., FoxP3; FJK-16s, DB Biosciences Co., Ltd., PD-1: 29F. 1A12, BioLegend, IFN ⁇ : 4SB3, BioLegend (Co., Ltd.).
  • the CD8 / Treg ratio is shown as a relative value obtained by dividing the number of CD8 + T cells by the number of Treg cells. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 23, there was no significant difference between CD8 + T cells, CD4 + T cells, Treg cells (CD4 + CD25 + FoxP3 + ), and IFN ⁇ + CD8 + T cells (activated CD8 + T cells).
  • NK cells CD3 - CD49b + NKp46 +
  • IFN ⁇ + NK cells were significantly higher in the MK-6-IL-2 administration group than in the PBS administration group, respectively.
  • Example 10 Antitumor effect of mature MK-6-IL-2-mouse albumin (SEQ ID NO: 12) monotherapy in CT26 colorectal cancer model mice Cancer-bearing mice subcutaneously transplanted with CT26 colorectal cancer cells (BALB / c) The effect of MSA-IL-2 (MSA-MK-14-IL-2 (SEQ ID NO: 13) or MSA-MK-6-IL-2 (SEQ ID NO: 12)) was measured. Specifically, 5x10 5 CT26 cells (purchased from the Medical Cell Resource Center, Institute of Aging Medicine, Tohoku University) were suspended in 100 ⁇ L of 1xD-PBS (-), and mice (BALB /) allogeneic to the cells were suspended.
  • MSA-IL-2 MSA-MK-14-IL-2
  • MSA-MK-6-IL-2 SEQ ID NO: 12
  • the tumor to which 1 ⁇ D-PBS (-) was administered increased with time, but the group to which MSA-MK-14-IL-2 was administered did not have a significant difference in the tumor shrinkage effect. rice field.
  • the group to which MSA-MK-6-IL-2 was administered tumor growth was significantly suppressed as compared with the PBS and MSA-MK-14-IL-2 groups.
  • Example 11 FACS analysis of intratumoral T cells by monotherapy with mature MK-6-IL-2-mouse albumin (SEQ ID NO: 12) in CT26 colorectal cancer-bearing model mice Intratumor T cells treated with IL-2 monotherapy in CT26 colorectal cancer-bearing model mice were prepared and FACS analysis was performed. Specifically, 5x10 5 CT26 cells (purchased from the Medical Cell Resource Center, Institute of Aging Medicine, Tohoku University) were suspended in 100 ⁇ L of 1xD-PBS (-), and a 26G needle and 1mL syringe were used. BALB / c mice (8 weeks old, Japan SLC Co., Ltd.) were subcutaneously transplanted into the back.
  • IL-2 For tumors grown to uniform size, IL-2 (MSA-MK-14-IL-2 or MSA-MK-6-IL-2) fused with 1xD-PBS (-) or albumin was given on day 5 and Intratumoral lymphocytes (TIL) were adjusted from the tumor excised on the 12th day by intraperitoneal administration twice in total on the 10th day. Specifically, the excised tumor is fragmented with scissors or the like, and then 10 mL of Dissociation buffer (10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone) added PRMI-1640 (FujiFilm-Wako 18902025) / penicillin 100 units / ml / streptomycin).
  • Dissociation buffer 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone) added PRMI-1640 (FujiFilm-Wako 18902025) / penicillin 100 units / ml / streptomycin).
  • Treg cells (CD4 + CD25 + FoxP3 + ), CD8 + T cells, PD-1 + CD8 + T cells, CD4 + T cells, NK cells (CD3 - CD49b + NKp46). + ) was analyzed by FACS and the number of each cell was quantified.
  • the CD8 / Treg ratio is a relative value obtained by dividing the number of CD8 + T cells by the number of Treg cells.
  • the antibody used was CD3 ⁇ : 145-2C11, BioLegend Co., Ltd., CD4: RM4-4, BioLegend Co., Ltd., CD8a: 53-6.7, BioLegend Co., Ltd., CD25 (IL-2R ⁇ ): PC61, BioLegend Co., Ltd., NKp46: 29A1.4, BioLegend Co., Ltd., FoxP3; FJK-16s, DB Biosciences Co., Ltd., PD-1: 29F.1A12, BioLegend.
  • FIG. 24b mature MK-6-IL-2.
  • the proportion of the CD3 + T cell group was significantly higher than that in the group administered with mature MK-14-IL-2-mouse albumin (SEQ ID NO: 13).
  • the Treg (%) in the CD4 + T cell group was significantly lower (Fig. 24b).
  • the CD8 / Treg ratio was significantly increased as compared with the PBS-administered group and the mature MK-14-IL-2-mouse albumin-administered group.
  • Example 12 Changes in IL-2 blood concentration after intraperitoneal administration of mature MK-6-IL-2 (SEQ ID NO: 3) and mature MK-6-IL-2-mouse albumin (SEQ ID NO: 12) (a) And quantification of intratumoral IL-2 in CT26 colorectal cancer-bearing model mice (a) BALB / c mice (8-week-old, MK-6 (SEQ ID NO: 3), which corresponds to an equal amount of mol with respect to Nippon SLC Co., Ltd.) 25 mg), MSA-MK-6 (SEQ ID NO: 12) (65 mg) were administered intraperitoneally. Each IL-2 was fused with a NanoLuc TM luciferase sequence (Promega Corporation, USA), after administration.
  • Blood IL-2 was quantified by NanoLuc TM activity.
  • Half-life in beta phase ( ⁇ phase) starting 1 hour after administration (Mean ⁇ help-lives (t 1/2 )) ⁇ SD (Standard deviation) was measured.
  • % Residual rate (% Remaining) is a relative value (%) obtained by dividing each NanoLuc activity measurement value 1 hour after administration by the NanoLuc activity measurement value at each time point.
  • ⁇ phase and Refers to the phase that rapidly decays in the early stage ( ⁇ phase) and then the phase that slowly decays ( ⁇ phase) in the subsequent transition of blood concentration, and the half-life is calculated in this phase. The result is 24a. As shown in FIG.

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Abstract

配列番号３で表されるアミノ酸配列又は配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ３５位、３８位、４２位又は４３位及び４５位のアミノ酸が全てＡであるアミノ酸配列を有するＩＬ－２変異体タンパク質

Description

ＩＬ－２変異体タンパク質及びこれを含む医薬
［関連出願の相互参照］
　本出願は、２０２０年９月１８日に出願された、日本国特許出願２０２０－１５７９００号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。本発明は、ＩＬ－２変異体タンパク質及びこれを含む医薬に関する。
　体内に侵入した病原体を除去するために発達した適応免疫応答に対して、哺乳動物の免疫系を刺激することは有用である。それによって活性化される免疫細胞の重要な集団はＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（細胞傷害性リンパ球）である。ＩＬ－２は、単球、ＮＫ細胞およびＴ細胞を含むさまざまな免疫細胞を刺激することが知られている。ＩＬ－２は病院で細胞性免疫反応を刺激するために用いられ、転移性メラノーマまたは転移性腎癌を有する患者における標準治療としてＦＤＡに認可されている（例えばアルデスロイキン（Ｃｈｉｒｏｎ）（別名Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）））。
　細胞性適応免疫反応に関与するＴ細胞レパートリーは、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を含む。これらのＴｒｅｇは、エフェクターＴ細胞およびメモリーＴ細胞の活性を低下させることにより、適応免疫プログラムにおいて重要な役割を果たしている。しかしながら、ＩＬ－２はまたＴ細胞のＴｒｅｇサブセットを活性化し、次いでそれがＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制するかまたは他のＴ細胞を寛容化するように作用する事ができることが観察されている。従って、ＩＬ－２は適応免疫反応の活性化およびその減弱化の両方に関与している。
　Ｔｒｅｇ細胞はＣＤ４および転写因子ＦｏｘＰ３の発現を特徴とし、ついでそれはＩＬ－２受容体複合体のαサブユニットであるＣＤ２５の発現を活性化する（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞）。このように、ＣＤ２５はＴｒｅｇ細胞において構成的に発現されている。ＣＤ２５とＩＬ－２受容体複合体のシグナル伝達構成成分（βサブユニットＣＤ１２２およびγサブユニットＣＤ１３２）の会合により、中親和性ＩＬ－２受容体複合体は高親和性ＩＬ－２受容体複合体に変換される。高親和性ＩＬ－２受容体複合体により中継されるシグナル伝達経路を通してＴｒｅｇ細胞のＩＬ－２活性化が起こる。
　高レベルのＣＤ２５発現は活性化Ｔ細胞の特徴であり、高親和性ＩＬ－２受容体複合体を介してこれらの細胞はＩＬ－２に感受性になる。ＣＤ２５の遮断は活性化Ｔ細胞におけるＩＬ－２媒介性シグナル伝達を阻害し、免疫抑制効果を示すという理論的根拠により、ＣＤ２５の遮断に基づく療法が開発されている。腎移植後の急性臓器拒絶の予防のために、ダクリズマブ（Ｒｏｃｈｅ）（別名Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））およびバシリキシマブ（ノバルティス）（別名Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））などの抗ＣＤ２５抗体がＦＤＡにより認可されている。ＩＬ－２の２重の役割のため、当該技術分野において、より効果的なＩＬ－２媒介性療法を提供する必要性が依然として存在する。
　細胞性免疫反応に関与する免疫細胞は、ＮＫ１．１＋の表現系を有するＮＫ細胞を含む。ＮＫ細胞は、適応免疫プログラムにおいて重要な役割を果たしている。しかしながら、ＩＬ－２はまたＴ細胞のＴｒｅｇサブセットを活性化し、次いでそれがＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制するかまたは他のＴ細胞を寛容化するように作用する事ができることが観察されている。従って、ＩＬ－２は適応免疫反応の活性化およびその減弱化の両方に関与している。
　高レベルのＣＤ２５発現は活性化Ｔ細胞の特徴であり、高親和性ＩＬ－２受容体複合体を介してこれらの細胞はＩＬ－２に感受性になる。ＣＤ２５の遮断は活性化Ｔ細胞におけるＩＬ－２媒介性シグナル伝達を阻害し、免疫抑制効果を示すという理論的根拠により、ＣＤ２５の遮断に基づく療法が開発されている。腎移植後の急性臓器拒絶の予防のために、ダクリズマブ（Ｒｏｃｈｅ）（別名Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））およびバシリキシマブ（ノバルティス）（別名Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））などの抗ＣＤ２５抗体がＦＤＡにより認可されている。ＩＬ－２の２重の役割のため、当該技術分野において、より効果的なＩＬ－２媒介性療法を提供する必要性が依然として存在する。
ＷＯ２０２０／０６９３９８ ＷＯ２０１８／２１５９３６ ＷＯ２０１８／２１５９３８ ＷＯ２０１４／０２８７４８ 特開２０１５－２２９６７６
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００６）１０３　ｐ．２７８８－９３ Ａｄｖ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖ　Ｒｅｖ．　２０１３　Ｏｃｔ　１５；　６５（１０）：　１３５７－１３６９．
　本発明は、ＩＬ－２受容体β及びγとの結合性は維持しつつＩＬ－２受容体αとの結合性が減弱されたＩＬ－２変異体を提供することを課題とする。
　かかる状況の下、鋭意研究した結果、成熟型ＩＬ－２の３５位、３８位、４２位（又は４３位）及び４５位のアミノ酸を全てＡに置換することによりＩＬ－２受容体β及びγとの結合性は維持しつつＩＬ－２受容体αとの結合性が減弱されることを見出した。本発明はかかる新規の知見に基づく。従って、本発明は、以下の項を提供する：
　項１．配列番号３で表されるアミノ酸配列又は配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ３５位、３８位、４２位又は４３位、及び４５位のアミノ酸が全てＡであるアミノ酸配列を有するＩＬ－２変異体タンパク質。
　項２．アルブミン及び／又は免疫グロブリンとの融合タンパク質である項１に記載のＩＬ－２変異体タンパク質。
　項３．免疫グロブリン部分が抗体のＦｃ部分である、項２に記載のＩＬ－２変異体タンパク質。
　項４．アルブミン－ＩＬ－２、ＩＬ－２－アルブミン、アルブミン－ＩＬ－２－免疫グロブリン、免疫グロブリン－ＩＬ－２－アルブミン、アルブミン－免疫グロブリン－ＩＬ－２－アルブミン又はアルブミン－ＩＬ－２－免疫グロブリン－アルブミンである、項２に記載のＩＬ－２変異体タンパク質。
　項５．ＩＬ－２受容体βおよびγを発現するＴＰＡ－Ｍａｔ細胞を活性化　させる　能力　を有し、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＩＬ－２変異体タンパク質と比較してＩＬ－２受容体αに対する結合性が抑制されている、項１～４のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異体タンパク質。
　項６．項１～５のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異体タンパク質を含む医薬。
　項７．癌を予防又は治療するための項６に記載の医薬。
　項８．それを必要とする対象に項１～５のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異体タンパク質の有効量を投与することを含む、癌を予防又は治療する方法。
　項９．癌の予防又は治療剤を製造するための、項１～５のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異体タンパク質の使用。
　本発明によれば、ＩＬ－２受容体β及びγとの結合性は維持しつつＩＬ－２受容体αとの結合性が減弱されたＩＬ－２変異体を提供することができる。従って、本発明のＩＬ－２変異体を用いることにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ１．１＋細胞を増殖させる能力を保持しながらＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）の増殖を抑制することにより、ＩＬ－２療法の有効性を高めることができる。
図１は、成熟ヒトＩＬ－２アミノ酸配列（配列番号１）である。 図２は、成熟安定型変異ヒトＩＬ－２アミノ酸配列（配列番号２）である。 図３は、成熟安定型ＩＬ－２受容体αサブユニット（ＣＤ２５）非結合型ヒトＩＬ－２アミノ酸配列（ＭＫ－６（配列番号３）、ＭＫ－１５（配列番号４）及び成熟安定型変異ヒトＩＬ－２アミノ酸配列ＭＫ－４（配列番号５）））である。 図４は、成熟ヒトアルブミンアミノ酸配列（配列番号６）である。 図５は、成熟ヒトアルブミン－ＭＫ－６－ＩＬ－２アミノ酸配列（ＨＳＡ－３ｘＧ４Ｓ－ＭＫ－６）（配列番号７）、成熟ヒトアルブミン－ＭＫ－１５－ＩＬ－２アミノ酸配列（ＨＳＡ－３ｘＧ４Ｓ－ＭＫ－１５）（配列番号８）、成熟ヒトアルブミン－３ｘ（ＥＡＡＡＫ）－ＭＫ－６－ＩＬ－２アミノ酸配列（ＨＳＡ－３ｘ（ＥＡＡＡＫ）－ＭＫ－６）（配列番号９）及び成熟ヒトアルブミン－３ｘ（ＥＡＡＡＫ）－ＭＫ－１５－ＩＬ－２アミノ酸配列（ＨＳＡ－３ｘ（ＥＡＡＡＫ）－ＭＫ－６）（配列番号１０）である。 図６は、マウスアルブミンタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１）、成熟ＭＫ－６マウスアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１２）、成熟ＭＫ－１４マウスアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３）及び成熟ＭＫ－１５マウスアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）である。 図７Ａは、ヒト抗ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ　アミノ酸配列（配列番号１５）、成熟ヒトアルブミン－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－６－ＩＬ－２－アミノ酸配列（ＨＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－６）（配列番号１６）、成熟ヒトアルブミン－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－１４－ＩＬ－２－アミノ酸配列（ＨＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－１４)（配列番号１７） 図７Ｂは、成熟ヒトアルブミン－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－１５－ＩＬ－２－アミノ酸配列（ＨＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－１５）（配列番号１８）である。成熟マウスアルブミン－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－６－ＩＬ－２－アミノ酸配列（ＨＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－６）（配列番号１９）、成熟マウスアルブミン－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－１４－ＩＬ－２－アミノ酸配列（ＨＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－１４)（配列番号２０） 図８は、成熟ＭＫ－６とアルブミンを繋ぐリンカーアミノ酸配列（配列番号２１及び２５）である。 図９（上）は、ＩＬ－２／ＩＬ－２受容体αβγ複合体の結合模式図である。図９（下）は、ＩＬ－２／ＩＬ－２受容体αβγ複合体とＩＬ－２の結合に関する立体構造模式図である。 図１０は細胞上のＩＬ－２受容体α結合性（ｏｎ－ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ）を示す。 図１１は、細胞上のＩＬ－２受容体α結合性（ｏｎ－ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ）を示す。 図１２は、細胞上のヒトＣＳＰＧ４結合性（ｏｎ－ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ）を示す。 図１３は、ＩＬ－２、ＭＫ－１４及びＭＫ－６によるマウス及びヒトリンパ球のＩＬ－２依存性細胞増殖を示す。 図１４は、ＭＫ－４、ＭＫ－６，　ＭＫ－１４及びＭＫ－１５によるマウス及びヒトリンパ球のＩＬ－２依存性細胞増殖を示す。 図１５は、ＭＫ－６、ＨＳＡ－３ｘＧ４Ｓ－ＭＫ－６及びＨＳＡ－３ｘ（ＥＡＡＡＫ）－ＭＫ－６によるマウス及びヒトリンパ球のＩＬ－２依存性細胞増殖を示す。 図１６は、ＭＫ－６、ＨＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－３ｘＧ４Ｓ－ＭＫ－６及びＨＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－３ｘＧ４Ｓ－ＭＫ－１４によるマウス及びヒトリンパ球のＩＬ－２依存性細胞増殖を示す。 図１７は、ＩＬ－２依存性のＴｒｅｇ細胞増殖を示す 図１８は、ＩＬ－２（ＭＫ―６－ＩＬ－２またはＭＫ―１４－ＩＬ－２）を投与したマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）における末梢免疫系細胞数に対する効果を示す。 図１９は、ＩＬ－２（ＭＫ―６－ＩＬ－２またはＭＫ―１４－ＩＬ－２）を１日１回連続４日間静脈内投与したマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）における、体重、肝臓、脾臓の重量に対する効果を示す。 図２０は、ＣＴ２６大腸癌細胞を皮下移植した担癌マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に対するＩＬ－２（ＭＫ―６－ＩＬ－２またはＭＫ―１４－ＩＬ－２）の効果を示す。 図２１は、ＣＴ２６大腸癌細胞を皮下移植したマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）し、ＩＬ－２（ＭＫ―６－ＩＬ－２またはＭＫ―１４－ＩＬ－２）を１日２回５日間連続で腹腔内投与した後に、摘出した腫瘍内リンパ球（ＴＩＬ）のＦＡＣＳ解析を示す。 図２２は、Ｂ１６Ｆ１０悪性黒色腫を皮下移植した担癌マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に対するＩＬ－２（ＭＫ―６－ＩＬ－２またはＭＫ―１４－ＩＬ－２）の効果を示す。 Ｂ１６Ｆ１０悪性黒色腫担癌モデルマウスにおけるＩＬ－２単剤治療による腫瘍内リンパ球（ＴＩＬ）のＦＡＣＳ解析を示す。 図２４は、ＣＴ２６大腸癌担癌モデルマウスにおけるアルブミン融合型ＩＬ－２（ＭＳＡーＩＬ－２）単剤治療による抗腫瘍効果を示す。 図２５は、成熟ＭＫ－６－ＩＬ－２および成熟ＭＫ－６－ＩＬ－２ーマウスアルブミンの腹腔内投与後のＩＬ－２血中濃度の推移およびＣＴ２６大腸癌担癌モデルマウスにおける腫瘍内ＩＬ－２の定量を示す。
　本発明において、「タンパク質（タンパク）」及び「ペプチド」は、オリゴペプチド及びポリペプチドを含む意味で用いられる。また、本明細書において、「タンパク質」及び「ペプチド」は、特に言及しない限り、糖鎖などによって修飾されているタンパク質及び非修飾のタンパク質の両方を包含するものとする。このことは、タンパク質であることが明記されていないタンパク質についても同様である。
　ＩＬ－２変異体タンパク質
　本発明は、配列番号３で表されるアミノ酸配列又は配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ３５位、３８位、４２位又は４３位及び４５位のアミノ酸が全てＡであるアミノ酸配列を有するＩＬ－２変異体タンパク質を提供する。従って、本発明は、配列番号３で表されるアミノ酸配列；配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ３５位、３８位、４２位及び４５位のアミノ酸が全てＡであるアミノ酸配列；又は配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ３５位、３８位、４３位及び４５位のアミノ酸が全てＡであるアミノ酸配列を有するＩＬ－２変異体タンパク質を提供する。配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ３５位、３８位、４２位及び４５位のアミノ酸が全てＡであるアミノ酸配列としては、例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列が挙げられる。
　本発明において、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するＩＬ－２変異体タンパク質とは、そのアミノ酸配列が配列番号３で表されるアミノ酸配列のみからなるＩＬ－２変異体タンパク質だけでなく、そのアミノ酸配列が配列番号３で表されるアミノ酸配列をその一部に含むＩＬ－２変異体タンパク質も包含する。同様に、本発明において、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ３５位、３８位、４２位又は４３位及び４５位のアミノ酸が全てＡであるアミノ酸配列を有するＩＬ－２変異体タンパク質とは、そのアミノ酸配列が配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ３５位、３８位、４２位又は４３位及び４５位のアミノ酸が全てＡであるアミノ酸配列のみからなるＩＬ－２変異体タンパク質だけでなく、そのアミノ酸配列が配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ３５位、３８位、４２位又は４３位及び４５位のアミノ酸が全てＡであるアミノ酸配列をその一部に含むＩＬ－２変異体タンパク質も包含する。
　配列番号２は、成熟安定型変異ヒトＩＬ－２のアミノ酸配列を示す。そして、配列番号３で表されるアミノ酸配列は、配列番号２における３５位のＫ、３８位のＲ、４３位のＫ及び４５位のＹを全てＡに置換したものに相当する。また、配列番号４で表されるアミノ酸配列は、配列番号２における３５位のＫ、３８位のＲ、４２位のＦ及び４５位のＹを全てＡに置換したものに相当する。ここで、ＩＬ－２／ＩＬ－２受容体結合と、本発明の１つの典型的な実施形態であるＭＫ―６－ＩＬ－２（後述の実施例に記載）とＩＬ－２受容体との結合の概要について図９に示す。具体的には、図９（上）は、ＩＬ－２／ＩＬ－２受容体αβγ複合体の結合模式図である。成熟ヒトＩＬ－２（および成熟改変型ヒトＩＬ－２）は、高親和性ＩＬ－２受容体αβγ複合体に結合する。一方、成熟ＭＫ－６－ＩＬ－２はαサブユニットに結合せず、βγからなる中間親和性ＩＬ－２受容体に結合する。
図９（下）は、ＩＬ－２／ＩＬ－２受容体αβγ複合体とＩＬ－２の結合に関する立体構造模式図である。図９（下）における各タンパク質の立体構造模式図は、蛋白質構造データバンク（ＰＤＢ：Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ）の公知データ（２ＥＲＪ）を用いて作出した。
　ＩＬ－２受容体αは血管内皮細胞、Ｔｒｅｇ細胞および活性化Ｔ細胞などに幅広く発現する。成熟ヒトＩＬ－２（および成熟改変型ヒトＩＬ－２）は、ＩＬ－２受容体αを単独で発現する細胞に結合する。これによって次に示す複数の有害事象を惹起する。その第１は血管漏出症候群（ＶＬＳ）であり、ＩＬ－２受容体αを単独で発現する血管内皮細胞に結合することで、血管透過性が亢進するため、ときに致死的な全身性多臓器浮腫および多臓器不全を起こす。第２の有害事象はＴｒｅｇの活性化である。Ｔｒｅｇは抗腫瘍免疫を抑制するため、がんの増大および転移・浸潤を誘導する。
　ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）は、α（ＣＤ２５）、β（ＣＤ１２２）およびγｃ（ＣＤ１３２）の３つのサブユニットが同定されている。ＩＬ－２Ｒαは単独で低親和性受容体、ＩＬ－２Ｒβおよびγｃのヘテロダイマーは中間親和性受容体、αβγは高親和性受容体となるが、シグナル伝達を有するのは後２者のみである。ＩＬ－２Ｒβ、γｃにはそれぞれチロシンキナーゼＪＡＫ１とＪＡＫ３が会合し、主にＳＴＡＴ５を活性化する。さらに、ＰＩ３Ｋ、ＡｋｔおよびＭＡＰＫ系の活性化がおこる。ＩＬ－２はＴ細胞増殖に働く。その効果の一つは抗原刺激を受けたＣＤ８+Ｔ細胞の増殖と活性化である。実際に、ＣＤ８+Ｔ細胞ではナイーブ・エフェクター・メモリーの全分化段階にわたって、ＩＬ－２が抗原依存性増殖を制御している。ＣＤ８+Ｔ細胞の少なくとも一部は細胞障害性Ｔ細胞あるいはキラーＴ細胞と呼ばれ、がん関連抗原を提示する腫瘍細胞を殺傷することが知られている。さらに、ＮＫ細胞はβγからなる中間親和性ＩＬ－２受容体を発現しており、ＩＬ－２刺激によって増殖と活性化され抗腫瘍活性をふくむ細胞障害活性を発揮する。一方、ＩＬ－２は胸腺でできる内在性Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）および末梢でできる誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）両者の分化に必要である。Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ２受容体αサブユニット（ＣＤ２５）、ＩＬ２受容体βサブユニット（ＣＤ１２２）、およびＩＬ２ＲＧサブユニット（ＣＤ１３２）から構成される高親和性ＩＬ－２受容体のＩＬ２Ｒαβγを構成的に高レベルで発現することを特徴とし、Ｔｒｅｇ細胞の増殖は、ＩＬ－２に依存することが示されている。抗腫瘍免疫では、Ｔｒｅｇ細胞による免疫抑制のため抗腫瘍免疫が有効に機能せず、抗腫瘍活性の賦活化が誘導されないため腫瘍の増大や転移浸潤が起こることが知られている。
　ここで、非特許文献１に記載のように、ＩＬ－２とＩＬ－２受容体αとの結合部分付記には、ＩＬ－２を構成するアミノ酸のうち十数個のアミノ酸が存在している。本発明者らはＩＬ－２とＩＬ－２受容体αとの結合性を低下させるために非常に多くの検討をしたなかでこれら十数個のアミノ酸のいずれかを変異させることを着想し、さらに多大な試行錯誤の上、ＩＬ－２の３５位のＫ、３８位のＲ、４２位のＦ又は４３位のＫ及び４５位のＹに着目するに至り、これらのアミノ酸をＡに置換することによりＩＬ－２受容体β及びγとの結合性は維持しつつＩＬ－２受容体αに対しては減弱された結合性を示すＩＬ－２変異体を得るに至った。従って、本願実施例に示すように、配列番号３で示すアミノ酸配列を有するＩＬ－２変異体タンパク質は、ＩＬ－２受容体β及びγとの結合性は維持しつつＩＬ－２受容体αに対しては減弱された結合性を示すのは、ＩＬ－２受容体αと接する３５位のＫ、３８位のＲ、４２位のＦ又は４３位のＫ及び４５位のＹを全てＡに置換したためと考えられる。従って、本発明のＩＬ－２変異体タンパク質は、３５位、３８位、及び４５位のＡを全て保存しつつ、かつ４３位にＡを保存するかもしくは４２位にＡを有するように、配列番号３で示されるアミノ酸配列から１個又は数個（例えば、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、１個等）のアミノ酸を付加、削除及び／又は置換してなるアミノ酸配列を有するものであってもよい。かかる実施形態において、ＩＬ－２変異体タンパク質は、配列番号３で表されるアミノ酸配列又は配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有することが好ましく、少なくとも９７％の配列同一性を有することがより好ましく、少なくとも９９％の配列同一性を有することがより好ましい。非限定的な例としては、配列番号３で表されるアミノ酸配列において、３５位、３８位、及び４５位のＡを全て保存しつつ、かつ４３位にＡを保存するかもしくは４２位にＡを有するように、配列番号３で示されるアミノ酸配列からアミノ酸を付加、削除及び／又は置換してなるアミノ酸配列としては、配列番号４で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。また、非限定的な例としては、配列番号３で表されるアミノ酸配列において、３５位、３８位、４３位及び４５位のＡを全て保存しつつ、配列番号３で示されるアミノ酸配列からアミノ酸を付加、削除及び／又は置換してなるアミノ酸配列としては、配列番号３において８１位と８４位との間の２アミノ酸を削除しＤＴＫを付加したアミノ酸配列、配列番号３における８２位のＰを削除したアミノ酸配列、配列番号３において４９位のＫをＱに置換したアミノ酸配列、配列番号３において７３位のＡをＴに置換したアミノ酸配列、配列番号３において１１９位のＮをＲに置換したアミノ酸配列、これらの改変の少なくとも２つを組み合わせたアミノ酸配列等が挙げられる。
　本発明においては、本発明の効果が得られる範囲で、ＩＬ－２変異体タンパク質は、配列番号３で表されるアミノ酸配列又は配列番号３で示されるアミノ酸配列から、３５位、３８位及び４５位のＡを全て保存しつつ、かつ４３位にＡを保存するかもしくは４２位にＡを有するように、１個又は数個のアミノ酸を付加、削除及び／又は置換してなるアミノ酸配列に、任意選択でリンカーを介し、別のアミノ酸配列が融合された融合タンパク質であってよい。尚、本発明において、融合タンパク質を構成するポリペプチドのうち、配列番号３で表されるアミノ酸配列又は配列番号３で示されるアミノ酸配列から、３５位、３８位及び４５位のＡを全て保存しつつ、かつ４３位にＡを保存するかもしくは４２位にＡを有するように、１個又は数個のアミノ酸を付加、削除及び／又は置換してなるアミノ酸配列からなる部分を、単にＩＬ－２変異体タンパク質部分と示すこともある。例えば、ＩＬ－２変異体タンパク質部分に、生体内で半減期の長い安定蛋白と融合することにより、本発明のＩＬ－２変異体タンパク質の生体内安定性を高めることができるため好ましい。例えば、本発明の好ましい実施形態において、ＩＬ－２変異体タンパク質は、配列番号３で表されるアミノ酸配列又は配列番号３で示されるアミノ酸配列から、３５位、３８位及び４５位のＡを全て保存しつつ、かつ４３位にＡを保存するかもしくは４２位にＡを有するように、１個又は数個のアミノ酸を付加、削除及び／又は置換してなるアミノ酸配列からなるタンパク質と、アルブミン及び／又は免疫グロブリンとの融合タンパク質であってもよい。免疫グロブリン部分としては、（ａ）抗体のＦｃ部分及び（ｂ）腫瘍細胞または腫瘍細胞環境中に提示される抗原分子に対する抗原に対する可変領域（Ｆａｂ部分）を包む抗体、でもよい。また、本発明において、「免疫グロブリン部分」との用語は、Ｆｃ部分及びＦａｂ部分を有するものだけでなく、抗原結合性を有する範囲で任意の断片（例えば、Ｆａｂ部分断片、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、重鎖抗体の可変領域フラグメント（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ　ｏｆ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＶＨＨ））等）であってもよい。かかる実施形態において、可変領域を有する抗体としては、抗ＥＧＦＲ抗体Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、抗Ｈｅｒ２抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、抗ＣＤ２０抗体Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ等が挙げられる。また、かかる融合タンパク質としては、アルブミン－ＩＬ－２、ＩＬ－２－アルブミン、アルブミン－ＩＬ－２－免疫グロブリン、免疫グロブリン－ＩＬ－２－アルブミン、アルブミン－免疫グロブリン－ＩＬ－２－アルブミン、アルブミン－ＩＬ－２－免疫グロブリン－アルブミン等が挙げられる。アルブミンとしては、アルブミン（ＨＳＡ）またはアルブミンの断片もしくは変異体等が挙げられる。このような実施形態にかかわる変異としては、野生型と同じ血漿半減期延長効果を有するヒト血清アルブミンの機能的変異体（切断型及び／又はアミノ酸置換された機能的変異体）を設計することが可能であることは当業者には公知である。例えば、ヒト血清アルブミンのドメインＩＩＩはＦＣＧＲＴ（ＦｃＲｎ）に高度に結合することが明らかにされており、このドメインのみを又は、長い半減期若しくは改変されている半減期を有する他のドメインとの組合せを含む変異体を作製することが可能である（例えば、Ａｌｂｕｆｕｓｅ　Ｆｌｅｘ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社）。ＩＬ－２変異体タンパク質部分に融合させるタンパク質としては、ヒト等の哺乳動物に由来するものが挙げられる。また、ＩＬ－２変異体タンパク質部分に融合させるタンパク質としては、ヒト化したもの等であってもよい。本発明のいくつかの実施形態として、成熟ヒトアルブミン－ＭＫ－６－ＩＬ－２アミノ酸配列の例（図５、配列番号７～１０）、成熟ＭＫ―６－ＩＬ－２ーマウスアルブミン－アミノ酸配列の例（図６、配列番号１２～１４）を、それぞれ図５、６に示す。また、これらの融合タンパク質を構築する成熟マウスアルブミンアミノ酸配列（配列番号１１）を図６に示す。これらの実施形態において、ＩＬ－２変異体タンパク質部分とその他のタンパク質とはリンカーを介して結合していてもよい。リンカーアミノ酸配列としては、いわゆるｒｉｇｉｄリンカー、ｆｌｅｘｉｂｌｅリンカーのいずれでもよく、例えば、非特許文献２に記載のもの等が挙げられ、具体的には、以下の表に記載のもの等が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 より具体的には、好ましい実施形態において、リンカーアミノ酸配列としては、例えば、図８に配列番号２３又は２７で示されるアミノ酸配列、配列番号２３又は２７で示されるアミノ酸配列から１個又は数個（例えば、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、１個等）のアミノ酸を付加、削除及び／又は置換してなるアミノ酸配列等が挙げられる。配列番号２３で表されるアミノ酸配列又はその改変配列においては、ＧＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳの繰り返し配列（たとえばＧＧＧＧＳ　ＧＧＧＧＳ　ＧＧＧＧＳ）は、柔軟性を持つ特性を有し、融合された蛋白質各々の特性を保持することができるため有用である。また、配列番号２７で表されるアミノ酸配列又はその改変配列においては、ＥＡＡＡＫまたはその繰り返し配列は、２つのタンパク質ドメイン間の距離を確実に保つ（隔てる）ことができるため、各タンパク質機能ドメイン固有の機能を保持したまま融合することができるため有用である。
　本発明において、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するＩＬ－２変異体タンパク質には、糖化、アセチル化等により修飾されたものも包含される。本発明においては、糖等により修飾されたものが好ましい。また、本発明の変異体には、後述する精製過程で精製しやすくするために、精製用タグ（例えば、ポリヒスチンタグやＳｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）等を遺伝子工学によって変異体のＮ末端またはＣ末端に加えることができる。また、本発明の変異体には、融合タンパク質を宿主細胞の分泌経路に導くために、融合タンパク質のＮ末端伸長として分泌シグナル配列（シグナルペプチド又はプレ配列としても知られている）を結合させてもよい。典型的には、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は正確なリーディングフレームにおいて融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の５'末端に結合される。シグナルペプチドは通常、タンパク質と関連しているペプチドでもよく、又は別の分泌されるタンパク質をコードする遺伝子由来あるいは人工的な分泌配列でもよい。
　典型的な実施形態において、本発明のＩＬ－２変異体タンパク質は、ＩＬ－２受容体βおよびγを発現する細胞を活性化させる能力を有し、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＩＬ－２変異体タンパク質と比較してＩＬ－２受容体αに対する結合性が抑制されているため好ましい。
　かかる変異株の作製方法としては、自体公知の方法（例えば、特許第６６４０８３４号に記載の方法）を適宜用いて、例えば、ＩＬ－２遺伝子に上記変異を加えた遺伝子カセットを構築し当該遺伝子カセットを適当なベクターに組み込み、得られたベクターを宿主に導入し、発現させること等により行うことができる。この場合、発現カセットは採用される宿主に適合する、適切なベクターへと接続する。（ベクターは、発現させる融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むことが可能でなければならない。）適切な宿主細胞は、真核細胞および原核細胞のうち容易に形質転換することができ、培養培地中で急速な増殖を呈しうる細胞を含む。具体的に、好ましい宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｌｕｓなどの原核細胞、ならびに動物細胞および酵母株、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの真核細胞を含む。哺乳動物細胞、特に、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、ＥｘｐｉＣＨＯ、ＨＥＫ、ＥxＪ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２－Ｏ、またはＣＨＯが一般に好ましい。他の適する宿主は、例えば、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞を含む。次いで、安定に形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞株を選択することができる。さらに、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける転写翻訳系も、発現系として採用することができる。また、本発明の変異体は、無細胞タンパク質合成系を使用して製造してもよい。また、得られた本発明の変異体は、自体公知の方法（濾過、遠心分離、クロマトグラフィー等）を適宜用いて、精製をしてもよい。
　医薬
　別の実施形態において、本発明は、上記ＩＬ－２変異体タンパク質を含む医薬を提供する。前述したＩＬ－２変異体タンパク質が奏する効果から、本発明は、ＩＬ－２受容体αに対する結合が減弱するＩＬ－２を改変した医薬、ＩＬ－２受容体βおよびγからなる受容体に対する結合が増加するＩＬ－２を改変した医薬を提供することができる。また、本発明の医薬は、例えば、癌を予防及び／又は治療するために用いることができる。
　かかる実施形態において、対象となる癌としては、例えば、腎臓癌、メラノーマ、非小細胞肺癌、大腸癌、肝細胞癌、頭頸部癌等の固形癌、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病等の血液系腫瘍等が挙げられる。
　本発明においては、本発明の有効成分であるＩＬ－２変異体タンパク質そのものを医薬として用いても、薬学的に許容される各種担体（例えば、等張化剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤等）と組み合わせた医薬組成物として用いてもよい。
　等張化剤としては、例えば、グルコース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール等の糖類、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等の無機塩類等が挙げられる。
　キレート剤としては、例えば、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、エデト酸四ナトリウム、エデト酸カルシウム等のエデト酸塩類、エチレンジアミン四酢酸塩、ニトリロ三酢酸又はその塩、ヘキサメタリン酸ソーダ、クエン酸等が挙げられる。
　安定化剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等が挙げられる。
　ｐＨ調節剤としては、例えば、塩酸、炭酸、酢酸、クエン酸等の酸が挙げられ、さらに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩又は炭酸水素塩、酢酸ナトリウム等のアルカリ金属酢酸塩、クエン酸ナトリウム等のアルカリ金属クエン酸塩、トロメタモール等の塩基等が挙げられる。
　防腐剤としては、例えば、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニウム塩、アルキルポリアミノエチルグリシン、クロロブタノール、ポリクォード、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン等が挙げられる。
　抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、濃縮混合トコフェロール等が挙げられる。
　溶解補助剤としては、例えば、安息香酸ナトリウム、グリセリン、Ｄ－ソルビトール、ブドウ糖、プロピレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、Ｄ－マンニトール等が挙げられる。
　粘稠化剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロースナトリウム、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
　また、上記医薬組成物は、ＩＬ－２変異体タンパク質以外に、当該医薬の対象疾患に対する予防又は治療作用を有するとされている化合物をさらに含んでいてもよい。当該医薬を抗腫瘍剤として用いる場合、抗腫瘍効果を有することが知られている化合物としては、例えば、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ等が挙げられる。本発明においては、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ等の免疫チェックポイント阻害剤等が好ましい。
　医薬組成物の実施形態において、組成物中のＩＬ－２変異体タンパク質の含有量は特に限定されず、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。
　製剤形態は、特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤；注射剤（静脈注射、筋肉注射、局所注射等）、含嗽剤、点滴剤、外用剤（軟膏、クリーム、貼付薬、吸入薬）、座剤等の非経口投与剤等の各種製剤形態を挙げることができる。上記製剤形態のうち、好ましいものとしては、例えば、経口投与剤（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等）、外用剤（吸入薬、軟膏、クリーム、貼付薬等）等が挙げられる。
　本発明において、ＩＬ－２変異体タンパク質の投与量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、成人に対する１日投与量が通常、約５０００ｍｇ以下、好ましくは約１０００ｍｇ以下になる量とすればよい。ＩＬ－２変異体タンパク質の投与量の下限も特に限定されず、成人に対する１日投与量が通常、０．１ｍｇ以上、好ましくは０．５ｍｇ以上の範囲で適宜設定できる。１日１回投与する場合は、１製剤中にこの量が含まれていればよく、１日３回投与する場合は、１製剤中にこの３分の１量が含まれていればよい。
　本発明の医薬は、哺乳動物等の患者に投与される。哺乳動物としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ等が挙げられ、好ましくはヒトである。従って、別の実施形態において、本発明は、それを必要とする対象に項１～５のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異体タンパク質の有効量を投与することを含む、癌を予防又は治療する方法を提供する。
　以下に実施例を用いて本発明の特定の実施形態を詳述するが、本発明は、かかる実施例に限定されない。
　実施例１　ＩＬ－２受容体α（ＩＬ－２Ｒα）結合性
　プラスミドの構築：
本発明の変異体タンパク質をコードするヒトＩＬ－２をコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ４－ＩＬ－２）は、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：　ＮＭ＿０００５８６．３に記載された配列情報をもとにＪｕｒｋａｔ細胞（＃ＴＫＧ　０２０９東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより購入）に由来するｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）　ＩＩ　１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ、タカラバイオ（株）＃６２１０Ａ）を鋳型としてＰＣＲ法により増幅し、哺乳類細胞用発現ベクター（ｐｃＤＮＡ（商標）４／ｍｙｃ－ＨｉｓＡ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株））に対して、所望の融合体をコードするＤＮＡをもたらすのに採用される基本ステップとして、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ反応（タカラバイオ（株）Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ＃６３９６４８）を用いて包含させた。精製のため、ＩＬ－２遺伝子のＣ末にプロテアーゼ切断配列（ＴＥＶ切断アミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＧ）とＳｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）Ｓｔｒｅｐ　ｔａｇ及びポリヒスチンタグを融合させた。ヒトＩＬ－２変異体ＭＫ－１４は、上記でプラスミドに包含されたヒトＩＬ－２遺伝子に対して、合成プライマーを用いたＰＣＲ法（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（商標）Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、タカラバイオ（株）＃　Ｒ０４５Ａ）により新たな変異を導入したものであり、構造物をコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ４－ＭＫ－１４）を構築した。本発明の変異体タンパク質をコードするＭＫ－６及びＭＫ－１５は、ＭＫ－１４を鋳型として、ＰＣＲ法により新たな変異を導入したものであり、構造物をコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ４－ＭＫ－６及びｐｃＤＮＡ４－ＭＫ－１５）を構築した。また、ＭＫ－４も、ＭＫ－１４を鋳型として、ＰＣＲ法により新たな変異を導入したものであり、構造物をコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ４－ＭＫ－４）を構築した。
　ＩＬ－２変異体タンパク質の製造：
以降の実施例で用いるＩＬ－２変異体タンパク質は、上記方法で得られたプラスミドを用い、以下のように製造した：
ポリヒスチジンタグ付きＩＬ－２変異体タンパク質は構造物をコードしているプラスミドをＮＥＢ社Ｓｔａｂｌｅ化学的コンピテント大腸菌細胞（ＮＥＢ（登録商標）＃Ｃ３０４０Ｈ）に形質転換し、コロニーはＡｍｐ選択寒天プレート上で増殖させ、形質転換体はＬＢ培養物に播種するのに使用した。一晩増殖後、ペレット状の大腸菌細胞は大規模プラスミド調製物（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｘｔｒａ　Ｍａｘｉ　ＥＦ（登録商標）マハライ・ナーゲル社＃７４０４２４）のために使用した。
ＩＬ－２変異体タンパク質構築物ごとの発現は、Ｅｘｐｉ２９３（登録商標）発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）、＃Ａ１４３５１０１）において増殖させた２５０ｍｌの懸濁培養物でのヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）、＃Ａ１４５２７）へのプラスミドの一過性トランスフェクションによって決定した。Ｅｘｐｉ２９３細胞は、３７℃、８％ＣＯ2および８０％湿度で使い捨て滅菌ディスポーザブル三角フラスコ平底１０００ｍＬベントフィルターＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株））において増殖させた。振盪速度はワケンビーテック（株）リモートシェイクにおいて１２５ｒｐｍであった。トランスフェクションごとに、１１．２５ｍｌのトランスフェクション培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ（１ｘ）＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）－Ｉ減少血清培地、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）（登録商標）＃５１９８５－０２６）中２５０μｇのＤＮＡ及び１１．８３ｍｌのトランスフェクション培中の６７５μｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２９３試薬（ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキット、Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）＃Ａ１４５２５）を、製造業者の使用説明書に従って使用した。トランスフェクション２２時間後、培養物に１．２５ｍｌのエンハンサー１及び１２．５ｍｌのエンハンサー２（ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２９３トランスフェクションキット、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）＃Ａ１４５２５）を与えた。トランスフェクションのおおよそ１２０時間後、細胞培養物は３０分間、４０００ｇの遠心分離により収穫し、浄化した培地は精製する前に０．２２μｍラピッドフィルターＭａｘセット（ボトルトップ＆ボトル）５００ｍｌ（Ｔｅｃｈｎｏ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ＡＧ社＃９９５００、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を通じた濾過を行った。フィルターを通して無菌濾過しタンパク質発現の精製のために使用した。以降の実施例において用いたＭＫ―６のアミノ酸配列は配列番号３に、ＭＫ―１５のアミノ酸配列を配列番号４に、ＭＫ―４のアミノ酸配列は配列番号５に示す。
精製
遠心分離及び０．２２μｍフィルターを通じた濾過を行った液は、ＡＫＴＡ　ｇｏクロマトグラフィーシステム（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して、ＮＰＩ－２０バッファー（５０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で平衡化した５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ　ＨＰカラム（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社＃１７５２４８０２、米国）に低流速で注ぎ、その後低親和性結合不純物はＮＰＩ－２０バッファーで溶出させた。結合している融合タンパク質は１００％ＮＰＩ－２５０バッファー（５０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で溶出し、主ピークはＵｎｉｃｏｒｎ（登録商標）ソフトウェアのピーク検出オプションを使用して収集した。１×Ｄ－ＰＢＳ（－）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））中、Ｐｒｅｐａｃｋｅｄ　Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ　ＰＤ－１０　Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社＃１７０８５１０１、米国）を更に使用して精製した。１ｍｌの各画分を収集し、スーパーセップＴＭエース１０～２０％１３ｗｅｌｌ（登録商標）ゲル（Ｆｕｊｉ－Ｆｉｌｍ　Ｗａｋｏ社＃１９１－１５０３１）を使用する還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。試料を１０×還元剤を補充した３×ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）試料バッファーと混合した。混合物は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに充填する前に９５℃で５分間加熱した。タンパク質はＱＣ　Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色（ＢＩＯ－ＲＡＤ社＃１６１０８０３）を製造業者の使用説明書に従って使用して可視化した。プロテアーゼによるタンパク質の切断は、ＴＥＶプロテアーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（株）＃Ｅ０２７）を用いた。タンパク質の定量は、プロテインアッセイＢＣＡキット（ナカライ（株）＃０６３８５－００）を用いて、製造業者の使用説明書に従って測定した。
　次に、細胞上のＩＬ－２受容体α結合性（ｏｎ－ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ）を測定した。具体的には、２９３Ｔ細胞はＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋより入手した（ＲＣＢ２２０２）。ヒトおよびマウスＩＬ－２受容体α発現２９３Ｔ（２９３Ｔａ）は、それぞれヒトおよびマウスＩＬ－２受容体α鎖遺伝子（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０００４１７．２およびＮＭ＿００８３６７．３）をカセットとして構築したレンチウイルスベクター（ｐＳＩＮ－ＥＦ－ＲｆＡ２－１－ｈｕｍａｎＩＬ－２ＲａおよびｐＳＩＮ－ＥＦ－ＲｆＡ２－１－ｍｏｕｓｅＩＬ－２Ｒａ）を用いて２９３ＴにＩＬ－２受容体αを安定発現する細胞として樹立した。２９３Ｔおよびヒトあるいはマウス２９３Ｔａを２４　ｗｅｌ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｔｅ（Ｔｅｃｈｎｏ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ＡＧ社＃９２４２４）に付着させたのち、ＮａｎｏＬｕｃ（商標）ルシフェラーゼ配列（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）を融合させた成熟安定型変異ヒトＭＫ－4－ＩＬ－２（ＭＫ―4、ｐｃＤＮＡ４－ＭＫ－4－ＮＬｕｃ、比較例相当）、成熟安定型変異ヒトＭＫ－６－ＩＬ－２（ＭＫ―６、ｐｃＤＮＡ４－ＭＫ－６－ＮＬｕｃ）、、成熟安定型変異ヒトＩＬ－２（ＭＫ－１４、ｐｃＤＮＡ４－ＭＫ－１４－ＮＬｕｃ、ＩＬ－２　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）あるいは成熟安定型変異ヒトＭＫ－１５－ＩＬ－２（ＭＫ―１５、ｐｃＤＮＡ４－ＭＫ－１５－ＮＬｕｃ）　の懸濁液（１０ｎＭ）を添加し、４℃１時間静置して反応させ、細胞を洗浄後に定量した。変異ＩＬ－２のαサブユニットに対する結合性は、２９３Ｔａおよび２９３Ｔに結合した量比（２９３Ｔａ／２９３Ｔ）の数値として示している。結果を図１０に示す。図１０はマウスおよびヒトＩＬ－２受容体α結合性を示す。図１０ａに示すように、ＭＫ―６およびＭＫ―１５はマウスのＩＬ－２受容体αに対する結合性を示さなかった。一方、ＭＫ－４はマウスＩＬ－２受容体α結合性が高いことが分かる。また、図１０ｂに示すように、ＭＫ－６およびＭＫ－１５はヒトのＩＬ－２受容体αに対しても結合性を示さなかった。
　次に、アッセイするＩＬ－２サンプルとしてＭＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－１４またはＭＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－６を用いた。ＭＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－１４またはＭＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－６は、配列番号２０又は１９に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いる以外、実施例１と同様にしてプラスミド構築及びＩＬ－２変異体タンパク質の製造を行うことにより得られた。ヒトおよびマウスＩＬ－２受容体α発現２９３Ｔ細胞に対する結合性を、同様に量比（２９３Ｔａ／２９３Ｔ）の数値として調べた。結果を図１１に示す。図１１に示すように、ＭＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－１４はヒトおよびマウスＩＬ－２受容体αに結合したが、ＭＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－６はＭＫ－６と同様にヒトおよびマウスＩＬ－２受容体αに結合しないことが分かる。
次に細胞上のヒトＣＳＰＧ４に対する結合（ｏｎ－ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ）を測定した。具体的には、ＣＴ２６細胞は東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより購入した。ヒトＣＳＰＧ４発現ＣＴ２６細胞（ＣＴ２６／ＣＳＰＧ４）は、ヒトＣＳＰＧ４鎖遺伝子（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００１８９７．５）をカセットとして構築したレンチウイルスベクター（ＬＴ３Ｇ－ｈＣＳＰＧ４－ｍｙｃ－Ｈｉｓ，　Ｊｏｈａｎｎｅｓｓ　Ｚｕｂｅｒ博士（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　（ＩＭＰ）より分与されたｐｍｉＲＥ１８＿ＬＴ３ＧＥＰＩＲ＿Ｒｅｎ７１３にヒトＣＳＰＧ４遺伝子ｃＤＮＡを挿入したプラスミド）を用いてドキシサイクリン存在下にヒトＣＳＰＧ４を誘導性発現するＣＴ２６細胞として樹立した。ＣＴ２６およびＣＴ２６／ＣＳＰＧ４を２４　ｗｅｌ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｔｅ（Ｔｅｃｈｎｏ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ＡＧ社＃９２４２４）に付着させたのち、ＮａｎｏＬｕｃ（商標）ルシフェラーゼ配列（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）を融合させた成熟安定型変異ヒトＭＫ－６－ＩＬ－２（ＭＫ－６、ｐｃＤＮＡ４－ＭＫ－６－ＮＬｕｃ）、成熟安定型変異ＭＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－６（ｐｃＤＮＡ４－ＭＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－６－ＮＬｕｃ）、成熟安定型変異ＭＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－６（ｐｃＤＮＡ４－ＭＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－６－ＮＬｕｃ）の懸濁液（１０ｎＭ）を添加し、４℃１時間静置して反応させ、細胞を洗浄後に定量した。　各変異ＩＬ－２のヒトＣＳＰＧ４に対する結合性は、ＮａｎｏＬｕｃ活性の数値として示している。結果を図１２に示す。図１２に示すように、アルブミンおよびＣＳＰＧ－ｓｃＦｖを融合させたＭＫ－６は、アルブミンおよびＣＳＰＧ－ｓｃＦｖを融合させたＭＫ－１４と同様にＣＳＰＧ４に結合した。この結果から、抗体様分子を結合させたＭＫ－６が癌細胞上に発現する標的抗原（ヒトＣＳＰＧ４）に結合することが分かる。
　実施例２　ＩＬ－２依存性細胞増殖
　実施例２－１ＩＬ－２依存性細胞増殖
　ＩＬ－２による培養細胞の増殖は、マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ－２細胞であるＣＴＬＬ－２細胞（ＲＩＫＥＮ細胞バンクＲＣＢ０６３７）を用いた。この細胞は、ＩＬ－２依存性に増殖するため、ＩＬ－２検出を目的とした迅速および感度の良いバイオアッセイに用いられる。ＣＴＬＬ－２細胞を，１ｎＭ　ヒトＩＬ－２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社＃５８９１０６）、５０μＭ　２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、１０％ウシ胎仔血清（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ），Ｈｙｃｌｏｎｅ社）添加ＰＲＭＩ－１６４０（ＦｕｊｉＦｉｌｍ－Ｗａｋｏ社＃１８９０２０２５）、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　３７℃　５％ＣＯ2で３７℃，１０％ＣＯ2および湿度９７％で成長させた。ＣＴＬＬ－２は成長にＩＬ－２を必要とする因子依存性の細胞系列である。従って，アッセイを行うためには，ＩＬ－２を除去するためにＣＴＬＬ－２細胞を，５％ＦＢＳ、５×１０-5Ｍ　２－メルカプトエタノール，５０μｇ／ｍｌペニシリン，５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン，および３－４．０ｍＭ　Ｌ－グルタミンを補った高グルコースＤＭＥＭで２回洗浄した。アッセイするＩＬ－２サンプルは９６　ｗｅｌ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｔｅ（Ｔｅｃｈｎｏ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ＡＧ社＃９２０９７）の中において１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩで滴定した。洗浄したＣＴＬＬ－２細胞を加え（最終アッセイ体積は１００μｌ，３０００細胞／穴），プレートを約７２時間，３７℃および１０％ＣＯ2でインキュベートした。ＩＬ－２によるヒトＴ培養細胞の増殖は、ＩＬ－２依存性Ｔ細胞株であるＴＰＡ－Ｍａｔ細胞（信州大学・竹下敏一博士より分与。Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３６：３１９－２５，１９８８）を用いて実施した。この細胞はヒトＩＬ－２を添加した培地（１ｎＭ　ヒトＩＬ－２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社＃５８９１０６）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ社）添加ＰＲＭＩ－１６４０（ＦｕｊｉＦｉｌｍ－Ｗａｋｏ社＃１８９０２０２５）、ペニシリン　１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００　ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）中で、３７℃　５％ＣＯ2で３７℃，１０％ＣＯ2および湿度９７％で成長させた。さらに、ＩＬ－２によるヒトＴ培養細胞の増殖試験のために、IL-2受容体βγ鎖のみを発現しα鎖を発現しない細胞も用いた。具体的には、ＩＬ－２依存性NK細胞株であるKHYG-1細胞(信州大学・竹下敏一博士より分与、ヒトIL-2受容体βγ鎖のみを発現しα鎖を発現しない)およびＴＰＡ－Ｍａｔ αKO細胞（信州大学・竹下敏一博士より分与。ヒトＩＬ－２受容体βγ鎖のみを発現し、α鎖を発現しない）を用いた。これらの細胞を、２度洗浄したのち、アッセイするＩＬ－２サンプルに添加した。アッセイするＩＬ－２サンプルとしてはＭＫ－４－ＩＬ－２（ＭＫ－４）、ＭＫ－６－ＩＬ－２（ＭＫ－６）、ＭＫ－１４－ＩＬ－２（ＭＫ－１４）、ＭＫ－１５－ＩＬ－２（ＭＫ－１５）、ＨＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－１４またはＨＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－６を用いた。ＨＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－１４またはＨＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－６は、配列番号１７又は１６で示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いる以外、実施例１と同様にしてプラスミド構築及びＩＬ－２変異体タンパク質の製造を行うことにより得られた。これらのＩＬ－２サンプルは、９６　ｗｅｌ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｔｅ（Ｔｅｃｈｎｏ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ＡＧ社＃）の中で１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０を用いて滴定し上昇濃度の各サンプルとして調整した。洗浄したＴＰＡ－Ｍａt、またはＴＰＡ－Ｍａｔ αKO細胞またはKHYG-1細胞を加え（最終アッセイ体積　は１００μｌ，３０００細胞／穴），プレートを約７２時間，３７℃および１０％ＣＯ2でインキュベートした。各穴の細胞は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社＃Ｇ７５７０）を用いて細胞数を定量的に測定し、各ＩＬ－２（変異体含む）それぞれのＥｍａｘを１００％とし、相対値で現した。ＩＬ－２、ＭＫ－６及びＭＫ－１４についての結果を図１３に示す。ＭＫ－６、ＭＫ－４、ＭＫ－１４、及びＭＫ－１５についての結果を図１４に示す。ＩＬ－２依存性増殖とは、生物活性に関する数値であり、細胞ベースの定量的ｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイにおける生物学的活性の測定値を指す。図１３に示すように、ＣＴＬＬ－２を用いた増殖試験において、ＭＫ－１４－ＩＬ－２およびＩＬ－２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社＃５８９１０６）の５０％効果濃度（ＥＣ５０）に比べてＭＫ－６－ＩＬ－２のＥＣ５０（５０％効果濃度）は、それぞれ低下した。同様にＴＰＡ－Ｍａｔを用いた解析においても、ＣＴＬＬ－２と同様の結果であった。以上から、ＭＫ－６はマウスおよびヒトＴ細胞株に対して、ＩＬ－２およびＭＫ－１４―ＩＬ－２と同等の最大増殖効果を発揮した。さらに、図１４に示すように、ＭＫ－１５はＭＫ－６と同様にＣＴＬＬ－２およびＴＰＡ－Ｍａｔに対する増殖活性を示した。さらに、ＭＫ－６およびＭＫ－１５はＴＰＡ－Ｍａｔ　αＫＯ細胞またはＫＨＹＧ－１細胞に対して増殖活性を発揮した。ＩＬ－２受容体βγ鎖のみを発現しα鎖を発現しないこれらの細胞に対してＭＫ－１４と同等の増殖活性を示したことから、ＭＫ－６及びＭＫ－１５はヒトＩＬ－２受容体βγ鎖発現細胞に対してＩＬ－２と同程度の増殖活性を発揮する能力を有することが分かる。
　実施例２－２
　ＩＬ－２サンプルとしてＭＫ－６－ＩＬ－２、ＨＳＡ－３ｘＧ４Ｓ－ＭＫ－６又はＨＳＡ－３ｘ（ＥＡＡＡＫ）－ＭＫ－６を用いる以外、実施例２－１と同様にして、ＣＴＬＬ－２を用いた増殖試験を行った。ＨＳＡ－３ｘＧ４Ｓ－ＭＫ－６又はＨＳＡ－３ｘ（ＥＡＡＡＫ）－ＭＫ－６は、ＭＫ－６－ＩＬ－２のリンカー配列をそれぞれ、３ｘＧ４Ｓ又は３ｘ（ＥＡＡＡＫ）に変えたものであり、アミノ酸配列を配列番号７又は９に示す。これらのＩＬ－２サンプルも配列番号７又は９に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いる以外、実施例１と同様にしてプラスミド構築及びＩＬ－２変異体タンパク質の製造を行うことにより得られた。
図１５に示すように、ＣＴＬＬ－２を用いた増殖試験において、ＭＫ－６－ＩＬ－２とＨＳＡ－３ｘＧ４Ｓ－ＭＫ－６およびＨＳＡ－３ｘ（ＥＡＡＡＫ）－ＭＫ－６は、すべて同等の増殖活性を示した。同様にＴＰＡ－Ｍａｔ、ＴＰＡ－Ｍａｔ　αＫＯ細胞またはＫＨＹＧ－１細胞を用いた解析においても、ＣＴＬＬ－２と同様の結果であった。以上から、アルブミンを融合させたＭＫ－６ーＩＬ－２は、ｆｌｅｘｉｂｌｅ　リンカーを用いてもｒｉｇｉｄリンカーを用いても、マウスおよびヒトＴ細胞株に対して、ＭＫ－６―ＩＬ－２と同等の増殖効果を発揮した。
　実施例２－３  
ＩＬ－２サンプルとしてＭＫ－６－ＩＬ－２、ＨＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－６およびＨＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－１４を用いる以外、実施例２－１と同様にして、ＩＬ－２依存性増殖試験を行った。結果を図１６に示す。図１６に示すように、ＣＴＬＬ－２およびＴＰＡ－Ｍａｔに対する増殖活性は、ＨＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－１４は高い増殖活性を示した。一方、ＨＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－６はＭＫ－６－ＩＬ－２と同等の増殖活性を示した。ＴＰＡ－Ｍａｔ　αＫＯ細胞またはＫＨＹＧ－１細胞に対してＨＳＡ－ＣＳＰＧ４－ｓｃＦｖ－ＭＫ－６はＨSA-CSPG4-scFv-MK-１４およびＭＫ－６－ＩＬ－２と同等の増殖活性を発揮した。IL-2受容体βγ鎖のみを発現しα鎖を発現しないこれらの細胞に対して３者が同等の増殖活性を示したことから、Ｇ４Ｓリンカーを介してＨＳＡおよびＣＳＰＧ４とＭＫ－６を連結しても、ヒトＩＬ－２受容体βγ鎖発現細胞に対して同程度の増殖活性を発揮する能力を有することが分かる。
　実施例３　ＩＬ－２依存性Ｔｒｅｇ細胞増殖
Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４+ＣＤ２５+）は、ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週令、日本エスエルシー（株））の脾臓からＣＤ４+ＣＤ２５+Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社＃１３０－０９１－０４１）を用いて製造業者の使用説明書に従って調製した。次にＴｒｅｇ細胞を１×Ｄ－ＰＢＳ（－）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で２回洗浄したのち１×Ｄ－ＰＢＳ（－）に再懸濁し、ＣＦＳＥ（５，６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉａｃｅｔａｔｅ　ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社＃４２３８０１）を用いて室温かつ暗所において１５分間染色した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ社）添加ＰＲＭＩ－１６４０（ＦｕｊｉＦｉｌｍ－Ｗａｋｏ社１８９０２０２５）／５０μＭ　２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））／ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ／ストレプトマイシン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ添加）を添加し反応を止め、再度１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ社）添加ＰＲＭＩ－１６４０液に懸濁した。あらかじめ、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（１μｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３ε　Ａｎｔｉｂｏｄｙ＃１００３０１）を添加した１×Ｄ－ＰＢＳ（－）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で４℃１６時間コーティングし、１×Ｄ－ＰＢＳ（－）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で３回洗浄した９６ｗｅｌ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｔｅ（Ｔｅｃｈｎｏ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ＡＧ社＃９２０９７）を用いて、１穴あたり１００，０００個のＴｒｅｇ細胞、抗ＣＤ２８抗体Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＣＤ２８　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社＃１０２１１２）、および昇濃度に滴定した、ＩＬ－２およびＭＫ－１４―ＩＬ－２を加え、３７℃　５％ＣＯ2湿度９７％で細胞を培養した。７２時間後に細胞を回収し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）にてＣＳＦＥ染色性を定量的に解析した。結果を図１７に示す。細胞増殖は、細胞分裂回数に依存して低下するＣＳＦＥ染色性によって示される。図１７に示すように、ＩＬ－２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社＃５８９１０６）およびＭＫ－１４－ＩＬ－２は１ｎＭの濃度において７０％超のＴｒｅｇに対して細胞分裂および増殖を誘導したが、ＭＫ－６によるＴｒｅｇの細胞分裂亢進作用は無添加（０ｐＭ）と何ら変化しなかったことから、Ｔｒｅｇに対する増殖活性が欠損していた。
　実施例４　ＩＬ－２　生体内投与による末梢免疫細胞に対する効果
　ＩＬ－２（ＭＫ―６－ＩＬ－２またはＭＫ―１４－ＩＬ－２）を投与したマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）における末梢免疫系細胞数に対する効果を測定した。具体的には、日本エスエルシー（株）から購入したＢＡＬＢ／ｃマウス（８週令、ｎ＝３）１個体あたり２．５μｇ，２５μｇ，２５０μｇ各量のＩＬ－２を１日１回連続４日間静脈内投与し、最終投与翌日にマウス脾臓から末梢血免疫系細胞を調製した。ＣＤ８+Ｔ細胞（ＣＤ３+ＣＤ４-ＣＤ８+：）、Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ３+ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦｏｘＰ３+）、ＮＫ（ＣＤ３-ＣＤ４９ｂ+ＮＫｐ４６+）を抗体で染色し、ＦＡＣＳ解析により細胞数を定量した。使用した抗体は、ＣＤ３ε：１４５－２Ｃ１１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株）、ＣＤ４：ＲＭ４－４，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株）、ＣＤ８ａ：５３－６．７，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株），ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα）：ＰＣ６１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株），ＮＫｐ４６：２９Ａ１．４，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株），ＦｏｘＰ３；ＦＪＫ－１６ｓ，ＤＢ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（株）である。結果を図１８に示す。図１８に示すように、ＭＫ－１４－ＩＬ－２およびＭＫ－６とも腫瘍内ＣＤ８+Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対する増加能はなかった。一方で、Ｔｒｅｇ細胞については、ＭＫ－１４－ＩＬ－２は２５μｇ投与により増加させたが、ＭＫ－６は２５０μｇ投与においても増加せしめなかった。さらに、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ　ｒａｔｉｏはＭＫ－１４－ＩＬ－２ではＰＢＳ投与群と比べて増加しなかったが、ＭＫ－６投与では２５０μｇ投与において、ＭＫ－１４－ＩＬ－２と比較して有意に増加させた。
　実施例５　ＩＬ－２　生体内投与による副作用
ＩＬ－２（ＭＫ―６－ＩＬ－２またはＭＫ―１４－ＩＬ－２）をマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、８週令、日本エスエルシー（株））に対し投与し生体内作用を検討した。具体的には、それぞれのＩＬ－２を、２．５μｇ，２５μｇ，２５０μｇの各量で、１日１回連続４日間静脈内投与した。５日目にマウスを安楽死させ、体重測定を行い、投与前と比較した体重増加比を計算した。また、肝臓および脾臓を摘出し、それぞれの重量を測定した。肺については、摘出後に重量測定を行い、次いでｍｉＶａｃ（Ｇｅｎｅｖａｃ、ＳＰ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて乾燥させ乾燥重量を測定し、後者を前者で除することでＷａｔｅｒ　Ｃｏｎｔｅｎｔ（含水量）を計算した。ＩＬ－２投与の副作用は、体重および各臓器の重量増加として示される。結果を図１９に示す。具体的には、ＭＫ－１４－ＩＬ－２は２５μｇ投与で体重が有意に増加したが、ＭＫ－６は２５０μｇ投与においても体重増加がなかった。脾臓および肝臓は、いずれも２５μｇのＭＫ－１４－ＩＬ－２によって臓器重量が有意に増加したが、ＭＫ－６には同様の作用は現れなかった。肺水腫の発生は、肺重量を乾燥重量で除した値（乾燥重量あたりの水分値）で示す。ＭＫ－１４－ＩＬ－２は２５０μｇ投与によって肺水腫が発生したが、ＭＫ－６投与では同容量の投与による肺水腫の発生はなかった。
　実施例６　ＣＴ２６大腸癌担癌モデルマウスにおけるＩＬ－２単剤治療による抗腫瘍効果
　ＣＴ２６大腸癌細胞を皮下移植した担癌マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に対するＩＬ－２（ＭＫ―１４－ＩＬ－２またはＭＫ―６－ＩＬ－２）の効果を測定した。具体的には、５ｘ１０5個のＣＴ２６細胞（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより購入）を１００μＬの１×Ｄ－ＰＢＳ（－）に懸濁し、細胞と同種であるマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の背部に皮下移植した。１×Ｄ－ＰＢＳ（－）、ＭＫ―１４－ＩＬ－２（５μｇ）またはＭＫ―６－ＩＬ－２（１００μｇ）を１日２回５日間連続で腹腔内投与し、経時的にノギスを用いて腫瘍径（短径ａおよび長径ｂｍｍ）を計測した。腫瘍体積（Ｖ）は、長径×長径×短径÷２（Ｖ＝ａｘｂ2／２）ｍｍ3という近似式を用いて計算した腫瘍系を計測した結果を図２０に示す。図２０に示すように、１×Ｄ－ＰＢＳ（－）およびＭＫ－１４－ＩＬ－２を投与した群は腫瘍が同様に増大したが、ＭＫ―６－ＩＬ－２投与群ではＭＫ－１４－ＩＬ－２群に比べて有意に腫瘍増殖が抑制された。
　実施例７　ＣＴ２６大腸癌担癌モデルマウスにおけるＩＬ－２単剤治療による腫瘍内Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析
ＣＴ２６大腸癌担癌モデルマウスにおけるＩＬ－２単剤治療による腫瘍内Ｔ細胞を調整し、ＦＡＣＳ解析を行った。具体的には、５ｘ１０5個のＣＴ２６細胞（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより購入）を１００μＬの１×Ｄ－ＰＢＳ（－）に懸濁し、２６Ｇ針および１ｍＬシリンジを用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週令、日本エスエルシー（株））の背部に皮下移植した。均一サイズ成長した腫瘍に対し、１×Ｄ－ＰＢＳ（－）またはＩＬ－２（ＭＫ―１４－ＩＬ－２またはＭＫ―６－ＩＬ－２）を１日２回５日間連続で腹腔内投与した後に、摘出した腫瘍から腫瘍内リンパ球（ＴＩＬ）を調整した。具体的には、摘出した腫瘍をハサミ等で小片化したのち１０ｍＬのＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎバッファー（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ社）添加ＰＲＭＩ－１６４０（ＦｕｊｉＦｉｌｍ－Ｗａｋｏ社１８９０２０２５）／ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ／ストレプトマイシン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ＃ＤＮ２５－１００ＭＧ，５０μｇ／ｍＬ添加）に浸し３７℃、３０分間　１２２ｒｐｍで振盪した（タイテック社ＢＲ－５３ＦＰ）。細胞浮遊液は７０μｍストレーナー（ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ）を通してシングル細胞化した後、ＴＩＬ（ＣＤ４５）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ，マウス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社＃１３０－１１０－６１８）を用いて、ＭＡＣＳ　Ｐｒｏ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）により、血液系細胞（ＣＤ４５＋）細胞をＴＩＬとして調整した。
調整したＴＩＬをＦＡＣＳ解析した結果を図２１に示す。Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦｏｘＰ３+）、ＣＤ８+Ｔ細胞、ＰＤ－１+ＣＤ８+Ｔ細胞、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＮＫ細胞（ＣＤ３-ＣＤ４９ｂ+ＮＫｐ４６+）をＦＡＣＳで解析し、それぞれの細胞数を定量した。ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比は、ＣＤ８+Ｔ細胞数をＴｒｅｇ細胞数で除した相対値で示す。使用した抗体は、ＣＤ３ε：１４５－２Ｃ１１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株）、ＣＤ４：ＲＭ４－４，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株）、ＣＤ８ａ：５３－６．７，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株），ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα）：ＰＣ６１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株），ＮＫｐ４６：２９Ａ１．４，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株），ＦｏｘＰ３；ＦＪＫ－１６ｓ，ＤＢ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（株）、ＰＤ－１：２９Ｆ．１Ａ１２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄである。図２１に示すように、ＭＫ―６－ＩＬ－２を投与したマウス由来のＴＩＬでは、ＭＫ―１４－ＩＬ－２を投与した群に比べてＣＤ４＋Ｔ細胞群におけるＴｒｅｇ（％）が有意に少なかった（図２１ｄ）。さらに、ＰＢＳ投与群に比べてＣＤ８／Ｔｒｅｇ比が有意に上昇した。一方、同腫瘍モデルでは、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、ＰＤ－１+ＣＤ８+Ｔ細胞およびＮＫ細胞に差異は認めなかった。
　実施例８　Ｂ１６Ｆ１０悪性黒色腫担癌モデルマウスにおけるＩＬ－２単剤治療による抗腫瘍効果
　Ｂ１６Ｆ１０悪性黒色腫を皮下移植した担癌マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に対するＩＬ－２（ＭＫ―６－ＩＬ－２またはＭＫ―１４－ＩＬ－２）の効果を測定した。具体的には、５ｘ１０5個のＢ１６－Ｆ１０細胞（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより購入）を１００μＬの１×Ｄ－ＰＢＳ（－）に懸濁し、２６Ｇの針および１ｍＬシリンジを用いて、Ｃ５７／ＢＬ６マウス（８週令、日本エスエルシー（株）））の背部に皮下移植した。均一サイズ成長した腫瘍に対し、１×Ｄ－ＰＢＳ（－）、ＭＫ－１４－ＩＬ－２（５μｇ）またはＭＫ－６－ＩＬ－２（１００μｇ）を１日２回５日間連続で腹腔内投与し、経時的にノギスを用いて腫瘍径（短径ａおよび長径ｂｍｍ）を計測した。腫瘍体積（Ｖ）は、長径×長径×短径÷２（Ｖ＝ａｘｂ2／２）ｍｍ3という近似式を用いて計算した。腫瘍系を計測した結果を図２２に示す。図２２に示すように、ＭＫ－６はＩＬ－２投与開始後第７日目において、１×Ｄ－ＰＢＳ（－）に比べて有意に腫瘍体積が小さかった。
　実施例９　Ｂ１６Ｆ１０悪性黒色腫担癌モデルマウスにおけるＩＬ－２単剤治療による腫瘍内リンパ球のＦＡＣＳ解析
　Ｂ１６Ｆ１０悪性黒色腫担癌モデルマウスにおけるＩＬ－２単剤治療による腫瘍内Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析を行った。具体的には、５ｘ１０5個のＢ１６Ｆ１０細胞（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより購入）を１００μＬの１×Ｄ－ＰＢＳ（－）に懸濁し、２６Ｇの針および１ｍＬシリンジを用いて、Ｃ５７／ＢＬ６マウス（８週令、日本エスエルシー（株）））の背部に皮下移植した。均一サイズ成長した腫瘍に対し、１×Ｄ－ＰＢＳ（－）、ＭＫ―１４－ＩＬ－２（５μｇ）またはＭＫ―６－ＩＬ－２（１００μｇ）を１日２回５日間連続で腹腔内投与した後に、摘出した腫瘍から腫瘍内リンパ球（ＴＩＬ）を調整した。具体的には、摘出した腫瘍をハサミ等で小片化したのち１０ｍＬのＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎバッファー（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ社）添加ＰＲＭＩ－１６４０（ＦｕｊｉＦｉｌｍ－Ｗａｋｏ社　＃１８９０２０２５）／ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ／ストレプトマイシン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ＃ＤＮ２５－１００ＭＧ，５０μｇ／ｍＬ添加）に浸し３７℃、３０分間１２２ｒｐｍで振盪した（タイテック社ＢＲ－５３ＦＰ）。細胞浮遊液は７０μｍストレーナー（ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ）を通してシングル細胞化した後、ＴＩＬ（ＣＤ４５）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ，マウス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社＃１３０－１１０－６１８）を用いて、ＭＡＣＳ　Ｐｒｏ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）により、血液系細胞（ＣＤ４５＋）細胞をＴＩＬとして調整した。
調整したＴＩＬをＦＡＣＳ解析した結果を摘出した腫瘍内リンパ球（ＴＩＬ）のＦＡＣＳ解析を行った。ＣＤ８+Ｔ細胞、ＣＤ４+Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦｏｘＰ３+）、ＩＦＮγ+ＣＤ８+Ｔ細胞（活性化ＣＤ８+Ｔ細胞）ＮＫ細胞（ＣＤ３-ＣＤ４９ｂ+ＮＫｐ４６+）、ＩＦＮγ+ＮＫ細胞（活性化ＮＫ細胞）、ＰＤ－１+ＣＤ８+Ｔ細胞およびＰＤ－１+Ｔｒｅｇ細胞（活性化Ｔｒｅｇ細胞）について、それぞれの細胞数を定量した。使用した抗体は、ＣＤ３ε：１４５－２Ｃ１１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株）、ＣＤ４：ＲＭ４－４，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株）、ＣＤ８ａ：５３－６．７，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株），ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα）：ＰＣ６１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株），ＮＫｐ４６：２９Ａ１．４，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株），ＦｏｘＰ３；ＦＪＫ－１６ｓ，ＤＢ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（株）、ＰＤ－１：２９Ｆ．１Ａ１２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＩＦＮγ：４ＳＢ３，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（（株））である。ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比は、ＣＤ８+Ｔ細胞数をＴｒｅｇ細胞数で除した相対値で示す。結果を図２３に示す。図２３に示すように、ＣＤ８+Ｔ細胞、ＣＤ４+Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦｏｘＰ３+）、ＩＦＮγ+ＣＤ８+Ｔ細胞（活性化ＣＤ８+Ｔ細胞）には有意差がなかったが、ＮＫ細胞（ＣＤ３-ＣＤ４９ｂ+ＮＫｐ４６+）およびＩＦＮγ+ＮＫ細胞は、それぞれＰＢＳ投与群よりＭＫ―６－ＩＬ－２投与群において有意に多かった。
　実施例１０　ＣＴ２６大腸癌担癌モデルマウスにおける成熟ＭＫ－６－ＩＬ－２ーマウスアルブミン（配列番号１２）単剤治療による抗腫瘍効果
ＣＴ２６大腸癌細胞を皮下移植した担癌マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に対するＭＳＡ－ＩＬ－２（ＭＳＡ－ＭＫ―１４－ＩＬ－２（配列番号１３）またはＭＳＡ－ＭＫ―６－ＩＬ－２（配列番号１２））の効果を測定した。具体的には、５ｘ１０5個のＣＴ２６細胞（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより購入）を１００μＬの１×Ｄ－ＰＢＳ（－）に懸濁し、細胞と同種であるマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の背部に皮下移植した。１×Ｄ－ＰＢＳ（－）、ＭＳＡ－ＭＫ―１４－ＩＬ－２（５μｇ）またはＭＳＡ－ＭＫ―６－ＩＬ－２（１００μｇ）を第５日および第１０日に計２回腹腔内投与し、経時的にノギスを用いて腫瘍径（短径ａおよび長径ｂｍｍ）を計測した。腫瘍体積（Ｖ）は、長径×長径×短径÷２（Ｖ＝ａｘｂ2／２）ｍｍ3という近似式を用いて計算した腫瘍系を計測した結果を図２４ａに示す。図２４ａに示すように、１×Ｄ－ＰＢＳ（－）を投与した腫瘍は経時的に増大したが、ＭＳＡ－ＭＫ－１４－ＩＬ－２を投与した群は腫瘍の縮小効果に有意差がなかった。一方、ＭＳＡ－ＭＫ―６－ＩＬ－２を投与した群は、ＰＢＳ及びＭＳＡ－ＭＫ－１４－ＩＬ－２群に比べて、いずれも有意に腫瘍増殖が抑制された。
　実施例１１　ＣＴ２６大腸癌担癌モデルマウスにおける成熟ＭＫ－６－ＩＬ－２ーマウスアルブミン（配列番号１２）単剤治療による腫瘍内Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析：
　ＣＴ２６大腸癌担癌モデルマウスにおけるＩＬ－２単剤治療による腫瘍内Ｔ細胞を調整し、ＦＡＣＳ解析を行った。具体的には、５ｘ１０5個のＣＴ２６細胞（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより購入）を１００μＬの１×Ｄ－ＰＢＳ（－）に懸濁し、２６Ｇ針および１ｍＬシリンジを用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週令、日本エスエルシー（株））の背部に皮下移植した。均一サイズ成長した腫瘍に対し、１×Ｄ－ＰＢＳ（－）またはアルブミンを融合したＩＬ－２（ＭＳＡ－ＭＫ―１４－ＩＬ－２またはＭＳＡ－ＭＫ―６－ＩＬ－２）を第５日および第１０日に計２回腹腔内投与し、第１２日に摘出した腫瘍から腫瘍内リンパ球（ＴＩＬ）を調整した。具体的には、摘出した腫瘍をハサミ等で小片化したのち１０ｍＬのＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎバッファー（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ社）添加ＰＲＭＩ－１６４０（ＦｕｊｉＦｉｌｍ－Ｗａｋｏ社１８９０２０２５）／ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ／ストレプトマイシン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ＃ＤＮ２５－１００ＭＧ，５０μｇ／ｍＬ添加）に浸し３７℃、３０分間　１２２ｒｐｍで振盪した（タイテック社ＢＲ－５３ＦＰ）。細胞浮遊液は７０μｍストレーナー（ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ）を通してシングル細胞化した後、ＴＩＬ（ＣＤ４５）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ，マウス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社＃１３０－１１０－６１８）を用いて、ＭＡＣＳ　Ｐｒｏ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）により、血液系細胞（ＣＤ４５＋）細胞をＴＩＬとして調整した。調整したＴＩＬをＦＡＣＳ解析した結果を図１６に示す。Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦｏｘＰ３+）、ＣＤ８+Ｔ細胞、ＰＤ－１+ＣＤ８+Ｔ細胞、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＮＫ細胞（ＣＤ３-ＣＤ４９ｂ+ＮＫｐ４６+）をＦＡＣＳで解析し、それぞれの細胞数を定量した。ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比は、ＣＤ８+Ｔ細胞数をＴｒｅｇ細胞数で除した相対値で示す。使用した抗体は、ＣＤ３ε：１４５－２Ｃ１１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株）、ＣＤ４：ＲＭ４－４，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株）、ＣＤ８ａ：５３－６．７，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株），ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα）：ＰＣ６１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株），ＮＫｐ４６：２９Ａ１．４，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（株），ＦｏｘＰ３；ＦＪＫ－１６ｓ，ＤＢ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（株）、ＰＤ－１：２９Ｆ．１Ａ１２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄである。結果を図２４ｂに示す。図２４ｂに示すように、成熟ＭＫ－６－ＩＬ－２ーマウスアルブミン（配列番号１２）を投与したマウス由来のＴＩＬでは、成熟ＭＫ－１４－ＩＬ－２ーマウスアルブミン（配列番号１３）を投与した群に比べてＣＤ３＋Ｔ細胞群の割合が有意に高く、ＣＤ４＋Ｔ細胞群におけるＴｒｅｇ（％）が有意に少なかった（図２４ｂ）。さらに、ＰＢＳ投与群および成熟ＭＫ－１４－ＩＬ－２ーマウスアルブミン投与群に比べてＣＤ８／Ｔｒｅｇ比が有意に上昇した。
　実施例１２　成熟ＭＫ－６－ＩＬ－２（配列番号３）および成熟ＭＫ－６－ＩＬ－２ーマウスアルブミン（配列番号１２）の腹腔内投与後のＩＬ－２血中濃度の推移（ａ）およびＣＴ２６大腸癌担癌モデルマウスにおける腫瘍内ＩＬ－２の定量
　（ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週令、日本エスエルシー（株）に対して等量モルにあたるＭＫ－６　（配列番号３）（２５　ｍｇ），　ＭＳＡ－ＭＫ－６　（配列番号１２）（６５　ｍｇ）を腹腔内投与した。各ＩＬ－２はＮａｎｏＬｕｃ（商標）ルシフェラーゼ配列（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）を融合させてある。、投与後の血中ＩＬ－２をＮａｎｏＬｕｃ（商標）活性により定量した。投与後１時間後を起点とした、ベータ相（β相）における半減期（Ｍｅａｎ　β　ｈａｌｆ－ｌｉｖｅｓ　（ｔ1/2）　）±　ＳＤ（標準偏差）を測定した。％残存率（％Ｒｅｍａｉｎｉｎｇ）とは、投与後１時間の各ＮａｎｏＬｕｃ活性測定値を各時点におけるＮａｎｏＬｕｃ活性測定値で除した相対値（％）で示す。　β相とは、後の血中濃度推移において，初期に急速に減衰する相（α相）に引き続きゆっくり減衰する相（β相）を指し，この相で半減期を算出するものである。結果を２４ａに示す。図２４ａが示すように薬物投与後の血ＭＳＡを融合した成熟ＭＫ－６－ＩＬ－２ーマウスアルブミンでは、ｔ1/2　が５．６時間であり、ｔ1/2が２．９時間である成熟ＭＫ－６－ＩＬ－２と比較して大幅に血中半減期が長くなっていた。（ｂ）ＣＴ２６大腸癌担癌モデルマウスにおける腫瘍内ＩＬ－２の定量：５ｘ１０5個のＣＴ２６細胞（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより購入）を１００μＬの１×Ｄ－ＰＢＳ（－）に懸濁し、２６Ｇ針および１ｍＬシリンジを用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週令、日本エスエルシー（株））の背部に皮下移植した。均一サイズ成長した腫瘍に対し成熟ＭＫ－６－ＩＬ－２（配列番号３）および成熟ＭＫ－６－ＩＬ－２ーマウスアルブミン（配列番号１２）を１回のみ腹腔内投与した。投与１時間後に、腫瘍を摘出し、１×Ｄ－ＰＢＳ（－）を添加した後にバイオマッシャー（商標、ニッピ（株））を用いて腫瘍を破砕した。ＮａｎｏＬｕｃ活性はプロメガ（株）のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍを用いて検体を調整し、ベルトールドジャパン（株）のＬｕｍａｔ3　ＬＢ９５０８を用いて定量した。結果を図２５ｂに示す。図２５ｂが示すように、成熟ＭＳＡ－ＭＫ－６－ＩＬ－２が腫瘍に有意に高い濃度で蓄積していることが示された。

Claims (7)

  1. 　配列番号３で表されるアミノ酸配列又は配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ３５位、３８位、４２位又は４３位、及び４５位のアミノ酸が全てＡであるアミノ酸配列を有するＩＬ－２変異体タンパク質。
  2. 　アルブミン及び／又は免疫グロブリンとの融合タンパク質である請求項１に記載のＩＬ－２変異体タンパク質。
  3. 　免疫グロブリン部分が抗体のＦｃ部分である、請求項２に記載のＩＬ－２変異体タンパク質。
  4. 　アルブミン－ＩＬ－２、ＩＬ－２－アルブミン、アルブミン－ＩＬ－２－免疫グロブリン、免疫グロブリン－ＩＬ－２－アルブミン、アルブミン－免疫グロブリン－ＩＬ－２－アルブミン又はアルブミン－ＩＬ－２－免疫グロブリン－アルブミンである、請求項２に記載のＩＬ－２変異体タンパク質。
  5. 　ＩＬ－２受容体βおよびγを発現する細胞を活性化させる能力を有し、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＩＬ－２変異体タンパク質と比較してＩＬ－２受容体αに対する結合性が抑制されている、請求項１に記載のＩＬ－２変異体タンパク質。
  6. 　請求項１に記載のＩＬ－２変異体タンパク質を含む医薬。
  7. 　癌を予防又は治療するための請求項６に記載の医薬。
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