WO2022085762A1 - 皮膚感作性測定試薬、化合物、及び皮膚感作性の測定方法 - Google Patents

皮膚感作性測定試薬、化合物、及び皮膚感作性の測定方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a skin sensitization measuring reagent, a compound, and a skin sensitizing measuring method.
  • Skin sensitization is not limited to symptoms such as local blisters and erythema in the area exposed to the substance, but may be accompanied by a serious and life-threatening systemic allergic reaction called anaphylaxis.
  • skin sensitization is considered to be one of the important toxicity because it requires management to avoid exposure for a long period of time once it develops.
  • test methods such as Test
  • Test methods have been widely used for many years.
  • research and development of alternative methods for animal experiments have been promoted due to ethical and social demands such as animal welfare.
  • In vitro tests include ARE-Nrf2 luciferase KeratinoSens TM test method (KeratinoSens is a registered trademark), LuSens (ARE-NrF2 luciferase Lusense Test cell) Sensitization Test) and IL-8 Lucassay are known.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 describe methods for utilizing two types of peptides (cysteine peptide and lysine peptide) as nucleophiles. Further, Patent Documents 1 and 2 describe a skin sensitization measuring reagent and a skin sensitizing measuring method using an aryl ring-introduced cysteine derivative and an aryl ring-introduced lysine derivative as a nucleophile. (Also called ADRA).
  • Non-Patent Documents 1 and 2 and Patent Documents 1 and 2 two types of reagents containing cysteine and lysine are separately chemically reacted with a test substance, measured and quantified separately, and depletion. ) Is calculated, so it takes time to evaluate. Therefore, a test method for detecting and evaluating a skin sensitizing substance using a peptide containing these two types of amino acids has also been reported.
  • the synthetic heptapeptide Cor1C-420 (Ac-Asn-Lys-Lys-Cys-Asp-Leu-Phe) (N of human Coronin 1 protein, which is a site showing extremely high reactivity with an electrophoretic reagent).
  • This is a test method for measuring by LC-MS (liquid chromatography / mass spectrum analysis) using a sequence derived from the sequence around cysteine at the 420th residue from the end (Non-Patent Document 3), and all of them have low detection sensitivity. Therefore, it is a test method that cannot be optically detected such as UV and visible light. Further, it is not effective to shorten the measurement time by including cysteine and lysine.
  • Non-Patent Document 4 describes that (1) the peptide-test substance adduct (covalent bond) and the oxidation of the peptide can be distinguished, and (2) the concentration of the test substance in the reaction solution can be lowered, so that the test substance is precipitated. (3) Since the prepared concentration of the test substance can be lowered, the problem of solubility of the test substance is reduced, and (4) There is no problem of co-eluting because it is an LC-MS measurement. (5) Five points are described in which a highly reactive test substance can be evaluated more accurately by performing kinetic measurement.
  • Non-Patent Document 5 includes three types of cysteine peptide and lysine peptide used in DPRA (Direct Peptide Reactionity Assay) described in Non-Patent Documents 1 and 2, and synthetic heptapeptide Cor1C-420 described in Non-Patent Document 3. It is stated that high prediction accuracy can be obtained by evaluating. Further, Patent Document 3 describes a skin sensitization detection reagent in which a fluorescent dye is bound to the end of a peptide having an amino group and a thiol group in the same molecule.
  • Gerberick G.F., Vassallo, J.D., Bailey, R.E., Chainy, J.G., Morrall, S.W. and Lepoittevin, J.P. Gerberick, G.F., Vassallo, J.D., Foertsch, L.M., Price, B.B., Chainy, J.G. and Lepoittevin, J.P. (2007). Quantification of chemical peptide reactivity for screening contact , 417-27. Denny MK, Richards AM, Wemke GR, Shyr Y, Liebler DC. (2006) Cytosolic and nuclear protein targets of thiol-reactive electrophiles.
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 2011-59102 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2014-37995 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2009-22466
  • Non-Patent Documents 1 and 2 the molar absorption coefficients of the two peptides used themselves are low, and only a short wavelength of 220 nm can be detected. Therefore, the residual ratio of these peptides is low.
  • the quantification sensitivity is low and that phenomena such as co-elution between the peptide and the test substance are likely to occur and the quantification is often difficult.
  • the method described in Non-Patent Document 3 is a test method in which optical detection of UV, visible light, etc. is difficult, there is a problem that evaluation by mass spectrometry is required.
  • this test method does not have the effect of shortening the measurement time by including cysteine and lysine.
  • Non-Patent Document 4 does not describe efficiency improvement by shortening the measurement time.
  • the method described in Non-Patent Document 5 has a problem that the optical quantitative sensitivity is low.
  • the peptide used in the method described in Patent Document 3 has a thiol group derived from cysteine and an ⁇ -amino group of an amino acid, but this peptide has low reactivity with a test substance having weak skin sensitization. , It may be judged as false negative, which has been a problem.
  • the present invention solves the problem of providing a skin sensitization measuring reagent, a compound, and a skin sensitization measuring method capable of measuring the sensitization of a test substance with high sensitivity using one kind of reagent. It should be an issue.
  • the present inventors have measured skin sensitivities of organic compounds having a mercapto group and a hydrazide structure and having an absorption spectrum in the ultraviolet, visible light or near-infrared region. We have found that it can be used as a reagent, and have completed the present invention. According to the present invention, the following inventions are provided.
  • a 1 represents a nitrogen atom or the following linking group.
  • R 11 , R 12 , R 13 and R 14 are independently hydrogen atoms, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms, an alkynyl group having 2 to 10 carbon atoms, and 3 to 10 carbon atoms.
  • -CO-NJ 1- or -NH-CO-NH- may be contained, and J 1 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and the above-mentioned alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, etc.
  • the cycloalkyl group or cycloalkenyl group is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, a cycloalkenyl group having 5 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercapto group, a mercaptomethyl group, a hydroxyl group, a phenyl group, or a hydroxyphenyl. It may have a substituent selected from a group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, or a frill group. * Indicates the connection position with X 1 , Y 1 , and Z 1 .
  • X 1 and X 2 are an alkyl group having 1 or more carbon atoms having one or more mercapto groups, an alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, and 2 to 2 carbon atoms having one or more mercapto groups.
  • O)-, -NJ 2 -CO-, -CO-NJ 2- , or -NH-CO-NH- may be contained, where J 2 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • the above-mentioned alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, cycloalkyl group, or cycloalkenyl group is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, a cycloalkenyl group having 5 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, or a mercaptomethyl group.
  • Y1 and Y2 represent groups having 6 to 20 carbon atoms including a structure having an absorption spectrum in the ultraviolet, visible light or near-infrared region.
  • Z 1 and Z 2 indicate -CO-NR 21 NR 22 R 23 , and R 21 , R 22 and R 23 each independently indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • a 10 represents a nitrogen atom or a trivalent linking group.
  • X 10 is an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, an alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, and an alkynyl having 2 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups.
  • It represents an alkyl group, a heteroalkylalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, or a mercapto group, and these are -O-, -C (O)-, -OC (O)-in the molecular chain.
  • -NJ 101 -CO-, -CO-NJ 101- , or -NH-CO-NH- may be contained, wherein J 101 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is the above-mentioned alkyl.
  • the group, alkenyl group, alkynyl group, cycloalkyl group, or cycloalkenyl group is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, a cycloalkenyl group having 5 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercaptomethyl group, a hydroxyl group, and the like. It may have a substituent selected from a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, or a frill group.
  • Y 10 represents a group having 6 to 20 carbon atoms including a structure having an absorption spectrum in the ultraviolet, visible light or near-infrared region.
  • L represents an amino group.
  • a 3 represents a trivalent hydrocarbon group having 1 or 2 carbon atoms.
  • R 3 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, which are -O-, -C (O)-, and -OC (O) in the molecular chain.
  • J 31 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group of is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercapto group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, and the like.
  • X 3 has an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, and 7 to 12 carbon atoms having one or more mercapto groups. It represents an arylalkyl group, a heteroalkylalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, or a mercapto group, and these are -O-, -C (O)-, -OC (O) in the molecular chain.
  • J 32 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group is composed of a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, or a frill group. It may have a substituent of choice.
  • Y3 represents a group having 6 to 20 carbon atoms including a structure having an absorption spectrum in the ultraviolet, visible light or near-infrared region.
  • Z 3 indicates -CO-NR 31 NR 32 R 33 , and R 31 , R 32 , and R 33 each independently indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • A4 represents a trivalent hydrocarbon group having 1 or 2 carbon atoms.
  • R4 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, which are -O-, -C (O)-, and -OC (O) in the molecular chain.
  • J 41 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group of is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercapto group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, and the like.
  • X4 has an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, and 7 to 12 carbon atoms having one or more mercapto groups. It represents an arylalkyl group, a heteroalkylalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, or a mercapto group, and these are -O-, -C (O)-, -OC (O) in the molecular chain.
  • J 42 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group is composed of a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, or a frill group. It may have a substituent of choice.
  • Y4 represents a group having 6 to 20 carbon atoms including a structure having an absorption spectrum in the ultraviolet, visible light or near-infrared region.
  • Z 4 indicates -CO-NR 41 NR 42 R 43 , and R 41 , R 42 , and R 43 each independently indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • a 5 represents a trivalent hydrocarbon group having 1 or 2 carbon atoms.
  • R 5 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, which are -O-, -C (O)-, and -OC (O) in the molecular chain.
  • J 51 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group of is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercapto group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, and the like.
  • X 5 has an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, and 7 to 12 carbon atoms having one or more mercapto groups. It represents an arylalkyl group, a heteroalkylalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, or a mercapto group, and these are -O-, -C (O)-, -OC (O) in the molecular chain.
  • J 52 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group is composed of a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, or a frill group. It may have a substituent of choice.
  • Y5 represents a group having 6 to 20 carbon atoms including a structure having an absorption spectrum in the ultraviolet, visible light or near-infrared region.
  • Z 5 indicates -CO-NR 51 NR 52 R 53 , and R 51 , R 52 , and R 53 each independently indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • Q indicates a hydrogen atom, a carboxyl group, a hydroxyl group, or a primary amide structure, or -CO-NR 5a NR 5b R 5c , and R 5a , R 5b , and R 5c are independent hydrogen atoms. Alternatively, it indicates an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • R 6 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, which are -O-, -C (O)-, and -OC (O) in the molecular chain.
  • R 6 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, which are -O-, -C (O)-, and -OC (O) in the molecular chain.
  • )-, -NJ 61 -CO-, -CO-NJ 61- , or -NH-CO-NH- may be contained, where J 61 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group of is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercapto group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, and the like. Alternatively, it may have a substituent selected from a frill group.
  • X 6 has an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, and 7 to 12 carbon atoms having one or more mercapto groups. It represents an arylalkyl group, a heteroalkylalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, or a mercapto group, and these are -O-, -C (O)-, -OC (O) in the molecular chain.
  • J 62 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group is composed of a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, or a frill group. It may have a substituent of choice.
  • Z 6 indicates -CO-NR 61 NR 62 R 63 , and R 61 , R 62 , and R 63 each independently indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • n indicates 0 or 1 and represents m represents 0 or 1.
  • R 7 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, which are -O-, -C (O)-, and -OC (O) in the molecular chain.
  • J 71 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercapto group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, and the like.
  • X 7 has an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, and 7 to 12 carbon atoms having one or more mercapto groups. It represents an arylalkyl group, a heteroalkylalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, or a mercapto group, and these are -O-, -C (O)-, -OC (O) in the molecular chain.
  • J 72 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group is composed of a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, or a frill group. It may have a substituent of choice.
  • W indicates NR 71 -NR 72 R 73
  • R 71 , R 72 , and R 73 indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • n indicates 0 or 1.
  • R 3 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, which are -O-, -C (O)-, and -OC (O) in the molecular chain.
  • )-, -NJ 31 -CO-, -CO-NJ 31- , or -NH-CO-NH- may be contained, where J 31 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group of is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercapto group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, and the like. Alternatively, it may have a substituent selected from a frill group.
  • X 3 has an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, and 7 to 12 carbon atoms having one or more mercapto groups. It represents an arylalkyl group, a heteroalkylalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, or a mercapto group, and these are -O-, -C (O)-, -OC (O) in the molecular chain.
  • J 32 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group is composed of a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, or a frill group. It may have a substituent of choice.
  • Y3 represents a group having 6 to 20 carbon atoms including a structure having an absorption spectrum in the ultraviolet, visible light or near-infrared region.
  • Z 3 indicates -CO-NR 31 NR 32 R 33 , and R 31 , R 32 , and R 33 each independently indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • A4 represents a trivalent hydrocarbon group having 1 or 2 carbon atoms.
  • R4 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, which are -O-, -C (O)-, and -OC (O) in the molecular chain.
  • J 41 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group of is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercapto group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, and the like.
  • X4 has an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, and 7 to 12 carbon atoms having one or more mercapto groups. It represents an arylalkyl group, a heteroalkylalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, or a mercapto group, and these are -O-, -C (O)-, -OC (O) in the molecular chain.
  • J 42 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group is composed of a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, or a frill group. It may have a substituent of choice.
  • Y4 represents a group having 6 to 20 carbon atoms including a structure having an absorption spectrum in the ultraviolet, visible light or near-infrared region.
  • Z 4 indicates -CO-NR 41 NR 42 R 43 , and R 41 , R 42 , and R 43 each independently indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • a 5 represents a trivalent hydrocarbon group having 1 or 2 carbon atoms.
  • R 5 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, which are -O-, -C (O)-, and -OC (O) in the molecular chain.
  • J 51 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercapto group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, and the like.
  • X 5 has an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, and 7 to 12 carbon atoms having one or more mercapto groups. It represents an arylalkyl group, a heteroalkylalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, or a mercapto group, and these are -O-, -C (O)-, -OC (O) in the molecular chain.
  • J 52 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group is composed of a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, or a frill group. It may have a substituent of choice.
  • Y5 represents a group having 6 to 20 carbon atoms including a structure having an absorption spectrum in the ultraviolet, visible light or near-infrared region.
  • Z 5 indicates -CO-NR 51 NR 52 R 53 , and R 51 , R 52 , and R 53 each independently indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • Q indicates a hydrogen atom, a carboxyl group, a hydroxyl group, or a primary amide structure, or -CO-NR 5a NR 5b R 5c , and R 5a , R 5b , and R 5c are independent hydrogen atoms. Alternatively, it indicates an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • R 6 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, which are -O-, -C (O)-, and -OC (O) in the molecular chain.
  • R 6 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, which are -O-, -C (O)-, and -OC (O) in the molecular chain.
  • )-, -NJ 61 -CO-, -CO-NJ 61- , or -NH-CO-NH- may be contained, where J 61 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group of is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercapto group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, and the like. Alternatively, it may have a substituent selected from a frill group.
  • X 6 has an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, and 7 to 12 carbon atoms having one or more mercapto groups. It represents an arylalkyl group, a heteroalkylalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, or a mercapto group, and these are -O-, -C (O)-, -OC (O) in the molecular chain.
  • J 62 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group is composed of a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, or a frill group. It may have a substituent of choice.
  • Z 6 indicates -CO-NR 61 NR 62 R 63 , and R 61 , R 62 , and R 63 each independently indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • n indicates 0 or 1 and represents m represents 0 or 1.
  • R 7 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, which are -O-, -C (O)-, and -OC (O) in the molecular chain.
  • J 71 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group of is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercapto group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, and the like.
  • X 7 has an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, and 7 to 12 carbon atoms having one or more mercapto groups. It represents an arylalkyl group, a heteroalkylalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, or a mercapto group, and these are -O-, -C (O)-, -OC (O) in the molecular chain.
  • J 72 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group is composed of a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, or a frill group. It may have a substituent of choice.
  • W indicates NR 71 -NR 72 R 73
  • R 71 , R 72 , and R 73 indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • n indicates 0 or 1.
  • test substance is at least one of a plant extract consisting of fragrances, essential oils, polymer compounds, pharmaceuticals, pesticides, foods, chemical products, and natural product-derived components, according to ⁇ 11>.
  • a method for measuring skin sensitization ⁇ 13> The measurement of skin sensitization according to ⁇ 11> or ⁇ 12>, which comprises chromatographically treating the reaction product obtained in the step of reacting the skin sensitization measuring reagent with the test substance.
  • Method. ⁇ 14> The optical measurement is a measurement using a fluorescence detector, and the excitation wavelength is 200 to 600 nm and the fluorescence wavelength is 200 to 800 nm, whichever is one of ⁇ 11> to ⁇ 13>. The method for measuring skin sensitization described.
  • the sensitization property of a test substance can be measured with high sensitivity using one kind of reagent.
  • FIG. 1 shows the results of calculating the residual ratio of compound 1 immediately after preparation of the solution (0 hours) and after 24 hours.
  • FIG. 2 shows the results of measuring the fluorescence intensity (peak area in HPLC) immediately after preparation of the solution (0 hours) for compound 1.
  • FIG. 3 shows the No. 1 shown in Table 2. The result of comparing the depletion of each nucleophile in the substance 1 to 8 is shown.
  • FIG. 4 shows the No. 1 shown in Table 2. The result of comparing the depletion of each nucleophile in 9 to 15 substances is shown.
  • the measurement of skin sensitization means to include the test of skin sensitization, and also includes the determination of the presence or absence of skin sensitization based on a certain standard, and the quantitative measurement of skin sensitization. It means.
  • Skin sensitization is caused by a complex process consisting of many stages. The first event is that the test substance penetrates through the skin and then covalently binds to proteins in the skin. Therefore, by evaluating this covalent bond, it is considered possible to predict whether or not the test substance of interest is skin sensitizing. It is known that the reaction between the protein in the skin and the test substance is due to about five organic chemical reactions. The amino acids involved in these five reactions are known to be the SH group of cysteine and the NH 2 group of lysine.
  • the present invention by using an organic compound having an absorption spectrum in the ultraviolet, visible light or near-infrared region, it is possible to quantify with a dilute evaluation reagent and the concentration of the test substance, so that precipitation due to poor dissolution does not occur. Quantitability can be improved.
  • an organic compound having a mercapto group and a hydrazide structure in the same molecule it has become possible to evaluate skin sensitization in one operation. Since the hydrazide group has high reactivity with a aldehyde-based test substance having low sensitivity or the stability of the reaction product is high, the conventional evaluation method which may be a false negative in the present invention. The false negative rate can be reduced as compared with.
  • the skin sensitization measuring reagent of the present invention contains an organic compound having a mercapto group and a hydrazide structure and having an absorption spectrum in the ultraviolet, visible light or near-infrared region as a measurement main agent.
  • the organic compound used in the present invention is a compound having an absorption spectrum in the ultraviolet, visible light or near-infrared region and exhibiting absorption in the as-is or solution state, preferably in the wavelength region of 190 to 2500 nm, and more preferably. It is a compound that exhibits absorption in the region of a wavelength of 200 to 700 nm.
  • the organic compound used in the present invention is preferably a compound having light emission at 200 to 800 nm, more preferably a compound having light emission at 200 to 700 nm, and further preferably a compound having light emission at 250 to 650 nm.
  • the organic compound used in the present invention is preferably a compound represented by the following formula (1) or (2), and more preferably a compound represented by the following formula (1).
  • a 1 represents a nitrogen atom or the following linking group.
  • R 11 , R 12 , R 13 and R 14 are independently hydrogen atoms, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms, an alkynyl group having 2 to 10 carbon atoms, and 3 to 10 carbon atoms. It represents 10 cycloalkyl groups or cycloalkenyl groups with 3-10 carbon atoms, which are -O-, -C (O)-, -OC (O)-, -NJ 1 -CO-, in the molecular chain.
  • J 1 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and the above-mentioned alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, etc.
  • the cycloalkyl group or cycloalkenyl group is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, a cycloalkenyl group having 5 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercapto group, a mercaptomethyl group, a hydroxyl group, a phenyl group, or a hydroxyphenyl.
  • X 1 and X 2 are an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, an alkenyl group having 1 or more mercapto groups and 2 to 10 carbon atoms, and 2 to 2 carbon atoms having one or more mercapto groups.
  • J 2 represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the group, alkenyl group, alkynyl group, cycloalkyl group, or cycloalkenyl group is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, a cycloalkenyl group having 5 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercaptomethyl group, a hydroxyl group, and the like.
  • Y1 and Y2 represent groups having 6 to 20 carbon atoms including a structure having an absorption spectrum in the ultraviolet, visible light or near-infrared region.
  • Z 1 and Z 2 indicate -CO-NR 21 NR 22 R 23 , and R 21 , R 22 and R 23 each independently indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • R 11 , R 12 , R 13 and R 14 are preferably hydrogen atoms or alkyl groups having 1 to 10 carbon atoms independently of each other.
  • R 11 , R 12 , R 13 and R 14 are more preferably hydrogen atoms or methyl groups.
  • R 11 , R 12 , R 13 and R 14 are particularly preferably hydrogen atoms.
  • X 1 and X 2 preferably have an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, an arylalkyl group having 7 to 12 carbon atoms having one or more mercapto groups, and one or more mercapto groups. It shows a heteroalkylalkyl group or a mercapto group having 3 to 10 carbon atoms, and these are -O-, -C (O)-, -OC (O)-, -NJ2 - CO-, -CO in the molecular chain. It may contain -NJ 2- or -NH-CO-NH-, where J 2 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • Y 1 and Y 2 preferably represent groups having 10 to 20 carbon atoms, including structures having absorption spectra in the ultraviolet, visible or near infrared regions.
  • R 21 , R 22 and R 23 are preferably hydrogen atoms.
  • the organic compound used in the present invention is more preferably a compound represented by the following formula (10).
  • a 10 represents a nitrogen atom or a trivalent linking group.
  • X 10 is an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, an alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, and an alkynyl having 2 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups.
  • It represents an alkyl group, a heteroalkylalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, or a mercapto group, and these are -O-, -C (O)-, -OC (O)-in the molecular chain.
  • -NJ 101 -CO-, -CO-NJ 101- , or -NH-CO-NH- may be contained, wherein J 101 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is the above-mentioned alkyl.
  • alkenyl group, alkynyl group, cycloalkyl group, or cycloalkenyl group is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, a cycloalkenyl group having 5 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercaptomethyl group, a hydroxyl group, and the like. It may have a substituent selected from a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, or a frill group.
  • Y 10 represents a group having 6 to 20 carbon atoms including a structure having an absorption spectrum in the ultraviolet, visible light or near-infrared region.
  • L represents an amino group.
  • a 10 preferably represents a trivalent linking group, more preferably Is shown.
  • the X 10 preferably has an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, an arylalkyl group having 7 to 12 carbon atoms having one or more mercapto groups, and 3 carbon atoms having one or more mercapto groups. It shows ⁇ 10 heteroalkylalkyl groups or mercapto groups, which are -O-, -C (O)-, -OC (O)-, -NJ 101-CO-, -CO-NJ 101 in the molecular chain. -Or -NH-CO-NH- may be contained, and J 101 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • Y 10 preferably represents a group having 10 to 20 carbon atoms including a structure having an absorption spectrum in the ultraviolet, visible light or near-infrared region.
  • the structure having an absorption spectrum in the ultraviolet, visible light or near-infrared region means the structure of the compound having absorption in the region from 200 nm to 2500 nm.
  • the compound having absorption in the region from 200 nm to 2500 nm include naphthalene derivative, anthracene derivative, phenanthrene derivative, tetracene derivative, pentasenne derivative, benzopyrene derivative, chrysen derivative, pyrene derivative, triphenylene derivative, corannelen derivative, coronen derivative and ovalen.
  • aclysine derivatives luciferin derivatives, pyranine derivatives, stilben derivatives, benzofuran derivatives, dihydroquinoxalinone derivatives, phthalimidinyl derivatives, dansyl derivatives, merocyanine derivatives, perylene derivatives, acridin derivatives, perylene derivatives, luciferin derivatives, pyranine derivatives, stilben derivatives, Rhodamine derivative, coumarin derivative, 4- (dicyanomethylene) -2-methyl-6- (4-dimethylaminostyryl) -4H-pyran (DCM) derivative, pyrromethene derivative, fluorescein derivative, umbelliferone derivative, benzothiazole derivative, Examples thereof include benzoxaziazole derivatives, ciconin derivatives, fluoranthene derivatives, carbazole derivatives, tetraphen derivatives, chrysene derivatives, acenaften derivatives, fluorene derivative
  • Diazol NBD-CL
  • Fluorothein Isothiocyanate FITC
  • Rhodamine B Isothiocyanate RBITC
  • 4-Fluoro-7-Nitro-2,1,3-benzoxaziazole NBD-F
  • 4- (N, N-dimethylaminosulfonyl) -7-fluoro-2,1,3-benzoxaziazole DBD-F
  • 4- (N-phthalimidinyl) benzenesulfonic acid chloride PISYL-CL
  • 4-amino Sulfonyl-7-fluoro-2,1,3-benzoxaziazole ABD-F
  • N- [4- (6-dimethylamino-2-benzofuranyl) phenyl] maleimide DBPM
  • 2- (4-maleimide) Phenyl) -6-methylbenzothiazole MPM
  • N- (9-acridinyl) maleimide NAM
  • the organic compound used in the present invention is more preferably a compound represented by the following formula (3), (4) or (5). According to the present invention, a compound represented by the following formula (3), (4) or (5) is provided.
  • a 3 , A 4 and A 5 represent trivalent hydrocarbon groups having 1 or 2 carbon atoms.
  • R 3 , R 4 , and R 5 represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, which are -O-, -C (O) in the molecular chain.
  • )-, -OC (O)-, -NJ 31 -CO-, -CO-NJ 31- , or -NH-CO-NH- may be contained, in which J 31 is a hydrogen atom or has 1 to 3 carbon atoms.
  • the above-mentioned alkyl group or cycloalkyl group is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercapto group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, or a pyridyl group. , A naphthyl group, a thienyl group, or a substituent selected from a frill group.
  • X 3 , X 4 and X 5 have an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, and one or more mercapto groups. It represents an arylalkyl group having 7 to 12 carbon atoms, a heteroalkylalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, or a mercapto group, which are -O-, -C (O)-in the molecular chain.
  • J 32 is a hydrogen atom or an alkyl having 1 to 3 carbon atoms.
  • the above-mentioned alkyl group or cycloalkyl group indicates a group, and the cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group and a thienyl group.
  • Y3 , Y4, and Y5 represent groups having 6 to 20 carbon atoms including structures having absorption spectra in the ultraviolet, visible, or near - infrared regions.
  • Z 3 indicates -CO-NR 31 NR 32 R 33 , and R 31 , R 32 , and R 33 each independently indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • Z 4 indicates -CO-NR 41 NR 42 R 43 , and R 41 , R 42 , and R 43 each independently indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • Z 5 indicates -CO-NR 51 NR 52 R 53 , and R 51 , R 52 , and R 53 each independently indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • Q indicates a hydrogen atom, a carboxyl group, a hydroxyl group, or a primary amide structure, or -CO-NR 5a NR 5b R 5c , and R 5a , R 5b , and R 5c are independent hydrogen atoms. Alternatively, it indicates an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • A3 , A4, and A5 are preferably A3, A4 , and A5.
  • R 3 , R 4 , and R 5 preferably represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, and more preferably a hydrogen atom or a methyl group.
  • the X 3 , X 4 and X 5 preferably have an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, an arylalkyl group having 7 to 12 carbon atoms having one or more mercapto groups, and one mercapto group.
  • Y3 , Y4, and Y5 preferably represent groups having 10 to 20 carbon atoms, including structures having absorption spectra in the ultraviolet, visible, or near-infrared regions.
  • R 21 , R 22 and R 23 preferably represent a hydrogen atom.
  • Q preferably exhibits a primary amide structure.
  • Y 1 , Y 2 , Y 3 , Y 4 , Y 5 , and Y 10 are preferably groups that emit fluorescence.
  • the organic compound used in the present invention is more preferably a compound represented by the following formula (6). According to the present invention, a compound represented by the following formula (6) is provided.
  • R 6 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, which are -O-, -C (O)-, and -OC (O) in the molecular chain.
  • )-, -NJ 61 -CO-, -CO-NJ 61- , or -NH-CO-NH- may be contained, where J 61 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercapto group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, and the like. Alternatively, it may have a substituent selected from a frill group.
  • X 6 has an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, and 7 to 12 carbon atoms having one or more mercapto groups. It represents an arylalkyl group, a heteroalkylalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, or a mercapto group, and these are -O-, -C (O)-, -OC (O) in the molecular chain.
  • J 62 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group is composed of a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, or a frill group. It may have a substituent of choice.
  • Z 6 indicates -CO-NR 61 NR 62 R 63 , and R 61 , R 62 , and R 63 each independently indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • n indicates 0 or 1 and represents m represents 0 or 1.
  • R6 preferably represents a hydrogen atom or a methyl group.
  • the X 6 is preferably an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, an arylalkyl group having 7 to 12 carbon atoms having one or more mercapto groups, and 3 carbon atoms having one or more mercapto groups.
  • ⁇ 10 heteroalkylalkyl groups or mercapto groups are shown, which are -O-, -C (O)-, -OC (O)-, -NJ 62-CO-, -CO-NJ 62 in the molecular chain.
  • J 62 indicates a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • R 61 , R 62 , and R 63 preferably represent a hydrogen atom.
  • n preferably indicates 1.
  • m preferably indicates 0.
  • the organic compound used in the present invention is particularly preferably a compound represented by the following formula (7). According to the present invention, a compound represented by the following formula (7) is provided.
  • R 7 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, which are -O-, -C (O)-, and -OC (O) in the molecular chain.
  • )-, -NJ 71 -CO-, -CO-NJ 71- , or -NH-CO-NH- may be contained, where J 71 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group is a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a mercapto group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, and the like. Alternatively, it may have a substituent selected from a frill group.
  • X 7 has an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, and 7 to 12 carbon atoms having one or more mercapto groups. It represents an arylalkyl group, a heteroalkylalkyl group having 3 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, or a mercapto group, and these are -O-, -C (O)-, -OC (O) in the molecular chain.
  • J 72 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms and is described above.
  • the alkyl group or cycloalkyl group is composed of a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, an amino group, a cyano group, a hydroxyl group, a carboxy group, a phenyl group, a hydroxyphenyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, a thienyl group, or a frill group. It may have a substituent of choice.
  • W indicates NR 71 -NR 72 R 73 , and R 71 , R 72 , and R 73 indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • n indicates 0 or 1.
  • R 7 preferably represents a hydrogen atom or a methyl group.
  • the X 7 is preferably an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms having one or more mercapto groups, an arylalkyl group having 7 to 12 carbon atoms having one or more mercapto groups, and 3 carbon atoms having one or more mercapto groups.
  • ⁇ 10 heteroalkylalkyl groups or mercapto groups are shown, which are -O-, -C (O)-, -OC (O)-, -NJ 72-CO-, -CO-NJ 72 in the molecular chain.
  • J 72 indicates a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • R 71 , R 72 , and R 73 preferably represent a hydrogen atom.
  • n preferably indicates 1.
  • Alkyl groups having 1 to 10 carbon atoms include, for example, methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, isopentyl group, neopentyl group, and the like. Examples thereof include a tert-pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, an octyl group, a nonyl group, and a decyl group.
  • the alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms is, for example, a vinyl group, a 1-propenyl group, a 2-propenyl group, a 1-butenyl group, a 2-butenyl group, a 3-butenyl group, a 1,3-butenyl group, 1-.
  • Examples thereof include a pentenyl group, a 1-hexenyl group, a 1-heptenyl group, a 1-octenyl group, a 1-nonenyl group, a 1-decenyl group and the like.
  • the alkynyl group having 2 to 10 carbon atoms is, for example, an ethynyl group, a 1-propynyl group, a 1-butynyl group, a 1-pentynyl group, a 1-hexynyl group, a 1-heptynyl group, a 1-octynyl group, a 1-nonyl group. , 1-decynyl group and the like can be mentioned.
  • Examples of the cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cycloheptyl group, a cyclooctyl group, a cyclononyl group, a cyclodecyl group and the like.
  • Examples of the cycloalkenyl group having 3 to 10 carbon atoms include a cyclopropenyl group, a cyclobutenyl group, a cyclopentenyl group, a cyclohexenyl group, a cycloheptenyl group, a cyclooctenyl group, a cyclononenyl group, a cyclodecenyl group and the like.
  • Examples of the arylalkyl group having 7 to 12 carbon atoms include a phenylmethyl group and a phenylethyl group.
  • Examples of the heteroalkylalkyl group having 3 to 10 carbon atoms include the following structures. * Indicates the connection point. If the structure has an asymmetric carbon, it shall contain all possible stereoisomers.
  • the organic compound used in the present invention can be produced by a chemical synthesis method.
  • compound 1 described in Examples is an intermediate N- (2-(2- (2-( Naphthalene-1-yl) Acetyl) -S-trityl-L-Cysteine is then synthesized by reacting this intermediate with hydrazine monohydrate in the presence of 1,1'-carbonyldiimidazole. Can be done.
  • the organic compound used in the present invention can be produced by using a known peptide synthesis method. Specifically, it can be produced according to the method described in the synthesis of compounds 6 to 12 and 14 in the examples described later. That is, the organic compound used in the present invention can be synthesized by performing solid-phase peptide synthesis using a commercially available automatic peptide synthesizer.
  • NMP N-methyl-2-pyrrolidone
  • Fmoc amino acid cyano-hydroxyimino-acetic acid ethyl ester
  • NMP solution of diiropropylethylamine NMP solution of diisopropylcarbodiimide
  • piperidine N-methyl-2-pyrrolidone
  • the NMP solution and the NMP solution of anhydrous acetic acid can be set and synthesized.
  • Fmoc deprotection, washing with NMP, condensation of Fmoc amino acids, and washing with NMP are set as one cycle, and the peptide chain can be extended by repeating this cycle.
  • the skin sensitization measuring reagent of the present invention may consist of only the above-mentioned organic compound, and may contain one or more additives in addition to the above-mentioned organic compound which is the main drug for measurement. You may. Examples of additives include pH regulators, stabilizers, and the like.
  • the skin sensitization measuring reagent of the present invention is prepared by dissolving the above-mentioned main agent for measurement and, if necessary, the above-mentioned additive in water, an aqueous buffer solution, an organic solvent, or a mixed solvent thereof. May be.
  • the skin sensitizer measuring reagent of the present invention may be provided in any form of solution, liquid, solid (powder, granule, lyophilized product, tablet, etc.).
  • the method for measuring skin sensitization of the present invention is: (1) The skin sensitization measuring reagent of the present invention is reacted with the test substance, and (2) the amount of the skin sensitization measuring reagent after the reaction or the amount of the product of the reaction is optically measured. To detect by target measurement, including.
  • the skin sensitization measuring reagent of the present invention is dissolved in, for example, an aqueous buffer such as a phosphate buffer or an organic solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO), and further, if necessary, an aqueous buffer such as a phosphate buffer. It may be used in a form diluted with a buffer solution or another organic solvent as a concentration of the above organic compound, for example, about 0.01 ⁇ mol / L to about 1 mol / L, usually about 1 ⁇ mol / L to about 100 ⁇ mol / L.
  • an aqueous buffer such as a phosphate buffer or an organic solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO)
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the type of the test substance is not particularly limited, but is, for example, at least one of a plant extract composed of fragrances, essential oils, polymer compounds, pharmaceuticals, pesticides, foods, chemical products, and natural product-derived components.
  • the test substance is, for example, water or an organic solvent such as methanol, ethanol, acetonitrile, acetone, DMSO (dimethyl sulfoxide) or a mixed solvent thereof, for example, at a concentration of about 0.01 ⁇ mol / L to about 1 mol / L, usually about about.
  • It may be dissolved to a concentration of about 0.1 mmol / L to about 500 mmol / L, and is preferably 0.1 mmol / L to 100 mmol / L, more preferably 0, for the purpose of preventing precipitation of the test substance. It may be dissolved so as to have a concentration of 1 mmol / L to 10 mmol / L.
  • the organic compound and the test substance solution which are the main agents for measuring the skin sensitization reagent of the present invention, are mixed and reacted so that the molar concentration ratio of the organic compound and the test substance is, for example, 1: 200 to 10: 1. Just let me do it.
  • the reaction is carried out by stirring or allowing the solution containing the organic compound and the test substance to be stirred or allowed to stand for about 1 minute to about 2 days while keeping the temperature in a temperature range of, for example, about 4 ° C to about 60 ° C. be able to.
  • the skin sensitization property of the test substance can be measured.
  • the residual amount of the organic compound and / or the amount of the reaction product of the organic compound and the test substance in the mixed solution of the skin sensitization measurement reagent solution and the test substance solution are produced. Should be analyzed.
  • the reaction rate constants of the organic compound and the test substance can be obtained, the reaction rate constants of different test substances can be compared, and the reaction rate constants of the test substances can be skin-sensitized by animal experiments.
  • the skin sensitivities of the test substance can be evaluated by comparing with the reaction rate constants obtained for the compounds whose presence or absence of sex and strength have been confirmed.
  • the skin sensitization measuring reagent may cause some changes in the reaction solution, prepare a reaction solution (control group) containing only the test substance as necessary. Then, analysis may be performed and correction may be made based on the value of the remaining amount in the reaction solution.
  • the method of the present invention may include chromatographic treatment of the reaction product obtained in the step of reacting the skin sensitization measuring reagent with the test substance. That is, the method for analyzing the compound and the compound produced by the above reaction is not particularly limited, but for example, the above reaction is carried out by high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography (GC), thin layer chromatography (TLC) or the like. The compound produced by the above-mentioned organic compound and the test substance can be separated and analyzed.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • GC gas chromatography
  • TLC thin layer chromatography
  • Examples of the chromatograph method that can be used for the HPLC, GC, or TLC include reverse phase, normal phase, and ion exchange.
  • Commercially available columns and TLCs that can be used for such chromatographic techniques include, for example, CAPCELL-PAK (manufactured by Osaka Soda), L-column ODS (manufactured by Chemical Evaluation Research Organization), and Shodex Asahipak (Showa) as LC columns. (Made by Denko) and the like, and examples of the TLC plate include silica gel 60F254 (manufactured by Merck) and Silica Gel Plate (manufactured by Nakaraitesk).
  • the method for detecting the compound produced by the above reaction or the remaining organic compound is not particularly limited, but examples of the detectors that can be used in the HPLC analysis include an ultraviolet-visible detector, a near-infrared detector, and a fluorescence detection. Examples include a device, a differential refractometer detector, an electric conductivity detector, and an evaporative light scattering detector. Examples of the ultraviolet-visible detector include a single-wavelength ultraviolet-visible detector, a two-wavelength ultraviolet-visible detector, and a photodiode array detector.
  • detectors that can be used for such detection methods include an ultraviolet visible detector, a differential refractometer detector, and in the case of an electrical conductivity detector, manufactured by Shimadzu, Hitachi, Waters, and Shiseido. Examples of the detector and the evaporative light scattering detector include those manufactured by Shimadzu Corporation.
  • the reduction rate of the skin sensitization measuring reagent (also referred to as a nucleating reagent) after the reaction between the test substance and the skin sensitization measuring reagent is detected by optical measurement using an ultraviolet detector.
  • an ultraviolet detector a commercially available detector can be used, and examples thereof include those manufactured by Shimadzu Corporation, Waters, Hitachi, and Agilent Technologies.
  • the detection wavelength is preferably 200 to 700 nm, more preferably 200 to 600 nm, more preferably 220 to 550 nm, still more preferably 280 to 480 nm. ..
  • the reduction rate of the skin sensitization measuring reagent (also referred to as a nucleating reagent) after the reaction between the test substance and the skin sensitizing measuring reagent is optically measured using a fluorescence detector. May be detected by. Molecules in the ground state absorb the excitation light and transition to the excited state. Part of the absorbed excitation energy is deactivated by vibrational energy or the like, and the light emitted when returning to the ground state after a non-radiative transition to a position with a low vibrational level is fluorescence.
  • Optical measurement using a fluorescence detector is generally said to be an analytical method that is 103 times or more more sensitive than the absorptiometry.
  • a fluorescent substance since a fluorescent substance is to be measured, it has excellent selectivity and is used as an analytical means for a very small amount. Since the fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorescent substance, quantitative analysis can be performed by creating a calibration curve.
  • the fluorescence detector a commercially available detector can be used, and examples thereof include Shimadzu, Waters, Hitachi, Agilent Technologies, and Osaka Soda.
  • the excitation wavelength is preferably 200 to 800 nm, more preferably 200 to 600 nm, still more preferably 200 to 550 nm, and even more preferably 200 to 500 nm. Particularly preferably, it is 200 to 480 m.
  • the fluorescence wavelength is preferably 200 to 1000 nm, more preferably 200 to 800 nm, still more preferably 200 to 700 nm, and particularly preferably 200 to 650 nm.
  • the rate of decrease of the skin sensitization measuring reagent is the average of the peak areas of the skin sensitization measuring reagent (also called nucleophilic reagent) in the optical measurement using the ultraviolet detector or the fluorescence detector. From the value, it can be calculated according to the following formula.
  • Decrease rate of nucleophile [1- (average value of peak area of unreacted nucleophile after reaction / average value of peak area of standard nucleophile)] ⁇ 100
  • the detection in the measuring method using the skin sensitization measuring reagent of the present invention is not limited to the above, and for example, refer to the method described in JP-A-2003-14761 or JP-A-2008-139275. It may be carried out by detecting ions having a specific mass based on the molecular weight or the like.
  • the present invention will be described in detail below with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
  • Compound 3 is S-trityl-isocysteine (synthesized by the method described in the literature, Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2008, 2008, instead of S-trityl-L-cysteine (Cys (Trt) -OH) used in the synthesis of compound 1. It was synthesized according to the synthesis method of compound 1 except that vol. 16, # 1, p.65) was used.
  • Compound 4 replaces S-trityl-L-cysteine (Cys (Trt) -OH) used in the synthesis of compound 1 with (2R) -2- (methylamino) -3-[(triphenylmethyl) sulfanyl] propionic acid ( It was synthesized according to the synthesis method of Compound 1 except that (ChemShuttle) was used.
  • Compound 5 conforms to the method for synthesizing compound 1 except that 4-mercaptophenylalanine (manufactured by Chemspace) was used instead of S-trityl-L-cysteine (Cys (Trt) -OH) used for the synthesis of compound 1.
  • Chemspace 4-mercaptophenylalanine
  • TFA Trifluoroacetic acid
  • the intermediate crude product was dissolved in 2 mL of dimethylformamide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and 32 mg (0.2 mmol) of 1,1'-carbonyldiimidazole (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. And stirred for 2 hours. Next, 25 mg (0.5 mmol) of hydrazine monohydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and stirred for 2 hours.
  • N- ⁇ -Fmoc-N- ⁇ -alloc-L-diaminoprionic acid (Iris Biotech) adjusted to 0.5 mol / L methylene chloride solution on a resin swollen with methylene chloride (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (Manufactured by) 0.075 mmol and 0.4 mL of diisopropylethylamine (manufactured by Tokyo Kasei Co., Ltd.) were added and shaken for 2 hours. After the reaction, the cells were washed with methylene chloride and N-methyl-2-pyrrolidone (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the intermediate crude product was dissolved in 2 mL of dimethylformamide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and 32 mg (0.2 mmol) of 1,1'-carbonyldiimidazole (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. And stirred for 2 hours. Next, 25 mg (0.5 mmol) of hydrazine monohydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and stirred for 2 hours.
  • N- ⁇ - (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) -L-aspartic acid ⁇ -allyl ester manufactured by Watanabe Chemical Industries, Ltd.
  • 1-naphthyl acetic acid manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • hydrazine monohydrate manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was condensed.
  • the intermediate crude product was dissolved in 2 mL of dimethylformamide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and 32 mg (0.2 mmol) of 1,1'-carbonyldiimidazole (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. And stirred for 2 hours. Next, 25 mg (0.5 mmol) of hydrazine monohydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and stirred for 2 hours.
  • reaction solution was cooled to room temperature, 25 mg (0.5 mmol) of hydrazine monohydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and the mixture was stirred for 1 hour.
  • water is added to the reaction solution, extracted with ethyl acetate (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), the organic layer is washed with water and saturated saline, and then anhydrous sodium sulfate (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). It was dried in. Anhydrous sodium sulfate was filtered off, and the filtrate was distilled off in vacuum.
  • TSA trifluoroacetic acid
  • n -Hexane manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Methyl-t-butyl ether manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • TFA Trifluoroacetic acid
  • Peptide solid-phase synthesis method using an automatic peptide synthesizer was performed using an automatic peptide synthesizer (SyroI manufactured by Biotage). Resin for solid phase synthesis, 4 equivalents of Fmoc amino acid (0.5 mol / L) N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) solution to the resin, 4 equivalents of cyano-hydroxyimino to the resin in the synthesizer.
  • NMP N-methyl-2-pyrrolidone
  • Synthesis was carried out by setting an NMP solution of acetate ethyl ester (1 mol / L), an NMP solution of 4 equivalents of diisopropylcarbodiimide (1 mol / L) and an NMP solution of piperidine (20% v / v) with respect to the resin. Fmoc deprotection (20 minutes), washing with NMP, condensation of Fmoc amino acids (1 hour), and washing with NMP were set as one cycle, and the peptide chain was extended by repeating this cycle.
  • MS mass spectrum
  • ESI Electron-ray Ionization
  • ⁇ Test method (1) Preparation of various solutions (1-1) 0.1 mmol / L EDTA aqueous solution 1) Weigh 37.2 mg of EDTA ⁇ 2Na ⁇ 2H2O (manufactured by Dojin Kagaku) in a 15 mL volume conical tube and use a 25 mL measuring pipette. Add 10 mL of distilled water (manufactured by Koyakusho, water for injection according to the Japanese Pharmacopoeia) and dissolve (10 mmol / L EDTA aqueous solution).
  • HPLC Mobile Phase B 0.1% (v / v) TFA acetonitrile solution Add 1.0 mL of TFA to 1 L of HPLC grade acetonitrile (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., for HPLC).
  • nucleophile stock solution Preparation of nucleophile stock solution
  • DMSO manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • 2 mmol / L nucleophile solution 2) Add 149.5 mL of the same buffer solution to a 500 mL container using a 50 mL measuring pipette, add 0.5 mL of the above 2 mmol / L nucleophile solution, mix by inversion, and dilute 300 times. (6.667 ⁇ mol / L). This solution is stored frozen at -70 ° C or lower.
  • test substance solution One type of solvent that can prepare a 1 mmol / L test substance solution is selected according to the priority of the acetonitrile solution of water, acetonitrile, acetone and 5% DMSO.
  • water, acetonitrile, or acetone When water, acetonitrile, or acetone is selected, first prepare a 20 mmol / L test substance solution. A solvent is added to the test substance weighed in an appropriate amount so as to form a 20 mmol / L solution, and the mixture is completely dissolved. Then, a part of the 20 mmol / L solution is separated and diluted 20 times with the same solvent to prepare a 1 mmol / L test substance solution.
  • a 20 mmol / L DMSO solution is prepared in the same manner as above. Then, a part of this is separated and diluted 20-fold with acetonitrile to prepare a 1 mmol / L test substance solution.
  • test substance solution was prepared on a 96-well plate (U96 PP-0.5 ML NATURAL, Thermo (NUNC)) mainly using a 12-pipette, and according to the following dose. Add reagents. Nucleophile: 150 ⁇ L Test substance solution: 50 ⁇ L
  • reaction stop solution for UV detection (2.5% (v / v)
  • TFA aqueous solution is added in an amount of 50 ⁇ L each to stop the reaction.
  • 180 ⁇ L of the reaction stop solution for fluorescence detection (0.5% (v / v) TFA aqueous solution) is dispensed to a new plate, and 20 ⁇ L of the reaction solution after incubation is added thereto to carry out the reaction. Stop it.
  • HPLC measurement The HPLC measurement conditions for the nucleophile are shown below. As the elution condition, condition 1, condition 2 or condition 3 was selected depending on the nucleophile.
  • Evaluation item (7-1) Stability of nucleophile (particularly, degree of oxidation of cysteine) Immediately after preparing the reaction solution (0 hours) and after incubating the reaction solution at 25 ° C. for 24 hours (24 hours), the reaction solution is measured by HPLC-UV, respectively. At this time, since the nucleophile and the oxidants and variants of the nucleophile can be confirmed on HPLC, the residual rate of the nucleophile is calculated based on the following formula.
  • Reactivity is described in the prior art DPRA depletion of cysteine peptide and lysine peptide, NAC and NAL reduction rate in ADRA, NAC (NAC-amide) having an amide N-terminal, JP-A-2009-222466.
  • the reduction rate of the reagent was compared.
  • Example 1 One type of nucleophile (Compound 1) was evaluated. The following compounds were also evaluated in the same manner as a comparative control of reactivity with 15 kinds of evaluation substances. Cys peptide: Lys peptide
  • NAC N- [2- (Naphthalene-1-yl) Acetyl] Cysteine NAL: ⁇ -N- [2- (Naphthalene-1-yl) Acetyl] Lysine NAC-amide: (R) -3-Mercapto-2- (2- (Naphthalene-1-yl) acetamide) Propanamide
  • GSH-NBD The compound according to paragraph 0043 of JP-A-2009-222466.
  • the four types of diethyl sulfate, 3-propylidenephthalide, tropolone, and phenylbenzoate were less reactive than the cysteine peptide or lysine peptide, but all of them were peptides. Was 5% or more, and some reactivity was confirmed.
  • it is a non-sensitizing substance in 1-bromobutane and 1-iodohexane, which are reactive with cysteine peptide in DPRA, no reactivity is observed in compound 1, and the actual sensitization information (non-sensitization information). The result was commensurate with the creativity).
  • the four substances other than the above showed the same level of reactivity as the cysteine peptide or lysine peptide.
  • compound 1 When compared with NAC-amide, compound 1 showed higher reactivity with respect to 5 types of sensitizing substances, trimellitic anhydride, methyl pyruvate, 10-undecenal, ⁇ -pentylcinnamaldehyde, and cyclamen aldehyde. ..
  • compound 1 When compared with GSH-NBD, compound 1 showed higher reactivity with respect to 5 types of sensitizing substances, methyl pyruvate, diethyl sulfate, 10-undecenal, ⁇ -pentylcinnamaldehyde, and cyclamen aldehyde.
  • GSH-NBD had higher reactivity with respect to trimellitic acid anhydride and nonanoyl chloride, but the depletion of compound 1 was 35% or more, confirming sufficient reactivity.
  • NAC-amide and GSH-NBD to 15 kinds of evaluation substances, 5.6%, which is a judgment condition in the method for predicting skin sensitization by NAC alone in ADRA of the prior art. Skin sensitization was predicted using depletion as a criterion.
  • Table 3 shows a comparison of the results of this compound 1 between the prediction results of NAC-amide and GSH-NBD performed above and the prediction results of DPRA and ADRA published in the literature.
  • sensitizing substances nonanoyl chloride, methyl pyruvate, 10-undecenal, ⁇ -pentylcinnamaldehyde
  • DPRA ⁇ -pentylcinnamaldehyde
  • eight sensitizing substances that were erroneously negative by ADRA methyl pyruvate, diethyl sulfate, 3-propylidenephthalide, tropolone, 10-undecenal, ⁇ -pentylcinnamaldehyde, phenylbenzoate, cyclamen aldehyde
  • NAC-amide compounds for 5 types of sensitizing substances (trimeritic anhydride, methyl pyruvate, 3-propylidenephthalide, 10-undecenal, ⁇ -pentylcinnamaldehyde) that were erroneously determined to be negative. In 1, it was correctly determined to be positive.
  • GSH-NBD 4 types of sensitizing substances (methyl pyruvate, diethyl sulfate, 3-propyridenephthalide, ⁇ -pentylcinnamaldehyde) that were erroneously determined to be negative were correctly positive for compound 1. It was judged.
  • two types of non-sensitizing substances (1-bromobutane and 1-iodohexane) that were erroneously determined to be positive by DPRA were correctly determined to be negative by Compound 1.
  • compound 1 may be able to predict sensitizing substances with higher sensitivity than the prior arts DPRA and ADRA, and it is possible to correctly evaluate sensitizing substances that were difficult to predict by conventional skin sensitization measurement methods. It is considered to be highly sexual.

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Abstract

本発明は、一種類の試薬を用いて高感度で被験物質の感作性を測定することができる皮膚感作性測定試薬、化合物、及び皮膚感作性の測定方法を提供することを課題とする。本発明によれば、メルカプト基とヒドラジド構造とを有し、かつ、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する有機化合物を測定主薬として含む、皮膚感作性測定試薬；皮膚感作性測定試薬において使用するための化合物；並びに、皮膚感作性測定試薬を用いる皮膚感作性の測定方法が提供される。

Description

皮膚感作性測定試薬、化合物、及び皮膚感作性の測定方法
　本発明は、皮膚感作性測定試薬、化合物、及び皮膚感作性の測定方法に関する。
　皮膚感作性（アレルギー）は、物質に暴露された箇所の局所的な水疱及び紅斑などの症状に留まらず、アナフィラキシーという重篤で生命に危険を及ぼす全身性のアレルギー反応を伴う場合がある。また、皮膚感作性は一旦発症すると長期にわたって暴露を回避する管理も必要となることなどから、重要な毒性の一つと考えられている。
　化学物質の皮膚感作性を評価する方法として、従来からモルモットを使用する試験法が一般的に知られており、アジュバントを用いるＧＰＭＴ（Ｇｕｉｎｅａ　Ｐｉｇ　Ｍａｘｉｍｉｓａｔｉｏｎ　Ｔｅｓｔ）や非アジュバント試験であるビューラー法（Ｂｕｅｈｌｅｒ　Ｔｅｓｔ）などの試験法が長年広く利用されてきた。これに対して、近年、動物愛護などの倫理的、社会的な要請から動物実験代替法の研究及び開発が進められている。
　動物を用いない皮膚感作性試験法として、主にｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験の開発が進んでいる。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験としては、ＡＲＥ－Ｎｒｆ２　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ＫｅｒａｔｉｎｏＳｅｎｓＴＭ　ｔｅｓｔ　ｍｅｔｈｏｄ（ＫｅｒａｔｉｎｏＳｅｎｓは登録商標）、ＬｕＳｅｎｓ（ＡＲＥ－ＮｒＦ２　ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅ　ＬｕＳｅｎｓ　ｔｅｓｔ　ｍｅｔｈｏｄ）、ｈ－ＣＬＡＴ（ｈｕｍａｎ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　Ｔｅｓｔ）、Ｕ－ＳＥＮＳ（Ｍｙｅｌｏｉｄ　Ｕ９３７　Ｓｋｉｎ　Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ　Ｔｅｓｔ）及びＩＬ－８　Ｌｕｃ　ａｓｓａｙなどが知られている。
　一方、培養細胞を用いない試験法としては、ｉｎ　ｃｈｅｍｉｃｏ試験がある。化学反応によるｉｎ　ｃｈｅｍｉｃｏ試験は、培養細胞を用いないため、特別な技術、知識及び設備が不要である等、多くの点で利点がある。例えば、非特許文献１及び２には、２種類のペプチド（システインペプチド及びリジンペプチド）を求核試薬として利用する方法が記載されている。また、特許文献１及び２には、アリール環を導入したシステイン誘導体、及びアリール環を導入したリジン誘導体を求核試薬とする皮膚感作性測定試薬及び皮膚感作性測定方法が記載されている（ＡＤＲＡとも称する）。
　非特許文献１及び２、並びに特許文献１及び２に記載の方法では、システインとリジンを含む２種類の試薬を別々に被験物質と化学反応させて、別々に測定・定量して減少率（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を算出するため、評価に時間がかかる。そこで、この２種類のアミノ酸を含むペプチドを利用して、皮膚感作性物質を検出及び評価する試験法も報告されている。しかし、いずれも合成ヘプタペプチドＣｏｒ１Ｃ－４２０（Ａｃ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ）（求電子試薬に対して非常に高い反応性を示す部位であるヒトＣｏｒｏｎｉｎ　１タンパクのＮ末端から４２０残基目のシステイン周りの配列に由来する（非特許文献３）を用いて、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー・質量スペクトル分析）により測定する試験法であり、いずれも検出感度が低いため、ＵＶや可視光などの光学的な検出は不可能な試験法である。また、システインとリジンを含むことで測定時間が短縮されることを効果とはしていない。
　非特許文献４には、（１）ペプチド－被験物質付加体（共有結合体）とペプチドの酸化が区別できること、（２）反応液中の被験物質濃度を下げることができるため、被験物質の沈殿の問題がないこと、（３）被験物質の調製濃度を下げられるため、被験物質の溶解性の問題が少なくなること、（４）ＬＣ－ＭＳ測定であるため、共溶出の問題がないこと、（５）速度論的測定を行うことで、反応性の高い被験物質をより正確に評価できること、の５点が記載されている。また非特許文献５には、非特許文献１及び２に記載のＤＰＲＡ（Ｄｉｒｅｃｔ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ　Ａｓｓａｙ　）で使用するシステインペプチドおよびリジンペプチドと、非特許文献３に記載の合成ヘプタペプチドＣｏｒ１Ｃ－４２０の３種類を評価することで、高い予測精度が得られることが記載されている。さらに、特許文献３には、アミノ基とチオール基を同一分子に有するペプチドの末端に蛍光色素を結合させた皮膚感作性検出試薬が記載されている。
Gerberick, G.F., Vassallo, J.D., Bailey, R.E., Chaney, J.G., Morrall, S.W. and Lepoittevin, J.P. (2004). Development of a peptide reactivity assay for screening contact allergens. Toxicological Sciences, 81(2), 332-43. Gerberick, G.F., Vassallo, J.D., Foertsch, L.M., Price, B.B., Chaney, J.G. and Lepoittevin, J.P. (2007). Quantification of chemical peptide reactivity for screening contact allergens: a classification tree model approach. Toxicological Sciences, 97(2), 417-27. Denny MK, Richards AM, Wemke GR, Shyr Y, Liebler DC. (2006) Cytosolic and nuclear protein targets of thiol-reactive electrophiles. Chemical Research in Toxicology, 19, 20-29. Natsch A, Gfeller H. (2008). LC-MS-based characterization of the peptide reactivity of chemicals to improve the in vitro prediction of the skin sensitization potential. Toxicological Sciences, 106(2), 464-78. Wong CL, Lam AL, Smith MT, Ghassabian S. (2016). Evaluation of a High-Throughput Peptide Reactivity Format Assay for Assessment of the Skin Sensitization Potential of Chemicals. Frontiers in Pharmacology, 14, 7(53), 1-14.
特開２０１１－５９１０２号公報 特開２０１４－３７９９５号公報 特開２００９－２２２４６６号公報
　非特許文献１及び２に記載されている皮膚感作性測定法においては、使用する２種類のペプチド自体のモル吸光係数が低く、かつ２２０ｎｍの短波長しか検出できないため、これらのペプチドの残存率をＨＰＬＣ－ＵＶ法で定量するには、定量感度が低いことや、ペプチドと被験物質との共溶出などの現象が起こりやすく、定量が困難な場合が多いという問題点があった。非特許文献３に記載されている方法は、ＵＶや可視光などの光学的な検出は困難な試験法であるため、質量分析によって評価が必要であるという問題点がある。また、この試験法は、システインとリジンを含むことで測定時間が短縮されることを効能としていない。非特許文献４においては測定時間短縮による効率化は記載されていない。非特許文献５に記載の方法は、光学的な定量感度が低いという問題がある。また、特許文献３に記載の方法で用いるペプチドは、システイン由来のチオール基及びアミノ酸のα－アミノ基を有しているが、このペプチドは弱い皮膚感作性を有する被験物質に対する反応性が低く、偽陰性と判定される場合があり、問題となっていた。
　本発明は、一種類の試薬を用いて高感度で被験物質の感作性を測定することができる皮膚感作性測定試薬、化合物、及び皮膚感作性の測定方法を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、メルカプト基とヒドラジド構造とを有し、かつ、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する有機化合物を皮膚感作性測定試薬として用いることができることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　メルカプト基とヒドラジド構造とを有し、かつ、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する有機化合物を測定主薬として含む、皮膚感作性測定試薬。
＜２＞　上記有機化合物が、下記式（１）又は（２）で表される、＜１＞に記載の皮膚感作性測定試薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 式中、
Ａ１は、窒素原子、又は以下の連結基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、炭素数２～１０のアルケニル基、炭素数２～１０のアルキニル基、炭素数３～１０のシクロアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルケニル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、又はシクロアルケニル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、炭素数５～６のシクロアルケニル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、メルカプトメチル基、水酸基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
＊は、Ｘ１、Ｙ１、Ｚ１との連結位置を示す。
Ｘ１およびＸ２は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数２～１０のアルケニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数２～１０のアルキニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルケニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、又はシクロアルケニル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、炭素数５～６のシクロアルケニル基、アミノ基、シアノ基、メルカプトメチル基、水酸基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｙ１およびＹ２は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示す。
Ｚ１およびＺ２は、－ＣＯ－ＮＲ２１ＮＲ２２Ｒ２３を示し、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
＜３＞　上記有機化合物が、下記式（１０）で表される、＜１＞に記載の皮膚感作性測定試薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 式中、
Ａ１０は、窒素原子、又は３価の連結基を示し、
Ｘ１０は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数２～１０のアルケニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数２～１０のアルキニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルケニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ１０１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ１０１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ１０１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、又はシクロアルケニル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、炭素数５～６のシクロアルケニル基、アミノ基、シアノ基、メルカプトメチル基、水酸基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｙ１０は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示し、
Ｌは、アミノ基を示す。
＜４＞　上記有機化合物が、下記式（３）、（４）又は（５）で表される、＜１＞に記載の皮膚感作性測定試薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 式中、
Ａ３は、炭素数１又は２の３価の炭化水素基を示し、
Ｒ３は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ３１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ３１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ３１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｘ３は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ３２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ３２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ３２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｙ３は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示す。
Ｚ３は、－ＣＯ－ＮＲ３１ＮＲ３２Ｒ３３を示し、Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 式中、
Ａ４は、炭素数１又は２の３価の炭化水素基を示し、
Ｒ４は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ４１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ４１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ４１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｘ４は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ４２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ４２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ４２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｙ４は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示す。
Ｚ４は、－ＣＯ－ＮＲ４１ＮＲ４２Ｒ４３を示し、Ｒ４１、Ｒ４２、及びＲ４３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 式中、
Ａ５は、炭素数１又は２の３価の炭化水素基を示し、
Ｒ５は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ５１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ５１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ５１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｘ５は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ５２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ５２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ５２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｙ５は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示す。
Ｚ５は、－ＣＯ－ＮＲ５１ＮＲ５２Ｒ５３を示し、Ｒ５１、Ｒ５２、及びＲ５３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
Ｑは、水素原子、カルボキシル基、水酸基、または１級アミド構造を示すか、あるいは－ＣＯ－ＮＲ５aＮＲ５bＲ５cを示し、Ｒ５a、Ｒ5b、及びＲ5cはそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
＜５＞　上記有機化合物が、下記式（６）で表される、＜１＞に記載の皮膚感作性測定試薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 式中、
Ｒ６は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ６１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ６１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ６１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｘ６は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ６２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ６２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ６２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｚ６は、－ＣＯ－ＮＲ６１ＮＲ６２Ｒ６３を示し、Ｒ６１、Ｒ６２、及びＲ６３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
ｎは、０あるいは１を示し、
ｍは、０あるいは１を示す。
＜６＞　上記有機化合物が、下記式（７）で表される、＜１＞に記載の皮膚感作性測定試薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 式中、
Ｒ７は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ７１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ７１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ７１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｘ７は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ７２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ７２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ７２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｗは、ＮＲ７１－ＮＲ７２Ｒ７３を示し、Ｒ７１、Ｒ７２、及びＲ７３は、水素原子、又は炭素数１～３のアルキル基を示し、
ｎは０あるいは１を示す。
＜７＞　Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５、及びＹ１０が、蛍光を発する基である、＜２＞から＜４＞の何れか一に記載の皮膚感作性測定試薬。
＜８＞　下記式（３）、（４）又は（５）で表される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 式中、
Ａ３は、炭素数１又は２の３価の炭化水素基を示し、
Ｒ３は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ３１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ３１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ３１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｘ３は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ３２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ３２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ３２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｙ３は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示す。
Ｚ３は、－ＣＯ－ＮＲ３１ＮＲ３２Ｒ３３を示し、Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 式中、
Ａ４は、炭素数１又は２の３価の炭化水素基を示し、
Ｒ４は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ４１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ４１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ４１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｘ４は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ４２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ４２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ４２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｙ４は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示す。
Ｚ４は、－ＣＯ－ＮＲ４１ＮＲ４２Ｒ４３を示し、Ｒ４１、Ｒ４２、及びＲ４３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 式中、
Ａ５は、炭素数１又は２の３価の炭化水素基を示し、
Ｒ５は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ５１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ５１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ５１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｘ５は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ５２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ５２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ５２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｙ５は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示す。
Ｚ５は、－ＣＯ－ＮＲ５１ＮＲ５２Ｒ５３を示し、Ｒ５１、Ｒ５２、及びＲ５３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
Ｑは、水素原子、カルボキシル基、水酸基、または１級アミド構造を示すか、あるいは－ＣＯ－ＮＲ５ａＮＲ５ｂＲ５ｃを示し、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、及びＲ５ｃはそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
＜９＞　下記式（６）で表される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 式中、
Ｒ６は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ６１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ６１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ６１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｘ６は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ６２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ６２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ６２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｚ６は、－ＣＯ－ＮＲ６１ＮＲ６２Ｒ６３を示し、Ｒ６１、Ｒ６２、及びＲ６３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
ｎは、０あるいは１を示し、
ｍは、０あるいは１を示す。
＜１０＞　下記式（７）で表される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 式中、
Ｒ７は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ７１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ７１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ７１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｘ７は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ７２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ７２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ７２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｗは、ＮＲ７１－ＮＲ７２Ｒ７３を示し、Ｒ７１、Ｒ７２、及びＲ７３は、水素原子、又は炭素数１～３のアルキル基を示し、
ｎは０あるいは１を示す。
＜１１＞　（１）＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の皮膚感作性測定試薬と被験物質とを反応させること、及び
（２）上記反応後の上記皮膚感作性測定試薬の量、又は上記反応の生成物の量を、光学的測定により検出すること、
を含む皮膚感作性の測定方法。
＜１２＞　上記被験物質が、香料、精油、高分子化合物、医薬品、農薬、食品、化学製品、及び天然物由来成分からなる植物抽出液のうちの少なくとも１種である、＜１１＞に記載の皮膚感作性の測定方法。
＜１３＞　上記皮膚感作性測定試薬と上記被験物質とを反応させる工程で得られる反応物を、クロマトグラフィー処理することを含む、＜１１＞又は＜１２＞に記載の皮膚感作性の測定方法。
＜１４＞　上記光学的測定が蛍光検出器を用いた測定であって、励起波長が２００～６００ｎｍであって、蛍光波長が２００～８００ｎｍである、＜１１＞から＜１３＞のいずれか一に記載の皮膚感作性の測定方法。
　本発明によれば、一種類の試薬を用いて高感度で被験物質の感作性を測定することができる。
図１は、化合物１について、溶液調製直後（０時間）及び２４時間経過後の残存率を算出した結果を示す。 図２は、化合物１について、溶液調製直後（０時間）における蛍光強度（ＨＰＬＣにおけるピーク面積）を測定した結果を示す。 図３は、表２に記載のＮｏ．１から８の物質における各求核試薬のｄｅｐｌｅｔｉｏｎを比較した結果を示す。 図４は、表２に記載のＮｏ．９から１５の物質における各求核試薬のｄｅｐｌｅｔｉｏｎを比較した結果を示す。
　本明細書において、「～」とはその前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用される。
　本明細書において皮膚感作性の測定とは皮膚感作性の検定を含む意味であり、また、一定の基準の皮膚感作性の有無の判断、及び皮膚感作性の定量的測定を含む意味である。
　医薬、農薬、及び化粧品等の製品に含まれる化学物質は、皮膚感作性を有さない物質であることが重要であり、化学物質の皮膚感作性を予測する方法を確立する必要がある。皮膚感作性は、多くの段階からなる複雑な過程によって発症する。最初の事象は、被験物質が皮膚から浸透した後、皮膚内のタンパクと共有結合することである。したがって、この共有結合性を評価することにより、対象の被験物質が皮膚感作性であるか否かを予測することができると考えられる。皮膚内のタンパクと被験物質との反応は、およそ５つの有機化学反応によることが知られている。この５つの反応に関わるアミノ酸は、システインのＳＨ基とリジンのＮＨ２基であることが知られている。このため、特許文献１及び２に記載の皮膚感作性の測定においては、システインとリジンのＮ末端に、ＵＶ領域に高いモル吸光係数を有するナフタレン環を導入した２種類の求核試薬をそれぞれ化学合成し、この２種類の求核試薬と被験物質とを反応させて、未反応の求核試薬を定量することにより、被験物質との反応性を算出し、皮膚感作性の予測を行っている。
　本発明においては、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する有機化合物を使用することにより、希薄な評価試薬と被験物質濃度において定量することができるため、溶解不良による析出が起こらず、定量性を向上することができる。
　本発明においては、メルカプト基とヒドラジド構造とを同一分子内に有する有機化合物を使用することにより、１回の作業で皮膚感作性を評価することが可能になった。
　ヒドラジド基は感作性が低いアルデヒド系被験物質に対して反応性が高い、あるいは、反応生成物の安定性が高いことから、本発明においては、偽陰性になる場合があった従来の評価方法と比較して、偽陰性率を低減することができる。
　本発明の皮膚感作性測定試薬は、メルカプト基とヒドラジド構造とを有し、かつ、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する有機化合物を測定主薬として含む。
　本発明で用いる有機化合物は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有し、そのままの状態又は溶液状態で、好ましくは波長１９０～２５００ｎｍの領域で吸収を示す化合物であり、さらに好ましくは波長２００～７００ｎｍの領域に吸収を示す化合物である。
　本発明において用いる有機化合物は、好ましくは２００～８００ｎｍに発光を有する化合物であり、より好ましくは２００～７００ｎｍに発光を有する化合物であり、さらに好ましくは２５０～６５０ｎｍに発光を有する化合物である。
　本発明で用いる有機化合物は、好ましくは下記式（１）又は（２）で表される化合物であり、より好ましくは下記式（１）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 式中、
Ａ１は、窒素原子、又は以下の連結基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、炭素数２～１０のアルケニル基、炭素数２～１０のアルキニル基、炭素数３～１０のシクロアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルケニル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、又はシクロアルケニル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、炭素数５～６のシクロアルケニル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、メルカプトメチル基、水酸基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
＊は、Ｘ１、Ｙ１、Ｚ１との連結位置を示す。
Ｘ１およびＸ２は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数２～１０のアルケニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数２～１０のアルキニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルケニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ２は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、又はシクロアルケニル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、炭素数５～６のシクロアルケニル基、アミノ基、シアノ基、メルカプトメチル基、水酸基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｙ１およびＹ２は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示す。
Ｚ１およびＺ２は、－ＣＯ－ＮＲ２１ＮＲ２２Ｒ２３を示し、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
　Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は、好ましくは、それぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１～１０のアルキル基である。
　Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は、より好ましくは、水素原子またはメチル基である。
　Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は、特に好ましくは、水素原子である。
　Ｘ１およびＸ２は、好ましくは、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示す。
　Ｙ１およびＹ２は、好ましくは、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数１０～２０の基を示す。
　Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３は、好ましくは水素原子である。
　本発明で用いる有機化合物は、より好ましくは下記式（１０）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 式中、
Ａ１０は、窒素原子、又は３価の連結基を示し、
Ｘ１０は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数２～１０のアルケニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数２～１０のアルキニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルケニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ１０１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ１０１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ１０１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、又はシクロアルケニル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、炭素数５～６のシクロアルケニル基、アミノ基、シアノ基、メルカプトメチル基、水酸基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
Ｙ１０は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示し、
Ｌは、アミノ基を示す。
　Ａ１０は、好ましくは、３価の連結基を示し、より好ましくは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 を示す。
　Ｘ１０は、好ましくは、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ１０１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ１０１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ１０１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示す。
　Ｙ１０は、好ましくは、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数１０～２０の基を示す。
　紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造とは、２００ｎｍから２５００ｎｍまでの領域に吸収を有する化合物の構造をいう。２００ｎｍから２５００ｎｍまでの領域に吸収を有する化合物としては、例えば、ナフタレン誘導体、アントラセン誘導体、フェナントレン誘導体、テトラセン誘導体、ペンタセンン誘導体、ベンゾピレン誘導体、クリセン誘導体、ピレン誘導体、トリフェニレン誘導体、コランニュレン誘導体、コロネン誘導体、オバレン誘導体、アクリジン誘導体、ルシフェリン誘導体、ピラニン誘導体、スチルベン誘導体、ベンゾフラン誘導体、ジヒドロキノキサリノン誘導体、フタルイミジニル誘導体、ダンシル誘導体、メロシアニン誘導体、ペリレン誘導体、アクリジン誘導体、ペリレン誘導体、ルシフェリン誘導体、ピラニン誘導体、スチルベン誘導体、ローダミン誘導体、クマリン誘導体、４－（ジシアノメチレン）－２－メチル－６－（４－ジメチルアミノスチリル）－４Ｈ－ピラン　（ＤＣＭ）　誘導体、ピロメテン誘導体、フルオレセイン誘導体、ウンベリフェロン誘導体、ベンゾチアゾール誘導体、ベンゾキサジアゾール誘導体、シコニン誘導体、フルオランテン誘導体、カルバゾール誘導体、テトラフェン誘導体、クリセン誘導体、アセナフテン誘導体、フルオレン誘導体等を挙げることができる。具体的には、２－ナフチルアセチルクロリド、４－（５，６－ジメトキシ－Ｎ－フタルイミジニル）ベンゼンスルホン酸クロリド　（ＤＰＳ－ＣＬ）、４－クロロ－７－ニトロ－２，１，３－ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ－ＣＬ）、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンＢイソチオシアネート（ＲＢＩＴＣ）、４－フルオロ－７－ニトロ－２，１，３－ベンゾキサジアゾール（ＮＤＢ－Ｆ）、４－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル）－７－フルオロ－２，１，３－ベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ－Ｆ）、４－（Ｎ－フタルイミジニル）ベンゼンスルホン酸クロリド（ＰＨＩＳＹＬ－ＣＬ）、４－アミノスルホニル－７－フルオロ－２，１，３－ベンゾキサジアゾール（ＡＢＤ－Ｆ）、Ｎ－［４－（６－ジメチルアミノ－２－ベンゾフラニル）フェニル］マレイミド（ＤＢＰＭ）、２－（４－マレイミドフェニル）－６－メチルベンゾチアゾール（ＭＢＰＭ）、Ｎ－（９－アクリジニル）マレイミド（ＮＡＭ）、４－クロロ－７－スルホベンゾフラザン　アンモニウム塩（ＳＢＤ－ＣＬ）、７－フルオロベンゾフラザン－４－スルホン酸アンモニウム塩（ＳＢＤ－Ｆ）、１，２－ジアミノ－４，５－ジメトキシベンゼン（ＤＤＢ）、４－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル）－７－ヒドラジノ－２，１，３－ベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ－Ｈ）、４－ヒドラジノ－７－ニトロ－２，１，３－ベンゾオキサジアゾールヒドラジン（ＤＢＤ－Ｈ）、２，２′－ジチオジ（１－ナフチルアミン）　（ＤＴＡＮ）、４－アミノ－３－ペンテン－２－オン（ＦＬＵＯＲＡＬ－Ｐ）、１，２－アミノ－４，５－メチレンジオキシベンゼン（ＭＤＢ）、４－（５，６－ジメトキシベンゾチアゾール－２－イル）安息香酸ヒドラジド（ＢＨＢＴ）、４－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルフホニル）－７－（Ｎ－ヒドラジノカルボニルメチル－Ｎ－メチル）アミノ－２，１，３－ベンゾキサジアゾール　（ＤＢＤ－ＣＯ－ＨＺ）、４－（Ｎ－ヒドラジノカルボニルメチル－Ｎ－メチルアミノ）－７－ニトロ－２，１，３－ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ－ＣＯ－ＨＺ）、３－ブロモメチル－６，７－ジメトキシ－１－メチル－１，２－ジヒドロキノキサリン－２－オン（ＢＲ－ＤＭＥＱ）、４－ブロモメチル－７－メトキシクマリン（ＢＲ－ＭＭＣ）、４－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル）－７－ピペラジノ－２，１，３－ベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ－ＰＺ）、４－ニトロ－７－ピペラジノ－２，１，３－ベンゾキサジアゾール　（ＮＢＤ－ＰＺ）、４－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル）－７－（２－アミノエチルアミノ）－２，１，３－ベンゾキサジアゾール　（ＤＢＤ－ＥＤ）、３－クロロカルボニル－６，７－ジメトキシ－１－メチル－２（１Ｈ）－キノキサリノン（ＤＭＥＱ－ＣＯＣＬ）、２－（５－クロロカルボニル－２－オキサゾールイル）－５，６－メチレンジオキシベンゾフラン（ＯＭＢ－ＣＯＣＬ）等から誘導される化合物が挙げられる。
　本発明で用いる有機化合物としては、より好ましくは、下記式（３）、（４）又は（５）で表される化合物である。本発明によれば、下記式（３）、（４）又は（５）で表される化合物が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　Ａ３、Ａ４、及びＡ５は、炭素数１又は２の３価の炭化水素基を示す。
　Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ３１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ３１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ３１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
　Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ３２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ３２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ３２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
　Ｙ３、Ｙ４、及びＹ５は紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示す。
　Ｚ３は、－ＣＯ－ＮＲ３１ＮＲ３２Ｒ３３を示し、Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
　Ｚ４は、－ＣＯ－ＮＲ４１ＮＲ４２Ｒ４３を示し、Ｒ４１、Ｒ４２、及びＲ４３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
　Ｚ５は、－ＣＯ－ＮＲ５１ＮＲ５２Ｒ５３を示し、Ｒ５１、Ｒ５２、及びＲ５３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
　Ｑは、水素原子、カルボキシル基、水酸基、または１級アミド構造を示すか、あるいは－ＣＯ－ＮＲ５ａＮＲ５ｂＲ５ｃを示し、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、及びＲ５ｃはそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
　Ａ３、Ａ４、及びＡ５は、好ましくは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 を示す。
　Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、好ましくは水素原子、又は炭素数１～１０のアルキル基を示し、より好ましくは水素原子、又はメチル基を示す。
　Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は、好ましくは、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ３２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ３２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ３２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示す。
　Ｙ３、Ｙ４、及びＹ５は、好ましくは、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数１０～２０の基を示す。
　Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３は、好ましくは水素原子を示す。
　Ｑは、好ましくは１級アミド構造を示す。
　本発明においては、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５、及びＹ１０としては、蛍光を発する基であることが好ましい。
　本発明で用いる有機化合物としては、さらに好ましくは下記式（６）で表される化合物である。本発明によれば、下記式（６）で表される化合物が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　Ｒ６は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ６１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ６１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ６１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
　Ｘ６は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ６２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ６２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ６２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
　Ｚ６は、－ＣＯ－ＮＲ６１ＮＲ６２Ｒ６３を示し、Ｒ６１、Ｒ６２、及びＲ６３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
　ｎは、０あるいは１を示し、
　ｍは、０あるいは１を示す。
　Ｒ６は、好ましくは、水素原子、又はメチル基を示す。
　Ｘ６は、好ましくは、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ６２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ６２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ６２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示す。
　Ｒ６１、Ｒ６２、及びＲ６３は、好ましくは水素原子を示す。
　ｎは、好ましくは１を示す。
　ｍは、好ましくは０を示す。
　本発明で用いる有機化合物としては、特に好ましくは下記式（７）で表される化合物である。本発明によれば、下記式（７）で表される化合物が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　Ｒ７は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ７１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ７１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ７１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
　Ｘ７は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ７２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ７２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ７２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、上記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
　Ｗは、ＮＲ７１－ＮＲ７２Ｒ７３を示し、Ｒ７１、Ｒ７２、及びＲ７３は、水素原子、又は炭素数１～３のアルキル基を示し、
　ｎは０あるいは１を示す。
　Ｒ７は、好ましくは、水素原子、又はメチル基を示す。
　Ｘ７は、好ましくは、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ７２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ７２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ７２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示す。
　Ｒ７１、Ｒ７２、及びＲ７３は、好ましくは水素原子を示す。
　ｎは、好ましくは１を示す。
　炭素数１から１０のアルキル基とは、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、及びデシル基などを挙げることができる。
　炭素数２～１０のアルケニル基とは、例えば、ビニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、３－ブテニル基、１，３－ブテニル基、１－ペンテニル基、１－ヘキセニル基、１－ヘプテニル基、１－オクテニル基、１－ノネニル基、１－デセニル基等を挙げることができる。
　炭素数２～１０のアルキニル基とは、例えば、エチニル基、１－プロピニル基、１－ブチニル基、１－ペンチニル基、１－ヘキシニル基、１－ヘプチニル基、１－オクチニル基、１－ノニル基、１－デシニル基等を挙げることができる。
　炭素数３～１０のシクロアルキル基とは、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基等を挙げることができる。
　炭素数３～１０のシクロアルケニル基とは、例えば、シクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘプテニル基、シクロオクテニル基、シクロノネニル基、シクロデセニル基等を挙げることができる。
　炭素数７～１２のアリールアルキル基としては、フェニルメチル基、フェニルエチル基等を挙げることができる。
　炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基としては、以下の構造を挙げることができる。＊は結合点を示す。構造中に不斉炭素を有する場合は、取り得る全ての立体異性体を含むものとする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
＜有機化合物の合成方法＞
　本発明で用いる有機化合物は、化学合成法により製造することができる。一例として、実施例に記載の化合物１は、１－ナフチル酢酸を１，１’－カルボニルジイミダゾールの存在下でＳ－トリチル－Ｌ－システインと反応させて中間体であるＮ－（２－（ナフタレン－１－イル）アセチル）－Ｓ－トリチル－Ｌ－システインを製造し、次いでこの中間体に１，１’－カルボニルジイミダゾールの存在下でヒドラジン一水和物を反応させることにより合成することができる。
　あるいは、本発明で用いる有機化合物は、公知のペプチド合成法を用いて製造することが可能である。具体的には、後記する実施例における化合物６～１２及び１４の合成に記載した方法に準じて製造することができる。即ち、本発明で用いる有機化合物は、市販のペプチド自動合成装置を用いてペプチド固相合成を行うことにより合成することができる。
　合成装置に固相合成用レジン、Ｆｍｏｃアミノ酸のＮ－メチル－２－ピロリドン　（ＮＭＰ）　溶液、シアノ－ヒドロキシイミノ－酢酸エチルエステル、及びジイロプロピルエチルアミンのＮＭＰ溶液、ジイソプロピルカルボジイミドのＮＭＰ溶液、ピペリジンのＮＭＰ溶液、及び無水酢酸のＮＭＰ溶液をセットし合成を行うことができる。Ｆｍｏｃ脱保護、ＮＭＰによる洗浄、Ｆｍｏｃアミノ酸の縮合、ＮＭＰによる洗浄を１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことで、ペプチド鎖を伸長させることができる。
＜皮膚感作性測定試薬＞
　本発明の皮膚感作性測定試薬は、上記の有機化合物のみからなるものであってもよく、測定主薬である上記の有機化合物のほかに１又は２以上の添加剤を含んでいるものであってもよい。添加剤の例としては、ｐＨ調整剤、安定化剤、等が挙げられる。また、本発明の皮膚感作性測定試薬は、上記の測定主薬及び必要に応じて上記の添加剤を、水、水性緩衝液、有機溶媒、又はこれらいずれかの混合溶媒等に溶解させたものであってもよい。
　本発明の皮膚感作性測定試薬は、溶液、液体状、固体状（粉末、顆粒、凍結乾燥物、錠剤等）のいずれの形態で提供されてもよい。
＜皮膚感作性測定方法＞
　本発明の皮膚感作性の測定方法は、
（１）本発明の皮膚感作性測定試薬と被験物質とを反応させること、及び
（２）上記反応後の上記皮膚感作性測定試薬の量、又は上記反応の生成物の量を、光学的測定により検出すること、
を含む。
　本発明の皮膚感作性測定試薬は、例えば、リン酸緩衝液などの水系緩衝液、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの有機溶媒に溶解し、さらに、必要に応じてリン酸緩衝液などの水系緩衝液または別の有機溶媒で希釈した形態で、例えば約０．０１μｍｏｌ／Ｌ～約１ｍｏｌ／Ｌ程度、通常約１μｍｏｌ／Ｌ～約１００μｍｏｌ／Ｌ程度の上記有機化合物の濃度として使用すればよい。
　被験物質の種類は特に限定されないが、例えば、香料、精油、高分子化合物、医薬品、農薬、食品、化学製品、及び天然物由来成分からなる植物抽出液のうちの少なくとも１種である。被験物質は、例えば、水またはメタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの有機溶媒またはこれらの混合溶媒に、例えば約０．０１μｍｏｌ／Ｌ～約１ｍｏｌ／Ｌ程度の濃度、通常約０．１ｍｍｏｌ／Ｌ～約５００ｍｍｏｌ／Ｌ程度の濃度となるように溶解すればよく、被験物質の析出を防ぐ目的においては、好ましくは、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ～１００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ～１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度となるように溶解すればよい。
　本発明の皮膚感作性測定試薬の測定主薬である上記有機化合物と被験物質溶液とは、上記有機化合物と被験物質のモル濃度比が例えば１：２００～１０：１となるように混合し反応させればよい。反応は、上記有機化合物と被験物質とを含む溶液を、例えば約４℃～約６０℃程度の温度範囲にて保温しながら、通常約１分～約２日間程度攪拌又は静置することによって行うことができる。
　上記反応により、上記有機化合物と被験物質との反応性を調べることによって、被験物質の皮膚感作性を測定することができる。上記の反応性を調べるためには、皮膚感作性測定試薬溶液と被験物質溶液との混合液中における上記有機化合物の残存量及び／又は上記有機化合物と被験物質との反応生成物の生成量を分析すればよい。この分析を経時的に行うことにより、上記有機化合物と被験物質との反応速度定数を求め、異なる被験物質の反応速度定数を比較することや、被験物質の反応速度定数を動物実験により皮膚感作性の有無や強度が確認されている化合物について求めた反応速度定数と比較することにより、被験物質の皮膚感作性を評価することができる。
　なお、残存量を分析する場合、皮膚感作性測定試薬は反応液中で何らかの変化を起こす可能性がある場合は、必要に応じて被験物質のみを含まない反応液（コントロール群）を別途用意して分析を行い、この反応液中の残量の値を元にして補正しても良い。
　本発明の方法においては、皮膚感作性測定試薬と被験物質とを反応させる工程で得られる反応物を、クロマトグラフィー処理することを含んでいてもよい。即ち、化合物及び上記反応により生成した化合物の分析方法としては、特に限定されないが、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などにより、上記反応により生成した化合物、上記有機化合物及び被験物質を分離して分析することができる。
　上記ＨＰＬＣ、ＧＣ又はＴＬＣに用いることのできるクロマトグラフ手法としては、逆相、順相、イオン交換などを挙げることができる。このようなクロマトグラフ手法に使用可能な市販のカラムやＴＬＣとしては、例えば、ＬＣカラムとしてはＣＡＰＣＥＬＬ－ＰＡＫ（大阪ソーダ製）、Ｌ－ｃｏｌｕｍｎ　ＯＤＳ（化学品評価研究機構製）、Ｓｈｏｄｅｘ　Ａｓａｈｉｐａｋ　（昭和電工製）などを挙げることができ、ＴＬＣプレートではシリカゲル６０Ｆ２５４（メルク社製）、Ｓｉｌｉｃａ　Ｇｅｌ　Ｐｌａｔｅ（ナカライテスク社製）などを挙げることができる。
　上記反応により生成した化合物又は残存する上記有機化合物の検出方法は、特に限定されないが、例えば上記ＨＰＬＣ分析で利用することのできる検出器としては、紫外可視検出器、近赤外検出器、蛍光検出器、示差屈折率検出器、電気伝導度検出器、蒸発光散乱検出器などが挙げられる。紫外可視検出器としては、例えば、単波長紫外可視検出器、二波長紫外可視検出器、フォトダイオードアレイ検出器などを挙げることができる。また、このような検出法に使用可能な市販の検出器としては、紫外可視検出器、示差屈折率検出器、電気伝導度検出器の場合、島津製作所製、日立製作所製、ウォーターズ製、資生堂製などの検出器、蒸発光散乱検出器としては島津製作所製などが挙げられる。
　本発明の一例においては、被験物質と皮膚感作性測定試薬との反応後の皮膚感作性測定試薬（求核試薬とも言う）の減少率を、紫外線検出器を用いた光学的測定により検出してもよい。紫外線検出器としては、市販の検出器を使用することができ、島津製作所社製、ウォーターズ社製、日立製作所社製、アジレント・テクノロジー社製などが挙げられる。
　紫外線検出器を用いた光学的測定においては、検出波長は、好ましくは２００～７００ｎｍであり、より好ましくは２００～６００ｎｍであり、より好ましくは２２０～５５０ｎｍであり、さらに好ましくは２８０～４８０ｎｍである。
　本発明の別の例においては、被験物質と皮膚感作性測定試薬との反応後の皮膚感作性測定試薬（求核試薬とも言う）の減少率を、蛍光検出器を用いた光学的測定により検出してもよい。
　基底状態の分子は、励起光を吸収して励起状態へ遷移する。吸収した励起エネルギーの一部は、振動エネルギーなどにより失活し、振動準位の低い位置に無輻射遷移した後、基底状態に戻る際に発する光が蛍光である。蛍光検出器を用いた光学的測定は、吸光光度法に比べて一般に１０３倍以上高感度な分析手法と言われる。さらに蛍光物質を測定対象とするため、選択性に優れ、かつ極微量の分析手段として用いられる。蛍光強度は蛍光物質の濃度に比例するため、検量線を作成することで定量分析が可能である。蛍光検出器としては、市販の検出器を使用することができ、島津製作所社製、ウォーターズ社製、日立製作所社製、アジレント・テクノロジー社製、大阪ソーダ社製などが挙げられる。
　蛍光検出器を用いた光学的測定においては、励起波長が好ましくは２００～８００ｎｍであり、より好ましくは２００～６００ｎｍであり、さらに好ましくは２００～５５０ｎｍであり、さらに一層好ましくは２００～５００ｎｍであり、特に好ましくは２００～４８０ｍである。蛍光波長は、好ましくは２００～１０００ｎｍであり、より好ましくは２００～８００ｎｍであり、さらに好ましくは２００～７００ｎｍであり、特に好ましくは２００～６５０ｎｍである。
　皮膚感作性測定試薬（求核試薬とも言う）の減少率は、紫外線検出器または蛍光検出器を用いた光学的測定における皮膚感作性測定試薬（求核試薬とも言う）のピーク面積の平均値から、次式に従って計算することができる。
　求核試薬の減少率（％　ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）＝［１－（反応後の未反応の求核試薬のピーク面積の平均値／標準の求核試薬のピーク面積の平均値）］×１００
　本発明の皮膚感作性測定試薬を用いた測定方法における検出は、上記に限定されず、例えば、特開２００３－１４７６１号公報又は特開２００８－１３９２７５号公報に記載の方法を参照して、分子量等に基づく、特定の質量のイオン検出により行ってもよい。
　以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜用語の説明＞
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＮＭＰ：Ｎ－メチル－２－ピロリドン
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
（化合物１の合成）
　１－ナフチル酢酸（富士フイルム和光純薬社製）２６９ｍｇとジメチルホルムアミド１０ｍＬ（富士フイルム和光純薬社製）をナスフラスコに入れて溶解させ、１，１’－カルボニルジイミダゾール（富士フイルム和光純薬社製）２３４ｍｇを添加して２時間攪拌した。その後、Ｓ－トリチル－Ｌ－システイン（Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ）（東京化成社製）５００ｍｇと、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（富士フイルム和光純薬社製）２５０μＬを添加し、２時間攪拌した。反応終了後、反応液に水を加え、酢酸エチル（富士フイルム和光純薬社製）で抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製）で乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ別した後にろ液を真空留去することによって中間粗生成物　Ｎー（２ー（ナフタレン－１－イル）アセチル）－Ｓ－トリチル－Ｌ－システイン６９０ｍｇを得た。
　次に、中間粗生成物６９０ｍｇとジメチルホルムアミド１０ｍＬ（富士フイルム和光純薬社製）をナスフラスコに入れて溶解させ、１，１’－カルボニルジイミダゾール（富士フイルム和光純薬社製）２３０ｍｇを添加して２時間攪拌した。次に、ヒドラジン一水和物（富士フイルム和光純薬社製）７２ｍｇを添加して２時間攪拌した。その後、反応液に水を加え、酢酸エチル（富士フイルム和光純薬社製）で抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製）で乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ別した後にろ液を真空留去した。
　次に、上記留去物にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（富士フイルム和光純薬社製）：トリイソプロピルシラン（東京化成社製）：水（＝９５：２．５：２．５）２ｍＬを添加した。２時間攪拌した後に減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を液体クロマトグラフィーにて精製した後、減圧下溶媒を留去し、凍結乾燥することによって白色固体（化合物１）を９５ｍｇ得た。
Ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ＭＳ（ＥＳＩ　ｍ／ｚ）：３０４．３　（Ｍ＋Ｈ）、ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０３
（化合物２～５の合成）
　化合物１の合成法に準じて合成した。
　化合物２は、化合物１の合成に用いたＳ－トリチル－Ｌ－システイン（Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ）の代わりにＳ－トリチル－Ｌ－ホモシステイン（文献記載の方法で合成、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１９９６，　ｖｏｌ．　３９，＃７，ｐ．１３６）を用いた以外は化合物１の合成法に準じて合成した。
　化合物３は、化合物１の合成に用いたＳ－トリチル－Ｌ－システイン（Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ）の代わりにＳ－トリチル－イソシステイン（文献記載の方法で合成、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２００８，　ｖｏｌ．　１６，＃１，ｐ．６５）を用いた以外は化合物１の合成法に準じて合成した。
　化合物４は、化合物１の合成に用いたＳ－トリチル－Ｌ－システイン（Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ）の代わりに（２Ｒ）－２－（ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）－３－［（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｓｕｌｆａｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ（ＣｈｅｍＳｈｕｔｔｌｅ社製）を用いた以外は化合物１の合成法に準じて合成した。
　化合物５は、化合物１の合成に用いたＳ－トリチル－Ｌ－システイン（Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ）の代わりに４－メルカプトフェニルアラニン（Ｃｈｅｍｓｐａｃｅ社製）を用いた以外は化合物１の合成法に準じて合成した。
（化合物６の合成）
　２－Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｒｅｓｉｎ（渡辺化学工業社製）を固相合成用レジンとして用いて、ペプチド固相合成を行った。レジンは０．０５ｍｍｏｌ相当量を使用した。塩化メチレン（富士フイルム和光純薬社製）で膨潤させたレジンに、０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化メチレン溶液に調整したＮ－α－（９－Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－Ｌ－ａｓｐａｒｔｉｃ　ａｃｉｄ　β－ａｌｌｙｌ　ｅｓｔｅｒ（渡辺化学工業社製）０．０７５ｍｍｏｌとジイソプロピルエチルアミン０．４ｍＬ（東京化成社製）を添加し２時間振とうさせた。反応後、塩化メチレンとＮ－メチル－２－ピロリドン（富士フイルム和光純薬社製）で洗浄した。次に、１－ナフチル酢酸（富士フイルム和光純薬社製）の縮合とアリル基の脱保護を行った後、２－［（Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｓｕｌｆａｎｙｌ］ｅｔｈａｎａｍｉｎｅ（Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ社製）を縮合した。ペプチド合成終了後、レジンをジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社製）で洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（富士フイルム和光純薬社製）：トリイソプロピルシラン（東京化成社製）：水（＝９５：２．５：２．５）２ｍＬを加え、ペプチドをレジンから切断しながら脱保護も同時に行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ－ヘキサン（富士フイルム和光純薬社製）：メチル－ｔ－ブチルエーテル（富士フイルム和光純薬社製）（＝１：１）１２ｍＬを加え、固体を生じさせた。遠心分離によって固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル－ｔ－ブチルエーテル（富士フイルム和光純薬社製）で固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。次に、中間粗生成物をジメチルホルムアミド２ｍＬ（富士フイルム和光純薬社製）に溶解させ、１，１’－カルボニルジイミダゾール（富士フイルム和光純薬社製）３２ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を添加して２時間攪拌した。次に、ヒドラジン一水和物（富士フイルム和光純薬社製）２５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を添加して２時間攪拌した。その後、反応液に水を加え、酢酸エチル（富士フイルム和光純薬社製）で抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製）で乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ別した後にろ液を真空留去した。得られた残渣を液体クロマトグラフィーにて精製した後、減圧下溶媒を留去し、凍結乾燥することによって白色固体を得た。
（化合物７の合成）
　化合物７は、化合物６の合成に用いた２－［（Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｓｕｌｆａｎｙｌ］ｅｔｈａｎａｍｉｎｅの代わりに（Ｒ）－２－ａｍｉｎｏ－３－（ｔｒｉｔｙｌｔｈｉｏ）ｐｒｏｐａｎ－１－ｏｌ（ＡｓｔａＴｅｃｈ社製）を用いた以外は化合物６の合成法に準じて合成した。
（化合物８の合成）
　２－Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｒｅｓｉｎ（渡辺化学工業社製）を固相合成用レジンとして用いて、ペプチド固相合成を行った。レジンは０．０５ｍｍｏｌ相当量を使用した。塩化メチレン（富士フイルム和光純薬社製）で膨潤させたレジンに、０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化メチレン溶液に調整したＮ－α－（９－Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－Ｌ－ａｓｐａｒｔｉｃ　ａｃｉｄ　β－ａｌｌｙｌ　ｅｓｔｅｒ（文献記載の方法で合成、Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１３，ｖｏｌ．　１５，＃１９，ｐ．５０７６）０．０７５ｍｍｏｌとジイソプロピルエチルアミン０．４　ｍＬ（東京化成社製）を添加し２時間振とうさせた。反応後、塩化メチレンとＮ－メチル－２－ピロリドン（富士フイルム和光純薬社製）で洗浄した。次に、１－ナフチル酢酸（富士フイルム和光純薬社製）の縮合とアリル基の脱保護を行った後、Ｓ－トリチルーＬ－システインーアリルエステル（文献記載の方法で合成、Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　２０１３，ｖｏｌ．１５，＃１９，ｐ．５０７６）の縮合とアリル基の脱保護を行った後、さらに、３－アミノピリジン（富士フイルム和光純薬社製）の縮合を行った。
　ペプチド合成終了後、レジンをジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社製）で洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（富士フイルム和光純薬社製）：トリイソプロピルシラン（東京化成社製）：水（＝９５：２．５：２．５）２ｍＬを加え、ペプチドをレジンから切断しながら脱保護も同時に行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ－ヘキサン（富士フイルム和光純薬社製）：メチル－ｔ－ブチルエーテル（富士フイルム和光純薬社製）（＝１：１）１２ｍＬを加え、固体を生じさせた。遠心分離によって固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル－ｔ－ブチルエーテル（富士フイルム和光純薬社製）で固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。次に、中間粗生成物をジメチルホルムアミド２ｍＬ（富士フイルム和光純薬社製）に溶解させ、１，１’－カルボニルジイミダゾール（富士フイルム和光純薬社製）３２ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を添加して２時間攪拌した。次に、ヒドラジン一水和物（富士フイルム和光純薬社製）２５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を添加して２時間攪拌した。その後、反応液に水を加え、酢酸エチル（富士フイルム和光純薬社製）で抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製）で乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ別した後にろ液を真空留去した。得られた残渣を液体クロマトグラフィーにて精製した後、減圧下溶媒を留去し、凍結乾燥することによって白色固体を得た。
（化合物９の合成）
　化合物９は、化合物８の合成に用いた３－アミノピリジンの代わりにシクロプロピルアミン（東京化成社製）を用いた以外は化合物８の合成法に準じて合成した。
（化合物１０の合成）
　２－Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｒｅｓｉｎ（渡辺化学工業社製）を固相合成用レジンとして用いて、ペプチド固相合成を行った。レジンは０．０５ｍｍｏｌ相当量を使用した。塩化メチレン（富士フイルム和光純薬社製）で膨潤させたレジンに、０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化メチレン溶液に調整したＮ－α－Ｆｍｏｃ－Ｎ－β－ａｌｌｏｃ－Ｌ－ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（Ｉｒｉｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）０．０７５ｍｍｏｌとジイソプロピルエチルアミン０．４ｍＬ（東京化成社製）を添加し２時間振とうさせた。反応後、塩化メチレンとＮ－メチル－２－ピロリドン（富士フイルム和光純薬社製）で洗浄した。次に、１－ナフチル酢酸（富士フイルム和光純薬社製）の縮合とアリル基の脱保護を行った後、Ｎ－α－（９－Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－Ｓ－ｔｒｉｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ（渡辺化学工業社製）を縮合した。次に、Ｆｍｏｃ基を脱保護した後、２－チオフェンカルボン酸（富士フイルム和光純薬社製）を縮合し、Ｎ－メチル－２－ピロリドンで洗浄した。
　ペプチド合成終了後、レジンをジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社製）で洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（富士フイルム和光純薬社製）：トリイソプロピルシラン（東京化成社製）：水（＝９５：２．５：２．５）２ｍＬを加え、ペプチドをレジンから切断しながら脱保護も同時に行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ－ヘキサン（富士フイルム和光純薬社製）：メチル－ｔ－ブチルエーテル（富士フイルム和光純薬社製）（＝１：１）１２ｍＬを加え、固体を生じさせた。遠心分離によって固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル－ｔ－ブチルエーテル（富士フイルム和光純薬社製）で固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。次に、中間粗生成物をジメチルホルムアミド２ｍＬ（富士フイルム和光純薬社製）に溶解させ、１，１’－カルボニルジイミダゾール（富士フイルム和光純薬社製）３２ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を添加して２時間攪拌した。次に、ヒドラジン一水和物（富士フイルム和光純薬社製）２５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を添加して２時間攪拌した。その後、反応液に水を加え、酢酸エチル（富士フイルム和光純薬社製）で抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製）で乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ別した後にろ液を真空留去した。得られた残渣を液体クロマトグラフィーにて精製した後、減圧下溶媒を留去し、凍結乾燥することによって白色固体を得た。
（化合物１１の合成）
　２－Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｒｅｓｉｎ（渡辺化学工業社製）を固相合成用レジンとして用いて、ペプチド固相合成を行った。レジンは０．０５ｍｍｏｌ相当量を使用した。塩化メチレン（富士フイルム和光純薬社製）で膨潤させたレジンに、０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化メチレン溶液に調整した（９Ｈ－ｆｌｕｏｒｅｎ－９－ｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ　Ｎ－（２－ｓｕｌｆａｎｙｌｅｔｈｙｌ）ｃａｒｂａｍａｔｅ（文献記載の方法で合成、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　２００５，ｖｏｌ．４６，＃　４３，ｐ．７４４３）０．０７５ｍｍｏｌとジイソプロピルエチルアミン０．４ｍＬ（東京化成社製）を添加し２時間振とうさせた。反応後、塩化メチレンとＮ－メチル－２－ピロリドン（富士フイルム和光純薬社製）で洗浄した。次に、Ｎ－α－（９－Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－Ｌ－ａｓｐａｒｔｉｃ　ａｃｉｄ　β－ａｌｌｙｌ　ｅｓｔｅｒ（渡辺化学工業社製）と、１－ナフチル酢酸（富士フイルム和光純薬社製）の縮合を行った。アリル基の脱保護を行った後、ヒドラジン一水和物（富士フイルム和光純薬社製）を縮合した。
　ペプチド合成終了後、レジンをジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社製）で洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（富士フイルム和光純薬社製）：トリイソプロピルシラン（東京化成社製）：水（＝９５：２．５：２．５）２ｍＬを加え、ペプチドをレジンから切断しながら脱保護も同時に行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ－ヘキサン（富士フイルム和光純薬社製）：メチル－ｔ－ブチルエーテル（富士フイルム和光純薬社製）（＝１：１）１２ｍＬを加え、固体を生じさせた。遠心分離によって固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル－ｔ－ブチルエーテル（富士フイルム和光純薬社製）で固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣を液体クロマトグラフィーにて精製した後、減圧下溶媒を留去し、凍結乾燥することによって白色固体を得た。
（化合物１２の合成）
　化合物１２は、化合物１１の合成に用いた（９Ｈ－ｆｌｕｏｒｅｎ－９－ｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ　Ｎ－（２－ｓｕｌｆａｎｙｌｅｔｈｙｌ）ｃａｒｂａｍａｔｅ　の代わりに（９Ｈ－ｆｌｕｏｒｅｎ－９－ｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ　（Ｒ）－２－（ｍｅｒｃａｐｔｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（文献記載の方法で合成、Ｓｙｎｌｅｔｔ，２０１０，＃７，ｐ．１０３７）を用いた以外は化合物１１の合成法に準じて合成した。
（化合物１３の合成）
　７－クロロ－４－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾール（東京化成社製）１２０ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）とジメチルホルムアミド１０ｍＬ（富士フイルム和光純薬社製）をナスフラスコに入れて溶解させ、Ｓ－トリチル－Ｌ－システイン（Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ）（東京化成社製）２００ｍｇ（０．５５ｍｍｏｌ）と，　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（富士フイルム和光純薬社製）２５０μＬを添加し、２時間攪拌した。反応終了後、反応液に水を加え、酢酸エチル（富士フイルム和光純薬社製）で抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製）で乾燥した。
　次に、中間粗生成物全量とジメチルホルムアミド５ｍＬ（富士フイルム和光純薬社製）をナスフラスコに入れて溶解させ、１，１’－カルボニルジイミダゾール（富士フイルム和光純薬社製）１１３ｍｇ（０．７ｍｍｏｌ）を添加して２時間攪拌した。次に、ヒドラジン一水和物（富士フイルム和光純薬社製）５０ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）を添加して２時間攪拌した。その後、反応液に水を加え、酢酸エチル（富士フイルム和光純薬社製）で抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製）で乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ別した後にろ液を真空留去した。
　次に、上記留去物にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（富士フイルム和光純薬社製）：トリイソプロピルシラン（東京化成社製）：水（＝９５：２．５：２．５）２ｍＬを添加した。２時間攪拌した後に減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を液体クロマトグラフィーにて精製した後、減圧下溶媒を留去し、凍結乾燥することによって白色固体を得た。
（化合物１４の合成）
　２－Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｒｅｓｉｎ（渡辺化学工業社製）を固相合成用レジンとして用いて、ペプチド固相合成を行った。レジンは０．０５ｍｍｏｌ相当量を使用した。塩化メチレン（富士フイルム和光純薬社製）で膨潤させたレジンに、０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化メチレン溶液に調整したＮ－α－（９－Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－Ｌ－ａｓｐａｒｔｉｃ　ａｃｉｄ　β－ａｌｌｙｌ　ｅｓｔｅｒ（渡辺化学工業社製）０．０７５ｍｍｏｌとジイソプロピルエチルアミン０．４ｍＬ（東京化成社製）を添加し２時間振とうさせた。反応後、塩化メチレンとＮ－メチル－２－ピロリドン（富士フイルム和光純薬社製）で洗浄した。次に、２－［（Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｓｕｌｆａｎｙｌ］ｅｔｈａｎａｍｉｎｅ（Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ社製）の縮合とアリル基の脱保護を行った後、ｍｏｎｏ－Ｆｍｏｃ　ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｄｉａｍｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを縮合した。次に、Ｆｍｏｃ基を脱保護した後、７－クロロ－４－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾール（東京化成社製）１２ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）のＮ－メチル－２－ピロリドン溶液２ｍＬを添加して１時間振とうし、Ｎ－メチル－２－ピロリドンで洗浄した。
　ペプチド合成終了後、レジンをジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社製）で洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（富士フイルム和光純薬社製）：トリイソプロピルシラン（東京化成社製）：水（＝９５：２．５：２．５）２ｍＬを加え、ペプチドをレジンから切断しながら脱保護も同時に行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ－ヘキサン（富士フイルム和光純薬社製）：メチル－ｔ－ブチルエーテル（富士フイルム和光純薬社製）（＝１：１）１２ｍＬを加え、固体を生じさせた。遠心分離によって固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル－ｔ－ブチルエーテル（富士フイルム和光純薬社製）で固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。次に、中間粗生成物をジメチルホルムアミド２ｍＬ（富士フイルム和光純薬社製）に溶解させ、１，１’－カルボニルジイミダゾール（富士フイルム和光純薬社製）３２ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を添加して２時間攪拌した。次に、ヒドラジン一水和物（富士フイルム和光純薬社製）２５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を添加して２時間攪拌した。その後、反応液に水を加え、酢酸エチル（富士フイルム和光純薬社製）で抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製）で乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ別した後にろ液を真空留去した。得られた残渣を液体クロマトグラフィーにて精製した後、減圧下溶媒を留去し、凍結乾燥することによって白色固体を得た。
（化合物１５の合成）
　２，６－Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｄｉａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（Ａ１　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｌａｂ社製）３００ｍｇとＮ－ヒドロキシスクシンイミド（東京化成社製）２９５ｍｇとジメチルホルムアミド１０ｍＬ（富士フイルム和光純薬社製）をナスフラスコに入れた。次に、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（同仁化学研究所社製）６７１ｍｇを添加し、２時間攪拌した。反応終了後、反応液に水を加え、酢酸エチル（富士フイルム和光純薬社製）で抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製）で乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ別し、ろ液を真空留去した。その後、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン（富士フイルム和光純薬社製）：酢酸エチル（富士フイルム和光純薬社製）＝１：０～０．７：０．３）で精製して白色固体ビス（１，　５－ジオキソピロリジン－１－イル）２，２’－（ナフタレン－２，６－ジイル）ジアセテート４８０ｍｇを得た。
Ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ＭＳ（ＥＳＩ　ｍ／ｚ）：４３９．２　（Ｍ＋Ｈ）、ＲＴ（ｍｉｎ）：１．２１
　次に、ビス（１，　５－ジオキソピロリジン－１－イル）２，２’－（ナフタレン－２，６－ジイル）ジアセテートを５６ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ）とＳ－トリチル－Ｌ－システインアミド（Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ社製）２３ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）とジメチルホルムアミド１ｍＬ（富士フイルム和光純薬社製）をナスフラスコに入れ、６５℃のオイルバスに浸けて３時間攪拌した。その後、反応液を室温まで冷却させ、ヒドラジン一水和物（富士フイルム和光純薬社製）２５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を添加し１時間攪拌した。反応終了後、反応液に水を加え、酢酸エチル（富士フイルム和光純薬社製）で抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製）で乾燥した。無水硫酸ナトリウムをろ別し、ろ液を真空留去した。次に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（富士フイルム和光純薬社製）：トリイソプロピルシラン（東京化成社製）：水（＝９５：２．５：２．５）１ｍＬを加え、２時間後ｎ－ヘキサン（富士フイルム和光純薬社製）：メチル－ｔ－ブチルエーテル（富士フイルム和光純薬社製）（＝１：１）６ｍＬを加え、固体を生じさせた。遠心分離によって固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル－ｔ－ブチルエーテル（富士フイルム和光純薬社製）で固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣を液体クロマトグラフィーにて精製した後、減圧下溶媒を留去し、凍結乾燥することによって白色固体を得た。
（比較例１の合成）
　Ｒｉｎｋ　Ａｍｉｄｅ－ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（Ｂｉｏｔａｇｅ社製）（０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を固相合成用レジンとして用いて、ペプチド固相合成を行った。レジンは１１１．１ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）使用した。
　（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－Ｓ－トリチル－Ｌ－システイン　（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ）（渡辺化学工業社製）、１－ナフチル酢酸（富士フイルム和光純薬社製）の順に縮合を行った。伸長終了後、レジンをジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社製）で洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（富士フイルム和光純薬社製）：トリイソプロピルシラン（東京化成社製）：水（＝９５：２．５：２．５）２ｍＬを加え、ペプチドをレジンから切断しながら脱保護も同時に行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ－ヘキサン（富士フイルム和光純薬社製）：メチル－ｔ－ブチルエーテル（富士フイルム和光純薬社製）（＝１：１）１２ｍＬを加え、固体を生じさせた。遠心分離によって固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル－ｔ－ブチルエーテル（富士フイルム和光純薬社製）で固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣を液体クロマトグラフィーにて精製した後、減圧下溶媒を留去し、凍結乾燥することによって白色固体を６．４ｍｇ得た。
Ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ＭＳ（ＥＳＩ　ｍ／ｚ）：２８９．２（Ｍ＋Ｈ）、ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０９
ペプチド自動合成装置によるペプチド固相合成法
　ペプチド自動合成装置（Ｂｉｏｔａｇｅ社製　ＳｙｒｏI）を用いてペプチド固相合成を行った。合成装置に固相合成用レジン、レジンに対して４当量のＦｍｏｃアミノ酸　（０．５ｍｏｌ／Ｌ）のＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）溶液、レジンに対して４当量のシアノ－ヒドロキシイミノ－酢酸エチルエステル（１ｍｏｌ／Ｌ）のＮＭＰ溶液、レジンに対して４当量のジイソプロピルカルボジイミド（１ｍｏｌ／Ｌ）のＮＭＰ溶液、ピペリジン（２０％ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液をセットし合成を行った。Ｆｍｏｃ脱保護（２０分）、ＮＭＰによる洗浄、Ｆｍｏｃアミノ酸の縮合（１時間）、ＮＭＰによる洗浄を１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことで、ペプチド鎖を伸長させた。
　アリル基の脱保護においては、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（東京化成社製）５８ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）とクロロホルム（富士フイルム和光純薬社製）１．８５ｍＬと酢酸（富士フイルム和光純薬社製）０．１ｍＬとＮメチルモルホリン（富士フイルム和光純薬社製）０．０５ｍＬを添加し、２時間振とうさせた。反応終了後、ＮＭＰで洗浄した。
　得られた粗生成物の精製は液体クロマトグラフィーによって行った。
カラム：Ｗａｔｅｒｓ社製　Ｘ　Ｓｅｌｅｃｔ　ＣＳＨ　Ｐｒｅｐ　Ｃ１８　５μｍ　ＯＢＤ（１９ｘ２５０ｍｍ）
カラム温度：４０度
流速：２０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：２２０ｎｍ、２５４ｎｍ
溶媒：Ａ液：０．１％ギ酸－水
　　　Ｂ液：０．１％ギ酸－アセトニトリル
Ｆｍｏｃアミノ酸は渡辺化学工業株式会社より入手した。
Ｎ－メチル－２－ピロリドン、ジイロプロピルエチルアミン、ジイソプロピルカルボジイミド、ピペリジン、無水酢酸は富士フイルム和光純薬株式会社から入手した。シアノ－ヒドロキシイミノ－酢酸エチルエステルは東京化成工業株式会社より入手した。
　質量スペクトル（ＭＳ）は、ＡＣＱＵＩＴＹ　ＳＱＤ　ＬＣ／ＭＳ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ社、イオン化法：ＥＳＩ（ＥｌｅｃｔｒｏＳｐｒａｙ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、エレクトロスプレーイオン化）法を用いて測定した。
　保持時間（ＲＴ）は、ＡＣＱＵＩＴＹ　ＳＱＤ　ＬＣ／ＭＳ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて測定し、分（ｍｉｎ）で示した。
カラム：Ｗａｔｅｒｓ社製ＢＥＨＣ　１８　１．７μｍ，２．１ｘ３０　ｍｍ
溶媒：Ａ液：０．１％ギ酸－水
　　　Ｂ液：０．１％ギ酸－アセトニトリル
グラジエントサイクル：０．００ｍｉｎ（Ａ液／Ｂ液＝９５／５）、２．００ｍｉｎ（Ａ液／Ｂ液＝５／９５）、３．００ｍｉｎ（Ａ液／Ｂ液＝９５／５）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：２５４ｎｍ
（比較例２の合成）
　特開２００９－２２２４６６の実施例１～５を参考に合成した。
＜試験法＞
（１）各種溶液調製
（１－１）０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ水溶液
１）　１５ｍＬ容量のコニカルチューブにＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ（同仁化学製）を３７．２ｍｇ秤量し、２５ｍＬメスピペットを使って１０ｍＬの蒸留水（光製薬製、日本薬局方注射用水）を加え、溶解させる（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ水溶液）。
２）　１００ｍＬ容量の容器に蒸留水（光製薬製、日本薬局方注射用水）を５０ｍＬメスピペットを使って４９．５ｍＬ加え、そこに上記１）の１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ水溶液を０．５ｍｌ添加して混合し１００倍希釈する　（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ水溶液）。
（１－２）１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４およびｐＨ８．０）
１）　１００ｍＬ容量の容器に無水リン酸二水素ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製、特級）を０．６ｇ秤量し、５０ｍＬメスピペットを使って５０ｍＬの蒸留水（光製薬製、日本薬局方注射用水）を加え、溶解させる。
２）　５００ｍＬ容量の容器に５０ｍＬ（又は１００ｍＬ）メスピペットを使って３００ｍＬの蒸留水（光製薬製、日本薬局方注射用水）を加える。
３）　無水リン酸水素二ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製、特級）を４．２６ｇ秤量し、２）の蒸留水（光製薬製、日本薬局方注射用水）に添加して溶解させる。
４）　ｐＨメーターでｐＨ測定しながら、３）の無水リン酸水素二ナトリウム溶液に１）の無水リン酸二水素ナトリウム溶液を２５ｍＬメスピペットを使って適量添加し、ｐＨ７．４またはｐＨ８．０に調製する。
５）　５０ｍＬメスピペットを使って４）の溶液から２９９ｍＬを新たな５００ｍＬ容量の容器に移し、そこに０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ水溶液を１ｍＬ添加して３００ｍＬにする。この溶液中のＥＤＴＡの濃度は０．３３μｍｏｌ／Ｌであり、反応液中での濃度は０．２５μｍｏｌ／Ｌとなる。
６）　上記溶液を０．２２μｍのフィルターでろ過滅菌する。
（１－３）反応停止液
１）ＵＶ検出用反応停止液（２．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液）
　蒸留水（富士フイルム和光純薬社製）１００ｍＬにＴＦＡ（富士フイルム和光純薬製、特級）を２．５ｍＬ添加する。
２）蛍光検出用反応停止液（０．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液）
　蒸留水（富士フイルム和光純薬社製）１００ｍＬにＴＦＡ（富士フイルム和光純薬製、特級）を０．５ｍＬ添加する。
（１－４）ＨＰＬＣ移動相Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液
　蒸留水（富士フイルム和光純薬社製）１ＬにＴＦＡを１．０ｍＬ添加する。
（１－５）ＨＰＬＣ移動相Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡアセトニトリル溶液
　ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル（富士フイルム和光純薬社製、ＨＰＬＣ用）１ＬにＴＦＡ１．０ｍＬを添加する。
（２）求核試薬ストック液調製
　１試験では同一のストック溶液を使用し、１試験毎に使い切れる量に小分けして保存する。具体的な調製例を以下に示す。
１）　求核試薬は、その分子量に応じてＤＭＳＯ（富士フイルム和光純薬社製）に溶解し、２ｍｍｏｌ／Ｌの求核試薬溶液を調製する。
２）　５００ｍＬ容量の容器に同緩衝液を５０ｍＬメスピペットを使って１４９．５ｍＬ加え、そこに上記の２ｍｍｏｌ／Ｌの求核試薬溶液を０．５ｍＬ添加し、転倒混和をして３００倍希釈する（６．６６７μｍｏｌ／Ｌ）。この溶液は、－７０℃以下で冷凍保管する。
（３）被験物質溶液の調製
　１ｍｍｏｌ／Ｌの被験物質溶液が調製できる溶媒を水、アセトニトリル、アセトン及び５％ＤＭＳＯのアセトニトリル溶液の優先順位に従って１種類選定する。水、アセトニトリル、アセトンを選定した場合には、まず２０ｍｍｏｌ／Ｌの被験物質溶液を調製する。適当量秤量した被験物質に対して、２０ｍｍｏｌ／Ｌ溶液になるように溶媒を加えて、完全に溶解する。その後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ溶液の一部を分取し、同じ溶媒で２０倍希釈して、１ｍｍｏｌ／Ｌの被験物質溶液を調製する。５質量％ＤＭＳＯのアセトニトリル溶液を選定した場合には、上記同様、２０ｍｍｏｌ／ＬのＤＭＳＯ溶液を調製する。その後、この一部を分取し、アセトニトリルで２０倍希釈して、１ｍｍｏｌ／Ｌの被験物質溶液を調製する。
（４）反応
（４－１）添加
　被験物質溶液は９６ウェルプレート（Ｕ９６ ＰＰ－０．５ ＭＬ ＮＡＴＵＲＡＬ、Ｔｈｅｒｍｏ （ＮＵＮＣ）社）上で主に１２連ピペットを用いて調製し、以下の用量に従って試薬を添加する。
求核試薬：１５０μＬ
被験物質溶液：５０μＬ
（４－２）反応
　プレートシール（ＴＯＲＡＳＴTM　９６ｗｅｌｌ　Ｓｅａｌ　Ｅ　Ｔｙｐｅ、島津ジーエルシー社）でしっかり密封し、プレートシェーカー（Ｔｉｔｒａｍａｘ １００、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ社）で攪拌する。遠心機でスピンダウンしたのち、２５℃、２４時間、遮光状態でインキュベートする。
（４－３）反応停止
　２４時間インキュベートした後、プレートシールを剥がし、後述のＨＰＬＣ測定において、ＵＶ検出で測定する場合は各サンプルにＵＶ検出用反応停止液（２．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液）を５０μＬずつ添加して反応を停止させる。蛍光検出で測定する場合は新たなプレートに蛍光検出用反応停止液（０．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液）を１８０μＬ分注し、そこにインキュベート後の反応液を２０μＬ添加して反応を停止させる。
（５）ＨＰＬＣ測定
　求核試薬のＨＰＬＣ測定条件を以下に示す。なお、溶出条件は、求核試薬によって、条件１、条件２又は条件３を選択した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000040
（６）データ解析
（６－１）減少率の算出
　求核試薬のピーク面積の平均値から、次式に従って求核試薬の減少率を計算する。
求核試薬の減少率（％ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）＝［１－（反応後の未反応の求核試薬のピーク面積／標準の求核試薬ピーク面積の平均値）］×１００
（７）評価項目
（７－１）求核試薬の安定性（特に、システインの酸化の程度）
　反応液調製直後（０時間）及び反応液を２５℃、２４時間インキュベーションした後（２４時間）の反応液を、それぞれＨＰＬＣ－ＵＶで測定する。この際、求核試薬と求核試薬の酸化体および変化体がＨＰＬＣ上で確認できるため、下記式に基づいて、求核試薬の残存率を算出する。
求核試薬の残存率（％）＝求核試薬の面積値／（求核試薬の面積値＋求核試薬の酸化体の面積値＋求核試薬の変化体の面積値）×１００
（７－２）求核試薬の蛍光検出感度
　蛍光検出は、ナフタレン環の持つ蛍光（励起波長：２８４ｎｍ、蛍光波長：３３３ｎｍで検出されるピーク面積）を求める。
（７－３）感作性物質との反応性評価
　反応性の評価には、以下の表に示す１５物質を使用した。なお、これら１５物質は先行技術のＤＰＲＡおよびＡＤＲＡにおいて感作性と非感作性を区別するのが困難な物質を含むように選んだ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
　反応性は、先行技術のＤＰＲＡにおけるシステインペプチドおよびリジンペプチドの減少率（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）、ＡＤＲＡにおけるＮＡＣおよびＮＡＬの減少率、Ｎ末端がアミド型のＮＡＣ（ＮＡＣ－ａｍｉｄｅ）、特開２００９－２２２４６６に記載の試薬（ＧＳＨ－ＮＢＤ）の減少率と比較した。
＜実施例１＞
　求核試薬１種類（化合物１）を評価した。なお、１５種類の評価物質に対する反応性の比較対照として、以下の化合物についても同様に評価した。
Ｃｙｓ　ｐｅｐｔｉｄｅ：
Ｌｙｓ　ｐｅｐｔｉｄｅ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
ＮＡＣ：Ｎ－[２－(ナフタレン－１－イル)アセチル]システイン
ＮＡＬ：α－Ｎ－［２－（ナフタレン－１－イル）アセチル］リジン
ＮＡＣ－ａｍｉｄｅ：(R)-3-メルカプト-2-(2-(ナフタレン-1-イル)アセトアミド)プロパンアミド
ＧＳＨ－ＮＢＤ：特開２００９－２２２４６６の段落００４３に記載の化合物
（被験物質及び溶液調製）
　上記の「（７－３）感作性物質との反応性評価」に示した１５物質について、１ｍｍｏｌ／Ｌ溶液を調製して試験に使用した。なお、化合物１については上記の「（２）求核試薬ストック液調製」において６．６６７μｍｏｌ／Ｌ溶液を調製する際にｐＨ７．４またはｐＨ８．０の緩衝液を使用して調製したストック液を用い、ＮＡＣ－ａｍｉｄｅおよびＧＳＨ－ＮＢＤについてはｐＨ８．０の緩衝液を使用して調製したストック液のみを用いた。
（測定条件）
　上記の「（５）ＨＰＬＣ測定」に記載のＨＰＬＣ測定条件により、求核試薬ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ（％）を求めた。ただし、ＧＳＨ－ＮＢＤにおいてはＨＰＬＣにおける検出を、検出波長３３８ｎｍのＵＶ検出で実施した。
（結果）
（１）求核試薬の安定性
　化合物１について、溶液調製直後（０時間）及び２４時間経過後の残存率を算出した。結果を図１に示す。化合物１は０時間で９０％以上、２４時間経過後でも８５%以上残存しており、大きく残存率が減少することはなかった。
（２）求核試薬の蛍光検出感度
　ｐＨ８．０の緩衝液を用いてストック溶液を調製した求核試薬について、溶液調製直後（０時間）における蛍光強度（ＨＰＬＣにおけるピーク面積）を測定した。結果を図２に示す。求核試薬を定量するのに十分なピーク面積が検出された。
（３）求核試薬の反応性
　化合物１について、１５種類の評価物質についての反応性を算出した。上記の「（７－３）感作性物質との反応性評価」の表２に記載のＮｏ．１から８の物質における各求核試薬のｄｅｐｌｅｔｉｏｎと比較した結果を図３に、Ｎｏ．９から１５の物質における同様の結果を図４に示す。
　その結果、まずＤＰＲＡにおけるシステインペプチド（Ｃｙｓ　ｐｅｐｔｉｄｅ）およびリジンペプチド（Ｌｙｓ　ｐｅｐｔｉｄｅ）と比較した場合、感作性物質であるノナノイルクロリド、ピルビン酸メチル、１０－ウンデセナール、α-ペンチルシンナムアルデヒド、シクラメンアルデヒドの５種類について化合物１の方がシステインペプチドおよびリジンペプチドよりも高い反応性を示した。これに対し、同じく感作性物質の内、硫酸ジエチル、3-プロピリデンフタリド、トロポロン、安息香酸フェニルの４種類についてはシステインペプチドまたはリジンペプチドと比較すると反応性が低かったが、いずれもｄｅｐｌｅｔｉｏｎが５％以上あり、ある程度の反応性が確認された。また、非感作性物質であるが、ＤＰＲＡにおいてシステインペプチドと反応性がみられる１－ブロモブタンおよび１－ヨードヘキサンにおいては化合物１では反応性は見られず、実際の感作性情報（非感作性）に見合った結果となった。上記以外の４物質（ジフェニルシクロプロペノン、トリメリト酸無水物、４'-メトキシアセトフェノン、ベンゾイル酢酸エチル）については、システインペプチドまたはリジンペプチドと同程度の反応性を示した。
　次にＡＤＲＡにおけるＮＡＣおよびＮＡＬと比較した場合、感作性物質であるジフェニルシクロプロペノン、ノナノイルクロリド、ピルビン酸メチル、硫酸ジエチル、トロポロン、１０－ウンデセナール、α-ペンチルシンナムアルデヒド、安息香酸フェニル、シクラメンアルデヒドの９種類についてＮＡＣおよびＮＡＬよりも高い反応性を示した。一方、トリメリト酸無水物については化合物１よりもＮＡＬの方が高い反応性を示したが、化合物１のｄｅｐｌｅｔｉｏｎは４１．０％（ｐＨ７．４）および３７．２％（ｐＨ８．０）であり、十分な反応性が確認された。上記以外の５物質（３－プロピリデンフタリド、１－ブロモブタン、１－ヨードヘキサン、４'-メトキシアセトフェノン、ベンゾイル酢酸エチル）については、ＮＡＣまたはＮＡＬと同程度の反応性を示した。
　ＮＡＣ－ａｍｉｄｅと比較した場合、感作性物質であるトリメリト酸無水物、ピルビン酸メチル、１０－ウンデセナール、α-ペンチルシンナムアルデヒド、シクラメンアルデヒドの５種類について化合物１の方が高い反応性を示した。上記以外の１０物質（ジフェニルシクロプロペノン、ノナノイルクロリド、硫酸ジエチル、３－プロピリデンフタリド、トロポロン、安息香酸フェニル、１－ブロモブタン、１－ヨードヘキサン、４'-メトキシアセトフェノン、ベンゾイル酢酸エチル）については、ＮＡＣ－ａｍｉｄｅと同程度の反応性を示した。
　ＧＳＨ－ＮＢＤと比較した場合、感作性物質であるピルビン酸メチル、硫酸ジエチル、１０－ウンデセナール、α-ペンチルシンナムアルデヒド、シクラメンアルデヒドの５種類について化合物1の方が高い反応性を示した。これに対し、トリメリト酸無水物およびノナノイルクロリドについてはＧＳＨ－ＮＢＤのほうが高い反応性であったが、化合物１のｄｅｐｌｅｔｉｏｎはいずれも３５％以上であり、十分な反応性が確認された。上記以外の８物質（ジフェニルシクロプロペノン、３－プロピリデンフタリド、トロポロン、安息香酸フェニル、１－ブロモブタン、１－ヨードヘキサン、４'-メトキシアセトフェノン、ベンゾイル酢酸エチル）については化合物１とＧＳＨ－ＮＢＤで同程度の反応性であった。
　化合物１、ＮＡＣ－ａｍｉｄｅおよびＧＳＨ－ＮＢＤにおける１５種類の評価物質に対する反応性（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）について、先行技術のＡＤＲＡにおいてＮＡＣ単独で皮膚感作性を予測する方法における判定条件である５．６％のｄｅｐｌｅｔｉｏｎを判定基準として皮膚感作性の予測を行った。この化合物１の結果について、上記で行ったＮＡＣ－ａｍｉｄｅおよびＧＳＨ－ＮＢＤの予測結果と文献で公表されているＤＰＲＡおよびＡＤＲＡの予測結果それぞれとの比較を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
　上記の結果、ＤＰＲＡでは誤って陰性と判定された感作性物質４種類（ノナノイルクロリド、ピルビン酸メチル、１０－ウンデセナール、α-ペンチルシンナムアルデヒド）について、化合物１では正しく陽性と判定された。同様にＡＤＲＡでは誤って陰性と判定された感作性物質８種類（ピルビン酸メチル、硫酸ジエチル、３－プロピリデンフタリド、トロポロン、１０－ウンデセナール、α-ペンチルシンナムアルデヒド、安息香酸フェニル、シクラメンアルデヒド）について、化合物１では正しく陽性と判定された。ＮＡＣ－ａｍｉｄｅに対しては、誤って陰性と判定された感作性物質５種類（トリメリト酸無水物、ピルビン酸メチル、３－プロピリデンフタリド、１０－ウンデセナール、α-ペンチルシンナムアルデヒド）について化合物１では正しく陽性と判定された。ＧＳＨ－ＮＢＤに対しては、誤って陰性と判定された感作性物質４種類（ピルビン酸メチル、硫酸ジエチル、３－プロピリデンフタリド、α-ペンチルシンナムアルデヒド）について、化合物１では正しく陽性と判定された。また、ＤＰＲＡでは誤って陽性と判定された非感作性物質２種類（１－ブロモブタン、１－ヨードヘキサン）について、化合物１では正しく陰性と判定された。
　以上より、化合物１は先行技術のＤＰＲＡおよびＡＤＲＡよりも高感度に感作性物質を予測できる可能性があり、従来の皮膚感作測定方法では予測が難しかった感作性物質も正しく評価できる可能性が高いと考えられる。

Claims (14)

  1. メルカプト基とヒドラジド構造とを有し、かつ、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する有機化合物を測定主薬として含む、皮膚感作性測定試薬。
  2. 前記有機化合物が、下記式（１）又は（２）で表される、請求項１に記載の皮膚感作性測定試薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     式中、
    Ａ１は、窒素原子、又は以下の連結基を示す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、炭素数２～１０のアルケニル基、炭素数２～１０のアルキニル基、炭素数３～１０のシクロアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルケニル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、又はシクロアルケニル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、炭素数５～６のシクロアルケニル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、メルカプトメチル基、水酸基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    ＊は、Ｘ１、Ｙ１、Ｚ１との連結位置を示す。
    Ｘ１およびＸ２は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数２～１０のアルケニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数２～１０のアルキニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルケニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、又はシクロアルケニル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、炭素数５～６のシクロアルケニル基、アミノ基、シアノ基、メルカプトメチル基、水酸基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｙ１およびＹ２は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示す。
    Ｚ１およびＺ２は、－ＣＯ－ＮＲ２１ＮＲ２２Ｒ２３を示し、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
  3. 前記有機化合物が、下記式（１０）で表される、請求項１に記載の皮膚感作性測定試薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     式中、
    Ａ１０は、窒素原子、又は３価の連結基を示し、
    Ｘ１０は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数２～１０のアルケニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数２～１０のアルキニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルケニル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ１０１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ１０１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ１０１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、又はシクロアルケニル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、炭素数５～６のシクロアルケニル基、アミノ基、シアノ基、メルカプトメチル基、水酸基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｙ１０は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示し、
    Ｌは、アミノ基を示す。
  4. 前記有機化合物が、下記式（３）、（４）又は（５）で表される、請求項１に記載の皮膚感作性測定試薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     式中、
    Ａ３は、炭素数１又は２の３価の炭化水素基を示し、
    Ｒ３は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ３１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ３１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ３１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｘ３は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ３２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ３２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ３２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｙ３は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示す。
    Ｚ３は、－ＣＯ－ＮＲ３１ＮＲ３２Ｒ３３を示し、Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     式中、
    Ａ４は、炭素数１又は２の３価の炭化水素基を示し、
    Ｒ４は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ４１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ４１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ４１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｘ４は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ４２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ４２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ４２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｙ４は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示す。
    Ｚ４は、－ＣＯ－ＮＲ４１ＮＲ４２Ｒ４３を示し、Ｒ４１、Ｒ４２、及びＲ４３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     式中、
    Ａ５は、炭素数１又は２の３価の炭化水素基を示し、
    Ｒ５は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ５１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ５１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ５１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｘ５は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ５２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ５２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ５２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｙ５は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示す。
    Ｚ５は、－ＣＯ－ＮＲ５１ＮＲ５２Ｒ５３を示し、Ｒ５１、Ｒ５２、及びＲ５３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
    Ｑは、水素原子、カルボキシル基、水酸基、または１級アミド構造を示すか、あるいは－ＣＯ－ＮＲ５aＮＲ５ｂＲ５ｃを示し、Ｒ５a、Ｒ５ｂ、及びＲ５ｃはそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
  5. 前記有機化合物が、下記式（６）で表される、請求項１に記載の皮膚感作性測定試薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     式中、
    Ｒ６は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ６１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ６１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ６１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｘ６は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ６２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ６２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ６２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｚ６は、－ＣＯ－ＮＲ６１ＮＲ６２Ｒ６３を示し、Ｒ６１、Ｒ６２、及びＲ６３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
    ｎは、０あるいは１を示し、
    ｍは、０あるいは１を示す。
  6. 前記有機化合物が、下記式（７）で表される、請求項１に記載の皮膚感作性測定試薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     式中、
    Ｒ７は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ７１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ７１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ７１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｘ７は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ７２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ７２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ７２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｗは、ＮＲ７１－ＮＲ７２Ｒ７３を示し、Ｒ７１、Ｒ７２、及びＲ７３は、水素原子、又は炭素数１～３のアルキル基を示し、
    ｎは０あるいは１を示す。
  7. Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５、及びＹ１０が、蛍光を発する基である、請求項２から４の何れか一項に記載の皮膚感作性測定試薬。
  8. 下記式（３）、（４）又は（５）で表される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     式中、
    Ａ３は、炭素数１又は２の３価の炭化水素基を示し、
    Ｒ３は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ３１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ３１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ３１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｘ３は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ３２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ３２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ３２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｙ３は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示す。
    Ｚ３は、－ＣＯ－ＮＲ３１ＮＲ３２Ｒ３３を示し、Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     式中、
    Ａ４は、炭素数１又は２の３価の炭化水素基を示し、
    Ｒ４は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ４１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ４１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ４１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｘ４は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ４２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ４２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ４２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｙ４は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示す。
    Ｚ４は、－ＣＯ－ＮＲ４１ＮＲ４２Ｒ４３を示し、Ｒ４１、Ｒ４２、及びＲ４３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     式中、
    Ａ５は、炭素数１又は２の３価の炭化水素基を示し、
    Ｒ５は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ５１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ５１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ５１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｘ５は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ５２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ５２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ５２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｙ５は、紫外、可視光又は近赤外域に吸収スペクトルを有する構造を含む炭素数６～２０の基を示す。
    Ｚ５は、－ＣＯ－ＮＲ５１ＮＲ５２Ｒ５３を示し、Ｒ５１、Ｒ５２、及びＲ５３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
    Ｑは、水素原子、カルボキシル基、水酸基、または１級アミド構造を示すか、あるいは－ＣＯ－ＮＲ５ａＮＲ５ｂＲ５ｃを示し、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、及びＲ５ｃはそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
  9. 下記式（６）で表される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     式中、
    Ｒ６は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ６１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ６１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ６１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｘ６は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ６２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ６２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ６２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｚ６は、－ＣＯ－ＮＲ６１ＮＲ６２Ｒ６３を示し、Ｒ６１、Ｒ６２、及びＲ６３はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。
    ｎは、０あるいは１を示し、
    ｍは、０あるいは１を示す。
  10. 下記式（７）で表される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     式中、
    Ｒ７は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、又は炭素数３～１０のシクロアルキル基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ７１－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ７１－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ７１は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、メルカプト基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｘ７は、メルカプト基を１個以上有する炭素数１～１０のアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のシクロアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数７～１２のアリールアルキル基、メルカプト基を１個以上有する炭素数３～１０のヘテロアルキルアルキル基、又はメルカプト基を示し、これらは分子鎖中に－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＪ７２－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＪ７２－、又は－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－を含んでいてもよく、Ｊ７２は水素原子又は炭素数１～３のアルキル基を示し、前記のアルキル基、又はシクロアルキル基は、炭素数３～６のシクロアルキル基、アミノ基、シアノ基、水酸基、カルボキシ基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、ピリジル基、ナフチル基、チエニル基、又はフリル基から選択される置換基を有していてもよい。
    Ｗは、ＮＲ７１－ＮＲ７２Ｒ７３を示し、Ｒ７１、Ｒ７２、及びＲ７３は、水素原子、又は炭素数１～３のアルキル基を示し、
    ｎは０あるいは１を示す。
  11. （１）請求項１から７の何れか一項に記載の皮膚感作性測定試薬と被験物質とを反応させること、及び
    （２）前記反応後の前記皮膚感作性測定試薬の量、又は前記反応の生成物の量を、光学的測定により検出すること、
    を含む皮膚感作性の測定方法。
  12. 前記被験物質が、香料、精油、高分子化合物、医薬品、農薬、食品、化学製品、及び天然物由来成分からなる植物抽出液のうちの少なくとも１種である、請求項１１に記載の皮膚感作性の測定方法。
  13. 前記皮膚感作性測定試薬と前記被験物質とを反応させる工程で得られる反応物を、クロマトグラフィー処理することを含む、請求項１１又は１２に記載の皮膚感作性の測定方法。
  14. 前記光学的測定が蛍光検出器を用いた測定であって、励起波長が２００～６００ｎｍであって、蛍光波長が２００～８００ｎｍである、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の皮膚感作性の測定方法。
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