WO2022169279A1 - 신장 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

신장 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating kidney disease.
  • Kidney is an important organ that maintains homeostasis. It regulates body fluid volume, ion concentration and pH in the blood, excretes waste products such as metabolic wastes, toxins, and drugs, and controls blood pressure and other metabolic and endocrine functions. carry out In addition, it activates vitamin D to help calcium absorption in the small intestine and is also involved in the synthesis of various hormones.
  • the kidney does not normally perform excretory, regulatory, metabolic and endocrine functions, and the overall function is reduced or abnormal is referred to as kidney disease.
  • Decreased function due to kidney damage results in enlargement of the kidneys and related structures, atrophy of the kidneys, changes in body fluid volume, electrolyte imbalance, metabolic acidosis, gas exchange disorders, impaired anti-infective function, and accumulation of uremic toxins.
  • acute renal failure is an intractable disease with a high mortality rate due to a decrease in renal function due to various causes. Even if renal function is restored, depending on the cause and severity of the damage, it may recur or progress to chronic or end-stage renal failure if not treated.
  • stem cells such as mesenchymal stem cells, adipose-derived stem cells, amniotic fluid stem cells, and renal progenitor cells
  • mesenchymal stem cells adipose-derived stem cells
  • amniotic fluid stem cells adipose-derived stem cells
  • renal progenitor cells are being studied in various ways to restore the kidney.
  • a cell therapy agent using adult stem cells derived from an adult kidney has a potential advantage of improved kidney engraftment and differentiation, and there are advantages such as being very useful for self-treatment.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of kidney disease comprising kidney tissue-derived stem cells as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is a method for preparing renal organoids; kidney organoids prepared through this; And to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of kidney disease comprising a kidney organoid as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is a composition for detecting kidney tissue-derived stem cells; And to provide a kit for detecting kidney stem cells comprising the same.
  • Another object of the present invention is a kidney tissue-derived stem cell detection method; And to provide a method for isolating renal stem cells.
  • Another object of the present invention is to provide a method for culturing kidney tissue-derived stem cells.
  • composition comprising kidney tissue-derived stem cells as an active ingredient
  • kidney tissue-derived stem cells as an active ingredient.
  • the renal stem cells of the present invention express Lrig1 (Leucine Rich Repeats And Immunoglobulin Like Domains 1) protein or a gene encoding the same.
  • Renal epithelial cells expressing Lrig1 or a gene encoding the same of the present invention are kidney tissue-derived stem cells having stem cell ability, unlike other cells, and are particularly involved in tubulogenesis, a later developmental stage of the kidney. It has the ability to split into nephrons. Therefore, in the case of using the renal epithelial cells expressing Lrig1 having the stem cell ability or a gene encoding the same for the purpose of the present invention, kidney disease can be very effectively prevented or treated.
  • the "Lrig1" of the present invention is a transmembrane protein that interacts with receptor tyrosine kinases such as EGFR-family, MET and RET proteins.
  • the Lrig1 may be derived from mammals including humans and primates such as monkeys, rodents such as mice and rats, and the like, for example, human Lrig1 (accession number: a polypeptide encoded by NM_015541 or NP_056356, The polypeptide represented by SEQ ID NO: 1), but is not limited thereto.
  • kidney tissue-derived stem cells may further express Klf6 (Krueppel-like factor 6) protein or a gene encoding the same.
  • the "Klf6" of the present invention is a protein encoded by the KLF6 gene, which corresponds to a tumor suppressor gene.
  • the Klf6 may be derived from mammals including humans and primates such as monkeys, rodents such as mice and rats, and the like, for example, human Lrig1 (accession number: a polypeptide encoded by NP_001153596.1 or NM_001160124 .1; polypeptide encoded by NP_001153597.1 or NM_001160125.1 [Q99612-3]; polypeptide encoded by NP_001291.3 or NM_001300.5 [Q99612-1], polypeptide represented by SEQ ID NO: 2) may be, but is not limited thereto.
  • kidney tissue-derived stem cell refers to a stem cell existing in the kidney tissue, and refers to a self-renewing and pluripotent stem cell that can be differentiated into all cell types of the kidney. Such stem cells may be involved in the regeneration and homeostasis of kidney damage.
  • kidney tissue-derived stem cells of the present invention may be used as cell therapy agents.
  • the "cell therapy agent" of the present invention is a living cell used in a treatment method directly injected into a patient, and is manipulated by physical, chemical or biological methods such as culturing, proliferating, or selecting living autologous, allogeneic or xenogeneic cells in vitro. medicines manufactured by For the purpose of the present invention, the kidney tissue-derived stem cells have very excellent stem cell ability in which Lrig1 protein or a gene encoding the Lrig1 protein present in the patient's kidney is expressed. do.
  • kidney disease of the present invention is a disease that causes weakening of renal function, and depending on the rate at which the deterioration of renal function progresses, acute kidney injury (AKI) and chronic kidney disease (CKD) Included, for example, may be acute kidney injury, but is not limited thereto.
  • AKI acute kidney injury
  • CKD chronic kidney disease
  • the kidney disease of the present invention may be, for example, at least one selected from the group consisting of glomerulonephritis, chronic renal failure, acute renal failure, nephrotic syndrome, pyelitis, kidney stones and kidney cancer, but is not limited thereto.
  • prevention of the present invention means a reduction in the degree of the occurrence of pathological cells or damage or loss of cells in an animal. Prevention may be complete or partial. In this case, it may mean a phenomenon in which the generation of pathological cells or abnormal immune action in the subject is reduced compared to the case where the composition for preventing and treating kidney disease is not used.
  • the "treatment" of the present invention refers to any action that clinically intervenes to change the natural process of a subject or cell to be treated, and may be performed while a clinical pathology is in progress or to prevent it.
  • the desired therapeutic effect is to prevent the occurrence or recurrence of a disease, alleviate symptoms, reduce any direct or indirect pathological consequences of the disease, prevent metastasis, reduce the rate of disease progression, or reduce the rate of disease progression. alleviating or temporarily ameliorating the condition, or improving the prognosis. That is, the treatment may be interpreted as encompassing all actions in which the symptoms of kidney disease are improved or cured by the composition.
  • the kidney tissue-derived stem cells of the present invention are 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 8 , 1 ⁇ 10 8 to 2 ⁇ 10 8 , 2 ⁇ 10 8 to 4 ⁇ 10 8 , 4 ⁇ 10 8 to 6 ⁇ 10 8 , 6 ⁇ 10 8 to 8 ⁇ 10 8 , 8 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 9 , 1 ⁇ 10 9 to 2 ⁇ 10 9 , 2 ⁇ 10 9 to 4 ⁇ 10 9 , 4 ⁇ 10 9 to 1 ⁇ 10 10 , 2 ⁇ 10 8 to 6 ⁇ 10 8 , 6 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 9 , 1 ⁇ 10 8 to 2 ⁇ 10 8 , 2 ⁇ 10 8 to 2 ⁇ 10 9 , 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 8 , 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 8 , 1 ⁇ 10 8 1 ⁇ 10 9 to 1 ⁇ 10 10 or 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 9 may be administered at a dose of any one cell/kg, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be characterized in the form of capsules, tablets, granules, injections, ointments, powders or beverages, and the pharmaceutical composition may be characterized in that it is targeted to humans.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not limited thereto, but each is formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions according to conventional methods to be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may include binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, fragrances, etc., for oral administration, and in the case of injections, buffers, preservatives, and pain relief Agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, etc.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, it can be prepared in the form of unit dose ampoules or multiple doses. have.
  • it can be formulated as a solution, suspension, tablet, capsule, sustained release formulation, and the like.
  • suitable carriers, excipients and diluents for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose , methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil may be used.
  • fillers, anti-agglomeration agents, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like may be further included.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is, but not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, Sublingual or rectal is included and may be, for example, oral or parenteral administration.
  • the "parenteral" of the present invention includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical composition may be administered by direct injection into the kidney, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention depends on several factors including the activity of the specific compound used, age, weight, general health, sex, formula, administration time, administration route, excretion rate, drug formulation, and the severity of the specific disease to be prevented or treated.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's condition, body weight, degree of disease, drug form, administration route and period, but may be appropriately selected by those skilled in the art, and 0.0001 to 50 mg/day per day kg or 0.001 to 50 mg/kg. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses. The above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated as pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, and suspensions.
  • Renal organoids to be described later in the present invention are easy to operate for treatment, can be supplied in large quantities with high self-proliferative ability, have excellent differentiation ability into renal cells, have low tumor formation potential, and are injected directly into the lesion. In this case, the ability to regenerate damaged tissue is very excellent. Therefore, it can be very suitably used for adult stem cell-based regenerative therapy.
  • kidney organoids have an advantage in that they have a very excellent direct regeneration effect compared to cell therapeutics using conventional mesenchymal stem cells, embryonic stem cells, or pluripotent stem cells.
  • renal organoids a method for preparing renal organoids, and uses thereof will be described in detail.
  • Another embodiment of the present invention provides renal organoids.
  • kidney organoids of the present invention include kidney tissue-derived stem cells expressing Lrig1 protein or a gene encoding the same.
  • Renal epithelial cells expressing Lrig1 or a gene encoding the same of the present invention are kidney tissue-derived stem cells having stem cell ability, unlike other cells, and are particularly involved in tubulogenesis, a later developmental stage of the kidney. It has the ability to split into nephrons. Therefore, for the purpose of the present invention, kidney epithelial cells expressing Lrig1 having the stem cell ability or a gene encoding the same can form organoids very effectively.
  • kidney tissue-derived stem cells may further express a Klf6 protein or a gene encoding the same.
  • kidney organoid of the present invention the contents related to Lrig1 or Klf6 protein or a gene encoded by it, kidney tissue-derived stem cells, etc. are as described above in "1.
  • Pharmaceutical composition comprising kidney tissue-derived stem cells as an active ingredient” In the same way, the description thereof is omitted.
  • the "organoid” of the present invention refers to a cell having a 3D three-dimensional structure, and refers to a model similar to a tissue prepared through an artificial culture process that is not collected or acquired from animals. Unlike 2D culture, 3D cell culture allows cells to grow in all directions in vitro.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for preparing renal organoids.
  • the production method of the present invention comprises the steps of (a) isolating a cell expressing a Leucine Rich Repeats And Immunoglobulin Like Domains 1 (Lrig1) protein or a gene encoding it from renal epithelial cells isolated from a target individual; (b) culturing the cells in which the Lrig1 protein or a gene encoding it is expressed; and (c) placing the cultured cells in matrigel to form organoids.
  • Lrig1 Leucine Rich Repeats And Immunoglobulin Like Domains 1
  • Renal epithelial cells expressing Lrig1 or a gene encoding the same of the present invention are kidney tissue-derived stem cells having stem cell ability, unlike other cells, and are particularly involved in tubulogenesis, a later developmental stage of the kidney. It has the ability to split into nephrons. Therefore, for the purpose of the present invention, when using kidney tissue-derived stem cells expressing Lrig1 having the stem cell ability or a gene encoding the same, kidney organoids can be prepared in a very high yield.
  • the cell separated in step (a) of the present invention may be one in which Klf6 (Krueppel-like factor 6) protein or a gene encoding it is expressed.
  • the contents related to Lrig1 or Klf6 protein or a gene encoded by it, kidney tissue-derived stem cells, organoids, etc. are described above in “1.
  • Pharmaceutical composition comprising renal stem cells as an active ingredient. It is the same as described in “ and “(1) renal organoid", and the description thereof is omitted.
  • the step of isolating cells includes dissociating a sample isolated from a target subject, and then performing magnetic activated cell sorting (MACS) or flow cytometry according to a conventional method. flow cytometry analysis), but is not limited thereto.
  • MCS magnetic activated cell sorting
  • the step of dissociating the sample of the present invention may be using collagenase, but is not limited thereto.
  • the step of culturing the gene-expressed cells may be using a cell culture medium containing fetal bovine serum, growth factors and antibiotics.
  • the step of forming the organoid is a cell culture containing B27 supplement, conditioned medium, growth factor, N-acetylcysteine and ALK 5 (TGF ⁇ kinase/activin receptor-like kinase) inhibitor. It may be possible to use a medium.
  • the "growth factor” of the present invention is a substance necessary for cell growth, for example, VEGF (Vascular endothelial growth factor), HGF (Hepatocyte growth factor), IGF (Insulin-like growth factor), EGF (Epidermal growth factor) ), may be Fibroblast growth factor (FGF), etc., but is not limited thereto.
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • HGF Hepatocyte growth factor
  • IGF Insulin-like growth factor
  • EGF Extracellular growth factor
  • FGF Fibroblast growth factor
  • the "conditioned medium” of the present invention may be at least one selected from the group consisting of Wnt3a conditioned medium, noggin conditioned medium, and Rspol conditioned medium, for example, Wnt3a conditioned medium, noggin conditioned medium and Rspo1 conditioned medium, and for example, may include, but is not limited to, 40% Wnt3a conditioned medium, 10% Noggin conditioned medium, and 10% Rspo1 conditioned medium.
  • the "cell culture medium” of the present invention includes basic components for growth and maintenance of cell lines in vitro, for example, DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal essential Medium), It may be BME (Basal Medium Eagle), RPMI-1640, DMEM/F10, DMEM/F12, ADMEM/F12, GMEM (Glasgow's Minimal essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), etc., and the cell culture of the step (b)
  • the medium may be RPMI-1640
  • the cell culture medium of step (c) may be ADMEM/F12, but is not limited thereto.
  • the cell culture medium may include 10% fetal bovine serum, 20 ng/ml of EGF (Epidermal growth factor) and 1% penicillin-streptomycin. , but is not limited thereto.
  • the cell culture medium in step (c), includes 1.5% B27 supplement, 40% Wnt3a conditioned medium, 10% Noggin conditioned medium, 10% Rspo1 conditioned medium, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml FGF-10, 1.25 mM N-acetylcysteine, and 5 ⁇ M A8301 (CAS no. CAS Number 909910-43-6) may be included, but is not limited thereto.
  • the Matrigel of the present invention may be a growth factor reduced Matrigel, but is not limited thereto.
  • Another embodiment of the present invention provides a kidney organoid prepared by the method for producing the kidney organoid according to the present invention.
  • the kidney organoid of the present invention is prepared using kidney tissue-derived stem cells expressing Lrig1 or a gene encoding the same, preferably Lrig1 and Klf6 proteins or a gene encoding them, having very excellent stem cell ability. It can be implemented very effectively to effectively screen a therapeutic agent for kidney damage, and it can be used as a cell therapy directly used for kidney damage.
  • kidney organoid of the present invention the Lrig1 or Klf6 protein or the gene encoded by it, the kidney organoid and the content related to the production method, etc. are described above in "1.
  • Pharmaceutical composition comprising kidney stem cells as an active ingredient” and "(1 ) kidney organoid", and the description thereof is omitted.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating kidney disease comprising a renal organoid as an active ingredient.
  • kidney organoid of the present invention may be used as a cell therapy agent.
  • kidney tissue-derived stem cells As it is the same as described in “Pharmaceutical composition comprising as an active ingredient” and “(1) Renal organoid", the description thereof is omitted.
  • the kidney organoid of the present invention is 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 8 , 1 ⁇ 10 8 to 2 ⁇ 10 8 , 2 ⁇ 10 8 to 4 ⁇ 10 8 , 4 ⁇ 10 8 to 6 ⁇ 10 8 , 6 ⁇ 10 8 to 8 ⁇ 10 8 , 8 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 9 , 1 ⁇ 10 9 to 2 ⁇ 10 9 , 2 ⁇ 10 9 , 2 ⁇ 10 9 to 4 ⁇ 10 9 , 4 ⁇ 10 9 to 1 ⁇ 10 10 , 2 ⁇ 10 8 to 6 ⁇ 10 8 , 6 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 9 , 1 ⁇ 10 8 to 2 ⁇ 10 8 , 2 ⁇ 10 8 to 2 ⁇ 10 9 , 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 8 , 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 8 to to 1 ⁇ 10 10 or 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 9 may be administered at a dose of any one cell/kg, but is not limited thereto.
  • Another embodiment of the present invention provides a composition for detecting kidney tissue-derived stem cells.
  • composition for detection of the present invention includes an agent for measuring the expression level of Lrig1 protein or a gene encoding the same.
  • the detection composition of the present invention may further include an agent for measuring the expression level of the Klf6 protein or a gene encoding the same.
  • the contents related to Lrig1 or Klf6 protein and kidney tissue-derived stem cells are the same as those described above in "Pharmaceutical composition comprising one kidney tissue-derived stem cell as an active ingredient", so the description thereof is omitted. .
  • the agent for measuring the expression level of the gene of the present invention may be included as long as it can measure the expression level of the DNA present in the biological sample or the mRNA transcribed by it, for example, it specifically binds to the gene. It may be at least one selected from the group consisting of primers, probes, and antisense nucleotides, but is not limited thereto.
  • the "primer” of the present invention is a fragment recognizing a target gene sequence, including a pair of forward and reverse primers, but preferably, a primer pair that provides analysis results having specificity and sensitivity.
  • the nucleic acid sequence of the primer is a sequence that is inconsistent with a non-target sequence present in the sample, and thus amplifies only the target gene sequence containing the complementary primer binding site and does not cause non-specific amplification, high specificity can be conferred. .
  • the "probe” of the present invention means a substance capable of specifically binding to a target substance to be detected in a sample, and means a substance capable of specifically confirming the presence of a target substance in the sample through the binding .
  • the type of probe is not limited as a material commonly used in the art, but preferably PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), peptide, polypeptide, protein, RNA or DNA, and most preferably It is PNA.
  • the probe is a biomaterial derived from or similar thereto, or manufactured in vitro, for example, enzymes, proteins, antibodies, microorganisms, animal and plant cells and organs, neurons, DNA, and It may be RNA, DNA includes cDNA, genomic DNA, and oligonucleotides, RNA includes genomic RNA, mRNA, and oligonucleotides, and examples of proteins include antibodies, antigens, enzymes, peptides, and the like.
  • LNA Locked nucleic acids
  • the "LNA (Locked nucleic acids)" of the present invention means a nucleic acid analog comprising a 2'-O, 4'-C methylene bridge.
  • LNA nucleosides include general nucleic acid bases of DNA and RNA, and can form base pairs according to the Watson-Crick base pairing rule. However, due to the 'locking' of the molecule due to the methylene bridge, the LNA does not form an ideal shape in the Watson-Crick bond.
  • LNAs When LNAs are incorporated into DNA or RNA oligonucleotides, LNAs can pair with complementary nucleotide chains more rapidly, increasing the stability of the double helix.
  • the "antisense” of the present invention means that the antisense oligomer is hybridized with a target sequence in RNA by Watson-Crick base pairing, and typically mRNA and RNA: oligomeric heteroduplex formation in the target sequence, allowing the formation of a sequence of nucleotide bases and oligomers having an inter-subunit backbone.
  • An oligomer may have exact sequence complementarity or approximate complementarity to a target sequence.
  • the agent for measuring the expression level of the protein of the present invention may be included as long as it can measure the amount of protein present in a biological sample, for example, an antibody, oligopeptide, ligand, which specifically binds to the protein; It may be at least one selected from the group consisting of peptide nucleic acid (PNA) and aptamer, but is not limited thereto.
  • PNA peptide nucleic acid
  • the "protein” of the present invention is not only the protein itself, but also a protein isomer (Isoform) or protein variant (Variant) that can be generated by splicing and variable promoters, or can be generated due to genetic changes such as mutation or polymorphism includes
  • the "antibody” of the present invention refers to a substance that specifically binds to an antigen and causes an antigen-antibody reaction.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to the biomarker protein.
  • Antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies.
  • the antibody can be readily prepared using techniques well known in the art.
  • the polyclonal antibody can be produced by a method well known in the art, including the process of injecting an antigen of the protein into an animal and collecting blood from the animal to obtain a serum containing the antibody.
  • Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal such as goat, rabbit, sheep, monkey, horse, pig, cow, dog, and the like.
  • monoclonal antibodies can be prepared using hybridoma methods well known in the art, or phage antibody library techniques.
  • the antibody prepared by the above method may be separated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • the antibodies of the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full-length light chains and two full-length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule means a fragment having at least an antigen-binding function, and includes all of Fab, F(ab'), F(ab')2 and Fv.
  • PNA The "PNA” of the present invention refers to a polymer similar to artificially synthesized DNA or RNA, and was first introduced in 1991 by Professors Nielsen, Egholm, Berg and Buchardt of the University of Copenhagen, Denmark. Whereas DNA has a phosphate-ribose sugar backbone, PNA has a repeated N-(2-aminoethyl)-glycine backbone linked by peptide bonds, which greatly increases binding strength and stability to DNA or RNA, resulting in molecular biology , diagnostic assays and antisense therapy.
  • the PNA can be further specified with reference to the background well known in the art.
  • the "aptamer” of the present invention is an oligonucleic acid or a peptide molecule, and the general contents of the aptamer are described in Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine”. J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "Anartificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library”. Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)].
  • the antibody, oligopeptide, ligand, PNA, aptamer, etc. of the present invention can be easily produced by those skilled in the art based on the amino acid sequence identifiable by the site identifiable through the NCBI accession number.
  • Another embodiment of the present invention provides a kit for detecting kidney tissue-derived stem cells comprising the composition for detecting according to the present invention.
  • kidney tissue-derived stem cells information related to Lrig1 protein or a gene encoding the same, kidney tissue-derived stem cells, agents for measuring protein expression levels, agents for measuring gene expression levels, etc. are described above in "1.
  • Kidney tissue-derived stems It is the same as described in "Pharmaceutical Composition Containing Cells as an Active Ingredient” and "(1) Composition for Detection of Renal Stem Cells", and thus description thereof will be omitted.
  • the kit of the present invention may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, an ELISA kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit, but is not limited thereto.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the kit of the present invention may further include one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method.
  • the kit may further include essential elements necessary for performing the reverse transcription polymerase reaction.
  • the reverse transcription polymerase reaction kit includes a pair of primers specific for the gene.
  • the primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of the gene, and may have a length of about 7 bp to 50 bp, more preferably about 10 bp to 30 bp. It may also include primers specific for the nucleic acid sequence of a control gene (eg, a housekeeping gene).
  • reverse transcription polymerase reaction kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffers (varying pH and magnesium concentrations), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors.
  • DEPC-water DEPC-water
  • the diagnostic kit of the present invention may include essential elements necessary for performing a DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or fragment thereof is attached, and reagents, agents, enzymes, etc. for preparing a fluorescently-labeled probe.
  • the substrate may include a cDNA or oligonucleotide corresponding to a control gene (eg, a housekeeping gene) or a fragment thereof, but is not limited thereto.
  • the diagnostic kit of the present invention may include essential elements necessary for performing ELISA.
  • the ELISA kit contains an antibody specific for this protein.
  • Antibodies are antibodies with high specificity and affinity for a marker protein and little cross-reactivity with other proteins, and are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies.
  • the ELISA kit may include an antibody specific for a control (eg, housekeeping protein) protein.
  • Other ELISA kits include reagents capable of detecting bound antibody, for example, labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (eg, conjugated with an antibody) and substrates thereof or capable of binding the antibody. other materials and the like.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for detecting kidney tissue-derived stem cells.
  • the detection method of the present invention includes the step of measuring the expression level of the Lrig1 protein or a gene encoding the same from a biological sample isolated from a subject of interest.
  • the expression level of the Klf6 protein or a gene encoding the same from the biological sample may be further measured.
  • kidney tissue-derived stem cells Lrig1 or Klf6 protein or genes encoding them, etc. are described above in "1.
  • Pharmaceutical composition comprising kidney tissue-derived stem cells as an active ingredient” and “(1) Composition for the detection of renal stem cells", and the description thereof is omitted.
  • the "biological sample” of the present invention refers to any material, biological fluid, tissue or cell obtained from or derived from an individual, for example, whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear peripheral blood mononuclear cells, buffy coat, blood including plasma and serum, urine, semen, organ secretions, cells Or it may include a cell extract (cell extract), for example, may be kidney tissue or kidney cells, but is not limited thereto.
  • a cell extract may be kidney tissue or kidney cells, but is not limited thereto.
  • RT-PCR reverse transcription Polymerase reaction
  • RPA RNase protection assay
  • Northern blotting Northern blotting
  • DNA chip a DNA chip
  • the step of measuring the expression level of the protein of the present invention is at least one selected from the group consisting of an antibody, oligopeptide, ligand, PNA (peptide nucleic acid) and aptamer that specifically binds to the protein.
  • kidney tissue-derived stem cells when the expression level of the Lrig1 protein or a gene encoding the same is increased compared to the control, detecting with kidney tissue-derived stem cells may be further included.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for isolating kidney tissue-derived stem cells.
  • the isolation method of the present invention includes a step of isolating cells expressing Lrig1 protein or a gene encoding the same from a biological sample isolated from a target individual.
  • the cell may be one in which the Klf6 protein or a gene encoding the same is additionally expressed.
  • kidney tissue-derived stem cells the contents related to Lrig1 or Klf6 protein or a gene encoding it, kidney tissue-derived stem cells, biological samples, etc. are described above in "1.
  • Pharmaceutical composition comprising kidney stem cells as an active ingredient
  • (1 ) composition for detecting renal stem cells and “(3) method for detecting kidney tissue-derived stem cells”, and the description thereof will be omitted.
  • the separation of the present invention may be performed through magnetic activated cell sorting (MACS) or flow cytometry analysis.
  • MCS magnetic activated cell sorting
  • flow cytometry analysis may be performed through magnetic activated cell sorting (MACS) or flow cytometry analysis.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for culturing kidney tissue-derived stem cells.
  • the culturing method of the present invention comprises the steps of isolating a kidney tissue-derived stem cell expressing the Lrig1 protein or a gene encoding it; and culturing the isolated kidney tissue-derived stem cells.
  • the kidney tissue-derived stem cells may be those in which Klf6 protein or a gene encoding the same is additionally expressed.
  • kidney stem cells In the isolation method of the present invention, the contents related to Lrig1 or Klf6 protein or a gene encoding it, kidney tissue-derived stem cells, etc. are the same as described above in "1.
  • Pharmaceutical composition comprising kidney stem cells as an active ingredient" omit
  • the culturing method of the present invention is performed after isolating kidney tissue-derived stem cells according to the method described in 5. Method for isolating kidney tissue-derived stem cells of the present invention and then culturing them, for example, in vitro. It may be cultured in, but is not limited thereto.
  • culture means any in vitro culture of cells.
  • the culture of the present invention may use a cell culture medium, and the cell culture medium refers to any type of medium used in an environment for culturing cells, for example, amino acids, at least one carbohydrate as an energy source, trace elements, vitamins , salts and possibly additional ingredients (eg, to affect cell growth, productivity, or product quality).
  • Another embodiment of the present invention provides a method for preparing an animal model for screening a cell therapy agent for the prevention or treatment of kidney disease.
  • the method for producing the animal model of the present invention comprises the steps of inducing kidney damage in an animal in which a desired gene is conditionally expressed by the CreERT2-LoxP system; and treating the animal with an estrogen antagonist to induce expression of a desired gene.
  • kidney tissue-derived stem cells contents of the kidney tissue-derived stem cells, kidney disease, and cell therapy are the same as described above in "1.
  • Pharmaceutical composition comprising kidney tissue-derived stem cells as an active ingredient”. omit the description.
  • the promoter-specifically expressed Cre-ERT2 polypeptide recognizes two LoxP nucleotide sequences and catalyzes site-specific recombination between the two LoxP nucleotide sequences, so that the LoxP nucleo It refers to a system that specifically expresses a gene downstream of the tide. How to build such a system is described in Lab Anim Res. 2018 Dec; 34(4): 147-159. A person skilled in the art can easily construct it according to the contents described in others.
  • the "gene of interest" of the present invention is a gene that is specifically expressed or expected to be expressed in a cell with potential to be used as a cell therapy agent, and for the purpose of the present invention, a gene encoding Lrig1, preferably It may be a gene encoding Lrig1 and a gene encoding Klf6, but is not limited thereto.
  • the "animal model” of the present invention means an animal capable of exhibiting a form very similar to a human disease.
  • the causes and pathogenesis of various diseases can be studied, and basic data for judging the feasibility, such as treatment selection and toxicity testing, can be obtained.
  • the animal of the present invention means any mammal other than humans, and includes animals of all ages including embryos, fetuses, newborns, and adults.
  • Such animals include rabbits, rodents (mice, rats, hamsters, gerbils or guinea pigs), cattle, sheep, pigs, goats, horses, dogs, cats, birds (chickens, turkeys, ducks, geese) and primates (chimpanzees, monkey, rhesus monkey) may be any one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the step of inducing kidney damage of the present invention includes intraperitoneal administration of folic acid; induce ischemia/reperfusion injury; And it may be to perform any one of the methods consisting of induction of unilateral ureteral obstruction, but is not limited thereto.
  • the folic acid of the present invention may be administered intraperitoneally at 100 mg/kg to 300 mg/kg, for example, 150 mg/kg or 250 mg/kg, but is not limited thereto. If the dose of folic acid is less than 100 mg/kg, acute kidney damage may not be induced, and if it exceeds 300 mg/kg, toxicity exists in animal models, affecting the interpretation of the desired experimental results. or the animal model may die.
  • the estrogen antagonist of the present invention may be tamoxifen, 4-hydroxytamoxifen, clomiphene, raloxifene, or a combination thereof, but is not limited thereto.
  • Another embodiment of the present invention provides an animal model for screening a cell therapy agent for the prevention or treatment of kidney disease produced by the production method of the present invention.
  • Kidney tissue-derived stem cells according to the present invention.
  • organoids are easy to operate for treatment, can be supplied in large quantities due to their high self-proliferative capacity, have excellent differentiation capacity into kidney cells, have a low probability of tumor formation, and have the ability to regenerate damaged tissue when directly injected into the lesion. This is very excellent. Therefore, among these stem cells, in particular, it can be used very suitably for adult stem cell-based regenerative therapy.
  • composition according to the present invention can specifically select only renal stem cells from among renal cells.
  • kidney stem cells expressing Lrig1 protein or a gene encoding the same have excellent regenerative ability and pluripotency, and have the ability to divide into nephrons, so they can be used very effectively for the prevention or treatment of kidney disease.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of an experimental process using a mouse animal model used in an in vivo lineage tracking study according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of an experimental process using an embryonic mouse animal model used in an in vivo lineage tracking study according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram illustrating a method for preparing a high-dose (250 mg/kg) folate-induced acute kidney injury animal model according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of an analysis process after transplantation of the renal organoid according to the present invention into a high-dose (150 mg/kg) folate-induced acute kidney injury animal model according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing a method for preparing an animal model of ischemia/reperfusion injury-induced acute kidney injury according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing a method of manufacturing an animal model of unilateral ureteral obstruction-induced acute kidney injury according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 shows the results of confirming the presence of tdTomato+ cells (Lrig1tdT+) in the kidneys of mice according to an embodiment of the present invention through tissue staining.
  • FIG. 8 shows the results of quantifying the number of tdTomato+ cells (Lrig1tdT+) in the kidney of a mouse according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 shows the results of quantifying the number of tdTomato+ cells (Lrig1tdT+) in mice in the developmental stage according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 shows the results of confirming the kidney organoid according to an embodiment of the present invention using a fluorescence microscope.
  • FIG. 12 shows the result of confirming the expression level of the gene expressed in the kidney organoid according to an embodiment of the present invention through real-time polymerase chain reaction.
  • FIG. 13 shows the results confirming that the number of kidney organoids is increased when the kidney organoids according to an embodiment of the present invention are cultured for a long period from 1 day to 19 days.
  • FIG. 14 is a high-dose (150 mg/kr) folic acid-induced acute kidney injury animal model according to an embodiment of the present invention transplanted with PBS or a renal organoid according to the present invention and tissue staining and It shows the result of confirming the expression level of KIM1.
  • 15 is a high-dose (150 mg/kr) folic acid-induced acute kidney injury animal model according to an embodiment of the present invention transplantation of PBS or a renal organoid according to the present invention and confirming the presence of kidney repair, blood BUN and Shows the results of checking the creatine concentration.
  • 16 shows the results of confirming the expression of Ki-67 in kidney organoids according to an embodiment of the present invention by fluorescence microscopy.
  • FIG. 17 shows the classification of the proximal tubule (PT) cluster into four sub-clusters of PTS1, PTS2, PTS3 and PTQPs in renal organoids according to an embodiment of the present invention.
  • 18 and 19 are bubble-plots showing the results of confirming the expression levels of genes for each cluster of PTS1, PTS2, PTS3 and PTQPs in kidney organoids according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 21 shows the results of measuring changes in the number of PTS1, PTS2, PTS3 and PTQPs cluster cells at 365 days compared to the 1st day after Cre-loxp induction after transplanting the renal organoid according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 23 shows the top 10 genes that are highly expressed in PTS3 and PTQPs clusters in kidney organoids according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 24 shows immunofluorescence staining photographs of LTL (PT marker) and KLF6 staining in kidney sections on days 1 and 365 after Cre-loxp induction after transplanting kidney organoids according to an embodiment of the present invention.
  • 26 shows the ratio of tdTomato+ cells for each cluster at the 1st day and 365 days after Cre-loxp induction after transplanting the renal organoid according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 27 is a pseudotime system in the proximal tubule (PT) of a renal organoid according to an embodiment of the present invention divided into three different states, PTS1, PTS3 and PTQPs clusters are shown in different colors, respectively. . Black arrows indicate the direction of pseudotime.
  • FIG. 29 shows immunofluorescence staining pictures of Lrig1tdTomato+ and KLF6 staining of kidney sections on days 1 and 365 after Cre-loxp induction after transplanting kidney organoids according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention is to overcome the limitations of the conventional treatment of kidney diseases such as acute renal failure, and to develop a more effective therapeutic agent.
  • the present invention is for the development of an effective therapeutic agent for kidney disease using kidney tissue-derived stem cells or organoids.
  • F high-concentration folic acid
  • F+PBS high-concentration folic acid
  • the levels of BUN and creatine in the blood were very high, whereas renal organoids were injected.
  • the levels in which BUN and creatine were present were reduced to a degree similar to that of Normal.
  • the animals were housed in a Specific pathogen-free (SPF) barrier facility, and PicoLab Lab Rodent Diet 20, LabDiet, St. Louis, MO, USA. ) The experimental animals were bred by feeding them.
  • SPF Specific pathogen-free
  • Lrig1CreERT2/+ was provided by Robert J. Coffey of Venterbilt University, and 2) B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14 (CAG-tdTomato)/Hze/J(R26R-LSL-tdTomato; The Jackson Laboratory, 007914) was provided by Professor Bok Jin-woong, Yonsei University, 3) B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdToamto) -EGFP)Luo/J(ACTB-mT/mG; The Jackson Laboratory, 007676) was provided by Professor Ki Hyun-woong, Yonsei University.
  • heterozygous mice were produced by crossing Lrig1CreERT2/+ mice and R26R-LSL-tdTomato mice, which are reporter mice of the same type as in Experimental Method 1. Cre-loxp recombination was induced by intraperitoneally injecting 2 mg of tamoxifen (Sigma-Aldrich) contained in corn oil to the mice for 3 consecutive days, 1 day, 3 days, 10 days, 30 days, 60 days, 90 days , analysis was performed on day 180 or day 365.
  • tamoxifen Sigma-Aldrich
  • E9.5, E10.5, E13.5 and E18.5 embryos were generated by crossing Lrig1CreERT2/+ mice and R26R-LSL-tdTomato mice, which are isoform reporter mice.
  • 2 mg of 4-hydroxytamoxifen (Sigma-Aldrich) contained in corn oil was injected once, and the analysis was performed at 6 weeks postpartum.
  • reporter mice of the same type produced by crossing Lrig1CreERT2/+ mice and R26R-ACTB-mT/mG mice were bred for 6 to 10 weeks, and then primary renal epithelial cells were collected. 2 mg/ml of type 1 collagenase was added to the collected primary renal epithelial cells, and cultured at 37° C. for 30 minutes with gentle agitation. Then, after filtering the primary renal epithelial cells using a filter, the isolated single cells were cultured.
  • the cells expressing the Lrig1 protein were placed in RPMI 1640 (10% fetal bovine serum (FBS), 20 ng/ml of EGF, and 1% penicillin-streptomycin) medium, 5% CO 2 and 37 It was cultured for 7 to 8 days at a confluence of 80% under the condition of °C. Thereafter, 1 ⁇ 10 3 of the cultured cells were dispensed and cultured in the wells containing the growth factor-reduced matrigel and culture medium.
  • FBS fetal bovine serum
  • EGF EGF
  • penicillin-streptomycin penicillin-streptomycin
  • the culture medium is based on ADMEM/F12 culture medium containing 1% penicillin-streptomycin, HEPS and glutamax, 1.5% B27 supplement, 40% Wnt3a conditioned medium (produced using stably transfected L) cells), 10% noggin conditioned medium, 10% Rspo1 conditioned medium, 50 ng/ml EGF, 100 ng/mL FGF-10, 1.25 mM N-acetylcysteine, and 5 ⁇ M A8301 (CAS) No. CAS Number 909910-43-6) was used.
  • an organoid culture medium was added, and the organoid culture medium was replaced every 3 days.
  • Lrig1 protein was expressed in adult (8 to 10 week old) Lrig1-CreERT2;LSL-tdTomato mice through the injection of tamoxifen. Thereafter, 250 mg/kg of folic acid (FA) was intraperitoneally injected to induce acute kidney injury.
  • FA folic acid
  • Lrig1 protein was expressed in adult (8 to 10 week old) Lrig1-CreERT2;LSL-tdTOmato mice through the injection of tamoxifen. Then, acute renal injury was induced through the process of closing the renal artery of the mouse with forceps for 20 minutes. After 3 days, as a result of collecting and confirming the kidney tissue of the mouse, it was confirmed that acute kidney damage was induced.
  • Lrig1 protein was expressed in adult (8 to 10 week old) Lrig1-CreERT2;LSL-tdTomato mice through the injection of tamoxifen. Then, acute kidney injury was induced through the process of closing the ureter with forceps for 7 days. After 7 days, as a result of collecting and confirming the kidney tissue of the mouse, it was confirmed that acute kidney damage was induced.
  • tdTomato+ cells (Lrig1tdT+) were not observed at E9.5 and E10.5, which are the ureteric bud branching stages. However, tdTomato+ cells were observed at E13.5, the nephrogenesis stage, and most of the cells had expanded to form a tube structure.
  • Lrig1 is a stem cell population that is involved in generating nephron division after developing from an early stage to a mature kidney.
  • the gene expression level on the 17th day after culturing kidney organoids was confirmed by performing a real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR) using the primers in Table 1 below according to a conventional method. It was confirmed that not only the expression level of Lrig1, but also the expression level of kidney stem cells such as Sall1, Six2, Foxo1, Cited, Osr1, Hoxp7, Jagged1 and Gata3 were increased together. Furthermore, as shown in FIG. 13 , in the case of Lrig1-positive kidney organoids, the number of generated organoids increased to about 40 or more from the 9th day to the 19th day.
  • the organoids injected into the kidneys were confirmed through immunofluorescence staining, and it was found that proliferation markers such as Ki-67 were expressed. It was confirmed that organoids were proliferative.
  • Lrig1-positive cells survive for a long time in the proximal tubule (PT) and correspond to potential renal stem/progenitor cells, and the Lrig1-positive cell-derived descendants maintain PT homeostasis. was found to have made a substantial contribution to the In order to confirm the cellular heterogeneity of Lrig1+ cells and their derived cells in PT, as shown in FIG. 17 , the PT cluster was classified into four sub-clusters of PTS1, PTS2, PTS3 and PTQPs.
  • Slc5a12 and Slc5a2 markers were used for PTS1 classification, Slc13a3 and Ddah1 markers for PTS2 classification, and Slc16a9 and Slc7a13 markers for PTS3 classification.
  • pyruvate dehydrogenase kidney 4 Pyruvate dehydrogenase kidney 4; Pdk4
  • cysteine-rich protein Cystein-rich protein 61; Cyr61
  • PTQPs were compared with other PT sub-clusters.
  • PT cells increase with time, and in particular, the number of PTQPs and PTS2 cluster cells increases.
  • clusters of PTQPs in the kidney were defined using the adult stem cell gene module. As a result, a total of 650 genes were detected in DEGs. 22, stem-related genes were highly expressed in the PTQPs cluster, self-renewal-related genes (except for Klf5, Ptbp1, Ncl, Ctr9 and Cited2), quiescence-related genes (Hif1a, Myc, and Foxo3), and pluripotency or immature cell-related genes (Id2, Btg2, Tubb6, and Klf2) were confirmed to be up-regulated. Through this, it was found that the PTQPs cluster expresses stem function-related genes, including kidney injury-recovery-related genes and markers of mature PT cells. will be named as
  • PTQPs marker distinct from PTS3 genes known as stem cell niche highly expressed in DEGs could be identified.
  • PT segment 3 specific genes were highly expressed, whereas in PTQPs, they were not highly expressed.
  • kidney sections were IF-stained using Jun, Klf6 and Cyr61. Jun and Cyr61 were highly expressed in various nephron fragments as well as PT, and these were excluded.
  • KLF6 and LTL were stained on day 1 and day 365 kidney sections to confirm whether they were expressed in PT. As shown in FIG.
  • Klf6+LTL+ PT tubules were weakly expressed in kidney sections on day 1, whereas Klf6+LTL+ PT tubules were strongly expressed in kidney sections on day 365.
  • FIG. 25 it was confirmed that the KLF6+ expression PT tubule significantly increased in the kidney on day 365. From this, it can be seen that the increase in the distribution of PTQPs in the kidney on day 365 can be confirmed using Klf6.
  • tdTomato-expressing cells were identified in kidney sections at day 1 and day 365. As a result, as shown in FIG. 26 , tdTomato+ cells constituted 54% of PTS1 cells and 27% of PTS3 cells in the kidney section on day 1, but decreased to 50% and 11% in the kidney section on day 365, respectively. On the other hand, 12% of PTS2 cells and 17.8% of PTQPs cells in the kidney section on day 1 were increased to 20% and 18%, respectively, on day 365. From this, it was found that progeny cells derived from Lrig1-positive cells constitute a PTQPs cell population.
  • PTS3 known as a PT stem cell niche
  • PTQPs a novel stem cell niche
  • the present invention is to overcome the limitations of the conventional treatment of kidney diseases such as acute renal failure, and to develop a more effective therapeutic agent.
  • kidney diseases such as acute renal failure
  • the present invention is kidney tissue-derived stem cells;
  • organoids are easy to operate for treatment, have excellent ability to differentiate into renal cells, have a low probability of tumor formation, and have excellent ability to regenerate damaged tissues when directly injected into a lesion. It is expected to be used very effectively for treatment.
  • SEQ ID NO: 3 GGTGAGCCTGGCCTTATGTGAATA
  • SEQ ID NO: 4 CACCACCATCCTGCACCTCC
  • SEQ ID NO: 5 TACTCTTTCCTTCAGGCAGTGA
  • SEQ ID NO: 7 CACCTCCACAAGAATGAAAGCG
  • SEQ ID NO: 8 CTCCGCCTCGATGTAGTGC
  • SEQ ID NO: 9 AACCTTGGAGTGGAAGGATCGC
  • SEQ ID NO: 10 GTAGGAGAGCCTATTGGAGATGT
  • SEQ ID NO: 11 CTCAACATTTCCAATCCGACCC
  • SEQ ID NO: 12 GGCATCCTTGCTCTTAGTGGG
  • SEQ ID NO: 13 GAGAGCCAGCCTACCATCC
  • SEQ ID NO: 14 GGGTCCTCGTGTTTGAAGGAA
  • SEQ ID NO: 15 AAGTTCGGTTTTCGCTCCAGG
  • SEQ ID NO: 16 ACACCCCGGAGAGGTTCTG
  • SEQ ID NO: 17 CTCGGCCATTCGTACATGGAA
  • SEQ ID NO: 18 GGATACCTCTGCACCGTAGC
  • SEQ ID NO: 19 GCGTCAGGGAGATGGTAAAG
  • SEQ ID NO: 20 CATCAGGGAAACAGTTGCAG
  • SEQ ID NO: 21 CGCTAAGAATCCGCTGGTGAAG
  • SEQ ID NO: 22 GGATCTTGACGAAGCAGTCGTT
  • SEQ ID NO: 23 CCTCGGGTCAGTTTGAGCTG
  • SEQ ID NO: 24 CCTTGAGGCACACTTTGAAGTA

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Abstract

본 발명에 따른 신장 조직유래 줄기세포; 또는 오가노이드는 치료를 위한 시술이 용이하고, 높은 자가 증식능으로 대량 공급이 가능하며, 신장 세포로 분화능이 뛰어나고, 종양 형성의 가능성이 낮을 뿐만 아니라, 병변에 직접 주입되는 경우 손상된 조직을 재생하는 능력이 매우 탁월하다. 따라서, 이와 같은 줄기세포 중에서, 특히 성제줄기세포 기반 재생치료에 매우 적합하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 신장 세포 중에서 특히 신장 줄기세포만을 특이적으로 선별해낼 수 있다. 나아가, Lrig1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 발현하는 신장 줄기세포는 재생능력 및 다능성이 매우 뛰어나고, 네프론으로 분열할 수 있는 능력을 가지고 있으므로 신장 질환의 예방 또는 치료에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

신장 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 신장 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
신장은 생체의 항상성(homeostasis)을 유지하는 중요한 장기로, 체내 체액량, 혈액 내의 이온 농도와 pH를 조절하고, 대사성 노폐물, 독소, 약물 등의 노폐물을 배설하며, 혈압 조절 및 기타 대사성, 내분비 기능을 수행한다. 또한, 비타민 D를 활성화시켜서 소장에서 칼슘이 흡수되도록 도와주며 여러 가지 호르몬의 합성에도 관여한다. 상기 신장이 배설, 조절, 대사 및 내분비적 기능을 정상적으로 수행하지 못하고 전체적으로 기능이 저하되거나 이상이 초래된 상태를 신장 질환이라고 한다. 신장의 손상으로 인한 기능의 저하는 신장 및 관련 구조의 증대, 신장의 위축, 체액량의 변화, 전해질 불균형, 대사성 산증, 가스교환장애, 항감염 기능 손상, 요독성 독소의 축적 등을 초래한다. 특히, 급성 신부전은 여러 가지 원인에 의해 신장기능이 저하되어 높은 치사율을 보이는 난치성 질환이다. 신장기능이 회복되더라도 손상의 원인과 정도에 따라 재발하거나 치료되지 않을 경우 만성 및 말기 신부전(end-stage renal failure)으로 진행되기도 한다.
현대의학의 발전에도 불구하고 병원에 입원하는 많은 환자들이 신장 기능의 저하로 인하여 많은 고통을 받고 있으며, 특히 병의 중증도가 높은 환자는 신장 기능의 저하로 인하여 신대체요법이 필요한 경우가 많이 있다. 급성 신손상의 유병률은 입원환자의 약 5%에서, 중환자실에 입원하는 환자의 약 30-50%까지 보고되고 있으며 이러한 유병률은 새로운 치료법의 개발에도 불구하고 꾸준히 증가하고 있는 추세에 있다.
이와 같은 신장 질환을 치료하기 위하여, 줄기세포에 대한 전임상 보고서와 임상 시험이 현재 활발하게 진행되고 있는 실정이다. 구체적으로, 중간엽 줄기세포, 지방유래 줄기세포, 양수 줄기세포 및 신장 전구세포 등에 이르는 다양한 유형의 줄기세포가 신장을 복구하는데 다양하게 연구되고 있다. 이와 같은 줄기세포 중에서, 특히 성인의 신장에서 유래된 성체 줄기세포를 이용한 세포치료제는 향상된 신장 생착 및 분화의 잠재적인 이점이 있으며, 자가 치료에 매우 유용하게 활용될 수 있다는 등의 이점이 존재한다.
이와 같은 맥락에서, 신장의 경우 근위 세뇨관 말단, 사구체 및 신장 유두부(Renal papiila)에 성체 줄기세포가 존재한다고 보고되어 있으며, 이와 같은 줄기세포에 의해 손상된 신장 세포의 재생을 유도할 수 있는 세포치료제에 대한 다양한 연구가 지속되고 있다.
그러나, 아직까지 이와 같은 신장 줄기세포를 식별하고 치료제로 적용하기 위한 줄기세포를 동정하고, 임상에 활용하기 위한 적용 가능성 등에 대한 연구는 미비한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 신장 조직유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신장 오가노이드의 제조 방법; 이를 통해 제조된 신장 오가노이드; 및 신장 오가노이드를 유효성분으로 포함하는 신장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신장 조직유래 줄기세포 검출용 조성물; 및 이를 포함하는 신장 줄기세포 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신장 조직유래 줄기세포 검출 방법; 및 신장 줄기세포를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신장 조직유래 줄기세포를 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
1. 신장 조직유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물
본 발명의 일 구현 예에서는 신장 조직유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 신장 줄기세포는 Lrig1(Leucine Rich Repeats And Immunoglobulin Like Domains 1) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 발현한다.
본 발명의 상기 Lrig1 또는 이를 암호화하는 유전자를 발현하는 신장 상피세포는 다른 세포와는 달리 줄기세포능을 갖는 신장 조직유래 줄기세포로서, 특히 신장의 후기 발달 단계인 투불로제네시스(Tubulogenesis)에 관여하여 네프론으로 분열할 수 있는 능력을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적상 상기 줄기세포능을 갖는 Lrig1 또는 이를 암호화하는 유전자를 발현하는 신장 상피세포를 이용하는 경우에는 신장 질환을 매우 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 상기 "Lrig1"은 EGFR-계통, MET 및 RET 단백질 등의 수용체 티로신 카이네이즈와 상호작용하는 막통과 단백질(transmembrane protein)이다. 상기 Lrig1은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류, 등을 포함하는 포유류로부터 유래하는 것일 수 있으며, 예를 들면, 인간의 Lrig1(접근번호: NM_015541에 의하여 암호화되는 폴리펩타이드 또는 NP_056356, 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 신장 조직유래 줄기세포는 Klf6(Krueppel-like factor 6) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 추가로 발현할 수 있다.
본 발명의 상기 "Klf6"는 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene)에 해당하는 KLF6 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. 상기 Klf6는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류, 등을 포함하는 포유류로부터 유래하는 것일 수 있으며, 예를 들면, 인간의 Lrig1(접근번호: NP_001153596.1에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 NM_001160124.1; NP_001153597.1에 의하여 암호화되는 폴리펩타이드 또는 NM_001160125.1 [Q99612-3]; NP_001291.3에 의하여 암호화되는 폴리펩타이드 또는 NM_001300.5 [Q99612-1], 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "신장 조직유래 줄기세포"는 신장의 조직내 존재하는 줄기세포로서, 신장의 모든 세포 유형으로 분화될 수 있는 자기 재생성(Self-renewing) 및 다능성 줄기세포를 의미한다. 이와 같은 줄기세포는 신장 손상의 재생 및 항상성에 관여할 수 있다.
본 발명의 상기 신장 조직유래 줄기세포는 세포치료제로 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 "세포치료제"는 환자에 직접 주입하는 치료 방법에 사용되는 살아있는 세포로서, 살아있는 자가세포, 동종세포 또는 이종세포를 체외에서 배양, 증식하거나 선별하는 등 물리적, 화학적 또는 생물학적 방법으로 조작하여 제조하는 의약품을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 신장 조직유래 줄기세포는 환자의 신장에 존재하는 Lrig1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 발현되어 있는 줄기세포능이 매우 뛰어나므로, 이식 거부 반응 등과 같은 부작용이 매우 적을 수 있다는 이점이 존재한다.
본 발명의 상기 "신장 질환"은 신장 기능의 약화를 초래하는 질환으로서, 신장 기능의 악화가 진행되는 속도에 따라 급성 신손상(Acute kidney injury; AKI) 및 만성 신손상(Chronic kidney disease; CKD)가 포함되며, 예를 들면 급성 신손상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 신장 질환은 예를 들면, 사구체 신염, 만성 신부전, 급성 신부전, 신증후군, 신우염, 신장결석 및 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "예방" 은 동물의 병리학적 세포의 발생 또는 세포의 손상, 소실의 정도의 감소를 의미한다. 예방은 완전할 수 있으며 또는 부분적일 수도 있다. 이 경우에는 개체 내의 병리학적 세포의 발생 또는 비정상적인 면역 작용 등이 상기 신장 질환의 예방 및 치료용 조성물을 사용하지 않은 경우와 비교하여 감소하는 현상을 의미할 수 있다.
본 발명의 상기 "치료"는 치료하고자 하는 대상 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위하여 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하며, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위하여 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과는 질병의 발생 또는 재발을 예방하거나, 증상을 완화시키거나, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키거나, 전이를 예방하거나, 질병 진행 속도를 감소시키거나, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키거나, 예후를 개선시키는 것을 포함할 수 있다. 즉, 상기 치료는 상기 조성물에 의해 신장 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 포괄하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 상기 신장 조직유래 줄기세포는 1Х107 내지 1Х108, 1Х108 내지 2Х108, 2Х108 내지 4Х108, 4Х108 내지 6Х108, 6Х108 내지 8Х108, 8Х108 내지 1Х109, 1Х109 내지 2Х109, 2Х109 내지 4Х109, 4Х109 내지 1Х1010, 2Х108 내지 6Х108, 6Х108 내지 1Х109, 1Х108 내지 2Х108, 2Х108 내지 2Х109, 1Х107 내지 1Х108, 1Х108 내지 1Х109, 1Х109 내지 1Х1010 또는 1Х107 내지 1Х109개 중 어느 하나의 세포/㎏의 투여량으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화되어 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 사용될 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등이 혼합되어 사용될 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수 회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함되며, 예를 들면, 경구 또는 비경구 투1일 수 있다.
본 발명의 상기 "비경구"란, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 목적상 상기 약학 조성물은 신장에 직접 주사되는 방식으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50 mg/kg 또는 0.001 내지 50 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
2. 오가노이드
본 발명에서 후술하여 기재되는 신장 오가노이드는 치료를 위한 시술이 용이하고, 높은 자가 증식능으로 대량 공급이 가능하며, 신장 세포로 분화능이 뛰어나고, 종양 형성의 가능성이 낮을 뿐만 아니라, 병변에 직접 주입되는 경우 손상된 조직을 재생하는 능력이 매우 탁월하다. 따라서, 성체 줄기세포 기반 재생치료에 매우 적합하게 사용될 수 있다. 특히, 이와 같은 신장 오가노이드는 기존의 중간엽 줄기세포, 배아 줄기세포 또는 역분화 만능 줄기세포를 이용하는 세포 치료제와 비교하여 직접 재생 효과가 매우 뛰어나다는 장점이 존재한다.
이하, 신장 오가노이드, 신장 오가노이드의 제조 방법 및 그 용도에 대해 자세히 설명한다.
(1) 신장 오가노이드
본 발명의 다른 구현 예에서는 신장 오가노이드를 제공한다.
본 발명의 상기 신장 오가노이드는 Lrig1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 발현하는 신장 조직유래 줄기세포를 포함한다.
본 발명의 상기 Lrig1 또는 이를 암호화하는 유전자를 발현하는 신장 상피세포는 다른 세포와는 달리 줄기세포능을 갖는 신장 조직유래 줄기세포로서, 특히 신장의 후기 발달 단계인 투불로제네시스(Tubulogenesis)에 관여하여 네프론으로 분열할 수 있는 능력을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적상 상기 줄기세포능을 갖는 Lrig1 또는 이를 암호화하는 유전자를 발현하는 신장 상피세포는 매우 효과적으로 오가노이드를 형성할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 신장 조직유래 줄기세포는 Klf6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 추가로 발현할 수 있다.
본 발명의 상기 신장 오가노이드에서, Lrig1 또는 Klf6 단백질 또는 이에 의해 암호화되는 유전자, 신장 조직유래 줄기세포 등과 관련된 내용은 앞서 "1. 신장 조직유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물"에 기재된 바와 동일하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 상기 "오가노이드"는 3D 입체구조를 가지는 세포를 의미하며, 동물 등에서 수집, 취득하지 않은 인공적인 배양 과정을 통해 제조한 조직과 유사한 모델을 의미한다. 2D 배양과는 달리, 3D 세포 배양은 체외에서 세포가 모든 방향으로 성장할 수 있다.
(2) 신장 오가노이드의 제조 방법
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 신장 오가노이드의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 제조 방법은 (a) 목적하는 개체로부터 분리된 신장 상피세포에서 Lrig1(Leucine Rich Repeats And Immunoglobulin Like Domains 1) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 발현된 세포를 분리하는 단계; (b) 상기 Lrig1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 발현된 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 세포를 마트리겔에 넣고 오가노이드를 형성하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 상기 Lrig1 또는 이를 암호화하는 유전자를 발현하는 신장 상피세포는 다른 세포와는 달리 줄기세포능을 갖는 신장 조직유래 줄기세포로서, 특히 신장의 후기 발달 단계인 투불로제네시스(Tubulogenesis)에 관여하여 네프론으로 분열할 수 있는 능력을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적상 상기 줄기세포능을 갖는 Lrig1 또는 이를 암호화하는 유전자를 발현하는 신장 조직유래 줄기세포를 이용하는 경우에는 신장 오가노이드를 매우 높은 수율로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 (a) 단계에서 분리되는 세포는 Klf6(Krueppel-like factor 6) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 신장 오가노이드의 제조 방법에서, Lrig1 또는 Klf6 단백질 또는 이에 의해 암호화되는 유전자, 신장 조직유래 줄기세포, 오가노이드 등과 관련된 내용은 앞서 "1. 신장 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물" 및 "(1) 신장 오가노이드"에 기재된 바와 동일하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 상기 (a) 단계에서, 세포를 분리하는 단계는 목적하는 개체로부터 분리된 샘플을 해리시킨 뒤, 통상의 방법에 따라 자기 활성 세포 분류법(Magnetic activated cell sorting; MACS) 또는 유세포 분석(Flow cytometry Analysis)을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 샘플을 해리시키는 단계는 콜라게나제(Collagenase)를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 (b) 단계에서, 상기 유전자가 발현된 세포를 배양하는 단계는 우태아혈청, 성장인자 및 항생제가 포함된 세포 배양 배지를 이용하는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 (c) 단계에서, 상기 오가노이드를 형성하는 단계는 B27 보충제, 조건 배지, 성장인자, N-아세틸시스테인 및 ALK 5(TGFβ kinase/activin receptor-like kinase) 억제제가 포함된 세포 배양 배지를 이용하는 것일 수 t있다.
본 발명의 상기 "성장인자"는 세포의 성장에 필요한 물질로서, 예를 들면, VEGF(Vascular endothelial growth factor), HGF(Hepatocyte growth factor), IGF(Insulin-like growth factor), EGF(Epidermal growth factor), FGF(Fibroblast growth factor) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "조건 배지"는 Wnt3a 조건 배지, 노긴(noggin) 조건 배지 및 Rspol 조건 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상인 것일 수 있고, 예를 들면, Wnt3a 조건 배지, 노긴(noggin) 조건 배지 및 Rspo1 조건 배지를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들면, 40% Wnt3a 조건 배지, 10% 노긴 조건 배지, 10% Rspo1 조건 배지를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "세포 배양 배지"는 생체 외(In vitro)에서 세포주의 성장 및 유지를 위한 기본적인 성분이 포함된 것으로서, 예를 들면, DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI-1640, DMEM/F10, DMEM/F12, ADMEM/F12, GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 등일 수 있고, 상기 (b) 단계의 세포 배양 배지는 RPMI-1640일 수 있고, 상기 (c) 단계의 세포 배양 배지는 ADMEM/F12일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체 예에서, 상기 (b) 단계에서, 상기 세포 배양 배지에는 10% 우태아 혈청, 20 ng/ml의 EGF(Epidermal growth factor) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체 예에서, 상기 (c) 단계에서, 상기 세포 배양 배지에는 1.5% B27 보충제, 40% Wnt3a 조건 배지, 10% 노긴 조건 배지, 10% Rspo1 조건 배지, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml FGF-10, 1.25 mM의 N-아세틸시스테인 및 5 μM의 A8301(CAS no. CAS Number 909910-43-6)가 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 마트리겔은 성장인자 감소 마트리겔인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
(3) 신장 오가노이드
본 발명의 다른 구현 예에서는 본 발명에 따른 상기 신장 오가노이드의 제조 방법에 의해 제조된 신장 오가노이드를 제공한다.
본 발명의 상기 신장 오가노이드는 매우 뛰어난 줄기세포능을 갖는 Lrig1 또는 이를 암호화하는 유전자, 바람직하게는 Lrig1 및 Klf6 단백질 또는 이들을 암호화나는 유전자를 발현하는 신장 조직유래 줄기세포를 이용하여 제조된 것으로서, 신장을 매우 효과적으로 구현하여 신장 손상 치료제를 효과적으로 스크리닝할 수 있을 뿐만 아니라, 직접 신장 손상에 사용되는 세포 치료제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 신장 오가노이드에서, Lrig1 또는 Klf6 단백질 또는 이에 의해 암호화되는 유전자, 신장 오가노이드 및 제조 방법 등과 관련된 내용은 앞서 "1. 신장 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물" 및 "(1) 신장 오가노이드"에 기재된 바와 동일하여 그 기재를 생략한다.
(4) 신장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 신장 오가노이드를 유효성분으로 포함하는 신장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 신장 오가노이드는 세포치료제로 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 신장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, Lrig1 단백질 또는 이에 의해 암호화되는 유전자, 약학 조성물, 예방, 치료, 신장 오가노이드 및 제조 방법 등과 관련된 내용은 앞서 "1. 신장 조직유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물" 및 "(1) 신장 오가노이드" 에 기재된 바와 동일하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 상기 신장 오가노이드는 1Х107 내지 1Х108, 1Х108 내지 2Х108, 2Х108 내지 4Х108, 4Х108 내지 6Х108, 6Х108 내지 8Х108, 8Х108 내지 1Х109, 1Х109 내지 2Х109, 2Х109 내지 4Х109, 4Х109 내지 1Х1010, 2Х108 내지 6Х108, 6Х108 내지 1Х109, 1Х108 내지 2Х108, 2Х108 내지 2Х109, 1Х107 내지 1Х108, 1Х108 내지 1Х109, 1Х109 내지 1Х1010 또는 1Х107 내지 1Х109개 중 어느 하나의 세포/㎏의 투여량으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
4. 검출용 조성물, 키트 및 검출 방법
(1) 신장 조직유래 줄기세포의 검출용 조성물
본 발명의 다른 구현 예에서는 신장 조직유래 줄기세포 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 검출용 조성물은 Lrig1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함한다.
또한, 본 발명의 상기 검출용 조성물은 Klf6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 검출용 조성물에서, Lrig1 또는 Klf6 단백질 및 신장 조직유래 줄기세포 등과 관련된 내용은 앞서 "1 신장 조직유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물"에 기재된 바와 동일하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 생물학적 시료 내에 존재하는 DNA 또는 이에 의해 전사되는 mRNA의 발현 수준을 측정할 수 있는 것이라면 모두 포함될 수 있고, 예를 들면 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "프라이머"란, 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명의 상기 "프로브"란, 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고 뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.
본 발명의 상기 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로mRNA와 RNA:올리고머 헤테로 이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브 유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명의 상기 유전자의 정보는 상기 NCBI 접근 번호를 통해 확인 가능한 사이트에 의해 통상의 기술자가 쉽게 확인할 수 있으므로, 통상의 기술자가 도출된 유전자 서열을 바탕으로 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 제작할 수 있다.
본 발명의 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 생물학적 시료 내에 존재하는 단백질의 양을 측정할 수 있는 것이라면 모두 포함될 수 있고, 예를 들면 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 압타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "단백질"은 그 단백질 자체뿐만 아니라, 스플라이싱 및 가변 프로모터에 의해 생성되거나, 돌연변이 또는 다형성과 같은 유전적 변화로 인해 생성될 수 있는 단백질 이성체(Isoform) 또는 단백질 변이체(Variant)를 포함한다.
본 발명의 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 바이오마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법, 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 모두 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 "PNA"란, 인공적으로 합성된 DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. 상기 PNA는 본 발명의 기술분야에 널리 알려진 배경 기술을 참고하여 더욱 구체화할 수 있다.
본 발명의 상기 "압타머"란, 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "Anartificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]을 참고하여 구체화할 수 있다.
본 발명의 상기 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA 및 압타머 등은 상기 NCBI 접근 번호를 통해 확인 가능한 사이트에 의해 확인 가능한 아미노산 서열을 바탕으로 통상의 기술자에 의해 용이하게 제작할 수 있다.
(2) 신장 조직유래 줄기세포의 검출용 키트
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 본 발명에 따른 상기 검출용 조성물을 포함하는 신장 조직유래 줄기세포의 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 키트에서, Lrig1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자, 신장 조직유래 줄기세포, 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제, 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제 등과 관련된 내용은 앞서 "1. 신장 조직유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 " 및 "(1) 신장 줄기세포의 검출용 조성물"에 기재된 바와 동일하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체 예에서, 상기 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 상기 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자(예를 들면, 하우스 키핑 유전자)의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역 전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체 예에서, 본 발명의 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자(예를 들면, 하우스 키핑 유전자) 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체 예에서, 본 발명의 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 상기 ELISA 키트는 대조군(예를 들면, 하우스 키핑 단백질) 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
(3) 신장 조직유래 줄기세포의 검출 방법
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 신장 조직유래 줄기세포의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 검출 방법은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Lrig1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함한다.
또한, 본 발명의 상기 발현 수준을 측정하는 단계 시 상기 생물학적 시료로부터 Klf6 단백질 또는 이를 암호화는 유전자의 발현 수준을 추가로 측정할 수 있다.
본 발명의 상기 검출 방법에서, 신장 조직유래 줄기세포, Lrig1 또는 Klf6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자 등과 관련된 내용은 앞서 "1. 신장 조직유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물" 및 "(1) 신장 줄기세포의 검출용 조성물"에 기재된 바와 동일하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma) 및 혈청(serum)을 포함하는 혈액, 소변(urine), 정액(semen), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell) 또는 세포 추출물(cell extract)을 포함할 수 있고, 예를 들면 신장 조직 또는 신장 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하여, 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 압타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하여, 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatographyMass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 검출 방법에서 상기 Lrig1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 대조군과 비교하여 증가된 경우, 신장 조직유래 줄기세포로 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
5. 신장 조직유래 줄기세포의 분리 방법
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 신장 조직유래 줄기세포의 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 분리 방법은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, Lrig1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 발현되는 세포를 분리하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 세포를 분리하는 단계 시 상기 세포는 Klf6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 추가로 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 분리 방법에서, Lrig1 또는 Klf6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자, 신장 조직유래 줄기세포, 생물학적 시료 등과 관련된 내용은 앞서 "1. 신장 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물", "(1) 신장 줄기세포의 검출용 조성물" 및 "(3) 신장 조직유래 줄기세포의 검출 방법"에 기재된 바와 동일하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 상기 분리하는 단계는 자기 활성 세포 분류법(Magnetic activated cell sorting; MACS) 또는 유세포 분석(Flow cytometry Analysis)을 통해 수행될 수 있다.
6. 신장 조직유래 줄기세포를 배양하는 방법
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 신장 조직유래 줄기세포를 배양하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 배양하는 방법은 Lrig1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 발현하는 신장 조직유래 줄기세포를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 신장 조직유래 줄기세포를 배양하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 상기 분리하는 단계 시 상기 신장 조직유래 줄기세포는 Klf6 단백질 또는 이를 암호화는 유전자가 추가로 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 분리 방법에서, Lrig1 또는 Klf6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자, 신장 조직유래 줄기세포 등과 관련된 내용은 앞서 "1. 신장 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물"에 기재된 바와 동일하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 상기 배양하는 방법은 본 발명의 상기 5. 신장 조직유래 줄기세포를 분리하는 방법에 기재된 방법에 따라, 신장 조직유래 줄기세포를 분리한 뒤에 이를 배양, 예를 들면 시험관 내(In vitro)에서 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 배양하는 단계에서, "배양"이란, 세포의 임의의 시험관 내 배양을 의미한다. 본 발명의 배양은 세포 배양 배지를 이용할 수 있으며, 세포 배양 배지는 세포를 배양하는 환경에서 쓰는 모든 종류의 배지를 의미하고, 예를 들면, 아미노산, 에너지원으로서 적어도 하나의 탄수화물, 미량원소, 비타민, 염 및 가능한 추가 성분(예:　세포의 성장, 생산성, 또는 생산물의 품질에 영향을 미치기 위함)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
7. 동물 모델의 제조 방법
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 신장 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제의 스크리닝용 동물 모델의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 동물 모델의 제조 방법은 목적하는 유전자가 CreERT2-LoxP 시스템에 의해 조건적으로 발현되는 동물에 신장 손상을 유도하는 단계; 및 상기 동물에 에스트로겐 길항제를 처리하여, 목적하는 유전자의 발현을 유도하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 상기 동물 모델의 제조 방법에서, 신장 조직유래 줄기세포, 신장 질환, 세포치료제에 대한 내용은 앞서 "1. 신장 조직유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 "에 기재된 바와 동일하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 상기 "CreERT2-LoxP 시스템"은 프로모터 특이적으로 발현된 Cre-ERT2 폴리펩티드가 두개의 LoxP 뉴클레오티드 서열을 인식하고, 두 개의 LoxP 뉴클레오티드 서열 사이를 부위 특이적 재조합을 촉매하여, 상기 LoxP 뉴클레오티 드 하류의 유전자를 특이적으로 발현시키는 시스템을 말한다. 이와 같은 시스템의 구축 방법은 Lab Anim Res. 2018 Dec; 34(4): 147-159. 등에 기재된 내용에 따라 통상의 기술자가 쉽게 구축할 수 있다.
본 발명의 상기 "목적하는 유전자"는 세포치료제로 사용될 수 있는 가능성이 있는 세포에서 특이적으로 발현되거나, 또는 발현될 것으로 예상되는 유전자로서, 본 발명의 목적상 Lrig1을 암호화하는 유전자, 바람직하게는 Lrig1을 암호화는 유전자 및 Klf6를 암호화하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "동물 모델"은 사람의 질병 등과 매우 유사한 형태를 나타낼 수 있는 동물을 의미한다. 이러한 동물 모델을 이용하는 경우에는 다양한 질병의 원인과 발병과정 등을 연구할 수 있으며, 치료제 선별, 독성 검사 등과 같은 가능성의 여부를 판단하는 기초 자료를 얻을 수 있다.
본 발명의 상기 동물은 인간을 제외한 임의의 포유류 동물을 의미하며, 배아, 태아, 신생아, 성인을 포함하는 모든 연령의 동물을 포함한다. 이와 같은 동물은 토끼, 설치류(생쥐, 쥐, 햄스터, 게르빌루스 또는 기니피그), 소, 양, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 새(닭, 칠면조, 오리, 거위) 및 영장류(침팬치, 원숭이, 붉은털 원숭이)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 신장 손상을 유도하는 단계는 엽산의 복강내 투여; 허혈/재관류 손상을 유도; 및 일측성 요관 폐쇄 유도로 구성된 방법 중 어느 하나를 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 엽산은 100 mg/kg 내지 300 mg/kg으로 복강내 투여되는 것일 수 있고, 예를 들면, 150 mg/kg 또는 250 mg/kg으로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 엽산의 투여 용량이 100 mg/kg 미만인 경우에는 신장에 급성 신장 손상이 유도되지 않을 수 있고, 300 mg/kg 초과인 경우에는 동물 모델에 독성이 존재하여 목적하는 실험 결과의 해석에 영향을 미치거나, 또는 동물 모델이 사망할 수 있다.
본 발명의 상기 에스트로겐 길항제는 타목시펜, 4-히드록시타목시펜, 클로미펜(Clomifene), 라록시펜 (Raloxifene), 또는 이들의 조합인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
8. 동물 모델
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 본 발명의 상기 제조 방법에 의해 제조된 신장 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 스크리닝용 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 상기 동물 모델에서, 제조 방법, 세포치료제, 신장 질환 등과 관련된 내용은 앞서 "1. 신장 조직유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물" 및 "6. 동물 모델의 제조 방법"에 기재된 바와 동일하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에 따른 신장 조직유래 줄기세포; 또는 오가노이드는 치료를 위한 시술이 용이하고, 높은 자가 증식능으로 대량 공급이 가능하며, 신장 세포로 분화능이 뛰어나고, 종양 형성의 가능성이 낮을 뿐만 아니라, 병변에 직접 주입되는 경우 손상된 조직을 재생하는 능력이 매우 탁월하다. 따라서, 이와 같은 줄기세포 중에서, 특히 성제줄기세포 기반 재생치료에 매우 적합하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 신장 세포 중에서 특히 신장 줄기세포만을 특이적으로 선별해낼 수 있다. 나아가, Lrig1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 발현하는 신장 줄기세포는 재생능력 및 다능성이 매우 뛰어나고, 네프론으로 분열할 수 있는 능력을 가지고 있으므로 신장 질환의 예방 또는 치료에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 내 계통 추적 연구에서 사용되는 생쥐 동물 모델을 이용한 실험 프로세스 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 내 계통 추적 연구에서 사용되는 배아 상태의 생쥐 동물 모델을 이용한 실험 프로세스 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 고용량(250 mg/kg) 엽산 유도 급성 신장 손상 동물 모델의 제조 방법에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 고용량(150 mg/kg) 엽산 유도 급성 신장 손상 동물 모델에 본 발명에 따른 신장 오가노이드를 이식한 뒤, 분석 과정에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 허혈/재관류 손상 유도 급성 신장 손상 동물 모델의 제조 방법에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 일측성 요관 폐쇄 유도 급성 신장 손상 동물 모델의 제조 방법에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 생쥐의 신장에서 tdTomato+ 세포(Lrig1tdT+)의 존재 여부를 조직 염색 결과를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 생쥐의 신장에서 tdTomato+ 세포(Lrig1tdT+)의 수를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 발생 단계의 생쥐에서 tdTomato+ 세포(Lrig1tdT+)의 존재 여부를 조직 염색 결과를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 발생 단계의 생쥐에서 tdTomato+ 세포(Lrig1tdT+)의 수를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 오가노이드를 형광 현미경을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 오가노이드에서 발현되는 유전자의발현 수준을 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 오가노이드를 1일에서 19일까지 장기간 배양하였을 때, 신장 오가노이드 수가 증가되는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 고용량(150 mg/kr) 엽산 유도 급성 신장 손상 동물 모델에 PBS 또는 본 발명에 따른 신장 오가노이드를 이식하고 신장 복구 존재 여부를 확인하기 위하여, 조직 염색 및 KIM1의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 고용량(150 mg/kr) 엽산 유도 급성 신장 손상 동물 모델에 PBS 또는 본 발명에 따른 신장 오가노이드를 이식하고 신장 복구 존재 여부를 확인하기 위하여, 혈중 BUN 및 크레아틴 농도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 오가노이드에서 Ki-67의 발현을 형광 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 오가노이드에서 근위세뇨관(PT) 클러스터를 PTS1, PTS2, PTS3 및 PTQPs의 4개의 서브-클러스터로 분류한 것을 나타내었다.
도 18 및 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 오가노이드에서 PTS1, PTS2, PTS3 및 PTQPs의 클러스터 별 유전자의 발현 수준을 확인한 결과를 버블-플롯으로 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 오가노이드를 이식한 뒤 Cre-loxp 유도 후 1일째와 365일째에서 PTS1, PTS2, PTS3 및 PTQPs 클러스터 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 오가노이드를 이식한 뒤 Cre-loxp 유도 후 1일째 대비 365일째에서 PTS1, PTS2, PTS3 및 PTQPs 클러스터 세포 수의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 오가노이드에서 PTS1, PTS2, PTS3 및 PTQPs 각 클러스터 별 자기-재생 관련 유전자, 정지(quiescence) 관련 유전자, 및 다능성/미성숙 세포 관련 유전자의 발현 수준을 확인한 결과를 바이올린-플롯으로 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 오가노이드에서 PTS3 및 PTQPs 클러스터에서 높게 발현되는 상위 10개의 유전자를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 오가노이드를 이식한 뒤 Cre-loxp 유도 후 1일째와 365일째 신장 절편에서 LTL(PT 마커) 및 KLF6를 염색한 면역 형광 염색 사진을 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 오가노이드를 이식한 뒤 Cre-loxp 유도 후 1일째와 365일째 신장 절편에서 20X 필드(field) 당 LTL+KLF6+ 세포를 정량화한 결과를 나타낸 것이다(N=3, 24개의 이미지).
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 오가노이드를 이식한 뒤 Cre-loxp 유도 후 1일째와 365일째에서 각 클러스터별 tdTomato+ 세포의 비율을 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 오가노이드의 근위세뇨관(PT)에서 슈도타임(pseudotime) 계통을 3개의 상이한 상태로 구분한 것으로, PTS1, PTS3 및 PTQPs 클러스터는 각각 상이한 색깔로 나타내었다. 흑색 화살표는 슈도타임의 방향을 나타내었다.
도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 오가노이드를 이식한 뒤 Cre-loxp 유도 후 1일째와 365일째에서 tdTomato+ 세포를 계통 그래프에 플로팅하고, 발현 수준을 색으로 구분한 결과를 나타낸 것이다. 여기서, 저발현은 회색, 고발현은 적색으로 나타내었다.
도 29는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 오가노이드를 이식한 뒤 Cre-loxp 유도 후 1일째와 365일째의 신장 절편을 Lrig1tdTomato+ 및 KLF6 염색한 면역 형광 염색 사진을 나타낸 것이다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장 오가노이드를 이식한 뒤 Cre-loxp 유도 후 1일째와 365일째 신장 절편에 있어서 20X 필드(field) 당 Lrig1tdTomato+KLF6+ 세포를 정량화한 결과를 나타낸 것이다(N=5, 42개의 이미지).
본 발명은 종래의 급성 신부전과 같은 신장 질환 치료의 한계점을 극복하고, 보다 효과적인 치료제 개발을 위한 것이다. 본 발명은 신장 조직유래 줄기세포 또는 오가노이드를 이용하여 효과적인 신장질환 치료제 개발을 위한 것이다. 고농도 엽산(FA)만을 처리한 경우 및 고농도 엽산을 처리하고 PBS를 주입한 경우(FA+PBS)에는 혈중 BUN 및 크레아틴(Creatine)이 존재하는 수준이 매우 높은 반면, 신장 오가노이드를 주입한 경우에는 BUN 및 크레아틴이 존재하는 수준이 정상(Normal)과 유사한 정도로 감소되었다. 이와 같은 결과를 통해, Lrig1 양성 신장 오가노이드는 손상된 신장의 치료에 매우 효과적으로 사용될 수 있음을 직접적으로 알 수 있다.
[실험 방법]
[실험 방법 1] 실험 동물
본 명세서에서 수행된 모든 생체 내(In vivo) 실험은 연세대학교 동물윤리심의위원회(IACUC 2017-0325)의 승인을 받아 수행되었다.
광암 주기 12시간 교대 하에서, 특정 병원체가 없는(Specific pathogen-free; SPF) 장벽 시설에 실험 동물을 수용하고, 피코랩 랩 설치류 다이어트 20(PicoLab Lab Rodent Diet 20, LabDiet, St. Louis, MO, 미국) 사료를 공급하는 방식으로 실험 동물을 사육하였다.
생체 내(In vivo) 실험에서 사용된 실험 동물의 경우, 1) Lrig1CreERT2/+는 벤터빌트 대학의 로버트 J. 코피(Robert J. Coffey)로부터 제공받았고, 2) B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)/Hze/J(R26R-LSL-tdTomato; The Jackson Laboratory, 007914)는 연세대학교 복진웅 교수로부터 제공받았으며, 3) B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdToamto-EGFP)Luo/J(ACTB-mT/mG; The Jackson Laboratory, 007676)는 연세대학교 기현웅 교수로부터 제공받았다.
[실험 방법 2] 생체 내 계통 추적 연구 방법
도 1에 도시된 바와 같이, 상기 실험 방법 1의 동형의 리포터 마우스인 Lrig1CreERT2/+ 생쥐 및 R26R-LSL-tdTomato 생쥐를 교배시켜 이형의 생쥐를 생산하였다. 상기 생쥐에 옥수수 오일에 포함된 타목시펜(Sigma-Aldrich) 2 mg을 3일 연속으로 복강내에 주입하여 Cre-loxp 재조합 유도한 뒤, 1일, 3일, 10일, 30일, 60일, 90일, 180일 또는 365일째에 분석을 수행하였다.
또한, 도 2에 도시된 바와 같이, 동형의 리포터 마우스인 Lrig1CreERT2/+ 생쥐 및 R26R-LSL-tdTomato 생쥐를 교배시켜 발생된지 E9.5, E10.5, E13.5 및 E18.5 배아에. 옥수수 오일에 포함된 4-히드록시타목시펜(Sigma-Aldrich) 2 mg을 한번 주입하고, 산후 6주에 분석을 수행하였다.
[실험 방법 3] 생체 외(In vitro) 2D 및 오가노이드 배양 방법
2D 및 오가노이드 배양을 위하여, Lrig1CreERT2/+ 생쥐 및 R26R-ACTB-mT/mG 생쥐를 교배시켜 생산된 동형의 리포터 생쥐를 6주 내지 10주 사육한 뒤, 일차 신장 상피세포를 채취하였다. 상기 채취된 일차 신장 상피세포에 2 mg/ml의 1형 콜라게나제를 넣고, 37℃에서 30분 동안 부드럽게 교반하면서 배양하였다. 그런 다음, 필터를 이용하여 상기 일차 신장 상피세포를 거른 뒤에 분리된 단일 세포들을 배양하였다. 이후, Lrig1 단백질이 발현된 세포를 RPMI 1640(10% 우태아혈청(Fetal bovine serum; FBS), 20 ng/ml의 EGF, 1% 페니실린-스트렙토마이신 포함) 배지에 넣고, 5% CO2 및 37℃ 조건에서 컨플루언스(Confluence)가 80%가 될 정도인 7일 내지 8일 동안 배양하였다. 이후, 성장인자 감소 마트리겔 및 배양 배지가 포함되어 있는 웰에 1Х103 수의 상기 배양된 세포를 분주하고 배양하였다. 여기서, 상기 배양 배지는 1% 페니실린-스트렙토마이신, 헵스(HEPS) 및 글루타맥스가 포함된 ADMEM/F12 배양 배지를 기초로하여, 1.5% B27 보충제, 40% Wnt3a 조건 배지(produced using stably transfected L cells), 10% noggin 조건 배지, 10% Rspo1 조건 배지, 50 ng/ml의 EGF, 100 ng/mL의 FGF-10, 1.25 mM의 N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine) 및 5 μM의 A8301(CAS no. CAS Number 909910-43-6)가 포함된 것을 사용하였다.
마트리겔에서 상기 세포가 충분히 폴리머리제이션(Polymerizaion)되도록 한 이후, 오가노이드 배양 배지를 추가였으며, 오가노이드 배양 배지는 3일마다 교체해 주었다.
[실험 방법 4] 급성 신장 손상 동물 모델 제작
[4-1] 고용량 엽산 유도 급성 신장 손상 동물 모델 제작
도 3에 도시된 바와 같이, 성인(8 내지 10주령) Lrig1-CreERT2;LSL-tdTomato 생쥐에 상기 실험 방법 2에 기재된 바와 같이, 타목시펜을 주입하는 과정을 통해 Lrig1 단백질이 발현될 수 있도록 하였다. 이후, 급성 신장 손상 유도를 위하여 250 mg/kg의 엽산(Folic acid; FA)을 복강내에 주입하였다.
또한, 도 4에 도시된 바와 같이, C57BL/6 생쥐에 150 mg/kg의 엽산을 복강내에 주입하여 급성신장손상을 유도하고, 엽산을 주입한지 3일 째에 상기 실험 방법 3에서 제작한 신장 오가노이드를 직립성 이식하는 방식으로 이식하였다. 구체적으로, 이소플루란을 이용하여 상기 급성신장손상이 유도된 C57BL/6 생쥐(n=3)를 마취하고, 옆구리를 절개하여 신장을 외부로 노출시켰다. 그런 다음, 대조군인 PBS 또는 상기 실험 방법 3에서 제작된 신장 오가노이드 대략 40개를 상기 신장의 피질 부위에 최소 15회 이상 직접 주입하였다. 이후, 분석을 위해 11일 동안 생쥐를 사육하였다. 이후, 14일 째에 생쥐로부터 혈장 크레아티닌(Creatinine) 및 BUN의 수치를 측정하기 위하여 혈액 샘플을 채취하였다.
[4-2] 허혈/재관류 손상 유도 급성 신장 손상 동물 모델 제작
도 5에 도시된 바와 같이, 성인(8 내지 10 주령) Lrig1-CreERT2;LSL-tdTOmato 생쥐에 상기 실험 방법 2에 기재된 바와 같이, 타목시펜을 주입하는 과정을 통해 Lrig1 단백질이 발현될 수 있도록 하였다. 이후, 상기 생쥐의 신동맥을 겸자로 20분 동안 폐쇄하는 과정을 통해 급성 신장 손상을 유도하였다. 3일 후, 상기 생쥐의 신장 조직을 채취하여 확인한 결과, 급성 신장 손상이 유도된 것을 확인할 수 있었다.
[4-3] 일측성 요관 폐쇄 유도 급성 신장 손상 동물 모델 제작
도 6에 도시된 바와 같이, 성인(8 내지 10 주령) Lrig1-CreERT2;LSL-tdTomato 생쥐에 상기 실험 방법 2에 기재된 바와 같이, 타목시펜을 주입하는 과정을 통해 Lrig1 단백질이 발현될 수 있도록 하였다. 이후, 요관을 겸자로 7일 동안 폐쇄하는 과정을 통해 급성 신장 손상을 유도하였다. 7일 후, 상기 생쥐의 신장 조직을 채취하여 확인한 결과, 급성 신장 손상이 유도된 것을 확인할 수 있었다.
[실험 결과]
[실험 결과 1] 생쥐의 신장에서 Lrig1-tdTomato 자손의 타목시펜 유도에 의한 혈통 분석
신장에서 Lrig1을 발현하는 세포와 그들의 자손의 행동양식을 분석하기 위해, R26R-LSL-tdTomato 생쥐 모델을 이용하여 계통 추적 분석을 수행하였다.
도 7에서 보는 바와 같이, 첫째 날에는 코르텍스(Cortex)에서 매우 적은 수준의 tdTomato+ 세포가 관찰된 반면, 365일째에는 Lrig1을 발현하는 세포 의해 유도된 자손 세포들은 전체 신장에서 관 구조의 12(±2.4)%를 생성하는 것으로 확인되었다.
도 8에서 보는 바와 같이, 날짜에 따라 Lrig1을 발현하는 세포의 수(Lrig1tdT+)를 정량화하였을 때, 이와 같은 세포 클론은 시기가 지속됨에 따라 순차적으로 함께 증가되었으며, 이와 같은 증가는 Lrig1 발현 후 365일까지 지속되었다.
도 9 및 도 10에서 보는 바와 같이, 수뇨관 버드 가지 단계(Ureteric bud branching stage)인 E9.5 및 E10.5에서는 tdTomato+ 세포(Lrig1tdT+)가 관찰되지 않았다. 그러나, 네프로제네시스 단계(Nephrogenesis stage)인 E13.5에서는 tdTomato+ 세포가 관찰되었으며, 대부분의 세포는 튜브 구조를 형성하도록 확장되어 있었다.
이와 같은 결과를 통해, Lrig1이 초기에서 성숙된 신장으로 발달한 이후 네프론 분열을 생성하는데 관여하는 줄기세포 집단임을 알 수 있다.
[실험 결과 2] 고농도 엽산에 의해 유도된 급성 신장 손상 동물 모델에서 신장 오가노이드 직교이식을 통한 치료 효과 확인
도 11에서 보는 바와 같이, 상기 실험 방법 3에 기재된 방법에 의해 제작된 신장 오가노이드를 형광현미경을 이용하여 분석한 결과, 신장 오가노이드를 배양한지 7일째 및 9일째에서 초록색의 Lrig1 세포가 다수 관찰되었다.
또한, 도 12에서 보는 바와 같이, 신장 오가노이드를 배양한지 17일째에서 유전자 발현 수준을 통상의 방법에 따라 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 수행하여 확인하였을 때, Lrig1의 발현 수준뿐만 아니라, Sall1, Six2, Foxo1, Cited, Osr1, Hoxp7, Jagged1 및 Gata3과 같은 신장 줄기세포의 유전자의 발현 수준 역시 함께 증가되어 있는 것을 확인하였다. 나아가, 도 13에서 보는 바와 같이, Lrig1 양성인 신장 오가노이드의 경우에는 생성되는 오가노이드 수가 9일째부터 19일째까지 약 40개 이상의 수로 증가되었다.
서열번호 유전자 특징 염기 서열
서열번호 3 mLrig1 정방향 GGTGAGCCTGGCCTTATGTGAATA
서열번호 4 역방향 CACCACCATCCTGCACCTCC
서열번호 5 Osr1 정방향 TACTCTTTCCTTCAGGCAGTGA
서열번호 6 역방향 GATCGAGGCAAGTGCATGG
서열번호 7 Six2 정방향 CACCTCCACAAGAATGAAAGCG
서열번호 8 역방향 CTCCGCCTCGATGTAGTGC
서열번호 9 1 정방향 AACCTTGGAGTGAAGGATCGC
서열번호 10 역방향 GTAGGAGAGCCTATTGGAGATGT
서열번호 11 Sall1 정방향 CTCAACATTTCCAATCCGACCC
서열번호 12 역방향 GGCATCCTTGCTCTTAGTGGG
서열번호 13 WT1 정방향 GAGAGCCAGCCTACCATCC
서열번호 14 역방향 GGGTCCTCGTGTTTGAAGGAA
서열번호 15 Hoxb1 정방향 AAGTTCGGTTTTCGCTCCAGG
서열번호 16 역방향 ACACCCCGGAGAGGTTCTG
서열번호 17 Gata3 정방향 CTCGGCCATTCGTACATGGAA
서열번호 18 역방향 GGATACCTCTGCACCGTAGC
서열번호 19 cRet 정방향 GCGTCAGGGAGATGGTAAAG
서열번호 20 역방향 CATCAGGGAAACAGTTGCAG
서열번호 21 Foxd1 정방향 CGCTAAGAATCCGCTGGTGAAG
서열번호 22 역방향 GGATCTTGACGAAGCAGTCGTT
서열번호 23 Jagged1 정방향 CCTCGGGTCAGTTTGAGCTG
서열번호 24 역방향 CCTTGAGGCACACTTTGAAGTA
도 14에서 보는 바와 같이, 상기 실험 방법 4의 [4-1]에 기재된 고농도 엽산에 의해 유도된 급성 신장 손상 동물 모델에 PBS(FA+PBS) 또는 신장 오가노이드(FA+Organoid)를 실험 방법 5에 따라 신장에 직접 주입하고, 14일 후에 통상의 방법에 따라 H&E 염색을 수행하였다. 그 결과, PBS만을 주입한 경우(FA+PBS)에는 고농도 엽산에 의해 손상된 신장이 복구되지 않으며, KIM1의 발현 수준이 높은 반면, 신장 오가노이드를 주입한 경우에는 고농도 엽산에 의해 손상된 신장이 복구되며, KIM1의 발현 수준이 감소되었다. 이와 같은 결과를 통해 신장 오가노이드의 주입은 손상된 신장을 매우 효과적으로 복구시킬 수 있음을 알 수 있다.
또한, 도 15에서 보는 바와 같이, 고농도 엽산(FA)만을 처리한 경우 및 고농도 엽산을 처리하고 PBS를 주입한 경우(FA+PBS)에는 혈중 BUN 및 크레아틴(Creatine)이 존재하는 수준이 매우 높은 반면, 신장 오가노이드를 주입한 경우에는 BUN 및 크레아틴이 존재하는 수준이 정상(Normal)과 유사한 정도로 감소되었다. 이와 같은 결과를 통해, Lrig1 양성 신장 오가노이드는 손상된 신장의 치료에 매우 효과적으로 사용될 수 있음을 직접적으로 알 수 있다.
또한 도 16에서 보는 바와 같이, 형광 현미경을 통해 확인한 결과, 면역형광염색을 통하여 신장 내 주입된 오가노이드를 확인하였으며, Ki-67과 같은 증식 마커가 발현되는 것을 볼 수 있었는 바, 신장 내 주입된 오가노이드는 증식성이 있음이 확인되었다.
[실험 결과 3] Lrig1 및 그 자손 세포들의 성인 신장에서 줄기세포 니체 형성 효과
앞선 실험 결과를 통해, Lrig1 양성 세포는 근위세뇨관(proximal tubule; PT)에서 장기간 생존하며 잠재적인 신장 줄기/전구 세포에 해당하며, 상기 Lrig1 양성 세포 유래의 자손 세포들(descendants)이 PT 항상성을 유지하는 데에 실질적으로 공헌을 하는 것을 알 수 있었다. PT에서 Lrig1+ 세포와 그 유래 세포의 세포적 이질성을 확인하기 위하여, 도 17에서 보는 바와 같이, PT 클러스터를 PTS1, PTS2, PTS3 및 PTQPs의 4개의 서브-클러스터로 분류하였다. 이때, PTS1의 분류를 위하여 Slc5a12 및 Slc5a2 마커, PTS2 분류를 위하여 Slc13a3 및 Ddah1 마커, PTS3 분류를 위하여 Slc16a9 및 Slc7a13 마커를 이용하였다. 그리고, 도 18에서 보는 바와 같이, 급성 신장 손상 상태에서 상향 조절되는 피루베이트 디하이드로제네이즈 신장 4(Pyruvate dehydrogenase kidney 4; Pdk4) 및 시스테인-풍부 단백질(Cystein-rich protein 61; Cyr61)이 풍부하게 발현하는 서브-클러스터인 PTQPs를 발견하였다. 보다 구체적으로 정의하고자, PTQPs를 다른 PT 서브-클러스터와 비교하였다. PTQPs에서 발현되는 상위 50개 유전자의 발현 수준을 확인한 결과, 도 19에서 보는 바와 같이, PTQPs에서는 신장 손상 및 회복 관련 유전자가 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었고, 2 네프론 전구체 유전자(2 nephron progenitor genes) 또한 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 각 PT 서브-클러스터에서 세포 수를 측정한 결과, 도 20에서 보는 바와 같이, Cre-loxp 재조합 후 365일째에서는 PTS2 및 PTQPs 세포 수가 증가하였다. 또한, 도 21에서 보는 바와 같이, Cre-loxp 재조합 후 365일째 신장에서 PTQPs 클러스터 세포 수가 1일째 신장에서와 비교하여 5배 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 PT 세포는 시간이 경과함에 따라 증가하며, 특히 PTQPs 및 PTS2 클러스터 세포 수가 증가하는 것을 알 수 있었다. 다음으로, 성인 줄기세포 유전자 모듈을 사용하여 신장의 PTQPs 클러스터를 정의하였다. 그 결과, DEGs에서 총 650 개의 유전자를 검출하였다. 도 22에서 보는 바와 같이, PTQPs 클러스터에서 줄기-관련 유전자가 높게 발현되었고, 자기-재생 관련 유전자(Klf5는 제외하고, Ptbp1, Ncl, Ctr9 및 Cited2), 정지(quiescence) 관련 유전자(Hif1a, Myc, 및 Foxo3), 그리고 다능성 또는 미성숙 세포 관련 유전자(Id2, Btg2, Tubb6, 및 Klf2)가 상향 조절된 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 PTQPs 클러스터는 신장 손상-회복 관련 유전자와 성숙 PT 세포의 마커를 포함하여 줄기능 관련 유전자가 발현되는 것을 알 수 있었고, 이러한 결과로부터 해당 클러스터를 "PT 정지 전구체(PT quiescent progenitors; PTQPs)"로 명명한 것이다.
다음으로, PTS3와 구별되는 PTQPs 마커를 확인한 결과, 도 23에서 보는 바와 같이, DEGs에서 높게 발현되는 줄기 세포 니체로 알려진 유전자들을 확인할 수 있었다. PTS3 클러스터에서는 PT 세그먼트 3(PT segment 3) 특이적 유전자가 높게 발현된 반면, PTQPs에서는 높게 발현되지 않았다. PTQPs 마커를 검증하기 위하여, Jun, Klf6 및 Cyr61을 이용하여 신장 절편을 IF 염색하였다. Jun 및 Cyr61은 PT 뿐만 아니라 다양한 네프론 절편에서 높게 발현되어, 이들을 제외하였다. 다음으로, PT에서 발현되는 지 확인하기 위하여 1일째 및 365일째 신장 절편에서 KLF6 및 LTL를 염색하였다. 도 24에서 보는 바와 같이, 1일째 신장 절편에서 Klf6+LTL+ PT 튜뷸이 약하게 발현된 반면, 365일째 신장 절편에서는 Klf6+LTL+ PT 튜뷸이 강하게 발현되었다. 정량화 결과, 도 25에서 보는 바와 같이, KLF6+ 발현 PT 튜뷸은 365일째 신장에서 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 365일째 신장에서 PTQPs 분포의 증가는 Klf6를 이용하여 확인할 수 있음을 알 수 있었다.
Lrig1 양성 세포로부터 유래된 자손 세포들이 PTQPs 집단을 이루는 지 확인하기 위하여, 1일째 및 365일째 신장 절편에서 tdTomato 발현 세포를 확인하였다. 그 결과, 도 26에서 보는 바와 같이, 1일째 신장 절편에서는 tdTomato+ 세포는 PTS1 세포의 54%, PTS3의 27%를 이루었으나, 365일째 신장 절편에서는 각각 50% 및 11%로 감소하였다. 반면, 1일째 신장 절편에서 PTS2 세포의 12%, PTQPs 세포의 17.8%를 이루었으나, 365일째에서는 각각 20% 및 18%로 증가하였다. 이로부터 Lrig1 양성 세포로부터 유래된 자손 세포들이 PTQPs 세포 집단을 이루는 것을 알 수 있었다. 또한, 단일 세포에서의 정보를 통해 분화로의 진행을 보이는 세포 동선(trajectory)을 분석하였다. 동선의 초기 단계에서는 PT 줄기 세포 니체로 알려진 PTS3와 새로운 줄기 세포 니체로 밝혀진 PTQPs에 해당하였다. 이러한 세포군 집단은 PTS1으로의 두개의 구분되는 동선으로 나뉘어질 수 있는데(도 27), 1일째 신장에서는 PTS3가 우세하였다가 PTS1 클러스터로 분화하는 양상을 보였고, 365일째에서는 PTQPs 클러스터가 주로 PTS1 클러스터 세포 항상성을 수행하는 것을 볼 수 있었다. 1일째 및 365일째에서 PTS3 및 PTQPs와 tdTomato-발현 세포를 얼라인해 본 결과, 도 28에서 보는 바와 같이 1일째에서는 PTS3 클러스터에서 tdTomato 발현 세포는 PTS1으로 분화되는 것을 확인할 수 있었고, 365일째에서는 PTQPs 클러스터에서 tdTomato 발현 세포는 주로 PTS1를 유지시키는 것을 알 수 있었다. Klf6 및 tdTomato+ 세포를 염색하면, 도 29 및 30에서 보는 바와 같이, 1일째와 비교하여 365일째에서 Klf6+tdTomato+ 튜뷸이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 Lrig1 양성 세포 및 이로부터 유래한 자손 세포들이 PTQPs 클러스터를 이루는 것을 알 수 있었다. 실험 조건에서도 1일재 신장은 6주령 마우스로부터 취하였으나, 365일째 신장은 13개월령의 마우스로부터 취하였다. 앞선 실험 결과로부터 신장 항상성은 젋은 신장(1일째 신장)에서는 PTS3에 의해 조절되며, 그리고 노화된 신장(365일째 신장)에서는 PTQPs가 새로운 줄기 세포 니체를 보이는 것을 알 수 있었다.
이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
본 발명은 종래의 급성 신부전과 같은 신장 질환 치료의 한계점을 극복하고, 보다 효과적인 치료제 개발을 위한 것이다. 현재 신장 줄기세포를 식별하고 치료제로 적용하기 위한 줄기세포를 동정하고, 임상에 활용하기 위한 적용 가능성 등에 대한 연구는 미비한 실정이지만, 개발 필요성이 요구되고 있다. 본 발명은 신장 조직유래 줄기세포; 또는 오가노이드는 치료를 위한 시술이 용이하고, 신장 세포로 분화능이 뛰어나고, 종양 형성의 가능성이 낮을 뿐만 아니라, 병변에 직접 주입되는 경우 손상된 조직을 재생하는 능력이 매우 탁월하므로, 신장 질환의 예방 또는 치료에 매우 효과적으로 이용될 것으로 기대된다.
서열번호 1:
MARPVRGGLG APRRSPCLLL LWLVLVRLEP VTAAAGPRAP CAAACTCAGD SLDCGGRGLA
ALPGDLPSWT RSLNLSYNKL SEIDPAGFED LPNLQEVNLS YNKLSEIDPA GFEDLPNLQE
VYLNNNELTA VPSLGAASSH VVSLFLQHNK IRSVEGSQLK AYLSLEVLDL SLNNITEVRN
TCFPHGPPIK ELNLAGNRIG TLELGAFDGL SRSLLTLRLS KNRITQLPVR AFKLPRLTQL
DLNRNRIRLI EGLTFQGLNS LEVLKLQRNN ISKLTDGAFW GLSKMHVLHL EYNSLVEVNS
GSLYGLTALH QLHLSNNSIA RIHRKGWSFC QKLHELVLSF NNLTRLDEES LAELSSLSVL
RLSHNSISHI AEGAFKGLRS LRVLDLDHNE ISGTIEDTSG AFSGLDSLSK LNLGGNAIRS
VQFDAFVKMK NLKELHISSD SFLCDCQLKW LPPWLIGRML QAFVTATCAH PESLKGQSIF
SVPPESFVCD DFLKPQIITQ PETTMAMVGK DIRFTCSAAS SSSSPMTFAW KKDNEVLTNA
DMENFVHVHA QDGEVMEYTT ILHLRQVTFG HEGRYQCVIT NHFGSTYSHK ARLTVNVLPS
FTKTPHDITI RTTTVARLEC AATGHPNPQI AWQKDGGTDF PAARERRMHV MPDDDVFFIT
DVKIDDAGVY SCTAQNSAGS ISANATLTVL ETPSLVVPLE DRVVSVGETV ALQCKATGNP
PPRITWFKGD RPLSLTERHH LTPDNQLLVV QNVVAEDAGR YTCEMSNTLG TERAHSQLSV
LPAAGCRKDG TTVGIFTIAV VSSIVLTSLV WVCIIYQTRK KSEEYSVTNT DETVVPPDVP
SYLSSQGTLS DRQETVVRTE GGPQANGHIE SNGVCPRDAS HFPEPDTHSV ACRQPKLCAG
SAYHKEPWKA MEKAEGTPGP HKMEHGGRVV CSDCNTEVDC YSRGQAFHPQ PVSRDSAQPS
APNGPEPGGS DQEHSPHHQC SRTAAGSCPE CQGSLYPSNH DRMLTAVKKK PMASLDGKGD
SSWTLARLYH PDSTELQPAS SLTSGSPERA EAQYLLVSNG HLPKACDASP ESTPLTGQLP
GKQRVPLLLA PKS
서열번호 2:
MDVLPMCSIF QELQIVHETG YFSALPSLEE YWQQTCLELE RYLQSEPCYV SASEIKFDSQ
EDLWTKIILA REKKEESELK ISSSPPEDTL ISPSFCYNLE TNSLNSDVSS ESSDSSEELS
PTAKFTSDPI GEVLVSSGKL SSSVTSTPPS SPELSREPSQ LWGCVPGELP SPGKVRSGTS
GKPGDKGNGD ASPDGRRRVH RCHFNGCRKV YTKSSHLKAH QRTHTGEKPY RCSWEGCEWR
FARSDELTRH FRKHTGAKPF KCSHCDRCFS RSDHLALHMK RHL
서열번호 3: GGTGAGCCTGGCCTTATGTGAATA
서열번호 4: CACCACCATCCTGCACCTCC
서열번호 5: TACTCTTTCCTTCAGGCAGTGA
서열번호 6: GATCGAGGCAAGTGCATGG
서열번호 7: CACCTCCACAAGAATGAAAGCG
서열번호 8: CTCCGCCTCGATGTAGTGC
서열번호 9: AACCTTGGAGTGAAGGATCGC
서열번호 10: GTAGGAGAGCCTATTGGAGATGT
서열번호 11: CTCAACATTTCCAATCCGACCC
서열번호 12: GGCATCCTTGCTCTTAGTGGG
서열번호 13: GAGAGCCAGCCTACCATCC
서열번호 14: GGGTCCTCGTGTTTGAAGGAA
서열번호 15: AAGTTCGGTTTTCGCTCCAGG
서열번호 16: ACACCCCGGAGAGGTTCTG
서열번호 17: CTCGGCCATTCGTACATGGAA
서열번호 18: GGATACCTCTGCACCGTAGC
서열번호 19: GCGTCAGGGAGATGGTAAAG
서열번호 20: CATCAGGGAAACAGTTGCAG
서열번호 21: CGCTAAGAATCCGCTGGTGAAG
서열번호 22: GGATCTTGACGAAGCAGTCGTT
서열번호 23: CCTCGGGTCAGTTTGAGCTG
서열번호 24: CCTTGAGGCACACTTTGAAGTA

Claims (30)

  1. Lrig1(Leucine Rich Repeats And Immunoglobulin Like Domains 1) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 발현하는 신장 조직유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 신장 조직유래 줄기세포는 Klf6(Krueppel-like factor 6) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 추가로 더 발현하는, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 신장 질환은 급성 신손상(Acute kidney injury; AKI) 또는 만성 신손상(Chronic kidney disease; CKD)인 것인, 약학 조성물.
  4. Lrig1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 발현하는 신장 조직유래 줄기세포를 포함하는 신장 오가노이드.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 신장 조직유래 줄기세포는 Klf6(Krueppel-like factor 6) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 추가로 더 발현하는, 신장 오가노이드.
  6. 제4항 또는 제5항의 신장 오가노이드를 유효성분으로 포함하는, 신장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. (a) 목적하는 개체로부터 분리된 신장 상피세포에서 Lrig1(Leucine Rich Repeats And Immunoglobulin Like Domains 1) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 발현된 세포를 분리하는 단계;
    (b) 상기 Lrig1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 발현된 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 배양된 세포를 마트리겔에 넣고 오가노이드를 형성하는 단계;를 포함하는 신장 오가노이드의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 분리된 세포는 Klf6(Krueppel-like factor 6) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 추가로 더 발현하는 것인, 제조 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서, 상기 유전자가 발현된 세포를 배양하는 단계는 우태아혈청, 성장인자 및 항생제가 포함된 세포 배양 배지를 이용하는 것인, 제조 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서, 상기 오가노이드를 형성하는 단계는 B27 보충제, 조건 배지, 성장인자, N-아세틸시스테인 및 ALK 5(TGFβ kinase/activin receptor-like kinase) 억제제가 포함된 세포 배양 배지를 이용하는 것인, 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 조건 배지는 Wnt3a 조건 배지, 노긴(noggin) 조건 배지 및 Rspo1 조건 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상인 것인, 제조 방법.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 마트리겔은 성장인자 감소 마트리겔인 것인, 제조 방법.
  13. Lrig1(Leucine Rich Repeats And Immunoglobulin Like Domains 1) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신장 조직유래 줄기세포 검출용 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 검출용 조성물은 Klf6(Krueppel-like factor 6) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는, 검출용 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 것인, 검출용 조성물.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 압타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 것인, 검출용 조성물.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 검출용 조성물을 포함하는 신장 조직유래 줄기세포 검출용 키트.
  18. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Lrig1(Leucine Rich Repeats And Immunoglobulin Like Domains 1) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 신장 조직유래 줄기세포 검출 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 발현 수준을 측정하는 단계 시 상기 생물학적 시료로부터 Klf6(Krueppel-like factor 6) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 추가로 측정하는, 검출 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나 이상을 통해 측정되는 것인, 검출 방법.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 단백질의 발현 수준은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA 및 압타머로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상을 통해 측정되는 것인, 검출 방법.
  22. 제18항에 있어서,
    상기 Lrig1(Leucine Rich Repeats And Immunoglobulin Like Domains 1) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 대조군과 비교하여 증가된 경우, 신장 조직유래 줄기세포로 검출하는 단계를 더 포함하는, 검출 방법.
  23. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, Lrig1(Leucine Rich Repeats And Immunoglobulin Like Domains 1) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 발현되는 세포를 분리하는 단계;를 포함하는 신장 조직유래 줄기세포의 분리 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 분리되는 세포는 Klf6(Krueppel-like factor 6) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 추가로 더 발현하는 것인, 분리 방법.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 분리하는 단계는 자기 활성 세포 분류법(Magnetic activated cell sorting; MACS) 또는 유세포 분석(Flow cytometry Analysis)을 통해 수행되는 것인, 분리 방법.
  26. Lrig1(Leucine Rich Repeats And Immunoglobulin Like Domains 1) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 발현하는 신장 조직유래 줄기세포를 분리하는 단계; 및
    상기 분리된 신장 조직유래 줄기세포를 배양하는 단계;를 포함하는 신장 조직 유래 줄기세포를 배양하는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 분리되는 세포는 Klf6(Krueppel-like factor 6) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 추가로 더 발현하는 것인, 배양하는 방법.
  28. 신장 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 스크리닝용 동물 모델의 제조 방법에 있어서,
    Lrig1(Leucine Rich Repeats And Immunoglobulin Like Domains 1)을 암호화하는 유전자가 CreERT2-LoxP 시스템에 의해 조건적으로 발현되는 동물에 신장 손상을 유도하는 단계; 및
    상기 동물에 에스트로겐 길항제를 처리하여, 목적하는 유전자의 발현을 유도하는 단계;를 포함하는, 동물 모델의 제조 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 신장 손상을 유도하는 단계는 엽산의 복강내 투여; 허혈/재관류 손상을 유도; 및 일측성 요관 폐쇄 유도로 구성된 방법 중 어느 하나를 수행하는 것인, 동물 모델의 제조 방법.
  30. 제28항의 제조 방법에 따라 제조된 신장 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 스크리닝용 동물 모델.
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