WO2022112155A1 - Verfahren und vorrichtung zur aufnahme nanoskopischer bilder mehrfach gefärbter proben - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur aufnahme nanoskopischer bilder mehrfach gefärbter proben Download PDF

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Roman Schmidt
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    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Definitions

  • the invention relates to localization microscopy, in particular to MINFLUX microscopy.
  • the invention enables improved nanoscopic imaging of multiply stained samples, i.e. stained with several different fluorescent labels, as well as tracking of individual molecules, i.e. fluorophores, in multiply stained samples.
  • Localization microscopy allows imaging of samples with a resolution below Abbe's diffraction limit.
  • To image a sample it is stained with markers that behave in such a way that they are each capable of fluorescing, i.e. in a state in which they can be excited to fluoresce, for at least a period of time and are not capable of fluorescence most of the time. It is generally said that the markers used blink. This can be based, for example, on the fact that the total amount of markers is in a state of equilibrium in which a small proportion of the markers is capable of fluorescing and a large proportion is not.
  • the sample is prepared or treated in such a way that, on average, some or even many markers are capable of fluorescence distributed over the sample, but the fluorescence-capable markers are typically spaced apart from one another by approximately the same size or greater than, for example, the diameter of a diffraction-limited excitation light spot. If the sample is now exposed to excitation light, the light of the individual fluorescent fluorophores can be detected in such a spatially resolved manner that an image is obtained for each individual fluorophore, the position of which can be determined with an uncertainty that is much smaller than Abbe's diffraction limit .
  • the sample in a Way with excitation light for example, be applied with a sequence of structured excitation light distributions that the positions of the fluorescent markers can be determined from the detected fluorescent light based on the knowledge of the excitation with an uncertainty that is much smaller than Abbe's diffraction limit.
  • the positions of a large number of markers are now determined in chronological order, with a large number of markers already being detected simultaneously when using localization microscopy in the wide field or in the case of parallelized localization microscopic methods. Finally, an image of the sample is obtained from the set of positions determined in this way.
  • co-localization is used in publications that refer to data from non-super-resolution microscopy methods such as simple fluorescence microscopy or light sheet fluorescence microscopy, this is generally understood to mean that signals from the co-localized fluorophores are not spatially separated in the image i.e. they appear within the same image pixel (see, for example, in "New Methods to Evaluate Colocalization of Fluorophores in Immunocytochemical Preparations as Exemplified by a Study on A2A and D2 Receptors in Chinese Hamster Ovary Cells", Luigi F. Agnati et al., J Histochem Cytochem 53:941-953, 2005).
  • the detection path is divided into two spectral channels by means of a spectral beam splitter, with the detection in each of the channels being carried out with a photon-counting detector, in another arrangement the detection is carried out using a prism and a camera with spectral resolution.
  • the locations of the individual emitters can be determined for each spectral channel from the scanned point spread functions with an accuracy far better than the resolution limit.
  • distances between different emitters can also be determined with very high resolution, which ultimately depends in particular on the quantity of photons detected, i.e.
  • a sample is stained with Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 488 and optionally Alexa Fluor 532 dyes.
  • a special buffer solution which the authors call OXEA, is used, which makes it possible to use all three dyes for localization microscopy imaging, specifically for a method called GSDIM microscopy (ground-state depletion followed by individual molecule return).
  • imaging is first performed using Alexa Fluor 647 dye, which is laser-excited with light of 647 nm wavelength. This is followed by imaging using the Alexa Fluor 488 dye, which is excited by a laser with light at a wavelength of 488 nm. According to the authors, both dyes can be absorbed independently and without mutual interference.
  • the dye Alexa Fluor 532 is also used for imaging in three colors. In this case, the above-mentioned steps are carried out first, with a bandpass filter being used in the detection path when using Alexa Fluor 488 in order not to also detect fluorescent light which is emitted by the third dye Alexa Fluor 532. Finally, imaging is performed using Alexa Fluor 532 dye, which is laser-excited with 532 nm light. When using this third dye, use is made of the fact that the dye Alexa Fluor 488 was bleached so much in the previous steps that it emits sufficiently little disruptive fluorescence.
  • the image data obtained in this way are individually post-processed, subsequently corrected with regard to any drift that occurs, and then images are generated which are finally corrected with regard to any chromatic imaging errors that occur.
  • the images are evaluated using knowledge of the shape of the structures depicted. In this way, the distances between marked structures are determined with less uncertainty than the uncertainty that results from the uncertainties of the individual localizations of two different fluorophores.
  • Two different photoactivatable dyes are used, both of which can be activated with light with a wavelength of 405 nm, but can be excited with different wavelengths and, if necessary, bleached.
  • activation light and longer-wavelength excitation light are applied and the fluorescent molecules are localized; this is done until a multitude of fluorophores are localized.
  • the excited dye bleaches out.
  • only those shorter-wavelength fluorophores that are then in an excitable state are deactivated with an intense light pulse at 488 nm, which is the shorter excitation wavelength, so that all shorter-wavelength fluorophores are then in a non-excitable state.
  • the fluorophores that can be excited with the shorter wavelength are localized. It is emphasized that the fluorophores show only a very low crosstalk, which means that the imaging in the different channels mutually influence each other little.
  • activator-reporter pairs enable selective activation and thus sequential localization of the different pairs, or simultaneous activation and simultaneous localization in different detection channels which can take place, namely when the emission wavelengths of the Distinguish reporters.
  • the sequential method based on activator-reporter pairs with different activation wavelengths is demonstrated, that is, verified by means of experimentally obtained images. Crosstalk between color channels is addressed. In this regard, it is stated that it is low in the activator-reporter pairs used.
  • the fluorescence signal of all fluorophores is divided into two color channels in the detection path and is detected within two sub-areas of one and the same camera sensor, so that essentially fluorescence light with a wavelength above a limit wavelength is detected on one part of the sensor and on the other part with a wavelength below a limit wavelength .
  • a pair of point images is obtained for each emitter in the sample.
  • Based on the ratio of the fluorescence quantity signals of each individual fluorophore in the two halves of the sensor it is determined what kind of fluorophore has caused a specific pair of point images. Subsequently, not only a location value, but also color information can be assigned to each point image.
  • the procedure is based on ensuring it is known that each individual spot is caused by a molecule, i.e. there is no signal that could have arisen as a mixture of different fluorescence emissions.
  • the resulting fluorescence is detected in two channels with different spectral sensitivity, each with spatial resolution, the ratio of the amounts of fluorescence detected for a single emitter is used to determine the type of emitter, based on the local distribution of the Fluorescence occurs in each case a localization.
  • the accompanying “Supplementary Information” explicitly mentions that the spatial coordinates of the two spectral channels are assigned to one another by imaging fluorescent beads that emit in both spectral channels.
  • the color channels are registered with one another by imaging gold beads in all detection channels under wide-field illumination before each individual image is recorded on the sample.
  • the authors give a value of less than 20 nm as the uncertainty of the co-registration. Drifts that occur over time during the recording are corrected using image correlation methods.
  • image correlation methods In the publication "Nanoscale subcellular architecture revealed by multicolor three-dimensional salvaged fluorescence imaging", Yongdeng Zhang et al. , Nat Methods 17, 225-231 (2020), https://doi.org/10.1038/s41592-019-0676-4, a method for the localization of fluorophores in a sample stained with several fluorescent dyes is presented, which is carried out at a Mi - performed kroskop with a 4-PI detection arrangement.
  • Excitation light is directed onto the sample via a dichroic element through a lens.
  • Fluorescence light emitted by fluorophores in the sample is directed to a first spatially resolving detector via the same lens, with only the part of the fluorescence light with longer wavelengths than the excitation light passing through the dichroic element and reaching the first detector; on the other hand, fluorescent light is directed in the opposite direction through another dichroic element corresponding to the first via a mirror onto the same detector and light with shorter wavelengths, in particular wavelengths below half or just above the excitation wavelength, is reflected out of the further dichroic element; the reflected light is passed through a further filter, which does not allow the wavelength of the excitation light to pass, to a further detector.
  • the fluorophores are localized on the basis of the intensity or light quantity distributions measured for individual fluorophores.
  • bursts detected simultaneously on the two detectors are assigned to one another, and the type of fluorophore is deduced from the ratio of the measured intensities or amounts of light.
  • the short-wave component is usually so small that a good localization based on measured intensity or light quantity distributions would hardly be possible.
  • the localization is therefore only based on the intensity or light quantity distribution of the long-wave fluorescence and the measured values of the short-wave fluorescence are used exclusively to identify the fluorophore type.
  • MINFLUX nanoscopy is a method of localization microscopy.
  • the fluorophores are localized using structured excitation light distributions.
  • the basic special feature of MINFLUX nanoscopy is that the fluorophores are excited in such a way that a fluorophore to be localized is always placed close to or in a minimum of the excitation light distribution, which is ideally a zero point, with the excitation light distribution adjacent to the Minimum has an intensity increase range.
  • a better utilization of the fluorescence photons is achieved in terms of obtaining information about the position of the respective emitting fluorophore. This also applies to applications in which the movement of fluorophores over time is to be tracked.
  • DE 102011 055 367 B4 The observation of a sample using an excitation minimum, the basis of MINFLUX nanoscopy, is known from the patents DE 102011 055 367 B4, initially only for tracking the movement of individual molecules in a sample, and DE 102013 114 860 B3.ln DE 102011 055367 B4 also addresses the possibility of tracking two different fluorophores simultaneously. For this, two different light sources are to be used, between which the user can switch quickly.
  • a position of the fluorophore in a preparatory step, must be estimated with a first, lower level of accuracy. This can be done, for example, using standard localization microscopy (PALM, STORM) or using other known methods.
  • PAM localization microscopy
  • STORM standard localization microscopy
  • a method is described in the cited publication, in which a sample is scanned with a Gaussian intensity distribution until fluorescence is detected at a scanning position, which fluorescence originates with a certain probability from an isolated molecule. The scanning is then stopped and the intensity distribution is then measured at several locations, specifically, positioned at four locations spaced less than the wavelength of the light around the scanning position. The position of the isolated emitter is estimated from the number of photons measured for the individual positions using a method described in the publication.
  • the estimation essentially corresponds to a ratiometric evaluation of the number of photons detected at the various positions.
  • an intensity distribution of excitation light with a central minimum e.g. in the shape of a donut, as known from STED microscopy, is placed at a known position which is chosen such that the fluorophore is close to the minimum of the intensity distribution.
  • the fluorescence response of the fluorophore is measured.
  • the same is repeated for one or more other positions of the intensity distribution.
  • the position of the fluorophore is determined with greater accuracy by means of a ratiometric evaluation of the measured intensity or light quantity ratios.
  • the emission rate increases the further the fluorophore is from the excitation minimum or the further the fluorophore is shifted into an intensity increase range.
  • This more precisely determined position can now be used as a starting position for repeating the sequence of the above steps, whereby the plurality of positions can be placed closer to the estimated fluorophore position.
  • the change in the emission rate when the fluorophore shifts into the intensity increase range or towards the minimum can be used to estimate the shift of the fluorophore with high precision.
  • the MINFLUX method can also be used for localization in three dimensions, for example using so-called bottle beams for excitation.
  • US 2019/0235220 A1 is aimed at a method with a small or minimal number of positions at which an intensity minimum, which is in each spatial direction, in the one Location of the fluorophore to be determined is placed adjacent on either side of intensity increase regions to determine the location of the fluorophore.
  • US 2019/0234882 A1 is based on the method described above, in which the location information obtained from a first MINFLUX step is used to place the minimum of the intensity light distribution closer to the fluorophore in a subsequent step and derive more precise location information from this.
  • US 2019/0234879 A1 is directed to a method in which the intensity minimum is placed very quickly, quasi simultaneously, at a plurality of positions around the estimated location of the fluorophore. An individual position is then pushed closer to the presumed minimum if an increased emission rate is detected at it.
  • the publication also documents the evidence that by iteratively approximating the minimum positions to the actual location of the relevant fluorophore, a reduction in the uncertainty of the localization is achieved compared to a ratiometric localization with fixed minimum positions. It is further shown that an isotropic resolution in three dimensions is achieved in this way. It is proven that MINFLUX nanoscopy can also be carried out using photoactivatable fluorescent proteins, specifically from mMaple, especially on living cells. For imaging using different fluorophores, dyes are used which mutually have a large overlap of the spectral absorption curves and can therefore be excited with one and the same excitation wavelength.
  • Three-dimensional nanoscopy is specifically shown with two different fluorophores each, using a total of two different pairs (A: CF660C and Alexa Fluor 647; B: CF680C and Alexa Fluor 647), with one partner of the pair being the dye Alexa Fluor 647 in both pairs.
  • A CF660C and Alexa Fluor 647
  • B CF680C and Alexa Fluor 647
  • Alexa Fluor 647 the same laser is used to excite both dyes in a pair.
  • a MINFLUX image of the nuclear pores of living cells is shown, for which the fluorescence of the Nup96-mMaple expressed by the correspondingly modified cell, i.e. only a dye, is used.
  • the experimental setup has two different lasers for excitation with an excitation donut, one with a wavelength of 642 nm, which is suitable for the excitation of the above dye pairs, and one with a wavelength of 560 nm, which is suitable for the excitation of Nup96-mMaple.
  • the two dyes in each pair differ in their emission characteristics.
  • the detection path of the nanoscopy arrangement used is divided by means of a dichroic beam splitter into a spectral detection channel for light with a wavelength above 685 nm and one for light with a wavelength below 685 nm.
  • MINFLUX nanoscopy requires fewer photons for precise localization, so that a larger selection of fluorophores can be used for MINFLUX.
  • MINFLUX MINFLUX
  • an isolated molecule is subjected to a focused distribution of intensity, which has a central minimum, preferably a zero point, and this has de increase areas; also as with MINFLUX, this minimum is placed at a plurality of sampling points around the suspected location of the isolated molecule and a fluorescence emission is detected for each sampling point; The actual position is estimated with high precision from the intensity values or photon numbers obtained in this way.
  • the intensity distribution is a distribution of fluorescence prevention light, particularly STED light.
  • this method is aimed at measurements on multiply colored nanostructures, the coloring being selected in such a way that different fluorophores that are spatially closer than a resolution limit can be distinguished. This can be ensured, for example, by using fluorophores that are excited with excitation wavelengths that differ from one another.
  • the superimposed intensity distributions are guided on a circular path around the location of an isolated fluorophore estimated from a pre-localization, while a detector is set up to detect fluorescence photons emitted from the circularly scanned area.
  • a detector is set up to detect fluorescence photons emitted from the circularly scanned area.
  • This process is continued iteratively, although the increase in the STED intensity ends at a fixed value, so that the center of the circular path may be shifted in later steps without the STED intensity being increased at the same time.
  • the position of the center of the circular path approaches the position of the fluorophore to be localized more and more.
  • the iterations are terminated when the isolated fluorophore no longer emits photons.
  • This method also offers excellent utilization of the information contained in the detected photons.
  • the publication announces that multiple color channels should be made possible by using spectrally shifted fluorophores.
  • the method is particularly suitable for tracking fast-moving emitters in a sample.
  • the authors call the proposed procedure MINSTED.
  • the position of fluorophores in two spatial directions could be determined experimentally with an uncertainty of only 1 nm, i.e. the accuracy of the position determination is comparable to the extent of the fluorophore itself. If the position of an individual fluorophore is determined with a given measurement uncertainty be, so this requires less time and in particular a smaller number of fluorescence photons than when determining the position of a single fluorophore using conventional localization microscopy. The same applies to MINSTED nanoscopy.
  • the invention is therefore based on the object of localization microscopic methods and devices for examining samples stained with several dyes, which improve the imaging of samples stained with several dyes or the tracking of the movement of individual fluorescent molecules in samples stained with several dyes to the extent that they make it easier to select fluorophores that are tailored to the sample to be examined.
  • the object of the invention is achieved by a localization microscopic method for examining a sample stained with several dyes with the features of independent claim 1 and by another localization microscopic method for examining a sample stained with several dyes with the features of the dependent claim 21 solved.
  • the dependent claims 2 to 20 relate to preferred embodiments of the method according to patent claim 1
  • the dependent claims 22 to 31 relate to preferred embodiments of the method according to patent claim 21.
  • the object is further solved by a microscope having the features of patent claim 32, which is set up to perform a method according to the invention, in particular a preferred method having the features of independent claim 1 and dependent claim 6 or for carrying out a preferred method having the features of independent claim 21 and the features of dependent claims 24 and 25.
  • Dependent claims 33 and 34 relate preferred embodiments of the microscope according to the invention.
  • Localization microscopic methods are understood to mean all the methods in which knowledge of an emitter's position is at least also based on the knowledge that the emitter was present in isolated cases. This includes the methods typically carried out in the wide field, such as PALM or STORM, as well as methods of structured illumination microscopy, insofar as these are carried out on individual emitters will. This also includes the MINFLUX and STED localization methods mentioned below, as well as methods in which localization takes place using the displacement of a focused excitation light distribution with a central intensity maximum within a small field area.
  • MINFLUX methods are understood to mean those methods in which a localization according to one of the MINFLUX methods known from the prior art using an excitation light distribution with a local, usually a central one, i.e. lying on the optical axis, Intensity minimum occurs.
  • an excitation light distribution having a center minimum can be moved either together with a distribution of fluorescence prevention light having a center minimum, or the center minimum of an excitation light distribution is moved within a range around a minimum of a distribution of fluorescence prevention light.
  • STED localization methods are understood to mean methods in which localization is carried out according to one of the MINFLUX-like methods known from the prior art or according to a MINSTED method also known from the prior art using a fluorescence prevention light distribution , where the influence of the fluorescence preventing light distribution is essential for the localization.
  • an excitation light distribution having a center maximum can be moved either together with a distribution of fluorescence prevention light having a center minimum, or the center minimum of a fluorescence prevention light distribution is moved within a range around a maximum of a distribution of excitation light.
  • MINSTED is also applied to methods in which the localization is terminated before the isolated emitter has lost its excitability or in which there is no threshold for a maximum STED intensity above which the intensity of the STED light is not is further increased or in which the half-width of the effective excitation spread function is changed by means other than increasing the STED intensity, and also those in which the fluorescence prevention light is not a STED light, respectively.
  • the object on which the invention is based is initially achieved by a first localization microscopic method for examining a sample stained with a plurality of dyes, which is described below.
  • This method according to the invention initially comprises a first excitation and detection, in which excitation light of a first wavelength is applied to a portion of the sample and fluorescent light emitted from the portion of the sample as a result of excitation with the excitation light of the first wavelength by a single molecule of a dye is detected and a first detection signal is obtained.
  • the detection signal includes a value that is representative of the amount of fluorescent light detected. This value is hereinafter referred to as the light quantity value.
  • the excitation and detection can take place in such a way that a first localization of a single excitable fluorophore can be obtained immediately.
  • the method includes first locating the singulated molecule based on the first detection signal and obtaining a first localization.
  • It also includes a second excitation and detection, in which the partial area of the sample is exposed to excitation light of a second wavelength and fluorescent light emitted from the partial area of the sample as a result of the excitation with the excitation light of the second wavelength by the individual molecule of the dye is detected and a second detection signal is obtained.
  • This second detection signal includes a light amount value.
  • the second excitation and detection is done in such a way that it is a second localization of the isolated molecule and that based on the second detection signal a second localization is obtained.
  • This second localization does not necessarily have to be obtained after the first localization. It is called the second localization because it is obtained using excitation light of a second wavelength.
  • this method includes determining a difference between the first location and the second location.
  • the difference determined in this way can be used to enable co-localization or co-registration of the multiple dyes in a common spatial reference system.
  • the sub-area of the sample is a small field area.
  • a small field area is understood to be an area that is only slightly larger than the measure for a diffraction-limited separability of structures in the sample.
  • a small field area can, for example, have an extent of less than 3 pm, preferably less than 2 pm, more preferably less than 1.5 pm, the small field area having the corresponding expansion in one, but preferably in two or three directions in space, that is related to a localization in two or three directions in space.
  • the excitation and detection are preferably carried out using focused excitation light in each case. This means that both the excitation light of the first wavelength and that of the second wavelength are irradiated in a focused manner in the small field area.
  • the first excitation and detection takes place with focused excitation light of the first wavelength, which has an intensity distribution with a central minimum in the focus area, which in particular is essentially a donut distribution or a bottle - Beam distribution is.
  • the focal point which here coincides with the center of the central minimum, is thereby positioned at a location within the partial area. It is known from the prior art how such a partial area, ie a small field area with a single excitable fluorophore, can be found.
  • the preferred embodiment of the first method according to the invention described here has the advantage that the intensity distribution with a central minimum makes it particularly easy to find a small-field area with an isolated excitable fluorophore and to subsequently locate it with great precision using a MINFLUX method .
  • a special light source is required for locating, nor is a change in the intensity distribution necessary.
  • the excitation light can be guided in spiral tracks over the sample until a quantity of fluorescence is detected in a partial area of the sample per period of time, which indicates the presence of a single excitable fluorophore.
  • the spiral scanning can now be ended at the point in question.
  • the focus point is then positioned at a location within the sub-area as written above.
  • a light quantity value is also obtained immediately, which corresponds to the quantity of fluorescence detected when it was found.
  • a first localization can be obtained by continuing the excitation with the first wavelength and the associated detection after stopping the spiral movement while the fluorescent light is in a plane conjugate to the plane in which the focus point lies, i.e , is confocal, is detected with a spatially resolving detector or while a detection aperture is within a plane perpendicular to an optical axis is oriented is positioned at a plurality of positions around the optical axis.
  • the signal detected in the confocal plane is then dependent on the location in this plane, with the location dependence depending on the position of the individual excitable fluorophore relative to the focal point of the excitation.
  • a localization can thus be obtained for the fluorophore.
  • an alternative possibility which is well suited to closely linking the finding of the small field region with the isolated excitable fluorophore to the first excitation with the first wavelength, is that the intensity distribution of the focused light of the first wavelength has a central maximum, in particular substantially is a Gaussian distribution, and in that the first excitation and detection, wherein excitation light of the first wavelength is applied to a portion of the sample, is performed by positioning the focal point of the excitation light of the first wavelength at a sequence of locations within the portion.
  • a detection signal having a light quantity value is obtained.
  • a first localization can be obtained from the partial detection signals obtained for the sequence of locations within the partial area.
  • the first excitation and detection can be terminated after a predetermined period of time, for example.
  • the first excitation and detection can be terminated when a light amount value of the first detection signal has reached a threshold value, that is, when a minimum number of fluorescence photons or a minimum amount of light has been detected.
  • a threshold value that is, when a minimum number of fluorescence photons or a minimum amount of light has been detected.
  • Other criteria can also be defined which, if met, end the first excitation and detection.
  • the detection signal can be examined while it is being completely recorded to determine whether a specific ratio to a background has been reached.
  • a background can be measured with an additional detection device, for example.
  • the intensity distribution of the focused light of the second wavelength preferably has a central minimum; in particular, it is essentially a donut distribution or a Bottle beam distribution, as known from STED microscopy.
  • the second excitation is then preferably carried out by the focal point of the excitation light of the second wavelength at a sequence of nominal locations which enclose the first localization as a reference point, i.e. as a central location, the enclosed area having a first extension within the partial area is positioned.
  • This sequence of locations can have a certain number of locations, but it can also be a continuous sequence of locations. Enclosing the range of the first location also includes the first location being included in the sequence of nominal locations.
  • the locations are referred to as nominal locations because an offset of the focus points of the excitation light distributions, which may be present due to the different excitation wavelengths, is not well known before the method is carried out.
  • the device with which the method is carried out can therefore be set, for example, as if no offset occurs, with calibration values already present being taken into account, of course, for example. Then the actual focal points in the sample deviate from the nominal focal points by approximately the value for the offset, which may be left even after accounting for calibration values.
  • a wavelength is selected with which the isolated fluorophore is intended to be further localized.
  • the selected wavelength can be selected from the first or second wavelength for which a detection signal has already been obtained, or a further wavelength can be selected if the microscope provides more than two excitation wavelengths.
  • the light of the selected wavelength is then used for further excitation within the small field area of the sample, with fluorescence light emitted by the isolated molecule of the dye being detected from the partial area of the sample as a result of the excitation with the excitation light of the selected wavelength and a further detection signal being obtained .
  • a further localization is then obtained for the isolated molecule on the basis of the further detection signal. If, for example, a small field area is illuminated with focussed light of the longer wavelength, which remains at a focus point, and the detection is carried out with a confocally arranged detector that locally resolves a diffraction image in the confocal plane, a localization can be determined from the detection signal.
  • the excitation is done with the further wavelength by the focal point is placed at a sequence of locations encompassing the suspected location of the isolated fluorophore based on the information obtained earlier in the method, i.e. the excitation and detection is carried out as a whole as a localization.
  • the wavelength is preferably selected by evaluating the first or the second detection signal or both detection signals.
  • This evaluation can be aimed, for example, at determining the type of dye of the isolated fluorophore that emitted the detected fluorescent light. For example, from the amount of light received per time of just one wavelength, it can be deduced whether the isolated fluorophore was strongly or weakly excited.
  • One or more reference values can also be stored, with which a detection signal or both are compared.
  • a preferred method relies on a comparison of the two detection signals, which in many cases is a good indicator of the fluorophore species.
  • the wavelength of the stronger signal can be selected without the intermediate step of inferring the type of fluorophore.
  • the selected wavelength can thus be the first wavelength or the second wavelength.
  • a further wavelength can also be selected, which differs both from the first wavelength and from the second wavelength. This can be useful in particular in cases where fluorophores of one type are to be localized in the sample, which cannot be localized sufficiently well in order to reach the target using wavelengths with which fluorophores of another type can be localized well in the sample to be able to achieve a co-localization. If such a further wavelength is selected, then the method also comprises determining a difference between the first localization and the further localization obtained with the further wavelength or the second localization and this further localization or determining both of these differences.
  • the light of the further wavelength is preferably focused light. It also preferably has an intensity distribution with a central minimum in the focal area.
  • This intensity distribution can preferably be a donut distribution or a bottle beam distribution. Further excitation and detection can then take place in all of the ways described above with regard to the second excitation and detection.
  • the reference point can be calculated from the first or the second or from the first and the second localization, with the first localization sation can only be taken into account if it has already been received.
  • the reference point is determined from the first location or is given directly by the first location when the selected wavelength is the first wavelength.
  • the reference point is preferably determined from the second location or is given directly by the second location when the selected wavelength is the second wavelength.
  • the reference point can be determined by interpolation from the first and second locations, and when the selected wavelength is another wavelength that is greater than the first and is the second wavelength or smaller than the first and second wavelengths, it can be determined by extrapolation from the first and second locations.
  • the first excitation and detection is not necessarily connected with a first localization.
  • the first localization takes place after a wavelength has been selected. Then the selected wavelength is the first wavelength and the further localization is the first localization.
  • the further excitation and detection and the further, ie the first, localization of the isolated fluorophore are then preferably carried out continuously or iteratively until a further localization is obtained with at most a predetermined uncertainty, which is then the first localization.
  • the second excitation and detection and the second localization take place only after the end of the further excitation and detection.
  • one of the methods carried out in the small field can be carried out repeatedly or in parallel on different individual fluorophores.
  • An image in which the multiple staining contributes to the acquisition of information can be obtained if a total of isolated fluorophores of the multiple fluorophore types are localized.
  • a total of several small field areas are then to be examined, which, however, preferably overlap and, if the structure to be examined itself is very small, also together form a small field area.
  • One of the small-field methods is then carried out for a set of sub-areas, i.e.
  • the differences determined in each case between the localizations can be used to transfer all localizations into a common reference system, i.e. to assign one for individual fluorophores of different types to obtain co-location.
  • a map with correction vectors for the co-registration of all localizations in a common spatial reference system can preferably be determined from the localizations and the differences in the localizations of the individual individual fluorophores that were obtained with excitation light of different wavelengths.
  • Information about the time at which the excitation and detection for the localization took place is preferably stored for each of the localizations. This information can then be contained in the respective detection signal.
  • the map with correction vectors can then be a map dependent on a time coordinate.
  • the correction vectors can each correspond to mean values over several or many differences. If the sample or the characteristics of the image of the sample vary over time, it is advantageous to form such averages over differences obtained in close temporal proximity. Correspondingly, in the case of spatial variability, the averaging can take place over close spatial proximity.
  • Methods known from the prior art are then available, for example, to correct long-term temporal drifts in the image, that is to say here in the image stack. Either active stabilization can take place, in which case the relative drifts of the color channels to one another are the essential correction that can be corrected using the invention, or post-processing can take place, which is based on improved basic data when using the inventive method.
  • An image of the sample can therefore consist of the first and second localizations and/or the first and further localizations and/or the second and further localizations and optionally from other localizations, which can be obtained by means of excitation with excitation light of the first wavelength or the second wavelength or one of the further wavelengths and detection were obtained.
  • the first excitation and detection and the second excitation and detection can take place in the same or overlapping periods of time take place.
  • it is preferably carried out in different periods of time, which more preferably do not overlap.
  • the first excitation and detection takes place before the second excitation and detection. As stated above, this does not rule out that the first localization takes place after the second excitation and detection.
  • the first method according to the invention can also be carried out in the wide field.
  • the sub-area of the sample is a wide-field area and the detection is an imaging of the sub-area on a wide-field detector, wherein fluorescent light emitted by the isolated molecule is detected spatially resolved on the wide-field detector, so that a spatially resolved detection signal is obtained.
  • wide-field methods make it possible to localize several or many isolated fluorophores simultaneously in a comparatively simple manner.
  • fluorescence light emitted from the partial region of the sample as a result of the excitation with excitation light of the respective wavelength is detected by a plurality of isolated molecules, and a first and a second one respectively become a plurality of isolated molecules receive spatially resolved detection signal.
  • the first and second localization of a plurality of isolated molecules, ie fluorophores then takes place on the basis of the respective first and second spatially resolved detection signals, from which the first and second localizations are obtained.
  • the person skilled in the art knows how a localization takes place from wide-field data.
  • localization is ultimately an analysis of image data, while in some of the above-mentioned small-field methods, localization is a process that includes scanning in a certain way. If a method according to the invention is carried out in the far field, then at least one difference between the first localization and the second localization is determined in each case.
  • the first excitation and detection and the second excitation and detection can preferably take place simultaneously. This makes sense if detectors are available for detection that detect animals in different spectral channels.
  • the first excitation and detection can be ended after a predetermined period of time. It can also add another wavelength for another Stimulate and Detect can be selected. This is then preferably done from a predetermined set of at least two wavelengths. The selection is then followed by further excitation and detection, with excitation light of the selected wavelength being applied to the sub-area of the sample and fluorescent light emitted from the sub-area of the sample as a result of excitation with the excitation light of the selected wavelength being detected by several isolated molecules and in each case a further detection signal is obtained. A further localization of the plurality of isolated molecules then takes place on the basis of the respective further detection signal, so that a further localization is obtained for a plurality of isolated fluorophores. In this case, it is not necessary for a localization to actually be obtained for all the individual fluorophores that have been excited.
  • the wavelength can preferably be selected by evaluating the quantity of the first and second detection signals with regard to the type of dye whose individual molecules have emitted the detected fluorescent light that has caused the majority of the quantity of detection signals obtained .
  • a selection can also be made without an analysis with regard to the type of dye, for example by examining at which excitation wavelength more fluorescence of isolated fluorophores is observed.
  • the selected wavelength can be not only the first or the second wavelength, but it can also be a further wavelength which differs from the first and the second wavelength.
  • the first method according to the invention then includes determining a difference between the respective first localization and the respective further localization and/or between the respective second localization and the respective further localization.
  • the object on which the invention is based is also achieved by a second localization microscopic method for examining a sample stained with several dyes, which is now described below.
  • the second method comprises a test-wise excitation and detection, wherein a portion of the sample is exposed to excitation light of a test wavelength and fluorescent light emitted from the portion of the sample as a result of the excitation with the excitation light of the test wavelength is detected by a single fluorophore and a test detection signal is obtained .
  • a test signal optionally based on further information such as a second test signal, in an alternative a first wavelength is selected from a predetermined set of at least two wavelengths for a subsequent excitation of the partial region of the sample.
  • a first excitation and detection takes place with light of this selected first wavelength, with the partial area of the sample being exposed to excitation light of the first wavelength and with light emitted from the separated molecule as a result of the excitation with the excitation light of the first wavelength Fluorescent light is detected and a first detection signal is obtained.
  • the isolated excitable fluorophore is localized based on the first detection signal, so that a first localization is obtained.
  • the first wavelength is selected based on two test detection signals.
  • a second test excitation takes place, with the partial area of the sample being exposed to excitation light of a second test wavelength and the partial area of the sample as a result of the excitation with the excitation light of the second test wavelength of one fluorescence light emitted by a single molecule is detected and a second test detection signal is obtained.
  • a small field area is selected on the basis of the test signal for a subsequent excitation of the partial area, that is to say a small field area in which the subsequent excitation and detection is carried out.
  • the wavelength with which the subsequent excitation and detection takes place can be specified from the outset. This then takes the place of the selected wavelength of the first alternative.
  • the alternatives are not mutually exclusive. Rather, it is possible for both a small field area and a wavelength to be selected.
  • each test detection signal can be a value that is representative of the amount of fluorescent light detected.
  • the first wavelength can be selected based on the ratio of the first test signal to the second test signal. It can also be based on a comparison of the first, the second or the first and second test detection signal with a predetermined reference value or with predetermined reference values.
  • the test wavelengths can each be wavelengths that are used for procedural localization, that is, both the first test wavelength also the second test wavelength may be a wavelength included in the predetermined set of wavelengths for excitation.
  • this method is not characterized by the feature of determining a difference between two localizations. Nor is it characterized by a second localization at a second wavelength. Even without these features, a decisive advantage is achieved. If, for example, a movement of structures marked with fluorophores is to be tracked in a multicolored sample, the method enables a wavelength which is particularly suitable for the tracking to be selected. Localization with the first wavelength can also take place when following a structure, with new localizations being determined over time using the same fluorophore.
  • a second wavelength can also be selected from a predetermined set of at least two wavelengths for a subsequent excitation of the partial region of the sample and a second excitation and detection in this second inventive method.
  • the partial area of the sample is exposed to excitation light of the second wavelength and fluorescent light emitted from the partial area of the sample as a result of the excitation with the excitation light of the second wavelength by the separated molecule is detected, so that a second detection signal is obtained.
  • a second localization of the isolated fluorophore takes place on the basis of this detection signal, so that a second localization is obtained.
  • a difference between the first localization and the second localization can also be determined in the second method according to the invention. If, in the second method according to the invention, a second excitation and detection takes place with a second wavelength, most of the advantages of the first method can also be realized.
  • the second method can also be carried out not only as a wide-field method, but also completely as a small-field method.
  • the partial area of the sample is then a small field area from the outset, which has an extent of 3 pm or less than 2 pm, for example.
  • the second method can preferably also be carried out in that the test excitation and detection, here both the first and the optional second, are carried out independently of one another in a wide-field method, while the first or the second or the first and second localization are carried out in one small field procedure he follows. If this is the case, then after the test-based detection, a small field area is selected, in which the first or the first and second localization is then carried out.
  • the first localization preferably takes place using a MINFLUX method, a MINSTED method or a STED localization method.
  • a MINSTED method can be used particularly advantageously if the first localization is used as part of the tracking of a fluorescence-labeled structure.
  • the second method can also be used within the scope of imaging structures in a sample, even if the localization takes place in the small field.
  • This method is then also carried out for a set of sub-areas of the sample, so that the finally examined set of sub-areas contains both sub-areas from which fluorescent light was emitted and detected by a single molecule of a first dye and those from which one was isolated Molecule of another dye fluorescence light was emitted and detected.
  • a map with correction vectors for the co-registration of all localizations in a common spatial reference system can also be obtained with the second method from the localizations and the differences in the localizations of the individual isolated molecules obtained with excitation light of different wavelengths to be determined.
  • This also applies insofar as information about the time at which the excitation and detection for the localization took place can be stored for each of the localizations and that the map with correction vectors can be a map dependent on a time coordinate.
  • an image of the sample can be generated from the first and the second and optionally from other localizations that were obtained by means of excitation with excitation light of the first wavelength or the second wavelength.
  • the object on which the invention is based is achieved by a microscope according to the invention.
  • the microscope is set up to carry out a method according to the invention, in particular to carry out a method in which a wavelength is selected.
  • the microscope has a laser unit for exciting fluorescence that is set up to emit narrow-band light of two wavelengths, or two laser units for exciting fluorescence that are set up together to emit narrow-band light of two wavelengths. It also has a detection unit and a selection unit that is set up on the basis of a detection signal with regard to a fluorescence emission of a single fluorophore to select a wavelength for excitation.
  • the microscope has a calculation unit that is set up to determine a localization and a difference between the localizations from two detection signals with regard to a fluorescence emission of an individual fluorophore.
  • the microscope can preferably provide excitation light of two wavelengths which differ from one another by a value of between 200 nm and 50 nm. More preferably, the microscope has a laser unit that is set up to emit narrow-band light of a third wavelength. This does not preclude it from having a laser unit that is set up to emit excitation light in total of the wavelengths that meet the above-mentioned conditions in relation to one another. More preferably, the microscope has one or more STED lasers.
  • control unit which is preferably set up to carry out a MINFLUX method, a STED localization method or a MINSTED method.
  • FIG. 2 shows a flow chart of the first method according to the invention.
  • FIG. 3 shows a flow chart of an implementation of a first embodiment of the first method according to the invention, in which excitation and detection take place in a small field area.
  • FIG. 4 shows a flow chart of another implementation of the embodiment of the first method according to the invention, which is also shown in FIG.
  • FIG. 5 shows a flow chart of a further embodiment of the first method according to the invention.
  • FIG. 6 shows a flow chart of steps that can be performed in several of the embodiments of both methods according to the invention.
  • Fig. 7 is a schematic representation for selecting a wavelength from a set of wavelengths.
  • FIG. 8 illustrates that each step of exciting and detecting comprises the two elements exciting and detecting.
  • Fig. 9 shows a flow chart of a further embodiment of the first method according to the invention with a selection of a further wavelength.
  • 10 shows a flow chart of a first embodiment of the second method according to the invention.
  • FIG. 11 shows a flowchart of a second embodiment of the second method according to the invention with a selection of a small field area.
  • 12 shows a partial area of a multicolored sample with a small field area with an isolated excitable fluorophore and other excitable fluorophores.
  • FIG. 13 shows a flowchart of an embodiment of the second method according to the invention, in which a test-wise excitation and detection is carried out with two test wavelengths.
  • Fig. 14 shows a flowchart of a further embodiment of the second method according to the invention, in which a test-wise excitation and detection is performed with two test wavelengths with a selection of a small-field range.
  • 15 shows a flow chart of an embodiment of the second method according to the invention with the obtaining of a first and a second localization and the obtaining of a difference in the localizations by a comparison.
  • FIG. 16 shows a scheme illustrating how different fluorophores can be co-localized in a common spatial reference system.
  • FIG. 17 shows another scheme to illustrate how different fluorophores can be co-localized in a common spatial reference system.
  • Figure 18 shows yet another scheme illustrating how dissimilar fluorophores can be co-located in a common spatial reference frame.
  • Fig. 19 shows a scheme regarding the co-localization of more than two types of dye.
  • FIG. 20 schematically shows a microscope according to the invention. DESCRIPTION OF FIGURES AND EXPLANATION OF THE INVENTION USING THE FIGURES
  • Excitation spectra 6.7 and emission spectra 8.9 of the two fluorescent dyes Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 647 are shown in FIG. This pair of dyes is useful in the practice of methods of the present invention. All excitation spectra 6.7 and emission spectra 8.9 are normalized to their respective maximum value, the values on the ordinate are ratio values in percent of the associated maximum value. The values on the abscissa indicate the wavelength in nanometers. All of the following information on the excitation spectra 6.7 and emission spectra 8.9 are derived from the illustration, ie not taken from a table of values. The reason for this is that the exact values are not important, but only certain properties that are illustrated using the figure.
  • the excitation spectrum 6 of the fluorescent dye Alexa Fluor 568 therefore has a value of about 30% at a wavelength of 525 nm, it has the maximum at a wavelength of 568 nm, and at a wavelength of 600 nm the value of the excitation spectrum 6 is still just under 40%, at about 625 nm still around 5% and at a wavelength of 647 nm the value is close to zero (0).
  • the excitation spectrum 7 of Alexa Fluor 647 has its maximum at 647 nm, at 625 nm its value is about 40%, at 600 nm about 30%, at a wavelength of 568 nm the value is about 10% and at a wavelength of 525 nm the value is less than 5%.
  • the excitation spectra 6,7 show an overlap, i.e. that there are wavelengths with whose light both one and the other dye can be excited, and on the other hand that wavelengths exist with whose light only one of the two dyes can be excited well or with whose light one of the dyes can be excited much more, for example ten times as much as the other.
  • the Alexa Fluor 568 dye can be excited well with a wavelength of 525 nm, specifically with about 30% of the maximum achievable excitation probability for this dye, while the Alexa Fluor 647 dye only has less than 5% of the maximum achievable excitation true probability can be stimulated.
  • the dye Alexa Fluor 647 can be excited with a wavelength of 625 nm, with a relative excitation probability of around 40%, and the dye Alexa Fluorine 568 is used at hardly excited at this wavelength, with a relative excitation probability of about 5%.
  • FIG. 2 shows a flowchart for a first method according to the invention.
  • the method is carried out on a multicolored sample with isolated excitable fluorophores or more precisely on a portion 1 of a multicolored sample with isolated excitable fluorophores, where portion 1 of the multicolored sample can also include the entire sample.
  • An isolated excitable fluorophore is a fluorophore that can be localized, the term localization 11,21,113 known from localization microscopy denoting the process by which a localization 12,22,114 of a fluorophore is obtained.
  • the person skilled in the art knows from the prior art how it can be ensured in a sample that isolated excitable fluorophores are present in the sample or in partial regions of the sample.
  • the left-hand column shows the following method steps or method elements from top to bottom: first excitation and detection 10, first localization 11, first localization 12.
  • the first excitation and detection 10 takes place using excitation light of a first wavelength.
  • second excitation and detection 20, second localization 21 and second localization 22 are specified in the right-hand column from top to bottom.
  • the second excitation and detection 20 is carried out using excitation light of a second wavelength, which differs from the first wavelength differs.
  • the steps of first excitation and detection 10 and first localization 11 and second excitation and detection 20 and second localization 21 are each connected by a line; the steps of first excitation and detection 10 and first localization 11 are in fact closely related, the nature of which depends on the specific implementation or embodiment.
  • the first excitation and detection 10 and the first localization 11 occur simultaneously, that is, during the first excitation and detection 10 the process of the first localization 11 is performed, or the result of the detection 71 from the first excitation and detection 10 is used directly for determining the first localization 12.
  • the result of the detection 71 from the first excitation and detection 10 is not used directly to determine the first localization 12 or the localization 11 is not carried out in direct connection with the first excitation and detection 10, but the step of the first localization 11 is carried out separately in connection with a further excitation and detection 15 .
  • a first localization 12 receive.
  • second excitation and detection 20 and the second localization 21 take place at the same time, i.e. during the second Excitation and detection 20, the process of the second localization 21 is carried out, or the result of the detection 71 from the second excitation and detection 20 is used directly for the second localization 21.
  • the steps in the left and right columns can be performed simultaneously. It is then necessary for at least two spectral channels to be used for the detection 71, of which at least one is set up in such a way that fluorescence from two of the dyes used can be detected in it, in such a way that for the two of the color used materials can be localized 11,21,113.
  • the first excitation and detection 10 and the second excitation and detection 20 can take place in the wide field, as is usual with PALM or STORM, for example, or it can take place in a small field area, as with MINFLUX.
  • the first and/or the second excitation and detection 10,20 can also be carried out using a distribution of additional fluorescence prevention light, in particular in such a way that the localization is carried out using a STED localization method or a MINSTED method.
  • the combination of dyes, excitation wavelengths and the spectral channels used for detection is always selected in such a way that in each individual detection channel that corresponds to an excitation wavelength, fluorescence of just one type of dye is detected as exclusively as possible. This is to avoid the localization of the fluorophores of one type of dye being disturbed by the fluorescence of another type of dye.
  • a single isolated fluorophore is localized once in one of the spectral channels using light of one excitation wavelength and again using light of the other excitation wavelength.
  • a single isolated fluorophore or a quantity of single isolated fluorophores is localized once using light of a first excitation wavelength, wavelength A 111 , and once again using light of a different excitation wavelength, wavelength B 112 .
  • the first localization 12 in the left column is therefore a localization 114 the same fluorophore for which the second localization 21 is also obtained. If the first excitation and detection 10 and the second excitation and detection 20 take place in the far field, a plurality of first localizations 12 and a plurality of second localizations 22 can be obtained simultaneously.
  • the first localization 12 or the first localizations 12 are compared with the second localization 22 or the second localizations 22, so that optionally in each case, a difference 31 of the first localization 12 or the first localizations 12 and the second localization 22 or the second localizations 22 is obtained.
  • FIG. 3 shows a flowchart for carrying out an embodiment of the first method according to the invention.
  • excitation and detection 10, 15, 20 takes place in a small field area, which is the partial area 1 to be examined of the multicolored sample.
  • the method starts with finding 2 the small field area. This can be done by illuminating the sample or a region of the sample in the far field, detecting the fluorescence imaging the sample or the region of the sample in the far field, and evaluating the image to identify a small field region in which fluorescence is detected, derived from a single fluorophore.
  • this can also be done by scanning, in that the sample or a region of the sample is scanned with focused excitation light 3 and the fluorescent light emitted from the sample or the region of the sample is detected.
  • a small field area with a single excitable fluorophore can then be identified based on the amount of fluorescent light detected at an illumination site, for example based on two limit values, with the detected amount of fluorescent light having to exceed a lower limit value, which can be chosen depending on a background signal, and must fall below an upper limit.
  • a first excitation and detection 10 takes place, with focused excitation light 3 of a first wavelength being used.
  • the focused excitation light 3 has a central intensity maximum 4 .
  • the excitation 70 of the first excitation and detection 10 takes place within a small field area. This means that the focal point of the excitation light is either not shifted at all during the first excitation and detection 10 or it is only shifted within a range of at most a few micrometers, for example 3 ⁇ m diameter or just 2 m in diameter.
  • the first excitation and detection 10 takes place during a period of time 40, after which the first excitation and detection are terminated 34 .
  • a first detection signal 51 is obtained, which in particular includes a light quantity value 50, which is a measure of the quantity of fluorescence detected during the time period 40.
  • the first detection signal 51 is evaluated 32.
  • its light quantity value 50 can be evaluated by comparing it with a reference value 27, not shown in this figure. For example, if a sample stained with Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 647 is excited with light of a wavelength of 640 nm during a first excitation and detection 10, then a comparatively large light quantity value 50 is obtained if the isolated excitable fluorophore is a fluorophore of the Alexa Fluor dye 568, while when the isolated excitable fluorophore is a fluorophore of the dye Alexa Fluor 647, a comparatively low light amount value 50 is obtained.
  • a wavelength 33 is selected on the basis of the evaluation 32 in such a way that a further excitation and detection 15 is then carried out using the first wavelength.
  • This further excitation and detection 15 is carried out in order to obtain a first localization 12 . Accordingly, a first localization 11 takes place together with the further excitation and detection 15. The first localization 11 can take place using a MINFLUX method. In this case, the further excitation and detection 15 takes place using focused excitation light 3 whose focus has a central intensity minimum 5 .
  • the small field area can, also when using a MINFLUX method, in addition to the focused excitation light 3 of the first wavelength, be exposed to further focused light as fluorescence prevention light with an intensity distribution with a central intensity minimum, with the focus points of the two light distributions either coinciding or with the fluorescence prevention light in any case, the sample is radiated in such a way that the focal point of the focused excitation light 3 is always in one area of the minimum of the fluorescence prevention light.
  • the first localization 11 can be carried out using a STED localization method or a MINSTED method, in both cases, in addition to the excitation light of the first wavelength, focused fluorescence prevention light with an intensity distribution having a central intensity minimum is used.
  • the first localization 11 is carried out in conjunction with the further excitation and detection 15 until a criterion 41 is met.
  • a predetermined accuracy of the localization is given as criterion 41 .
  • Other possible criteria 41 are, for example, a number of iterations of MINFLUX iterations that have been carried out or, when using MINSTED, an intensity of the fluorescence prevention light that has been reached. It is also possible in each case that additional information from the first detection signal 51 is used to obtain the first localization 12 .
  • a first localization 12 can be obtained, which can be used, for example, to acquire an image of the sample or a region of the sample.
  • the isolated excitable fluorophore is in an excitable state even after the first localization 12 has been obtained.
  • This is now used by carrying out a further excitation and detection with a second wavelength, this further excitation and detection being the second excitation and detection 20 with which a second localization 22 is obtained.
  • the second excitation and detection 20 with the second localization 21, from which the second localization 22 is obtained the same applies with regard to the applicable method as for the further excitation and detection 15 with the first localization 11, from which the first localization 12 is obtained.
  • FIG. 4 shows a flow chart of another implementation of the same embodiment of the first method according to the invention as in FIG. The process differs because a fluorophore of a different type of dye than that shown in FIG. 3 is present as an isolated excitable fluorophore in the small field area under consideration.
  • a wavelength 33 is selected on the basis of the evaluation 32 of the first detection signal 51, a second wavelength is therefore selected. In this case, after the selection, the second excitation and detection 20 takes place together with the second localization 21, so that a second localization 22 is obtained.
  • the first localization 12 is compared 30 with the second localization 22, so that a difference 31 between the first localization 12 and of the second localization 22 is obtained.
  • FIG. 5 shows a flow chart of another embodiment of the first method according to the invention.
  • the finding of a small field area 2 and the first localization 11, from which a first localization 12 is obtained are more closely linked.
  • Both the finding of a small field area 2 and the first localization 11 are carried out with focused excitation light 3, in the example shown with a central intensity minimum 5.
  • both the finding of a small field area 2 and the first localization 11 are carried out with focused excitation light 3 with a central intensity maximum.
  • a partial area 1 of a multicolored sample is scanned with focused excitation light 3 until a fluorescence signal is obtained which originates from an isolated excitable fluorophore.
  • the scanning can take place in a raster fashion, but it can also take place on spiral paths or on circular paths, which are offset along one direction when a circle is completed.
  • a region of a few micrometers in extent around the location at which a fluorescence signal originating from an isolated excitable fluorophore is obtained is the small field region which is examined with a method according to the invention. For this purpose, when the small field area 2 is found, there is a transition to the first excitation and detection 10 with a first localization 11, from which a first localization 12 is obtained.
  • the first stimulus and Detect 10 receive a first detection signal 51 that includes a light quantity value 50 .
  • the first excitation and detection 10 can take place when the intensity distribution of the focused excitation light 3 is a donut distribution or a bottle beam distribution by placing the focal point of the focused excitation light 3 of the first wavelength at a location within the small field area, i.e of the partial region 1 of the multicolored stained sample is positioned, the detection 71 comprising the detection of the fluorescent light emitted as a result of the excitation with the focused excitation light of the first wavelength from the isolated molecule, i.e.
  • a detection takes place that is spatially resolved in the detection plane.
  • a first localization 12 can be obtained from the spatial distribution of the fluorescence signal obtained in this way in the detection plane.
  • a second excitation and detection 20 then takes place within the same partial area 1 of the multicolored sample, wherein a small field area 42 can be defined based on the first localization 12 according to the first localization 12, which is smaller than the partial area 1 of the multicolored sample.
  • a second localization 21 takes place together with the second excitation and detection 20, from which a second localization 22 is obtained. In principle, this can be carried out in the manner described in connection with FIGS.
  • the first localization 12 is compared with the second localization 22, so that a difference 31 between the first localization 12 and the second localization 22 is obtained.
  • the first detection signal 51 and the second detection signal 52 are evaluated 32, specifically the respective light quantity values 50.
  • the evaluation 32 provides information about the type of dye 62, to which the isolated excitable fluorophore, to which a first and a second localization 12 ,22 were received, heard; the type of dye can usually be determined, since it is often already known which types of dye were used to stain the sample.
  • the overall information 63 obtained from the method includes the difference 61 between the first localization 12 and the second localization 22 as well as information about the type of dye 62.
  • FIG. shows a flow chart of steps that can be carried out in several of the embodiments of both methods according to the invention.
  • a key point of the invention is that isolated excitable fluorophores of at least one type of fluorophore with which partial areas 1 of the multicolored stained sample are stained, once using excitation light of a first wavelength, in this figure wavelength A 111, are localized and once under using excitation light of a second wavelength, in this figure wavelength B 112, where wavelength A differs from wavelength B.
  • the left-hand column shows schematically that an excitation and detection 110 and a localization 113 with a localization 114 being obtained are carried out with a wavelength ⁇ 111 .
  • a detection signal 115 comprising a light quantity value 50 is obtained.
  • the right column shows the same schematic for a wavelength ⁇ 112 . The processes shown schematically in the two columns can be carried out simultaneously if the detection of the excitation and the detection 110 are carried out in different spectral detection channels.
  • the excitation and detection 110 each take place in a small field, it can be advantageous to carry out the steps in the left column (wavelength A 111) and the right column (wavelength B 112) one after the other.
  • the steps can be carried out, for example, in such a way that the localization takes place according to a MINFLUX method, a MINSTED method or a STED localization method.
  • the steps in the right and left columns can also be carried out alternately until the isolated excitable fluorophore has lost its excitability.
  • a localization 114 which is determined from the set of individual localizations, or a set with a plurality of localizations 114 can be obtained from the steps carried out in each case for the wavelength ⁇ 111 .
  • an overall detection signal 115 that results from the set of individual detection signals or a set of detection signals 115 is obtained.
  • a comparison 30 then takes place of the two localizations 114 for the wavelengths A 111 and B 112 or of the two sets with a plurality of localizations 114, so that a difference between the localizations for the two wavelengths is determined.
  • the two total detection signals 115 or the two sets of detection signals 115 are evaluated, with information being obtained about the type of dye 62 of the isolated excitable fluorophore that is emitted with light of the two wavelengths A 111 and B 112 was located.
  • the overall information 63 obtained from the method includes the differences 61 of the localizations 114 as well as the information about the type of dye 62.
  • Figure 7 illustrates selecting a wavelength from a set of wavelengths.
  • the set 117 comprises a wavelength A 111, a wavelength B 112 and another wavelength 116 mutually different from each other.
  • the selection 33 of a wavelength here the wavelength B 112 takes place here on the basis of two detection signals 115.
  • the selection 33 of a wavelength here includes a step of evaluating 32, shown separately in FIGS first detection signal 51 directed.
  • the arrow from set 117 to the step of selecting 33 a wavelength is intended to indicate that the elements from set 117 can be made available for use by selecting 33 the wavelength.
  • FIG. 8 shows the fact that each step of excitation and detection 110 includes the two elements excitation 70 and detection 71 .
  • a step of exciting and detecting 110 appears in this application as first exciting and detecting 10 , second exciting and detecting 20 , further exciting and detecting 15 and generally exciting and detecting 110 .
  • exciting and detecting 10,15,20,110 comprises corresponding elements exciting 70 and detecting.
  • FIG. 6 shows a flow chart of steps that can be carried out in several of the embodiments of both methods according to the invention.
  • the upper part represents the excitation and detection steps 110 already shown in FIG Light quantity value 50 comprises.
  • the further wavelength 116 shown in this FIG. 9 can be identical to one of the wavelengths A 111 and B 112, but it can also differ from both.
  • the addition to the processes shown in Fig. 6 is that at a point in time at which at least one localization 114 and at least one detection signal 115 have been received for both wavelength A 111 and wavelength B 112, a selection 33 of a further wavelength 116 for further excitation and detection 110 he follows.
  • the selection 33 includes an evaluation 32, which is presented separately elsewhere.
  • the selection of one of the wavelengths A 111 or B 112 as a further wavelength 116 can take place, for example, if an isolated excitable fluorophore is in any case associated with each of the wavelengths A 111 and B 112 at least one localization 114 is to be obtained and if, in addition, a localization 114 that is as precise as possible is to be obtained overall, possibly with the additional aim of stressing the sample as little as possible.
  • the two associated localizations 113 then take place first, so that at least one localization 114 is obtained for each of the wavelengths A 111 and B 112 .
  • a further wavelength 116 can now be selected, which excites the isolated excitable fluorophore as efficiently as possible.
  • the isolated excitable fluorophore can be localized well with the least possible total load on the sample.
  • the wavelength of the two wavelengths A 111 or B 112 can be selected, for example, for which the larger light quantity value 50 or a larger one from the light quantity value 50, taking into account the radiated in, during the associated excitation and detection 115 Amount of light known, for example, as part of the detection signal 115, derived value, was obtained.
  • the excitability of the Alexa Fluor 647 dye is maximum, but also the excitability of the Alexa Fluor 568 dye is hardly present, so that when exciting 70 with the further wavelength 116 of 647 nm, hardly any background fluorescence of the Alexa Fluor 568 dye is excited.
  • the localizations 114 are then compared 30 so that differences 61 in the localizations 114 are obtained, and the detection signals 115 are evaluated 32, the light quantity values 50 shown specifically in the figure, in order to obtain information about the type of dye 62 or to secure it.
  • the last evaluation 32 can also be omitted, in which case the information about the type of dye 62 from the first evaluation 32 (not shown) must then be taken over for the overall information 63.
  • the overall information 63 obtained from the process then includes the differences 61 in the localizations 114 and information about the type of dye 62.
  • FIG. 10 shows a flowchart for a first embodiment of a second method according to the invention.
  • This method is also carried out on a multicolored sample with isolated excitable fluorophores or, more precisely, on part 1 of a multicolored sample with isolated excitable fluorophores, where part 1 of the multicolored sample can also include the entire sample.
  • an excitation and detection 110 takes place in a first step, which is carried out with a test wavelength 25 as a test.
  • a detection signal 115 is obtained, which includes a light quantity value 50 .
  • a first wavelength is selected 33, which is used for a first localization 11.
  • a first excitation and detection 10 takes place with a first localization 11, from which a first localization 12 is obtained.
  • a reference value 27 is shown in the figure.
  • the dashed arrow in the step of selecting 33 the first wavelength is intended to indicate that the use of a reference value 27 is only one of the possible is. It is a good option in particular if partial area 1 of the multicolored sample is a small field area.
  • partial area 1 of the multicolored sample is a wide-field area and this is to be examined further using methods carried out in the wide-field, it can be determined, for example, using the detection signal 115 whether and how many isolated excitable fluorophores are in the image field and, if applicable, how many weak ones and how many show strong fluorescence emission. On the basis of this analysis, a wavelength can then be selected with which the largest possible number of individual fluorophores can be localized at the same time at the relevant recording time.
  • an excitation and detection 110 takes place in a first step, which is carried out with a test wavelength 25 as a test.
  • a detection signal 115 is obtained which includes a light quantity value 50 .
  • the excitation and detection 11 for testing purposes can take place in a number of sub-areas of the sample that are small-field areas. In this embodiment, however, the test excitation and detection 11 preferably takes place in the wide field.
  • a small field area 42 (not shown in this figure) is selected 43 in which a first localization 11 is to take place. Then, as in the first embodiment of this method, a first excitation and detection 10 takes place with a first localization 11, as a result of which a first localization 12 is obtained.
  • a wavelength is selected 33 . In principle, both selections 33, 43 can take place in parallel or dependent on one another.
  • FIG. 12 shows a partial area 1 of a multicolored sample with a small field area 42 with a single excitable fluorophore 44 and further excitable fluorophores 44,45.
  • FIG. 11 A wide-field image of a partial area 1 of a multicolored sample is recorded. In this picture can then fluorophores 44,45 be mapped from section 1 of the multicolored sample.
  • the figure corresponds to the sample except for measurement uncertainties and imaging errors.
  • the measurement uncertainties can be large because the test-wise excitation and detection 110 with the test wavelength 25 is not used to obtain an exact localization, but rather only to find a small field area 42, which is to be examined to obtain an exact localization. Based on the image, only such a region can be selected as the small field region 42 to be examined, in which an isolated excitable fluorophore 42 is present.
  • partial area 1 of the multicolored sample there are three isolated excitable fluorophores 42, two of which emit strongly, which is indicated by the larger radius, and one emits weaker, which is indicated by the smaller radius.
  • Several fluorophores 45, weaker-emitting and stronger-emitting ones, are present in the section on the right, but they are not isolated.
  • a small field area 42 can now be selected by examining the image of partial area 1 of the multicolored sample.
  • a small field area 42 can now be defined around the location of the image of the strongly emitting fluorophore 42, which has the greater distance to the non-separated excitable fluorophores 45, on the basis of the image, which is not shown.
  • This small field area 42 is slightly shifted compared to the actual location of the isolated excitable fluorophore 42 because of the measurement uncertainty.
  • the test wavelength can be used as the first wavelength. If the selection 43 of the small field area 42 takes place in such a way that the test wavelength can be used as the first wavelength, there is no step of selecting 33 a wavelength at this point.
  • Another possibility is that a region around the location of the only isolated excitable fluorophore 44 that shows weaker emission would be selected as the small-field region 42, because examination of the image indicates that a particularly good localization of this fluorophore using a different wavelength than the test wavelength for the first localization 10 is possible.
  • both a selection 43 of a small field area 42 and a selection 33 of a wavelength for the first excitation and detection 10 would take place for the following first excitation and detection 10 .
  • FIG. 13 shows a flowchart for a further embodiment of the second method according to the invention.
  • the diagram contains all of the elements shown in FIG. Reference is made to the information on FIG. 10 for the description of the relationships associated with these elements.
  • FIG. 13 there is another test-wise excitation and detecting 110, which is performed with a second test wavelength 26 that differs from the first test wavelength 25. If the detection 71 takes place in several different spectral detection channels, this further excitation and detection 110 as a test can take place simultaneously and can generally take place after the excitation and detection 110 as a test with the first test wavelength 25 .
  • a detection signal 115 which includes a light quantity value 50 , is also obtained for the further excitation and detection 110 with the second test wavelength 26 as a test.
  • the selection 33 of a first wavelength, which is used for a first localization 11 takes place on the basis of the two detection signals 115 that were obtained for the first test wavelength 25 and the second test wavelength 26 .
  • a ratio of the two light quantity values can be characteristic of a type of dye of an isolated excitable fluorophore, for whose first excitation and detection 10 with the associated first localization 11 the most suitable wavelength is then selected. If the excitation and detection 110 as a test is carried out in the wide field, for example the images of the partial region 1 of the multicolored stained sample can be examined to determine which of the test wavelengths 25, 26 contains more isolated excitable fluorophores that emit strongly.
  • This test wavelength 25, 26 can then be selected as the wavelength for the first excitation and detection 10.
  • a reference value 27 can also be used for selecting 33 a wavelength.
  • the reference value 27, which does not have to be a scalar value, can contain, for example, entries for comparison light quantity values or entries for comparison ratios of light quantity values, with which the two light quantity values 50 or their ratio is compared in order to select a wavelength for the first excitation and detection 10.
  • a small field area 42 (not shown in this figure) can be selected 43, in which a first localization 11 is to take place, on the basis of the two detection signals 115, once using the first test wavelength 25 and once using the second Test wavelength 26 were obtained, take place.
  • a first excitation and detection 10 then takes place with a first localization 11, as a result of which a first localization 12 is obtained.
  • a small field area is selected 43 42 a selection 33 of a wavelength.
  • both selections 33, 43 can take place in parallel or independently of one another, essentially in accordance with the information given in connection with FIG. 11 and in connection with FIGS. 15 shows an embodiment in which a difference between the first localization 12 and the second localization 22 is finally obtained by comparing 30 a first localization 12 and a second localization 22 of a single excitable fluorophore.
  • Elements known from FIG. 14 can be found in the upper part of the figure.
  • the group of FIG. 14 with the elements first excitation and detection 10, first localization 11 and first localization 12 can be found in FIG. 15 supplemented by the element detection signal
  • a new feature is the selection of a second wavelength 33' and a second excitation and detection 20 with a second localization 21, from which a second localization 22 is obtained.
  • a detection signal 115 each, which each includes a light quantity value 50, is obtained. If the lower part is now compared with the elements first excitation and detection 10 and second excitation and detection 20 and all the elements entered below, it can be seen that this part of the
  • Figure 6 corresponds, except that in Figure 6 reference is made generally to certain elements such as wavelengths A 111 and B 112, a locale 113 and so on, while in Figure 15 specific elements such as the first locale 11 and the second locale are referred to 22 and so on. Reference is therefore first made here to the description of FIG. 6 for the linking of the elements and the respective process sequences.
  • FIG. 15 there is a link between the left-hand element block with the first excitation and detection 10 and the corresponding right-hand element block, which is marked as optional block entered. Although this is not entered in FIG. 6, the description states that the right-hand block should be executed after the left-hand block under certain conditions.
  • the steps after the selection 33 of the wavelength for the first detection 10 or the selection 43 of a small field area 42 thus correspond to steps that are also known from the first method.
  • a wavelength is selected which differs from the wavelength for the first excitation and detection 20.
  • This wavelength can be selected in such a way that it is particularly suitable for locating a different type of fluorophore than that to which the fluorophore to be localized in this step belongs.
  • it must be chosen in such a way that it is possible to localize the fluorophore to be localized in this step. How this is to be understood becomes clear from FIG. 1 with the associated description. Overall, this means that two localizations 114 are obtained for the isolated excitable fluorophore, one of which can be highly accurate and another can have less accuracy or greater uncertainty.
  • a possibility for the co-localization of fluorophores of several, specifically two, fluorescent dyes in a common reference system is shown with reference to FIG.
  • a plurality 62 of fluorophores of a first dye 54 is localized using any of the methods according to the invention, one or more localizations L 56 being obtained for each individual fluorophore at a wavelength A 111 and one or more localizations U 57 at a wavelength B 112 .
  • the wavelength ⁇ 111 is a wavelength that is well suited for localizing 113 isolated excitable fluorophores of the first dye 54 .
  • the wavelength A 111 can be the first wavelength, i.e.
  • each individual localization L 56 can be a first localization 12, or it can be the second wavelength, i.e. each individual localization L 56 can be a second localization 22 .
  • the wavelength B 111 can be a wavelength that is less well suited for locating 113 isolated excitable fluorophores of the first dye 54 , but at the same time well suited for locating 113 isolated excitable fluorophores of the second dye 55 .
  • the wavelength B 112 can also be the first wavelength or the second wavelength, depending on the method and the specific course of the method, i.e. each individual localization U 57 can have a first localization 12 or a second lo- calization be 22. Overall, a plurality of localizations 58 is obtained.
  • This number can be the set of localizations L 56 or a subset or a set derived from the set of localizations L 56 .
  • a plurality of localizations L 56 to be identified as localizations of one and the same isolated fluorophore at different points in time and to be contained in the plurality of localizations 58 combined into a single localization of this fluorophore.
  • a difference 61 is determined for each of the localizations L 56 and U 57 .
  • a mean difference 59 between the localizations is determined from the set of differences 61 . Depending on the number of individual differences 61, this mean difference 59 can be determined with greater accuracy, that is to say with less uncertainty than an individual difference 61.
  • the plurality of localizations L 56 and U 57 may be results of locating 113 within a spatially restricted area of a sample or results of locating 113 within a restricted period of time. The latter is advantageous if the sample or the properties of the microscope with which the sample is examined are subject to fluctuations over time.
  • An isolated excitable fluorophore of a second dye 55 is localized with a wavelength B 112 well suited for this purpose.
  • a localization L 56 is obtained.
  • the mean difference 59 which results from the different wavelengths A 111 and B 112 when localizing Sieren, is known from the localizations of the first dye 54.
  • the localization L 56 of this isolated fluorophore of the second dye 55 is now classified by this average difference 59 together with the majority of localizations 58 in a total set of localizations 60, whereby a co-localization of fluorophores of different dyes is achieved.
  • the localization L 56 of the fluorophore of the second dye 55 and the mean difference 59 are preferably determined from data that were collected within a spatial or temporal neighborhood, preferably within a spatial and temporal neighborhood.
  • Localizations L 56 are obtained here for a plurality 62 of fluorophores of the first dye 54 with a wavelength A 111 and for a plurality 62 of fluorophores of the second dye 55 with a wavelength B 112.
  • pluralities 58 of localizations are obtained for both types of dye 59 and a mean difference 59 obtained.
  • This average difference 59 relates to a further wavelength 116 that is common to both types of dye.
  • the majority 58 of the localizations L 56 of the isolated fluorophores of the second dye 55 taking into account the two average differences 59 together with the majority 58 of the localizations L 56 of the isolated fluorophores of the first dye 54 classified in a total set of localizations 60, whereby a co-localization of fluorophores of different dyes is achieved.
  • the two dyes that localizations U 57 do not have to be obtained for all individual fluorophores that are used for imaging on a multicolored sample. Rather, it is sufficient, for example, to obtain this for such a quantity of isolated fluorophores that the mean difference 59 is obtained with a desired accuracy in each case.
  • both fluorophores of a first dye 54 and fluorophores of a second dye 55 are each localized with light of wavelength A 111 and with light of wavelength B 112, with localizations L 56 for fluorophores of the first dye 54 with wavelength A 111 and with the wavelength B 112 localizations U 57 are obtained.
  • fluorophores of the second dye 55 with wavelength B 112 localizations L 56 and with wavelength A 112 localizations U 57 are obtained.
  • the A 111 and B 112 wavelengths are chosen to excite one of the dyes well and the other sufficiently, with the roles of the wavelengths depending on the particular dye under consideration.
  • the respective pluralities 58 of the localizations L for both types of dye are now, taking into account the two mean differences 59, from which, for example, a mean value with the correct sign can be formed, into a total set of localizations 60 in which isolated fluorophores of both dyes are co-localized, summarized.
  • localizations U 57 do not have to be obtained for all isolated fluorophores that are used for imaging on a multicolored sample.
  • Fluorophores from more than two types of dyes can also be co-localized. This can take place, for example, in accordance with a course shown in FIG. As shown, for example, in FIG. 9, detection signals 115, which each include a light quantity value 50, can be present for the respective localizations 114. It is therefore possible that, for example, dye molecules of two types of dye with a common wavelength can be well localized and can be differentiated on the basis of the light quantity values 50 . It is advantageous to record light quantity values 50 for the two types of dye for all individual excitable fluorophores with a second wavelength of excitation light, for example by also obtaining localizations U 57 for all individual excitable fluorophores. Another possibility arises from looking at Figures 16 and 17 together, for example.
  • the solid connections express that the wavelength A 111 for localizing fluorophores of a first dye 54, the wavelength B 112 for localizing fluorophores of a second dye 55 and the further wavelength 116 for localizing fluorophores of a further dye 155 are well suited are.
  • wavelength ⁇ 111 is sufficient to localize fluorophores of the second dye 55
  • wavelength B 112 is sufficient to localize fluorophores of the first dye 54 to detect differences 61 in localizations with the different wavelengths; this is expressed by the dashed connection.
  • the wavelength B 112 is sufficiently suitable for localizing fluorophores of the further dye 155 in order to detect differences 61 in the localizations with the different wavelengths, in this case the wavelength B 112 and the further wavelength 116 .
  • the respective determination of the differences 61 of the localizations makes it possible to combine all localizations in a total set of localizations 60 .
  • information about the type of dye can be available for each localization of the total number of localizations 60 , which information can be obtained from the detection signals 115 with the light quantity values 50 , as explained in the corresponding context.
  • Fig. 20 shows schematically a microscope 80 according to the invention.
  • it has a control unit 89, in which a selection unit 87, which is set up based on a detection signal 51,52,115 with regard to a fluorescence emission of a single fluorophore, a wavelength for a Select excitation, and a calculation unit 89, which is set up to determine a localization and a difference in the localizations from two detection signals 51,52,115 with regard to a fluorescence emission of a single fluorophore.
  • the fact that a wavelength is selected on the basis of a detection signal 51, 52, 115 means that further information, such as a reference value 27 or a further detection signal 115, is also evaluated during the selection 33.
  • the selection unit 87 is linked via control lines to a laser unit 81, which is set up to emit narrow-band light of two wavelengths, and a laser unit 82, which is set up to emit narrow-band light of a third wavelength, which differs from the two wavelengths of the first laser unit 81. Furthermore, the microscope 80 has a detection unit 86 with which fluorescent light emitted from a sample can be detected. The detection unit 86 is connected to the selection unit 87 by means of the control unit 89 .
  • the narrow-band light 83, 84, 85 is coupled via beam couplers 90, 90' into a beam path 93, through which the light can be directed onto or into a sample.
  • the basic structure of various microscopes is known to those skilled in the art.
  • Fluorescent light 92 emitted from a sample can be directed to the detection unit 86 via the beam path 93 .
  • the microscope 1 has a calculation unit 88 which is set up to determine a localization 12, 22 and a difference 61 of the localizations from two detection signals 51, 52, 115 with regard to a fluorescence emission of a single fluorophore.
  • the wavelengths of the narrow-band lights 83,84,85 include two wavelengths that differ from one another by a value between 200 nm and 50 nm the narrow-band light 83 can be light with a wavelength of approximately 525 nm and the narrow-band light 84 can be light with a wavelength of approximately 650 nm, for example.
  • Narrow-band light is to be understood here as meaning light with spectral widths in the range of up to a few nanometers. If the narrow-band light 83,84,85 is intended to excite fluorophores by two-photon absorption or more generally multi-photon absorption, the bandwidth of the narrow-band light 83,84,85 can be up to 50 nm. If the narrow-band light 83, 84, 85 is intended to excite fluorophores by one-photon absorption, it typically has bandwidths in the range below 20 nm, preferably below 15 nm or below 10 nm.
  • Test wavelength second test wavelength

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Abstract

Offenbart werden lokalisationsmikroskopische Untersuchungen an mit mehreren Farbstoffen gefärbten Proben. Dabei ist entweder vorgesehen, dass ein vereinzelter anregbarer Fluorophor (54) einer ersten Sorte mit Anregungslicht zweier unterschiedlicher Wellenlängen (111, 112) angeregt wird und dass für jede der beiden Wellenlängen eine Lokalisation (114) des Fluorophors (54) erhalten wird, oder dass zunächst testweise angeregt wird, um dann eine Wellenlänge für Anregungslicht auszuwählen (33), mit der ein vereinzelter Fluorophor lokalisiert wird. Im ersten Fall wird der Unterschied (61) der so erhaltenen Lokalisationen des einen oder bevorzugt mehrerer einzelner Fluorophore bestimmt und genutzt, um Lokalisationen von Fluorophoren (54, 55) einer anderen Sorte und die der ersten Sorte in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem zu erhalten. Der zweite Fall ist vorteilhaft für das Verfolgen von Strukturen anwendbar. Auch im zweiten Fall können die Vorteile des ersten Falls zusätzlich verwirklicht sein.

Description

VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR AUFNAHME NANOSKOPISCHER BILDER
MEHRFACH GEFÄRBTER PROBEN
TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf die Lokalisationsmikroskopie, insbesondere auf die MINFLUX- Mikroskopie. Die Erfindung ermöglicht eine verbesserte nanoskopische Bildgebung mehrfach gefärbter, das heißt mit mehreren unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern gefärbter Proben, sowie ein Verfolgen einzelner Moleküle, das heißt Fluorophore, in mehrfach gefärbten Proben.
STAND DER TECHNIK
Lokalisationsmikroskopie erlaubt die Abbildung von Proben mit einer Auflösung unterhalb des Abbe’schen Beugungslimits. Für die Abbildung einer Probe wird diese mit Markern angefärbt, die sich so verhalten, dass sie jeweils mindestens für einen Zeitabschnitt fluoreszenzfähig sind, das heißt in einem Zustand sind, in dem sie zur Fluoreszenz angeregt werden können, und die meiste Zeit nicht fluoreszenzfähig sind. Man spricht allgemein davon, dass die verwendeten Marker blin ken. Dies kann beispielsweise darauf beruhen, dass sich die Gesamtmenge der Marker in einem Gleichgewichtszustand befinden, in dem jeweils ein kleiner Anteil der Marker fluoreszenzfähig ist und ein großer Anteil nicht. Die Probe wird so präpariert oder behandelt, dass im Mittel über die Probe verteilt zwar einige oder sogar viele Marker fluoreszenzfähig sind, die fluoreszenzfähigen Marker aber untereinander typischerweise Abstände aufweisen, die ungefähr gleich groß wie oder größer sind als beispielsweise der Durchmesser eines beugungsbegrenzten Anregungs lichtflecks. Wird die Probe nun mit Anregungslicht beaufschlagt, so kann das Licht der einzelnen fluoreszenzfähigen Fluorophore derart ortsaufgelöst detektiert werden, dass für jeden einzelnen Fluorophor ein Abbild erhalten wird, dessen Position mit einer Unsicherheit bestimmt werden kann, die viel kleiner ist als das Abbe’sche Beugungslimit. Alternativ kann auch die Probe in einer Weise mit Anregungslicht, beispielsweise mit einer Sequenz strukturierter Anregungslichtvertei lungen beaufschlagt werden, dass aus dem detektierten Fluoreszenzlicht auf Grund der Kenntnis über die Anregung die Positionen der fluoreszenzfähigen Marker mit einer Unsicherheit bestimmt werden können, die viel kleiner ist als das Abbe’sche Beugungslimit. In zeitlicher Abfolge werden nun die Positionen einer Vielzahl von Markern bestimmt, wobei bei Anwendung von Lokalisati onsmikroskopie im Weitfeld oder bei parallelisierten lokalisationsmikroskopischen Verfahren gleichzeitig bereits eine Mehrzahl von Markern erfasst werden. Schließlich wird aus der Menge der so bestimmten Positionen ein Bild der Probe erhalten.
Soll nun mittels eines lokalisationsmikroskopischen Verfahrens ein Bild einer Probe, die mit ver schiedenartigen Markern, beispielsweise zur Markierung verschiedener Strukturen, angefärbt ist, gewonnen werden, so ergeben sich verschiedene Probleme. Selbst wenn jede Sorte der gewähl ten Marker für sich genommen geeignet für die Lokalisationsmikroskopie ist, so gilt dies für das Paar der Sorten oder die gesamte Markermenge häufig nicht. Denn werden die Bedingungen derart eingestellt, dass die eine Markersorte einen geeigneten Gleichgewichtszustand aufweist, so kann unter denselben Bedingungen die oder eine andere Markersorte entweder zu selten oder gar nicht fluoreszenzfähig oder zu häufig fluoreszenzfähig sein. Weiter sind die Abbildungsbe dingungen für verschiedene Farben, das heißt Wellenlängen immer leicht unterschiedlich, sodass eine Unsicherheit hinsichtlich der Ko-Lokalisation von Markern verschiedener Sorten auftritt.
Wird in Publikationen, die sich auf Daten nicht überauflösender Mikroskopieverfahren wie bei spielsweise der einfachen Fluoreszenzmikroskopie oder der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie beziehen, der Begriff Ko-Lokalisation verwendet, so wird darunter regelmäßig verstanden, dass Signale der ko-lokalisierten Fluorophore im Bild nicht örtlich getrennt werden können, das heißt, dass sie innerhalb desselben Bild-Pixels erscheinen (siehe beispielsweise in „New Methods to Evaluate Colocalization of Fluorophores in Immunocytochemical Preparations as Exemplified by a Study on A2A and D2 Receptors in Chinese Hamster Ovary Cells“, Luigi F. Agnati et al., J Histo- chem Cytochem 53:941-953, 2005). Mit Blick auf lokalisationsmikroskopische Verfahren wird dieser Begriff allgemeiner verstanden, nämlich in dem Sinne, dass unter Ko-Lokalisation ver schiedenartiger Fluorophore die Bestimmung, in welcher räumlichen Beziehung die verschieden artigen Fluorophore angeordnet sind, verstanden wird. Darunter fällt auch die Bestimmung, dass die Orte verschiedenartiger Fluorophore räumlich im Bild nicht trennbar sind. In dem als „Tutorial Review“ bezeichneten Artikel „A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy”, S. Bolte und F. P. Cordelieres, Journal of Microscopy, Vol. 224, Pt 3, pp. 213-232, (2006), wird herausgestellt, dass es essenziell sei, zu vermeiden, dass Fluores zenzlicht einer Fluorophorsorte in einem einer anderen Fluorophorsorte zugeordneten Detekti- onskanal ein Signal erzeugt, das heißt, ein Übersprechen (englisch „bleed-through“) zwischen Detektionskanälen sei zu vermeiden; weiter sei zu vermeiden, dass Anregungslicht, welches eine Fluorophorsorte anregen soll, auch eine andere Fluorophorsorte anregt, das heißt eine Kreuz- Anregung (englisch „cross-talk“) oder ein Übersprechen der Fluoreszenzanregung sei zu vermei den. Weiter wird geraten, die Bildaufnahmen zu verschiedenartigen Fluororophoren nicht gleich- zeitig, sondern sequenziell durchzuführen. Sowohl ein Übersprechen zwischen Detektionskanä len als auch eine Kreuz-Anregung führten zu einer Vermischung der Spektralkanäle. Trete diese als nachteilige Störung auf, könnten Verfahren zur spektralen Entmischung angewendet werden. Grundsätzlich wird eine Vermischung der Spektralkanäle aber als Störung aufgefasst.
In der Publikation “Ultrahigh-Resolution Colocalization of Spectrally Separable Point-like Fluorescent Probes”, Xavier Michalet et al. , METHODS 25, 87-102 (2001), https://doi. org/10. 1006/meth.2001.1218, wird ein Verfahren zur Ko- Lokalisation verschiedener quasi-punktförmiger Fluoreszenzemitter gezeigt. Die Emitter werden in einer konfokalen, abtastenden Anordnung mit ein und derselben Anregungslichtquelle bzw. Anregungswellenlänge angeregt. In einer der ver wendeten Anordnungen wird der Detektionspfad mittels eines spektralen Strahlteilers in zwei Spektralkanäle geteilt, wobei die Detektion in jedem der Kanäle mit einem Photonen zählenden Detektor erfolgt, in einer anderen Anordnung erfolgt die Detektion unter Verwendung eines Pris mas und einer Kamera spektral aufgelöst. Solange sichergestellt ist, dass sich innerhalb der Auf lösungsbreite für jeden Spektralkanal nur jeweils ein einzelner Punktemitter befindet, können für jeden Spektralkanal aus den abtastend aufgenommenen Punktverbreiterungsfunktionen die Orte der einzelnen Emitter mit einer Genauigkeit weit besser als die Auflösungsgrenze bestimmt werden. Somit können auch Abstände verschiedener Emitter mit sehr hoher Auflösung, die letzt lich insbesondere von der Menge der detektierten Photonen abhängt, bestimmt werden, das heißt, im Detektionslicht trennbare, aber mit derselben Anregungswellenlänge anregbare Fluo reszenzemitter können mit Superauflösung ko-lokalisiert werden. Als Vorteil der Nutzung nur einer Anregungswellenlänge stellen die Autoren heraus, dass chromatische Fehler im Anregungspfad vollkommen eliminiert werden. Aus der Publikation von Leila Nahidiazar et.al, „The molecular architecture of hemidesmosomes, as revealed with super-resolution microscopy”, Journal of Cell Science 128, p. 3714-3719 (2015); https://doi.org/10.1242/jcs.171892, in Verbindung mit der zugehörigen „Supplementary Informa tion“ sind Verfahren zur Lokalisationsmikroskopie in zwei sowie in drei Farben unter Nutzung eines Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops bekannt. Eine Probe wird mit den Farbstoffen Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 488 und gegebenenfalls Alexa Fluor 532 gefärbt. Es wird eine spezielle Puffer lösung, die die Autoren OXEA nennen, verwendet, die es ermöglicht, alle drei Farbstoffe für lo kalisationsmikroskopische Bildgebung, konkret für ein als GSDIM-Mikroskopie (ground-state depletion followed by individual molecule return) bezeichnetes Verfahren, zu verwenden. Für Bild gebung in zwei Farben wird zunächst eine Abbildung unter Nutzung des Farbstoffs Alexa Fluor 647 durchgeführt, der mittels eines Lasers mit Licht einer Wellenlänge von 647 nm angeregt wird. Anschließend erfolgt eine Abbildung mit Nutzung des Farbstoffs Alexa Fluor 488, der mittels eines Lasers mit Licht einer Wellenlänge von 488 nm angeregt wird. Beide Farbstoffe können gemäß den Autoren unabhängig und ohne wechselseitige Störung aufgenommen werden. Für Bildge bung in drei Farben wird zusätzlich der Farbstoff Alexa Fluor 532 genutzt. Hierbei werden zu nächst die oben genannten Schritte durchgeführt, wobei bei der Nutzung von Alexa Fluor 488 ein Bandpassfilter im Detektionspfad genutzt wird, um Fluoreszenzlicht, welches vom dritten Farb stoff Alexa Fluor 532 emittiert wird, nicht mitzudetektieren. Abschließend wird eine Abbildung unter Nutzung des Farbstoffs Alexa Fluor 532 durchgeführt, der mittels eines Lasers mit Licht einer Wellenlänge von 532 nm angeregt wird. Bei der Nutzung dieses dritten Farbstoffs wird aus genutzt, dass bei den vorangehenden Schritten der Farbstoff Alexa Fluor 488 so stark gebleicht wurde, dass hinreichend wenig störende Fluoreszenz von ihm ausgeht. Die so erhaltenen Bild daten werden einzeln nachbearbeitet, folgend hinsichtlich auftretender Drift korrigiert, anschlie ßend werden Bilder erzeugt, die abschließend bezüglich auftretender chromatischer Abbildungs fehler korrigiert werden. Um Abstände der in unterschiedlichen Farben beobachteten Strukturen zu bestimmen, werden die Bilder unter Nutzung der Kenntnis über die Form abgebildeter Struk turen ausgewertet. Auf diese Weise werden die Abstände markierter Strukturen mit geringerer Unsicherheit bestimmt als der Unsicherheit, die sich aus den Unsicherheiten der einzelnen Loka lisationen zweier verschiedener Fluorophore ergibt. Aus der späteren Publikation von Leila Nahidiazar et.al, “Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution”, PLoS ONE 11 (7): e0158884. (2016), https://doi.orq/10.1371/iournal.pone.0158884. ist bekannt, dass sich die oben genannte Korrektur hinsichtlich auftretender Driften entweder auf Kreuzkorre lationstechniken oder aber auf die Abbildung in die Proben integrierter spezieller Referenzmarker, nämlich fluoreszierender Kügelchen (beads) stützt. Aus der Publikation “Dual-color Superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes”, Hari Shroff et. al. , Proceedings of the National Academy of Sciences, 104 (51) 20308-20313; (2007), https://doi.orq/10.1073/pnas.0710517105, ist ein wei teres Verfahren zur Lokalisationsmikroskopie in zwei Farben unter Nutzung eines Weitfeld-Fluo- reszenzmikroskops bekannt. Es werden zwei verschiedene photoaktivierbare Farbstoffe genutzt, die beide mit Licht einer Wellenlänge von 405 nm aktiviert werden können, aber mit unterschied lichen Wellenlängen angeregt und gegebenenfalls gebleicht werden. In einer ersten Schrittfolge wird Aktivierungslicht und längerwelliges Anregungslicht appliziert und die fluoreszierenden Mo leküle werden lokalisiert; dies wird durchgeführt, bis eine Vielzahl von Fluorophoren lokalisiert ist. Dabei bleicht der angeregte Farbstoff aus. Anschließend werden erst diejenigen kürzerwelligen Fluorophore, die sich dann in einem anregbaren Zustand befinden, mit einem intensiven Lichtpuls bei 488 nm, das ist die kürzere Anregungswellenlänge, deaktiviert, sodass anschließend alle kürzerwelligen Fluorophore in einem nicht anregbaren Zustand sind. Danach erfolgt wie für die erste Fluorophorsorte eine Lokalisierung der mit der kürzeren Wellenlänge anregbaren Fluoro- phore. Es wird betont, dass die Fluorophore nur ein sehr geringes Übersprechen zeigen, das heißt, dass die Bildgebungen in den unterschiedlichen Kanälen sich wechselseitig wenig beeinflussen.
Aus der Publikation “A user-friendly two-color super-resolution localization microscope", Teng Zhao et. al., Opt. Express 23, 1879-1887 (2015), ist ein Verfahren der Lokalisationsmikroskopie an zweifach gefärbten Proben bekannt. Eine Probe wird mit zwei Farbstoffen, Alexa Fluor 647 und Alexa Fluor 750, angefärbt. Es wird eine spezielle Pufferlösung verwendet, die derart einge stellt wird, dass sich beide Farbstoffe hinsichtlich der für die Lokalisationsmikroskopie wichtigen Schalteigenschaften möglichst gleich verhalten. Die Probe wird gleichzeitig im TIRF-Weitfeld- Mode (TIRF: total internal reflection microscopy) mit Fluoreszenzanregungslicht für beide Farb- Stoffe beaufschlagt. Im Detektionspfad wird die Fluoreszenz des einen Farbstoffs von der des anderen separiert. Die Fluoreszenzsignale werden jeweils in unterschiedlichen Hälften ein und desselben Kamerasensors detektiert. Zur Vermeidung von farbabhängigen Abweichungen der bestimmten Orte unterschiedlicher Fluorophore erfolgt eine Kalibrierung. Für die Kalibrierung werden Aggregate erzeugt, die jeweils Fluorophore beider Sorten enthalten und insgesamt eine Größe unterhalb des Abbe’schen Beugungslimits aufweisen. Eine Anzahl solcher Aggregate wird auf ein Deckglas aufgebracht, das Deckglas mit den Aggregaten wird unter dem Mikroskop be obachtet, die Aggregate werden lokalisiert. Da die Aggregate Fluorophore beider Sorten enthal ten, wird zu jedem Aggregat in beiden Sensorhälften Fluoreszenzlicht detektiert. Anhand dieser Messung werden die Detektorhälften aufeinander gemappt. Das so kalibrierte Mikroskop könne für mehrere Wochen für Aufnahmen, die frei von chromatischen Fehlern seien, genutzt werden.
In der Publikation „Multicolor Super-resolution Imaging with Photo-switchable Fluorescent Pro- bes”, W. Mark Bates et.al., Science; 317(5845): 1749pp, (2007), https://doi.Org/10.1126/science. 1146598, wird eine weitere Methode zur Weitfeld-Lokalisationsmikroskopie an mehrfach gefärb ten Proben vorgestellt. Anstelle einfacher Fluorophore werden jeweils Farbstoffpaare verwendet. Ein Partner des Farbstoffpaars, genannt Aktivator, fungiert dabei als Substanz, die die Akti vierungswellenlänge des Farbstoffpaars bestimmt, der andere Partner, genannt Reporter, ist eine Substanz, die die Anregungswellenlänge und die Emissionswellenlänge des Farbstoffpaars be- stimmt. Durch die Verwendung verschiedener Aktivator-Reporter-Paare wird ermöglicht, dass eine selektive Aktivierung und damit eine sequenzielle Lokalisation der unterschiedlichen Paare erfolgen kann, oder aber, dass eine simultane Aktivierung und simultane Lokalisation in verschie denen Detektionskanälen erfolgen kann, nämlich wenn sich die Emissionswellenlängen der Re porter unterscheiden. Demonstriert, das heißt anhand experimentell erhaltener Bilder belegt, wird das sequenzielle Verfahren basierend auf in den Aktivierungswellenlängen unterschiedlichen Ak- tivator-Reporter-Paaren. Ein Übersprechen zwischen Farbkanälen wird angesprochen. Diesbe züglich wird festgestellt, dass es bei den verwendeten Aktivator-Reporter-Paaren gering sei.
In der Publikation „Multicolor Fluorescence Nanoscopy in Fixed and Living Cells by Exciting Conventional Fluorophores with a Single Wavelength”, Maria Testa et. al. , Biophysical Journal, Volume 99, 2686-2694, (2010), https://doi.Org/10.1016/i.bpi.2010.08.012, wird ein weiteres GSDIM-Verfahren zur Weitfeld-Lokalisationsmikroskopie in mehreren Farben vorgestellt. Für die Anregung aller Farbstoffe sowie für die Entvölkerung des Grundzustands aller Farbstoffe wird ein und derselbe Laser, konkret ein cw-Laser einer Wellenlänge von 488 nm, verwendet. Das Fluo reszenzsignal aller Fluorophore wird im Detektionspfad in zwei Farbkanäle aufgeteilt und jeweils innerhalb zweier Teilbereiche ein und desselben Kamerasensors detektiert, sodass im Wesentli chen auf dem einen Teil des Sensors Fluoreszenzlicht mit einer Wellenlänge oberhalb und auf dem anderen mit einer Wellenlänge unterhalb einer Grenzwellenlänge detektiert wird. Auf diese Weise wird zu jedem Emitter in der Probe ein Paar von Punktbildern erhalten. Anhand des Ver hältnisses der Fluoreszenzmengensignale jedes einzelnen Fluorophors in den beiden Sensor- hälften wird erschlossen, was für ein Fluorophor jeweils ein konkretes Punktbildpaar hervor gerufen hat. Anschließend kann jedem Punktbild nicht nur ein Ortswert, sondern auch eine Farb information zugeordnet werden. Das Verfahren basiert darauf, dass sichergestellt wird bzw. bekannt ist, dass jeder einzelne Spot durch ein Molekül hervorgerufen wird, also kein Signal, welches als Mischung verschiedener Fluoreszenzemission entstanden sein könnte, vorliegt.
In der Publikation „Multicolor Far-Field Fluorescence Nanoscopy through Isolated Detection of Distinct Molecular Species”, Mariano Bossi et. al., Nano Lett, 8, 8, 2463-2468, (2008), https:// doi.org/10.1021/nl801471d, wird ein weiteres Verfahren zur Weitfeld-Lokalisationsmikroskopie in mehreren Farben vorgestellt. Es werden verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe genutzt, die alle durch Aktivierungslicht mit einer Wellenlänge von 375 nm aus einem nicht fluoreszenzfähigen Zustand in einen fluoreszenzfähigen geschaltet werden können und außerdem alle mittels Anre gungslicht ein und derselben Wellenlänge von 532 nm zur Fluoreszenz angeregt werden können. Dabei weisen die Fluorophore stark unterschiedliche Emissionsspektren auf. Es erfolgt nun jeweils eine Aktivierung und Anregung im Weitfeld, die resultierende Fluoreszenz wird in zwei Kanälen mit unterschiedlicher spektraler Empfindlichkeit jeweils ortsaufgelöst detektiert, aus dem Verhältnis der jeweils für einen Einzelemitter detektierten Fluoreszenzmengen wird auf die Art des Emitters geschlossen, auf Basis der örtlichen Verteilung der Fluoreszenz erfolgt jeweils eine Lokalisation. In der zugehörigen „Supplementary Information“ wird explizit erwähnt, dass die Orts koordinaten der beiden Spektralkanäle mittels der Abbildung fluoreszenter Beads, die in beiden Spektralkanälen emittieren, einander zugeordnet werden.
In der Publikation “Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super- resolution imaging”, Graham T Dempsey et al., Nat Methods 8, 1027-1036 (2011), https://doi.org/10.1038/nmeth.1768, wird ein Verfahren zur Bildgebung mittels STORM an mit vier unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen gefärbten Proben beschrieben. Es werden gezielt vier Farbstoffe ausgewählt, die sich sowohl in ihren Anregungsspektren als auch in ihren Emissions spektren stark unterscheiden. Diese werden jeweils einzeln mit einem zugehörigen Laser ange regt und die zugehörige Fluoreszenz wird in einem zugehörigen Spektralkanal detektiert. Die Auswahl der Farbstoffe und der Anregungswellenlängen stellt sicher, das keine Kreuz-Anregung stattfindet, sodass die einzelnen Bilder jeweils nur minimal von Fluoreszenz der jeweils anderen Farbstoffe gestört sind. Die Farbkanäle werden aufeinander registriert, indem vor jeder einzelnen Bildaufnahme an der Probe jeweils Goldbeads unter Weitfeldbeleuchtung in allen Detektionska nälen abgebildet werden. Die Autoren geben als Unsicherheit der Ko-Registrierung den Wert kleiner 20 nm an. Drifts, die während der Aufnahme über die Zeit auftreten, werden mit Hilfe von Bildkorrelationsverfahren korrigiert. In der Publikation “Nanoscale subcellular architecture revealed by multicolor three-dimensional salvaged fluorescence imaging”, Yongdeng Zhang et al. , Nat Methods 17, 225-231 (2020), https://doi.org/10.1038/s41592-019-0676-4, wird ein Verfahren zur Lokalisation von Fluorophoren in einer mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen gefärbten Probe vorgestellt, welches an einem Mi- kroskop mit einer 4-PI-Detektionsanordnung durchgeführt wird. Anregungslicht wird über ein di chroitisches Element durch ein Objektiv auf die Probe geleitet. Von Fluorophoren in der Probe emittiertes Fluoreszenzlicht wird zum einen über dasselbe Objektiv auf einen ersten ortsauflö- senden Detektor geleitet, wobei nur der Teil des Fluoreszenzlichts mit längeren Wellenlängen als das Anregungslicht das dichroitische Element passiert und auf den ersten Detektor gelangt; zum anderen wird in Gegenrichtung Fluoreszenzlicht durch ein weiteres, dem ersten entsprechendes dichroitisches Element über einen Spiegel auf denselben Detektor geleitet und am weiteren di chroitischen Element wird Licht mit kürzeren Wellenlängen, insbesondere Wellenlängen unter halb bzw. bis knapp oberhalb der Anregungswellenlänge herausgespiegelt; das herausgespie gelte Licht wird durch ein weiteres Filter, welches die Wellenlänge des Anregungslichts gerade nicht passieren lässt, auf einen weiteren Detektor geleitet. Anhand der zu einzelnen Fluorophoren gemessenen Intensitäts- oder Lichtmengenverteilungen werden die Fluorophore lokalisiert. Zur Unterscheidung zwischen Fluorophoren werden gleichzeitig auf den beiden Detektoren detektierte Burst einander zugeordnet, aus dem Verhältnis der gemessenen Intensitäten oder Lichtmengen wird die Art des Fluorophors erschlossen. Hierbei wird ausgenutzt, dass gerade der Anteil der kurzwelligen Fluoreszenz mit Wellenlängen unterhalb einer gegebenen Anregungswel lenlänge im Verhältnis zu der langwelligen Fluoreszenz mit Wellenlängen oberhalb einer gege benen Anregungswellenlänge sich zwischen verschiedenen Fluorophoren stark unterscheidet. Der kurzwellige Anteil ist dabei zumeist so klein, dass eine gute Lokalisation anhand gemessener Intensitäts- oder Lichtmengenverteilungen kaum möglich wäre. Die Lokalisation erfolgt daher nur anhand der Intensitäts- oder Lichtmengenverteilung der langwelligen Fluoreszenz und die Messwerte der kurzwelligen Fluoreszenz werden ausschließlich für die Identifikation der Fluoro phorsorte genutzt.
In der Publikation “Visualizing Intracellular Organelle and Cytoskeletal Interactions at Nanoscale Resolution on Millisecond Timescales”, Yuting Guo et al., Cell (2018), https://doi.org/10.1016/ j. cell.2018.09.057, wird ein Verfahren zur hochauflösenden Abbildung mittels strukturierter Be leuchtung beschrieben, welches nicht auf der Lokalisation einzelner Fluorophore basiert. Es wer den Bilder gezeigt, die auf der Nutzung dreier verschiedener fluoreszenter Proteine basieren, wobei jeweils mit voneinander unterschiedlichen Fluorophoren markierte biologische Strukturen hoch aufgelöst in ihrer räumlichen Beziehung zueinander abgebildet sind. Daneben wird demon striert, dass das Verfahren auch geeignet ist, einzelne Fluorophore zu detektieren.
Bei der MINFLUX-Nanoskopie handelt es sich um Verfahren der Lokalisationsmikroskopie. Die Lokalisation der Fluorophore erfolgt mittels strukturierter Anregungslichtverteilungen. Die grund legende Besonderheit der MINFLUX-Nanoskopie ist, dass die Anregung der Fluorophore jeweils so erfolgt, dass ein zu lokalisierender Fluorophor immer nah an einem oder in einem Minimum der Anregungslichtverteilung, welches idealerweise eine Nullstelle ist, platziert ist, wobei die An regungslichtverteilung benachbart zum Minimum einen Intensitätsanstiegsbereich aufweist. Hier durch wird eine bessere Ausnutzung der Fluoreszenzphotonen hinsichtlich der Gewinnung von Information über die Lage des jeweiligen emittierenden Fluorophors erreicht. Dies gilt auch für Anwendungen, in denen die Bewegung von Fluorophoren über die Zeit verfolgt werden soll. Die Beobachtung einer Probe unter Nutzung eines Anregungsminimums, der Grundlage der MINFLUX-Nanoskopie, ist bekannt aus den Patenten DE 102011 055 367 B4, hier zunächst nur zur Verfolgung der Bewegung einzelner Moleküle in einer Probe, und DE 102013 114 860 B3.ln DE 102011 055367 B4 wird auch die Möglichkeit angesprochen, zwei verschiedene Fluorophore gleichzeitig zu verfolgen. Hierfür sollen zwei verschiedene Lichtquellen verwendet werden, zwischen denen im schnellen Wechsel umgeschaltet wird.
Auf Basis dieser Grundlage sind eine Reihe von Verfeinerungen zur Informationsgewinnung ent standen, die eine Lokalisation der Fluorophore mit einer Unsicherheit im Bereich unterhalb von 2 nm ermöglichen. Diese Größe der Unsicherheit entspricht der Ausdehnung von Fluorophoren. Eine ausführliche Darstellung zur MINFLUX-Mikroskopie findet sich in „Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes“, Francisco Balzarotti et. al., arXiv: 1611.03401 [physics.optics] (2016). Grundsätzlich muss, um einen Fluorophor mittels MINFLUX-Mikroskopie lokalisieren zu können, das Intensitätsminimum bzw. die Intensi tätsnullstelle an einer Mehrzahl von Positionen relativ zur Lage des Fluorophors platziert werden. Hierfür muss in einem vorbereitenden Schritt eine Position des Fluorophors mit einer ersten, geringeren Genauigkeit abgeschätzt werden. Dies kann beispielsweise mittels gewöhnlicher Lo kalisationsmikroskopie (PALM, STORM) geschehen oder mittels anderer bekannter Verfahren. In der genannten Publikation wird hierfür ein Verfahren beschrieben, bei dem eine Probe mit einer Gauß’schen Intensitätsverteilung abgetastet wird, bis an einer Abtastposition Fluoreszenz detek- tiert wird, die mit gewisser Wahrscheinlichkeit von einem vereinzelten Molekül stammt. Die Ab tastung wird dann gestoppt und die Intensitätsverteilung wird anschließend an mehreren Orten, konkret an vier Orten, im Abstand von weniger als der Wellenlänge des Lichts zur Abtastposition um diese herum positioniert. Aus den zu den einzelnen Positionen gemessenen Photonenzahlen wird die Position des vereinzelten Emitters nach einem in der Publikation beschriebenen Verfah ren abgeschätzt. Die Abschätzung entspricht im Kern einer ratiometrischen Auswertung der zu den verschiedenen Positionen detektierten Photonenzahlen. Anschließend wird eine Intensitäts verteilung von Anregungslicht mit einem zentralen Minimum, beispielsweise in der Form eines Donuts, wie aus der STED-Mikroskopie bekannt, an einer bekannten Position platziert, die derart gewählt ist, dass der Fluorophor nah am Minimum der Intensitätsverteilung liegt. Die Fluores zenzantwort des Fluorophors wird gemessen. Dasselbe wird für eine oder mehrere weitere Posi tionen der Intensitätsverteilung wiederholt. Mittels einer ratiometrischen Auswertung der gemessenen Intensitäts- oder Lichtmengenverhältnisse wird die Position des Fluorophors mit höherer Genauigkeit bestimmt. Grundsätzlich steigt die Emissionsrate, je weiter der Fluorophor vom Anregungsminimum entfernt ist bzw. je weiter der Fluorophor in einen Intensitätsanstiegs bereich hinein verschoben ist. Diese genauer bestimmte Position kann nun als Ausgangsposition für eine Wiederholung der Abfolge der vorgenannten Schritte verwendet werden, wobei die Mehr zahl von Positionen dichter an die abgeschätzte Fluorophorposition gelegt werden kann. Insbe sondere mit Blick auf die Verfolgung der Bewegung von Fluorophoren kann auch die Verände rung der Emissionsrate bei einer Verlagerung des Fluorophors in den Intensitätsanstiegsbereich hinein oder zum Minimum hin genutzt werden, um die Verlagerung des Fluorophors hochgenau abzuschätzen. Je näher die Minimumspositionen der Intensitätsverteilung jeweils am tatsächli chen Ort des Fluorophors liegen, umso weniger Fluoreszenzphotonen werden für eine Lokalisa tion mit einer vorgegebenen Unsicherheit bzw. Genauigkeit benötigt. Das MINFLUX-Verfahren kann beispielweise unter Nutzung sogenannter Bottle-Beams zur Anregung auch zur Lokalisation in drei Dimensionen angewendet werden.
Als Patentoffenlegungsschriften zur MINFLUX-Mikroskopie sind insbesondere die Schriften WO 2018/069283 A1, US 2019/0235220 A1 , US 2019/0234882 A1 und US 2019/0234879 A1 zu nennen, wobei die genannten US-Patentanmeldungen alle Folgeanmeldungen zu der zuerst genannten vorläufigen internationalen Patentanmeldung sind, in der alle in der Folge mit Bezug zu den US-Offenlegungsschriften genannten Konzepte ebenfalls offenbart sind.
Die US 2019/0235220 A1 richtet sich auf ein Verfahren mit einer geringen oder minimalen Anzahl von Positionen, an denen ein Intensitätsminimum, welches in jeder Raumrichtung, in der eine Lage des Fluorophors bestimmt werden soll, beiderseits von Intensitätsanstiegsbereichen benachbart ist, platziert wird, um die Lage des Fluorophors zu bestimmen.
Die US 2019/0234882 A1 richtet sich auf das weiter oberhalb beschriebene Verfahren, bei dem die aus einem ersten MINFLUX-Schritt gewonnene Ortsinformation genutzt wird, um in einem Folgeschritt das Minimum der Intensitätslichtverteilung jeweils näher an dem Fluorophor zu platzieren und hieraus genauere Ortsinformation abzuleiten.
Die US 2019/0234879 A1 richtet sich auf ein Verfahren, bei dem das Intensitätsminimum sehr schnell, quasi gleichzeitig, an einer Mehrzahl von Positionen um die abgeschätzte Lage des Fluorophors herum platziert wird. Eine einzelne Position wird dann näher an das vermutete Minimum herangeschoben, wenn an ihr eine erhöhte Emissionsrate festgestellt wird.
In der Publikation „MINFLUX monitors rapid molecular jumps with superior spatiotemporal reso- lution”, Yvan Eilers et. al. , Proceedings of the National Academy of Sciences, 115 (24) 6117- 6122, (2018); https://doi.org/10.1073/pnas.1801672115, wird insbesondere beschrieben, wie mit tels MINFLUX die Bewegung einzelner Moleküle mit einer Auflösung der Bewegung im Bereich weniger Nanometer verfolgt werden kann. Im Ausblick wird erwähnt, dass Mehrfarbenanwend ungen der MINFLUX-Technologie vorhersehbar seien. Hierzu werden aber keine konkreten An gaben gemacht.
Die Veröffentlichung „MINFLUX nanoscopy delivers 3D multicolor nanometer resolution in cells“, Klaus C. Gwosch et. al., Nat Methods 17, 217-224 (2020), https://doi.org/10.1038/s41592-019- 0688-0, richtet sich auf dreidimensionale Nanoskopie mit mehreren verschiedenen Fluorophoren.
In der Publikation wird auch der Nachweis dokumentiert, dass mittels des iterativen Annäherns der Minimumspositionen an den tatsächlichen Ort des betreffenden Fluorophors eine Verringe rung der Unsicherheit der Lokalisation gegenüber einer ratiometrischen Lokalisation mit festen Minimumspositionen erreicht wird. Weiter wird gezeigt, dass auf diese Weise eine isotrope Auf- lösung in drei Dimensionen erreicht wird. Es wird nachgewiesen, dass MINFLUX-Nanoskopie auch mit Nutzung photoaktivierbarer fluoreszenter Proteine, konkret von mMaple, insbesondere auch an lebenden Zellen durchgeführt werden kann. Für Bildgebung unter Verwendung verschie dener Fluorophore werden jeweils Farbstoffe verwendet, die wechselseitig einen großen Über lapp der spektralen Absorptionskurven aufweisen und somit mit ein und derselben Anregungs- weilenlänge angeregt werden können. Konkret dargestellt wird dreidimensionale Nanoskopie mit jeweils zwei verschiedenen Fluorophoren, wobei insgesamt zwei verschiedene Paare (A: CF660C und Alexa Fluor 647; B: CF680C und Alexa Fluor 647), wobei bei beiden Paaren ein Partner des Paars der Farbstoff Alexa Fluor 647 ist, verwendet werden. Im Rahmen der MINFLUX-Aufnahme wird für die Anregung beider Farbstoffe eines Paars jeweils derselbe Laser genutzt. Außerdem wird eine MINFLUX-Aufnahme von Kernporen lebender Zellen gezeigt, für die die Fluoreszenz des von der entsprechend modifizierten Zelle exprimierten Nup96-mMaple, also lediglich eines Farbstoffs, genutzt wird. Der experimentelle Aufbau weist zwei verschiedene Laser für die Anregung mit einem Anregungsdonut auf, einen mit einer Wellenlänge von 642 nm, dieser ist geeignet für die Anregung der oben genannten Farbstoffpaare, und einen mit einer Wellenlänge von 560 nm, der geeignet ist für die Anregung von Nup96-mMaple. Die jeweils zwei Farbstoffe des Paars unterscheiden sich in ihrer Emissionscharakteristik. Der Detektionspfad der verwendeten Nanoskopie-Anordnung wird mittels eines dichroitischen Strahlteilers in einen spek tralen Detektionskanal für Licht einer Wellenlänge oberhalb von 685 nm und einen für Licht einer Wellenlänge unterhalb von 685 nm aufgeteilt. Bei Durchführung der Messung wird, da die spek- trale Emissionskurve aller verwendeten Fluorophore sowohl oberhalb als auch unterhalb der Grenzwellenlänge deutlich ungleich 0 (null) ist, für alle verwendeten Fluorophore Licht in beiden Spektralkanälen detektiert. Das Summensignal wird für die Lokalisation des Fluorophors verwen det. Da regelmäßig im Lokalisationsbereich nur ein Fluorophor, abgesehen von Hintergrundfluo reszenz, fluoresziert und da die verschiedenen Fluorophore eines Paars sich in der spektralen Emission unterscheiden, kann jeweils aus dem Verhältnis der Signale in den verschiedenen De tektionskanälen erschlossen werden, welche Fluorophorsorte des Farbstoffpaars das Signal ver ursacht hat. Im Ergebnis kann daher jeder Lokalisation ein konkreter Farbstoff zugeordnet wer den. Hierbei mögliche Fehlzuordnungen werden im Rahmen einer Datenanalyse mittels einer Hauptkomponentenanalyse der spektralen Anteile aller MINFLUX-Iterationen minimiert. Da die Lokalisation auf der Kenntnis über die Positionen der Minima der Intensitätsverteilungen alleine des Anregungslichts basiert, gibt es keinen farbabhängigen Versatz zwischen Lokalisationen der verschiedenen Fluorophore, da diese mit identischen Anregungswellenlängen angeregt werden. In der Publikation wird als bedeutend angesprochen, dass, da die Fluorophore lediglich Marker für abzubildende biologische Strukturen seien, die mittels der MINFLUX-Nanoskopie erreichte Auflösung der Abbildung der biologischen Strukturen letztlich bestimmt sei durch die Größe der genutzten Fluorophore. Um das Potential der MINFLUX-Nanoskopie vollständig zu nutzen, müs se daher die Fluoreszenzmarkierung optimiert werden, wobei Größe und Ausrichtung der Fluoro- phore zu berücksichtigen seien. Günstig sei, dass bei der MINFLUX-Nanoskopie weniger Photo nen zur genauen Lokalisation nötig seien, sodass für MINFLUX grundsätzlich eine größere Aus wahl von Fluorophoren verwendet werden könne.
Ein im Wesentlichen identisches Verfahren wie in der oberhalb genannten Publikation wird zur Untersuchung anderer Proben in der Veröffentlichung „Multicolor 3D MINFLUX nanoscopy of mitochondrial MICOS proteins“, Jasmin Pape et. al., PNAS,117 (34) 20607-20614, (2020), https://doi.org/10.1073/pnas.2009364117, behandelt.
In der europäischen Offenlegungsschrift EP 3 372 990 A1 wird neben weiteren MINFLUX- Verfahren ein dem MINFLUX-Verfahren in einem Aspekt ähnliches Verfahren beschrieben. Wie bei einem MINFLUX-Verfahren wird ein vereinzeltes Molekül fokussiert mit einer Intensitätsver teilung beaufschlagt, die ein zentrales Minimum, bevorzugt eine Nullstelle, und dieses umgeben de Anstiegsbereiche aufweist; ebenfalls wie bei MINFLUX wird dieses Minimum an eine Mehrzahl von Abtastpunkten um den vermuteten Ort des vereinzelten Moleküls platziert und es wird für jeden Abtastpunkt eine Fluoreszenzemission detektiert; aus den so erhaltenen Intensitätswerten oder Photonenzahlen wird die tatsächliche Position hochgenau abgeschätzt. Im Unterschied zu MINFLUX ist die Intensitätsverteilung eine Verteilung von Fluoreszenzverhinderungslicht, insbe sondere von STED-Licht. Diese wird gemeinsam mit Anregungslicht angewendet, wobei die In tensitätsverteilung des Anregungslichts kein zentrales lokales Minimum aufweist. Während bei MINFLUX die Fluoreszenzemission dann höher ist, wenn das vereinzelte Moleküle weiter vom zentralen Minimum der Intensitätsverteilung entfernt ist, ist es bei diesem Verfahren umgekehrt. Dieses Verfahren richtet sich, wie auch in der Schrift beschriebene MINFLUX-Verfahren auf Mes sungen an mehrfach gefärbten Nanostrukturen, wobei die Färbung derart gewählt ist, dass ver schiedene Fluorophore, die räumlich näher als eine Auflösungsgrenze benachbart sind, unter schieden werden können. Dies könne beispielsweise dadurch sichergestellt werden, dass Fluoro phore verwendet werden, die mit zueinander unterschiedlichen Anregungswellenlängen angeregt werden.
In der Publikation „MINSTED fluorescence localization and nanoscopy”, Michael Weber et al., bioRxiv 2020.10.31.363424; doi: https://doi.orq/10.1101/2020.10.31.363424, wird eine Variante des oben genannten MINFLUX-ähnlichen Lokalisationsverfahrens beschrieben. Für die Lokalisa tion vereinzelter Fluorophore wird eine Intensitätsverteilung eines STED-Lichts mit einem zentra len Intensitätsminimum mit einer gaußförmigen Intensitätsverteilung eines Anregungslichts überlagert. Zu Beginn des Lokalisierens wird eine geringe STED-Intensität verwendet, aus der sich eine gegenüber einer einfachen Anregung nur wenig verengte effektive Anregungsspreiz funktion ergibt. Die überlagerten Intensitätsverteilungen werden auf einer Kreisbahn um den aus einer Vorlokalisation abgeschätzten Ort eines vereinzelten Fluorophors geführt, während ein De tektor eingerichtet ist, aus dem kreisförmig abgetasteten Bereich emittierte Fluoreszenzphotonen zu detektieren. Wird nun ein Photon detektiert, wird das Zentrum der Kreisbahn in Richtung auf den Ort, an dem sich das Zentrum der überlagerten Lichtverteilungen befand, als das Photon emittiert wurde, verschoben um einen Wert, der ein Anteil des Radius der ursprünglichen Kreis bahn ist. Gleichzeitig wird die STED-Intensität erhöht, sodass sich die Halbwertsbreite der effek tiven Anregungsspreizfunktion verringert. Dieses Verfahren wird iterativ fortgesetzt, wobei aller dings die Erhöhung der STED-Intensität bei einem festen Wert beendet wird, sodass in späteren Schritten gegebenenfalls das Zentrum der Kreisbahn verschoben wird, ohne dass gleichzeitig die STED-Intensität erhöht würde. Die Lage des Zentrums der Kreisbahn nähert sich dabei immer mehr der Lage des zu lokalisierenden Fluorophors an. Die Iterationen werden beendet, wenn der vereinzelte Fluorophor keine Photonen mehr emittiert. Auch dieses Verfahren bietet wie MINFLUX eine hervorragende Ausnutzung der in den detektierten Photonen enthaltenen Infor mation. In der Publikation wird angekündigt, dass mehrere Farbkanäle durch Anwendung spektral verschobener Fluorophore ermöglicht werden sollen. Das Verfahren sei insbesondere geeignet zum Verfolgen sich schnell in einer Probe bewegender Emitter. Die Autoren nennen das vorge schlagene Verfahren MINSTED.
Mittels MINFLUX-Nanoskopie konnte die Position von Fluorophoren in zwei Raumrichtungen ex perimentell mit einer Unsicherheit von nur 1 nm bestimmt werden, das heißt die Genauigkeit der Lagebestimmung ist vergleichbar mit der Ausdehnung der Fluorophore selbst. Soll die Lage eines einzelnen Fluorophors mit einer gegebenen Messunsicherheit bestimmt werden, so wird hierfür eine geringere Zeit und insbesondere eine geringere Anzahl von Fluoreszenzphotonen benötigt als bei einer Lagebestimmung eines einzelnen Fluorophors mittels herkömmlicher Lokalisations mikroskopie. Ähnliches gilt auch für MINSTED-Nanoskopie.
Alle lokalisationsmikroskopischen Verfahren aus dem Stand der Technik weisen den Nachteil auf, dass eine Abbildung mehrfach gefärbter Proben nur gelingt, wenn die Fluorophorpaare speziell mit Blick auf das gewählte Abbildungsverfahren ausgewählt sind. Dies erschwert die Auswahl optimal auf die abzubildenden Strukturen abgestimmter Fluorophore. AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt dementsprechend die Aufgabe zugrunde, lokalisationsmikroskopische Ver fahren und Vorrichtungen für eine Untersuchung mit mehreren Farbstoffen gefärbter Proben anzugeben, die die Abbildung mit mehreren Farbstoffen gefärbter Proben oder die Verfolgung der Bewegung einzelner fluoreszenter Moleküle in mit mehreren Farbstoffen gefärbten Proben insoweit verbessern, als sie es erleichtern, auf die zu untersuchende Probe abgestimmte Fluorophore auszuwählen.
LOSUNG
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein lokalisationsmikroskopisches Verfahren für eine Unter- suchung einer mit mehreren Farbstoffen gefärbten Probe mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und durch ein weiteres lokalisationsmikroskopisches Verfahren für eine Un tersuchung einer mit mehreren Farbstoffen gefärbten Probe mit den Merkmalen des nebenge ordneten Patentanspruchs 21 gelöst. Die abhängigen Ansprüche 2 bis 20 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens gemäß Patentanspruch 1, die abhängigen Ansprüche 22 bis 31 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens gemäß Patentanspruch 21. Weiter wird die Aufgabe gelöst durch ein Mikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruchs 32, welches eingerichtet ist zur Ausführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere eines bevorzugten Verfahrens mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und des abhängigen Patentanspruchs 6 oder zur Ausführung eines bevorzugten Verfahrens mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 21 und den Merkmalen der abhängigen Patentansprüche 24 und 25. Die abhängigen Patentansprüche 33 und 34 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Mikroskops.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Im Rahmen dieser Anmeldung werden bestimmte Begriffe verwendet, deren Bedeutung eingangs klargestellt werden soll. Unter lokalisationsmikroskopischen Verfahren werden alle die Verfahren verstanden, bei denen eine Kenntnis über eine Lage eines Emitters zumindest auch auf dem Wissen darüber basiert, dass der Emitter vereinzelt Vorgelegen hat. Hierunter fallen die typischerweise im Weitfeld durchgeführten Verfahren wie PALM oder STORM sowie Verfahren der structured illumionation microscopy, soweit diese an vereinzelten Emittern durchgeführt werden. Hierunter fallen auch die im folgenden genannten Verfahren MINFLUX und STED- Lokalisation sowie Verfahren, bei denen ein Lokalisieren unter Nutzung der Verlagerung einer fokussierten Anregungslichtverteilung mit einem zentralen Intensitätsmaximum innerhalb eines Kleinfeldbereichs erfolgt. Unter MINFLUX-Verfahren werden im Rahmen dieser Anmeldung solche Verfahren verstanden, bei denen eine Lokalisation gemäß einem der aus dem Stand der Technik bekannten MINFLUX- Verfahren unter Nutzung einer Anregungslichtverteilung mit einem lokalen, zumeist einem zentra len, das heißt auf der optischen Achse liegenden, Intensitätsminimum erfolgt. Beispielsweise kann eine Anregungslichtverteilung mit einem zentralen Minimum entweder gemeinsam mit einer Verteilung von Fluoreszenzverhinderungslicht mit einem zentralen Minimum bewegt werden oder aber das zentrale Minimum einer Anregungslichtverteilung wird innerhalb eines Bereichs um ein Minimum einer Verteilung von Fluoreszenzverhinderungslicht bewegt.
Unter STED-Lokalisationsverfahren werden im Rahmen dieser Anmeldung solche Verfahren ver standen, bei denen eine Lokalisation gemäß einem der aus dem Stand der Technik bekannten MINFLUX-ähnlichen Verfahren oder gemäß einem ebenfalls aus dem Stand der Technik bekann ten MINSTED-Verfahren unter Nutzung einer Fluoreszenzverhinderungslichtverteilung erfolgt, wobei der Einfluss der Fluoreszenzverhinderungslichtverteilung wesentlich für das Lokalisieren ist. Beispielsweise kann eine Anregungslichtverteilung mit einem zentralen Maximum entweder gemeinsam mit einer Verteilung von Fluoreszenzverhinderungslicht mit einem zentralen Minimum bewegt werden oder aber das zentrale Minimum einer Fluoreszenzverhinderungslichtverteilung wird innerhalb eines Bereichs um ein Maximum einer Verteilung von Anregungslicht bewegt. In dieser Anmeldung wird die Bezeichnung MINSTED auch auf solche Verfahren angewendet, bei denen die Lokalisation beendet wird, bevor der vereinzelte Emitter seine Anregbarkeit verloren hat oder bei denen kein Schwellwert für eine maximale STED-Intensität existiert, ab der die Intensität des STED-Lichts nicht weiter erhöht wird oder bei denen die Halbwertsbreite der effektiven Anregungsspreizfunktion durch andere Maßnahmen als eine Erhöhung der STED- Intensität verändert wird sowie jeweils auch solche, bei denen das Fluoreszenzverhinderungslicht kein STED-Licht ist.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird zunächst gelöst, durch ein erstes lokalisationsmikroskopisches Verfahren für eine Untersuchung einer mit mehreren Farbstoffen gefärbten Probe, das im Folgenden beschrieben wird. Dieses erfindungsgemäße Verfahren umfasst zunächst ein erstes Anregen und Detektieren, wobei ein Teilbereich der Probe mit Anregungslicht einer ersten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei aus dem Teilbereich der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ersten Wellenlänge von einem vereinzelten Molekül eines Farbstoffs emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und ein erstes Detektionssignal erhalten wird. Das Detektionssignal umfasst dabei einen Wert, der repräsentativ für die Menge des detektierten Fluoreszenzlichts ist. Dieser Wert wird in der Folge als Lichtmengenwert bezeichnet. Das Anregen und Detektieren kann dabei derart erfolgen, dass unmittelbar eine erste Lokalisation eines vereinzelten anregbaren Fluoro phors erhalten werden kann. In jedem Fall umfasst das Verfahren ein erstes Lokalisieren des vereinzelten Moleküls auf Grundlage des ersten Detektionssignals und ein Erhalten einer ersten Lokalisation.
Weiter umfasst es ein zweites Anregen und Detektieren, wobei der Teilbereich der Probe mit Anregungslicht einer zweiten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei aus dem Teilbereich der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der zweiten Wellenlänge von dem ver- einzelten Molekül des Farbstoffs emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und ein zweites Detek tionssignal erhalten wird. Dieses zweite Detektionssignal umfasst einen Lichtmengenwert. Das zweite Anregen und Detektieren erfolgt in einer Weise, dass es ein zweites Lokalisieren des ver einzelten Moleküls ist und dass auf Grundlage des zweiten Detektionssignals eine zweite Lokali sation erhalten wird. Diese zweite Lokalisation muss nicht notwendigerweise nach der ersten Lo- kalisation erhalten werden. Sie ist deswegen als zweite Lokalisation bezeichnet, weil sie unter Nutzung von Anregungslicht einer zweiten Wellenlänge erhalten wird.
Schließlich umfasst diese Verfahren ein Bestimmen eines Unterschieds zwischen der ersten Lo kalisation und der zweiten Lokalisation. Der so bestimmte Unterschied kann bei einer Bildgebung an mit mehreren Farbstoffen gefärbten Proben dazu dienen, eine Ko-Lokalisation oder Ko-Regis- trierung der mehreren Farbstoffe in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem zu ermög lichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Teilbereich der Probe ein Kleinfeldbereich. Unter einem Kleinfeldbereich wird ein Bereich verstanden, der nur wenig größer ist, als sich aus den dem Maß für eine beugungsbegrenzte Trennbarkeit von Strukturen in der Probe ergibt. Ein Klein- feldbereich kann beispielsweise eine Ausdehnung von weniger als 3 pm, bevorzugt von weniger als 2 pm, weiter bevorzugt von weniger als 1,5 pm aufweisen, wobei der Kleinfeldbereich die entsprechende Ausdehnung in einer, bevorzugt aber in zwei oder drei Raumrichtungen aufweist, das heißt in Bezug zu einer Lokalisierung in zwei oder drei Raumrichtungen steht.
Wenn der Teilbereich ein Kleinfeldbereich ist, erfolgt das Anregen und Detektieren bevorzugt jeweils unter Anwendung von fokussiertem Anregungslicht. Das heißt, sowohl das Anregungslicht der ersten Wellenlänge als auch das der zweiten Wellenlänge werden fokussiert in den Kleinfeldbereich eingestrahlt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, bei der der Teilbereich ein Kleinfeldbereich ist, erfolgt das erste Anregen und Detektieren mit fokussiertem Anregungslicht der ersten Wellenlänge, das im Fokusbereich eine Intensitätsverteilung mit einem zentralen Minimum aufweist, die insbesondere im Wesentlichen eine Donut-Verteilung oder eine Bottle- Beam-Verteilung ist. Der Fokuspunkt, der hier mit dem Zentrum des zentralen Minimums zusam menfällt, wird dabei an einem Ort innerhalb des Teilbereichs positioniert. Wie ein solcher Teilbe reich, das heißt ein Kleinfeldbereich mit einem vereinzelten anregbaren Fluorophor aufgefunden werden kann, ist aus dem Stand der Technik bekannt. Die hier beschriebene bevorzugte Ausfüh- rungsform des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens weist den Vorteil auf, dass mit der Intensi tätsverteilung mit einem zentralen Minimum sowohl ein Auffinden eines Kleinfeldbereichs mit einem vereinzelten anregbaren Fluorophor als auch ein folgendes hochgenaues Lokalisieren mit einem MINFLUX-Verfahren besonders gut möglich ist. Für das Auffinden wird daher vorteilhaft weder eine besondere Lichtquelle benötigt noch ist eine Änderung der Intensitätsverteilung erfor- derlich. Für das Auffinden kann beispielsweise das Anregungslicht in Spiralbahnen über die Probe geführt werden, bis in einem Teilbereich der Probe pro Zeitraum eine Fluoreszenzmenge detektiert wird, die auf das Vorliegen eines vereinzelten anregbaren Fluorophors hindeutet. An der betreffenden Stelle kann nun das spiralförmige Abtasten beendet werden. Der Fokuspunkt ist dann, wie oben geschrieben, an einem Ort innerhalb des Teilbereichs positioniert. Ebenso wird unmittelbar auch ein Lichtmengenwert erhalten, der mit der beim Auffinden detektierten Fluores zenzmenge korrespondiert.
Eine erste Lokalisation kann erhalten werden, indem das Anregen mit der ersten Wellenlänge und das zugehörige Detektieren nach dem Abstoppen der Spiralbewegung fortgesetzt wird, während das Fluoreszenzlicht in einer Ebene, die konjugiert zu der Ebene ist, in der der Fokus- punkt liegt, das heißt, konfokal ist, mit einem ortsauflösenden Detektor detektiert wird oder während eine Detektionsapertur innerhalb einer Ebene, die senkrecht zu einer optischen Achse orientiert ist, an einer Mehrzahl von Positionen um die optische Achse herum positioniert wird. Das in der konfokalen Ebene detektierte Signal ist dann in dieser Ebene vom Ort abhängig, wobei die Ortsabhängigkeit von der Lage des vereinzelten anregbaren Fluorophors relativ zum Fokus punkt der Anregung abhängt. Für den Fluorophor kann somit eine Lokalisation erhalten werden. Diese hat zwar, verglichen mit einer Lokalisation nach einem MINFLUX-Verfahren, eine hohe Unsicherheit. Die erzielbare Genauigkeit reicht aber aus, um anschließend beispielsweise ein MINFLUX-Lokalisieren beginnen zu können. Sie kann auch ausreichen, um in Verbindung mit weiteren Informationen eine Ko-Lokalisation oder Ko-Registrierung der mehreren Farbstoffe in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem zu ermöglichen.
Eine alternative Möglichkeit, die gut geeignet ist, um das Auffinden des Kleinfeldbereichs mit dem vereinzelten anregbaren Fluorophor eng mit dem ersten Anregen mit der ersten Wellenlänge zu verbinden, ist, dass die Intensitätsverteilung des fokussierten Lichts der ersten Wellenlänge ein zentrales Maximum aufweist, insbesondere im Wesentlichen eine Gauß’sche Verteilung ist, und dass das erste Anregen und Detektieren, wobei ein Teilbereich der Probe mit Anregungslicht der ersten Wellenlänge beaufschlagt wird, erfolgt, indem der Fokuspunkt des Anregungslichts der ersten Wellenlänge an einer Abfolge von Orten innerhalb des Teilbereichs positioniert wird. Wie bei der oberhalb beschriebenen Ausführungsform wird ein Detektionssignal mit einem Lichtmeng enwert erhalten. Aus den zu der Abfolge von Orten innerhalb des Teilbereichs erhaltenen Teildetektionssignalen kann eine erste Lokalisation erhalten werden.
Das erste Anregen und Detektieren kann beispielsweise nach einer vorbestimmten Zeitspanne beendet werden. Alternativ kann das erste Anregen und Detektieren beendet werden, wenn ein Lichtmengenwert des ersten Detektionssignals einen Schwellwert erreicht hat, das heißt, wenn eine Mindestzahl von Fluoreszenzphotonen oder eine Mindestlichtmenge detektiert worden sind. Es können auch andere Kriterien definiert sein, bei deren Erfüllen das erste Anregen und Detek tieren beendet wird. Beispielsweise kann während des Anregens das Detektionssignal schon während es vollständig aufgenommen wird, untersucht werden, ob ein bestimmtes Verhältnis zu einem Hintergrund erreicht ist. Ein Hintergrund kann beispielsweise mit einer zusätzlichen Detek tionseinrichtung gemessen werden.
Die Intensitätsverteilung des fokussierten Lichts der zweiten Wellenlänge weist bevorzugt ein zentrales Minimum auf, sie ist insbesondere im Wesentlichen eine Donut-Verteilung oder eine Bottle-Beam-Verteilung, wie sie jeweils aus der STED-Mikroskopie bekannt sind. Das zweite An regen erfolgt dann bevorzugt, indem der Fokuspunkt des Anregungslichts der zweiten Wellen länge an einer Abfolge von nominellen Orten, die die erste Lokalisation als Bezugspunkt, das heißt als zentralen Ort umschließen, wobei der umschlossene Bereich eine erste Ausdehnung aufweist, innerhalb des Teilbereichs positioniert wird. Diese Abfolge von Orten kann eine be stimmte Anzahl von Orten aufweisen, es kann sich aber auch um eine kontinuierliche Abfolge von Orten handeln. Dass der Bereich der ersten Lokalisation umschlossen ist, umfasstauch, dass die erste Lokalisation in der Abfolge von nominellen Orten enthalten ist. Die Orte werden deswe gen als nominelle Orte bezeichnet, weil ein Versatz der Fokuspunkte der Anregungslichtverteil- ungen, der aufgrund der unterschiedlichen Anregungswellenlängen vorhanden sein kann, vor Durchführung des Verfahrens nicht gut bekannt ist. Die Einrichtung, mit der das Verfahren durch geführt wird, kann daher beispielsweise so eingestellt werden, als träte kein Versatz auf, wobei natürlich beispielsweise bereits vorhandene Kalibrierwerte berücksichtigt werden. Dann weichen die tatsächlichen Fokuspunkte in der Probe um ungefähr den Wert für den Versatz, der der auch nach Berücksichtigung von Kalibrierwerten übrig bleibende sein kann, von den nominellen Fokus punkten ab.
Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen, bei denen schließlich ein Kleinfeldbereich mit einem Kleinfeldverfahren untersucht wird, werden im Folgenden genannte weitere Schritte durch geführt. Auf Basis eines der Detektionssignale oder auf Basis beider Detektionssignale wird eine Wellenlänge ausgewählt, mit der der vereinzelte Fluorophor weiter lokalisiert werden soll. Die ausgewählte Wellenlänge kann dabei ausgewählt werden aus der ersten oder zweiten Wellenlänge, zu denen bereits jeweils ein Detektionssignal erhalten wurde, oder es kann eine weitere Wellenlänge ausgewählt werden, wenn das Mikroskop mehr als zwei Anregungswellen längen bereitstellt. Mit dem Licht der ausgewählten Wellenlänge erfolgt dann ein weiteres Anregen innerhalb des Kleinfeldbereichs der Probe, wobei aus dem Teilbereich der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ausgewählten Wellenlänge von dem vereinzel ten Molekül des Farbstoffs emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und ein weiteres Detektionssig nal erhalten wird. Für das vereinzelte Molekül wird dann auf Grundlage des weiteren Detektions signals eine weitere Lokalisation erhalten. Wird beispielsweise ein Kleinfeldbereich mit fokussier- tem Licht der weiteren Wellenlänge, welches an einem Fokuspunkt verweilt, beleuchtet und erfolgt das Detektieren mit einem konfokal angeordneten Detektor, der ein Beugungsbild in der konfokalen Ebene örtlich auflöst, so kann aus dem Detektionssignal eine Lokalisation bestimmt werden. Bei einer bevorzugten Methode erfolgt das Anregen mit der weiteren Wellenlänge, indem der Fokuspunkt an einer Abfolge von Orten, die den aufgrund der im Verfahren früher erhaltenen Informationen vermuteten Ort des vereinzelten Fluorophors umschließen, platziert wird, das heißt, das Anregen und Detektieren wird insgesamt als ein Lokalisieren ausgeführt.
Das Auswählen der Wellenlänge erfolgt dabei bevorzugt durch ein Auswerten des ersten oder des zweiten Detektionssignals oder beider Detektionssignale. Diese Auswertung kann beispiels weise darauf gerichtet sein, die Farbstoffsorte des vereinzelten Fluorophors, der das detektierte Fluoreszenzlicht emittiert hat, zu bestimmen. Beispielsweise kann aus der pro Zeit empfangenen Lichtmenge schon nur einer Wellenlänge erschlossen werden, ob der vereinzelte Fluorophor stark oder schwach angeregt wurde. Es können auch ein oder mehrere Referenzwerte hinterlegt sein, mit denen ein Detektionssignal oder beide verglichen werden. Eine bevorzugte Methode stützt sich auf einen Vergleich der beiden Detektionssignale, der in vielen Fällen ein guter Indika tor der Fluorophorsorte ist. Ist beispielsweise die pro Zeit empfangene Lichtmenge des einen Detektionssignals ein Vielfaches der des anderen Detektionssignals, so kann auch ohne den Zwischenschritt des Rückschließens auf die Fluorophorsorte die Wellenlänge des stärkeren Sig- nals ausgewählt werden. Die ausgewählte Wellenlänge kann also die erste Wellenlänge oder die zweite Wellenlänge sein.
Hierbei kann aber auch eine weitere Wellenlänge ausgewählt werden, die sich sowohl von der ersten Wellenlänge als auch von der zweiten Wellenlänge unterscheidet. Dies kann insbesondere in Fällen sinnvoll sein, in denen in der Probe Fluorophore einer Sorte lokalisiert werden soll, die mit Wellenlängen, mit denen in der Probe enthaltene Fluorophore einer anderen Sorte gut lokali siert werden können, nicht hinreichend gut lokalisiert werden können, um das Ziel einer Ko-Loka- lisation erreichen zu können. Wird eine solche weitere Wellenlänge ausgewählt, dann umfasst das Verfahren auch ein Bestimmen eines Unterschieds zwischen der ersten Lokalisation und der weiteren Lokalisation, die mit der weiteren Wellenlänge erhalten wird oder der zweiten Lokalisa- tion und dieser weiteren Lokalisation oder ein Bestimmen beider dieser Unterschiede. Bevorzugt ist das Licht der weiteren Wellenlänge fokussiertes Licht. Es weist weiter bevorzugt im Fokusbe reich eine Intensitätsverteilung mit einem zentralen Minimum auf. Diese Intensitätsverteilung kann bevorzugt eine Donut-Verteilung oder eine Bottle-Beam-Verteilung sein. Das weitere Anre gen und Detektieren kann dann in allen den Weisen erfolgen, die oberhalb mit Blick auf das zweite Anregen und Detektieren beschrieben sind. Dabei kann der Bezugspunkt aus der ersten oder der zweiten oder aus der ersten und der zweiten Lokalisation berechnet sein, wobei die erste Lokali- sation nur berücksichtigt werden kann, wenn sie bereits erhalten wurde. Bevorzugt wird der Be zugspunkt aus der ersten Lokalisation bestimmt oder ist unmittelbar durch die erste Lokalisation gegeben, wenn die ausgewählte Wellenlänge die erste Wellenlänge ist. Entsprechend wird der Bezugspunkt bevorzugt aus der zweiten Lokalisation bestimmt oder ist unmittelbar durch die zweite Lokalisation gegeben, wenn die ausgewählte Wellenlänge die zweite Wellenlänge ist. Wenn die ausgewählte Wellenlänge eine weitere Wellenlänge ist, die zwischen der ersten und der zweiten Wellenlänge liegt, kann der Bezugspunkt durch Interpolation aus der ersten und der zweiten Lokalisation bestimmt werden und wenn die ausgewählte Wellenlänge eine weitere Wel lenlänge ist, die größer als die erste und die zweite Wellenlänge oder kleiner als die erste und die zweite Wellenlänge ist, kann er durch Extrapolation aus der ersten und der zweiten Lokalisation bestimmt werden.
Es wurde bereits darauf hingewiesen, dass das erste Anregen und Detektieren nicht zwingend mit einem ersten Lokalisieren verbunden ist. Insbesondere in einem solchen Fall erfolgt das erste Lokalisieren nach dem Auswählen einer Wellenlänge. Dann ist die ausgewählte Wellenlänge die erste Wellenlänge und das weitere Lokalisieren ist das erste Lokalisieren. Das weitere Anregen und Detektieren und das weitere, das heißt das erste, Lokalisieren des vereinzelten Fluorophors werden dann bevorzugt zusammenhängend oder iterativ so lange durchgeführt, bis eine weitere Lokalisation mit höchstens einer vorbestimmten Unsicherheit erhalten wird, die dann die erste Lokalisation ist. In einem solchen Fall erfolgt das zweite Anregen und Detektieren und das zweite Lokalisieren erst nach dem Beenden des weiteren Anregens und Detektierens.
Um nun ein Bild der mehrfach gefärbten Probe oder eines Bereichs der Probe, zum Beispiel einer bestimmten biologischen Struktur zu gewinnen, kann eines der im Kleinfeld durchgeführten Ver fahren wiederholt oder parallelisiert an verschiedenen vereinzelten Fluorophoren durchgeführt werden. Dabei kann eine Abbildung, in der die Mehrfachfärbung zum Informationsgewinn bei trägt, erhalten werden, wenn insgesamt vereinzelte Fluorophore der mehreren Fluorophorsorten lokalisiert werden. Hierzu sind dann insgesamt mehrere Kleinfeldbereiche zu untersuchen, die aber bevorzugt überlappen und, wenn die zu untersuchende Struktur selbst sehr klein ist, auch gemeinsam einen Kleinfeldbereich bilden. Eines der Kleinfeldverfahren wird dann also für eine Menge von Teilbereichen, das heißt Kleinfeldbereichen der Probe durchgeführt, wobei die Menge von Teilbereichen sowohl Teilbereiche enthält, aus denen von jeweils einem vereinzelten Fluoro phor eines ersten Farbstoffs Fluoreszenzlicht emittiert und detektiert wurde als auch solche, aus denen von jeweils einem vereinzelten Fluorophoreines anderen Farbstoffs Fluoreszenzlicht emit tiert und detektiert wurde.
Die jeweils bestimmten Unterschiede zwischen den Lokalisationen, also zwischen den ersten und den zweiten oder zwischen den ersten und den zweiten und den weiteren, können genutzt werden, um alle Lokalisationen in ein gemeinsames Bezugssystem zu übertragen, das heißt, um für vereinzelte Fluorophore verschiedener Sorten eine Ko-Lokalisation zu erhalten. Hierfür kann bevorzugt aus den Lokalisationen und den Unterschieden der Lokalisationen der einzelnen ver einzelten Fluorophore, die mit Anregungslicht verschiedener Wellenlängen erhalten wurden, eine Karte mit Korrekturvektoren für die Ko-Registrierung aller Lokalisationen in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem bestimmt werden. Bevorzugt ist zu jeder der Lokalisationen Infor mation über die Zeit, zu der das Anregen und Detektieren für das Lokalisieren erfolgte, gespei chert. Diese Information kann dann im jeweiligen Detektionssignal enthalten sein. Die Karte mit Korrekturvektoren kann dann eine von einer Zeitkoordinate abhängende Karte sein. Die Korrek turvektoren können dabei jeweils Mittelwerten über mehrere oder viele Unterschiede entsprechen. Wenn die Probe oder die Eigenschaften der Abbildung der Probe zeitlich schwan ken, ist es vorteilhaft, solche Mittelwerte über Unterschiede zu bilden, die in enger zeitlicher Nach barschaft erhalten wurden. Entsprechend kann bei räumlicher Variabilität die Mittelwertbildung über enge räumliche Nachbarschaften erfolgen. Um dann beispielsweise längerfristige zeitliche Driften im Bild, das heißt hier im Bildstapel zu korrigieren, stehen dann aus dem Stand der Tech nik bekannte Verfahren zur Verfügung. Entweder kann eine aktive Stabilisierung erfolgen, dann sind die relativen Driften der Farbkanäle zueinander die wesentliche Korrektur, die mittels der Erfindung korrigiert werden können, oder es kann eine Nachbearbeitung erfolgen, die sich bei Anwendung erfindungsgemäßer Verfahren auf verbesserte Grunddaten stützt.
Für die Bildgewinnung können grundsätzlich alle erhaltenen Lokalisationen und alle bestimmten Unterschiede genutzt werden. Ein Bild der Probe kann also aus den ersten und den zweiten Lokalisationen und/oder den ersten und den weiteren Lokalisationen und/oder den zweiten und den weiteren Lokalisationen und optional aus anderen Lokalisationen, die mittels Anregen mit Anregungslicht der ersten Wellenlänge oder der zweiten Wellenlänge oder einer der weiteren Wellenlängen und Detektieren erhalten wurden, erzeugt werden.
Grundsätzlich kann auch bei Anwendung eines Kleinfeldverfahrens das erste Anregen und Detektieren und das zweite Anregen und Detektieren in gleichen oder überlappenden Zeiträumen erfolgen. Bevorzugt erfolgt es bei Anwendung eines Kleinfeldverfahrens aber in voneinander unterschiedlichen Zeiträumen, die weiter bevorzugt nicht überlappen. Dabei erfolgt das erste Anregen und Detektieren zeitlich vor dem zweiten Anregen und Detektieren. Das schließt, wie weiter oben geschrieben, nicht aus, dass das erste Lokalisieren nach dem zweiten Anregen und Detektieren erfolgt.
Das erste erfindungsgemäße Verfahren kann auch im Weitfeld durchgeführt werden. Dann ist der Teilbereich der Probe ein Weitfeldbereich und das Detektieren ist ein Abbilden des Teilbereichs auf einen Weitfelddetektor, wobei von dem vereinzelten Molekül emittiertes Fluoreszenzlicht auf dem Weitfelddetektor örtlich aufgelöst detektiert wird, sodass ein örtlich aufgelöstes Detektions- Signal erhalten wird. Weitfeldverfahren ermöglichen vorteilhaft, mehrere oder viele vereinzelte Fluorophore auf vergleichsweise einfache Weise gleichzeitig zu lokalisieren. Bei dem ersten Anregen und Detektieren und dem zweiten Anregen und Detektieren wird dann von aus dem Teilbereich der Probe als Folge der Anregung mit Anregungslicht der jeweiligen Wellenlänge von mehreren vereinzelten Molekülen emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und zu mehreren verein- zelten Molekülen wird jeweils ein erstes und ein zweites örtlich aufgelöstes Detektionssignal erhalten. Das erste und das zweite Lokalisieren mehrerer vereinzelter Moleküle, das heißt Fluoro phore, erfolgt dann auf Grundlage der jeweiligen ersten und zweiten örtlich aufgelösten Detekti onssignale, aus denen jeweils die ersten und zweiten Lokalisationen erhalten werden. Wie aus Weitfelddaten eine Lokalisation erfolgt, ist dem Fachmann bekannt. Das Lokalisieren ist bei Weit- feldverfahren letztlich ein Analysieren von Bilddaten, während bei einigen der vorgehend genann ten Kleinfeldverfahren das Lokalisieren ein Prozess ist, der ein Abtasten in einer bestimmten Weise umfasst. Wird ein erfindungsgemäßes Verfahren im Weitfeld durchgeführt, dann erfolgt jeweils zumindest ein Bestimmen eines Unterschieds zwischen der ersten Lokalisation und der zweiten Lokalisation. Auch bei Anwendung von Weitfeldverfahren kann zu den mehreren vereinzelten Molekülen, von denen emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert wurde, jeweils anhand des ersten und/oder des zweiten Detektionssignals bestimmt werden, zu welchem Farbstoff das vereinzelte Molekül gehört. Bei Anwendung von Weitfeldverfahren kann bevorzugt das erste Anregen und Detektie ren und das zweite Anregen und Detektieren gleichzeitig erfolgen. Sinnvoll ist dies, wenn für die Detektion Detektoren zur Verfügung stehen, die in unterschiedlichen spektralen Kanälen detek tieren. Auch bei Weitfeldverfahren kann das erste Anregen und Detektieren nach einer vorbe stimmten Zeitspanne beendet werden. Es kann auch eine weitere Wellenlänge für ein weiteres Anregen und Detektieren ausgewählt werden. Dies erfolgt dann bevorzugt aus einer vorbestimm ten Menge von mindestens zwei Wellenlängen. Dem Auswählen nachfolgend erfolgt dann das weitere Anregen und Detektieren, wobei der Teilbereich der Probe mit Anregungslicht der aus gewählten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem T eilbereich der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ausgewählten Wellenlänge von mehreren vereinzelten Molekülen emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und jeweils ein weiteres Detektionssignal erhal ten wird. Ein weiteres Lokalisieren der mehreren vereinzelten Moleküle erfolgt dann auf Grund lage jeweils des weiteren Detektionssignals, sodass jeweils für mehrere vereinzelte Fluorophore eine weitere Lokalisation erhalten wird. Es ist dabei nicht notwendig, dass tatsächlich für alle vereinzelten Fluorophore, die angeregt wurden, auch eine Lokalisation erhalten wird.
Das Auswählen der Wellenlänge kann bei Anwendung eines Weitfeldverfahrens bevorzugt erfol gen durch ein Auswerten der Menge der ersten und der zweiten Detektionssignale hinsichtlich der Sorte des Farbstoffs, dessen vereinzelte Moleküle das detektierte Fluoreszenzlicht emittiert haben, das den überwiegenden Anteil der Menge der erhaltenen Detektionssignale hervorgeru fen hat. Auch ohne eine Analyse hinsichtlich der Farbstoffsorte kann ein Auswählen erfolgen, beispielsweise indem untersucht wird, zu welcher Anregungswellenlänge mehr Fluoreszenz ver einzelter Fluorophore beobachtet wird. Die ausgewählte Wellenlänge kann auch hier nicht nur die erste oder die zweite Wellenlänge sein, sondern sie kann auch eine weitere Wellenlänge sein, die sich von der ersten und der zweiten Wellenlänge unterscheidet. Dann umfasst das erste erfin dungsgemäße Verfahren ein Bestimmen jeweils eines Unterschieds zwischen der jeweiligen ersten Lokalisation und der jeweiligen weiteren Lokalisation und/oder jeweils zwischen der jeweiligen zweiten Lokalisation und der jeweiligen weiteren Lokalisation.
Weiter wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe gelöst, durch ein zweites lokalisations mikroskopisches Verfahren für eine Untersuchung einer mit mehreren Farbstoffen gefärbten Probe, das im nun Folgenden beschrieben wird.
Das zweite Verfahren umfasst ein testweises Anregen und Detektieren, wobei ein Teilbereich der Probe mit Anregungslicht einer Testwellenlänge beaufschlagt wird und wobei aus dem Teilbe reich der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der Testwellenlänge von einem vereinzelten Fluorophor emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und ein Testdetektionssignal erhalten wird. Auf Basis dieses Testsignals, optional gestützt auf weitere Informationen wie ein zweites Test signal erfolgt in einer Alternative ein Auswählen einer ersten Wellenlänge aus einer vorbestimm ten Menge von mindestens zwei Wellenlängen für ein folgendes Anregen des Teilbereichs der Probe. Mit Licht dieser ausgewählten ersten Wellenlänge erfolgt ein erstes Anregen und Detek- tieren, wobei der T eilbereich der Probe mit Anregungslicht der ersten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei aus dem Teilbereich der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ersten Wellenlänge von dem vereinzelten Molekül emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und ein erstes Detektionssignal erhalten wird. Der vereinzelte anregbare Fluorophor wird auf Grund lage des ersten Detektionssignals lokalisiert, sodass eine erste Lokalisation erhalten wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erste Wellenlänge auf Basis zweier Testdetektionssignale ausgewählt. In dieser Alternative erfolgt vor dem Auswählen und nach dem testweisen Anregen und Detektieren ein zweites testweises Anregen, wobei der Teilbereich der Probe mit Anregungslicht einer zweiten Testwellenlänge beaufschlagt wird und wobei aus dem Teilbereich der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der zweiten Testwellenlänge von einem vereinzelten Molekül emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert und ein zweites Testdetek tionssignal erhalten wird.
In einer anderen Alternative erfolgt auf Basis des Testsignals ein Auswählen eines Kleinfeldbe reichs für ein folgendes Anregen des Teilbereichs, das heißt, eines Kleinfeldbereichs, in dem das folgende Anregen und Detektieren durchgeführt wird. In diesem Fall kann von vornherein festge- legt sein, mit welcher Wellenlänge das folgende Anregen und Detektieren erfolgt. Diese tritt dann an die Stelle der ausgewählten Wellenlänge der ersten Alternative. Die Alternativen schließen sich aber nicht aus. Vielmehr ist es möglich, dass sowohl ein Kleinfeldbereich als auch eine Wellenlänge ausgewählt werden.
Unabhängig davon, ob ein oder zwei Testdetektionssignale bestimmt werden, kann jedes Test- detektionssignal ein Wert, der repräsentativ für die Menge des detektierten Fluoreszenzlichts ist, sein. Das Auswählen der ersten Wellenlänge kann, wenn zwei Testdetektionssignale bestimmt werden, auf Basis des Verhältnisses des ersten Testsignals zu dem zweiten Testsignal erfolgen. Es kann auch auf Basis eines Vergleichs des ersten, des zweiten oder des ersten und zweiten Testdetektionssignals mit einem vorbestimmten Referenzwert oder mit vorbestimmten Re- ferenzwerten erfolgen. Die Testwellenlängen können jeweils Wellenlängen sein, die für ein ver fahrensgemäßes Lokalisieren genutzt werden, das heißt, sowohl die erste Testwellenlänge als auch die zweite Testwellenlänge kann eine Wellenlänge sein, die in der vorbestimmten Menge von Wellenlängen für das Anregen enthalten ist.
Dieses Verfahren ist zunächst nicht durch das Merkmal des Bestimmens eines Unterschieds zwi schen zwei Lokalisationen gekennzeichnet. Ebenso wenig ist es gekennzeichnet durch ein zwei tes Lokalisieren mit einer zweiten Wellenlänge. Auch ohne diese Merkmale wird ein entscheiden der Vorteil erreicht. Wenn beispielsweise eine Bewegung von mit Fluorophoren markierten Struk turen in einer mehrfarbig gefärbten Probe verfolgt werden soll, so ermöglicht das Verfahren, dass eine für das Verfolgen besonders geeignete Wellenlänge ausgewählt wird. Auch bei einem Ver folgen einer Struktur kann jeweils ein Lokalisieren mit der ersten Wellenlänge erfolgen, wobei über die Zeit jeweils neue Lokalisierungen anhand desselben Fluorophors bestimmt werden.
Dem testweisen Anregen und Detektieren nachfolgend, kann aber auch bei diesem zweiten erfin dungsgemäßen Verfahren ein Auswählen einer zweiten Wellenlänge aus einer vorbestimmten Menge von mindestens zwei Wellenlängen für ein folgendes Anregen des Teilbereichs der Probe und ein zweites Anregen und Detektieren erfolgen. Dabei wird der Teilbereich der Probe mit An regungslicht der zweiten Wellenlänge beaufschlagt und aus dem Teilbereich der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der zweiten Wellenlänge von dem vereinzelten Molekül emittiertes Fluoreszenzlicht wird detektiert, sodass ein zweites Detektionssignal erhalten wird. Auf Grundlage dieses Detektionssignals erfolgt ein zweites Lokalisieren des vereinzelten Fluoro phors, sodass eine zweite Lokalisation erhalten wird. Schließlich kann auch bei dem zweiten erfindungsgemäßen Verfahren ein Unterschied zwischen der ersten Lokalisation und der zweiten Lokalisation bestimmt werden. Erfolgt bei dem zweiten erfindungsgemäßen Verfahren ein zweites Anregen und Detektieren mit einer zweiten Wellenlänge, können somit die meisten Vorteile des ersten Verfahren ebenfalls realisiert werden.
Wie das erste Verfahren, kann auch das zweite Verfahren nicht nur als Weitfeldverfahren, sondern auch vollständig als Kleinfeldverfahren ausgeführt werden. Dann ist der Teilbereich der Probe von vornherein ein Kleinfeldbereich, der beispielsweise eine Ausdehnung von 3 pm oder von weniger als 2 pm aufweist. Das zweite Verfahren kann aber bevorzugt auch ausgeführt werden, indem das testweise Anregen und Detektieren, hier jeweils unabhängig voneinander sowohl das erste als auch das optionale zweite, in einem Weitfeldverfahren erfolgt, während das erste oder das zweite oder das erste und zweite Lokalisieren jeweils in einem Kleinfeldverfahren erfolgt. Ist dies der Fall, dann wird nach dem testweisen Detektieren ein Kleinfeldbereich ausgewählt, in dem dann das erste oder das erste und zweite Lokalisieren durchgeführt wird.
Bevorzugt erfolgt sowohl bei dem ersten als auch dem zweiten erfindungsgemäßen Verfahren das erste Lokalisieren nach einem MINFLUX-Verfahren, einem MINSTED-Verfahren oder einem STED-Lokalisationsverfahren. Ein MINSTED-Verfahren ist dabei besonders vorteilhaft anwend bar, wenn das erste Lokalisieren im Rahmen des Verfolgens einer fluoreszenzmarkierten Struktur angewendet wird. Auch das zweite Verfahren kann auch dann, wenn das Lokalisieren jeweils im Kleinfeld erfolgt, im Rahmen des Abbildens von Strukturen in einer Probe angewendet werden. Dann wird auch dieses Verfahren für eine Menge von Teilbereichen der Probe durchgeführt, sodass die schließlich untersuchte Menge von Teilbereichen sowohl Teilbereiche enthält, aus denen von jeweils einem vereinzelten Molekül eines ersten Farbstoffs Fluoreszenzlicht emittiert und detektiert wurde als auch solche, aus denen von jeweils einem vereinzelten Molekül eines anderen Farbstoffs Fluoreszenzlicht emittiert und detektiert wurde.
Wie bei dem ersten Verfahren, kann auch bei dem zweiten Verfahren aus den Lokalisationen und den Unterschieden der Lokalisationen der einzelnen vereinzelten Moleküle, die mit Anregungs licht verschiedener Wellenlängen erhalten wurden, eine Karte mit Korrekturvektoren für die Ko- Registrierung aller Lokalisationen in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem bestimmt werden. Dies gilt auch insofern, dass zu jeder der Lokalisationen Information über die Zeit, zu der das Anregen und Detektieren für das Lokalisieren erfolgte, gespeichert sein kann und dass die Karte mit Korrekturvektoren eine von einer Zeitkoordinate abhängende Karte sein kann. Ebenso kann aus den ersten und den zweiten und optional aus anderen Lokalisationen, die mittels Anregen mit Anregungslicht der ersten Wellenlänge oder der zweiten Wellenlänge erhalten wurden, ein Bild der Probe erzeugt werden.
Schließlich wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe gelöst durch ein erfindungsge- mäßes Mikroskop. Das Mikroskop ist eingerichtet zur Ausführung eines erfindungsgemäßen Ver fahrens, insbesondere zur Ausführung eines Verfahrens, bei dem ein Auswählen einer Wellen länge erfolgt. Das Mikroskop weist eine Lasereinheit für die Anregung von Fluoreszenz auf, die eingerichtet ist, schmalbandiges Licht zweier Wellenlängen abzugeben, oder zwei Lasereinheiten für die Anregung von Fluoreszenz, die zusammen eingerichtet sind, schmalbandiges Licht zweier Wellenlängen abzugeben. Weiter weist es eine Detektionseinheit auf und eine Auswahleinheit, die eingerichtet ist, auf Basis eines Detektionssignals hinsichtlich einer Fluoreszenzemission eines einzelnen Fluorophors eine Wellenlänge für ein Anregen auszuwählen. Zudem weist es eine Berechnungseinheit, die eingerichtet ist, aus zwei Detektionssignalen hinsichtlich einer Fluo reszenzemission eines einzelnen Fluorophors jeweils eine Lokalisation und einen Unterschied der Lokalisationen zu bestimmen, auf. Bevorzugt kann das Mikroskop Anregungslicht zweier Wel- lenlängen bereitstellen, die sich um einen Wert zwischen 200 nm und 50 nm voneinander unter scheiden. Weiter bevorzugt weist das Mikroskop eine Lasereinheit auf, die eingerichtet ist, schmalbandiges Licht einer dritten Wellenlänge abzugeben. Dies schließt nicht aus, dass es eine Lasereinheit aufweist, die eingerichtet ist, Anregungslicht insgesamt der Wellenlängen abzugeben, die die oben genannten Bedingungen zueinander erfüllen. Weiter bevorzug weist das Mikroskop einen oder mehrere STED-Laser auf. Bevorzugt weist es eine Steuereinheit auf, die bevorzugt eingerichtet zur Durchführung eines MINFLUX-Verfahrens, ein STED- Lokalisationsverfahrens oder eines MINSTED-Verfahrens. Weitere vorteilhafte Merkmale des erfindungsgemäßen Mikroskops ergeben sich insbesondere aus den im Zusammenhang mit den Verfahren genannten Angaben. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen und den zugehörigen Erläuterungen zu den Zeichnungen. Einige der Zeichnungen sind Ablaufdiagramme, anhand derer die erfindungsgemäßen Verfahren insgesamt sehr ausführlich erläutert werden.
Die Ansprüche sind nicht dahingehend zu verstehen, dass nur solche Gegenstände, Vorrichtungen oder Verfahren, die jeweils nur alle oder keines der Merkmale eines Unteranspruchs zusätzlich zu den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche 1, 21 und 32 aufweisen, mögliche Weiterbildungen der Erfindung sein können. Vielmehr können sich weitere Weiterbildungen aus in der Beschreibung genannten sowie aus den Zeichnungen und den zugehörigen Erläuterungen entnehmbaren Merkmalen, die einzeln oder kumulativ zur Wirkung kommen können, ergeben. Insbesondere sind viele Merkmale, die in dieser eingereichten Fassung nur im Zusammenhang mit einem der beiden erfindungsgemäßen Verfahren nach Anspruch 1 oder nach Anspruch 21 erläutert werden, auch Merkmale vorteilhafter Weiterbildungen des jeweils anderen erfindungsgemäßen Verfahrens. KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Fig. 1 zeigt Absorptions- und Emissionsspektren zweier Fluoreszenzfarbstoffe, die geeignet sind für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren.
Fig. 2 zeigt ein Ablaufdiagramm des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens. Fig. 3 zeigt ein Ablaufdiagramm einer Durchführung einer ersten Ausführungsform des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem ein Anregen und Detektieren in einem Kleinfeldbereich erfolgt.
Fig. 4 zeigt ein Ablaufdiagramm einer anderen Durchführung der auch in Figur 3 dargestellten Ausführungsform des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens. Fig. 5 zeigt ein Ablaufdiagramm einer weiteren Ausführungsform des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens.
Fig. 6 zeigt ein Ablaufdiagramm zu Schritten, die in mehreren der Ausführungsformen beider erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden können.
Fig. 7 ist eine schematische Darstellung zum Auswählen einer Wellenlänge aus einer Menge von Wellenlängen.
Fig. 8 illustriert, dass jeder Schritt Anregen und Detektieren die zwei Elemente Anregen und Detektieren umfasst.
Fig. 9 zeigt ein Ablaufdiagramm einer weiteren Ausführungsform des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Auswählen einerweiteren Wellenlänge. Fig. 10 zeigt ein Ablaufdiagramm einer ersten Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens.
Fig. 11 zeigt ein Ablaufdiagramm einer zweiten Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Auswählen eines Kleinfeldbereichs. Fig. 12 zeigt einen Teilbereich einer mehrfarbig gefärbten Probe mit einem Kleinfeldbe reich mit einem vereinzelten anregbaren Fluorophor und weiteren anregbaren Fluorophoren.
Fig. 13 zeigt ein Ablaufdiagramm einer Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der ein testweises Anregen und Detektieren mit zwei Testwellenlängen durchgeführt wird.
Fig. 14 zeigt ein Ablaufdiagramm einerweiteren Ausführungsform des zweiten erfindungs gemäßen Verfahrens, bei der ein testweises Anregen und Detektieren mit zwei Testwellenlängen durchgeführt wird mit einem Auswählen eines Kleinfeldbereichs. Fig. 15 zeigt ein Ablaufdiagramm einer Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem Erhalten einer ersten und einer zweiten Lokalisation und dem Erhalten eines Unterschieds der Lokalisationen durch ein Vergleichen.
Fig. 16 zeigt ein Schema zur Illustration, auf welche Weise eine Ko-Lokalisation verschie denartiger Fluorophore in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem ermög licht wird.
Fig. 17 zeigt ein weiteres Schema zur Illustration, auf welche Weise eine Ko-Lokalisation verschiedenartiger Fluorophore in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem ermöglicht wird.
Fig. 18 zeigt ein noch weiteres Schema zur Illustration, auf welche Weise eine Ko- Lokalisation verschiedenartiger Fluorophore in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem ermöglicht wird.
Fig. 19 zeigt ein Schema hinsichtlich der Ko-Lokalisation von mehr als zwei Farbstoffsorten.
Fig. 20 zeigt schematisch ein erfindungsgemäßes Mikroskop. FIGURENBESCHREIBUNG UND ERLÄUTERUNG DER ERFINDUNG ANHAND DER FIGUREN
Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.
In Fig. 1 sind Anregungsspektren 6,7- und Emissionsspektren 8,9 der zwei Fluoreszenzfarbstoffe Alexa Fluor 568 und Alexa Fluor 647 gezeigt. Dieses Paar von Farbstoffen ist für die Durchfüh rung erfindungsgemäßer Verfahren geeignet. Alle Anregungsspektren 6,7 und Emissionsspek tren 8,9 sind auf ihren jeweiligen Maximalwert normiert, die Werte an der Ordinate sind Verhältnis werte in Prozent des zugehörigen Maximalwerts. Die Werte an der Abszisse geben die Wellen länge in der Einheit Nanometer an. Alle folgenden Angaben zu den Anregungsspektren 6,7 und Emissionsspektren 8,9 sind aus der Darstellung abgeleitet, also nicht einer Wertetabelle entnom men. Der Grund hierfür ist, dass es nicht auf die exakten Werte ankommt, sondern nur auf bestimmte Eigenschaften, die anhand der Figur verdeutlicht werden. Das Anregungsspektrum 6 des Fluoreszenzfarbstoffs Alexa Fluor 568 weist demnach bei einer Wellenlänge von 525 nm einen Wert von etwa 30% auf, bei einer Wellenlänge von 568 nm weist es das Maximum auf, bei einer Wellenlänge von 600 nm beträgt der Wert des Anregungsspektrums 6 noch knapp 40%, bei etwa 625 nm noch rund 5% und bei einer Wellenlänge von 647 nm liegt der Wert nahe Null (0). Das Anregungsspektrum 7 von Alexa Fluor 647 weist sein Maximum bei 647 nm auf, bei 625 nm beträgt sein Wert etwa 40%, bei 600 nm etwa 30%, bei einer Wellenlänge von 568 nm beträgt der Wert etwa 10% und bei einer Wellenlänge von 525 nm beträgt der Wert weniger als 5%. Entscheidend für die Anwendbarkeit des Farbstoffpaares ist, dass einerseits die Anregungsspek tren 6,7 einen Überlapp zeigen, das heißt, dass es Wellenlängen gibt, mit deren Licht sowohl der eine als auch der andere Farbstoff angeregt werden können, und dass andererseits Wellenlängen existieren, mit deren Licht nur jeweils einer der beiden Farbstoffe gut angeregt werden kann oder mit deren Licht einer der Farbstoffe wesentlich stärker, beispielsweise zehnmal so stark wie der andere, angeregt werden kann. Für die dargestellte Farbstoffpaarung kann beispielsweise mit einer Wellenlänge von 525 nm der Farbstoff Alexa Fluor 568 gut angeregt werden, konkret mit etwa 30% der maximal für diesen Farbstoff erzielbaren Anregungswahrscheinlichkeit, während der Farbstoff Alexa Fluor 647 nur mit weniger als 5% der maximal erzielbaren Anregungswahr scheinlichkeit angeregt werden kann. Ähnlich günstige Verhältnisse ergeben sich beispielsweise für den gesamten Wellenlängenbereich von 525 nm bis etwa bei 568 nm. Umgekehrt kann mit einer Wellenlänge von 625 nm der Farbstoff Alexa Fluor 647 gut, mit einer relativen Anregungs wahrscheinlichkeit von etwa 40%, angeregt werden und der Farbstoff Alexa Fluor 568 wird bei dieser Wellenlänge kaum, mit einer relativen Anregungswahrscheinlichkeit von etwa 5%, angeregt.
In Fig. 2 ist ein Ablaufdiagramm zu einem ersten erfindungsgemäßen Verfahren dargestellt. Das Verfahren wird ausgeführt an einer mehrfarbig gefärbten Probe mit vereinzelten anregbaren Fluo- rophoren oder genauer an einem Teilbereich 1 einer mehrfarbig gefärbten Probe mit vereinzelten anregbaren Fluorophoren, wobei der Teilbereich 1 der mehrfarbig gefärbten Probe auch die ganze Probe umfassen kann. Ein vereinzelter anregbarer Fluorophor ist dabei ein Fluorophor, welcher lokalisiert werden kann, wobei der aus der Lokalisationsmikroskopie bekannte Begriff des Lokalisierens 11,21,113 den Prozess bezeichnet, durch den eine Lokalisation 12,22,114 eines Fluorophors erhalten wird. Wie in einer Probe dafür Sorge getragen werden kann, dass in der Probe oder in Teilbereichen der Probe vereinzelt anregbare Fluorophore vorliegen, ist dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt. In der linken Spalte sind von oben nach unten folgende Verfahrensschritte beziehungsweise Verfahrenselemente angegeben: erstes Anregen und Detektieren 10, erstes Lokalisieren 11, erste Lokalisation 12. Das erste Anregen und Detek- tieren 10 erfolgt unter Nutzung von Anregungslicht einer ersten Wellenlänge. Entsprechend sind in der rechten Spalte von oben nach unten weitere Verfahrensschritte beziehungsweise Verfah renselemente angegeben: zweites Anregen und Detektieren 20, zweites Lokalisieren 21 und zweite Lokalisation 22. Das zweite Anregen und Detektieren 20 erfolgt unter Nutzung von Anre gungslicht einer zweiten Wellenlänge, die sich von der ersten Wellenlänge unterscheidet. Die Schritte erstes Anregen und Detektieren 10 und erstes Lokalisieren 11 sowie zweites Anregen und Detektieren 20 und zweites Lokalisieren 21 sind jeweils durch eine Linie verbunden; die Schritte erstes Anregen und Detektieren 10 und erstes Lokalisieren 11 stehen nämlich in einem engen Zusammenhang, dessen Art abhängig ist von der konkreten Ausführung beziehungsweise Ausführungsform. In manchen Ausführungsformen erfolgen das erste Anregen und Detektieren 10 und das erste Lokalisieren 11 gleichzeitig, das heißt, während des ersten Anregens und Detek- tierens 10 wird der Prozess des ersten Lokalisierens 11 durchgeführt, oder das Ergebnis des Detektierens 71 aus dem ersten Anregen und Detektieren 10 wird unmittelbar für das Bestimmen der ersten Lokalisation 12 genutzt. In anderen Ausführungsformen wird das Ergebnis des Detek tierens 71 aus dem ersten Anregen und Detektieren 10 nicht unmittelbar für das Bestimmen der ersten Lokalisation 12 genutzt oder das Lokalisieren 11 wird nicht in unmittelbarem Zusammen hang mit dem ersten Anregen und Detektieren 10 durchgeführt, sondern der Schritt des ersten Lokalisierens 11 wird separat in Zusammenhang mit einem weiteren Anregen und Detektieren 15 durchgeführt. Als Ergebnis des ersten Lokalisierens 11 wird schließlich eine erste Lokalisation 12 erhalten. Das Gesagte gilt sinngemäß ebenso für die Schritte beziehungsweise Elemente zweites Anregen und Detektieren 20, zweites Lokalisieren 21 und zweite Lokalisation 22. Im Regelfall wird hier allerdings das zweite Anregen und Detektieren 20 und das zweite Lokalisieren 21 gleich zeitig erfolgen, das heißt, während des zweiten Anregens und Detektierens 20 wird der Prozess des zweiten Lokalisierens 21 durchgeführt, oder das Ergebnis des Detektierens 71 aus dem zweiten Anregen und Detektieren 20 wird unmittelbar für das zweite Lokalisieren 21 genutzt. Die Schritte der linken und der rechten Spalte können gleichzeitig durchgeführt werden. Dann ist es notwendig, dass für das Detektieren 71 mindestens zwei Spektralkanäle genutzt werden, von denen mindestens einer derart eingerichtet ist, dass in ihm Fluoreszenz von zwei der verwende- ten Farbstoffe detektiert werden kann, und zwar derart, dass für die zwei der verwendeten Farb stoffe ein Lokalisieren 11,21,113 erfolgen kann. Sie können zeitlich nacheinander durchgeführt werden, dann reicht für das Detektieren 71 ein einzelner Spektralkanal aus. Das erste Anregen und Detektieren 10 und das zweite Anregen und Detektieren 20 können, wie beispielsweise bei PALM oderSTORM üblich, im Weitfeld erfolgen öderes kann jeweils, wie bei MINFLUX, in einem Kleinfeldbereich erfolgen. Das erste und/oder das zweite Anregen und Detektieren 10,20 kann jeweils auch unter Nutzung einer Verteilung von zusätzlichem Fluoreszenzverhinderungslicht erfolgen, insbesondere auch derart, dass das Lokalisieren mittels eines STED-Lokalisationsver- fahrens oder eines MINSTED-Verfahrens erfolgt.
Es ist zwar aus dem Stand der Technik bekannt, lokalisationsmikroskopische Verfahren im Weit- feld unter Nutzung zweier Anregungswellenlängen und zweier Spektralkanäle durchzuführen. Die
Kombination aus Farbstoffen, Anregungswellenlängen und der für das Detektieren genutzten Spektralkanäle ist dann aber immer gerade so gewählt, dass in jedem einzelnen Detektionskanal, der mit einer Anregungswellenlänge korrespondiert, möglichst ausschließlich Fluoreszenz nur einer einzelnen Farbstoffsorte detektiert wird. Hierdurch soll vermieden werden, dass das Lokali- sieren der Fluorophore einer Farbstoffsorte durch Fluoreszenz einer anderen Farbstoffsorte gestört wird. Damit ist aber im betreffenden Stand der Technik auch ausgeschlossen, dass ein einzelner vereinzelter Fluorophor in einem einzelnen der Spektralkanäle einmal unter Nutzung von Licht der einen Anregungswellenlänge und ein weiteres Mal unter Nutzung von Licht der anderen Anregungswellenlänge lokalisiert wird. Im Unterschied hierzu wird erfindungsgemäß ein einzelner vereinzelter Fluorophor oder eine Menge einzelner vereinzelter Fluorophore einmal unter Nutzung von Licht einer ersten Anregungswellenlänge, Wellenlänge A 111 , und ein weiteres Mal unter Nutzung von Licht einer anderen Anregungswellenlänge, Wellenlänge B 112, lokalisiert. Bei der ersten Lokalisation 12 der linken Spalte handelt es sich also um eine Lokalisation 114 desselben Fluorophors, für den auch die zweite Lokalisation 21 erhalten wird. Erfolgen das erste Anregen und Detektieren 10 und das zweite Anregen und Detektieren 20 im Weitfeld, können jeweils mehrere erste Lokalisationen 12 und mehrere zweite Lokalisationen 22 gleichzeitig erhal ten werden. Nach dem Erhalten der ersten Lokalisation 12 oder der ersten Lokalisationen 12 und dem Erhal ten der zweiten Lokalisation 22 oder der zweiten Lokalisationen 22 erfolgt ein Vergleichen der ersten Lokalisation 12 oder der ersten Lokalisationen 12 mit der zweiten Lokalisation 22 oder den zweiten Lokalisationen 22, sodass, gegebenenfalls jeweils, ein Unterschied 31 der ersten Lokali sation 12 oder der ersten Lokalisationen 12 und der zweiten Lokalisation 22 oder den zweiten Lokalisationen 22 erhalten wird.
In Fig. 3 ist ein Ablaufdiagramm einer Durchführung einer Ausführungsform des ersten erfin dungsgemäßen Verfahrens dargestellt. Bei dieser Ausführungsform erfolgt ein Anregen und Detektieren 10,15,20 in einem Kleinfeldbereich, der der zu untersuchende Teilbereich 1 der mehr farbig gefärbten Probe ist. Das Verfahren beginnt mit dem Auffinden 2 des Kleinfeldbereichs. Dies kann erfolgen, indem die Probe oder ein Bereich der Probe im Weitfeld beleuchtet wird, die Fluo reszenz die Probe oder den Bereich der Probe im Weitfeld abbildend detektiert wird und das Bild ausgewertet wird, um einen Kleinfeldbereich zu identifizieren, in dem Fluoreszenz detektiert wird, die von einem vereinzelten Fluorophor stammt. Dies kann aber auch abtastend erfolgen, indem die Probe oder ein Bereich der Probe mit fokussiertem Anregungslicht 3 abgetastet und das aus der Probe oder dem Bereich der Probe emittierte Fluoreszenzlicht detektiert wird. Ein Klein feldbereich mit einem vereinzelten anregbaren Fluorophor kann dann anhand der zu einem Be leuchtungsort detektierten Menge von Fluoreszenzlicht identifiziert werden, beispielsweise anhand zweier Grenzwerte, wobei die detektierte Menge von Fluoreszenzlicht einen unteren Grenzwert, der abhängig von einem Hintergrundsignal gewählt sein kann, überschreiten muss und einen oberen Grenzwert unterschreiten muss. Nach dem Auffinden 2 eines Kleinfeldbereichs oder zusammen mit dem Auffinden 2 eines Kleinfeldbereichs erfolgt ein erstes Anregen und Detektieren 10, wobei fokussiertes Anregungslicht 3 einer ersten Wellenlänge genutzt wird. In der dargestellten Ausführungsform weist das fokussierte Anregungslicht 3 ein zentrales Intensi tätsmaximum 4 auf. Das Anregen 70 des ersten Anregens und Detektierens 10 erfolgt innerhalb eines Kleinfeldbereichs. Das bedeutet, der Fokuspunkt des Anregungslichts wird während des ersten Anregens und Detektierens 10 entweder gar nicht verschoben oder er wird jeweils nur innerhalb eines höchstens wenige Mikrometer ausgedehnten Bereichs, beispielsweise mit 3 pm Durchmesser oder nur 2 m Durchmesser platziert. Das erste Anregen und Detektieren 10 erfolgt in der dargestellten Ausführungsform während einer Zeitspanne 40, nach der ein Beenden 34 des ersten Anregens und Detektierens erfolgt. Als Ergebnis des ersten Anregens und Detektie- rens 10 wird ein erstes Detektionssignal 51 erhalten, das insbesondere einen Lichtmengenwert 50, der ein Maß für die Menge der während der Zeitspanne 40 detektierten Fluoreszenz ist, umfasst.
Weiter erfolgt ein Auswerten 32 des ersten Detektionssignals 51. Beispielsweise kann dessen Lichtmengenwert 50 ausgewertet werden, indem er mit einem in dieser Figur nicht dargestellten Referenzwert 27 verglichen wird. Wird beispielsweise eine mit Alexa Fluor 568 und Alexa Fluor 647 angefärbte Probe bei einem ersten Anregen und Detektieren 10 mit Licht einer Wellenlänge von 640 nm angeregt, so wird dann ein vergleichsweise großer Lichtmengenwert 50 erhalten, wenn der vereinzelte anregbare Fluorophor ein Fluorophor des Farbstoffs Alexa Fluor 568 ist, während dann, wenn der vereinzelte anregbare Fluorophor ein Fluorophor des Farbstoffs Alexa Fluor 647 ist, ein vergleichsweise niedriger Lichtmengenwert 50 erhalten wird. Zusätzlich zum Lichtmengenwert 50 können auch weitere Eigenschaften des ersten Detektionssignals 51, wenn solche erfasst werden, wie beispielsweise eine Variation der in einzelnen Zeitabschnitten der Zeitspanne 40 erhaltenen Anteile des gesamten Lichtmengenwerts 50 oder Werte von Anteilen des gesamten Lichtmengenwerts 50, die in verschiedenen spektralen Detektionskanälen erfasst wurden, ausgewertet werden. Im dargestellten Beispiel erfolgt anhand des Auswertens 32 ein Auswählen einer Wellenlänge 33 derart, dass anschließend ein weiteres Anregen und Detektieren 15 unter Verwendung der ersten Wellenlänge durchgeführt wird.
Dieses weitere Anregen und Detektieren 15 wird durchgeführt, um eine erste Lokalisation 12 zu erhalten. Dementsprechend erfolgt zusammen mit dem weiteren Anregen und Detektieren 15 ein erstes Lokalisieren 11. Das erste Lokalisieren 11 kann unter Anwendung eines MINFLUX- Verfahrens erfolgen. In diesem Fall erfolgt das weitere Anregen und Detektieren 15 unter Nutzung von fokussiertem Anregungslicht 3, dessen Fokus ein zentrales Intensitätsminimum 5 aufweist. Der Kleinfeldbereich kann, auch bei Anwendung eines MINFLUX-Verfahrens, zusätzlich zu dem fokussierten Anregungslicht 3 der ersten Wellenlänge mit weiterem fokussierten Licht als Fluores zenzverhinderungslicht mit einer Intensitätsverteilung mit einem zentralen Intensitätsminimum beaufschlagt werden, wobei die Fokuspunkte der beiden Lichtverteilungen entweder jeweils zusammenfallen oderwobei das Fluoreszenzverhinderungslicht jedenfalls derart in die Probe ein gestrahlt wird, dass der Fokuspunkt des fokussierten Anregungslichts 3 immer in einem Bereich des Minimums des Fluoreszenzverhinderungslichts platziert ist. Alternativ kann das erste Lokali sieren 11 unter Anwendung eines STED-Lokalisationsverfahrens oder eines MINSTED-Ver- fahrens erfolgen, wobei in beiden Fällen zusätzlich zum Anregungslicht der ersten Wellenlänge fokussiertes Fluoreszenzverhinderungslicht mit einer Intensitätsverteilung mit einem zentralen Intensitätsminimum genutzt wird. Dies ist insbesondere dann günstig, wenn von zwei Farbstoffen der Farbstoff mit der kleineren Wellenlänge des Maximums des Anregungsspektrums einen großen Stokesshift aufweist, sodass beide Farbstoffe im Wesentlichen einzeln angeregt, aber dennoch mit demselben Fluoreszenzverhinderungslicht abgeregt werden können. Im dargestellten Beispiel wird das erste Lokalisieren 11 in Verbindung mit dem weiteren Anregen und Detektieren 15 so lange durchgeführt, bis ein Kriterium 41 erfüllt ist. Im konkret dargestellten Fall ist als Kriterium 41 eine vorbestimmte Genauigkeit der Lokalisation angegeben. Andere mög liche Kriterien 41 sind beispielsweise eine durchgeführte Anzahl von Iterationen von MINFLUX- Iterationen oder bei Anwendung von MINSTED eine erreichte Intensität des Fluoreszenzverhin derungslichts. Weiter ist es jeweils möglich, dass zusätzlich Information aus dem ersten Detek- tionssignal 51 für das Erhalten der ersten Lokalisation 12 genutzt wird.
In Fällen, bei denen der vereinzelte anregbare Fluorophor seine Anregbarkeit verliert, bevor das Kriterium 41 erreicht ist, kann das Verfahren an diesem vereinzelt anregbaren Fluorophor nicht vollständig ausgeführt werden. Dennoch kann aber eine erste Lokalisation 12 erhalten werden, die beispielsweise für eine Bildgewinnung der Probe oder eines Bereichs der Probe genutzt werden kann.
Wenn das Kriterium 41 dagegen erreicht wird, befindet sich der vereinzelte anregbare Fluorophor auch nach Erhalt der ersten Lokalisation 12 in einem anregbaren Zustand. Dies wird nun genutzt, indem ein weiteres Anregen und Detektieren mit einer zweiten Wellenlänge erfolgt, wobei dieses weitere Anregen und Detektieren das zweite Anregen und Detektieren 20 ist, mit dem eine zweite Lokalisation 22 erhalten wird. Für das zweite Anregen und Detektieren 20 mit dem zweiten Lokali sieren 21, aus dem die zweite Lokalisation 22 erhalten wird, gilt hinsichtlich der anwendbaren Verfahren sinngemäß dasselbe wie für das weitere Anregen und Detektieren 15 mit dem ersten Lokalisieren 11, aus dem die erste Lokalisation 12 erhalten wird.
Nach dem Erhalten der ersten Lokalisation 12 und dem Erhalten der zweiten Lokalisation 22 erfolgt ein Vergleichen der ersten Lokalisation 12 mit der zweiten Lokalisation 22, sodass ein Unterschied 31 der ersten Lokalisation 12 und der zweiten Lokalisation 22 erhalten wird. In Fig. 4 ist ein Ablaufdiagramm einer anderen Durchführung derselben Ausführungsform des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens wie in Fig. 3 dargestellt. Der Ablauf unterscheidet sich, da ein Fluorophor einer anderen Farbstoffsorte als im in Fig. 3 dargestellten als vereinzelter anreg barer Fluorophor im betrachteten Kleinfeldbereich vorliegt. Beim Auswählen einer Wellenlänge 33 auf Basis des Auswertens 32 des ersten Detektionssignals 51 wird daher eine zweite Wellen länge ausgewählt. In diesem Falle erfolgt nach dem Auswählen das zweite Anregen und Detek- tieren 20 zusammen mit dem zweiten Lokalisieren 21 , sodass eine zweite Lokalisation 22 erhalten wird. Hier werden diese Schritte durchgeführt, bis ein Kriterium 41 erfüllt ist, beispielsweise bis eine zweite Lokalisation 22 mit einer vorbestimmten Genauigkeit erhalten ist. Im Anschluss daran erfolgt ein weiteres Anregen und Detektieren 15 zusammen mit dem ersten Lokalisieren 11, wodurch eine erste Lokalisation 12 erhalten wird.
Nach dem Erhalten der zweiten Lokalisation 22 und dem Erhalten der ersten Lokalisation 12, das hier erst nach dem Erhalten der zweiten Lokalisation 22 erfolgt, erfolgt ein Vergleichen 30 der ersten Lokalisation 12 mit der zweiten Lokalisation 22, sodass ein Unterschied 31 der ersten Lokalisation 12 und der zweiten Lokalisation 22 erhalten wird.
In Fig. 5 ist ein Ablaufdiagramm einer anderen Ausführungsform des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt. In dieser Ausführungsform sind das Auffinden eines Kleinfeldbereichs 2 und das erste Lokalisieren 11, aus dem eine erste Lokalisation 12 erhalten wird, enger miteinan der verknüpft. Sowohl das Auffinden eines Kleinfeldbereichs 2 als auch das erste Lokalisieren 11 erfolgen mit fokussiertem Anregungslicht 3, im dargestellten Beispiel mit einem zentralen Intensi tätsminimum 5. Möglich ist aber auch, dass sowohl das Auffinden eines Kleinfeldbereichs 2 als auch das erste Lokalisieren 11 mit fokussiertem Anregungslicht 3 mit einem zentralen Intensitäts maximum erfolgt. Vor dem Auffinden 2 eines Kleinfeldbereichs wird ein Teilbereich 1 einer mehr farbig gefärbten Probe mit fokussiertem Anregungslicht 3 abgetastet, bis ein Fluoreszenzsignal erhalten wird, das von einem vereinzelten anregbaren Fluorophor stammt. Die Abtastung kann dabei rasternd erfolgen, sie kann aber auch auf Spiralbahnen oder auf Kreisbahnen, die jeweils bei Vollendung eines Kreises entlang einer Richtung versetzt werden, erfolgen. Ein Bereich mit wenigen Mikrometern Ausdehnung um den Ort, zu dem ein Fluoreszenzsignal erhalten wird, das von einem vereinzelten anregbaren Fluorophor stammt, ist der Kleinfeldbereich, der mit einem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht wird. Hierfür erfolgt mit dem Auffinden des Kleinfeld bereichs 2 ein Übergehen in das erste Anregen und Detektieren 10 mit einem erstes Lokalisieren 11, aus dem eine erste Lokalisation 12 erhalten wird. Zudem wird beim ersten Anregen und Detektieren 10 ein erstes Detektionssignal 51 erhalten, dass einen Lichtmengenwert 50 umfasst. Beispielsweise kann das erste Anregen und Detektieren 10 erfolgen, wenn die Intensitätsvertei lung des fokussierten Anregungslichts 3 eine Donut-Verteilung oder eine Bottle-Beam-Verteilung ist, indem der Fokuspunkt des fokussierten Anregungslichts 3 der ersten Wellenlänge an einem Ort innerhalb des Kleinfeldbereichs, das heißt des Teilbereichs 1 der mehrfarbig gefärbten Probe positioniert wird, wobei das Detektieren 71 das Detektieren des als Folge der Anregung mit dem fokussierten Anregungslicht der ersten Wellenlänge von dem vereinzelten Molekül, das heißt von dem vereinzelten Fluorophor emittierten Fluoreszenzlichts umfasst, wobei das Fluoreszenzlicht in einer Ebene, die konjugiert zu der Ebene ist, in der der Fokuspunkt liegt, mit einem ortsauflösenden Detektor detektiert wird oder wobei eine Detektionsapertur innerhalb einer Ebene, die senkrecht zu einer optischen Achse orientiert ist, an einer Mehrzahl von Positionen um die optische Achse herum positioniert wird. In beiden Fällen erfolgt eine Detektion, die in der Detektionsebene ortsaufgelöst ist. Aus der so erhaltenen örtlichen Verteilung des Fluoreszenzsignals in der Detektionsebene kann eine erste Lokalisation 12 erhalten werden. Anschließend erfolgt ein zweites Anregen und Detektieren 20 innerhalb desselben Teilbereichs 1 der mehrfarbig gefärbten Probe, wobei anhand der ersten Lokalisation 12 ein Kleinfeldbereich 42 gemäß der ersten Lokalisation 12 festgelegt sein kann, der kleiner ist als der Teilbereich 1 der mehrfarbig gefärbten Probe. Zusammen mit dem zweiten Anregen und Detektieren 20 erfolgt ein zweites Lokalisieren 21 , aus dem eine zweite Lokalisation 22 erhalten wird. Dies kann grundsätz- lieh auf die Weisen durchgeführt werden wie im Zusammenhang mit den Figuren 3 und 4 beschrieben.
Nach dem Erhalten der zweiten Lokalisation 22 und dem Erhalten der ersten Lokalisation 12 erfolgt ein Vergleichen der ersten Lokalisation 12 mit der zweiten Lokalisation 22, sodass ein Unterschied 31 der ersten Lokalisation 12 und der zweiten Lokalisation 22 erhalten wird. Außerdem erfolgt ein Auswerten 32 des ersten Detektionssignals 51 und des zweiten Detektionssignals 52, hier konkret der jeweiligen Lichtmengenwerte 50. Aus dem Auswerten 32 wird Information über die Farbstoffsorte 62 erhalten, zu der der vereinzelte anregbare Fluorophor, zu dem eine erste und eine zweite Lokalisation 12,22 erhalten wurden, gehört; in der Regel kann die Farbstoffsorte bestimmt werden, da häufig vorbekannt ist, welche Farbstoffsorten für die Färbung der Probe genutzt wurden. Die aus dem Verfahren erhaltene Gesamtinformation 63 umfasst den Unterschied 61 der ersten Lokalisation 12 und der zweiten Lokalisation 22 sowie die Information über die Farbstoffsorte 62. Anhand von Fig. 6 soll ein wichtiger Aspekt der Erfindung verdeutlicht werden. Sie zeigt ein Ablaufdiagramm zu Schritten, die in mehreren der Ausführungsformen beider erfindungsge mäßen Verfahren durchgeführt werden können. Ein Kernpunkt der Erfindung ist, dass vereinzelte anregbare Fluorophore von zumindest einer Sorte der Fluorophore, mit denen Teilbereiche 1 der mehrfarbig gefärbten Probe gefärbt sind, einmal unter Verwendung von Anregungslicht einer ersten Wellenlänge, in dieser Figur die Wellenlänge A 111, lokalisiert werden und einmal unter Verwendung von Anregungslicht einer zweiten Wellenlänge, in dieser Figur die Wellenlänge B 112, lokalisiert werden, wobei sich die Wellenlänge A von der Wellenlänge B unterscheidet.. Es kann auch für Fluorophore beider oder aller, wenn die Probe mit mehr als zwei Farbstoffsorten gefärbt ist, möglich sein, dass vereinzelte anregbare Fluorophore einmal mit Licht einer Wellen länge A 111 und einmal mit Licht einer Wellenlänge B 112 lokalisiert werden. In der linken Spalte ist schematisch dargestellt, dass mit einer Wellenlänge A 111 ein Anregen und Detektieren 110 und ein Lokalisieren 113 mit dem Erhalten einer Lokalisation 114 erfolgt. Zudem wird ein Detek tionssignal 115 erhalten, das einen Lichtmengenwert 50 umfasst. In der rechten Spalte ist sche- matisch dasselbe für eine Wellenlänge B 112 dargestellt. Die in den beiden Spalten schematisch dargestellten Prozesse können gleichzeitig durchgeführt werden, sofern das Detektieren des Anregens und Detektierens 110 in unterschiedlichen spektralen Detektionskanälen durchgeführt wird. Wenn das Anregen und Detektieren 110 jeweils in einem Kleinfeld erfolgt, kann es vorteilhaft sein, die Schritte der linken Spalte (Wellenlänge A 111) und der rechten Spalte (Wellenlänge B 112) nacheinander durchzuführen. Die Schritte können beispielsweise derart durchgeführt werden, dass das Lokalisieren jeweils nach einem MINFLUX-Verfahren, einem MINSTED-Ver- fahren oder einem STED-Lokalisationsverfahren erfolgt. Die Schritte der rechten und der linken Spalte können auch alternierend durchgeführt werden, bis der vereinzelte anregbare Fluorophor seine Anregbarkeit verloren hat. Auf diese Weise kann aus den jeweils zur Wellenlänge A 111 durchgeführten Schritten entweder eine Lokalisation 114, die aus der Menge einzelner Lokalisa tionen bestimmt ist, oder eine Menge mit mehreren Lokalisationen 114 erhalten werden. Zusätz lich wird entweder ein gesamtes Detektionssignal 115, dass sich aus der Menge der einzelnen Detektionssignale ergibt, oder eine Menge von Detektionssignalen 115 erhalten. Dasselbe gilt für die Wellenlänge B 112. Anschließend erfolgt ein Vergleichen 30 der beiden Lokalisationen 114 zu den Wellenlängen A 111 und B 112 oder der beiden Mengen mit mehreren Lokalisationen 114, sodass ein Unterschied der Lokalisationen zu den beiden Wellenlängen bestimmt wird. Zudem erfolgt ein Auswerten der beiden gesamten Detektionssignale 115 oder der beiden Mengen von Detektionssignalen 115, wobei Information über die Farbstoffsorte 62 des vereinzel ten anregbaren Fluorophors erhalten wird, das mit Licht der beiden Wellenlängen A 111 und B 112 lokalisiert wurde. Die aus dem Verfahren erhaltene Gesamtinformation 63 umfasst die Unterschiede 61 der Lokalisationen 114 sowie jeweils die Information über die Farbstoffsorte 62.
Fig. 7 illustriert das Auswählen einer Wellenlänge aus einer Menge von Wellenlängen. Die Menge 117 umfasst eine Wellenlänge A 111 , eine Wellenlänge B 112 und eine weitere Wellenlänge 116, die sich wechselseitig voneinander unterscheiden. Das Auswählen 33 einer Wellenlänge, hier der Wellenlänge B 112, erfolgt hier auf Basis zweier Detektionssignale 115. Das Auswählen 33 einer Wellenlänge umfasst hier einen in den Figuren 3 und 4 separat dargestellten Schritt des Auswer- tens 32, der sich dort auf das Auswerten eines ersten Detektionssignals 51 richtet. Durch den Pfeil von der Menge 117 zu dem Schritt des Auswählens 33 einer Wellenlänge soll angedeutet werden, dass die Elemente aus der Menge 117 durch das Auswählen 33 der Wellenlänge für die Nutzung bereitgestellt werden können.
Fig. 8 stellt den Sachverhalt dar, dass jeder Schritt des Anregens und Detektierens 110 die beiden Elemente Anregen 70 und Detektieren 71 umfasst. Ein Schritt Anregen und Detektieren 110 tritt in dieser Anmeldung als erstes Anregen und Detektieren 10, zweites Anregen und Detektieren 20, weiteres Anregen und Detektieren 15 sowie allgemein als Anregen und Detektieren 110 auf. In jedem Fall umfasst das Anregen und Detektieren 10,15,20,110 korres pondierende Elemente Anregen 70 und Detektieren.
Anhand von Fig. 9 soll ein wichtiger Aspekt der Erfindung verdeutlicht werden. Sie zeigt ein Ab laufdiagramm zu Schritten, die in mehreren der Ausführungsformen beider erfindungsgemäßer Verfahren durchgeführt werden können. Der obere Teil stellt die schon in Fig. 6 dargestellten Schritte Anregen und Detektieren 110 einmal für eine Wellenlänge A 111 und einmal für eine Wellenlänge B 112 jeweils mit dem zugehörenden Schritt Lokalisieren 113 und den zugehören den Elementen Lokalisation 114 und Detektionssignal 115, welches jeweils einen Lichtmengen wert 50 umfasst, dar. Die weiteren in Fig. 6 dargestellten Schritte Vergleichen 30 und Auswerten 32 sowie die Elemente Unterschied 61 der Lokalisationen und Information über die Farbstoffsorte
62 des vereinzelten anregbaren Fluorophors sind in Fig. 9 ebenfalls enthalten, hier aber zusätz lich verknüpft mit einem Schritt Anregen und Detektieren 110, der mit einerweiteren Wellenlänge 116 durchgeführt wird. Für alle aus Fig. 6 bekannten Schritte gelten im Übrigen die in deren Be schreibung gemachten Ausführungen. Die in dieser Fig. 9 dargestellte weitere Wellenlänge 116 kann identisch sein mit einer der Wellenlängen A 111 und B 112, sie kann sich aber auch von beiden unterscheiden. Die Ergänzung zu den in Fig. 6 dargestellten Abläufen besteht darin, dass zu einem Zeitpunkt, zu dem sowohl zu der Wellenlänge A 111 als auch zu der Wellenlänge B 112 je mindestens eine Lokalisation 114 und je mindestens ein Detektionssignal 115 erhalten worden sind, ein Auswählen 33 einer weiteren Wellenlänge 116 für eine weiteres Anregen und Detektie- ren 110 erfolgt. Das Auswählen 33 umfasst auch hier ein an anderer Stelle separat dargestelltes Auswerten 32. Das Auswählen einer der Wellenlängen A 111 oder B 112 als weitere Wellenlänge 116 kann beispielsweise dann erfolgen, wenn zu einem vereinzelten anregbaren Fluorophor in jedem Falle zu jeder der Wellenlängen A 111 und B 112 mindestens je eine Lokalisation 114 erhalten werden soll und wenn außerdem insgesamt eine möglichst genaue Lokalisation 114, zusätzlich möglicherweise mit dem Ziel, die Probe möglichst wenig zu belasten, erhalten werden soll. Dann erfolgen zunächst eben genau die beiden zugehörigen Lokalisierungen 113, sodass zu jeder der Wellenlängen A 111 und B 112 mindestens je eine Lokalisation 114 erhalten wird.
Bei dem Auswählen 33 kann nun eine weitere Wellenlänge 116 ausgewählt werden, die den ver einzelten anregbaren Fluorophor möglichst effizient anregt. Dadurch kann der vereinzelte anreg bare Fluorophor bei insgesamt möglichst geringer Belastung der Probe gut lokalisiert werden. Stehen nur zwei Wellenlängen für die Auswahl zur Verfügung, kann beispielsweise die Wellenlänge der beiden Wellenlängen A 111 oder B 112 ausgewählt werden, für die bei dem zugehörigen Anregen und Detektieren 115 der größere Lichtmengenwert 50 oder ein größerer, aus dem Lichtmengenwert 50 unter Berücksichtigung der eingestrahlten Lichtmenge, die beispielsweise als Teil des Detektionssignals 115 bekannt ist, abgeleiteter Wert, erhalten wurde.
Eine weitere Möglichkeit, insbesondere wenn eine von den Wellenlängen A 111 und B 112 ver schiedene Wellenlänge zur Verfügung steht, ist, aus einem Verhältnis der Lichtmengenwerte 50 oder entsprechend aus diesem abgeleiteten Werten auf die Sorte des Farbstoffs zu schließen, zu dem der vereinzelte anregbare Fluorophor gehört, und dementsprechend diejenige Wellenlänge aus der Menge 117 der Wellenlängen auszuwählen, mit der die betreffende Farbstoffsorte am besten anregbar ist. Beispielsweise kann ein solcher Vergleich bei Untersuchungen an einer Probe, die zumindest mit den Farbstoffen Alexa Fluor 568 und Alexa Fluor 647 gefärbt ist und die mit einer Wellenlänge A 111 von 525 nm und einer Wellenlänge B von 625 nm untersucht wurde, ergeben, dass der vereinzelte anregbare Fluorophor, der lokalisiert wurde, zu der Farbstoffsorte Alexa Fluor 647 gehört. Dann kann, wenn als weitere Wellenlänge 116 eine Wellenlänge von 647 nm auswählbar ist, diese Wellenlänge, bei der das erste Anregungsspektrum 7, das das Anregungsspektrum der Farbstoffsorte Alexa Fluor 647 ist, für das folgende Anregen und Detektieren 110 ausgewählt werden. Bei dieser Wellenlänge ist nicht nur die Anregbarkeit des Farbstoffs Alexa Fluor 647 maximal, sondern auch die Anregbarkeit des Farbstoffs Alexa Fluor 568 kaum vorhanden, sodass beim Anregen 70 mit der weiteren Wellenlänge 116 von 647 nm kaum Hintergrundfluoreszenz des Farbstoffs Alexa Fluor 568 angeregt wird. Anschließend erfolgt ein Vergleichen 30 der Lokalisationen 114, sodass Unterschiede 61 der Lokalisationen 114 erhalten werden, und ein Auswerten 32 der Detektionssignale 115, in der Figur konkret dargestellt der Lichtmengenwerte 50, um Information über die Farbstoffsorte 62 zu erhalten oder diese abzusichern. Wenn das Auswählen 33 einer weiteren Wellenlänge bereits ein Auswerten 32 hinsichtlich der Farbstoffsorte umfasst hat, dann kann das letzte Auswerten 32 auch unterbleiben, wobei dann die Information über die Farbstoffsorte 62 aus dem nicht darge stellten ersten Auswerten 32 für die Gesamtinformation 63 übernommen werden muss. Die aus dem Verfahren erhaltene Gesamtinformation 63 umfasst dann die Unterschiede 61 der Lokalisa tionen 114 sowie die Information über die Farbstoffsorte 62.
In Fig. 10 ist ein Ablaufdiagramm zu einer ersten Ausführungsform eines zweiten erfindungsge- mäßen Verfahrens dargestellt. Auch dieses Verfahren wird ausgeführt an einer mehrfarbig gefärbten Probe mit vereinzelten anregbaren Fluorophoren oder genauer an einem Teilbereich 1 einer mehrfarbig gefärbten Probe mit vereinzelten anregbaren Fluorophoren, wobei der Teilbe reich 1 der mehrfarbig gefärbten Probe auch die ganze Probe umfassen kann. Bei diesem Ver fahren erfolgt in einem ersten Schritt ein Anregen und Detektieren 110, welches testweise mit einer Testwellenlänge 25 durchgeführt wird. Beim testweisen Anregen und Detektieren 110 wird ein Detektionssignal 115 erhalten, das einen Lichtmengenwert 50 umfasst. Auf Basis des Detek tionssignals 115 erfolgt bei dieser ersten Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Ver fahrens ein Auswählen 33 einer ersten Wellenlänge, die für ein erstes Lokalisieren 11 verwendet wird. Während bei dem ersten Verfahren bei dem ersten durchgeführten Schritt des Anregens und Detektierens 110 zwingend eine Wellenlänge verwendet wird, mit der ein erstes Lokalisieren 11 durchgeführt wird, ist dies hier zwar möglich, aber nicht notwendig. Nach dem Auswählen 33 einer ersten Wellenlänge erfolgt dann ein erstes Anregen und Detektieren 10 mit einem ersten Lokalisieren 11 , woraus eine erste Lokalisation 12 erhalten wird. Für das Auswählen 33 der ersten Wellenlänge stehen mehrere Möglichkeiten zur Verfügung. In der Figur dargestellt ist ein Refe- renzwert 27. Durch die Strichelung des Pfeils zum Schritt des Auswählens 33 der ersten Wellen länge soll angedeutet werden, dass die Verwendung eine Referenzwerts 27 nur eine der Mög- lichkeiten ist. Sie ist insbesondere dann eine gute Möglichkeit, wenn der Teilbereich 1 der mehr farbig gefärbten Probe ein Kleinfeldbereich ist. Wie ein solcher Kleinfeldbereich mit einem verein zelten anregbaren Fluorophor aufgefunden werden kann, ist unter anderem aus dem Stand der Technik bekannt. Ist der Teilbereich 1 der mehrfarbig gefärbten Probe ein Weitfeldbereich und soll dieser mittels im Weitfeld durchgeführter Verfahren weiter untersucht werden, kann Beispiels weise anhand des Detektionssignals 115 festgestellt werden, ob und wie viele vereinzelte anreg bare Fluorophore im Bildfeld sowie gegebenenfalls wie viele schwache und wie viele starke Fluo reszenzemission zeigen. Anhand dieser Analyse kann dann eine Wellenlänge ausgewählt werden, mit der zum betreffenden Aufnahmezeitpunkt eine möglichst große Zahl vereinzelter Fluorophore gleichzeitig lokalisiert werden können.
Anhand von Fig. 11 soll ein Ablauf einer weiteren Ausführungsform des zweiten erfindungsge mäßen Verfahrens erläutert werden. Auch bei dieser Ausführungsform des zweiten erfindungs gemäßen Verfahrens erfolgt in einem ersten Schritt ein Anregen und Detektieren 110, welches testweise mit einer Testwellenlänge 25 durchgeführt wird. Beim testweisen Anregen und Detek- tieren 110 wird ein Detektionssignal 115 erhalten, dass einen Lichtmengenwert 50 umfasst. Grundsätzlich kann das testweise Anregen und Detektieren 11 in einer Menge von Teilbereichen der Probe erfolgen, die Kleinfeldbereiche sind. Bevorzugt erfolgt das testweise Anregen und Detektieren 11 bei dieser Ausführungsform aber im Weitfeld. Auf Basis des Detektionssignals 115 erfolgt bei dieser weiteren Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens ein Auswählen 43 eines Kleinfeldbereichs 42 (in dieser Figur nicht dargestellt), in dem ein erstes Lokalisieren 11 erfolgen soll. Anschließend erfolgt, wie auch in der ersten Ausführungsform die ses Verfahrens, ein erstes Anregen und Detektieren 10 mit einem ersten Lokalisieren 11, als dessen Ergebnis eine erste Lokalisation 12 erhalten wird. Optional erfolgt vor dem ersten Anregen und Detektieren 10 zusätzlich zu dem Auswählen 43 eines Kleinfeldbereichs 42 ein Auswählen 33 einer Wellenlänge. Grundsätzlich kann beides Auswählen 33,43 parallel oder abhängig voneinander erfolgen.
Fig. 12 zeigt einen Teilbereich 1 einer mehrfarbig gefärbten Probe mit einem Kleinfeldbereich 42 mit einem vereinzelten anregbaren Fluorophor 44 und weiteren anregbaren Fluorophoren 44,45.
Eine Möglichkeit des in Fig. 11 dargestellten Auswählens 43 eines Kleinfeldbereichs 44 kann nun anhand der Figuren 11 und 12 erläutert werden. Es wird ein Weitfeldbild eines Teilbereichs 1 einer mehrfarbig gefärbten Probe aufgenommen. In diesem Bild können dann Fluorophore 44,45 aus dem Teilbereich 1 der mehrfarbig gefärbten Probe abgebildet sein. Die Abbildung entspricht bis auf Messunsicherheiten und Abbildungsfehler der Probe. Die Messunsicherheiten können groß sein, weil das testweise Anregen und Detektieren 110 mit der Testwellenlänge 25 nicht dazu dient, eine genaue Lokalisation zu erhalten, sondern hier lediglich zum Auffinden eines Kleinfeld bereichs 42 dient, bei dessen Untersuchung eine genaue Lokalisation erhalten werden soll. Als zu untersuchender Kleinfeldbereich 42 kann anhand der Abbildung nur ein solcher Bereich aus gewählt werden, in dem ein vereinzelter anregbarer Fluorophor 42 vorhanden ist. Im Teilbereich 1 der mehrfarbig gefärbten Probe sind drei vereinzelte anregbare Fluorophore 42 vorhanden, von denen zwei stark emittieren, was durch den größeren Radius angedeutet ist, und einer schwächer emittiert, was durch den geringeren Radius angedeutet ist. Rechts im Teilbereich sind mehrere Fluorophore 45, schwächer emittierende und stärker emittierende, vorhanden, die aber nicht ver einzelt sind. Es kann nun ein Kleinfeldbereich 42 ausgewählt werden, indem die Abbildung des Teilbereichs 1 der mehrfarbig gefärbten Probe untersucht wird. Anhand der nicht dargestellten Abbildung kann nun um den Ort der Abbildung des stark emittierenden Fluorophors 42, welcher den größeren Abstand zu den nicht vereinzelten anregbaren Fluorophoren 45 aufweist, ein Kleinfeldbereich 42 festgelegt werden. Dieser Kleinfeldbereich 42 ist gegenüber dem tatsächli chen Ort des vereinzelten anregbaren Fluorophors 42 wegen der Messunsicherheit leicht ver schoben. Nach dem Auswählen kann die Testwellenlänge als erste Wellenlänge eingesetzt werden. Sofern das Auswählen 43 des Kleinfeldbereichs 42 derart erfolgt, dass die Testwellen länge als erste Wellenlänge genutzt werden kann, so gibt es an dieser Stelle keinen Schritt des Auswählens 33 einer Wellenlänge.
Eine andere Möglichkeit ist, dass als Kleinfeldbereich 42 ein Bereich um den Ort des einzigen vereinzelten anregbaren Fluorophors 44, der schwächere Emission zeigt, ausgewählt würde, weil die Untersuchung des Abbildes darauf hindeutet, dass eine besonders gute Lokalisation dieses Fluorophors mit Verwendung einer anderen Wellenlänge als der Testwellenlänge für das erste Lokalisieren 10 möglich ist. In diesem Fall würde für das folgende erste Anregen und Detektieren 10 also sowohl ein Auswählen 43 eines Kleinfeldbereichs 42 als auch eine Auswählen 33 einer Wellenlänge für das erste Anregen und Detektieren 10 erfolgen.
In Fig. 13 ist ein Ablaufdiagramm zu einer weiteren Ausführungsform des zweiten erfindungsge mäßen Verfahrens dargestellt. Das Diagramm enthält sämtliche in Figur 10 dargestellten Ele mente. Für die Beschreibung der mit diesen Elementen verbundenen Zusammenhänge wird auf die Angaben zur Fig. 10 verwiesen. Zusätzlich ist in der Fig. 13 ein weiteres testweises Anregen und Detektieren 110, welches mit einer zweiten Testwellenlänge 26, die sich von der ersten Test wellenlänge 25 unterscheidet, durchgeführt wird, dargestellt. Dieses weitere testweise Anregen und Detektieren 110 kann, wenn das Detektieren 71 in mehreren unterschiedlichen spektralen Detektionskanälen erfolgt, gleichzeitig erfolgen und kann im Allgemeinen nach dem testweisen Anregen und Detektieren 110 mit der ersten Testwellenlänge 25 erfolgen. Auch zu dem weiteren testweisen Anregen und Detektieren 110 mit der zweiten Testwellenlänge 26 wird ein Detektions signal 115 erhalten, welches einen Lichtmengenwert 50 umfasst. Das Auswählen 33 einer ersten Wellenlänge, die für ein erstes Lokalisieren 11 verwendet wird, erfolgt bei der in dieser Figur dargestellten Ausführungsform auf Basis der beiden Detektionssignale 115, die zu der ersten Testwellenlänge 25 beziehungsweise der zweiten Testwellenlänge 26 erhalten wurden. Bei spielsweise kann ein Verhältnis der beiden Lichtmengenwerte charakteristisch für eine Farbstoff sorte eines vereinzelten anregbaren Fluorophors sein, für dessen erstes Anregen und Detektie ren 10 mit dem zugehörigen ersten Lokalisieren 11 dann die am besten geeignete Wellenlänge ausgewählt wird. Wenn das testweise Anregen und Detektieren 110 im Weitfeld durchgeführt wird, können beispielsweise die Abbilder des Teilbereichs 1 der mehrfarbig gefärbten Probe darauf untersucht werden, bei Verwendung welcher der T estwellenlängen 25,26 mehr vereinzelte anregbare Fluorophore, die stark emittieren, enthalten sind. Diese Testwellenlänge 25,26 kann dann als Wellenlänge für das erste Anregen und Detektieren 10 ausgewählt werden. Zusätzlich zu den beiden Detektionssignalen 115 kann für das Auswählen 33 einer Wellenlänge auch auf einen Referenzwert 27 zurückgegriffen werden. Der Referenzwert 27, der kein skalarer Wert sein muss, kann beispielsweise Einträge für Vergleichslichtmengenwerte enthalten oder Einträge für Vergleichsverhältnisse von Lichtmengenwerten, mit denen die beiden Lichtmengenwerte 50 oder deren Verhältnis verglichen wird, um eine Wellenlänge für das erste Anregen und Detektieren 10 auszuwählen.
In Fig. 14 ist eine Ausführungsform dargestellt, in der sowohl der Schritt eines weiteren testwei sen Anregens und Detektierens 110 mit einer zweiten Testwellenlänge 26 und der des Aus- wählens 43 eines Kleinfeldbereichs 42 enthalten sind. In dieser Ausführungsform kann das Aus wählen 43 eines Kleinfeldbereichs 42 (in dieser Figur nicht dargestellt), in dem ein erstes Lokali sieren 11 erfolgen soll, auf Basis der beiden Detektionssignale 115, die einmal unter Nutzung der ersten Testwellenlänge 25 und einmal unter Nutzung der zweiten Testwellenlänge 26 gewonnen wurden, erfolgen. Anschließend erfolgt ein erstes Anregen und Detektieren 10 mit einem ersten Lokalisieren 11 , als dessen Ergebnis eine erste Lokalisation 12 erhalten wird. Optional erfolgt vor dem ersten Anregen und Detektieren 10 zusätzlich zu dem Auswählen 43 eines Kleinfeldbereichs 42 ein Auswählen 33 einer Wellenlänge. Grundsätzlich kann beides Auswählen 33,43 parallel oder abhängig voneinander erfolgen, im Wesentlichen entsprechend den Angaben, die im Zusammenhang mit Figur 11 sowie im Zusammenhang mit den Figuren 11 und 12 gemacht wurden. In Fig. 15 ist eine Ausführungsform dargestellt, bei der schließlich durch ein Vergleichen 30 einer ersten Lokalisation 12 und einer zweiten Lokalisation 22 eines vereinzelten anregbaren Fluoro phors ein Unterschied zwischen der ersten Lokalisation 12 und der zweiten Lokalisation 22 er halten wird. Im oberen Teil der Figur finden sich Elemente, die aus Figur 14 bekannt sind. Die Gruppe der Figur 14 mit den Elementen erstes Anregen und Detektieren 10, erstes Lokalisieren 11 und erste Lokalisation 12 findet sich in der Figur 15 ergänzt um das Element Detektionssignal
115, welches ein Element Lichtmengenwert 50 umfasst, nach unten versetzt im linken Teil der Figur, ist aber im Übrigen im Wesentlichen genauso mit der Gruppe der Elemente Auswählen eines Kleinfeldbereichs 43 und Auswählen einer Wellenlänge 33 verknüpft wie in Figur 14. In der Figur 15 sind solche Verknüpfungen gestrichelt dargestellt, die beim Ablauf des Verfahrens opti- onalen Schritten beziehungsweise Verknüpfungen entsprechen. Gegenüber der Figur 14 ist im oberen Teil ein Schritt des Auswählens einer zweiten Wellenlänge 33‘ ergänzt.
Für die Beschreibung der auch Figur 14 enthaltenen Elemente beziehungsweise der darin dar gestellten Verfahrensschritte, Verknüpfungen und Elemente wird zunächst auf die Beschreibung der Figur 14 verwiesen. In den in Figur 15 illustrierten Ausführungsformen tritt nun neu hinzu das Auswählen einer zweiten Wellenlänge 33‘ und ein zweites Anregen und Detektieren 20 mit einem zweiten Lokalisieren 21, aus dem eine zweite Lokalisation 22 erhalten wird. Zusätzlich wird so wohl neben der ersten Lokalisation 12 als auch neben der zweiten Lokalisation 22 je ein Detekti onssignal 115, welches jeweils einen Lichtmengenwert 50 umfasst, erhalten. Wird nun der untere Teil mit den Elementen erstes Anregen und Detektieren 10 und zweites Anregen und Detektieren 20 sowie aller unterhalb eingetragenen Element verglichen, so ist zu sehen, dass dieser Teil der
Figur 6 entspricht mit dem Unterschied, dass in Figur 6 allgemein auf bestimmte Elemente wie Wellenlängen A 111 und B 112, ein Lokalisieren 113 und so weiter Bezug genommen wird, während in Figur 15 auf konkrete Elemente wie beispielsweise das erste Lokalisieren 11 und das zweite Lokalisieren 22 und so weiter Bezug genommen wird. Für die Verknüpfung der Elemente und die jeweiligen Verfahrensabläufe wird daher hier zunächst auf die Beschreibung der Figur 6 verwiesen. In Figur 15 ist eine als optional gekennzeichnete Verknüpfung zwischen dem linken Elementeblock mit dem ersten Anregen und Detektieren 10 und dem korrespondierenden rechten Block eingetragen. Diese ist zwar in Figur 6 nicht eingetragen, in der Beschreibung wird aber angegeben, dass der rechte Block unter bestimmten Bedingungen nach dem linken Block ausgeführt werden soll.
Die Schritte nach dem Auswählen 33 der Wellenlänge für das erste Detektieren 10 oder dem Auswählen 43 eines Kleinfeldbereichs 42 entsprechen somit Schritten, die auch aus dem ersten Verfahren bekannt sind. Bei dem Auswählen 33‘ einer zweiten Wellenlänge für das zweite Anre gen und Detektieren 20 wird eine Wellenlänge ausgewählt, die sich von der Wellenlänge für das erste Anregen und Detektieren 20 unterscheidet. Diese Wellenlänge kann dabei so gewählt werden, dass sie für das Lokalisieren einer anderen Sorte der Fluorophore als derjenigen, zu der der in diesem Schritt zu lokalisierende Fluorophor gehört, besonders geeignet ist. Gleichzeitig muss sie so gewählt werden, dass ein Lokalisieren des in diesem Schritt zu lokalisierenden Fluorophors möglich ist. Wie dies zu verstehen ist, wird aus Figur 1 mit der zugehörigen Beschrei bung deutlich. Insgesamt wird dadurch erreicht, dass zu dem vereinzelten anregbaren Fluorophor zwei Lokalisationen 114 erhalten werden, von denen eine hochgenau sein kann und eine andere eine geringere Genauigkeit, oder höhere Unsicherheit, aufweisen kann.
Anhand von Fig. 16 wird eine Möglichkeit zur Ko-Lokalisation von Fluorophoren mehrerer, kon kret zweier, Fluoreszenzfarbstoffe in einem gemeinsamen Bezugssystem gezeigt. Eine Mehrzahl 62 von Fluorophoren eines ersten Farbstoffs 54 wird mittels irgendeines der erfindungsgemäßen Verfahren lokalisiert, wobei bei je einzelnem Fluorophor zu einer Wellenlänge A 111 eine oder mehrere Lokalisationen L 56 und zu einer Wellenlänge B 112 eine oder mehrere Lokalisationen U 57 erhalten werden. Die Wellenlänge A 111 ist dabei eine Wellenlänge, die für das Lokalisieren 113 vereinzelter anregbarer Fluorophore des ersten Farbstoffs 54 gut geeignet ist. Sie, die Wel lenlänge A 111 , kann dabei je nach Verfahren und nach konkretem Verfahrensablauf die erste Wellenlänge sein, das heißt, jede einzelne Lokalisation L 56 kann eine erste Lokalisation 12, oder sie kann die zweite Wellenlänge, das heißt, jede einzelne Lokalisation L 56 kann eine zweite Lokalisation 22 sein. Die Wellenlänge B 111 kann dabei eine Wellenlänge sein, die für das Loka lisieren 113 vereinzelter anregbarer Fluorophore des ersten Farbstoffs 54 weniger gut geeignet ist, gleichzeitig aber für das Lokalisieren 113 vereinzelter anregbarer Fluorophore des zweiten Farbstoffs 55 gut geeignet ist. Auch diese, die Wellenlänge B 112, kann dabei je nach Verfahren und nach konkretem Verfahrensablauf die erste Wellenlänge oder die zweite Wellenlänge sein, das heißt, jede einzelne Lokalisation U 57 kann eine erste Lokalisation 12 oder eine zweite Lo- kalisation 22 sein. Insgesamt wird eine Mehrzahl von Lokalisationen 58 erhalten. Bei dieser Mehr zahl kann es sich um die Menge der Lokalisationen L 56 handeln oder um eine Untermenge oder eine aus der Menge der Lokalisationen L 56 abgeleitete Menge. Beispielsweise ist es möglich, dass mehrere Lokalisationen L 56 als Lokalisationen ein und desselben vereinzelten Fluorophors zu verschiedenen Zeitpunkten identifiziert werden und zu einer einzelnen Lokalisation dieses Fluorophors zusammengefasst in der Mehrzahl von Lokalisationen 58 enthalten sind. Zu den Lokalisationen L 56 und U 57 wird jeweils ein Unterschied 61 bestimmt. Aus der Menge von Unterschieden 61 wird ein mittlerer Unterschied 59 zwischen den Lokalisationen bestimmt. Dieser mittlere Unterschied 59 kann abhängig von der Anzahl der einzelnen Unterschiede 61 mit höherer Genauigkeit, das heißt geringerer Unsicherheit als ein einzelner Unterschied 61 bestimmt werden. Deswegen kann hingenommen werden, dass die einzelnen Unsicherheiten der Lokalisationen U 57, die bestimmend in die Unsicherheiten der Unterschiede 61 eingehen, größer sind als die der Lokalisationen L 57, wie sich in der Regel aus den unterschiedlichen Eignungen der Wellenlängen A 111 und B112 für das Lokalisieren des ersten Farbstoffs 54 ergibt. Bei der Mehrzahl der Lokalisationen L 56 und U 57 kann es sich dabei um Ergebnisse des Lokalisierens 113 innerhalb eines räumlich eingeschränkten Gebiets einer Probe oder Ergebnisse des Lokalisierens 113 innerhalb eines beschränkten Zeitraums handeln. Letzteres ist vorteilhaft, wenn die Probe oder die Eigenschaften des Mikroskops, mit dem die Probe untersucht wird, zeitlichen Schwankungen unterliegen. Ein vereinzelter anregbarer Fluorophor eines zweiten Farbstoffs 55 wird mit einer Wellenlänge B 112 lokalisiert, die hierfür gut geeignet ist. Es wird eine Lokalisation L 56 erhalten. Der mittlere Unterschied 59, der sich aus den unterschiedlichen Wellenlängen A 111 und B 112 beim Lokali sieren ergibt, ist aus den Lokalisationen des ersten Farbstoffs 54 bekannt. Die Lokalisation L 56 dieses vereinzelten Fluorophors des zweiten Farbstoffs 55 wird nun um diesen mittleren Unter- schied 59 zusammen mit der Mehrzahl der Lokalisationen 58 in eine Gesamtmenge von Lokali sationen 60 eingeordnet, womit eine Ko-Lokalisation von Fluorophoren verschiedener Farbstoffe erreicht ist. Bevorzugt sind dabei die Lokalisation L 56 des Fluorophors des zweiten Farbstoffs 55 und der mittlere Unterschied 59 aus Daten bestimmt, die innerhalb einer räumlichen oder zeit lichen Nachbarschaft, bevorzugt innerhalb einer räumlichen und zeitlichen Nachbarschaft erho- ben wurden.
Es ist unmittelbar klar, dass auf dieselbe Weise Lokalisationen L 56 zu mehreren oder vielen Fluorophoren des zweiten Farbstoffs 55 mit Fluorophoren des ersten Farbstoffs 54 ko-lokalisiert werden können. Ebenso ist unmittelbar klar, dass auch Fluorophore des ersten Farbstoffs 54, zu der nur Lokalisationen L 56 unter Verwendung der Wellenlänge 111 , aber keine Lokalisationen U 57 unter Verwendung der Wellenlänge B 112 erhalten wurden, ebenso ko-lokalisiert werden kön nen. Um also eine Bild einer mehrfarbig gefärbten Probe oder eines Teilbereichs 1 einer mehr farbig gefärbten Probe, in dem Fluorophore mehrerer, beispielsweise zweier Farbstoffe ko-loka- lisiert, insbesondere mit hoher Genauigkeit ko-lokalisiert sind, zu erhalten, reicht es aus, nur eine Teilmenge der Fluorophore, die zur Bildgewinnung genutzt werden, mit zwei Wellenlängen zu lokalisieren.
Anhand von Fig. 17 wird eine weitere Möglichkeit zur Ko-Lokalisation von Fluorophoren mehre rer, konkret zweier, Fluoreszenzfarbstoffe in einem gemeinsamen Bezugssystem illustriert. Bei dieser Ausführungsform ist es nicht nötig, dass für Fluorophore eines der Farbstoffe mit einer Wellenlänge, die für das Lokalisieren von Fluorophoren des anderen Farbstoffs eine besonders geeignete Wellenlänge ist, Lokalisationen U 57 zur Bestimmung eines Unterschieds 61 von Lo kalisationen verschiedener Wellenlängen erhalten werden. Vielmehr wird für Fluorophore beider Farbstoffe 54,55 eine gemeinsame weitere Wellenlänge 116 verwendet, um jeweils zugehörige Lokalisationen U 57 zu erhalten. Lokalisationen L 56 werden hier für eine Mehrzahl 62 von Fluoro phoren des ersten Farbstoffs 54 mit einer Wellenlänge A 111 erhalten und für eine Mehrzahl 62 von Fluorophoren des zweiten Farbstoffs 55 mit einer Wellenlänge B 112. Auf diese Weise werden für beide Farbstoffsorten Mehrzahlen 58 von Lokalisationen 59 und ein mittlerer Unter schied 59 erhalten. Dieser mittlere Unterschied 59 bezieht sich jeweils auf eine für beide Farb stoffsorten gemeinsame weitere Wellenlänge 116. Dementsprechend wird die Mehrzahl 58 der Lokalisationen L 56 der vereinzelten Fluorophore des zweiten Farbstoffs 55 unter Berücksichti gung beider mittlerer Unterschiede 59 zusammen mit der Mehrzahl 58 der Lokalisationen L 56 der vereinzelten Fluorophore des ersten Farbstoffs 54 in eine Gesamtmenge von Lokalisationen 60 eingeordnet, womit eine Ko-Lokalisation von Fluorophoren verschiedener Farbstoffe erreicht ist. Entsprechend den Erläuterungen zu Fig. 16 gilt auch hier, und zwar für jeden der beiden Farbstoffe, dass nicht für alle vereinzelten Fluorophore, die für eine Bildgebung an einer mehr farbig gefärbten Probe genutzt werden, Lokalisationen U 57 erhalten werden müssen. Vielmehr reicht es beispielsweise aus, diese für eine solche Menge vereinzelter Fluorophore zu gewinnen, dass der mittlere Unterschied 59 jeweils mit einer angestrebten Genauigkeit erhalten wird.
Anhand von Fig. 18 wird eine weitere Möglichkeit zur Ko-Lokalisation von Fluorophoren mehre rer, konkret zweier, Fluoreszenzfarbstoffe in einem gemeinsamen Bezugssystem illustriert. Bei dieser Ausführungsform werden sowohl Fluorophore eines ersten Farbstoffs 54 als auch Fluoro phore eines zweiten Farbstoffs 55 jeweils mit Licht einer Wellenlänge A 111 als auch mit Licht einer Wellenlänge B 112 lokalisiert, wobei für Fluorophore des ersten Farbstoffs 54 mit der Wel lenlänge A 111 Lokalisationen L 56 und mit der Wellenlänge B 112 Lokalisationen U 57 erhalten werden. Umgekehrt werden für Fluorophore des zweiten Farbstoffs 55 mit der Wellenlänge B 112 Lokalisationen L 56 und mit der Wellenlänge A 112 Lokalisationen U 57 erhalten. Dies bedeutet, die Wellenlängen A 111 und B 112 sind so ausgewählt, dass sie jeweils einen der Farbstoffe gut und den anderen hinreichend anregen, wobei die Rollen der Wellenlängen vom jeweils betrach teten Farbstoff abhängen. Die jeweiligen Mehrzahlen 58 der Lokalisationen L zu beiden Farbstoff sorten werden nun unter Berücksichtigung der beiden mittleren Unterschiede 59, aus denen bei spielsweise ein vorzeichenkorrekter Mittelwert gebildet werden kann, zu einer Gesamtmenge von Lokalisationen 60, in der vereinzelte Fluorophore beider Farbstoffe ko-lokalisiert sind, zusam mengefasst. Auch hier gilt wieder, entsprechend dem zu den vorigen Figuren erläuterten, dass nicht für alle vereinzelten Fluorophore, die für eine Bildgebung an einer mehrfarbig gefärbten Probe genutzt werden, Lokalisationen U 57 erhalten werden müssen.
Fluorophore von mehr als zwei Farbstoffsorten können ebenfalls ko-lokalisiert werden. Dies kann beispielsweise entsprechend einem in Fig. 18 dargestellten Verlauf geschehen. Wie beispiels weise in Fig. 9 dargestellt, können zu den jeweiligen Lokalisationen 114 Detektionssignale 115, die jeweils einen Lichtmengenwert 50 umfassen, vorliegen. Es ist daher möglich, dass beispiels weise Farbstoffmoleküle zweier Farbstoffsorten mit einer gemeinsamen Wellenlänge gut lokali siert werden können und anhand der Lichtmengenwerte 50 unterschieden werden können. Dafür ist es vorteilhaft, für die beiden Farbstoffsorten jeweils für alle vereinzelten anregbaren Fluoro phore auch mit einer zweiten Wellenlänge von Anregungslicht Lichtmengenwerte 50 aufzuneh men, beispielsweise indem jeweils für alle vereinzelten anregbaren Fluorophore auch Lokalisati onen U 57 erhalten werden. Eine weitere Möglichkeit ergibt sich aus der Zusammenschau bei spielsweise der Figuren 16 und 17.
Eine weitere Möglichkeit, für Fluorophore von mehr als zwei Farbstoffsorten unter Nutzung eines erfindungsgemäßen Verfahrens Ko-Lokalisationen zu erhalten, wird hier anhand von Fig. 19 er läutert. Wie oben ausgeführt, reicht es für das Ko-Lokalisieren aus, dass für eine von zwei Farb stoffsorten Lokalisationen unter Nutzung zweier Wellenlängen für das Anregungslicht durchge führt werden, wenn Fluorophore des zweiten Farbstoffs mit Anregungslicht einer der beiden Wel lenlängen lokalisiert werden. In der Fig. 19 sind nun die Beziehungen von Fluorophoren eines ersten Farbstoffs 54, von Fluorophoren eines zweiten Farbstoffs 55 und von Fluorophoren eines weiteren Farbstoffs 155 zu einer Wellenlänge A 111, einer Wellenlänge B 112 und einerweiteren Wellenlänge 116 dargestellt. Durch die durchgezogenen Verbindungen wird ausgedrückt, dass die Wellenlänge A 111 zum Lokalisieren von Fluorophoren eines ersten Farbstoffs 54, die Wel- lenlänge B 112 zum Lokalisieren von Fluorophoren eines zweiten Farbstoffs 55 und die weitere Wellenlänge 116 zum Lokalisieren von Fluorophoren eines weiteren Farbstoffs 155 gut geeignet sind. Zudem ist die Wellenlänge A 111 hinreichend zum Lokalisieren von Fluorophoren des zwei ten Farbstoffs 55 und die Wellenlänge B 112 hinreichend zum Lokalisieren von Fluorophoren des ersten Farbstoffs 54 geeignet, um Unterschiede 61 der Lokalisationen mit den verschiedenen Wellenlängen zu erfassen; dies wird durch die gestrichelte Verbindung zum Ausdruck gebracht. Die Wellenlänge B 112 ist hinreichend zum Lokalisieren von Fluorophoren des weiteren Farb stoffs 155 geeignet, um Unterschiede 61 der Lokalisationen mit den verschiedenen Wellenläng en, hier also der Wellenlänge B 112 und der weiteren Wellenlänge 116, zu erfassen. Die jeweilige Bestimmung der Unterschiede 61 der Lokalisationen ermöglicht, alle Lokalisationen in einer Gesamtmenge von Lokalisationen 60 zusammenzufassen. Auch hierbei kann zu jeder Lokalisa tion der Gesamtmenge von Lokalisationen 60 Information über die Farbstoffsorte vorliegen, die jeweils, wie im entsprechenden Zusammenhang dargelegt, aus den Detektionssignalen 115 mit den Lichtmengenwerten 50 erhalten werden kann.
Fig. 20 zeigt schematisch ein erfindungsgemäßes Mikroskop 80. In der dargestellten Ausführ- ungsform weist es eine Steuereinheit 89 auf, in die eine Auswahleinheit 87, die eingerichtet ist, auf Basis eines Detektionssignals 51,52,115 hinsichtlich einer Fluoreszenzemission eines einzelnen Fluorophors eine Wellenlänge für ein Anregen auszuwählen, und eine Berechnungseinheit 89, die eingerichtet ist, aus zwei Detektionssignalen 51,52,115 hinsichtlich einer Fluoreszenzemission eines einzelnen Fluorophors jeweils eine Lokalisation und einen Unterschied der Lokalisationen zu bestimmen, integriert ist. Dass auf Basis eines Detektionssignals 51,52,115 eine Wellenlänge ausgewählt wird, umfasst, dass bei dem Auswählen 33 auch weitere Informationen wie beispielsweise ein Referenzwert 27 oder ein weiteres Detektionssignal 115 ausgewertet werden. Die Auswahleinheit 87 ist über Steuerleitungen verknüpft mit einer Lasereinheit 81, die eingerichtet ist, schmalbandiges Licht zweier Wellenlängen abzugeben, und einer Lasereinheit 82, die eingerichtet ist, schmalbandiges Licht einer dritten Wellenlänge abzugeben, die sich von den zwei Wellenlängen der ersten Lasereinheit 81 unterscheidet. Weiter weist das Mikroskop 80 eine Detektionseinheit 86 auf, mit der aus einer Probe emittiertes Fluoreszenzlicht erfasst werden kann. Die Detektionseinheit 86 ist mittels der Steuereinheit 89 mit der Auswahleinheit 87 verbunden. Das schmalbandige Licht 83,84,85 wird über Strahlkoppler 90,90' in einen Strahlengang 93 eingekoppelt, durch den das Licht auf eine oder in eine Probe geleitet werden kann. Der grundsätzliche Aufbau verschiedener Mikroskope ist dem Fachmann bekannt. Auf die Darstellung weiterer Komponenten zum Beispiel des Strahlengangs 93 wird daher hier verzichtet. Über den Strahlengang 93 kann aus einer Probe emittiertes Fluoreszenzlicht 92 auf die Detektionseinheit 86 geleitet werden. Weiter verfügt das Mikroskop 1 über ein Berechnungseinheit 88, die eingerichtet ist, aus zwei Detektionssignalen 51,52,115 hinsichtlich einer Fluoreszenzemission eines einzelnen Fluorophors jeweils eine Lokalisation 12,22 und einen Unterschied 61 der Lokalisationen zu bestimmen. Die Wellenlängen der schmalbandigen Lichte 83,84,85 umfassen dabei zwei Wellenlängen, die sich um einen Wert zwischen 200 nm und 50 nm voneinander unterscheiden, beispielsweise kann es sich bei dem schmalbandigen Licht 85 um Licht einer Wellenlänge von 488 nm oder 525 nm und bei dem schmalbandigen Licht 83 kann es sich um Licht einer Wellenlänge von etwa 525 nm handeln und das schmalbandige Licht 84 kann beispielsweise Licht einer Wellenlänge von etwa 650 nm sein. Unter schmalbandigem Licht ist hier Licht mit spektralen Breiten im Bereich bis zu einigen Nanometern zu verstehen. Ist das schmalbandige Licht 83,84,85 vorgesehen, Fluorophore durch Zweiphotonen-Absorption oder allgemeiner Mehrphotonen-Absorption anzuregen, so kann die Bandbreite des schmalbandigen Lichts 83,84,85 bis zu 50 nm betragen. Ist das schmalbandige Licht 83,84,85 vorgesehen, Fluorophore durch Einphotonen-Absorption anzuregen, weist es typischerweise Bandbreiten im Bereich unterhalb von 20 nm, bervorzugt unterhalb von 15 nm oder unterhalb von 10 nm auf.
BEZUGSZEICHENLISTE
Teilbereich
Auffinden eines Kleinfeldbereichs fokussiertes Anregungslicht zentrales Intensitätsmaximum zentrales Intensitätsminimum erstes Anregungsspektrum zweites Anregungsspektrum erstes Emissionsspektrum zweites Emissionsspektrum erstes Anregen und Detektieren erstes Lokalisieren erste Lokalisation erste Wellenlänge
Weiteres Anregen und Detektieren zweites Anregen und Detektieren zweites Lokalisieren zweite Lokalisation zweite Wellenlänge
Testwellenlänge zweite Testwellenlänge
Referenzwert
Vergleichen
Auswerten
Auswählen einer Wellenlänge
Auswählen einer zweiten Wellenlänge
Beenden Anregen und Detektieren
Zeitspanne
Kriterium
Kleinfeldbereich
Auswählen eines Kleinfeldbereichs vereinzelter anregbarer Fluorophor anregbare Fluorophore Lichtmengenwert erstes Detektionssignal zweites Detektionssignal Mehrzahl Fluorophor eines ersten Farbstoffs Fluorophor eines zweiten Farbstoffs Lokalisation L Lokalisation U Mehrzahl Lokalisationen Mittlerer Unterschied Gesamtmenge von Lokalisationen Unterschied Information über Farbstoffsorte Gesamtinformation Anregen Detektieren Mikroskop Lasereinheit Lasereinheit schmalbandiges Licht schmalbandiges Licht schmalbandiges Licht Detektionseinheit Auswahleinheit Berechnungseinheit Steuereinheit ,90' Strahlkoppler Fluoreszenzlicht Strahlengang 0 Anregen und Detektieren 1 Wellenlänge A 2 Wellenlänge B Lokalisieren Lokalisation Detektionssignal weitere Wellenlänge Menge Fluorophor eines weiteren Farbstoffs

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Lokalisationsmikroskopisches Verfahren für eine Untersuchung einer mit mehreren Farbstoffen gefärbten Probe umfassend: ein erstes Anregen und Detektieren (10), wobei ein Teilbereich (1) der Probe mit Anregungslicht einer ersten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich (1) der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ersten Wellenlänge von einem vereinzelten Fluorophor eines Farbstoffs emittiertes Fluoreszenzlicht (92) detektiert und ein erstes Detektionssignal (51) erhalten wird, ein erstes Lokalisieren (11) des vereinzelten Fluorophors und Erhalten einer ersten Lokalisation (12), ein zweites Anregen und Detektieren (20), wobei der Teilbereich (1) der Probe mit Anregungslicht einer zweiten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei aus dem Teilbereich (1) der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der zweiten Wellenlänge von dem vereinzelten Fluorophor des Farbstoffs emittiertes Fluoreszenzlicht (92) detektiert und ein zweites Detektionssignal (52) erhalten wird, ein zweites Lokalisieren (21) des vereinzelten Fluorophors und Erhalten einer zweiten Lokalisation (22), ein Bestimmen eines Unterschieds (61) zwischen der ersten Lokalisation (12) und der zweiten Lokalisation (22).
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Teilbereich (1) der Probe ein Kleinfeldbereich (42) ist, der eine Ausdehnung von weniger als 3 pm, bevorzugt von weniger als 2 pm, aufweist und dass das Anregungslicht der ersten Wellenlänge und das Anregungslicht der zweiten Wellenlänge fokussiertes Licht (3) mit einem Fokuspunkt und mit einer Intensitätsverteilung ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitätsverteilung des fokussierten Lichts (3) der ersten Wellenlänge ein zentrales Minimum (4) aufweist, insbesondere im Wesentlichen eine Donut-Verteilung oder eine Bottle-Beam-Verteilung ist, und dass das erste Anregen erfolgt, indem der Fokuspunkt des Anregungslichts der ersten Wellenlänge an einem Ort innerhalb des Teilbereichs (1) positioniert wird, weiter dadurch gekennzeichnet, dass das Detektieren das Detektieren des als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ersten Wellenlänge von dem vereinzelten Fluorophor emittierten Fluoreszenzlichts (92) umfasst, dass das Fluoreszenzlicht (92) in einer Ebene, die konjugiert zu der Ebene ist, in der der Fokuspunkt liegt, mit einem ortsauflösenden Detektor detektiert wird oder dass eine Detektionsapertur innerhalb einer Ebene, die senkrecht zu einer optischen Achse orientiert ist, an einer Mehrzahl von Positionen um die optische Achse herum positioniert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitätsverteilung des fokussierten Lichts (3) der ersten Wellenlänge ein zentrales Maximum (4) aufweist, insbesondere im Wesentlichen eine Gauß’sche Verteilung ist, und dass das erste Anregen und Detektieren (10), wobei ein Teilbereich (1) der Probe mit Anregungslicht der ersten Wellenlänge beaufschlagt wird, erfolgt, indem der Fokuspunkt des Anregungslichts der ersten Wellenlänge an einer Abfolge von Orten innerhalb des Teilbereichs (1) positioniert wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitätsverteilung des fokussierten Lichts (3) der zweiten Wellenlänge ein zentrales Minimum (5) aufweist, insbesondere im Wesentlichen eine Donut-Verteilung oder eine Bottle-Beam- Verteilung ist, und dass das zweite Anregen erfolgt, indem der Fokuspunkt des Anregungslichts der zweiten Wellenlänge an einer Abfolge von nominellen Orten, die die erste Lokalisation (12) umschließen, wobei der umschlossene Bereich eine erste Ausdehnung aufweist, innerhalb des Teilbereichs (1) positioniert wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: ein Auswählen (33) einer Wellenlänge aus einer vorbestimmten Menge (117) von mindestens zwei Wellenlängen für ein weiteres Anregen des Teilbereichs (1) der Probe auf Basis des ersten Detektionssignals (51) und/oder des zweiten Detektionssignals (52), sodass eine ausgewählte Wellenlänge erhalten wird, und dem Auswählen (33) nachfolgend ein weiteres Anregen und Detektieren (15), wobei der Teilbereich (1) der Probe mit Anregungslicht der ausgewählten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem T eilbereich (1 ) der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ausgewählten Wellenlänge von dem vereinzelten Fluorophor des Farbstoffs emittiertes Fluoreszenzlicht (92) detektiert und ein weiteres Detektionssignal erhalten wird, zusammen mit dem Erhalten des weiteren Detektionssignals (115) ein weiteres Lokalisieren (113) des vereinzelten Fluorophors und Erhalten einer weiteren Lokalisation (114).
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Auswählen (33) der Wellenlänge erfolgt durch ein Auswerten (32) des ersten Detektionssignals (51) und/oder des zweiten Detektionssignals (52) hinsichtlich des Farbstoffs, dessen vereinzelter Fluorophor das detektierte Fluoreszenzlicht (92) emittiert hat.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die ausgewählte Wellenlänge die erste Wellenlänge oder die zweite Wellenlänge ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Anre gungslicht der ausgewählten Wellenlänge fokussiertes Licht (3) mit einem Fokuspunkt und mit einer Intensitätsverteilung ist, die ein zentrales Minimum (5) aufweist, insbesondere im Wesentlichen eine Donut-Verteilung oder eine Bottle-Beam-Verteilung ist, und dass das weitere Anregen und Detektieren (110), erfolgt, indem der Fokuspunkt des Anregungslichts der ausgewählten Wellenlänge an einer nominellen Abfolge von Orten innerhalb des Teilbereichs positioniert wird, die einen zentralen Ort, der aus der ersten Lokalisation (12) und/oder der zweiten Lokalisation (22) berechnet ist, umschließen, wobei der umschlossene Bereich eine zweite Ausdehnung aufweist, die kleiner ist als die erste Ausdehnung, innerhalb des Teilbereichs positioniert wird, wobei der zentrale Ort wenn die ausgewählte Wellenlänge die erste Wellenlänge ist, die erste Lokalisation ist, wenn die ausgewählte Wellenlänge die zweite Wellenlänge ist, die zweite Lokalisation ist, wenn die ausgewählte Wellenlänge eine weitere Wellenlänge ist, die zwischen der ersten und der zweiten Wellenlänge liegt, durch Interpolation aus der ersten und der zweiten Lokalisation bestimmt wird, und wenn die ausgewählte Wellenlänge eine weitere Wellenlänge ist, die größer als die erste und die zweite Wellenlänge oder kleiner als die erste und die zweite Wellenlänge ist, durch Extrapolation aus der ersten Lokalisation (12) und der zweiten Lokalisation (22) bestimmt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Anregen und Detektieren (10) nach einer vorbestimmten Zeitspanne (40) oder dann, wenn ein Lichtmengenwert (50) des ersten Detektionssignals (51) einen Schwellwert erreicht hat, beendet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die ausgewählte Wellenlänge die erste Wellenlänge ist und dass das weitere Anregen und Detektieren (15) und das weitere Lokalisieren des vereinzelten Fluorophors zusammenhängend oder iterativ so lange durchgeführt wird, bis eine weitere Lokalisation mit höchstens einer vorbestimmten Unsicherheit erhalten wird, wobei die weitere Lokalisation in diesem Fall die erste Lokalisation (12) ist, und dass erst nach dem Beenden des weiteren Anregens und Detektierens (15) das zweite Anregen und Detektieren (20) und das zweite Lokalisieren (21) durchgeführt wird.
12. Lokalisationsmikroskopisches Verfahren für eine Untersuchung einer mit mehreren Farbstoffen gefärbten Probe, dadurch gekennzeichnet, dass ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11 für eine Menge von Teilbereichen (1) der Probe durchgeführt wird, wobei die so erhaltene Menge von Teilbereichen (1) sowohl Teilbereiche (1) enthält, aus denen von jeweils einem vereinzelten Fluorophor eines ersten Farbstoffs Fluoreszenzlicht (92) emittiert und detektiert wurde als auch solche, aus denen von jeweils einem vereinzelten Fluorophor eines anderen Farbstoffs Fluoreszenzlicht (92) emittiert und detektiert wurde.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass aus den Lokalisationen (12,22,56,57,114) und den Unterschieden (61) der Lokalisationen der einzelnen vereinzelten Fluorophore, die mit Anregungslicht verschiedener Wellenlängen erhalten wurden, eine Karte mit Korrekturvektoren für die Ko-Registrierung aller Lokalisationen in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem bestimmt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass zu jeder der Lokalisationen (12,22,56,57,114) Information über die Zeit, zu der das Anregen und Detektieren (10,15,20,110) für das Lokalisieren erfolgte, gespeichert ist und dass die Karte mit Korrekturvektoren eine von einer Zeitkoordinate abhängende Karte ist.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass aus den ersten Lokalisationen (12) und den zweiten Lokalisationen (22) und/oder den ersten und den weiteren Lokalisationen und/oder den zweiten und den weiteren Lokalisationen und optional aus anderen Lokalisationen, die mittels Anregen mit Anregungslicht der ersten Wellenlänge oder der zweiten Wellenlänge oder einer der weiteren Wellenlängen und Detektieren erhalten wurden, ein Bild der Probe erzeugt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Teilbereich (1) der Probe ein Weitfeldbereich ist und dass das Detektieren ein Abbilden des Teilbereichs (1) auf einen Weitfelddetektor ist, wobei von dem vereinzelten Fluorophor emittiertes Fluoreszenzlicht auf dem Weitfelddetektor örtlich aufgelöst detektiert wird, sodass ein örtlich aufgelöstes Detektionssignal erhalten wird, wobei bei dem erstes Anregen und Detektieren (10) und dem zweiten Anregen und Detektieren (20) von aus dem Teilbereich (1) der Probe als Folge der Anregung mit Anregungslicht der jeweiligen Wellenlänge insgesamt von mehreren vereinzelten Fluorophoren emittiertes Fluoreszenzlicht detektiert wird und zu mehreren vereinzelten Fluorophoren jeweils ein erstes und ein zweites örtlich aufgelöstes Detektionssignal (51 ,52) erhalten wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: ein erstes und ein zweites Lokalisieren (11 ,12) mehrerer vereinzelter Fluorophore auf Grundlage der jeweiligen ersten und zweiten örtlich aufgelösten Detektionssignale (51,52) und Erhalten von jeweils ersten und zweiten Lokalisationen (12,22) und jeweils ein Bestimmen eines Unterschieds (61) zwischen der jeweiligen ersten Lokalisation (12) und der jeweiligen zweiten Lokalisation (22).
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Anregen und Detektieren (10) und das zweite Anregen und Detektieren (20) gleichzeitig erfolgen.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: ein Auswählen (33) einer Wellenlänge aus einer vorbestimmten Menge (117) von mindestens zwei Wellenlängen für ein weiteres Anregen des Teilbereichs (1) der Probe auf Basis zumindest der Menge der ersten und der zweiten Detektionssignale (51 ,52), sodass eine ausgewählte Wellenlänge erhalten wird, und dem Auswählen (33) nachfolgend ein weiteres Anregen und Detektieren (110), wobei der Teilbereich (1) der Probe mit Anregungslicht der ausgewählten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem T eilbereich (1 ) der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ausgewählten Wellenlänge von mehreren vereinzelten Fluorophoren emittiertes Fluoreszenzlicht (92) detektiert und jeweils ein weiteres Detektionssignal (115) erhalten wird, ein weiteres Lokalisieren (113) der mehreren vereinzelten Fluorophore auf Grundlage jeweils des weiteren Detektionssignals (115) und Erhalten jeweils einer weiteren Lokalisation (114), wobei das Auswählen (33) der Wellenlänge erfolgt durch ein Auswerten (32) der Menge der ersten und der zweiten Detektionssignale (51 ,52) hinsichtlich der Sorte des Farbstoffs, dessen vereinzelte Fluorophore das detektierte Fluoreszenzlicht (92) emittiert haben, das den überwiegenden Anteil der Menge der erhaltenen Detektionssignale hervorgerufen hat.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die ausgewählte Wellenlänge die erste Wellenlänge oder die zweite Wellenlänge ist.
21. Lokalisationsmikroskopisches Verfahren für eine Untersuchung einer mit mehreren Farbstoffen gefärbten Probe umfassend: ein testweises Anregen und Detektieren (110), wobei ein Teilbereich 1 der Probe mit Anregungslicht einer Testwellenlänge (25) beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich (1) der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der Testwellenlänge (25) von einem vereinzelten Fluorophor emittiertes Fluoreszenzlicht (92) detektiert und ein Testdetektionssignal erhalten wird, ein Auswählen (33) einer ersten Wellenlänge aus einer vorbestimmten Menge (117) von mindestens zwei Wellenlängen und/ oder ein Auswählen (43) eines Kleinfeldbereichs (42) innerhalb des Teilbereichs (1) für ein folgendes Anregen des Teilbereichs (1) der Probe auf Basis zumindest des Testdetektionssignals, ein erstes Anregen und Detektieren (10), wobei der Teilbereich (1) der Probe oder der Kleinfeldbereich (42) innerhalb des Teilbereichs (1) der Probe mit Anregungslicht der ersten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich (1) der Probe oder aus dem Kleinfeldbereich (42) innerhalb des Teilbereichs (1) der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der ersten Wellenlänge von dem vereinzelten Fluorophor emittiertes Fluoreszenzlicht (92) detektiert und ein erstes Detektionssignal erhalten wird, ein erstes Lokalisieren (11) des vereinzelten Fluorophors und Erhalten einer ersten Lokalisation (12).
22. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: ein Auswählen (33) einer ersten Wellenlänge aus einer vorbestimmten Menge (117) von mindestens zwei Wellenlängen für ein folgendes Anregen des Teilbereichs (1) der Probe auf Basis zumindest des Testdetektionssignals, vor dem Auswählen (33) der ersten Wellenlänge aus einer vorbestimmten Menge (117) von mindestens zwei Wellenlängen und nach dem testweisen Anregen und Detektieren ein zweites testweises Anregen, wobei der Teilbereich (1) der Probe oder der Kleinfeldbereich (42) innerhalb des Teilbereichs (1) der Probe mit Anregungslicht einer zweiten Testwellenlänge (26) beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich (1) der Probe oder aus dem Kleinfeldbereich (42) innerhalb des Teilbereichs (1) der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der zweiten Testwellenlänge (26) von einem vereinzelten Fluorophor emittiertes Fluoreszenzlicht (92) detektiert und ein zweites Testdetektionssignal erhalten wird, und dass das Auswählen (33) einer ersten Wellenlänge auf Basis zumindest des ersten und des zweiten Testdetektionssignals erfolgt, wobei das erste Testdetektionssignal und/oder das zweite Testdetektionssignal ein Lichtmengenwert (50) des detektierten Fluoreszenzlichts (92) ist.
23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Auswählen (33) der ersten Wellenlänge auf Basis eines Vergleichs des ersten und/oder des zweiten Testdetektionssignals mit einem vorbestimmten Referenzwert (27) oder mit vorbestimmten Referenzwerten (27) oder auf Basis des Verhältnisses des ersten Testdetektionssignals zu dem zweiten Testdetektionssignal erfolgt.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: ein Auswählen (33) einer zweiten Wellenlänge aus einer vorbestimmten Menge von mindestens zwei Wellenlängen für ein folgendes Anregen des Teilbereichs der Probe, ein zweites Anregen und Detektieren (20), wobei der Teilbereich (1) der Probe mit Anregungslicht der zweiten Wellenlänge beaufschlagt wird und wobei von aus dem Teilbereich (1) der Probe oder dem Kleinfeldbereich (42) innerhalb des Teilbereichs (1) der Probe als Folge der Anregung mit dem Anregungslicht der zweiten Wellenlänge von dem vereinzelten Fluorophor emittiertes Fluoreszenzlicht (92) detektiert und ein zweites Detektionssignal (52) erhalten wird, ein zweites Lokalisieren (21) des vereinzelten Fluorophors und Erhalten einer zweiten Lokalisation (22) und ein Bestimmen eines Unterschieds (61) zwischen der ersten Lokalisation (12) und der zweiten Lokalisation (22).
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Teilbereich (1) der Probe ein Kleinfeldbereich (42) ist, der bevorzugt eine Ausdehnung von weniger als 3 pm, bevorzugt von weniger 2 pm aufweist.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem testweisen Anregen und Detektieren ein Auswählen (43) eines Kleinfeldbereichs (42) innerhalb des Teilbereichs (1) erfolgt, wobei der Kleinfeldbereich (42) bevorzugt eine Ausdehnung von weniger als 3 pm, bevorzugt von weniger als 2 pm aufweist.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 und 26, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Lokalisieren (11) und/oder das zweite Lokalisieren (21) innerhalb des Kleinfeldbereichs (42) nach einem MINFLUX-Verfahren erfolgt.
28. Lokalisationsmikroskopisches Verfahren für eine Untersuchung einer mit mehreren Farbstoffen gefärbten Probe, dadurch gekennzeichnet, dass ein Verfahren nach Anspruch 24 und einem der Ansprüche 25 bis 27 für eine Menge von Kleinfeldbereichen (42) der Probe durchgeführt wird, wobei die so erhaltene Menge von Kleinfeldbereichen (42) sowohl Kleinfeldbereiche (42) enthält, aus denen von jeweils einem vereinzelten Fluorophor eines ersten Farbstoffs Fluoreszenzlicht (92) emittiert und detektiert wurde als auch solche, aus denen von jeweils einem vereinzelten Fluorophor eines anderen Farbstoffs Fluoreszenzlicht (92) emittiert und detektiert wurde.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass aus den Lokalisationen (12,22,56,57,114) und den Unterschieden (61) der Lokalisationen der einzelnen vereinzelten Fluorophore, die mit Anregungslicht verschiedener Wellenlängen erhalten wurden, eine Karte mit Korrekturvektoren für die Ko-Registrierung aller Lokalisationen in einem gemeinsamen räumlichen Bezugssystem bestimmt wird.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass zu jeder der Lokalisationen Information über die Zeit, zu der das Anregen und Detektieren für das Lokalisieren erfolgte, gespeichert ist und dass die Karte mit Korrekturvektoren eine von einer Zeitkoordinate abhängende Karte ist.
31. Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, dass aus den ersten und den zweiten und optional aus anderen Lokalisationen, die mittels Anregen mit Anregungslicht der ersten Wellenlänge oder der zweiten Wellenlänge oder optional einer weiteren Wellenlänge erhalten wurden, ein Bild der Probe erzeugt wird, in dem Fluorophore verschiedener Farbstoffsorten ko-lokalisiert sind.
32. Mikroskop (1) zur Ausführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 31 , insbesondere nach Anspruch 6 oder nach den Ansprüchen 24 und 25 oder 26, aufweisend: eine Lasereinheit (81 ,82) für die Anregung von Fluoreszenz, die eingerichtet ist, schmalbandiges Licht zweier Wellenlängen abzugeben, oder zwei Lasereinheiten (81 ,82) für die Anregung von Fluoreszenz (92), die zusammen eingerichtet sind, schmalbandiges Licht (83,84,85) zweier Wellenlängen abzugeben, eine Detektionseinheit (86), eine Auswahleinheit (87), die eingerichtet ist, auf Basis eines Detektionssignals hinsichtlich einer Fluoreszenzemission eines einzelnen Fluorophors eine Wellenlänge für ein Anregen auszuwählen, eine Berechnungseinheit (88), die eingerichtet ist, aus zwei Detektionssignalen hinsichtlich einer Fluoreszenzemission eines einzelnen Fluorophors jeweils eine Lokalisation und einen Unterschied (61) der Lokalisationen zu bestimmen.
33. Mikroskop (1) nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass sich die zwei Wellenlängen um einen Wert zwischen 200 nm und 50 nm voneinander unterscheiden
34. Mikroskop (1) nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Lasereinheit (81 ,82) aufweist, die eingerichtet ist, schmalbandiges Licht einer dritten Wellenlänge abzugeben, die sich von den zwei Wellenlängen unterscheidet.
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