JPH0216972A - 細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は細胞を培養するために好適な多孔質中空糸膜を
用いた細胞培養方法に関するものである。

（従来の技術） 近年モノクロナール抗体、インターフェロン、インター
ロイキン、ＴＰＡ等の生体由来の生理活性物質の医学、
産業分野での有用性が明らかとなってきている。それに
伴い、これらの有用物質を大量かつ安価に生産するため
の高密度細胞培養方法の必要性が増加している。

特にＫＮＡ８ＦｆＫらによる中空糸膜面に細胞を付着さ
せ、中空糸の中空部に培養液を循環させて、中空糸膜面
を介して細胞に栄養物を供給する方法（特開昭４９−４
１５７９号公報）は効率的に細胞を培養する方法として
注目されている。

中空糸法の利点は、限られた空間内に多くの表面積を確
保することによシ、付着性細胞に対し広−付着面を供給
することが出来、又、中空糸の膜方向に開いた微小な孔
を通して、細胞の生存、増殖に必要な各種栄養物、酸素
などの供給や細胞の代謝によシ生成した老廃物の除去を
拡散または中空糸内外に与えた圧力差によシ生じる液体
の流れに同伴して、極めて容易に行わしめることにある
。その結果、細胞の高密度培養が可能となり、生産物の
濃度、生産性を高めることが出来る。

従来、中空未決細胞培養には、セルロースアセテート（
％公昭５４−６６３４　）、ポリスルホン（特開昭６２
−１３０６７８）などの使用例がみられる。

これらのうち、ポリスルホン中空糸は、セルロース系中
空糸に比較して細胞の付着性、伸展性及び増殖性におい
て優れた特性を有しているが、現在一般に広く使用され
ているポリスチレン製デイツシュに較べると、細胞の付
着性、増殖性、生存性において満足のいくものではない
。

また、細胞培養のよシ改良された方法として、ポリオレ
フィンからなる多孔質膜を用いる方法が提案されている
（特開昭６３−１７６８５）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし、本発明者等の研究によれば、該ポリプロピレン
、ポリエチレン等のポリオレフィンよシなる多孔質膜は
、細胞の付着性、増殖性において充分で々騒ことが明ら
かとなった。この理由にりｈでは定かでないが、一般に
基材表面への細胞の付着性については基材表面のイオン
的特性、親水−疎水性及びそれらの分布状態等が複雑に
関与していると言われており、該中空糸膜面の材質、構
造等が細胞の培養に最適に々つでいるとは言い難いため
と思われる。また、オートクレーブ等によるスチーム殺
菌処理を行うと著しく収縮し、その膜性能が低下するた
め、エチレンオキサイド等のガス殺菌が行われるが、エ
チレンオキサイド等のガスは細胞に対して前件が高く、
又爆発性があシ、危険であり、その取扱いが難しく、構
造の複雑な多孔質中空糸膜ではエチレンオキサイドガス
滅菌後のエチレンオキサイドガスの除去が困難であるた
め、滅菌水又は培養液で長期にわたシ、膜面に付着残存
しているエチレンオキサイドを洗浄する等、手間のかか
る処理が必要であった。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで本発明者等は、上記した様なポリエチレン、ポリ
プロピレン多孔質膜を用いた細胞培養方法の欠点を解決
し、よシ好適な細胞培養方法を得るために、鋭意検討し
た結果、本発明を完成するに至った。

即ち本発明の要旨は、ポリエチレン又はポリプロピレン
からなる多孔質膜の少々くとも一部の表面上にスチレン
、α−メチルスチレンカラ選ばれる一種以上の重合性モ
ノマー及びジビニルベンゼンとからなる架橋重合体を保
持せしめてなる多孔質中空糸膜を用いて細胞を培養する
ことを特徴とする細胞培養方法にある。

本発明に用いる多孔質膜はポリエチレン又はポリプロピ
レンからなる多孔質膜の少なくとも一部の表面にスチレ
ン、α−メチルスチレンから選ばれた一種以上の重合性
モノマーとジビニルベンゼンとからなる架橋重合体を保
持せしめた多孔質膜であ）、例えば特願昭６２−９６４
４０号に記載した方法で製造することができる。

本発明で用いる多孔質膜の孔は、培養液の十分な流れが
得られ、細胞が漏れない様な孔径であれば良く、孔の形
状も特に選ばないが、分画粒子径が１０１〜５μｍ程度
であることが好ましく、（１１〜２μｍ程度であること
がより好ましい。

多孔質膜が延伸法によシ多孔質化されたものである場合
は、この分画粒子径は節部とミクロフィブリルとでかと
まれてなる細孔のフィブリＶ間のスリット径の平均値で
示される。又、空孔率は、同様に培養液の十分な流れが
得られ、実用上十分な強度が保てる範囲で良く、具体的
には１０〜９０チであればよく、４０〜８０係であるこ
とが好ましい。膜厚は同様に実用上十分な強度が保てる
範囲で良いが、およそ２０〜２００μｍ程度であること
が好まし論。

本発明におけるポリエチレンまたはポリプロピレンから
なる多孔質膜とは、中空糸状、平膜、管状膜等の任意の
形態のものを用いることが出来るが、特忙延伸法によシ
製造した中空糸は、中空糸の膜面にミクロフィブリＶと
節部とによって形成されるスリット状の微小空間（細孔
）が３次元的に相互に連通した細孔構造が形成されてい
るため、空孔率が高く、本中空糸を用いて付着性細胞の
培養を行った場合においては、表面に付着した細胞に対
し、連通した細孔構造部を通して、実質的忙充分に均一
に栄養物や酸素などを供給したシ、細胞生産物、代謝産
物等を容易に除去出来、かつ、目詰まシによる性能低下
が少ないという点から延伸法によって得られる多孔質膜
が好ましく、その製造法は特公昭５６−５２１２３号公
報、特開昭５７−４２９１９号公報等に記載さＡた方法
によって製造することができる。

また、本発明においての架橋重合体が保持される多孔質
膜の少なくとも一部の表面とは、細孔表面及び外表面の
一部あるいは全部をいう。

即ち、実質的に架橋重合体が保持されていれば良く、必
ずしも全ての表面に架橋重合体が保持されている必要は
ない。表面に保持される架橋重合体の量は多孔質膜の空
孔率や細孔径にも依存するが、多孔質膜の重量に対して
およそ７〜１５０Ｍ量係、好ましくけ５〜１２０チ、更
に好ましくは１０〜ｊ００チである。

又、架橋重合体を構成する重合性モノマーと架橋性モノ
マーの組成比は、特に限定しないが、およそ９８７２〜
２／９Ｂ（重量部）程度であれば良い。

保持させてなるとは保存中や使用中に容易に脱離しない
程度に該重合物が該細孔表面に結合ないしは密着されて
いることを言う。

ここでスチレン、α−メチＶスチレン、ジビニルベンゼ
ン等のスチレン系ポリマーを用いる理由は、その機構は
不明であるが細胞の接着性、増殖性が向上し、しかも架
橋結合によシ耐熱性が向上して膜の構造に損傷を与えず
に１２０〜１３０℃のスチーム滅菌が可能となシ、よっ
て細胞培養器具に必須の滅菌処理が有害な副次作用なく
容易に行なえるようになるためである。

本発明の方法で用い得る膜を用いた細胞培養容器の例を
第１図、第２図に示す。第１図は中空糸膜２の両端をポ
ツティング材で固定し、中空糸の中空部につながる空間
に連通した端部導管３，３′は栄養物や酸素の供給、老
廃物の除去用に用いることができる。

又、側部導管４．４′は培養開始時の細胞の導入口であ
り、培養が長時間行われて細胞濃度が高まった時はとこ
から老廃物や死亡した細胞を含有する培養液を抜くこと
ができる。

第２図は第１図の細胞培養容器を用いて構成した細胞培
養装置の例であり、ここでは細胞を注入した後に側部導
管４，４′をエンドキャップで封鎖している例を示して
おり、細胞培養の初期や高濃度培養を行わないときはこ
の方式でよい。高濃°度培養の場合は端部導管の一方３
′を封鎖して残シの端部導管３から入った培養液を側部
導管４．４′から抜くようにしてこれを培養液貯槽７に
戻すようにしてもよい。この場合、生きている細胞は膜
に付着していてはがれることはないが、死亡した細胞は
はがれおちてくるので、これを濾過してＰ液を培養液貯
槽７に戻すのが好ましい。

本発明で用いる培養においては、無機塩類、アミノ酸類
、勃類、脂肪酸類、ビタミン類、補酵素類、核酸塩様類
、ホルモン類、アルブミン、トランスフェリン、その他
の種々の細胞の生長因子、血清中の成分等の水溶液を培
養液として用い、目的とする細胞を培養する。

本発明によって培養される細胞としては、付着性細胞が
好ましいが、例えばアフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒ
ｏ細胞）、上皮細胞（９４０ｃｓ）、マウス繊維芽細胞
（５Ｔ３）、チャイニーズハムスター卵細胞（ＣＨＯ）
、チャイニーズハムスター肺＃［芽細胞（Ｖ−７９）、
子宮頚部癌細胞（Ｈｅｌａ）、ヒト２倍体細胞（Ｗニー
３８）などがあげられる。

また、浮遊性細胞としては、例えばリンパ球細胞、骨髄
腫細胞、白血球細胞など、および、これらと他の細胞と
の細胞融合によって得られる雑種細胞（バイブリド−２
）などが挙げられるが、これらの細胞においても付着培
養可能な細胞株が好ましい。

本発明の培養方法をさらに具体的に説明すると、細胞添
加口と培養液の出入口の少なくとも一つを膜を隔てて有
する容器を用い、その一方の空間に細胞を添加し、該細
胞の生育に必要な栄養物や酸素、あるいは該細胞の代謝
により生成した生産物、老廃物の除去を膜壁を通して行
なうことによシ、細胞を培養するととができる。

中空糸膜を用いた場合には、中空糸膜の外側に細胞を置
き、中空糸膜の内側（中空部）に培養液を流通あるいは
循環させるか、あるいは培養液を膜の内側から外側へ、
又はその逆に流通あるいは循環させることによって培養
することにある。本方法を実施することによシ、容易に
栄養物や酸素を供給し、あるいは該培養細胞の生産物お
よび老廃物を除去することが出来る。

（５ｊ！施例） 以下、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこ
れらの実施例で限定されるものではない。

尚、実施例においては多孔質膜としていずれも延伸法に
よって、得られるミクロフィブリルと節部とで形成され
るスリット状の空ｒＩＩＪ（空孔）が３次元的に連通し
た多孔質膜を用い、該多孔質膜の孔径は該スリット状空
間の幅の平均値と長さの平均値とで表現した。

架橋重合体の保持量はテトラリン還流下、多孔質膜を溶
解させる溶解分別法によシ求め多孔質膜に対する重量係
で表示した。

実施例１ ポリエチレン多孔質中空糸（スリット状細孔の幅０．８
μ乳長さ２．２μ翫空孔率７０チ、膜厚５５　（ｔｍ、
内径２７　Ｄ　ｐｍ）をヌチレン５０部、ジビニルベン
ゼン５０部の組成比の混合モノマー２５部、過酸化ベン
ゾイル１０２５部、アセトン１００部からなる溶液中に
１０秒間浸漬した後、溶液中から取シ出し、室温下で３
０分間風乾しアセトンを押設した。

次−で窒素雰囲気中６０℃で２時間加熱するとと妃よシ
モノマー類を重合させた。

このようにして得られた細孔質膜について溶解分別法に
よシ保持された架橋重合体量を求めたところ２ａ７チで
あった。

該多孔質中空糸１００本を集束してポリカーボネート製
円筒容器（８４Ｘ１５０μｍ）に充填し、中空糸端部の
開口状態を保持するように、ウレタン樹脂で両端を固定
して、第１図に示すような細胞培養器１を作成した。

本細胞培養器を１２０℃、３０分の蒸気滅菌後、７０チ
エタノールにて湿潤化し、滅菌蒸留水で十分に洗浄した
後、別に蒸気滅菌したシリコンチューブ５によシ培養液
貯槽７と連結し、第２図に示すような細胞培養装置を作
製した。

この細胞培養器の中空糸外側空間部に付着性細胞である
チャイニーズハムスター肺絨維芽細胞由来のｖ−７９の
ケンタラ４から注入しんとう腺を添加して培養した。細
胞接種量は６Ｘ１０”個、培養液は１０％ウシ胎児血清
添加１ｆｃＭ培地１ｔを培養液貯槽７に入れ、培養液貯
槽には１０チＣＯ，添加空気をフィμター８を介して少
量ずつ導入してバブリングさせた。

培養は、ｖ−７９細胞を側部導管４よシ注入し、培養器
を振盪して細胞を均一に分散させ、３時間放置した後、
装置全体を３７℃の恒温槽中に設置し、ポンプ６によシ
培養液を０．５ゴ／ｈｒで循環させながらおとなった。

なお、培養液は３日目に１度新しい培養液と交換した。

培養開始後５日目に、培養器をダルベツコのＰＢＳ（−
）で洗浄後、トリプシン［Ｌ２５１ＫＤＴＡ（１０２優
を含むダルベツコＰＢＢにて、細胞を回収し、七Ｍカウ
ンターにて細胞数を測定した。また、回収した細胞を０
．０２５％トリベンプＶ−染色をおこない、細胞生存率
を求め生細胞数を算出した結果、生細胞数は：１ｊＸ１
０６個であった。

く比較例〉 実施例１１ｃ用すたのと同様なポリエチレン製中空糸の
スチレン、ジビニルベンゼンを保持すせる前のもの１０
０本を集束して、ポリカーボネート製円筒容器（８φＸ
　１５０　ｍ　）に充填し、ウレタン樹脂をポツティン
グ材として両端を固定した細胞培養器を作製した。

細胞培養器をエチレンオキサイドガス殺菌後、７０チエ
タノールにて親水化した後、滅菌蒸留水で充分洗浄した
。

本細胞培養器を用いて実施例１と同様にして細胞培養装
置を作製し、上記と同様にしてＶ−７９Ｎｉ胞の培養を
行った結果、５日後の生細胞数は１．５ＸｊＯ’個であ
った。

〔発明の効果〕

以上述べたように本発明の細胞培養方法はポリエチレン
又はポリプロピレンを基材としている多孔質膜を用いて
込るため、強度特性に優れ膜の取扱−が容易であシ、し
かもその上にスチレン、α−メチルスチレンから選ばれ
る一種以上の重合性モノマーとジビニルベンゼンとから
々る架橋重合体を保持せしめた膜を用いているため、培
養前のスチーム滅菌が可能であシ、しかも他の素材から
なる膜に較べ細胞の付着性に優れ、増殖性に優れるため
、本方法によれば良好な細胞培養が行えるという特徴を
有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は細胞培養器の１例を示す模式断面図であシ、第
２図は細胞培養器を用いた細胞培養装置の１例を示す図
である。 図において、１：Ｍ胞培養容器、２：多孔質中空糸膜、
３：端部導管、４：側部導管、５：シリコンチューブ、
６：チューブポンプ、７：培養液貯槽、８：フィルター
を示す。 纂１図 手続補正書 昭和６３年１２月入日 地２図 １　事件の表示 特願昭６３−１６７１１５号 ２、発明の名称 細胞培養方法 ３、補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 東京都中央区京橋二丁目３番１９号 （６０３）三菱レイヨン株式会社 取締役社長　未井彌太部 ４、代理人　　　〒１０４東京都中央区京橋二丁目３番
１９号自発補正 ６、補正の対象 １）明細書第９頁第１３行の「この場合」を「特に、付
着性を有する細胞を培養する場合は」に訂正する。 ２）同頁第１７行の「好ましい。」の次に「又、培養液
の流れ方向を逆にする方法、膜を介して培養液を交互に
流す方法も高濃度培養の場合は有効である。」を加入す
る。 ３）明細書第１０頁第１５行の「バイブリド−２」を「
ハイブリドーマ」に訂正する。 ４）同頁第１７行の「細胞株」を「細胞株Ｊに訂正する
。 ５）明細書第１１頁第２行の「酸素」と「、あるいは」
の間に「を供給し」を加入する。 ６）明細書第１２頁第１４行の「挿設」を「揮発」に訂
正する。 ７）同頁第１７行の「細孔質」を「多孔質」に訂正する
。 ８）明細書第１３行第１行の「１５０μｍ」をｒ１５０
ｍｍ」に訂正する。 ９）同頁第１２行乃至第１３行の「のケンタラ４から注
入しんどう腺」を削除する。 １０）同頁第１３行のｒ６ｘｌｏ５Ｊを「３×１０５」
に訂正する。 １１）明細書第１４頁第６行のｒＰＢＳＪを「ＰＢＳ　
（−）Ｊに訂正する。 １２）同頁第８行乃至第９行の「トリベンブルー」を「
トリバンブルー」に訂正する。 手続補正書 平成　１年　９月２０日 １）手続補正書第２頁第１８行の「第１３行」を「第１
３頁」に訂正する。 事件の表示 特願昭６３−１６７１１、 発明の名称 細胞培養方法 補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 東京都中央区京橋二丁目３番１９号 （６０３）三菱レイヨン株式会社 取締役社長　永井彌太部

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリエチレン又はポリプロピレンからなる多孔質
   膜の少なくとも一部の表面上にスチレン、α−メチルス
   チレンから選ばれる一種以上の重合性モノマー及びジビ
   ニルベンゼンとからなる架橋重合体を保持せしめてなる
   多孔質中空糸膜を用いて細胞を培養することを特徴とす
   る細胞培養方法。