WO2022092067A1 - 細胞凍結保存用の中空糸膜 - Google Patents

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cells
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崇嗣 田島
由典 滝井
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Toyobo Co Ltd
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    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/78—Cellulose

Definitions

  • the present invention relates to a hollow fiber membrane for cryopreserving cells.
  • the vitrification freezing method is known as a method for cryopreserving cells such as egg cells and germ cells.
  • an instrument called Cryotop (registered trademark) is used.
  • the cryotop is a special device with a very thin strip-shaped sheet attached to the tip of the handle.
  • the cells are cryopreserved in liquid nitrogen or the like in a state of being placed on a sheet at the tip of the cryotop together with a freezing liquid such as a vitrifying liquid.
  • a method using a hollow fiber membrane has also been studied for cryopreservation of such cells.
  • the hollow fiber cryopreservation method cells are frozen and stored in a state of being contained inside a hollow fiber membrane composed of cellulose acetate. This method is expected to improve the survival rate of cells after freezing.
  • Patent Document 1 Patent No. 5252556
  • Patent Document 2 Patent No. 5051716
  • Patent Document 3 Patent No. 6667903
  • a support device for hollow fibers for this purpose is disclosed.
  • the conventional hollow fiber membrane is used, for example, for hemodialysis, hemodialysis filtration, etc. as disclosed in Patent Document 4 (Patent No. 5440332) and Patent Document 5 (Patent No. 5212837). Hollow fiber membranes made of cellulose acetate are known.
  • Japanese Patent No. 5252556 Japanese Patent No. 5051716 Japanese Patent No. 6667903 Japanese Patent No. 5440332 Japanese Patent No. 5212837
  • hollow fiber membranes made of cellulose esters such as cellulose acetate are strong due to exposure to extremely low temperatures such as those used for cryopreservation of cells, and volume changes during freezing and subsequent thawing. There was a risk of damage due to the decrease.
  • an object of the present invention is to suppress a decrease in strength of a hollow fiber membrane made of cellulose ester for cell cryopreservation when it is used for cell cryopreservation.
  • a hollow fiber membrane containing cellulose ester for cell cryopreservation A hollow fiber membrane in which the breaking strength when thawed after being frozen by the vitrification freezing method is 80% or more of the breaking strength when wet before freezing.
  • a hollow fiber membrane made of cellulose ester for cell cryopreservation it is possible to suppress a decrease in strength when used for cell cryopreservation.
  • a to B means the upper and lower limits of the range (that is, A or more and B or less), and there is no description of the unit in A and the unit is described only in B.
  • the unit of A is the same as the unit of B.
  • the hollow fiber membrane of the present embodiment can be suitably used for cryopreservation of cells.
  • the target cells include egg cells (fertilized eggs, etc.), embryonic cells, pluripotent stem cells including iPS cells, ES cells, etc., and artificial tissues (cell clumps) such as organoids derived from pluripotent stem cells. Be done.
  • the cell clump may be composed of a plurality of cell types.
  • the cells are cryopreserved in a state of being arranged inside the hollow fiber membrane. Cell suspensions containing disjointed cells may be cryopreserved inside the hollow fiber membrane.
  • the hollow fiber membrane of this embodiment contains a cellulose ester.
  • the ratio of the cellulose ester in the material constituting the hollow fiber membrane is preferably 90% by mass or more, more preferably 95% by mass or more, and further preferably 98% by mass or more.
  • the hollow fiber membrane may be composed only of cellulose ester.
  • the hollow fiber membrane is preferably transparent enough to allow the cells contained therein to be visible. Since the cellulose ester is a highly transparent material, it is preferable that the ratio of the cellulose ester in the material constituting the hollow fiber membrane is high. Further, it is preferable that the hollow fiber membrane does not dissolve in the vitrification liquid and the resin component does not elute into the vitrification liquid. From this viewpoint as well, it is preferable that the ratio of the cellulose ester in the material constituting the hollow fiber membrane is high.
  • cellulose ester examples include cellulose acetate, cellulose phthalate, and cellulose succinate.
  • the cellulose ester is preferably cellulose acetate.
  • Cellulose acetate is resistant to chlorine, which is a bactericidal agent, and can be sterilized with chlorine.
  • cellulose acetate examples include cellulose triacetate, cellulose monoacetate, cellulose diacetate, cellulose acetate butyrate, and cellulose acetate propionate. From the viewpoint of durability and the like, cellulose acetate is preferably cellulose triacetate.
  • cellulose acetate for example, various cellulose acetates having different degrees of vinegarization, degree of polymerization, etc. (L-20, 30, 40, 50, 70, LT-35, 55, 105, etc.) are commercially available from Daicel Chemical Industry Co., Ltd. ing. It is preferable to use cellulose acetate (a polymer having a relatively low viscosity) having a 6% viscosity of more than 140 mPa ⁇ s and less than 200 mPa ⁇ s.
  • the degree of vinegarization of cellulose acetate is preferably 53 to 62%, more preferably 55 to 61.5%, and even more preferably 58 to 61.5%.
  • the degree of vinegarization represents the degree of acetic acid group substitution of the hydroxyl group in cellulose.
  • the theoretical upper limit of the degree of vinegarization is 62.5%, but if the degree of vinegarization is too high, the solubility and moldability may decrease.
  • the hollow fiber membrane of the present embodiment has a breaking strength when thawed after being frozen by the vitrification freezing method, which is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 90% or more, which is the breaking strength when wet before freezing. It is 95% or more.
  • the hollow fiber membrane of the present embodiment has a breaking elongation when thawed after being frozen by the vitrification freezing method, preferably 80% or more, more preferably than the breaking elongation at the time of wetting before freezing. Is 90% or more, more preferably 95% or more.
  • the yield strength when thawed after being frozen by the vitrification freezing method is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, with respect to the yield strength at the time of wetting before freezing. % Or more, more preferably 95% or more.
  • the hollow fiber membrane containing the cellulose ester of the present embodiment suppresses the decrease in strength when used for cryopreservation of cells.
  • breaking strength, breaking elongation and yield strength are measured by the method for measuring the strength elongation (breaking strength, breaking elongation and yield strength) in the examples described later.
  • the vitrification freezing method prevents the crystallization of water, which is said to occur easily at -60 ° C to -15 ° C, by rapidly lowering the temperature by immersing the cells in liquid nitrogen, and in an amorphous glass state.
  • a method of freezing cells This method is superior to the slow freezing method in that it does not cause cell damage due to the formation of ice crystals, the processing time is short, no special equipment is required, and the long-term storage of cells is good.
  • Many specific methods for vitrification and freezing of cells have been developed. As an example, cells are immersed in a freezing-resistant storage solution in liquid nitrogen or in an ultra-low temperature freezer at -80 ° C or lower, more preferably -190 ° C or lower. There is a method of rapidly freezing in.
  • the conditions of the vitrification freezing method for comparing the above-mentioned strong elongations (breaking strength, breaking elongation and yield strength) before and after freezing and thawing are as follows.
  • the inner diameter of the hollow fiber membrane is preferably 30 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less, and more preferably 35 ⁇ m or more and 260 ⁇ m or less.
  • the thickness of the hollow fiber membrane is preferably 20 to 200 ⁇ m, more preferably 30 to 150 ⁇ m. The film thickness can be calculated from "(outer diameter-inner diameter) / 2".
  • the hollow fiber membrane (hollow fiber type membrane) is preferably composed of a semipermeable membrane.
  • the cells are not allowed to pass through the cells housed in the hollow fiber membrane and cryopreserved, but the culture solution, the cryopreservation solution, the frost damage protective substance contained in the preservation solution, etc. are allowed to pass through, so that the inside of the hollow fiber membrane is allowed to pass through. It is possible to maintain the state in which cells are contained in the space. That is, there is an advantage that the culture solution or intracellular fluid in the internal space of the hollow fiber membrane can be easily replaced with the cryopreservation solution.
  • the hollow fiber membrane has a hollow ratio of preferably 10 to 65%, more preferably 12 to 55%.
  • the hollow ratio is a ratio of the area of the hollow portion in the cross section of the hollow fiber membrane, and is expressed as "hollow section cross section / (membrane cross section + hollow section cross section) x 100 (%)".
  • the average pore diameter of the hollow fiber membrane (average pore diameter of the fine pores of the entire membrane) is preferably 10 ⁇ m or less.
  • Examples of the method for measuring the average pore size include a bubble point method and a mercury intrusion method.
  • the hollow fiber membrane of the present embodiment is preferably a membrane having a non-uniform structure (asymmetric structure) in the thickness direction.
  • asymmetric structure a non-uniform structure
  • it is considered to be highly effective in suppressing a decrease in the strength of the hollow fiber membrane due to an extremely low temperature used for cryopreservation of cells, a volume change during freezing and subsequent thawing, and the like. ..
  • the reason is not clear, but one reason is that the non-uniform structure has a higher buffering capacity of the polymer chain than the uniform structure and is less susceptible to changes in the volume of the hollow fiber membrane. ..
  • hollow fiber membrane having an asymmetric structure examples include hollow fiber membranes having different densities (vacancy ratio, cross-sectional aperture ratio) in the thickness direction.
  • one surface side has a dense layer, and this dense layer is a separation active layer that substantially defines the pore size of the hollow fiber membrane, and the other surface side has a dense layer.
  • films having a lower density than the dense layer examples include films having a lower density than the dense layer.
  • the opening ratio of one surface and the opening ratio of the other surface are different.
  • the opening ratio of one surface having a larger opening ratio is preferably 1.1 times or more, more preferably 1.3 times or more the opening ratio of the other surface.
  • the image is binarized into white / black using image analysis software (for example, WinROOF2013), and the inner and outer surfaces of the hollow fiber membrane are quantified. Obtain the opening rate. This is carried out in 10 visual fields, the average is calculated, and the surface aperture ratio is used.
  • image analysis software for example, WinROOF2013
  • the area ratio of the hollow fiber membrane is the area ratio of the real part (the part where the membrane exists) other than the pores in the thickness direction cross section (cross section) of the hollow fiber membrane.
  • the area ratio is determined by analyzing an image of the cross section of the hollow fiber membrane taken by SEM. Specifically, the cross section of the film is divided into three equal parts in the film thickness direction and divided into three regions, and the area ratio is measured for each region.
  • the three regions are a region A including the outer surface, a region B including the inner surface, and a region (central region C) between the regions A and B.
  • the magnification of the SEM may be any magnification as long as the pores and the actual portion can be recognized, and for the measurement of the hollow fiber membrane of the present invention, for example, 5000 to 20000 times is appropriate.
  • the area ratio is calculated by a method using image analysis. Specifically, image analysis software (for example, WinROOF2013) is used to perform binarization processing of the pore portion and the real portion (polymer portion). After the binarization treatment, the area ratio is calculated from the ratio of the total area of the pores to the total area of the polymer.
  • the hollow fiber membrane has the above-mentioned asymmetric structure, but has a feature that the variation in bulk density (area ratio in the cross section in the thickness direction) is small (preferably almost constant) in the thickness direction of the film.
  • the structural characteristics can withstand a sudden temperature change and a volume change of the vitrified liquid. Therefore, it is considered that embrittlement and breakage of the hollow fiber membrane structure due to freezing and thawing can be suppressed, and the membrane strength can be maintained.
  • the small variation in the area ratio in the thickness direction cross section means, for example, that, in the thickness direction cross section, the region A including the outer surface, the region B including the inner surface, and the central region C (between the region A and the region B). It means that the difference in area ratio (%) is small for the area). Specifically, when the area ratios of regions A, B and C are measured, they are selected from a (area ratio of region A), b (area ratio of region B) and c (area ratio of region C). In all combinations of the two area ratios, the absolute value of the difference between the two area ratios is preferably less than 5%, more preferably less than 3% (see the formula below).
  • the region A is a region from the outer surface to a depth of 30% of the film thickness
  • the region B is a region from the inner surface to a depth of 30% of the film thickness.
  • ⁇ 5% More preferably
  • the average area ratio of the cross section in the thickness direction is preferably 40% or more and 70% or less (see the following formula). 40% ⁇ (a + b + c) / 3 ⁇ 70%
  • the hollow fiber membrane has high inner surface smoothness. Due to the high smoothness of the inner surface, even if an egg cell or a germ cell comes into contact with the inner surface of the hollow fiber membrane, the risk of damaging the cell surface can be minimized.
  • high smoothness means that the arithmetic average roughness Ra value is 20 nm or less. The higher the smoothness, the smaller the damage to the cells. Therefore, the Ra value is more preferably 10 nm or less, and further preferably 1 nm or more and less than 8 nm.
  • the arithmetic mean roughness Ra value can be measured using an atomic force microscope (AFM).
  • the present invention also relates to a method for producing a hollow fiber membrane containing the above-mentioned cellulose ester.
  • the method for producing the hollow fiber membrane of the present embodiment is, for example, the following method.
  • the above method for manufacturing a hollow fiber membrane The undiluted spinning solution and the internal solution are discharged from a double tubular nozzle into the coagulating solution via an aerial traveling portion, the undiluted spinning solution is coagulated in the coagulating solution, and the coagulated product of the undiluted spinning solution is pulled from the coagulating solution.
  • the spinning stock solution contains a resin raw material containing a cellulose ester, a solvent and a non-solvent, and contains.
  • the internal liquid contains water and contains water.
  • the temperature of the undiluted spinning solution at the nozzle is 70 to 110 ° C, and the temperature of the internal solution is 40 to 70 ° C.
  • the ratio of the amount of the solvent to the non-solvent in the coagulant is 60/40 to 80/20.
  • the concentration of the cellulose ester in the spinning stock solution is preferably 10 to 30% by mass.
  • the ratio of the amount of the solvent to the total amount of the solvent and the non-solvent is preferably 60 to 80% by mass.
  • the solvent is preferably an aprotic polar solvent.
  • the non-solvent is preferably a glycol ester.
  • the linear distance of the aerial traveling portion is preferably 10 to 50 mm.
  • the spinning dope 10a and the inner liquid 10b are discharged from the double tubular nozzle 11 into the coagulating liquid 21 via the aerial traveling portion (air gap) 20 to spin.
  • the hollow fiber membrane 16 is obtained by coagulating the undiluted solution in the coagulating solution 21 and pulling out the coagulated product of the spinning undiluted solution from the coagulating solution 21.
  • the hollow fiber membrane is pulled out by, for example, the submersible guide 12 and the rollers 13, 14, 15.
  • the nozzle 11 has a double tubular shape and includes an outer tube and an inner tube provided inside the outer tube.
  • the undiluted spinning solution is discharged from the gap (slit) between the outer tube and the inner tube, and the inner solution is discharged from the inside of the inner tube.
  • the ratio of the diameter of the inner diameter (inner diameter of the slit) to the diameter of the outer pipe (outer diameter of the slit) is preferably 110 to 300%, more preferably 110 to 200%.
  • the diameter of the outer tube is preferably 220 to 400 ⁇ m, more preferably 220 to 330 ⁇ m.
  • the diameter of the inner tube is preferably 150 to 330 ⁇ m, more preferably 150 to 270 ⁇ m.
  • the diameter of the inner tube is preferably about the same as the diameter of the hollow fiber membrane.
  • the ratio of the cross-sectional area of the inner pipe to the cross-sectional area of the slit is preferably 80 to 120%.
  • the discharge line speed of the membrane-forming stock solution is the slit cross-sectional area [ ⁇ (a / 2) 2 - ⁇ (b) obtained from the nozzle slit outer diameter (a) and the nozzle slit inner diameter (b) for the discharge amount of the membrane-forming stock solution. / 2) Obtained by dividing by 2 ] (see the formula below).
  • Discharge line speed of the film-forming stock solution [m / min] Discharge amount of the film-forming stock solution / Slit cross-sectional area
  • the take-up speed is the rotation speed (surface speed) of the roller 13 provided at the outlet of the coagulation bath (FIG. 6). reference).
  • the nozzle draft ratio which is the ratio of the discharge line speed to the take-up speed (take-up speed / discharge line speed), is 0.4 to 0.9, preferably 0.5 to 0.9.
  • the linear distance of the aerial traveling portion 20 (distance between the tip of the nozzle 11 and the liquid level of the coagulating liquid 21) is preferably 10 to 50 mm, more preferably 10 to 40 mm.
  • the hollow fiber membrane obtained by the spinning step may be further subjected to a washing step (water washing step) with pure water.
  • a washing step water washing step
  • the flow of water is preferably a flow in the direction opposite to the moving direction of the hollow fiber membrane (counterflow), but even if the flow is in the same direction as the moving direction of the hollow fiber membrane (parallel flow). good.
  • the spinning stock solution 10a contains a resin raw material containing the above-mentioned cellulose ester, a solvent and a non-solvent.
  • the temperature (set temperature) of the undiluted spinning solution at the nozzle 11 is 70 to 110 ° C, preferably 70 to 100 ° C.
  • the concentration of the cellulose ester in the spinning stock solution is preferably 10 to 30% by mass, more preferably 10 to 25% by mass. If the concentration of cellulose ester is too low, the strength of the hollow fiber membrane will be low. On the other hand, if the concentration of the cellulose ester is too high, the viscosity of the undiluted spinning solution becomes too high, which may make spinning difficult.
  • the solvent is a liquid that can dissolve cellulose ester.
  • the solvent is preferably a polar solvent and is preferably soluble in water.
  • the polar solvent is preferably an aprotic polar solvent.
  • Examples of the aprotonic polar solvent include N-methylpyrrolidone (NMP), dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide (DMA), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile and the like.
  • the non-solvent is a liquid (excluding water) that does not dissolve the cellulose ester.
  • the non-solvent include glycol esters, glycerin, alcohols and the like, and glycol esters are preferable.
  • the glycol ester include ethylene glycol, triethylene glycol (TEG), polyethylene glycol (polyethylene glycol 200, polyethylene glycol 400, etc.), propylene glycol and the like.
  • the ratio (S / NS ratio) of the amount of the solvent (S) to the non-solvent (NS) is 60/40 to 80/20, more preferably 65/35 to 75/25. If the S / NS ratio in the undiluted spinning solution is too small, the dissolution of the cellulose ester becomes unstable, so that the spinning stability may be lowered or an asymmetric structure suitable for the application of the present invention may not be obtained. When the S / NS ratio becomes large, a hollow fiber membrane having an asymmetric structure may not be obtained, or spinning stability may decrease.
  • the undiluted spinning solution may further contain water in addition to the solvent and the non-solvent.
  • the order of addition and the mixing method of the resin raw material containing the cellulose ester which is the constituent material of the hollow fiber membrane, the solvent and the non-solvent are not particularly limited.
  • the internal liquid contains water.
  • the content of water in the internal liquid is 95 to 100% by mass, preferably 98 to 100% by mass.
  • the inner surface of the hollow fiber membrane is preferably highly smooth. This is because the damage caused by contact with the cells to be cryopreserved can be reduced.
  • the inner surface should be quickly solidified (fixed) before being affected by disturbance to prevent excessive phase separation. preferable. Further, it is preferable not to apply an external force such as stretching to the inner surface during and after solidification, and to suppress fluctuations in the inner diameter after the hollow fiber membrane structure is fixed as much as possible.
  • an inner liquid 10b having a high coagulability with respect to the spinning stock solution 10a In order to quickly coagulate the inner surface, it is preferable to use an inner liquid 10b having a high coagulability with respect to the spinning stock solution 10a, or to adopt a spinning stock solution composition and temperature conditions that facilitate coagulation. Therefore, in the production method of the present embodiment, an internal liquid containing water having high coagulation property with respect to the spinning stock solution containing cellulose ester is used.
  • ethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol 200 or 400, glycerin, propylene glycol and the like, which are generally used as non-solvents for cellulose esters, can also be used alone or in combination.
  • the upper limit is 5% by weight of N-methylpyrrolidone, dimethylacetamide, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, etc., which are the solvents of the non-solvent and the cellulose triacetate polymer, as components other than water. Can be added as.
  • the temperature (set temperature) of the internal liquid in the nozzle 11 is 40 to 70 ° C, preferably 45 to 65 ° C. As described above, the temperature (set temperature) of the undiluted spinning solution at the nozzle 11 is 70 to 110 ° C., but the internal solution is preferably set to a temperature lower than this.
  • the temperature of the internal liquid in the nozzle 11 is preferably 10 ° C. or higher, more preferably 20 ° C. or higher, and even more preferably 30 ° C. or higher, as compared with the temperature of the undiluted spinning solution in the nozzle 11.
  • a temperature difference is provided between the undiluted spinning solution and the internal solution to provide coagulation (coagulation) on the inner surface of the undiluted spinning solution (hollow fiber membrane). It is preferable to increase the speed). By increasing the solidification rate of the inner surface, a hollow fiber membrane having an asymmetric structure (a structure non-uniform in the thickness direction) can be obtained.
  • adjusting the composition of the coagulating liquid to be described later to a specific range or adjusting the nozzle draft enhances the smoothness of the inner surface of the hollow fiber membrane.
  • a nozzle having a structure capable of controlling the temperature of the undiluted spinning solution and the internal solution separately until just before discharge.
  • the coagulant preferably contains a solvent and a non-solvent (excluding water).
  • the coagulating liquid may further contain water in addition to the solvent and the non-solvent.
  • the ratio of the total amount of the solvent and the non-solvent in the coagulating liquid is 60 to 90% by mass, preferably 65 to 90% by mass.
  • the temperature of the coagulating liquid is preferably 20 to 60 ° C, more preferably 30 to 50 ° C.
  • Example 1 The hollow fiber membrane of Example 1 was manufactured under the following conditions by the method for producing a hollow fiber membrane described in the embodiment.
  • composition of coagulant Solvent (S): NMP Non-solvent (NS): TEG Concentration of water coagulant [(mass of S + mass of NS) / mass of coagulant]: 78 mass% The S / NS ratio is the same as the undiluted spinning solution.
  • Discharge temperature of undiluted spinning solution (set temperature): 93 ° C
  • Distance of the aerial traveling part (air gap length): 25 mm, Dwelling time of aerial traveling part: 0.025 seconds
  • Coagulant temperature 43 ° C Pulling speed: 60m / min Nozzle draft ratio: 0.78
  • Examples 2 and 3 As shown in Table 1, the nozzle draft ratio was changed.
  • the hollow fiber membranes of Examples 2 and 3 were manufactured in the same manner as in Example 1 except for the above points.
  • Table 2 shows the results of measuring the arithmetic mean roughness and the area ratio of the inner surface of the obtained hollow fiber membrane.
  • Comparative Examples 1 and 2 As shown in Table 1, the composition of each of the undiluted spinning solution, the internal solution and the coagulating solution, and each production condition were changed. Liquid paraffin is used as the internal liquid, and the set temperature of the internal liquid is not particularly controlled and is about the same as the temperature of the undiluted spinning solution.
  • the hollow fiber membranes of Comparative Example 1 and Comparative Example 2 were manufactured in the same manner as in Example 1 except for the above points.
  • a sample having a smooth cross section was obtained by immersing the wet hollow fiber membrane in liquid nitrogen, freezing it, taking it out of liquid nitrogen, and immediately bending and cutting it.
  • the sample was fixed on the sample table so that the cross section could be observed, and carbon vapor deposition was performed on the cross section of the sample.
  • the cross section of the sample after vapor deposition was imaged using a scanning electron microscope (S-2500 manufactured by Hitachi) at an acceleration voltage of 5 kV and a magnification of 10000 times.
  • S-2500 manufactured by Hitachi
  • the pores and the polymer were binarized using the image analysis software WinROOF2013.
  • the area ratio was calculated from the ratio of the pore portion and the polymer portion.
  • the region A is a region from the outer surface to a depth of 30% of the film thickness
  • the region B is a region from the inner surface to a depth of 30% of the film thickness.
  • the structure may become unclear due to part of the cross section being melted by cutting or electron beam. In that case, measure using the part where the structure is clear, or change the sample and take a picture. I took it again. Table 2 shows the measurement results of the area ratio.
  • ⁇ Croze storage test> The hollow fiber membranes of Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 and 2 were subjected to a cryopreservation test using a vitrification freezing method.
  • the conditions of the vitrification freezing method are the same as the conditions for measuring the above-mentioned breaking strength (breaking strength when thawed after being frozen by the vitrification freezing method).
  • the initial dry state (“dry state”) the wet state with water (“wet state”), and the equilibrium liquid infiltrate.
  • the inner and outer diameters of the hollow thread film are measured using a projector (Nikon PROFILE PROJECTOR V-12). Specifically, the dimensions of the outer surface of the hollow fiber membrane in the XX and YY directions (two orthogonal directions on the cross section) are measured for each hollow fiber membrane cross section, and the arithmetic average value of these values is calculated. The outer diameter was set to one hollow fiber membrane cross section.
  • the dimensions of the hollow fiber in the XX and YY directions were measured for each hollow fiber membrane cross section, and the arithmetic mean value was taken as the inner diameter of one hollow fiber membrane cross section. ..
  • the 10 cross sections were measured in the same manner, and the average values were taken as the inner diameter and the outer diameter.
  • the film thickness (average value) is calculated by the formula "(outer diameter-inner diameter) / 2" based on the measurement results (average value) of the inner diameter and the inner diameter of the hollow fiber membrane.
  • the measurement result (average value) of the inner diameter of the hollow fiber membrane is shown in Table 3 (FIG. 1), and the measurement result (average value) of the film thickness is shown in Table 4 (FIG. 2).
  • the inner diameter and the film thickness could not be measured because the strength of the hollow fiber membrane was low after melting and a cross-sectional sample of the hollow fiber membrane could not be prepared.
  • a tensile tester (UTMII manufactured by Toyo Baldwin) to cut one hollow fiber membrane to a length of about 15 cm so that there is no slack between the chucks (distance about 10 cm).
  • the hollow fiber membrane was pulled at a crosshead speed of 10 cm / min under a temperature and humidity environment of 20 ⁇ 5 ° C. and 60 ⁇ 10% Rh, and measurement was performed. From the obtained SS curve, the load per single yarn (breaking strength), elongation (breaking elongation) at the breaking point of the hollow fiber membrane, and the load (yield strength), elongation (yield strength) per single yarn at the yield point. Yield elongation) was read.
  • the load and the elongation were obtained by using the method shown in [0061] of JP-A-2011-212638.
  • the measurement results of the breaking strength, the breaking elongation and the yield strength are shown in Tables 5 to 7 (FIGS. 3 to 5).
  • each of the Example and the Comparative Example was measured 5 times, and the average value thereof is shown as a measured value.
  • the breaking strength in the hollow fiber membrane of the comparative example is 95% or more of the breaking strength in the wet state (“wet state”) before freezing.
  • the breaking elongation or yield strength in the thawed state after freezing by the vitrification freezing method is the breaking elongation or yield strength in the wet state before freezing (“wet state”). It is 95% or more.
  • the hollow fiber membrane of the example can suppress the decrease in strength when used for cryopreservation of cells.
  • cells are frozen and thawed by the vitrification freezing method (cryotop method) using Cryotop (registered trademark, manufactured by Kitasato Corporation), which is a commercially available cell cryopreservation device, and then survived. The number of cells was measured and the survival rate was calculated.
  • the evaluation results of the above survival rate are shown in Table 8 together with the number of test cells (the number of cells subjected to the test) and the number of surviving cells.
  • the conditions of the vitrification freezing method are the same as those for measuring the above-mentioned strong elongation.
  • the cells are cryopreserved in a state of being contained inside the hollow fiber membrane. gone.
  • the ratio (survival rate) of the viable cells after thawing was higher than that of the commercially available product or the comparative example. .. From this result, it can be seen that the hollow fiber membranes of Examples 1 to 3 can be suitably used for cell cryopreservation.

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Abstract

細胞凍結保存用のセルロースエステル製の中空糸膜において、細胞の凍結保存に用いられた際の強度の低下を抑制する。セルロースエステルを含む細胞凍結保存用の中空糸膜であって、ガラス化凍結法によって凍結された後に融解されたときの破断強度が、凍結前の湿潤時の破断強度の８０％以上である、中空糸膜。

Description

細胞凍結保存用の中空糸膜
　本発明は、細胞凍結保存用の中空糸膜に関する。
　卵細胞、胚細胞等の細胞の凍結保存方法として、ガラス化凍結法が知られている。ガラス化凍結法では、クライオトップ（登録商標）と呼ばれる器具が用いられる。クライオトップは、柄の先端に非常に薄い短冊状のシートが取り付けられた専用器具である。細胞は、クライオトップの先端のシート上にガラス化液などの凍結用の液と共に載置された状態で、液体窒素等により凍結保存される。
　近年、このような細胞の凍結保存において、中空糸膜を用いる方法（中空糸凍結保存法）も検討されている。中空糸凍結保存法では、細胞は酢酸セルロースから構成される中空糸膜の内部に収容された状態で凍結して保存される。この方法では、凍結後の細胞の生存率が向上すると期待される。
　しかし、中空糸膜は比較的もろい素材であり、凍結保存に用いたときに破損するおそれがあり、取扱い性に問題があった。例えば、特許文献１（特許第５２５２５５６号公報）、特許文献２（特許第５０５１７１６号公報）および特許文献３（特許第６６６７９０３号公報）には、凍結保存の際の中空糸の取扱い性を向上させるための中空糸の支持器具等が開示されている。
　なお、従来の中空糸膜としては、例えば、特許文献４（特許第５４４０３３２号公報）および特許文献５（特許第５２１２８３７号公報）に開示されるような、血液透析、血液透析ろ過などに用いられる酢酸セルロースからなる中空糸膜が知られている。
特許第５２５２５５６号公報 特許第５０５１７１６号公報 特許第６６６７９０３号公報 特許第５４４０３３２号公報 特許第５２１２８３７号公報
　上述のように、酢酸セルロースなどのセルロースエステル製の中空糸膜は、細胞の凍結保存に用いられるような極めて低い温度にさらされることや、凍結およびその後の融解の際の体積変化などによって、強度が低下し、破損する虞があった。
　したがって、本発明は、細胞凍結保存用のセルロースエステル製の中空糸膜において、細胞の凍結保存に用いられた際の強度の低下を抑制することを目的とする。
　（１）　セルロースエステルを含む細胞凍結保存用の中空糸膜であって、
　ガラス化凍結法によって凍結された後に融解されたときの破断強度が、凍結前の湿潤時の破断強度の８０％以上である、中空糸膜。
　（２）　厚み方向に不均一な構造を有する、（１）に記載の中空糸膜。
　（３）前記中空糸膜の外表面の平均孔径は、内表面の平均孔径の１．１倍以上である、（１）または（２）に記載の中空糸膜。
　（４）厚み方向断面の平均面積率が４０％以上７０％以下である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の中空糸膜。
　（５）厚み方向断面の面積率の厚み方向における変動が５％未満である、（１）～（４）のいずれか１項に記載の中空糸膜。
　（６）前記中空糸膜の内表面を原子間力顕微鏡により測定したときの算術平均粗さが２０ｎｍ以下である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の中空糸膜。
　本発明によれば、細胞凍結保存用のセルロースエステル製の中空糸膜において、細胞の凍結保存に用いられた際の強度の低下を抑制することができる。
中空糸膜の内径の測定結果を示すグラフである。 中空糸膜の膜厚の測定結果を示すグラフである。 中空糸膜の破断強度の測定結果を示すグラフである。 中空糸膜の破断伸度の測定結果を示すグラフである。 中空糸膜の降伏強度の測定結果を示すグラフである。 中空糸膜の製造方法の一例を説明するための模式図である。
　以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本明細書において「Ａ～Ｂ」という形式の表記は、範囲の上限下限（すなわちＡ以上Ｂ以下）を意味し、Ａにおいて単位の記載がなく、Ｂにおいてのみ単位が記載されている場合、Ａの単位はＢの単位と同じである。
　＜中空糸膜＞
　本実施形態の中空糸膜は、細胞の凍結保存に好適に用いることができる。
　対象となる細胞としては、卵細胞（受精卵等）、胚細胞、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞等を含む多能性幹細胞、多能性幹細胞由来のオルガノイド等の人工的組織（細胞集塊）などが挙げられる。細胞集塊は、複数の細胞種から構成されていてもよい。なお、細胞は、中空糸膜の内部に配置された状態で凍結保存される。バラバラの細胞を含む細胞懸濁液が中空糸膜の内部で凍結保存されてもよい。
（セルロースエステル）
　本実施形態の中空糸膜は、セルロースエステルを含む。中空糸膜を構成する材料中のセルロースエステルの比率は好ましくは９０質量％以上であり、より好ましくは９５質量％以上、さらに好ましくは９８質量％以上である。中空糸膜は、セルロースエステルのみから構成されていてもよい。
　中空糸膜は、その内部に収容された細胞が見える程度の透明性を有することが好ましい。セルロースエステルは透明性が高い材料であるため、中空糸膜を構成する材料中のセルロースエステルの比率が高いことが好ましい。
　また、中空糸膜はガラス化液に溶解せず、ガラス化液中に樹脂成分が溶出しないことが好ましい。この観点からも、中空糸膜を構成する材料中のセルロースエステルの比率が高いことが好ましい。
　セルロースエステルとしては、例えば、酢酸セルロース、フタル酸セルロース、コハク酸セルロースなどが挙げられる。セルロースエステルは、好ましくは酢酸セルロースである。酢酸セルロースは、殺菌剤である塩素に対する耐性があり、塩素による殺菌が可能である。
　酢酸セルロースとしては、例えば、三酢酸セルロース、一酢酸セルロース、二酢酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸プロピオン酸セルロースなどが挙げられる。耐久性等の観点から、酢酸セルロースは、好ましくは三酢酸セルロースである。
　酢酸セルロースとしては、例えば、ダイセル化学工業社より酢化度、重合度等の異なる種々の酢酸セルロース（Ｌ－２０、３０、４０、５０、７０、ＬＴ－３５、５５、１０５など）が市販されている。６％粘度が１４０ｍＰａ・ｓ超２００ｍＰａ・ｓ未満という比較的低粘度の酢酸セルロース（比較的低粘度のポリマー）を用いることが好ましい。
　酢酸セルロースの酢化度は、好ましくは５３～６２％であり、より好ましくは５５～６１．５％であり、さらに好ましくは５８～６１．５％である。なお、酢化度は、セルロース中の水酸基の酢酸基置換度を表す。なお、酢化度の理論上限は６２．５％であるが、酢化度が高すぎると溶解性や成型性が低下する可能性がある。
　（破断強度等の強伸度）
　本実施形態の中空糸膜は、ガラス化凍結法によって凍結された後に融解されたときの破断強度が凍結前の湿潤時の破断強度の８０％以上であり、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
　また、本実施形態の中空糸膜は、ガラス化凍結法によって凍結された後に融解されたときの破断伸度が凍結前の湿潤時の破断伸度に対して、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
　また、本実施形態の中空糸膜は、ガラス化凍結法によって凍結された後に融解されたときの降伏強度が凍結前の湿潤時の降伏強度に対して、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
　このように、本実施形態のセルロースエステルを含む中空糸膜は、細胞の凍結保存に用いられた際の強度の低下が抑制されたものである。
　なお、破断強度、破断伸度および降伏強度は、後述する実施例での強伸度（破断強度、破断伸度および降伏強度）の測定方法により、測定される。
　ガラス化凍結法は、細胞を液体窒素に浸漬するなどして急速に温度を下げることにより－６０℃～－１５℃で生じやすいと言われる水の結晶化を防ぎ、非晶質のガラス状態で、細胞を凍結する方法である。この方法は、氷晶の形成による細胞の損傷が生じない、処理にかかる時間が短い、特別な機器が不要である、細胞の長期保存が良好であるなどの点で、緩慢凍結法より優れている。細胞のガラス化凍結の具体的方法は多数開発されており、一例として、細胞を耐凍性の保存液に浸して液体窒素中や超低温の冷凍庫内で－８０℃以下、より好ましくは－１９０℃以下にて急速に凍結させる方法が挙げられる。
　なお、上記強伸度（破断強度、破断伸度および降伏強度）を凍結および融解の前後で比較する際のガラス化凍結法の条件は、以下のとおりである。
　〔ガラス化凍結法の条件〕
　（平衡液）
　組成：エチレングリコール（７．５質量％）、ジメチルスルホキシド（７．５質量％）および水
　浸漬時間：４分
　（ガラス化液）
　組成：エチレングリコール（１５質量％）、ジメチルスルホキシド（１５質量％）、ショ糖（ガラス化液中０．５Ｍ）および水
　浸漬時間：３０秒
　（凍結保存条件）
　凍結方法：液体窒素（ＬＮ２）中への浸漬
　保存方法：液体窒素（ＬＮ２）中への浸漬したままで１週間保存
　（融解方法）
　融解液（１Ｍショ糖水溶液）に１分間浸漬
　希釈液（０．５Ｍショ糖水溶液）に３分間浸漬
　洗浄液（市販のＴＣＭ１９９培地（ＧＩＢＣＯ社））に５分間浸漬し、さらに同じ組成の別の洗浄液に５分間浸漬
　（中空糸膜の形状等）
　中空糸膜の内径は、好ましくは３０μｍ以上３００μｍ以下であり、より好ましくは３５μｍ以上２６０μｍ以下である。
　中空糸膜の厚みは、好ましくは２０～２００μｍであり、より好ましくは３０～１５０μｍである。なお、膜厚は「（外径－内径）／２」より算出できる。
　中空糸膜（中空糸型の膜）は、半透膜から構成されることが好ましい。中空糸膜内に収容され凍結保存される細胞に対して、細胞は通過させないが、培養液や凍結保存液、前記保存液に含まれる凍害保護物質などを通過させるので、中空糸膜内の内部空間に細胞が内包された状態を維持できる。すなわち、中空糸膜の内部空間の培養液や細胞内液などを凍結保存溶液に置換することが容易にできるという利点があるからである。
　中空糸膜の中空率は、好ましくは１０～６５％であり、より好ましくは１２～５５％である。なお、中空率は、中空糸膜の横断面における中空部の面積の割合であり、「中空部断面積／（膜部断面積＋中空部断面積）×１００（％）」で表される。
　中空糸膜の平均孔径（膜全体の微細孔の平均孔径）は、１０μｍ以下であることが好ましい。平均孔径の測定方法としては、例えば、バブルポイント法や水銀圧入法が挙げられる。
　本実施形態の中空糸膜は、厚み方向に不均一な構造（非対称構造）を有する膜であることが好ましい。中空糸膜は非対称構造を有する場合、細胞の凍結保存に用いられるような極めて低い温度、凍結およびその後の融解の際の体積変化などによる中空糸膜の強度低下を抑制する効果が高いと考えられる。その理由は明らかではないが、不均一な構造の方が均一な構造よりもポリマー鎖の緩衝能力が高くなり、中空糸膜の体積変化等の影響を受けにくくなることが一つの理由として考えられる。
　非対称構造を有する中空糸膜としては、例えば、厚み方向で密度（空孔率、断面開孔率）などが異なる中空糸膜が挙げられる。このような中空糸膜としては、例えば、一方の表面側に緻密層を有し、この緻密層が実質的に中空糸膜の孔径を規定する分離活性層となっており、他方の表面側は緻密層よりも密度が低いような膜が挙げられる。
　非対称構造を有する中空糸膜では、一方の表面の開孔率と他方の表面の開孔率とが異なることが好ましい。開孔率が大きい方の一方の表面の開孔率は、他方の表面の開孔率の１．１倍以上であることが好ましく、１．３倍以上であることがより好ましい。このような非対称構造を有することにより、ガラス化凍結において中空糸膜の外側の溶液から中空糸膜内部の溶液への伝熱が速やかに生じるために氷晶の生成を抑制でき、膜構造や細胞へのダメージを抑えているものと考えられる。
　なお、膜表面の開孔率の測定においては、まず、中空糸膜を１０，０００倍の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて撮像する。得られた画像より、縦７６２pixel×横６２０pixelの領域を切り出した後、画像解析ソフト（例えば、ＷｉｎＲＯＯＦ２０１３）を使用し、白／黒に画像を二値化し、中空糸膜の内表面および外表面の開孔率を求める。これを１０視野実施してその平均を求め、表面開孔率とする。
　中空糸膜の面積率は、中空糸膜の厚み方向断面（横断面）における空孔部以外の実部（膜が存在する部分）の面積比率である。面積率は、中空糸膜の断面をＳＥＭで撮影した画像を解析することにより決定される。具体的には、膜断面を膜厚方向に３等分して３つの領域に分割し、それぞれについて面積率を測定する。３つの領域は、外表面を含む領域Ａ、内表面を含む領域Ｂ、および、領域Ａと領域Ｂの間の領域（中心領域Ｃ）である。ＳＥＭの倍率は、空孔部と実部が認識できる倍率であればよく、本発明の中空糸膜の測定のためには例えば５０００倍～２００００倍が適当である。面積率は、画像解析を用いた方法で算出される。具体的には、画像解析ソフト（例えば、ＷｉｎＲＯＯＦ２０１３）を用いて空孔部と実部（ポリマー部）の二値化処理を行う。二値化処理の後、空孔部の総面積とポリマー部の総面積の比率から面積率を算出する。
　本実施形態において中空糸膜は、上記非対称構造を有しながら、膜の厚み方向においてかさ密度（厚み方向断面における面積率）の変動が小さい（好ましくはほぼ一定である）という特徴を有する。理由は明らかでないが、上記構造的特徴を有することにより急激な温度変化やガラス化液の体積変化に耐えることができるものと思われる。そのため、凍結、融解による中空糸膜構造の脆化や破壊を抑えることができ、膜強度を保つことができると考えられる。
　なお、厚み方向断面における面積率の変動が小さいとは、例えば、厚み方向断面のうち、外表面を含む領域Ａ、内表面を含む領域Ｂ、および、中心領域Ｃ（領域Ａと領域Ｂの間の領域）について面積率（％）の差が小さいことを意味する。具体的には、領域Ａ、ＢおよびＣの面積率を測定したときに、ａ（領域Ａの面積率）、ｂ（領域Ｂの面積率）およびｃ（領域Ｃの面積率）から選択される２つの面積率の組み合わせの全てにおいて、２つの面積率の差の絶対値が５％未満であることが好ましく、３％未満であることがより好ましい（下記式参照）。なお、例えば、領域Ａは、外表面から膜厚の３０％の深さまでの領域であり、領域Ｂは、内表面から膜厚の３０％の深さまでの領域である。
　好ましくは、
　　｜ａ－ｂ｜＜５％、かつ、｜ｂ－ｃ｜＜５％、かつ、｜ｃ－ａ｜＜５％
　より好ましくは、
　　｜ａ－ｂ｜＜３％、かつ、｜ｂ－ｃ｜＜３％、かつ、｜ｃ－ａ｜＜３％
　厚み方向断面の平均面積率（例えば、「（ａ＋ｂ＋ｃ）／３」）は、好ましくは４０％以上７０％以下である（下式参照）。
　　４０％≦（ａ＋ｂ＋ｃ）／３≦７０％
　また、本発明において、中空糸膜は内表面の平滑性が高いことが好ましい。内表面の平滑性が高いことにより中空糸膜の内表面に卵細胞や胚細胞が接触しても、細胞表面に傷などを与えるリスクを最小限に抑えることができる。ここで、平滑性が高いとは、算術平均粗さＲａ値が２０ｎｍ以下であることを意味する。平滑性が高い方が細胞に与えるダメージは小さくなるので、Ｒａ値は１０ｎｍ以下がより好ましく、１ｎｍ以上８ｎｍ未満がさらに好ましい。算術平均粗さＲａ値は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて測定することができる。
　＜中空糸膜の製造方法＞
　本発明は、上記のセルロースエステルを含む中空糸膜の製造方法にも関する。
　本実施形態の中空糸膜の製造方法は、例えば、以下の方法である。
　上記の中空糸膜の製造方法であって、
　紡糸原液および内液を二重管状のノズルから空中走行部を経て凝固液中に吐出して、前記紡糸原液を前記凝固液中で凝固させ、前記紡糸原液の凝固物を前記凝固液中から曳き出すことにより、中空糸膜を得る、紡糸工程を含み、
　前記紡糸原液は、セルロースエステルを含む樹脂原料、溶剤および非溶剤を含み、
　前記内液は水を含み、
　前記ノズルでの紡糸原液の温度が７０～１１０℃であり、内液の温度が４０～７０℃であり、
　前記凝固液中の前記非溶剤に対する前記溶剤の量の比率が６０／４０～８０／２０であり、
　ノズルドラフト比が０．４～０．９である、製造方法。
　前記紡糸原液中のセルロースエステルの濃度は、１０～３０質量％であることが好ましい。
　前記紡糸原液において、前記溶剤および前記非溶剤の総量に対する前記溶剤の量の比率は、６０～８０質量％であることが好ましい。
　前記溶剤は、非プロトン性極性溶剤であることが好ましい。
　前記非溶剤は、グリコールエステルであることが好ましい。
　前記空中走行部の直線距離は、１０～５０ｍｍであることが好ましい。
　〔紡糸工程〕
　図６を参照して、紡糸工程では、紡糸原液（spinning　dope）１０ａおよび内液１０ｂを二重管状のノズル１１から空中走行部（エアギャップ）２０を経て凝固液２１中に吐出して、紡糸原液を凝固液２１中で凝固させ、紡糸原液の凝固物を凝固液２１中から曳き出すことにより、中空糸膜１６が得られる。中空糸膜の曳き出し等は、例えば、液中ガイド１２およびローラー１３，１４，１５により行われる。
　ノズル１１は、二重管状であり、外管と、外管の内部に設けられた内管と、を備える。外管と内管との間の空隙（スリット）から紡糸原液が吐出され、内管の内部から内液が吐出される。外管の直径（スリットの外径）に対する内径の直径（スリットの内径）の比率は、好ましくは１１０～３００％であり、より好ましくは１１０～２００％である。外管の直径は、好ましくは２２０～４００μｍであり、より好ましくは２２０～３３０μｍである。内管の直径は、好ましくは１５０～３３０μｍであり、より好ましくは１５０～２７０μｍである。なお、内管の直径は、中空糸膜の直径と同程度であることが好ましい。
　スリットの断面積に対する内管の断面積の比率は、８０～１２０％であることが好ましい。このようなノズルを採用することによって、製膜原液の吐出線速度と引取り速度を同程度にできるため、吐出された製膜原液と内液との界面摩擦を低減することが可能となり、中空糸膜内面の荒れを防ぐことが可能となる。
　なお、製膜原液の吐出線速度は、製膜原液の吐出量をノズルスリット外径（ａ）とノズルスリット内径（ｂ）から求められるスリット断面積〔π（ａ／２）２－π（ｂ／２）２〕で除して求められる（下記式参照）。
　製膜原液の吐出線速度［ｍ／分］＝製膜原液の吐出量／スリット断面積
　引取り速度は、凝固浴の出口に設けられたローラー１３の回転速度（表面速度）である（図６参照）。
　引き取り速度に対する吐出線速度の比率（引取り速度／吐出線速度）であるノズルドラフト比は、０．４～０．９であり、好ましくは０．５～０．９である。このように、製膜原液の引き取り速度に対して吐出線速度を早くすることにより、本発明の中空糸の特徴的な膜構造を得ることができる。
　前記空中走行部２０の直線距離（ノズル１１の先端と凝固液２１の液面との間の距離）は、好ましくは１０～５０ｍｍであり、より好ましくは１０～４０ｍｍである。
　なお、紡糸工程によって得られた中空糸膜は、さらに純水による洗浄工程（水洗工程）に付されてもよい。水洗工程での、水の流れは中空糸膜の移動方向と反対方向の流れ（向流）であることが好ましいが、中空糸膜の移動方向と同じ方向の流れ（並流）であってもよい。
　（紡糸原液）
　紡糸原液１０ａは、上記セルロースエステルを含む樹脂原料、溶剤および非溶剤を含む。
　ノズル１１での紡糸原液の温度（設定温度）は、７０～１１０℃であり、好ましくは７０～１００℃である。
　前記紡糸原液中のセルロースエステルの濃度は、好ましくは１０～３０質量％であり、より好ましくは１０～２５質量％である。セルロースエステルの濃度が低すぎると、中空糸膜の強度が低くなる。一方、セルロースエステルの濃度が高すぎると、紡糸原液の粘度が高くなり過ぎて、紡糸の実施が困難になる場合がある。
　溶剤は、セルロースエステルを溶解可能な液体である。溶剤は、極性溶剤であることが好ましく、水に可溶であることが好ましい。極性溶剤は、好ましくは非プロトン性極性溶剤であることが好ましい。非プロトン性極性溶剤としては、例えば、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル等が挙げられる。
　非溶剤は、セルロースエステルを溶解しない液体（水を除く）である。非溶剤としては、例えば、グリコールエステル、グリセリン、アルコール類などが挙げられるが、好ましくはグリコールエステルである。グリコールエステルとしては、例えば、エチレングリコール、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、ポリエチレングリコール（ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール４００など）、プロピレングリコールなどが挙げられる。
　前記紡糸原液において、非溶剤（ＮＳ）に対する溶剤（Ｓ）の量の比率（Ｓ／ＮＳ比）は、６０／４０～８０／２０であり、より好ましくは６５／３５～７５／２５である。紡糸原液中のＳ／ＮＳ比が小さくなりすぎると、セルロースエステルの溶解が不安定になるため、紡糸安定性が低下するとか、本発明の用途に適した非対称構造を得られないことがある。Ｓ／ＮＳ比が大きくなると、非対称構造の中空糸膜が得られないとか、紡糸安定性が低下することがある。
　なお、紡糸原液は、溶剤と非溶剤に加えて、さらに水を含んでいてもよい。
　中空糸膜の構成材料となるセルロースエステルを含む樹脂原料、溶剤および非溶剤を混合する際の材料の添加順序や混合方法は、特に限定されない。
　（内液）
　内液は、水を含む。内液中の水の含有率は、９５～１００質量％であり、好ましくは９８～１００質量％である。
　中空糸膜の内表面は平滑性が高いことが好ましい。凍結保存する細胞との接触によるダメージを少なく出来るからである。
　中空糸膜の内表面の平滑性を高めるためには、紡糸原液をノズルより吐出した後、外乱の影響を受ける前に内表面を素早く凝固（固定）させ、過剰に相分離を進行させないことが好ましい。また、凝固中および凝固した後の内表面に延伸を掛けるなどの外力を与えず、中空糸膜構造が固定した後の内径変動などを極力抑制することが好ましい。
　内表面を素早く凝固させるためには、紡糸原液１０ａに対して凝固性の高い内液１０ｂを用いたり、凝固しやすい紡糸原液組成や温度条件を採用したりすることが好ましい。
　このため、本実施形態の製造方法では、セルロースエステルを含む紡糸原液に対して凝固性の高い水を含む内液が用いられる。
　水のほか、一般的にセルロースエステルの非溶剤として用いられるエチレングリコールやトリエチレングリコール、ポリエチレングリコール２００または４００、グリセリン、プロピレングリコールなどもそれぞれ単独または混合して用いることができる。水を主体とした内液を用いる場合は、水以外の成分として、前記非溶剤やセルローストリアセテート系ポリマーの溶剤であるＮ－メチルピロリドンやジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどを５重量％を上限として添加することができる。
　ノズル１１での内液の温度（設定温度）は、４０～７０℃であり、好ましくは４５～６５℃である。上述のとおり、ノズル１１での紡糸原液の温度（設定温度）は７０～１１０℃であるが、内液はこれよりも低い温度に設定されることが好ましい。ノズル１１での内液の温度は、ノズル１１での紡糸原液の温度に比べて、１０℃以上低いことが好ましく、２０℃以上低いことがより好ましく、３０℃以上低いことが更に好ましい。
　紡糸原液１０ａと内液１０ｂを二重管状のノズル１１より吐出する際、紡糸原液と内液との間に温度差を設けることが、紡糸原液（中空糸膜）の内表面の凝固性（凝固速度）を高めるうえで好ましい。内表面の凝固速度を高めることで、非対称構造（厚み方向に不均一な構造）を有する中空糸膜を得ることができる。また、内液の温度を特定の範囲に設定したうえで、後述する凝固液の組成を特定の範囲に調整したり、ノズルドラフトを調整することが、中空糸膜内表面の平滑性を高め、非対称構造でありながら膜断面において膜の厚み方向におけるかさ密度（面積率）の変化を少なくすることができる一因となっている。なお、紡糸原液と内液との間に温度差を設けるために、吐出直前まで紡糸原液と内液とを別々に温度コントロールできる構造を有するノズルを用いることが好ましい。
　（凝固液）
　凝固液は、好ましくは溶剤と非溶剤（水を除く）とを含む。なお、この場合、凝固液は、溶剤と非溶剤に加えて、さらに水を含んでいてもよい。
　凝固液中の溶剤および非溶剤の総量の比率（凝固液の濃度）は、６０～９０質量％であり、好ましくは６５～９０質量％である。これにより、本発明の中空糸膜の特徴的な構造を得ることできる。
　また、凝固液の温度は、好ましくは２０～６０℃であり、より好ましくは３０～５０℃である。
　以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　〔実施例１〕
　実施形態で説明した中空糸膜の製造方法により、以下の条件で実施例１の中空糸膜が製造された。
　（紡糸原液の組成）
　原料樹脂（セルロースエステル）：三酢酸セルロース（ＣＴＡ）（ＬＴ７５、ダイセル化学工業製）
　原料樹脂濃度（ポリマー濃度）：１７．５質量％（紡糸原液中）
　溶剤：Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）
　非溶剤：トリエチレングリコール（ＴＥＧ）
　〔溶剤／非溶剤（Ｓ／ＮＳ）比＝７／３〕
　内液：水
　（紡糸原液の調製）
　上記の原料樹脂の粉末を他の材料と共に混合することで、紡糸工程で用いる紡糸原液を調製した。
　（凝固液の組成）
　　溶剤（Ｓ）：ＮＭＰ
　　非溶剤（ＮＳ）：ＴＥＧ
　　水
　　凝固液の濃度〔（Ｓの質量＋ＮＳの質量）／凝固液の質量〕：７８質量％
　　Ｓ／ＮＳ比は、紡糸原液と同じ。
　（紡糸工程の条件）
　紡糸原液の吐出温度（設定温度）：９３℃
　内液（水）の吐出温度（設定温度）：５５℃
　ノズル：二重管状ノズル（外管の直径：２７０μｍ、内管の直径：２００μｍ）
　空中走行部の距離（エアギャップ長）：２５ｍｍ、
　空中走行部の滞留時間：０．０２５秒
　凝固液の温度：４３℃
　曳き出し速度：６０ｍ／分
　ノズルドラフト比：０．７８
　〔水洗工程の条件〕
　　水洗槽の流れ：向流
　　温度　９８℃
　〔実施例２，３〕
　表１に示されるように、ノズルドラフト比が変更された。それ以外の点は実施例１と同様にして、実施例２および実施例３の中空糸膜が製造された。得られた中空糸膜の内表面の算術平均粗さ、面積率を測定した結果を表２に示した。
　〔比較例１，２〕
　表１に示されるように、紡糸原液、内液および凝固液の各々の組成、並びに各製造条件が変更された。なお、内液として流動パラフィンを用い、内液の設定温度は、特に制御されず、紡糸原液温度と同程度である。それ以外の点は実施例１と同様にして、比較例１および比較例２の中空糸膜が製造された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　〔面積率の測定〕
　湿潤状態の中空糸膜を液体窒素中に浸漬して凍結させた後、液体窒素から取り出し、直ぐに折り曲げて割断することにより、平滑な断面（厚み方向断面）を有するサンプルを得た。断面を観察できるようにサンプルを試料台に固定し、サンプルの断面に対しカーボン蒸着を行った。蒸着後のサンプルの断面を走査型電子顕微鏡（日立製Ｓ－２５００）を用いて加速電圧５ｋＶ、倍率１００００倍にて撮像した。得られた画像のうち上述の領域Ａ～Ｃ（外表面を含む領域Ａ、内表面を含む領域Ｂ、および、領域Ａと領域Ｂの間の中心領域Ｃ）の各々に相当する領域の中心部付近について、画像解析ソフトＷｉｎＲＯＯＦ２０１３を用いて空孔部とポリマー部の二値化処理を行った。二値化処理の後、空孔部とポリマー部の比率から面積率を算出した。ここで、領域Ａは、外表面から膜厚の３０％の深さまでの領域であり、領域Ｂは、内表面から膜厚の３０％の深さまでの領域である。
　なお、割断や電子線により断面の一部が溶解するなどして構造が不鮮明になることがあるので、その場合は構造が鮮明な部分を用いて測定を行うか、サンプルを変更して写真を撮り直した。
　面積率の測定結果を表２に示す。
　〔算術平均粗さの測定〕
　中空糸膜の内表面を観察できるように開腹した（中空糸膜の長手方向に斜めにカットした）中空糸膜を試料として準備した。原子間力顕微鏡Ｅ－Ｓｗｅｅｐ（日立ハイテクノロジーズ社）を用いてＤＦＭモードで大気中で観察を行った。カンチレバーとしてはＳｉ－ＤＦ３、スキャナとしては２０μｍスキャナを用いた。観測視野を２μｍ四方とし、２５６×２５６ｐｉｘｅｌで中空糸膜の内表面の算術平均粗さ（Ｒａ）を測定した。算術平均粗さ（Ｒａ）の測定結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　＜凍結保存試験＞
　実施例１～３および比較例１，２の中空糸膜について、ガラス化凍結法を用いた凍結保存試験を行った。ガラス化凍結法の条件は、上述の破断強度（ガラス化凍結法によって凍結された後に融解されたときの破断強度）を測定する際の条件と同様である。
　凍結保存試験における実施例１～３および比較例１，２の各々の中空糸膜について、最初の乾燥状態（「乾燥状態」）、水により湿潤した状態（「湿潤状態」）、平衡液が浸潤した状態（「平衡液」）、ガラス化液が浸潤した状態（「ガラス化液」）、および、凍結後に融解された状態（「融解後」）において、以下の測定を実施した。
　〔中空糸膜の内径、外径および膜厚の測定〕
　内径、外径および膜厚を以下の方法で測定した。
　中空糸膜をスライドグラスの中央に開けられた直径３ｍｍの孔に中空糸膜が抜け落ちない程度に適当本数通し、スライドグラスの上下面に沿ってカミソリにより中空糸膜をカットし、中空糸膜断面サンプルを得る。得られた中空糸膜断面サンプルについて、投影機（Nikon　PROFILE　PROJECTOR　V-12）を用いて中空糸膜の内径および外径を測定する。
　具体的には、中空糸膜断面１個につき中空糸膜外表面のＸ－Ｘ方向とＹ－Ｙ方向（断面上の直交する２方向）の寸法を測定し、それらの値の算術平均値を中空糸膜断面１個の外径とした。また、中空糸膜断面１個につき中空部のＸ－Ｘ方向とＹ－Ｙ方向（断面上の直交する２方向）の寸法を測定し、算術平均値を中空糸膜断面１個の内径とした。なお、１０断面について同様に測定を行い、平均値を内径および外径とした。
　膜厚（平均値）は、中空糸膜の内径および内径の測定結果（平均値）に基づいて、「（外径－内径）／２」の式により算出される。
　中空糸膜の内径の測定結果（平均値）が表３（図１）に示され、膜厚の測定結果（平均値）が表４（図２）に示される。なお、比較例については、融解後は中空糸膜の強度が低く中空糸膜断面サンプルを作製することができなかったため、内径および膜厚を測定できなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　〔強伸度の測定〕
　実施例１～３および比較例１，２の中空糸膜について、以下の方法で強伸度（破断強度、破断伸度および降伏強度）を測定した。
　中空糸膜の強伸度は、引っ張り試験機(東洋ボールドウィン社製ＵＴＭＩＩ)を用い、中空糸膜１本を約１５ｃｍの長さに切断してチャック間(距離約１０ｃｍ)に弛みがないように取り付け、２０±５℃、６０±１０％Ｒｈの温湿度環境下、クロスヘッドスピード１０ｃｍ／ｍｉｎで中空糸膜を引張り、測定を行った。
　得られたＳ－Ｓカーブから、中空糸膜の破断点の単糸あたりの荷重（破断強度）、伸度（破断伸度）および降伏点の単糸あたりの荷重（降伏強度）、伸度（降伏伸度）を読み取った。具体的には、特開２０１１－２１２６３８号公報の［0061］に示される方法を用いて荷重および伸度を得た。
　破断強度、破断伸度および降伏強度の各々の測定結果が表５～表７（図３～図５）に示される。なお、実施例および比較例の各々について、５回ずつ測定を実施し、その平均値が測定値として示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表５（図３）に示されるように、比較例の中空糸膜では、凍結前（表および図中の「乾燥状態」、「湿潤状態」、「平衡液」および「ガラス化液」）の値に比べて、凍結を経た融解後の状態では破断強度が顕著に低下している。これに対して、実施例の中空糸膜の場合は、凍結前の値に比べて、融解後の状態でも破断強度がほとんど低下していない。なお、実施例の中空糸膜では、ガラス化凍結法による凍結後の融解された状態での破断強度が凍結前の湿潤時（「湿潤状態」）の破断強度の９５％以上である。
　また、表６および表７（図４および図５）に示されるように、比較例の中空糸膜では、凍結前の値に比べて、凍結を経た融解後の状態では破断伸度および降伏強度が顕著に低下している。これに対して、実施例の中空糸膜の場合は、凍結前の値に比べて、融解後の状態でも破断伸度および降伏強度がほとんど低下していない。なお、実施例の中空糸膜では、ガラス化凍結法による凍結後の融解された状態での破断伸度または降伏強度が凍結前の湿潤時（「湿潤状態」）の破断伸度または降伏強度の９５％以上である。
　これらの結果から、実施例の中空糸膜が細胞の凍結保存に用いられた際の強度の低下を抑制できることが分かる。
　＜細胞生存率の評価＞
　実施例１～３および比較例１の中空糸膜を用いて、ガラス化凍結法（中空糸凍結保存法）により、細胞（ブタ由来胚細胞）を凍結し、融解した後に、生存細胞数を測定し、生存率（供試細胞数に対する生存細胞数の比率）を算出した。
　また、細胞凍結保存器具の市販品であるクライオトップ（Cryotop：登録商標、株式会社北里コーポレーション製）を用いて、ガラス化凍結法（クライオトップ法）により、細胞を凍結し、融解した後に、生存細胞数を測定し、生存率を算出した。
　以上の生存率の評価結果が、供試細胞数（試験に供された細胞の数）および生存細胞数と共に、表８に示される。なお、ガラス化凍結法の条件は、上述の強伸度を測定した際と同様の条件であり、中空糸膜凍結保存法では、細胞が中空糸膜の内部に収容された状態で凍結保存を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８に示されるように、実施例１～３の中空糸膜を用いて細胞の凍結保存を行った場合、融解後の生存細胞の比率（生存率）が市販品や比較例よりも高かった。この結果から、実施例１～３の中空糸膜は、細胞凍結保存の用途に好適に使用できることが分かる。
　１０ａ　紡糸原液、１０ｂ　内液、１１　ノズル、１２　液中ガイド、１３，１４，１５　ローラー、１６　中空糸膜、２０　空中走行部、２１　凝固液。

Claims (6)

  1. 　セルロースエステルを含む細胞凍結保存用の中空糸膜であって、
    　ガラス化凍結法によって凍結された後に融解されたときの破断強度が、凍結前の湿潤時の破断強度の８０％以上である、中空糸膜。
  2. 　厚み方向に不均一な構造を有する、請求項１に記載の中空糸膜。
  3. 　前記中空糸膜の外表面の平均孔径は、内表面の平均孔径の１．１倍以上である、請求項１または２に記載の中空糸膜。
  4. 　厚み方向断面の平均面積率が４０％以上７０％以下である、請求項１～３のいずれか１項に記載の中空糸膜。
  5. 　厚み方向断面の面積率の厚み方向における変動が５％未満である、請求項１～４のいずれか１項に記載の中空糸膜。
  6. 　前記中空糸膜の内表面を原子間力顕微鏡により測定したときの算術平均粗さが２０ｎｍ以下である、請求項１～３のいずれか１項に記載の中空糸膜。
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