WO2022059980A1 - 세포 배양용 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 배양 조성물 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a microcarrier for cell culture, a method for preparing the same, and a cell culture composition using the same.
  • Adherent cells are cultured using microcarriers in a 3D bioreactor.
  • Cells, a culture medium, and a microcarrier are put in the bioreactor, and the culture medium is stirred to contact the cells and the microcarrier, thereby attaching the cells to the surface of the microcarrier and culturing. Since the microcarrier used at this time provides a high surface area/volume to which cells can attach and proliferate, it is suitable for mass culture of cells.
  • microcarriers have a density of about 1.1 to 1.3 g/cm 3 , and a cell density of about 1.2 g/cm 3 .
  • centrifugation is difficult when separating and recovering cells after culture, and a filtering method based on microcarriers and cell size must be used.
  • the filter is clogged or the process takes a long time, physical damage and contamination of cells may easily occur, and loss of cells may occur.
  • a microcarrier having a density lower than 1.0 g/cm 3 or higher than 1.3 g/cm 3 was manufactured using the properties of the material, but in this case, the range of densities that can be implemented is limited, and damage And there is a disadvantage in that it is difficult to sufficiently secure the yield of microcarriers having a perfect spherical shape without destruction.
  • the present invention relates to a microcarrier for cell culture that can be more easily separated during separation and recovery of microcarriers and cells after cell culture while sufficiently securing a yield of microcarriers having a perfect spherical shape without damage or destruction.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the microcarrier for cell culture.
  • the present invention relates to a cell culture composition using the microcarrier for cell culture.
  • a microcarrier for cell culture comprising polystyrene-based particles including at least one of a hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, or pores derived therefrom.
  • a method for preparing a microcarrier for cell culture which includes performing a suspension polymerization reaction of a monomer composition containing a styrene monomer in the presence of a hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms.
  • the present specification also provides a cell culture composition comprising a cell and a microcarrier for cell culture.
  • microcarrier for cell culture a method for preparing the same, and a cell culture composition using the same according to specific embodiments of the present invention will be described in more detail.
  • first element may be referred to as a second element, and similarly, a second element may be referred to as a first element.
  • a microcarrier for cell culture comprising polystyrene-based particles including at least one of hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, or pores derived therefrom may be provided.
  • the present inventors have found that, in the case of the microcarrier for cell culture of the embodiment, at least one of hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, or pores derived therefrom, is included in the polystyrene-based particles to lower the density of the microcarrier for cell culture.
  • hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, or pores derived therefrom.
  • the microcarrier for cell culture may include polystyrene-based particles including at least one of hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, or pores derived therefrom. That is, the polystyrene-based particles may include one type of hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, one type of pores derived from hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, or a mixture of these two types.
  • the polystyrene-based particles include one type of pores derived from hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, or include both pores derived from hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms and hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, the polystyrene-based particles are porous polystyrene-based particles may correspond to particles.
  • the polystyrene-based particles are synthesized by suspension polymerization in the presence of hydrocarbon oil as in the production method of another embodiment to be described later so that the hydrocarbon oil continues to remain trapped inside the polystyrene particles, or by high-speed suspension polymerization stirring conditions. Some or all of the trapped hydrocarbon oil may escape and voids may form inside the polystyrene particles.
  • the void means an empty space inside the polystyrene-based particle, and may be used in the same meaning as a pore, a hollow, a hole, a void, and the like.
  • the pores may be derived from hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms. Specifically, the pores correspond to spaces formed while the hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms is phase-separated from polystyrene during suspension polymerization.
  • the polystyrene-based particles contain only one hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, it means that the hydrocarbon oil is completely phase-separated in the polymerization process, but is not lost to the outside of the particles during the polymerization and washing process, and the polystyrene-based particles have 12 or more carbon atoms.
  • the inclusion of only one type of pores derived from hydrocarbon oil means that the hydrocarbon oil is completely phase-separated in the polymerization process and is lost to the outside of the particles during the polymerization and washing process.
  • the fact that the polystyrene-based particles include all of the pores derived from the hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms and the hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms means that the hydrocarbon oil is partially phase-separated and lost in the polymerization process and some remain.
  • the present inventors confirmed that hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms was detected during component analysis of the microcarrier for cell culture obtained in the one embodiment.
  • the microcarrier for cell culture obtained in the embodiment is freeze-pulverized and dissolved in chloroform to extract unreacted residual compounds, and detailed components are purified through GC/FID (gas chromatography-flame ionization detector). , and as a result of quantitative analysis, oil or a component derived therefrom was detected. Through this, it was confirmed that hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms or a component derived therefrom remained in the pores.
  • the diameter of the pores may be 0.1 ⁇ m to 5 ⁇ m. More specifically, the diameter of the pores may be 0.1 ⁇ m or more, or 1 ⁇ m or more, 5 ⁇ m or less, or 3 ⁇ m or less, 0.1 ⁇ m to 10 ⁇ m, or 0.1 ⁇ m to 5 ⁇ m, or 1 ⁇ m to 5 ⁇ m , or 1 ⁇ m to 4 ⁇ m.
  • the pores are derived from hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, the pores having a diameter of 0.1 ⁇ m to 5 ⁇ m can be implemented as small pores, and thus the density of microcarriers can be easily controlled.
  • expanded styrene has been prepared through an additional foaming process after injecting a foaming agent with a low boiling point during the polystyrene polymerization process. There are difficult limits.
  • the number of carbon atoms of the hydrocarbon oil may be 12 or more, or 12 or more and 50 or less, or 12 or more and 16 or less.
  • the number of carbon atoms of the hydrocarbon oil is excessively reduced to less than 12, there is a limitation in that a large number of particles having a concave shape without uniform particle surfaces are produced due to a decrease in the phase separation rate of the hydrocarbon oil and polystyrene during suspension polymerization.
  • the hydrocarbon oil may include a linear or branched saturated hydrocarbon compound having 12 or more and 50 or less carbon atoms.
  • the linear or branched saturated hydrocarbon compound having 12 or more and 50 or less carbon atoms may be used alone or in combination, and examples of the linear or branched saturated hydrocarbon compound having 12 or more and 50 or less carbon atoms include normal alkanes having 12 or more and 16 or less carbon atoms, an isoalkane having 12 or more and 16 or less carbon atoms, or a mixture thereof.
  • dodecane having 12 carbon atoms dodecane having 12 carbon atoms, hexadecane having 16 carbon atoms, or Isopar M (a mixture of isoalkane having 12 to 14 carbon atoms and isoalkane having 13 to 16 carbon atoms) can be used. there is.
  • the hydrocarbon oil may be included in an amount of 30 wt% or less, or 10 wt% or more and 30 wt% or less based on the total weight (100% weight) of the dispersed phase composition including the styrene monomer.
  • the lower limit of the content of the hydrocarbon oil is 10 wt% or more, or 11 wt% or more, or 12 wt% or more, or 13 wt% or more, or 14 wt% or more
  • the upper limit thereof is, for example, 30 wt% or less, or 25 wt% or less, or 20 wt% or less.
  • the density of the hydrocarbon oil may be 0.75 g/cm 3 or more and 0.80 g/cm 3 or less, or 0.75 g/cm 3 or more and 0.791 g/cm 3 or less. Since the density of the hydrocarbon oil is very low in the above-described range, the density of the polystyrene-based particles can be significantly reduced through this.
  • the particle surface is not uniform and a large number of concave-shaped particles are produced due to a decrease in the phase separation rate of the hydrocarbon oil and polystyrene during suspension polymerization.
  • the apparent density of the polystyrene-based particles may be 0.95 g/cm 3 or more and less than 1.00 g/cm 3 .
  • the apparent density of the polystyrene-based particles may be 0.95 g/cm 3 or more and less than 1.00 g/cm 3 .
  • the density of the microcarrier exceeds 1 g/cm 3 , the difference in density between the cells and the microcarrier is small, so it may be difficult to centrifuge during cell separation and recovery after culture.
  • the carrier floats only on the surface of the culture medium, so it may be difficult to attach cells.
  • Examples of the cells are not particularly limited to adherent animal cells, but for example, fibroblasts, epithelial cells, osteoblasts, chondrocytes, hepatocytes, and human-derived cord blood cells. , human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, CHO (Chinese hamster ovary) cells, kidney cells (HEK293, BHK21, MDCK, vero cells, etc.), or a mixture of two or more thereof.
  • adherent animal cells but for example, fibroblasts, epithelial cells, osteoblasts, chondrocytes, hepatocytes, and human-derived cord blood cells.
  • human bone marrow-derived mesenchymal stem cells CHO (Chinese hamster ovary) cells
  • kidney cells HEK293, BHK21, MDCK, vero cells, etc.
  • the density of the cells may be 1.02 g/cm 3 or more and less than 1.1 g/cm 3 .
  • the difference in density between the cell culture microcarrier and the cells may be 0.02 g/cm 3 or more and 0.20 g/cm 3 or less.
  • the density difference between the cell culture microcarrier and the cell satisfies 0.02 g/cm 3 or more and 0.20 g/cm 3 or less, the microcarrier and the cells are separated and recovered after cell culture through the difference in sedimentation rate due to gravity. and the microcarrier can be easily separated.
  • the polystyrene-based particles may include a hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, or a polystyrene-based polymer in which at least one of pores derived therefrom are dispersed.
  • the polystyrene-based particles may include at least one of a polystyrene-based polymer matrix, a hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms dispersed in the polystyrene-based polymer matrix, or pores derived therefrom.
  • the polystyrene-based polymer comprises: 1 part by weight of a styrene monomer; and more than 0.033 parts by weight and less than 3 parts by weight of the ethylenically unsaturated crosslinking agent, or 0.1 or more and 1 or less, or 0.33 or more and 1 or less; may include a reaction product.
  • the ethylenically unsaturated crosslinking agent is excessively reduced to less than 0.033 parts by weight based on 1 part by weight of the styrene monomer, as the crosslinking density of the polystyrene-based polymer decreases, it is difficult to stably maintain the spherical shape of the particles, and the overall density of the polystyrene-based particles There is a limit to which it is difficult to lower to the target level.
  • Examples of the ethylenically unsaturated crosslinking agent include divinylbenzene.
  • the ratio of the surface area of the polystyrene-based particles in contact with the micropores present on the surface of the polystyrene-based particles may be less than 0.01%.
  • the total surface area of the polystyrene-based particles means the sum of the surface areas exposed to the air at the outermost surface of the polystyrene-based particles, and the surface area of the polystyrene-based particles in contact with micropores present on the surface of the polystyrene-based particles is the polystyrene-based particles It means the total surface area of micropores existing on the surface in contact with the outermost surface of the polystyrene-based particles.
  • the micropore is a pore having a maximum diameter of a micrometer size, for example, means a pore having a maximum diameter of 1 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less.
  • the ratio of the surface area of the polystyrene-based particles in contact with the micropores present on the surface of the polystyrene-based particles may be obtained through Equation 3 below.
  • the ratio (%) of the surface area of the polystyrene-based particles in contact with the micropores on the surface of the polystyrene-based particles [(Contact with the micropores on the surface of the polystyrene-based particles) surface area of the polystyrene-based particles) / (total surface area of the polystyrene-based particles)] x 100
  • the ratio of the surface area of the polystyrene-based particles in contact with the micropores present on the surface of the polystyrene-based particles is less than 0.01%, based on the total surface area of the polystyrene-based particles, the micropores present on the surface of the polystyrene-based particles It means that there are no or very few size pores. That is, micropores may not exist on the surface of the polystyrene-based particle.
  • expanded styrene has been produced by injecting a blowing agent to lower the density of polystyrene particles, but in this case, as the distribution of the diameter range and density range of polystyrene particles is too wide, the yield within the applicable range as a microcarrier for cell culture is secured. I had a hard time doing it.
  • the polystyrene-based particles based on the total surface area of the polystyrene-based particles, since the ratio of the surface area of the polystyrene-based particles in contact with the micropores present on the surface of the polystyrene-based particles is less than 0.01%, conventional expanded styrene and Otherwise, since the foaming process by the foaming agent does not proceed at all, there is an advantage in that the distribution of the diameter range and the density range of the polystyrene particles can be more precisely controlled.
  • the polystyrene-based particles may have an average diameter of 50 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, or 60 ⁇ m or more and 390 ⁇ m or less.
  • the average diameter of the polystyrene-based particles satisfies the above-described range, cell adhesion and culture performance are excellent.
  • the average diameter of the polystyrene-based particles is less than 50 ⁇ m, there is a concern that the cell cultureable surface area is small and the culture efficiency is lowered. Inner cell density is lowered, and there may be a problem in that cell culture efficiency is lowered.
  • the diameter of the polystyrene-based particle means the distance between two points where a straight line passing through the center of gravity of the polystyrene-based particle meets the outermost surface of the polystyrene-based particle, and the average diameter of the polystyrene-based particle is the cell culture through an optical microscope. It can be obtained by checking the diameter of all polystyrene-based particles included in the microcarrier. In addition, the average particle diameter of the polystyrene-based particles can be confirmed through the diameter of all polystyrene-based particles obtained in the manufacturing process of the polystyrene-based particles or their average diameter.
  • the polystyrene-based particles may be a group of individual particles having an average diameter of 50 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, or 60 ⁇ m or more and 390 ⁇ m or less. It may have a diameter of 400 ⁇ m or more, or 60 ⁇ m or more and 390 ⁇ m or less. More specifically, 95%, or 99% of the individual particles included in the group may have a diameter of 50 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, or 60 ⁇ m or more and 390 ⁇ m or less.
  • a primer polymer layer, a cell adhesion inducing layer, or a combination layer thereof may be further included on the surface of the polystyrene-based particle. That is, on the surface of the polystyrene-based particles, one type of primer polymer layer, one type of cell adhesion inducing layer, or a mixed layer of one type of primer polymer layer and one type of cell adhesion inducing layer may be further included.
  • the stacking order is not particularly limited.
  • a structure in which a cell adhesion inducing layer is laminated on a primer polymer layer, or a structure in which a primer polymer layer is laminated on a cell adhesion inducing layer are all applicable.
  • the primer polymer layer serves as an adhesive layer capable of introducing a functional polymer to the surface of polystyrene-based particles without a functional group, thereby effectively introducing a polymer layer for cell attachment to the microcarrier surface and stably maintained during culture.
  • L-dihydroxyphenylalanine L-DOPA
  • dopamine dopamine
  • polydopamine norepinephrine as a catechol derivative capable of inducing water-based adhesion
  • epinephrine norepinephrine
  • epigallocatechin and derivatives thereof may include any one or more selected from the group consisting of.
  • the cell adhesion inducing layer is composed of cell adhesion substances, which serve to provide a place where transmembrane proteins of cells can bind, so that adherent cells can stably attach, spread and allow it to be cultivated.
  • polymer forming the cell adhesion inducing layer examples are not particularly limited, but gelatin, collagen, fibronectin, chitosan, polydopamine, poly L-lysine, vitronectin, peptides including RGD, including RGD It may include any one or more selected from the group consisting of acrylic polymer, lignin, cationic dextran, and derivatives thereof.
  • the microcarrier includes a primer polymer layer formed on the surface of the polystyrene-based particle, and is dispersed in water by modifying the surface of the microcarrier to be hydrophilic, and a cell adhesion inducing layer is introduced on the surface of the primer polymer layer.
  • the floating degree of microcarriers in the culture medium can be controlled, and it can have the effect of stably attaching and culturing cells.
  • the ratio of the radius of the polystyrene-based particles to the thickness of the primer polymer layer may be 1:0.00001 to 1:0.01, or 1:0.0001 to 1:0.001.
  • the ratio of the radius of the polystyrene-based particles to the thickness of the surface coating layer is less than 1:0.00001, the effect of modifying the surface of the microcarrier to be hydrophilic is insignificant because the primer polymer layer is too thin compared to the polystyrene-based particles, and when it exceeds 1:0.01, The polymer layer of the primer becomes thicker compared to the polystyrene-based particles, and there is a fear that the adhesion between the cells and the microcarriers is reduced during cell culture.
  • the microcarrier for cell culture has a perfect spherical particle ratio of more than 90% and 100% or less, or 92% or more and 100% or less, or 95% or more and 100% or less, or 96% without damage and destruction according to Equation 1 below. It may be greater than or equal to 99%.
  • Percentage of perfectly spherical particles without damage and breakage (number of polystyrenic particles having perfect spherical shape without damage and breakage / number of total polystyrenic particles) x 100.
  • the ratio of perfect spherical particles without damage and destruction according to Equation 1 is measured through SEM by measuring the number of particles having a perfect spherical shape without damage and destruction among the total particles for the microcarrier for cell culture of the one embodiment, and total particles Contrast It can be obtained by calculating the percentage ratio of the number of perfect spherical particles without damage or destruction.
  • the microcarrier for cell culture may contain a plurality of polystyrene-based particles, and whether or not the plurality of polystyrene-based particles have a perfect spherical shape without damage or destruction can be visually determined through SEM.
  • the microcarrier for cell culture has a porosity of 0% or more and less than 8%, or 1% or more and less than 8%, or 2% or more and less than 8%, or 3% or more and less than 8%, or 3.9 according to the following Equation 2 % or more and 7.5% or less, or 6.5% or more and 7.5% or less.
  • Porosity (%) [1- (apparent density of polystyrene-based particles / true density of polystyrene-based particles)] x 100.
  • the apparent density is a density obtained using the actual particle volume including the particles and the voids between the particles, and the true density is the density obtained using the volume of only the particle materials excluding the voids.
  • the apparent density of the polystyrene-based particles is measured by adding them to an aqueous ethanol solution having a density of 0.95 g/cm 3 and water having a density of 1 g/cm 3 , respectively, and confirming whether the particles float or settle. and true density can be measured using He pycnometry.
  • the porosity of 0% according to Equation 2 means that the hydrocarbon oil is not phase-separated in the polymerization process and is lost during polymerization, so that the polystyrene-based particles do not contain one hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms. And, that the porosity according to Equation 2 is greater than 0% and less than 8% means that the hydrocarbon oil is phase-separated in the polymerization process and then disappears or partially remains in the polymerization and washing process, and the polystyrene-based particles have 12 or more carbon atoms. And it means a state including all of the pores derived from hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms.
  • a method for preparing a microcarrier for cell culture comprising performing a suspension polymerization reaction of a monomer composition containing a styrene monomer in the presence of a hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms.
  • the contents of the hydrocarbon oil and the styrene monomer include all the contents described above in the embodiment.
  • the monomer composition may be a mixture of 1 part by weight of a styrene monomer and more than 0.033 parts by weight of an ethylenically unsaturated crosslinking agent and less than 3 parts by weight.
  • the amount is excessively reduced to less than 0.033 parts by weight of the ethylenically unsaturated crosslinking agent based on 1 part by weight of the styrene monomer, as the crosslinking density of the polystyrene-based polymer decreases, it is difficult to stably prepare the pores generated by the hydrocarbon oil.
  • the content of the hydrocarbon oil may be 10 wt% or more and 30 wt% or less, or 14 wt% or more and 20 wt% or less.
  • the content of the hydrocarbon oil is excessively reduced, it is difficult to sufficiently lower the density of the polystyrene-based particles because the amount of the hydrocarbon oil phase-separated during polymerization is small.
  • the shape of the polystyrene-based particles is difficult to have a spherical shape, so that the uniformity of the produced particles is reduced.
  • the suspension polymerization reaction of the monomer composition may include: mixing the monomer composition in an aqueous dispersion and applying shear to homogenize the monomer composition in the aqueous dispersion in the form of droplets; and suspension polymerization of the homogenized monomer composition at a stirring speed of 300 rpm or more and 1000 rpm or less.
  • examples of the suspension polymerization conditions are not particularly limited, but for example, 50 ° C. or more and 100 ° C. It can proceed for 3 hours or more and 18 hours or less at the temperature.
  • the method for preparing a microcarrier for cell culture may further include washing and drying the suspension polymerization reaction product after the step of performing the suspension polymerization reaction.
  • washing the suspension polymerization reaction product may include filtering the suspension polymerization reaction product through a sieve of 50 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, followed by stirring in 100% ethanol 5-7 times at room temperature.
  • Drying the suspension polymerization reaction product includes placing in a vacuum oven and vacuum drying at room temperature.
  • the present invention is not limited thereto, and a drying method known to be commonly used may be used without any other limitation.
  • a primer polymer layer, a cell adhesion inducing layer, or a combination layer thereof is applied to the surface of the suspension polymerization reaction result. It may further include the step of applying.
  • the contents of the primer polymer layer and the cell adhesion inducing layer include all the contents described above in the embodiment.
  • a cell culture composition comprising a cell and the microcarrier for cell culture of the embodiment.
  • the content of the microcarrier for cell culture includes all of the content described above in the embodiment.
  • Examples of the cells are not particularly limited to adherent animal cells, but for example, fibroblasts, epithelial cells, osteoblasts, chondrocytes, hepatocytes, and human-derived cord blood cells. , human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, CHO (Chinese hamster ovary) cells, kidney cells (HEK293, BHK21, MDCK, vero cells, etc.), or a mixture of two or more thereof.
  • adherent animal cells but for example, fibroblasts, epithelial cells, osteoblasts, chondrocytes, hepatocytes, and human-derived cord blood cells.
  • human bone marrow-derived mesenchymal stem cells CHO (Chinese hamster ovary) cells
  • kidney cells HEK293, BHK21, MDCK, vero cells, etc.
  • the density of the cells may be 1.02 g/cm 3 or more and less than 1.1 g/cm 3 .
  • the difference in density between the cell culture microcarrier and the cells may be 0.02 g/cm 3 or more and 0.20 g/cm 3 or less.
  • the density difference between the cell culture microcarrier and the cell satisfies 0.02 g/cm 3 or more and 0.20 g/cm 3 or less, the microcarrier and the cells are separated and recovered after cell culture through the difference in sedimentation rate due to gravity. and the microcarrier can be easily separated.
  • the cell culture composition may further include a medium solution.
  • the medium solution may contain various additives to sufficiently satisfy environmental conditions such as nutrients and pH, temperature, and osmotic pressure close to the conditions of the living body based on body fluids such as plasma or lymph, which are widely used in cell culture related art.
  • a variety of known substances can be used without limitation.
  • the microcarrier for cell culture of one embodiment has a smaller density than the medium solution, and is injected into the medium solution to float in the medium solution under stirring conditions. Thereafter, as the number of cells attached to the surface of the low-density microcarriers increases, the density of the microcarriers to which the cells are attached (hereinafter, referred to as 'microcarrier-cell combination') gradually increases and gradually sinks in the medium solution. do.
  • cultured cells can be easily obtained by separating the microcarrier to which the cells are attached (microcarrier-cell complex) by centrifugation after addition of cell desorption enzyme, and then separating the cells from the microcarrier-cell complex.
  • a microcarrier for cell culture that can be more easily separated during separation and recovery of microcarriers and cells after cell culture, a method for preparing the same, and a method for producing the same Cell culture methods using can be provided.
  • Example 1 shows an SEM image of the microcarrier for cell culture obtained in Example 1.
  • Figure 4 shows the particle cross-sectional shape SEM image of the microcarrier for cell culture obtained in Example 2.
  • the monomer composition was added to the aqueous dispersion, and a shearing force was applied to the aqueous dispersion and the monomer composition at a speed of 800 rpm to disperse the monomer composition in the form of fine droplets in the aqueous dispersion to homogenize.
  • the homogenized mixture was reacted under nitrogen purge at 90° C. for 6 hours while stirring at the stirring speed shown in Table 1 to prepare polystyrene particles, and the particles washed in ethanol were dried at room temperature and recovered.
  • the recovered particles were immersed in tris buffer (pH 8.0) in which dopamine hydrochloride was dissolved at 1 mg/mL and coated for 2 hours at room temperature under stirring. After washing the excess coating material with ethanol, the particles were filtered on a 70 ⁇ m sieve and dried at room temperature, and the dried particles were used as a microcarrier for cell culture.
  • tris buffer pH 8.0
  • a microcarrier for cell culture was prepared in the same manner as in Example 1, except that the weight ratio of styrene and divinylbenzene, oil, or agitation speed were used differently.
  • a microcarrier for cell culture was prepared in the same manner as in Example 1, except that the weight ratio of styrene and divinylbenzene, oil, and agitation speed were used differently.
  • a microcarrier for cell culture was prepared in the same manner as in Example 1, except that styrene, divinylbenzene, and oil were used differently.
  • Example 1 Suspension polymerization conditions division Styrene: divinylbenzene weight ratio oil type oil density (g/cm 3 ) oil dosage (wt%) Stirring speed (rpm)
  • Example 1 1:0.33 Isopar M 0.791 14 800
  • Example 2 1:0.33 Isopar M 0.791 20 800
  • Example 3 1:0.33 Isopar M 0.791 20 400
  • Example 4 1:1 Isopar M 0.791 20 800
  • Example 5 1:0.33 Dodecane 0.750 14 800
  • Example 6 1:0.33 Dodecane 0.750 20 800
  • Example 7 1:0.33 Hexadecane 0.773 14 800
  • Example 8 1:0.33 Hexadecane 0.773 20 800 Comparative Example 1 1:0 - - 0 800 Comparative Example 2 1:0.33 n-heptane 0.684 14 800 Comparative Example 3 1:0.33 iso-octane 0.690 14 800
  • Reference Example 1 1:0 Iso
  • microcarriers for cell culture obtained in Examples and Comparative Examples, a sample in which the drying process is completed is prepared, and the sample is subjected to a density of 0.95 g/cm at room temperature (25° C.) and atmospheric pressure (1 atm) conditions. 3 , 0.97 g/cm 3 , 0.98 g/cm 3 , or 0.995 g/cm 3 of an aqueous ethanol solution and distilled water (DIW) with a density of 1 g/cm 3 , respectively, were added to check whether the particles float or settle, and the following criteria The apparent density was evaluated under
  • microcarriers for cell culture obtained in the Examples and Comparative Examples, prepare a sample under the condition that the drying process is completed, and measure the number of spherical particles (completely spherical particles that are not broken) among all the particles in the sample by SEM. was measured, and the number percent ratio of spherical particles was measured by Equation 1 below.
  • the particle internal structure was confirmed through SEM. Specifically, after embedding the particles in epoxy, a cross section was prepared through ion milling, and the shape of the particle cross section was confirmed through SEM.
  • the cross-section was prepared through ion milling, and the shape of the particle cross-section was checked by SEM to obtain the minimum and maximum diameters among the pores inside the particles.
  • microcarriers for cell culture obtained in Examples and Comparative Examples were immersed in tris buffer (pH 8.0) in which dopamine hydrochloride was dissolved at 1 mg/mL, and coated for 2 hours at room temperature under stirring. After washing the excess coating material with ethanol, the particles were filtered through a 70 ⁇ m sieve and dried at room temperature.
  • a culture medium containing mesenchymal stem cells (density: 1.05 g/cm 3 ) was filled in 100 mL vertical wheel bioreactor (PBS), and a polydopamine-coated microcarrier for cell culture was injected into the culture medium and stirred. After culturing at room temperature for 14 days, the microcarriers floating in the supernatant were recovered by centrifugation of the culture solution after treatment with 0.25% trypsin, and the weight was measured after drying to evaluate the recovery efficiency.
  • PBS vertical wheel bioreactor
  • styrene (1/4000 mg/mL ⁇ 1 mg/mL)
  • divinylbenzene (1/10000 mg/mL ⁇ 1 mg/mL)
  • Isopar by concentration in a solvent mixed with chloroform and methanol in a 1:2 volume ratio
  • a standard sample of M (1/400 mg/mL to 10 mg/mL) was prepared.
  • a standard sample of 1 uL was injected into the GC/FID instrument and a calibration curve was prepared. 1 uL of the unreacted residual compound solution extracted from the sample in Table 1 was injected, and the content was calculated using a calibration curve.
  • a column on Rtx (styrene, Isopar M) or wax (divinylbenzene) with an inner diameter of 0.53 mm, a length of 30 m, and a film thickness of 5 ⁇ m was used. It heated up to 250 degreeC at the rate.
  • As the mobile phase gas 15 mL/min of helium gas was used.
  • Example 3 ( ⁇ 51) 0.95 or more and less than 1 7.5 Min: 1 Max: 4 99 porous 90 O
  • Example 5 96 ( ⁇ 30) 0.95 or more and less than 1 6.9 Min: 1 Max: 4 99 porous 90 O
  • Example 6 105 ( ⁇ 27) 0.95 or more and less than 1 7.3 Min: 1 Max: 4 99 porous 90 O
  • Example 7 107 ( ⁇ 23) 0.95 or more and less than 1 7.2 Min: 1 Max: 4 99 porous 90 O
  • the microcarrier for cell culture of Examples has a porous structure with a porosity of 3.9% or more and 7.5% or less inside the particles, and satisfies a low density of 0.95 g/cm 3 or more and 1 g/cm 3 or less.
  • the proportion of perfectly spherical particles without damage and destruction was very high at 99%, so that most of the particles could have a homogeneously spherical shape.
  • the carrier culture proceeded effectively under the cell culture conditions, and the recovery efficiency of the microcarrier after culturing was also high as 90%.
  • the cell culture microcarrier of Comparative Example 1 was As a non-porous structure with no pores with an internal porosity of 0%, the density increased to more than 1 g/cm 3 , so there was a problem that cells and microcarriers could not be separated through centrifugation after cell culture and detachment.
  • the microcarriers for cell culture of Comparative Examples 2 and 3 had an excessively low particle density of less than 0.95 g/cm 3 , and the particles were suspended on the surface of the culture medium under agitation conditions, thereby reducing cell adhesion and thus cell culture was impossible.
  • the cell culture microcarriers of Comparative Examples 2 and 3 had a perfect spherical particle ratio without damage and destruction of 90%, and the particle surface was not uniform and concave-shaped particles were generated in a large amount compared to Examples. There was a problem that the cell culture efficiency was lowered to an impossible degree.
  • the microcarriers for cell culture of Reference Examples 1 to 5 had a ratio of perfect spherical particles without damage and destruction of 0% or more and 70% or less, which was lower than in Examples, so that the shape of the particles was relatively non-uniform compared to Examples.
  • the cell culture microcarriers of Reference Examples 6 to 8 have an apparent density of more than 1 g/cm 3 during cell culture, so that precipitation occurs during low-speed stirring during culture, or the suspension of the culture medium is increased due to non-spherical particles. There was a problem in that cell culture efficiency was lowered to such an extent that cell culture was impossible due to a physical impact in the future.

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Abstract

본 발명은 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상을 포함한 폴리스티렌계 입자를 포함하는 세포 배양용 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 배양 조성물에 관한 것이다.

Description

세포 배양용 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 배양 조성물
관련 출원(들)과의 상호 인용
본 출원은 2020년 9월 15일자 한국 특허 출원 제10-2020-0118533호 및 2021년 9월 3일자 한국 특허 출원 제10-2021-0117811호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 발명은 세포 배양용 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 배양 조성물에 관한 것이다.
바이오 의약품 및 재생 의료 분야가 확장됨에 따라, 세포, 조직, 미생물 등을 효율적으로 생산할 수 있는 세포 대량 배양 기술에 대한 요구가 증대하고 있다.
부착성을 갖는 세포는 3D 바이오리액터(bioreactor) 내에서 마이크로 캐리어를 이용하여 배양된다. 바이오리액터 내에 세포, 배양액 및 마이크로 캐리어를 넣고, 배양액을 교반하여 세포 및 마이크로 캐리어를 접촉시킴으로써, 세포를 마이크로 캐리어의 표면에 부착시켜 배양하게 된다. 이 때 사용하는 마이크로 캐리어는 세포가 부착하여 증식할 수 있는 높은 표면적 비율(surface area/volume)을 제공하기 때문에, 세포의 대량 배양에 적합하다.
현재 상업적으로 이용되는 마이크로 캐리어는 밀도가 약 1.1 내지 1.3 g/cm3이며, 세포의 밀도는 약 1.2 g/cm3 정도이다. 이 경우, 바이오리액터 내 배양 초기 세포를 부착하기에는 유리하지만, 배양 후 세포 분리 회수 시 원심분리가 어렵고, 마이크로 캐리어와 세포의 크기에 근거한 필터링 방법을 이용하여야 한다. 그러나 이러한 경우 필터가 막히거나 공정 시간이 오래 걸리고, 세포의 물리적 손상 및 오염이 쉽게 발생할 수 있으며, 세포의 손실이 발생할 수 있는 문제가 있다.
이러한 문제를 해결하기 위해, 밀도가 1.0 g/cm3 보다 낮거나, 1.3 g/cm3 보다 높은 재료의 특성을 이용하여 마이크로 캐리어를 제조하였으나, 이 경우 구현할 수 있는 밀도의 범위가 제한적이고, 손상 및 파괴 없이 완전한 구형을 갖는 마이크로 캐리어의 수율이 충분히 확보되기 어려운 단점이 있다.
따라서, 손상 및 파괴 없이 완전한 구형을 갖는 마이크로 캐리어의 수율이 충분히 확보되면서도, 세포 배양 후 마이크로 캐리어와 세포의 분리 회수 시 보다 손쉽게 분리할 수 있는 새로운 마이크로 캐리어의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 손상 및 파괴 없이 완전한 구형을 갖는 마이크로 캐리어의 수율이 충분히 확보되면서도, 세포 배양 후 마이크로 캐리어와 세포의 분리 회수 시 보다 손쉽게 분리할 수 있는 세포 배양용 마이크로 캐리어를 제공하기 위한 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어를 이용한 세포 배양 조성물에 관한 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 명세서에서는, 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상을 포함한 폴리스티렌계 입자를 포함하는 세포 배양용 마이크로 캐리어를 제공한다.
본 명세서에서는 또한, 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 존재하에, 스티렌 단량체가 함유된 단량체 조성물의 현탁 중합 반응을 진행하는 단계를 포함하는 세포 배양용 마이크로 캐리어 제조방법이 제공된다.
본 명세서에서는 또한, 세포 및 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어를 포함하는 세포 배양 조성물이 제공된다.
이하 발명의 구체적인 구현예에 따른 세포 배양용 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 배양 조성물에 대하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.
본 명세서에서 명시적인 언급이 없는 한, 전문용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 '포함'의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 성분 및/또는 군의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.
그리고, 본 명세서에서 '제 1' 및 '제 2'와 같이 서수를 포함하는 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로 사용되며, 상기 서수에 의해 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위 내에서 제 1 구성요소는 제 2 구성요소로도 명명될 수 있고, 유사하게 제 2 구성요소는 제 1 구성요소로 명명될 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
1. 세포 배양용 마이크로 캐리어
발명의 일 구현예에 따르면, 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상을 포함한 폴리스티렌계 입자를 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어가 제공될 수 있다.
본 발명자들은 상기 일 구현예의 세포 배양용 마이크로 캐리어의 경우, 폴리스티렌계 입자 내부에 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상이 포함되어, 세포 배양용 마이크로 캐리어의 밀도를 낮출 수 있을 뿐 아니라, 손상 및 파괴 없이 완전한 구형 입자 비율이 현저히 높아져 균질한 구형 형상의 마이크로 캐리어를 높은 수율로 확보할 수 있다는 점을 실험을 통해 확인하고 발명을 완성하였다.
구체적으로, 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어는 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상을 포함한 폴리스티렌계 입자를 포함할 수 있다. 즉, 상기 폴리스티렌계 입자는 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 1종, 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일로부터 유도된 공극 1종, 혹은 이들 2종 의 혼합물을 포함할 수 있다.
상기 폴리스티렌계 입자가 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일로부터 유도된 공극 1종을 포함하거나, 혹은 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 및 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일로부터 유도된 공극을 모두 포함하는 경우, 상기 폴리스티렌계 입자는 다공성 폴리스티렌계 입자에 해당할 수 있다.
상기 폴리스티렌계 입자는 후술하는 다른 구현예의 제조방법과 같이 탄화수소 오일 존재 하에서 현탁중합에 의해 폴리스티렌 입자 합성을 진행하여 탄화수소 오일이 폴리스티렌 입자 내부에 갇힌 상태로 계속 잔류하거나, 고속의 현탁중합 교반조건에 의해 갇혀있던 탄화수소 오일 일부 혹은 전체가 빠져나와 폴리스티렌 입자 내부에 공극이 형성될 수 있다.
상기 공극이란 폴리스티렌계 입자 내부의 빈 공간을 의미하며, 기공, 할로우(hollow), 구멍, 보이드(void) 등과 같은 의미로 사용될 수 있다.
상기 공극은 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일로부터 유도된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 공극은 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일이 현탁 중합 도중 폴리스티렌과 상분리되면서 형성된 공간에 해당한다.
따라서, 상기 폴리스티렌계 입자가 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 1종만을 포함하는 것은 중합 과정에서 탄화수소 오일이 완전히 상분리되었으나 중합 및 세척 공정 중 입자 외부로 소실되지 않은 것을 의미하며, 상기 폴리스티렌계 입자가 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일로부터 유도된 공극 1종만을 포함하는 것은 중합 과정에서 탄화수소 오일이 완전히 상분리되어 중합 및 세척 공정 중 입자 외부로 소실된 상태를 의미한다. 또한, 상기 폴리스티렌계 입자가 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 및 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일로부터 유도된 공극을 모두 포함하는 것은 탄화수소 오일이 중합 과정에서 일부 상분리되어 소실되고 일부는 잔류하는 상태를 의미한다.
본 발명자들은 상기 공극이 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일로부터 유도된 것을 입증하기 위해, 상기 일 구현예에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어에 대한 성분 분석시 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일이 검출됨을 확인하였다. 구체적으로, 상기 일 구현예에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어를 동결 분쇄하고 클로로포름(Chloroform)에 녹여 미반응 잔류 화합물을 추출하고, GC/FID(가스 크로마토그래피 - 불꽃 이온화 검출기)를 통해 세부 성분을 정성, 정량분석하였고, 그 결과 오일 또는 이로부터 유래된 성분이 검출되었다. 이를 통해 상기 공극 내부에 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 또는 이로부터 유래된 성분이 잔류하였음을 확인할 수 있었다.
구체적으로, 상기 공극의 직경은 0.1 ㎛ 내지 5 ㎛일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 공극의 직경은 0.1 ㎛ 이상, 또는 1 ㎛ 이상일 수 있고, 5㎛ 이하, 또는 3㎛ 이하일 수 있고, 0.1 ㎛ 내지 10㎛, 또는 0.1 ㎛ 내지 5㎛, 또는 1 ㎛ 내지 5 ㎛, 또는 1 ㎛ 내지 4 ㎛일 수 있다.
상술한 바와 같이, 상기 공극은 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일로부터 유도된 것임에 따라, 상기 공극의 직경은 0.1 ㎛ 내지 5 ㎛로 작은 크기의 공극을 구현할 수 있으며, 이에 따라 마이크로 캐리어의 밀도를 용이하게 조절할 수 있다.
종래 폴리스티렌 입자의 밀도를 낮추기 위해 폴리스티렌 중합 과정 중 저비점의 발포제를 투입한 후 추가 발포 공정을 통해 발포 스티렌을 제조해 왔으나, 이와 같은 경우 수십 ㎛ 크기의 큰 공극이 형성되어, 마이크로 캐리어의 밀도 조절이 어려운 한계가 있다.
상기 탄화수소 오일의 탄소수는 12이상, 또는 12 이상 50 이하, 또는 12 이상 16 이하일 수 있다. 상기 탄화수소 오일의 탄소수가 12 미만으로 지나치게 감소하게 되면, 현탁 중합 중 탄화수소 오일과 폴리스티렌의 상분리 속도의 감소로 인해 입자 표면이 균일하지 않고 움푹 패인 형상의 입자가 다수 제조되는 한계가 있다.
구체적으로, 상기 탄화수소 오일은 탄소수 12 이상 50 이하인 직쇄 또는 분지쇄의 포화탄화수소 화합물을 포함할 수 있다. 상기 탄소수 12 이상 50 이하인 직쇄 또는 분지쇄의 포화탄화수소 화합물은 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 상기 탄소수 12 이상 50 이하인 직쇄 또는 분지쇄의 포화탄화수소 화합물의 예로는 탄소수 12 이상 16 이하의 노말알케인, 탄소수 12 이상 16 이하의 이소알케인, 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 탄화수소 오일로는 탄소수 12의 도데칸, 탄소수 16의 헥사데칸, 또는 Isopar M(탄소수 12 이상 14 이하의 이소알케인과 탄소수 13 이상 16 이하의 이소알케인의 혼합물)을 사용할 수 있다.
상기 탄화수소 오일은 스티렌 모노머를 포함하는 분산상 조성물 전체 중량 (100% 중량)을 기준으로 30 중량% 이하, 또는 10 중량% 이상 30 중량% 이하로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 탄화수소 오일의 함량 하한은 10 중량% 이상, 또는 11 중량% 이상, 또는 12 중량% 이상, 또는 13 중량% 이상, 또는 14 중량% 이상이고, 그 상한은 예를 들어, 30 중량% 이하, 또는 25 중량% 이하, 또는 20 중량% 이하일 수 있다. 상기 탄화수소 오일의 함량이 상기 함량 범위 미만으로 사용될 경우, 저밀도 특성의 캐리어 입자를 확보하기 어렵고, 상기 함량 범위를 지나치게 초과할 경우, 폴리스티렌계 입자의 형상이 구형을 갖기 어려워져 제조되는 입자의 균일성이 감소하게 된다.
상기 탄화수소 오일의 밀도는 0.75 g/cm3 이상 0.80 g/cm3 이하, 또는 0.75 g/cm3 이상 0.791 g/cm3 이하일 수 있다. 상기 탄화수소 오일의 밀도가 상술한 범위로 매우 낮기 때문에, 이를 통해 폴리스티렌계 입자의 밀도를 현저히 낮출 수 있다.
다만, 상기 탄화수소 오일의 밀도가 0.75 g/cm3 미만으로 지나치게 감소하게 되면, 현탁 중합 중 탄화수소 오일과 폴리스티렌의 상분리 속도의 감소로 인해 입자 표면이 균일하지 않고 움푹 패인 형상의 입자가 다수 제조되는 한계가 있다.
구체적으로, 상기 폴리스티렌계 입자의 겉보기 밀도가 0.95 g/cm3 이상 1.00 g/cm3 미만일 수 있다. 상술한 저밀도 범위를 가짐에 따라, 세포 배양 후 마이크로 캐리어와 세포를 분리 회수 시 중력에 의한 침강 속도 차이를 통하여 세포와 마이크로 캐리어를 손쉽게 분리할 수 있다.
상기 마이크로 캐리어의 밀도가 1 g/cm3 를 초과하는 경우, 세포와 마이크로 캐리어의 밀도 차이가 적어 배양 후 세포 분리 회수 시 원심 분리가 어려울 수 있고, 0.95 g/cm3 미만인 경우, 배양 초기에 마이크로 캐리어가 배양액 표면에서만 부유하여 세포를 부착하기 어려운 문제가 발생할 수 있다.
상기 세포는 부착성 동물 세포로 그 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 섬유아세포 (fibroblasts), 상피세포 (epithelial cell), 골아세포 (osteoblast), 연골세포 (chondrocyte), 간세포, 인간 유래 제대혈 세포, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell), CHO(Chinese hamster ovary) 세포, 신장세포 (HEK293, BHK21, MDCK, vero cell 등), 또는 이들의 2종 이상 혼합물일 수 있다.
상기 세포의 밀도는 1.02 g/cm3 이상 1.1 g/cm3 미만일 수 있다.
또한, 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어와 상기 세포의 밀도 차이가 0.02 g/cm3 이상 0.20 g/cm3 이하일 수 있다. 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어와 상기 세포의 밀도 차이가 0.02 g/cm3 이상 0.20 g/cm3 이하를 만족함에 따라, 세포 배양 후 마이크로 캐리어와 세포를 분리 회수 시 중력에 의한 침강 속도 차이를 통하여 세포와 마이크로 캐리어를 손쉽게 분리할 수 있다.
상기 폴리스티렌계 입자는 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상이 내부에 분산된 폴리스티렌계 고분자를 포함할 수 있다.
즉, 상기 폴리스티렌계 입자는 폴리스티렌계 고분자 매트릭스와, 상기 폴리스티렌계 고분자 매트릭스 내부에 분산된 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 폴리스티렌계 고분자는, 스티렌 단량체 1 중량부; 및 에틸렌계 불포화 가교제 0.033 중량부 초과 3 중량부 미만, 또는 0.1 이상 1 이하, 또는 0.33 이상 1 이하;의 반응 결과물을 포함할 수 있다. 스티렌 단량체 1 중량부에 대하여, 에틸렌계 불포화 가교제 0.033 중량부 미만으로 지나치게 감소할 경우, 상기 폴리스티렌계 고분자의 가교 밀도가 감소함에 따라 입자의 형태가 구형을 안정적으로 유지하기 어렵고 폴리스티렌계 입자의 전체적인 밀도가 목표한 수준까지 낮아지기 어려운 한계가 있다.
반면, 스티렌 단량체 1 중량부에 대하여, 에틸렌계 불포화 가교제 3 중량부 이상으로 지나치게 증가할 경우, 입자의 형태가 구형을 안정적으로 유지하기 어려운 한계가 있다.
상기 에틸렌계 불포화 가교제의 예로는 디비닐벤젠을 들 수 있다.
상기 폴리스티렌계 입자의 전체 표면적을 기준으로, 상기 폴리스티렌계 입자 표면에 존재하는 마이크로포어와 접촉하는 상기 폴리스티렌계 입자의 표면적의 비율이 0.01% 미만일 수 있다. 상기 폴리스티렌계 입자의 전체 표면적은 폴리스티렌계 입자의 최외각에서 공기중에 노출된 표면적의 합계를 의미하며, 상기 폴리스티렌계 입자 표면에 존재하는 마이크로포어와 접촉하는 상기 폴리스티렌계 입자의 표면적은 상기 폴리스티렌계 입자 표면에 존재하는 마이크로포어가 폴리스티렌계 입자의 최외각 표면과 접촉하는 표면적의 합계를 의미한다. 또한, 상기 마이크로포어란 최대 직경이 마이크로미터 사이즈인 공극으로서, 예를 들어 1 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하의 최대 직경을 갖는 공극을 의미한다.
보다 구체적으로, 상기 폴리스티렌계 입자의 전체 표면적을 기준으로, 상기 폴리스티렌계 입자 표면에 존재하는 마이크로포어와 접촉하는 상기 폴리스티렌계 입자의 표면적의 비율은 하기 수학식 3을 통해 구할 수 있다.
[수학식3]
상기 폴리스티렌계 입자의 전체 표면적을 기준으로, 상기 폴리스티렌계 입자 표면에 존재하는 마이크로포어와 접촉하는 상기 폴리스티렌계 입자의 표면적의 비율(%) = [(상기 폴리스티렌계 입자 표면에 존재하는 마이크로포어와 접촉하는 상기 폴리스티렌계 입자의 표면적) / (상기 폴리스티렌계 입자의 전체 표면적)] x 100
상기 폴리스티렌계 입자의 전체 표면적을 기준으로, 상기 폴리스티렌계 입자 표면에 존재하는 마이크로포어와 접촉하는 상기 폴리스티렌계 입자의 표면적의 비율이 0.01% 미만이라 함은, 상기 폴리스티렌계 입자의 표면에 존재하는 마이크로 크기 포어가 아예 없거나, 거의 없다고 볼 수 있을 정도로 극히 적다는 것을 의미한다. 즉, 상기 폴리스티렌계 입자 표면에는 마이크로포어가 존재하지 않을 수 있다.
종래 폴리스티렌 입자의 밀도를 낮추기 위해 발포제를 투입하여 발포 스티렌을 제조해 왔으나, 이 경우 폴리스티렌 입자의 직경범위와 밀도범위의 분포가 지나치게 넓어짐에 따라 세포 배양용 마이크로 캐리어로서 적용 가능한 범위로의 수율을 확보하는데 어려움이 있었다.
반면, 상기 폴리스티렌계 입자는 상기 폴리스티렌계 입자의 전체 표면적을 기준으로, 상기 폴리스티렌계 입자 표면에 존재하는 마이크로포어와 접촉하는 상기 폴리스티렌계 입자의 표면적의 비율이 0.01% 미만이므로, 종래의 발포 스티렌과 달리 발포제에 의한 발포공정이 전혀 진행되지 않아, 폴리스티렌 입자의 직경범위와 밀도범위의 분포를 보다 정밀하게 조절할 수 있는 장점이 있다.
상기 폴리스티렌계 입자의 평균 직경이 50 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 또는 60 ㎛ 이상 390 ㎛ 이하일 수 있다. 상기 폴리스티렌계 입자의 평균 직경이 상술한 범위를 만족하는 경우 세포 부착 및 배양 성능이 우수하다. 한편, 상기 폴리스티렌계 입자의 평균 직경이 50 ㎛ 미만인 경우, 세포 배양이 가능한 표면적이 작아 배양 효율이 낮아지는 문제점이 발생할 우려가 있고, 400 ㎛ 초과인 경우, 부착 세포간 상호 작용이 저하되고, 배양기 내 세포 밀도가 낮아져, 세포 배양 효율이 낮아지는 문제가 발생할 수 있다.
상기 폴리스티렌계 입자의 직경은 상기 폴리스티렌계 입자의 무게 중심점을 지나는 직선이 폴리스티렌계 입자의 최외각 표면과 만나는 두 지점 간의 거리를 의미하며, 상기 폴리스티렌계 입자의 평균 직경은 광학현미경을 통해 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어에 포함되는 전체 폴리스티렌계 입자의 직경을 확인하여 구할 수 있다. 또한 상기 폴리스티렌계 입자의 평균 입경은 상기 폴리스티렌계 입자의 제조과정에서 얻어지는 전체 폴리스티렌계 입자의 직경이나 이들의 평균 직경을 통하여도 확인 가능하다.
상기 폴리스티렌계 입자는 50 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 또는 60 ㎛ 이상 390 ㎛ 이하의 평균 직경을 갖는 개별 입자의 군(group)일 수 있으며, 이러한 군(group)에 포함되는 개별 미립자는 평균적으로 50 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 또는 60 ㎛ 이상 390 ㎛ 이하의 직경을 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 군(group)에 포함되는 개별 미립자의 95%, 또는 99%가 50 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 또는 60 ㎛ 이상 390 ㎛ 이하의 직경을 가질 수 있다.
상기 폴리스티렌계 입자 표면에, 프라이머 고분자층, 세포부착 유도층, 또는 이들의 조합층이 더 포함될 수 있다. 즉, 상기 폴리스티렌계 입자 표면에, 프라이머 고분자층 1종, 세포부착 유도층 1종, 또는 프라이머 고분자층 1종과 세포부착 유도층 1종의 혼합층이 더 포함될 수 있다. 프라이머 고분자층 1종과 세포부착 유도층 1종의 혼합층에서 이들의 적층 순서는 특별히 한정되지 않으며 프라이머 고분자층상에 세포부착 유도층이 적층된 구조, 혹은 세포부착 유도층상에 프라이머 고분자층이 적층된 구조를 모두 적용가능하다.
한편, 상기 프라이머 고분자층은 관능기가 없는 폴리스티렌계 입자 표면에 기능성 고분자를 도입할 수 있는 점착층 역할을 하며, 이로 인해 마이크로 캐리어 표면에 세포 부착을 위한 고분자 층이 효과적으로 도입되고 배양 중에도 안정적으로 유지될 수 있도록 한다.
상기 프라이머 고분자층은 그 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 수상 접착을 유도할 수 있는 카테콜 유도체로서 L-디하이드록시 페닐알라닌(L-DOPA), 도파민(dopamine), 폴리도파민, 노레피네프린(norepinephrine), 에피네프린(epinephrine), 에피갈로카테킨(epigallocatechin) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
한편, 상기 세포 부착 유도층은 세포 부착성 물질들로 구성되며, 이들은 세포의 막관통 단백질(transmembrane protein)들이 결합할 수 있는 장소를 제공하는 역할을 하여, 부착성 세포들이 안정적으로 부착, spreading 및 배양될 수 있도록 한다.
상기 세포 부착 유도층을 형성하는 고분자는 그 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 젤라틴, 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin) 키토산, 폴리도파민, 폴리 L-라이신, 비트로넥틴(vitronectin), RGD를 포함한 펩타이드, RGD를 포함한 아크릴계 고분자, 리그닌(lignin), 양이온성 덱스트란 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
일례로, 상기 마이크로 캐리어는 폴리스티렌계 입자의 표면에 형성되는 프라이머 고분자층을 포함하여, 마이크로 캐리어의 표면을 친수성으로 개질하는 것을 통해 수분산 되고, 상기 프라이머 고분자층 표면에 세포 부착 유도층을 도입하여 배양액 내에서 마이크로 캐리어의 부유도가 조절될 수 있으며, 세포를 안정적으로 부착 배양하는 효과를 가질 수 있다.
한편, 상기 폴리스티렌계 입자의 반경과 프라이머 고분자층의 두께의 비율은 1:0.00001 내지 1:0.01, 또는 1:0.0001 내지 1:0.001일 수 있다.
폴리스티렌계 입자의 반경과 표면 코팅층의 두께의 비율이 1:0.00001 미만인 경우, 폴리스티렌계 입자 대비 프라이머 고분자층이 너무 얇아 마이크로 캐리어 표면이 친수성으로 개질하는 효과가 미미하며, 1:0.01를 초과하는 경우, 폴리스티렌계 입자 대비 프라이머 고분자층이 두꺼워져, 세포 배양 시 세포와 마이크로 캐리어의 부착도가 감소될 우려가 있다.
한편, 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어는 하기 수학식1에 의한 손상 및 파괴없이 완전한 구형 입자 비율이 90% 초과 100% 이하, 또는 92% 이상 100% 이하, 또는 95% 이상 100% 이하, 또는 96% 이상 99% 이하일 수 있다.
[수학식1]
손상 및 파괴 없이 완전한 구형 입자 비율(%) = (손상 및 파괴 없이 완전한 구형을 갖는 폴리스티렌계 입자의 개수 / 전체 폴리스티렌계 입자의 개수) x 100.
상기 수학식1에 의한 손상 및 파괴 없이 완전한 구형 입자 비율은 상기 일 구현예의 세포 배양용 마이크로 캐리어에 대하여, 전체 입자 중 손상 및 파괴 없이 완전한 구형을 갖는 입자의 개수를 SEM을 통해 측정하고, 전체 입자 대비 손상 및 파괴 없이 완전한 구형입자의 개수의 퍼센트 비율을 계산하여 구할 수 있다.
즉, 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어는 복수의 폴리스티렌계 입자를 함유할 수 있으며, 이러한 복수의 폴리스티렌계 입자들 중 손상 및 파괴 없이 완전한 구형인 형상을 갖는지 여부는 SEM을 통해 육안으로 판별할 수 있다.
상기 수학식1에 의한 손상 및 파괴 없이 완전한 구형 입자 비율이 90% 이하로 감소하게 되면, 입자 표면이 균일하지 않고 움푹 패인 비정형 입자의 수가 증가하고 세포 배양액 내에 비정형 입자가 부유하여 배양 중인 세포에 물리적 충격을 가해 세포 배양이 불가능할 정도로 세포 배양 효율이 낮아지는 문제점이 발생할 우려가 있다.
또한, 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어는 하기 수학식2에 의한 공극율이 0% 이상 8% 미만, 또는 1% 이상 8% 미만, 또는 2% 이상 8% 미만, 또는 3% 이상 8% 미만, 또는 3.9% 이상 7.5% 이하, 또는 6.5% 이상 7.5% 이하일 수 있다.
[수학식2]
공극율(%) = [1- (폴리스티렌계 입자의 겉보기밀도 / 폴리스티렌계 입자의 진밀도)] x 100.
상기 겉보기 밀도는 입자와 입자간 공극이 포함된 실제 입자 부피를 이용하여 구한 밀도이고, 진밀도는 공극을 제외한 입자재료들만의 부피를 이용하여 구한 밀도이다.
상기 수학식2에 의한 공극율에서, 폴리스티렌계 입자의 겉보기 밀도는 밀도가 0.95 g/cm3인 에탄올 수용액과, 밀도가 1 g/cm3인 물에 각각 첨가하여 입자가 부유 또는 침강하는지 확인하여 측정할 수 있으며, 진밀도는 He pycnometry를 이용하여 측정할 수 있다.
상기 수학식2에 의한 공극율이 0%라는 것은, 중합 과정에서 탄화수소 오일이 상분리되지 않고 중합 중 소실되어 상기 폴리스티렌계 입자가 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 1종을 포함하지 않는 상태를 의미한다. 그리고, 상기 수학식2에 의한 공극율이 0% 초과 8% 미만이라는 것은, 탄화수소 오일이 중합 과정에서 상분리된 후 중합 및 세척 과정에서 소실되거나 일부는 잔류하여, 상기 폴리스티렌계 입자가 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 및 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일로부터 유도된 공극을 모두 포함하는 상태를 의미한다.
상기 수학식2에 의한 공극율이 8% 이상 등으로 지나치게 증가하게 되면, 폴리스티렌계 입자의 밀도가 지나치게 감소하면서, 배양 초기에 마이크로 캐리어가 배양액 표면에서만 부유하여 세포를 부착하기 어려운 문제가 발생할 수 있다.
2. 세포 배양용 마이크로 캐리어 제조방법
발명의 다른 구현예에 따르면, 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 존재하에, 스티렌 단량체가 함유된 단량체 조성물의 현탁 중합 반응을 진행하는 단계를 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어 제조방법이 제공될 수 있다.
상기 탄화수소 오일, 스티렌 단량체에 대한 내용은 상기 일 구현예에서 상술한 내용을 모두 포함한다.
상기 단량체 조성물은 스티렌 단량체 1 중량부 및 에틸렌계 불포화 가교제 0.033 중량부 초과 3 중량부 미만이 혼합된 것일 수 있다. 구체적으로, 스티렌 단량체 1 중량부에 대하여, 에틸렌계 불포화 가교제 0.033 중량부 미만으로 지나치게 감소할 경우, 상기 폴리스티렌계 고분자의 가교 밀도가 감소함에 따라 탄화수소 오일로 인해 생성된 공극이 안정적으로 제조되기 어려워 폴리스티렌계 입자의 밀도를 충분히 낮추기 어렵고, 입자의 형태가 손상 및 파괴없는 완전한 구형을 유지하기 어려운 한계가 있다.
반면, 스티렌 단량체 1 중량부에 대하여, 에틸렌계 불포화 가교제 3 중량부 이상으로 지나치게 증가할 경우, 상기 폴리스티렌계 고분자의 가교밀도가 증가하면서, 폴리스티렌계 입자의 전체적인 밀도가 목표한 수준까지 낮아지기 어려운 한계가 있다.
또한, 상기 단량체 조성물의 중량을 기준으로, 상기 탄화수소 오일의 함량이 10 중량% 이상 30 중량% 이하, 또는 14 중량% 이상 20 중량% 이하일 수 있다. 상기 탄화수소 오일의 함량이 지나치게 감소할 경우, 탄화수소 오일이 중합 중 상분리되는 양이 적어 폴리스티렌계 입자의 밀도가 충분히 낮아지기 어렵다. 또한, 상기 탄화수소 오일의 함량이 지나치게 증가할 경우, 폴리스티렌계 입자의 형상이 구형을 갖기 어려워져 제조되는 입자의 균일성이 감소하게 된다.
보다 구체적으로, 상기 단량체 조성물의 현탁 중합 반응은, 상기 단량체 조성물을 수계 분산액에 혼합하고 전단력을 가하여 상기 단량체 조성물을 수계 분산액에 액적 형태로 균질화하는 단계; 및 상기 균질화된 단량체 조성물을 300 rpm 이상 1000 rpm 이하의 교반속도로 현탁 중합하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 균질화된 단량체 조성물을 300 rpm 이상 1000 rpm 이하, 또는 400 rpm 이상 800 rpm 이하의 교반속도로 현탁 중합하는 단계에서 폴리스티렌과 탄화수소 오일의 입자 구조 형성 중 폴리스티렌과 탄화수소 오일의 상분리에 의해 내부 공극을 형성하면서 세포 배양용 마이크로 캐리어의 밀도를 보다 낮출 수 있으면서도, 손상 및 파괴없이 완전한 구형 입자 비율이 높은 세포 배양용 마이크로 캐리어 제조가 가능하다.
상기 균질화된 단량체 조성물을 300 rpm 이상 1000 rpm 이하, 또는 400 rpm 이상 800 rpm 이하의 교반속도로 현탁 중합하는 단계에서 상기 현탁 중합 조건의 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 예를 들어, 50 ℃ 이상 100 ℃ 온도에서 3 시간 이상 18 시간 이하로 진행할 수 있다.
한편, 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어 제조방법은 상기 현탁 중합 반응을 진행하는 단계 이후에, 현탁 중합 반응 결과물을 세척하는 단계 및 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
구체적으로 상기 현탁 중합 반응 결과물을 세척하는 단계는 현탁 중합 반응 결과물을 50 ㎛ 이상 100 ㎛ 이하의 sieve에 거른 뒤, 에탄올 100%에 5-7 회 상온 교반하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 현탁 중합 반응 결과물을 건조하는 단계는 진공 오븐에 넣고 상온에서 진공 건조하는 단계를 포함한다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니고, 통상적으로 사용되는 것으로 알려진 건조 방법을 별 다른 제한 없이 사용할 수 있다.
한편, 상기 다른 구현예의 세포 배양용 마이크로 캐리어의 제조방법은, 상기 현탁 중합 반응을 진행하는 단계 이후에, 상기 현탁 중합 반응 결과물의 표면에 프라이머 고분자층, 세포부착 유도층, 또는 이들의 조합층을 도포하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 프라이머 고분자층, 세포부착 유도층에 대한 내용은 상기 일 구현예에서 상술한 내용을 모두 포함한다.
3. 세포 배양 조성물
발명의 또 다른 구현예에 따르면, 세포 및 상기 일 구현예의 세포 배양용 마이크로 캐리어를 포함하는 세포 배양 조성물이 제공될 수 있다. 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어에 대한 내용은 상기 일 구현예에서 상술한 내용을 모두 포함한다.
상기 세포는 부착성 동물 세포로 그 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 섬유아세포 (fibroblasts), 상피세포 (epithelial cell), 골아세포 (osteoblast), 연골세포 (chondrocyte), 간세포, 인간 유래 제대혈 세포, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell), CHO(Chinese hamster ovary) 세포, 신장세포 (HEK293, BHK21, MDCK, vero cell 등), 또는 이들의 2종 이상 혼합물일 수 있다.
상기 세포의 밀도는 1.02 g/cm3 이상 1.1 g/cm3 미만일 수 있다.
또한, 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어와 상기 세포의 밀도 차이가 0.02 g/cm3 이상 0.20 g/cm3 이하일 수 있다. 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어와 상기 세포의 밀도 차이가 0.02 g/cm3 이상 0.20 g/cm3 이하를 만족함에 따라, 세포 배양 후 마이크로 캐리어와 세포를 분리 회수 시 중력에 의한 침강 속도 차이를 통하여 세포와 마이크로 캐리어를 손쉽게 분리할 수 있다.
상기 세포 배양 조성물은 배지 용액을 더 포함할 수 있다. 상기 배지 용액은 혈장이나 림프액과 같은 체액을 근거한 생체의 조건에 가까운 영양분과 pH, 온도, 삼투압 등의 환경 조건을 충분히 만족시켜 주기 위한 각종 첨가제들을 포함할 수 있고, 이는 세포 배양 관련 기술분야에서 널리 알려진 다양한 물질을 제한 없이 사용할 수 있다.
일례로, 상기 일 구현예의 세포 배양용 마이크로 캐리어는 배지 용액보다 작은 밀도를 가져, 배지 용액 내에 주입되어 교반 조건 하에 배지 용액 내부에서 부유하게 된다. 이후, 저밀도의 마이크로 캐리어의 표면에 부착되는 세포의 수가 증가함에 따라, 세포가 부착된 마이크로 캐리어(이하, '마이크로 캐리어-세포 결합체'라고 함)의 밀도는 점차 증가하여 배지 용액내에서 점차 가라앉게 된다.
이에, 세포가 부착된 마이크로 캐리어(마이크로 캐리어-세포 결합체)을 세포 탈착효소 첨가 처리 후 원심분리를 통해 분리하여, 마이크로 캐리어-세포 결합체로부터 세포를 분리시킴으로서 배양된 세포를 용이하게 확보할 수 있다.
본 발명에 따르면, 손상 및 파괴없이 완전한 구형을 갖는 마이크로 캐리어의 수율이 충분히 확보되면서도, 세포 배양 후 마이크로 캐리어와 세포의 분리 회수 시 보다 손쉽게 분리할 수 있는 세포 배양용 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및 이를 이용하는 세포 배양 방법이 제공될 수 있다.
도 1은 실시예1에서 얻은 세포 배양용 마이크로 캐리어의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 2는 참고예1에서 얻은 세포 배양용 마이크로 캐리어의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 참고예5에서 얻은 세포 배양용 마이크로 캐리어의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 4은 실시예2에서 얻은 세포 배양용 마이크로 캐리어의 입자 단면 형상 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 비교예1에서 얻은 세포 배양용 마이크로 캐리어의 입자 단면 형상 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
발명을 하기의 실시예에서 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예: 세포 배양용 마이크로 캐리어의 제조>
실시예1
물 250 g에 폴리바이닐 알코올 2.5g을 혼합하여 수계 분산액을 제조한 후, 상온에서 20 분간 교반하였다.
하기 표1에 기재된 함량비율로 단량체인 스티렌과 가교제인 디비닐벤젠과 하기 표 1에 기재된 오일(투입량: 총 합 기준 오일 첨가량)의 합계 25 g을 혼합하여 충분히 녹이고, 상기 혼합물에 benzoyl peroxide 개시제 (Sigma Aldrich) 2.06 중량%, tert-butyl peroxybenzoate 개시제 (Sigma Aldrich) 0.3125 중량 % (개시제 투입량: 단량체, 가교제, 오일 총 합 기준)을 첨가하여 5 분간 추가로 교반함으로서 단량체 조성물을 제조하였다.
그리고, 상기 수계 분산액에 상기 단량체 조성물을 첨가하고, 800 rpm 의 속도로 상기 수계 분산액 및 단량체 조성물에 전단력을 가하여 상기 단량체 조성물을 수계 분산액에 미세한 액적 형태로 분산시켜 균질화하였다.
상기 균질화된 혼합물을 하기 표1에 기재된 교반속도로 교반하면서 90 ℃에서 6 시간 동안 질소 퍼징하에 반응시켜 폴리스티렌 입자를 제조하고, 에탄올에 세척된 입자를 상온 건조하여 회수하였다.
건조 후 회수된 입자를 dopamine hydrochloride가 1mg/mL로 용해된 tris buffer (pH 8.0)에 침지하여 교반 하에 상온에서 2시간 코팅하였다. 과량의 코팅물질을 ethanol로 세척 후 70 ㎛ sieve에 입자를 거른 뒤 상온 건조하였으며, 건조된 입자를 세포 배양용 마이크로 캐리어로 사용하였다.
실시예2 내지 실시예8
하기 표1에 기재된 바와 같이, 스티렌과 디비닐벤젠 중량비율, 오일, 또는 교반속도를 달리 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예1과 동일한 방법으로 세포 배양용 마이크로 캐리어를 제조하였다.
<비교예: 세포 배양용 마이크로 캐리어의 제조>
비교예1 내지 비교예3
하기 표1에 기재된 바와 같이, 스티렌과 디비닐벤젠 중량비율, 오일, 교반속도를 달리 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예1과 동일한 방법으로 세포 배양용 마이크로 캐리어를 제조하였다.
<참고예: 세포 배양용 마이크로 캐리어의 제조>
참고예1 내지 참고예8
하기 표1에 기재된 바와 같이, 스티렌과 디비닐벤젠 중량비율, 오일을 달리 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예1과 동일한 방법으로 세포 배양용 마이크로 캐리어를 제조하였다.
현탁중합 조건
구분 스티렌 : 디비닐벤젠 중량비율 오일 종류 오일 밀도
(g/cm3)		 오일 투입량
(wt%)		 교반속도(rpm)
실시예1 1:0.33 Isopar M 0.791 14 800
실시예2 1:0.33 Isopar M 0.791 20 800
실시예3 1:0.33 Isopar M 0.791 20 400
실시예4 1:1 Isopar M 0.791 20 800
실시예5 1:0.33 Dodecane 0.750 14 800
실시예6 1:0.33 Dodecane 0.750 20 800
실시예7 1:0.33 Hexadecane 0.773 14 800
실시예8 1:0.33 Hexadecane 0.773 20 800
비교예1 1:0 - - 0 800
비교예2 1:0.33 n-헵탄 0.684 14 800
비교예3 1:0.33 이소-옥탄 0.690 14 800
참고예1 1:0 Isopar M 0.791 20 800
참고예2 1:0 Isopar M 0.791 50 800
참고예3 1:0.0025 Isopar M 0.791 20 800
참고예4 1:0.033 Isopar M 0.791 20 800
참고예5 1:3 Isopar M 0.791 20 800
참고예6 1:0.33 Isopar M 0.791 7 800
참고예7 1:0.33 Dodecane 0.750 7 800
참고예8 1:0.33 Hexadecane 0.773 7 800
<실험예: 세포 배양용 마이크로 캐리어의 물성 측정>상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어에 대하여, 하기 방법으로 물성을 측정하였으며, 그 결과를 표2에 나타내었다.
1. 입자 크기
상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어에 대하여, 광학현미경을 통해 100개의 입자 직경을 측정하고, 이들의 산술평균값을 구하였다.
2. 입자 겉보기 밀도
상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어에 대하여, 건조 과정이 완료된 조건의 시료를 준비하고, 상기 시료를 상온(25 ℃) 및 상압(1 atm) 조건에서, 밀도가 0.95 g/cm3, 0.97 g/cm3, 0.98 g/cm3 또는 0.995 g/cm3인 에탄올 수용액과, 밀도가 1 g/cm3인 증류수(DIW)에 각각 첨가하여 입자가 부유 또는 침강하는지 확인하여 다음 기준하에 겉보기 밀도를 평가하였다.
1) 밀도가 0.95 g/cm3인 에탄올 수용액에서 부유 : 0.95 g/cm3 미만
2) 밀도가 1 g/cm3인 증류수(DIW)에서 침강 : 1 g/cm3 초과
3) 밀도가 0.95 g/cm3인 에탄올 수용액에서 침강하고, 밀도가 1 g/cm3인 증류수(DIW)에서 부유 : 0.95 g/cm3 이상 1 g/cm3 미만
4) 밀도가 0.95 g/cm3인 에탄올 수용액에서 침강하고, 밀도가 0.97 g/cm3인 에탄올 수용액에서 부유 : 0.95 g/cm3 이상 0.97 g/cm3 미만
5) 밀도가 0.98 g/cm3인 에탄올 수용액에서 침강하고, 밀도가 0.995 g/cm3 인 에탄올 수용액에서 부유 : 0.98 g/cm3 이상 0.995 g/cm3 미만
3. 손상 및 파괴 없는 완전한 구형 입자 비율
상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어를 이용하여, 건조 과정이 완료된 조건의 시료를 준비하고, 상기 시료에서 전체 입자 중 구형을 갖는 입자(부서지지 않은 완전한 구형 입자)의 개수를 SEM을 통해 측정하고, 다음 수학식1에 의해 구형입자의 개수 퍼센트 비율을 측정하였다.
[수학식1]
손상 및 파괴없는 완전한 구형 입자 비율(%) = (손상 및 파괴없는 완전한 구형을 갖는 입자의 개수 / 전체 입자의 개수) x 100.
4. 입자 내부 공극율(Porosity)
상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어를 이용하여, 건조 과정이 완료된 조건의 시료를 준비하고, 상기 시료에서 He pycnometry로 진밀도를 측정하고, 다음 수학식2에 의해 공극율을 측정하였다.
[수학식2]
공극율 (%) = [1- (겉보기밀도 / 진밀도)] x 100
5. 입자 내부 구조 및 공극 직경
(1) 입자 내부 구조
상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어에 대하여, SEM을 통해 입자 내부 구조를 확인하였다. 구체적으로 입자를 에폭시에 embedding한 후 ion milling을 통해 단면을 제조한 후 입자 단면의 형상을 SEM을 통해 확인하였다.
(2) 공극 직경
입자를 에폭시에 embedding한 후 ion milling을 통해 단면을 제조한 후 입자 단면의 형상을 SEM으로 확인하여 입자 내부 공극 중 최소 직경과 최대 직경을 구하였다.
6. 마이크로 캐리어의 회수 효율 평가
상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어를 dopamine hydrochloride가 1mg/mL로 용해된 tris buffer (pH 8.0)에 침지하여 교반 하에 상온에서 2시간 코팅하였다. 과량의 코팅물질을 ethanol로 세척 후 70 ㎛ sieve에 입자를 거른 뒤 상온 건조하였다.
100mL vertical wheel bioreactor (PBS社)에 중간엽 줄기세포(밀도: 1.05 g/cm3)를 포함하는 배양액을 채우고, Polydopamine이 코팅된 세포 배양용 마이크로 캐리어를 배양액에 주입하고 교반하였다. 상온에서 14일간 배양한 후, 0.25% trypsin 처리 후 배양액을 원심분리 하여 상층액에 부유하는 마이크로 캐리어를 회수하였으며, 이를 건조 후 무게를 측정하여 회수 효율을 평가하였다.
7. 공극 성분 분석
상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어에 대하여, 내부 공극에 함유된 성분을 분석하기 위해, 세포 배양용 마이크로 캐리어를 동결 분쇄하고 클로로포름(Chloroform)에 녹여 미반응 잔류 화합물을 추출하고, GC/FID(가스 크로마토그래피 - 불꽃 이온화 검출기)를 통해 세부 성분을 정성, 정량분석하였다.
구체적으로 클로로포름과 메탄올을 1:2 부피비로 혼합한 용매에 농도별로 스티렌 (1/4000 mg/mL~1 mg/mL), 디비닐벤젠 (1/10000 mg/mL~1 mg/mL), Isopar M (1/400 mg/mL~10 mg/mL)의 표준 시료를 제조하였다. GC/FID 기기에 1 uL의 표준 시료를 주입하고 검량선을 작성하였다. 표 1의 시료로부터 추출한 미반응 잔류 화합물 용액을 1 uL 주입하고 검량선을 이용하여 함량을 계산하였다. GC/FID 측정은 내경 0.53mm, 길이 30 m, 필름 두께 5 ㎛의 Rtx (스티렌, Isopar M) 또는 wax (디비닐벤젠)상의 컬럼을 이용하였으며, 초기 오븐 온도 50℃에서 시작하여 10℃/min 속도로 250℃까지 승온하였다. 이동상 기체는 15 mL/min의 헬륨 기체를 사용하였다.
이때, 오일 또는 이로부터 유래된 성분이 검출되는 경우를 “O”, 오일 또는 이로부터 유래된 성분이 검출되지 않는 경우를 “X”로 표시하였다.
실시예 및 비교예의 실험예 측정 결과
구분 입자크기(㎛) 입자 겉보기 밀도(g/cm3) 공극율 (%) 공극 직경(㎛) 손상 및 파괴없는 완전한 구형 입자 비율(%) 입자내부구조 회수 효율(%) 공극성분분석
실시예1 104(±24) 0.98이상 0.995 미만 3.9 최소:1최대:4 99(도면1) 다공성
 90 O
실시예2 92(±22) 0.95이상 0.97 미만 7.1 최소:1최대:4 99 다공성(도면4) 90 O
실시예3 322(±51) 0.95이상 1 미만 7.5 최소:1최대:4 99 다공성 90 O
실시예4 99(±21) 0.95이상 1 미만 6.7 최소:1최대:4 99 다공성 90 O
실시예5 96(±30) 0.95이상 1 미만 6.9 최소:1최대:4 99 다공성 90 O
실시예6 105(±27) 0.95이상 1 미만 7.3 최소:1최대:4 99 다공성 90 O
실시예7 107(±23) 0.95이상 1 미만 7.2 최소:1최대:4 99 다공성 90 O
실시예8 102(±26) 0.95이상 1 미만 6.5 최소:1최대:4 99 다공성 90 O
비교예1 198(±99) 1초과 0 - 100 기공 없음(도면5) 원심분리를 통한 세포-마이크로캐리어 분리 불가 X
비교예2 93(±20) 0.95 미만 - 최소:1최대:4 90 다공성 세포배양불가 O
비교예3 99(±15) 0.95 미만 - 최소:1최대:4 90 다공성 세포배양불가 O
참고예1 92(±66) 1초과 - 최소:1최대:4 0(도면2) 다공성 세포배양불가 O
참고예2 입자제조불가 - - - - - 세포배양불가 -
참고예3 80(±16) 1초과 - 최소:1최대:4 50 다공성 세포배양불가 O
참고예4 97(±24) 0.95이상 1 미만 - 최소:1최대:4 50 다공성 세포배양불가 O
참고예5 112(±22) 0.95이상 1 미만 - 최소:1최대:4 70(도면3) 다공성 세포배양불가 O
참고예6 96(±26) 1초과 - 최소:1최대:4 90 다공성 세포배양불가 O
참고예7 120(±26) 1초과 - 최소:1최대:4 90 다공성 세포배양불가 O
참고예8 98(±24) 1초과 - 최소:1최대:4 90 다공성 세포배양불가 O
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 실시예의 세포 배양용 마이크로 캐리어는 입자 내부가 3.9% 이상 7.5% 이하의 공극율을 나타내어 다공성 구조를 가져 0.95 g/cm3 이상 1 g/cm3 미만의 저밀도를 만족하면서도, 손상 및 파괴 없는 완전한 구형 입자 비율이 99%로 매우 높아 대다수의 입자가 균질하게 구형 형상을 가질 수 있었다. 또한, 실시예의 세포 배양용 마이크로 캐리어는 세포 배양 조건에서 캐리어 배양이 효과적으로 진행되고, 배양후 마이크로 캐리어의 회수 효율도 90%로 높다는 것을 확인할 수 있었다.반면, 비교예1의 세포 배양용 마이크로 캐리어는 입자 내부 공극율이 0%로 기공이 없는 비다공성 구조로서, 1 g/cm3 초과로 밀도가 증가하여 세포 배양 및 탈착 후 원심 분리를 통해 세포와 마이크로캐리어를 분리할 수 없는 문제가 있었다.또한, 비교예2, 3의 세포 배양용 마이크로 캐리어는 입자의 밀도가 0.95 g/cm3 미만으로 지나치게 낮아, 교반 조건 하에서 입자가 배양액 표면에서 부유되어 세포 부착성이 감소하여 세포배양이 불가능한 문제가 있었다. 또한, 비교예2, 3의 세포 배양용 마이크로 캐리어는 손상 및 파괴 없는 완전한 구형 입자 비율이 90%로 측정되면서, 입자 표면이 균일하지 않고 움푹 패인 형상의 입자가 실시예 대비 다량 발생되면서 세포 배양이 불가능할 정도로 세포 배양 효율이 낮아지는 문제가 있었다.
한편, 참고예 1 내지 5의 세포 배양용 마이크로 캐리어는 손상 및 파괴 없는 완전한 구형 입자 비율이 0% 이상 70% 이하로 실시예 대비 낮아 입자의 형상이 상대적으로 실시예에 비해 불균일해지는 한계가 있었다. 또한, 참고예 6 내지 8의 세포 배양용 마이크로 캐리어는 세포 배양시 겉보기 밀도가 1 g/cm3 초과로 높아 배양 중 저속 교반 과정에서 침전이 발생하거나, 비구형 입자에 의해 배양액의 현탁도가 높아져 향후 물리적 충격으로 인해 세포 배양이 불가능할 정도로 세포 배양 효율이 낮아지는 문제가 있었다.

Claims (20)

  1. 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상을 포함한 폴리스티렌계 입자를 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  2. 제1항에 있어서,
    하기 수학식1에 의한 손상 및 파괴 없이 완전한 구형 입자 비율이 90% 초과 100% 이하인, 세포 배양용 마이크로 캐리어:
    [수학식1]
    손상 및 파괴 없는 완전한 구형 입자 비율(%) = (손상 및 파괴 없는 완전한 구형을 갖는 폴리스티렌계 입자의 개수 / 전체 폴리스티렌계 입자의 개수) x 100.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 폴리스티렌계 입자의 겉보기 밀도가 0.95 g/cm3 이상 1.00 g/cm3 미만인, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 폴리스티렌계 입자의 하기 수학식2에 의한 공극율이 0% 이상 8% 미만인, 세포 배양용 마이크로 캐리어:
    [수학식2]
    공극율(%) = [1- (폴리스티렌계 입자의 겉보기밀도 / 폴리스티렌계 입자의 진밀도)] x 100.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 탄화수소 오일의 밀도가 0.75 g/cm3 이상 0.80 g/cm3 이하인, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 탄화수소 오일은 탄소수 12 이상 50 이하인 직쇄 또는 분지쇄의 포화탄화수소 화합물을 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 폴리스티렌계 입자는 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상이 내부에 분산된 폴리스티렌계 고분자를 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 폴리스티렌계 고분자는, 스티렌 단량체 1 중량부; 및 에틸렌계 불포화 가교제 0.033 중량부 초과 3 중량부 미만;의 반응 결과물을 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 폴리스티렌계 입자의 평균 직경이 50 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하인, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 탄화수소 오일은 폴리스티렌계 입자의 중량을 기준으로 30 중량% 이하로 함유되는, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 폴리스티렌계 입자의 전체 표면적을 기준으로, 상기 폴리스티렌계 입자 표면에 존재하는 마이크로포어와 접촉하는 상기 폴리스티렌계 입자의 표면적의 비율이 0.01% 미만인, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 공극의 직경이 0.1 ㎛ 내지 5 ㎛인, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 폴리스티렌계 입자 표면에, 프라이머 고분자층, 세포부착 유도층, 또는 이들의 조합층이 더 포함되는, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  14. 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 존재하에, 스티렌 단량체가 함유된 단량체 조성물의 현탁 중합 반응을 진행하는 단계를 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어 제조방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 단량체 조성물의 중량을 기준으로, 상기 탄화수소 오일의 함량이 10 중량% 이상 30 중량% 이하인, 세포 배양용 마이크로 캐리어 제조방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 단량체 조성물은 스티렌 단량체 1 중량부 및 에틸렌계 불포화 가교제 0.033 중량부 초과 3 중량부 미만이 혼합된 것인, 세포 배양용 마이크로 캐리어 제조방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 단량체 조성물의 현탁 중합 반응은,
    상기 단량체 조성물을 수계 분산액에 혼합하고 전단력을 가하여 상기 단량체 조성물을 수계 분산액에 액적 형태로 균질화하는 단계; 및
    상기 균질화된 단량체 조성물을 300 rpm 이상 1000 rpm 이하의 교반속도로 현탁 중합하는 단계;를 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어 제조방법.
  18. 세포 및 제1항의 세포 배양용 마이크로 캐리어를 포함하는, 세포 배양 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 세포는 섬유아세포, 상피세포, 골아세포, 연골세포, 간세포, 제대혈 세포, 중간엽 줄기세포, CHO 세포, 신장세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 포함하는, 세포 배양 조성물.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 세포 배양용 마이크로 캐리어와 상기 세포의 겉보기 밀도 차이가 0.02 g/cm3 이상 0.20 g/cm3 이하인, 세포 배양 조성물.
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